TWI432453B

TWI432453B - 改良型人化抗人α９整連蛋白抗體

Info

Publication number: TWI432453B
Application number: TW098100558A
Authority: TW
Inventors: Kenji Uehara; Hirofumi Higuchi; Toshihiro Nakashima; Daisuke Ishikawa; Nobuchika Yamamoto; Hirotada Fujita; Fumihiko Sakai
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2008-01-11
Filing date: 2009-01-09
Publication date: 2014-04-01
Also published as: EP2243829A4; KR20100110852A; IL206898A0; RU2503720C2; BRPI0905656A8; RU2010133550A; CA2711882A1; IL206898A; CY1115897T1; EP2239323A1; EP2239323A4; ES2519047T3; MX2010007515A; AU2009203369A1; US20110014193A1; AU2009203369B2; CA2711882C; HRP20141110T1; CN101918549B; KR101634636B1

Description

改良型人化抗人α9整連蛋白抗體

本發明係關於改良型人化抗人α9整連蛋白(integrin)抗體。詳言之，為具有結合人α9整連蛋白之蛋白質而抑制α9整連蛋白依存性之細胞附著的活性，而與小鼠抗人α9整連蛋白抗體Y9A2比較時活性及/或物性被改善的改良型人化Y9A2抗體。該人化抗體被期待作為類風濕性關節炎等之自體免疫疾病、過敏或移植片排斥反應等之免疫疾病、及與其他α9整連蛋白病態形成有關的各種疾病之診斷、預防或治療藥。

整連蛋白(integrin)為細胞表面糖蛋白質之一者，主要作為對細胞外基質(膠原、層黏運蛋白(laminin)等)之細胞附著或免疫球蛋白家族之成員(ICAM-1、VCAM-1等)之受體的機能，且為參與自細胞外基質之訊息傳導的附著分子。因此，細胞接收來自細胞外基質之訊號，而誘導分化、增殖、細胞死亡等。整連蛋白為由α鏈及β鏈兩者之次單元而成的異二聚體(heterodimer)，存有相異的α鏈、β鏈，而有多樣組合，整連蛋白超家族為存有24種類。整連蛋白剔除小鼠之全部次單元為致死的或致病的，暗示於生命之維持上各個整連蛋白為必要。因此，促進將周邊環境傳達於細胞而反應的整連蛋白，被認為於生命現象之所有場面中作用，參與各式各樣病態。

此等生存上不可或缺的整連蛋白被認為即使於疾病狀態下亦扮演角色，顯示抑制有效於病態改善的情形。例如，於血小板特異性整連蛋白αIIbβ3之抑制，已認可PCTA再狹窄治療藥Abciximab(商品名：ReoPro；Eli Lilly公司)。又，己認可α4β1(VLA4)抑制劑natalizumab(商品名：Antegren；ELAN公司)作為多發性硬化症治療藥。再者，αvβ3抑制劑Vitaxin(MEDIMMUNE公司)亦由於此血管新生抑制作用、破骨細胞活性化抑制作用等，而有現在治療試驗進展的狀況。

一般認為整連蛋白α9β1於巨嗜細胞、NKT細胞、樹狀細胞(Dendritic Cell)、嗜中性球中表現，而完成此等炎症細胞之浸潤或附著、骨吸收等重要任務。又最近，破骨細胞之形成中整連蛋白α9β1之參與已被報告，暗示對骨破壞之參與(非專利文獻1)。作為此配位體已知有切斷型骨橋蛋白(Osteopontin)(N末端OPN)、VCAM-1、Tenascin-C等。臨床上亦認為類風濕性關節炎患者之滑膜組織中整連蛋白α9β1為有意義的上昇(非專利文獻2)。

因此，若可開發特異性結合α9整連蛋白蛋白質，且具有抑制α9整連蛋白依存之細胞附著的活性之單株抗體，期待其有用於α9整連蛋白參與之病態形成之各種疾病之診斷、預防或治療。

迄今，作為顯示對人α9整連蛋白之機能抑制作用的抗體，已報告有小鼠單株抗體之Y9A2(非專利文獻3)、1K11、24I11、21C5及25B6(專利文獻1)、28S1(專利文獻2)。此等抗體由活體外實驗結果顯示可抑制人α9依存之細胞附著，但其中Y9A2亦抑制對骨橋蛋白或Tenascin-C任一者之細胞附著，作為抗α9整連蛋白之抗體醫藥之候補上被視為最有希望者。

尤其，Y9A2由於是以抗原免疫小鼠而製作之來自小鼠的抗體，由安全性(抗原性之誘發)及有效性(半減期之縮短)之觀點，以此樣投與人類為現實上不可能。因此，維持Y9A2之活性，並變換具有人抗體之胺基酸序列之分子之改變，即，進行人化為必要。

今日，作為人化抗體之製作法，基於Winter氏等人想到之進行互補決定區(以下，表示為CDR)胺基酸之移植的方法(非專利文獻4)為最一般性的方法。其中，由成為CDR胺基酸之供給者之異種抗體，相對於成為CDR之接受者的人抗體，不僅移植CDR，亦一併移植參與CDR之構造保持或與抗原結合的CDR外胺基酸，所謂框架(framework)區(以下，表示為FR)，亦已充分得知係為了再現供給者抗體所具原本活性上為重要(非專利文獻4及5)。

然而，基於CDR移植之人化抗體之製作中，存有一些課題。首先第一者，亦為最一般性的課題係可列舉即使適切進行供與者抗體之活性再現上必要的FR胺基酸之選擇，獲得供給者抗體對抗原之親和性或生物活性上之提升的人化抗體為有困難的。

近年，嵌合抗體、人化抗體及人抗體有許多以單株醫藥品上市，但任一者之有效投與量皆為每1kg體重為數mg之極多量。因此，抗體醫藥品必變得昂貴，結果造成患者經濟負担或醫療成本的增加。規定此抗體醫藥之有效投與量的主要要因可列舉抗體對抗原的親和性或於體內存在的抗原量。由此等觀點，尤以使抗體對抗原之親和性提升上，所謂與投與量之減低有關，而結果亦導致患者之經濟負担或醫療成本減低上極有益的改良。

因此，為了實現抗體對抗原之親和性提升，大多採用於抗體之可變區內導入胺基酸取代之方法。然而，抗體或抗原若相異，由於CDR胺基酸之序列或立體構造、抗原一抗體相互作用有關的胺基酸之位置亦會變化，將與CDR應一起移植的FR胺基酸之位置規定為可適用於全部抗體者為事實上不可能。

又，作為其他課題，可列舉如基於CDR移植的人化抗體之製作中，一般將為供與者之小鼠抗體之CDR胺基酸全部移植至模板人抗體，但來自小鼠抗體之CDR胺基酸序列為與抗原之結合上重要者，顯示對人之抗原性，亦常常成為產生抗個體基因型(idiotype)抗體的原因。

即，人化抗體之製作中，為了持續迴避人類中抗原性發生或抗體之安定性降低，且賦予較供與者抗體更高活性，進行適切的接受者抗體之選擇，或應取代的CDR胺基酸及FR胺基酸之選擇為不可或缺，對此等一般認為需相當之創意工夫及嘗試錯誤。

專利文獻1　WO 2006/075784

專利文獻2　WO 2008/007804

非專利文獻1　Journal of Bone and Mineral Research,2006,21:1657-1665

非專利文獻2　The Journal of Clinical Investigation,2005,115:1060-1067

非專利文獻3　Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.,1996,15:664-672

非專利文獻4　Science,239,1534-1536(1988)

非專利文獻5　Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86,10029-10033(1989)

本發明之課題係提供克服與人化抗體製作有關之上述諸課題，並與供與者小鼠抗人α9整連蛋白抗體(Y9A2)比較之下活性及/或物性被改善的人化抗人α9整連蛋白抗體。

即，本發明為包含醫學上或產業上有用的物質‧方法之下述(1)～(15)之發明。

(1)一種人化抗人α9整連蛋白抗體，其包含選自以下任一種之重鏈可變區及輕鏈可變區：

(a)由序列編號11所示胺基酸序列而成之重鏈可變區、及序列編號17所示胺基酸序列而成之輕鏈可變區；

(b)序列編號13所示胺基酸序列而成之重鏈可變區、及序列編號17所示胺基酸序列而成之輕鏈可變區；或

(c)序列編號15所示胺基酸序列而成之重鏈可變區、及序列編號9所示胺基酸序列而成之輕鏈可變區。

(2)如上述(1)記載之人化抗人α9整連蛋白抗體，其中該抗體之重鏈恆定區為人Igγ1。

(3)如上述(1)記載之人化抗人α9整連蛋白抗體，其中該抗體之輕鏈恆定區為人Igκ。

(4)如上述(1)記載之人化抗人α9整連蛋白抗體，其中該抗體之重鏈恆定區為人Igγ1，該抗體之輕鏈恆定區為人Igκ。

(5)如上述(1)記載之人化抗人α9整連蛋白抗體，其包含序列編號19所示胺基酸序列而成之重鏈、及序列編號25所示胺基酸序列而成之輕鏈。

(6)如上述(1)記載之人化抗人α9整連蛋白抗體，其包含序列編號21所示胺基酸序列而成之重鏈、及序列編號25所示胺基酸序列而成之輕鏈。

(7)如上述(1)記載之人化抗人α9整連蛋白抗體，其包含序列編號23所示胺基酸序列而成之重鏈、及序列編號27所示胺基酸序列而成之輕鏈。

(8)一種多核苷酸，其包含編碼如上述(1)中記載之人化抗人α9整連蛋白抗體之重鏈可變區的序列。

(9)一種多核苷酸，其包含編碼如上述(1)中記載之人化抗人α9整連蛋白抗體之輕鏈可變區的序列。

(10)一種表現載體，其包含如上述(8)中記載之多核苷酸及/或上述(9)中記載之多核苷酸。

(11)一種宿主細胞，其導入如上述(10)中記載之表現載體。

(12)一種生產人化抗人α9整連蛋白抗體之方法，其包含培養如上述(11)中記載之宿主細胞，並使人化抗人α9整連蛋白抗體表現的步驟。

(13)一種類風濕性關節炎之治療藥，其包含如上述(1)～(7)中任一項記載之人化抗人α9整連蛋白抗體。

(14)一種預防或處理類風濕性關節炎用之方法，其包含投與如上述(1)～(7)中任一項記載之人化抗人α9整連蛋白抗體之治療有效量的步驟。

(15)一種如上述(1)～(7)中任一項記載之人化抗人α9整連蛋白抗體之用途，其用於製造預防或處理類風濕性關節炎用之醫藥。

依據本發明，提供與供與者小鼠抗人α9整連蛋白抗體比較之下活性及/或物性被改善的人化抗人α9整連蛋白抗體。本發明之人化抗人α9整連蛋白抗體經由人α9整連蛋白與其複數之配位體之相互作用的遮斷，而為具有強力抗炎症作用或骨破壞抑制作用者，而有用於人α9整連蛋白參與的病態形成之各種疾病之預防或治療。而且，此等本發明之人化抗人α9整連蛋白抗體帶來投與量之減低、投與間隔之擴大、投與方法之改善(例如，皮下注射劑)等之臨床適用上優異的改善，而大大地寄望治療有效性及患者服從性之改善。

實施發明之最佳形態

以下，詳述本發明。

本發明者們，不斷創新檢討小鼠抗人α9整連蛋白抗體Y9A2之人化抗體之製作的結果，成功製作出與Y9A2比較下活性及/或物性為有意義被改善之3種人化抗人α9整連蛋白抗體(以下，亦稱為人化Y9A2抗體或RY9A2)。

具體而言，本發明者們首先最初將小鼠抗人α9整連蛋白抗體Y9A2(以下，亦稱為小鼠Y9A2抗體)之重鏈可變區(以下，亦稱為VH)及輕鏈可變區(以下，亦稱為VL)之CDR胺基酸序列及數個地方之FR胺基酸移植至模板人抗體上，而製作具有與小鼠Y9A2抗體同等程度之活性之2種人化抗人α9整連蛋白抗體RY9A2v501及RY9A2v801。CDR依據Kabat等人分類(Sequences of Proteins of Immunological Interest 4^th ed‧，Public Health Service，NIH,Washington DC,1987)決定。RY9A2v501及RY9A2v801之VH之胺基酸序列各自為序列編號5及序列編號7。其中，RY9A2v801之VH為將RY9A2v501之VH之來自小鼠Y9A2抗體的FR胺基酸殘基中的4個胺基酸殘基取代為對應的模板人抗體胺基酸。兩個人化抗體之VL之胺基酸序列為序列編號9所示者，為兩抗體共通。

其次，本發明者們為了持續迴避人化抗體抗原性發生的危險性或抗體保存安定性的降低，並製作抗人α9整連蛋白之具有較原始小鼠Y9A2抗體更高親和性的人化抗體，而檢討上述2種人化抗體之VH及VL之CDR中的胺基酸序列之取代。此結果確認以下所示3種人化抗人α9整連蛋白抗體與原始小鼠Y9A2抗體相比較之下具有意義的改善活性及/或物性。

1)一種人化抗人α9整連蛋白抗體，其包含序列編號11所示胺基酸序列而成之重鏈可變區、及序列編號17所示胺基酸序列而成之輕鏈可變區。

2)一種人化抗人α9整連蛋白抗體，其包含序列編號13所示胺基酸序列而成之重鏈可變區、及序列編號17所示胺基酸序列而成之輕鏈可變區。

3)一種人化抗人α9整連蛋白抗體，其包含序列編號15所示胺基酸序列而成之重鏈可變區、及序列編號9所示胺基酸序列而成之輕鏈可變區。

本發明之人化抗人α9整連蛋白抗體基於揭示於本說明書之其重鏈可變區及輕鏈可變區之序列情報，使用該領域公知之方法，由本項技術領域者可容易製作。具體而言，製作具有編碼本發明之人化抗體之重鏈可變區胺基酸的鹼基序列的重鏈可變區基因片斷、及具有編碼本發明之人化抗體之輕鏈可變區胺基酸的鹼基序列的輕鏈可變區基因片斷。之後，將此可變區基因與人抗體適當群之恆定區基因連結而製作人化抗體基因。其次，將此人化抗體基因連結適當表現載體，導入培養細胞中。最後培養此培養細胞而可自培養上清液獲得人化抗體。

編碼上述本發明之人化抗體之重鏈及輕鏈可變區胺基酸之各可變區基因片斷，例如，基於以該重鏈及輕鏈可變區之鹼基序列或該重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列所設計的鹼基序列，利用本項技術領域公知之基因合成方法可合成。作為此等基因合成方法，可使用WO90/07861記載之抗體基因合成方法等之本項技術領域者公知之各種方法。又，一旦取得本發明之抗體之可變區基因片斷，經由於此基因片斷之所定部位導入變異，亦可取得本發明之其他抗體。作為此等變異導入方法，可使用部位專一性變異誘發法(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987)Publish. John Wiley ＆ Sons Section 8.1-8.5)等本項技術領域者公知之各種方法。

其次，使上述可變區基因片斷與人抗體之恆定區基因連結而製作人化抗體基因。所使用之人抗體之恆定區亦可選擇任一種亞群之恆定區(例如，作為重鏈為γ1、γ2、γ3或γ4，作為輕鏈為λ或κ鏈之恆定區)，但較佳可使用人Igγ1作為重鏈恆定區，又，可使用人Igκ作為輕鏈恆定區。

繼續於此人化抗體基因之製作，關於人化抗體基因之對表現載體之導入、表現載體之對培養細胞之導入、培養細胞之培養、抗體之純化等，使用本項技術領域公知之各種方法，或可參照WO2007/139164或WO2003/027151記載之人化抗人骨橋蛋白抗體之製作方法而進行。

作為與如上述所得之人化抗體基因連結的表現載體，可使用國際公開公報WO94/20632中記載之AG-γ1或AG-κ等表現載體，但只要可表現人化抗體基因者即可未特別限制。又，若利用作為表現載體之AG-γ1或AG-κ等之預先具有人Ig恆定區基因者，於此僅插入人化抗體可變區基因而成為具有人化抗體基因的表現載體為較佳。又，關於表現載體，為促進抗體之向細胞外分泌表現亦可使用引導(leader)序列，作為此等引導序列，可使用來自Y9A2之引導序列或來自其他抗體(例如，WO2007/139164記載之人化抗骨橋蛋白抗體)之引導序列。

上述之表現載體經由例如FreeStyle 293 Expression system(Invitrogen)、磷酸鈣法等之使用而被導入培養細胞中。

作為導入表現載體之培養細胞，可使用例如293細胞、CHO-DG44細胞等之培養細胞，將其依常法培養為宜。

上述培養後，於培養上清液中蓄積之抗體，可經由使用各種管柱層析法，例如，使用蛋白質A管柱之層析法純化。

作為測定所得人化抗體之對人α9整連蛋白之結合活性的方法有ELISA或FACS等之方法。例如，使用ELISA之場合，將使α9整連蛋白表現之細胞(例如，SW480細胞)固定於ELISA平盤，對此添加人化抗體使反應後，添加以西洋山葵過氧化酶(HRP)等酵素標識之人IgG抗體等之二次抗體使反應，洗淨後，添加發色基質(例如，HRP標識之場合為TMB)而測定吸光度。

作為評價所得人化抗體是否具有抗人α9整連蛋白之機能抑制活性的方法，例如，可經由J. Biol. Chem.,274：36328-36334,1999記載之抗人骨橋蛋白分子的人α9整連蛋白分子依存性細胞附著之抑制試驗而確認。即，將為α9之配位體之一者的N末端OPN(骨橋蛋白經由凝血酶(thrombin)切斷後之N末端側片段；以下，表示為nOPN)之RAA改變體(為了抑制與其他整連蛋白之反應將RGD序列改變為RAA者；以下，表示為nOPN-RAA)固定於平盤，進行阻斷(blocking)。添加各種人化抗體後，添加α9表現細胞，於37℃培育1小時。細胞使用結晶紫(crystal violet)及甲醇進行固定‧染色，洗淨後，將附著的細胞中之色素以Triton X-100抽出，於波長595nm測定吸光度。

再者，作為更詳細評價所得人化抗體是否具有抗人α9整連蛋白之機能抑制活性之方法，可列舉例如，基於Molecular Biology of the cell,12:3214-3225,2001記載之細胞游離抑制試驗之方法。即，將nOPN-RAA固定於Transwell之上層後收取於平盤，之後添加含10% FCS之F15培養基於下層。上層中與α9表現細胞一起添加人化抗體，於37℃培育16小時。之後，於Transwell之下層中游離的細胞，使用例如，QCM Chemotaxis Cell Migration 24-well Assay套組(Millipore公司)而定量化。

本發明之3種人化抗人α9整連蛋白抗體，經由使用本項技術領域公知之方法，合成(編碼序列編號11、13或15所示VH胺基酸序列的DNA及編碼序列編號17或9所示之VL胺基酸序列的DNA，將此等與適當群之人抗體恆定區基因，較佳為重鏈中之人Igγ1恆定區基因、輕鏈中之人Igκ恆定區基因連結而構築人抗體基因，使用本項技術領域公知之各種方法或WO02/081522或WO03/027151記載之方法等，將該人化抗體基因導入表現載體，將該表現載體導入培養細胞而培養該培養細胞，自所得培養物純化抗體製而可容易取得。較佳為編碼序列編號11、13或15所示VH胺基酸序列之DNA各自含有序列編號12、14或16所示鹼基序列。較佳為編碼序列編號17或9所示VL胺基酸序列之DNA各自含有序列編號18或10所示鹼基序列。

連結序列編號11所示重鏈可變區及人Igγ1恆定區而得之本發明較佳人化抗體重鏈為序列編號19所示胺基酸序列而成之重鏈。連結序列編號17所示輕鏈可變區及人Igκ恆定區而得之本發明較佳人化抗體輕鏈為序列編號25所示胺基酸序列而成之輕鏈。較佳地，編碼序列編號19所示胺基酸序列而成之人化抗體重鏈的DNA包含序列編號20所示鹼基序列。較佳地，編碼序列編號25所示胺基酸序列而成之人化抗體輕鏈的DNA包含序列編號26所示鹼基序列。含有序列編號19所示胺基酸序列而成之重鏈以及序列編號25所示胺基酸序列而成之輕鏈的本發明人化抗α9整連蛋白抗體可列舉後述實施例所示RY9A2v12(M34L)012抗體。

連結序列編號13所示重鏈可變區及人Igγ1恆定區而得之本發明的較佳人化抗體重鏈為序列編號21所示胺基酸序列而成之重鏈。連結序列編號17所示輕鏈可變區及人Igκ恆定區而得之本發明較佳人化抗體輕鏈為序列編號25所示胺基酸序列而成之輕鏈。較佳地，編碼序列編號21所示胺基酸序列而成之人化抗體重鏈的DNA包含序列編號22所示鹼基序列。較佳地，編碼序列編號25所示胺基酸序列而成之人化抗體輕鏈的DNA包含序列編號26所示鹼基序列。包含序列編號21所示胺基酸序列而成之重鏈及序列編號25所示胺基酸序列而成之輕鏈之本發明人化抗α9整連蛋白抗體可列舉後述實施例所示RY9A2v11(M34L)012抗體。

連結序列編號15所示重鏈可變區及人Igγ1恆定區而得之本發明較佳人化抗體重鏈為序列編號23所示胺基酸序列而成之重鏈。連結序列編號9所示輕鏈可變區及人Igκ恆定區而得之本發明較佳人化抗體輕鏈為序列編號27所示胺基酸序列而成之輕鏈。較佳地，編碼序列編號23所示胺基酸序列而成之人化抗體重鏈的DNA包含序列編號24所示鹼基序列。較佳地，編碼序列編號27所示胺基酸序列而成之人化抗體輕鏈的DNA包含序列編號28所示鹼基序列。包含序列編號23所示胺基酸序列而成之重鏈及序列編號27所示胺基酸序列而成之輕鏈之本發明人化抗α9整連蛋白抗體可列舉後述實施例所示RY9A2v05(IAW)01抗體。

如此所得之本發明人化抗人α9整連蛋白抗體視需要純化後，依常法經製劑化，可用於類風濕性關節炎等之自體免疫疾病、過敏、移植片排斥反應等之免疫疾病、骨質疏鬆症、慢性閉塞性肺疾病、癌等之α9整連蛋白參與病態形成之疾病的治療。

本發明之人化抗人α9整連蛋白抗體較佳可用於作為類風濕性關節炎治療劑。作為此等治療劑之劑型例，可作成注射劑、點滴用劑等之非經口劑，經由靜脈內投與、皮下投與等投與為較佳。又，於製劑化時，在藥學可容許的範圍內，視此等劑型可使用載體或添加劑。

於上述製劑化時本發明之人化抗人α9整連蛋白抗體之添加量依患者症狀之程度、年齡或使用的製劑之劑型或抗體之結合力價等而異，但例如使用0.1mg/kg至100mg/kg左右為宜。

又本發明提供編碼本發明之人化抗人α9整連蛋白抗體或其重鏈及/或輕鏈可變區的多核苷酸、及含其之表現載體。本發明之表現載體只要於原核細胞及/或真核細胞之各種宿主細胞中可表現編碼本發明之人化抗體或其重鏈或輕鏈可變區的基因，而產生此等多胜肽者即可無特別限制。例如，可列舉質體載體、病毒載體(例如，腺病毒、反轉錄病毒)等。

本發明之表現載體可含有編碼本發明人化抗人α9整連蛋白抗體或其重鏈及/或輕鏈可變區的基因、及可機能連結該基因之啟動子。作為細菌中使編碼本發明人化抗體或其重鏈及/或輕鏈可變區的基因表現用之啟動子，宿主為埃希氏菌屬(Escherichia)菌之場合，可列舉例如，Trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、tac啟動子等。作為酵母中使編碼人化抗體或其重鏈及/或輕鏈可變區的基因表現用之啟動子，可列舉例如，PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子，宿主為牙孢桿菌屬(Bacillus)菌之場合，可列舉SL01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。又，宿主為哺乳動物細胞等之真核細胞的場合，可列舉β肌動蛋白(actin)啟動子、CAG啟動子(Niwa H. et al.,Gene,108,193-200,1991)、來自SV40之啟動子、反轉錄病毒之啟動子、熱休克啟動子等。

作為宿主細胞之細菌，尤其使用大腸菌的場合，本發明之表現載體可進一步含有開始碼、終止碼、終止子區及複製可能單位。另一方面，使用作為宿主之酵母、動物細胞或昆蟲細胞的場合，本發明之表現載體可含有開始碼、終止碼。又，此場合，亦可含有增強子序列、編碼本發明之人化抗體或其重鏈或輕鏈可變區的基因之5’側及3’側之轉譯區、剪接接合都、聚腺苷酸化部位、或複製可能單位等。又，視目的亦可含有通常使用之選擇標記(例如，抗四環黴素基因、氨比西林(ampicillin)耐性基因、卡那黴素(kanamycin)耐性基因、新黴素(neomycin)耐性基因、二氫葉酸還原酵素基因)。

又本發明提供導入編碼本發明之人化抗體或其重鏈及/或輕鏈可變區之基因的轉形體。如此轉形體，例如，可經由以本發明之表現載體將宿主細胞轉形而製作。作為轉形體之製作所使用之宿主細胞，只要適合前述表現載體而被轉形者即可無特別限定，可列舉本發明技術領域中通常使用之天然細胞或人工建立的細胞等各種細胞(例如，細菌(埃希氏菌屬菌、牙孢桿菌屬菌)、酵母(釀母菌(Saccharomyces)屬、畢赤酵母菌(Pichia)屬等)、動物細胞或昆蟲細胞(例如，Sf9)等)。轉形可依本身公知之方法進行。

又本發明提供包含使編碼本發明之人化抗體或其重鏈及/或輕鏈可變區的基因於宿主細胞中表現者，即，使用如此轉形體者之本發明人化抗人α9整連蛋白抗體之生產方法。較佳為以該方法所使用的宿主細胞為已導入本發明之表現載體，該表現載體亦可各別或同時含有編碼人化抗人α9整連蛋白抗體之重鏈及輕鏈可變區的多核苷酸。

於本發明之人化抗人α9整連蛋白抗體之生產，轉形體可於營養培養基中培養。營養培養基含有轉形體之生育上必要的碳源、無機氮源或有機氮源為較佳。作為碳源，例如，葡萄糖、葡聚糖、可溶性澱粉、蔗糖等，作為無機氮源或有機氮源，例如，銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米浸漬液(corn steep liquor)、腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯抽出液等。又視所欲亦可含有其他營養素(例如，無機鹽(例如，氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類、抗生素(例如，四環黴素、新黴素、氨比西林、卡那黴素等)等)。

轉形體之培養依自體公知之方法進行。可適宜選擇培養條件，例如，溫度、培養基之pH及培養時間。例如，宿主為動物細胞的場合，作為培養基可使用含約5～20%胎牛血清之MEM培養基(Science,Vol.122,p.501,1952)、DMEM培養基(Virology,Vol.8,p.396,1959)、RPMI1640培養基(J. Am. Med. Assoc.,Vol.199,p.519,1967)、199培養基(Proc. Soc. Exp. Biol. Med.,Vol.73,p.1,1950)等。培養基之pH為約6～8較佳，培養通常於約30～40℃進行約15～72小時，視必要亦可進行通氣或攪拌。宿主為昆蟲細胞的場合，例如，可列舉含有胎牛血清之Grace’s培養基(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,Vol. 82,p.8404,1985)等，其pH為約5～8者較佳。培養通常於約20～40℃進行15～100小時，視必要亦可進行通氣或攪拌。宿主為細菌、放線菌、酵母、絲狀菌的場合，例如，含有上述營養源的液體培養基為適當。較佳地，pH為5~8的培養基。宿主為大腸桿菌(E.coli)的場合，作為較佳培養基可列舉LB培養基、M9培養基(Miller等人，Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory,p.431,1972)等。該場合，培養視必要可一邊通氣、一邊攪拌，通常於14~43℃進行約3~24小時。宿主為芽孢桿菌屬菌的場合，視必要可一邊通氣、一邊攪拌，通常於30~40℃進行約16~96小時。宿主為酵母的場合，作為培養基，例如，可列舉Burkholder最小培養基(Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77,p.4505, 1980)，pH為5~8者為所欲的。培養通常於約20~35℃進行約14~144小時，視必要亦可進行通氣或攪拌。

本發明之人化抗人α9整連蛋白抗體可如上述培養轉形體，自該轉形體回收，較佳為單離、純化。作為單離、純化方法，例如，可列舉鹽析、溶劑沈澱法等之利用溶解度的方法、透析、超過濾、凝膠過濾、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳等利用分子量的差異的方法、離子交換層析法或羥基磷灰石色譜(Hydroxyapatite chromatography)等利用荷電的方法、親和性層析法等之利用特異性親和性的方法、逆相高速液體層析法等利用疏水性之差異的方法、等電點電泳等利用等電點之差異的方法等。

以下，基於實施例詳細說明本發明，但本發明未受此等任一種之限定。

實施例

關於使用市售套組或試藥的部分，只要未特別指明則依添付之使用說明書進行實驗。

《實施例1：小鼠Y9A2抗體可變區序列之決定及嵌合Y9A2抗體之製作》

決定小鼠Y9A2抗體之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)基因，將VH基因連結人Igγ1基因、VL基因連結人Igκ基因而製作小鼠一人類之嵌合抗體(以下，亦稱為嵌合Y9A2抗體)。其順序如下。

首先，自加州大學舊金山分校(UCSF)提供之小鼠Y9A2抗體產生融合瘤使用TRIzol試藥(Ivitrogen公司)抽出RNA。以此RNA為模板，使用隨機引子(Random Primer)及Super Script III反轉錄酶(同樣為Ivitrogen公司)合成cDNA。其次，使用此cDNA為模板，使用參照依Kabat等人的V區及J區序列之分類(Sequences of Proteins of Immunological Interest 4^th ed.,Public Health Service,NIH,Washington DC,1987)設計對引導區的引子及對J區的引子，以Ex Taq DNA聚合酶(Takara公司)增幅VH基因片段。於此使用之上述對引導區之引子及對J區之引子，各自附加HindIII認識序列及BamHI認識序列。即使於VL亦與VH的場合同樣地，使用與引導序列合致的引子及與J區合致的引子，獲得VL基因片段。

如此所得之VH、VL基因片段以HindIII及BamHI(同樣為Takara公司)消化，各自與為表現載體之AG-γ1、AG-κ(WO94/20632)連結。AG-γ1具有β肌動蛋白啟動子、人類免疫球蛋白恆定區γ1鏈之基因及作為選擇標記之新黴素耐性基因(neo)，於γ1基因之上游的HindIII認識序列及BamHI認識序列之間插入小鼠Y9A2抗體VH基因，作成表現嵌合Y9A2抗體之重鏈的質體。AG一κ具有β肌動蛋白啟動子、人類免疫球蛋白恆定區κ鏈之基因及作為選擇標記之二氫葉酸還原酵素(dhfr)基因，同樣於κ基因之上游的HindIII認識序列及BamHI認識序列之間插入小鼠Y9A2抗體VL基因，作成表現嵌合Y9A2抗體之輕鏈的質體。

此等表現質體依常法導入大腸菌而獲得轉形株，自此等使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QLAGEN公司)調製質體DNA。將所得質體DNA作為模板，使用GenomeLab DTCS-Quick Start Kit及CEQ2000自動定序儀(同樣為BECKMAN COULTER公司)，解讀經選殖的VH及VL之鹼基序列。該VH及VL之鹼基序列各自示於序列編號2及序列編號4。基於所得序列各自決定的VH及VL之胺基酸序列示於第1圖及第2圖。又，各自示於序列編號1及序列編號3。

大量培養上述大腸菌株，使用EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN公司)純化嵌合Y9A2抗體之重鏈表現質體及輕鏈表現質體，混合此等，經由使用FreeStyle 293 Expression System(Ivitrogen公司)導入細胞，使暫時表現嵌合Y9A2抗體。所得培養上清液所含嵌合Y9A2抗體濃度經由使用來自山羊抗人IgG Fc抗體(CAPPEL公司)及蛋白質A-HRP(ZYMED公司)的三明治ELISA測定。此時，製作市售之人IgG1抗體(Biogenesis公司)之稀釋系列，將其作為標準試料。其次，上述培養上清液中之嵌合Y9A2抗體，使用蛋白質A管柱(GE HEALTHCARE公司)而親和性純化，獲得純化嵌合Y9A2抗體。純化嵌合Y9A2抗體之濃度，於波長280nm之吸光度為1.4的場合算出為1mg/mL。

《實施例2：嵌合Y9A2抗體之細胞附著抑制試驗》

於以前項記載之方法調製的純化嵌合Y9A2抗體，為了與小鼠Y9A2抗體(CHEMICON INTERNATIONAL公司)作活性比較，進行J. Biol. Chem.,274：36328-36334,1999記載之細胞附著抑制試驗。即，首先將骨橋蛋白經凝血酶切斷而產生的N末端側之片段(nOPN)所含RGD序列置換為RAA的改變體(nOPN-RAA)固定化，進行阻斷後，添加小鼠Y9A2抗體或純化嵌合Y9A2抗體。接著添加使人α9整連蛋白分子表現的SW480細胞(以下，表示為SW480/hα9細胞)，於37℃培育1小時。之後，使用結晶紫及甲醇進行固定‧染色，洗淨後，附著的細胞中之色素以TritonX-100抽出，測定波長595nm之吸光度。

此結果如表1所示，小鼠Y9A2抗體及純化嵌合Y9A2抗體大約為相同IC50，判斷為具有抑制對nOPN-RAA的SW480/hα9細胞之附著的活性。IC50以未添加抗α9整連蛋白抗體的場合產生的細胞附著程度為基準時，將其定義為50%附著抑制的抗α9整連蛋白抗體之濃度。

《實施例3：人化Y9A2抗體基因之製作》

先移植小鼠Y9A2抗體之VH及VL中之互補決定區(CDR)胺基酸作成模板的人抗體，選自相對於小鼠Y9A2抗體之VH、對於VL之框架區(FR)之胺基酸序列，具有與此等相同性高的胺基酸序列的人抗體之種系(germ line)。具體而言，作為模板人VH，選擇於DP-88組合JH6者，作為模板人VL則選擇於DPK-1組合Jκ4者。

於上述之模板人抗體VH及VL之FR，移植來自小鼠Y9A2抗體之VH及VL的必要胺基酸序列而製作人化抗體。具體而言，首先於VH，將前述模板人抗體VH之CDR胺基酸序列及FR胺基酸之數個地方以小鼠Y9A2抗體之VH中的對應胺基酸序列取代，2種類人化Y9A2抗體之VH，即，設計RY9A2VHv5及RY9A2VHv8之胺基酸序列(各為序列編號5及序列編號7)，進一步，設計編碼此等之胺基酸序列的DNA之鹼基序列(各為序列編號6及序列編號8)。RY9A2VHv8為RY9A2VHv5中來自小鼠Y9A2抗體之FR胺基酸殘基中的4個取代為模板人抗體者。

於VL，將前述模板人抗體VL之CDR胺基酸序列以小鼠Y9A2抗體之VL之CDR胺基酸序列取代，設計為人化Y9A2抗體之VL的RY9A2VLv01之胺基酸序列(序列編號9)，再者，設計編碼此胺基酸序列的DNA之鹼基序列(序列編號10)。

為製作編碼上述之RY9A2VHv5、RY9A2VHv8及RY9A2VLv01的DNA片段，以寡DNA為材料經由PCR進行全合成。具體而言，於RY9A2VHv5，各如第3圖所示，經由涵蓋VH之全長的6種類之寡DNA(記載於序列編號29～34)分別合成，使用此等以下列順序進行PCR。即，首先將6種類之寡DNA各別等量混合者作為模板，使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara)，於96℃30秒、50℃30秒、72℃3分鐘之步驟重複15次循環。其次，以此PCR產物1μL作為模板使用，將具有第3圖粗體字表記部分之序列的寡DNA(記載於序列編號35及36)作為引子，使用Pyrobest DNA聚合酶，經由於96℃20秒、72℃2分鐘之步驟重複25次循環，增幅VH全長。RY9A2VHv8亦以大略相同之方法製作。

RY9A2VLv01之製作之場合，使用第4圖所示6條寡DNA(記載於序列編號37～42)，與上述同樣地進行15次循環之PCR後，將此增幅產物作為模板使用，以具有第4圖粗體字表記部分之序列的寡DNA(記載於序列編號43及44)作為引子，經由與上述同樣地進行25次循環之PCR，增幅VL全長。

與上述VH、VL一起使用作為抗體之引導序列之WO2007/139164記載之與人化抗骨橋蛋白單株抗體相同者。又，所得DNA片段之兩端上附加選殖用之HindIII認識序列及BamHI認識序列。

如此所得VH及VL之DNA片段以限制酵素HindIII及BamHI消化，各自經由與前述表現載體AG-γ1、AG-κ連結依規定方法導入大腸菌中選殖，自所得大腸菌株使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN公司)調製質體DNA。將所得質體DNA作為模板，使用Genome Lab DTCS-Quick Start Kit及CEQ2000自動定序儀(同為BECKMAN COULTER公司)，經由解讀經選殖的VH及VL之鹼基序列，獲得具有如設計之鹼基序列的選殖株。培養此等選殖株，使用EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN公司)，純化重鏈、輕鏈之表現質體。

混合經純化的重鏈表現質體、輕鏈表現質體，使用FreeStyle 293 Expression System導入細胞，使抗體暫時表現。此際，將插入RY9A2VHv5的重鏈表現質體、及插入RY9A2VLv01的輕鏈表現質體組合的場合所表現的人化Y9A2抗體命名為RY9A2v501抗體，將插入RY9A2VHv8的重鏈表現質體、及插入RY9A2VLv01的輕鏈表現質體組合的場合所表現的人化Y9A2抗體命名為RY9A2v801抗體。

培養上清液中蓄積的各人化Y9A2抗體之濃度之測定，及自培養上清液之純化抗體之取得，以與前述嵌合Y9A2抗體之場合之相同方法進行。

《實施例4：人化Y9A2抗體之對人α9整連蛋白的結合性確認》

關於以前述方法表現的RY9A2v501抗體、RY9A2v801抗體，將對人α9整連蛋白分子的結合性經由Cell ELISA 法與嵌合Y9A2抗體(以下，表示為cY9A2抗體)作比較。即，將使表現人α9整連蛋白分子的SW480細胞固定於ELISA平板上，對此使上述cY9A2抗體或RY9A2v501抗體或RY9A2v801抗體反應後，使作為二次抗體之HRP標識山羊抗人IgG(Fc)抗體(American Qualex公司)反應，添加TMB而使發色後，添加稀硫酸使反應停止而調查於波長450nm之吸光度。此結果，如第5圖及第6圖所示，確認RY9A2v501抗體及RY9A2v801抗體具有與cY9A2抗體同等之人α9整連蛋白分子結合性。

《實施例5：人化Y9A2抗體之細胞附著抑制試驗》

關於上述之純化RY9A2v501抗體、純化RY9A2v801抗體及小鼠Y9A2抗體，以實施例2記載之相同順序進行細胞附著抑制試驗。

此結果如表2所示。IC50(μg/mL)定義為以未添加抗α9整連蛋白抗體的場合所產生的細胞附著的程度為基準時，將其附著抑制50%的抗α9整連蛋白抗體之濃度。小鼠Y9A2抗體之IC50值之平均值為0.070μg/mL。表2中小鼠Y9A2之IC50值為1的場合表示人化抗體之比活性。表2中顯示2次試驗之平均值。如表2所示，上述2種人化抗體確認具有與小鼠Y9A2抗體同等之細胞附著抑制活性。

《實施例6：改良型人化Y9A2抗體之製作》

如前述，可取得具有與原始小鼠Y9A2抗體相同程度之細胞附著抑制活性的2種人化Y9A2抗體(RY9A2v501抗體、RY9A2v801抗體)後，接著，基於此等人化抗體，經由進行變異導入，嘗試人化Y9A2抗體的進一步改良。

依本發明者們相當之創意檢討之結果，成功製作出以下3種抗體：RY9A2v12(M34L)012抗體、RY9A2v11(M34L)012抗體及RY9A2v5(IAW)01抗體作為具有較小鼠Y9A2抗體更有意義的優異活性的人化Y9A2抗體。

1.RY9A2v12(M34L)012抗體

RY9A2v12(M34L)012抗體之重鏈可變區(VH)具有序列編號11所示胺基酸序列，輕鏈可變區(VL)具有序列編號17所示胺基酸序列。RY9A2v12(M34L)012抗體之VH及VL之鹼基序列，各自如序列編號12及18所示。RY9A2v12(M34L)012抗體之VH，為具有上述RY9A2VHv8(序列編號7)之CDR1中之甲硫胺酸殘基(VH胺基酸序列之第34號胺基酸殘基)取代為白胺酸，以及CDR2中之離胺酸殘基及天冬胺酸殘基(VH胺基酸序列之第65號及第66號胺基酸殘基)各自取代為麩醯胺酸及甘胺酸者。RY9A2v12(M34L)012抗體之VL，為具有上述RY9A2VLv01(序列編號9)之CDR1中之離胺酸殘基(VL胺基酸序列之第24號胺基酸殘基)取代為精胺酸者。

2.RY9A2v11(M34L)012抗體

RY9A2v11(M34L)012抗體之VH具有序列編號13所示胺基酸序列，VL具有序列編號17所示胺基酸序列。RY9A2v11(M34L)012抗體之VH及VL之鹼基序列各自如序列編號14及18所示。RY9A2v11(M34L)012抗體之VH，為具有上述RY9A2VHv5(序列編號5)之CDR1中之甲硫胺酸殘基(VH胺基酸序列之第34號胺基酸殘基)取代為白胺酸，以及CDR2中之離胺酸殘基及天冬胺酸殘基(VH胺基酸序列之第65號及第66號胺基酸殘基)各自取代為麩醯胺酸及甘胺酸者。RY9A2v11(M34L)012抗體之VL，為具有上述RY9A2VLv01(序列編號9)之CDR1中之離胺酸殘基(VL胺基酸序列之第24號胺基酸殘基)取代為精胺酸者。

3.RY9A2v5(IAW)01抗體

RY9A2v5(IAW)01抗體之VH具有序列編號15所示胺基酸序列，VL具有序列編號9所示胺基酸序列。RY9A2v5(IAW)01之VH及VL之鹼基序列各自如序列編號16及10所示。RY9A2v5(IAW)01抗體之VH，為具有上述RY9A2VHv5(序列編號5)之CDR1中之甲硫胺酸殘基(VH胺基酸序列之第34號胺基酸殘基)取代為異白胺酸，以及CDR3中之天冬胺酸殘基及苯丙胺酸殘基(VH胺基酸序列之第104號及第105號胺基酸殘基)各自取代為丙胺酸及色胺酸者。RY9A2v5(IAW)01抗體之VL與上述RY9A2VLv01(序列編號9)相同。

將上述之3種之改良型人化Y9A2抗體之VH及VL的DNA片段與前述同樣地連結表現載體AG-γ1、AG-κ而製作表現質體，使用FreeStyle 293 Expression System使其表現，與前述同樣地使用蛋白質A管柱自培養上清液取得各別純化抗體。

《實施例7：改良型人化Y9A2抗體之對人α9整連蛋白的結合性確認》

關於如前述製作之3種類人化Y9A2抗體及cY9A2抗體，與實施例4同樣地，經由CELL ELISA進行對人α9整連蛋白的結合性之確認。此結果，確認改良型人化Y9A2抗體任一者皆與嵌合Y9A2抗體同樣地，具有對人α9整連蛋白的結合性。

《實施例8：改良型人化Y9A2抗體之對人nOPN的細胞附著抑制試驗》

關於3種類之改良型人化Y9A2抗體，為了與小鼠Y9A2抗體比較活性，進行如實施例2記載之相同順序進行細胞附著抑制試驗。

此結果示於表3。IC50(μg/mL)定義為以未添加抗α9整連蛋白抗體的場合所產生的細胞附著的程度為基準時，其附著抑制50%的抗α9整連蛋白抗體之濃度。小鼠Y9A2抗體之IC50值之平均為0.039μg/mL。表3中顯示小鼠Y9A2之IC50值為1的場合之人化Y9A2抗體之比活性。2～3次試驗之平均值示於表3。3種類之改良型人化Y9A2抗體與小鼠Y9A2抗體相比較之下為4倍以上，判斷細胞附著抑制活性提升。

《實施例9：改良型人化Y9A2抗體之對人VCAM-1、人TenascinC的細胞附著抑制試驗》

於3種類之改良型人化Y9A2抗體，使用與前述用於細胞附著抑制試驗的nOPN-RAA相異的配位體進行檢討。具體而言，使用將人VCAM-1/Ig(R & D公司)、人TenascinC之RGD序列取代為RAA的改變體人TenascinC-RAA而同樣地進行細胞附著抑制作用之檢討。

2次試驗之平均值示於表4。小鼠Y9A2抗體之對人VCAM-1、人TenascinC-RAA的細胞附著抑制活性IC50值之平均值各為0.077μg/mL、0.041μg/mL。表4中顯示小鼠Y9A2抗體之IC50值為1時之人化Y9A2抗體之比活性。3種類之改良型人化Y9A2抗體由使用之配位體而相異，但判斷顯示與小鼠Y9A2抗體同等以上之抑制活性。

《實施例10：改良型人化Y9A2抗體之細胞游離抑制試驗》

關於3種類之改良型人化Y9A2抗體，檢討SW480/hα9細胞之抗nOPN-RAA的游離活性的抑制作用。實驗基於Molecular Biology of the cell,12：3214-3225,2001記載之細胞游離抑制試驗加上若干改變而進行。即，將nOPN-RAA固定於Transwell(Millipore公司)上層後收取於平盤，之後添加含10% FCS的F15培養基於下層。-起添加小鼠Y9A2抗體或人化Y9A2抗體與SW480/hα9細胞於上層中，於37℃培育16小時。之後，於Transwell下層游離的細胞使用QCM Chemotaxis Cell Migration 24-well Assay套組(Millipore公司)定量化。經由添加為過剩量的100μg/mL之小鼠Y9A2抗體而被抑制的游離活性定義為α9依存的的游離活性(100%抑制)，各抗體之抑制率示於表5。

小鼠Y9A2抗體若投與50μg/mL未見到到有意義的游離抑制作用，但經由本發明者們製作的改良型人化Y9A2抗體投與5μg/mL時可見到為小鼠Y9A2抗體之1/10之濃度的有意義的抑制活性。又，於有意義差異検定，進行對抗體未添加之孔之Student’s t-test。*:P<0.05，**:P<0.01。

此有意義的細胞游離抑制作用與臨床有效濃度直接關連，臨床有效濃度成為1/10時與於臨床之投與間隔之擴大有關(例如，2週投與1次成為數月投與1次等)，再者，若血中濃度維持5μg/mL左右，則皮下注製劑之開發成為可能。皮下注製劑為現在世界中被認為可自己注射，於慢性疾病，尤其對患者、醫療機構雙方採取之便利性特別地提升。如此依本發明的生物學的活性之改善，不僅期望其治療有效性，患者順應性之改善上亦大大期望。

《實施例11：改良型人化Y9A2抗體之熱安定性試驗》

關於3種類之改良型人化Y9A2抗體及小鼠Y9A2抗體，於70℃2小時或10小時培育後，使用實施例8記載之細胞附著抑制試驗進行關於熱安定性之評價。

4次實驗之平均值示於表6。以未進行熱處理的場合之細胞附著抑制活性為100%，顯示熱處理後之各抗體之活性殘存率。小鼠Y9A2抗體被認為於2小時之活性降低，但3種類之改良型人化Y9A2抗體於10小時培育活性亦85%以上殘留。如此，改良型人化Y9A2抗體對熱極安定的性質，被認為與於臨床開發製劑中室溫保存可能的利便性高的製劑之開發有關。

產業上之利用可能性

將本發明之改良型人化抗人α9整連蛋白抗體與供與者小鼠抗人α9整連蛋白抗體作比較，為活性及/或物性被改善的抗體，經由人α9整連蛋白及其複數配位體之相互作用之遮斷，具有強力抗炎症作用或骨破壞抑制作用，有用於人α9整連蛋白參與病態形成的各種疾病之預防或治療。

本申請案以日本申請的特願2008-004975(申請日：平成20年1月11日)及特願2008-282496(申請日：平成20年10月31日)為基礎，其內容全部包含於本說明書。

第1圖為小鼠Y9A2抗體之VH區之胺基酸序列。

第2圖為小鼠Y9A2抗體之VL區之胺基酸序列。

第3圖為製作編碼人化Y9A2抗體之VH之一例的RY9A2VHv5的基因用之寡DNA之構成。

第4圖為製作編碼人化Y9A2抗體之VL之一例的RY9A2VLv01的基因用之寡DNA之構成。

第5圖為嵌合Y9A2抗體與RY9A2v501抗體之細胞ELISA之結果。

第6圖為嵌合Y9A2抗體與RY9A2v801抗體之細胞ELISA之結果。

Claims

一種人化抗人α9整連蛋白(integrin)抗體，其包含選自以下任一種之重鏈可變區及輕鏈可變區：(a)序列編號11所示胺基酸序列而成之重鏈可變區及序列編號17所示胺基酸序列而成之輕鏈可變區；(b)序列編號13所示胺基酸序列而成之重鏈可變區及序列編號17所示胺基酸序列而成之輕鏈可變區；或(c)序列編號15所示胺基酸序列而成之重鏈可變區及序列編號9所示胺基酸序列而成之輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1項之人化抗人α9整連蛋白抗體，其中該抗體之重鏈恆定區為人Igγ1。
如申請專利範圍第1項之人化抗人α9整連蛋白抗體，其中該抗體之輕鏈恆定區為人Igκ。
如申請專利範圍第1項之人化抗人α9整連蛋白抗體，其中該抗體之重鏈恆定區為人Igγ1，該抗體之輕鏈恆定區為人Igκ。
如申請專利範圍第1項之人化抗人α9整連蛋白抗體，其包含序列編號19所示胺基酸序列而成之重鏈及序列編號25所示胺基酸序列而成之輕鏈。
如申請專利範圍第1項之人化抗人α9整連蛋白抗體，其包含序列編號21所示胺基酸序列而成之重鏈及序列編號25所示胺基酸序列而成之輕鏈。
如申請專利範圍第1項之人化抗人α9整連蛋白抗體，其包含序列編號23所示胺基酸序列而成之重鏈及序列編號27所示胺基酸序列而成之輕鏈。
一種表現載體，其含有包含編碼如申請專利範圍第1項之人化抗人α9整連蛋白抗體之重鏈可變區的序列之多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈可變區的序列之多核苷酸。
一種宿主細胞，其選自以下之(a)及(b)組成之群：(a)導入含有包含編碼如申請專利範圍第1項之人化抗人α 9整連蛋白抗體之重鏈可變區的序列的多核苷酸及包含編碼該抗體之輕鏈可變區的序列的多核苷酸的表現載體之宿主細胞，(b)導入含有包含編碼如申請專利範圍第1項之人化抗人α 9整連蛋白抗體之重鏈可變區的序列的多核苷酸的表現載體及含有包含編碼該抗體之輕鏈可變區的序列的多核苷酸的表現載體之宿主細胞。
一種生產人化抗人α9整連蛋白抗體之方法，其包含培養如申請專利範圍第9項之宿主細胞，並使表現人化抗人α9整連蛋白抗體的步驟。
一種類風濕性關節炎之治療藥，其包含如申請專利範圍第1至7項中任一項之人化抗人α9整連蛋白抗體。
一種如申請專利範圍第1至7項中任一項之人化抗人α9整連蛋白抗體之用途，其用於製造處理類風濕性關節炎用之醫藥。