UA123209C2 - Fab-ФРАГМЕНТ АНТИТІЛА ДО ЛЮДСЬКОГО NGF - Google Patents
Fab-ФРАГМЕНТ АНТИТІЛА ДО ЛЮДСЬКОГО NGF Download PDFInfo
- Publication number
- UA123209C2 UA123209C2 UAA201712706A UAA201712706A UA123209C2 UA 123209 C2 UA123209 C2 UA 123209C2 UA A201712706 A UAA201712706 A UA A201712706A UA A201712706 A UAA201712706 A UA A201712706A UA 123209 C2 UA123209 C2 UA 123209C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- fragment
- antibody
- human
- mob
- rar
- Prior art date
Links
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 title abstract 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 title abstract 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 249
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 48
- 208000004550 Postoperative Pain Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 101000702718 Homo sapiens Phosphatidylcholine:ceramide cholinephosphotransferase 1 Proteins 0.000 claims description 87
- 102000050044 human SGMS1 Human genes 0.000 claims description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 45
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 45
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 45
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 36
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 30
- 102100030919 Phosphatidylcholine:ceramide cholinephosphotransferase 1 Human genes 0.000 claims description 19
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 101100462200 Homo sapiens OPN4 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 4
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 30
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 abstract description 8
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 abstract 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 abstract 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 39
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 37
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 31
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 16
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 16
- PYVRVRFVLRNJLY-KTKRTIGZSA-N 1-oleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(O)COP(O)(=O)OCCN PYVRVRFVLRNJLY-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 15
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 15
- 235000018087 Spondias lutea Nutrition 0.000 description 15
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 15
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 208000000114 Pain Threshold Diseases 0.000 description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 13
- 230000037040 pain threshold Effects 0.000 description 13
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 108020001612 μ-opioid receptors Proteins 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 10
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 9
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 9
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 9
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 8
- 229950008160 tanezumab Drugs 0.000 description 8
- 101001115699 Homo sapiens Myelin-oligodendrocyte glycoprotein Proteins 0.000 description 7
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 6
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 6
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100498160 Mus musculus Dach1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 102000047972 human MOG Human genes 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 208000004454 Hyperalgesia Diseases 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 description 2
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 description 2
- 235000005459 Digitaria exilis Nutrition 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035154 Hyperesthesia Diseases 0.000 description 2
- -1 Ids2 Proteins 0.000 description 2
- 208000005615 Interstitial Cystitis Diseases 0.000 description 2
- 208000034693 Laceration Diseases 0.000 description 2
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 244000046146 Pueraria lobata Species 0.000 description 2
- 235000010575 Pueraria lobata Nutrition 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- 206010053552 allodynia Diseases 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 2
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 2
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 2
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 2
- NPWMTBZSRRLQNJ-VKHMYHEASA-N (3s)-3-aminopiperidine-2,6-dione Chemical compound N[C@H]1CCC(=O)NC1=O NPWMTBZSRRLQNJ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GGZZISOUXJHYOY-UHFFFAOYSA-N 8-amino-4-hydroxynaphthalene-2-sulfonic acid Chemical class C1=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(N)=CC=CC2=C1O GGZZISOUXJHYOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 101100421770 Arabidopsis thaliana SNI1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101710161338 Beta-enolase Proteins 0.000 description 1
- 206010005063 Bladder pain Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 244000194101 Ginkgo biloba Species 0.000 description 1
- 235000008100 Ginkgo biloba Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150083807 HSD17B10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000877537 Homo sapiens Beta-enolase Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100025912 Melanopsin Human genes 0.000 description 1
- 101100269376 Mus musculus Agfg2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 244000004005 Nypa fruticans Species 0.000 description 1
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 description 1
- 206010030124 Oedema peripheral Diseases 0.000 description 1
- 101100491259 Oryza sativa subsp. japonica AP2-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091005682 Receptor kinases Proteins 0.000 description 1
- 101100366622 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SRO7 gene Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 206010072005 Spinal pain Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000005937 Tropomyosin Human genes 0.000 description 1
- 108010030743 Tropomyosin Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000014155 detection of activity Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229950009370 fulranumab Drugs 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000009454 functional inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 101150028208 hesA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011201 multiple comparisons test Methods 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000035824 paresthesia Diseases 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 102200020637 rs121912986 Human genes 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000008337 systemic blood flow Effects 0.000 description 1
- 230000008542 thermal sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008736 traumatic injury Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Винахід стосується Fab-фрагмента антитіла до людського NGF, полінуклеотиду, що його кодує, експресуючого вектора, клітини-хазяїна, способу одержання даного Fab-фрагмента. Винахід також стосується застосування Fab-фрагмента антитіла до людського NGF для створення фармацевтичної композиції для місцевого введення для лікування післяопераційного болю та фармацевтичної композиції, що містить такий Fab-фрагмент.
Description
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
Даний винахід належить до нового Бар-фрагмента антитіла до людського МОРЕ. Даний винахід також належить до полінуклеотиду, який містить послідовність основ, що кодує Еар- фрагмент антитіла до людського МОРЕ, експресуючого вектора, що включає полінуклеотид, і клітини-хазяїна, трансформованої експресуючим вектором, і до способу одержання Рар- фрагмента антитіла до людського МОР. Даний винахід додатково належить до фармацевтичної композиції, що містить Рар-фрагмент антитіла до людського МОРЕ, і до способу лікування післяопераційного болю з використанням Раб-фрагмента антитіла до людського МОБ.
ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Фактор росту нервів (МОРЕ) є одним з гуморальних факторів, як правило, що називаються "нейротрофічні фактори", і відіграє важливу роль в утворюванні і диференціюванні нейронів і в підтримці функцій нейронів в організмі. Високоафінний ІгКА (тропоміозин-рецепторна кіназа А) і низькоафінний р/5МТЕК (рецептор р75 нейротрофіну) відомі як рецептори МОР. Відносно до них, є дані, в яких повідомляють, що р/5МТЕ зв'язується з усіма нейротрофічними факторами і бере участь в апоптозі в процесі утворювання нейронів. Однак, роль р/5МТК ще недостатньо пояснена. Крім того, відомо, що миші, нокаутні по МОРЕ і ї(КА, експресують такий же фенотип (МРГ), ії вважається, що фізіологічна дія МОЕ виражається, в основному, через ІгКА.
Повідомлялося, що введення МОРЕ викликає біль у щурів (МРІ. 2), і що внутрішньовенне введення МОРЕ людині викликає м'язовий біль в усьому тілі, а місцеве нанесення МОРЕ викликає гіпералгезію і алодинію в місці введення МОБ, а також біль в усьому тілі (МР. 3). Відомо, що кількість МОРЕ, що експресується у тварин, підвищується, коли тканини ушкоджені при розсіченні м'язової тканини (МРІ 4) ії шкірної тканини (МРІ 5) у тварин, таких як щурині моделі післяопераційного болю. Що стосується патологічного стану болю у людини, було підтверджено, що експресія МОР і (КА прискорюється в суглобовому хрящі при остеоартриті (ОА) (МРІ 6), що рівень МОЕ підвищується в ексудатах з ділянки розрізу, коли проводять кесарів розтин (МРІ. 7), ї що рівень МОЕ підвищується у пацієнтів з ревматоїдним артритом (МРІ. 8) або інтерстиціальним циститом (МРІ. 9).
До теперішнього часу повідомлялося, що біль приглушується у різних моделей болю на тваринах, коли інгібується сигнал МОБ (МРІ. 10, РТІ. з 1 до 3).
Дотепер були описані антитіла до МОЕ людини, КЕСМА75 (РТІ. 2), 1-15(«М520-А)-Рар-РЕСЯ (РТ 3), фультранумаб (РТ 4), і МЕ0І-578 (РТІ 5) як повністю людські антитіла до МОГ людини, і танезумаб (РТІ. 6) і РО110 (РТІ 7) як гуманізовані антитіла до МОЕ людини. Відносно до них описано, що підшкірне введення танезумабу на додаток до його внутрішньовенного введення демонструє поширений аналгетичний вплив на біль, такий як артралгія, що супроводжує остеоартрит, хронічний хребетний біль, і цисталгія, що супроводжує інтерстиціальний цистит (МРІ. з 11 до 13) в клінічних умовах.
Було описано, що множина медичних препаратів демонструє побічні ефекти, і антитіла до
МОБ не є виключенням. У зв'язку з клінічним дослідженням танезумабу (МРІ. 11) повідомлялося про побічні явища, пов'язані з введенням людині антитіла до МОБ, такі як головні болі, інфекція верхніх дихальних шляхів, і парестезія; у зв'язку з клінічним дослідженням фульранумабу (МРІ. 14 - сприйняття порушення, головні болі і ринофарингіт; і артралгія, гіперестезія, м'язовий біль, периферичний набряк, і суглобова грижа у зв'язку з клінічним дослідженням КЕСМА75 (МРІ. 15).
Загалом, коли лікарський засіб впливає на тканини, інші, ніж тканина-мішень, він викликає небажані для організму людини побічні ефекти в тканинах.
Звичайно розробляють фармацевтичні засоби для місцевого введення для профілактики або зниження побічних ефектів за рахунок підвищення концентрації в тканині в місці введення і за рахунок зниження впливу на інші тканини за допомогою системного кровотоку через безпосереднє введення в тканину-мішень.
Є багато терапевтичних антитіл, які можна вводити підшкірно або внутрішньом'язово на додаток до антитіл, які вводять шляхом внутрішньосудинного введення у вени і т. д. Після підшкірного або внутрішньом'язового введення, антитіла відразу ж переносяться у кров через лімфатичну систему, а потім циркулюють на всьому протязі тіла. Багато терапевтичних антитіл після перенесення у кров циркулюють у кровотоку для доставки в тканину-мішень, де вони проявляють фармакологічні ефекти. Додатково, багато терапевтичних антитіл демонструють переважне розподілення у крові, і низьке проникнення в тканину-мішень (співвідношення концентрацій в тканині/крові). Таким чином, висока концентрація багатьох терапевтичних антитіл у крові має бути істотною для підтримки ефективної концентрації в тканині-мішені (МР. 16). Крім того, багато терапевтичних антитіл мають напіввиведення у крові в діапазоні від декількох діб до місяця, і підтримують довгострокову стійку концентрацію у крові для збереження фармакологічного впливу протягом тривалого періоду. Таким чином, навіть якщо звичайне терапевтичне антитіло вводять місцево, як підшкірне або внутрішньом'язове введення, воно все ще буде виробляти системний фармакологічний вплив/побічний ефект, залишаючись у крові і циркулюючи по всьому тілу.
Мультимеризація, включаючи димеризацію, стає серйозною проблемою при спробі гарантувати стабільну і однорідну якість в галузі біологічних препаратів, таких як терапевтичні антитіла.
Відомо, що Е(аб)г, який є димером Рар', має фармакокінетику, що відрізняється від Рар' (МРІ. 17 ії 18).
Повідомлялося, що природне антитіло проти Е(аб)», який є димером Раб, викликає видалення антитіла (МРІ 19). Цей тип реакції антиген-антитіло порушує фармакокінетику фармацевтичного засобу таким чином, що антитіло видаляється набагато швидше, і також створює ризики реакції анафілаксії, і т. д. Як можна бачити, існують деякі ризики, пов'язані з
Каб)».
ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ:
ПАТЕНТНА ЛІТЕРАТУРА
РТІ 1: МО 2013/183032
РТІ 2: МО 2009/023540
РТІ 3: МО 2013/022083
РТІ 4: МО 2005/019266
РТІ 5: МО 2006/077441
РТІ 6: МО 2004/058184
РТІ. 7: патент США Мо 8435523
НЕПАТЕНТНА ЛІТЕРАТУРА
МРІ. 1: "Немівемув іп Ше Мешгозсієепсев", 1997, Мої. 8, р.13-27
МРІ. 2: "Тне уЧоштпаї ої Меигозсіепсе", 1993, Мої. 13, р. 2136-2148
МРІ. 3: "Аппаї5 ої Мешйгоіоду", 1994, Мої. 36, р. 244-246
МРІ. 4: "Апевіпезіоіоду", 2009, Мої. 110, р. 140-149
МРІ. 5: "Раїп", 2005, Мої. 117, р. 68-76
Коо) МРІ. 6: "Япеитаюіоду", 2002, Мої. 41, р. 1413-1418
МРІ. 7: "Тне уоштпаї ої Раїп", 2008, Мої. 9, р. 650-657
МРІ. 8: "Сіїіпіса! апа Ехрегітепіа! Апешйтагйоіоду", 1997, Мої. 15, р. 433-438
МРІ. 9: "Вийівп уоштаї ої Огоіоду", 1997, Мої. 79, р. 572-577
МРІ. 10: "Ттепавз іп Рнаптасоїіодіса! 5сіепсев", 2006, Мої. 27, р. 85-91
МРІ. 11: "Тне Мем Епдіапа уоиштпаї ої Медісіпе", 2010, Мої. 363, р. 1521-1531
МРІ. 12: "Тне Уоситпаї ої Огоїоду", 2011, Мої.1 85, р. 1716-1721
МРІ. 13: "Раїп", 2011, Мої. 152, р. 2248-2258
МРІ. 14: "Раїп", 2013, Мої. 154, р. 1910-1919
МРІ. 15: "Раїп", 2014, Мої. 155, р. 1245-1252
МРІ. 16: "Віоапа!увів", 2013, Мої. 5, р. 2003-2014
МРІ. 17: "Тне Уоигпаї ої Рпаппасоїоду апа Ехрегітепіа! Пегарешісв", 1997, Мої. 281, р. 1-8
МРІ. 18: "Сапсег Везвєагсп", 1986, Мої. 46, р. 3969-3978
МРІ. 19: "Гштореап уошгтпаї ої Іттипоіоду", 1995, Мої. 25, р. 3128-3133
СУТЬ ВИНАХОДУ
ТЕХНІЧНЕ ЗАВДАННЯ
Метою даного винаходу є створення кращого Бар-фрагмента антитіла до людського МОБ, який зберігає високу нейтралізуючу активність, і який знижує системні побічні ефекти, що виникають через системний вплив, з одночасною демонстрацією місцевого фармакологічного впливу.
РОЗВ'ЯЗАННЯ ЗАВДАННЯ
Даний винахід належить до наступних винаходів, що належать до продуктів і способів, які мають медичну і промислову придатність.
Інакше кажучи, варіант здійснення даного винаходу може бути у наступній формі: (1) Рар-фрагмент антитіла до людського МОЕ, вибраний з групи, що складається з (а) і (Б) нижче: (а) Рар-фрагмент антитіла до людського МОРЕ, що містить фрагмент важкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в 5ЕО ІО МО: 5, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЗХЕОІЮ МО: 8; і, (5) Раб-фрагмент антитіла до людського МОБ, отриманий шляхом посттрансляційної бо модифікації Рар-фрагмента антитіла до людського МОБ з (а).
(2) Рар-фрагмент антитіла до людського МОРЕ згідно з (1), що містить фрагмент важкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЗЕО ІО МО: 5, і фрагмент легкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ХЕО ІЮО МО: 8. (3) Раб-фрагмент антитіла до людського МОБ за п. (1), де вказана посттрансляційна модифікація являє собою піроглутамінування на М-кінці варіабельної ділянки важкого ланцюга. (4) Рар-фрагмент антитіла до людського МОР згідно з (1), що містить фрагмент важкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в хЕО ІО МО: 5, де глутамін в амінокислотному положенні 1 5ЕО ІЮ МО: 5 модифікований у піроглутамінову кислоту, і фрагмент легкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЗЕО ІЮ
МО: 8. (5) Полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга з
Еаб-фрагмента антитіла до людського МОБ згідно з (1). (6) Експресуючий вектор, вибраний з групи, що складається з (а) і (б), показаних нижче: (а) експресуючий вектор, що включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Раб-фрагмента антитіла до людського МО згідно з (1), |і полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг вказаного Еар- фрагмента антитіла до людського МОБ; і (Б) експресуючий вектор, що включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Рар-фрагмента антитіла до людського МОБ згідно з (1). (7) Клітина-хазяїн, трансформована експресуючим вектором згідно з (6). (8) Клітина-хазяїн за п. (7), вибрана з групи, що складається з (а) і (б), показаних нижче: (а) клітина-хазяїн, трансформована експресуючим вектором, що включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Рар-фрагмента антитіла до людського МО згідно з (1), ї полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг вказаного Гар-фрагмента антитіла до людського МОБ; і (р) клітина-хазяїн, трансформована експресуючим вектором, що включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Рар-фрагмента антитіла до людського МОБ згідно з (1), і експресуючим вектором, що включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг вказаного Гар-фрагмента антитіла до людського
Коо) Ма. (9)у Спосіб для одержання Еар-фрагмента антитіла до людського МОБ, що включає культивування клітини-хазяїна згідно з (8) для експресії Рар-фрагмента антитіла до людського
Ма. (10) Рар-фрагмент антитіла до людського МОРЕ, здатний вироблятися по способу згідно з (9). (11) Фармацевтична композиція, що містить Рар-фрагмент антитіла до людського МОЕ за будь-яким з (1)-(4) і (10) і фармацевтично прийнятний носій. (12) Фармацевтична композиція згідно з (11), яка являє собою фармацевтичну композицію для місцевого введення для лікування післяопераційного болю. (13) Фармацевтична композиція, що містить Барб-фрагмент антитіла до людського МОГ згідно з (2), Рар-фрагмент антитіла до людського МОБ згідно з (4), і фармацевтично прийнятний носій. (14) Фармацевтична композиція згідно з (13), яка являє собою фармацевтичну композицію для місцевого введення для лікування післяопераційного болю. (15) Застосування Раб-фрагмента антитіла до людського МОЕ за будь-яким з (1)-(4) і (10) для одержання фармацевтичної композиції для місцевого введення для лікування післяопераційного болю. (16) Застосування Раб-фрагмента антитіла до людського МОЕ за будь-яким з (1)-(4) і (10) для лікування післяопераційного болю шляхом місцевого введення. (17) Рабр-фрагмент антитіла до людського МОБ за будь-яким з (1)-(4) і (10) для застосування для місцевого введення для лікування післяопераційного болю. (18) Спосіб лікування післяопераційного болю, що включає місцеве введення індивідууму ефективної кількості гар-фрагмента антитіла до людського МОБ за будь-яким з (1)-(4) і (10).
КОРИСНИЙ ЕФЕКТ ЗА ВИНАХОДОМ
Рар-фрагмент антитіла до людського МОЕ за даним винаходом ефективний для лікування післяопераційного болю, який як патологічний стан розвивається під впливом людського МОР.
Таким чином, Рар-фрагмент антитіла до людського МОЕ, що характеризується, за даним винаходом відрізняється чудовою фармакокінетикою, такою як висока нейтралізуюча активність і місцеве утримування, а також швидким видаленням з крові, що, таким чином, знижує дозу і продовжує дію лікарського засобу, а також знижує системні побічні ефекти від системного бо впливу і, таким чином, очікується, що буде забезпечувати помітне покращення як впливу, так і безпеки лікарського засобу для клінічного застосування. Гар-фрагмент антитіла до людського
МОР за даним винаходом вносить значний вклад у лікування післяопераційного болю, який пов'язаний з людським МОР.
ОПИС ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ
Даний винахід далі описаний докладно, але ці описи не обмежують обсяг винаходу. Якщо в даному описі не визначено інше, наукові терміни і технічні терміни, застосовувані у зв'язку з даним винаходом, мають значення, як правило, що розуміється фахівцем в даній галузі. Автори даного винаходу провели великі дослідження того, як одержати антитіла до людського МОРЕ або їх антигензв'язувальні фрагменти, і успішно одержали чудовий Рар-фрагмент антитіла до людського МОР, який зберігав високу нейтралізуючу активність, а також демонстрував місцевий вплив лікарського засобу, з одночасним зниженням системних побічних ефектів, що виникають через системний вплив.
Основна структура молекули антитіла широко поширена серед відповідних класів антитіл і складається з важких ланцюгів з молекулярною масою від 50000 до 70000 і легких ланцюгів з молекулярною масою від 20000 до 30000. Важкий ланцюг, як правило, складається з поліпептидного ланцюга, що включає приблизно 440 амінокислот, і кожний клас має свою характерну структуру. Важкі ланцюги називаються ланцюгами у, |, а, б, і є, що відповідають до,
І9М, ІДдА, дО, ії ЧЕ. Крім того, до має підкласи, такі як ІДС1, Ідс2, Ід, і Ідс4, і ці ланцюги називаються у, уг2, УЗ, і у4, відповідно. Легкий ланцюг, як правило, складається з поліпептидного ланцюга, що включає приблизно 220 амінокислот, і відомі два типи легкого ланцюга, що включають І-тип і К-тип, які називаються ланцюгами АХ і к, відповідно. Що стосується будови пептиду основної структури молекули, два гомологічних важких ланцюги і два гомологічних легких ланцюги зв'язані дисульфідними зв'язками (зв'язками 5-5) і нековалентними зв'язками, і їх молекулярна маса становить від 150000 до 190000. Два типи легких ланцюгів можуть бути спарені з будь-яким важким ланцюгом. Кожна молекула антитіла завжди складається з двох ідентичних легких ланцюгів і двох ідентичних важких ланцюгів.
Існують чотири внутрішньоланцюжкові зв'язки 5-5 у важкому ланцюзі (п'ять зв'язків для ланцюгів ної є) і два - у легкому ланцюзі. Одна петля утворена з 100-110 амінокислотних залишків, і ця стерична структура подібна серед відповідних петель і називається структурна одиниця або домен. Як для важких ланцюгів, так і для легких ланцюгів, амінокислотна послідовність домена, розташованого на них М-кінці, не є постійною, навіть у референсному стандарті з того ж самого класу (підкласу) того ж самого роду тварини, і цей домен називається варіабельною ділянкою. Кожний з доменів називається варіабельною ділянкою важкого ланцюга (МН) і варіабельною ділянкою легкого ланцюга (МІ), відповідно. Оскільки амінокислотна послідовність С-кінцевого боку від варіабельної ділянки практично постійна в кожному класі або підкласі, ця ділянка називається константною ділянкою, і кожний з доменів описується як СНІ, СН2, СНЗ і СІ, відповідно.
Ділянка антигенної детермінанти антитіла складається з МН і МІ, і специфічність зв'язування залежить від амінокислотної послідовності цієї ділянки. З іншого боку, види біологічної активності, такі як зв'язування з комплементом або різними клітинами відображають відмінності в структурі константної ділянки серед різних класів Ід. Відомо, що мінливість у варіабельних ділянках важкого ланцюга і легкого ланцюга переважно обмежена трьома невеликими гіперваріабельними ділянками, що є присутніми на обох ланцюгах, і ці ділянки називаються ділянками, що визначають комплементарність (СОК; СОКІ, СОК2 і СОКЗ, починаючи з М- кінцевої ділянки). Частина варіабельної ділянки, що залишилася, називається каркасною ділянкою (ЕК) і є відносно постійною.
Ділянка між доменом СНІ і доменом СН2 константної ділянки важкого ланцюга антитіла називається шарнірною ділянкою. Ця ділянка містить множину залишків проліну і має множину міжланцюжкових зв'язків 5-5, що з'єднують два важкі ланцюги. Наприклад, кожна шарнірна ділянка людини Ідс1, Ідс2, ІДОЗ, і ІдД4 включає 2, 4, 11, і 2 цистеїнових залишки, відповідно, які складають зв'язки 5-5 між важкими ланцюгами. Шарнірна ділянка являє собою ділянку з високою чутливістю до протеолітичного ферменту, такого як папаїн або пепсин. Коли антитіло розщеплюють папаїном, його важкий ланцюг розщеплюється в положенні, яке розташовано ближче до М-кінцевого боку, ніж до зв'язку 5-5 між важкими ланцюгами в шарнірній ділянці, за допомогою чого антитіло розділяється на два Рар-фрагменти і один Ес-фрагмент. Рар- фрагмент складається з легкого ланцюга і фрагмента важкого ланцюга, включаючи варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), домен СНІ і частину шарнірної ділянки. Коли антитіло розщеплюють пепсином, його важкий ланцюг розщеплюється в положенні, яке розташовано ближче до С-кінцевого боку, ніж до зв'язку 5-5 між важкими ланцюгами в шарнірній ділянці, за 60 допомогою чого одержують Е(аб)г2-фрагменти. Е(ар)2-фрагмент являє собою фрагмент з димерною структурою, в якому два фрагменти Рар' зв'язані один з одним за допомогою зв'язку 5-5 між важкими ланцюгами в шарнірній ділянці. Фрагмент Рар' складається з легкого ланцюга і фрагмента важкого ланцюга, включаючи варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), домен СНІ1 і частину шарнірної ділянки. Залишки цистеїну, що складають зв'язок 5-5 між важкими ланцюгами, включені в частину шарнірної ділянки. Усі з Гар-фрагмента, Е(аб)25-фрагмента, і фрагмента Рар' включають варіабельну ділянку і мають антигензв'язувальну активність.
Раб-фрагмент антитіла до людського МОБ за даним винаходом, успішно отриманий авторами даного винаходу, являє собою Раб-фрагмент з наступними характеристиками:
Еаб-фрагмент антитіла до людського МОР, що містить фрагмент важкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в 5ЕО ІЮ МО: 5, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЖЕО ІЮО МО: 8.
Конкретно, автори даного винаходу модифікували 1-15 (М520-А)-Рар'-ррагмент людського антитіла до МОЄ людини (РТІ 3; який також називається "1-15 (М520-А)-Ра" у вказаному документі) і шляхом скринінгу антитіл за допомогою різних тестів на біологічну активність і фізичні властивості успішно ідентифікували Рар-фрагмент антитіла до людського МОРЕ за даним винаходом як Рар-фрагмент антитіла до людського МОР, який є стабільним і зберігає високу нейтралізуючу активність і місцеве накопичення.
Еар-фрагмент антитіла до людського МОРЕ за даним винаходом може бути легко отриманий фахівцем в даній галузі з використанням загальновідомого способу на основі інформації про послідовність, розкриту в даному описі. Наприклад, РГаб-фрагмент антитіла до людського МОГ за даним винаходом можна одержувати шляхом синтезу полінуклеотиду, що містить послідовність основ, що кодує його фрагмент важкого ланцюга, і полінуклеотиду, що містить послідовність основ, що кодує його легкий ланцюг, і з'єднання їх з придатними експресуючими векторами. Потім, експресуючі вектори вводять в культуру клітин. Нарешті, коли клітини культивують, фахівець в даній галузі може одержувати моноклональні Рар-фрагменти з культурального супернатанту.
Полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Еар- фрагмента за даним винаходом, і полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг Рар-фрагмента за даним винаходом можна синтезувати, наприклад, на основі послідовності основ, сконструйованої згідно з амінокислотними послідовностями фрагмента важкого ланцюга і легкого ланцюга з використанням способів синтезу генів, загальновідомих в даній галузі. Наприклад, як такі способи синтезу генів можна використовувати спосіб синтезу генів антитіла, викладений в УМО 90/07861, і інші способи, загальновідомі фахівцю в даній галузі.
В одному з варіантів здійснення як полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга ЕРар-фрагмента антитіла до МОЄ людини, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в 5ЕО ІО МО: 5, для прикладу можна вказати полінуклеотид, що містить послідовність основ, показану в ЗЕО ІЮ МО: 1. Як полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг Рар-фрагмента антитіла до МОЄ людини, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в хЕО ІЮО МО: 8, для прикладу можна вказати полінуклеотид, що містить послідовність основ, показану в зХЕО ІЮ МО: 4.
Процеси після одержання полінуклеотиду, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Бар-фрагмента за даним винаходом, і полінуклеотиду, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг Раб-фрагмента за даним винаходом, такі як введення полінуклеотиду в експресуючий вектор, введення експресуючого вектора в культуру клітин, інкубація культури клітин і очищення Баб-фрагмента, можна проводити за допомогою різних способів, загальновідомих в даній галузі.
Експресуючі вектори, які можна використовувати, включають, наприклад, вектори 5 рЕЕб.4 або рЕЄЕ12.4 (опа), без конкретних обмежень за умови, що вектор здатний експресувати полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Еар- фрагмента за даним винаходом, і/або полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг Раб-фрагмента за даним винаходом, і, таким способом, здатний виробляти поліпептиди, що ними кодуються.
Вищеописані експресуючі вектори вводять в культуру клітин такими способами, як трансфекція за допомогою фосфату кальцію або електропорація.
Клітини, що культивуються, в які можна вводити експресуючі вектори, можуть бути, наприклад, клітинами СНО-КІ1І5М, клітинами СНО-О(044, і клітинами 293, і їх можна культивувати шляхом загальноприйнятого способу.
Після вищевказаного культивування, Рар-фрагменти, що накопичилися в культуральному супернатанті, можна очищати різними способами хроматографії на колонках, такими як способи бо з використанням Карразеї!есі.
Приклад ЕРар-фрагмента антитіла до людського МОРЕ за даним винаходом належить до антитіла П11.6, описаного в розділі Приклади далі.
Коли антитіло експресується в клітинах, відомо, що антитіло піддається посттрансляційним модифікаціям. Приклад посттрансляційних модифікацій включає розщеплення лізину на С-кінці важкого ланцюга за допомогою карбоксипептидази, модифікацію глутаміну або глутамінової кислоти на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга піроглутамінової кислоти шляхом піроглутамінування, глікозилювання, окиснення, деамідування, глікування, і т. п. В даній галузі відомо, що такі посттрансляційні модифікації відбуваються з різними антитілами |У. Рпагт. 5сі., 2008, Мої. 97, р. 2426-2447).
Раб-фрагмент антитіла до людського МОБ за даним винаходом може включати РЕар- фрагмент антитіла до людського МОБ, який піддається посттрансляційній модифікації/модифікаціям. Приклад Раб-фрагмента антитіла до людського МОРЕ, який може піддаватися посттрансляційній модифікації/модифікаціям, включає Баб-фрагмент антитіла до людського МОРЕ, у якого М-кінець варіабельної ділянки важкого ланцюга піроглутамінований.
Така посттрансляційна модифікація шляхом піроглутамінування на М-кінці відома в даній галузі, як така, що не впливає на активність антитіла (Апаї. Віоспет., 2006, Мої. 348, р. 24-39).
Наприклад, Баб-фрагмент антитіла до людського МОЕ за даним винаходом належить до наступного Гар-фрагмента антитіла до людського МОРЕ:
Еаб-фрагмент антитіла до людського МОР, що містить фрагмент важкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЗЕО ІО МО: 5, де глутамін в амінокислотному положенні 1 5ЕО ІЮ МО:5 модифікований до піроглутамінової кислоти, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в зЕО ІЮ МО: 8.
Рар-фрагмент антитіла до людського МОЕ за даним винаходом зв'язується з МОЄ людини.
Активність зв'язування отриманого Габ-фрагмента антитіла до людського МОЕ з МОЕ людини можна вимірювати шляхом ЕГІЗА, РАС, і т. д. Наприклад, при використанні ЕГІЗА, людський
МОЄ іммобілізують на планшеті для ЕГІ5А і додають у цей планшет для ЕГІЗА Рар-фрагмент, а після цього додають вторинне антитіло, таке як антитіло до каппа, мічене біотином, і т.д. і стрептавідин, мічений лужною фосфатазою додають. Потім вимірюють активність з використанням реагенту для детекції активності (наприклад, хемілюмінесцентний субстрат для
Зо лужної фосфатази для міток з лужною фосфатазою) для виявлення зв'язування вторинного антитіла. Крім того, Еар-фрагмент антитіла до людського МОБ за даним винаходом може зв'язуватися з іншим МОРЕ, отриманим від тварини (наприклад, мишиним МОРЕ) на додаток до людського МОБ, і також можна вимірювати активність зв'язування з цими білками.
Еаб-фрагмент антитіла до людського МОБ за даним винаходом має нейтралізуючу активність проти людського МОБ. Як застосовують в даному описі, термін "нейтралізуюча активність" Гар-фрагмента антитіла до людського МОРЕ належить до активності, яка інгібує будь- яку біологічну активність, що індукується за допомогою людського МОРЕ, шляхом зв'язування з людським МО, і її можна оцінювати за допомогою одного або декількох видів біологічної активності людського МОБ як показник. Така нейтралізуюча активність включає, наприклад, інгібування зв'язування між людським МОРЕ і його рецептором людським ІїгКА, і її можна оцінювати з використанням способів, описаних в розділі Приклади далі.
Для того щоб оцінити вплив Гар-фрагмента антитіла до людського МОЕ за даним винаходом більш докладно, також можливо проводити дослідження іп мімо. Наприклад, можливо проводити, як показано далі в розділі ПРИКЛАДИ, дослідження знеболювальних ефектів з використанням щуриної моделі післяопераційного болю після підошовного розрізу, для оцінювання іп мімо впливу лікарського засобу з Рар-фрагментом антитіла до людського МОБ.
Також можливо підтверджувати фармакологічну активність Рар-фрагмента антитіла до людського МОЄ у тканину, проводячи дослідження для оцінювання активності зв'язування МОГ або дослідження для оцінювання інгібування зв'язування між людським МОБ і його рецептором
ЇїКА, з використанням гомогенату тканини, отриманого після місцевого введення Бар-фрагмента антитіла до людського МОБ у стегновий м'яз щурів. Додатково, також можливо проводити дослідження для оцінювання концентрації ЕРаб-фрагмента в плазмі або тканинах для оцінювання збереження локального рівня впливу Габ-фрагмента, а також зниження системного впливу в крові.
Як інший спосіб, способи для оцінювання стабільності Гар-фрагмента антитіла до людського
МОБ за даним винаходом (наприклад, термостабільність, стабільність при тривалому зберіганні, і стабільність високої концентрації) включають спосіб, який вимірює агрегацію під час зберігання за допомогою гель-фільтраційної хроматографії.
Еаб-фрагмент антитіла до людського МОБ за даним винаходом можна формулювати шляхом загальноприйнятого способу після очищення, що проводиться в міру необхідності, для використання для лікування післяопераційного болю.
Термін "післяопераційний біль" належить до болю, який викликаний або виникає у результаті травматичних ушкоджень таких як різана рана, колота рана, розсічення, рвана рана або ушкодження тканини індивідуума (включаючи ушкодження, викликані всіма видами хірургічного лікування, інвазивного або неінвазивного). Термін "післяопераційний біль", застосовуваний в даному описі, не включає біль, що виникає без якого-небудь фізичного ушкодження від зовнішніх причин (тобто, біль, який не викликаний ушкодженням або не є результатом ушкодження). Післяопераційний біль являє собою внутрішній або зовнішній (у тому числі, периферичний) біль, і рана, різана рана, ушкодження, рвана рана або розріз можуть бути заподіяні випадково (у випадку зовнішнього ушкодження/рани) або навмисно (у випадку розрізу або операції). Біль можна оцінювати об'єктивно або суб'єктивно за допомогою шкали болю і інших способів, добре відомих в даній галузі. Післяопераційний біль, як застосовують в даному описі, включає алодинію (тобто, як правило, підвищення величини відповіді на небольовий стимул) і гіперпатію (тобто, як правило, підвищення величини відповіді на больовий або неприємний стимул), і вони можуть бути термальної або механічної природи. Болі характеризуються термочутливістю, чутливістю до механічного стимулу і/або болем у спокої.
Післяопераційний біль включає біль, що індукується механічним стимулом, і біль у спокої.
Рар-фрагмент антитіла до людського МОЕ за даним винаходом можна використовувати як терапевтичний засіб для післяопераційного болю. Приклади складу терапевтичного засобу включають парентеральні засоби, такі як ін'єкції, краплі і препарати пролонгованого дії, і переважним є введення шляхом внутрішньом'язової ін'єкції або підшкірних ін'єкцій в локальну тканину-мішень. Також можливо при формуванні фармацевтичного складу використовувати носії і домішки, які підходять для складу за умови, що вони є фармацевтично прийнятними.
Кількість Рар-фрагмента антитіла до людського МОРЕ за даним винаходом, яку додають при складанні вищевказаного фармацевтичного складу, варіює залежно від ступеня симптому і віку пацієнта, використовуваної форми фармацевтичного складу, або валентності антитіла, але можна використовувати кількість приблизно від 0,001 до 100 мг/кг.
Зо Даний винахід також належить до фармацевтичної композиції, що містить Рар-фрагмент антитіла до людського МОЕ за даним винаходом. Фармацевтична композиція за даним винаходом може містити фармацевтично прийнятні носії або домішки. Такі фармацевтично прийнятні носії або домішки конкретно не обмежені, і можна використовувати носії або домішки, добре відомі фахівцю в даній галузі. Даний винахід також належить до Гар-фрагмента антитіла до людського МОЕ за даним винаходом для застосування для лікування післяопераційного болю і до застосування РГар-фрагмента антитіла до людського МОЕ за даним винаходом для виробництва фармацевтичної композиції для лікування післяопераційного болю. Даний винахід також належить до способу лікування післяопераційного болю, що включає місцеве введення індивідууму ефективної кількості Рар-фрагмента антитіла до людського МОБ за даним винаходом. Слід зазначити, що "індивідуум" Є людиною або іншими ссавцями, яким необхідно лікування, і один з варіантів здійснення є людиною, якій необхідно лікування. Ефективна кількість Габ-фрагмента антитіла до людського МОРЕ в способі лікування за даним винаходом може бути кількістю, аналогічною до кількості Рар-фрагмента, доданого при формуванні фармацевтичного складу, як зазначено вище. Крім того, фармацевтична композиція для місцевого застосування за даним винаходом належить до фармацевтичної композиції, яку вводять або застосовують на ділянці, що вимагає лікування, або ділянках, прилеглих до цієї ділянки, зокрема, на тканині-мішені, такій як тканина, розсічена у хірургічній операції або на навколишній ділянці. Наприклад, фармацевтичну композицію можна вводити шляхом внутрішньом'язової ін'єкції або підшкірних ін'єкцій місцево в тканину-мішень, як зазначено вище.
Даний винахід належить до випадку, коли Гар-фрагмент антитіла до людського МОЕ за даним винаходом зберігається в локальній тканині-мішені протягом визначеного часу, переважно, 72 години, і, більш переважно, 24 години.
Фармацевтична композиція за даним винаходом може містити множину типів Еар- фрагмента антитіла до людського МОЕ за даним винаходом. Наприклад, даний винахід також належить до фармацевтичної композиції, що містить Гар-фрагмент антитіла до людського МОРЕ, який не піддається посттрансляційній модифікації і Рар-фрагмент антитіла до людського МОБ, отриманий шляхом посттрансляційної модифікації.
В одному з варіантів здійснення фармацевтична композиція за даним винаходом включає фармацевтичну композицію, що містить ЕРар-фрагменти антитіла до людського МОР, як бо показано в (а) і (Б) нижче:
(а) Рар-фрагмент антитіла до людського МОРЕ, що містить фрагмент важкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в 5ЕО ІЮО МО: 5, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЖЕО ІЮО МО: 8; і (5) Раб-фрагмент антитіла до людського МОБ, отриманий шляхом посттрансляційної модифікації Рар-фрагмента антитіла до людського МОБ з (а).
В одному з варіантів здійснення фармацевтична композиція за даним винаходом включає фармацевтичну композицію, що містить ЕРар-фрагменти антитіла до людського МОР, як показано в (а) і (Б) нижче: (а) Рар-фрагмент антитіла до людського МОЄ, що містить фрагмент важкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в 5ЕО ІЮ МО: 5, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЖЕО ІЮО МО: 8; і (б) Рар-фрагмент антитіла до людського МОЄ, що містить фрагмент важкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЗЕО ІО МО: 5, де глутамін в амінокислотному положенні 1 5ЕО І МО:5 модифікований до піроглутамінової кислоти, і фрагмент легкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в зхЕО ІЮ
МО:8.
Даний винахід також належить до полінуклеотиду, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Рар-фрагмента антитіла до людського МОРЕ за даним винаходом, і до полінуклеотиду, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг Бар-фрагмента антитіла до людського МОБ за даним винаходом (які можуть далі спільно позначатися в даному документі як "полінуклеотид за даним винаходом"), і до експресуючого вектора, що містить один або обидва таких полінуклеотиди (який може далі в даному документі позначатися як "експресуючий вектор за даним винаходом").
Експресуючий вектор за даним винаходом не обмежений конкретним типом за умови, що він експресує полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга
Еаб-фрагмента антитіла до людського МОБ за даним винаходом і/або полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг Бар-фрагмента антитіла до людського
МОРЕ за даним винаходом, у різних клітинах-хазяїнах, які являють собою прокаріотичні клітини іабо еукаріотичні клітини, і здатний виробляти поліпептид(-и), що кодуються вказаним
Зо нуклеотидом/нуклеотидами. Приклади експресуючих векторів, які можна використовувати, включають плазмідний вектор, вірусний вектор (наприклад, аденовірусний, ретровірусний), наприклад, можна використовувати вектор 55 рЕЕб.4 і рЕЕ12.4 (І опа). В одному з варіантів здійснення експресуючий вектор за даним винаходом являє собою експресуючий вектор, який включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга
Рар-фрагмента антитіла до людського МОЕ за даним винаходом. В іншому варіанті здійснення експресуючий вектор за даним винаходом являє собою експресуючий вектор, який включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Еар- фрагмента антитіла до людського МОБ за даним винаходом, і полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг такого Гар-фрагмента антитіла до людського МОР.
Експресуючий вектор за даним винаходом може містити промотор, функціонально зв'язаний з полінуклеотидом за даним винаходом. Промотори, які дозволяють експресуватися гену, що кодує Рар-фрагмент за даним винаходом або його варіабельну ділянку важкого ланцюга і/або варіабельну ділянку легкого ланцюга в бактерії, включають промотор Тгр, промотор Іас, промотор гесА, промотор АРІ, промотор Ірр, і промотор їас, коли бактерія-хазяїн належить до роду ЕзсПпегіспіа. Промотори, які дозволяють експресуватися в дріжджах, включають, наприклад, промотор РНО5, промотор РОК, промотор САР, і промотор АОН, і промотори, які дозволяють експресуватися в бактерії роду Васіїйй5, включають промотор 51 01, промотор 5РО2, і промотор репР. Промотори для клітини-хазяїна, яка є еукаріотичною клітиною, такою як клітини ссавців, включають промотор, отриманий з 540, промотор ретровірусу або промотор теплового шоку.
Коли як клітину-хазяїна використовують бактерію, зокрема, Е. соїї, експресуючий вектор за даним винаходом може додатково містити кодон ініціації, стоп-кодон, кодон термінації і реплікативну одиницю. Коли як хазяїна використовують дріжджі, клітину тварини або клітину комахи, експресуючий вектор за даним винаходом може включати кодон ініціації і стоп-кодон. В цьому випадку, він може включати енхансерну послідовність, ділянки, що не транслюються, на
Б'-кінці і 3"-кінці гена, який кодує Гар-фрагмент антитіла до людського МОРЕ за даним винаходом, сигнальна послідовність для секреції, точку сплайсингу, ділянку поліаденілювання, реплікативну одиницю або т. п. Також, він може включати селективний маркер, який широко використовується (наприклад, ген стійкості до тетрацикліну, ген стійкості до ампіциліну, ген стійкості до канаміцину, ген стійкості до неоміцину, ген редуктази дигідрофолієвої кислоти), згідно з передбачуваним застосуванням.
Даний винахід також належить до клітини-хазяїна, трансформованої експресуючим вектором за даним винаходом. Клітина-хазяїн, яку використовують для одержання трансформанта, не обмежена конкретним типом за умови, що вона відповідає вказаному вище експресуючому вектору і її можна трансформувати; приклади клітини-хазяїна включають різні клітини, такі як природні клітини або клітини, отримані штучним шляхом, які широко використовуються в галузі техніки за даним винаходом (наприклад, бактерії (бактерії роду
Езспегіспіа, бактерії роду Васіййй5), дріжджі (роду Засспаготусев, роду Ріспіа і т. п.), клітини тварин (клітина СНО-КІ15МУ, клітина СНО-О644, клітина 293 і т. п.) або клітини комах (наприклад,
ОІ9) і т. п. Трансформацію як таку можна проводити будь-яким відомим способом.
Клітина-хазяїн за даним винаходом включає наступні (а) і (Б): (а) клітина-хазяїн, трансформована експресуючим вектором, що включає полінуклеотид, який містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга РГар-фрагмента антитіла до людського МОРЕ за даним винаходом, і полінуклеотид, який містить послідовність основ, що кодують легкий ланцюг вказаного Гар-фрагмента антитіла до людського МОБ; і (р) клітина-хазяїн, трансформована експресуючим вектором, що включає полінуклеотид, який містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга РГар-фрагмента антитіла до людського МОРЕ за даним винаходом, і експресуючим вектором, що включає полінуклеотид, який містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг вказаного РГар-фрагмента антитіла до людського МОР.
Даний винахід також належить до способу одержання Бар-фрагмента антитіла до людського
МОРЕ, що включає етапи культивування клітини-хазяїна за даним винаходом і експресування
Еаб-фрагмента антитіла до людського МОРГ. Переважно, клітина-хазяїн, яку використовують у вищевказаному способі, включає вказану вище клітину-хазяїна (а) і (б) за даним винаходом.
Для одержання Рар-фрагмента антитіла до людського МОБ за даним винаходом, трансформовану клітину-хазяїна можна культивувати в живильному середовищі. Живильне середовище переважно містить джерело вуглецю і джерело неорганічного азоту або джерело органічного азоту, який необхідний для росту клітини-хазяїна. Приклади джерела вуглецю
Зо включають глюкозу, декстран, розчинний крохмаль, сахарозу і т. п.; приклади джерела неорганічного азоту або джерела органічного азоту включають амонійні солі, нітрати, амінокислоти, рідкий кукурудзяний екстракт, пептон, казеїн, м'ясний екстракт, соєву макуху, картопляний екстракт і т. п. За бажанням, можна включати інші поживні речовини (наприклад, неорганічні солі (наприклад, хлорид кальцію, дигідрогенфосфат натрію, хлорид магнію), вітаміни, і т. п.), антибіотики (наприклад, тетрациклін, неоміцин, ампіцилін, канаміцин і т. п.).
Клітину-хазяїна культивують загальновідомим способом. Умови культивування, наприклад, температуру, рН середовища, і час культивування підбирають відповідним чином. Наприклад, коли хазяїном є клітина тварини, як середовище можна використовувати середовище МЕМ, що містить приблизно від 5 до 20 95 ембріональної телячої сироватки (Зсіепсе, Мої. 122, р. 501, 1952), середовище ОМЕМ (ГМігоіоду, Мої. 8, р. 396, 1959), середовище КРМІ1640 |У. Ат. Меа.
Авзос., Мої. 199, р. 519, 1967), середовище 199 |Ргос. ос. Ехр. Віої. Мед., Мої. 73, р. 1, 19501 і т. п. рН середовища переважно становить приблизно від б до 8, культивування звичайно проводять при температурі приблизно від 30 до 40 "С протягом приблизно від 15 до 72 годин, і можна проводити в міру необхідності аерацію або перемішування. Коли хазяїном є клітини комахи, можна використовувати, наприклад, середовище Грейса, що містить ембріональну телячу сироватку (Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА, Мої. 82, р. 8404, 19851 і т. п., і рН середовища переважно становить приблизно від 5 до 8. Культивування звичайно проводять при температурі приблизно від 20 до 40 "С протягом від 15 до 100 годин, і можна проводити в міру необхідності аерацію або перемішування. Коли хазяїном є бактерія, актиноміцет, дріжджі, або ниткоподібний гриб, придатним є, наприклад, рідке середовище, що містить вищевказані джерела поживних речовин. Переважним є середовище з рН від 5 до 8. Коли хазяїном є Е. соїї, переважні приклади середовища включають середовище ІВ, середовище МОУ ІМіМПег еї аіІ., Ехр. Мої. Сепеї, Соїа
Зргіпу Наїбог Іарогагу, р. 431, 1972) і т. п. У цьому випадку, культивування звичайно проводять при температурі приблизно від 14 до 43 "С протягом приблизно від З до 24 годин, при цьому аерацію або перемішування проводять в міру необхідності. Коли хазяїном є бактерія роду Васіїйш5, культивування звичайно проводять при температурі приблизно від 30 до 40 "С протягом приблизно від 16 до 96 годин, при цьому аерацію або перемішування проводять в міру необхідності. Коли хазяїном є дріжджі, приклади середовища включають мінімальне середовище Буркхолдер |Возіап, Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА, Мої. 77, р. 4505, 1980), ї рн бо середовища бажано становить від 5 до 8. Культивування звичайно проводять при температурі приблизно від 20 до 35 "С протягом приблизно від 14 до 144 годин, і аерацію або перемішування можна проводити в міру необхідності.
Спосіб одержання Еар-фрагмента антитіла до людського МОБ за даним винаходом додатково включає, на додаток до стадій культивування клітини-хазяїна за даним винаходом і експресування ЕБаб-фрагмента антитіла до людського МОРЕ, стадію виділення, і переважно, виділення і очищення, Рар-фрагмента антитіла до людського МОРЕ з вказаної клітини-хазяїна.
Приклади способу виділення і очищення включають способи, основані на відмінностях у розчинності, такі як висолювання і осадження розчинником; способи, основані на відмінностях у молекулярній масі, такі як діаліз, ультрафільтрація, гель-фільтрація, і електрофорез в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (505); способи, основані на відмінностях в електричному заряді, такі як іонообмінна хроматографія і хроматографія з гідроксилапатитом; способи, основані на специфічній афінності, такі як афінна хроматографія; способи, основані на відмінностях у гідрофобності, такі як обернено-фазова високоефективна рідинна хроматографія; способи, основані на відмінностях в ізоелектричній точці, такий як ізоелектрофокусування; і т. п.
Раб-фрагмент антитіла до людського МОБ за даним винаходом також включає Рар- фрагмент антитіла до людського МОР, який можна одержувати способом для одержання Еар- фрагмента антитіла до людського МОБ за даним винаходом.
Хоча даний винахід в основному був описаний вище, конкретні приклади наведені в даному документі тільки для кращого розуміння даного винаходу. Ці приклади призначені тільки для ілюстративних цілей і не обмежують обсяг даного винаходу.
ПРИКЛАДИ
На стадіях з використанням комерційно доступного набору або реагенту, експерименти проводили згідно з протоколами, що прикладаються, якщо не зазначено інше. «ПРИКЛАД 1: Одержання Рар-фрагментів антитіла до людського МОЕ»
Три типи генетичних фрагментів ампліфікували за допомогою ДНК-полімерази Рпшвіоп Нідп-
Ніаеїйу (Гіппгутев, Е-5301І) з використанням як матрицю експресуючого вектора, який включав поліпептид, що кодує важкий ланцюг з 1-15 (М520) Рар'-фрагмента (РТ. 3), ії праймерів, сконструйованих так, щоб вони були здатні ампліфікувати кожний з трьох типів генетичних
Зо фрагментів від ділянки МН до шарнірної ділянки (ЕС ІЮ МО: 1, 2 ії 3). Ампліфіковані ділянки містили Ніпа! на 5'-кінці і ЕсОКІ на 3'-кінці. Отримані генетичні фрагменти важкого ланцюга розщеплювали Ніпапй їі ЕсоКІ (обидва ферменти від МЕВ) і вставляли в експресуючий вектор
РЕЕб.4.
Ці експресійні плазміди вводили в Е.соїї загальноприйнятим способом для одержання трансформованих клонів, і використовували систему для очищення ДНК Умігага Ріи5 5М
Міпіргерз (Рготеда, А1460) для виділення плазмідної ДНК. При цьому, ген легкого ланцюга мав таку саму послідовність основ (5ЕО ІЮ МО: 4), що і ген легкого ланцюга з 1-15 (М520) Рар'- фрагмента, і амінокислотна послідовність, що кодується геном, являє собою ЗЕО ІЮ МО:8.
Використовували рЕЕ12.4, що кодує фрагмент гена легкого ланцюга.
Вектор 5 (рЕЕб.4), що кодує фрагмент гена важкого ланцюга з Гар-фрагмента антитіла до людського МОБ, і вектор 5 (рЕЕ12.4), що кодує фрагмент гена легкого ланцюга з Рар- фрагмента антитіла до людського МОРЕ, розщеплювали рестрикційними ферментами Мої! і Рмиї (обидва від МЕВ). Потім проводили лігування з використанням ОМА І ідабіоп Міх (ТакКага Віо Іпс., 6023) для конструювання векторів 55, що кодують генетичні фрагменти і важкого ланцюга, і легкого ланцюга з Рар-фрагментів антитіла до людського МОР. Отриману плазмідну ДНК використовували як матриці для реакцій секвенування, і продемонстрували, що плазмідна ДНК містить послідовності основ клонованого важкого ланцюга від ділянки УН до шарнірної ділянки і легкого ланцюга від ділянки Мі. до ділянки СІ. Послідовності основ від ділянки МН до шарнірної ділянки з трьох типів важких ланцюгів показані у вигляді ЗЕО ІЮ МО: 1, БЕО ІЮ МО: 2 і ЗЕО ІО
МО: 3. Крім того, амінокислотні послідовності, що кодуються цими послідовностями основ, показані у вигляді БЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІО МО: 6 ії 5ЕО ІЮО МО: 7, відповідно. Три типи ЕРар- фрагментів антитіла до людського МОЕ одержували шляхом поєднання важкого ланцюга з БЕО
ІО МО: 1 і легкого ланцюга з БЕО ІЮ МО: 4, важкого ланцюга з 5ЕО ІО МО: 2 і легкого ланцюга з
ЗЕО ІЮО МО: 4, і важкого ланцюга з 5ЕО ІО МО: З і легкого ланцюга з 5ЕО ІЮО МО: 4, і позначали їх як антитіло П11.6, антитіло П11.7 і антитіло П11.8, відповідно.
Еаб-фрагменти антитіла до людського МОЄ експресували двома способами транзиторної експресії і конститутивної експресії з використанням векторів 55. Для транзиторної експресії векторами 5 трансфікували клітини СНО-К15М (І опа), що культивуються в середовищі СО-
СНО (Іпмігодеп), з використанням способу електропорації МахСуїє (МахсСуїє), а потім бо інкубували протягом 7 діб. Рар-фрагменти антитіла до людського МОЕ виділяли з культуральних супернатантів з використанням Карразеїесі (СЕ НеайПсаге, 17-5458-02). Для конститутивної експресії, векторами 5, розщепленими рестрикційним ферментом Руиї! трансфікували клітини
СНО-КІЗМ клітини з використанням способу електропорації спосіб для експресії Еар- фрагментів антитіла до людського МОР. Рар-фрагменти антитіла до людського МОРЕ виділяли з культуральних супернатантів з використанням КарразЗеїесі і підтверджували гель- фільтраційною хроматографією і електрофорезом в поліакриламідному гелі з 505. Для підтвердження посттрансляційної модифікації очищеного антитіла п1ї.6 проводили мас- спектрометрію. У результаті для більшості антитіл одержували пік, який розглядали як М- кінцеве піроглутамінування. «ПРИКЛАД 2: Оцінювання активності, що інгібує зв'язування, для Раб-фрагментів антитіла до людського МОЕ проти людського МОЄ
Для оцінювання активності, що інгібує зв'язування, для Рар-фрагментів антитіла до людського МОЄ проти людського МОРЕ, проводили конкурентний аналіз ЕГІЗБА для людського
МОаг-ККА, який спрямований на інгібування зв'язування між людським МОР і його рецептором
І/КА як індикатор. Людський їгКА (КО 5узіетв, 175-1К-050), розведений фосфатно-сольовим буфером (РВ5) до концентрації 2000 нг/мл додавали в білий 9б-лунковий планшет Мипс
Махізогр (Мипс, 436110) по 50 мкл/лунку і іммобілізували інкубуванням протягом ночі при 4 "с.
Розчин людського їїКА видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді і додавали
ВІосКег Сазеіпе в ТВ5 (Тпепто, 37532) по 200 мкл/лунку. Після цього планшет інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, ВіосКег Сазейпе в ТВ5 видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді. Очищені зразки антитіл, розведені в 7-11 етапів приблизно від 200000 нг/мл до приблизно 2 нг/мл за допомогою РВ5, що містить 0,1 95 бичачого сироваткового альбуміну (ВА), змішували з 700 нг/мл біотинільованого людського МОБ у однакових кількостях, інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, і отримані зразки додавали по 100 мкл/лунку. Біотинільований людський МОРЕ, застосовуваний у даному документі, одержували шляхом біотинілювання людського МОРЕ (КО Зуєіетв, 256-СЕ-100/СЕ) за допомогою Е2-І пк МН5О-РЕСА-Віоїїпе (Тпепто 5сіепійіс, 21329). Біотинілювання людського
МОРЕ проводили, додаючи 1,25 мкл 5 мМ розчину МН5-РЕС4-Віоїпе до 250 мкл 0,4 мг/мл людського МОБ, інкубуючи протягом 2 годин на льоду у темряві, і заміняючи розчин реакційної
Зо суміші на РВ5 з використанням Атісоп ОГКга ЗК на 0,5 мл (Мійроге, ШЕС500324) двічі згідно з посібником. РВ5, що містить 0,1 95 ВЗА, одержували як контроль. Після інкубації протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, планшет відмивали три рази розчином для відмивання (фізіологічний розчин, який забуферений Трис (ТВ5) і містить 0,05 95 Гувеп-20) і додавали 100 мкл на лунку розведеного у 1000 разів і міченого лужною фосфатазою стрептавідину (Тпепто, 21324) в розведеному у 20 разів ВіІосКіпд Опе (МасаїІаіїТездие Іпс., 03953-95) в РВ5. Після інкубації протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, планшет відмивали розчином для відмивання три рази і додавали 100 мкл/лунку розведеного у 5 разів субстрату для лужної фосфатази (Хемілюмінесцентний субстрат для ЛФ для мікролунок/мембран, суперчутливий, 450 нм; 5игМодісх, АРО4-0100-01) у 2 мМ буфері Трис (рН 9,8), що містить 0,1 мМ хлорид магнію. Після інкубації протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, величину сигналу вимірювали лічильником Епмізіоп (Режкіп ЕІтег).
Тести для 1-15 (М520-А) Рар'-ррагмента, антитіла п17.6, антитіла П11.7, і антитіла п117.8 проводили двічі. Для розрахунку рівня інгібування зв'язування людського МОБ-НКА для кожного антитіла, виміряну величину для РВ5, що містить 0,195 В5БА, приймали за 0 95 і виміряну величину максимальної концентрації кожного антитіла приймали за 100 95. Аналізували розрахований рівень інгібування зв'язування людського МОБР-ІїГКА і величину ІСзо для антитіла розраховували за допомогою алгоритму підбору з три- або чотирипараметричною логістичною кривою. Розраховували геометричні середні для значень ІСхо для двох повторів, значення ІСво для 1-15 (М520-А) Раб'-фрагмента, антитіла Н11.6, антитіла Н11.7, і антитіла Н11.8 для інгібування зв'язування людського МОБЕ-їКА склали 0,30 мкг/мл, 0,32 мкг/мл, 0,30 мкг/мл, і 0,28 мкг/мл, відповідно, показуючи, що їх активність інгібування людського МОБЕ-їКА була приблизно однаковою. «ПРИКЛАД 3: Оцінювання утворювання димерів Рар-фрагментів антитіла до людського МОЕ після інкубації протягом 14 діб при 50 С»
Розчини 1-15 (М520-А) Рар'-(фрагмента, антитіла п11.6, антитіла П11.7, і антитіла п11.8 заміняли на буфери з рН 5, 6 і 7 (20 мМ лимонної кислоти/120 мМ Масі в рН 5 або 6, РВ5 в рн 7), і коригували до 10 мг/мл, потім інкубували протягом 14 діб при 50 "С для оцінювання стабільності.
Утворювання димерів до і після інкубування протягом 14 діб при 50 "С оцінювали за бо допомогою І С1100 (Адіїепі ТесппоЇодіе5) з гель-фільтраційною хроматографією з гелем Т5К зирег 5м/3000 (ТО5ОН, 2 мм ІОх300 мм). Вимірювання проводили з розчином рухомої фази з 0,1 М динатрію гідрофосфату і 0,2 М кислої солі І(ж)-аргініну з рН, скоригованим до 6,8 за допомогою соляної кислоти, швидкість потоку 0,075 мл/хв при 25 "С, з детектуванням довжини хвилі 280 нм і референсною довжиною хвилі 360 нм. Вимірювання проводили двічі для одержання арифметичного середнього, і рівень росту димерів одержували шляхом віднімання рівня росту димерів до інкубації з рівня росту димерів після інкубації. Таким чином, рівні росту димерів 1-15 (М520-А) Рар'-фрагмента при рн 5, 6 і 7 склали 5,4 Фо, 17,0 Фо і 18,2 Фо, відповідно, демонструючи, що в цих умовах утворювалася значна кількість димерів. Рівні росту димерів антитіла П17.б при рН 5,6 і 7 склали 0,1 95, 0,3 95 і 0,5 95, відповідно, для антитіла п11.7 при рН 5, бі7 склали 0,1 95, 0,3 95 і 0,4 95, відповідно, і для П1ї.8 прирН.5, бі 7 склали0,195,0,59610,7 95, відповідно. Таким чином, показано, що антитіло П11.6, антитіло П11.7, і антитіло п11.8 мали значно більш низький рівень утворювання димерів і були більш стабільні, ніж 1-15 (М520-А)
Еабр'-фрагмент. «ПРИКЛАД 4: Оцінювання активності, що інгібує зв'язування, Рар-фрагментів антитіла до людського МОРЕ проти людського МОБ після інкубації протягом 14 діб при 50 С»
Оцінювали зміну активності, що інгібує зв'язування, для 1-15 (М520-А) Рар'-фрагмента, антитіла п11.6, антитіла НП11.7, і антитіла п171.8 проти людського МОБ після інкубації протягом 14 діб при рН 6 ї 50 "С за допомогою конкурентного ЕГІЗА з людським МОБ-їКА, описаного в прикладі 2. Розраховували геометричні середні для значень ІСв5о для двох повторів, величина
ІСво для 1-15 (М520-А) Раб'-фрагмента, антитіла П11.6, антитіла НП11.7, і антитіла 11.8 відносно інгібування зв'язування людського МОБ-їКА склала 0,47 мкг/мл, 0,38 мкг/мл, 0,56 мкг/мл, і 0,47 мкг/мл, відповідно, після інкубації протягом 14 діб при 50 "С. Рівень росту значення ІСзо для антитіл після інкубації протягом 14 діб при 50 "С відносно значення до інкубації склав 59 95, 21 У, 87 9 і 68 95, відповідно.
Згідно з результатами, антитіло П17.6, антитіло П11.7, і антитіло п171.8 являють собою Еар- фрагменти антитіла до МОБЕ, які мають значно більш низький рівень росту димерів, ніж 1-15 (М520-А) Рар'-фрагмент після інкубації протягом 14 діб при 50 "С. Показано, що антитіло Н11.6 мало тільки незначне зниження активності, що інгібує зв'язування, під час інкубації і зберігає високу стабільність. «ПРИКЛАД 5: Оцінювання за допомогою ЕГІБА активності зв'язування для антитіл до людського МОЕ з людським МОГ»
Аналіз ЕГІЗА застосовували для вимірювання активності зв'язування антигену для антитіла 11.6. Для оцінювання зв'язувальної здатності антитіл до людського МОРЕ, проводили тест з використанням планшета з іммобілізованим людським МОБ. Як контроль використовували антитіло порівняння Танезумаб.
Людський МОРЕ (КО Зузіетв5, 256-СЕ-100/СЕ), розведений РВ5З до концентрації 1000 нг/мл додавали в білий 9б6-лунковий планшет Мипс Махібогр (Мипс, 436110) по 100 мкл/лунку і іммобілізували інкубуванням протягом ночі при 4 "С. Розчин людського МОГ видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді і додавали по 200 мкл/лунку ВіосКег Сазеїпе в ТВ5 (Тпегто, 37532), і планшет інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. ВіосКег
Сазеїіпе в ТВ5 видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді і очищені зразки антитіла, розведені в 11 етапів від 1000 до 0,01 нг/мл за допомогою РВ5, що містить 0,1 95 В5А, додавали по 100 мкл/лунку, і планшет інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. РВ5, що містить 0,1 95 В5БА, одержували як контроль. Планшет відмивали три рази розчином для відмивання (ТВ5, що містить 0,05 95 Гмуееп-20), додавали на лунку 100 мкл розведеного в 1000 разів біотинільованого антитіла до людського легкого ланцюга каппа (ІВІ., 17249) в розведеному у 20 разів ВіосКіпуд Опе (Масаїаї Тездие, Іпс., 03953-95) в РВ5, і планшет інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Планшет відмивали три рази розчином для відмивання, і додавали 100 мкл на лунку розведеного у 1,000 разів і міченого лужною фосфатазою стрептавідину (Пепто, 21324) в розведеному у 20 разів ВіосКіпд Опе в
РВ5, і планшет інкубували протягом 0,5 години при кімнатній температурі. Планшет відмивали розчином для відмивання три рази і додавали 100 мкл/лунку розведеного у 5 разів субстрату для лужної фосфатази (Хемілюмінесцентний субстрат для ЛФ для мікролунок/мембран, суперчутливий, 450 нм; ЗигМодіс5, АРО4-0100-01) в 2 мМ буфері Трис (рН 9,8), що містить 0,1
ММ хлорид магнію. Після інкубації протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, величину сигналу вимірювали лічильником ЕпМівіоп (РеїКіп ЕІтег).
Тести для кожного антитіла проводили двічі і одержували арифметичне середнє. Для розрахунку рівня інгібування людського МОЕ для кожного антитіла, виміряну величину для РВ5, що містить 0,1 95 ВБА, приймали за 0 95 і виміряну величину максимальної концентрації кожного бо антитіла приймали за 10095. Аналізували розрахований рівень інгібування зв'язування людського МОБ-їКА і величину ЕС5о для антитіла розраховували за допомогою алгоритму підбору з трипараметричною логістичною кривою. Розраховували геометричні середні для значень ЕСзхо для двох повторів, значення ЕСво для антитіла П11.6 склало 73,0 нг/мл, у той час як значення ЕСзо Танезумабу склало 146 нг/мл. «ПРИКЛАД 6: Оцінювання активності, що інгібує зв'язування, антитіл до людського МОГ проти людського МОЕг»
Конкурентний аналіз ЕГІЗА, використаний в прикладі 2 для оцінювання інгібування зв'язування МОБ-їКА, застосовували для вимірювання активності, що інгібує зв'язування, антитіла п1ї.6 проти людського МОБ. Як контроль використовували антитіло порівняння
Танезумаб.
Тест проводили чотири рази для антитіла йп1ї.6 і три рази для танезумабу, і брали геометричні середні розрахованих значень ІСво. У результаті, значення ІСзо для антитіла п11.6 відносно інгібування зв'язування людського МО Е-їїКА склало 0,31 мкг/мл, у той час як значення
ІСво для Танезумабу відносно інгібування зв'язування людського МОРБ-ІГКА склало 0,86 мкг/мл. «ПРИКЛАД 7: Оцінювання антитіла на місцеве утримування в тканині, активність зв'язування з людським МОБ, і активність, пов'язану з функціональним інгібуванням людського
Маг»
Після місцевого введення антитіла п17.6 оцінювали концентрацію антитіла в тканині, в яку вводили, для оцінювання місцевого утримування. Антитіло П17.б6 місцево вводили в стегновий м'яз здорових щурів у дозах 0,3 і З мг/кг з п-4 для кожної дози, і вимірювали концентрації антитіла в стегновому м'язі через б годин після введення за допомогою електрохемілюмінесцентного аналізу (ЕС). Місцеве введення проводили шляхом ін'єкції антитіла в стегновий м'яз з об'ємною дозою 0,2 мл/кг з використанням РВ5 як розчинника.
Гомогенат стегнового м'яза одержували, додаючи 2,5-кратний об'єм розчину для гомогенату тканини (10 мМ Трис, 137 мМ Масі, сОтріеїе, Міпі (Коспе), рН 8,0) до зібраної тканини стегнового м'яза. Два типи антитіл до 1-15, АНК-ІВІ -13А і біотинільоване АНК-ІВІ-52А, які одержували при імунізації миші антитілом 1-15 (РТІ 3), отриманим при імунізації миші
МеІюосіттипе людським МОРЕ, використовували для вимірювання в аналізі ЕСІ. На додаток, одержували біотинільоване АНК-ІВЇ-52А шляхом біотинілювання АНК-ІВІ-52А згідно з технічним посібником для Віоїіп І абеїїпд КИ-МНа2 (Ооїїпао І арогайгієв, І КОЗ).
Спосіб аналізу ЕСІЇ показаний далі. Антитіло до 1-15, АНК-ІВІ-АЗА, розводили ТВ5 до концентрації 1000 нг/мл і додавали до 96-лункового планшету Мий-аттау (Мезо Зсаїе Різсомегу,
ЇТ5ХА-6) по 25 мкл/лунку. Планшет інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі, щоб іммобілізувати АНК-ІВІ-1ЗА. Розчин АНК-ІВІ-1А3А видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді, планшет відмивали три рази розчином для відмивання (ТВ5, що містить 0,05 95 ПГуєеп-20), і додавали по 150 мкл/лунку ВіосКег Сазеіпе в ТВ5 (Тпегто, 37532).
Після інкубації протягом 1 години при кімнатній температурі, ВіосКег Сазеіпе в ТВ5 видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді, і планшет відмивали три рази, потім додавали 25 мкл/лунку розведеного у 100 разів гомогенату стегнового м'яза у розріджувачі (ВіосКег Сазеїпе в
ТВ5, що містить 0,05 95 Тмєеп-20) і, для зразків, які потрібно було розвести додатково, розведеного розріджувачем, що містить 1 95 гомогенату стегнового м'яза без антитіла, щоб потрапити у діапазон калібрувальної кривої. Для одержання калібрувальної кривої гомогенату стегнового м'яза, антитіло п11.6, розведене у 10 етапів у діапазоні від 10000 нг/мл до 0,51 нг/мл з використанням розріджувача, було розведено у 100 разів розріджувачем, що містить 1 95 гомогенату стегнового м'яза без антитіла. Розріджувач, що містить 1 95 гомогенату стегнового м'яза без антитіла, використовували як контроль. Після інкубації протягом 1 години при кімнатній температурі, розчин видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді, планшет відмивали три рази розчином для відмивання, і додавали в лунку 25 мкл біотинільованого АНК-
ІВІ-52А, розведеного до 300 нг/мл розріджувачем. Після інкубації протягом 1 години при кімнатній температурі, розчин видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді, планшет відмивали три рази розчином для відмивання, і додавали в лунку 25 мкл стрептавідину М5О
ЗМІ ГО-ТАа (Мезо 5саїе Різсомегу, ВЗ2АЮ-1), розведеного до 1000 нг/мл розріджувачем. Після інкубації протягом 1 години при кімнатній температурі, розчин видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді і планшет відмивали три рази розчином для відмивання. Після цього додавали в лунку 150 мкл М5О Кеай Вийег Т(4х) з поверхнево-активною речовиною (Мезо зЗсаіє Оібзсомегу, НУ2ТО-2), розведеного у два рази ультрачистою водою (МіО (зареєстрована торговельна марка), Мегск), електрохемілюмінесценцію зразків вимірювали за допомогою
ЗЕСТОВ Ітадег 6000 (Мезо 5саїе Оізсомегу).
Була побудована калібрувальна крива для розрахунку концентрації антитіла. Рівняння бо регресії аналізували за допомогою алгоритму підбору з чотирипараметричною логістичною кривою. З використанням калібрувальної кривої розраховували концентрації антитіла в стегновому м'язі для кожної точки. Кожний тест проводили у двох повтореннях, і розраховували арифметичне середнє концентрацій.
Після місцевого введення антитіла п17.б по 0,3 і З мг/кг в стегновий м'яз, концентрації в стегновому м'язі склали 2,66 і 67,9 мкг/мл, відповідно, через 6 годин після введення.
Для оцінювання кількості антитіла П17.6, яке має активність зв'язування з людським МОБ, в стегновому м'язі, проводили аналіз зв'язування з людським МОРЕ за допомогою ЕГІЗА.
Людський МОБ (КО Зузіет5, 256-ОБ/СЕ), розведений РВЗ5 до концентрації 1000 нг/мл додавали в білий 384-лунковий планшет Мипс Махібогр (Мипс, 460372) по 20 мкл/лунку і іммобілізували шляхом інкубації протягом ночі при 4 "С. Розчин людського МОЄ видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді, у планшет додавали по 80 мкл/лунку ВіосКіпд Опе (Масаїаї Тездиє, Іпс., 03953-95), і планшет інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшет відмивали три рази розчином для відмивання (ТВ5, що містить 0,05 Фо
Тмееп-20), і додавали в лунку по 20 мкл гомогенату стегнового м'яза з групи з введенням 0,3 мг/кг і групи з введенням 3 мг/кг, які розводили у 10 ї 100 разів, відповідно, з розведеним у 10 разів Віоскіпд Опе в ТВ5, що містить 0,05 95 Пуееп-20.
Для побудови калібрувальної кривої для гомогенату стегнового м'яза з групи з введенням 0,3 мг/кг і групи з введенням З мг/кг, антитіла П17.6 розводили у 11 етапів у діапазоні від 3000 до 0,03 нг/мл розріджувачем, приготовленим шляхом додавання гомогенату стегнового м'яза без антитіла у концентрації 10 ї 1 95, відповідно, до ВіосКіпд Опе, який був розведений у 10 разів
ТВ5, що містить 0,05 95 Гмееп-20, і додавали по 20 мкл/лунку.
Після інкубації протягом 1 години при кімнатній температурі, планшет відмивали три рази розчином для відмивання і додавали в лунку 20 мкл розведеного у 2500 разів біотинільованого антитіла до людського легкого ланцюга каппа (ІВ, 17249) в розведеному у 10 разів ВіосКіпд
Опе в ТВ5, що містить 0,05 95 Гмиееп-20. Після інкубації протягом 1 години при кімнатній температурі, планшет відмивали три рази розчином для відмивання, додавали в лунку 20 мкл розведеного у 8000 разів високочутливого стрептавідину-НЕР (Тпепто, 21130) в розведеному у 10 разів ВіосКіпд Опе в ТВ5, що містить 0,05 95 ПГувеп-20, і планшет інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшет відмивали три рази розчином для відмивання і
Зо додавали в лунку 20 мкл хемілюмінесцентної речовини (ВМ Спетіїштіпезсепсе ЕГІБА Зибрзігаїе (РОБ); Коспе, 11582950001), потім вимірювали величину сигналу за допомогою лічильника
Епмізіоп (Регкіп ЕІтег). Кожний тест проводили у двох повтореннях, і побудували калібрувальну криву, щоб розрахувати кількість антитіла п17.6б, яке має активність зв'язування з людським
МОР. Рівняння регресії аналізували за допомогою алгоритму підбору з чотирипараметричною логістичною кривою, і розраховували кількість антитіла, яке має активність зв'язування з людським МОБ, для кожної точки на основі калібрувальної кривої. Кількість антитіла п11.6, яке має активність зв'язування з людським МОР, в стегновому м'язі розраховували, помножуючи отримані значення для групи з введенням 0,3 мг/кг і групи з введенням З мг/кг на 35 і 350, відповідно, і одержували арифметичне середнє.
Таким чином, кількість антитіла П17.6, яке має активність зв'язування з людським МОБ, для групи з введенням 0,3 мг/кг склала 2,12 мкг/мл і для групи з введенням З мг/кг склала 77,9 мкг/мл.
Ці результати, які належать до концентрації антитіла 11.6 і кількості антитіла п17.6, що має активність зв'язування з людським МОР, в стегновому м'язі, показали, що майже усе антитіло, що знаходиться в стегновому м'язі, є антитілом, яке має активність зв'язування з людським
Ма.
Далі, для оцінювання активності, пов'язаної з інгібуванням зв'язування відносно людського
МОРЕ в стегновому м'язі, проводили конкурентний аналіз ЕГІЗА з людським МОБ-їКА, який спрямований на інгібування зв'язування між людським МОБ і його рецептором ІгКА як індикатор.
Людський КА (КаО Бузіетв5, 175-1К-050), розведений РВ5 до концентрації 2000 нг/мл, додавали в білий 384-лунковий планшет Мипс Махібогр по 20 мкл/лунку і іммобілізували інкубуванням протягом ночі при 4 "С. Розчин людського їїКА видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді і додавали ВіосКег Сазеїіпе в ТВ5 по 80 мкл/лунку, і планшет інкубували протягом 30 хв при кімнатній температурі Планшет відмивали три рази розчином для відмивання (ТВ5, що містить 0,05 95 Гуєеп-20) для видалення ВіосКег Сазеїпе в ТВ5. Гомогенат стегнового м'яза щура, розведений у 5 разів для групи з введенням 0,3 мг/кг і розведений у 50 разів для групи з введенням З мг/кг за допомогою РВ5, що містить 0,1 956 В5А, змішували кожний з 0,4 мкг/мл біотинільованого людського МОБ у однакових кількостях, і інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, і додавали отримані зразки по 20 мкл/лунку. бо Оскільки зібрані м'язові тканини розводили розчином для гомогенату тканини, який у 2,5 рази перевищував кількість м'язових тканин, концентрації антитіла в стегновому м'язі для групи з введенням 0,3 мг/кг і групи з введенням З мг/кг оцінювали з використанням розчинів з розведенням у 35 разів і 350 разів, відповідно.
Біотинільований людський МОРЕ, застосовуваний у даному документі, одержували шляхом біотинілювання людського МОБ (КО БЗувіет5, 256-СЕ-100/СЕ) за допомогою Е2-Гіпк МНн5-
РЕСА-Віоїїпе (Тпегто 5сіепійіс, 21329). Біотинілювання людського МОРЕ проводили, додаючи 5 мкл 5 мМ розчину МНЗ-РЕС4-Віоїіпе до 1 мл 0,4 мг/мл людського МОБ, інкубуючи протягом 2 годин на льоду у темряві, і заміняючи розчин реакційної суміші на РВ5 з використанням Атісоп
МНга ЗК на 0,5 мл (Мійроге, ШЕС500324) двічі згідно з посібником.
РВ5, що містить 0,1 95 В5А, і 10 мкг/мл антитіла п11.6, розведеного РВ5, що містить 0,1 95
ВЗА, використовували як контроль. Контрольні зразки для групи з введенням 0,3 мг/кг і групи з введенням З мг/кг розводили РВ5, що містить 0,1 956 В5БА, який містив 10 і 1 95 гомогенату стегнового м'яза без антитіла, відповідно. Після інкубації протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, планшет відмивали три рази розчином для відмивання і додавали в лунку 20 мкл розведеного у 1000 разів і міченого лужною фосфатазою стрептавідину (Пегто, 21324) в розведеному у 20 разів ВіосКкіпд Опе в ТВ5, що містить 0,05 95 Туееп-20. Після інкубації протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, планшет відмивали три рази розчином для відмивання і додавали 20 мкл/лунку субстрату для лужної фосфатази (Хемілюмінесцентний субстрат для ЛФ для мікролунок/мембран, суперчутливий, 450 нм; ЗигМодісв, АРО4-0100-01), змішаного у співвідношенні 1:1 з розведеним у 10 разів розчином 200 мМ буфера Трис (рН 9,8), що містить 10 мМ хлориду магнію. Після інкубації протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, величину сигналу вимірювали лічильником ЕпМізіоп (РеїКіп ЕІтег).
Для розрахунку активності антитіла, пов'язаної з інгібуванням зв'язування людського МОБ для кожної концентрації, виміряну величину для РВ5, що містить 0,1 95 В5А, приймали за 0 95 і виміряну величину максимальної концентрації кожного антитіла приймали за 100 95. Тест проводили у двох повтореннях (з 4 або 8 лунками для контролю), і одержували арифметичне середнє.
Таким чином, група з введенням 0,3 мг/кг показала активність, пов'язану з інгібуванням зв'язування, 21,2 95 навіть в умовах, коли концентрація антитіла в стегновому м'язі розведена у
Зо 35 разів. Далі, група з введенням З мг/кг показала активність, пов'язану з інгібуванням зв'язування, 59,9 956 в умовах, коли концентрація антитіла в стегновому м'язі розведена у 350 разів. Це підтверджує, що в тканинах стегнового м'яза в групах, де антитіло П17.6 вводять по 0,3 і З мг/кг, антитіло має активність, пов'язану з інгібуванням зв'язування проти людського МОБ шляхом інгібування зв'язування між людським МОБ і його рецептором ІгКА. 35 Вищевказане ясно демонструє, що Рар-фрагмент антитіла до людського МОЕ за даним винаходом, антитіло п11.6, зберігає свою концентрацію в тканині-мішені і активність зв'язування з людським МОБ при місцевому введенні, і, таким чином, інгібує зв'язування між людським МОБ і його рецептором. Бар-фрагмент антитіла до людського МОЕ за даним винаходом, антитіло
НП11.6, має високий потенціал для забезпечення чудового лікарського засобу, який проявляє 40 бажані ефекти лікарського засобу для місцевого впливу в тканині-мішені з меншим рівнем місцевої дози. «ПРИКЛАД 8: Оцінювання аналгетичних ефектів на моделі післяопераційного болю у щурів після розсічення підошви»
Аналгетичні впливи антитіла п11.6 на післяопераційний біль при місцевому введенні в 45 ділянку операції оцінювали на щуриній моделі післяопераційного болю з розсіченням підошви
ІВапік АК еї аї. Раїп 2005; 117. р. 68-76), яка розглядається як відображення післяопераційного болю в клінічній моделі. Патентний документ 3 показує, що системне внутрішньовенне введення повністю людського антитіла 1-15 (М520-А)-Рар--ї0Кк РЕС до людського МОГ демонструє аналгетичний ефект на цій моделі. В цьому дослідженні, 1-15 (М520-А)-Рар-ТОК 50 РЕС застосовували для порівняння післяопераційного болю при місцевому і системному введенні для оцінювання аналгетичних ефектів при місцевому введенні антитіла п17.6.
Конкретно, усього було п'ять груп, кожна група з операцією включала 10 щурів, і кожна група без операції включала 5 щурів, групи являли собою групу без операції, групу з розчинником (20
ММ цитрату, 120 мм масі, рнНб), групу, якій місцево вводили 900 мкг антитіла п11.6 у підошву, 55 групу, якій місцево вводили 900 мкг 1-15 (М520-А)-Рар'-10К РЕС у підошву, і групу, якій вводили 1 мг/кг 1-15 (М520-А)-Рар-10К РЕС внутрішньовенно. Місцеве введення в підошву проводили, імплантуючи в розрізану частину підошовного м'яза шматочок листа Зропдеї! (зареєстрована торговельна марка) (АзіеЇа5 Рпапта) приблизно в 2 мг, який був змочений і просочений 30 мкл мг/мл розчину антитіла. Групі з розчинником і групі, якій вводили 1 мг/кг 1-15 (М520О-А)-Бабр'- бо 10К РЕС внутрішньовенно, імплантували листи Зропдеії, які були змочені і просочені розчинниками. В цьому оцінюванні, підошва лівої задньої лапи була розрізана приблизно на 10 мм у довжину прямою лінією, яка починалася від точки приблизно на 5 мм від кінця п'яти у напрямку до пальців, під анестезією ізофлураном, і підошовний м'яз, що відкрився, був розрізаний вертикально перед поверненням м'яза в його положення і імплантацією листа
Зропдеї, потім м'яз був зшитий матрацним швом у двох точках з використанням нейлонової нитки. Больовий поріг вимірювали через 24 години, 48 годин і 72 години після операції.
Больовий поріг досліджували з використанням динамічного підошовного естезіометра (до
Вазпйе) для вимірювання тиску, що вказує на поведінку для відвертання тиску на щурину підошву.
Як больовий поріг розраховували арифметичне середнє трьох значень порога тиску, які викликали поведінку уникнення у окремих щурів в кожній групі, і ступінь покращення больового порога в кожній групі, якій вводили фармацевтичний засіб, розраховували, встановлюючи больовий поріг в групі без операції як 100 95, і больовий поріг в групі з розчинником як 0 95. У результаті, через 24 години після операції, рівні покращення больового порога в групі, якій місцево вводили 900 мкг антитіла Пп11.6 у підошву, в групі, якій місцево вводили 900 мкг 1-15 (М520-А)-Рабр-10К РЕС у підошву, і в групі, якій вводили 1 мг/кг 1-15 (М520-А)-Рар-1ОК РЕС внутрішньовенно, склали 34 95, 49 9бв, і 46 95, відповідно, і больовий поріг в кожній групі, якій вводили фармацевтичний засіб, показав значуще покращення з р-0,05 з і-критерієм Стьюдента у порівнянні з групою з розчинником. Додатково, через 48 годин після операції, рівні покращення больового порога в групі, якій місцево вводили 900 мкг антитіла п11.6 у підошву, в групі, якій місцево вводили 900 мкг 1-15 (М520О-А)-Еар'-тоК РЕС у підошву, і в групі, якій вводили 1 мг/кг 1-15 (М520-А)-бар-10К РЕС внутрішньовенно, склали 38 95, З1 90, і 34 9о, відповідно, і больовий поріг в кожній групі, якій вводили фармацевтичний засіб, показав значуще покращення з р-0,05 з і-критерієм Стьюдента у порівнянні з групою з розчинником. Додатково, через 72 години після операції, рівні покращення больового порога в групі, якій місцево вводили 900 мкг антитіла п11.6 у підошву, в групі, якій місцево вводили 900 мкг 1-15 (М520-А)-Рар-1ок
РЕС у підошву, і в групі, якій вводили 1 мг/кг 1-15 (М520-А)-Рар-1Ь30К РЕС внутрішньовенно, склали 2695, 3395, і 2895, відповідно, і больовий поріг в кожній групі, якій вводили фармацевтичний засіб, показав значуще покращення з р-0,05 з і-критерієм Стьюдента у
Зо порівнянні з групою з розчинником. Коли проводили тест множинних порівнянь Тьюкі, ніяких значущих відмінностей з р«е0,05 не спостерігали в больовому порозі в трьох групах, а саме, в групі, якій місцево вводили 900 мкг антитіла П11.6 у підошву, в групі, якій місцево вводили 900 мкг 1-15 (М520-А)-Рар'-тоК РЕС у підошву, і в групі, якій вводили 1 мг/кг 1-15 (М520-А)-Бар-ТОоК
РЕС внутрішньовенно, ні через 24 години, ні через 48 годин, ні через 72 години після операції.
Це показує, що аналгетичні ефекти, спостережувані між цими трьома групами, є фармакологічно однаковими через 24 години, 48 годин і 72 години після операції, відповідно. «ПРИКЛАД 9: Оцінювання концентрації лікарського засобу в плазмі або тканині при місцевому введенні»
Для оцінювання концентрації кожного антитіла в підошовному м'язі або в плазмі з оцінювання в прикладі 8, групу, якій місцево вводили 900 мкг антитіла п17.6 у підошву, групу, якій місцево вводили 900 мкг 1-15 (М520-А)-Рар'-10К РЕС у підошву, і групу, якій вводили 1 мг/кг 1-15 (М520-А)-РарД-10К РЕС внутрішньовенно виділяли у щурів з п-3 способом, аналогічним до способу в прикладі 8, і вимірювали концентрацію антитіл в підошовному м'язі або в плазмі через 24 години після операції за допомогою електрохемілюмінесцентного аналізу (ЕС). Місцеве введення в підошву проводили аналогічно до прикладу 8, імплантуючи в розрізану частину підошовного м'яза шматочок листа Зропде! (зареєстрована торговельна марка) (АвіейПав5
РІпапгта) приблизно в 2 мг, який був змочений і просочений 30 мкл 30 мг/мл розчину антитіла.
Концентрацію антитіл в підошовному м'язі одержували, вимірюючи концентрацію зразків, які були гомогенізовані з 9-кратним об'ємом розчину гомогенату підошовної тканини (10 мМ Трис, 137 мМ масі, 1 95 тритон Х-100, 10 9о гліцерин, сОтріеїе, Міпі (Коспе), рН 8,0), і помножуючи цю концентрацію на 10. Вимірювання за допомогою аналізу ЕСІ проводили з використанням двох типів антитіл до 1-15, АНК-ІВІ -13А їі біотинільованого АНК-ІВІ -52А. Крім того, біотинільоване
АНК-ІВІ -52А одержували шляхом біотинілювання АНК-ІВІ-52А згідно з технічним посібником для Віоїіп Гареїпо КА-МНаІа (Ооїіпао І арогаюгієв, І КОЗ).
Спосіб аналізу ЕСІ показаний далі. Антитіло до 1-15, АНК-ІВІ-ІЇЗА, розведене ТВ5 до концентрації 5000 нг/мл, додавали до 96-лункового планшету Мийі-атау (Мезо 5сае Рівсомегу,
ЇТ5ХА-6) по 25 мкл/лунку. Планшет інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі, щоб іммобілізувати АНК-ІВІ-1ЗА. Розчин АНК-ІВІ-1А3А видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді, планшет відмивали три рази розчином для відмивання (ТВ5, що 60 містить 0,05 95 ПГуєеп-20), і додавали по 150 мкл/лунку ВіосКег Сазеіпе в ТВ5 (Тпегто, 37532).
Після інкубації протягом 1 години при кімнатній температурі, ВіосКег Сазеіпе в ТВ5 видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді. Планшет відмивали три рази розчином для відмивання, потім додавали 25 мкл/лунку розведеного у 10 разів зразка плазми гомогенату підошовного м'яза в розріджувачі (ВіосКег Сазеїпе в ТВ5, що містить 0,05 ую Гуееп-20).
Для одержання калібрувальної кривої для зразка плазми, одержували антитіло п11.6 їі 1-15 (М520-А)-Баб-1ї0кК РЕС, розведені у 10 етапів у діапазоні від 333 нг/мл до 0,017 нг/мл розріджувачем, що містить 10 95 плазму без антитіла, і розріджувач, що містить 10 95 плазму без антитіла, використовували як контроль. Для одержання калібрувальної кривої для гомогенату підошовного м'яза, антитіло Пп11.6 ї 1-15 (М520О-А)-Рар'-10К РЕС розведені у 10 етапів у діапазоні від 333 нг/мл до 0,017 нг/мл розріджувачем, що містить 10 95 гомогенат підошовного м'яза без антитіла. Розріджувач, що містить 10 95 гомогенат підошовного м'яза без антитіла, використовували як контроль. Після інкубації протягом 1 години при кімнатній температурі, розчин видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді. Планшет відмивали три рази розчином для відмивання, і додавали в лунку 25 мкл біотинільованого АНК-ЇІВІ -52А, розведеного до 1000 нг/мл розріджувачем, і планшет інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Розчин видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді, планшет відмивали три рази розчином для відмивання, і додавали в лунку 25 мкл стрептавідину М5О
ЗМІ ГО-ТАа (Мезо Зсаїе Різсомегу, ВЗ2АЮ-1), розведеного у 500 разів розріджувачем. Планшет інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі, розчин видаляли центрифугуванням у переверненому вигляді, і планшет відмивали три рази розчином для відмивання. Після цього додавали в лунку 150 мкл М5О Кеаа Виїег Т(4х) (Мезо Зсаїе бізсомегу, КУ2ТС-1), розведеного у два рази ультрачистою водою (МіО (зареєстрована торговельна марка), МегсК), електрохемілюмінесценцію зразків вимірювали за допомогою 5ЕСТОК Ітадег 6000 (Мезо зЗсаїе рівсомегу).
Була побудована калібрувальна крива для розрахунку концентрації антитіла. Рівняння регресії аналізували за допомогою алгоритму підбору з чотири- або п'ятипараметричною логістичною кривою, концентрації антитіла в плазмі і підошовному м'язі розраховували для кожної точки. Кожний тест проводили в трьох повтореннях, і одержували арифметичне середнє розрахованих концентрацій. Границя визначення антитіла П11.6 в цьому тесті склала 0,2 нг/мл
Зо для концентрації в плазмі, і 2 нг/мл для концентрації в підошовному м'язі, і границя визначення повністю людського антитіла до МОРЕ 1-15 (М520-А)-Рар-1О0К РЕС склала 0,5 нг/мл для концентрації в плазмі, і 2 нг/мл для концентрації в підошовному м'язі.
Концентрація в підошовному м'язі в групі, якій місцево вводили 900 мкг антитіла 17.6 у підошву, групі, якій місцево вводили 900 мкг 1-15 (М520-А)-Рар'-10К РЕС у підошву, і групі, якій вводили 1 мг/кг 1-15 (М520О-А)-Рар'-10К РЕС внутрішньовенно, через 24 години після введення склала 132 нг/мл, 46,2 нг/мл, і 24,1 нг/мл, відповідно. Концентрація в підошовному м'язі була найбільшою для введення антитіла Пп11.6 у підошву. З іншого боку, концентрація в плазмі через 24 години після введення була менше ніж 0,230 нг/мл (з трьох прикладів, один був 0,230 нг/мл, і два були менше ніж 0,2 нг/мл), 65,1 нг/мл, 396 нг/мл, відповідно, і концентрація в плазмі була найбільш низькою для місцевого введення антитіла п11.6 у підошву.
На основі концентрації кожного антитіла в підошовному м'язі і в плазмі, розраховували співвідношення концентрацій в підошовному м'язі/плазмі через 24 години після введення для групи, якій місцево вводили 900 мкг антитіла п11.6 у підошву, групи, якій місцево вводили 900 мкг 1-15 (М520-А)-Рар'-1ОК РЕС у підошву, і групи, якій вводили 1 мг/кг 1-15 (М520-А)-Бар-ТоК
РЕС внутрішньовенно. Концентрація в плазмі через 24 години після введення для індивідуумів, яким вводили 900 мкг антитіла п17.6 у підошву була призначена величиною границі визначення, 0,2 нг/мл, оскільки вона була нижче границі визначення в цих умовах.
Співвідношення концентрацій в підошовному м'язі/плазмі через 24 години після введення для групи, якій місцево вводили 900 мкг антитіла п11.6 у підошву, групи, якій місцево вводили 900 мкг 1-15 (М520-А)-Гар'-10К РЕС у підошву, і групи, якій вводили 1 мг/кг 1-15 (М520-А)-Раб'- 10К РЕС внутрішньовенно, склали 628, 0,71, і 0,061, відповідно. Співвідношення концентрацій в підошовному м'язі/плазмі для 1-15 (М520-А)-Рар'-10К РЕС, яке вводили у підошву, було більше ніж і 10 разів вище, ніж для внутрішньовенного введення. Антитіло п1ї.6 продемонструвало співвідношення концентрацій в підошовному м'язі/плазмі більше ніж у 800 разів високе, ніж 1-15 (М520-А)-БЕар'-10К РЕС, при порівнянні їх місцевого введення у підошву.
Вищеописані результати вказують на те, що місцеве введення антитіла п11.6, яке являє собою Рар-фрагмент антитіла до людського МОБ за даним винаходом, може знижувати концентрацію лікарського засобу у системному кровотоку, з одночасним збереженням концентрації лікарського засобу у цільовому місцевому осередку, і додатково демонструють, що 60 воно знижує концентрацію лікарського засобу у системному кровотоку з одночасним збереженням концентрації лікарського засобу у цільовому місцевому осередку більш ефективно ніж повністю людське антитіло до МОБ 1-15 (М520-А)-Гарі-1ОК РЕС. Як такий, Бар-фрагмент антитіла до людського МОГ за даним винаходом, має високий потенціал для забезпечення чудового лікарського засобу, який знижує системні побічні ефекти, одночасно проявляючи бажані ефекти лікарського засобу у місцевому осередку.
ПРОМИСЛОВА ПРИДАТНІСТЬ
Очікується, що Раб-фрагмент антитіла до людського МОБ за даним винаходом буде корисним для лікування післяопераційного болю. Очікується, що Рар-фрагмент антитіла до людського МОРЕ за даним винаходом буде особливо корисним як покращений фармацевтичний засіб, який знижує системні побічні ефекти від системного впливу у крові, одночасно проявляючи бажані ефекти лікарського засобу у місцевому осередку.
СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ У ДОВІЛЬНІЙ ФОРМІ
Пояснення наведені для "Штучної Послідовності? описаної для кожного числового показника «223» зі списку послідовностей, показаного далі. Конкретно, послідовність основ, показана в ЗЕО ІЮ МО:1 зі списку послідовностей, являє собою послідовність основ фрагмента важкого ланцюга з антитіла П17.6, і амінокислотна послідовність, показана в 5ЕО ІЮ МО:5 зі списку послідовностей, являє собою амінокислотну послідовність фрагмента важкого ланцюга, що кодується 5ЕО ІЮ МО:1. Послідовність основ, показана в 5ЕБО ІЮ МО:2 зі списку послідовностей, являє собою послідовність основ фрагмента важкого ланцюга з антитіла П11.7, і амінокислотна послідовність, показана в 5ЕО ІЮ МО:6 зі списку послідовностей, являє собою амінокислотну послідовність фрагмента важкого ланцюга, що кодується 5ЕБЕО ІЮО МО2.
Послідовність основ, показана в ЗЕО ІЮ МО:З зі списку послідовностей, являє собою послідовність основ фрагмента важкого ланцюга з антитіла П11.8, і амінокислотна послідовність, показана в 5ЕО ІЮ МО;:7 зі списку послідовностей, являє собою амінокислотну послідовність фрагмента важкого ланцюга, що кодується ЗЕО ІЮ МО:3. Послідовність основ, показана в ЗЕО
ІЮ МО:4 зі списку послідовностей, являє собою послідовність основ легкого ланцюга з 1- 15(мМ520-А) Рар'-фрагмента, і амінокислотна послідовність, показана в 5ЕО ІО МО:8 зі списку послідовностей, являє собою амінокислотну послідовність легкого ланцюга, що кодується 5ЕО
ІО МО:4. Послідовність основ, показана в ЗЕО ІЮО МО:9 зі списку послідовностей, являє собою
Зо послідовність основ варіабельної ділянки важкого ланцюга з ЕРар-фрагмента антитіла до людського МОБ за даним винаходом, і амінокислотна послідовність, показана в 5ЕО ІЮ МО:10 зі списку послідовностей, являє собою амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що кодується 5ЕО ІЮ МО:9. Послідовність основ, показана в ЗЕО ІЮ МО:11 зі списку послідовностей, являє собою послідовність основ варіабельної ділянки легкого ланцюга з ЕРар- фрагмента антитіла до людського МОЕ за даним винаходом, і амінокислотна послідовність, показана в ЗЕО ІЮО МО:12 зі списку послідовностей, являє собою амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що кодується ЗЕО ІЮ МО:11.
СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Авбе11а5 Ріахтхша Іпс. «1205 НОВИЙ КЕАВ-ФРАГМЕНТ АНТИТІЛА ДО ЛЮДСЬКОГО МСЕ «1305 РЕА1535-16021 «1505 ОР2О15-104806 «1515 2015-05-22 «1605 12 «1705 РасепсІп уеквіоп 3.5 «2105 1 «2115 675 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» ДНК, що кодує фрагмент важкого ланцюга П1Т.6 60
«4005 1 саддесдсадс гасадсадед дддсдсадчда седеЕсдаадс сЕссддадас ссудЕсссес бо асстдсдстд єстаєсддеду деЕссЕссадеі ддеєстастасі ддадсвєдддЕ ссдссадссс 120 ссаддчаадч доассддадчсд чассдодддаа ассдассаса дсддаадсас саасаасаас 180 ссдЕСсСсСЕСсСа ададеЕсдчадес сассаваєса дсаддсасудс ссаадаасса дЕсссссстд 240 аадсєдадсе срдсдассдс сдсододасасуд дсЕдЕЧвасс ассдеЕссдад ачасддаддадсе 300 сссдаассоядч дчасддаддс ЄЕЄЕєЧатртаєс сддддссаад ддасаасддс сассдЕСссс
З6о
Есадссеєсса ссаадддсесс ассуддассеЕс сссстддсас ссІссессаа дадсасстсь 420 чаддаддсасад сдадссстдуда сЕдсстддеЕсС ааддастасе ЕСсСсссддаасс даєсдасоаЧвед 480
ЕсдеЕддаасеі саддсдсссо дассадсддс десдсасассеє ЕсссддсвдЕеЕ сстасадссс 540
ЕсаддасеЕсс ассссстсад садсчєддаєд ассдсдсссо ссадсадсес дддсасссад
Зо бо асстасаєсс дсаасдєдаа Есасаадссс адсаасасса аддеЕддасаа дааадеЕсдвад бо сссаааєстєсє дедас 675 «2105 2 «2115 672 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» ДНК, що кодує фрагмент важкого ланцюга П1Х.7 «4005 2 саддесдсадс гасадсадсд дддсодсадчда седеЕсдаадс сЕссддадас ссудЕсссес бо асстдсудсста ЕСТавєдаєдуа дЕССЕЕСадЕ дЧдЕБасвасе ддвадсгідддІ ссдссадссс 120 ссаддчаадч доассддадчсд чассдодддаа ассдассаса дсддаадсас саасаасаас 180 ссдЕСсСсСсСЕСсСа ададеЕсдчадс сассавгаєса дсаддсасудс ссаадаасса дЕссЕсссвд 240 аадсєдадсе срдсдассдс сдсододасасуд дсЕдЕЧвасс ассдеЕссдад ачасддаддадсе сссдааєсдд ддаєдддддс ЕЄЕЕдатаєс єддддссаад ддасааєдді сассаєстсс
З6о
Есадссссса ссаадддссс агсдддЕССсс сссстддсас ссеіссессаа дадсассесь 420 чаддаддсасад сдадссстдуда сЕдсстддеЕсС ааддастасе ЕСсСсссддаасс даєсдасоаЧвед 480
ЕсдеЕддаасеі саддсдсссо дассадсддс десдсасассеє ЕсссддсвдЕеЕ сстасадссс 540
ЕсаддасеЕсс ассссстсад садсчєддаєд ассдсдсссо ссадсадсес дддсасссад бо асстасассе дсаасдєдаа єсасаадссс адсаасасса аддсддасаа дчааадсєдад бо сссааассьє де 672 «2105 З «2115 678 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» ДНК, що кодує фрагмент важкого ланцюга П1Т.8
З5 «4005 З саддесдсадс гасадсадсд дддсодсадчда седеЕсдаадс сЕссддадас ссудЕсссес бо асстдсудсста ЕСТавєдаєдуа дЕССЕЕСадЕ дЧдЕБасвасе ддвадсгідддІ ссдссадссс 120 ссаддчаадч доассддадчсд чассдодддаа ассдассаса дсддаадсас саасаасаас 180 ссдссссІса ададссдадс сассатаєса деаддсасдІ ссаадаасса дЕсстссст 240 аадсєдадсе срдсдассдс сдсододасасуд дсЕдЕЧвасс ассдеЕссдад ачасддаддадсе 300 сссдаассоядч дчасддаддс ЄЕЄЕєЧатртаєс сддддссаад ддасаасддс сассдЕСссс
З6о
Есадссссса ссаадддссс аєсддЕССсс сссстддсас ссеісссссаа дадсассеісу 420 чаддаддсасад сдадссстдуда сЕдсстддеЕсС ааддастасе ЕСсСсссддаасс даєсдасоаЧвед 480
ЕсдеЕддаасеі саддсдсссо дассадсддс десдсасассеє ЕсссддсвдЕеЕ сстасадссс
Есаддассст асеЕссстеЕвад гадсдіддед ассдедсссІ ссадсадсеє дддсасссад бо асстасаєсс дсаасдєдаа сСсасаадссс адсаасасса аддеЕддасаа дааадеЕсдвад бо сссааассес деЕдсадсс 678 «2105 4 «2115 657 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» ДНК, що кодує легкий ланцюг 1-15(М520-А)-Еар'-фрагмента «4005 4 чавгасєєсдеЕда єдасесадесс сссасеЕсссс сідсссдеса сссстрддада дссддссесс бо ассЕсСстсдса ддЕЕстадсса дадссеЕсстд сагадсааєсд дасєсааста ЕЕсОдЧЯєсТСаО 120
Зо тассрдсада адссадддса дсЕсЕссасад сеЕССЕДдасст аєссддаєєс тсааєссоддасс 180
ЕссддаддеЕСсССсС сідасаддеЕс садсддсадеЕ двдаєссаддса сачарєссвтас єСЕсдааааєс 240
З5 ачсачачедч ададсеЕдчадча сДЯдеЕсоодоадеЕЕ саєстаседса гдсаадсесс асааассссд 300 гасасьсеєсд дссаддддас саадсеєддад ассааасада судеЕддсвдс ассаєстдеЕс
З6о ссасссвсс содассаєстьда сдадсадессд ааасстддаа сСдсссстає єдЕдЕДДСсСвд 420 сЕЧчааєаасе сстаєссссад ададдссааа дсасадсдда аддсддасаа сдесстссаа 480
Есдддсаасоі сссаддачад Сбдссасадад саддасадса аддасадсас стасадссес 540 адсадсассс гдасдссдад сааадсадас сбасдадааас асааадсста сдсстдсдаа бо дЕсасссаєсс адддссодад сЕСдсссдсс асааачадсо єсаасаддавда ачдадеде 657 «2105 -Б15555
«2115 225 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» фрагмент важкого ланцюга П17Т.6 «4005 (5
Сіп Маї сбіп Гецш сіп біп Тгр сбі1у Аїа сіу Гей пецп Гув Ркго бет біц 1 5 10 15
ТпПх Гец бБет Гецп ТПї Сув Азїа Уа1 Тук сіу с1і1у бБет РПпе Бек с1Уу Тук
Тут Тер бБет Тктр Уаі Агу біп Рго Рго сбі1у Ппув с1Уу Гей сі ТкЕр Ше 20 сСіу б1іц І1їе Авр Нів Бех Сіу бБет ТрІ Авп Авп Авп Рго бет Ієц Гуз бо 25 зек Акуд Уа1і ТПх Іїе бек Уаї с1у ТПг бек Гув Авп сбіп РоПе бБетг Гей 65 70 75 80
Зо їпув Гец бБег бБет Уаі! ТПт Аза Аза Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тук Сув Бекг 85 Зо 95
Ат Авр сб1у с1і1у Рго сіц бет сі1у Меє сС1у Аза Рпе Авр Іїе Тгр 01Уу
З5 1600 195 110 сбіп сб1у ТПт Мес Уа1! ТПт Уаї бет бБет Аїа бет ТПт пув б1іу Рго 5бБег 115 120 125 40 уаї Рпе Рго Гец Аїа Рко бет бет Гуз Бех ТПтІ бет біу с1іу ТПт А1а 130 135 140 45
А1їа тецшц с1у Сув Гец Уаії Гпув Авр Тут РіПбе Рго біц Рго Уаі1! ТПт Уаї 145 150 155 160 50 бек Тер Авп бек с1у А1їа їецй ТПх бек сС1і1у Уаі1 Нів ТрПх Ріе Рго Аї1а 165 170 175 уаї Гей сбіп бБет бБет сіу Гецп Тут бБектк Гецй бет бет Уаі1і Уаі1і ТПт Уаї 55 180 185 190
Рго бек бет бБет Гец біу ТПт Сіп Тіт Тут І1ї1е Суз Авп Уаї Авп Нів
195 200 205
Туз Рко бБет Авп ТПтІ Гуз Уаі Авр гув пув Уаії біц Рго Ппув бБетг Сув 210 215 220
Авр 225 «2105 6 «2115 224 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» фрагмент важкого ланцюга П1Х.7 «4005 6 сбіп Маі сбіп Гец сіп сіп Ткр с1у Аїа сС1у Гей гей пув Рго бБет б1ц 1 5 10 15
ТпПх Гец бБет Гецп ТПї Сув Азїа Уа1 Тук сіу с1і1у бБет РПпе Бек с1Уу Тук 20 25 30
Зо Тут Тер бБег Тгр Уаі Агд сіп Рго Рго Сіу Гув с1у Гец сії Тгр Ії1е сСіу б1іц І1їе Авр Нів Бех Сіу бБет ТрІ Авп Авп Авп Рго бет Ієц Гуз
З5 50 зо бо зек Акд Уа1і ТПх Іїе бек Уаї с1у ТПг бек Гув Авп сбіп РоПе бБетг Гей 65 70 75 80 40
Туз Гец бБет бБет Уаі ТПйх Аза Аза Авр ТПтІ Аїа Уа1ї Тут Тук Сув бек 85 Зо 95 45
Ат Авр сб1у с1і1у Рго сіц бет сі1у Меє сС1у Аза Рпе Авр Іїе Тгр 01Уу 100 105 110
Сбіп сіу ТПпк Меєс Уаї ТПтї Уаї бек бек Аїа бБетїт ТПт Гув с1у Рго 5бБег 115 120 125 уаї Рпе Рго Гец Аїа Рко бет бет Гуз Бех ТПтІ бет біу с1іу ТПт А1а 130 135 140
А1їа тецшц с1у Сув Гец Уаії Гпув Авр Тут РіПбе Рго біц Рго Уаі1! ТПт Уаї
145 150 155 160 бек Тер Авп бехт С1у Аїа їєц ТП бегт с1іу Уаї Ніз Трк Ріе Рго А1а 165 170 175 уаї Гей сбіп бБет бБет сіу Гецп Тут бБектк Гецй бет бет Уаі1і Уаі1і ТПт Уаї 180 185 190
Рго бек бет бБет Гец біу ТПт Сіп ТПт Тут І1ї1е Сувз Авп Уаї Авп Нівз 195 200 205
Туз Рко бБет Авп ТПтІ Гуз Уаі Авр гув пув Уаії біц Рго Ппув бБетг Сув 210 215 220 «2105 7 «2115 226 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» фрагмент важкого ланцюга ПІ1Т.8 «4005 17
Зо Сіп Маї сбіп Гецш сіп біп Тгр б1у Аїа сіу Гей Гец Гув Рго бет біц 1 5 10 15
ТпПх Гец бБет Гецп ТПї Сув Азїа Уа1 Тук сіу с1іу бБет РпПе бек С1УуУу Тук
З5 20 25 30
Тут Тер бБет Тктр Уаі Агд біп Рго Рго сбі1у Ппув с1Уу Гей сі ТкЕр Ше 40 сСіу б1іц І1їе Авр Нів Бех Сіу бБет ТрІ Авп Авп Авзп Рго бет Іец Гуз бо 45 зек Акд Уа1і ТПх Іїе бек Уаї с1у ТПг бек Гув Авп сбіп РоПе бБетг Гей 65 70 75 80 50 їпув Гец бБег бБет Уаі! ТПх Аза Аза Авр ТПт Аїа Уаї Тут Тут Сув 5бекг 85 Зо 95
Ат Авр сб1у с1і1у Рго сіц бет сі1у Меє сС1у Аза Рпе Авр Іїе Тгр 01Уу 55 1600 195 110 сбіп сб1у ТПт Мес Уа1! ТПї Уаі1ї бек бек Аїа бБет ТПт пув біу Рго 5бБег
115 120 125 уаї Рпе Рго Гец Аїа Рко бет бет Гуз Бех ТПтІ бет біу с1іу ТПт А1а 130 135 140
А1їа тецшц с1у Сув Гец Уаі1і Гпув Авр Тут РіПе Рго біц Рго Уаі1! ТПт Уаї 145 150 155 160 бек Тер Авп бехт С1у Аїа їєц ТП бегт с1іу Уаї Ніз Трг Ріе Рго А1а 165 170 175 уаї Гей сбіп бБет бБет сіу Гецп Тут бБектк Гецй бет бет Уаі1і Уаі1і ТПт Уаї 180 185 190
Рго бек бБет бек Гей С1у ТПг Сіп ТПт Тук І1е Сув Авп Уаії Авп Нів 195 200 205
Туз Рко бБет Авп ТПтІ Гуз Уаі Авр гув пув Уаії біц Рго Ппув бБетг Сув 210 215 220
Аза Аїта 225
Зо «2105 8 «2115 219 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» легкий ланцюг 1-15(М520-А) --Еар'-фрагмента «4005 8
Авр Іїе Маії Мес ТПтІ сіп бет Рко Гец бБеїт Гей Рго Уа! ТПг Рго 01Уу 1 5 10 15
Сіш Рго Аїа бек І1е бБег Сув Агд бБет бек біп бек Гей Гец Нів 5бег 20 25 30
Авп обіу Рпе Авзп Тут їец сіу Тгр Тут Гей біп Пув Рго сб1у сіп бБег 35 40 45
Ркто Сіп Гей Ггеп Іїе Тухк пГец сіу бБег Авп Агтуд Аїа Бех сіу Уаі1ї Рго 50 55 бо
Авр Атуд Рпе бБет сіу бБет сіу бБет біу ТПх Авр Рпе ТПтІ Іец Гув І1е
65 70 75 80 зехт Акд Уаі бі Аїа біш Авр Уа1і! сіу Маї Тут Тут Сув Меє сіп Аїа 85 30 95 теп сіп ТПт Рко Тут ТПїІ Рпе сбіу біп бі1у ТПтї пув Те бі Іїе Гуз 100 105 110
Атуд ТП Маі Аза Аїа Рко бет Уаі! РпПе І1ї1е Рбе Рго Рго бБет Авр б1ц 115 120 125 біп Гей Гув бБет с1у ТПтІ Аїа бБет Уаії Уаї Сув Гей Гей Авп Авп РІе 130 135 140
Тук Рго Акд біц Аза Гуз Уаі1ії сіп Ткр пув Ма1! Авр Авп Аїа еп сіп 145 150 155 160 бек б1у Авп бек біп бі бек Уа1! ТПг бі сбіп Авр бек Гув Авр бек 165 170 175
ТПт Тут бБет Ггец бет бек ТПх Ггецп ТПх Гей бет Гув Аїа Авр Тух б1ц 180 185 190
Зо пуз Ніз пув Маї Тут Аїа Сув Ссіц Уаї ТрІ Нів СсСіп сб1у Гєц бег 5бег 195 200 205
З5
Рхто Уа1і ТПї Кпув бек Рпе Ап Агуд о1у сії Сув 210 215 «2105 139 «2115 363 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Ген УН антитіла до людського МСЕ «2205 «221» кодуюча послідовність «222» (1)..(363) «4005 19 сад дб9д сад ста сад сад сб9д9 додс о дса дда ссд СсСдд аад сс сс дад 48 сбіп Маі сбіп Гец сіп сіп Ткр с1у Аїа сС1у Гей гей пув Рго бБет б1ц 1 5 10 15 асс студ сс осос асс гос дсе дес тає дає дад сс сс адес дає вас дв)
ТпПх Гец бБет Гецп ТПї Сув Азїа Уа1 Тук сіу с1і1у бБет РПпе Бек с1Уу Тук 20 25 30 ас сдуд адс бодд дес сус сад ссс осса дод аад дад ст дадч єдч асе 144
Тут Тер бБет Тктр Уаі Агд біп Рго Рго сбіу пув с1у Гей сі Тгр Ше 35 40 45 чад даа ас дас сасє ад дда адс асс аас аас аас ссд сс сс аад 192 сСіу б1іц І1їе Авр Нів Бех Сіу бБет ТрІ Авп Авп Авп Рго бет Іец Гуз 50 зо бо адЕ счда дес асс аса са дра додс ас сс аад аас сад сс сс сід 240 зек Акд Уа1і ТПх Іїе бек Уаї с1у ТПг бек Гув Авп сбіп РоПе бБетг Гей 65 7о 75 80 аад суд адс сс дебд о асс одсс о дсу дас ас дсс дсд ває вас вєДдеЕ єс 288
Туз Гец бБет бБет Уаі ТПйх Аза Аза Авр ТПтІ Аїа Уа1ї Тут Тук Сув бек 85 30 35 ача чає да дас о ссс одаа су дадвчд асчд дач дсе сс дає ас вада дос 336
Ат Авр сб1у с1і1у Рго сіц бет сі1у Меє сС1у Аза Рпе Авр Іїе Тгр 01Уу 1600 195 110
Зо саа дад аса асбд дсс асс дес сс са 363 сбіп с1у ТПт Мес Уаї! ТПтІ Уаї бек 5бег 115 120
З5 «2105 10 «2115 121 «212» Білок 40 «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція 45 «4005 10 сбіп Маі сбіп Гец сіп сіп Ткр с1у Аїа сС1у Гей гей пув Рго бБет б1ц 1 5 19 15 50
ТпПх Гец бБет Гецп ТПї Сув Азїа Уа1 Тук сіу сіу бБет РпПе бек С1УуУу Тук 20 25 30 55 Тут Тер бБег Тгр Уаі Агд сіп Рго Рго Сіу Гув с1у Гец сії Тгр Ії1е сСіу б1іц І1їе Авр Нів Бех Сіу бБет ТБПг Авп Авп Авзп Рго бБет Гец Гуз 50 зо бо зет Акд Уаі ТПїІ Іїе бек Уаї Сіу ТПї Бек Гув Авп біп РоПе 5бег Гец 65 70 75 80
Туз Гец бБет бБет Уаі ТПІ Аза Аза Авзр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тук Сув бек 85 30 35
Ат Авр сб1у с1і1у Рго сіц бет сі1у Меє сС1у Аза Рпе Авр Іїе Тгр 01Уу 1600 195 110 сбіп с1у ТПт Мес Уаї! Тіт Уаї бек 5бег 115 120 «2105 11 «2115 339 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Ген Уї антитіла до людського МСЕ
Зо «2205 «221» кодуюча послідовність «2225 (1)..(339) «4005 11 чає ас дчед ад ас сад сс сса сос сс сб ссс о десс асс о ссе дова 48
Авр Іїе Маії Мес ТПтІ сіп бет Рко Гец бБеїт Гей Рго Уа! ТПг Рго 01Уу 1 5 19 15 чач ссуд дсс о ссс ас сс гдс адд СЕ ад сач адс сс сс сає аЧчес дв)
Сіш Рго Аїа бек І1е бБег Сув Агд бБет бек біп бек Гей Гец Нів 5бег 20 25 30 аає дда сс аас тає суд ддЕ ду гас студ сад аач сса дда сад сс 144
Авп о б1у Рпе Авзп Тут Гец сіу Ткр Тут Гей біп ув Рго біу сбіп 5бег 35 40 45 сса сад сс студ ас тає суд ддеЕ СЕ аає сдуд дсс сс дда дес сс 192
Ркто Сіп Гей Ггеп Іїе Тухк Пец сіу бБег Авп Акгуд А1ї1а бек біу Уаі1ї Рго 50 зо бо час адд ЄС адеЕ ддс ад дда са ддс аса чає сс асо студ ааа асс 240
Авр Атуд Рпе бБет сіу бБет сіу бБет біу ТПх Авр Рпе ТПтІ Іец Гув І1е 65 70 75 80 ачс ача дс9д дад дсс дач дає дес дач дес вас вас єдс ад саа дес зехт Акд Уаі бі Аїа біш Авр Уа1і! сіу Маї Тут Тут Сув Меє сіп Аїа 85 90 95 ста саа ас ссу бас асо сс дос сад додд асс о аад сгд дад ас ааа 336 теп сіп ТПт Рко Тут ТПїІ Рпе сбіу біп бі1у ТПтї пув Те бі Іїе Гуз 1600 195 110 са9 339
АгЧ «2105 12 «2115 113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 12
Авр Іїе Маії Мес ТПтІ сіп бет Рко Гец бБеїт Гей Рго Уа! ТПг Рго 01Уу 1 5 19 15
Зо
Сі Рго Аїа бек І1е бек Сув Агд бек бет Сіп бек Гей Гец Нів 5бег 20 25 30
З5
Авп о б1у Рпе Авзп Тут Гец сіу Ткр Тут Гей біп ув Рго біу сбіп 5бег 40 Рго Сіп їец Гец Іїе Тут Гей Сіу 5Бегт Авп Агд Аїа бБет Сіу Уаї1ї Рго зо бо
Авр Атуд Рпе бБет сіу бБет сіу бБет біу ТПх Авр Рпе ТПтІ Іец Гув І1е 45 65 70 75 80 зехт Акд Уаі бі Аїа біш Авр Уа1і! сіу Маї Тут Тут Сув Меє сіп Аїа 85 30 35 50 теп сіп ТПт Рко Тут ТПїІ Рпе сбіу біп бі1у ТПтї пув Те бі Іїе Гуз 1600 195 110
АгЧ
Claims (18)
1. Рар-фрагмент антитіла до людського МОБЕ, вибраний з групи, що складається з (а) і (Б) нижче: (а) Гар-фрагмент антитіла до людського МОРЕ, що містить фрагмент важкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в 5ЕО ІЮ МО: 5, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЗХЕОІЮ МО: 8; і, (5) Раб-фрагмент антитіла до людського МОР, отриманий шляхом посттрансляційної модифікації Рар-фрагмента антитіла до людського МОБ з (а).
2. Гар-фрагмент антитіла до людського МОБ за п. 1, що містить фрагмент важкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в 5ЕО ІЮ МО: 5, і фрагмент легкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЗЕО ІО МО: 8.
3. Гар-фрагмент антитіла до людського МОБ за п. 1, де вказана посттрансляційна модифікація являє собою піроглутамінування на М-кінці варіабельної ділянки важкого ланцюга.
4. Рар-фрагмент антитіла до людського МОБ за п. 1, що містить фрагмент важкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЗЕО ІО МО: 5, де глутамін в амінокислотному положенні 1 5ЕО І МО: 5 модифікований у піроглутамінову кислоту, і фрагмент легкого ланцюга, що складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЗЕО ІЮ МО: 8.
5. Полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга з Еар- фрагмента антитіла до людського МОБ за п. 1.
6. Експресуючий вектор, вибраний з групи, що складається з (а) і (б), показаних нижче: (а) експресуючий вектор, що включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга РГаб-фрагмента антитіла до людського МОБ за п. 1, і полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг вказаного Гар-фрагмента антитіла до людського МОБ; і (р) експресуючий вектор, що включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Бар-фрагмента антитіла до людського МОБ за п. 1.
7. Клітина-хазяїн, трансформована експресуючим вектором за п. 6.
8. Клітина-хазяїн за п. 7, вибрана з групи, що складається з (а) і (б), показаних нижче: Зо (а) клітина-хазяїн, трансформована експресуючим вектором, що включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Рар-фрагмента антитіла до людського МОБ за п. 1, і полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг вказаного Гар-фрагмента антитіла до людського МОБ; і (р) клітина-хазяїн, трансформована експресуючим вектором, що включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує фрагмент важкого ланцюга Рар-фрагмента антитіла до людського МОБ за п. 1, і експресуючим вектором, що включає полінуклеотид, що містить послідовність основ, що кодує легкий ланцюг вказаного Гар-фрагмента антитіла до людського
Ма.
9. Спосіб одержання Рар-фрагмента антитіла до людського МОРЕ, що включає культивування клітини-хазяїна за п. 8 для експресії Рар-фрагмента антитіла до людського МОРЕ.
10. Рар-фрагмент антитіла до людського МОБ, здатний вироблятися за способом за п. 9.
11. Фармацевтична композиція, що містить Гар-фрагмент антитіла до людського МОЕ за будь- яким з пп. 1-4 і 10 ії фармацевтично прийнятний носій.
12. Фармацевтична композиція за п. 11, яка являє собою фармацевтичну композицію для місцевого введення для лікування післяопераційного болю.
13. Фармацевтична композиція, що містить Гар-фрагмент антитіла до людського МОБ за п. 2, Еаб-фрагмент антитіла до людського МОБ за п. 4, і фармацевтично прийнятний носій.
14. Фармацевтична композиція за п. 13, яка являє собою фармацевтичну композицію для місцевого введення для лікування післяопераційного болю.
15. Застосування БГар-фрагмента антитіла до людського МОЕ за будь-яким з пп. 1-4 і 10 для одержання фармацевтичної композиції для місцевого введення для лікування післяопераційного болю.
16. Застосування БГар-фрагмента антитіла до людського МОЕ за будь-яким з пп. 1-4 і 10 для лікування післяопераційного болю шляхом місцевого введення.
17. Рар-фрагмент антитіла до людського МОР за будь-яким з пп. 1-4 і 10 для застосування для місцевого введення для лікування післяопераційного болю.
18. Спосіб лікування післяопераційного болю, що включає місцеве введення індивідууму ефективної кількості Рар-фрагмента антитіла до людського МОБ за будь-яким з пп. 1-4 і 10. Зо
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015104806 | 2015-05-22 | ||
| PCT/JP2016/065099 WO2016190263A1 (ja) | 2015-05-22 | 2016-05-20 | 新規抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA123209C2 true UA123209C2 (uk) | 2021-03-03 |
Family
ID=57393503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201712706A UA123209C2 (uk) | 2015-05-22 | 2016-05-20 | Fab-ФРАГМЕНТ АНТИТІЛА ДО ЛЮДСЬКОГО NGF |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11260124B2 (uk) |
| EP (1) | EP3299461B1 (uk) |
| JP (1) | JP6700620B2 (uk) |
| KR (1) | KR102440054B1 (uk) |
| CN (1) | CN107614683B (uk) |
| AR (1) | AR104721A1 (uk) |
| AU (1) | AU2016268625B2 (uk) |
| BR (1) | BR112017025029A2 (uk) |
| CA (1) | CA2986210C (uk) |
| CO (1) | CO2017012397A2 (uk) |
| HK (1) | HK1246349A1 (uk) |
| IL (1) | IL255832B (uk) |
| MA (1) | MA42138A (uk) |
| MX (1) | MX2017014911A (uk) |
| MY (1) | MY184164A (uk) |
| PH (1) | PH12017502126A1 (uk) |
| RU (1) | RU2729825C2 (uk) |
| SG (1) | SG11201709589XA (uk) |
| TW (1) | TWI706959B (uk) |
| UA (1) | UA123209C2 (uk) |
| WO (1) | WO2016190263A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201708169B (uk) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113413938B (zh) * | 2015-04-06 | 2023-07-28 | 中尺度技术有限责任公司 | 操作测定系统的方法及ecl免疫测定系统 |
| NL2017890B1 (nl) * | 2016-11-29 | 2018-06-11 | Josh Ip Iii B V | Medische transportinrichting, hulpaandrijving, en werkwijze voor het transporteren van een dergelijke transportinrichting |
| JPWO2019221097A1 (ja) * | 2018-05-15 | 2021-05-27 | アステラス製薬株式会社 | 抗ヒトｎｇｆ抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分とする心房細動の抑制用医薬組成物 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5527358A (en) | 1994-01-21 | 1996-06-18 | Medtronic, Inc. | Temporary medical electrical lead |
| AU2003284010A1 (en) | 2002-10-04 | 2004-05-04 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating cardiac arrhythmia and preventing death due to cardiac arrhythmia using ngf antagonists |
| CN102746399B (zh) | 2002-12-24 | 2016-03-02 | 里纳特神经系统学公司 | 抗ngf抗体及其使用方法 |
| WO2005019266A2 (en) | 2003-07-15 | 2005-03-03 | Amgen Inc. | Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors |
| ITRM20030601A1 (it) | 2003-12-24 | 2005-06-25 | Lay Line Genomics Spa | Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti. |
| SI1732949T1 (sl) * | 2004-04-07 | 2010-05-31 | Rinat Neuroscience Corp | Postopki za zdravljenje bolečine kostnega raka zdajanjem antagonista živčnega rastnega faktorja |
| BRPI0606933B8 (pt) * | 2005-01-24 | 2021-05-25 | Cambridge Antibody Tech Limited | membro de ligação específico isolado para fator de crescimento de nervos, molécula de anticorpo isolado, composição e uso de um membro de ligação específico |
| US9532943B2 (en) | 2010-12-20 | 2017-01-03 | Cormatrix Cardiovascular, Inc. | Drug eluting patch for the treatment of localized tissue disease or defect |
| JP2007244601A (ja) | 2006-03-15 | 2007-09-27 | Kanazawa Univ | 心筋用パッド |
| KR101709495B1 (ko) | 2007-08-10 | 2017-02-23 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 인간 신경성장인자에 대한 고친화성 인간 항체 |
| SG10201703707YA (en) * | 2009-03-19 | 2017-06-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Pharmaceutical formulation containing improved antibody molecules |
| EP2448970B1 (en) | 2009-05-04 | 2014-07-09 | Abbott Research B.V. | Antibodies against nerve growth factor (ngf) with enhanced in vivo stability |
| KR20140005920A (ko) | 2010-12-20 | 2014-01-15 | 코매트릭스 카디오바스컬라 인코포레이티드 | 국부화된 조직 질병 또는 결함의 치료를 위한 약물 용출 패치 |
| CA2834983C (en) * | 2011-05-06 | 2020-11-17 | Nvip Pty Ltd | Anti-nerve growth factor antibodies and methods of preparing and using the same |
| SG194793A1 (en) * | 2011-05-06 | 2013-12-30 | Nvip Pty Ltd | Anti-nerve growth factor antibodies and methods of preparing and using the same |
| GB201114858D0 (en) * | 2011-08-29 | 2011-10-12 | Nvip Pty Ltd | Anti-nerve growth factor antibodies and methods of using the same |
| ME02944B (me) * | 2011-08-11 | 2018-04-20 | Astellas Pharma Inc | Novo antitelo protiv humanog ngf |
| EA201492163A1 (ru) | 2012-06-08 | 2015-08-31 | Гленмарк Фармасьютикалс С.А. | ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К TrkA, СОДЕРЖАЩИЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ |
| US9127055B2 (en) * | 2013-02-08 | 2015-09-08 | Astellas Pharma Inc. | Method of treating pain with anti-human NGF antibody |
| JP6135161B2 (ja) * | 2013-02-08 | 2017-05-31 | アステラス製薬株式会社 | 新規抗ヒトｎｇｆ抗体 |
| BR112017012104B1 (pt) | 2014-12-17 | 2021-11-30 | Dow Global Technologies Llc | Sistema de reação para formação de uma espuma de poliuretano viscoelástico e método para formar uma espuma de poliuretano viscoelástico |
-
2016
- 2016-05-20 TW TW105115796A patent/TWI706959B/zh active
- 2016-05-20 WO PCT/JP2016/065099 patent/WO2016190263A1/ja active Application Filing
- 2016-05-20 US US15/575,969 patent/US11260124B2/en active Active
- 2016-05-20 MY MYPI2017704449A patent/MY184164A/en unknown
- 2016-05-20 BR BR112017025029-2A patent/BR112017025029A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2016-05-20 CN CN201680029680.7A patent/CN107614683B/zh active Active
- 2016-05-20 AR ARP160101483A patent/AR104721A1/es unknown
- 2016-05-20 KR KR1020177034038A patent/KR102440054B1/ko active IP Right Grant
- 2016-05-20 RU RU2017145071A patent/RU2729825C2/ru active
- 2016-05-20 SG SG11201709589XA patent/SG11201709589XA/en unknown
- 2016-05-20 CA CA2986210A patent/CA2986210C/en active Active
- 2016-05-20 AU AU2016268625A patent/AU2016268625B2/en active Active
- 2016-05-20 JP JP2017520694A patent/JP6700620B2/ja active Active
- 2016-05-20 EP EP16799968.9A patent/EP3299461B1/en active Active
- 2016-05-20 UA UAA201712706A patent/UA123209C2/uk unknown
- 2016-05-20 MA MA042138A patent/MA42138A/fr unknown
- 2016-05-20 MX MX2017014911A patent/MX2017014911A/es unknown
-
2017
- 2017-11-21 IL IL255832A patent/IL255832B/en unknown
- 2017-11-22 PH PH12017502126A patent/PH12017502126A1/en unknown
- 2017-11-30 CO CONC2017/0012397A patent/CO2017012397A2/es unknown
- 2017-11-30 ZA ZA2017/08169A patent/ZA201708169B/en unknown
-
2018
- 2018-05-03 HK HK18105725.1A patent/HK1246349A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2016190263A1 (ja) | 2016-12-01 |
| SG11201709589XA (en) | 2017-12-28 |
| EP3299461A1 (en) | 2018-03-28 |
| EP3299461B1 (en) | 2023-03-29 |
| US20180147281A1 (en) | 2018-05-31 |
| MY184164A (en) | 2021-03-24 |
| TW201713691A (zh) | 2017-04-16 |
| US11260124B2 (en) | 2022-03-01 |
| IL255832A (en) | 2018-01-31 |
| KR20180006391A (ko) | 2018-01-17 |
| AR104721A1 (es) | 2017-08-09 |
| IL255832B (en) | 2021-07-29 |
| KR102440054B1 (ko) | 2022-09-06 |
| RU2729825C2 (ru) | 2020-08-12 |
| JP6700620B2 (ja) | 2020-05-27 |
| AU2016268625B2 (en) | 2022-01-27 |
| PH12017502126A1 (en) | 2018-05-07 |
| BR112017025029A2 (pt) | 2018-08-07 |
| CN107614683A (zh) | 2018-01-19 |
| MX2017014911A (es) | 2018-03-23 |
| TWI706959B (zh) | 2020-10-11 |
| ZA201708169B (en) | 2019-06-26 |
| HK1246349A1 (zh) | 2018-09-07 |
| CO2017012397A2 (es) | 2018-02-28 |
| CA2986210C (en) | 2022-04-26 |
| RU2017145071A3 (uk) | 2019-10-17 |
| CN107614683B (zh) | 2020-12-22 |
| CA2986210A1 (en) | 2016-12-01 |
| JPWO2016190263A1 (ja) | 2018-04-12 |
| RU2017145071A (ru) | 2019-06-24 |
| EP3299461A4 (en) | 2018-12-19 |
| MA42138A (fr) | 2018-03-28 |
| AU2016268625A1 (en) | 2017-12-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5376095B2 (ja) | 新規抗ヒトｎｇｆ抗体 | |
| US9127055B2 (en) | Method of treating pain with anti-human NGF antibody | |
| TW200829267A (en) | Method of treating endothelial dysfunction | |
| KR101672114B1 (ko) | 항암제에서 기인하는 말초성 신경 장해성 동통의 예방 및/또는 치료제 | |
| UA123209C2 (uk) | Fab-ФРАГМЕНТ АНТИТІЛА ДО ЛЮДСЬКОГО NGF | |
| JP6135161B2 (ja) | 新規抗ヒトｎｇｆ抗体 | |
| US11497795B2 (en) | Medicament for mitigating conditions and/or suppressing onset of peripheral neuropathy induced by anti-malignant tumor agent |