KR20180006391A

KR20180006391A - 신규 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트

Info

Publication number: KR20180006391A
Application number: KR1020177034038A
Authority: KR
Inventors: 히로츠구 다나카; 히로타다 후지타; 도시아키 아오키
Original assignee: 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2016-05-20
Publication date: 2018-01-17
Also published as: CA2986210A1; UA123209C2; AU2016268625A1; CN107614683A; CO2017012397A2; MA42138A; TWI706959B; IL255832A; US11260124B2; ZA201708169B; HK1246349A1; EP3299461A1; EP3299461B1; AR104721A1; MX2017014911A; RU2017145071A; MY184164A; EP3299461A4; CA2986210C; RU2729825C2

Abstract

높은 중화 활성을 유지하고, 국소에서의 약효를 발현하면서 전신 폭로에 의한 전신성의 부작용을 저감한, 우수한 항 인간 NGF 항체 프래그먼트, 및 해당 항체 프래그먼트를 사용한, 수술 후 동통의 치료 수단의 제공. 서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.

Description

신규 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트

본 발명은 신규 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 당해 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 당해 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 당해 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 당해 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당해 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 포함하는 의약 조성물 및 당해 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 사용하여 수술 후 동통을 치료하는 방법에 관한 것이다.

신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF)는, 신경 영양 인자(neurotrophic factor)라고 총칭되는 액성 인자의 하나이고, 생체 내에서 뉴런의 발생, 분화, 기능 유지에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다. NGF의 수용체로서는, 고친화성의 trkA(tropomyosin receptor kinase(트로포미오신 수용체 키나아제) A)와 저친화성의 p75NTR(p75 neurotrophin receptor(뉴로트로핀 수용체))이 알려져 있다. 이 중 p75NTR은 모든 신경 영양 인자와 결합하여, 뉴런의 발생 과정에 있어서 아포토시스에 관여하고 있는 것이 보고되고 있지만, 그 역할은 아직 충분히 해명되어 있지 않다. 한편, NGF와 trkA의 녹아웃 마우스 사이에는 동일한 페노타입이 확인됨이 알려져 있고(비특허문헌 1), NGF의 생리 작용은 주로 trkA를 통하여 발현한다고 여겨지고 있다.

NGF를 래트에 투여하면 통증이 유발되는 것이 보고되고(비특허문헌 2), 또한 인간에게 NGF를 정맥 내 투여하면 전신성의 근육통을 발생하는 것, 또한 NGF의 국소 투여에 의해 전신성의 통증뿐만 아니라, 투여한 부위에 통각 과민 및 이질통이 유발된다고 보고되어 있다(비특허문헌 3). 동물에 있어서 NGF의 발현량은 래트의 수술 후 동통 모델 등 근육(비특허문헌 4) 및 피부(비특허문헌 5) 조직의 절개 시 등의 조직 장애에 의해 상승하는 것이 알려져 있다. 인간 동통 병태에 있어서는, 변형성 관절증(osteoarthritis; OA)의 관절 연골에서 NGF 및 trkA의 발현이 항진하는 것이나(비특허문헌 6), 제왕 절개 시의 절개부 삼출액 중에서 NGF 레벨이 상승하는 것(비특허문헌 7), 류마티스성 관절염(비특허문헌 8)이나 간질성 방광염(비특허문헌 9)의 환자에서 NGF 레벨이 상승하는 것이 실증되어 있다.

지금까지 여러 가지 동통 동물 모델에 있어서 NGF 시그널을 저해하면 동통이 억제되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10, 특허문헌 1 내지 3).

현재까지 보고되어 있는 인간 NGF에 대한 항체로서는, 완전 인간형 항 인간 NGF 항체인 REGN475(특허문헌 2), 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG(특허문헌 3), 풀라누맙(Fulranumab)(특허문헌 4) 및 MEDI-578(특허문헌 5), 인간화 항 인간 NGF 항체인 타네주맙(Tanezumab)(특허문헌 6) 및 PG110(특허문헌 7)이 보고되어 있다. 그 중에서도 임상에 있어서 타네주맙의 정맥 내 투여에 더하여, 피하 투여로 변형성 관절증에 수반하는 관절통, 만성 요통, 간질성 방광염에 수반하는 방광통 등의 동통에 대하여 폭넓은 진통 효과를 나타내는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 11 내지 13).

의약품에 있어서 부작용은 많은 의약품에서 보고되어 있고, 그것은 항 NGF 항체에 있어서도 예외가 아니다. 항 NGF 항체의 인간으로의 투여에 의해 발현한 유해 사상으로서, 타네주맙의 임상 시험에 있어서는 두통, 상기도 감염증, 감각 이상 등이 보고되고(비특허문헌 11), 풀라누맙의 임상 시험에 있어서는 지각 장애, 두통, 비인두염 등이 보고되고(비특허문헌 14), 나아가 REGN475의 임상 시험에서는 관절통, 지각 과민, 근육통, 말초 부종 및 관절 종창 등이 보고되어 있다(비특허문헌 15).

일반적으로, 의약품이 작용하는 표적 조직 이외의 조직에 폭로되었을 경우, 그들 조직에 있어서는 인체에 있어서 바람직하지 않은 부작용이 발생한다.

일반적으로, 의약품을 표적 조직에 직접 투여하여, 그 부위에서의 조직 농도를 높여, 전신 순환혈을 통한 표적 이외의 조직의 폭로를 저감함으로써, 부작용을 회피하는 국소 투여제가 개발되고 있다.

많은 항체 의약품은 정맥 등의 혈관 내로의 투여에 더하여, 피하 또는 근육 내라고 하는 부위에 투여하는 것도 많이 존재한다. 이들은 피하 또는 근육 내에 투여된 뒤, 림프관을 통해 빠르게 혈중에 이행한다. 많은 항체 의약품은 혈중에 이행한 후에 혈류 순환을 통해 표적 조직에 운반되어서 약리 작용을 발휘한다. 또한, 많은 항체 의약품의 분포는 혈액이 높고, 혈중으로부터 표적 조직으로의 이행성(조직/혈액 농도비)은 낮다. 그로 인해 많은 항체 의약품이 표적 조직의 작용 농도를 유지하기 위해서는, 높은 혈중 농도의 유지가 필요하다(비특허문헌 16). 또한, 많은 항체 의약품은 수일로부터 1개월 정도의 혈중 반감기를 갖고, 장기간의 혈중 농도 지속을 나타냄으로써, 장시간 약리 작용이 유지된다. 따라서, 통상의 항체 의약품을 피하 또는 근육 내라고 하는 국소 부위에 투여했다고 해도, 항체 의약품의 대부분은 혈액 내에 잔존하여 전신 순환함으로써 전신성의 약효 및 부작용이 발현한다.

항체 의약품 등의 바이오 의약품에 있어서 2량체화 등의 다량체화는 안정되고 균질한 품질을 담보함에 있어서 큰 과제가 된다.

Fab'의 2량체화체의 F(ab')₂는 Fab'과는 체내 동태가 상이한 것이 알려져 있다(비특허문헌 17, 18).

Fab'의 2량체화체의 F(ab')₂에 대한 자연 항체는 항체의 소실을 일으키는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 19). 이러한 항원-항체 반응은 약제의 체내 동태에 영향을 미쳐서 소실을 빠르게 하는 것 외에, 아나필락시스 반응 등의 리스크도 발생한다. 이와 같이, F(ab')₂에는 몇 가지의 리스크가 있다.

국제 공개 제2013/183032호 국제 공개 제2009/023540호 국제 공개 제2013/022083호 국제 공개 제2005/019266호 국제 공개 제2006/077441호 국제 공개 제2004/058184호 미국 특허 제8435523호 명세서

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본 발명의 과제는, 높은 중화 활성을 유지하고, 국소에서의 약효를 발현하면서 전신 폭로에 의한 전신성의 부작용을 저감한, 우수한 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 제공하는 데 있다.

본 발명은 의학상 또는 산업상 유용한 물질·방법으로서 이하의 발명을 포함하는 것이다.

즉, 일 형태에 있어서, 본 발명은 아래와 같아도 된다.

(1) 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트:

(a) 서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트; 및

(b) (a)의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.

(2) 서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 상기 (1)에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.

(3) 번역 후 수식이 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화인, 상기 (1)에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.

(4) 서열 번호 5의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 상기 (1)에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.

(5) 상기 (1)에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.

(6) 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는, 발현 벡터:

(a) 상기 (1)에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 및

(b) 상기 (1)에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.

(7) 상기 (6)에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.

(8) 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 (7)에 기재된 숙주 세포:

(a) 상기 (1)에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및

(b) 상기 (1)에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.

(9) 상기 (8)에 기재된 숙주 세포를 배양하여, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 생산하는 방법.

(10) 상기 (9)에 기재된 방법으로 생산할 수 있는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.

(11) 상기 (1) 내지 (4) 및 (10) 중 어느 한 항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.

(12) 수술 후 동통의 치료용 국소 의약 조성물인, 상기 (11)에 기재된 의약 조성물.

(13) 상기 (2)에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트, 상기 (4)에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.

(14) 수술 후 동통의 치료용 국소 의약 조성물인, 상기 (13)에 기재된 의약 조성물.

(15) 수술 후 동통의 치료용 국소 의약 조성물의 제조를 위한, 상기 (1) 내지 (4) 및 (10) 중 어느 한 항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 용도.

(16) 수술 후 동통의 치료를 위한, 상기 (1) 내지 (4) 및 (10) 중 어느 한 항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 국소 투여에 의한 용도.

(17) 수술 후 동통의 치료에 국소 투여로 사용하기 위한, 상기 (1) 내지 (4) 및 (10) 중 어느 한 항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.

(18) 상기 (1) 내지 (4) 및 (10) 중 어느 한 항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 유효량을 대상의 국소에 투여하는 것을 포함하는, 수술 후 동통의 치료 방법.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 인간 NGF가 병태 형성에 관여하는 수술 후 동통의 치료에 유용하다. 이러한 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 그의 중화 활성 및 국소 체류성이 높고 또한 혈중으로부터의 소실이 빠르다고 하는 우수한 체내 동태에 의해, 투여량의 저감 및 약효 지속의 연장을 나타내고, 또한 전신 폭로에 의한 전신성의 부작용이 저감된, 임상 적용에 있어서 약효, 안전성 모두 매우 우수한 개선을 나타내는 것이 기대되는 것이다. 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 인간 NGF가 관여하는 수술 후 동통의 치료에 있어서 크게 공헌하는 것이다.

이하에, 본 발명에 대하여 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 특별히 정의되지 않는 한, 본 발명에 관련하여 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는, 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 한다.

본 발명자들은, 항 인간 NGF 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 제조에 있어서 상당한 창의 검토를 거듭한 결과, 높은 중화 활성을 유지하면서, 국소에서의 약효를 발현하면서 전신 폭로에 의한 전신성의 부작용을 저감한, 우수한 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 제조하는 것에 성공하였다.

항체 분자의 기본 구조는, 각 클래스 공통으로, 분자량 5만 내지 7만의 중쇄와 2만 내지 3만의 경쇄로 구성된다. 중쇄는, 통상 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄로 이루어지고, 클래스마다 특징적인 구조를 갖고, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 γ, μ, α, δ, ε쇄라고 불린다. 또한 IgG에는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 존재하고, 각각 γ1, γ2, γ3, γ4라고 불리고 있다. 경쇄는, 통상 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄로 이루어지고, L형과 K형의 2종이 알려져 있고, 각각 λ, κ쇄라고 불린다. 항체 분자의 기본 구조의 펩티드 구성은, 각각 상동의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가, 디술피드 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 분자량 15만 내지 19만이다. 2종의 경쇄는, 어느 중쇄와도 쌍을 이룰 수 있다. 개개의 항체 분자는, 항상 동일한 경쇄 2개와 동일한 중쇄 2개로 만들어진다.

쇄 내 S-S 결합은, 중쇄에 4개(μ, ε쇄에는 5개), 경쇄에는 2개가 있고, 아미노산 100 내지 110 잔기마다 하나의 루프를 이루고, 이 입체 구조는 각 루프 사이에서 유사하고, 구조 단위 또는 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 N 말단에 위치하는 도메인은, 동종 동물의 동일 클래스(서브 클래스)로부터의 표품이어도, 그의 아미노산 서열이 일정하지 않고, 가변 영역이라고 불리고 있고, 각 도메인은, 각각, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이라고 불리고 있다. 가변 영역으로부터의 C 말단측의 아미노산 서열은, 각 클래스 또는 서브 클래스마다 거의 일정하여 정상 영역이라고 불리고 있고, 각 도메인은, 각각 CH1, CH2, CH3 또는 CL로 표시된다.

항체의 항원 결정 부위는 VH 및 VL에 의해 구성되고, 결합의 특이성은 이 부위의 아미노산 서열에 의한다. 한편, 보체나 각종 세포와의 결합과 같은 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 정상 영역의 구조 차를 반영하고 있다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역의 가변성은, 어느 쇄에도 존재하는 3개의 작은 초가변 영역에 대부분 한정되는 것이 알려져 있고, 이들 영역을 상보성 결정 영역(CDR; 각각 N 말단측에서부터 CDR1, CDR2, CDR3)이라고 칭하고 있다. 가변 영역의 나머지 부분은 프레임 워크 영역(FR)이라고 불리고, 비교적 일정하다.

항체의 중쇄 정상 영역의 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이에 있는 영역은 힌지 영역이라고 불리고, 이 영역은, 프롤린 잔기를 많이 포함하고, 2개의 중쇄를 연결하는 복수의 쇄 사이 S-S 결합을 포함한다. 예를 들어, 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 각 힌지 영역에는, 중쇄 사이의 S-S 결합을 구성하고 있는, 각각 2개, 4개, 11개, 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 힌지 영역은, 파파인이나 펩신 등의 단백질 분해효소에 대한 감수성이 높은 영역이다. 항체를 파파인으로 소화했을 경우, 힌지 영역의 중쇄 사이 S-S 결합보다도 N 말단측의 위치에서 중쇄가 절단되어, 2개의 Fab 프래그먼트와 1개의 Fc 프래그먼트로 분해된다. Fab 프래그먼트는 경쇄와, 중쇄 가변 영역(VH), CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성된다. 항체를 펩신으로 소화했을 경우, 힌지 영역의 중쇄 사이 S-S 결합보다도 C 말단측의 위치에서 중쇄가 절단되어, F(ab')₂ 프래그먼트가 생성된다. F(ab')₂ 프래그먼트는, 2개의 Fab' 프래그먼트가 힌지 영역 중의 중쇄 사이 S-S 결합으로 결합한 2량체 구조의 프래그먼트이다. Fab' 프래그먼트는 경쇄와, 중쇄 가변 영역(VH), CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성되고, 이 힌지 영역의 부분에는 중쇄 사이 S-S 결합을 구성하고 있었던 시스테인 잔기가 포함된다. Fab 프래그먼트, F(ab')₂ 프래그먼트, Fab' 프래그먼트는 모두 가변 영역을 포함하고, 항원 결합 활성을 갖는다.

본 발명자들이 제조에 성공한 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 이하의 특징을 갖는 Fab 프래그먼트이다:

서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.

구체적으로는, 본 발명자들은, 완전 인간형 항 인간 NGF 항체 1-15(N52D-A)-Fab' 프래그먼트(특허문헌 3; 동 문헌 중에서 1-15(N52D-A)-Fab'라고도 칭함)를 개변하고, 각종 생물학적 활성 시험 및 물성 시험을 사용한 항체의 스크리닝에 의해, 안정되고 또한 높은 중화 활성 및 국소 체류성을 유지하는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트로서, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 동정하는 것에 성공하였다.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 본원 명세서에 개시되는 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 그의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 적당한 발현 벡터에 연결한다. 계속해서, 당해 발현 벡터를 배양 세포 중에 도입한다. 마지막으로 이 배양 세포를 배양하여 배양 상청으로부터 모노클로날 Fab 프래그먼트를 얻을 수 있다.

본 발명의 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 당해 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 아미노산 서열에 기초하여 디자인된 염기 서열에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이러한 유전자 합성 방법으로서는, 국제 공개 제90/07861호에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다.

하나의 실시 형태에 있어서, 서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 4에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

본 발명의 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 제조에 계속되는, 당해 폴리뉴클레오티드의 발현 벡터로의 도입, 발현 벡터의 배양 세포로의 도입, 배양 세포의 배양, Fab 프래그먼트의 정제 등에 대해서는, 당해 분야에서 공지된 다양한 방법을 사용하여 행할 수 있다.

사용되는 발현 벡터로서는, 예를 들어 GS 벡터 pEE6.4나 pEE12.4(Lonza사)를 들 수 있지만, 본 발명의 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하고, 이들에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 산생할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

상기의 발현 벡터는, 예를 들어 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등에 의해, 배양 세포 중에 도입된다.

발현 벡터를 도입하는 배양 세포로서는, 예를 들어 CHO-K1SV 세포, CHO-DG44 세포, 293 세포 등의 배양 세포를 사용할 수 있고, 이것을 통상의 방법에 의해 배양하면 된다.

상기 배양 후, 배양 상청 중에 축적된 Fab 프래그먼트는, 각종 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있고, 예를 들어 KappaSelect 등에 의한 칼럼 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 예로서는, 후기 실시예에 기재되는 h1f.6 항체를 들 수 있다.

항체를 세포에서 발현시키는 경우, 항체가 번역 후에 수식을 받는 것이 알려져 있다. 번역 후 수식의 예로서는, 중쇄 C 말단의 리신의 카르복시펩티다아제에 의한 절단, 중쇄 및 경쇄 N 말단의 글루타민 또는 글루탐산의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식, 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 당화 등을 들 수 있고, 여러 가지 항체에 있어서, 이러한 번역 후 수식이 발생하는 것이 알려져 있다(J. Pharm. Sci., 2008, Vol.97, p.2426-2447).

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트에는, 번역 후 수식에 의해 발생한 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트도 포함될 수 있다. 번역 후 수식에 의해 발생할 수 있는 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 예로서는, 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화한 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 들 수 있다. 이러한 N 말단의 피로글루타밀화에 의한 번역 후 수식은, 항체의 활성에 영향을 미치는 것이 아님은 당해 분야에서 알려져 있다(Anal. Biochem., 2006, Vol.348, p.24-39).

예를 들어, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트에는, 이하의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트도 포함된다:

서열 번호 5의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄가 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 인간 NGF에 결합한다. 얻어진 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 인간 NGF에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, ELISA나 FACS 등의 방법이 있다. 예를 들어, ELISA를 사용하는 경우, 인간 NGF를 ELISA 플레이트에 고정화하고, 이에 대하여 Fab 프래그먼트를 첨가하여 반응시킨 후, 비오틴 등으로 표식한 항 Kappa 항체 등의 2차 항체 및 알칼리 포스파타아제 표지 스트렙트아비딘을 반응시킨 후, 그 활성을 검출하는 시약(예를 들어, 알칼리 포스파타아제 표식의 경우, 화학 발광 알칼리 포스파타아제 기질) 등을 사용한 활성 측정에 의해, 2차 항체의 결합을 동정한다. 또한, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 인간 NGF에 첨가하여, 다른 동물 유래의 NGF(예를 들어, 마우스 NGF)에도 결합할 수 있고, 이들 단백질에 대한 결합 활성을 측정해도 된다.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 인간 NGF에 대한 중화 활성을 갖고 있다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 「중화 활성」이란, 인간 NGF에 대한 결합에 의해 인간 NGF를 통하여 초래되는 임의의 생물 활성을 저해하는 활성을 의미하고, 인간 NGF의 하나 또는 복수의 생물활성을 지표로 평가할 수 있다. 이러한 중화 활성으로서는, 예를 들어 인간 NGF와 그의 수용체인 인간 trkA와의 결합 저해 활성을 들 수 있고, 후기 실시예에 기재되는 것과 같은 방법을 사용함으로써 평가할 수 있다.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 효과를 보다 상세하게 평가하기 위해서, in vivo(생체내)에서의 시험을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 후기 실시예에 기재한 바와 같이, 래트 발바닥 절개 수술 후 통증 모델을 사용하는 진통 효과 시험 등을 사용하여, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 in vivo에서의 약효를 평가할 수 있다. 또한, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 래트의 대퇴근에 국소 투여한 후에 그의 조직 호모지네이트를 사용한 NGF와의 결합 활성 평가 시험이나, NGF와 그의 수용체인 trkA와의 결합 저해 활성 평가 시험을 행함으로써 조직 중의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 약리 활성을 확인할 수도 있다. 또한, 혈장 중 및 조직 중의 약물 농도 평가 시험을 행함으로써 Fab 프래그먼트의 국소 폭로량의 유지 및 전신 혈중 폭로량의 저감을 평가할 수도 있다.

기타, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 각종 안정성(예를 들어, 열 안정성, 장기 보존 안정성, 고농도 안정성)을 평가하는 방법으로서는, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피에 의한 보존 중의 응집체 형성의 측정을 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 필요에 따라 정제된 후, 통상법에 따라서 제제화되어, 수술 후 동통의 치료에 사용할 수 있다.

「수술 후 동통」이란, 절창, 천자, 절개, 열상, 또는 개체의 조직 내의 창상 등의 외부의 외상에 기인하거나 또는 그것으로부터 발생하는 동통을 말한다(침습성 또는 비침습성에 관계없이, 모든 외과적 처치에 기인하는 것이 포함된다). 본 명세서 중에서 사용하는 수술 후 동통에는, 외부로부터의 물리적인 외상을 수반하지 않고 일어나는(외상에 기인하지 않거나, 또는 외상에 의해 파생된 것이 아닌) 동통은 포함되지 않는다. 수술 후 동통은 내부 또는 외부(말초가 포함됨)의 동통이고, 창상, 절창, 외상, 열상 또는 절개는 우발적(외상 창상의 경우) 또는 의도적 (수술 시의 절개의 경우)으로 일어날 수 있다. 동통은 동통 스코어 및 당 분야에서 주지의 다른 방법을 사용하여 객관적 및 주관적으로 평가할 수 있다. 본 명세서 중에서 사용하는 수술 후 동통에는 이질통(즉, 통상적으로는 비침해인 자극에 대한 응답의 증가) 및 통각 이상 과민(즉, 통상적으로는 침해성 또는 불쾌한 자극에 대한 응답의 증가)이 포함되고, 이들은 열적 또는 기계적 성질인 경우가 있다. 동통은 열 감수성, 기계적 자극에 대한 감수성 및/또는 안정 시 동통에 의해 특징지어진다. 수술 후 동통에는, 기계적 자극에 대하여 유도된 동통 및 안정 시 동통이 포함된다.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 수술 후 동통의 치료제로서 사용할 수 있다. 이 치료제의 제형의 예로서는 주사제, 점적용제, 데포제 등의 비경구제를 들 수 있고, 표적 조직 국소로의 근육 내 주사, 피하 주사 등에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 제제화에 있어서는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 담체나 첨가제를 사용할 수 있다.

상기 제제화에 있어서의 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 첨가량은, 환자의 증상 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 또는 항체의 결합 역가 등에 따라 상이하지만, 예를 들어 0.001mg/kg 내지 100mg/kg 정도를 사용하면 된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 포함하는 의약 조성물에도 관한 것이다. 본 발명의 의약 조성물은, 약학적으로 허용되는 담체나 첨가제를 포함하고 있어도 된다. 약학적으로 허용되는 담체나 첨가제의 종류는 특별히 한정되지 않고 당업자에게 주지의 담체나 첨가제를 사용할 수 있다. 본 발명은 수술 후 동통의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트 및 수술 후 동통의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 용도에도 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 유효량을 대상의 국소에 투여하는 것을 포함하는, 수술 후 동통의 치료 방법에도 관한 것이다. 또한, 「대상」이란, 그 치료를 필요로 하는 인간 또는 기타의 포유 동물이며, 어떤 형태로서는, 그 치료를 필요로 하는 인간이다. 본 발명의 치료 방법에 있어서의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 유효량은, 상기 제제화에 있어서 Fab 프래그먼트의 첨가량과 동일한 양이면 된다. 또한, 본 발명의 국소 의약 조성물은, 치료가 요망되는 부위, 또는 그 영역에 인접한 부위, 특히 외과 수술 시의 절개 조직 등의 표적 조직, 또는 그 근방에 투여, 사용되는 의약 조성물을 의미한다. 예를 들어, 상기에 기재한 대로, 표적 조직 국소로의 근육 내 주사, 피하 주사 등에 의해 투여할 수 있다. 또한, 표적 조직 국소에 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트가 일정 시간, 바람직하게는 72시간, 더욱 바람직하게는 24시간 체류하는 것을 포함한다.

본 발명의 의약 조성물에는, 복수종의 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 번역 후 수식을 받지 않고 있는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트 및 번역 후 수식에 의해 발생한 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.

하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에는, 이하의 (a) 및 (b)의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물도 포함된다.

(b) 서열 번호 5의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.

본 발명은 또한, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(이하, 통합하여 「본 발명의 폴리뉴클레오티드」라고도 칭함), 및 그들 중 어느 하나 또는 양쪽을 포함하는 발현 벡터(이하, 「본 발명의 발현 벡터」라고도 칭함)에 관한 것이다.

본 발명의 발현 벡터는, 원핵 세포 및/또는 진핵 세포의 각종 숙주 세포 중에서 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하고, 이들에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 산생할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 사용되는 발현 벡터로서는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있고, 예를 들어 GS 벡터 pEE6.4나 pEE12.4(Lonza사)를 사용할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터이다. 별도의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터이다.

본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 기능 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 세균 중에서 본 발명의 Fab 프래그먼트 또는 그의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 숙주가 에세리키아속균의 경우, 예를 들어 Trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 효모 중에서의 발현용 프로모터로서는, 예를 들어 PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터를 들 수 있고, 바실루스속균에서의 발현용 프로모터로서는 SL01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 숙주가 포유동물 세포 등의 진핵 세포일 경우, SV40 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 히트 쇼크 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주 세포로서 세균, 특히 대장균을 사용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈, 종지 코돈, 터미네이터 영역 및 복제 가능 단위를 추가로 포함할 수 있다. 한편, 숙주로서 효모, 동물 세포 또는 곤충 세포를 사용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는 개시 코돈, 종지 코돈을 포함할 수 있다. 또한, 이 경우, 인핸서 서열, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 분비 시그널 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐화 부위, 또는 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 된다. 또한, 목적에 따라 통상 사용되는 선택 마커(예를 들어, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 디히드로엽산 환원효소 유전자)를 포함하고 있어도 된다.

본 발명은 또한, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 형질 전환체의 제조에 사용되는 숙주 세포로서는, 상기한 발현 벡터에 적합하고, 형질 전환될 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 수립된 세포 등 다양한 세포(예를 들어, 세균(에세리키아속균, 바실루스속균), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등), 동물 세포(CHO-K1SV 세포, CHO-DG44 세포, 293 세포 등) 또는 곤충 세포(예를 들어, Sf9) 등)가 예시된다. 형질 전환 자체는, 공지된 방법에 의해 행해질 수 있다.

본 발명의 숙주 세포로서는, 이하의 (a) 및 (b)를 들 수 있다:

(a) 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와, 해당 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및

(b) 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 해당 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.

본 발명은 또한, 본 발명의 숙주 세포를 배양하여, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 해당 방법에서 사용되는 숙주 세포로서는, 상기 본 발명의 숙주 세포 (a) 및 (b)를 들 수 있다.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 생산에 있어서, 형질 전환된 숙주 세포는, 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 영양 배지는, 숙주 세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원 또는 유기 질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예를 들어 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등이, 무기 질소원 또는 유기 질소원으로서는, 예를 들어 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 옥수수 침지액, 펩톤, 카제인, 고기 엑기스, 콩깻묵, 감자 추출액 등이 예시된다. 또한 원한다면 다른 영양소(예를 들어, 무기염(예를 들어, 염화칼슘, 인산2수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류 등), 항생 물질(예를 들어, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등)을 포함하고 있어도 된다.

숙주 세포의 배양 자체는, 공지된 방법에 의해 행해진다. 배양 조건, 예를 들어 온도, 배지의 pH 및 배양 시간은 적절히 선택된다. 예를 들어, 숙주가 동물 세포의 경우, 배지로서는 약 5 내지 20％의 태아소혈청을 포함하는 MEM 배지(Science, 1955, Vol.122, p.501-504), DMEM 배지(Virology, 1959, Vol.8, p.396-397), RPMI1640 배지(J.Am.Med.Assoc., 1967, Vol.199, p.519-524), 199 배지(Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1950, Vol.73, p.1-8) 등을 사용할 수 있다. 배지의 pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하고, 배양은 통상 약 30 내지 40℃에서 약 15 내지 72시간 행해지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다. 숙주가 곤충 세포인 경우, 예를 들어 태아소혈청을 포함하는 그레이스(Grace's) 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, Vol.82, p.8404-8408) 등을 들 수 있고, 그의 pH는 약 5 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 내지 40℃에서 15 내지 100시간 행해지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다. 숙주가 세균, 방선균, 효모, 사상균인 경우, 예를 들어 상기 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 바람직하게는, pH가 5 내지 8인 배지이다. 숙주가 E.coli인 경우, 바람직한 배지로서 LB 배지, M9 배지(Mol. Col., Cold Spring Harbor Laboratory, Vol.3, A 2.2) 등이 예시된다. 이러한 경우, 배양은 필요에 따라 통기, 교반하면서, 통상 14 내지 43℃, 약 3 내지 24시간 행할 수 있다. 숙주가 바실루스(Bacillus)속균인 경우, 필요에 따라 통기, 교반을 하면서, 통상 30 내지 40℃, 약 16 내지 96시간 행할 수 있다. 숙주가 효모인 경우, 배지로서, 예를 들어 버크홀더(Burkholder) 최소 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, Vol.77, p.4504-4508)를 들 수 있고, pH는 5 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 내지 35℃에서 약 14 내지 144시간 행해지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 생산하는 방법은, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정에 더하여, 나아가, 해당 숙주 세포로부터 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 회수, 바람직하게는 단리, 정제할 수 있다. 단리 또는 정제 방법으로서는, 예를 들어 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 겔 여과, 도데실황산나트륨(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 등 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피나 히드록실 아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 친화성 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트에는, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 생산하는 방법으로 생산할 수 있는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트도 포함된다.

본 발명에 대하여 전반적으로 기재했지만, 더욱 이해를 얻기 위하여 참조하는 특정한 실시예를 여기에 제공한다. 그러나, 이들은 예시 목적으로 하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예

시판하고 있는 키트 또는 시약 등을 사용한 부분에 대해서는, 특별히 언급하지 않는 한 첨부의 프로토콜에 따라서 실험을 행하였다.

(실시예 1: 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 제조)

1-15(N52D)-Fab' 프래그먼트(특허문헌 3)의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 주형으로 하여, VH로부터 힌지 영역의 유전자 단편 3종(서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3)을 각각 증폭할 수 있도록 설계한 프라이머를 사용하고, 푸션(Phusion) 고성능 DNA 폴리머라제(High-Fidelity DNA Polymerase)(Finnzymes사, F-530L)를 사용하여 당해 3종의 유전자 단편을 증폭하였다. 증폭한 영역의 5'측에는 HindIII가, 3'측에는 EcoRI가 포함되어 있다. 이와 같이 하여 얻은 중쇄 유전자 단편을 HindIII와 EcoRI(모두 NEB사)에서 소화하고, 발현 벡터인 pEE6.4에 삽입하였다.

이들 발현 플라스미드를 통상의 방법에 의해 대장균에 도입하여 형질 전환 클론을 얻고, 그것으로부터 위저드 플러스 SV 미니프렙스 DNA 퓨리피케이션 시스템(Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System)(Promega사, A1460)을 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 한편, 경쇄 유전자는, 1-15(N52D-A)-Fab' 프래그먼트의 경쇄 유전자와 같은 염기 서열(서열 번호 4)이고, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 8이다. 이 경쇄 유전자 단편을 포함하는 pEE12.4를 사용하였다.

항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 유전자 단편이 삽입된 GS 벡터(pEE6.4) 및 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄 유전자 단편이 삽입된 GS 벡터(pEE12.4)를 제한효소인 NotI와 PvuI(모두 NEB사)를 사용하여 각각 절단하였다. 그 후, DNA 라이게이션 믹스(Ligation Mix)(다카라 바이오사, 6023)를 사용하여 라이게이션을 행하여, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 및 경쇄의 양쪽 유전자 단편이 삽입된 GS 벡터를 구축하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 시퀀스 반응을 행하여, 클로닝되어 있는 중쇄를 VH로부터 힌지 영역까지, 경쇄를 VL로부터 CL 영역까지의 염기 서열을 확인하였다. 3종류의 중쇄의 당해 VH로부터 힌지 영역의 염기 서열을 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3에 나타내었다. 또한, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 각각 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7에 나타내었다. 3종류의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는 서열 번호 1의 중쇄와 서열 번호 4의 경쇄, 서열 번호 2의 중쇄와 서열 번호 4의 경쇄 및 서열 번호 3의 중쇄와 서열 번호 4의 경쇄를 조합하여 제조하고, 각각을 h1f.6 항체, h1f.7 항체, h1f.8 항체로 하였다.

당해 GS 벡터를 사용하여, 일과성 발현 및 항상적 발현의 2종류의 방법으로 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 발현시켰다. 일과성 발현에 대해서는, CD-CHO 배지(medium)(Invitrogen사)에서 배양된 CHO-K1SV 세포(Lonza사)에 대하여, 당해 GS 벡터를 MaxCyte 일렉트로포레이션 장치(MaxCyte사)에 의해 형질 전환하고, 7일간 배양하였다. 그 배양 상청으로부터 KappaSelect(GE 헬스케어사, 17-5458-02)를 사용하여, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 정제하였다. 항상적 발현에 대해서는, 일렉트로포레이션법을 사용하여 제한효소인 PvuI로 절단한 당해 GS 벡터를 CHO-K1SV 세포에 형질 전환함으로써 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 발현시켰다. 그 배양 상청으로부터 KappaSelect를 사용하여, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 정제하고, 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인하였다. 또한, 정제한 h1f.6 항체의 번역 후 수식을 확인하기 위하여 질량 분석을 한 결과, 그의 대부분에 있어서 N 말단의 피로글루타밀화라고 생각되는 피크가 발생했다.

(실시예 2: 각 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 인간 NGF 기능 저해 활성 평가)

제조한 각 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 인간 NGF 기능 저해 활성 평가를 행하기 위해서, 인간 NGF와 그의 수용체 trkA의 결합 저해를 지표로 한 인간 NGF-trkA 길항 ELISA를 행하였다. 인간 trkA(R&D Systems사, 175-TK-050)를 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 2000ng/mL가 되도록 희석하고, 눈크 맥시소프 백색 96 플레이트(Nunc사, 436110)에 1웰당 50μL 첨가하고, 4℃에서 밤새 플레이트를 인큐베이트함으로써 고상화하였다. 역원심에 의해 인간 trkA 고상 액을 제거하고, TBS 중 블록커 카제인(Blocker Casein in TBS)(Thermo사, 37532)를 1웰당 200μL 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, 역원심에 의해 Blocker Casein in TBS를 제거하였다. 0.1％ 소 혈청 유래 알부민(BSA) 함유 PBS를 사용하여 약 200000ng/mL로부터 약 2ng/mL 사이에서 7 내지 11단계로 희석한 정제 항체 샘플을, 각각 700ng/mL의 비오틴화 인간 NGF와 등량씩 혼합하고, 실온에서 30분간 인큐베이트한 샘플을 1웰당 100μL 첨가하였다. 또한, 여기서 사용한 비오틴화 인간 NGF는, 인간 NGF(R&D Systems사, 256-GF-100/CF)를 EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo사, 21329)을 사용하여 비오틴화한 것을 사용하였다. 인간 NGF의 비오틴화는, 250μL의 0.4mg/mL 인간 NGF 용액에 대하여 1.25μL의 5mM NHS-PEG4-Biotin 용액을 첨가하고, 빙상, 차광 조건에서 2시간 반응시킨 후, 매뉴얼에 따라서 Amicon Ultra-0.5mL 3K(Millipore사, UFC500324)를 2회 사용하여, 반응액을 PBS 용액으로서 회수함으로써 행하였다. 컨트롤로서 0.1％ BSA 함유 PBS를 준비하였다. 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, 플레이트를 세정액(0.05％ Tween-20 함유 트리스 완충 생리 식염수(TBS))으로 3회 세정하고, PBS로 20배로 희석한 블로킹 원(나카라이테스크사, 03953-95) 용액으로 1000배로 희석한 알칼리 포스파타아제 표지 스트렙트아비딘(Thermo사, 21324)을 1웰당 100μL 첨가하였다. 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 0.1mM 염화마그네슘 함유 2mM 트리스(pH9.8) 완충액으로 5배 희석한 알칼리 포스파타아제 기질(Chemiluminescent AP Microwell/Membrane Substrate, Super Sensitive, 450nm; SurModics사, APU4-0100-01)을 1웰당 100μL 첨가하였다. 실온에서 30분간 인큐베이트하고, 그 시그널 값을 EnVision 카운터(퍼킨 엘마사)로 측정하였다.

1-15(N52D-A)-Fab' 프래그먼트, h1f.6 항체, h1f.7 항체, h1f.8 항체의 시험을 2시행 실시하였다. 각 항체의 인간 NGF-trkA 결합 저해율을 산출하는 데 있어서, 0.1％ BSA 함유 PBS의 측정값을 0％로 하고, 각 항체에 있어서의 최대 농도의 측정값을 100％로 설정하였다. 산출된 인간 NGF-trkA 결합 저해율을 해석하고, 3 파라미터 로지스틱 또는 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 항체의 IC₅₀값을 산출하였다. 2시행의 IC₅₀값을 기하 평균한 결과, 1-15(N52D-A)-Fab' 프래그먼트, h1f.6 항체, h1f.7 항체, h1f.8 항체의 인간 NGF-trkA 결합 저해 IC₅₀값은 각각 0.30μg/mL, 0.32μg/mL, 0.30μg/mL, 0.28μg/mL이고, 이들의 인간 NGF-trkA 결합 저해능은 거의 동등하였다.

(실시예 3: 각 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 50℃, 14일간 보존에 의한 2량체 형성 평가)

1-15(N52D-A)-Fab' 프래그먼트, h1f.6 항체, h1f.7 항체, h1f.8 항체의 각 용액을 pH5, 6, 7의 완충액(pH5, 6은 20mM 시트르산·120mM NaCl, pH7은 PBS)으로 치환하고, 10mg/mL로 조정하여 50℃, 14일간 보존하고, 안정성을 평가하였다.

50℃, 14일간 보존하는 전후의 샘플 중의 2량체의 형성은 LC1100(애질런트 테크놀로지사)을 사용하고, 칼럼으로서 TSK gel Super Sw3000(TOSOH사, 2mmID×300mm) 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 평가하였다. 이동상으로서 0.1M 인산수소이나트륨, 0.2M L(+) 아르기닌산염에 염산을 첨가하여 pH6.8로 조정한 용액을 사용하고, 유속을 0.075mL/분, 온도 25℃에서 사용하고, 검출 파장 280nm, 레퍼런스 파장 360nm로 측정하였다. 측정은 각 2회 실시하여 2량체 형성률을 산술 평균하고, 보존 후의 2량체 형성률에서 보존 전의 2량체 형성률을 뺌으로써 2량체 증가율을 산출하였다. 결과, 1-15(N52D-A)-Fab' 프래그먼트의 2량체 증가율은 pH5, 6, 7의 조건 하에서 각각 5.4％, 17.0％, 18.2％이고, 어느 pH에 있어서도 현저한 2량체의 형성이 확인되었다. 한편으로 h1f.6 항체의 2량체 증가율은 pH5, 6, 7의 조건 하에서 각각 0.1％, 0.3％, 0.5％, h1f.7 항체의 2량체 증가율은 pH5, 6, 7의 조건 하에서 각각 0.1％, 0.3％, 0.4％, h1f.8 항체의 2량체 증가율은 pH5, 6, 7의 조건 하에서 각각 0.1％, 0.5％, 0.7％였다. h1f.6 항체, h1f.7 항체, h1f.8 항체는 1-15(N52D-A)-Fab' 프래그먼트에 비하여 2량체의 증가율이 현저하게 낮고, 안정되는 것으로 나타났다.

(실시예 4: 각 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 50℃, 14일간 보존에 의한 인간 NGF 기능 저해 활성 안정성 평가)

pH6에 있어서 50℃, 14일간 보존한 1-15(N52D-A)-Fab' 프래그먼트, h1f.6 항체, h1f.7 항체 및 h1f.8 항체의 보존 후의 인간 NGF-trkA 결합 저해 활성의 변화를 실시예 2에 기재된 인간 NGF-trkA 길항 ELISA를 사용하여 평가하였다. 2시행의 IC₅₀값을 기하 평균한 결과, 1-15(N52D-A)-Fab' 프래그먼트, h1f.6 항체, h1f.7 항체, h1f.8 항체의 50℃, 14일간 보존 후의 인간 NGF-trkA 결합 저해 IC₅₀값은 각각 0.47μg/mL, 0.38μg/mL, 0.56μg/mL, 0.47μg/mL였다. 각 항체의 50℃, 14일간 보존 후의 보존 전에 대한 IC₅₀ 증가율은 각각 59％, 21％, 87％, 68％였다.

이상에서, h1f.6 항체, h1f.7 항체, h1f.8 항체가 50℃, 14일간의 보존에 있어서 1-15(N52D-A)-Fab' 프래그먼트에서 일어나는 2량체 증가를 현저하게 감소시켰다. h1f.6 항체는 보존 중의 활성 감약도 적고, 높은 안정성을 갖는 항 NGF 항체 Fab 프래그먼트임을 발견하였다.

(실시예 5: ELISA에 의한 항 인간 NGF 항체의 인간 NGF 결합 평가)

h1f.6 항체의 항원 결합 활성을 측정하기 위해서, ELISA를 사용하였다. 여기에서는 인간 NGF에 대한 결합능을 평가하기 위해서, 인간 NGF를 고상화한 플레이트를 사용하여 시험하였다. 이때, 비교 대조로서 선행 항체 타네주맙을 사용하였다.

인간 NGF(R&D Systems사, 256-GF-100/CF)를 PBS로 1000ng/mL가 되도록 희석하고, 눈크 맥시소프 백색 96 플레이트(Nunc사, 436110)에 1웰당 100μL 첨가하고, 4℃에서 밤새 플레이트를 인큐베이트함으로써 고상화하였다. 역원심에 의해 인간 NGF 고상 액을 제거하고, Blocker Casein in TBS(Thermo사, 37532)를 1웰당 200μL 첨가하고, 실온에서 30분간 플레이트를 인큐베이트하였다. 그 후 역원심에 의해 Blocker Casein in TBS를 제거하고, 0.1％ BSA 함유 PBS를 사용하여, 정제 항체 샘플을 1000ng/mL로부터 0.01ng/mL까지 11단계로 희석하고, 1웰당 100μL 첨가하여, 실온에서 30분간 플레이트를 인큐베이트하였다. 컨트롤로서 0.1％ BSA 함유 PBS를 준비하였다. 플레이트를 세정액(0.05％ Tween-20 함유 TBS)으로 3회 세정하고, PBS로 20배로 희석한 블로킹 원(나카라이테스크사, 03953-95) 용액으로 1000배로 희석한 비오틴화 항인간 Kappa 경쇄 항체(IBL사, 17249)를 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 30분 인큐베이트하였다. 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, PBS로 20배로 희석한 블로킹 원 용액으로 1000배로 희석한 알칼리 포스파타아제 표지 스트렙트아비딘(Thermo사, 21324)을 1웰당 100μL 첨가하고, 플레이트를 실온에서 0.5시간 인큐베이트하였다. 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 0.1mM 염화마그네슘 함유 2mM 트리스(pH9.8) 완충액으로 5배 희석한 알칼리 포스파타아제 기질(Chemiluminescent AP Microwell/Membrane Substrate, Super Sensitive, 450nm; SurModics사, APU4-0100-01)을 1웰당 100μL 첨가하였다. 실온에서 30분간 인큐베이트하고, 그 시그널 값을 EnVision 카운터(퍼킨 엘마사)로 측정하였다.

각 항체의 시험을 듀플리케이트로 행하고, 산술 평균을 산출하였다. 각 항체의 인간 NGF 결합률을 산출하는 데 있어서, 0.1％ BSA 함유PBS의 측정값을 0％로 하고, 각 항체에 있어서의 최대 농도의 측정값을 100％로 설정하였다. 산출된 인간 NGF 결합률을 해석하고, 3 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 항체의 EC₅₀값을 산출하였다. h1f.6 항체에 대해서는 2시행의 EC₅₀값을 기하 평균한 결과, h1f.6 항체의 EC₅₀값은 73.0ng/mL였던 것에 대해, 타네주맙의 EC₅₀값은 146ng/mL였다.

(실시예 6: 항 인간 NGF 항체의 인간 NGF 기능 저해 활성 평가)

h1f.6 항체의 인간 NGF 기능 저해 활성을 측정하기 위해서, 실시예 2에서 사용한 NGF-trkA 결합 저해를 평가하는 길항 ELISA를 사용하였다. 이때, 비교 대조로서 선행 항체 타네주맙을 사용하였다.

h1f.6 항체는 4시행, 타네주맙은 3시행 실시하고, 산출한 IC₅₀값의 기하 평균을 산출하였다. 결과, h1f.6 항체의 인간 NGF-trkA 결합 저해 IC₅₀값은 0.31μg/mL였던 것에 대해, 타네주맙의 인간 NGF-trkA 결합 저해 IC₅₀값은 0.86μg/mL였다.

(실시예 7: 조직 중의 항체의 국소 체류성, 인간 NGF 결합 활성 및 인간 NGF 기능 저해 활성의 평가)

h1f.6 항체를 국소 투여한 후, 항체의 국소 체류를 평가하기 위해서, 투여 조직에 있어서의 항체 농도를 평가하였다. 정상 래트에 각 n=4로 h1f.6 항체를 0.3 및 3mg/kg으로 대퇴근 내에 국소 투여하고, 투여 6시간 후의 대퇴근 중의 항체 농도를 전기화학발광(Electrochemiluminescence; ECL) 분석에 의해 측정하였다. 국소 투여는 항체를 PBS를 용매로 하여 0.2mL/kg의 투여 용량으로 대퇴근 내에 주사함으로써 행하였다.

채취한 대퇴근 조직은 2.5배량의 조직 호모지네이트액(10mM 트리스, 137mM NaCl, cOmplete, Mini(Roche사), pH8.0)을 첨가하고, 대퇴근 호모지네이트를 제조하였다. ECL 분석에서의 측정에는 벨록이뮨(VelocImmune) 마우스에 인간 NGF를 면역하여 얻어진 1-15 항체(특허문헌 3)를 마우스에 면역하여 취득한 2종류의 항 1-15 항체인 ANA-IBL-13A와 비오틴화 ANA-IBL-52A를 사용하였다. 또한, 여기서 사용한 비오틴화 ANA-IBL-52A는, ANA-IBL-52A를 비오틴 표지 키트(Biotin Labeling Kit)-NH2(도진 가가꾸, LK03)를 사용하여, 테크니컬 매뉴얼에 따라 비오틴화한 것을 사용하였다.

ECL 분석의 방법을 이하에 나타내었다. 항 1-15 항체인 ANA-IBL-13A를 TBS로 1000ng/mL가 되도록 희석하고, 멀티-어레이 96웰 플레이트(Multi-array 96-well Plate)(Meso Scale Discovery사, L15XA-6)에 1웰당 25μL 첨가하였다. 실온에서 1시간 플레이트를 인큐베이트함으로써, ANA-IBL-13A를 고상화하였다. 역원심에 의해 ANA-IBL-13A 고상 액을 제거하고, 플레이트를 세정액(0.05％ Tween-20 함유 TBS)으로 3회 세정하고, Blocker Casein in TBS(Thermo사, 37532)을 1웰당 150μL 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 역원심에 의해 Blocker Casein in TBS를 제거하여, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 대퇴근 호모지네이트는 희석액(0.05％ Tween-20 함유 Blocker Casein in TBS)으로 100배로 희석하고, 더 희석이 필요한 샘플에 대해서는, 항체 미투여의 대퇴근 호모지네이트를 1％ 포함하는 희석액을 사용하여 검량선의 범위 내가 되도록 희석하고, 1웰당 25μL 첨가하였다. 대퇴근 호모지네이트의 검량선 작성용으로, 희석액을 사용하여 10000ng/mL 내지 0.51ng/mL까지 10단계로 희석한 h1f.6 항체를, 항체 미투여의 대퇴근 호모지네이트 1％를 포함하는 희석액을 사용하여 100배 희석한 샘플을 준비하였다. 컨트롤로서, 항체 미투여의 대퇴근 호모지네이트 1％를 포함하는 희석액을 준비하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 역원심에 의해 용액을 제거하여, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 희석액을 사용하여 300ng/mL가 되도록 희석한 비오틴화 ANA-IBL-52A를 1웰당 25μL 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 역원심에 의해 용액을 제거하여, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 희석액을 사용하여 1000ng/mL로 희석한 MSD SULFO-TAG 표지된 스트렙트아비딘(MSD SULFO-TAG labeled Streptavidin)(Meso Scale Discovery사, R32AD-1)을 25μL 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 역원심에 의해 용액을 제거하고, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하였다. 초순수(MilliQ(등록 상표), 머크사)로 2배로 희석한, 계면활성제를 갖는 MSD 판독 버퍼 T(4x)(MSD Read Buffer T(4x) with Surfactant)(Meso Scale Discovery사, R92TC-2)를 150μL 첨가하고, 그의 전기 화학 발광을 섹터 이미저(SECTOR Imager) 6000(Meso Scale Discovery사)으로 측정하였다.

항체 농도를 산출하는 데 있어서, 검량선을 작성하였다. 회귀식은 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀로 해석을 행하였다. 검량선으로부터, 각 포인트에 있어서의 대퇴근 중의 항체 농도를 산출하였다. 각 개체를 듀플리케이트로 행하고, 농도의 산술 평균을 구하였다.

h1f.6 항체를 0.3 및 3mg/kg 대퇴근 내로 국소 투여하고, 투여 6시간 후의 대퇴근 중 농도를 측정한 결과, h1f.6 항체에 0.3 및 3mg/kg 투여군에서는 각각 2.66μg/mL 및 67.9μg/mL였다.

이어서, 대퇴근 중에서의 인간 NGF 결합 활성을 갖는 h1f.6 항체량을 측정하기 위해서, 인간 NGF 결합 ELISA를 사용하였다.

인간 NGF(R&D Systems사, 256-GF/CF)를 PBS로 1000ng/mL이 되도록 희석하고, 눈크 맥시소프 백색 384 플레이트(Nunc사, 460372)에 1웰당 20μL 첨가하고, 4℃에서 밤새 플레이트를 인큐베이트하여 고상화하였다. 역원심에 의해 인간 NGF 고상 액을 제거하고, 블로킹 원(나카라이테스크사, 03953-95) 용액을 1웰당 80μL 첨가하고, 실온에서 1시간 플레이트를 인큐베이트하였다. 플레이트를 세정액(0.05％ Tween-20 함유 TBS)으로 3회 세정하고, 0.05％ Tween-20 함유 TBS로 10배로 희석한 블로킹 원을 사용하여 0.3mg/kg 투여군은 10배, 3mg/kg 투여군은 100배로 대퇴근 호모지네이트를 희석하고, 1웰당 20μL 첨가하였다.

또한, 0.3mg/kg 투여군 및 3mg/kg 투여군의 대퇴근 호모지네이트의 검량선 작성용으로, 0.05％ Tween-20 함유 TBS로 10배로 희석한 블로킹 원에 항체 미투여의 대퇴근 호모지네이트 10％ 및 1％를 첨가한 희석액으로, 각각 h1f.6 항체를 3000ng/mL 내지 0.03ng/mL까지 11단계로 희석하고, 1웰당 20μL 첨가하였다.

실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 0.05％ Tween-20 함유 TBS로 10배로 희석한 블로킹 원을 사용하여, 비오틴화 항 인간 Kappa 경쇄 항체(IBL사, 17249)를 2500배 희석하고, 1웰당 20μL 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 0.05％ Tween-20 함유 TBS로 10배 희석한 블로킹 원을 사용하여, 고감도 스트렙트아비딘-HRP(Thermo사, 21130)를 8000배 희석하고, 1웰당 20μL 첨가하여 실온에서 1시간 플레이트를 인큐베이트하였다. 플레이트를 세정액으로 3회 세정하여, 화학 발광 기질(BM Chemiluminescence ELISA Substrate(POD); Roche사, 11582950001)을 1웰당 20μL 첨가하고, 그 시그널 값을 EnVision 카운터(퍼킨 엘마사)로 측정하였다. 시험은 듀플리케이트로 행하고, 인간 NGF 결합 활성을 갖는 항체량을 산출하기 위하여 검량선을 작성하였다. 회귀식은 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해, 검량선으로부터 각 포인트에 있어서의 인간 NGF 결합 활성을 갖는 항체량을 산출하였다. 0.3 및 3mg/kg 투여군에 대하여 각각 35배 및 350배 함으로써 대퇴근 중에서의 인간 NGF 결합 활성을 갖는 h1f.6 항체량을 구하고, 산술 평균을 산출하였다.

그 결과, 0.3mg/kg 투여군에서 인간 NGF 결합 활성을 갖는 h1f.6 항체는 2.12μg/mL, 3mg/kg 투여군에서는 77.9μg/mL였다.

따라서, 상기의 대퇴근 중의 h1f.6 항체 농도 및 인간 NGF 결합 활성을 갖는 h1f.6 항체량의 결과로부터, 대퇴근 중에 존재하는 항체의 거의 모두가, 인간 NGF 결합 활성을 갖는 것으로 나타났다.

그래서 이어서, 대퇴근 중의 인간 NGF 기능 저해 활성 평가를 행하기 위해서, 인간 NGF와 그의 수용체 trkA의 결합 저해를 지표로 한 인간 NGF-trkA 길항 ELISA를 행하였다.

인간 trkA(R&D Systems사, 175-TK-050)를 PBS로 2000ng/mL가 되도록 희석하고, 눈크 맥시소프 백색 384 플레이트에 1웰당 20μL 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이트함으로써 고상화하였다. 역원심에 의해 인간 trkA 고상 액을 제거하고, Blocker Casein in TBS를 1웰당 80μL 첨가하고, 실온에서 30분간 플레이트를 인큐베이트하였다. 플레이트를 세정액(0.05％ Tween-20 함유 TBS)으로 3회 세정하고, Blocker Casein in TBS를 제거하였다. 0.1％ BSA 함유 PBS를 사용하여 0.3mg/kg 투여군은 5배, 3mg/kg 투여군은 50배로 희석한 래트 대퇴근 호모지네이트를, 각각 0.4μg/mL의 비오틴화 인간 NGF와 등량씩 혼합하고, 실온에서 30분간 인큐베이트한 샘플을 1웰당 20μL 첨가하였다. 또한, 래트 대퇴근 호모지네이트는 채취한 대퇴근 조직을 2.5배량의 조직 호모지네이트액으로 제조하고 있기 때문에, 0.3 및 3mg/kg 투여군은 원래의 대퇴근 조직 농도의 각각 35배 및 350배 희석한 용액을 사용하여 평가하고 있다.

여기에서 사용한 비오틴화 인간 NGF는, 인간 NGF(R&D Systems사, 256-GF-100/CF)를 EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo사, 21329)을 사용하여 비오틴화한 것을 사용하였다. 인간 NGF의 비오틴화는, 1mL의 0.4 mg/mL 인간 NGF 용액에 대하여, 5μL의 5mM NHS-PEG4-Biotin 용액을 첨가하였다. 빙상, 차광 조건에서 2시간 반응시킨 후, 매뉴얼에 따라서 Amicon Ultra-0.5mL 3K(Millipore사, UFC500324)를 2회 사용하여, 반응액을 PBS 용액으로서 회수함으로써 행하였다.

컨트롤로서 0.1％ BSA 함유 PBS와, 0.1％ BSA 함유 PBS를 사용하여 희석한 h1f.6 항체 10μg/mL을 준비하였다. 0.3mg/kg 투여군 및 3mg/kg 투여군의 컨트롤 샘플은 0.1％ BSA 함유 PBS에 항체 미투여의 대퇴근 호모지네이트를 10％ 및 1％ 첨가한 희석액을 사용하여 각각 제조하였다. 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 0.05％ Tween-20 함유 TBS로 20배로 희석한 블로킹 원 용액으로 1000배로 희석한 알칼리 포스파타아제 표지 스트렙트아비딘(Thermo사, 21324)을 1웰당 20μL 첨가하였다. 실온에서 30분간 인큐베이트한 후, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 10mM 염화마그네슘 함유 200mM 트리스(pH9.8) 완충액을 10배 희석한 용액과 1:1로 혼화한 알칼리 포스파타아제 기질(Chemiluminescent AP Microwell/Membrane Substrate, Super Sensitive, 450nm; SurModics사, APU4-0100-01)을 1웰당 20μL 첨가하였다. 실온에서 30분간 인큐베이트하고, 그 시그널 값을 EnVision 카운터(퍼킨 엘마사)로 측정하였다.

각 농도에 있어서의 인간 NGF 기능 저해 활성을 산출하는 데 있어서, 0.1％ BSA 함유 PBS를 첨가한 샘플의 측정값을 0％로 하고, 10μg/mL의 측정값을 100％로 설정하였다. 시험은 듀플리케이트(컨트롤은 4 또는 8웰)로 행하고, 산술 평균을 산출하였다.

그 결과, 0.3mg/kg 투여군에서는, 대퇴근 내 항체 농도의 35배 엷은 조건에 있어서도 21.2％의 저해 활성을 나타내었다. 또한, 3mg/kg 투여군에서는, 대퇴근 내 항체 농도의 350배 엷은 조건에 있어서 59.9％의 저해 활성을 나타내었다. 즉, h1f.6 항체를 0.3 및 3mg/kg 투여한 군의 대퇴근 조직 중에서는, 인간 NGF와 그의 수용체 trkA의 결합을 저해하는 것에 의한 인간 NGF 기능 저해 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로부터, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트인 h1f.6 항체는 국소에 투여함으로써 표적 조직에서의 항체 농도 및 인간 NGF 결합 활성을 유지함으로써, 인간 NGF와 그의 수용체의 결합을 저해하는 것이 명확해졌다. 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트인 h1f.6 항체는, 더 적은 국소 투여량으로 표적 조직의 국소 약효를 발현하는 우수한 의약품이 될 수 있을 가능성이 높을 것으로 기대된다.

(실시예 8: 래트 발바닥 절개 수술 후 동통 모델에 있어서의 진통 효과 평가)

임상에 있어서의 수술 후 동통을 반영한다고 여겨지는 래트 발바닥 절개 수술 후 동통 모델(Pain, 2005, Vol. 117, p.68-76)을 사용하여, h1f.6 항체를 수술부에 국소 투여했을 때의 수술 후 동통에 대한 진통 효과를 평가하였다. 특허문헌 3에는, 완전 인간형 항 인간 NGF 항체 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG가 정맥 내 투여의 전신 투여에 의해 본 모델에서의 진통 효과를 갖는 것이 나타나 있다. 본 시험에서는, h1f.6 항체의 국소 투여에 의한 수술 후 동통에 대한 진통 효과를 평가하는 데 있어서, 비교 대조로서 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG의 국소 투여 및 전신 투여를 사용하였다.

구체적으로는, 수술 군은 각 군 10마리, 비수술 군은 5마리로 하고, 비수술 군, 용매(20mM 시트레이트(Citrate), 120mM NaCl, pH6)군, h1f.6 항체를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 900μg 발바닥 국소 투여한 군 및 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG을 1mg/kg 정맥 내 투여한 군의 계 5군을 설정하였다. 발바닥 국소 투여는 약 2mg 소편의 Spongel(등록 상표) 시트(아스텔라스 세이야쿠)에 30mg/mL 항체 용액 30μL를 침투 팽윤시킨 것을 절개한 발바닥의 힘줄부에 매립함으로써 행하였다. 또한, 용매 군 및 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 1mg/kg 정맥 내 투여한 군에 있어서는 용매를 침투 팽윤시킨 Spongel 시트를 매립하였다. 본 평가에서는 이소플루란 마취 하에 있어서 왼쪽 뒷다리 발바닥을 발뒤꿈치 선단으로부터 약 5mm 부분을 기점으로 하여 약 10mm 발끝 방향으로 직선적으로 절개하고, 노출된 발바닥 힘줄을 세로 방향으로 절개 후, 힘줄의 위치를 복귀시키고, Spongel 시트를 매립하여 나일론사로 2군데 매트리스 봉합하였다. 수술 종료 24시간, 48시간, 72시간 후의 동통 역치를 측정하였다. 동통 역치는, 동적 발바닥 촉각계(Dynamic plantar aesthesiometer)(Ugo Basile사)를 사용하여, 래트의 발바닥으로의 가압에 대한 도피 행동을 나타내는 압력을 측정하였다.

동통 역치로서 각 군의 개체의 회피 행동을 일으킨 압력 역치의 3회의 산술 평균을 산출하고, 비수술 군의 동통 역치를 100％, 용매 군의 동통 역치를 0％로 하여 각 약제 군의 동통 역치의 개선율을 산출하였다. 결과, 수술 후 24시간 후의 h1f.6 항체를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 1mg/kg 정맥 내 투여한 군의 동통 역치 개선율은, 각각 34％, 49％, 46％이고, 각 약제 투여군의 동통 역치는 스튜던트-t(Student-t) 검정에 있어서 모두 용매 군에 대하여 p<0.05의 유의한 개선 작용이 확인되었다. 또한, 수술 후 48시간 후의 h1f.6 항체를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 1mg/kg 정맥 내 투여한 군의 동통 역치 개선율은, 각각 38％, 31％, 34％이고, 각 약제 투여군의 동통 역치는 스튜던트-t 검정에 있어서 모두 용매 군에 대하여 p<0.05의 유의한 개선 작용이 확인되고, 수술 후 72시간 후의 h1f.6 항체를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 1mg/kg 정맥 내 투여한 군의 동통 역치 개선율은, 각각 26％, 33％, 28％이고, 각 약제 투여군의 동통 역치는 스튜던트-t 검정에 있어서 모두 용매 군에 대하여 p<0.05의 유의한 개선 작용이 확인되었다. 이때, 수술 후 24시간 후, 48시간 후, 72시간 후의 어떤 경우든 터키(Tukey) 다중 비교 검정에 있어서 h1f.6 항체를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG을 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG을 1mg/kg 정맥 내 투여한 군에 3군 사이에서 동통 역치에 p<0.05가 유의한 차는 보이지 않고, 이들 3군 사이에서 관찰된 진통 약효는 수술 후 24시간 후, 48시간 후, 72시간 후의 어떤 경우든 약리학적으로 동등한 것이 판명되었다.

(실시예 9: 국소 투여에 의한 혈장 중 및 조직 중의 약물 농도 평가)

실시예 8에서의 평가 시의 각 항체의 발바닥 힘줄 중 및 혈장 중의 농도를 평가하기 위해서, 실시예 8과 동일한 방법으로 래트에 각 n=3으로 h1f.6 항체를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 1mg/kg 정맥 내 투여한 군을 설정하고, 24시간 후의 발바닥 힘줄 중 및 혈장 중의 항체 농도를 ECL 분석에 의해 측정하였다. 발바닥 국소 투여는 실시예 8과 동일하게 약 2mg 소편의 Spongel(등록 상표) 시트(아스텔라스 세이야쿠)에 30mg/mL 항체 용액 30μL를 침투 팽윤시킨 것을 절개한 발바닥의 힘줄부에 매립하고 봉합함으로써 행하였다.

발바닥 힘줄 중의 항체 농도는, 채취한 발바닥 힘줄을 9배량의 발바닥 조직 호모지네이트액(10mM 트리스, 137mM NaCl, 1％ Triton X-100, 10％ Glycerol, cOmplete, Mini(Roche사), pH8.0)으로 호모지네이트한 샘플 중 농도를 측정하고, 그 농도를 10배 한 값을 사용하였다. ECL 분석에서의 측정에는 2종류의 항 1-15 항체인 ANA-IBL-13A와 비오틴화 ANA-IBL-52A를 사용하였다. 또한, 여기서 사용한 비오틴화 ANA-IBL-52A는, ANA-IBL-52A를 비오틴 표지 키트-NH2(도진 가가꾸, LK03)를 사용하고, 테크니컬 매뉴얼에 따라 비오틴화한 것을 사용하였다.

ECL 분석의 방법을 이하에 나타내었다. ANA-IBL-13A를 TBS로 5000ng/mL가 되도록 희석하고, 멀티-어레이 96웰 플레이트(Meso Scale Discovery사, L15XA-3)에 1웰당 25μL 첨가하였다. 실온에서 1시간 플레이트를 인큐베이트함으로써, ANA-IBL-13A를 고상화하였다. 역원심에 의해 ANA-IBL-13A 고상 액을 제거하고, 세정액(0.05％ Tween-20 함유 TBS)로 플레이트를 3회 세정하고, Blocker Casein in TBS(Thermo사, 37532)을 1웰당 150μL 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 역원심에 의해 Blocker Casein in TBS를 제거하였다. 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 혈장 샘플 및 발바닥 힘줄 호모지네이트를 희석액(0.05％ Tween-20 함유 Blocker Casein in TBS)으로 10배로 희석하고, 1웰당 25μL 첨가하였다. 혈장 샘플의 검량선 작성용으로, 항체 미투여의 혈장 10％를 포함하는 희석액을 사용하여, 333ng/mL 내지 0.017ng/mL까지 10단계로 희석한 h1f.6 항체 및 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 준비하고, 컨트롤로서, 항체 미투여의 혈장 10％를 포함하는 희석액을 준비하였다. 발바닥 힘줄 호모지네이트의 검량선 작성용으로, 항체 미투여의 발바닥 힘줄 호모지네이트 10％를 포함하는 희석액을 사용하여, 333ng/mL 내지 0.017ng/mL까지 10단계로 희석한 h1f.6 항체 및 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 준비하였다. 컨트롤로서, 항체 미투여의 발바닥 힘줄 호모지네이트 10％를 포함하는 희석액을 준비하였다. 실온에서 1시간 플레이트를 인큐베이트한 후, 역원심에 의해 용액을 제거하였다. 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 희석액을 사용하여 1000ng/mL가 되도록 희석한 비오틴화 ANA-IBL-52A를 1웰당 25μL 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이트하였다. 역원심에 의해 용액을 제거하여, 세정액으로 3회 세정하고, 희석액을 사용하여 500배로 희석한 MSD SULFO-TAG 표지된 스트렙트아비딘(Meso Scale Discovery사, R32AD-1)을 25μL 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 역원심에 의해 용액을 제거하고, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하였다. 초순수(MilliQ(등록 상표), 머크사)로 2배로 희석한 MSD 판독 버퍼 T(4x)(Meso Scale Discovery사, R92TC-1)를 150μL 첨가하고, 그의 전기 화학 발광을 섹터 이미저 6000(Meso Scale Discovery사)으로 측정하였다.

항체 농도를 산출하는 데 있어서, 검량선을 작성하였다. 회귀식은 4 파라미터 로지스틱 또는 5 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 해석을 행하였다. 검량선으로부터, 각 포인트에 있어서의 혈장 중 및 발바닥 힘줄 중의 항체 농도를 산출하였다. 각 시험을 트리플리케이트로 행하고, 산출한 농도의 산술 평균을 구하였다. 본 시험에서의 h1f.6 항체의 정량 한계는 혈장 중 농도가 0.2ng/mL, 발바닥 힘줄 중 농도가 2ng/mL이고, 완전 인간형 항 NGF 항체 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG의 정량 한계는 혈장 중 농도가 0.5ng/mL, 발바닥 힘줄 중 농도가 2ng/mL였다.

h1f.6 항체를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 1mg/kg 정맥 내 투여한 군 각각에 있어서의 투여 24시간 후의 발바닥 힘줄 중 농도를 측정한 결과, 각각 132ng/mL, 46.2ng/mL, 24.1ng/mL였다. h1f.6 항체를 발바닥 내 투여한 군의 발바닥 힘줄 중 농도가 가장 높았다. 한편, 투여 24시간 후의 혈장 중 농도는 각각 0.230ng/mL 미만(3예 중 일례는 0.230ng/mL, 2예는 0.2ng/mL 미만), 65.1ng/mL, 396ng/mL이고, h1f.6 항체를 발바닥 내 투여한 군의 혈장 중 농도가 가장 낮았다.

각 항체의 발바닥 힘줄 중 농도 및 혈장 중 농도를 기초로, h1f.6 항체를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 1mg/kg 정맥 내 투여한 군 각각에 대하여 투여 24시간 후의 발바닥 힘줄 중/혈장 중의 농도비를 산출하였다. 그 때, 정량 한계 미만이었던 h1f.6 항체를 900μg 발바닥 국소 투여한 개체의 투여 24시간 후의 혈장 중 농도는 정량 한계의 0.2ng/mL로 하였다.

h1f.6 항체를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 900μg 발바닥 국소 투여한 군, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG를 1mg/kg 정맥 내 투여한 군 각각에 있어서의 투여 24시간 후의 발바닥 힘줄 중/혈장 중의 농도비는 각각 628, 0.71, 0.061이었다. 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG는 발바닥 내 투여를 행함으로써 정맥 내 투여에 비하여 발바닥 힘줄 중/혈장 중의 농도비가 10배 이상 높았다. 발바닥으로의 국소 투여군의 비교에서는, h1f.6 항체는 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG와 비교하여, 발바닥 힘줄 중/혈장 중의 농도비가 800배 이상이었다.

이상으로부터, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트인 h1f.6 항체의 국소 투여는 목적으로 하는 국소에서의 약제 농도를 유지하면서 전신 혈류 중의 항체 농도를 저감할 수 있는 것으로 나타나고, 또한 완전 인간형 항 인간 NGF 항체 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG에 비하여 극히 유효하게 국소에서의 약제 농도를 유지하면서 전신 혈류 중의 약제 농도를 저감하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는 국소에서의 약효를 발현하면서 전신성의 부작용을 저감하는 우수한 의약품이 될 수 있을 가능성이 높을 것으로 기대된다.

본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 수술 후 동통의 치료에 유용할 것으로 기대된다. 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트는, 국소에서의 약효를 발현하면서 전신성의 혈중 폭로에 기초하는 부작용을 저감한 우수한 약제라고 하는 점에서 특히 유용할 것으로 기대된다.

이하의 서열표의 숫자 표제 <223>에는, 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 구체적으로는, 서열표의 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열은, h1f.6 항체의 중쇄 프래그먼트의 염기 서열이고, 서열표의 서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 1에 의해 코딩되는 중쇄 프래그먼트의 아미노산 서열이다. 서열표의 서열 번호 2에 나타나는 염기 서열은, h1f.7 항체의 중쇄 프래그먼트의 염기 서열이고, 서열표의 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 2에 의해 코딩되는 중쇄 프래그먼트의 아미노산 서열이다. 서열표의 서열 번호 3에 나타나는 염기 서열은, h1f.8 항체의 중쇄 프래그먼트의 염기 서열이고, 서열표의 서열 번호 7에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 3에 의해 코딩되는 중쇄 프래그먼트의 아미노산 서열이다. 서열표의 서열 번호 4에 나타나는 염기 서열은, 1-15(N52D-A)-Fab' 프래그먼트의 경쇄 염기 서열이고, 서열표의 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 4에 의해 코딩되는 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열표의 서열 번호 9에 나타나는 염기 서열은, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열표의 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 9에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열표의 서열 번호 11에 나타나는 염기 서열은, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열표의 서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 11에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.

SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> NOVEL ANTI-HUMAN NGF ANTIBODY FAB FRAGMENT <130> FA1535-16021 <150> JP2015-104806 <151> 2015-05-22 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 675 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding h1f.6 heavy chain fragment <400> 1 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctgggt ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcgaccata gtggaagcac caacaacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtaggcacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agatgggggc 300 cccgaatcgg ggatgggggc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actcccttag tagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgac 675 <210> 2 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding h1f.7 heavy chain fragment <400> 2 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctgggt ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcgaccata gtggaagcac caacaacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtaggcacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agatgggggc 300 cccgaatcgg ggatgggggc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actcccttag tagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gt 672 <210> 3 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding h1f.8 heavy chain fragment <400> 3 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctgggt ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcgaccata gtggaagcac caacaacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtaggcacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agatgggggc 300 cccgaatcgg ggatgggggc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actcccttag tagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgcagcc 678 <210> 4 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding 1-15(N52D-A)-Fab?fragment light chain <400> 4 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gattcaacta tttgggttgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac tctgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300 tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaacgga ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657 <210> 5 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1f.6 heavy chain fragment <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp 225 <210> 6 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1f.7 heavy chain fragment <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 <210> 7 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1f.8 heavy chain fragment <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Ala Ala 225 <210> 8 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-15(N52D-A)-Fab?fragment light chain <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 9 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH gene of anti-human NGF antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 9 cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt ggt tac 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 tac tgg agc tgg gtc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att 144 Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 ggg gaa atc gac cat agt gga agc acc aac aac aac ccg tcc ctc aag 192 Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 agt cga gtc acc ata tca gta ggc acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg 240 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 aag ctg agc tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt tcg 288 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 aga gat ggg ggc ccc gaa tcg ggg atg ggg gct ttt gat atc tgg ggc 336 Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 caa ggg aca atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL gene of anti-human NGF antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 11 gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctg cat agt 96 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 aat gga ttc aac tat ttg ggt tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct 144 Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt act ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 cta caa act ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 336 Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 cgg 339 Arg <210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg

Claims

이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트:
(a) 서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트; 및
(b) (a)의 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.
제1항에 있어서, 서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.
제1항에 있어서, 번역 후 수식이 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화인, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.
제1항에 있어서, 서열 번호 5의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 5에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.
제1항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는, 발현 벡터:
(a) 제1항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 및
(b) 제1항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제6항에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
제7항에 있어서, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는, 숙주 세포:
(a) 제1항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(b) 제1항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
제8항에 기재된 숙주 세포를 배양하여, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트를 생산하는 방법.
제9항에 기재된 방법으로 생산할 수 있는 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.
제1항 내지 제4항 및 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
제11항에 있어서, 수술 후 동통의 치료용 국소 의약 조성물인, 의약 조성물.
제2항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트, 제4항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
제13항에 있어서, 수술 후 동통의 치료용 국소 의약 조성물인, 의약 조성물.
수술 후 동통의 치료용 국소 의약 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제4항 및 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 용도.
수술 후 동통의 치료를 위한, 제1항 내지 제4항 및 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 국소 투여에 의한 용도.
제1항 내지 제4항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 수술 후 동통의 치료에 국소 투여로 사용하기 위한, 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트.
제1항 내지 제4항 및 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트의 유효량을 대상의 국소에 투여하는 것을 포함하는, 수술 후 동통의 치료 방법.