BRPI0815370B1

BRPI0815370B1 - anticorpos humanos de alta afinidade contra o fator de crescimento neural humano e seu uso, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, método para produção de um anticorpo anti-ngf humano e composiçao farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0815370B1
Application number: BRPI0815370-1A
Authority: BR
Inventors: Joel C. Reinhardt; Lynn MacDonald; Richard Torres; Marc R. Morra; Joel H. Martin
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2007-08-10
Filing date: 2008-08-08
Publication date: 2020-10-20
Also published as: ZA201000725B; RU2010108525A; KR20150125735A; AU2008287037A1; EP2572729A2; IL203558A; ME02239B; BRPI0815370B8; NI201000021A; EP2572729A3; CY1116072T1; KR101709495B1; MY161564A; NZ583200A; RU2473564C2; US20110256587A1; SI2187964T1; US20120164688A1; WO2009023540A1; MA31695B1

Abstract

ANTICORPOS HUMANOS DE ALTA AFINIDADE CONTRA O FATOR DE CRESCIMENTO NEURAL HUMANO E SEU USO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-NGF HUMANO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A invenção refere-se a um anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que especificamente se liga ao fator de crescimento neural humano (NGF) com KD de 5 pM ou menos, não reage cruzadamente com a neurotrofina-3 (NT-3), e liga-se a NGF humano com um KD de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 vezes superior do que o anticorpo ou fragmento se liga ao NGF de rato e de camundongo. Os anticorpos são úteis no tratamento de dor, incluindo dor inflamatória, dor de incisão pós-operatória, dor neuropática, dor de fratura, dor de fratura osteoporótica, nevralgia pós-herpética, osteoartrite, artrite reumatoide, dor de câncer, dor resultante de queimaduras, dor de gota articular, bem como doenças, tais como carcinoma hepatocelular, câncer de mama e cirrose hepática.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos humanos e fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos humanos que especificamente se ligam ao fator de crescimento neural humano (NGF), e métodos terapêuticos de uso daqueles anticorpos.

Exposição da Técnica Relacionada

[0002] O fator de crescimento neural (NGF) foi a primeira neurotrofina a ser identificada, e o seu papel no desenvolvimento e sobrevivência tanto de neurônios periféricos como centrais foi bem caracterizado. Mostrou-se que NGF é um fator de manutenção e sobrevivência crítico no desenvolvimento de neurônios sensoriais simpáticos e embrionários periféricos e dos neurônios colinérgicos da base do prosencéfalo (Smeyne et al. (1994) Nature 368:246-249; Crowley et al. (1994) Cell 76:1001-1011). NGF regula para cima a expressão de neuropeptídeos em neurônios sensoriais (Lindsay et al. (1989) Nature 337:362-364) e sua atividade é mediada através de dois receptores ligados à membrana diferentes, o receptor de TrkA e o receptor de neurotrofina comum p75.

[0003] NGF é elevado no fluido sinovial em pacientes que sofrem de artrite reumatoide e outros tipos de artrite. Mostrou-se que antagonistas de NGF previnem a hiperalgesia e a alodinia em modelos animais de dor inflamatória crônica e neuropática.Anticorpos anti-NGF são descritos em, por exemplo, WO 01/78698, WO 02/096458, WO 2004/032870, publicações de Patente U.S. 2005/0074821, 2004/0237124, e 2004/0219144.

Breve Sumário da Invenção

[0004] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece anticorpos totalmente humanos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam ao fator de crescimento neural humano (NGF) com um KD de aproximadamente 5 pM ou menos e não reagem cruzadamente com a neurotrofina-3 (NT-3). Em uma modalidade preferencial, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo liga-se ao NGF humano com um KD de 1,0 pM ou menos. Estes anticorpos são caracterizados pela ligação a NGF com alta afinidade, alta especificidade e pela capacidade de neutralizar a atividade de NGF. Em modalidades preferenciais, o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se ao NGF humano aproximadamente 2 a 10 vezes superior a que NGF de rato e/ou NGF de camundongo.

[0005] Os anticorpos podem ser completos (por exemplo, um anticorpo lgG1 ou lgG4) ou podem compreender somente uma porção de ligação a antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab')2 ou scFv), e podem ser modificados para efetuar a funcionalidade, por exemplo, eliminar funções efetoras residuais (Glu que elimina funções efetoras residuais (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).

[0006] Em uma modalidade, a invenção compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) selecionada a partir do grupo das SEQ ID NOS:4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 104, 108, 112, 116, 132, 136, 140, 156, 160, 176, 180, 184, 200, 204, 208, 224, 228, 232, 236, 240, 256, 260, 264, 280, 284, 288, 304, 308, 312, 328, 332, 336, 352, 356, 360, 376, 380, 384, 400, 404, 420, 424, 440, 456, 460, 464, 480, 484, 488, 504, 508, 512, 528 e 532 ou uma sequência substancialmente similar a essas tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou de pelo menos 99%; mais preferencialmente, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreendem a HCVR mostrada na SEQ ID NO: 108, 100 ou 84; ainda mais preferencialmente, a HCVR compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 108.

[0007] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende ainda uma região variável de cadeia leve (LCVR) selecionada a partir do grupo das SEQ ID NOS:12, 28, 44, 60, 76, 92, 102, 106, 110, 114, 124, 134, 138, 148, 158, 168, 178, 182, 192, 202, 206, 216, 226, 230, 234, 238, 248, 258, 262, 272, 282, 286, 296, 306, 310, 320, 330, 334, 344, 354, 358, 368, 378, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 448, 458, 462, 472, 482, 486, 496, 506, 510, 520, 530, e 534, ou uma sequência substancialmente similar a essas tendo identidade de sequência pelo menos de 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou de pelo menos 99%. Em uma modalidade preferencial, a LCVR é a SEQ ID NO:110, 102 ou 92; ainda mais preferencialmente, a LCVR é a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:110.

[0008] Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um par de sequências HCVR e LCVR (HCVR/LCVR) selecionado a partir do grupo das SEQ ID NOS:4/12, 20/28, 36/44, 52/60, 68/76 , 84/92, 100/102, 104/106, 108/110, 112/114, 116/124, 132/134, 136/138, 140/148, 156/158, 160/168, 176/178, 180/182, 184/192, 200/202, 204/206, 208/216, 224/226, 228/230, 232/234, 236/238, 240/248, 256/258, 260/262, 264/272, 280/282, 284/286, 288/296, 304/306, 308/310, 312/320, 328/330, 332/334, 336/344, 352/354, 356/358, 360/368, 376/378, 380/382, 384/392, 400/402, 404/412, 420/422, 424/432, 440/448, 456/458, 460/462, 464/472, 480/482, 484/486, 488/496, 504/506, 508/510, 512/520, 528/530 e 532/534. Em uma modalidade preferencial, o par HCVR/LCVR é um das SEQ ID NO: 108/110, 100/102 ou 84/92; mais preferencialmente, SEQ ID NQ:108/110.

[0009] Em um segundo aspecto, a invenção caracteriza um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo compreendendo um domínio CDR3 da cadeia pesada (HCDR3) selecionado a partir das SEQ ID NOS:10, 26, 42, 58, 74, 90, 122, 146, 166, 190, 214, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 410, 430, 446, 470, 494 e 518, ou uma sequência substancialmente similar a essas tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou de pelo menos 99%; e um domínio CDR3 de cadeia leve (LCDR3) selecionado a partir de 18, 34, 50, 66, 82, 98, 130, 154, 174, 198, 222, 254, 278, 302, 326, 350, 374, 398, 418, 438, 454, 478, 502 e 526, ou sequências substancialmente similares a essas tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou de pelo menos 99%. Em uma modalidade preferencial, o par HCDR3/LCDR3 é de SEQ ID NO:90 e 98; 214 e 222; 410 e 418; 430 e 438; ou 446 e 454; mais preferencialmente, SEQ ID NQ:90 e 98.

[00010] Em uma modalidade adicional, a invenção compreendendo um anticorpo ou fragmento do mesmo compreende ainda um domínio CDR1 da cadeia pesada (HCDR1) selecionado a partir das SEQ ID NOS:6, 22, 38, 54, 70, 86, 118, 142, 162, 186, 210, 242, 266, 290, 314, 338, 362, 386, 406, 426, 442, 466, 490, e 514, ou uma sequência substancialmente similar a essas tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou de pelo menos 99%; um domínio CDR2 da cadeia pesada (HCDR2) selecionado a partir das SEQ ID NO:8, 24, 40, 56, 72, 88, 120, 144, 164, 188, 212, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388, 408, 428, 444, 468, 492 e 516 ou uma sequência substancialmente similar a essas tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou de pelo menos 99%; um domínio CDR1 da cadeia leve (LCDR1) selecionado a partir das SEQ ID NOS:14, 30, 46, 62, 78, 94, 126, 150, 170, 194, 218, 250, 274, 298, 322, 346, 370, 394, 414, 434, 450, 474, 498, e 522, ou uma sequência substancialmente similar a essas tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou de pelo menos 99%; e um domínio da cadeia leve CDR2 (LCDR2) selecionado a partir das SEQ ID NOS:16, 32, 48, 64, 80, 96, 128, 152, 172, 196, 220, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 416, 436, 452, 476, 500 e 524, ou uma sequência substancialmente similar a essas tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou de pelo menos 99%. Em uma modalidade preferencial, as sequências da cadeia pesada e leve das CDR SEQ ID NOS:86, 88, 90, 94, 96 e 98; 210, 212, 214, 218, 220 e 222; 406, 408, 410, 414, 416 e 418; 442, 444, 446, 450, 452 e 454; e 426, 428, 430, 434, 436 e 438; ainda mais preferencialmente, as sequências CDR são SEQ ID NOS:86, 88, 90, 94, 96 e 98.

[00011] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-NGF ou fragmentos dos mesmos. Vetores de expressão recombinante que transportam os ácidos nucleicos da invenção, e células hospedeiras nas quais tais vetores foram introduzidos, também são englobados pela invenção, já que são métodos de produção de anticorpos pelo cultivo das células hospedeiras sob condições que permitam a produção dos anticorpos, e recuperação dos anticorpos produzidos.

[00012] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo uma HCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir das SEQ ID NOS:3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 103, 107, 111, 115, 131, 135, 139, 155, 159, 175, 179, 183, 199, 203, 207, 223, 227, 231, 235, 239, 255, 259, 263, 279, 283, 287, 303, 307, 311, 327, 331, 335, 351, 355, 359, 375, 379, 383, 399, 403, 419, 423, 439, 455, 459, 463, 479, 483, 487, 503, 507, 511, 527 e 531, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo homologia de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% à mesma; mais preferencialmente, HCVR é codificada pela SEQ ID NO: 107 ou 99.

[00013] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende ainda uma LCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NO.H, 27, 43, 59, 75, 91, 101, 105, 109, 113, 123, 133, 137, 147, 157, 167, 177, 181, 191, 201, 205, 215, 225, 229, 233, 237, 247, 257, 261, 271, 281, 285, 295, 305, 309, 319, 329, 333, 343, 353, 357, 367, 377, 381, 391, 401, 411, 421, 431, 447, 457, 461, 471, 481, 485, 495, 505, 509, 519, 529 e 533, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo homologia de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% à mesma; preferencialmente, a LCVR é codificada pela SEQ ID NO: 109 ou 101.

[00014] Em uma modalidade, a invenção caracteriza um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo compreendendo um domínio HCDR3 codificado por uma sequência nucleotídica selecionada a partir das SEQ ID NOS:9, 25, 41, 57, 73, 89, 121, 145, 165, 189, 213, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 409, 429, 445, 469, 493 e 517, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo homologia de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% à mesma; e um domínio LCDR3 codificado por uma sequência nucleotídica selecionada a partir das SEQ ID NOS: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 129, 153, 173, 197, 221, 253, 277, 301, 325, 349, 373, 397, 417, 437, 453, 477, 501 e 525, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo homologia de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% à mesma. Em uma modalidade preferencial, as sequências de HCDR3 e LCDR3 são codificadas pelas SEQ ID NOS:89 e 97, respectivamente.

[00015] Em uma modalidade adicional, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende ainda, um domínio HCDR1 codificado por uma sequência nucleotídica selecionada a partir das SEQ ID NOS:5, 21, 37, 53, 69, 85, 117, 141, 161, 185, 209, 241, 265, 289, 313, 337, 361, 385, 405, 425, 441, 465, 489 e 513, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo homologia de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da mesma; um domínio HCDR2 codificado por uma sequência nucleotídica selecionada a partir das SEQ ID NOS:7, 23, 39, 55, 71, 87, 119, 143, 163, 187, 211, 243, 267, 291, 315, 339, 363, 387, 407, 427, 443, 467, 491 e 515, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo homologia de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% à mesma; um domínio LCDR1 codificado por uma sequência nucleotídica selecionada a partir das SEQ ID NOS: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 125, 149, 169, 193, 217, 249, 273, 297, 321, 345, 369, 393, 413, 433, 449, 473, 497 e 521, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo homologia de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% à mesma; e um domínio LCDR2 codificado por uma sequência nucleotídica selecionada a partir das SEQ ID NOS:15, 31, 47, 63, 79, 95, 127, 151, 171, 195, 219, 251, 275, 299, 323, 347, 371, 395, 415, 435, 451, 475, 499 e 523, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo homologia de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% à mesma. Em uma modalidade preferencial, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende sequências de CDR da cadeia pesada codificadas pelas SEQ ID NOS:85, 87, e 89; e sequências de CDR da cadeia leve codificadas pelas SEQ ID NOS:93, 95 e 97.

[00016] Em um quarto aspecto, a invenção caracteriza um anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que especificamente se liga ao NGF humano, compreendendo um HCDR3 ammoácido da fórmula X1 - x2 Xs C°mpreende uma sequência de ^-x -X -X5-X6-X7-X8-X9-XW.X11 °u Ser, X2 é Thr ou Lys X3X"G *18 (θEQ ID NO:537> em que X’ é Ala G'y. X6 é Val ou Trp X7 é Vai o θ Phβ °U Gly' é Val ou X’» é Phe ou Leu, Xn •é Gly’ X° * Asn ou ou ausente, x« é Tyr ou ausente X,= éV θ °" é Sβr θusente, X’7 é Asp ou ausenfe θ * isente, X’β é Met ou ∞mpreende uma sequência de aminoá H H * θ ° L∞R3 - X5 - X8 - X7 - Xθ X9 ÍSFO ,n K ° da formula X’ - x2 - x2 - X- Tyr, X< é Asn X5 é Aro X’ é Gln' *é Gln' X3 é Trp, e X9 é Thr. ASn’ é °U TrP' X? ‘ Pr°' X8 é Tyr ou

[00017] Em uma modalidade mak fragmento dn d especifica, o anticorpo ou 9 onto do mesmo compreenda aindo fórmula K _ X2 _ X3 _ X4 _ Y5 Y6 θ Uma Sequencia HCDR1 da é Gly, X2 é Phe X3 é Th " ' X7" X8 (SEQ '° NO:535)1 em 9ue X1 é Asp ou Glu \σ ' T r °U ASn’ X4 θ Phθ °U LeU’ X5θ Thr °U Asp’ X6 HCDR9 H e yr θu Leu, e X8 é Ser ou Ala; uma sequência θm que K P " ' ** (SEQ ID NO:536). Asn X8 A °" ’ X2 0 ASP °U Ser’ X3 é Pr° °u Trp’ X4 é θ'u ou um HCDR3 7 °" Ser' X6 ' Gly’ X? 6 Thr' GIU °U Sβr' Xβ é Thr °u "θ: X2 V3 omPrθθnde uma sequência de aminoácido da fórmula X1 xi7.l'X4-X5-X6-X7-xβ-x9-x’“-x"-xi2-xi3.xu.xl8.xlβ. (SEQ ID NO:537) em que X' é Ala ou Ser, X2 é Thr ou Lys, X8 ou Phe^' X4 θ Phe °U Gly' X5 ® Val °U Gly' Xδ é Val Ou Trp’ X7 é Val ou Phe’ Y,2e Thr °" Gly’ Xβ é ASn °U LyS' X10 é Phe ou Leu' X" é Asp x15 , _ θ Asn ou Ser’ x13 θ sθr ou ausente, X14 é Tyr ou ausente, X18 é V y 0U aUSente’ X16 ® Met ou ausente, X17 é Asp ou ausente, e X4 xs al °U aUSente’ Uma secluência LCDR1 da fórmula X1 - X2 - x3 - Thr 3" X6 (SEQ ID NO:538) em que X1 θ Gln ou Arg- X2 θ Ala- Ser ou Val ou lie, X4 é Arg ou Thr, X5 é Asn, Phe ou Tyr, e X6 é Asp PetÍÇSo 87020009138, d o ou Asn; uma sequência LCDR2 da fórmula X1 - X2 - x3 (SEQ |D NO:539) em que X1 é Gly ou Ala, X2 é Ala, e X3 é Ser ou Phe; e um LCDR3 compreende uma sequência de aminoácido da fórmula X1 - x2 - X3 - X4 - X5 - Xs- X7 - Xs - X9 (SEQ ID NO:540) em que X’ é Gin, X2 é Gin, X3 e Tyr, X4 é Asn, X5 é Arg ou Asn, X6 é Tyr ou Trp, X7 • Pro, X8 é Tyr ou Trp, eX9éThr.

[00018] Em um quinto aspecto, a invenção caracteriza um anticorpo totalmente humano ou fragmento de anticorpo que bloqueia a atividade de NGF com uma IC50 de menos de aproximadamente 10 nM, como medido no ensaio baseado na célula PC12 in vitro (descrito abaixo). Em uma modalidade preferencial, 0 anticorpo da invenção exibe uma IC50 de aproximadamente 500 pM ou menos; ainda mais preferencialmente, uma IC50 de aproximadamente 100 pM ou menos; aproximadamente 50 pM ou menos; ou aproximadamente 25 pM ou menos.

[00019] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo humano isolado, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga a NGF com um KD de menos do que aproximadamente 500 pM, preferencialmente menos do que aproximadamente 300 pM, ainda mais preferencialmente menos do que aproximadamente 100 pM, menos do que aproximadamente 50 pM, menos do que aproximadamente 20 pM; menos do que aproximadamente 10 pM, menos do que aproximadamente 5 pM, ou menos do que aproximadamente 1 pM, como determinado por ressonância de plasmônio de superfície (BIACORE®). Em uma modalidade preferencial, 0 anticorpo anti-NGF humano ou fragmento de anticorpo da invenção liga-se ao NGF humano com um KD de aproximadamente 0,5 pM ou menos. Em modalidades preferenciais, 0 anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se ao NGF humano com afinidade superior a 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes ou 10 vezes que a NGF de rato e superior a 1,5 vezes, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, ou 10 vezes superior ao NGF de camundongo.

[00020] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo ou fragmento do mesmo exibe alta especificidade para NGF humano, por exemplo, não reage cruzadamente com a neurotrofina-3 (NT-3) estreitamente relacionada. Dessa forma, em uma modalidade preferencial, o anticorpo de alta afinidade e alta seletividade ou fragmento do mesmo exibe um KD para NGF humano de 1,0 pM ou menos, inibe a ligação de NGF a receptores TrkA e p75, e não reage cruzadamente com NT- 3 humano, como medido pela ressonância de plasmônio de superfície. NT-3 desempenha um papel crítico em tais processos fisiológicos como, por exemplo, a coordenação neuronal motora muscular, e dessa forma, anticorpos ou fragmentos de anticorpo que não reagem cruzadamente com NT-3 fornecem uma vantagem clínica e terapêutica não esperada para anticorpos da técnica prévia. Foi mostrado que NT- 3 previne o desenvolvimento da hiperalgesia térmica no modelo CCI de dor neuropática (ver, por exemplo, Wilson-Gerwing et al. (2005) J Neuroscience 25:758-767). Mais recentemente, mostrou-se que NT-3 exógena reduz significativamente a expressão de dois canais de sódio que parecem desempenhar um papel na geração da dor neuropática (Wilson-Gerwing & Verge (2006) Neuroscience 141:2075-2085. Estes dados sugerem um papel benéfico de NT-3 na dor neuropática.

[00021] A invenção engloba anticorpos anti-NGF que têm um padrão de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo que necessita de uma porção fucose presente na cadeia oligossacarídica, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (ver Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, modificação da galactosilação pode ser feita para modificar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[00022] Em um sexto aspecto, a invenção caracteriza uma composição compreendendo um anticorpo humano recombinante ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a NGF e um veículo aceitável. Em um aspecto relacionado, a invenção caracteriza uma composição que é uma combinação de um inibidor de NGF e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o inibidor de NGF é um anticorpo ou fragmento do mesmo. Em uma modalidade preferencial, o segundo agente terapêutico é qualquer agente terapêutico adequado que seja vantajosamente combinado com um inibidor de NGF.

[00023] Em um sétimo aspecto, a invenção caracteriza métodos para inibir a atividade de NGF humano usando o anticorpo anti-NGF ou a porção de ligação a antígeno do anticorpo da invenção. O distúrbio tratado é qualquer doença ou condição que é melhorada, aliviada, inibida ou prevenida pela remoção, inibição ou redução da atividade de NGF. Mais especificamente, a invenção fornece um método de tratamento de uma condição ou doença mediada por NGF, tal como dor inflamatória, dor de incisão pós-operatória, síndrome de dor regional complexa, dor de câncer ósseo primário ou metastático, dor neuropática, dor de fratura, dor de fratura osteoporótica, dor resultante de queimadura, osteoporose, dor de gota articular, dores associadas com crises de célula falciforme, e outras dores nocicépticas, bem como carcinoma hepatocelular, câncer de mama e cirrose hepática, pela administração de um inibidor de NGF, tal como o anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção, como um agente único, ou com um segundo agente terapêutico. Em modalidades preferenciais de dor neuropática, referidas nevralgia do trigêmio, nevralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, fibromialgia, distrofia simpática reflexiva e condições de dor neurogênica são preferencialmente tratadas. O segundo agente terapêutico pode ser um inibidor de interleucina-1 (IL-1), por exemplo, uma proteína de fusão, tal como aquela descrita em US 6.927.044; ou um fármaco antiepiléptico, tal como gabapentaína, pregabalina, topiramato; ou um antidepressivo tricíclico, tal como amitriptilina; celecoxib; um antagonista de citocina, tal como uma proteína antagonista ou anticorpo contra IL-1, IL-6, IL-6R, IL-18 ou IL-18R. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é outra neurotrofina, por exemplo, NT-3.

[00024] Em um oitavo aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como descrito acima para o uso para atenuar ou inibir uma doença ou condição mediada por NGF em um ser humano. A condição ou doença mediada por NGF é inibida sem significante dano da coordenação motora, e é dor inflamatória, dor de incisão pós-operatória, dor neuropática, dor de fratura, dor de gota articular, nevralgia pós-herpética, dor resultante de queimaduras, dor de câncer, dor de osteoartrite ou artrite reumatoide, dor no nervo ciático, dor associada com crises de célula falciforme ou nevralgia pós- herpética.

[00025] Em um aspecto relacionado, a invenção fornece o uso de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo como descrito acima na produção de um medicamento para uso para atenuar ou inibir uma doença ou condição mediada por NGF em um ser humano.

[00026] Outros objetos e vantagens ficarão evidentes em uma revisão do seguinte relatório descritivo detalhado.

Relatório Descritivo Detalhado

[00027] Antes que os presentes métodos sejam descritos, deve ser entendido que esta invenção não é limitada a determinados métodos e condições experimentais descritos, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste pedido é com o objetivo de descrever modalidades particulares somente, e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações adicionadas.

[00028] A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que comumente entendido por um versado ordinário na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste pedido possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos preferenciais e materiais são descritos agora.

Definições

[00029] O termo "fator de crescimento neural humano" ou "NGF", como usado neste pedido, refere-se a NGF humano tendo a sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO:1 e a sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:2, ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo.

[00030] O termo "anticorpo", como usado neste pedido, pretende referir-se a moléculas de imunoglobulina compreendidas por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável da cadeia pesada (abreviada neste pedido como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável da cadeia leve (abreviada neste pedido como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é compreendida de um domínio CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), entremeadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões conservadas (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, arranjadas do amino-terminal ao carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[00031] O termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo" ou "fragmento de anticorpo"), como usado neste pedido, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que conservam a capacidade de ligar-se especificamente a um antígeno (por exemplo, NGF). Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo completo. Exemplos de fragmentos de ligação englobados pelo termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento de dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, podem ser agrupados, usando métodos recombinantes, por um ligador sintético que lhes permite ser produzidos como uma cadeia proteica única em que o par de regiões VL e VH forma moléculas monovalentes (conhecido como cadeia única Fv (scFv); ver por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única também são destinados a serem englobados pelo termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos também são englobadas. Diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecíficos nos quais os domínios VH e VL são expressos em uma cadeia polipeptídica única, mas usando um ligador que é demasiado curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, por meio disso forçando os domínios a parear com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação a antígeno (ver por exemplo, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

[00032] Ainda mais, um anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo podem ser partes de moléculas de imunoadesão maiores, formadas pela associação covalente ou não-covalente do anticorpo ou porção de anticorpo com uma ou mais proteínas ou peptídeos. Exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem o uso da região de núcleo de estreptavidina para produzir um molécula tetramérica scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93- 101) e uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e uma marcação de poli-histidina C-terminal para produzir moléculas scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). As porções de anticorpo, tais como fragmentos Fab e F(ab')2, podem ser preparadas a partir de anticorpos inteiros usando técnicas convencionais, tais como digestão por papaína ou pepsina, respectivamente, de anticorpos inteiros. Além disso, os anticorpos, as porções de anticorpo e as moléculas de imunoadesão podem ser obtidos usando técnicas de DNA recombinante padrão, como descrito neste pedido.

[00033] O termo "anticorpo humano", como usado neste pedido, é destinado a incluir anticorpos que têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas pela mutagênese randômica ou sítio-específica in vitro ou pela mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e em particular, CDR3. Entretanto, o termo "anticorpo humano", como usado neste pedido, não é destinado a incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outras espécies de mamífero, tais como um camundongo, foram enxertadas nas sequências conservadas humanas.

[00034] O termo "anticorpo recombinante humano", como usado neste pedido, é destinado a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (descrito mais abaixo), anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpo humano recombinante, (descrito mais abaixo), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvam combinação de sequências gênicas de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de lg humana é usado, mutagênese somática in vivo) e dessa forma as sequências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, enquanto derivadas e relacionadas a sequências de VH e VL de linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linhagem germinativa de anticorpo humano in vivo.

[00035] Um "anticorpo isolado", como usado neste pedido, é destinado a referir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente se liga a NGF é substancialmente livre de anticorpos que especificamente se ligam a antígenos exceto NGF). Um anticorpo isolado que especificamente se liga a NGF pode, entretanto, ter reatividade cruzada a outros antígenos, tais como moléculas de NGF de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos.

[00036] Um "anticorpo de neutralização", como usado neste pedido (ou um "anticorpo que neutraliza a atividade de NGF"), é destinado a referir-se a um anticorpo cuja ligação a NGF resulta na inibição da atividade biológica de NGF. Esta inibição da atividade biológica de NGF pode ser avaliada pela medida de um ou mais indicadores da atividade biológica de NGF, tal como ativação celular induzida por NGF e ligação de NGF ao receptor de NGF. Estes indicadores da atividade biológica de NGF podem ser avaliados por um ou mais de vários ensaios padrão in vitro ou in vivo conhecidos na técnica (ver exemplos abaixo).

[00037] Uma "CDR" ou região de determinação de complementaridade é uma região de hipervariabilidade entremeada com regiões que são mais conservadas, denominadas "regiões conservadas". Um grupo de CDRs pode ser definido como uma sequência consenso de aminoácido.

[00038] O termo "ressonância de plasmõnio de superfície", como usado neste pedido, refere-se a um fenômeno ótico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real pela detecção de alterações em concentrações proteicas dentro de uma matriz biossensora, por exemplo, usando o sistema BIACORE® (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J.).

[00039] O termo "KD", como usado neste pedido, é destinado a referir-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma determinada interação antígeno-anticorpo.

[00040] O termo "molécula isolada de ácido nucleico", como usado neste pedido em referência a ácidos nucleicos que codificam anticorpos ou porções de anticorpo (por exemplo, VH, VL, CDR3) que se ligam a NGF é destinado a referir-se a uma molécula de ácido nucleico na qual as sequências nucleotídicas que codificam o anticorpo ou porção de anticorpo são livres de outras sequências nucleotídicas que codificam anticorpos ou porções de anticorpo que se ligam a antígenos exceto NGF, que outras sequências podem flanquear naturalmente o ácido nucleico em DNA genômico humano. Dessa forma, por exemplo, um ácido nucleico isolado da invenção que codifica uma região VH de um anticorpo anti-NGF não contém outras sequências que codificam outras regiões VH que se ligam a antígenos exceto NGF humano.

[00041] O termo "epitopo" inclui qualquer determinante, preferencialmente um determinante polipeptídico, capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Em certas modalidades, determinantes de epitopo incluem grupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila, ou grupos sulfonila, e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específica. Um epitopo é uma região de um antígeno que está ligada por um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo é dito ligar especificamente um antígeno quando preferencialmente reconhece seu antígeno-alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Em modalidades preferenciais, um anticorpo é dito ligar especificamente um antígeno quando a constante de equilíbrio de dissociação é menos do que ou igual a 10-8 M, mais preferencialmente quando a constante de equilíbrio de dissociação é menos do que ou igual a 10-9 M, e ainda mais preferencialmente quando a constante de dissociação é menos do que ou igual a 10’1°M.

[00042] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico" referindo-se a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo, indica que, quando otimamente alinhado com inserções ou deleções nucleotídicas apropriadas com outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), há identidade de sequência nucleotídica em pelo menos aproximadamente 90%, e mais preferencialmente pelo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases nucleotídicas, como medido por qualquer algoritmo bem-conhecido de identidade de sequência, tais como FASTA, BLAST ou GAP, como discutido abaixo.

[00043] Quando aplicado a polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou "substancialmente similar" significa que duas sequências peptídicas, quando otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna predeterminados, compartilha pelo menos identidade de sequência de 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferencialmente, as posições de resíduo que não são idênticas diferenciam-se por substituições de aminoácido conservatives. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é aquela na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservative não modificará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde duas ou mais sequências de aminoácido se diferenciam uma da outra por substituições conservatives, a porcentagem ou grau de similaridade pode ser ajustado para cima para correção da natureza conservative da substituição. Meios para produzir este ajuste são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais hidróxi-alifáticas: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais acídicas: aspartate e glutamate, e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Os grupos de substituição conservative de aminoácidos preferenciais são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer modificação que tem um valor positivo na matriz de probabilidade do log PAM250 revelada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer modificação que tem um valor não negativo na matriz de probabilidade do log PAM250.

[00044] A similaridade da sequência polipeptídica é tipicamente medida usando um programa de análise de sequência. O programa de análise proteica combina sequências similares usando as medidas de similaridade determinada para várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácido conservativas. Por exemplo, o programa GCG contém programas, tais como GAP e BESTFIT que podem ser usados com parâmetros predeterminados para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos estreitamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de espécies diferentes de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma muteína da mesma. Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências polipeptídicas também podem ser comparadas usando FASTA com parâmetros predeterminados ou recomendados; um programa em GCG Versão 6.1 FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e porcentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências interrogada e de busca (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferencial comparando uma sequência da invenção a um banco de dados contendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros predeterminados. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.

Preparação de Anticorpos Humanos

[00045] Métodos para geração de anticorpos humanos incluem, por exemplo, tecnologia VELOCIMMUNE®, XENOMOUSE® (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21), abordagem de "minilocus", e exposição de fago. A tecnologia VELOCIMMUNE® (US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals) engloba um método para gerar um anticorpo de alta especificidade totalmente humano para um antígeno selecionado. Esta tecnologia envolve a geração de um camundongo transgênico que tem um genoma compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada e leve humana operacionalmente ligadas a loci endógenos de região constante de camundongo tal que o camundongo produza um anticorpo compreendendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo em resposta à estimulação antigênica. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo é isolado e operacionalmente ligado a DNA que codifica as regiões constantes da cadeia pesada e leve humana. O DNA então é expresso em uma célula capaz de expressar o anticorpo totalmente humano. Na modalidade específica, a célula é uma célula CHO.

[00046] Anticorpos podem ser terapeuticamente úteis em bloquear uma interação ligante-receptor ou inibir a interação componente- receptor, em vez de matar células através da fixação de complemento e participação na citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ou matar células através da citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). A região constante de um anticorpo é dessa forma importante na capacidade de um anticorpo de fixar complemento e mediar citotoxicidade dependente de célula. Dessa forma, o isotipo de um anticorpo pode ser selecionado com base em se é desejável para o anticorpo mediar citotoxicidade.

[00047] Imunoglobulinas humanas podem existir em duas formas que estão associadas com a heterogeneidade de dobradiça. Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende um construto de quatro cadeias estáveis de aproximadamente 150 a 160 kDa nos quais os dímeros são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto intercadeia na cadeia pesada. Em uma segunda forma, os dímeros não são ligados através de ligações dissulfeto intercadeia e uma molécula de aproximadamente 75 a 80 kDa é formada composta de uma cadeia leve e pesada covalentemente ligadas (metade-anticorpo). Estas formas foram extremamente difíceis de separar, até após purificação por afinidade.

[00048] A frequência do aparecimento da segunda forma em vários isotipos IgG intactos é devida a, mas não limitada a diferenças estruturais associadas com o isotipo de região de dobradiça do anticorpo. Uma substituição de aminoácido única na região de dobradiça da dobradiça de lgG4 humana pode reduzir significativamente o aparecimento da segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) a níveis tipicamente observados usando uma dobradiça de lgG1 humana. A presente invenção engloba anticorpos tendo uma ou mais mutações na região de dobradiça, CH2 ou CH3 que podem ser desejáveis, por exemplo, na produção, para melhorar o rendimento da forma de anticorpo desejada.

[00049] Os anticorpos da invenção são preferencialmente preparados com o uso de tecnologia VELOCIMMUNE®. Um camundongo transgênico no qual as regiões variáveis de cadeia pesada e leve da imunoglobulina endógena são substituídas com as regiões variáveis humanas correspondentes é desafiado com o antígeno de interesse, e as células linfáticas (tais como células B) são recuperadas dos camundongos que expressam anticorpos. As células linfáticas podem ser fusionadas com uma linhagem celular de mieloma para preparar linhagens celulares de hibridoma imortais, e tais linhagens celulares de hibridoma são classificadas e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos para o antígeno de interesse. DNA que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve pode ser isolado e ligado a regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e cadeia leve. Tal proteína de anticorpo pode ser produzida em uma célula, tal como uma célula CHO. Alternativamente, o DNA que codifica os anticorpos quiméricos específicos para o antígeno ou os domínios variáveis das cadeias leve e pesada pode ser isolado diretamente de linfócitos específicos para o antígeno.

[00050] Em geral, os anticorpos da presente invenção possuem afinidades muito altas, tipicamente possuindo KD de aproximadamente 10'9 a aproximadamente 10'12M ou mais alto, por exemplo, pelo menos aproximadamente 10'9 M, pelo menos 10'10 M, pelo menos 10'11 M ou pelo menos 10'12 M, quando medidos pela ligação ao antígeno imobilizado na fase sólida ou na fase de solução.

[00051] Inicialmente, anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como descrito abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados para características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epitopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas com uma região constante humana desejada para gerar o anticorpo totalmente humano da invenção, por exemplo, lgG1 ou lgG4 de tipo selvagem ou modificadas (por exemplo, SEQ ID NO:541, 542 ou 543). Enquanto a região constante selecionada pode variar de acordo com o uso específico, ligação a antígeno de alta afinidade e características de especificidade pelo alvo residem na região variável.

Mapeamento de Epitopo e Tecnologias Relacionadas

[00052] Para classificação dos anticorpos que se ligam a um epitopo particular (por exemplo, aqueles que bloqueiam a ligação de IgE ao seu receptor de alta afinidade), um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como aquele descrito em Harlow e Lane (1990) supra pode ser realizado. Outros métodos incluem mutantes de varredura de alanina, marcações peptídicas (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), ou análise de clivagem de peptídeo. Além disso, métodos tais como excisão de epitopo, extração de epitopo e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).

[00053] O termo "epitopo" refere-se a um sítio em um antígeno aos quais células B e/ou T respondem. Os epitopos de célula B podem ser formados por ambos aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos pela conformação terciária de uma proteína. Os epitopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente conservados na exposição a solventes desnaturantes, ao passo que os epitopos formados pela conformação terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epitopo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais usualmente, pelo menos 5 ou 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial única.

[00054] Perfil Assistido por Modificação (MAP), também conhecido como Perfil de Anticorpo baseado na Estrutura de Antígeno (ASAP) é um método que categoriza grandes números de anticorpos monoclonais (mAbs) dirigidos contra o mesmo antígeno de acordo com as similaridades do perfil de ligação de cada anticorpo a superfícies de antígeno quimicamente ou enzimaticamente modificadas (US 2004/0101920). Cada categoria pode refletir um epitopo único distintamente diferente ou sobrepondo parcialmente com o epitopo representado por outra categoria. Esta tecnologia permite a filtração rápida de anticorpos geneticamente idênticos, tal que a caracterização pode ser concentrada em anticorpos geneticamente distintos. Quando aplicado à classificação de hibridoma, MAP pode facilitar a identificação de clones de hibridoma raros que produzem mAbs tendo as características desejadas. MAP pode ser usado para classificar os anticorpos anti-NGF da invenção em grupos de anticorpos que se ligam a epitopos diferentes.

Imunoconjugados

[00055] A invenção engloba um anticorpo monoclonal anti-NGF humano conjugado a uma porção terapêutica ("imunoconjugado"), tal como um citotoxina, um fármaco quimioterápico, um imunossupressor ou um radioisótopo. Os agentes citotoxina incluem qualquer agente que seja prejudicial para células. Exemplos de agentes citotoxina e agentes quimioterápicos adequados para formar imunoconjugados são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, WO 05/103081).

Biespecíficos

[00056] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para epitopos diferentes de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação a antígenos específicos para mais de um alvo polipeptídico. Ver, por exemplo, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69. Os anticorpos anti-NGF humanos podem ser ligados ou coexpressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode estar funcionalmente ligado (por exemplo, por ligação química, fusão genética, associação não-covalente ou de outra maneira) a uma ou mais entidades moleculares, tais como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo, para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação.

Administração e Formulações Terapêuticas

[00057] A invenção fornece composições terapêuticas compreendendo os anticorpos anti-NGF ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção. A administração de composições terapêuticas conforme a invenção será administrada com veículos, excipientes e outros agentes adequados que são incorporados em formulações para fornecer melhoradas transferência, entrega, tolerância e similares. Uma grande quantidade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, unguentos, geleias, ceras, óleos, lipídios, vesículas contendo lipídio (catiônico ou aniônico) (tais como LIPOFECTIN®), conjugados de DNA, pastas absorventes anidras, emulsões óleo-em-água e água-em-óleo, emulsões de carbowax (polietileno glicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos, e misturas semissólidas contendo carbowax. Ver também Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[00058] A dose pode variar dependendo da idade e do tamanho de um indivíduo a ser administrado, doença-alvo, condições, via de administração e similares. Quando o anticorpo da presente invenção é usado para tratar várias condições e doenças associadas com NGF, incluindo dor inflamatória, neuropática e/ou dor nociceptiva, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, cirrose hepática e similares, em um paciente adulto, é vantajoso administrar intravenosamente o anticorpo da presente invenção normalmente em uma dose única de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5, ou aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, preferencialmente aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, e mais preferencialmente aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. Dependendo da severidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas.

[00059] Vários sistemas de entrega são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulamento em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Métodos de introdução incluem, mas não são limitados a, vias intradérmica, intramuscular, intraperitonial, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. A composição pode ser administrada por qualquer via adequada, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através de revestimento epitelial ou mucocutâneo (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada em conjunto com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.

[00060] A composição farmacêutica também pode ser entregue em uma vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein e Fidler (eds.), Liss, Nova Iorque, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; ver ibid em geral.

[00061] Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser entregue em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (ver Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados (ver Medicai Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Flórida (1974). Ainda em outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado na proximidade da composição-alvo, dessa forma requerendo somente uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, em Medicai Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer (1990) Science 249:1527-1533.

[00062] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intramusculares, infusões por gotejamento, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, dissolvendo, suspendendo ou emulsionando o anticorpo ou o seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou em um meio oleoso convencionalmente usado para injeções. Como meio aquoso para injeções, há, por exemplo, solução salina fisiológica, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que pode ser usada em combinação com um agente solubilizante apropriado, tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propilenoglicol, polietilenoglicol), um tensoativo não- iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (polioxietileno (50 mols) aduto de óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de sésamo, óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante, tal como benzoato de benzila, álcool de benzila, etc. A injeção preparada dessa forma é preferencialmente preenchida em uma ampola apropriada.

[00063] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem em uma unidade de dose ajustada para adequar uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagem em uma unidade de dose incluem, por exemplo, pastilhas, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo contido é geralmente aproximadamente 5 a 500 mg por forma de dosagem em uma unidade de dose; na forma de injeção, é preferencial que o anticorpo esteja contido em aproximadamente 5 a 100 mg e em aproximadamente 10 a 250 mg de outras formas de dosagem.

[00064] Terapias única e de combinação. A invenção fornece métodos terapêuticos nos quais o fragmento de anticorpo ou anticorpo da invenção é útil para tratar a dor associada com uma variedade de condições envolvendo NGF. Os anticorpos anti-NGF ou os fragmentos de anticorpo da invenção são particularmente úteis para o tratamento de dor que resulta de qualquer condição associada com dor neurogênica, neuropática ou nocicéptica. Em modalidades preferenciais referidas nevralgia do trigêmio, nevralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, fibromialgia, distrofia simpática reflexiva e condições de dor neurogênica são preferencialmente tratadas. Em outras modalidades preferenciais, dor de câncer, particularmente, a dor de câncer ósseo, dor de osteoartrite ou de artrite reumatoide, dor lombar, dor de incisão pós-operatória, dor de fratura, dor de fratura osteoporótica, osteoporose, dor de gota articular, neuropatia diabética, dor no nervo ciático, dores associadas com crises de célula falciforme, enxaqueca, e outra dor neuropática e/ou nocicéptica são preferencialmente tratadas.

[00065] Outras indicações incluem, por exemplo, o tratamento de câncer de mama (Adriaenssens et al. (2008) Cancer Res 68:346-51). Em modalidades específicas dos métodos terapêuticos da invenção, um indivíduo sofrendo de dor articular associada com gota é tratado com uma combinação de um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção e opcionalmente com um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é preferencialmente um antagonista de interleucina-1 (IL-1), tal como rilonacept ("armadilha para IL-1Regeneron). Os agentes terapêuticos adicionais adequados podem ser um ou mais agentes selecionados a partir do grupo consistindo em rilonacept, anaquinra (KINERET®, Amgen), uma forma recombinante, não glicosilada do antagonista de receptor de IL-1 humana (IL1Ra), um fármaco anti-IL-18, tal como IL-18BP ou um derivado, uma Armadilha para IL-18, ou um anticorpo, tal como um anticorpo anti-IL-18, anti-IL-18R1, anti-IL-18Racp, anti-IL-6 e/ou anti- IL6Ra. Outra coterapia que pode ser combinada com um anticorpo para NGF ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, sozinho ou em combinação com um antagonista de IL-1, inclui baixa dose de colchina, aspirina ou outro NSAIDs, esteroides, tais como prednisolona, metotrexato, baixa dose de ciclosporina A, inibidores de TNF, tais como ENBREL®, ou HUMIRA®, outros inibidores inflamatórios, tais como os inibidores de caspase-1, p38, IKK1/2, CTLA-4lg, etc., e/ou coterapias, tais como inibidores de síntese de ácido úrico para inibir o acúmulo de ácido úrico no corpo, por exemplo, alopurinol, promotores de excreção de ácido úrico para acelerar a rápida excreção de ácido úrico acumulado no corpo, por exemplo, probenecid, sulfinpirazona e/ou benzbromarona são exemplos de promotores de excreção de ácido úrico; corticosteroides; fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), fármacos antiepilépticos, tais como topiramato; gabapentina, pregabablina; celecoxib; ou outra neurotrofina, tal como NT-3.

Exemplos

[00066] Os seguintes exemplos se apresentam de modo a proporcionar aos versados ordinários na técnica com uma revelação e relatório descritivo completos como fazer e usar os métodos e as composições da invenção, e não são destinados a limitar o escopo do que os inventores consideram como a sua invenção. Esforços foram feitos para assegurar a exatidão com respeito a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser contabilizados. A menos que indicado de outra maneira, partes são partes em peso, peso molecular é o peso molecular médio, temperatura está em graus Centígrados, e a pressão está na ou próxima à atmosférica. As análises estatísticas foram conduzidas de acordo com o Fatorial variado ANOVA com os testes de Bondferroni post hoc ou Turkey HSD post hoc.

Exemplo 1. Imunização e Geração de Anticorpo

[00067] A imunização de roedores pode ser feita por qualquer método conhecido na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque; Malik e Lillehoj, Antibody techniques: Academic Press, San Diego). Em uma modalidade preferencial, a proteína NGF humana é administrada diretamente a camundongos que têm loci de DNA que codificam tanto a região variável da cadeia pesada e lg humana como a região variável da cadeia leve Kappa (VELOCIMMUNE®, Regeneron; US 6.596.541), com um adjuvante para estimular a resposta imune. Tal adjuvante inclui adjuvante de Freund completo e incompleto, sistema adjuvante MPL+TDM (Sigma), ou RIBI (muramil dipeptídeos) (ver O'Hagan, Vaccine Adjuvant, Human Press, 2000, Totawa, NJ). Tai adjuvante pode prevenir a dispersão rápida do polipeptídeo isolando o antígeno em um local de depósito, e pode conter fatores que podem estimular a resposta imune do hospedeiro. Em uma modalidade, NGF é administrado indiretamente como um plasmídeo de DNA que contém o gene NGF e expressa NGF usando o maquinário de expressão proteica do hospedeiro celular para produzir o antígeno polipeptídico in vivo. Em ambas as abordagens, para obter ótimas respostas antiantígeno, aos camundongos são dadas injeções de estímulo cada 3~4 semanas e amostras de soro são coletadas 10 dias após cada injeção. A resposta imune de anticorpo é monitorada usando métodos padrão de ligação direta ao antígeno por ELISA. As amostras de soro pós-estímulo diluídas em diluições seriadas de 3 vezes são aplicadas em placas cobertas de NGF. O título sérico é definido como a diluição da amostra de soro que rendeu duas vezes o sinal de fundo do ensaio. Os animais com respostas ótimas recebem um estímulo final através de injeções intravenosas e intraperitoniais sem um adjuvante 3~4 dias antes do sacrifício. Os esplenócitos colhidos são processados como descrito abaixo a fim de obter anticorpos monoclonais específicos para o antígeno.

Exemplo 2. Isolamento de Anticorpo Monoclonal

[00068] Em uma modalidade, células B expressando anticorpo é fundida com células de mieloma de camundongo para formar células de hibridoma. As células híbridas são plaqueadas em placas de 96 poços sob seleção por HAT e permitidas crescer por 10 a 20 dias. Os meios condicionados dos poços com as células de hibridoma em crescimento são rastreados para ligação ao antígeno e atividades de bloqueio de receptor como descrito abaixo. As células de hibridoma que expressam os anticorpos de interesse são a célula única subclonada usando citometria de fluxo, e genes de VH e VL de células clonais de hibridoma clonados e sequenciados. As proteínas de anticorpo também são purificadas de culturas de hibridomas específicos para antígeno que usam meio depletado de IgG (Invitrogen) e caracterizado como descrito abaixo.

[00069] Em outra modalidade, anticorpos específicos para o antígeno são isolados diretamente das células B positivas para o antígeno sem ser imortalizados com células de mieloma específicas, e uma célula hospedeira CHO produzindo um anticorpo recombinante estável é gerada, como descrito em USSN 11/809.482 (Publicação de Patente U.S. N° 2007/0280945).

Exemplo 3. Ligação Primária a Antígeno e Classificação de Blogueio de Receptor

[00070] Para identificar hibridomas que produzem anticorpo específico para o antígeno, meios condicionados foram amostrados em placas de cultura de 96 poços 10 a 20 dias após fusão, e a especificidade de ligação ao antígeno determinada usando ELISA de ligação direta de alto rendimento. Resumidamente, permitiu-se que os meios de condição em diluição de 1:10 e 1:100 vezes se ligassem à placas MAXISORB® (Nunc)recobertas com proteína NGF recombinante em 100 ng/poço. Os anticorpos ligados à placa foram detectados usando anticorpo policlonal para IgG Fcy específica anticamundongo de cabra conjugado a HRP (Jackson Immuno Lab). As placas foram desenvolvidas usando substratos TMB (BD Pharmigen) e densidade ótica em DO450nm registrada. Em paralelo, amostras nas mesmas diluições foram aplicadas a placas com NGF marcado com biotina apresentadas à estreptavidina, e a placa ligou-se aos anticorpos detectados. Poços exibindo atividade de ligação a placa foram selecionados para a expansão de cultura celular e criopreservação, e os sobrenadantes contendo anticorpo foram usados para análise adicional para obter o perfil de especificidade, afinidade e funcionalidade.

[00071] Além da classificação de ligação direta ao antígeno, classificação funcional também foi utilizada para identificar clones que secretam anticorpo com propriedades desejáveis. Placas Maxisorb foram cobertas com 100 ng/poço de TrkA-hFc recombinante humano durante a noite a 4°C. Permitiu-se que meios condicionados em diluições 1:2 e 1:10 vezes se ligassem a 2 ng/ml de NGF-biotina em solução por 1 hora antes da transferência para placas cobertas de TrkA-hFc para medição do NGF-biotina ligado à placa. O NGF-biotina ligado à placa foi detectado usando estreptavidina conjugada a HRP (Pierce) e desenvolvida por substratos TMB (BD Pharmingen) e densidade ótica registrada. Hibridomas nos quais os meios de cultura preveniram a ligação de NGF-biotina a TrkA-hFc foram identificados como bloqueadores potenciais e foram ainda caracterizados.

[00072] Classificações similares in vitro foram aplicadas a meio condicionado em 96 poços de células de CHO transfectadas com IgG totalmente humana contendo genes V isolados diretamente de células B positivas para o antígeno. Além disso, as amostras foram classificadas para atividade de ligação a NGF usando contas LUMINEX® cobertas de antígeno, às quais o anticorpo ligado ao antígeno específico foi detectado usando anticorpos policlonais anti- humano de cabra específicos para IgG Fcy conjugados a PE. Os anticorpos de ligação a antígeno foram submetidos à mensuração de afinidade usando BIACORE®. Resumidamente, os anticorpos dos sobrenadantes de cultura brutos foram capturados em uma superfície de anticorpo policlonal específico para hFc ligada à amina. A ligação do antígeno em uma concentração única foi monitorada. Um modelo de interação bimolecular 1:1 foi usado para ajustar a ligação sensograma para determinar as afinidades de ligação ao antígeno (KD) usando as constantes de taxa cinéticas ka e kd para cada interação de anticorpo sob condições idênticas. Especificamente, anticorpos policlonais anti-humano de cabra específicos para IgG Fcy foram covalentemente ligados a superfícies de chip CM 5 e os sobrenadantes de CHO contendo o anticorpo foram injetados a 1 pl/min por 5 min seguidos por uma lavagem com tampão. NGF humano (25 nM) foi injetado por 3 min para permitir a NGF ligar-se ao anticorpo humano na superfície imobilizada. Imediatamente após injeção de NGF, as superfícies foram injetadas com tampão a 100 pl/min por ~ 10 min e o decaimento do sinal de RU registrado. As superfícies foram regeneradas para remover o anticorpo ligado e NGF, e o ciclo repetido com a próxima amostra de sobrenadante de CHO.

Exemplo 4. Determinação de Afinidade de Ligação ao Antígeno

[00073] As afinidades de ligação ao antígeno dos anticorpos para NGF humano foram determinadas pelas cinéticas superficiais usando um ensaio de biossensor de ressonância de plasmônio de superfície em tempo real (BIACORE®). Os anticorpos foram capturados em uma superfície de anticorpo policlonal de IgG de cabra, anti-humana ou em anticamundongo criada pela ligação direta à amina do anticorpo de captura a um chip BIACORE®. Várias concentrações de NGF humano foram injetadas nas superfícies de anticorpo capturado enquanto a associação do antígeno ao anticorpo e a dissociação do complexo ligado foram monitoradas em tempo real. A análise cinética foi realizada para obter a constante de equilíbrio de dissociação (KD) e a constante de taxa de dissociação, e a última foi usada para calcular o ti/2 de dissociação do complexo antígeno/anticorpo (Tabela 1). Um anticorpo monoclonal para NGF anti-humano humanizado E3 ("RN624") (tanezumab; Registro CAS No. 880266-57-9; publicação de Patente U.S. 2004/0237124) foi usado como controle. Tabela 1

[00074] As afinidades de ligação ao antígeno dos anticorpos para NGF purificados selecionados também foram determinadas pelas cinéticas superficiais que empregam um ensaio de biossensor de ressonância de plasmônio de superfície em tempo real (BIACORE®) como descrito acima. Por conveniência, o anticorpo 301272-3H10-A10 foi renomeado "REGN261" (HCVR/LCVR SEQ ID NOs:84/92 e hlgG1 SEQ ID NO:541); 301272-6E07-D10 foi renomeado "REGN263" (HCVR/LCVR SEQ ID NO:208/216 e hlgG1 SEQ ID NO:541). Os anticorpos derivados testados incluíram REGN472 (HCVR/LCVR SEQ ID N0:100/102 e hlgG1 SEQ ID NO:541), REGN474 (HCVR/LCVR SEQ ID N0:100/102 e hlgG4 mutante SEQ ID NO:543), REGN475 (HCVR/LCVR SEQ ID NO:108/110 e hlgG4 mutante SEQ ID NO:543), REGN476 (HCVR/LCVR SEQ ID NO:224/226 e hlgG4 mutante SEQ ID NO:543), e REGN477 (HCVR/LCVR SEQ ID NO:232/234 e hlgG4 mutante SEQ ID NO:543). Tabela 2

Exemplo 5. Reatividade cruzada a Neurotrofina-3 (NT-3)

[00075] NGF e NT-3 pertencem à família de fator de crescimento neural e são proteínas pequenas, básicas, secretórias que permitem a sobrevivência de populações neuronais específicas. Embora estas duas neurotrofinas compartilhem alguma identidade de aminoácidos, as funções biológicas podem variar (Barde et al. 1990 Prog Growth Factor Res 2(4):237-48).

[00076] Os anticorpos anti-NGF foram examinados para reatividade cruzada de ligação com NT-3 humana. Resumidamente, anticorpo policlonal IgG anti-humano de cabra foi quimicamente ligado a um chip CM5. Os anticorpos monoclonais anti-NGF foram injetados formando uma superfície de aproximadamente 50 a 900 RU de anticorpo imobilizado através da interação com os anticorpos policlonais ligados ao chip. A proteína NT-3 ou NGF em uma concentração de 20 nM foi injetada na superfície, seguido por um tampão de lavagem para permitir ao ligante ligado dissociar-se. Tanto as fases de associação como de dissociação foram monitoradas e os dados foram analisados. Os resultados são mostrados na Tabela 3 (NB = nenhuma atividade de ligação observada). Em contraste com o anticorpo controle (RN624), todos dos anticorpos teste não mostraram ligação mensurável a NT-3, dessa forma indicando um grau mais alto de especificidade pelo antígeno em relação ao anticorpo controle. Tabela 3

[00077] Os ensaios de competição de solução baseados em OCTET® também foram empregados para medir a capacidade de REGN475 e RN624 competir em solução pela ligação a NT-3, NGF ou fator neurotrófico derivado de cérebro humano (hBDNF). Resumidamente, as amostras de antígeno-anticorpo foram preparadas pela pré-incubação do anticorpo controle RN624 (2,5 pg/ml) ou REGN475 (2,5 pg/ml), com várias concentrações de NT-3 (0 a 4 pM), hBDNF (0 a 4 pM) ou NGF (0 a 0,2 pM) por 1 hora a 30°C. Sensores FA de alta ligação à estreptavidina (HBS, ForteBio, Inc., CA) foram incubados com NGF-biotina a 2 pg/ml por 10 min a 30°C. Os sensores ligados a NGF-biotina então foram incubados com as amostras antígeno-anticorpo pré-incubadas por 10 min a 30°C. Modificações na espessura da camada biológica foram medidas após incubação. A ligação foi normalizada como uma porcentagem de ligação em relação à ligação do anticorpo na ausência do competidor. Como mostrado na Tabela 4, a ligação entre NGF e RN624 foi bloqueada por NT-3 de uma maneira dose-dependente, ao passo que a ligação entre REGN475 e NGF não foi bloqueada por NT-3. A presença de hBDNF não bloqueou a ligação de RN624 ou de REGN475 a NGF, ao passo que a presença de NGF solúvel bloqueou quase completamente a ligação tanto de RN624 como de REGN475 a NGF imobilizado. Tabela 4 Competidor % de Ligação a RN624 % de Ligação a REGN475

[00078] A ligação entre o anticorpo anti-NGF humano purificado selecionado REGN472, REGN474, REGN475, REGN476, REGN477 ou anticorpo controle RN624 e NT-3 também foi avaliada usando o ensaio de BIACORE® com concentrações NT-3 variando de 1,25 nM a 40 nM. Enquanto o anticorpo controle (RN624) se ligou a NT-3 com um KD de 1,1 nM, nenhum dos anticorpos teste exibiu afinidade mensurável por NT-3.

Exemplo 6. Reatividade cruzada a NGF Murino e de Rato

[00079] NGF humano (NGF) é altamente homólogo na sequência de aminoácidos ao NGF de camundongo (nriNGF) e NGF de rato (rNGF) com identidade de aproximadamente 90%. As afinidades de ligação dos anticorpos tanto a mNGF como a rNGF foram determinadas como descrito acima. Todos os anticorpos mostraram reatividade cruzada tanto a mNGF como a rNGF. Um grupo de anticorpos ligou-se fortemente ao NGF de todas as espécies com um valor de KD de menos do que 10 pM; um segundo grupo ligou-se preferencialmente a NGF e exibiu KDs> ~ 100 pM de mNGF e rNGF (controle = RN624) (Tabela 5). Tabela 5

[00080] A afinidade de ligação dos anticorpos anti-NGF selecionados purificados a mNGF e rNGF também foi determinada (Tabela 6). Tabela 6

Exemplo 7. Inibição da Ligação de NGF aos Receptores TrkA/hFc e p75/hFc

[00081] Para identificar anticorpos de bloqueio, um ensaio de bloqueio de receptor foi projetado usando um instrumento BIACORE® 3000. TrkA-hFc humano recombinante e as proteínas p75-hFc humanas foram ligados pela amina a um chip CM5 em uma densidade de aproximadamente 5000 a 6000 RU. NGF humano (10 nM a 25 nM) foi ligado à superfície de TrkA e de p75 para determinar RU máximo de ligação a NGF. A superfície então foi regenerada e 10 nM a 25 nM de NGF foram misturados com concentrações molares em excesso dos anticorpos individuais ou corpos receptores solúveis, e a solução foi injetada na superfície do chip regenerada para determinar os sinais de ligação ao NGF livre restante. A tabela 7 mostra a porcentagem de NGF livre ligado a TrkA e p75 na presença do anticorpo ou corpo receptor. A ligação RU máxima de NGF humano na ausência do anticorpo foi dada um valor relativo de 100%. Como controles positivos, RN624, TrkA-hFc e p75-hFc em solução foram usados e, como um controle negativo de ligação, lgG1 controle (AVASTIN®; Genentech, CA) foi usada. Tabela 7

[00082] A capacidade dos anticorpos teste selecionados, REGN472, REGN474, REGN475, REGN476 e REGN477, e do anticorpo controle RN624 bloquear a ligação do NGF humano aos receptores humanos de TrkA e p75 também foi quantitativamente medida com um ELISA sanduíche de competição, no qual a presença do anticorpo com uma concentração fixa de NGF na solução impediu NGF de ligar-se a TrkA-hFc ou p75-hFc recobertos em uma placa de microtítulo. O NGF humano usado no ensaio foi uma proteína recombinante produzida em E. coli e o TrkA-hFc e as proteínas p75- hFc humanas foram proteínas de fusão diméricas compostas dos domínios extracelulares dos respectivos receptores fundidos ligados em série com a porção Fc da lgG1 humana. A proteína NGF marcada com biotina em uma concentração fixa de 50 pM foi titulada com várias quantidades do anticorpo de 1,5 pM a 1,5 nM em solução por uma hora à temperatura ambiente. A quantidade de NGF-biotina livre não ligado nas misturas de solução então foi quantificada pela captura do NGF-biotina em placas de microtítulo cobertas de hTrkA-hFc ou hp75- hFc, seguido pela detecção de NGF biotinilado ligado à placa com a Estreptavidina-HRP. Especificamente, as placas de microtítulo foram preparadas pelo revestimento das placas com 0,5 pg/ml de hTrkA-hFc ou 1 pg/ml de hp75-hFc em solução tampão PBS durante a noite a 4°C, seguido pelo bloqueio das placas com BSA 0,5% antes do uso. Para medir o NGF-biotina não ligado, as soluções de anticorpo pré- incubado e NGF-biotina foram transferidas para as placas cobertas pelo receptor seguido pela incubação por 1 hora à temperatura ambiente. O NGF biotinilado ligado à placa foi detectado com Estreptavidina-HRP e desenvolvido com um substrato TMB colorimétrico, e DCXisonm registrada. A dependência dos valores de DO450nm nas concentrações de REGN475 nas soluções pré-ligação foi analisada usando um modelo de dose resposta sigmoidal fornecido pelo PRISM® (Graph Pad, CA). O valor de ICso predito, que é definido como a concentração de anticorpo necessária bloquear 50% da ligação de 50 pM de NGF biotinilado nas placas cobertas pelo receptor, foi usado como um indicador da potência do anticorpo no bloqueio da ligação de NGF a hTrkA-hFc ou hp75-hFc. A tabela 8 mostra valores de IC50 para cada anticorpo testado contra hTrkA-hFc e hp75-hFc. mAb controle = RN624. Tabela 8

Exemplo 8. Inibição da Ligação de NT-3 aos Receptores TrkA-, TrkB-, TrkC- e p75-hFc

[00083] A ligação de 20 nM de NT-3 humana ao humano TrkA-, TrkB-, TrkC- e p75-hFc superficiais, respectivamente, na presença de 500 nM de REGN475, RN624 e AVASTIN® (lgG1 controle), também foi testada. TrkA-hFc humano (9300 RU), TrkB-hFc humano (6000 RU), TrkC-hFc humano (9100 RU) e p75-hFc humano (7500 RU) foram covalentemente ligados a superfícies de chip CM5 BIACORE® pelo procedimento de ligação à amina. Vinte nM da NT-3 humana foram misturados com 500 nM do controle (lgG1 controle AVASTIN®), REGN475, RN624, hTrkA-hFc, TrkB-hFc, TrkC-hFc ou p75-hFc em solução. A mistura de ligação foi primeiro incubada à temperatura ambiente para alcançar o equilíbrio (aproximadamente 1 hora) e então foi injetada nos mencionados TrkA-hFc, TrkB-hFc, TrkC-hFc e de p75- hFc superficiais. O nível de ligação à NT-3 humana em cada amostra foi medido. A ligação RU de cada mistura de amostra foi normalizada de acordo com o valor de RU da amostra controle negativo (isto é, 20 nM de NT-3 humana com 500 nM de AVASTIN®) e apresentada como % de ligação a superfícies Trk (Tabela 9). REGN475 não mostrou quase nenhuma interferência com a ligação de NT-3 nos nos receptores, enquanto as amostras restantes mostraram bloqueio significante da ligação de NT-3 aos receptores. Tabela 9

Exemplo 9. Neutralização da Atividade Biológica de NGF In Vitro

[00084] A capacidade de anticorpos para NGF bloquearem a atividade de crescimento celular dependente de NGF e mediada pelo receptor de TrkA foi realizada usando células MG87 estavelmente transfectadas com um plasmídeo que codifica o receptor de TrkA humano. Resumidamente, as células transfectadas foram tripsinizadas e ressuspensas em aproximadamente 2,5 x 105 células por ml e plaqueadas em 5.000 células por poço em placa de cultura de tecido de 96 poços. As proteínas de anticorpo purificadas foram diluídas em série em meio definido mais BSA 0,1% e adicionadas às células plaqueadas em concentrações variando de 0 a 500 nM. NGF humano foi adicionado aos poços a uma concentração final de 373 pM. A resposta foi medida após incubação das células por 3 dias a 37°C em uma incubadora úmida em 002 5%. A atividade de crescimento celular foi medida com um conjunto CCK8 (Dojindo) e a DO450nm registrada. A dependência dos sinais nas concentrações do anticorpo foi analisada e os valores de IC50 informados (Tabela 10, coluna 2).

[00085] A capacidade de anticorpos para NGF de bloquear a sinalização da atividade de NGF mediada por receptor de p75 e TrkA foi também medida in vitro usando uma linhagem celular de medula adrenal de rato, PC12, que expressa endogenamente ambos os receptores (Urdiales et al. 1998 J. Neuroscience 18 (17):6767-6775). Resumidamente, as células PC12 foram estavelmente transfectadas com um plasmídeo repórter contendo um elemento de resposta sérica (SRE) ligado a um gene de luciferase. As células transfectadas foram ressuspensas em aproximadamente 2,5 x 105 células por ml e plaqueadas em 50.000 células por poço em placa de cultura de tecido de 96 poços em meios Opti-MEM durante a noite. As proteínas de anticorpo purificadas foram diluídas em série em meio (DMEM mais BSA 0,1%) e acrescentadas às células plaqueadas em concentrações variando de 0 a 100 nM. NGF humano foi adicionado aos poços a uma concentração final de 12,5 pM. A atividade de Luciferase foi medida após incubação das células por 6 horas a 37°C em uma incubadora úmida de CO2 7,5% usando um sistema de ensaio de luciferaseBRIGHT GLOW® (Promega). Os valores de IC50 foram determinados como descrito acima, e informados na Tabela 10, coluna 3. mAb controle = RN624. Tabela 10

[00086] A capacidade dos anticorpos anti-NGF selecionados purificados REGN472, REGN474, e REGN475, e mAb RN624 controle bloquear a sinalização de NGF através da atividade mediada pelo receptor de p75 e TrkA em uma linhagem celular PC12 também foi avaliada com 0 ensaio de luciferase descrito acima (Tabela 11). Tabela 11

[00087] A capacidade do anticorpo anti-NGF, REGN475, e do anticorpo controle bloquear a sinalização da atividade de NT-3 através do receptor de p75 e TrkA na linhagem celular PC12 foi avaliada com o ensaio de luciferase descrito acima, modificado pela substituição de 12,5 pM de NGF com 75 nM de NT-3. Os resultados mostraram que o mAb controle RN624 bloqueou a sinalização de NT-3 com uma IC50 de aproximadamente 104,8 nM, enquanto REGN475 não afetou a sinalização de NT-3 sob as condições experimentais correntes.

[00088] Além disso, um bioensaio foi desenvolvido para determinar a capacidade de anticorpos anti-NGF, REGN475 e RN624, neutralizar a função celular mediada por NT-3 através de TrkC in vitro. Uma linhagem celular HEK293 projetada expressando TrkC foi transfectada com um plasmídeo repórter SRE-luciferase. NT-3 dirige a expressão de luciferase em um ensaio de 6 horas. A capacidade de REGN475 e RN624 bloquearem a atividade de sinalização de NT-3 mediada pelo receptor de TrkC nesta linhagem celular projetada foi avaliada com 0 ensaio de luciferase. A linhagem celular HEK293 projetada foi semeada em placas de 96 poços a 1 x104 células/poço em meios sem soro e incubada durante a noite a 37°C, CO2 5%. REGN475 e RN624 em concentrações variando de 1,6 pM a 28 pM foram pré-incubados com 15 pM de NT-3 por 1 hora e a mistura foi adicionada às células. As células foram então incubadas a 37°C, CO2 5% por 6 horas. A atividade de Luciferase foi determinada pela adição de um volume ao igual ao do poço de BRIGHT GLOW® (Promega). O resultado mostrou que RN624 inibiu a atividade de luciferase mediada por NT-3 com uma ICÕO de ~ 150 a 200 nM na presença de uma concentração constante de 15 pM de NGF, ao passo que REGN475 não inibiu a atividade de luciferase mediada por NT-3.

Exemplo 10. Neutralização de Atividade Biológica de NGF In Vivo

[00089] Teste de dor inflamatória de Adjuvante de Freund completo (CFA). Para determinar se os anticorpos anti-NGF podem aliviar a dor em um modelo inflamatório periférico crônico de camundongo, adjuvante de Freund completo (CFA) foi injetado subcutaneamente (s.c). na pata traseira de camundongos machos C57BL/6, causando hiperalgesia térmica, que foi medida usando o teste de Hargreaves (Torres et al. (2007) Pain 130:267-278). Camundongos controle receberam somente o veículo (isto é, PBS). Após aclimatar os camundongos ao aparelho de Hargreaves (modelo 336, IITC Life Science) por 2 a 3 horas por dia por 3 dias, eles foram testados no aparelho com uma configuração de intensidade ativa de 17%. Um tempo de corte de 25 segundos foi usado para evitar dano tecidual. Para cada camundongo, 3 leituras foram obtidas por um período de 30 min por dia e a latência mediana foi usada para a análise. Após obter uma leitura de referência no aparelho de Hargreaves, anticorpos anti-NGF teste, 301272-7E05-F6 (REGN268) e 301272-7G09-E4 (REGN270), e anticorpo anti-NGF humanizado (RN624) como um controle positivo, foram injetados s.c. a 10 mg/kg ou 25 mg/kg, 1 hora antes da injeção de uma solução de CFA 50% (10 mg/20 pl) na pata traseira intraplantar. O teste de Hargreaves foi repetido diariamente por até 4 dias após injeção de CFA e a % de redução na referência na latência calculada retirada de pata (Tabelas 12 e 13, % de modificação média ± SEM). Uma redução significante na hiperalgesia térmica foi observada em pelo menos um dos dias examinados sobre cada um dos anticorpos testados, em comparação com camundongos controle que receberam somente o veículo (p <0,001 a 0,05). Não houve diferença estatística entre os anticorpos testados e o anticorpo controle. Tabela 12: n=7 para cada grupo; todos os grupos 10 mg/kg. Tabela 13: veículo: n=5; controle RN624: n=5, 10 mg/kg; ambos REGN269: n=9). Tabela 12

Tabela 13

[00090] Modelo de dor de incisão pós-operatório. Um modelo de roedor da dor pós-operatóra na qual uma incisão plantar na pata traseira causou sensibilidade aumentada ao toque, comportamento de proteção, e hiperalgesia térmica, foi usado para estudar a eficácia da terapia de anticorpo anti-NGF. Para a cirurgia de incisão plantar, os camundongos C57BL/6 sob isoflurano receberam uma incisão através da pele, aponeurose e então isolamento do músculo flexor subjacente e bissecção verticalmente. Após sutura e recuperação, os camundongos foram testados para hiperalgesia térmica no teste de Hargreaves e para comportamento de proteção no teste de carregamento de peso (modelo 600, IITC Life Science) por 5 dias. Uma injeção s.c. única de veículo (n=7), mAb REGN268 (n=7), ou mAb controle RN624 (n=7), a 10 mg/kg, foi administrada 1 h antes da incisão (Tabela 14, porcentagem de modificação média do Hargreaves de referência ± SEM. A tabela 15 mostra os resultados do teste de carregamento de peso (média da porcentagem da distribuição de peso no membro afetado ± SEM) (n=7 para cada grupo, RN624 controle e REGN268 cada um 10 mg/kg). Em ambos os testes, o pré-tratamento com o anticorpo teste ou o anticorpo controle reduziu significativamente a dor pós-operatória em comparação aos camundongos controle que receberam somente o veículo (p <0,001 a 0,05). Tabela 14

Tabela 15

[00091] Para estudar se os anticorpos anti-NGF podem aliviar a dor estabelecida no modelo de dor de incisão pós-operatória, REGN475 (25 mg/kg, n=7), RN624 (25 mg/kg, n=7), e anticorpo lgG1 controle (25 mg/kg, n=7) foram intraperitonialmente (i.p). injetados no dia 1 pós- cirurgia após realizar o trabalho com portamental. A hiperalgesia térmica foi estudada no teste de Hargreaves e a alodinia mecânica foi testada no teste de von Frey. Neste último teste, os camundongos foram testados após serem aclimatados por 2 a 3 horas por 4 dias em um aparelho com um assoalho de rede de arame. O teste foi realizado pela aplicação, em ordem ascendente, de uma série de fibras de von Frey através da rede de arame na superfície plantar da pata traseira com a incisão. Uma resposta foi considerada positiva se a pata foi levantada da plataforma em resposta à aplicação do filamento. Começando da fibra mais fina, cada filamento de von Frey foi aplicado até cinco vezes até que uma resposta fosse observada. A consequência do teste de Hargreaves (Tabela 16) mostrou que o tratamento com anticorpo REGN475 levou a uma reversão significante da hiperalgesia térmica em 72 horas pós-cirurgia (p <0,001 a 0,01). Este regresso à referência não foi observado na coorte de camundongos tratada com RN624, que se comportou similarmente ao grupo tratado com IgG controle. No teste de von Frey (Limiar de Retirada de Pata) (g) (Tabela 17), ambos os anticorpos anti-NGF causaram alívio similar da alodinia mecânica (p <0,001 a 0,05) (lgG1 controle = AVASTIN®, 25 mg/kg, n=7; RN624, 25 mg/kg, n=7; REGN475, 25 mg/kg, n=7). Tabela 16

Tabela 17

[00092] No dia 4, após os testes comportamentais para modelo de dor pós-incisão foram concluídos, os soros dos camundongos foram coletados e analisados para níveis circulantes de neurotrofina-3 (NT-3) usando um ELISA sanduíche. O limite de detecção (~40 pg/ml) foi definido como dois desvios padrão (2 o) acima do fundo com um mínimo de cinco padrões de NT-3 para definir a resposta à curva de concentração. Os níveis de NT-3 de camundongos tratados com RN624 (média ± desvio padrão pg/ml, Tabela 18) mostraram um aumento significante (172 ± 114 pg/ml, n=7) daqueles tratados com qualquer REGN475 (não detectado =ND, n=7) ou IgG controle (AVASTIN®; ND, n=7).

[00093] Para comparação, a camundongos naive C57BL/6 sob isoflurano foi dada uma injeção s.c. (50 mg/kg) de mAb REGN475, RN624 ou lgG1 controle (AVASTIN®) e seus soros foram analisados em 1, 7 e 14 dias pós-tratamento para níveis de NT-3 usando um ELISA sanduíche. O limite de detecção (~40 pg/ml) foi definido como dois desvios padrão (2 o) acima do fundo com um mínimo de cinco padrões NT-3 para definir a resposta à curva de concentração. Os níveis de NT-3 (Tabela 19) em camundongos tratados com RN624 (131 a 199 pg/ml, n=6) foram elevados em comparação com REGN475 (ND, n=6) ou IgG controle (ND, n=6), como observado com o modelo de dor de incisão pós-operatória descrito acima. Tabela 19

[00094] Modelo de dor de gota articular aguda. Um modelo de camundongo de dor articular causada pela injeção de cristais de urato monossódico (MSU) no tornozelo foi usado para estudar a eficácia dos anticorpos da invenção para tratar a dor articular artrítica de gota. Cristais de MSU livres de Endotoxina (0,5 mg/20 pl) foram injetados intra-articularmente no tornozelo de camundongos C57BL/6 e os camundongos foram então testados para dor térmica no calcanhar no teste de Hargreaves por até 3 dias pós-injeção de cristais de MSU. Os parâmetros de aclimatização e a configuração do aparelho para o teste de Hargreaves são como descritos acima. O mAb teste 7E05-F6 (REGN268; n=7), 6E07-D10 (REGN263; n=7), ou mAb humanizado controle (RN624; n=7), ou veículo (n=7) foi injetado s.c. a 10 mg/kg 1 h antes da injeção no tornozelo de cristais de MSU. Como mostrado nas Tabelas 20 e 21, os anticorpos teste significativamente reduziram a dor articular, em comparação aos camundongos controle que receberam somente veículo (p <0,001 a 0,05). Tabela 20

Tabela 21

[00095] A capacidade de um anticorpo anti-NGF aliviar a dor estabelecida no modelo de gota aguda foi ainda estudada em camundongos injetados com um antagonista de IL-1 (armadilha para IL-1 (rinolacept), Economides et al. (2003) Nature 9:47-52) ou colchicina. Um dia após injeção dos cristais de MSU nos tornozelos, os camundongos foram injetados com armadilha para mlL-1 (35 mg/kg; n=7), colchicina (1 mg/kg; n=7), mAb controle RN624 (10 mg/kg; n=7), ou veículo (n=7), e testado para hiperalgesia térmica como descrito acima. Adicionalmente, outra coorte de camundongos (n=3) recebeu cotratamento tanto com armadilha para mlL-1 como com o controle RN624. A terapia de combinação de anticorpo anti-NGF e antagonista de IL-1 aliviou significativamente a hiperalgesia térmica estabelecida em comparação com o tratamento com somente veículo (p <0,001 a 0,05), ou anticorpo anti-NGF sozinho (p <0,001) ou antagonista de IL-1 sozinho (p <0,001) no Dia 2 pós-tratamento (Tabela 22). Tabela 22

[00096] Dor neuropática. O modelo de Seltzer de camundongo de dor neuropática (Malmberg et al. (1998) Pain 76:215-222) foi usado com camundongos machos C57BL/6, nos quais uma injúria neural parcial foi produzida pela amarração de uma ligadura apertada com uma seda de sutura 7-0 de aproximadamente 1/3 a 1/2 do diâmetro do nervo ciático de uma única coxa por camundongo. Pós-cirurgia, os camundongos foram permitidos recuperarem-se por pelo menos dois dias e então foram estudados por várias semanas pós-cirurgia para hiperalgesia térmica no teste de Hargreaves. Os controles foram camundongos operados por simulação na qual o nervo ciático foi exposto e elevado mas não amarrado. Após cirurgia, os camundongos foram testados no dia 4 e no dia 7 pós-cirurgia para confirmar que a hiperalgesia térmica tinha se desenvolvido. No dia 7 pós-cirurgia, os camundongos foram injetados s.c. com mAb REGN268 (100 mg/kg), lgG1 controle (AVASTIN® 100 mg/kg), e com veículo. REGN268 significativamente aliviou a hiperalgesia térmica estabelecida neste modelo de injúria neural (Tabela 23; p <0,05). Este alívio de dor não foi observado nos camundongos operados por simulação. Resultados expressos como média da porcentagem de modificação de referência de Hargreaves ± SEM (simulação-veículo, n=3; simulação-100 mg/kg de lgG1 controle (AVASTIN®), n=4; simulação-100 mg/kg de REGN268, n=5; Seltzer-veículo, n=5; Seltzer-100 mg/kg de lgG1 controle (AVASTIN®), n=5; Seltzer-100 mg/kg de REGN268, n=8). Tabela 23

[00097] No segundo experimento, a fim de ver se o tratamento com anti-NGF pode aliviar a hiperalgesia térmica após o dia 7 pós-cirurgia, anti-NGF REGN268 (100 mg/kg) foi injetado s.c. nos dias 7, 14, ou 21 pós-cirurgia. O alívio de dor significante foi obtido nos 3 pontos de tempo em comparação ao lgG1 controle (AVASTIN® 100 mg/kg; p <0,05) (Tabela 24, média de porcentagem de modificação da referência de Hargreaves ± SEM; lgG1 controle 100 mg/kg, n=6; REGN268 100 mg/kg, n=7).Tabela 24

[00098] No terceiro experimento, a capacidade de outro anticorpo anti-NGF REGN475 foi testado no modelo Seltzer. Após cirurgia Seltzer, os camundongos foram testados nos dias 5 e 7 pós-cirurgia para confirmar que a hiperalgesia térmica tinha se desenvolvido. Então, no dia 7 pós-cirurgia os camundongos foram injetados pelas vias s.c. ou i.p. com REGN475 (50 mg/kg), mAb controle RN624 (50 mg/kg) ou lgG1 controle (AVASTIN®) (50 mg/kg). Alívio de dor significante foi observado com ambos os anticorpos anti-NGF em ambas as coortes de camundongos, injetados s.c. (Tabela 25) ou i.p. (Tabela 26), enquanto a lgG1 controle não mostrou efeito (p <0,001 a 0,05) (média de porcentagem de modificação da referência de Hargreaves ± SEM; lgG1 controle 50 mg/kg, n=7; RN624 50 mg/kg, n=7; REGN475 50 mg/kg, n=7). Tabela 25

Tabela 26

[00099] Para determinar a capacidade de anticorpos de neutralizar atividades NGF humano in vivo, camundongos transgênicos foram produzidos dos quais o locus de NGF de camundongo endógeno foi substituído com o gene de NGF humano. Estes camundongos foram usados em um modelo de dor neuropático de Seltzer para testar os mAbs REGN268 e controle. Após a cirurgia Seltzer, estes camundongos foram testados no dia 4 e no dia 8 pós-cirurgia para confirmar que a hiperalgesia térmica tinha se desenvolvido. Então, no dia 8 pós-cirurgia, os camundongos foram injetados s.c. com mAb REGN268 50 mg/kg (n=7), RN624 controle 50 mg/kg (n=8), ou lgG1 controle 50 mg/kg (AVASTIN®) (n=6). Os resultados (Tabela 27) mostraram que REGN268 foi tão eficaz como um anticorpo anti-NGF humanizado (RN624) no alívio da dor neuropática nos camundongos NGF humanizados, ao passo que o lgG1 controle não teve efeito (p <0,05). Tabela 27

Exemplo 11. Efeito de Anti-NGF na Função Motora Animal

[000100] A fim de estudar se o tratamento com anti-NGF pode alterar a função motora, a coordenação motora no teste rota-rod em camundongos machos C57BL/6 naive foi estimado. Os animais foram primeiro treinados para ficar em um rota-rod (Columbus Instruments, diâmetro de 3,5 cm, 9 cm de largura) girando com velocidades progressivamente mais altas (velocidade máxima 10 rpm). Os camundongos permaneceram em 10 rpm em treinamento até que puderam andar por 60 segundos consecutivamente, ou até que tivessem passado um total de 2 min andando no rota-rod em 10 rpm cada dia durante três dias consecutivos. Após treinamento, cada camundongo foi colocado no rota-rod em 10 rpm três vezes consecutivamente (com um breve intervalo entre os testes), e a latência para queda foi registrada. Os animais foram removidos após 1 minuto, e determinado um escore de 60 segundos se não caíram. O escore mediano de 3 provas de cada camundongo foi usado na análise. Após obtenção de uma leitura de base no rota-rod, mAbs REGN475, RN624, ou controle negativo IgG foi injetado s.c. em 50 mg/kg ou 100 mg/kg. Os camundongos foram então testados até 20 dias pós-injeção de anticorpo. Os resultados (Tabela 28, expressa como latência para queda em seg) (média ± sem) mostraram que os camundongos tratados com RN624, mas não REGN475, tinham coordenação motora significativamente prejudicada (p <0,001 a 0,05). De maneira interessante, foi relatado que camundongos com NT-3 e TrkC silenciados exibiram movimentos e posturas anormais e perderam propriocepção (Ernfors et al. (1994) Cell 77:503-512; e Klein et al. (1994) Nature 368:249-251). Além de rota-rod, testes de Hargreaves e de von Frey em camundongos naive injetados com anticorpos anti-NGF também foram conduzidos. Nenhuma diferença estatisticamente significante foi observada para qualquer grupo de camundongos nos testes de von Frey e Hargreaves durante os 20 dias pós-administração do anticorpo de (n=6 para cada grupo). Tabela 28

Exemplo 12. Tratamento de Paciente Sofrendo de Nevralgia Pós- Herpética

[000101] Um paciente que desenvolveu dor crônica no sítio de uma erupção de herpes é diagnosticado com nevralgia pós-herpética. O paciente é tratado pela administração de quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um mAb anti-NGF da invenção. A administração pode ser por injeção subcutânea ou intravenosa, nas concentrações de anticorpo anti-NGF de, preferencialmente, entre 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal. A frequência do tratamento pode ser de 1 a 12 semanas, ou quando necessário. Dentro de vários dias após administração da composição de anticorpo anti-NGF, a dor do paciente é substancialmente aliviada. A administração repetida da composição de mAb anti-NGF mantém este alívio da dor.

Exemplo 13. Tratamento de Paciente Sofrendo de Dor de Osteoartrite

[000102] Um paciente sofrendo de dor moderada à severa causada por osteoartrite em qualquer articulação é tratado pela administração de quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um mAb anti-NGF da invenção. A composição pode ser administrada intravenosamente nas concentrações do anticorpo anti-NGF entre 10 pg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal. A frequência do tratamento pode ser de 1 a 12 semanas, ou quando necessário. Dentro de vários dias da administração da composição de anticorpo anti-NGF, a dor do paciente é substancialmente aliviada e recuperada a mobilidade da articulação afetada. O tratamento pode ser repetido enquanto necessário.

Claims

1. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao fator de crescimento neural humano (NGF) com KD de 5 pM ou menos, como medido por ressonância de plasmônio de superfície, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: (a) uma região de determinação de complementaridade 3 da cadeia pesada (HCDR3) e uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3), em que HCDR3 e LCDR3 são as sequências de aminoácido apresentadas nas SEQ ID NOs: 90 e 98, respectivamente, e (b) HCDR1, HCDR2, LCDR1 e LCDR2, em que HCDR1 é SEQ ID NO: 86, HCDR2 é SEQ ID NO: 88, LCDR1 é SEQ ID NO: 94 e LCDR2 é SEQ ID NO: 96.

2. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao fator de crescimento neural humano (NGF) com KD de 5 pM ou menos.

3. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) e uma região variável de cadeia leve (LCVR), em que HCVR e LCVR compreendem sequências de aminoácido apresentadas nas SEQ ID NOs: 108 e 110, respectivamente.

4. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que se liga ao NGF humano com um KD de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 vezes superior que o anticorpo ou fragmento se liga ao NGF de rato e de camundongo.

5. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao fator de crescimento neural humano (NGF) com KD de 0,5 pM ou menos.

6. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno, como definido na SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas codificando as mesmas sequências de aminoácidos.

7. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 6.

8. Método de produção de um anticorpo anti-NGF humano ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de introdução do vetor de expressão, como definido na reivindicação 7, em uma célula hospedeira isolada, cultivo da célula sob condições que permitam a produção do anticorpo ou fragmento de anticorpo, e recuperação do anticorpo ou fragmento de anticorpo assim produzido, preferencialmente em que a célula hospedeira é uma célula E. coli, uma célula CHO, ou uma célula COS.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente terapêutico adicional selecionado a partir de um inibidor de interleucina-1 (IL-1), um fármaco antiepiléptico, um antagonista de citocina e outra neurotrofina.

11. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é na produção de um medicamento para uso para atenuar ou inibir uma doença ou condição mediada por NGF em um ser humano selecionada a partir de dor inflamatória, dor de incisão pós-operatória, dor neuropática, dor de fratura, dor de gota articular, nevralgia pós-herpética, dor resultante de queimaduras, dor de câncer, dor de osteoartrite ou artrite reumatoide, dor no nervo ciático, dor associada com crises de célula falciforme, ou nevralgia pós-herpética.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso de um primeiro e um segundo agente terapêutico a um indivíduo humano em necessidade do mesmo, em que o primeiro agente terapêutico é o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, e preferivelmente em que o segundo agente terapêutico é um inibidor de interleucina-1 (IL-1), um fármaco antiepiléptico, um antagonista de citocina ou uma neurotrofina.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a condição ou doença mediada por NGF é inibida sem dano significante da coordenação motora.

14. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a condição ou doença mediada por NGF é inibida sem dano significante da coordenação motora.