ES2582386T3 - Composiciones de anticuerpos recombinantes contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico - Google Patents

Abstract

Una composición de anticuerpos que comprende una primera molécula de anticuerpo contra EGFR humano y una segunda molécula de anticuerpo contra EGFR humano distinta, en la que: a) la primera molécula de anticuerpo contra EGFR comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada en la SEQ ID NO: 40 y las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera en la SEQ ID NO: 72; y b) la segunda molécula de anticuerpo contra EGFR comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada en la SEQ ID NO: 41 y las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera en la SEQ ID NO: 73.

Description

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Definiciones

El término “anticuerpo” describe un componente de suero funcional y a menudo hace referencia a cualquiera de una colección de moléculas (anticuerpos o inmunoglobulinas) o a una molécula (la molécula de anticuerpo o la molécula de inmunoglobulina). Una molécula de anticuerpo tiene la capacidad de unirse a, o reaccionar con, un determinante antigénico específico (el antígeno o el epítopo antigénico), que a su vez, puede conducir a la inducción de mecanismos efectores inmunológicos. Una molécula de anticuerpo individual normalmente se considera como monoespecífica, y una composición de moléculas de anticuerpo pueden ser monoclonal (es decir, consistir en moléculas de anticuerpo idénticas) o policlonal (es decir, consistir en dos o más moléculas de anticuerpo diferentes que reaccionan con el mismo epítopo o con epítopos diferentes en el mismo antígeno o incluso en antígenos diferentes, distintos). Cada molécula de anticuerpo tiene una estructura exclusiva que permite que se una específicamente a su antígeno correspondiente, y todas las moléculas de anticuerpo naturales tienen la misma estructura básica general de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos también se conocen conjuntamente como inmunoglobulinas. Los términos anticuerpo o anticuerpos, de la manera en la que se usa en el presente documento, también pretenden incluir anticuerpos quiméricos y monocatenarios, así como fragmentos de unión de anticuerpos, tales como Fab, fragmentos Fv o fragmentos scFv, así como formas multiméricas tales como moléculas de IgA diméricas o IgM pentavalente . Un anticuerpo puede ser humano, murino, quimérico, humanizado o puede remodelarse.

La expresión “par codificante VH y VL homólogo” describe un par original de secuencias codificantes VH y VL contenidas dentro, o procedentes de, la misma célula productora del anticuerpo. Por tanto, un par VH y VL homólogo representa el emparejamiento de VH y VL originalmente presente en el donante del cual procede dicha célula. La expresión “un anticuerpo expresado a partir de un par codificante VH y VL” indica que un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo se produce a partir de un vector, plásmido o similar, que contiene las secuencias codificantes VH y VL. Cuando se expresa un par codificante VH y VL homólogo, bien como un anticuerpo completo o como un fragmento estable del mismo, conserva la afinidad y especificidad de unión del anticuerpo originalmente expresado a partir de la célula de la que procede. Una biblioteca de pares homólogos también se denomina repertorio o colección de pares homólogos, y puede guardarse individualmente o agruparse.

El término “CDR” -región determinante de la complementariedad -es como definen Lefranc et al (2003) en IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp Immunol 27, 55-77.

La expresión “un miembro distinto de una proteína policlonal recombinante” se refiere a una molécula de proteína de una composición de proteínas que comprende moléculas de proteína homólogas aunque diferentes, siendo cada molécula de proteína homóloga a las otras moléculas de la composición, aunque conteniendo también uno o más tramos de secuencia polipeptídica variable, que se caracteriza (caracterizan) por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal.

La expresión “promotores cabeza con cabeza” se refiere a un par de promotores que se coloca en estrecha proximidad de tal manera que la transcripción de dos fragmentos génicos conducida por los promotores se produce en direcciones opuestas. Un promotor cabeza con cabeza también puede construirse con un relleno compuesto de ácidos nucleicos irrelevantes entre los dos promotores. Dicho fragmento de relleno puede contener fácilmente más de 500 nucleótidos. Los promotores cabeza con cabeza también se denominan promotores bidireccionales.

La expresión “inmunoglobulina” normalmente se usa como un nombre colectivo de la mezcla de anticuerpos que se encuentra en la sangre o en el suero, pero también puede usarse para nombrar una mezcla de anticuerpos que procede de otras fuentes.

La expresión “molécula de inmunoglobulina” indica una molécula de anticuerpo individual, por ejemplo, que forma parte de una inmunoglobulina, o parte de cualquier composición de anticuerpos policlonal o monoclonal.

La expresión “una biblioteca de moléculas de ácido nucleico variante de interés” se usa para describir el conjunto de moléculas de ácido nucleico, que colectivamente codifica una “proteína policlonal recombinante de interés”. Cuando se usa para la transfección, la biblioteca de moléculas de ácido nucleico variante de interés está contenida en una biblioteca de vectores de expresión. Dicha biblioteca típicamente tiene al menos 2, 3, 5, 10, 20, 50, 1000, 104, 105 o 106 miembros distintos.

La expresión “transferencia masiva” se usa para describir la transferencia de secuencias de ácido nucleico de interés de una población de vectores a otra población de vectores y hacer esto para cada ADN simultáneamente sin recurrir el aislamiento del ADN individual de interés. Dichas poblaciones de vectores pueden ser bibliotecas que contienen, por ejemplo, regiones variables, promotores, secuencias líder o elementos potenciadores de interés. Después, estas secuencias pueden llevarse sin aislamiento previo, por ejemplo, de un vector de fago a un vector de expresión de mamífero. Especialmente, para secuencias de anticuerpos, esta técnica garantiza que no se pierda la unión entre la diversidad de VH y VL aunque se lleven bibliotecas, por ejemplo, de un vector de selección (por ejemplo, un vector de

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Por “proteína o “polipéptido” se entiende que es cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o modificación postraduccional. Las proteínas pueden existir como monómeros o multímeros, que comprenden dos o más cadenas polipeptídicas, fragmentos de proteínas, polipéptidos, oligopéptidos o péptidos ensamblados.

El término “RFLP” (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a “polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción”, un método mediante el cual el patrón migratorio del gel de los fragmentos de la molécula de ácido nucleico se analiza después de escisión con enzimas de restricción.

La expresión “translocación” describe situaciones en las que dos o más miembros distintos de una proteína policlonal que comprende dos cadenas polipeptídicas diferentes, por ejemplo, de la superfamilia de inmunoglobulina, se expresan a partir de una célula individual. Esta situación puede surgir cuando la célula individual ha integrado, en el genoma, más de un par de segmentos génicos, en el que cada par de segmentos génicos codifica un miembro distinto de la proteína policlonal. En dichas situaciones pueden hacerse combinaciones involuntarias de las cadenas polipeptídicas expresadas a partir de los segmentos génicos. Estas combinaciones involuntarias de las cadenas polipeptídicas podrían no tener ningún efecto terapéutico.

La expresión “translocación de cadenas VH-VL” es un ejemplo de la translocación descrita anteriormente. En este ejemplo, los segmentos génicos que codifican VH y VL constituyen un par de segmentos génicos. La translocación ocurre cuando se producen combinaciones involuntarias de polipéptidos de VH y VL de una célula en la que dos pares de segmentos génicos que codifican VH y VL diferentes se integran en la misma célula. Es probable que dicha molécula de anticuerpo translocada no conserve la especificidad original y por tanto podría no tener ningún efecto terapéutico.

El término “transfección”, como se usa en el presente documento, es un término amplio para introducir ADN extraño en una célula. El término también significa que incluye otros métodos equivalentes funcionales para introducir ADN extraño en una célula, tal como, por ejemplo, transformación, infección, transducción o fusión de una célula donadora y una célula aceptora.

Las expresiones “secuencia polipeptídica variable” y “región variable” se usan indistintamente.

La expresión “epítopos distintos” significa que cuando dos anticuerpos diferentes se unen a epítopos distintos, hay una competencia menor del 100 % para la unión antigénica, preferentemente una competencia menor del 50 % para la unión antigénica, más preferentemente de un modo esencial no hay competencia para la unión antigénica. Un análisis para “epítopos distintos” de pares de anticuerpos se determina típicamente mediante experimentos de unión en condiciones de anticuerpos saturantes con cualquiera de análisis FACS en células que expresan EGFR y anticuerpos marcados individualmente con fluorescencia o Resonancia de Plasmón Superficial usando el antígeno EGFR capturado o conjugado con una superficie de célula de flujo como se describe en los ejemplos.

La expresión ser capaz de “inhibir la unión con EGF” cuando se aplica a una molécula de anticuerpo significa que la molécula de anticuerpo presenta un valor de CI50 con respecto a la unión de EGF con EGFR de menos de 10 nM, preferentemente menos de 8 nM, más preferentemente menos de 7 nM, más preferentemente menos de 5 nM, más preferentemente menos de 4 nM, más preferentemente menos de 3 nM, más preferentemente menos de 2 nM, más preferentemente menos de 2 nM, más preferentemente menos de 1 nM.

Las expresiones “receptor del factor de crecimiento epidérmico” “EGFR” y “antígeno EGFR” se usan indistintamente en el presente documento, e incluyen variantes, isoformas y homólogos de especie del EGFR humano. En una realización preferida, la unión de un anticuerpo de la invención con el antígeno EGFR inhibe el crecimiento de células que expresan EGFR (por ejemplo, una célula tumoral) inhibiendo o bloqueando la unión del ligando de EGFR con EGFR. La expresión “ligando de EGFR” incluye todos los ligandos (por ejemplo fisiológicos) para EGFR, incluyendo pero sin limitación EGF, TGF-alfa, EGF de unión a heparina (HB-EGF), anfirregulina (AR), herregulina, betacelulina y epirregulina (EPI). En otra realización preferida, la unión de un anticuerpo de la invención con el antígeno EGFR media la fagocitosis de células efectoras y/o la destrucción de células que expresan EGFR.

Estructura de dominio de EGFR: la parte extracelular del EGFR maduro (SwissProt n.º de acceso P00533) consta de 621 aminoácidos y de cuatro dominios receptores: el dominio I incluye los restos 1-165, el dominio II los restos 166312, el dominio III los restos 313-481 y el dominio IV los restos 482-621 (Cochran et al., 2004, J. Immunol. Methods 287, 147-158). Se ha sugerido que los dominios I y III contribuyen a la formación de sitios de unión de alta afinidad para ligandos. Los dominios II y IV son regiones similares a laminina ricas en cisteína que estabilizan el plegamiento de las proteínas y contienen una posible interfaz de dimerización con EGFR.

Como se usa en el presente documento, la expresión “inhibe el crecimiento” (por ejemplo, referente a células) pretende incluir cualquier disminución medible en la proliferación (aumento en el número de células) o metabolismo de una célula cuando se pone en contacto con un anticuerpo contra EGFR en comparación con el crecimiento de las mismas células que no se ponen en contacto con un anticuerpo contra EGFR, por ejemplo, la inhibición del

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Figura 9: Determinación de grupos de epítopos dentro del repertorio de anticuerpos contra EGFR mediante análisis de competición con SPR de pares de anticuerpos contra EGFR. Los anticuerpos se agruparon de acuerdo con un supuesto reconocimiento de dominio de EGFR. Las células en las que se descubrieron combinaciones de anticuerpos que se unían a epítopos solapantes que dieron como resultado una inhibición de más del 50 % se sombrean en color gris. Las células en las que no se realizaron determinaciones se colorearon en negro. A) Cálculo de inhibición. B) La puntuación de la inhibición fue la siguiente: 25-49 %: competición moderada (+); 50-74 %: competición fuerte (++); 75-100 %: competición muy fuerte (+++).

Figura 10: Mapas epitópicos de anticuerpos de referencia y anticuerpos contra EGFR dirigidos contra el dominio extracelular de EGFR determinado por análisis Biacore. A) Mapeo epitópico de anticuerpos dirigidos contra el dominio I o dominio I/II del dominio extracelular (ECD, Extra Cellular Domain) de EGFR. B) Mapeo epitópico de anticuerpos dirigidos contra el dominio III del ECD de EGFR.

Figura 11: Investigación de la unión simultánea de una mezcla oligoclonal de anticuerpos dirigidos contra epítopos no solapantes en EGFR. A) adición secuencial de anticuerpos contra el dominio III, dominio I o especificidad desconocida. Los valores de inhibición de los mAb de muestras sencillas ensayados frente a diferentes mezclas de mAb o mAb sencillos se muestran en cuadros sombreados. También se muestran los valores de Ur máx usados para calcular la inhibición. B) Análisis de competición de seis mAb de muestras distintas dirigidos contra epítopos no solapantes en EGFR y una mezcla de anticuerpos que contienen los seis anticuerpos ensayados. Las mezclas de anticuerpos donde no se incluyó el anticuerpo de muestra ensayado sirvieron como un control positivo. Los valores de inhibición de mAb de muestras sencillas ensayados contra diferentes mezclas de mAb se muestran en cuadros sombreados. También se muestran los valores de Ur máx usados para calcular la inhibición. C) Los sensogramas correspondientes de los análisis en B ilustran el bloqueo de anticuerpos y, en algunos casos, la potenciación de la unión de los anticuerpos. D) Ensayo de anticuerpos adicionales dirigidos contra el dominio I, I/II y especificidad desconocida contra la mezcla de seis anticuerpos mAb.

Figura 12: Determinación del bloqueo del ligando EGF mediado por anticuerpos mediante titulación de anticuerpos en EGFR de longitud completa y detección de la unión del ligando EGF biotinilado con un reactivo de estreptavidina-HRP. Las IgG Erbitux, Vectibix y Synagis (palivizumab) se usaron como controles positivos y negativos, respectivamente. Después del bloqueo del epítopo del anticuerpo reconocido con los anticuerpos ensayados, se visualizó el grado de competición del ligando EGF por adición de 0,1 μg/ml de ligando EGF biotinilado y de un conjugado de estreptavidina-HRP secundario para la detección.

Figura 13: Efecto del tratamiento previo con los anticuerpos indicados sobre la fosforilación de EGFR inducida por EGF (50 ng/ml) en células HN5. Los anticuerpos (10 μg/ml) indicados en el gráfico se incubaron con las células durante 30 minutos antes de la adición de EGF durante 7,5 min. Los conjuntos de datos marcados con asterisco (*) fueron significativamente diferentes del conjunto de datos del control ((-) ctrl) (p <0,05). A. 1208 tuvo un efecto protector significativo sobre la fosforilación de EGFR. B. 1277 y 1320 protegieron significativamente contra la fosforilación inducida por EGF. Las barras de error representan desviaciones típicas de tres experimentos independientes.

Figura 14: Análisis Western celular de EGFR fosforilado (pEGFR) y de EGFR en células HN5. La mezcla indica la mezcla equimolar de los anticuerpos 992, 1030 y 1042 a una concentración final de 10 μg/ml, cada uno de los anticuerpos restantes se usó en una concentración de 10 μg/ml. Se añadieron 50 μg/ml de EGF durante 7,5 minutos antes de la fijación para estimular la fosforilación de EGFR. Las barras de error representan desviaciones típicas de 6 (ctlr-) o de 3 (992, 1030, 1042, mezcla o Erbitux) puntos de datos distintos. El 992, 1030, la mezcla y Erbitux tuvieron un efecto protector significativo (* = p <0,05) sobre la fosforilación.

Figura 15: Efecto de la incubación de anticuerpos sobre la internalización de EGFR. Los datos se muestran como porcentaje de receptores retirados de la superficie celular con respecto a la tinción inicial. Las barras de error corresponden al ETM.

Figura 16: Curvas de crecimiento de células A431-NS en presencia de diversas concentraciones de los anticuerpos 992, 1030 y 1042 y mezclas de los mismos medidas mediante el porcentaje de células metabólicamente activas en comparación con el control no tratado. 1001 es un anticuerpo no funcional con isotipo similar usado como control negativo.

Figura 17: Curvas de crecimiento de células A431-NS en presencia de 10 μg/ml de los anticuerpos 992, 1030 y 1042 y mezclas de los mismos y diversas concentraciones de ligando EGF de EGFR medidas mediante la absorbancia a 450 nm. 1001 es un anticuerpo no funcional con isotipo similar usado como control negativo.

Figura 18: Curvas de crecimiento de células A431-NS en presencia de diversas concentraciones del anticuerpo 992 y mezclas de 992 y anticuerpos con epítopos no solapantes presentes en el dominio I, II o III. 1001 es un anticuerpo no funcional con isotipo similar usado como control negativo.

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visualizado con anticuerpo secundario de ratón contra Fc de ser humano conjugado con HRP. A) Características de unión de IgG 992 con células A431-NS con o sin saturación previa del receptor con los fragmentos Fab indicados. B) Características de unión de IgG 1024 con células A431-NS con o sin saturación previa del receptor con los fragmentos Fab indicados. C) Características de unión de IgG 1030 con células A431-NS con o sin saturación previa del receptor con los fragmentos Fab indicados.

Figura 34: ADNc de EGFR de longitud completa de Cinomolgo (Figura 34A; SEQ ID NO 102) y proteína codificada (Figura 34B; SEQ ID NO 103).

Figura 35: Apoptosis obtenida en células A431NS con 1 μg/ml de los anticuerpos/combinaciones que se indican. Se detectaron complejos de histona-AD en un kit ELISA de Roche. Los niveles de apoptosis se relacionaron con los de un control positivo (apoptosis máxima).

Figura 36: Ratones nu/nu Balb/C recibieron inyección de 1x106 células A431 NS. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de aproximadamente 100 mm3 los tratamientos se iniciaron. Los ratones recibieron 17 inyecciones con anticuerpo. El primer tratamiento comenzó el día 8 y el último el día 34. El anticuerpo/composiciones se inyectaron a 0,5 mg/dosis o a 0,17 mg/dosis. Se muestran valores medios del volumen tumoral +/-ETM.

Figura 37: Inhibición de la proliferación de células A431 NS. El eje X muestra diferentes combinaciones representativas de 3 anticuerpos de la invención. El eje Y muestra la actividad metabólica como porcentaje de control no tratado (control). Se representan barras de error +/-ETM. Para detalles adicionales véase el Ejemplo 6.

Figura 38. Efecto inhibidor del crecimiento de dos dosis diferentes de la mezcla de 992+1024 en comparación con Erbitux en xenoinjertos tumorales humanos A431 NS. Ratones nu/nu BALB/c se inocularon con 106 células A431 NS. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 100 mm3 (día 8) los ratones se asignaron al azar en grupos de 9 y comenzó el tratamiento. Los anticuerpos indicados se inyectaron a 0,5 mg/dosis o a 1 mg/dosis, dos veces a la semana durante un total de 9 inyecciones. En el gráfico, el área en color gris claro indica el periodo de tratamiento. El inicio de una línea de puntos señala el momento en el cual el primer ratón de un grupo determinado se sometió a eutanasia debido a un tamaño tumoral excesivo. Las diferencias estadísticamente significativas entre 2 mg/semana de 992+1024 frente a 2 mg/semana de Erbitux y 1 mg/semana de 992+1024 frente a 2 mg/semana de Erbitux se calcularon todas el día 60 excepto el grupo de 992+1024 2 mg/semana. El tamaño tumoral de los animales excluidos antes del día 60 se realizó, por tanto, el gráfico muestra el volumen tumoral acumulado de todos los ratones en un grupo determinado. Se muestran los valores medios +/-ETM.

Figura 39. Representación gráfica Kaplan-Meyer de la supervivencia de los ratones tratados con la mezcla de anticuerpos 992+1024, Erbitux o anticuerpo de control (mismo experimento que el mostrado en la Figura 38). Los resultados se presentan como porcentaje de supervivencia de los ratones tratados. Se observó una diferencia significativa entre el porcentaje de supervivencia de los ratones en los grupos tratados con una dosis alta (2 mg/semana, P = 0,0008)) y una dosis baja (1 mg/semana, P = 0,0004) cuando se comparaba con 992+1024 y Erbitux. Además, una dosis baja de 992+1024 fue significativamente mejor cuando se comparó con una dosis alta de Erbitux (P = 0,0087). La diferencia estadística se calculó usando un ensayo de rango logarítmico (Mantel-Cox).

Figura 40: Análisis de reactividad cruzada de las IgG 992, 1024 y 1320 contra células CHO transfectadas con EGFR de longitud completa de Cinomolgo y de Humano mediante análisis FACS. El anticuerpo unido se detectó con un anticuerpo de cabra contra Fc F(ab’)2 de IgG de ser humano marcado con PE. La selección se realizó en células uniformes (propiedades SCC/FCS) que expresaban EGFR. La unión se expresó como % máximo de unión del anticuerpo a una concentración de 1 nM.

Figura 41: Alineamiento Clustalw2 de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables candidatas humanizadas (hu) y murinas (qui (quiméricas)) de las cadenas tanto pesada como ligera de 992 (A) y 1024 (B). Las regiones CDR, definidas por IMGT, se indican subrayadas; los huecos se presentan con (-), los aminoácidos idénticos con (*), las mutaciones conservativas con (:) y las semiconservativas con (.). El aminoácido en negrita indica posiciones de aminoácidos donde se realizarán retromutaciones en el resto murino identificado original si las variantes estructurales completamente humanas presentan afinidad de unión disminuida. Los números de secuencia ID son los siguientes: VH 992 humanizado (SEQ ID NO 104). VL 992 humanizado (SEQ ID NO 105). VH 1024 humanizado (SEQ ID NO 106). VL 1024 humanizado (SEQ ID NO 107). VH 992 quimérico (aa 3-124 de SEQ ID NO 40). VL 992 quimérico (aa 3-109 de SEQ ID No 72). VH 1024 quimérico (aa 3-120 de SEQ ID NO 41). VL 1024 quimérico (aa 3-114 de SEQ ID NO 73).

Figura 42A: Representación esquemática de los genes que codifican el dominio variable doble para 992L1024; IGHV 992L1024 (751 pb) se representa desde el sitio de restricción 5’ AscI seguido por IGHV 992, el enlazador ASTKGP, IGHV 1024 y terminación en el sitio de restricción 3’ XhoI, IGKV 992L1024 (1071 pb) se representa desde el sitio de restricción 5’ NheI seguido por IGKV 992, el enlazador TVAAP, IGKV 1024, IGKC y la terminación en el sitio de restricción 3’ NotI.

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Figura 42B: Representación esquemática de los genes que codifican el dominio variable doble de 1024L992; IGHV 1024L992 (751 pb) se representa desde el sitio de restricción AscI 5’ seguido por IGHV 1024, el enlazador ASTKGP, IGHV 992 y terminación en el sitio de restricción 3’ XhoI, IGKV 1024L992 (1071 pb) se representa desde el sitio de restricción 5’ NheI seguido por IGKV 1024, el enlazador TVAAP, IGKV 992, IGKC y terminación en el sitio de restricción 3‘ NotI.

Descripción detallada de la invención

Mezclas de anticuerpos

En el presente documento se describe una composición de anticuerpos que comprende moléculas de anticuerpo capaces de unirse a al menos tres epítopos de EGFR distintos, preferentemente tres epítopos de EGFR no solapantes. La naturaleza no solapante de los anticuerpos se determina preferentemente usando anticuerpos marcados de manera diferente en un análisis FACS con células que expresan EGFR o usando resonancia de plasmón superficial usando el antígeno EGFR capturado o conjugado con una superficie de célula de flujo. También pueden usarse métodos basados en ELISA como se describe en los ejemplos. Una composición que se une a tres epítopos de EGFR no solapantes puede usarse contra una amplia serie de tipos de cáncer dependiente de EGFR dado que puede ser menos vulnerable a diferencias en la conformación de EGFR y menos vulnerable a mutaciones en comparación con una composición de anticuerpos monoclonales que se dirige a uno o más epítopos. Adicionalmente, la composición de anticuerpos que se une a tres epítopos de EGFR no solapantes puede proporcionar una eficacia superior en comparación con una composición que se dirige a menos epítopos. En particular, la composición de anticuerpos puede proporcionar eficacia superior con respecto a la diferenciación terminal de células cancerosas in vivo. Figura 37 numerosos ejemplos de fuertes composiciones de anticuerpos que se unen a tres epítopos de hEGFR distintos ilustran la aplicabilidad general del concepto.

Para una terapia con anticuerpos monoclonales contra EGFR una determinada proporción de pacientes no responderá eficazmente al tratamiento con anticuerpos. Para algunos de los pacientes, esto puede deberse a la rápida eliminación del anticuerpo o debido a que el anticuerpo genera una respuesta inmunitaria en el paciente contra el anticuerpo. Para algunos pacientes, la ausencia de respuesta puede ser porque su cáncer dependiente de EGFR particular expresa EGFR en una conformación en la que el anticuerpo monoclonal no puede unirse a su epítopo. Esto podría deberse a diferencias en la glucosilación, debido a una deleción de dominio, o debido a mutaciones y/o SNP.

Además, para algunos cánceres, la estimulación autocrina del EGFR causada por la producción de ligandos de células cancerosas es importante, aunque en otros casos, el EGFR expresado por las células cancerosas no requiere estimulación de ligando. Para los últimos tipos de cáncer, un anticuerpo capaz de inhibir la unión con el ligando puede que no sea eficaz.

Una composición de anticuerpos en la que los anticuerpos pueden unirse al menos a tres epítopos distintos en EGFR será más ampliamente aplicable, dado que disminuye la probabilidad de que se cambien los tres epítopos en comparación con el epítopo (o epítopos) reconocido por los anticuerpos. Adicionalmente, la probabilidad de que el paciente elimine todos los anticuerpos es mucho más baja. Finalmente, los ejemplos muestran que en ensayos funcionales, una mezcla que comprende tres anticuerpos que se unen a epítopos distintos es superior a un anticuerpo monoclonal y a una mezcla que comprenda dos anticuerpos. La superioridad se ha mostrado más claramente en términos de inducción de diferenciación terminal de las células cancerosas usando tres anticuerpos de Dominio III con epítopos no solapantes. Dicha diferenciación terminal eficaz inducida por anticuerpos de las células cancerosas no se ha notificado anteriormente y representa una etapa significativa hacia adelante en el diseño eficaz de carcinoterapias basadas en anticuerpos. Resultados posteriores han mostrado que pueden obtenerse resultados similares o incluso superiores con una combinación particular de dos anticuerpos.

Para una eficacia clínica mejorada y una utilidad más general contra una amplia serie de tipos de cáncer dependientes de EGFR, el número de anticuerpos presente en la composición puede aumentarse. Por tanto, la composición puede comprender anticuerpos con capacidad para unirse a cuatro epítopos no solapantes. La composición puede comprender anticuerpos con capacidad para unirse a cinco epítopos no solapantes. La composición puede comprender anticuerpos con capacidad para unirse a seis epítopos no solapantes. Los ejemplos de la presente solicitud muestran que al menos seis anticuerpos distintos pueden unirse a la vez al EGFR (Ejemplo 3). Esto no excluye que sea posible, o incluso ventajoso, diseñar una composición que comprenda anticuerpos con capacidad para unirse a más de seis, tal como siete u ocho epítopos no solapantes, seleccionando cuidadosamente anticuerpos.

La composición puede comprender más de una molécula de anticuerpo que se una a un epítopo, tal como dos anticuerpos que se unen a epítopos diferentes aunque solapantes. Puede haber ventajas de incluir anticuerpos con epítopos solapantes ya que esto aumenta la probabilidad de que se una el epítopo. Una lógica detrás de esto es que el epítopo, en algunos pacientes y/o en algunas células cancerosas, puede cambiarse debido a cambios conformacionales o a mutaciones o a SNP (polimorfismos mononucleotídicos). Aunque esto pueda afectar a la unión de un anticuerpo, puede no afectar a la unión de otro anticuerpo que se una a un epítopo solapante. Asimismo,

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existe un riesgo de que los pacientes eliminen uno de los anticuerpos, dado que este se contempla como un antígeno. Incluyendo dos anticuerpos que se unan a epítopos diferentes aunque solapantes, la consecuencia de la eliminación de uno de los dos anticuerpos y la consecuencia de una mutación en un epítopo disminuye.

La composición puede comprender dos anticuerpos que se unen a diferentes epítopos aunque solapantes. La composición puede comprender dos moléculas de anticuerpo distintas que se unan al mismo epítopo. Los anticuerpos que se unen a los mismos epítopos o a epítopos solapantes pueden ser del mismo isotipo o de isotipo diferente.

Una composición de anticuerpos que comprende anticuerpos dirigidos contra tres epítopos no solapantes puede comprender por tanto cuatro, cinco o seis moléculas de anticuerpo distintas de tal manera que dos anticuerpos se unan a dos epítopos solapantes, o al mismo primer epítopo, que otros dos anticuerpos se unan a otros dos epítopos solapantes, o al mismo segundo epítopo y que dos anticuerpos se unan a otros dos epítopos solapantes o al mismo tercer epítopo. Por supuesto, la composición puede comprender más de dos, tal como tres o cuatro moléculas de anticuerpo que pueden unirse a epítopos solapantes o que pueden unirse al mismo epítopo. Por tanto, el número de anticuerpos total incluido en la composición puede ser de más de 6, teniendo más de un anticuerpo para cada epítopo o teniendo varios anticuerpos con epítopos solapantes. Manteniendo constante la dosificación total de anticuerpo, para cada anticuerpo adicional incluido en la composición, la concentración de cada anticuerpo disminuye. Por lo tanto, se espera que haya un límite con respecto al número de anticuerpos que pueda incluirse en una composición, manteniendo al mismo tiempo una eficacia aceptable. Basándose en observaciones de los estudios de unión con Resonancia de Plasmón Superficial y ensayos de proliferación y teniendo en cuenta los desafíos durante la fabricación, se espera poder obtener una ventaja adicional limitada (si la hubiera) aumentando el número de anticuerpos de 6 a 7, 8, 9, 10 o más. Por supuesto, esto no excluye que la composición comprenda más de 10 anticuerpos, tal como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 anticuerpos o más, tal como 25 anticuerpos o más, por ejemplo, 30 anticuerpos o más, tal como 40 anticuerpos o más, tal como 50 anticuerpos o más.

Aunque una composición de anticuerpos puede comprender anticuerpos que puedan unirse a al menos tres epítopos de EGFR no solapantes, también se han obtenido resultados superiores con combinaciones específicas de anticuerpos que pueden unirse a dos epítopos de EGFR no solapantes. Estas composiciones preferidas de “dos anticuerpos” se describen con más detalle más adelante junto con una guía que hace referencia a cómo diseñar composiciones de anticuerpos de la invención. Como resultado se ha obtenido que, comparando con la composición de tres anticuerpos que comprende los anticuerpos 992, 1030 y 1042, podría obtenerse una eficacia similar o incluso mejorada cuando se usa una composición solo con dos anticuerpos: 992 y 1024. Dado que los anticuerpos 1024 y 1042 pertenecen al mismo grupo, y por lo tanto tienen la misma especificidad de unión, en efecto, los resultados observados para la composición de tres anticuerpos, incluyendo el efecto sobre la diferenciación terminal, puede atribuirse a solo dos de las especificidades de unión (992 y 1024/1042) en la composición.

Adicionalmente al menos un anticuerpo en la composición se une a un epítopo de dominio III, más preferentemente la composición comprende al menos dos anticuerpos que se unen a epítopos de dominio III, y la composición también puede comprender tres anticuerpos que se unen a epítopos de dominio III.

La composición puede comprender al menos un anticuerpo con unión a un epítopo de dominio I y puede comprender al menos dos anticuerpos con unión a epítopos de dominio I.

La composición puede comprender al menos un anticuerpo con unión a un epítopo de dominio II y puede comprender anticuerpos con unión a dos epítopos de dominio II.

La composición también puede comprender un anticuerpo con unión a un epítopo de dominio I/II como se define en el presente documento.

La composición puede comprender un anticuerpo que puede unirse a un epítopo de dominio IV.

La composición puede comprender al menos una molécula de anticuerpo que puede inhibir la unión con EGF.

Adicionalmente, la composición puede comprender un anticuerpo capaz de prevenir la fosforilación de EGFR.

Adicionalmente la composición puede comprender un anticuerpo capaz de potenciar la internalización/degradación de EGFR.

La composición puede comprender al menos un anticuerpo de dominio III y al menos un anticuerpo de dominio I/II. Adicionalmente, la composición puede comprender al menos dos anticuerpos de dominio III y un anticuerpo de dominio I.

La composición puede comprender al menos dos anticuerpos de dominio III, tal como al menos tres anticuerpos de dominio III.

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También se ha mostrado que la superioridad de las mezclas de anticuerpos es mayor en ensayos de proliferación cuando se añaden al medio de crecimiento concentraciones fisiológicas de ligando (EGF) en comparación con cuando no se añade EGF (Figura 17). De acuerdo con la bibliografía (Hayashi y Sakamoto 1998 J Pharmacobiodyn 11; 146-51) el suero contiene aproximadamente de 1 a 1,8 ng/ml o de 0,2 a 0,3 nM de EGF aunque se indica que el jugo gástrico contiene 0,3 ng/ml (aprox. 0,05 nM) (Pessonen et al. 1987 Life Sci 40; 2489-94). En un entorno in vivo, el EGF y otros ligandos de EGFR están probablemente presentes y la capacidad de la mezcla de anticuerpos para que sea efectiva en presencia de ligando EGFR es por lo tanto una característica importante de las mezclas de anticuerpos de la presente invención.

Los anticuerpos de ratón/ser humano quiméricos proporcionan mejores resultados cuando se usan en combinación que cuando se usan en solitario. Esto se ilustra en diversos experimentos (véase, por ejemplo, el Ejemplo 6), en el que cuando los anticuerpos se ensayan en solitario solo muestran efectos antiproliferativos moderados en una línea celular de cáncer (A431-NS), pero cuando se usan en cualquier combinación, muestran resultados notablemente superiores. Estos resultados se han confirmado con numerosas combinaciones de los anticuerpos quiméricos de la presente invención. Se han obtenido resultados particularmente superiores con una composición que comprende los anticuerpos 992 y 1024.

Por ejemplo, en un ensayo de antiproliferación con A431-NS y HN-5, se han analizado diversos anticuerpos junto con cualquiera de los anticuerpos 992, 1208, 1254, y 1277.

Estudios de unión con receptores han mostrado que algunos anticuerpos pueden estimular realmente la unión de anticuerpos adicionales, de tal manera que un anticuerpo particular se une en mayores cantidades con el receptor después de la saturación del receptor con uno o varios anticuerpos. La unión del anticuerpo 992, dirigida contra el dominio III, se beneficia claramente de este efecto sinérgico obtenido por saturación previa del receptor con uno o más anticuerpos que se unen a epítopos no solapantes. Otro ejemplo de este efecto cooperativo se observa cuando el anticuerpo 1396, dirigido contra un epítopo desconocido, se ensaya contra EGFR saturado con anticuerpos que se unen a epítopos no solapantes.

Estudios de unión con receptores también han mostrado que es posible unir al menos 6 anticuerpos con el dominio extracelular de EGFR simultáneamente. Estos 6 anticuerpos representan 3 anticuerpos de dominio III, un anticuerpo de dominio I, un anticuerpo de dominio I/II y un anticuerpo que se une a un epítopo desconocido. Cabe destacar que, la unión de los tres anticuerpos de dominio III parece facilitar la unión posterior de anticuerpos adicionales. Esto confirma claramente el concepto de proporcionar composiciones de anticuerpos con diversos anticuerpos que se unan a epítopos distintos.

Cuando se diseña la composición de una composición de anticuerpos contra EGFR, los anticuerpos con epítopos no solapantes se usan preferentemente como estos proporcionando un efecto sinérgico superior.

También es preferible que al menos uno de los anticuerpos de la mezcla (cuando se ensaya en solitario) pueda inhibir la unión del ligando con EGFR, por ejemplo, pueda inhibir la unión con EGF y/o pueda inhibir la unión con TGFalfa y/o pueda inhibir la unión con la anfirregulina. El anticuerpo que puede inhibir la unión con EGF puede seleccionarse del grupo que consiste en los anticuerpos 992, 1030, 1024, 1042, 1208, 1254, 1277, 1284, 1320, y 1428, o del grupo que consiste en los anticuerpos 1208, 1260, 1277 y 1320.

Probablemente, es preferible que al menos un miembro de anticuerpo en la mezcla de anticuerpo pueda reducir la fosforilación de EGFR. Los ejemplos de anticuerpos con esta propiedad incluyen: 992, 1030, 1042, 1208, 1277 y 1320.

El dominio III de EGFR es de importancia para la unión del ligando con el receptor. Además, la unión del anticuerpo con el Dominio III puede estabilizar al EGFR en la conformación monomérica unida, que no conduce a la señalización del receptor. Por estas razones, la composición de anticuerpos debe contener al menos un anticuerpo con especificidad para el dominio III. Los anticuerpos de dominio III incluyen los anticuerpos 992, 1024, 1030, 1208, 1254, 1277 y 1320. Adicionalmente, el al menos un anticuerpo de dominio III puede seleccionarse del grupo que consiste en los anticuerpos 992, 1254, 1277, 1208 y 1320. La composición de anticuerpos puede comprender más de un anticuerpo de dominio III tal como al menos 3 anticuerpos de dominio III, por ejemplo al menos 4 anticuerpos de dominio III, tal como al menos 5 anticuerpos de dominio III, por ejemplo al menos 6 anticuerpos de dominio III.

Como se describe en el presente documento, la composición de anticuerpos puede comprender al menos un anticuerpo de dominio I. El al menos un anticuerpo de dominio I puede seleccionarse del grupo que consiste en los anticuerpos 1284, 1308, 1344 y 1347.

Como se describe en el presente documento, la composición de anticuerpos puede comprender al menos un anticuerpo de dominio I/II. El al menos un anticuerpo de dominio I/II puede seleccionarse del grupo que consiste en los anticuerpos 1257, 1260, 1261,1428 y 1434.

Las combinaciones específicas eficaces de dos anticuerpos descritos en el presente documento son: 17

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Anticuerpo 1280 junto con 1024, 1320, 1308, 1284, 1260 o 1030.

Anticuerpo 1254 junto con 1024, 1030, 1260, 1284, 1308 o 1320.

Anticuerpo 1277 junto con 1024, 1030, 1260, 1284, 1308 o 1320.

Anticuerpo 992 junto con 1030, 1260, 1284, 1308, 1320 o 1024.

Los ejemplos de mezclas superiores de dos anticuerpos incluyen 992+1024; 992+1320; 992+1042; 1277+1320; 1208+1320. Particularmente se prefiere 992+1024.

Las mezclas con tres anticuerpos incluyen: los anticuerpos 992+1030+1042; 992+1320+1024; 992+1024+1030; 1320+1284+1261; 1320+1214+1320; 992+1284+1320; 992+1255+1024; 992+1030+1320; 992+1024+1214; 992+1261+1320; 992+1024+1284; 992+1024+1211; 992+1024+1030; 1260+1214+1254; 992+1255+1320; 992+1211+1320; 992+1030+1261; 992+1260+1030; 992+1260+1320; 992+1030+1214.

Las mezclas con cuatro anticuerpos incluyen: los anticuerpos 992+1320+1024+1030; 992+1024+1030+1284; 1277+1320+1260+1347; 1277+1320+1261+1347; 1277+1320+1261+1284; 1254+1320+1260+1347; 1254+1320+1261+1347; 1254+1320+1261+1284; 1254+1024+1260+1347; 1254+1024+1261+1347; 1254+1024+1261+1284; 1277+1024+1260+1347; 1277+1024+1261+1347; 1277+1024+1261+1284.

Las mezclas con 5 anticuerpos incluyen: 992+1030+1024+1260+1347; 992+1030+1024+1261+1347; 992+1030+1024+1261+1284; 992+1030+1320+1260+1347; 992+1030+1320+1261+1347; 992+1030+1320+1261+1284;

Una mezcla con 8 anticuerpos incluye: 992+1030+1024+1277+1254+1320+1260+1261+1284+1347;

Adicionalmente, para poder realizar un estudio toxicológico en un primate no humano, es preferible que todos los anticuerpos de la composición se unan al EGFR de ser humano así como a al menos otro EGFR de primate, tal como EGFR de chimpancé, Macaca mulatta , mono Rhesus y otros monos, o mono cinomolgo. El mono cinomolgo es un animal relativamente pequeño, y muy bien adecuado para realizar estudios toxicológicos. Por lo tanto, el EGFR de primate adicional es preferentemente EGFR de mono cinomolgo. Preferentemente los anticuerpos se unen aproximadamente con la misma afinidad al EGFR de ser humano y al de primate no humano.

La presente divulgación ha mostrado resultados superiores en uno o más ensayos funcionales cuando se combinan 2, 3, 4, 5, 6, 7, y 8 anticuerpos en una composición. Aunque estos datos proporcionan una orientación sobre la selección del número de anticuerpos en la composición, de ninguna manera debe interpretarse de un modo limitante. La composición puede comprender más de 8 anticuerpos, aún cuando los datos experimentales solo muestren unión simultánea de 6 anticuerpos. Puede haber otras razones para incluir más de 6 anticuerpos en la composición, tal como, por ejemplo, diferencias en la tasa de eliminación de los miembros de anticuerpo.

Una característica adicional preferida de los anticuerpos de las composiciones es la homogeneidad de las proteínas, de tal manera que los anticuerpos pueden purificarse fácilmente. Para los miembros de anticuerpos individuales, se prefiere un perfil de cromatografía de intercambio iónico con un pico distinto para facilitar la caracterización. También se prefiere un perfil de cromatografía de intercambio iónico claro para facilitar la caracterización de la composición final de anticuerpos. También es preferible, cuando se combinan los anticuerpos, que puedan diferenciarse usando cromatografía de intercambio iónico, de tal manera que la composición con todos los anticuerpos pueda caracterizarse en un proceso.

Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen, tal como ser humano, murino, conejo, pollo, cerdo, llama, cabra. Los anticuerpos también pueden ser quiméricos, como se describe en los ejemplos, o pueden ser humanizados, superhumanizados o versiones remodeladas de los mismos usando métodos bien conocidos descritos en la técnica.

Una composición de anticuerpos preferida

Como se muestra en los ejemplos que se adjuntan, la composición contra EGFR basada en los anticuerpos 992 y 1024 tiene propiedades únicas y distintas. La unión del anticuerpo 992 está potenciada por la unión de otros anticuerpos que incluyen 1024. A diferencia de lo que ocurre con los anticuerpos comerciales, tanto 992 como 1024 se unen preferencialmente a epítopos conformacionales presentados en las células (Ejemplos 14 y 15). Los dos epítopos de 992 y 1024 se solapan con pero son distintos del epítopo o epítopos de Erbitux y Vectibix. A diferencia de diversas otras composiciones de dos anticuerpos en las que los anticuerpos individuales se unen a epítopos no solapantes, la composición basada en las especificidades de unión de los anticuerpos 992 y 1024 desencadena la internalización del receptor rápida y eficazmente. Un nuevo mecanismo de acción que implica la diferenciación terminal acompañada de expresión aumentada de involucrina y la aparición de perlas de queratina se observa en un modelo animal después de tratamiento con las composiciones de anticuerpos basadas en los anticuerpos 992 y 1024. Este mecanismo de acción exclusivo conduce a una inhibición del crecimiento más eficaz y prolongada in vitro

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X10 = D, E, N o Q; y

X11 = Y, o F;

y una CDRL3 descrita mediante la siguiente fórmula: CX1X2X3X4X5X6PX7TF en la que X1 a X7 se seleccionan

individualmente de los grupos de aminoácidos indicados a continuación:

X1 = A, G, o V;

X2 = Q o H;

X3 = N, Q o H;

X4 = L, I, M o V;

X5 = E, D, N o Q;

X6 = L, I, M o V; y

X7= Y, F, W o H.

Los anticuerpos con las CDR3 mutadas pueden prepararse usando técnicas convencionales y expresarse y ensayarse con respecto a su unión usando métodos descritos en el presente documento.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden ser quiméricos, humanos, humanizados, remodelados o superhumanizados. Esto puede realizarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos 992 y 1024 pueden humanizarse usado los métodos descritos en el Ejemplo 18. En el documento US 6.881.557 se describen métodos para la “superhumanización”.

La primera molécula de anticuerpo contra EGFR distinta se selecciona del grupo que consiste en el anticuerpo 992, un anticuerpo que comprende las secuencias VL y VH del anticuerpo 992, y un anticuerpo que tiene las CDR del anticuerpo 992; y dicha segunda molécula de anticuerpo contra EGFR distinta se selecciona del grupo que consiste en el anticuerpo 1024, un anticuerpo que comprende las secuencias VL y VH del anticuerpo 1024, y un anticuerpo que tiene las CDR del anticuerpo 1024.

Más preferentemente la composición comprende los anticuerpos 992 y 1024.

Como se describe, preferentemente, el primer y segundo anticuerpo contra EGFR, no inhiben entre sí la unión con el EGFR humano. Incluso más preferentemente, al menos uno de los anticuerpos tiene la capacidad de aumentar la capacidad de unión máxima del otro anticuerpo con respecto al EGFR humano. Este efecto se observa en los anticuerpos 992 y 1024 (Ejemplo 16).

La proporción entre los dos anticuerpos no tiene por qué ser exactamente una proporción de 1:1. Por consiguiente, la proporción del primer anticuerpo con respecto al segundo anticuerpo en la composición puede ser entre 5 y 95 %, tal como entre 10 y 90 %, preferentemente entre 20 y 80 %, más preferentemente entre 30 y 70, más preferentemente entre 40 y 60, tal como entre 45 y 55, tal como aproximadamente 50 %.

Preferentemente, el primer y segundo anticuerpo son del isotipo IgG1 o IgG2.

Los ejemplos de anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo 992 identificados por los autores de la presente invención son anticuerpos del grupo de anticuerpos que comprenden los clones 1209, 1204, 992, 996, 1033 y 1220.

Los ejemplos de anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo 1024 identificado por los autores de la presente invención son anticuerpos del grupo de anticuerpos que comprenden los clones 1031, 1036, 1042, 984, 1024, 1210, 1217, 1221 y 1218.

La CDR3 determina la especificidad de unión de los anticuerpos. Las secuencias CDR de los anticuerpos pueden encontrarse en la Tabla 12, ejemplo 17.

La competición de los anticuerpos con el anticuerpo 992 como se describe en el presente documento puede seleccionarse del grupo que consiste en los anticuerpos 1208, 1254, y 1277. Del mismo modo, la competición del anticuerpo con el anticuerpo 1024 puede seleccionarse del grupo que consiste en los anticuerpos 1042 y 1320.

En una realización, la composición no contiene anticuerpos adicionales además de dichos primer y segundo anticuerpo, más preferentemente no contiene más anticuerpos contra EGFR.

Cuando la composición comprende adicionalmente un tercer anticuerpo contra EGFR distinto, en el que dicha tercera molécula de anticuerpo contra EGFR distinto se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo 1030, un anticuerpo que comprende las secuencias VL (aminoácidos 3-113 de SEQ ID NO 74) y VH (aminoácidos 3-120 de SEQ ID NO 42) del anticuerpo 1030, un anticuerpo que tiene las CDR3 del anticuerpo 1030 (SEQ ID NO 112 y 119), un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 1030, y un anticuerpo capaz de inhibir la unión del anticuerpo 1030 con EGFR humano. Dicho tercer anticuerpo da, preferentemente, como resultado una unión potenciada al EGFR humano de dicho primer y/o segundo anticuerpo. En una realización, la composición no

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Aislamiento y selección de pares que codifican la cadena ligera variable y cadena pesada variable

El proceso para la generación de una composición de anticuerpos recombinantes contra EGFR implica el aislamiento de secuencias que codifican las cadenas pesada variable (VH) y ligera variable (VL) de una fuente adecuada, generando de este modo un repertorio de pares codificantes VH y VL. Generalmente, una fuente adecuada para obtener secuencias codificantes VH y VL son fracciones de células que contienen linfocitos tales como muestras de sangre, bazo o médula ósea de un animal no humano inmunizado/vacunado con un polipéptido o péptido de EGFR humano o con proteínas de EGFR procedentes de una célula que expresa el EGFR humano o con células que expresan EGFR humano o fracciones de dichas células. Preferentemente, las fracciones que contienen linfocitos se extraen de mamíferos no humanos o de animales transgénicos con genes de inmunoglobulina humana. La fracción celular que contiene los linfocitos recogidos puede enriquecerse adicionalmente para obtener una población de linfocitos particular, por ejemplo, células de la estirpe de linfocitos B. Preferentemente, el enriquecimiento se realiza usando separación celular con perlas magnéticas (MACS) y/o separación celular activada con fluorescencia (FACS), aprovechando proteínas marcadoras de la superficie celular específicas de estirpe, por ejemplo, células B, blastos plasmáticos y/o células plasmáticas. Preferentemente, la fracción celular que contiene linfocitos se enriquece o separa con respecto a células B, blastos plasmáticos y/o células plasmáticas. Incluso más preferentemente, las células con alta expresión de CD43 y CD138 se aíslan del bazo o sangre. Estas células a veces se denominan células plasmáticas circulantes, células plasmáticas tempranas o blastos plasmáticos. Para simplificar, en el presente documento reciben solo el nombre de células plasmáticas, aunque pueden usarse indistintamente otros términos.

El aislamiento de secuencias codificantes VH y VL puede realizarse de una forma clásica, en la que las secuencias codificantes VH y VL se combinan al azar en un vector para generar una biblioteca combinatoria de pares de secuencias que codifican VH y VL. Sin embargo, en el presente documento, se prefiere reflejar la diversidad, la afinidad y la especificidad de los anticuerpos producidos en una respuesta inmunitaria humoral después de inmunización con EGFR. Esto implica el mantenimiento del emparejamiento de VH y VL originalmente presente en el donante, generando de este modo un repertorio de pares de secuencias en el que cada par codifica una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) correspondiente a un par VH y VL presente en un principio en un anticuerpo producido por el donante a partir del cual se aíslan las secuencias. Este también se denomina par homólogo de secuencias codificantes VH y VL y el anticuerpo se denomina anticuerpo homólogo. Preferentemente, los pares codificantes VH y VL, combinatorios u homólogos, se obtienen de ratones donantes, y por lo tanto las secuencias son murinas.

Hay varias estrategias diferentes para la generación de pares homólogos de secuencias codificantes VH y VL, una estrategia implica la amplificación y el aislamiento de secuencias codificantes VH y VL de células sencillas separadas de una fracción celular que contiene linfocitos. Para obtener un repertorio de pares de secuencias codificantes de VH y VL que se asemejen a la diversidad de pares de secuencias VH y VL en el donante, se prefiere un método de alto rendimiento con una pequeña transposición (combinación al azar) de los pares VH y VL según sea posible, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2005/042774.

Las secuencias codificantes VH y VL pueden amplificarse individualmente y emparejarse en una segunda etapa o pueden emparejarse durante la amplificación (Coronella et al. 2000. Nucleic Acids Res. 28: E85; Babcook et al 1996. PNAS 93: 7843-7848 y documento WO 2005/042774). Una segunda estrategia implica la amplificación en células y el emparejamiento de las secuencias codificantes VH y VL (Embleton et al 1992 Nucleic Acids Res. 20: 3831-3837; Chapal et al 1997. BioTechniques 23: 518-524). Una tercera estrategia es el método de anticuerpos con linfocitos seleccionados (SLAM; del inglés, selected lymphocyte antibody method) que combina un ensayo de placa hemolítica con clonación de ADNc de VH y VL (Babcook et al. 1996. PNAS 93: 7843-7848). Otro método que puede usarse con ratones es la técnica convencional de hibridoma, seguido por exploración y selección de candidatos líder y posterior clonación de los anticuerpos codificados.

En una realización preferida de la presente invención se genera un repertorio de pares codificantes VH y VL, en el que los pares de miembros reflejan los pares de genes responsables de la respuesta inmunitaria humoral resultante de una inmunización con EGFR, de acuerdo con un método que comprende las etapas de i) proporcionar una fracción celular que contenga linfocitos de un animal donante inmunizado con EGFR humano; ii) opcionalmente enriquecer células B o células plasmáticas de dicha fracción de células; iii) obtener una población de células sencillas aisladas, que comprende distribuir células de dicha fracción celular individualmente en una pluralidad de recipientes; iv) amplificar y efectuar la unión de los pares codificantes VH y VL, en un procedimiento de PCR en tiempo real de extensión solapante múltiple, usando un molde procedente de dichas células sencillas aisladas y v) opcionalmente realizar una PCR anidada de los pares codificantes VH y VL unidos. Preferentemente, los pares codificantes VH y VL homólogos aislados se someten a un procedimiento de exploración como se describe más adelante.

Una vez generados los pares de secuencias VH y VL, se realiza un procedimiento de exploración para identificar secuencias que codifican los pares VH y VL con reactividad de unión hacia un antígeno asociado con EGFR. Preferentemente, el antígeno asociado con EGFR comprende una parte extracelular de EGFR tal como el dominio III, II, I y/o IV, fragmentos de los dominios o el dominio extracelular completo. Otros antígenos incluyen mutantes

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tales como mutantes de deleción de EGFR o SNP, o fragmentos de los mismos. Si los pares de secuencias VH y VL son combinatorios, puede aplicarse un procedimiento de presentación en fagos para enriquecer los pares VH y VL que codifican los fragmentos de anticuerpo de unión a EGFR antes de la exploración.

Para reflejar la diversidad, la afinidad y la especificidad de los anticuerpos producidos en una respuesta inmunitaria humoral después de inmunización con EGFR, en el presente documento se describe un procedimiento de exploración para los pares homólogos, para obtener la diversidad más amplia posible. Con el fin de explorar, el repertorio de pares codificantes VH y VL homólogos se expresa individualmente como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo scFv o Fab) o como anticuerpos de longitud completa usando un vector de exploración bacteriano o de mamíferos transfectado en una célula hospedadora adecuada. El repertorio de Fab/anticuerpos puede explorarse sin limitación – para determinar la reactividad contra EGFR, para determinar la actividad antiproliferativa contra una línea de células de cáncer que exprese EGFR y para determinar la capacidad de inhibir la unión del ligando (por ejemplo EGF) con EGFR, para determinar la inhibición de la fosforilación, la inducción de la apoptosis, la internalización de EGFR.

En paralelo, el repertorio de los Fab/anticuerpos se explora contra antígenos seleccionados, tales como péptidos de EGFR de ser humano y opcionalmente de mono cinomolgo o chimpancé o mono rhesus. Los péptidos antigénicos pueden seleccionarse, por ejemplo, del dominio extracelular de EGFR humano, del domino extracelular de EGFR mutante humano y del dominio extracelular de EGFR de cinomolgo o fragmentos de los mismos. Los péptidos pueden biotinilarse para facilitar la inmovilización en perlas o placas durante la exploración. También pueden utilizarse medios de inmovilización alternativos. Los antígenos se seleccionan basándose en el conocimiento de la biología de EGFR y posiblemente pueden proporcionarse anticuerpos con efectos protectores y/o neutralizantes esperados capaces de unirse a estos antígenos. Este procedimiento de exploración puede aplicarse del mismo modo a una biblioteca combinatoria de presentación en fagos.

Las proteínas de EGFR recombinante usadas para explorar pueden expresarse en bacterias, en células de insecto, en células de mamífero o en otro sistema de expresión adecuado. Para el correcto procesamiento (incluyendo la glucosilación) las proteínas se expresan en células de mamífero. La proteína EGFR-ECD puede expresarse como una proteína soluble (sin la región transmembrana e intracelular) o puede fusionarse a una tercera proteína, para aumentar la estabilidad. Si la proteína EGFR se expresa con una etiqueta de fusión, el compañero de fusión puede escindirse antes de la exploración. Además de la exploración primaria descrita anteriormente, puede realizarse una exploración secundaria, para garantizar que ninguna de las secuencias seleccionadas codifican positivos falsos.

Generalmente, los ensayos inmunológicos son adecuados para la exploración descrita en el presente documento. Dichos ensayos son muy conocidos en la técnica y constituyen, por ejemplo, ensayos de ELISPOT, ELISA, FLISA y de membrana (por ejemplo, transferencias Western), micromatrices en filtros y FACS. Los ensayos pueden realizarse sin ninguna etapa de enriquecimiento previa, utilizando polipéptidos producidos a partir de las secuencias que codifican los pares VH y VL. En el caso de que el repertorio de los pares codificantes VH y VL sean pares homólogos, no se requiere enriquecimiento mediante, por ejemplo, presentación en fagos antes de la exploración. Sin embargo, en la exploración de bibliotecas combinatorias, los inmunoensayos se realizan preferentemente en combinación con o después de métodos de enriquecimiento tales como presentación en fagos, presentación en ribosomas, presentación en superficies bacterianas, presentación en levaduras, presentación en virus de eucariotas, presentación de ARN o presentación covalente (revisado en FitzGerald, K., 2000. Drug Discov. Today 5, 253-258).

Las secuencias que codifican los pares VH y VL seleccionadas en la exploración, se someten generalmente a secuenciación y se analizan con respecto a la diversidad de las regiones variables. En particular la diversidad de las regiones CDR es de interés, pero también es de interés la representación de la familia VH y VL. Basándose en estos análisis, se seleccionan secuencias que codifican los pares VH y VL que representan la diversidad global de los anticuerpos de unión a EGFR aislados de uno o más animales donantes. Preferentemente, se seleccionan secuencias con diferencias en todas las regiones CDR (CDRH1, CDRH2, CDRH3 y CDRL1, CDRL2 y CDRL3). Si hay secuencias con una o más regiones CDR idénticas o muy similares que pertenecen a familias diferentes de VH o VL, también se seleccionan. Preferentemente, al menos la región CDR3 de la cadena pesada variable (CDRH3) se diferencia entre los pares de secuencias seleccionados. Posiblemente, la selección de pares de secuencias VH y VL puede basarse solemnemente en la variabilidad de la región CDRH3. Durante el cebado y amplificación de las secuencias, pueden producirse mutaciones en las regiones marco conservadas de la región variable, en particular en la primera región marco conservada. Preferentemente, los errores que se producen en la primera región marco conservada se corrigen para garantizar que las secuencias corresponden completamente, o al menos, a un 98 % con respecto a las del origen de la línea germinal, por ejemplo, de tal manera que las secuencias VH y VL sean completamente murinas.

Cuando se garantiza que la diversidad global del conjunto de secuencias seleccionadas que codifican los pares de VH y VL es altamente representativa de la diversidad observada a nivel genético en una respuesta humoral contra una inmunización con EGFR, se espera que la especificidad global de los anticuerpos expresados a partir de un conjunto de pares codificantes de VH y VL seleccionados también sea representativa con respecto a la especificidad de los anticuerpos producidos en los animales inmunizados con EGFR. Una indicación de si la especificidad de los anticuerpos expresados a partir de un conjunto de pares codificantes de VH y VL seleccionados es representativa de

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Preferentemente se utilizan células de mamífero, tales como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0 o NS0), fibroblastos tales como NIH 3T3 y células humanas inmortalizadas, tales como células HeLa, células HEK 293 o PER.C6. Sin embargo, también pueden emplearse células eucariotas que no son de mamífero o procariotas, tales como células vegetales, células de insecto, células de levadura, hongos, E. coli, etc. Una célula hospedadora adecuada comprende uno o más sitios de reconocimiento de recombinasa adecuados en su genoma. La célula hospedadora también debe contener un modo de selección que esté unido operativamente al sitio de integración, para poder seleccionar integrantes (es decir, células que tienen una copia integrada de un vector de expresión o fragmento de un vector de expresión del Ab contra EGFR en el sitio de integración). La preparación de células que tienen un sitio FRT en una localización predeterminada en el genoma se describió, por ejemplo, en el documento US 5.677.177. Preferentemente, una célula hospedadora tiene únicamente solo un sitio de integración, que se localiza en un sitio que permite una alta expresión del integrante (un denominado punto caliente).

Un vector de expresión adecuado comprende un sitio de reconocimiento de recombinación que coincide con uno o más sitios de reconocimiento de recombinasa de la célula hospedadora. Preferentemente el sitio de reconocimiento de recombinasa está ligado a un gen de selección adecuado diferente del gen de selección usado para la construcción de la célula hospedadora. En la técnica se conocen bien genes de selección, y se incluyen, el gen de la glutamina sintetasa (GS), el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) y el de la neomicina, pudiendo la GS o la DHFR usarse para la amplificación génica de la secuencia VH y VL insertada. El vector también puede contener dos sitios de reconocimiento de recombinasa diferentes para permitir el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE, del inglés Recombinase-Mediated Cassette Exchange) de la secuencia codificante del anticuerpo en lugar de la integración completa del vector. El RMCE se describe en Langer et al 2002; Schlake y Bode 1994. En la técnica se conocen bien sitios de reconocimiento de recombinasa adecuados, e incluyen sitios FRT, lox y attP/attB. Preferentemente, el vector de integración es un vector que codifica un isotipo, en el que las regiones constantes (que incluyen preferentemente intrones) están presentes en el vector antes de transferir el par codificante VH y VL desde el vector de exploración (o las regiones constantes ya están presentes en el vector de exploración si dicha exploración se realiza sobre anticuerpos de longitud completa). Las regiones constantes presentes en el vector pueden ser la región constante de cadena pesada entera (CH1 a CH3 o a CH4) o la región constante que codifica la parte Fc del anticuerpo (CH2 a CH3 o a CH4). La región constante Kappa o Lambda de cadena ligera también puede estar presente antes de la transferencia. La elección del número de regiones constantes presentes, si hubiera, depende del sistema de exploración y de transferencia que se utilice. Las regiones constantes de cadena pesada pueden seleccionarse de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD e IgE. Los isotipos preferidos son IgG1, IgG2 y/o IgG3. Adicionalmente, el vector de expresión para la integración específica de sitio del ácido nucleico que codifica el anticuerpo contra EGFR contiene promotores adecuados o secuencias equivalentes que dirigen niveles de expresión altos de cada una de las cadenas VH y VL. La Figura 4 ilustra una posible forma para diseñar el vector de expresión, aunque son posibles numerosos diseños distintos.

La transferencia de los pares codificantes VH y VL seleccionados a partir del vector de exploración puede realizarse mediante escisión con enzimas de restricción convencionales y ligamiento, de tal manera que cada molécula de vector de expresión contiene un par codificante VH y VL. Preferentemente, los pares codificantes VH y VL se transfieren individualmente, sin embargo, si se desea, también pueden transferirse en masa. Cuando todos los pares codificantes VH y VL seleccionados se transfieren al vector de expresión, se obtiene una colección o una biblioteca de vectores de expresión. Si se desea, también pueden usarse formas de transferencia alternativas. Si el vector de exploración es idéntico al vector de expresión, la biblioteca de vectores de expresión está constituida por los pares de secuencias VH y VL seleccionados durante la exploración, que están situados en el vector de exploración/expresión.

En la técnica se conocen métodos de transfección de una secuencia de ácido nucleico en una célula hospedadora. Para garantizar la integración específica de sitio, también debe proporcionarse una recombinasa adecuada a la célula hospedadora. Esto se realiza preferentemente por cotransfección de un plásmido que codifica la recombinasa. Son recombinasas adecuadas, por ejemplo, Flp, Cre o la integrasa del fago ΦC31, usadas junto con un sistema de célula hospedadora/vector con los sitios de reconocimiento de recombinasa correspondientes. La célula hospedadora puede transfectarse en masa, lo que significa que la biblioteca de vectores de expresión se transfecta en la línea celular en una sola reacción obteniendo de este modo una línea celular policlonal. Como alternativa, la colección de vectores de expresión puede transfectarse individualmente en la célula hospedadora, generando de este modo una colección de líneas celulares individuales (cada línea celular produce un anticuerpo con una especificidad particular). Las líneas celulares generadas después de la transfección (individual o policlonal) se seleccionan después para integrantes específicos de sitio, y se adaptan para el crecimiento en suspensión y en medios aséricos, si aún no tienen estas propiedades antes de la transfección. Si la transfección se realiza individualmente, las líneas celulares individuales se analizan adicionalmente con respecto a sus propiedades de crecimiento y producción de anticuerpos. Preferentemente, se seleccionan líneas celulares con tasas de proliferación y niveles de expresión de anticuerpos similares para la generación de la línea celular policlonal. La línea celular policlonal se genera después mezclando las líneas celulares individuales en una proporción predefinida. Generalmente, a partir de la línea celular policlonal, se establece un banco de células maestro policlonales (pMCB), un banco de células de investigación policlonales (pRCB) y/o un banco de células de trabajo policlonales (pWCB). La línea celular policlonal se genera mezclando las líneas celulares individuales en una proporción predefinida. La

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el plásmido se purificó mediante métodos convencionales. La secuencia VH se secuenció para verificar la corrección y el vector se sometió a digestión con NheI/NotI para prepararlo para la inserción de la cadena ligera.

En la segunda etapa, la cadena ligera completa se amplificó por PCR con un conjunto de cebadores que contenía la

5 secuencia correspondiente a la del clon de interés originado a partir del gen de VL, corrigiendo de este modo cualquiera de las mutaciones introducidas por cebado en cruzado. El fragmento PCR se sometió a digestión con NheI/NotI y se ligó en el vector que contenía VH preparado anteriormente. El producto de ligamiento se amplificó en

E. coli y el plásmido se purificó mediante métodos convencionales. Posteriormente, la cadena ligera se secuenció para verificar la corrección.

10 En el caso en el que la región constante Kappa de un clon seleccionado contenga mutaciones, introducidas durante la amplificación de los genes, esta se reemplaza por una región constante no mutada. Esto se realiza en una PCR solapante en la que el gen VL reparado (amplificado sin la región constante) se fusionó con una región constante con secuencia corregida (obtenida en una PCR distinta). La secuencia entera se amplificó y se clonó en el vector que

15 contenía VH como se ha descrito anteriormente y en la cadena ligera reparada se secuenció para verificar la corrección.

Tabla 2 Programas de inmunización usados para generar material de partida para la clonación contra EGFR

Programa, Grupo de ratones

Cepa Inyección 1 Inyección 2 Inyección 3 Inyección 4 Finalización

101

Balb/c Día 1, 25 μg de rhEGFR (R&D systems 1095-ER) CFA s.c. Día 35, 25 μg de rhGH-EGFR (Symphogen) IFA s.c Día 56, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) IFA s.c Día 70, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) IFA s.c Día 73

108

Balb/c Día 1, 1x107 células HN5 CFA i.p. Día 28, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) IFA s.c. Día 42, 1x107 células HN5 IFA i.p. Día 56, 25 μg de rhEGFR*, (Symphogen) IFA s.c. Día 59

109

Balb/c Día 1, 1x107 células HN5, CFA i.p. Día 28, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) IFA s.c. Día 42, 1x107 células HN5 IFA i.p. Día 56, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) PBS i.v. Día 59

111

Balb/c Día 1, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) CFA s.c. Día 28, 25 μg de rhEGFR+ rhEGFRvIII** (Symphogen) IFA s.c. Día 42, 25 μg de rhEGFR+ rhEGFRvIII** (Symphogen) IFA s.c. Día 56, 25 μg de rhEGFR+ rhEGFRvIII** (Symphogen) IFA s.c. Día 59

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Balb/c Día 1, 1x107 células HN5 CFA i.p. Día 29, 100 μg de rhGH-EGFR (Symphogen) IFA s.c. Día 44, 1x107 células HN5 IFA i.p. Día 58, 25 μg de rhEGFR, (Sigma E3641) IFA s.c. Día 61

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C57B Día 1, 1x107 células HN5 CFA i.p. Día 29, 100 μg de rhGH-EGFR (Symphogen) IFA s.c. Día 44, 1x107 células HN5 IFA i.p. Día 58, 25 μg de rhEGFR, (Sigma E3641) IFA s.c. Día 61

Tabla 3 Mezcla de cebadores de extensión para RT-PCR de solapamiento Multiplex

Nombre del cebador

Conc. (nM) Secuencia SEQ ID

mHCre

0,2 GACSGATGGGCCCTTGGTGG 1

mKapp

0,2 GCTGTAGGTGCTGTCTTTGC 2

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mVH

mVH A

0,04 TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTCCARCTGCARCAGYCTG 3

mVH B

0,04 TATTCCCATGGCGCGCCGARGTGMAGCTKGTKGAGTC 4

mVH C

0,04 TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTGCAGCTKMAGGAGTC 5

mVH 8

0,04 TATTCCCATGGCGCGCCCAGGTTACTCTGAAAGAGTC 6

mVH 9

0,04 TATTCCCATGGCGCGCCCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTG 7

mVK

mVK D

0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAYATCCAGATGACHCARWCT 8

mVK E

0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCRACATTGTGMTGACHCAGTC 9

mVK F

0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCSAMATTGTKCTSACCCARTCTC 10

mVK 1

0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGATRTTGTGATGACBCARRCT 11

W=A/T, R=A/G, S=G/C, Y=C/T, K=G/T, M=A/C, H=ACT, B=GCT; Conc. -concentración final.

Tabla 4 Conjunto de cebadores anidados

Nombre del cebador

Conc. (nM) Secuencia SEQ ID

mHCrev

0,2 GGACAGGGMTCCAKAGTTCCADKT 16

hmJK

hmJK1

0,2 GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCAGCTTGGTG 17

hmJK2

0,2 GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTTATTTCCAGCTTGGTC 18

hmJK4

0,2 GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTTATTTCCAACTTTGTC 19

hmJK5

0,2 GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTC 20

K=G/T, M=A/C, D=AGT; Conc. -concentración final.

Tabla 5 Conjunto de cebadores de corte y empalme de la cadena kappa constante

Cebador

Conc. (nM) Secuencia SEQ ID

Amplificación de la cadena constante kappa humana

hKCforwv2

0,2 GAACTGTGGCTGCACCATCTGTC 21

Kappa3’

0,2 ACCGCCTCCACCGGCGGCCGCTTATTAACACTCTCCCCTGTTG 22

Corte y empalme por extensión solapante

mhKCrev

0,2 ACCGCCTCCACCGGCGGCCGCTTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT 23

conjunto mJH

mJH1

0,2 GGAGGCGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC 12

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SEQ NO

ID Nombre cebador del Secuencia

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1024H_O3’ CGGGGCCCTTGGTGCTGGCTGACGAGACGGTGACTGAG

130

992H_O5’ GCCAGCACCAAGGGCCCCGAGGTCCAACTGCAGCAAC

131

992K_O3’ GTCTGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCAGCTTGGTG

132

1024K_O5’ CGAACTGTGGCTGCACCAGACATCGTGATGACACAAGC

133

1024K_O3’ GTCTGGTGCAGCCACAGTTCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCC

134

992K_O5’ CGAACTGTGGCTGCACCAGACATTCAGATGACTCAGACTAC

Tabla 14 Combinaciones de cebadores y moldes para la 1ª etapa de la PCR para construir genes que codifican DVD de 992 y 1024

DVD

Moldes para la PCR Cebadores para la amplificación del gen IGHV Cebadores para la amplificación del gen IGKV

1ª etapa de PCR

1er producto de PCR (tamaño en pb) 1ª etapa de PCR 1er producto de PCR (tamaño en pb)

992L1024

992 992_5’VH 92H_O3’ 992HO (406 pb) 992_5’VK 992K_O3’ 992KO (359 pb)

1024

1024H_O5’ 3’JH HO1024 (381 pb) 1024K_O5’ Kappa3’ KO1024* (702 pb)

1024L992

992 992H_O5’ 3’JH HO992 (393 pb) 992K_O5’ Kappa3’ KO992 (687 pb)

1024

1024_5’VH 1024H_O3’ 1024HO (392 pb) 1024_5’VK 1024K_O3’ 1024KO* (374 pb)

*La secuencia codificante amplificada incluye el gen IGKC

Tabla 15 Combinaciones de cebadores y moldes para la 2ª etapa de la PCR, corte y empalme mediante extensión solapante, para construir genes que codifican DVD de 992 y 1024

IGHV

IGKV

DVD

Moldes Cebadores Producto (pb) Moldes Cebadores Producto (pb)

992L1024

992HO 992_5’VH 766 992KO 992_5’VK 1040

HO1024

3’JH KO1024 Kappa3’

1024L992

HO992 1024_5’VH 766 KO992 1024_5’VK 1040

1024HO

3’JH 1024KO Kappa3’

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Claims (1)

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