JP6700620B2 - 新規抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント - Google Patents
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Description
(1)以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント:
(a)配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント;及び
(b)(a)の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの翻訳後修飾により生じた抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
(2)配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記(1)に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
(3)翻訳後修飾が重鎖可変領域N末端のピログルタミル化である、上記(1)に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
(4)配列番号5のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記(1)に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
(5)上記(1)に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
(6)以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、発現ベクター:
(a)上記(1)に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクター;及び
(b)上記(1)に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(7)上記(6)に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(8)以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、上記(7)に記載の宿主細胞:
(a)上記(1)に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(b)上記(1)に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。
(9)上記(8)に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントを生産する方法。
(10)上記(9)に記載の方法で生産できる抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
(11)上記(1)〜(4)及び(10)のいずれかに記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
(12)術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、上記(11)に記載の医薬組成物。
(13)上記(2)に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント、上記(4)に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
(14)術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、上記(13)に記載の医薬組成物。
(15)術後疼痛の治療用局所医薬組成物の製造のための、上記(1)〜(4)及び(10)のいずれかに記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの使用。
(16)術後疼痛の治療のための、上記(1)〜(4)及び(10)のいずれかに記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの局所投与による使用。
(17)術後疼痛の治療に局所投与での使用をするための、上記(1)〜(4)及び(10)のいずれかに記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
(18)上記(1)〜(4)及び(10)のいずれかに記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの有効量を対象の局所に投与することを含む、術後疼痛の治療方法。
配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
配列番号5のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
(a)配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント;及び
(b)(a)の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの翻訳後修飾により生じた抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
(a)配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント;及び
(b)配列番号5のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
(a)本発明の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、該抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(b)本発明の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、該抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
1−15(N52D)−Fab’フラグメント(特許文献3)の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを鋳型として、VHからヒンジ領域の遺伝子断片3種(配列番号1、配列番号2及び配列番号3)を各々増幅できるように設計したプライマーを用い、Phusion High−Fidelity DNA Polymerase(Finnzymes社、F−530L)を用いて当該3種の遺伝子断片を増幅した。増幅した領域の5’側にはHindIIIが、3’側にはEcoRIが含まれている。このようにして得た重鎖遺伝子断片をHindIIIとEcoRI(ともにNEB社)で消化し、発現ベクターであるpEE6.4に挿入した。
作製した各抗ヒトNGF抗体FabフラグメントのヒトNGF機能阻害活性評価を行うため、ヒトNGFとその受容体trkAの結合阻害を指標としたヒトNGF−trkA拮抗ELISAを行った。ヒトtrkA(R&D Systems社、175−TK−050)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2000ng/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色96プレート(Nunc社、436110)に1ウェルあたり50μL添加し、4℃で一晩プレートをインキュベートすることで固相化した。逆遠心によりヒトtrkA固相液を除去し、Blocker Casein in TBS(Thermo社、37532)を1ウェルあたり200μL添加した。プレートを室温にて30分間インキュベートした後、逆遠心によりBlocker Casein in TBSを除去した。0.1%ウシ血清由来アルブミン(BSA)含有PBSを用いて約200000ng/mLから約2ng/mLの間で7から11段階に希釈した精製抗体サンプルを、それぞれ700ng/mLのビオチン化ヒトNGFと等量ずつ混合し、室温にて30分間インキュベートしたサンプルを1ウェルあたり100μL添加した。尚、ここで用いたビオチン化ヒトNGFは、ヒトNGF(R&D Systems社、256−GF−100/CF)をEZ−Link NHS−PEG4−Biotin(Thermo社、21329)を使用してビオチン化したものを用いた。ヒトNGFのビオチン化は、250μLの0.4mg/mL ヒトNGF溶液に対して、1.25μLの5mM NHS−PEG4−Biotin溶液を添加し、氷上、遮光条件で2時間反応させた後、マニュアルに従ってAmicon Ultra−0.5mL 3K(Millipore社、UFC500324)を2回用いて、反応液をPBS溶液として回収することにより行った。コントロールとして0.1%BSA含有PBSを準備した。室温にて30分間インキュベートした後、プレートを洗浄液(0.05% Tween−20含有トリス緩衝生理食塩水(TBS))で3回洗浄し、PBSで20倍に希釈したブロッキングワン(ナカライテスク社、03953−95)溶液で1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン(Thermo社、21324)を1ウェルあたり100μL添加した。室温にて30分間インキュベートした後、プレートを洗浄液で3回洗浄し、0.1mM塩化マグネシウム含有2mMトリス(pH9.8)緩衝液で5倍希釈したアルカリフォスファターゼ基質(Chemiluminescent AP Microwell/Membrane Substrate, Super Sensitive, 450nm;SurModics社、APU4−0100−01)を1ウェルあたり100μL加えた。室温にて30分間インキュベートし、そのシグナル値をEnVisionカウンター(パーキンエルマー社)で測定した。
1−15(N52D−A)−Fab’フラグメント、h1f.6抗体、h1f.7抗体、h1f.8抗体の各溶液をpH5,6,7の緩衝液(pH5,6は20mM クエン酸・120mM NaCl、pH7はPBS)に置換し、10mg/mLに調整して50℃、14日間保存し、安定性を評価した。
pH6において50℃、14日間保存した1−15(N52D−A)−Fab’フラグメント、h1f.6抗体、h1f.7抗体、及びh1f.8抗体の保存後のヒトNGF−trkA結合阻害活性の変化を実施例2に記載のヒトNGF−trkA拮抗ELISAを用いて評価した。2試行のIC50値を幾何平均した結果、1−15(N52D−A)−Fab’フラグメント、h1f.6抗体、h1f.7抗体、h1f.8抗体の50℃、14日間保存後のヒトNGF−trkA結合阻害IC50値はそれぞれ0.47μg/mL、0.38μg/mL、0.56μg/mL、0.47μg/mLであった。各抗体の50℃、14日間保存後の保存前に対するIC50増加率はそれぞれ59%、21%、87%、68%であった。
h1f.6抗体の抗原結合活性を測定するために、ELISAを使用した。ここではヒトNGFに対する結合能を評価するために、ヒトNGFを固相化したプレートを用いて試験した。この際、比較対照として先行抗体Tanezumabを用いた。
h1f.6抗体のヒトNGF機能阻害活性を測定するために、実施例2で用いたNGF−trkA結合阻害を評価する拮抗ELISAを使用した。この際、比較対照として先行抗体Tanezumabを用いた。
h1f.6抗体を局所投与した後、抗体の局所滞留を評価するため、投与組織における抗体濃度を評価した。正常ラットに各n=4でh1f.6抗体を0.3及び3mg/kgで大腿筋内に局所投与し、投与6時間後の大腿筋中の抗体濃度をElectrochemiluminescence(ECL)アッセイにより測定した。局所投与は抗体をPBSを溶媒として0.2mL/kgの投与容量で大腿筋内に注射することで行った。
ヒトNGF(R&D Systems社、256−GF/CF)をPBSで1000ng/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色384プレート(Nunc社、460372)に1ウェルあたり20μL添加し、4℃で一晩プレートをインキュベートして固相化した。逆遠心によりヒトNGF固相液を除去し、ブロッキングワン(ナカライテスク社、03953−95)溶液を1ウェルあたり80μL添加し、室温にて1時間プレートをインキュベートした。プレートを洗浄液(0.05% Tween−20含有TBS)で3回洗浄し、0.05% Tween−20含有TBSで10倍に希釈したブロッキングワンを用いて0.3mg/kg投与群は10倍、3mg/kg投与群は100倍に大腿筋ホモジネートを希釈し、1ウェルあたり20μL添加した。
また、0.3mg/kg投与群及び3mg/kg投与群の大腿筋ホモジネートの検量線作成用に、0.05% Tween−20含有TBSで10倍に希釈したブロッキングワンに抗体未投与の大腿筋ホモジネート10%及び1%を加えた希釈液で、それぞれh1f.6抗体を3000ng/mLから0.03ng/mLまで11段階に希釈し、1ウェルあたり20μL添加した。
ヒトtrkA(R&D Systems社、175−TK−050)をPBSで2000ng/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色384プレートに1ウェルあたり20μL添加し、4℃で一晩インキュベートすることで固相化した。逆遠心によりヒトtrkA固相液を除去し、Blocker Casein in TBSを1ウェルあたり80μL添加し、室温にて30分間プレートをインキュベートした。プレートを洗浄液(0.05% Tween−20含有TBS)で3回洗浄し、Blocker Casein in TBSを除去した。0.1%BSA含有PBSを用いて0.3mg/kg投与群は5倍、3mg/kg投与群は50倍に希釈したラット大腿筋ホモジネートを、それぞれ0.4μg/mLのビオチン化ヒトNGFと等量ずつ混合し、室温にて30分間インキュベートしたサンプルを1ウェルあたり20μL添加した。尚、ラット大腿筋ホモジネートは採取した大腿筋組織を2.5倍量の組織ホモジネート液で作製しているため、0.3及び3mg/kg投与群はもとの大腿筋組織濃度のそれぞれ35倍及び350倍希釈した溶液を用いて評価している。
ここで用いたビオチン化ヒトNGFは、ヒトNGF(R&D Systems社、256−GF−100/CF)をEZ−Link NHS−PEG4−Biotin(Thermo社、21329)を使用してビオチン化したものを用いた。ヒトNGFのビオチン化は、1mLの0.4 mg/mL ヒトNGF溶液に対して、5μLの5mM NHS−PEG4−Biotin溶液を添加した。氷上、遮光条件で2時間反応させた後、マニュアルに従ってAmicon Ultra−0.5mL 3K(Millipore社、UFC500324)を2回用いて、反応液をPBS溶液として回収することにより行った。
コントロールとして0.1%BSA含有PBSと、0.1%BSA含有PBSを用いて希釈したh1f.6抗体 10μg/mLを準備した。0.3mg/kg投与群及び3mg/kg投与群のコントロールサンプルは0.1%BSA含有PBSに抗体未投与の大腿筋ホモジネートを10%及び1%加えた希釈液を用いてそれぞれ調製した。室温にて30分間インキュベートした後、プレートを洗浄液で3回洗浄し、0.05% Tween−20含有TBSで20倍に希釈したブロッキングワン溶液で1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン(Thermo社、21324)を1ウェルあたり20μL添加した。室温にて30分間インキュベートした後、プレートを洗浄液で3回洗浄し、10mM塩化マグネシウム含有200mMトリス(pH9.8)緩衝液を10倍希釈した溶液と1:1で混和したアルカリフォスファターゼ基質(Chemiluminescent AP Microwell/Membrane Substrate, Super Sensitive, 450nm;SurModics社、APU4−0100−01)を1ウェルあたり20μL加えた。室温にて30分間インキュベートし、そのシグナル値をEnVisionカウンター(パーキンエルマー社)で測定した。
各濃度におけるヒトNGF機能阻害活性を算出するにあたり、0.1%BSA含有PBSを添加したサンプルの測定値を0%とし、10μg/mLの測定値を100%と設定した。試験はデュプリケート(コントロールは4或いは8ウェル)で行い、算術平均を算出した。
臨床における術後疼痛を反映するとされるラット足裏切開術後痛モデル(Pain、2005、Vol.117、p.68−76)を用いて、h1f.6抗体を術部に局所投与した際の術後痛に対する鎮痛効果を評価した。特許文献3には、完全ヒト型抗ヒトNGF抗体1−15(N52D−A)−Fab’−10kPEGが静脈内投与の全身投与によって本モデルでの鎮痛効果を有することが示されている。本試験では、h1f.6抗体の局所投与による術後痛に対する鎮痛効果を評価するにあたり、比較対照として1−15(N52D−A)−Fab’−10kPEGの局所投与及び全身投与を用いた。
実施例8での評価の際の各抗体の足底筋中及び血漿中の濃度を評価するために、実施例8と同様の方法でラットに各n=3でh1f.6抗体を900μg足裏局所投与した群、1−15(N52D−A)−Fab’−10kPEGを900μg足裏局所投与した群、1−15(N52D−A)−Fab’−10kPEGを1mg/kg静脈内投与した群を設定し、24時間後の足底筋中及び血漿中の抗体濃度をECLアッセイにより測定した。足裏局所投与は実施例8と同じく約2mg小片のSpongel(登録商標)シート(アステラス製薬)に30mg/mL抗体溶液30μLを浸透膨潤させたものを切開した足底の筋部に埋め込み縫合することで行った。
Claims (16)
- 以下の(a)及び(b)からなる群より選択される抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント:
(a)配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント;及び
(b)(a)の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの翻訳後修飾により生じた抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。 - 配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項1に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
- 翻訳後修飾が重鎖可変領域N末端のピログルタミル化である、請求項1に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
- 配列番号5のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項1に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
- 請求項1に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
- 以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、発現ベクター:
(a)請求項1に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドと該抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとを含む発現ベクター;及び
(b)請求項1に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 - 請求項6に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、請求項7に記載の宿主細胞:
(a)請求項1に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドと該抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(b)請求項1に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。 - 請求項8に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントを生産する方法。
- 請求項9に記載の方法で生産できる抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
- 請求項1〜4及び10のいずれか1項に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、請求項11に記載の医薬組成物。
- 請求項2に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント、請求項4に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、請求項13に記載の医薬組成物。
- 術後疼痛の治療用局所医薬組成物の製造のための、請求項1〜4及び10のいずれか1項に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメントの使用。
- 術後疼痛の治療に局所投与での使用をするための、請求項1〜4及び10のいずれか1項に記載の抗ヒトNGF抗体Fabフラグメント。
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