JP6135161B2 - 新規抗ヒトｎｇｆ抗体 - Google Patents

Description

本発明は、新規な抗ヒトＮＧＦ抗体、より具体的には、抗ヒトＮＧＦ抗体のＦａｂ’フラグメントに関する。

神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）は、神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）と総称される液性因子の一つであり、生体内においてニューロンの発生、分化、機能維持において重要な役割を担っている。ＮＧＦの受容体としては、高親和性のｔｒｋＡ受容体（受容体型チロシンキナーゼ）と低親和性のｐ７５ＮＴＲ受容体が知られている。このうちｐ７５ＮＴＲは全ての神経栄養因子と結合し、ニューロンの発生過程においてアポトーシスに関与していることが報告されているが、その役割は未だ十分に解明されていない。一方、ＮＧＦとｔｒｋＡ受容体のノックアウトマウスは同様のフェノタイプを示すことが知られており（非特許文献１）、ＮＧＦの生理作用は主にｔｒｋＡ受容体を介して発現すると考えられている。

１９９３年にラットへのＮＧＦの投与により痛みが誘発されることが報告され（非特許文献２）、その後、ヒトへのＮＧＦの静脈内投与により全身性の筋肉痛を生じること、また局所投与により全身的な効果に加え、注射部位の痛覚過敏及び異痛症を誘発することが報告されている（非特許文献３）。さらに、ｔｒｋＡ受容体のノックアウトマウスで痛覚が欠如することが報告され（非特許文献４）、ＮＧＦは痛みの発現に強く関わる分子であると考えられている。ヒト疼痛病態との関連性については、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）の関節軟骨でＮＧＦ／ｔｒｋＡの発現が亢進していることや（非特許文献６）、リウマチ性関節炎（非特許文献７）や間質性膀胱炎（非特許文献８）の患者でＮＧＦレベルの上昇が実証されている。

これらのことから、ＮＧＦに特異的に結合し、その作用を阻害する活性を有するモノクローナル抗体を開発することができれば、疼痛をはじめとする、ＮＧＦに関連する各種疾患の治療、予防、診断に有用であることが期待される。

現在までに臨床開発が進められているヒトＮＧＦに対する抗体としては、ヒト化抗ヒトＮＧＦ抗体であるＴａｎｅｚｕｍａｂ（特許文献１）及びＰＧ１１０（特許文献２）、完全ヒト型抗ヒトＮＧＦ抗体であるＲＥＧＮ４７５（特許文献３）、Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ（特許文献４）、及びＭＥＤＩ−５７８（特許文献５）が報告されている。その中でもＴａｎｅｚｕｍａｂは最も開発が先行しており、その臨床結果から、変形性関節症に伴う関節痛、慢性腰痛、間質性膀胱炎に伴う膀胱痛などの疼痛に対して、強力で幅広い鎮痛効果を示すことが報告されている（非特許文献９〜１１）。

一般に、抗体医薬の有効投与量を規定する主な要因としては、抗体が有する抗原に対する中和活性や、体内に存在する抗原の量が挙げられるが、中和活性を向上させることは投与量の低減に繋がり、結果として患者の経済的な負担や医療コストの低減にも繋がる極めて有益な改良であると言える。また、投与量の低減が実現できれば、皮下投与を行うことも可能となる。皮下投与は、一定の条件を満たせば在宅で自己注射できる最大のメリットを有し、また、一般に静脈内投与では多くの場合、一定時間をかけて点滴投与されるのに対して、皮下投与ではボーラスで投与できる点も有用であり、医師と患者双方にとって静脈内投与製剤と皮下投与製剤を選択できることは望ましいことである。しかし、一般に、皮下投与では１回に投与できる容量が１ｍＬ程度と少量であり、この液量中に薬効を発現するのに十分な抗体が含まれる必要がある。また、静脈内投与とは異なり、バイオアベイラビリティも考慮しなければならない。すなわち、皮下投与の製剤を実現するためには、溶解性に優れ、かつ低用量でも十分な薬効を発現する抗体を作製することが求められる。従って、従来の抗体よりもＮＧＦに対する中和活性がより高い抗体を取得することは、ＮＧＦに関連する疾患の治療及びその利便性向上に有用である。

また、前述のように、ＮＧＦはニューロンの発達に重要な因子であるが、ＮＧＦの機能を阻害する医薬品の開発においては安全性の観点からも十分な検討が必要となる。特に、安全性に関して検討すべき事項の１つとして、胎児への影響が挙げられる。現在までに、ＮＧＦの機能阻害に関して、ＮＧＦ変異が先天性無痛症の原因であることや（非特許文献５）、動物実験において、妊娠モルモットにＮＧＦに対する自己抗体を産生させて生体内のＮＧＦを阻害すると、出産した新生仔モルモットが無痛症状を呈すること（非特許文献１２）が報告されている。また、ＮＧＦやｔｒｋＡの欠損マウスを用いた試験からも、ＮＧＦ作用の欠失により、胚の感覚神経及び交感神経のニューロンの発達が阻害されることが実証されており（非特許文献４及び１３）、これらのことからも、ＮＧＦが発生初期の神経発達に必須の因子であることが理解される。一方、ＮＧＦが関連する疾患には、間質性膀胱炎（患者の半数以上が４４歳以下であり、患者の９０％が女性（非特許文献１４））、慢性腰痛（平均年齢は４０〜５０歳であり、患者の５０％強が女性（非特許文献１５〜１７））、偏頭痛（１５〜４０歳で好発し、患者の８０％が女性（非特許文献１８））など、妊娠適齢期の女性に高い割合で発生する疾患も含まれる。このような状況から、抗ＮＧＦ抗体を医薬品として開発する場合に、妊娠中の女性における胎児への副作用リスクを回避することが極めて重要となる。

また、抗ＮＧＦ抗体を医薬品として開発する場合の別のリスク要因として、免疫複合体（ＩＣ）の形成が挙げられる。抗体と抗原が結合した免疫複合体は、通常、脾臓や肝臓などの網内系で処理されるが、免疫異常等の病態時や、形成されるＩＣサイズが大きい場合には、ＩＣが可溶性を失い、血栓形成のリスクが高まるほか、腎糸球体に蓄積し、腎炎の発症に関連すると言われている。ＩｇＧは２価抗体であるが、抗原が多価である場合、ＩＣは格子形成（ｌａｔｔｉｃｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により様々なサイズを取り得る。ＩＣのサイズは、抗体と抗原の量や比、抗体の親和性等に依存し、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（商品名：アバスチン）は、ＩｇＧ１抗体であり、これは、二量体のＶＥＧＦと結合してＩＣを形成し、血栓形成を誘発するとの報告がある。具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩα受容体ＴｇマウスにアバスチンとＶＥＧＦを投与すると肺動脈血栓が形成されることが観察されている（非特許文献１９）。さらに、化学療法とアバスチンの治療を受けた転移性癌の患者は、化学療法のみのプラセボ群と比べて動脈血栓の発生率が高いことが報告されている（非特許文献２０）。ＮＧＦも生体内では二量体を形成して生理作用を発揮することから、抗ＮＧＦ抗体の医薬品開発においても、ＩＣ形成のリスクを回避し、安全性をより高めることが望ましい。

さらに、Ｔａｎｅｚｕｍａｂの臨床試験フェーズ３において急速進行性変形性関節症（Ｒａｐｉｄｌｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＲＰＯＡ）等の関節関連の有害事象が認められ、Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂの臨床試験フェーズ２においても同様の事象が認められた（非特許文献２１及び２２）。これに関して、米国での抗ＮＧＦ抗体の臨床開発はＦｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）の勧告に従い中断となっていた。従って、抗ＮＧＦ抗体を医薬品として開発する場合に、ＲＰＯＡ等の関節関連の有害事象リスクを低減することも安全性の観点から望ましい。

これらのことから、高い中和活性を保持しつつ、胎児への影響や血栓形成、ＲＰＯＡ等の関節関連の有害事象などの副作用リスクを低減した、安全性に優れた抗ＮＧＦ抗体を取得することが、ＮＧＦに関連する各種疾患の治療又は予防において極めて重要である。

WO2004/058184 WO2005/061540 WO2009/023540 WO2005/019266 WO2006/077441

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本発明の課題は、高い中和活性を保持しつつ、胎児への影響や血栓形成、ＲＰＯＡ等の関節関連の有害事象などの副作用リスクを低減した、安全性に優れた抗ヒトＮＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供することにある。

本発明は、医学上又は産業上有用な物質・方法として以下の発明を含むものである。
［１］配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
［２］前記Ｆａｂ’フラグメントの重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域である、［１］のＦａｂ’フラグメント。
［３］前記Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、［１］のＦａｂ’フラグメント。
［４］前記Ｆａｂ’フラグメントの重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域であり、前記Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、［１］のＦａｂ’フラグメント。
［５］配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［１］のＦａｂ’フラグメント。
［６］ポリエチレングリコールを結合させた、［１］〜［５］のいずれかのＦａｂ’フラグメント。
［７］［１］〜［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［８］［１］〜［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［９］［７］及び／又は［８］のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１０］［９］の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［１１］以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、［１０］の宿主細胞。
（ａ）［１］〜［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）［１］〜［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。
［１２］［１０］又は［１１］の宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを発現させる工程を包含する、［１］〜［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントを生産する方法。
［１３］［１］〜［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントを含む、疼痛治療薬。
［１４］前記疼痛が変形性関節症に伴う関節痛である、［１３］の治療薬。
［１５］［１］〜［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントを投与する工程を包含する、疼痛を予防又は処置するための方法。
［１６］前記疼痛が変形性関節症に伴う関節痛である、［１５］の方法。
［１７］疼痛の予防又は処置に使用するための、［１］〜［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメント。
［１８］前記疼痛が変形性関節症に伴う関節痛である、［１７］のＦａｂ’フラグメント。

本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防又は治療に有用である。このような本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、その高い中和活性により、投与量の低減、投与間隔の拡大、投与方法の改善（例えば、皮下注射剤）等の臨床適用における優れた改善をもたらすとともに、胎児への影響や血栓形成、ＲＰＯＡ等の関節関連の有害事象などの副作用リスクが低減された、安全性に非常に優れたものであり、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防や治療において大きく貢献するものである。

マウスコラーゲン誘発関節炎モデルの足底における抗体滞留量の経時的変化を示す。 ラットＭＩＡモデルにおける抗体投与後の膝関節浮腫の形成を示す。 ラット破骨細胞により誘導される吸収窩形成に対する抗ヒトＮＧＦ抗体の影響を示す。

以下に、本発明について詳述する。
本発明者らは、抗ヒトＮＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントの作製において相当の創意検討を重ねた結果、高い中和活性を保持しつつ、胎児への影響や血栓形成、ＲＰＯＡ等の関節関連の有害事象などの副作用リスクを低減した、安全性に優れた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを作製することに成功した。

抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。

鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（Ｖ_H）及び軽鎖可変領域（Ｖ_L）とよばれている。これよりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、Ｃ_H１、Ｃ_H２、Ｃ_H３あるいはＣ_Lと表される。

抗体の抗原決定部位はＶ_H及びＶ_Lによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。重鎖と軽鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。

抗体の重鎖定常領域のＣ_H１ドメインとＣ_H２ドメインとの間にある領域はヒンジ領域とよばれ、この領域は、プロリン残基を多く含み、２本の重鎖をつなぐ複数の鎖間Ｓ−Ｓ結合を含む。例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の各ヒンジ領域には、重鎖間のＳ−Ｓ結合を構成している、それぞれ、２個、４個、１１個、２個のシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、パパインやペプシン等のタンパク質分解酵素に対する感受性が高い領域である。抗体をパパインで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ−Ｓ結合よりもＮ末端側の位置で重鎖が切断され、２個のＦａｂフラグメントと１個のＦｃフラグメントに分解される。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（Ｖ_H）、Ｃ_H１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される。抗体をペプシンで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ−Ｓ結合よりもＣ末端側の位置で重鎖が切断され、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントが生成される。Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ−Ｓ結合で結合した二量体構造のフラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（Ｖ_H）、Ｃ_H１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成され、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ−Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントは、いずれも可変領域を含み、抗原結合活性を有する。

本発明者らが作製に成功した本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、以下の特徴を有するＦａｂ’フラグメントである。
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。

具体的には、本発明者らは、ヒトモノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社（米国特許６５９６５４１号））マウスを用いて抗体を作製し、各種生物学的活性試験及び物性試験を用いた抗体のスクリーニングによって、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを同定することに成功した。ベロシミューン技術では、内因性の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域が対応するヒト可変領域で置換されたトランスジェニックマウスを目的の抗原（例えば、ヒトβＮＧＦ）で免疫した後、抗体を発現するマウスのリンパ系細胞を取得し、マウスミエローマ細胞と細胞融合することによってハイブリドーマを作製する。次いで、このハイブリドーマ細胞を、目的の抗原に特異的に結合し、所望の中和活性を有する抗体を産生するか否かについてスクリーニングする。ここで産生される抗体は、ヒト抗体の可変領域とマウス抗体の定常領域を有する抗体（本明細書中、キメラ抗体とも称する）である。次いで、目的の抗原に特異的に結合し、所望の中和活性を有する抗体が同定された場合、そのハイブリドーマ細胞から抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを所望のクラスのヒト抗体重鎖及び軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡに連結する。このようにして得られた重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を細胞内（例えば、ＣＨＯ細胞）で発現させて、抗体分子を産生する。当該方法により作製された抗体の重鎖及び軽鎖は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に由来する「完全ヒト型」抗体の重鎖及び軽鎖である。

本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、本願明細書に開示される、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。好ましくは、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をヒト抗体の重鎖定常領域の一部分（Ｃ_H１ドメインと、ヒンジ領域システインを含むヒンジ領域の一部とを含む）及び軽鎖定常領域にそれぞれ連結して、完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメントとして作製することができる。具体的には、本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号６）をコードする塩基配列を有する重鎖可変領域遺伝子断片、及び本発明のＦａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号４）をコードする塩基配列を有する軽鎖可変領域遺伝子断片を作製する。そして、この重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子をヒト抗体の適当なクラスの重鎖定常領域部分及び軽鎖定常領域の各遺伝子と連結させて、完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメントの遺伝子を作製する。次いで、この遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からモノクローナルＦａｂ’フラグメントを得ることができる。

本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片は、例えば、該重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。

次いで、上記の可変領域遺伝子断片とヒト抗体の定常領域遺伝子とを連結させて完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメント遺伝子を作製する。ヒト抗体の定常領域は、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖としてγ１、γ２、γ３又はγ４、軽鎖としてλ又はκ鎖の定常領域）も選択可能であり得るが、好ましくは重鎖定常領域としてはヒトＩｇγ１が、軽鎖定常領域としてはヒトＩｇκを用いることができる。

この完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメント遺伝子の作製につづく、当該遺伝子の発現ベクターへの導入、発現ベクターの培養細胞への導入、培養細胞の培養、Ｆａｂ’フラグメントの精製等については、当該分野で公知の種々の方法を使用して行うことができる。

上記のようにして得られた遺伝子と連結される発現ベクターとしては、例えば、ＧＳベクターｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）が挙げられるが、抗体遺伝子を発現することができるものであれば特に制限されない。また、ＡＧ−γ１やＡＧ−κ（例えば、ＷＯ９４／２０６３２を参照）等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有する発現ベクターに可変領域遺伝子断片を導入して抗体遺伝子を発現することもできる。

上記の発現ベクターは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等により、培養細胞中に導入される。

発現ベクターを導入する培養細胞としては、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞等の培養細胞が使用でき、これを常法により培養すればよい。

上記培養後、培養上清中に蓄積されたＦａｂ’フラグメントは、各種カラムクロマトグラフィーにより精製することができ、例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ等によるカラムクロマトグラフィーを使用することができる。

本発明のＦａｂ’フラグメントは、前述のような組換え発現法を用いて作製することもできるが、一旦全長抗体として作製した後にペプシンで消化して、得られたＦ（ａｂ’）₂フラグメントを２−メルカプトエタノールのような還元剤で処理して、Ｆａｂ’フラグメントとして作製してもよい。

好ましくは、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、当該分野で公知の方法を用いて、配列番号６に示される重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及び配列番号４に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを合成し、これらを適当なクラスのヒト抗体定常領域遺伝子、好ましくは重鎖についてはヒトＩｇγ１定常領域遺伝子、軽鎖についてはヒトＩｇκ定常領域遺伝子と連結して完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメント遺伝子を構築し、当該分野で公知の種々の方法を用いて、該遺伝子を発現ベクターへ導入し、該発現ベクターを培養細胞に導入して該培養細胞を培養し、得られる培養物からＦａｂ’フラグメントを精製することによって、容易に取得することができる。好ましくは、配列番号６に示される重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号５に示される塩基配列を含む。好ましくは、配列番号４に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号３に示される塩基配列を含む。

本明細書中、「Ｆａｂ’フラグメント」とは、軽鎖と、重鎖可変領域（Ｖ_H）、Ｃ_H１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖のフラグメントから構成される、１価の抗体のフラグメントであり、このヒンジ領域の部分には、重鎖−軽鎖間のＳ−Ｓ結合を構成しているシステイン残基以外の少なくとも１つのシステイン残基（本明細書中、「ヒンジ領域システイン」とも称する）が含まれる。ヒンジ領域システインは、後述のポリエチレングリコールでの修飾部位として使用することができる。Ｆａｂ’フラグメント中のヒンジ領域システインの数は、使用する抗体のクラスによって１〜数個の間で異なり得るが、当業者によって容易に調整可能である。例えば、ヒトのＩｇＧ１クラス（通常、ヒンジ領域において、２個のヒンジ領域システインを有する）のＦａｂ’フラグメントを作製する場合、重鎖のヒンジ領域において、最初のヒンジ領域システインのコード部位と２番目のヒンジ領域システインのコード部位との間に停止コドンを挿入することによって、ヒンジ領域中に１個のヒンジ領域システインを有するＦａｂ’フラグメントを作製することができ、２番目のヒンジ領域システインのコード部位の後に停止コドンを挿入することによって、ヒンジ領域中に２個のヒンジ領域システインを有するＦａｂ’フラグメントを作製することができる。

配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とヒトＩｇγ１定常領域の部分とを含む、本発明の好ましい抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントは、配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントである。好ましくは、配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号９、配列番号１３、又は配列番号１５に示される塩基配列を含む。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とヒトＩｇκ定常領域とを含む、本発明の好ましい抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖である。好ましくは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号１１に示される塩基配列を含む。

配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントと、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明の好ましい抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとしては、後記実施例に記載される完全ヒト型１−１５（Ｎ５２Ｄ）抗体Ｆａｂ’フラグメントが挙げられる。配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントと、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明の好ましい抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとしては、後記実施例に記載される完全ヒト型１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）抗体Ｆａｂ’フラグメントが挙げられる。配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントと、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明の好ましい抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとしては、後記実施例に記載される完全ヒト型１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ｐ）抗体Ｆａｂ’フラグメントが挙げられる。

本発明は、配列番号６の３１〜３５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６の５０〜６５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６の９８〜１１０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４の２４〜３９番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４の５５〜６１番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４の９４〜１０２番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントをも包含する。このようなＦａｂ’フラグメントもまた、前述のような手順に従って当業者に容易に作製され得る。

本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、そのヒンジ領域システインを介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させて修飾してもよい。Ｆａｂ’フラグメントへのＰＥＧの結合は、当該分野で公知の方法を使用して実施可能である（例えば、欧州特許ＥＰ０９４８５４４）。本発明においては、直鎖又は分枝鎖の、任意の平均分子量のＰＥＧ又はその誘導体が使用可能であり、使用目的に応じて当業者により容易に選択され得る。例えば、腫瘍組織や炎症反応時においては、正常組織と比べて血管透過性が著しく亢進しており、到達した物質は血管外に漏出し、腫瘍や炎症組織に蓄積する傾向がある（ＥＰＲ効果）。また、分子量が小さい物質は血管へ再吸収されやすく、分子量が大きい物質は再吸収されにくいことも知られている。従って、Ｆａｂ’フラグメントの病巣組織での滞留性を改善するために、高い平均分子量（例えば、約４００００Ｄａ）のＰＥＧを結合してもよく、体外への速やかな排泄が望ましい場合には、低い平均分子量（例えば、約１００００Ｄａ）のＰＥＧを結合してもよい。また、ヒンジ領域システインへのＰＥＧの結合を容易にするために、ＰＥＧの誘導体を使用してもよい。例えば、後述の実施例に記載のように、マレイミドのようなチオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体を使用し、ヒンジ領域システインのチオール基とマレイミド基を共有結合させることができる。一般的にＰＥＧの平均分子量は、約５００Ｄａ〜約５００００Ｄａであり、好ましくは、約５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａであり、より好ましくは、約１００００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲である。

本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、ヒトＮＧＦに結合する。得られた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒトＮＧＦに対する結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡやＦＡＣＳ等の方法がある。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトβＮＧＦをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、これに対してＦａｂ’フラグメントを添加して反応させた後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識した抗ｋａｐｐａ抗体等の二次抗体を反応させ、洗浄した後、その活性を検出する試薬（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ＴＭＢ発色試薬）等を用いた活性測定により、二次抗体の結合を同定する。また、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントには、ヒトＮＧＦに加え、他の動物由来のＮＧＦ（例えば、マウスＮＧＦ）にも結合するＦａｂ’フラグメントも含まれ、これらのタンパク質に対する結合活性を測定してもよい。

本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、ヒトＮＧＦに対する中和活性を有している。本明細書中で使用される場合、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの「中和活性」とは、ＮＧＦへの結合によりＮＧＦを介してもたらされる任意の生物活性を阻害する活性を意味し、ＮＧＦの１つ又は複数の生物活性を指標に評価することができる。このような中和活性としては、例えば、ＮＧＦとその受容体であるｔｒｋＡとの結合阻害活性、ＮＧＦ−ｔｒｋＡシグナル媒介細胞内カルシウム流入阻害活性、ＮＧＦ依存性の細胞生存シグナル阻害活性が挙げられ、後記実施例に記載されるような方法を用いることによって評価することができる。

本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの効果をより詳細に評価するために、ｉｎ ｖｉｖｏでの試験を用いることもできる。例えば、後記実施例に記載のように、マウス関節炎モデルを用いる鎮痛効果試験等を用いて、Ｆａｂ’フラグメントのｉｎ ｖｉｖｏでの薬効を評価することができ、また、病巣移行性試験を用いて、その病巣組織滞留効果を評価することもできる。

さらに、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントについて、副作用リスクの低さを評価してもよい。例えば、後記実施例に記載のように、妊娠中の動物におけるＦａｂ’フラグメント投与後の胎盤通過試験を使用することによって、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントが胎児に影響を及ぼす可能性について評価することができる。また、後記実施例に記載のように、ＮＧＦとの免疫複合体（ＩＣ）形成試験を用いて、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとＮＧＦとの間で形成されるＩＣのサイズを測定し、血栓形成を誘発する可能性について評価することができる。また、後記実施例に記載のように、ラット変形性関節症モデルやラット破骨細胞を用いて本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのＲＰＯＡ等の関節関連の有害事象リスクを評価することができる。

その他、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの各種安定性（例えば、熱安定性、長期保存安定性、高濃度安定性）を評価する方法としては、例えば、示差走査熱量測定や、保存中の凝集体形成の測定を利用する方法が挙げられる。

本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、必要に応じて精製された後、常法に従って製剤化され、変形性関節症に伴う関節痛（ＯＡ疼痛）、リウマチに伴う関節痛、癌性疼痛、神経因性疼痛、慢性腰痛、術後疼痛、帯状疱疹後神経痛、有痛性糖尿病性神経障害、骨折痛、膀胱痛症候群等の疼痛や、間質性膀胱炎、急性膵炎、慢性膵炎、子宮内膜症等のＮＧＦが病態形成に関連する疾患の治療に用いることができる。

本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、好ましくは、疼痛治療剤、より好ましくは、変形性関節症に伴う関節痛治療剤として用いることができる。これら治療剤等の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤とすることができ、静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。

上記製剤化に当たっての本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。

本発明はまた、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド及びそれを含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド、及び本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド、並びにそれらのいずれか又は両方を含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明のＦａｂ’フラグメントあるいはその重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現し、これらポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げることができる。好ましくは、本発明の発現ベクターは、前述の本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメント又は軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むか、あるいは本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドと本発明のＦａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む。

本発明の発現ベクターは、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントをコードする遺伝子、あるいは本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子、及び当該遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。細菌中で本発明のＦａｂ’フラグメントあるいはその重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中での発現用プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、バチルス属菌での発現用プロモーターとしては、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。

宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域及び複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞又は昆虫細胞を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明のＦａｂ’フラグメントあるいはその重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。

本発明はまた、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントをコードする遺伝子あるいは本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子が導入された形質転換体を提供する。このような形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより作製できる。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）が例示される。形質転換は自体公知の方法により行われ得る。

好ましくは、本発明の形質転換体は、本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞であるか、又は、本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。より好ましくは、本発明の形質転換体は、前述の本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞であるか、又は、前述の本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。

本発明はまた、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントをコードする遺伝子あるいは本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子を宿主細胞に発現させること、即ち、このような形質転換体を用いることを含む、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの生産方法を提供する。好ましくは、該方法で使用される宿主細胞は、前述の本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞であり、本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを、別々にか又は同時に含んでもよい。

本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの生産において、形質転換体は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。

形質転換体の培養は自体公知の方法により行われる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．５０１，１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば、上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１，１９７２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。

本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、上述のような形質転換体を培養し、該形質転換体から回収、好ましくは単離、精製することができる。単離、精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。

市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。

（実施例１：ベロシミューンマウスへの免疫）
ヒトＮＧＦに対する抗体を、ベロシミューンマウスに免疫することによって取得した。本発明者らは、得られる抗体の多様性を高めるために、複数の免疫方法、投与経路、アジュバント、免疫期間等を検討した。免疫原としては、ヒトβＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）を使用し、ヒトβＮＧＦを溶解してアジュバントと混和した後に免疫に使用する方法と、ヒトβＮＧＦを熱変性（０．５％ＳＤＳ溶液下、８０℃、１０分処理）した後にアジュバントと混和して免疫する方法を検討した。投与経路としては、足蹠投与と腹腔内投与を検討した。アジュバントとしては、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ社）、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ社）、及びＲＩＢＩアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を検討した。さらに添加する免疫賦活剤としては、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとＡｌｕｍｉｎｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｇｅｌ（ＢＲＥＮＮＴＡＧ社）を検討した。免疫期間としては，３週間〜１４週間まで検討した。数回免疫した後、マウス尾静脈より採血を行い、力価をモニターすることで、ヒトＮＧＦに結合する抗体を産生するベロシミューンマウスの選択を行った。

力価測定は以下の標準的なＥＬＩＳＡ方法を用いて測定した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４プレート（Ｎｕｎｃ社）にヒトβＮＧＦを１ウェルあたり１０ｎｇ添加し、４℃にて一晩インキュベートして固相化した。翌日、プレートを洗浄液（ＴＢＳＴ：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリスバッファー（ＴＢＳ））で１回洗浄後、ブロッキング剤（２０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク社）含有ＴＢＳＴ）を添加し室温にて１時間静置した。ＴＢＳＴ洗浄液で１回洗浄後、採血した血液の希釈系列を作製して添加した。室温にて１時間インキュベート後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、５％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ含有ＴＢＳＴ洗浄液で２０００倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ＨＲＰ−ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｚｙｍｅｄ社）を添加した。室温にて１時間インキュベートした後、ＴＢＳＴ洗浄液で３回洗浄した。ＴＭＢ発色試薬（住友ベークライト社）を加えて室温で１０分静置した後、停止液（２ｍｏｌ／Ｌ 硫酸）を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

（実施例２：抗ヒトＮＧＦ抗体産生ハイブリドーマの作製）
抗体価の上昇を確認して選択したマウスに最終免疫（抗原の静脈内投与又は腹腔内投与）を行った。定法に従い、免疫したマウスの脾臓やリンパ節等を摘出しリンパ球を収集し、これをマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマを限界希釈し、単一クローンにしたうえで、上清からプロテインＡ又はプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて抗体を精製した。

（実施例３：ＮＧＦ−ｔｒｋＡ結合阻害評価）
ヒトβＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）とＥＺ−ＬＩＮＫ ５−（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）ｐｅｎｔｙｌａｍｉｎｅ（ＰＩＥＲＣＥ社）を室温暗所にて３０分反応させてビオチン標識を行い、脱塩カラムにて過剰量のビオチンを除去し、ビオチン標識ヒトβＮＧＦを取得した。なお、作製したビオチン標識ヒトβＮＧＦについては、生物活性が元のヒトβＮＧＦと同等であることを以下の実施例６及び実施例７で確認した。

阻害活性を以下の方法を用いて測定した。白色Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４プレート（Ｎｕｎｃ社）にヒトｔｒｋＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を１ウェルあたり６０ｎｇ添加し、４℃にて一晩インキュベートして固相化した。翌日、プレートをＴＢＳＴ洗浄液で１回洗浄後、ブロッキング剤（２０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク社）含有ＴＢＳＴ）を添加し室温にて１時間静置した。次に、上記で作製したビオチン標識ヒトβＮＧＦ（０．２μｇ／ｍｌ）と実施例２で得た抗体を混和したものを、ブロッキング後のｔｒｋＡ固相プレートに添加した。室温にて１時間インキュベート後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社）を添加した。室温にて１時間インキュベート後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、化学発光検出試薬であるＡＰＵ４（ＢｉｏＦＸ社）を加えて、その化学発光量をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。

（実施例４：種交差性評価）
抗体がマウスβＮＧＦに対して交差性を有する場合、当該抗体を用いてマウス病態モデルでの薬効評価を行うことが可能となる。そこで、実施例３の方法において、マウスβＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてビオチン標識マウスβＮＧＦを作製することによって、抗体のマウスβＮＧＦに対する交差性を評価した。

（実施例５：結合特異性評価）
実施例１に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて、抗体のＮＧＦへの結合特異性を評価した。具体的には、ＮＧＦと最も相同性の高いファミリー分子であるＮＴ−３を用いて、実施例１の方法においてヒトＮＴ−３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を１ウェルあたり２０ｎｇ添加してプレートに固相化して評価した。

（実施例６：ＮＧＦ−ｔｒｋＡシグナル阻害評価）
抗体のＮＧＦ−ｔｒｋＡシグナルの阻害活性について評価した。ＮＧＦはその受容体であるｔｒｋＡを介して細胞内カルシウム（Ｃａ²⁺）濃度の上昇を引き起こす。通常、このＣａ²⁺濃度変化は、カルシウム指示薬存在下のもとで、細胞内Ｃａ²⁺濃度測定システム（ＦＬＩＰＲ；モレキュラーデバイス社）を用いると評価できる。

阻害活性を以下の方法を用いて測定した。ヒトｔｒｋＡを安定的に発現させたＨＥＫ２９３細胞（ＷＯ２００９／０５４４６８）を、実験前日に２×１０⁴細胞／ウェルとなるように、９６ウェル ポリ−Ｄ−リジン−コートプレート（日本ベクトンディッキンソン社）に分注し、一晩培養した。翌日、培地をカルシウム指示薬（Ｆｌｕｏ４−ＡＭ；同仁堂社）を含むＤＭＥＭ培地（３．６ｍＭ 水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、２．５ｍＭ プロベネシド（Ｓｉｇｍａ社）含有）に置き換え、３７℃にて３０分静置した。次いで、洗浄液（ハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）（２０ｍＭ ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３．６ｍＭ 水酸化ナトリウム、２．５ｍＭ プロベネシド（Ｓｉｇｍａ社）、０．１％ ウシ血清アルブミン））にて細胞を２回洗浄し、培地をこの洗浄液１５０μｌ／ウェルで置き換えた。細胞プレートをＦＬＩＰＲ内にセットした。ＦＬＩＰＲの操作により、実施例２で得た抗体とβＮＧＦとの混和液を５０μｌ／ウェル添加し（ＮＧＦ最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）、細胞内Ｃａ²⁺濃度変化を測定した。細胞内Ｃａ²⁺濃度変化の最大値と最小値の差を算出し、測定データとして保存した。

（実施例７：ＮＧＦ依存性細胞生存シグナル阻害評価）
天然にｔｒｋＡ及びｐ７５受容体を発現しているＰＣ１２細胞を無血清条件で培養した場合、ＮＧＦは細胞の生存を数日間維持できる。以下の方法を用いて、抗体のＮＧＦ依存的細胞生存シグナルに対する阻害活性を評価した。

９６ウェルのコラーゲンコートプレート（旭テクノ社）にＰＣ１２細胞を１ウェルあたり１×１０⁴細胞で播き、２．５％ウシ胎仔血清及び１５％ウマ非働化血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＦ１２Ｋ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて３７℃、５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。翌日、培地をＦ１２Ｋのみの無血清条件に置換した。１時間後、抗体及びヒトβＮＧＦ（最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、７２時間培養を行った。その後、培養液をアスピレーターにて除去し、細胞の内在性ＡＴＰ定量試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）により細胞の生存能を測定した。

（実施例８：Ｆａｂフラグメントの作製）
Ｆａｂプレパレーションキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用し、抗体１ｍｇ／ｍｌに消化酵素パパイン結合ゲルを加え、３７℃、３時間処理した。処理した反応液をプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）に添加し、切断されたＦｃ及び未反応のＩｇＧをカラムに吸着させて除去し、溶出画分を回収することでＦａｂフラグメントを得た。得られたＦａｂフラグメントについて、実施例３、実施例６、及び実施例７に記載した試験で評価を行った。

実施例３〜８による評価の結果、１−１５と命名した抗体（キメラ抗体）が、高い中和活性、種交差性、結合特異性を有するとともに、１価の抗体フラグメントにした場合にも高い中和活性を保持することが確認された。

（実施例９：抗体遺伝子配列の決定）
同定された１−１５抗体について、本発明者らはハイブリドーマから抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をクローニングした。具体的には、ハイブリドーマクローンを１×１０⁵以上準備し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）に添付のＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒで懸濁後、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて細胞の破砕を行った。その後プロトコールに従ってＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡ増幅キット（ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い、重鎖及び軽鎖の可変領域を伸長及び増幅した。このＰＣＲ産物を直接シークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で配列解析を行った。また、ＰＣＲ産物をｐＣＲ３．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等のＰＣＲ産物サブクローニング用ベクターへ組み換えた後、遺伝子配列を解析して配列決定を行った。

決定された１−１５抗体の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に、該抗体の軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。１−１５抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、Ｋａｂａｔ番号付けに基づく重鎖可変領域の３１〜３５番目、５０〜６５番目、及び９５〜１０２番目の領域であり、それぞれ、配列番号２の３１〜３５番目、５０〜６５番目、及び９８〜１１０番目のアミノ酸配列からなる。１−１５抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、Ｋａｂａｔ番号付けに基づく軽鎖可変領域の２４〜３４番目、５０〜５６番目、及び８９〜９７番目の領域であり、それぞれ、配列番号４の２４〜３９番目、５５〜６１番目、及び９４〜１０２番目のアミノ酸配列からなる。

（実施例１０：可変領域の糖鎖修飾部位の変異体作製）
前述の１−１５抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２）には、Ｎ−Ｘ−（Ｔ／Ｓ）のＮ型糖鎖修飾モチーフ配列が含まれている。具体的には、配列番号２で示す重鎖可変領域における、Ｋａｂａｔ番号付けに基づく５２番目のＡｓｎ（Ｎ５２）が糖鎖修飾部位に該当する。糖鎖修飾部位が存在すると細胞培養の間に抗体への糖鎖の付加が起こるが、糖鎖の付加は培養条件や発現させる宿主に依存することが知られている。すなわち、樹立した同一の抗体産生細胞であっても、培養条件（培地、細胞密度など）によって糖鎖付加の程度が変わる可能性があり、均一な品質の抗体医薬品を取得することが困難となる可能性がある。そこで、本発明者らは、１−１５抗体の重鎖可変領域におけるＮ５２に変異を導入した１−１５（Ｎ５２Ｄ）を作製した。

作製した１−１５（Ｎ５２Ｄ）の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。１−１５（Ｎ５２Ｄ）抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、Ｋａｂａｔ番号付けに基づく重鎖可変領域の３１〜３５番目、５０〜６５番目、及び９５〜１０２番目の領域であり、配列番号６の３１〜３５番目、５０〜６５番目、及び９８〜１１０番目のアミノ酸配列からなる。

（実施例１１：完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメントの作製）
前述の１−１５及び１−１５（Ｎ５２Ｄ）の重鎖可変領域と１−１５の軽鎖可変領域を用いて、各々の完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメントを作製した。

１−１５及び１−１５（Ｎ５２Ｄ）の各重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列を、そして３’側にヒトＩｇγ１の定常領域遺伝子（Ｍａｎ Ｓｕｎｇ Ｃｏら，（１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１４８（４）：１１４９−１１５４）をそれぞれ繋げ、この重鎖フラグメント遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）に挿入した。ここで、Ｆａｂ’フラグメントとして発現させるために、重鎖定常領域遺伝子において、ＥＵインデックスに基づく２２６番目のＣｙｓ（後述の配列番号８及び１０のアミノ酸配列中の２３０番目のＣｙｓに対応）のコドンの後に停止コドンを挿入した。また、１−１５の軽鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列を、そして３’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子（Ｍａｎ Ｓｕｎｇ Ｃｏら，前出）をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）に挿入した。

一過性発現及び恒常的発現の２種類の方法でＦａｂ’フラグメントの発現を行った。一過性発現については、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で約１００万個／ｍＬに培養されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に対し、前述の重鎖フラグメント及び軽鎖のＧＳベクターを２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクトし、７日間培養した。恒常的発現については、前述の両ＧＳベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。この発現ベクターは、重鎖フラグメント及び軽鎖とグルタミン合成酵素（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）をコードしており、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞へのトランスフェクションにより発現させた。各方法で発現させた後、培養上清をＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて精製し、各Ｆａｂ’フラグメントを得た。

作製した完全ヒト型１−１５抗体Ｆａｂ’フラグメント（１−１５−Ｆａｂ’とも称する）の重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８にそれぞれ示す。

作製した完全ヒト型１−１５（Ｎ５２Ｄ）抗体Ｆａｂ’フラグメント（１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’とも称する）の重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す。

各Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖は共通で、その塩基配列は配列番号１１に、アミノ酸配列は配列番号１２にそれぞれ示す。

（実施例１２：完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメントの中和活性及び発現量評価）
実施例１１で取得した１−１５−Ｆａｂ’と１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’について、実施例３及び実施例６に記載した試験で評価した。実施例３の試験において、１−１５−Ｆａｂ’及び１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’のＩＣ５０は、それぞれ０．１７μｇ／ｍｌ及び０．１８μｇ／ｍｌであった。実施例６の試験において、１−１５−Ｆａｂ’及び１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’のＩＣ５０は、それぞれ０．０２１μｇ／ｍｌ及び０．０１８μｇ／ｍｌであった。これらの結果から、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’は、改変前の１−１５−Ｆａｂ’と同程度の中和活性を保持し、変異の導入によっても中和活性に影響を与えないことが確認された。

また、各Ｆａｂ’フラグメントの恒常的発現を行い、安定発現細胞プール培養の上清中における抗体産生量を測定した。その結果、１−１５−Ｆａｂ’及び１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’の各培養上清中の濃度は、それぞれ８６ｍｇ／Ｌ及び１０６ｍｇ／Ｌであり、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’は、改変前の１−１５−Ｆａｂ’よりも高い量で産生される抗体であることが示された。

（実施例１３：ＰＥＧ化Ｆａｂ’フラグメントの作製と中和活性評価）
次いで、本発明者らは、前述の１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’に対してＰＥＧの導入を行った。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔで精製後、Ｆａｂ’フラグメントをＴＣＥＰ塩酸塩（Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ＨＣｌ）により還元反応をすることで、ＰＥＧ化可能な構造体にした。

具体的には、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）にて１．２ｍｇ／ｍｌに調整したＦａｂ’フラグメント溶液に、１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加して、３７℃で２時間反応させたのち、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で希釈しｐＨを整えた。これを陽イオン交換樹脂（ＳＰ−５ＰＷ；東ソー製）に吸着させ、ＮａＣｌグラジエントで溶出し、メインピークを回収した。得られたＦａｂ’フラグメントを２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）で１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、ｐＨを６．８に調整後、４℃で一晩以上静置し自然酸化させた。これに終濃度０．１ｍＭとなるように４０ｋＤａ ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−４００ＭＡ；ＮＯＦ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を添加し、室温で２時間静置後、４℃で一晩静置した。同ＰＥＧは末端にマレイミド基を有しているので、重鎖フラグメントのカルボキシル末端のＣｙｓ（ＥＵインデックスに基づくＣ２２６；配列番号１０の２３０番目のＣｙｓ）と速やかに反応する。これを２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）で希釈してｐＨを調整後、再度陽イオン交換樹脂（ＳＰ−５ＰＷ；東ソー製）に吸着させ、ＮａＣｌのグラジエントで溶出、メインピークを回収した。このようにしてＰＥＧ化したＦａｂ’フラグメントを精製した。このＰＥＧ化した１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’を、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧとも称する。

ＰＥＧ化前及びＰＥＧ化した１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’について、実施例３に示す方法で中和活性を評価した。その結果、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’のＩＣ５０が０．１５μｇ／ｍｌであったのに対し、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧのＩＣ５０は０．１２μｇ／ｍｌ（Ｆａｂ’フラグメント濃度として）であり、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’は、ＰＥＧの付加によっても中和活性に影響を受けないことが確認された。

また、実施例６の方法を用いて、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧと先行抗ヒトＮＧＦ抗体Ｔａｎｅｚｕｍａｂのヒト及びマウスβＮＧＦに対する中和活性を比較した。その結果、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧのＩＣ５０が、ヒトＮＧＦに対して０．０５１μｇ／ｍｌ、マウスβＮＧＦに対して０．０６９μｇ／ｍｌであったのに対し、ＴａｎｅｚｕｍａｂのＩＣ５０は、ヒトβＮＧＦに対して０．１７μｇ／ｍｌ、マウスβＮＧＦに対して０．２３μｇ／ｍｌであり、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧが、ヒト及びマウスのいずれのβＮＧＦに対しても、Ｔａｎｅｚｕｍａｂより３．３倍程度強力な中和活性を有することが確認された。

（実施例１４：マウスアジュバント誘発関節炎モデルによる鎮痛効果試験）
本発明者らは、前述の１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧについて、マウスアジュバント誘発関節炎モデルに対する鎮痛効果を評価した。

１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧをマウス静脈内に投与し（０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、投与容量は１０ｍＬ／ｋｇ）、後肢足蹠にフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ社）１ｍｇ／ｍＬを２５μＬ投与して疼痛を惹起した。惹起２４時間に２０分間の立ち上がり行動を測定した。具体的には、スーパーメックス自発運動量測定システム（室町機械）を用いて、マウスの自発的な立ち上がり行動の回数を赤外線ビームセンサーで２０分間自動計測した（Ｍａｔｓｏｎら、ＪＰＥＴ ３２０：１９４−２０１，２００７）。比較対照として、先行抗体Ｔａｎｅｚｕｍａｂを用いた。その結果、Ｔａｎｅｚｕｍａｂの静脈内投与での鎮痛効果がＥＤ５０＝０．２７ｍｇ／ｋｇだったのに対し、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧは、ＥＤ５０＝０．１１ｍｇ／ｋｇで鎮痛効果を発揮し、約３倍の有効性を示した。

（実施例１５：ラット胎盤通過試験）
雌性ラットの妊娠１７日目に、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ又はＴａｎｅｚｕｍａｂを静脈内に投与し（１００ｍｇ／ｋｇ、投与容量１０ｍＬ／ｋｇ）、３日後の母体及び胎仔の血液中の抗体濃度を測定した。

抗体濃度の測定は以下のように行った。ＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ Ｐｌａｔｅ（Ｓｔａｎｄａｒｄ）９６プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）にヒトβＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を１ウェルあたり２５ｎｇ添加して、室温にて１時間静置することで固相化した。プレートをＴＢＳＴ洗浄液で３回洗浄後、ブロッキング剤（１％カゼイン ＴＢＳ；サーモフィッシャー社）を添加し、室温にて１時間静置した。次に、経時的に採血した血液を希釈した血液サンプルを、ブロッキング後のヒトβＮＧＦ固相プレートに添加した。室温で撹拌しながら６０分反応後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、ビオチン標識抗ヒトカッパ抗体（免疫生物研究所）を添加した。室温で撹拌しながら６０分反応後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識ストレプトアビジン（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）を添加した。室温で撹拌しながら６０分反応後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）を加えて、その電気化学発光量をＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で測定した。

本試験を３匹のラット母体において行った結果、３日後のラット母体血中における１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ及びＴａｎｅｚｕｍａｂの抗体濃度は、それぞれ平均１２．１μｇ／ｍｌ及び７．１μｇ／ｍｌであった。一方、各ラット母体から３例ずつ胎仔を摘出（合計９例）した胎仔血中における抗体濃度については、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧの血中濃度が、全例で定量限界の０．０１μｇ／ｍｌ以下であったのに対し、Ｔａｎｅｚｕｍａｂの血中濃度は、平均５．３９μｇ／ｍｌであった。すなわち、Ｔａｎｅｚｕｍａｂの胎仔移行率は７５．９％であったのに対し、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧの胎仔移行率は検出限界の０．０８％以下の移行率であった。このことから、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧは、胎児におけるＮＧＦ阻害による副作用リスクを回避し、安全性に優れる薬剤であることが示唆された。

（実施例１６：免疫複合体（ＩＣ）の形成）
１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧがＩＣを形成するか否か、あるいは形成されるＩＣのサイズがどの程度になるかを評価した。具体的には、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧを１ｍｇ／ｍｌとヒトβＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を、モル比で１：１になるように混和し、室温で３時間インキュベートしてＩＣを形成させた。この反応液を、動的光散乱を測定する機器Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）を用い、ＩＣの粒子径と分布を測定した。解析にはＺｅｔａｓｉｚａｒ ｖ６．０１（Ｍａｌｖｅｒｎ社）を用い、粒子径はＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（％）で解析した値（ｄ．ｎｍ）で示した。

測定された粒子サイズを以下の表１に示す。この実験において、ＮＧＦ単独の粒子径は平均で６．２ｎｍであった。Ｔａｎｅｚｕｍａｂ単独では１１．７ｎｍにピーク径が出現した。ＴａｎｅｚｕｍａｂとＮＧＦをインキュベートしてＩＣを形成させたものを測定すると、ピーク径が９１．３ｎｍにシフトした。一方、コントロール抗体としてＮＧＦと結合しない抗体を用いた場合、ピーク径は１１．７ｎｍのままであった。シフト幅から考えると、ＴａｎｅｚｕｍａｂとＮＧＦはそれぞれ複数分子を結合した巨大分子となり、巨大サイズのＩＣを形成していると推測された。これに対して、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧとＮＧＦとのＩＣの形成を測定した結果、ピーク径が１８．１ｎｍから２４．４ｎｍへとシフトした。シフト幅から考察すると、１：１結合のみを反映し、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧでは格子形成されないことが示唆された。

（実施例１７：病巣組織移行性）
雄性ＤＢＡ／１マウス足関節にコラーゲン（ウシ関節由来タイプ２コラーゲン、１０ｍｇ／ｍＬ；コラーゲン技術研修会）及び完全フロイントアジュバント（０．５ｍｇ／ｍＬ；ＤＩＦＣＯ社）の１：１のエマルジョンを皮下投与し、コラーゲン誘発関節炎モデルを作製した。惹起４週間後に再度、エマルジョンを投与し、関節炎を発症させた。後肢関節炎の発症程度（スコア・腫脹の大きさ）を観察し、マウスの群分けを行った。１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ及びＴａｎｅｚｕｍａｂの１ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳ溶液について、ＳＡＩＶＩ^TM Ｒａｐｉｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて蛍光標識を行った。それぞれを２ｍｇ／ｋｇにて尾静脈から投与を行った（Ｎ＝４）。腫脹した足底に蓄積してくる蛍光を、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎ社）を用いて、投与後１時間から５０時間まで解析し、蛍光強度を数値化した。

図１に足底の抗体滞留量の経時的変化を示す。１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧはＴａｎｅｚｕｍａｂに比較して明らかな病巣組織滞留効果を示し、その効果は４８時間まで持続した。この結果から、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧは効率的に鎮痛効果を発揮する考えられ、薬効強度以上に低用量で鎮痛効果期待できること、さらには、病巣部位選択的に集積するので安全性に優れる薬剤となりうることが期待できる。

（実施例１８：Ｆａｂ’フラグメントのアミノ酸付加体の作製）
本発明者らは、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’において、ＰＥＧの導入効率を改善するために、重鎖フラグメントのカルボキシル末端のＣｙｓ残基の後に２個のアラニン（Ａ）又はプロリン（Ｐ）を付加したＦａｂ’フラグメントを作製し、発現及び精製した。これらのＦａｂ’フラグメントの作製においては、実施例１１と同様の方法を用い、ここで、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’の重鎖フラグメントのカルボキシル末端Ｃｙｓ残基のコドンの後に２個のアラニン又はプロリンのコドンを挿入し、その後に停止コドンを挿入した。

アラニン付加した１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’（完全ヒト型１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）抗体Ｆａｂ’フラグメント；１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’とも称する）の重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号１３に、アミノ酸配列を配列番号１４にそれぞれ示す。プロリン付加した１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’（完全ヒト型１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ｐ）抗体Ｆａｂ’フラグメント；１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ｐ）−Ｆａｂ’とも称する）の重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号１５に、アミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。なお、各Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖は、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’の軽鎖と同じであり、その塩基配列は配列番号１１に、アミノ酸配列は配列番号１２にそれぞれ示される。

（実施例１９：ＰＥＧ化１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’の作製並びに中和活性及び薬理評価）
１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’に対して、実施例１３と同様の方法を用いて４０ｋＤａ ＰＥＧを結合させ、ＰＥＧ化した１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’（以下、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧとも称する）を得た。

１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧについて、実施例３に示す方法を用いて中和活性を評価した。その結果、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧのＩＣ５０が０．０８１±０．０３４μｇ／ｍｌであったのに対し、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧのＩＣ５０は０．０７４±０．０２１μｇ／ｍｌであった。また、このときＴａｎｅｚｕｍａｂのＩＣ５０は０．４１０±０．０９９μｇ／ｍｌであった。

次に、実施例６に示す方法を用いて中和活性を比較した。その結果、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧのＩＣ５０が、ヒトＮＧＦに対して０．０６１±０．０１１μｇ／ｍｌであったのに対し、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧのＩＣ５０は０．０６４±０．０２８μｇ／ｍｌであった。

さらに、実施例１４に示す方法を用いてアジュバント誘発関節炎モデルにおける鎮痛効果を評価した。その結果、１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧは、ＥＤ５０＝０．１４ｍｇ／ｋｇで鎮痛効果を発揮したのに対し、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧは、ＥＤ５０＝０．２１ｍｇ／ｋｇで鎮痛効果を発揮した。

以上より、カルボキシル末端のＣｙｓ残基の後に２個のアラニンを付加することによっても、中和活性及び薬理活性に影響を受けないことが確認された。

（実施例２０：１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧの結合親和性の評価）
１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ及びＴａｎｅｚｕｍａｂのＮＧＦ抗原に対する結合熱力学を等温滴定型熱量測定（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；ＩＴＣ）によって検討した（Ｓｃａｐｐａｔｉｃｃｉ ＦＡ，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００７，９９：１２３２−９．Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ−Ｃａｍｐｏｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４，Ｃｈａｐｔｅｒ １７，Ｕｎｉｔ １７−１８．）。すべての測定はＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＡｕｔｏ−ｉＴＣ２００を用いて行った。実験では１価のＦａｂ’フラグメントと１分子の抗原間の結合を評価すべく、以下の濃度で試験を行い、試験は全てＰＢＳ溶媒中で行った。具体的には、滴定用シリンジに入ったヒトβＮＧＦ ４４μＭ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を１．４μＬずつ３０回にわたって抗体試料（３μＭの１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ又は１．５μＭのＴａｎｅｚｕｍａｂ）を満たした熱量計セルに滴定し、その際に生じた熱量を検出した。得られたデータを装置付属のソフトを用いＳｉｎｇｌｅ ｓｉｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌによって解析することで、抗原−抗体結合に伴われる結合親和力（Ｋｄ）、結合比（ｎ）、結合自由エネルギー（ΔＧ）、結合エンタルピー（ΔＨ）、及び結合エントロピー（−ＴΔＳ）を見積もった。結果を表２に示す。

その結果、ＴａｎｅｚｕｍａｂのＫｄ値が２０．４１ｎＭであったのに対し、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧのＫｄ値は１．４９ｎＭであり、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧの結合親和性はＴａｎｅｚｕｍａｂよりも１０倍以上強力であった。

（実施例２１：各種ＰＥＧサイズのＰＥＧ化１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’の作製及び中和活性評価）
実施例１８で作製した１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’に対して、実施例１３と同様の手順を用いて、５ｋＤａ ＰＥＧ又は１０ｋＤａ ＰＥＧを結合させた。具体的には、２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４）にて調製したＦａｂ’フラグメント溶液をＴＣＥＰで還元させた後、脱塩カラムを用いてＦａｂ’フラグメントを回収した。得られたＦａｂ’フラグメントにＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−５０ＭＡ又はＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−１００ＭＡ；いずれもＮＯＦ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を添加し、４℃で一晩静置した。このようにして得られた、５ｋＤａ ＰＥＧ又は１０ｋＤａ ＰＥＧを結合させた１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’を、それぞれ１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−５ｋＰＥＧ、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧと称する。

次に、実施例６に示す方法を用いて、各ＰＥＧ化Ｆａｂ’フラグメントの中和活性を比較した。比較対照として、実施例１９で作製した１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ（４０ｋＤａ ＰＥＧを結合；以下、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−４０ｋＰＥＧとも称する）を用いた。今回の実験ではＮＧＦ最終濃度を５０ｎｇ／ｍｌで実施した。その結果、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−５ｋＰＥＧ、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧ、及び１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−４０ｋＰＥＧのＩＣ５０は、それぞれ０．０３０μｇ／ｍｌ、０．０２８μｇ／ｍｌ、及び０．０２３μｇ／ｍｌであった。この結果から、ＰＥＧサイズは５ｋＤａから４０ｋＤａのサイズにおいてはＦａｂ’フラグメントの中和活性に影響しないことがわかった。

（実施例２２：各種ＰＥＧサイズのＰＥＧ化１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’のマウスＰＫ評価）
各種ＰＥＧ化１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’のマウスＰＫ評価を行った。具体的には、０．３ｍｇ／ｋｇの各種ＰＥＧ化１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’を静脈内に投与し、投与後１、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、及び１６８時間毎に採血した。得られた血液中の被検抗体量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。具体的には、被検抗体を、ＮＧＦを固定化したＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）に添加した。プレートに結合した被検抗体をビオチン標識抗ヒトカッパ抗体で認識し、これをＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識ストレプトアビジンで検出した。血中濃度の算出は、各標準品で検量線を作製して求めた。算出した血中濃度より血中半減期（Ｔ１／２：時間）を計算した。その結果、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−５ｋＰＥＧ、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧ、及び１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−４０ｋＰＥＧのＴ１／２は、それぞれ１３．８±２．２時間、１７．７±０．４時間、及び３９．２±３．７時間であった。

（実施例２３：ラット足裏切開モデルによる鎮痛効果試験）
臨床における術後痛を反映するとされるラット足裏切開後痛モデル(Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００４；５．３４．１−５．３４．８)を用いて、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−５ｋＰＥＧ及び１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧの術後痛に対する鎮痛効果を評価した。

具体的には、各群８匹とし、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−５ｋＰＥＧ又は−１０ｋＰＥＧをラット静脈内に投与し（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、投与容量は１ｍＬ／ｋｇ）、右後肢足裏を踵先端から５ｍｍ部分を起点として１０ｍｍつま先方向へ直線的に切開して直ちにナイロン糸で２か所マットレス縫合することで疼痛を惹起した。惹起５時間、１日、２日、３日、４日、及び５日に術部位付近の疼痛閾値を測定した。測定は、Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ社製Ｄｙｎａｍｉｃ ｐｌａｎｔａｒ ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒを用いて、ラットの足裏への加圧に対する逃避行動を示す圧力を測定した。比較対照として、先行抗体Ｔａｎｅｚｕｍａｂを用いた。

その結果、術後１日のＴａｎｅｚｕｍａｂの静脈内投与での鎮痛効果がＥＤ５０＝０．２６ｍｇ／ｋｇであったのに対し、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−５ｋＰＥＧ又は−１０ｋＰＥＧは、いずれもＥＤ５０＝０．１５ｍｇ／ｋｇで鎮痛効果を発揮し、約２倍の有効性を示した。また、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−５ｋＰＥＧ又は−１０ｋＰＥＧの有意な鎮痛効果は、それぞれ術後３日あるいは４日まで観察された。

（実施例２４：凝集安定性評価）
１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−４０ｋＰＥＧを、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７．４、及びｐＨ９の各条件で１ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌに溶解した。これらをそれぞれ５０℃の条件におき、２週間後の凝集安定性について評価を行った。凝集性の評価はサイズ排除クロマトグラフィーにより行い、Ａｇｉｌｅｎｔ社製１１００を用いて測定した。測定条件は、移動相のバッファーとして０．１Ｍリン酸ナトリウム（０．２Ｍアルギニン含有）（ｐＨ６．８）を用い、カラムはＴＳＫ ｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ Ｓｗ３０００（ＴＯＳＯＨ,２．０ｍｍＩＤ×３００ｍｍ）を用いた。検出波長は２８０ｎｍで行った。１ｍｇ／ｍｌでの試験では、比較抗体としてＴａｎｅｚｕｍａｂを用い、その結果を表３に示す。１０ｍｇ／ｍｌでの試験では、比較抗体としてＴａｎｅｚｕｍａｂ及びＲＥＧＮ４７５を用い、その結果を表４に示す。

その結果、Ｔａｎｅｚｕｍａｂ及びＲＥＧＮ４７５は２週間後に顕著な凝集体の産生上昇が観察されたのに対し、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−４０ｋＰＥＧでは凝集体が殆ど検出されなかった。この結果から、ＰＥＧ化１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’は、保存安定性に優れる医薬品になりうる可能性が高いことが示唆された。

− 試験せず

（実施例２５：ラットモノソディウムヨードアセテート誘発変形性関節症モデルにおける膝関節浮腫に対する抗ヒトＮＧＦ抗体の影響）
雄性ＳＤラットをイソフルランで麻酔し、１ｍｇモノソディウムヨードアセテート（ＭＩＡ；シグマ社）を右膝の膝蓋靭帯を通して関節内に投与した。ＭＩＡは生理食塩水で希釈して調製し、２６ゲージ、０．５インチの注射針を用いて５０μｌの用量で投与した。ＭＩＡ投与後２日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；コントロール群）、Ｔａｎｅｚｕｍａｂ（１ｍｇ／ｋｇ、１回）、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ（１ｍｇ／ｋｇ、１回／８日）、又は１−１５（Ｎ５２Ｄ）−ヒトＩｇＧ抗体（実施例１１に記載の方法において１−１５（Ｎ５２Ｄ）の重鎖可変領域遺伝子の３’側にヒトＩｇγ１の定常領域遺伝子を繋げ、全長の完全ヒト型抗体として作製）（１ｍｇ／ｋｇ、１回）を尾静脈から投与した（各群ｎ＝６）。ＭＩＡを投与した右膝及び投与していない左膝の関節幅をノギスを用いて測定し、右膝の幅と左膝の幅の差を計算した。

結果を図２に示す。ＰＢＳで処置したラット（図２中、Ｃｏｎｔｒｏｌ）においては、膝関節の幅の差（関節浮腫）は、ＭＩＡ投与後一過的に増加したが、約１４日以内にほぼ正常レベル（ＭＩＡ非処置群；図２中、Ｎｏｒｍａｌ）まで減少した。同様の結果は、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ処置群でも認められた。一方、Ｔａｎｅｚｕｍａｂ投与群では膝関節浮腫が時間依存的に亢進され、ＭＩＡ投与後２８日目に右膝と左膝の差は約３．６ｍｍに達した。同様の浮腫の亢進は１−１５（Ｎ５２Ｄ）−ヒトＩｇＧ抗体投与群（図２中、１−１５（Ｎ５２Ｄ））でも認められた。また、膝関節浮腫が抗ヒトＮＧＦ抗体に起因することを確認するために、ヒトＩｇＧ抗体（抗ＫＬＨ抗体、１ｍｇ／ｋｇ、１回）を用いて同様の試験を行ったところ、ＰＢＳ群及び１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ群と同様、膝関節浮腫の亢進作用は認められなかった。

右膝関節のＭＲＩ画像において、ＭＩＡ投与により大腿骨遠位端及び脛骨近位端に軟骨破壊が認められた。Ｔａｎｅｚｕｍａ投与群では、浮腫像及び軟骨・軟骨下骨の損傷が認められたが、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧでは損傷程度はコントロールと変わらなかった。これらの結果から、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ投与では変形性関節症における炎症状態が亢進するリスクを低減できる可能性があることが示唆された。

（実施例２６：ラット破骨細胞による吸収窩形成に対する抗ヒトＮＧＦ抗体の影響）
本実施例を破骨細胞培養キット（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ社）を用いて実施した。ラット骨髄由来破骨前駆細胞を温浴にて３７℃で解凍後、洗浄用培地を添加し遠心した。上清を除去後同様の操作を繰り返した後、ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＳＦを含む培養用培地を用いて細胞浮遊液を調製した。オステオプレートに細胞を播種し、ＰＢＳ、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ、又はＴａｎｅｚｕｍａｂを、各３２０ｎＭをウェルに添加した。細胞を５％ＣＯ₂存在下の３７℃のＣＯ₂インキュベーターで7日間培養した。２日おきに培地を交換し、７日目に破骨細胞によって形成される吸収窩の面積をＡｒｒａｙＳｃａｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）にて計測した。

結果を図３に示す。ＴａｎｅｚｕｍａｂはＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＳＦによって誘導される破骨細胞の吸収窩形成作用（面積）を亢進させたのに対し、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧは吸収窩形成作用に影響を与えなかった。このことから、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ投与では骨吸収作用による関節損傷のリスクが低減できる可能性があることが示唆された。

本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体、より具体的には、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防又は治療に有用である。

Claims (7)

1. ポリエチレングリコールを結合させた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントの生産方法であって、
   以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントを発現させる工程、及び、
   チオール反応基を結合させた平均分子量約４０ＫＤａのポリエチレングリコール誘導体を使用し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基とマレイミド基を共有結合させる工程を包含する、
   ポリエチレングリコールを結合させた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントを生産する方法：
   （ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
   （ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
2. ポリエチレングリコールを結合させた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントの生産方法であって、
   以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントを発現させる工程、及び、
   チオール反応基を結合させた平均分子量約４０ＫＤａのポリエチレングリコール誘導体を使用し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基とマレイミド基を共有結合させる工程を包含する、
   ポリエチレングリコールを結合させた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントを生産する方法：
   （ａ）配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
   （ｂ）配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
3. ポリエチレングリコールを結合させた、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントであって、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントを発現させる工程を包含する抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントを生産する方法によって生産された抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントに、チオール反応基を結合させた平均分子量約４０ＫＤａのポリエチレングリコール誘導体を使用し、ヒンジ領域システインのチオール基とマレイミド基を共有結合させる工程を包含する方法によって結合させた、ポリエチレングリコールを結合させた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメント：
   （ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
   （ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
4. ポリエチレングリコールを結合させた、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントであって、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントを発現させる工程を包含する抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントを生産する方法によって生産された、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントに、チオール反応基を結合させた平均分子量約４０ＫＤａのポリエチレングリコール誘導体を使用し、ヒンジ領域システインのチオール基とマレイミド基を共有結合させる工程を包含する方法によって結合させた、ポリエチレングリコールを結合させた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメント：
   （ａ）配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
   （ｂ）配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
5. 抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントであって、
   配列番号２の３１〜３５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２の５０〜６５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２の９８〜１１０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに
   配列番号４の２４〜３９番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４の５５〜６１番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４の９４〜１０２番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
   を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
6. 抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントであって、
   配列番号６の３１〜３５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６の５０〜６５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６の９８〜１１０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに
   配列番号４の２４〜３９番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４の５５〜６１番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４の９４〜１０２番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
   を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
7. 配列番号２又は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。

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