KR20230131207A - ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성항체 - Google Patents

ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성항체 Download PDF

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Abstract

[과제] ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하여, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14를 개재시키는 근 위축 작용을 저해하는 것에 의해 봉입체근염 등의 근 위축성 질환을 예방 또는 치료하는 다중 특이성 항체를 제공하는 것에 있다. [해결수단] 본 발명자들은, 다중 특이성 항체에 대해 검토하여, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드, 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 포함하는, 다중 특이성 항체를 제공했다.

Description

ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체
본 발명은, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체에 관한 것이다.
액티빈 수용체 타입 2A(ActRIIA) 및 액티빈 수용체 타입 2B(ActRIIB)는, 미오스타틴 및 액티빈 A의 수용체로서 알려져 있다. ActRIIA 및 ActRIIB에의 리간드 자극에 의해 Smad2 및 Smad3이 인산화된다. 인산화 Smad2/3은 Smad4와 복합체를 형성하고, 각종 전사 인자와 결합하여 유전자 발현을 제어함이 알려져 있다(Tsuchida K et al., Endocr J. 2008, Vol. 55, p. 11-21). 골격근에 있어서는, ActRIIA 및 ActRIIB는 단백 분해에 관여하고 있음이 알려져 있다(MorvanF et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2017, vol. 114, p. 12448-12453).
섬유아세포 증식 인자 유도성 14(Fn14: Fibroblast growth factor-inducible 14)(TNFRSF12A라고도 칭한다)는, 종양괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리의 일원이다. 또한, Fn14는, TNF양 아포토시스 약유도 인자(TWEAK: TNF-like weak inducer of apoptosis)의 수용체로서도 알려져 있다. Fn14에는 TWEAK의 결합에 의해 야기되는 TWEAK 의존적인 활성화와, TWEAK의 비존재하에서 야기되는 TWEAK 비의존적인 활성화가 있다. TWEAK 의존적 또는 비의존적인 Fn14의 활성화는, 모두 NF-κB 시그널 전달 경로를 활성화하여, 세포의 증식, 이동, 분화, 및 아포토시스, 및, 혈관 신생, 조직 손상, 재생에 관여하는 염증을 제어함이 알려져 있다(Winkles JA, Nat Rev Drug Discov. 2008, Vol. 7, p. 411-425). 골격근에 있어서는, Fn14는 병태 시에 발현이 상승하여, 골격근 위축에 관여하고 있음이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 지금까지 몇몇 Fn14에 결합하는 항체의 개발이 보고되어 있다. 이들 항체의 대부분은, TWEAK 자극에 의한 Fn14의 활성화에 대한 안타고니스트 활성(이후, 간단히 「안타고니스트 활성」이라고도 칭한다)과 동시에, TWEAK 비존재하에서 Fn14를 활성화시키는 아고니스트 활성(이후, 간단히 「아고니스트 활성」이라고도 칭한다)도 가짐이 알려져 있다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체 CRCBT-06-002는, 인간 악성 흑색종 유래 세포주 A375 세포에서의 TWEAK 자극에 의한 IL-8 산생을 저해하는 안타고니스트 활성이 보고되어 있다. 그러나, 동시에 TWEAK 비존재하에서 A375 세포로부터의 IL-8 산생을 유도하는 아고니스트 활성을 가짐도 보고되어 있다(특허문헌 1). 근년에는, 안타고니스트 활성을 가지고, 아고니스트 활성을 가지지 않는 Fn14에 결합하는 항체도 알려져 있다(특허문헌 2).
골격근 위축에는, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14 이외에도 몇몇 인자가 관여하고 있음이 보고되어 있다(비특허문헌 2). 종양괴사 인자(TNF)α는 TNF 수용체를 개재시켜 골격근 단백의 분해에 관련된다. 당질 코르티코이드도 마찬가지로, 당질 코르티코이드 수용체를 개재시켜 골격근 단백 분해에 관련된다. 또한, 골격근의 단백 동화에 관여하는 인슐린양 성장 인자의 억제에 의해, 골격근이 위축된다.
봉입체근염(sIBM: Sporadic inclusion body myositis)은 만성 진행성의 근 질환이다. 대퇴사두절이나 수지·수지굴근을 중심으로 근 위축과 근력 저하가 인정된다. 특징적인 소견으로서 연취공포(緣取空胞)를 수반하는 근섬유의 발현, 비괴사 섬유나 근 내초에의 단핵구 침입이나 포위가 보인다. 진행과 함께 보행 기능의 저하나 연하(嚥下) 장애가 인정되어, 생활의 질(QOL: Quality of life)을 현저히 저하시킨다. 그렇지만, sIBM에는 현재 확립된 치료법이 없다(비특허문헌 3).
지금까지, 수많은 미오스타틴 저해제 또는 ActRIIA 및 ActRIIB 저해제의 근 질환에 대한 임상 시험이 실시되고 있다. 그 중에서도, ActRIIA 및 ActRIIB 저해 항체인 Bimagrumab(특허문헌 3)는 가장 고차까지 개발이 진행된 약제이며, sIBM을 대상으로 하여 제2B상/제3상 시험이 실시되었다. Bimagrumab의 제2B상/제3상 시험에 있어서 제지방 체중의 증가는 인정되었지만, 주요 평가 항목인 6분간 보행 거리의 개선은 인정되지 않았다(비특허문헌 4).
sIBM 환자의 골격근에서는, Smad2의 인산화의 상승이 인정되고 있으므로, 근 위축에의 ActRIIA 및 ActRIIB 자극의 관여가 시사되고 있다(비특허문헌 5). 더하여, sIBM 환자의 골격근에 있어서 Fn14의 발현이 상승하고 있음이 보고되어 있다(비특허문헌 6). 그러나, 지금까지 ActRIIA 및 ActRIIB와 Fn14의 양 경로 저해를 표적으로 한 sIBM의 치료약은 보고되어 있지 않다.
국제 공개 제2013/026099호 국제 공개 제2020/090892호 국제 공개 제2017/081624호
Sato S et al., Front Immunol. (스위스) 2014, Vol. 5, Article 18 Bonald P et al., Dis Model Mech. (영국) 2013, Vol. 6, p. 25-39 Naddaf E et al., Neurotherapeutics. (미국) 2018, Vol. 15, p. 995-1005 Hanna MG et al., Lancet Neurol. (영국) 2019, Vol. 18, p. 834-844 Amato AA et al., Neurology. (미국) 2014, Vol. 83, p. 2239-2246 Morosetti R et al., Am J Pathol. (미국) 2012, Vol. 180, p. 1603-1613
본 발명의 과제는, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하여, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14를 개재시키는 근 위축 작용을 저해하는 것에 의해 봉입체근염 등의 근 위축성 질환을 예방 또는 치료하는 것이 기대되는 다중 특이성 항체를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 다중 특이성 항체의 제작에 있어서 상당한 창의 궁리를 가지고 검토를 거듭한 결과, 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 98부터 105까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는, 제1 VHH, 및, 서열 번호 2의 아미노산 번호 172부터 176까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 195부터 210까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 243부터 251까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는, 제2 VHH를 포함하는 ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 폴리펩타이드를 제작했다(실시예 2). 더욱이, 당해 폴리펩타이드의 C말단이 인간 Fn14에 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는 다중 특이성 항체를 제작했다(실시예 3∼4). 당해 다중 특이성 항체가, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하여(실시예 5), 미오스타틴 자극에 의한 Smad의 인산화를 저해하는 것(실시예 6), TWEAK 자극에 의한 NF-κB의 활성화를 저해하는 것(실시예 7), 및, TWEAK 비존재 아래에 있어서 NF-κB의 활성화를 유도하지 않는 것(실시예 7)을 발견했다. 이들의 결과, 상기 ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체를 제공하여, 본 발명을 완성했다.
본 발명에 의하면, 예를 들어, 이하의 발명이 제공된다.
[1]
ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
(a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
(b) Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트
를 포함하고,
제1 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 98부터 105까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하고,
제2 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 172부터 176까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 195부터 210까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 243부터 251까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
다중 특이성 항체.
[2]
제1 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는, [1]에 기재된 다중 특이성 항체.
[3]
제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는, [1] 또는 [2]에 기재된 다중 특이성 항체.
[4]
(a)의 폴리펩타이드가 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는, [1]에 기재된 다중 특이성 항체.
[5]
Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 303부터 307까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 322부터 338까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 371부터 379까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 4의 아미노산 번호 89부터 97까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체.
[6]
Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체.
[7]
Fn14에 결합하는 항체를 포함하고, 해당 Fn14에 결합하는 항체가, L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는, [1]∼[6] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체.
[8]
Fn14에 결합하는 항체를 포함하고, 해당 Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체.
[9]
Fn14에 결합하는 항체를 포함하고, 해당 Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 720까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체.
[10]
서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, [1]에 기재된 다중 특이성 항체.
[11]
번역 후 수식을 받은, [1]∼[10] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체.
[12]
[1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 (a)의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[13]
[5]∼[9] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[14]
[5]∼[9] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[15]
[1]∼[9] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 (a)의 폴리펩타이드와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[16]
[10]에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[17]
[10]에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[18]
[12]∼[15] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
[19]
[14] 및/또는 [15]에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
[20]
[16] 및/또는 [17]에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
[21]
[18]∼[20] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[22]
이하의 (i) 및 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 또는 이하의 (i)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및/또는 이하의 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포:
(i) [1]∼[9] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(ii) [1]∼[9] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 (a)의 폴리펩타이드와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[23]
이하의 (A)∼(D)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 숙주 세포:
(A) [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(B) [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(C) [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(D) [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[24]
이하의 (i) 및 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 또는 이하의 (i)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 이하의 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 다중 특이성 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체를 생산하는 방법:
(i) [1]∼[9] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(ii) [1]∼[9] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 (a)의 폴리펩타이드와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[25]
이하의 (E)∼(G)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 다중 특이성 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체를 생산하는 방법:
(E) [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(F) [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(G) [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, [10]에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[26]
[24]에 기재된 방법으로 생산된 다중 특이성 항체.
[27]
[25]에 기재된 방법으로 생산된 다중 특이성 항체.
[28]
[1]∼[11], [26] 및 [27] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체, 및, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
[29]
봉입체근염의 예방 또는 치료용 의약 조성물인, [28]에 기재된 의약 조성물.
[30]
[1]∼[11], [26] 및 [27] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 봉입체근염을 예방 또는 치료하는 방법.
[31]
봉입체근염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, [1]∼[11], [26] 및 [27] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체.
[32]
봉입체근염의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, [1]∼[11], [26] 및 [27] 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 사용.
본 발명의 다중 특이성 항체는, 미오스타틴 자극에 의한 Smad의 인산화를 저해하고, 더욱이 아고니스트 활성을 나타내지 않고 TWEAK 자극에 의한 Fn14의 활성화를 저해하는 것에 의해, 근 위축 억제 작용을 갖는다고 기대되는 것이고, 봉입체근염 등의 근 위축성 질환의 예방 또는 치료제로서 사용할 수 있을 가능성이 있다.
[도 1] (A) ActRIIA/HEK293 세포에 있어서의 미오스타틴 유발 Smad3 인산화에 대한 저해 작용(ActRIIA 저해 작용), 및 (B) ActRIIB/HEK293 세포에 있어서의 미오스타틴 유발 Smad3 인산화에 대한 저해 작용(ActRIIB 저해 작용)을 나타낸다. 세로축은 미오스타틴 100ng/mL에 의한 Smad3 인산화에 대한 저해율(미오스타틴 100ng/mL 자극 조건하의 측정치를 0% 저해, 미오스타틴 비존재하의 측정치를 100% 저해로 한다)을 나타낸다. 가로축은 항체 농도(nmol/L)의 대수를 나타낸다. 한편, 데이터는 2 시행(각 시행은 듀플리케이트로 실시)의 평균치를 나타낸다.
[도 2] NF-κB/HEK293 세포에 있어서의 (A) TWEAK 유발 NF-κB 활성화에 대한 안타고니스트 활성, 및 (B) Fn14에 대한 아고니스트 활성을 나타낸다. 세로축은 (A) TWEAK 100ng/mL에 의한 NF-κB 활성화에 대한 저해율(TWEAK 100ng/mL 자극 조건하의 측정치를 0% 저해, TWEAK 비존재하의 측정치를 100% 저해로 한다), 및 (B) TWEAK 100ng/mL 자극 조건하의 측정치를 100%, TWEAK 비존재하의 측정치를 0%로 했을 때의, TWEAK 비존재하에 있어서의 평가 항체에 의한 상대적 활성화율을 나타낸다. 가로축은 항체 농도(nmol/L)의 대수를 나타낸다. 한편, 데이터는 2 시행(각 시행은 듀플리케이트로 실시)의 평균치를 나타낸다.
[도 3] 스테로이드 유발 미오파시 모델 마우스에 있어서의, 스테로이드 및 피험 물질 투여 개시 후 14일의 (A) 대퇴사두절 중량, 및 (B) 악력을 나타낸다. 세로축은 (A) 적출 대퇴사두절의 실측 중량(g), 및 (B) 사지 악력(kg)을 나타낸다. 한편, 데이터는 각 군 10예의 평균치±SEM을 나타낸다. *P＜0.05 대정상군, ＃P＜0.05 대용매 투여군, ＋P＜0.05 대75E9(mFc)군, ＋＋P＜0.05 대STF8-1(mFc)군, ＆P＜0.05 대75E9(mFc)＋STF8-1(mFc)군, 모두 스튜던트 t 검정.
[도 4] 스테로이드 유발 미오파시 모델 원숭이에 있어서의, 스테로이드 및 피험 물질 투여 개시 후 4주의 대퇴부 제지방 중량을 나타낸다. 세로축은 이중 에너지 X선 흡수 측정법에 의한 골밀도 측정 장치로 계측한 대퇴부의 제지방 중량(g)을 나타낸다. 한편, 정상군의 데이터는 2예의 실측치 및 평균치, 스테로이드 유발 미오파시 모델 각 군의 데이터는 각 군 3예의 실측치 및 평균치±SEM을 나타낸다. *P＜0.05 대용매 투여군, 스튜던트 t 검정.
이하에, 본 발명에 대해 상술한다.
항체에는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 5개의 클래스가 존재한다. 항체 분자의 기본 구조는, 각 클래스 공통으로, 분자량 5만∼7만의 중쇄와 2만∼3만의 경쇄로 구성된다. 중쇄는, 통상 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드쇄로 이루어지고, 클래스마다 특징적인 구조를 가지고, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 Igγ, Igμ, Igα, Igδ, Igε이라고 불린다. 더욱이 IgG에는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 서브클래스가 존재하고, 각각 대응하는 중쇄는 Igγ1, Igγ2, Igγ3, Igγ4라고 불리고 있다. 경쇄는, 통상 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드쇄로 이루어지고, λ형과 κ형의 2종이 알려져 있고, 각각 Igλ, Igκ라고 불린다. 항체 분자의 기본 구조의 펩타이드 구성은, 각각 상동인 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가, 다이설파이드 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 분자량 15만∼19만이다. 2종의 경쇄는, 어느 중쇄와도 짝을 이룰 수 있다. 개개의 항체 분자는, 항상 동일한 경쇄 2개와 동일한 중쇄 2개로 되어 있다.
쇄내 S-S 결합은, 중쇄에 4개(Igμ, Igε에는 5개), 경쇄에는 2개 있고, 아미노산 100∼110잔기마다 하나의 루프를 이루고, 이 입체 구조는 각 루프간에 유사하고, 구조 단위 또는 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 N말단에 위치하는 도메인은, 동종 동물의 동일 클래스(서브클래스)로부터의 표품이더라도, 그 아미노산 서열이 일정하지 않아, 가변 영역이라고 불리고 있고, 각 도메인은, 각각, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이라고 불리고 있다. 가변 영역보다 C말단측의 아미노산 서열은, 각 클래스 또는 서브클래스마다 거의 일정하여 정상 영역이라고 불리고 있다(정상 영역의 각 도메인은, 각각, 중쇄 정상 영역의 N말단측으로부터 CH1, CH2, CH3이라고 표시되고, 경쇄 정상 영역은 CL이라고 표시된다).
항체의 항원 결합 부위는 VH 및 VL에 의해 구성되고, 결합의 특이성은 각각 이 부위의 아미노산 서열에 달려 있다. 한편, 보체나 각종 Fc 수용체 발현 세포와의 결합과 같은 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 정상 영역의 구조의 차이를 반영하고 있다. 경쇄, 중쇄의 가변 영역의 가변성은, 어느 쪽의 쇄에도 존재하는 3개의 작은 초가변 영역으로 거의 한정됨을 알 수 있고, 이들 영역은 상보성 결정 영역(CDR: 각각 N말단측으로부터 CDR1, CDR2, CDR3)이라고 불리고 있다. 가변 영역의 나머지의 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리고, 비교적 일정하다.
항체의 VH 및 VL을 포함하는 각종 항원 결합 프래그먼트도 항원 결합 활성을 갖고, 이와 같은 대표적인 항원 결합 프래그먼트로서, 1본쇄 가변 영역 프래그먼트(scFv), Fab, Fab＇, F(ab＇)2를 들 수 있다. scFv는, 링커로 연결된 VH와 VL로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이며, Fab는, 경쇄와 VH, CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이다. Fab＇는, 경쇄와 VH, CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이며, 이 힌지 영역의 부분에는 중쇄간 S-S 결합을 구성하고 있던 시스테인 잔기가 포함된다. F(ab＇)2 프래그먼트는, 2개의 Fab＇프래그먼트가 힌지 영역 중의 중쇄간 S-S 결합으로 결합한 2가의 항체 프래그먼트이다.
낙타과 동물(쌍봉낙타, 단봉낙타, 라마, 알파카) 유래의 항체로서, 경쇄와 CH1 도메인이 결손된 중쇄만으로 구성된 항체(중쇄 항체)가 알려져 있다. 중쇄 항체의 가변 영역은 variable domain of heavy chain of heavy chain antibody(VHH)라고 불리고, 중쇄 항체의 항원 결합 부위는 VHH만으로 구성된다. VHH는 3개의 CDR을 포함하고, 항원에의 결합의 특이성은 CDR의 아미노산 서열에 달려 있다.
본 명세서에 있어서의 「VHH」에는, FR의 아미노산 서열의 일부, 대부분, 또는 전부가 인간 면역글로불린 분자에서 유래하는 아미노산 서열로 치환된 그 인간화형(인간화 VHH)도 포함된다. 인간화의 방법으로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 국제 공개 제2006/122825호, 미국 특허 제5225539호, 미국 특허 제6180370호 등을 참조하여 인간화 항체를 제작할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「다중 특이성 항체」는 2종 이상의 상이한 항원에 결합하는 항체를 의미한다.
본 명세서에 있어서 「펩타이드 링커」란, 가변 영역간을 연결하기 위한, 유전자 공학적 수법에 의해 도입할 수 있는 1 이상의 임의의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 의미한다.
＜본 발명의 다중 특이성 항체＞
본 발명은, 이하의 다중 특이성 항체(이하, 「본 발명의 다중 특이성 항체」라고도 칭한다)를 제공한다:
ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
(a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
(b) Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트
를 포함하고,
제1 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 98부터 105까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하고,
제2 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 172부터 176까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 195부터 210까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 243부터 251까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
다중 특이성 항체.
본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 인간화 VHH이다. 본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 다중 특이성 항체의 (a)의 폴리펩타이드에 있어서, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 연결되어 있어도 되고, 제2 VHH의 C말단이 제1 VHH의 N말단에 연결되어 있어도 된다. 본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 연결되어 있다.
본 발명의 다중 특이성 항체의 (a)의 폴리펩타이드에 있어서, 제1 VHH와 제2 VHH는 직접 연결되어 있어도 되고 또는 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있어도 된다. 본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH와 제2 VHH는 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있다.
본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있다. 본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 인간화 VHH이며, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있다.
본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있다.
제1 VHH와 제2 VHH를 연결하는 펩타이드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하다. 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH와 제2 VHH는, 5아미노산 이상의 펩타이드 링커로 연결되고, 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH와 제2 VHH는, 5아미노산 이상 35아미노산 이하, 5아미노산 이상 30아미노산 이하, 5아미노산 이상 25아미노산 이하, 10아미노산 이상 25아미노산 이하, 또는 15아미노산 이상 25아미노산 이하의 펩타이드 링커로 연결된다.
펩타이드 링커로서, 예를 들어,
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 5)
Ser·Gly·Gly·Gly(서열 번호 6)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 7)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열 번호 8)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 9)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열 번호 10)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 11)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열 번호 12)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 7))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열 번호 8))n
[n은 1 이상의 정수이다] 등을 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH와 제2 VHH를 연결하는 펩타이드 링커는, (Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 7))n[n은 1∼5의 정수이다]이고, 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH와 제2 VHH를 연결하는 펩타이드 링커는, (Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)5(서열 번호 2의 아미노산 번호 117 내지 141)이다.
본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 인간화 VHH이며, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있고, 해당 제1 VHH와 제2 VHH를 연결하는 펩타이드 링커가 (Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)5(서열 번호 2의 아미노산 번호 117 내지 141)이다.
본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, (a)의 폴리펩타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 303부터 307까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 322부터 338까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 371부터 379까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 4의 아미노산 번호 89부터 97까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 다중 특이성 항체의 하나의 실시형태에 있어서, Fn14에 결합하는 항체의 항원 결합 프래그먼트는, scFv, Fab, Fab＇, 또는 F(ab＇)2인 항원 결합 프래그먼트이다.
Fn14에 결합하는 항체에 있어서의 정상 영역으로서는, 어떠한 서브클래스의 정상 영역(예를 들어, 중쇄로서 Igγ1, Igγ2, Igγ3 또는 Igγ4, 경쇄로서 Igλ또는 Igκ의 정상 영역)도 선택 가능할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, Fn14에 결합하는 항체는, 중쇄 정상 영역으로서 인간 Igγ1 정상 영역, 경쇄 정상 영역으로서 인간 Igκ정상 영역을 포함한다.
본 명세서 중에서 사용되는 항체의 정상 영역에 있어서의 아미노산 변이 도입에 관한 잔기 번호에 대해서는, EU 인덱스(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda)에 따른다. L234A란, 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 234위의 류신의 알라닌으로의 치환이다. L235A란, 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 235위의 류신의 알라닌으로의 치환이다. M252Y란, 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 252위의 메티오닌의 티로신으로의 치환이다. S254T란, 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 254위의 세린의 트레오닌으로의 치환이다. T256E란, 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 256위의 트레오닌의 글루타민산으로의 치환이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, Fn14에 결합하는 항체를 포함하고, 해당 Fn14에 결합하는 항체가, L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함한다. L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 정상 영역으로서는, 예를 들어, 서열 번호 2의 아미노산 번호 391부터 720까지의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 Igγ1 정상 영역을 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, Fn14에 결합하는 항체를 포함하고, 해당 Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, Fn14에 결합하는 항체를 포함하고, 해당 Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273 내지 720에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 다중 특이성 항체에 있어서, (a)의 폴리펩타이드의 C말단은, Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있다. 사용되는 펩타이드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하다. 하나의 실시형태에 있어서, (a)의 폴리펩타이드와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는, 5아미노산 이상의 펩타이드 링커로 연결되고, 하나의 실시형태에 있어서, (a)의 폴리펩타이드와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는, 5아미노산 이상 35아미노산 이하, 5아미노산 이상 30아미노산 이하, 5아미노산 이상 25아미노산 이하, 5아미노산 이상 20아미노산 이하, 또는 10아미노산 이상 20아미노산 이하의 펩타이드 링커로 연결된다.
펩타이드 링커로서, 예를 들어,
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 5)
Ser·Gly·Gly·Gly(서열 번호 6)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 7)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열 번호 8)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 9)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열 번호 10)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 11)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열 번호 12)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 7))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열 번호 8))n
[n은 1 이상의 정수이다] 등을 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, (a)의 폴리펩타이드와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 연결하는 펩타이드 링커는, (Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 7))n[n은 1∼5의 정수이다]이고, 하나의 실시형태에 있어서, (a)의 폴리펩타이드와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 연결하는 펩타이드 링커는, (Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)2(서열 번호 2의 아미노산 번호 263부터 272)이다.
본 발명의 다중 특이성 항체에 있어서, 제1 VHH와 제2 VHH를 연결하는 펩타이드 링커와 (a)의 폴리펩타이드와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 연결하는 펩타이드 링커는, 동일한 펩타이드 링커여도, 상이한 펩타이드 링커여도 된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하의 다중 특이성 항체이다:
ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
(a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
(b) Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트
를 포함하고,
제1 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지고,
Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
다중 특이성 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하의 다중 특이성 항체이다:
ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
(a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
(b) Fn14에 결합하는 항체
를 포함하고,
제1 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지고,
Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는 경쇄를 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
다중 특이성 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하의 다중 특이성 항체이다:
ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
(a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
(b) Fn14에 결합하는 항체
를 포함하고,
제1 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지고,
Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273 내지 720에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
다중 특이성 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하의 다중 특이성 항체이다:
ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
(a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
(b) Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트
를 포함하고,
제1 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있고,
Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
다중 특이성 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하의 다중 특이성 항체이다:
ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
(a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
(b) Fn14에 결합하는 항체
를 포함하고,
제1 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있고,
Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는 경쇄를 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
다중 특이성 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하의 다중 특이성 항체이다:
ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
(a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
(b) Fn14에 결합하는 항체
를 포함하고,
제1 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있고,
Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273 내지 720에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
다중 특이성 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하의 다중 특이성 항체이다:
ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
(a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
(b) Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트
를 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지고,
Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
다중 특이성 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하의 다중 특이성 항체이다:
ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
(a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
(b) Fn14에 결합하는 항체
를 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지고,
Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는 경쇄를 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
다중 특이성 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하의 다중 특이성 항체이다:
ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
(a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
(b) Fn14에 결합하는 항체
를 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지고,
Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273 내지 720에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하고,
(a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
다중 특이성 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 다중 특이성 항체이다.
항체를 세포에서 발현시키는 경우, 항체가 번역 후에 수식을 받음이 알려져 있다. 번역 후 수식의 예로서는, 카복시펩티다제에 의한 중쇄 C말단의 리신의 결실, 중쇄 및 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루타민산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식, 글리코실화, 산화, 탈아마이드화, 당화 등을 들 수 있고, 여러 가지 항체에 있어서, 이와 같은 번역 후 수식이 생김이 알려져 있다(Liu H et al., J Pharm Sci. 2008, Vol. 97, p. 2426-2447).
본 발명의 다중 특이성 항체에는, 번역 후 수식을 받은 다중 특이성 항체도 포함된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 전술한 본 발명의 다중 특이성 항체의 (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14에 결합하는 항체의 중쇄 C말단의 리신 결실을 받은 다중 특이성 항체이다. 이와 같은 N말단의 파이로글루타밀화 또는 C말단 리신 결실에 의한 번역 후 수식이 항체의 활성에 영향을 미치는 것은 아님은 당해 분야에서 알려져 있다(Lyubarskaya Y et al., Anal Biochem. 2006, Vol. 348, p. 24-39).
당업자이면, 본 발명에 기초하여, 본 발명의 다중 특이성 항체와 다른 펩타이드나 단백질의 융합체를 제작하는 것이나, 수식제를 결합시킨 수식체를 제작하는 것도 가능하고, 이들 형태의 다중 특이성 항체도 본 발명의 다중 특이성 항체에 포함된다. 융합에 이용되는 다른 펩타이드나 단백질은, 융합체가 ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 각종 태그 펩타이드, 인공 헬릭스 모티프 펩타이드, 말토스 결합 단백질, 글루타티온 S트랜스페라제, 각종 독소, 그 외 다량체화를 촉진할 수 있는 펩타이드 또는 단백질 등을 들 수 있다. 수식에 이용되는 수식제는, 수식체가 ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜, 당쇄, 인지질, 리포솜, 저분자 화합물 등을 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체의 수식에 이용되는 수식제는 폴리에틸렌 글라이콜이다.
본 발명의 다중 특이성 항체는, ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH, 및, Fn14에 결합하는 항체 또는 항원 결합 프래그먼트를 포함한다. 본 발명의 다중 특이성 항체는, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합한다. ActRIIA, ActRIIB 또는 Fn14에 결합하는지 여부는, 공지된 결합 활성 측정 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA) 등의 방법을 들 수 있다. ELISA를 이용하는 경우는, 예를 들어, ActRIIA, ActRIIB 또는 Fn14 단백질을 ELISA 플레이트에 고상화하고, 이것에 대해서 피험 항체를 첨가하여 반응시킨 후, 호스 래디시 퍼옥시다제(HRP) 등의 효소로 표지한 항IgG 항체 등의 2차 항체를 반응시킨다. 반응 후, 세정한 후, 그 활성을 검출하는 시약(예를 들어, HRP 표지의 경우, TMB Microwell Peroxidase Substrate(Kirkegaard＆Perry Laboratories사, 50-76-03)) 등을 이용한 활성 측정에 의해, 2차 항체의 결합을 동정함으로써, 피험 항체가 ActRIIA, ActRIIB 또는 Fn14에 결합하는지 여부를 확인할 수 있다. 구체적인 평가 방법으로서는, 후기 실시예 5에 기재되는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 다중 특이성 항체는, 인간 ActRIIA, 인간 ActRIIB 및 인간 Fn14뿐만 아니라, 다른 동물(마우스, 원숭이 등) 유래의 ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에도 결합하는 다중 특이성 항체도 포함된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 인간 ActRIIA, 인간 ActRIIB 및 인간 Fn14에 결합한다.
본 발명의 다중 특이성 항체는, 본 명세서에 개시되는, 본 발명의 다중 특이성 항체의 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 다중 특이성 항체는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 후술하는 ＜본 발명의 다중 특이성 항체를 생산하는 방법＞에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 다중 특이성 항체는, 필요에 따라 추가로 정제된 후, 정해진 방법에 따라 제제화되어, 봉입체근염 등의 근 위축성 질환의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.
＜본 발명의 폴리뉴클레오타이드＞
본 발명은 또한, 이하의 (1)∼(4)의 폴리뉴클레오타이드(「본 발명의 폴리뉴클레오타이드」라고도 칭한다)를 제공한다:
(1) 본 발명의 다중 특이성 항체의 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드((a)의 폴리펩타이드)를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드,
(2) 본 발명의 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드,
(3) 본 발명의 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드,
(4) 본 발명의 다중 특이성 항체의 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드((a)의 폴리펩타이드)와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
하나의 실시형태에 있어서, (1)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (1)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하고, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는, 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (1)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
하나의 실시형태에 있어서, (2)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (2)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (2)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273 내지 720에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
하나의 실시형태에 있어서, (3)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (3)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (3)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및, Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하고, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는, 폴리펩타이드, 및, Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 및 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하고, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는, 폴리펩타이드, 및, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하고, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는, 폴리펩타이드, 및, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273 내지 720에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하고, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는, 폴리펩타이드, 및, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273 내지 720에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 273 내지 720에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
하나의 실시형태에 있어서, (4)의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 그의 염기 서열에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 당해 분야에서 공지된 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이와 같은 유전자 합성 방법으로서는, 국제 공개 제90/07861호에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지된 여러 가지 방법이 사용될 수 있다.
＜본 발명의 발현 벡터＞
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터(「본 발명의 발현 벡터」라고도 칭한다)를 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는, ＜본 발명의 폴리뉴클레오타이드＞의 항에 기재된 (1)∼(4)의 폴리뉴클레오타이드의 어느 것을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터에 포함되는 폴리뉴클레오타이드의 구체적인 실시형태의 예로서는, ＜본 발명의 폴리뉴클레오타이드＞의 항에 기재된 (1)∼(4)의 폴리뉴클레오타이드에 대해 기재된 것을 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는, (i) 본 발명의 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 (ii) 본 발명의 다중 특이성 항체의 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드((a)의 폴리펩타이드)와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 발현 벡터에 포함되는 상기 (i) 및 (ii)의 폴리뉴클레오타이드의 구체적인 실시형태의 예로서는, ＜본 발명의 폴리뉴클레오타이드＞의 항에 기재된 (3) 및 (4)의 폴리뉴클레오타이드에 대해 기재된 것을 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터로서는, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위해서 이용하는 발현 벡터로서는, 진핵세포(예를 들어, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모) 및/또는 원핵세포(예를 들어, 대장균)의 각종의 숙주 세포 중에서 본 발명의 다중 특이성 항체의 제1 VHH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 해당 다중 특이성 항체의 제2 VHH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하여, 이들에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 산생할 수 있는 것인 한, 특별히 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 발현 벡터로서는, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있고, 예를 들어, pEE6.4나 pEE12.4 등의 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 또한, AG-γ1이나 AG-κ(예를 들어, 국제 공개 94/20632호를 참조) 등의 미리 인간 Ig 정상 영역 유전자를 갖는 발현 벡터에 가변 영역 유전자 단편을 도입하여 항체 유전자를 발현할 수도 있다.
본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 기능 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 동물 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, CMV, RSV, SV40 등의 바이러스 유래 프로모터, 액틴 프로모터, EF(elongation factor) 1α 프로모터, 히트쇼크 프로모터 등을 들 수 있다. 세균(예를 들어, 에시리키아속균)에서 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, λPL 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 효모에서 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서 동물 세포, 곤충 세포, 또는 효모를 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈 및 종지 코돈을 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 인핸서 서열, 본 발명의 다중 특이성 항체 또는 그 중쇄 가변 영역 혹은 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자의 5＇측 및 3＇측의 비번역 영역, 분비 시그널 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 혹은 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 된다. 숙주 세포로서 대장균을 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈, 종지 코돈, 터미네이터 영역, 및 복제 가능 단위를 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 목적에 따라 통상 이용되는 선택 마커(예를 들어, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 다이하이드로엽산 환원 효소 유전자)를 포함하고 있어도 된다.
＜본 발명의 형질 전환된 숙주 세포＞
본 발명은 또한, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포(「본 발명의 형질 전환된 숙주 세포」라고도 칭한다)를 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 숙주 세포는, ＜본 발명의 폴리뉴클레오타이드＞의 항에 기재된 (1)∼(4)의 폴리뉴클레오타이드의 어느 것을 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다. 당해 발현 벡터에 포함되는 폴리뉴클레오타이드의 구체적인 실시형태의 예로서는, ＜본 발명의 폴리뉴클레오타이드＞의 항에 기재된 (1)∼(4)의 폴리뉴클레오타이드에 대해 기재된 것을 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 숙주 세포는, 이하의 (i) 및/혹은 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 또는 이하의 (i)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및/혹은 이하의 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다:
(i) 본 발명의 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(ii) 본 발명의 다중 특이성 항체의 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드((a)의 폴리펩타이드)와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 숙주 세포에 있어서의 상기 (i) 및 (ii)의 폴리뉴클레오타이드의 구체적인 실시형태의 예로서는, ＜본 발명의 폴리뉴클레오타이드＞의 항에 기재된 (3) 및 (4)의 폴리뉴클레오타이드에 대해 기재된 것을 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포에는, 이하의 (A)∼(D)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포가 포함된다.
(A) 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(B) 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(C) 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(D) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
형질 전환하는 숙주 세포로서는, 사용하는 발현 벡터에 적합하고, 해당 발현 벡터로 형질 전환되어, 다중 특이성 항체를 발현할 수 있는 것인 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 형질 전환하는 숙주 세포로서는, 예를 들어, 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 수립된 세포 등 여러 가지 세포(예를 들어, 동물 세포(예를 들어, CHO-K1SV 세포), 곤충 세포(예를 들어, Sf9), 세균(에시리키아속균 등), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등) 등)를 들 수 있고, 예를 들어, CHO 세포(CHO-K1SV 세포, CHO-DG44 세포 등), 293 세포, NS0 세포 등의 배양 세포를 사용할 수 있다.
숙주 세포를 형질 전환하는 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인산 칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 이용할 수 있다.
＜본 발명의 다중 특이성 항체를 생산하는 방법＞
본 발명은 또한, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 다중 특이성 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체를 생산하는 방법((「본 발명의 생산 방법」이라고도 칭한다))을 제공한다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 생산 방법은, 이하의 (i) 및 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 또는 이하의 (i)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 이하의 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 다중 특이성 항체를 발현시키는 공정을 포함한다:
(i) 본 발명의 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(ii) 본 발명의 다중 특이성 항체의 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드((a)의 폴리펩타이드)와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 생산 방법에 있어서의 상기 (i) 및 (ii)의 폴리뉴클레오타이드의 구체적인 실시형태의 예로서는, ＜본 발명의 폴리뉴클레오타이드＞의 항에 기재된 (3) 및 (4)의 폴리뉴클레오타이드에 대해 기재된 것을 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 생산 방법에는, 이하의 (A)∼(C)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 다중 특이성 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체를 생산할 방법이 포함된다.
(A) 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(B) 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(C) 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및,
서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
형질 전환된 숙주 세포의 배양은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, 배지의 pH, 및 배양 시간은, 적절히 선택된다. 숙주 세포가 동물 세포인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 약 5∼20%의 태아 소 혈청을 포함하는 MEM 배지(EagleH, Science. 1959, Vol. 130, p. 432-437), DMEM 배지(Dulbecco R and Freeman G, Virology. 1959, Vol. 8, p. 396-397), RPMI1640 배지(Moore GE et al., JAMA. 1967, Vol. 199, p. 519-524), 199 배지(Morgan JF et al., Proc Soc Exp Biol Med. 1950, Vol. 73, p. 1-8) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는 약 6∼8인 것이 바람직하고, 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 30∼40℃에서 약 15∼336시간 행해진다. 숙주 세포가 곤충 세포인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 태아 소 혈청을 포함하는 Grace＇s 배지(Smith GE et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1985, Vol. 82, p. 8404-8408) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는 약 5∼8인 것이 바람직하고, 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 20∼40℃에서 약 15∼100시간 행해진다. 숙주 세포가 대장균 또는 효모인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 영양 배지는, 형질 전환된 숙주 세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원 또는 유기 질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예를 들어, 글루코스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등이, 무기 질소원 또는 유기 질소원으로서는, 예를 들어, 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘 스티프 리커, 펩톤, 카제인, 고기 익스트랙트, 대두박, 감자 추출액 등을 들 수 있다. 소망에 따라 다른 영양소(예를 들어, 무기염(예를 들어, 염화 칼슘, 인산이수소 나트륨, 염화 마그네슘), 비타민류 등), 항생 물질(예를 들어, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등)을 포함하고 있어도 된다. 배지의 pH는 약 5∼8인 것이 바람직하다. 숙주 세포가 대장균인 경우, 바람직한 배지로서는, 예를 들어, LB 배지, M9 배지(Mol. Clo., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001, Vol. 3, A2.2) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 14∼39℃에서 약 3∼24시간 행해진다. 숙주 세포가 효모인 경우, 배지로서는, 예를 들어, Burkholder 최소 배지(Bostian KA et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1980, Vol. 77, p. 4504-4508) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 20∼35℃에서 약 14∼144시간 행해진다. 전술과 같은 배양에 의해, 본 발명의 다중 특이성 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 다중 특이성 항체를 생산하는 방법은, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 다중 특이성 항체를 발현시키는 공정에 더하여, 추가로, 해당 형질 전환된 숙주 세포 및/또는 배양 상청으로부터 다중 특이성 항체를 회수, 예를 들어 단리 또는 정제하는 공정을 포함할 수 있다. 단리 또는 정제 방법으로서는, 예를 들어, 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 겔 여과 등의 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 하이드록실 아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 예를 들어, 배양 상청 중에 축적된 항체는, 각종 크로마토그래피, 예를 들어, 프로틴 A 칼럼 또는 프로틴 G 칼럼을 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
본 발명의 다중 특이성 항체에는, 본 발명의 다중 특이성 항체를 생산하는 방법으로 생산된 다중 특이성 항체도 포함된다.
＜본 발명의 의약 조성물＞
본 발명은 또한, 본 발명의 다중 특이성 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물(「본 발명의 의약 조성물」이라고도 칭한다)을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물은, 당해 분야에 있어서 통상 이용되고 있는 부형제, 즉, 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 이용하여, 통상 사용되는 방법에 의해 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물의 제형의 예로서는, 예를 들어, 주사제, 점적용제 등의 비경구제를 들 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여, 및 근육내 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 제제화에 임해서는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 부형제, 담체, 첨가제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 포함해도 된다. 본 발명의 의약 조성물은, 복수종의 본 발명의 다중 특이성 항체를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체, 및, 해당 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 함유한다. 하나의 실시형태에 있어서, 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체는, (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14에 결합하는 항체(간단히 「Fn14 항체」라고도 칭한다)의 중쇄 C말단 리신의 결실을 포함한다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체 및/또는 해당 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 함유하고, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
하나의 실시형태에 있어서, 당해 번역 후 수식은, (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14 항체의 중쇄 C말단 리신의 결실이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체 및/또는 해당 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 함유하고, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fn14에 결합하는 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 당해 번역 후 수식은, (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14 항체의 중쇄 C말단 리신의 결실이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체 및/또는 해당 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 함유하고, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 273 내지 720에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 Fn14에 결합하는 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 당해 번역 후 수식은, (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14 항체의 중쇄 C말단 리신의 결실이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체 및/또는 해당 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 함유하고, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드로서, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는, 폴리펩타이드, 및,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
하나의 실시형태에 있어서, 당해 번역 후 수식은, (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14 항체의 중쇄 C말단 리신의 결실이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체 및/또는 해당 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 함유하고, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드로서, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는, 폴리펩타이드, 및,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fn14에 결합하는 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 당해 번역 후 수식은, (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14 항체의 중쇄 C말단 리신의 결실이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체 및/또는 해당 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 함유하고, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제1 VHH 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드로서, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는, 폴리펩타이드, 및,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 273 내지 720에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 Fn14에 결합하는 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 당해 번역 후 수식은, (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14 항체의 중쇄 C말단 리신의 결실이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체 및/또는 해당 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 함유하고, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드, 및,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 포함하는 Fn14에 결합하는 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 당해 번역 후 수식은, (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14 항체의 중쇄 C말단 리신의 결실이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체 및/또는 해당 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 함유하고, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드, 및,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fn14에 결합하는 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 당해 번역 후 수식은, (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14 항체의 중쇄 C말단 리신의 결실이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체 및/또는 해당 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 함유하고, 본 발명의 다중 특이성 항체는, 이하를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드, 및,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 273 내지 720에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 Fn14에 결합하는 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 당해 번역 후 수식은, (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14 항체의 중쇄 C말단 리신의 결실이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 다중 특이성 항체 및/또는 해당 다중 특이성 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 다중 특이성 항체를 함유하고, 본 발명의 다중 특이성 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 의약 조성물이다. 하나의 실시형태에 있어서, 당해 번역 후 수식은, (a)의 폴리펩타이드의 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 Fn14 항체의 중쇄 C말단 리신의 결실이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 하기 (c)∼(f) 중 1종 또는 2종 이상의 다중 특이성 항체를 함유한다:
(c) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 719까지의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 포함하는, 다중 특이성 항체.
(d) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드로서, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루타민산이 파이로글루타민산으로 수식된 폴리펩타이드 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 포함하는, 다중 특이성 항체.
(e) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 719까지의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드로서, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루타민산이 파이로글루타민산으로 수식된 폴리펩타이드 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 포함하는, 다중 특이성 항체.
(f) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 포함하는, 다중 특이성 항체.
상기 제제화에 임해서의 본 발명의 다중 특이성 항체의 첨가량은, 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 혹은 항체의 결합 역가 등에 따라 상이하지만, 예를 들어, 투여 시에 0.001mg/kg∼100mg/kg 정도가 되도록 이용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, ActRIIA, ActRIIB, Fn14가 병태 형성에 관여하는 질환, 예를 들어, 봉입체근염의 예방 또는 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에는, 본 발명의 다중 특이성 항체를 포함하는, 봉입체근염의 예방 또는 치료용 의약 조성물이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 본 발명의 다중 특이성 항체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 봉입체근염을 예방 또는 치료하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 봉입체근염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 다중 특이성 항체가 포함된다. 더욱이, 본 발명에는, 봉입체근염의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, 본 발명의 다중 특이성 항체의 사용이 포함된다.
＜ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 폴리펩타이드＞
본 발명은 또한, 이하의 ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 폴리펩타이드(이하, 「본 발명의 ActRIIA/B 결합 펩타이드」라고도 칭한다)를 제공한다:
ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 폴리펩타이드로서, ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하고,
제1 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 98부터 105까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하고,
제2 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 172부터 176까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 195부터 210까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 243부터 251까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는,
폴리펩타이드.
하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 인간화 VHH이다. 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 ActRIIA/B 결합 펩타이드에 있어서, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 연결되어 있어도 되고, 제2 VHH의 C말단이 제1 VHH의 N말단에 연결되어 있어도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 연결되어 있다.
본 발명의 ActRIIA/B 결합 펩타이드에 있어서, 제1 VHH와 제2 VHH는 직접 연결되어 있어도 되고 또는 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있어도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH와 제2 VHH는 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 인간화 VHH이며, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있다.
제1 VHH와 제2 VHH를 연결하는 펩타이드 링커는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, ＜본 발명의 다중 특이성 항체＞의 항에 있어서 제1 VHH와 제2 VHH를 연결하는 펩타이드 링커로서 예시된 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH와 제2 VHH를 연결하는 펩타이드 링커는, (Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 7))n[n는 1∼5의 정수이다]이고, 하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH와 제2 VHH를 연결하는 펩타이드 링커는, (Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)5(서열 번호 2의 아미노산 번호 117 내지 141)이다.
하나의 실시형태에 있어서, 제1 VHH 및 제2 VHH는 인간화 VHH이며, 제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있고, 해당 제1 VHH와 제2 VHH를 연결하는 펩타이드 링커가 (Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)5(서열 번호 2의 아미노산 번호 117 내지 141)이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 ActRIIA/B 결합 펩타이드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
당업자이면, 본 발명에 기초하여, 본 발명의 ActRIIA/B 결합 펩타이드와 다른 펩타이드나 단백질의 융합체를 제작하는 것이나, 수식제를 결합시킨 수식체를 제작하는 것도 가능하고, 이들 융합체 및 수식체도 본 발명의 ActRIIA/B 결합 펩타이드에 포함된다. 융합에 이용되는 다른 펩타이드나 단백질은, 융합체가 ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트, 인간 혈청 알부민, 각종 태그 펩타이드, 인공 헬릭스 모티프 펩타이드, 말토스 결합 단백질, 글루타티온 S 트랜스페라제, 각종 독소, 그 외 다량체화를 촉진할 수 있는 펩타이드 또는 단백질 등을 들 수 있다. 수식에 이용되는 수식제는, 수식체가 ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜, 당쇄, 인지질, 리포솜, 저분자 화합물 등을 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 ActRIIA/B 결합 펩타이드의 수식에 이용되는 수식제는 폴리에틸렌 글라이콜이다.
본 발명의 ActRIIA/B 결합 펩타이드, 그 융합체 및 수식체는, VHH의 서열 정보, 융합체에 사용되는 다른 펩타이드 또는 단백질(예, 항체), 수식체에 이용되는 수식제의 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 ActRIIA/B 결합 펩타이드는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, ＜본 발명의 다중 특이성 항체를 생산하는 방법＞의 항에 기재된 방법에 따라 생산할 수 있다.
본 발명에 대해 더 이해를 얻기 위해서 참조하는 특정한 실시예를 여기에 제공하지만, 이들은 예시 목적으로 하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
시판되는 키트 또는 시약 등을 이용한 부분에 대해서는, 특별히 예고가 없는 한 첨부된 프로토콜에 따라 실험을 행했다.
실시예 1: 싱글 VHH의 취득
본 발명자들은, ActRIIB의 세포외 도메인을 표적으로 하는 VHH를 취득하기 위해서, ActRIIB의 세포외 도메인을 포함하는 단백질을 알파카에게 복수회 면역했다. 면역 종료 후에 알파카로부터 채혈을 행하고, 그 채혈 샘플로부터 알파카 말초혈 림프구를 분리하여, 공지된 방법(Miyazaki N et al., J Biochem. 2015, Vol. 158, p. 205-215)에 따라 파지 디스플레이용 면역 라이브러리를 구축했다. 파지 디스플레이를 사용한 ActRIIB의 세포외 도메인에 대한 바이오패닝은, ActRIIB의 세포외 도메인을 포함하는 단백질, CHO 세포에 인간 ActRIIB 유전자(NCBI 액세션 번호: NM＿001106.4)를 도입한 안정 발현 세포주(이하, ActRIIB/CHO 세포라고 칭한다), 및, HEK293 세포에 인간 ActRIIB 유전자(NCBI 액세션 번호: NM＿001106.4)를 도입한 안정 발현 세포주(이하, ActRIIB/HEK293 세포라고 칭한다)를 대상으로 실시했다. ActRIIB의 세포외 도메인을 포함하는 단백질을 대상으로 한 바이오패닝은 공지된 방법(Miyazaki N et al., J Biochem. 2015, Vol. 158, p. 205-215)에 따라 행했다. ActRIIB/CHO 세포 또는 ActRIIB/HEK293 세포를 대상으로 한 바이오패닝에서는, 파지 라이브러리와 각 세포를 혼합하고 세정 조작을 수회 반복한 후에, 파지·세포 복합체로부터 세포에 결합한 파지를 산으로 용출시킨다,라고 하는 방법으로 각 세포에 결합한 파지의 취득을 행했다. 상기 바이오패닝에 의해, ActRIIB의 세포외 도메인에 결합하는 파지를 복수 취득했다. 취득한 파지로부터 VHH를 코딩하는 유전자를 클로닝하여, 서열 결정했다.
실시예 2: 탠덤 VHH의 취득
실시예 1에서 얻은 VHH 중, 임의의 2개의 VHH를 코딩하는 유전자를 Gly 및 Ser로 구성되는 다양한 길이의 펩타이드 링커(GS 링커라고도 칭한다)를 코딩하는 유전자로 연결한 파지 디스플레이용의 라이브러리를 복수 구축하여, 실시예 1과 마찬가지로 바이오패닝을 실시했다. 파지 디스플레이를 사용한 ActRIIA의 세포외 도메인 및 ActRIIB의 세포외 도메인에 대한 바이오패닝은, ActRIIA의 세포외 도메인을 포함하는 단백질, ActRIIB의 세포외 도메인을 포함하는 단백질, CHO 세포에 인간 ActRIIA 유전자(NCBI 액세션 번호: AB529011.1)를 도입한 안정 발현 세포주(이하, ActRIIA/CHO 세포라고 칭한다), 및, ActRIIB/CHO 세포를 대상으로 실시했다. 복수의 탠덤 VHH를 평가한 결과, ActRIIA의 세포외 도메인 및 ActRIIB의 세포외 도메인에 결합하는 탠덤 VHH를 취득했다. 이 탠덤 VHH를 75E9라고 칭한다. 그리고, 국제 공개 제2006/122825호 등의 예를 모방하여 탠덤 VHH75E9를 인간화했다. 이것을 인간화 탠덤 VHH75E9라고 칭한다.
인간화 탠덤 VHH75E9의 아미노산 서열을 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262에 나타낸다. 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262에 나타나는 인간화 탠덤 VHH75E9 중의 제1 VHH는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
인간화 탠덤 VHH75E9의 제1 VHH의 CDR1, CDR2, CDR3은 각각 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지, 50부터 65까지, 98부터 105까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 인간화 탠덤 VHH75E9의 제2 VHH의 CDR1, CDR2, CDR3은 각각 서열 번호 2의 아미노산 번호 172부터 176까지, 195부터 210까지, 243부터 251까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
실시예 3: 항Fn14 항체의 취득
본 발명자들은, 세포 표면 상에 발현하는 인간 Fn14에 결합하는 항체를 취득하기 위해, 국제 공개 제2020/090892호의 실시예 1에 따라 인간 Fn14의 세포외 도메인을 포함하는 인간 Fc 융합 단백질의 조제, 및 Jurkat 세포에 인간 Fn14 유전자(NCBI 액세션 번호: NM＿016639)를 도입한 안정 발현 세포주(이하, Fn14/Jurkat 세포라고 칭한다)의 구축을 행하여, 면역 및 스크리닝에 이용했다. 그리고, 인간 모노클로날 항체 개발 기술 「벨로시뮨」(VelocImmune antibody technology: Regeneron사(미국 특허 6596541호)) 마우스를 이용하여 항체를 제작했다. 벨로시뮨 기술에 의해 얻어진 항체는, 인간 항체의 가변 영역과 마우스 항체의 정상 영역을 갖는 항체이다. 벨로시뮨 마우스에게, 면역 반응을 야기하는 아주반트와 함께, 상기에서 제작한 인간 Fn14의 세포외 도메인을 포함하는 인간 Fc 융합 단백질로부터 FabRICATOR(Sigma사, 77661)를 이용하여 인간 Fc 영역을 절단·제거한 인간 Fn14 단백질과 Fn14/Jurkat 세포를 교대로 면역했다. 정해진 방법에 따라, 면역한 마우스의 림프절로부터 채취한 림프구를, 마우스 유래 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14(ATCC: CRL-1581)와 세포 융합함으로써 하이브리도마를 제작하고, 모노클론화했다. 인간 Fn14 및 Fn14/Jurkat 세포에 결합하고, 또한, TWEAK 자극에 의한 NF-κB의 활성화(이하, 후기 실시예에 있어서, TWEAK 유발 NF-κB 활성화라고 칭한다)를 억제하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선별했다. 그리고, 그 하이브리도마로부터, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 클로닝하여, 서열 결정했다. 이 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자(서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390을 코딩하는 염기 서열에 해당)의 3＇측에 L234A 및 L235A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역을 코딩하는 유전자를 연결하고(서열 번호 13), 5＇측에 시그널 서열을 코딩하는 유전자(Whittle N et al., Protein Eng. 1987, Vol. 1, p. 499-505)를 연결한 다음, GS 벡터 pEE6.4(Lonza사)에 삽입했다. 서열 번호 13을 아미노산으로 번역한 서열이 서열 번호 14이다. 또한, 이 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자(서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108을 코딩하는 염기 서열에 해당)의 5＇측에 상기 시그널 서열을 코딩하는 유전자를, 그리고 3＇측에 인간 κ쇄의 정상 영역을 코딩하는 유전자(서열 번호 4의 아미노산 번호 109부터 214를 코딩하는 염기 서열에 해당)를 각각 연결하여, GS 벡터 pEE12.4(Lonza사)에 삽입했다. 이들 GS 벡터로부터 중쇄와 경쇄의 양 유전자가 삽입된 Double-Gene 벡터(이하, DGV라고 칭한다)를 구축했다. 이 벡터를 트랜스펙트한 CHO-K1SV 세포의 배양 상청으로부터, 정해진 방법에 따라 항체를 정제했다. 이 항체를 STF8-1로 칭한다.
STF8-1의 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390의 아미노산 서열로 이루어진다. STF8-1의 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
STF8-1의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3은 각각 서열 번호 2의 아미노산 번호 303부터 307까지, 322부터 338까지, 371부터 379까지의 아미노산 서열로 이루어진다. STF8-1의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3은 각각 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 34까지, 50부터 56까지, 89부터 97까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
실시예 4: 인간화 75E9STF8-1의 제작
상기 시그널 서열을 코딩하는 유전자, 인간화 탠덤 VHH75E9를 코딩하는 유전자(서열 번호 1의 염기 번호 1부터 786에 해당), GS 링커를 코딩하는 유전자(서열 번호 1의 염기 번호 787 내지 816에 해당), STF8-1의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자(서열 번호 1의 염기 번호 817 내지 1170에 해당), 및, L234A 및 L235A의 아미노산 변이와 M252Y, S254T, T256E의 아미노산 변이(국제 공개 제2002/060919호)를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역을 코딩하는 유전자(서열 번호 1의 염기 번호 1171부터 2160에 해당)를 순차로 연결한 폴리뉴클레오타이드를 GS 벡터 pEE6.4(Lonza사)에 삽입했다. 또한, STF8-1의 경쇄 가변 영역 유전자(서열 번호 3의 염기 번호 1부터 324에 해당)의 5＇측에는 상기 시그널 서열을 코딩하는 유전자를, 그리고 3＇측에 인간 κ쇄의 정상 영역을 코딩하는 유전자(서열 번호 3의 염기 번호 325 내지 642에 해당)를 각각 연결하여, GS 벡터 pEE12.4(Lonza사)에 삽입했다. 이들 GS 벡터로부터 중쇄와 경쇄의 양 유전자가 삽입된 DGV를 구축했다. 이 벡터를 트랜스펙트한 CHO-K1SV 세포의 배양 상청으로부터, 정해진 방법에 따라 항체를 정제했다. 이 항체를 인간화 75E9STF8-1로 칭한다.
실시예 5: 인간화 75E9STF8-1의 결합 활성 평가
실시예 4에서 얻은 인간화 75E9STF8-1과, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14의 결합 활성을 평가했다. ActRIIA-His(LifeSpan Biosciences사, LS-G39063), ActRIIB-His(LifeSpan Biosciences사, LS-G38834) 및 실시예 3에서 조제한 인간 Fn14의 세포외 도메인을 포함하는 인간 Fc 융합 단백질을 각각 인산 버퍼 생리 식염수(PBS)로 1μg/mL로 희석하고, 각각을 맥시소프 384웰 투명 플레이트(Nunc사, 464718)에 1웰당 15μL 첨가하고, 하룻밤 4℃에서 인큐베이션함으로써 고상화했다. 다음날 고상액을 제거하고, 0.05% Tween20 함유 트리스 완충 생리 식염수(TBS-T)로 세정했다. 그 후, 20%의 Blocking One(나카라이 테스크사, 03953-95)을 포함하는 PBS를 1웰당 50μL 첨가하고, 실온에서 1시간 정치한 후, TBS-T로 세정했다. 인간화 75E9STF8-1을 최고 농도 30μg/mL부터 12단계, 4배 공비의 희석에 의해 희석 계열을 제작하여, 1웰당 20μL 첨가했다. 희석액으로서는 5%의 Blocking One을 포함하는 TBS-T를 이용했다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, TBS-T로 세정했다. 검출 항체로서 희석액(5%의 BlockingOne를 포함하는 TBS-T)으로 4000배 희석한 Goat Anti-Human Kappa, Mouse ads-HRP(SouthernBiotech, 2061-05)를, 1웰당 20μL 첨가했다. 실온에서 1.5시간 인큐베이션한 후, TBS-T로 세정하고, TMB＋Substrate-Chromogen(DAKO사, S159985)을 첨가하고 정치한 후, 1M 황산을 가하여 반응을 정지시키고, 450nm의 흡광도를 Infinite(등록상표) 200Pro(TECAN)로 측정했다.
그 결과, 인간화 75E9STF8-1은 ActRIIA-His(EC50=5.03ng/mL), ActRIIB-His(EC50=9.24ng/mL) 및 인간 Fn14의 세포외 도메인을 포함하는 인간 Fc융합 단백질(EC50=23.3ng/mL)의 어느 것에도 결합했다.
실시예 6: 인간화 75E9STF8-1의 Smad 인산화 저해 평가
인간화 75E9STF8-1의 ActRIIA 및 ActRIIB에 있어서의 미오스타틴 유발 Smad3 인산화에 대한 저해 작용을 평가했다. HEK293 세포에 인간 ActRIIA 유전자(NCBI 액세션 번호: AB529011.1)를 도입한 안정 발현 세포주(이하, ActRIIA/HEK293 세포라고 칭한다), 및 ActRIIB/HEK293 세포를 평가에 이용했다.
ActRIIA/HEK293 세포 또는 ActRIIB/HEK293 세포를 10% 소 태아 혈청 함유 DMEM(Sigma사, D6429)으로 2×105cells/mL로 현탁하고, 콜라겐 I 코트 96웰 플레이트(IWAKI사, 4860-010)에 1웰당 100μL 파종했다. 그것을, 37℃, 5% CO2로 설정한 CO2 인큐베이터로 하룻밤 배양했다. 배양 후, 배지를 원심 제거하고, 2% 소 태아 혈청 함유 DMEM을 각 웰에 80μL씩 첨가했다. 그것을, 상기와 동 조건의 CO2 인큐베이터로 하룻밤 배양했다. 인간화 75E9STF8-1에 대해, ActRIIA/HEK293 세포에는 최고 농도 300nmol/L부터, ActRIIB/HEK293 세포에는 최고 농도 1000nmol/L부터 각각 8단계, 약 3배 공비의 희석에 의해 희석 계열을 제작하고, 1웰당 10μL 첨가했다. 또한, 대조로서 동 희석 계열의 Bimagrumab를 첨가했다. 희석 용매로서는 2% 소 태아 혈청 함유 DMEM을 사용했다. 그것을, 상기와 동 조건의 CO2 인큐베이터로 15분 배양했다. 그 후, 2% 소 태아 혈청 함유 DMEM에서 조제한 미오스타틴(PEPROTECH사, 120-00)을 최종 농도 100ng/mL가 되도록 1웰당 10μL 첨가했다. 상기와 동 조건의 CO2 인큐베이터로 1시간 배양한 후, 배지를 원심 제거하고, AlphaLISA(등록상표) SureFire(등록상표) UltraTM SMAD3(p-Ser423/425) 어세이 키트(PerkinElmer사, ALSU-PSM3) 내의 Lysis buffer를 1웰당 50μL 첨가하고 실온에서 10분간 교반하여 세포를 용해했다. 세포 용해액 중의 인산화 Smad3을, 상기 키트를 이용하여 검출했다. 결과는, 미오스타틴 100ng/mL 자극 조건하의 측정치를 0% 저해, 미오스타틴 비존재하의 측정치를 100% 저해로 하는 저해율로 나타냈다. 미오스타틴 비존재하의 측정은, 미오스타틴 대신에 배지를 첨가하여 실시했다. 한편, 데이터는 2 시행(각 시행은 듀플리케이트로 실시)의 평균치를 나타낸다.
그 결과, 인간화 75E9STF8-1은, ActRIIA/HEK293 세포 및 ActRIIB/HEK293 세포에 있어서, 미오스타틴에 의해 유도되는 Smad3의 인산화를 저해했다(도 1).
실시예 7: 인간화 75E9STF8-1의 안타고니스트 활성 평가 및 아고니스트 활성 평가
TWEAK 존재하 또는 비존재하에서 Fn14가 활성화되면, 하류 시그널로서 NF-κB가 활성화된다. 인간화 75E9STF8-1의 안타고니스트 활성 평가를 위해, 이 시그널을 지표로 하여, 인간 Fn14에 있어서의 TWEAK 유발 NF-κB 활성화의 저해 작용을 평가했다. 또한, 인간화 75E9STF8-1의 아고니스트 활성 평가로서, TWEAK 비존재하에서의 NF-κB 활성화 작용을 평가했다. 구체적으로는, TWEAK 존재하 또는 비존재하에서의 인간화 75E9STF8-1의 NF-κB 활성화에 대한 작용을, 리포터 어세이로 평가했다. NF-κB 전사 응답 서열이 짜넣어진 루시페라제 리포터 벡터 pGL4.32(Promega사, E8491)를 안정적으로 도입한 HEK293 세포(이하, NF-κB/HEK293 세포라고 칭한다)를 제작하여, 평가에 이용했다.
NF-κB/HEK293 세포를 10% 소 태아 혈청 함유 DMEM(Sigma사, D6429)으로 1.25x105cells/mL에 현탁하고, 클리어 보텀 백색 96웰 플레이트(Corning사, 3610)에 1웰당 80μL 파종했다. 그것을, 37℃, 5% CO2로 설정한 CO2 인큐베이터로 2시간 배양했다. 인간화 75E9STF8-1에 대해 상기 배지로 희석 계열을 제작한 후, 1웰당 10μL 첨가했다. 각 웰 내의 최종 농도는, 안타고니스트 활성 평가에서는 최고 농도 100nmol/L부터 11단계(약 3배 공비), 아고니스트 활성 평가에서는 최고 농도 300nmol/L부터 11단계(약 3배 공비)로 했다. 또한, 대조로서 동 희석 계열의 STF8-1을 첨가했다. 안타고니스트 활성 평가에서는, 각 웰에, 상기 배지로 조제한 TWEAK(PEPROTECH사, 310-06)를 최종 농도 100ng/mL가 되도록 10μL 첨가했다. 아고니스트 활성 평가에서는, 각 웰에 상기 배지를 10μL 첨가했다. 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 배양한 후, 루시페라제 측정 시약 ONE-GloTM Luciferase Assay System(Promega사, E6120)를 이용하여, 루시페라제 발현량을 측정하는 것에 의해, NF-κB 활성화를 정량화했다. 결과는, 안타고니스트 활성 평가에서는 TWEAK 100ng/mL 자극 조건하의 측정치를 0% 저해, TWEAK 비존재하의 측정치를 100% 저해로 하는 저해율로 나타내고, 아고니스트 활성 평가에서는 TWEAK 100ng/mL 자극 조건하의 측정치를 100%, TWEAK 비존재하의 측정치를 0%로 하는 활성화율로 나타냈다. TWEAK 비존재하의 측정은, TWEAK 대신에 배지를 첨가하여 실시했다. 한편, 데이터는 2 시행(각 시행은 듀플리케이트로 실시)의 평균치를 나타낸다.
그 결과, 인간화 75E9STF8-1은 100ng/mL의 TWEAK에 의한 Fn14를 개재시킨 NF-κB 활성화를 완전히 저해했다. 또한, 인간화 75E9STF8-1은 TWEAK 비존재하에서의 NF-κB 활성화를 유도하지 않았다(도 2). 따라서, 인간화 75E9STF8-1은 안타고니스트 활성을 갖지만, 아고니스트 활성은 갖지 않음이 인정되었다.
실시예 8: 마우스 in vivo 약효 평가에서 이용하는 항체의 조제와 기능 평가
마우스 in vivo 약효 평가를 위하여, 인간화 탠덤 VHH75E9, STF8-1, 및, 인간화 75E9STF8-1의 아미노산 서열에 기초하여, 75E9(mFc), STF8-1(mFc), 및, 75E9STF8-1(mFc)을 각각 조제했다. 75E9(mFc)는 실시예 2에 있어서의 탠덤 VHH의 75E9의 C말단에 mouse IgG1 중쇄 정상 영역의 Hinge, CH2, 및, CH3을 연결한 항체이다(서열 번호 15). STF8-1(mFc)은 실시예 3의 STF8-1의 정상 영역을 중쇄, 경쇄 모두 마우스 정상 영역으로 치환한 항체인 (STF8-1(mFc)의 중쇄를 서열 번호 16에, STF8-1(mFc)의 경쇄를 서열 번호 17에 나타낸다). 75E9STF8-1(mFc)은, 실시예 2의 75E9의 C말단에 STF8-1(mFc) 중쇄의 N말단을 펩타이드 링커(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열 번호 7))2로 연결한 폴리펩타이드(서열 번호 18), 및 STF8-1(mFc)의 경쇄로 이루어지는 항체이다.
75E9STF8-1(mFc)의 제1 VHH의 CDR1, CDR2, CDR3 및 75E9STF8-1(mFc)의 제2 VHH의 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열은 각각 인간화 75E9STF8-1의 제1 VHH의 CDR1, CDR2, CDR3 및 인간화 75E9STF8-1의 제2 VHH의 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열과 동일하다. 더욱이, 75E9STF8-1(mFc)에 포함되는 STF8-1(mFc)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 각각 인간화 75E9STF8-1에 포함되는 STF8-1의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 동일하다.
75E9(mFc), 및, 75E9STF8-1(mFc)은, 실시예 6에 기재된 기능 평가를 행하여 Smad 인산화 저해 활성이 있음을 확인했다. 또한, 실시예 7에 기재된 기능 평가를 행하여, STF8-1(mFc), 및, 75E9STF8-1(mFc)은, 안타고니스트 활성이 있음을, 75E9STF8-1(mFc)에는 아고니스트 활성이 없음을 확인했다.
실시예 9: 스테로이드 유발 미오파시 모델 마우스에 대한 in vivo 약효 평가
마우스에 있어서, 근 중량 및 악력을 지표로 하여, 근 위축과 근 기능에 대한 in vivo 약효를 평가했다. 근 위축 모델 동물로서, 스테로이드의 지속 투여에 의한 스테로이드 유발 미오파시 모델(SIM 모델)을 이용하고, 피험 물질의 연속 투여 후 14일째에 사지 악력 및 적출 대퇴사두절 중량을 측정했다.
마우스의 체중 및 악력을 측정하여, 체중 및 악력이 군 사이에서 균등해지도록 각 군 10예씩 할당했다. 군 구성은, 정상군을 1군, SIM 모델군을 5군의 전체 6군으로 하고, SIM 모델의 5군은 용매 투여군, 75E9(mFc)군, STF8-1(mFc)군, 75E9(mFc)＋STF8-1(mFc)군, 75E9STF8-1(mFc)군으로 했다. SIM 모델군에는 코르티코스테론(100μg/mL의 농도로 에탄올을 1% 혼합한 여과수에 용해)을 자유 음수로 14일간 지속 음수 투여하여, 근 위축을 유발했다. 한편, 정상군에는 여과수를 자유 음수시켰다. 코르티코스테론의 투여 개시와 같은 날부터 피험 물질 1 및 피험 물질 2의 투여를 개시했다. 각 군의 피험 물질 투여의 상세는 표 1에 나타낸다. 한편, 75E9STF8-1(mFc)군의 용량은 각각의 단독 투여군의 투여량과 동일한 정도의 몰농도가 되도록 설정했다. 피험 물질 투여 개시 후 14일에, 소동물 악력 측정 장치(MELQUEST사, GPM-100)로 악력 측정을 실시했다. 그 후, 마우스를 마취하 방혈 치사하고, 대퇴사두절을 적출하여 중량을 측정했다.
Figure pct00001
그 결과, 75E9(mFc) 또는 STF8-1(mFc)은, SIM 모델의 골격근 위축 및 악력 저하를 부분적으로 억제했다. 더욱이, 75E9(mFc)와 STF8-1(mFc)의 혼합 처치에 의해, 각각의 단독 투여보다 유의하게 강한 골격근 위축 억제 작용 및 악력 저하 억제 작용을 나타냈다. 또한, 75E9STF8-1(mFc)은 75E9(mFc)와 STF8-1(mFc)의 혼합 처치와 비교하여 유의하게 강한 골격근 위축 억제 작용 및 악력 저하 억제 작용을 나타냈다(도 3).
실시예 10: 스테로이드 유발 미오파시 모델 원숭이에 대한 in vivo 약효 평가
스테로이드 유발 미오파시 모델의 필리핀원숭이에 있어서, 피험 물질의 투여 후 4주에 있어서의 대퇴부 제지방 중량에 대한 in vivo 약효를 평가했다. 한편, 제지방 중량은 지방을 제외한 근, 골, 혈액 등의 총 중량이며, 골격근량과 상관함이 알려져 있다(Walowski CO et al., Nutrients. 2020, Vol. 12, 755).
이중 에너지 X선 흡수 측정법에 의한 골밀도 측정 장치(Hologic사, Discovery C)로 필리핀원숭이의 대퇴부 제지방 중량을 측정하고, 군 사이에서 균등해지도록 4군에 할당했다. 군 구성은, 정상군(n=2), SIM 모델군을 3군(각 군 n=3)의 전체 4군으로 하고, SIM 모델의 3군은 용매 투여군, 인간화 75E9STF8-1군 및, Bimagrumab군으로 했다. SIM 모델군에는 프레드니솔론(30mg/3mL/kg)을 4-5일/주에 1일 2회 배부(背部) 피하에 투여하여, 근 위축을 유발했다. 정상군에는 생리 식염수를 마찬가지로 배부 피하에 투여했다. 피험 물질은, 정상군 및 용매 투여군에는 PBS를, 인간화 75E9STF8-1군에는 인간화 75E9STF8-1 40mg/2.4mL/kg을, Bimagrumab군에는 Bimagrumab 30mg/2.4mL/kg을, 프레드니솔론 투여 1일째에 정맥내 투여했다. 투여 용량은, 인간화 75E9STF8-1과 Bimagrumab의 투여 몰수가 동일한 정도가 되도록 설정했다. 피험 물질 투여 후 4주에, 대퇴부 제지방 중량 측정을 실시했다. 좌우 각각의 대퇴부에서 제지방 중량을 측정하고, 그 평균치를 개체의 측정치로 했다.
그 결과, SIM 모델 원숭이에 있어서, 인간화 75E9STF8-1군의 대퇴부 제지방 중량은, 용매 투여군의 대퇴부 제지방 중량과 비교하여 유의하게 무거웠다. Bimagrumab군은, 용매 투여군과 비교하여 유의한 차이는 인정되지 않았다(도 4).
본 발명의 다중 특이성 항체는, 인간 ActRIIA, 인간 ActRIIB 및 인간 Fn14가 병태 형성에 관여하는 각종 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터, 형질 전환된 숙주 세포 및 항체를 생산하는 방법은, 상기 다중 특이성 항체를 생산하는 데 유용하다고 기대된다.
이하의 서열목록의 숫자 표제＜223＞에는, 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 구체적으로는 서열목록의 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열은, 다중 특이성 항체의 제1 VHH, 해당 다중 특이성 항체의 제2 VHH, 및 해당 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체의 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열이며, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열은, 해당 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열이다. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열은, 서열 번호 1에 의해 코딩되는 해당 다중 특이성 항체의 제1 VHH, 해당 다중 특이성 항체의 제2 VHH, 및 해당 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체의 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드이며, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열은, 서열 번호 3에 의해 코딩되는 해당 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체의 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열 번호 5∼12는 예시적인 펩타이드 링커의 아미노산 서열이다. 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열은, Fn14에 결합하는 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열이며, 서열 번호 14로 표시되는 아미노산 서열은, 서열 번호 13의 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열이다. 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열은, 탠덤 VHH의 C말단에 마우스 정상 영역을 연결한 항체의 아미노산 서열이다. 서열 번호 16로 표시되는 아미노산 서열은, Fn14에 결합하는 항체의 중쇄의 아미노산 서열이며, 서열 번호 17로 표시되는 아미노산 서열은, Fn14에 결합하는 항체의 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열 번호 18로 표시되는 아미노산 서열은, 탠덤 VHH, 및 Fn14에 결합하는 항체의 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드이다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> Multispecific antibody binding to ActRIIA,ActRIIB,and Fn14 <130> A22003A00 <150> JP 2021-003805 <151> 2021-1-13 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2160 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NMA_75E9S81.5_h1y_HC <220> <221> CDS <222> (1)..(2160) <400> 1 gaa gtg cag ctg gtt gaa tct ggc ggc gga ttg gtt cag cct ggc gga 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tct ctg aga ctg tct tgc gcc gcc tcc aga tcc atc ttt gcc tac ggc 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Phe Ala Tyr Gly 20 25 30 acc atg gcc tgg tac aga cag gct cct ggc aag ggc aga gaa ctg gtg 144 Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 gct aca atc tct ggc gga ggc acc acc tcc tac tcc gac tct gtg aag 192 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys 50 55 60 ggc aga ttc acc atc tcc aga gac aac ggc aag tcc acc gtg tac ctg 240 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Ser Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 cag atg aac tcc ctg aga gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc aac 288 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 aag cgg tct atc ggc acc aac gat ttc tgg ggc cag ggc aca ctg gtc 336 Lys Arg Ser Ile Gly Thr Asn Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 aca gtt tct agc gga ggc gga gga tca ggt ggc ggt gga agt ggt ggt 384 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 ggc gga agt ggc ggc ggt gga tca ggc ggt ggc gga tct gaa gtt cag 432 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 130 135 140 ctc gtg gaa agt ggc gga gga ctg gtg caa cca ggt gga agt ctg cgg 480 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 145 150 155 160 ctg tct tgt gct gcc tct ggc ttc acc ctg acc acc aac gct ctg atc 528 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Thr Thr Asn Ala Leu Ile 165 170 175 tgg ggc aga caa gct cca ggt gct gct cct gga aaa ggc cct gaa tgg 576 Trp Gly Arg Gln Ala Pro Gly Ala Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp 180 185 190 gtg gcc ggc atc aga gct gat ggc aga cct tac tac ggc gac tcc atg 624 Val Ala Gly Ile Arg Ala Asp Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Asp Ser Met 195 200 205 aag gga aga gtg acc atc agc cgg gat atc gcc aag aac acc gcc tat 672 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Ala Tyr 210 215 220 ctc cag atg aac agc ctg cgg cct gag gat aca gct gtg tac ttc tgc 720 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240 gcc acc aga ctg gac gac tct ggc acc tac gat aga ggc aga ggc aca 768 Ala Thr Arg Leu Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asp Arg Gly Arg Gly Thr 245 250 255 acc gtg acc gtg tct agt ggc ggc gga gga agc ggc gga ggc gga agc 816 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 260 265 270 gaa gtt cag ttg gtt gag tca ggc gga ggc ctc gtg aaa cct ggc ggt 864 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 275 280 285 agc ctc aga ctt tcc tgt gcc gct tct ggc atc acc ttc tcc acc tac 912 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Thr Tyr 290 295 300 ggc atg aac tgg gtc cga cag gca cca ggc aaa gga ctg gaa tgg gtg 960 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 305 310 315 320 tcc tcc atc tcc tct cgg tcc atc cac atc agc tac gcc gac agc gtg 1008 Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Ile His Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val 325 330 335 aaa ggc cgg ttc acc atc agc aga gat aat gcc aaa aac tcc ctc tac 1056 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 340 345 350 ttg cag atg tcc tct ctg cgg gcc gac gat act gcc gtg tat tat tgc 1104 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 355 360 365 gcc aga gac aga ggc gcc gct gcc ttc gat tat tgg ggc aga gga aca 1152 Ala Arg Asp Arg Gly Ala Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr 370 375 380 ctg gtg gcc gtg tcc tcc gct tct acc aag gga cct tct gtg ttc cct 1200 Leu Val Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 385 390 395 400 ctg gct ccc tcc agc aag tct act tct ggc gga aca gct gcc ctg ggc 1248 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 405 410 415 tgc ctg gtc aag gat tac ttt cct gag cct gtg aca gtg tcc tgg aac 1296 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 420 425 430 tct ggc gct ctg aca tct ggc gtg cac acc ttt cca gct gtg ctg cag 1344 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 435 440 445 tcc tct ggc ctg tac tct ctg tcc tcc gtc gtg aca gtg cct tcc agc 1392 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 450 455 460 tct ctg ggc acc cag acc tac atc tgt aat gtg aac cac aag cct tcc 1440 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 465 470 475 480 aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag tcc tgc gac aag acc 1488 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 485 490 495 cac acc tgt cca cca tgt cct gct cca gaa gct gct ggc ggc cca tcc 1536 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 500 505 510 gtg ttt ctg ttc cct cca aag cct aag gac acc ctg tac atc acc cgc 1584 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg 515 520 525 gag cct gaa gtg acc tgc gtg gtg gtc gat gtg tct cac gag gac ccc 1632 Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 530 535 540 gaa gtg aag ttt aat tgg tac gtg gac ggc gtc gag gtg cac aac gct 1680 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 545 550 555 560 aag acc aag cct aga gag gaa cag tac aac agc acc tac aga gtg gtg 1728 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 565 570 575 tcc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gat tgg ctg aac ggc aaa gag tac 1776 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 580 585 590 aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg cct gct cct atc gaa aag acc 1824 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 595 600 605 atc tct aag gcc aag ggc cag cct cgg gaa ccc cag gtt tac aca ttg 1872 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 610 615 620 cca cct tct cgg gac gag ctg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt 1920 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 625 630 635 640 ctc gtg aag ggc ttc tac ccc tcc gat atc gcc gtg gaa tgg gag tct 1968 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 645 650 655 aat ggc cag cca gag aac aac tac aag aca acc cct cct gtg ctg gac 2016 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 660 665 670 tcc gac ggc tca ttc ttt ctg tac tcc aag ctg aca gtg gac aag tcc 2064 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 675 680 685 aga tgg cag cag ggc aac gtg ttc tcc tgc agc gtg atg cac gag gcc 2112 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 690 695 700 ctg cac aat cac tac acc cag aag tcc ctg tct ctg tcc cct ggc aaa 2160 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 705 710 715 720 <210> 2 <211> 720 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Phe Ala Tyr Gly 20 25 30 Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Ser Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Lys Arg Ser Ile Gly Thr Asn Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 130 135 140 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 145 150 155 160 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Thr Thr Asn Ala Leu Ile 165 170 175 Trp Gly Arg Gln Ala Pro Gly Ala Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp 180 185 190 Val Ala Gly Ile Arg Ala Asp Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Asp Ser Met 195 200 205 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Ala Tyr 210 215 220 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240 Ala Thr Arg Leu Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asp Arg Gly Arg Gly Thr 245 250 255 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 260 265 270 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 275 280 285 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Thr Tyr 290 295 300 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 305 310 315 320 Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Ile His Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val 325 330 335 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 340 345 350 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 355 360 365 Ala Arg Asp Arg Gly Ala Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr 370 375 380 Leu Val Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 385 390 395 400 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 405 410 415 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 420 425 430 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 435 440 445 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 450 455 460 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 465 470 475 480 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 485 490 495 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 500 505 510 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg 515 520 525 Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 530 535 540 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 545 550 555 560 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 565 570 575 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 580 585 590 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 595 600 605 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 610 615 620 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 625 630 635 640 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 645 650 655 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 660 665 670 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 675 680 685 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 690 695 700 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 705 710 715 720 <210> 3 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STF_8-1_h1g_LC <220> <221> CDS <222> (1)..(642) <400> 3 gcc atc cag atg acc cag tct cca tcc tct ctg tcc gcc tct gtg ggc 48 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc tct cag gcc atc tcc aac gac 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Asn Asp 20 25 30 ctc ggc tgg tat cag cag aag cct ggc aag gct ccc aag ctg ctg atc 144 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac gac gcc atc tct ctg cag tct ggc gtg ccc tct aga ttc tcc ggc 192 Tyr Asp Ala Ile Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 tct ggc tct ggc acc gac ttt acc ctg aca atc tcc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gag gac ttc gcc acc tac tac tgc ctg caa gac ttc aac tac cct cgg 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Arg 85 90 95 acc ttt ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgg aca gtg gcc gct 336 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 cct tcc gtg ttc atc ttc cca cct tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc 384 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 aca gct tct gtc gtg tgc ctg ctg aac aac ttc tac ccc aga gaa gcc 432 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gca ctg cag tcc ggc aac tcc caa 480 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 gag tct gtg acc gag cag gac tcc aag gac agc acc tac agc ctg tcc 528 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 tcc aca ctg acc ctg tcc aag gcc gac tac gaa aag cac aag gtg tac 576 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 gcc tgc gaa gtg acc cat cag ggc ctg tct agc cct gtg acc aag tct 624 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 ttc aac cgg ggc gag tgc 642 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ile Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 5 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 6 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 7 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 8 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 9 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 10 Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 11 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 12 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 13 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STF_8-1_h1g_HC <220> <221> CDS <222> (1)..(1344) <400> 13 gaa gtg cag ctg gtt gaa tct ggc ggc gga ctg gtt aag cct ggc gga 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 tct ctg aga ctg tct tgt gcc gct tcc ggc atc acc ttc tcc acc tac 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 ggc atg aac tgg gtc cga cag gct cct ggc aaa ggc ctg gaa tgg gtg 144 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tcc tcc atc tcc agc cgg tcc atc cac atc tct tac gcc gac tcc gtg 192 Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Ile His Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc aga ttc acc atc agc cgg gac aac gcc aag aac tcc ctg tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 ctg cag atg tcc agc ctg aga gcc gat gac acc gcc gtg tac tac tgc 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc aga gat aga ggc gcc gct gcc ttc gat tat tgg ggc aga gga aca 336 Ala Arg Asp Arg Gly Ala Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 ctg gtg gcc gtg tcc tct gct tcc acc aag gga cct tcc gtg ttt ccc 384 Leu Val Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 ctg gct cct tcc agc aag tct acc tct ggt ggc aca gct gct ctg ggc 432 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 tgc ctg gtc aag gat tac ttc cct gag cct gtg acc gtg tcc tgg aac 480 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 tct ggc gct ctg aca tct ggc gtg cac acc ttt cca gct gtg ctg cag 528 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 tcc tcc ggc ctg tac tct ctg tcc tct gtc gtg acc gtg cct tcc agc 576 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 tct ctg gga acc cag acc tac atc tgc aat gtg aac cac aag cct tcc 624 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag tcc tgc gac aag acc 672 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 cac acc tgt cca cca tgt cct gct cca gaa gct gct ggc ggc cct tct 720 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 gtg ttt ctg ttc cct cca aag cct aag gac acc ctg atg atc tct cgg 768 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 acc cct gaa gtg acc tgc gtg gtg gtg gat gtg tct cac gag gat ccc 816 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aat gcc 864 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 aag acc aag cct aga gag gaa cag tac aac agc acc tac aga gtg gtg 912 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 tcc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gat tgg ctg aac ggc aaa gag tac 960 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg cct gct cct atc gaa aag acc 1008 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 atc tcc aag gcc aag ggc cag cct agg gaa ccc cag gtt tac acc ttg 1056 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 cca cct tct cgg gac gag ctg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgc 1104 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 ctc gtg aag gga ttc tac ccc tcc gat atc gcc gtg gaa tgg gag tct 1152 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 aat ggc cag cca gag aac aac tac aag aca acc cct cct gtg ctg gac 1200 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 tcc gac ggc tca ttc ttt ctg tac tcc aag ctg aca gtg gac aag tcc 1248 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 aga tgg cag cag ggc aac gtg ttc tcc tgc agc gtg atg cac gag gcc 1296 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 ctg cac aat cac tac acc cag aag tcc ctg tct ctg tcc cct ggc aag 1344 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 14 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Ile His Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 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Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 15 <211> 489 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NMA_75E9.2_m10_HC <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Phe Ala Tyr Gly 20 25 30 Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Ser Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Lys Arg Ser Ile Gly Thr Asn Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln 130 135 140 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Thr 145 150 155 160 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Thr Thr Asn Ala Leu Ile 165 170 175 Trp Gly Arg Gln Ala Pro Gly Ala Ala Pro Gly Glu Gly Pro Glu Trp 180 185 190 Val Ala Gly Ile Arg Ala Asp Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Asp Ser Met 195 200 205 Lys Gly Arg Val Thr Val Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Ala Tyr 210 215 220 Leu Gln Met Thr Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240 Ala Thr Arg Leu Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asp Arg Gly Arg Gly Thr 245 250 255 Gln Val Thr Val Ser Ser Val Pro Arg Asp Ser Gly Cys Lys Pro Cys 260 265 270 Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 275 280 285 Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 290 295 300 Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe 305 310 315 320 Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu 325 330 335 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His 340 345 350 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala 355 360 365 Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg 370 375 380 Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met 385 390 395 400 Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro 405 410 415 Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn 420 425 430 Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val 435 440 445 Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr 450 455 460 Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu 465 470 475 480 Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 485 <210> 16 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STF_8-1.2_m10_HC <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Ile His Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ala Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ala Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr 180 185 190 Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 210 215 220 Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp 260 265 270 Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 305 310 315 320 Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335 Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln 340 345 350 Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe 355 360 365 Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu 370 375 380 Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe 385 390 395 400 Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn 405 410 415 Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 420 425 430 Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 17 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STF_8-1.2_m10_LC <400> 17 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ile Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 18 <211> 714 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NMA_75E9STF8-1_m10_HC <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Phe Ala Tyr Gly 20 25 30 Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Ser Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Lys Arg Ser Ile Gly Thr Asn Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln 130 135 140 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Thr 145 150 155 160 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Thr Thr Asn Ala Leu Ile 165 170 175 Trp Gly Arg Gln Ala Pro Gly Ala Ala Pro Gly Glu Gly Pro Glu Trp 180 185 190 Val Ala Gly Ile Arg Ala Asp Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Asp Ser Met 195 200 205 Lys Gly Arg Val Thr Val Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Ala Tyr 210 215 220 Leu Gln Met Thr Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240 Ala Thr Arg Leu Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Asp Arg Gly Arg Gly Thr 245 250 255 Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 260 265 270 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 275 280 285 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Thr Tyr 290 295 300 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 305 310 315 320 Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Ile His Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val 325 330 335 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 340 345 350 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 355 360 365 Ala Arg Asp Arg Gly Ala Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr 370 375 380 Leu Val Ala Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 385 390 395 400 Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly 405 410 415 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 420 425 430 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 435 440 445 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr 450 455 460 Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 465 470 475 480 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 485 490 495 Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 500 505 510 Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 515 520 525 Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp 530 535 540 Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu 545 550 555 560 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met 565 570 575 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 580 585 590 Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 595 600 605 Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln 610 615 620 Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe 625 630 635 640 Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu 645 650 655 Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe 660 665 670 Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn 675 680 685 Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 690 695 700 Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 705 710

Claims (32)

  1. ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체로서,
    (a) ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하는 폴리펩타이드, 및
    (b) Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트
    를 포함하고,
    제1 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 98부터 105까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하고,
    제2 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 172부터 176까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 195부터 210까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 243부터 251까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하고,
    (a)의 폴리펩타이드의 C말단이 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는,
    다중 특이성 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제1 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 116까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VHH가 서열 번호 2의 아미노산 번호 142부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중 특이성 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제1 VHH의 C말단이 제2 VHH의 N말단에 펩타이드 링커를 개재시켜 연결되어 있는, 다중 특이성 항체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    (a)의 폴리펩타이드가 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 262까지의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중 특이성 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 303부터 307까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 322부터 338까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 371부터 379까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 4의 아미노산 번호 89부터 97까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 다중 특이성 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 다중 특이성 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fn14에 결합하는 항체를 포함하고, 해당 Fn14에 결합하는 항체가, L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는, 다중 특이성 항체.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fn14에 결합하는 항체를 포함하고, 해당 Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 390까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 L234A, L235A, M252Y, S254T, 및 T256E의 아미노산 변이를 갖는 중쇄 정상 영역을 포함하는 중쇄, 및, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 108까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 다중 특이성 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fn14에 결합하는 항체를 포함하고, 해당 Fn14에 결합하는 항체가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 273부터 720까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 다중 특이성 항체.
  10. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 다중 특이성 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    번역 후 수식을 받은, 다중 특이성 항체.
  12. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 (a)의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 (a)의 폴리펩타이드와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  19. 제 14 항 및/또는 제 15 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  20. 제 16 항 및/또는 제 17 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  22. 이하의 (i) 및/혹은 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 또는 이하의 (i)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및/혹은 이하의 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포:
    (i) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (ii) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 (a)의 폴리펩타이드와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  23. 이하의 (A)∼(D)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 숙주 세포:
    (A) 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (B) 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (C) 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (D) 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  24. 이하의 (i) 및 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 또는 이하의 (i)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터와 이하의 (ii)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 다중 특이성 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체를 생산하는 방법:
    (i) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (ii) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 (a)의 폴리펩타이드와 Fn14에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  25. 이하의 (E)∼(G)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 다중 특이성 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성 항체를 생산하는 방법:
    (E) 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (F) 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (G) 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 제 10 항에 기재된 다중 특이성 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  26. 제 24 항에 기재된 방법으로 생산된 다중 특이성 항체.
  27. 제 25 항에 기재된 방법으로 생산된 다중 특이성 항체.
  28. 제 1 항 내지 제 11 항, 제 26 항 및 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체, 및, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서,
    봉입체근염의 예방 또는 치료용 의약 조성물인, 의약 조성물.
  30. 제 1 항 내지 제 11 항, 제 26 항 및 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 봉입체근염을 예방 또는 치료하는 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 11 항, 제 26 항 및 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    봉입체근염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 다중 특이성 항체.
  32. 봉입체근염의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, 제 1 항 내지 제 11 항, 제 26 항 및 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 다중 특이성 항체의 사용.
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