CN107614683B

CN107614683B - 新型抗人NGF抗体Fab片段

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Publication number: CN107614683B
Application number: CN201680029680.7A
Authority: CN
Inventors: 田中祐嗣; 藤田大雅; 青木俊明
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2016-05-20
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2036-05-20
Also published as: US20180147281A1; MA42138A; IL255832B; BR112017025029A2; KR102440054B1; PH12017502126A1; KR20180006391A; CN107614683A; JPWO2016190263A1; RU2017145071A; CO2017012397A2; TWI706959B; CA2986210C; RU2017145071A3; ZA201708169B; US11260124B2; AU2016268625A1; MX2017014911A; RU2729825C2; IL255832A

Abstract

本发明提供了一种保持高的中和活性、并且在表现出局部药效的同时还减少了由全身暴露所引起的全身性副作用的优异的抗人NGF抗体片段，以及使用了该抗体片段的术后疼痛治疗方法。一种抗人NGF抗体Fab片段，其包含由序列编号5所示的氨基酸序列构成的重链片段以及由序列编号8所示的氨基酸序列构成的轻链。

Description

新型抗人NGF抗体Fab片段

技术领域

本发明涉及一种新型抗人NGF抗体Fab片段。本发明还涉及包含编码该抗人NGF抗体Fab片段的碱基序列的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体、及经该表达载体转化了的宿主细胞、以及生产该抗人NGF抗体Fab片段的方法。本发明进一步涉及包含该抗人NGF抗体Fab片段的医药组合物、以及使用该抗人NGF抗体Fab片段来治疗术后疼痛的方法。

背景技术

神经生长因子(nerve growth factor；NGF)是总称为神经营养因子(neurotrophic factor)的体液因子中的一种，在生物体内在神经元的产生、分化、功能维持方面担负着重要的作用。作为NGF的受体，已知有高亲和性的trkA(tropomyosinreceptor kinase A(原肌球蛋白受体激酶A))和低亲和性的p75NTR(p75neurotrophinreceptor(p75神经营养因子受体))。其中，p75NTR虽然被报道与全部的神经营养因子结合，在神经元的产生过程中与细胞凋亡相关，但是其作用尚未完全阐明。另一方面，已知在NGF和trkA的基因敲除小鼠之间可看出相同的表型(非专利文献1)，据认为NGF的生理作用主要经由trkA而表达。

据报道，当向大鼠给药NGF时会诱发疼痛(非专利文献2)，此外，据报道，当向人静脉内给药NGF时会产生全身性的肌肉疼痛，另外，通过NGF的局部给药，不仅会诱发全身性的疼痛，而且会在给药部位诱发痛觉过敏和异常性疼痛(非专利文献3)。已知在动物中NGF的表达量会由于大鼠术后疼痛模型等肌肉(非专利文献4)及皮肤(非专利文献5)组织的切开时等的组织损伤而上升。在人类疼痛病症中，已经证实在变形性关节炎(osteoarthritis；OA)的关节软骨处NGF及trkA的表达会亢进(非专利文献6)，在剖腹产时的切开部渗出液中NGF水平会上升(非专利文献7)，在类风湿性关节炎(非专利文献8)或间质性膀胱炎(非专利文献9)的患者中NGF水平会上升。

迄今已报道了在各种疼痛动物模型中，若抑制NGF信号则可抑制疼痛(非专利文献10、专利文献1～3)。

作为迄今已报道的对人NGF的抗体，已报道有作为完全人型抗人NGF抗体的REGN475(专利文献2)、1-15(N52D-A)-Fab’-PEG(专利文献3)、Fulranumab(专利文献4)及MEDI-578(专利文献5)；作为人源化抗人NGF抗体的Tanezumab(专利文献6)及PG 110(专利文献7)。其中，已报道在临床上除了Tanezumab的静脉内给药之外，皮下给药也对于伴随变形性关节炎而来的关节痛、慢性腰痛、伴随间质性膀胱炎而来的膀胱痛等疼痛显示出广泛的镇痛效果(非专利文献11～13)。

就医药品而言，已经报道了许多医药品具有副作用，这在抗NGF抗体中也不例外。作为由于对人类给药抗NGF抗体而表现出的不良反应，在Tanezumab的临床试验中报道有头痛、上呼吸道感染、感觉异常等(非专利文献11)；在Fulranumab的临床试验中报道有知觉障碍、头痛、鼻咽炎等(非专利文献14)；另外在REGN475的临床试验中报道有关节痛、知觉过敏、肌肉痛、末梢水肿及关节肿胀等(非专利文献15)。

一般而言，当医药品暴露于所作用的靶组织以外的组织时，在这些组织中会产生对人体而言为不期望的副作用。

一般而言，已经开发了通过将医药品直接给药至靶组织以提高该部位的组织浓度、并减少经由全身血液循环的靶标以外的组织的暴露，从而避免副作用的局部给药剂。

对于许多抗体医药品来说，除了静脉等血管内的给药以外，也存在有很多的对皮下或肌肉内等部位的给药。在对皮下或肌肉内进行了给药之后，这些抗体医药品经由淋巴管而快速地转移至血中。许多抗体医药品在转移至血中以后经由血流循环而被运送到靶组织并发挥药理作用。另外，许多抗体医药品的分布在血液中较高，从血中向靶组织的转移性(组织/血液浓度比)较低。因此，对于许多抗体医药品而言，为了维持靶组织的作用浓度，需要维持较高的血中浓度(非专利文献16)。进一步地，许多抗体医药品在血中的半衰期为数天至一个月左右，显示出长时间的血中浓度持续性，由此维持了长时间药理作用。因此，即使将一般的抗体医药品给药至皮下或肌肉内这样的局部部位，抗体医药品的大部分也仍会残留在血液中并进行全身循环，由此表现出全身性的药效及副作用。

在抗体医药品等生物医药品领域中，诸如二聚体化等的多聚体化在确保稳定且均衡的品质方面成为较大的课题。

已知Fab’的二聚体F(ab’)₂与Fab’在体内动力学方面是不同的(非专利文献17、18)。

已经报道了针对Fab’的二聚体F(ab’)₂的自然抗体会引起抗体的消失(非专利文献19)。这种抗原-抗体反应除了会影响药剂的体内动力学而加速消失之外，还会有产生过敏性反应等风险。如此地，F(ab’)₂会存在有数种风险。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2013/183032号

专利文献2：国际公开第2009/023540号

专利文献3：国际公开第2013/022083号

专利文献4：国际公开第2005/019266号

专利文献5：国际公开第2006/077441号

专利文献6：国际公开第2004/058184号

专利文献7：美国专利第8435523号说明书

非专利文献

非专利文献1：“Reviews in the Neurosciences”,1997,Vol.8,p.13-27

非专利文献2：“The Journal of Neuroscience”,1993,Vol.13,p.2136-2148

非专利文献3：“Annals of Neurology”,1994,Vol.36,p.244-246

非专利文献4：“Anesthesiology”,2009,Vol.110,p.140-149

非专利文献5：“Pain”,2005,Vol.117,p.68-76

非专利文献6：“Rheumatology”,2002,Vol.41,p.1413-1418

非专利文献7：“The Journal of Pain”,2008,Vol.9,p.650-657

非专利文献8：“Clinical and Experimental Rheumatology”,1997,Vol.15,p.433-438

非专利文献9：“British Journal of Urology”,1997,Vol.79,p.572-577

非专利文献10：“Trends in Pharmacological Sciences”,2006,Vol.27,p.85-91

非专利文献11：“The New England Journal of Medicine”,2010,Vol.363,p.1521-1531

非专利文献12：“The Journal of Urology”,2011,Vol.185,p.1716-1721

非专利文献13：“Pain”,2011,Vol.152,p.2248-2258

非专利文献14：“Pain”,2013,Vol.154,p.1910-1919

非专利文献15：“Pain”,2014,Vol.155,p.1245-1252

非专利文献16：“Bioanalysis”,2013,Vol.5,p.2003-2014

非专利文献17：“The Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics”,1997,Vol.281,p.1-8

非专利文献18：“Cancer Research”,1986,Vol.46,p.3969-3978

非专利文献19：“European Journal of Immunology”,1995,Vol.25,p.3128-3133

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于提供一种保持高的中和活性、并且在表现出局部的药效的同时还减少了由于全身暴露所引起的全身性的副作用的优异的抗人NGF抗体Fab片段。

解决课题的手段

本发明包含以下发明作为医学上或产业上有用的物质、方法。

也就是说，在一个实施方式中，本发明可如下所述。

(1)一种抗人NGF抗体Fab片段，其选自由以下的(a)和(b)所组成的组：

(a)包含由序列编号5所示的氨基酸序列构成的重链片段以及由序列编号8所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人NGF抗体Fab片段；以及

(b)由(a)的抗人NGF抗体Fab片段的翻译后修饰而生成的抗人NGF抗体Fab片段。

(2)根据上述(1)所述的抗人NGF抗体Fab片段，其包含由序列编号5所示的氨基酸序列构成的重链片段以及由序列编号8所示的氨基酸序列构成的轻链。

(3)根据上述(1)所述的抗人NGF抗体Fab片段，其中，翻译后修饰是重链可变区N末端的焦谷氨酰化。

(4)根据上述(1)所述的抗人NGF抗体Fab片段，其包含由其中序列编号5的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰成焦谷氨酸的序列编号5所示的氨基酸序列构成的重链片段、以及由序列编号8所示的氨基酸序列构成的轻链。

(5)一种多核苷酸，其包含编码上述(1)所述的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列。

(6)一种表达载体，其选自由以下的(a)和(b)所组成的组：

(a)包含含有编码上述(1)所述的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸、以及含有编码该抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体；以及

(b)包含含有编码上述(1)所述的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体。

(7)一种宿主细胞，其由上述(6)所述的表达载体进行了转化。

(8)根据上述(7)所述的宿主细胞，其选自由以下的(a)和(b)所组成的组：

(a)由包含含有编码上述(1)所述的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸、以及含有编码该抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及

(b)由包含含有编码上述(1)所述的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体以及包含含有编码该抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。

(9)一种抗人NGF抗体Fab片段的生产方法，包括培养上述(8)所述的宿主细胞，并使抗人NGF抗体Fab片段表达的步骤。

(10)一种抗人NGF抗体Fab片段，其能够通过上述(9)所述的方法来生产。

(11)一种医药组合物，其包含上述(1)至(4)及(10)中任一项所述的抗人NGF抗体Fab片段、以及药学上可接受的载体。

(12)根据上述(11)所述的医药组合物，其为术后疼痛的治疗用局部医药组合物。

(13)一种医药组合物，其包含上述(2)所述的抗人NGF抗体Fab片段、上述(4)所述的抗人NGF抗体Fab片段、以及药学上可接受的载体。

(14)根据上述(13)所述的医药组合物，其为术后疼痛的治疗用局部医药组合物。

(15)上述(1)至(4)及(10)中任一项所述的抗人NGF抗体Fab片段在用于制造术后疼痛的治疗用局部医药组合物中的应用。

(16)上述(1)至(4)及(10)中任一项所述的抗人NGF抗体Fab片段通过局部给药用于治疗术后疼痛的应用。

(17)根据上述(1)至(4)及(10)中任一项所述的抗人NGF抗体Fab片段，其用于在术后疼痛的治疗中经由局部给药而使用。

(18)一种术后疼痛的治疗方法，包括将有效量的上述(1)至(4)及(10)中任一项所述的抗人NGF抗体Fab片段给药至对象的局部。

本发明的效果

本发明的抗人NGF抗体Fab片段可用于人NGF与病态形成相关的术后疼痛的治疗。本发明的这种抗人NGF抗体Fab片段由于其中和活性以及局部滞留性较高并且从血中的消失较快这样的优异的体内动力学，从而显示出给药量的减少以及药效持续性的延长，并且可期望显示出减少了由于全身暴露所引起的全身性的副作用的在临床应用上药效、安全性均非常优异的改善。本发明的抗人NGF抗体Fab片段在与人NGF相关的术后疼痛的治疗中具有极大的贡献。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。在本说明书中除非特别定义，否则有关本发明所使用的科学用语及技术用语均具有对本领域技术人员而言为一般所理解的意义。

本发明人等在抗人NGF抗体或其抗原结合片段的制作方面进行了大量的创造性研究，结果，成功地制作了保持高的中和活性、并且在表现出局部药效的同时还减少了由于全身暴露所引起的全身性的副作用的优异的抗人NGF抗体Fab片段。

抗体分子的基本结构在各类中是共通的，由分子量5万～7万的重链和2万～3万的轻链构成。重链通常由含有约440个氨基酸的多肽链构成，每类均具有特征性结构，对应于IgG、IgM、IgA、IgD、IgE而被称为γ、μ、α、δ、ε链。此外，在IgG中存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分别被称为γ1、γ2、γ3、γ4。轻链通常由含有约220个氨基酸的多肽链构成，已知有L型和K型2种，分别被称为λ、κ链。就抗体分子的基本结构的肽构成而言，各自同源的2条重链及2条轻链通过二硫键(S-S键)及非共价键结合，分子量为15万～19万。2种轻链与任一个重链均可以构成对。各个抗体分子通常可由2条相同的轻链和2条相同的重链形成。

链内S-S键在重链上存在四个(在μ、ε链上存在五个)，在轻链上存在两个，每100～110个氨基酸残基形成一个环，该立体结构在各环间类似，被称为结构单元或结构域。即使为来自同种动物的相同类(亚类)的标准品，在重链、轻链中位于N末端的结构域的氨基酸序列也不恒定，被称为可变区，各结构域分别被称为重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)。来自可变区的C末端侧的氨基酸序列在各类或亚类中大致恒定，被称为恒定区，各结构域分别表示为CH1、CH2、CH3或CL。

抗体的抗原决定部位由VH及VL构成，结合特异性取决于该部位的氨基酸序列。另一方面，与补体或各种细胞的结合这样的生物学活性反映各类Ig的恒定区的结构差别。已知重链和轻链的可变区的可变性大致限于在任一个链上均存在的3个小的超变区，将这些区域称为互补决定区(CDR；从N末端侧起分别为CDR1、CDR2、CDR3)。可变区的剩余部分被称为骨架区(FR)，相对恒定。

抗体的重链恒定区的CH1结构域与CH2结构域之间的区域被称为铰链区，该区域包含多个脯氨酸残基，并且包含连接2条重链的多个链间S-S键。例如，在人的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的各铰链区中，包含构成重链间的S-S键的分别为2个、4个、11个和2个的半胱氨酸残基。铰链区为对于木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白水解酶具有高敏感性的区域。当用木瓜蛋白酶消化抗体时，重链会在比铰链区的重链间S-S键更靠近N末端侧的位置处被切断，并分解为2个Fab片段和1个Fc片段。Fab片段由轻链、以及包含重链可变区(VH)、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成。当用胃蛋白酶消化抗体时，重链会在比铰链区的重链间S-S键更靠近C末端侧的位置处被切断，并生成了F(ab’)₂片段。F(ab’)₂片段为两个Fab’片段通过铰链区中的重链间S-S键结合而成的二聚体结构的片段。Fab’片段由轻链、以及包含重链可变区(VH)、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成，该铰链区的一部分中包含构成重链间S-S键的半胱氨酸残基。Fab片段、F(ab’)₂片段以及Fab’片段均包含可变区，并具有抗原结合活性。

本发明人制作成功了的本发明抗人NGF抗体Fab片段为具有以下特征的Fab片段：

包含由序列编号5所示的氨基酸序列构成的重链片段以及由序列编号8所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人NGF抗体Fab片段。

具体而言，本发明人修饰了完全人型抗人NGF抗体1-15(N52D-A)-Fab’片段(专利文献3；在该文献中也被称为1-15(N52D-A)-Fab’)，通过使用各种生物学活性试验及物性试验筛选抗体，成功地鉴定出本发明的抗人NGF抗体Fab片段作为稳定且保持高中和活性及局部滞留性的抗人NGF抗体Fab片段。

本发明的抗人NGF抗体Fab片段可以基于本发明说明书中所公开的序列信息，使用该领域的公知方法由本领域技术人员容易地制作。例如，本发明的抗人NGF抗体Fab片段可以通过以下方法得到：合成包含编码其重链片段的碱基序列的多核苷酸以及包含编码轻链的碱基序列的多核苷酸，再连接到适当的表达载体上；然后，将该表达载体导入到培养细胞中；最后，培养该培养细胞，并从培养上清液得到单克隆Fab片段。

包含编码本发明的Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸以及包含编码本发明的Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸，例如可以基于根据该重链片段及轻链的氨基酸序列而设计的碱基序列，利用本领域中公知的基因合成方法来合成。作为这样的基因合成方法，可使用在国际公开第90/07861中所记载的抗体基因合成方法等本领域技术人员所公知的各种方法。

在一个实施方式中，作为包含编码由序列编号5所示的氨基酸序列构成的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可列举出(例如)包含序列编号1所示的碱基序列的多核苷酸。作为包含编码由序列编号8所示的氨基酸序列构成的抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸，可列举出(例如)包含序列编号4所示的碱基序列的多核苷酸。

在制作包含编码本发明的Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸以及包含编码本发明的Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸之后，对于该多核苷酸向表达载体中的导入、表达载体向培养细胞中的导入、培养细胞的培养、Fab片段的纯化等，可以使用本领域所公知的各种方法来进行。

作为所使用的表达载体，可列举出(例如)GS载体pEE6.4或pEE12.4(Lonza公司)，但只要是能够表达包含编码本发明的Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸及/或包含编码本发明的Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸、并产生由其编码的多肽即可，没有特别的限制。

上述表达载体通过(例如)磷酸钙法、电穿孔法等导入到培养细胞中。

作为表达载体所导入的培养细胞，可以使用(例如)CHO-K1SV细胞、CHO-DG44细胞、293细胞等培养细胞，并且通过常用方法培养它们即可。

上述培养之后，累积于培养上清液中的Fab片段可以通过各种柱色谱来纯化，例如可以使用利用了KappaSelect等的柱色谱。

作为本发明的抗人NGF抗体Fab片段的实例，可列举出后述实施例中记载的h1f.6抗体。

当使抗体在细胞中表达时，已知有使抗体在翻译后再经受修饰。作为翻译后修饰的例子，可列举出：重链C末端的赖氨酸被羧肽酶切断、重链及轻链N末端的谷氨酰胺或谷氨酸的通过焦谷氨酰化而修饰为焦谷氨酸、糖基化、氧化、脱酰胺化、糖化(glycation)等，已知在多种抗体中会产生这样的翻译后修饰(J.Pharm.Sci.,2008,Vol.97,p.2426-2447)。

本发明的抗人NGF抗体Fab片段也可以包含经由翻译后修饰而生成的抗人NGF抗体Fab片段。作为经由翻译后修饰而能够生成的本发明的抗人NGF抗体Fab片段的实例，可列举出重链可变区N末端的经焦谷氨酰化而得的抗人NGF抗体Fab片段。本领域所公知的是，这种N末端的焦谷氨酰化所引起的翻译后修饰不会对抗体的活性造成影响(Anal.Biochem.,2006,Vol.348,p.24-39)。

例如，本发明的抗人NGF抗体Fab片段也可以包含以下的抗人NGF抗体Fab片段：

包含由其中序列编号5的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰成焦谷氨酸了的序列编号5所示的氨基酸序列构成的重链片段、以及由序列编号8所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人NGF抗体Fab片段。

本发明的抗人NGF抗体Fab片段与人NGF结合。作为所得到的抗人NGF抗体Fab片段对于人NGF的结合活性的测定方法，有ELISA或FACS等方法。例如，当使用ELISA时，将人NGF固定于ELISA板，对其添加Fab片段使其反应，然后使以生物素等标记的抗Kappa抗体等二次抗体和碱性磷酸酶标记链霉亲和素反应，之后通过使用了检测其活性的试剂(例如，在碱性磷酸酶标记的情况下，为化学发光碱性磷酸酶基质)等的活性测定，从而鉴定二次抗体的结合。另外，本发明的抗人NGF抗体Fab片段除了人NGF之外，也可以与源自其他动物的NGF(例如小鼠NGF)结合，并且也可以测定对这些蛋白质的结合活性。

本发明的抗人NGF抗体Fab片段具有对人NGF的中和活性。在本说明书中使用时，抗人NGF抗体Fab片段的“中和活性”是指这样的活性：通过对人NGF的结合来抑制经由人NGF所带来的任何生物活性，能够以人NGF的一个或多个生物活性作为指标来评价。作为这样的中和活性，可列举出(例如)人NGF与作为其受体的人trkA的结合抑制活性，并且可以通过使用如后述实施例所记载的方法来进行评价。

为了更详细地评价本发明的抗人NGF抗体Fab片段的效果，也可以采用在体内(invivo)的试验。例如，如后述实施例所记载的那样，可以采用使用大鼠脚底切开术后疼痛模型的镇痛效果试验等，从而评价抗人NGF抗体Fab片段在体内的药效。另外，也可以通过在将抗人NGF抗体Fab片段局部给药至大鼠的大腿肌肉之后使用其组织匀浆进行与NGF的结合活性评价试验、或者NGF与作为其受体的trkA的结合抑制活性评价试验，从而确认组织中的抗人NGF抗体Fab片段的药理活性。进一步地，也可以通过进行血浆中及组织中的药物浓度评价试验，从而评价Fab片段的局部暴露量的维持及全身血中暴露量的降低。

此外，作为评价本发明的抗人NGF抗体Fab片段的各种稳定性(例如热稳定性、长期保存稳定性、高浓度稳定性)的方法，可列举出(例如)利用尺寸排除色谱来测定保存中的凝聚物形成的方法。

本发明的抗人NGF抗体Fab片段可以在根据需要而进行纯化后，依照常规方法制成制剂，并用于术后疼痛的治疗。

“术后疼痛”指的是：起因于切割、穿刺、切开、裂伤、或个体组织内的创伤等外部外伤的疼痛或由此产生的疼痛(无论是侵入性还是非侵入性，包括所有的起因于外科处理的疼痛)。本说明书中使用的术后疼痛不包括未伴有来自外部的物理性外伤而引起的疼痛(非起因于外伤、或不是由外伤所衍生的疼痛)。术后疼痛为内部或外部(包括末梢)的疼痛，并且可能会由创伤、切割、外伤、裂伤或切开而偶发性(外伤创伤的情况下)或有意图性(手术时的切开的情况下)地引起。疼痛可采用疼痛评分及本领域所公知的其他方法来客观及主观地进行评价。本说明书中使用的术后疼痛包括异常性疼痛(即，通常对非侵害性的刺激的响应增加)以及痛觉异常过敏(即，通常对侵害性或不适的刺激的响应增加)，而这些有时为热或机械性的性质。疼痛通过热敏感性、对机械刺激的敏感性及/或静止时的疼痛来表征。术后疼痛包括针对机械刺激所诱发的疼痛及静止时疼痛。

本发明的抗人NGF抗体Fab片段可以用作术后疼痛的治疗剂。作为该治疗剂的剂型的例子，可列举出注射剂、点滴剂、长效制剂等非经口剂，优选通过对靶组织局部进行肌肉内注射、皮下注射等来进行给药。另外，在制成制剂时，在药学上可接受的范围内，可以使用与这些剂型对应的载体或添加剂。

在上述制成制剂时，本发明的抗人NGF抗体Fab片段的添加量根据患者的症状程度或年龄、使用的制剂剂型、或抗体的效价等而不同，例如使用0.001mg/kg～100mg/kg左右即可。

另外，本发明也涉及包含本发明的抗人NGF抗体Fab片段的医药组合物。本发明的医药组合物也可以包含药学上可接受的载体或添加剂。药学上可接受的载体或添加剂的种类没有特别的限定，可以使用本领域技术人员所公知的载体或添加剂。本发明也涉及用于术后疼痛治疗的本发明的抗人NGF抗体Fab片段、以及本发明的抗人NGF抗体Fab片段在术后疼痛治疗用医药组合物的制造中的应用。本发明也涉及术后疼痛的治疗方法，其包括将有效量的本发明的抗人NGF抗体Fab片段给药至对象的局部。需要说明的是，“对象”指的是需要该治疗的人或其他哺乳动物，作为某一实施方式，为需要该治疗的人。本发明的治疗方法中的抗人NGF抗体Fab片段的有效量可以为与上述制剂时的Fab片段的添加量相同的量。另外，本发明的局部医药组合物指的是：在期望治疗的部位、或与该区域相邻的部位(特别是外科手术时的切开组织等靶组织或其附近)给药、使用的医药组合物。例如，如上述所记载，可以通过对靶组织局部进行肌肉内注射、皮下注射等进行给药。此外，本发明包括：本发明的抗人NGF抗体Fab片段在靶组织局部滞留一定时间，优选为72小时，更优选为24小时。

本发明的医药组合物可以包含多种本发明的抗人NGF抗体Fab片段。例如，本发明也可以包含这样的医药组合物：其含有未经翻译后修饰的抗人NGF抗体Fab片段以及通过翻译后修饰而生成的抗人NGF抗体Fab片段。

在一个实施方式中，本发明的医药组合物也包含含有以下(a)及(b)的抗人NGF抗体Fab片段的医药组合物：

(b)通过(a)的抗人NGF抗体Fab片段的翻译后修饰而生成的抗人NGF抗体Fab片段。

(b)包含由其中序列编号5的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰成焦谷氨酸了的序列编号5所示的氨基酸序列构成的重链片段、以及由序列编号8所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人NGF抗体Fab片段。

另外，本发明涉及包含编码本发明的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸、及包含编码本发明的抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸(以下统称为“本发明的多核苷酸”)、以及包含它们中的一者或两者的表达载体(以下也称为“本发明的表达载体”)。

本发明的表达载体没有特别的限制，只要其在原核细胞和/或真核细胞各种宿主细胞中能够表达包含编码本发明的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸及/或包含编码本发明的抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸并产生由其编码的多肽即可。作为所使用的表达载体，可列举出质粒载体、病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)等，例如可使用GS载体pEE6.4或pEE12.4(Lonza公司)。在一个实施方式中，本发明的表达载体为包含含有编码本发明的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体。在另一个实施方式中，本发明的表达载体为包含含有编码本发明的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸、以及含有编码该抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。

本发明的表达载体可以包含能够与本发明的多核苷酸可操作地连接的启动子。作为用于在细菌中表达编码本发明的Fab片段或者其重链可变区及/或轻链可变区的基因的启动子，当宿主为埃希氏菌属菌时，可列举出(例如)Trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、tac启动子等。作为在酵母中的表达用启动子，可列举出(例如)PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子；作为在芽孢杆菌属菌中的表达用启动子，可列举出SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等。另外，当宿主为哺乳动物细胞等真核细胞时，可列举出源自SV40的启动子、逆转录病毒的启动子、热激启动子等。

当使用细菌、特别是大肠杆菌作为宿主细胞时，本发明的表达载体还可以包含起始密码子、终止密码子、终止子区域以及可复制单元。另一方面，当使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主时，本发明的表达载体可以包含起始密码子和终止密码子。另外，在这种情况下，也可以包含增强子序列、编码本发明的抗人NGF抗体Fab片段的基因的5’侧及3’侧的非翻译区域、分泌信号序列、剪接接合部、聚腺苷酸化位点、或者可复制单元等。另外，也可以根据目的而包含通常所使用的选择标记(例如，四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因)。

本发明还涉及一种由本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞。作为转化体的制作所使用的宿主细胞，只要是适合于前述表达载体并可以被转化即可，没有特别的限定，可例示出本发明技术领域中通常所使用的天然细胞或人工建立的细胞等多种细胞(例如细菌(埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌)、酵母(酵母菌属、毕赤酵母菌属等))、动物细胞(CHO-K1SV细胞、CHO-DG44细胞、293细胞等)或昆虫细胞(例如Sf 9等)。转化本身可以通过公知的方法进行。

作为本发明的宿主细胞，可列举出以下的(a)及(b)：

(a)由包含含有编码本发明的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸、以及含有编码该抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及

(b)由包含含有编码本发明的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及包含含有编码该抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。

本发明还涉及一种抗人NGF抗体Fab片段的生产方法，其包括培养本发明的宿主细胞、并使抗人NGF抗体Fab片段表达的步骤。优选的是，作为该方法中所使用的宿主细胞，可列举出上述本发明的宿主细胞(a)及(b)。

在本发明的抗人NGF抗体Fab片段的生产中，进行了转化的宿主细胞可以在营养培养基中培养。营养培养基优选含有宿主细胞的生长所必需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，例如可列举出葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，例如可列举铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、胨、酪蛋白、肉类提取物、大豆粕、马铃薯提取液等。另外，根据期望也可以含有其它营养素(例如，无机盐(例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类等)、抗生素(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)。

宿主细胞的培养本身通过公知的方法来进行。培养条件例如温度、培养基的pH及培养时间可适当选择。例如，当宿主为动物细胞时，作为培养基，可以使用含有约5～20％的胎牛血清的MEM培养基(Science,1955,Vol.122,p.501-504)、DMEM培养基(Virology,1959,Vol.8,p.396-397)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.,1967,Vol.199,p.519-524)、199培养基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1950,Vol.73,p.1-8)等。培养基的pH优选为约6～8，培养通常在约30～40℃下进行约15～72小时，根据需要也可以进行通气或搅拌。当宿主为昆虫细胞时，例如可以列举出含有胎牛血清的Grace’s培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,Vol.82,p.8404-8408)等，其pH优选为约5～8。培养通常在约20～40℃下进行15～100小时，根据需要也可以进行通气或搅拌。当宿主为细菌、放线菌、酵母、丝状菌时，(例如)含有上述营养源的液体培养基是适当的。优选为pH5～8的培养基。当宿主为E.coli时，作为优选的培养基，可例示出LB培养基、M9培养基(Mol.Col.,Cold Spring Harbor Laboratory,Vol.3,A2.2)等。在这种情况下，培养时，根据需要可以一边进行通气、搅拌，一边在通常14～43℃下进行约3～24小时。当宿主为Bacillus属菌时，可以根据需要一边进行通气、搅拌，一边在通常30～40℃下进行约16～96小时。当宿主为酵母时，作为培养基，可列举出(例如)Burkholder基本培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1980,Vol.77,p.4505-4508)，pH期望为5～8。培养通常在约20～35℃下进行约14～144小时，根据需要可以进行通气或搅拌。

除了培养本发明的进行了转化的宿主细胞、并使抗人NGF抗体Fab片段表达的步骤之外，本发明的抗人NGF抗体Fab片段的生产方法还可以包括由该宿主细胞回收(优选分离或纯化)抗人NGF抗体Fab片段的步骤。作为分离或纯化方法，可列举出(例如)盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法；透析、超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差的方法；离子交换色谱或羟基磷灰石色谱等利用电荷的方法；亲和性色谱等利用特异亲和性的方法；反相高效液相色谱等利用疏水性差的方法；等电点电泳等利用等电点差的方法等。

本发明的抗人NGF抗体Fab片段也包含能够用本发明的抗人NGF抗体Fab片段的生产方法生产的抗人NGF抗体Fab片段。

对于本发明进行了概括描述，在此提供为了进一步理解而参照的特定实施例。但是它们仅为例示性目的，并不限定本发明。

实施例

对于使用市售的试剂盒或试剂等的部分，若无特定指明，则依照随附的实验方案来进行实验。

(实施例1：抗人NGF抗体Fab片段的制作)

以包含编码1-15(N52D)-Fab’片段(专利文献3)的重链的多核苷酸的表达载体为模板，使用被设计为能够分别扩增由VH至铰链区的三种基因片段(序列编号1、序列编号2及序列编号3)的引物，并采用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(Finnzymes公司，F-530L)以扩增上述三种基因片段。扩增后的区域的5’侧含有Hind III，3’侧含有EcoRI。用Hind III和EcoRI(均来自NEB公司)来消化如此得到的重链基因片段，并插入到作为表达载体的pEE6.4中。

将这些表达质粒通过常规方法导入到大肠杆菌以得到转化克隆，其后采用WizardPlus SV Minipreps DNA Purification System(Promega公司，A1460)制备质粒DNA。另一方面，轻链基因为与1-15(N52D-A)-Fab’片段的轻链基因相同的碱基序列(序列编号4)，由其编码的氨基酸序列为序列编号8。使用包含该轻链基因片段的pEE 12.4。

使用作为限制性酶的NotI和PvuI(均来自NEB公司)分别将插入有抗人NGF抗体Fab片段的重链基因片段的GS载体(pEE6.4)、以及插入有抗人NGF抗体Fab片段的轻链基因片段的GS载体(pEE12.4)切断。其后，使用DNA Ligation Mix(TAKARA BIO公司，6023)进行连接，构建了插入有抗人NGF抗体Fab片段的重链及轻链这两个基因片段的GS载体。以所得的质粒DNA为模板进行测序反应，确认了从VH至铰链区的克隆重链的碱基序列、以及从VL至CL区域的轻链的碱基序列。将3种重链的该VH至铰链区的碱基序列表示为序列编号1、序列编号2以及序列编号3。另外，将由其编码的氨基酸序列分别表示为序列编号5、序列编号6以及序列编号7。将序列编号1的重链和序列编号4的轻链、序列编号2的重链和序列编号4的轻链、以及序列编号3的重链和序列编号4的轻链组合从而制作了三种抗人NGF抗体Fab片段，并分别将其称为h1f.6抗体、h1f.7抗体和h1f.8抗体。

使用该GS载体，并以瞬时表达及恒定表达这两种方法来表达抗人NGF抗体Fab片段。关于瞬时表达，通过MaxCyte电穿孔装置(MaxCyte公司)将该GS载体转染至在CD-CHO培养基(Invitrogen公司)中培养后的CHO-K1SV细胞(Lonza公司)，并培养7天。使用KappaSelect(GE Healthcare公司，17-5458-02)由其培养上清液纯化抗人NGF抗体Fab片段。关于恒定表达，使用电穿孔法将被作为限制性酶的PvuⅠ切断了的该GS载体转染到CHO-K1SV细胞，由此使抗人NGF抗体Fab片段表达。使用KappaSelect由其培养上清液纯化抗人NGF抗体Fab片段，并通过尺寸排除色谱及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行确认。需要说明的是，为确认纯化后的h1f.6抗体的翻译后修饰而进行了质谱分析，结果，在其大部分中产生了被认为是N末端的焦谷氨酰化的峰。

(实施例2：各抗人NGF抗体Fab片段的人NGF机能抑制活性评价)

为了进行所制作的各抗人NGF抗体Fab片段的人NGF机能抑制活性评价，进行了以人NGF与其受体trkA的结合抑制为指标的人NGF-trkA竞争ELISA。将人trkA(R&D Systems公司，175-TK-050)用磷酸缓冲生理盐水(PBS)稀释成2000ng/mL，对Nunc Maxisorp白色96孔板(Nunc公司，436110)按每个孔添加50μL，在4℃下对孔板培养一夜而进行固相化。通过反向离心除去人trkA固相液，将Blocker Casein in TBS(Thermo公司，37532)按每个孔添加200μL。在室温下对孔板进行培养30分钟之后，通过反向离心除去Blocker Casein in TBS。对于用含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在约200000ng/mL至约2ng/mL之间稀释为7至11级的纯化抗体试样，将其分别与700ng/mL的生物素化人NGF以等量混合，在室温下培养30分钟而得到试样，将试样按每个孔添加100μL。需要说明的是，在此使用的生物素化人NGF采用了用EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo公司，21329)将人NGF(R&D Systems公司，256-GF-100/CF)生物素化而得的物质。人NGF的生物素化如下进行：对于0.4mg/mL的人NGF溶液250μL，添加5mM的NHS-PEG4-Biotin溶液1.25μL，在冰上、遮光条件下反应2小时之后，依照手册使用Amicon Ultra-0.5mL 3K(Millipore公司，UFC500324)两次，从而回收反应液作为PBS溶液。作为对照，制备了含有0.1％BSA的PBS。在室温下培养30分钟后，采用清洗液(含有0.05％Tween-20的Tris缓冲生理食盐水(TBS))清洗孔板3次，将用PBS稀释20倍后的Blocking One(Nacalai Tesque公司，03953-95)溶液稀释1000倍后的碱性磷酸酶标记链霉亲和素(Thermo公司，21324)按每个孔添加100μL。在室温下培养30分钟之后，采用清洗液清洗孔板3次，将用含有0.1mM氯化镁的2mM Tris(pH9.8)缓冲液稀释为5倍后的碱性磷酸酶基质(Chemiluminescent AP Microwell/Membrane Substrate,Super Sensitive,450nm；SurModics公司，APU4-0100-01)按每个孔添加100μL。在室温下培养30分钟之后，用EnVision计数器(Perkin Elmer公司)测定其信号值。

实施了1-15(N52D-A)-Fab’片段、h1f.6抗体、h1f.7抗体、h1f.8抗体的试验2次。在计算各抗体的人NGF-trkA结合抑制率时，将含有0.1％BSA的PBS的测定值设定为0，将各抗体中的最大浓度的测定值设定为100％。对算出的人NGF-trkA结合抑制率进行解析，并根据3参数逻辑或4参数逻辑曲线回归来算出抗体的IC₅₀值。对两次试验的IC₅₀值进行几何平均，其结果是：1-15(N52D-A)-Fab’片段、h1f.6抗体、h1f.7抗体、h1f.8抗体的人NGF-trkA结合抑制IC₅₀值分别为0.30μg/mL、0.32μg/mL、0.30μg/mL、0.28μg/mL，它们的人NGF-trkA结合抑制能力大致相等。

(实施例3：各抗人NGF抗体Fab片段在50℃下保存14天后的二聚体形成评价)

将1-15(N52D-A)-Fab’片段、h1f.6抗体、h1f.7抗体、h1f.8抗体的各溶液置换为pH5、6、7的缓冲液(pH5、6为20mM柠檬酸/120mM NaCl，pH7为PBS)，调整为10mg/mL并在50℃下保存14天，评价稳定性。

利用LC 1100(Agilent Technologies公司)，并使用TSK gel Super Sw 3000(TOSOH公司，2mm ID×300mm)尺寸排除色谱作为柱子来评价在50℃下保存14天前后的试样中的二聚体的形成。使用在0.1M磷酸氢二钠、0.2M L(+)精氨酸盐中添加盐酸以调整为pH6.8的溶液作为流动相，在0.075mL/分钟的流速、25℃的温度下使用，并在检测波长280nm、参考波长360nm下进行测定。分别进行2次测定并对二聚体形成率进行算术平均，由保存后的二聚体形成率减去保存前的二聚体形成率来算出二聚体增加率。其结果是，1-15(N52D-A)-Fab’片段的二聚体增加率在pH5、6、7的条件下分别为5.4％、17.0％、18.2％，在各pH下均观察到显著的二聚体形成。另一方面，h1f.6抗体的二聚体增加率在pH5、6、7的条件下分别为0.1％、0.3％、0.5％，h1f.7抗体的二聚体增加率在pH5、6、7的条件下分别为0.1％、0.3％、0.4％，h1f.8抗体的二聚体增加率在pH5、6、7的条件下分别为0.1％、0.5％、0.7％。与1-15(N52D-A)-Fab’片段相比，h1f.6抗体、h1f.7抗体和h1f.8抗体的二聚体的增加率显著降低，显示其为稳定的。

(实施例4：各抗人NGF抗体Fab片段在50℃下保存14天后的人NGF机能抑制活性稳定性评价)

使用实施例2所记载的人NGF-trkA竞争ELISA来评价在pH6、50℃下保存14天后的1-15(N52D-A)-Fab’片段、h1f.6抗体、h1f.7抗体、以及h1f.8抗体的保存后的人NGF-trkA结合抑制活性的变化。对两次试验的IC₅₀值进行几何平均，其结果是，1-15(N52D-A)-Fab’片段、h1f.6抗体、h1f.7抗体、h1f.8抗体在50℃下保存14天后的人NGF-trkA结合抑制IC₅₀值分别为0.47μg/mL、0.38μg/mL、0.56μg/mL、0.47μg/mL。各抗体在50℃下保存14天后相对于保存前的IC₅₀增加率分别为59％、21％、87％、68％。

由以上可以看出，在50℃下保存14天后与1-15(N52D-A)-Fab’片段中所发生的二聚体增加相比，h1f.6抗体、h1f.7抗体、h1f.8抗体的二聚体增加显著地减少。发现h1f.6抗体在保存中的活性减弱也较少，为具有高稳定性的抗NGF抗体Fab片段。

(实施例5：利用ELISA进行的抗人NGF抗体的人NGF结合评价)

为了测定h1f.6抗体的抗原结合活性，使用了ELISA。在此，为了评价对于人NGF的结合能力，使用将人NGF固相化了的孔板进行试验。此时，使用了前述抗体Tanezumab作为比较对照。

采用PBS将人NGF(R&D Systems公司，256-GF-100/CF)稀释成1000ng/mL，对NuncMaxisorp白色96孔板(Nunc公司，436110)按每个孔添加100μL，在4℃下对孔板培养一夜从而进行固相化。通过反向离心除去人NGF固相液，将Blocker Casein in TBS(Thermo公司，37532)按每个孔添加200μL，在室温下对孔板进行培养30分钟。其后通过反向离心除去Blocker Casein in TBS，使用含有0.1％BSA的PBS，将纯化抗体试样从1000ng/mL至0.01ng/mL稀释为11级，按每个孔添加100μL，在室温下对孔板进行培养30分钟。作为对照，准备了含有0.1％BSA的PBS。采用清洗液(含有0.05％Tween-20的TBS)清洗孔板3次，将用PBS稀释20倍后的Blocking One(Nacalai Tesque公司，03953-95)溶液稀释1000倍后的生物素化抗人Kappa轻链抗体(IBL公司，17249)按每个孔添加100μL，在室温下培养30分钟。采用清洗液清洗孔板3次，将以PBS稀释20倍后的Blocking One溶液稀释1000倍的碱性磷酸酶标记链霉亲和素(Thermo公司，21324)按每个孔添加100μL，在室温下对孔板进行培养0.5小时。采用清洗液清洗孔板3次，将用含有0.1mM氯化镁的2mM Tris(pH9.8)缓冲液稀释5倍的碱性磷酸酶基质(Chemiluminescent AP Microwell/Membrane Substrate,SuperSensitive,450nm；SurModics公司，APU4-0100-01)按每个孔添加100μL。在室温下培养30分钟，用EnVision计数器(Perkin Elmer公司)测定其信号值。

以重复一次的方式进行各抗体的试验，计算算术平均。在计算各抗体的人NGF结合率时，将含有0.1％BSA的PBS的测定值设定为0％，将各抗体中的最大浓度的测定值设定为100％。对算出的人NGF结合率进行解析，并根据3参数逻辑曲线回归来算出抗体的EC₅₀值。对于h1f.6抗体，对两次试验的EC₅₀值进行几何平均，其结果是：h1f.6抗体的EC₅₀值为73.0ng/mL，与此相对，Tanezumab的EC₅₀值为146ng/mL。

(实施例6：抗人NGF抗体的人NGF机能抑制活性评价)

为了测定h1f.6抗体的人NGF机能抑制活性，使用了实施例2中所用的评价NGF-trkA结合抑制的竞争ELISA。此时，使用了前述抗体Tanezumab作为比较对照。

对于h1f.6抗体进行了4次试验，对于Tanezumab进行了3次试验，并计算出算得的IC₅₀值的几何平均。其结果是，h1f.6抗体的人NGF-trkA结合抑制IC₅₀值为0.31μg/mL，与此相对，Tanezumab的人NGF-trkA结合抑制IC₅₀值为0.86μg/mL。

(实施例7：组织中抗体的局部滞留性、人NGF结合活性以及人NGF机能抑制活性的评价)

在局部给药h1f.6抗体之后，为了评价抗体的局部滞留，评价了给药组织中的抗体浓度。对于正常大鼠，以每组n＝4将h1f.6抗体按0.3及3mg/kg局部给药至大腿肌肉内，通过电致化学发光(ECL)分析法测定给药6小时之后的大腿肌肉中的抗体浓度。局部给药通过以下方式进行：以PBS作为溶剂并以0.2mL/kg的给药容量将抗体注射到大腿肌肉内。

向采集的大腿肌肉组织添加2.5倍量的组织匀浆液(10mM Tris，137mM NaCl，cOmplete，Mini(Roche公司)，pH8.0)，从而制作了大腿肌肉匀浆。在采用ECL分析法的测定中，使用了将1-15抗体(专利文献3)对小鼠免疫而得到的2种抗1-15抗体即ANA-IBL-13A和生物素化ANA-IBL-52A，其中所述1-15抗体是通过用人NGF免疫VelocImmune小鼠而得到的。需要说明的是，对于在此使用的生物素化ANA-IBL-52A，使用了采用Biotin Labeling Kit-NH2(同仁化学，LK03)并依照技术手册将ANA-IBL-52A生物素化而得到的物质。

以下示出了ECL分析法的方法。用TBS将作为抗1-15抗体的ANA-IBL-13A稀释为1000ng/mL，对Multi-array(多阵列)96孔板(Meso Scale Discovery公司，L15XA-6)按每个孔添加25μL。通过在室温下对孔板进行培养1小时，从而使ANA-IBL-13A固相化。通过反向离心除去ANA-IBL-13A固相液，采用清洗液(含有0.05％Tween-20的TBS)清洗孔板3次，将Blocker Casein in TBS(Thermo公司，37532)按每个孔添加150μL。在室温下进行培养1小时之后，通过反向离心除去Blocker Casein in TBS，采用清洗液清洗孔板3次，并用稀释液(含有0.05％Tween-20的Blocker Casein in TBS)将大腿肌肉匀浆稀释100倍，对于需要进一步稀释的试样，采用含有1％的未给药抗体的大腿肌肉匀浆的稀释液来稀释至校准曲线的范围内，按每个孔添加25μL。为了制作大腿肌肉匀浆的校准曲线，采用含有1％的未给药抗体的大腿肌肉匀浆的稀释液将用稀释液从10000ng/mL至0.51ng/mL稀释为10级的h1f.6抗体稀释100倍，从而准备试样。作为对照，准备了含有1％的未给药抗体的大腿肌肉匀浆的稀释液。在室温下培养1小时之后，通过反向离心除去溶液，采用清洗液清洗孔板3次，将采用稀释液稀释成300ng/mL的生物素化ANA-IBL-52A按每个孔添加25μL。在室温下培养1小时之后，通过反向离心除去溶液，采用清洗液清洗孔板3次，添加25μL的采用稀释液稀释成1000ng/mL的MSD SULFO-TAG labeled Streptavidin(Meso Scale Discovery公司，R32AD-1)。在室温下进行培养1小时之后，通过反向离心除去溶液，采用清洗液清洗孔板3次。添加150μL的采用超纯水(MilliQ(注册商标)，Merck公司)稀释成2倍的MSD Read Buffer T(4x)with Surfactant(Meso Scale Discovery公司，R92TC-2)，并通过SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery公司)测定其电化学发光。

在计算抗体浓度时，制作了校准曲线。回归方程式通过4参数逻辑曲线回归进行解析。从校准曲线算出各个点的大腿肌肉中的抗体浓度。对于各个体重复一次试验，并求出浓度的算术平均。

将h1f.6抗体以0.3及3mg/kg对大腿肌肉内进行局部给药，测定给药6小时之后的大腿肌肉中的浓度，其结果是，在h1f.6抗体的0.3及3mg/kg给药组中分别为2.66μg/mL及67.9μg/mL。

接下来，为了测定大腿肌肉中的具有人NGF结合活性的h1f.6抗体量，使用了人NGF结合ELISA。

将人NGF(R&D Systems公司，256-GF/CF)用PBS稀释成1000ng/mL，对NuncMaxisorp白色384孔板(Nunc公司，460372)按每个孔添加20μL，在4℃下对孔板进行培养一夜从而进行固相化。通过反向离心除去人NGF固相液，将Blocking One(Nacalai Tesque公司，03953-95)溶液按每个孔添加80μL，在室温下对孔板进行培养1小时。采用清洗液(含有0.05％Tween-20的TBS)清洗孔板3次，使用以含有0.05％Tween-20的TBS稀释10倍的Blocking One，在0.3mg/kg给药组中将大腿肌肉匀浆稀释10倍，在3mg/kg给药组中将大腿肌肉匀浆稀释100倍，按每个孔添加20μL。

另外，为了制作0.3mg/kg给药组及3mg/kg给药组的大腿肌肉匀浆的校准曲线，采用向以含有0.05％Tween-20的TBS稀释10倍的Blocking One中添加10％及1％的未给药抗体的大腿肌肉匀浆而成的稀释液，分别将h1f.6抗体从3000ng/mL至0.03ng/mL稀释成11级，按每个孔添加20μL。

在室温下培养1小时之后，采用清洗液清洗孔板3次，使用以含有0.05％Tween-20的TBS稀释10倍后的Blocking One将生物素化抗人Kappa轻链抗体(IBL公司，17249)稀释2500倍，按每个孔添加20μL。在室温下培养1小时之后，采用清洗液清洗孔板3次，使用以含有0.05％Tween-20的TBS稀释10倍后的Blocking One将高灵敏度链霉亲和素-HRP(Thermo公司，21130)稀释8000倍，按每个孔添加20μL，在室温下对孔板进行培养1小时。采用清洗液清洗孔板3次，将化学发光基质(BM Chemiluminescence ELISA Substrate(POD)；Roche公司，11582950001)按每个孔添加20μL，并用EnVision计数器(Perkin Elmer公司)测定其信号值。将试验重复一次，制作了用于计算具有人NGF结合活性的抗体量的校准曲线。回归方程式通过4参数逻辑曲线回归进行解析，从校准曲线算出各点的具有人NGF结合活性的抗体量。关于0.3及3mg/kg给药组，通过分别成为35倍及350倍从而求出大腿肌肉中的具有人NGF结合活性的h1f.6抗体量，并算出算术平均。

其结果是，在0.3mg/kg给药组中具有人NGF结合活性的h1f.6抗体为2.12μg/mL，在3mg/kg给药组中为77.9μg/mL。

由此，从上述的大腿肌肉中的h1f.6抗体浓度以及具有人NGF结合活性的h1f.6抗体量的结果，显示出存在于大腿肌肉中的抗体几乎全部具有人NGF结合活性。

因此，接下来，为了进行大腿肌肉中的人NGF机能抑制活性评价，进行了以人NGF与其受体trkA的结合抑制为指标的人NGF-trkA竞争ELISA。

采用PBS将人trkA(R&D Systems公司，175-TK-050)稀释成2000ng/mL，对NuncMaxisorp白色384孔板按每个孔添加20μL，在4℃下培养一夜从而进行固相化。通过反向离心除去人trkA固相液，将Blocker Casein in TBS按每个孔添加80μL，在室温下对孔板培养30分钟。采用清洗液(含有0.05％Tween-20的TBS)清洗孔板3次，除去了Blocker Casein inTBS。将使用含有0.1％BSA的PBS对于0.3mg/kg给药组稀释5倍、对于3mg/kg给药组稀释50倍而成的大鼠大腿肌肉匀浆分别与0.4μg/mL的生物素化人NGF各自等量混合，在室温下进行培养30分钟而得到试样，将该试样按每个孔添加20μL。需要说明的是，由于大鼠大腿肌肉匀浆由组织匀浆液制作，该组织匀浆液是采集的大腿肌肉组织的2.5倍量，因此，对于0.3及3mg/kg给药组，使用原本的大腿肌肉组织浓度的分别稀释成35倍及350倍后的溶液来评价。

在此使用的生物素化人NGF采用了使用EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo公司，21329)将人NGF(R&D Systems公司，256-GF-100/CF)生物素化而得到的物质。人NGF的生物素化如下进行：对于0.4mg/mL的人NGF溶液1mL，添加5mM NHS-PEG4-Biotin溶液5μL。在冰上、遮光条件下反应2小时之后，依照手册使用Amicon Ultra-0.5mL 3K(Millipore公司，UFC500324)两次，从而回收反应液作为PBS溶液。

作为对照，准备了含有0.1％BSA的PBS、以及使用含有0.1％BSA的PBS稀释了的h1f.6抗体10μg/mL。对于0.3mg/kg给药组以及3mg/kg给药组的对照试样，使用向含有0.1％BSA的PBS中添加10％及1％的未给药抗体的大腿肌肉匀浆而得到的稀释液来分别进行制备。在室温下培养30分钟后，采用清洗液清洗孔板3次，将用含有0.05％Tween-20的TBS稀释20倍的Blocking One溶液稀释1000倍的碱性磷酸酶标记链霉亲和素(Thermo公司，21324)按每个孔添加20μL。在室温下培养30分钟之后，采用清洗液清洗孔板3次，将与含有10mM氯化镁的200mM Tris(pH9.8)缓冲液的10倍稀释液以1:1混合的碱性磷酸酶基质(Chemiluminescent AP Microwell/Membrane Substrate,Super Sensitive,450nm；SurModics公司，APU4-0100-01)按每个孔添加20μL。在室温下培养30分钟，用EnVision计数器(Perkin Elmer公司)测定其信号值。

在计算各浓度的人NGF机能抑制活性时，将添加了含有0.1％BSA的PBS的试样的测定值设定为0％，将10μg/mL的测定值设定为100％。将试验重复一次(对照为4或8孔)，算出算术平均。

其结果是，对于0.3mg/kg给药组，在大腿肌肉内抗体浓度稀释35倍的条件下也显示出21.2％的抑制活性。另外，对于3mg/kg给药组，在大腿肌肉内抗体浓度稀释350倍的条件下显示出59.9％的抑制活性。也就是说，在给药0.3及3mg/kg的h1f.6抗体的组的大腿肌肉组织中，可以确认通过抑制人NGF与其受体trkA的结合从而具有人NGF机能抑制活性。

从以上可知，通过局部给药作为本发明的抗人NGF抗体Fab片段的h1f.6抗体以确保在靶组织中的抗体浓度及人NGF结合活性，由此抑制人NGF与其受体的结合。作为本发明的抗人NGF抗体Fab片段的h1f.6抗体可作为以更少的局部给药量而表现出靶组织的局部药效的优异医药品的可能性可望提高。

(实施例8：大鼠脚掌切开术后疼痛模型中的镇痛效果评价)

采用被视为反映临床上的术后疼痛的大鼠脚掌切开术后疼痛模型(Pain,2005,Vol.117,p.68-76)，评价将h1f.6抗体局部给药至手术部位时对术后疼痛的镇痛效果。专利文献3中示出了：完全人型抗人NGF抗体1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG通过静脉内给药的全身给药而具有本模型中的镇痛效果。在本试验中，当评价h1f.6抗体的局部给药所引起的对术后疼痛的镇痛效果时，使用了1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG的局部给药及全身给药作为比较对照。

具体而言，将手术组设为每组10只，非手术组设为5只，并设定了以下5个组：非手术组、溶剂(20mM Citrate,120mM NaCl,pH6)组、将900μg的h1f.6抗体局部给药至脚掌的组、将900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG局部给药至脚掌的组、以及以1mg/kg将1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG静脉内给药的组。脚掌局部给药通过以下方式进行：将用30mg/mL抗体溶液30μL浸透膨润约2mg小片的Spongel(注册商标)薄片(Astellas制药)而得的物质埋入至切开的脚底的肌肉部分中。另外，在溶剂组以及以1mg/kg将1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG静脉内给药的组中，埋入用溶剂浸透膨润的Spongel薄片。在本评价中，在异氟烷麻醉下以距脚跟末端约5mm部分为起点朝脚尖方向直线地切开左后肢脚掌约10mm，并将露出的脚底肌肉纵向地切开后，再使肌肉恢复位置，埋入Spongel薄片并以尼龙缝线进行2个地方的褥式缝合。测定手术结束24小时、48小时、72小时之后的疼痛阈值。对于疼痛阈值，使用Dynamic plantar aesthesiometer(Ugo Basile公司)，测定显示出对于向大鼠脚掌加压的逃避行动时的压力。

作为疼痛阈值，算出引起各组个体的回避行动时的压力阈值的3次的算术平均，将非手术组的疼痛阈值设为100％，将溶剂组的疼痛阈值设为0％，从而算出各药剂组的疼痛阈值的改善率。其结果是，术后24小时后的将900μg h1f.6抗体局部给药至脚掌的组、将900μg1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG局部给药至脚掌的组、以及以1mg/kg将1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG静脉内给药的组的疼痛阈值改善率分别为34％、49％以及46％，各药剂给药组的疼痛阈值在Student-t检验中均可看出相对于溶剂组具有p<0.05的显著改善效果。另外，术后48小时后的将900μg h1f.6抗体局部给药至脚掌的组、将900μg1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG局部给药至脚掌的组、以及以1mg/kg将1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG静脉内给药的组的疼痛阈值改善率分别为38％、31％以及34％，各药剂给药组的疼痛阈值在Student-t检验中均可看出相对于溶剂组具有p<0.05的显著改善效果；术后72小时后的将900μg h1f.6抗体局部给药至脚掌的组、将900μg1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG局部给药至脚掌的组、以及以1mg/kg将1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG静脉内给药的组的疼痛阈值改善率分别为26％、33％以及28％，各药剂给药组的疼痛阈值在Student-t检验中均可看出相对于溶剂组具有p<0.05的显著改善效果。此时，对于术后24小时后、48小时后以及72小时后的任一者，在Tukey多重比较检验中，在将900μg h1f.6抗体局部给药至脚掌的组、将900μg 1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG局部给药至脚掌的组、以及以1mg/kg将1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG静脉内给药的组这三个组之间，疼痛阈值未发现p<0.05的显著差异，证明了这三个组之间观察到的镇痛药效在术后24小时后、48小时后以及72小时后的任一者均为药理学上同等的。

(实施例9：经由局部给药的血浆中及组织中的药物浓度评价)

为了评价在实施例8中评价时的各抗体的脚底肌肉中及血浆中的浓度，按照与实施例8相同的方法并以使大鼠为各n＝3的方式设定将900μg h1f.6抗体局部给药至脚掌的组、将900μg1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG局部给药至脚掌的组、以及以1mg/kg将1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG静脉内给药的组，并通过ECL分析法测定24小时后的脚底肌肉中及血浆中的抗体浓度。脚掌局部给药通过与实施例8相同的方式进行，即：将用30mg/mL抗体溶液30μL浸透膨润约2mg小片的Spongel(注册商标)薄片(Astellas制药)而得到的物质埋入至切开的脚底肌肉部分中并予以缝合。

对于脚底肌肉中的抗体浓度，测定用9倍量的脚掌组织匀浆液(10mM tris,137mMNaCl,1％Triton X-100,10％Glycerol,cOmplete,Mini(Roche公司),pH8.0)将采集的脚底肌肉匀浆化后的试样中的浓度，采用将该浓度乘以10倍后的值。在利用ECL分析法的测定中使用了作为两种抗1-15抗体的ANA-IBL-13A和生物素化ANA-IBL-52A。需要说明的是，在此所使用的生物素化ANA-IBL-52A是采用Biotin Labeling Kit-NH2(同仁化学，LK03)并依照技术手册将ANA-IBL-52A生物素化而得的物质。

以下示出了ECL分析法的方法。将ANA-IBL-13A用TBS稀释为5000ng/mL，对多阵列96孔板(Meso Scale Discovery公司，L15XA-3)按每个孔添加25μL。通过在室温下对孔板进行培养1小时，从而使ANA-IBL-13A固相化。通过反向离心除去ANA-IBL-13A固相液，采用清洗液(含有0.05％Tween-20的TBS)清洗孔板3次，将Blocker Casein in TBS(Thermo公司，37532)按每个孔添加150μL。在室温下对孔板进行培养1小时之后，通过反向离心除去Blocker Casein in TBS。采用清洗液清洗孔板3次，通过稀释液(含有0.05％Tween-20的Blocker Casein in TBS)将血浆试样及脚底肌肉匀浆稀释10倍，按每个孔添加25μL。为了制作血浆试样的校准曲线，准备了采用含有10％的未给药抗体的血浆的稀释液从333ng/mL至0.017ng/mL稀释为10级而得到的h1f.6抗体及1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG，作为对照，准备了含有10％的未给药抗体的血浆的稀释液。为了制作脚底肌肉匀浆的校准曲线，准备了采用含有10％的未给药抗体的脚底肌肉匀浆的稀释液从333ng/mL至0.017ng/mL稀释为10级而得到的h1f.6抗体及1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG。作为对照，准备了含有10％的未给药抗体的脚底肌肉匀浆的稀释液。在室温下对孔板进行培养1小时之后，通过反向离心除去溶液。采用清洗液清洗孔板3次，并将采用稀释液稀释成1000ng/mL的生物素化ANA-IBL-52A按每个孔添加25μL，在室温下对孔板进行培养1小时。通过反向离心除去溶液，采用清洗液清洗孔板3次，添加25μL的采用稀释液稀释成500倍后的MSD SULFO-TAG labeledStreptavidin(Meso Scale Discovery公司，R32AD-1)。在室温下对孔板进行培养1小时之后，通过反向离心除去溶液，采用清洗液清洗孔板3次。添加150μL的采用超纯水(MilliQ(注册商标)，Merck公司)稀释成2倍后的MSD Read Buffer T(4x)(Meso Scale Discovery公司，R92TC-1)，并通过SECTOR Imager6000(Meso Scale Discovery公司)测定其电化学发光。

当计算抗体浓度时，制作了校准曲线。回归方程式通过4参数逻辑曲线或5参数逻辑曲线回归进行解析。从校准曲线算出各点的血浆中及脚底肌肉中的抗体浓度。再将各试验重复进行二次，求得所算出的浓度的算术平均。对于本试验中的h1f.6抗体的定量限，血浆中浓度为0.2ng/mL，脚底肌肉中浓度为2ng/mL；对于完全人型抗NGF抗体1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG的定量限，血浆中浓度为0.5ng/mL，脚底肌肉中浓度为2ng/mL。

对于将900μg h1f.6抗体局部给药至脚掌的组、将900μg1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG局部给药至脚掌的组、以及以1mg/kg将1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG静脉内给药的组中的各个组的给药24小时之后的脚底肌肉中浓度的测定结果，它们分别为132ng/mL、46.2ng/mL以及24.1ng/mL。将h1f.6抗体给药至脚掌内的组的脚底肌肉中浓度是最高的。另一方面，给药24小时后的血浆中浓度分别为：低于0.230ng/mL(3例中，1例为0.230ng/mL，2例为低于0.2ng/mL)、65.1ng/mL以及396ng/mL，将h1f.6抗体给药至脚掌内的组的血浆中浓度是最低的。

对于将900μg的h1f.6抗体局部给药至脚掌的组、将900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG局部给药至脚掌的组、以及以1mg/kg将1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG静脉内给药的组中的各个组，基于各抗体的脚底肌肉中浓度及血浆中浓度，算出给药24小时后的脚底肌肉中/血浆中的浓度比。此时，将900μg的低于定量限的h1f.6抗体局部给药至脚掌而得到的个体在给药24小时后的血浆中浓度设为定量限0.2ng/mL。

对于将900μg的h1f.6抗体局部给药至脚掌的组、将900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG局部给药至脚掌的组、以及以1mg/kg将1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG静脉内给药的组中的各个组，其给药24小时之后的脚底肌肉中/血浆中的浓度比分别为628、0.71以及0.061。与静脉内给药相比，通过进行脚掌内给药，1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG的脚底肌肉中/血浆中的浓度比要高10倍以上。在对脚掌的局部给药组的比较中，与1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG相比，h1f.6抗体的脚底肌肉中/血浆中的浓度比为800倍以上。

以上示出，作为本发明的抗人NGF抗体Fab片段的h1f.6抗体的局部给药在保持目标局部中的药剂浓度的同时，还可降低全身血流中的抗体浓度，还示出与完全人型抗人NGF抗体1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG相比，在非常有效地保持局部处的药剂浓度的同时，还降低全身血流中的药剂浓度。因此，对于本发明的抗人NGF抗体Fab片段，其成为在表现出局部处的药效的同时还降低全身性副作用的优异医药品的可能性可望提高。

工业实用性

本发明的抗人NGF抗体Fab片段可期待用于术后疼痛的治疗。本发明的抗人NGF抗体Fab片段可期待特别用作在表现出局部处的药效的同时还降低基于全身性的血中暴露的副作用的优异药剂。

序列表自由文本

在以下序列表的数字标题<223>中，记载了“人工序列(Artificial Sequence)”的说明。具体而言，序列表的序列编号1表示的碱基序列为h1f.6抗体的重链片段的碱基序列，序列表的序列编号5表示的氨基酸序列为经由序列编号1编码的重链片段的氨基酸序列。序列表的序列编号2表示的碱基序列为h1f.7抗体的重链片段的碱基序列，序列表的序列编号6表示的氨基酸序列为经由序列编号2编码的重链片段的氨基酸序列。序列表的序列编号3表示的碱基序列为h1f.8抗体的重链片段的碱基序列，序列表的序列编号7表示的氨基酸序列为经由序列编号3编码的重链片段的氨基酸序列。序列表的序列编号4表示的碱基序列为1-15(N52D-A)-Fab’片段的轻链的碱基序列，序列表的序列编号8表示的氨基酸序列为经由序列编号4编码的轻链的氨基酸序列。序列表的序列编号9表示的碱基序列为本发明的抗人NGF抗体Fab片段的重链可变区的碱基序列，序列表的序列编号10表示的氨基酸序列为经由序列编号9编码的重链可变区的氨基酸序列。序列表的序列编号11表示的碱基序列为本发明的抗人NGF抗体Fab片段的轻链可变区的碱基序列，序列表的序列编号12表示的氨基酸序列为经由序列编号11编码的轻链可变区的氨基酸序列。

SEQUENCE LISTING

<110> 安斯泰来制药株式会社

<120> 新型抗人NGF抗体Fab片段

<130> FA1535-16021

<150> JP2015-104806

<151> 2015-05-22

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码h1f.6重链片段的DNA

<400> 1

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctgggt ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcgaccata gtggaagcac caacaacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtaggcacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agatgggggc 300

cccgaatcgg ggatgggggc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcc 360

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actcccttag tagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgac 675

<210> 2

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码h1f.7重链片段的DNA

<400> 2

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctgggt ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcgaccata gtggaagcac caacaacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtaggcacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agatgggggc 300

cccgaatcgg ggatgggggc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcc 360

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actcccttag tagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gt 672

<210> 3

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码h1f.8重链片段的DNA

<400> 3

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctgggt ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcgaccata gtggaagcac caacaacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtaggcacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agatgggggc 300

cccgaatcgg ggatgggggc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcc 360

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actcccttag tagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgcagcc 678

<210> 4

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码1-15(N52D-A)-Fab'片段轻链的DNA

<400> 4

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gattcaacta tttgggttgg 120

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac tctgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300

tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaacgga ctgtggctgc accatctgtc 360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657

<210> 5

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> h1f.6重链片段

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp

225

<210> 6

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> h1f.7重链片段

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 7

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> h1f.8重链片段

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Ala Ala

225

<210> 8

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 1-15(N52D-A)-Fab'片段轻链

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 9

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗人NGF抗体的VH基因

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(363)

<400> 9

cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag 48

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt ggt tac 96

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

tac tgg agc tgg gtc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att 144

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

ggg gaa atc gac cat agt gga agc acc aac aac aac ccg tcc ctc aag 192

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

agt cga gtc acc ata tca gta ggc acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg 240

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

aag ctg agc tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt tcg 288

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

aga gat ggg ggc ccc gaa tcg ggg atg ggg gct ttt gat atc tgg ggc 336

Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

caa ggg aca atg gtc acc gtc tcc tca 363

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗人NGF抗体的VL基因

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(339)

<400> 11

gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctg cat agt 96

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

aat gga ttc aac tat ttg ggt tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct 144

Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt act ctg aaa atc 240

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct 288

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

cta caa act ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 336

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

cgg 339

Arg

<210> 12

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

Claims

1.一种抗人NGF抗体Fab片段，其选自由以下的(a)和(b)所组成的组：

2.根据权利要求1所述的抗人NGF抗体Fab片段，其包含由序列编号5所示的氨基酸序列构成的重链片段以及由序列编号8所示的氨基酸序列构成的轻链。

3.根据权利要求1所述的抗人NGF抗体Fab片段，其中，翻译后修饰是重链可变区N末端的焦谷氨酰化。

4.根据权利要求1所述的抗人NGF抗体Fab片段，其包含由其中序列编号5的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰成焦谷氨酸的序列编号5所示的氨基酸序列构成的重链片段、以及由序列编号8所示的氨基酸序列构成的轻链。

5.一种表达载体，其为：

包含由编码权利要求1所述的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列构成的多核苷酸、以及由编码该抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列构成的多核苷酸的表达载体。

6.一种宿主细胞，其由权利要求5所述的表达载体进行了转化。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其选自由以下的(a)和(b)所组成的组：

(a)由包含由编码权利要求1所述的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列构成的多核苷酸、以及由编码该抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列构成的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及

(b)由包含由编码权利要求1所述的抗人NGF抗体Fab片段的重链片段的碱基序列构成的多核苷酸的表达载体和包含由编码该抗人NGF抗体Fab片段的轻链的碱基序列构成的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。

8.一种抗人NGF抗体Fab片段的生产方法，包括培养权利要求7所述的宿主细胞、并使抗人NGF抗体Fab片段表达的步骤。

9.一种抗人NGF抗体Fab片段，其由权利要求8所述的方法来生产。

10.一种医药组合物，其包含权利要求1至4和9中任一项所述的抗人NGF抗体Fab片段、以及药学上可接受的载体。

11.根据权利要求10所述的医药组合物，其为术后疼痛的治疗用局部医药组合物。

12.一种医药组合物，其包含权利要求2所述的抗人NGF抗体Fab片段、权利要求4所述的抗人NGF抗体Fab片段以及药学上可接受的载体。

13.根据权利要求12所述的医药组合物，其为术后疼痛的治疗用局部医药组合物。

14.权利要求1至4和9中任一项所述的抗人NGF抗体Fab片段在术后疼痛的治疗用局部医药组合物的制造中的应用。

15.根据权利要求1至4和9中任一项所述的抗人NGF抗体Fab片段，其用于在术后疼痛的治疗中经由局部给药而使用。