JPWO2009088064A1 - 改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ドナーマウス抗ヒトα９インテグリン抗体と比較して、活性および／または物性が改善されたヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、即ち、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、並びに、該抗体を用いた、ヒトα９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療手段を提供する。

Description

本発明は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体に関する。詳細には、ヒトα９インテグリン蛋白質に結合してα９インテグリン依存性の細胞接着を阻害する活性を持ち、マウス抗ヒトα９インテグリン抗体Ｙ９Ａ２と比較して活性および／または物性が改善された改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体である。当該ヒト化抗体は、関節リウマチ等の自己免疫疾患、アレルギーや移植片拒絶反応等の免疫疾患、及びその他のα９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の診断、予防または治療薬として期待される。

インテグリン（integrin）は細胞表面糖タンパク質のひとつで、主に細胞外マトリックス（コラーゲン、ラミニンなど）への細胞の接着やイムノグロブリンファミリーのメンバー(ICAM-1、VCAM-1など)の受容体として機能し、細胞外マトリックスからの情報伝達に関与する接着分子である。それにより、細胞は細胞外マトリックスよりシグナルを受け取り、分化、増殖、細胞死などが誘導される。インテグリンはα鎖とβ鎖の２つのサブユニットからなるヘテロダイマーであり、異なるα鎖、β鎖が存在し、多様な組み合わせがあり、インテグリンスーパーファミリーは２４種類存在する。インテグリンノックアウトマウスは、全てのサブユニットで致死的あるいは病的で、生命の維持に個々のインテグリンが必要であることが示唆されている。この事から、周辺の環境を細胞に伝え対応を促すインテグリンは、生命現象のあらゆる場面で機能しており、様々な病態に関与していると考えられる。

このように生存に不可欠なインテグリンは病的状態でも役割を演じていると考えられ、阻害が病態改善に働くケースが示されている。例えば、血小板に特異的なインテグリンαIIｂβ３の阻害は、PCTA再狭窄治療薬アブシキシマブ（商品名：ReoPro；Eli Lilly社）として認可されている。また、α４β１（VLA4）阻害剤ナタリツマブ（商品名：Antegren；ELAN社）は多発性硬化症治療薬として認可されている。さらに、αｖβ３阻害剤Vitaxin（MEDIMMUNE社)も、その血管新生阻害作用、破骨細胞活性化阻害作用などから、現在治験が進んでいる状況にある。

インテグリンα９β１はマクロファージ、NKT細胞、樹状細胞（Dendritic Cell）、好中球に発現しており、これら炎症細胞の浸潤や接着、骨吸収などに重要な役割を果しているとされる。また最近、破骨細胞の形成においてインテグリンα９β１の関与が報告されており、骨破壊への関与が示唆されている（非特許文献１）。そのリガンドとしては切断型オステオポンチン（Ｎ末OPN）、VCAM-1、Tenascin-Cなどが知られている。臨床においても、関節リウマチ患者の滑膜組織においてインテグリンα９β１の有意な上昇が認められている（非特許文献２）。

従って、α９インテグリン蛋白質に特異的に結合し、α９インテグリン依存の細胞接着を阻害する活性を有するモノクローナル抗体を開発することができれば、α９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の診断、予防または治療に有用であることが期待される。

これまで、ヒトα９インテグリンに対して機能阻害作用を示す抗体としては、マウスモノクローナル抗体であるＹ９Ａ２（非特許文献３）、１Ｋ１１、２４Ｉ１１、２１Ｃ５及び２５Ｂ６（特許文献１）、２８Ｓ１（特許文献２）が報告されている。これらの抗体は、ヒトα９依存の細胞接着を抑制し得ることがin vitroの実験結果より示されているが、その中でも、Ｙ９Ａ２は、オステオポンチンやTenascin-Cのいずれに対する細胞接着をも阻害し、α９インテグリンに対する抗体医薬の候補として最も有望視されるものである。

もっとも、Ｙ９Ａ２は、マウスに抗原を免疫して作製されたマウス由来の抗体であるために、安全性（抗原性の惹起）及び有効性（半減期の短縮）の観点から、そのままヒトに投与することは現実的には不可能である。そこで、Ｙ９Ａ２の活性を維持したまま、ヒト抗体のアミノ酸配列を持つ分子に変えるための改変、すなわち、ヒト化を行う必要がある。

今日、ヒト化抗体の作製法としては、ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）らが考案した、相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記することがある）アミノ酸の移植を行う方法（非特許文献４）に基づくものが、最も一般的である。ここで、ＣＤＲアミノ酸のドナーとなる異種抗体からＣＤＲのアクセプターとなるヒト抗体に対して、ＣＤＲのみならず、ＣＤＲの構造保持あるいは抗原との結合に関与しているＣＤＲ外アミノ酸、いわゆるフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記することがある）も併せて移植することが、ドナー抗体の持つ本来の活性を再現するために重要であることも良く知られている（非特許文献４及び５）。

しかし、ＣＤＲ移植に基づくヒト化抗体の作製においては、いくつかの課題が存在する。まず第一に、最も一般的な課題として、ドナー抗体の活性再現に必要なＦＲアミノ酸の選択を適切に行ったとしても、抗原への親和性や生物活性がドナー抗体のそれを上回るヒト化抗体を得ることが困難であることが挙げられる。

近年、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体がモノクローナル医薬品として多数上市されているが、いずれについても有効投与量は体重１ｋｇあたり数ｍｇと極めて多量である。それ故、抗体医薬品は高価とならざるを得ず、結果として患者の経済的な負担や医療コストの増大を招いている。この抗体医薬の有効投与量を規定する主な要因としては、抗体の抗原に対する親和性や、体内に存在する抗原の量が挙げられる。このような観点から、特に抗体の抗原に対する親和性を向上させることは、投与量の低減に繋がり、結果として患者の経済的な負担や医療コストの低減にも繋がる極めて有益な改良であると言える。

そこで、抗体の抗原に対する親和性向上を実現するために、抗体の可変領域内にアミノ酸置換を導入する方法が取られることが多い。しかし、抗体や抗原が異なれば、ＣＤＲアミノ酸の配列や立体構造、抗原−抗体相互作用に関わるアミノ酸の位置も変化するため、ＣＤＲとともに移植すべきＦＲアミノ酸の位置を、全ての抗体に適用可能なものとして規定することは事実上不可能である。

また、別の課題として、ＣＤＲ移植に基づくヒト化抗体の作製においては、ドナーであるマウス抗体のＣＤＲアミノ酸全部を鋳型ヒト抗体に移植するのが一般的であるが、マウス抗体由来のＣＤＲアミノ酸配列は抗原との結合に重要である一方で、ヒトに対する抗原性を示すことがあり、しばしば抗イディオタイプ抗体を生じる原因ともなることが挙げられる。

すなわち、ヒト化抗体の作製において、ヒトにおける抗原性発生や抗体の安定性低下を回避しつつ、ドナー抗体よりも高い活性を付与するためには、適切なアクセプター抗体の選択や、置換すべきＣＤＲアミノ酸及びＦＲアミノ酸の選択が不可欠であり、これらには、相当の創意工夫と試行錯誤が必要とされる。
WO 2006/075784 WO 2008/007804 Journal of Bone and Mineral Research, 2006, 21: 1657-1665 The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115: 1060-1067 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1996, 15: 664-672 Science, 239, 1534-1536 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033 (1989)

本発明の課題は、ヒト化抗体作製に関する上記の諸課題を克服し、ドナーマウス抗ヒトα９インテグリン抗体（Ｙ９Ａ２）と比較して、活性および／または物性が改善されたヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を提供することにある。

すなわち、本発明は、医学上または産業上有用な物質・方法として下記（１）〜（１５）の発明を含むものである。
（１）以下のいずれかから選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（ａ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
（ｂ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、または
（ｃ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
（２）前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１である、上記（１）に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（３）前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、上記（１）に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（４）前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、上記（１）に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（５）配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（１）に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（６）配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（１）に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（７）配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（１）に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（８）上記（１）に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
（９）上記（１）に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
（１０）上記（８）に記載のポリヌクレオチドおよび／または上記（９）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１１）上記（９）に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
（１２）上記（１１）に記載の宿主細胞を培養し、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を発現させる工程を包含する、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を生産する方法。
（１３）上記（１）〜（７）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含む、関節リウマチの治療薬。
（１４）上記（１）〜（７）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、関節リウマチを予防または処置するための方法。
（１５）関節リウマチを予防または処置するための医薬の製造における、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の使用。

本発明によって、ドナーマウス抗ヒトα９インテグリン抗体と比較して活性および／または物性が改善されたヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体が提供される。本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、ヒトα９インテグリンとその複数のリガンドとの相互作用の遮断を通じ、強力な抗炎症作用や骨破壊抑制作用を有するものであり、ヒトα９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療に有用である。そして、このような本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、投与量の低減、投与間隔の拡大、投与方法の改善（例えば、皮下注射剤）等の臨床適用における優れた改善をもたらし、治療有効性及び患者コンプライアンスの改善に大きく寄与するものである。

マウスＹ９Ａ２抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列である。 マウスＹ９Ａ２抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列である。 ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のＶＨの一例であるＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５をコードする遺伝子を作製するためのオリゴＤＮＡの構成である。 ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のＶＬの一例であるＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１をコードする遺伝子を作製するためのオリゴＤＮＡの構成である。 キメラＹ９Ａ２抗体とＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体のＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡの結果である。 キメラＹ９Ａ２抗体とＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体のＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡの結果である。

以下に、本発明について詳述する。
本発明者らは、マウス抗ヒトα９インテグリン抗体Ｙ９Ａ２のヒト化抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、Ｙ９Ａ２と比較して活性および／または物性が有意に改善された、３種のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体（以下、ヒト化Ｙ９Ａ２抗体またはＲＹ９Ａ２とも称する）を作製することに成功した。

具体的には、本発明者らは、まず最初に、マウス抗ヒトα９インテグリン抗体Ｙ９Ａ２（以下、マウスＹ９Ａ２抗体とも称する）の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）及び軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲアミノ酸配列及び数ヶ所のＦＲアミノ酸を鋳型ヒト抗体に移植して、マウスＹ９Ａ２抗体と同程度の活性を有する、２種のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体ＲＹ９Ａ２ｖ５０１及びＲＹ９Ａ２ｖ８０１を作製した。ＣＤＲは、カバット（Ｋａｂａｔ）らによる分類（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ ４ｔｈ ｅｄ．， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， ＮＩＨ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ， １９８７）に従って決定した。ＲＹ９Ａ２ｖ５０１及びＲＹ９Ａ２ｖ８０１のＶＨのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５及び配列番号７である。ここで、ＲＹ９Ａ２ｖ８０１のＶＨは、ＲＹ９Ａ２ｖ５０１のＶＨのマウスＹ９Ａ２抗体由来のＦＲアミノ酸残基のうち４つのアミノ酸残基を、対応する鋳型ヒト抗体アミノ酸に置換したものである。両ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列は、配列番号９に示されるものであり、両抗体共通である。

次に、本発明者らは、ヒト化抗体における抗原性発生の危険性や抗体の保存安定性の低下を回避しつつ、ヒトα９インテグリンに対する、オリジナルのマウスＹ９Ａ２抗体よりも高い親和性を有するヒト化抗体を作製するために、上記の２種のヒト化抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ中のアミノ酸配列の置換を検討した。その結果、以下に示す３種のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体が、オリジナルのマウスＹ９Ａ２抗体と比較して有意に改善された活性および／または物性を有することが確認された。
１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
３）配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。

本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、本願明細書に開示される、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。具体的には、本発明のヒト化抗体の重鎖可変領域アミノ酸をコードする塩基配列を有する重鎖可変領域遺伝子断片、及び、本発明のヒト化抗体の軽鎖可変領域アミノ酸をコードする塩基配列を有する軽鎖可変領域遺伝子断片を作製する。そして、この可変領域遺伝子をヒト抗体の適当なクラスの定常領域遺伝子と連結させてヒト化抗体遺伝子を作製する。次いで、このヒト化抗体遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からヒト化抗体を得ることができる。

上記の本発明のヒト化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸をコードする各可変領域遺伝子断片は、例えば、該重鎖及び軽鎖可変領域の塩基配列又は該重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。また、本発明の抗体の可変領域遺伝子断片を一旦取得すれば、この遺伝子断片の所定の部位に変異を導入することによって、本発明の他の抗体を取得することも可能である。このような変異導入方法としては、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ８．１−８．５）等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。

次いで、上記の可変領域遺伝子断片とヒト抗体の定常領域遺伝子とを連結させてヒト化抗体遺伝子を作製する。使用されるヒト抗体の定常領域は、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖としてγ１、γ２、γ３またはγ４、軽鎖としてλまたはκ鎖の定常領域）も選択可能であり得るが、好ましくは、重鎖定常領域としてはヒトＩｇγ１を、また、軽鎖定常領域としてはヒトＩｇκを用いることができる。

このヒト化抗体遺伝子の作製につづく、ヒト化抗体遺伝子の発現ベクターへの導入、発現ベクターの培養細胞への導入、培養細胞の培養、抗体の精製等については、当該分野で公知の種々の方法を使用してか、あるいは、ＷＯ２００７／１３９１６４またはＷＯ２００３／０２７１５１に記載される、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の作製方法を参照して行うことができる。

上記のようにして得られたヒト化抗体遺伝子と連結される発現ベクターとしては、国際公開公報ＷＯ９４／２０６３２に記載のＡＧ−γ１やＡＧ−κ等の発現ベクターが使用できるが、ヒト化抗体遺伝子を発現することができるものであれば特に制限されない。なお、発現ベクターとしてＡＧ−γ１またはＡＧ−κ等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有するものを利用すれば、これにヒト化抗体可変領域遺伝子を挿入するだけでヒト化抗体遺伝子を有する発現ベクターとなるため好ましい。また、発現ベクターにおいては、抗体の細胞外への分泌発現を促すためのリーダー配列を使用してもよく、このようなリーダー配列としては、Ｙ９Ａ２に由来するリーダー配列や、別の抗体（例えば、ＷＯ２００７／１３９１６４に記載のヒト化抗オステオポンチン抗体）由来のリーダー配列を使用することができる。

上記の発現ベクターは、例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓiｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リン酸カルシウム法等の使用により、培養細胞中に導入される。

発現ベクターを導入する培養細胞としては、例えば、２９３細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞等の培養細胞が使用でき、これを常法により培養すればよい。

上記培養後、培養上清中に蓄積された抗体は、各種のカラムクロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラムを用いたクロマトグラフィーにより精製することができる。

得られたヒト化抗体のヒトα９インテグリンに対する結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡやＦＡＣＳ等の方法がある。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、α９インテグリンを発現させた細胞（例えば、ＳＷ４８０細胞）をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、これに対してヒト化抗体を添加して反応させた後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識したヒトＩｇＧ抗体等の二次抗体を添加して反応させ、洗浄した後、発色基質（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ＴＭＢ）を加えて吸光度を測定する。

得られたヒト化抗体がヒトα９インテグリンに対する機能阻害活性を有しているか否かを評価する方法としては、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３６３２８−３６３３４，１９９９に記載のヒトオステオポンチン分子に対するヒトα９インテグリン分子依存性細胞接着の阻害試験により確認することができる。すなわち、α９のリガンドの一つであるＮ末ＯＰＮ（オステオポンチンがトロンビンにより切断された後のＮ末端側フラグメント；以下、ｎＯＰＮと表記することがある）のＲＡＡ改変体（他のインテグリンとの反応を抑えるためにＲＧＤ配列をＲＡＡに改変したもの；以下、ｎＯＰＮ−ＲＡＡと表記することがある）をプレートに固定化し、ブロッキングを行う。各種ヒト化抗体を添加した後、α９発現細胞を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。細胞をクリスタルバイオレットとメタノールを用いて固定・染色して、洗浄後、接着した細胞中の色素をＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で抽出し、波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定する。

更に、得られたヒト化抗体がヒトα９インテグリンに対する機能阻害活性を有しているか否かをより詳細に評価する方法としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ，１２：３２１４−３２２５，２００１に記載の細胞遊走阻害試験に基づく方法が挙げられる。すなわち、ｎＯＰＮ−ＲＡＡをトランスウェルの上層に固定化した後にプレートに取り付け、その後１０％ＦＣＳを含んだＦ１５培地を下層に加える。上層にα９発現細胞と共にヒト化抗体を添加し、３７℃で１６時間インキュベートする。その後、トランスウェルの下層に遊走してきた細胞を、例えば、ＱＣＭ Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ２４−ｗｅｌｌ Ａｓｓａｙキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、定量化する。

本発明の３種のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、当該分野で公知の方法を用いて、配列番号１１、１３又は１５に示されるＶＨアミノ酸配列をコードするＤＮＡ及び配列番号１７又は９に示されるＶＬアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、これらを適当なクラスのヒト抗体定常領域遺伝子、好ましくは重鎖についてはヒトＩｇγ１定常領域遺伝子、軽鎖についてはヒトＩｇκ定常領域遺伝子と連結してヒト抗体遺伝子を構築し、当該分野で公知の種々の方法あるいはＷＯ０２／０８１５２２またはＷＯ０３／０２７１５１に記載される方法等を用いて、該ヒト化抗体遺伝子を発現ベクターへ導入し、該発現ベクターを培養細胞に導入して該培養細胞を培養し、得られる培養物から抗体を精製することによって、容易に取得することができる。好ましくは、配列番号１１、１３又は１５に示されるＶＨアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、それぞれ配列番号１２、１４又は１６に示される塩基配列を含む。好ましくは、配列番号１７又は９に示されるＶＬアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、それぞれ配列番号１８又は１０に示される塩基配列を含む。

配列番号１１に示される重鎖可変領域とヒトＩｇγ１定常領域とを連結して得られる、本発明の好ましいヒト化抗体重鎖は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖である。配列番号１７に示される軽鎖可変領域とヒトＩｇκ定常領域とを連結して得られる、本発明の好ましいヒト化抗体軽鎖は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖である。好ましくは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒト化抗体重鎖をコードするＤＮＡは、配列番号２０に示される塩基配列を含む。好ましくは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるヒト化抗体軽鎖をコードするＤＮＡは、配列番号２６に示される塩基配列を含む。配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明のヒト化抗α９インテグリン抗体としては、後記実施例に示されるＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体が挙げられる。

配列番号１３に示される重鎖可変領域とヒトＩｇγ１定常領域とを連結して得られる、本発明の好ましいヒト化抗体重鎖は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖である。配列番号１７に示される軽鎖可変領域とヒトＩｇκ定常領域とを連結して得られる、本発明の好ましいヒト化抗体軽鎖は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖である。好ましくは、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるヒト化抗体重鎖をコードするＤＮＡは、配列番号２２に示される塩基配列を含む。好ましくは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるヒト化抗体軽鎖をコードするＤＮＡは、配列番号２６に示される塩基配列を含む。配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明のヒト化抗α９インテグリン抗体としては、後記実施例に示されるＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体が挙げられる。

配列番号１５に示される重鎖可変領域とヒトＩｇγ１定常領域とを連結して得られる、本発明の好ましいヒト化抗体重鎖は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖である。配列番号９に示される軽鎖可変領域とヒトＩｇκ定常領域とを連結して得られる、本発明の好ましいヒト化抗体軽鎖は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖である。好ましくは、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるヒト化抗体重鎖をコードするＤＮＡは、配列番号２４に示される塩基配列を含む。好ましくは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるヒト化抗体軽鎖をコードするＤＮＡは、配列番号２８に示される塩基配列を含む。配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明のヒト化抗α９インテグリン抗体としては、後記実施例に示されるＲＹ９Ａ２ｖ０５（ＩＡＷ）０１抗体が挙げられる。

このようにして得られた本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、関節リウマチ等の自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶反応等の免疫疾患、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患、癌等のα９インテグリンが病態形成に関与する疾患の治療に用いることができる。

本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、好ましくは、関節リウマチ治療剤として用いることができる。これらの治療剤の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤とすることができ、静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。

上記製剤化に当たっての本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の添加量は、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。

本発明はまた、本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体あるいはその重鎖および／または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及びそれを含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明のヒト化抗体あるいはその重鎖又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現し、これらポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げることができる。

本発明の発現ベクターは、本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体あるいはその重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子、及び当該遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。細菌中で本発明のヒト化抗体あるいはその重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中でヒト化抗体あるいはその重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、βアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（Niwa H. et al., Gene, 108, 193-200, 1991）、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。

宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明のヒト化抗体あるいはその重鎖又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。

本発明はまた、本発明のヒト化抗体あるいはその重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子が導入された形質転換体を提供する。このような形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより作製できる。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）が例示される。形質転換は、自体公知の方法により行われ得る。

本発明はまた、本発明のヒト化抗体あるいはその重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子を宿主細胞に発現させること、即ち、このような形質転換体を用いることを含む、本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の生産方法を提供する。好ましくは、該方法で使用される宿主細胞は、本発明の発現ベクターが導入されており、該発現ベクターは、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを別々にか又は同時に含んでもよい。

本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の生産において、形質転換体は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。

形質転換体の培養は自体公知の方法により行われる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨおよび培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．５０１，１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行われ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば、上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１，１９７２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。

本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、上述のような形質転換体を培養し、該形質転換体から回収、好ましくは単離、精製することができる。単離、精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

市販のキットあるいは試薬を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。

《実施例１：マウスＹ９Ａ２抗体可変領域配列の決定及びキメラＹ９Ａ２抗体の作製》
マウスＹ９Ａ２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子を決定し、ＶＨ遺伝子をヒトＩｇγ１遺伝子に、ＶＬ遺伝子をヒトＩｇκ遺伝子に連結してマウス−ヒトのキメラ抗体（以下、キメラＹ９Ａ２抗体とも称する）を作製した。手順は下記の通りである。

まず、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）より提供された、マウスＹ９Ａ２抗体産生ハイブリドーマからＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）を用いてＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを鋳型とし、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ともにインビトロジェン社）を用いてｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡを鋳型として用い、カバット（Ｋａｂａｔ）らによるＶ領域及びＪ領域の配列の分類（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ ４ｔｈ ｅｄ．， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， ＮＩＨ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ， １９８７）を参照してデザインしたリーダー領域に対するプライマーとＪ領域に対するプライマーを用い、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）でＶＨ遺伝子断片を増幅した。ここで用いた上記リーダー領域に対するプライマーとＪ領域に対するプライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列が付加されている。ＶＬについてもＶＨの場合と同様に、リーダー配列に合致するプライマーとＪ領域に合致するプライマーを用いて、ＶＬ遺伝子断片を得た。

このようにして得たＶＨ、ＶＬ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ（ともにタカラバイオ社）で消化し、それぞれを、発現ベクターであるＡＧ−γ１、ＡＧ−κ（ＷＯ９４／２０６３２）と連結した。ＡＧ−γ１は、βアクチンプロモーター、ヒト免疫グロブリン定常領域γ１鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を持ち、γ１遺伝子の上流にあるＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列の間にマウスＹ９Ａ２抗体ＶＨ遺伝子を挿入することにより、キメラＹ９Ａ２抗体の重鎖を発現するプラスミドとなる。ＡＧ−κは、βアクチンプロモーター、ヒト免疫グロブリン定常領域κ鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を持ち、同じくκ遺伝子の上流にあるＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列の間にマウスＹ９Ａ２抗体ＶＬ遺伝子を挿入することにより、キメラＹ９Ａ２抗体の軽鎖を発現するプラスミドとなる。

これらの発現プラスミドを常法により大腸菌に導入して形質転換クローンを得、それからＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔを及びＣＥＱ２０００オートシークエンサー（ともにＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いて、クローニングされているＶＨ及びＶＬの塩基配列を解読した。当該ＶＨ及びＶＬの塩基配列を、それぞれ配列番号２及び配列番号４に示した。得られた配列をもとに決定したＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ、図１及び図２に示した。また、それぞれを、配列番号１及び配列番号３に示した。

上記大腸菌クローンを大量培養して、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてキメラＹ９Ａ２抗体の重鎖発現プラスミド及び軽鎖発現プラスミドを精製し、それらを混合して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて細胞に導入することにより、キメラＹ９Ａ２抗体を一過性に発現させた。得られた培養上清に含まれるキメラＹ９Ａ２抗体濃度を、ヤギ由来抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社）とプロテインＡ−ＨＲＰ（ＺＹＭＥＤ社）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。この際、市販のヒトＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）の希釈系列を作製し、それを標準試料とした。次に、上記培養上清中のキメラＹ９Ａ２抗体を、プロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いてアフィニティ精製し、精製キメラＹ９Ａ２抗体を得た。精製キメラＹ９Ａ２抗体の濃度は、波長２８０ｎｍにおける吸光度が１．４の場合に１ｍｇ／ｍＬとして算出した。

《実施例２：キメラＹ９Ａ２抗体の細胞接着阻害試験》
前項に記載の方法で調製した精製キメラＹ９Ａ２抗体について、マウスＹ９Ａ２抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社）との活性を比較するために、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３６３２８−３６３３４，１９９９に記載の細胞接着阻害試験を行った。すなわち、まずオステオポンチンがトロンビンにより切断されて生じるＮ末端側の断片（ｎＯＰＮ）に含まれるＲＧＤ配列をＲＡＡに置換した改変体（ｎＯＰＮ−ＲＡＡ）を固定化し、ブロッキングを行った後、マウスＹ９Ａ２抗体または精製キメラＹ９Ａ２抗体を添加した。続けてヒトα９インテグリン分子を発現させたＳＷ４８０細胞（以下、ＳＷ４８０／ｈα９細胞と表記することがある）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、クリスタルバイオレットとメタノールを用いて固定・染色して、洗浄後、接着した細胞中の色素をＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で抽出し、波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。

その結果、表１に示したように、マウスＹ９Ａ２抗体及び精製キメラＹ９Ａ２抗体は、ほぼ同じＩＣ５０で、ｎＯＰＮ−ＲＡＡに対するＳＷ４８０／ｈα９細胞の接着を阻害する活性を持つことが判った。ＩＣ５０は、抗α９インテグリン抗体を添加しない場合に起こる細胞接着のレベルを基準としたときに、それを５０％抑制する抗α９インテグリン抗体の濃度として定義される。

《実施例３：ヒト化Ｙ９Ａ２抗体遺伝子の作製》
マウスＹ９Ａ２抗体のＶＨ及びＶＬ中の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸の移植先となる鋳型ヒト抗体は、マウスＹ９Ａ２抗体のＶＨ、ＶＬのフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列に対して、それらと相同性の高いアミノ酸配列を持つヒト抗体のｇｅｒｍｌｉｎｅの中から選んだ。具体的には、鋳型ヒトＶＨとしてはＤＰ−８８にＪＨ６を組み合わせたもの、鋳型ヒトＶＬとしてはＤＰＫ−１にＪκ４を組み合わせたものを選んだ。

上記の鋳型ヒト抗体ＶＨ及びＶＬのＦＲに、マウスＹ９Ａ２抗体のＶＨ及びＶＬから必要なアミノ酸配列を移植してヒト化抗体を作製した。具体的には、まずＶＨについては、前述の鋳型ヒト抗体ＶＨのＣＤＲアミノ酸配列及びＦＲアミノ酸の数カ所をマウスＹ９Ａ２抗体のＶＨ中の対応するアミノ酸配列で置換し、２種類のヒト化Ｙ９Ａ２抗体のＶＨ、すなわち、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５及びＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８のアミノ酸配列をデザインし（それぞれ、配列番号５及び配列番号７）、更に、それらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列をデザインした（それぞれ、配列番号６及び配列番号８）。ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８では、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５におけるマウスＹ９Ａ２抗体由来のＦＲアミノ酸残基のうちの４つが鋳型ヒト抗体のものに置換されている。

ＶＬについては、前述の鋳型ヒト抗体ＶＬのＣＤＲアミノ酸配列をマウスＹ９Ａ２抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列で置換し、ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のＶＬであるＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１のアミノ酸配列をデザインし（配列番号９）、更に、そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列をデザインした（配列番号１０）。

上記のＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８及びＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１をコードするＤＮＡ断片を作製するために、オリゴＤＮＡを材料としたＰＣＲによる全合成を行った。具体的には、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５については、それぞれ図３に示したように、ＶＨの全長をカバーするように６種類のオリゴＤＮＡ（配列番号２９〜３４に記載）に分けて合成し、それらを用いて次の手順でＰＣＲを行った。すなわち、まず６種類のオリゴＤＮＡを各々等量混合したものを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いて、９６℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３分のステップを１５サイクル繰り返した。次に、このＰＣＲ産物の１μＬを鋳型として用い、図３の太文字表記部分の配列を持つオリゴＤＮＡ（配列番号３５及び３６に記載）をプライマーとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９６℃で２０秒、７２℃で２分のステップを２５サイクル繰り返すことにより、ＶＨの全長を増幅した。ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８についても、概ね同様の方法で作製した。

ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１の作製の場合は、図４に示した６本のオリゴＤＮＡ（配列番号３７〜４２に記載）を用いて、上記と同様に１５サイクルのＰＣＲを行った後、その増幅産物を鋳型として用い、図４の太文字表記部分の配列を持つオリゴＤＮＡ（配列番号４３及び４４に記載）をプライマーとして、上記と同様の２５サイクルのＰＣＲを行うことにより、ＶＬの全長を増幅した。

上記のＶＨ、ＶＬともに、抗体のリーダー配列としては、ＷＯ２００７／１３９１６４に記載の、ヒト化抗オステオポンチンモノクローナル抗体と同じものを使用した。また、得られたＤＮＡ断片の両端には、クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ認識配列及びＢａｍＨＩ認識配列が付加されている。

このようにして得たＶＨ及びＶＬのＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、それぞれ前述の発現ベクターＡＧ−γ１、ＡＧ−κと連結して定法により大腸菌に導入してクローニングし、得られた大腸菌クローンからＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型としてＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔを及びＣＥＱ２０００オートシークエンサー（ともにＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いて、クローニングされているＶＨ及びＶＬの塩基配列を解読することにより、デザイン通りの塩基配列を持つクローンを得た。これらのクローンを培養して、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、重鎖、軽鎖の発現プラスミドを精製した。

精製した重鎖発現プラスミド、軽鎖発現プラスミドを混合して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて細胞に導入し、抗体を一過性に発現させた。この際、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５を挿入した重鎖発現プラスミドと、ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１を挿入した軽鎖発現プラスミドを組み合わせた場合に発現するヒト化Ｙ９Ａ２抗体をＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体と命名し、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８を挿入した重鎖発現プラスミドと、ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１を挿入した軽鎖発現プラスミドを組み合わせた場合に発現するヒト化Ｙ９Ａ２抗体をＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体と命名した。

培養上清中に蓄積した各ヒト化Ｙ９Ａ２抗体の濃度の測定及び、培養上清からの精製抗体の取得は、前述のキメラＹ９Ａ２抗体の場合と同じ方法で行った。

《実施例４：ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のヒトα９インテグリンに対する結合性確認》
前述の方法で発現させたＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体について、ヒトα９インテグリン分子に対する結合性をＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法によりキメラＹ９Ａ２抗体（以下、ｃＹ９Ａ２抗体と表記することがある）と比較した。すなわち、ヒトα９インテグリン分子を発現させたＳＷ４８０細胞をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、それに対して上記ｃＹ９Ａ２抗体またはＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体またはＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体を反応させた後、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社）を反応させ、ＴＭＢを加えて発色させた後、希硫酸を加えて反応を停止させ波長４５０ｎｍにおける吸光度を調べた。その結果、図５及び図６に示したようにＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体はｃＹ９Ａ２抗体と同等のヒトα９インテグリン分子結合性を持つことが確認された。

《実施例５：ヒト化Ｙ９Ａ２抗体の細胞接着阻害試験》
上記の精製ＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体、精製ＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体及びマウスＹ９Ａ２抗体について、実施例２に記載と同様の手順で細胞接着阻害試験を行った。

その結果を表２に示した。ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）は、抗α９インテグリン抗体を添加しない場合に起こる細胞接着のレベルを基準としたときに、それを５０％抑制する抗α９インテグリン抗体の濃度として定義される。マウスＹ９Ａ２抗体のＩＣ５０値の平均値は０．０７０μｇ／ｍＬであった。表２にはマウスＹ９Ａ２のＩＣ５０値を１とした場合のヒト化抗体の比活性を示す。表２に２回の試験の平均値を示した。表２に示したように、上記２種のヒト化抗体はマウスＹ９Ａ２抗体と同等の細胞接着阻害活性を持つことが確認された。

《実施例６：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体の作製》
前述のように、オリジナルのマウスＹ９Ａ２抗体と同程度の細胞接着阻害活性を有する２種のヒト化Ｙ９Ａ２抗体（ＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体）を取得できたことから、次に、本発明者らは、これらのヒト化抗体を基に、変異導入を行うことによって、ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のさらなる改良を試みた。

本発明者らによる相当の創意検討の結果、マウスＹ９Ａ２抗体よりも有意に優れた活性を有するヒト化Ｙ９Ａ２抗体として、以下の３種の抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１抗体を作製することに成功した。

１．ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体
ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する。ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＨ及びＶＬの塩基配列は、それぞれ配列番号１２及び１８に示される。ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＨは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８（配列番号７）の、ＣＤＲ１中のメチオニン残基（ＶＨアミノ酸配列の３４番目のアミノ酸残基）のロイシンへの置換、並びに、ＣＤＲ２中のリジン残基及びアスパラギン酸残基（ＶＨアミノ酸配列の６５番目及び６６番目のアミノ酸残基）のそれぞれグルタミン及びグリシンへの置換を有するものである。ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＬは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１（配列番号９）の、ＣＤＲ１中のリジン残基（ＶＬアミノ酸配列の２４番目のアミノ酸残基）のアルギニンへの置換を有するものである。

２．ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体
ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＨは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有し、ＶＬは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する。ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＨ及びＶＬの塩基配列は、それぞれ配列番号１４及び１８に示される。ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＨは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（配列番号５）の、ＣＤＲ１中のメチオニン残基（ＶＨアミノ酸配列の３４番目のアミノ酸残基）のロイシンへの置換、並びに、ＣＤＲ２中のリジン残基及びアスパラギン酸残基（ＶＨアミノ酸配列の６５番目及び６６番目のアミノ酸残基）のそれぞれグルタミン及びグリシンへの置換を有するものである。ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＬは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１（配列番号９）の、ＣＤＲ１中のリジン残基（ＶＬアミノ酸配列の２４番目のアミノ酸残基）のアルギニンへの置換を有するものである。

３．ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１抗体
ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１抗体のＶＨは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有し、ＶＬは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する。ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１のＶＨ及びＶＬの塩基配列は、それぞれ配列番号１６及び１０に示される。ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１抗体のＶＨは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（配列番号５）の、ＣＤＲ１中のメチオニン残基（ＶＨアミノ酸配列の３４番目のアミノ酸残基）のイソロイシンへの置換、並びに、ＣＤＲ３中のアスパラギン酸残基及びフェニルアラニン残基（ＶＨアミノ酸配列の１０４番目及び１０５番目のアミノ酸残基）のそれぞれアラニン及びトリプトファンへの置換を有するものである。ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１抗体のＶＬは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１（配列番号９）と同じである。

上記の３種の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のＶＨ及びＶＬのＤＮＡ断片を、前述と同様に発現ベクターＡＧ−γ１、ＡＧ−κと連結して発現プラスミドを作製し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて発現させ、前述と同様にプロテインＡカラムを用いて培養上清から各々の精製抗体を取得した。

《実施例７：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のヒトα９インテグリンに対する結合性確認》
前述のように作製した３種類のヒト化Ｙ９Ａ２抗体およびｃＹ９Ａ２抗体について、実施例４と同様に、ＣＥＬＬ ＥＬＩＳＡによりヒトα９インテグリンに対する結合性の確認を行った。その結果、改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体はいずれもキメラＹ９Ａ２抗体と同様、ヒトα９インテグリンに対する結合性を有することが確認できた。

《実施例８：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のヒトｎＯＰＮに対する細胞接着阻害試験》
３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体について、マウスＹ９Ａ２抗体との活性を比較するために、実施例２に記載と同様の手順で細胞接着阻害試験を行った。

その結果を表３に示した。ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）は、抗α９インテグリン抗体を添加しない場合に起こる細胞接着のレベルを基準としたときに、それを５０％抑制する抗α９インテグリン抗体の濃度として定義される。マウスＹ９Ａ２抗体のＩＣ５０値の平均的は０．０３９μｇ／ｍＬであった。表３にはマウスＹ９Ａ２のＩＣ５０値を１とした場合のヒト化Ｙ９Ａ２抗体の比活性を示す。２〜３回の試験の平均値を表３に示した。３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体は、マウスＹ９Ａ２抗体と比較して４倍以上、細胞接着阻害活性が向上していることが判った。

《実施例９：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のヒトＶＣＡＭ−１、ヒトＴｅｎａｓｃｉｎＣに対する細胞接着阻害試験》
３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体について、前述の細胞接着阻害試験に用いたｎＯＰＮ−ＲＡＡとは異なるリガンドを用いて検討を行った。具体的にはヒトＶＣＡＭ−１/Ｉｇ（Ｒ＆Ｄ社）、ヒトＴｅｎａｓｃｉｎＣのＲＧＤ配列をＲＡＡに置換した改変体ヒトＴｅｎａｓｃｉｎＣ−ＲＡＡを用いて同様に細胞接着阻害作用の検討を行なった。

２回の試験の平均値を表４に示した。マウスＹ９Ａ２抗体のヒトＶＣＡＭ−１、ヒトＴｅｎａｓｃｉｎＣ−ＲＡＡに対する細胞接着阻害活性ＩＣ５０値の平均値は、それぞれ、０．０７７μｇ／ｍＬ、０．０４１μｇ／ｍＬであった。表４にはマウスＹ９Ａ２抗体のＩＣ５０値を１とした場合のヒト化Ｙ９Ａ２抗体の比活性を示す。３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体は、用いるリガンドにより違いはあるが、マウスＹ９Ａ２抗体と同等以上の阻害活性を示すことが判った。

《実施例１０：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体の細胞遊走阻害試験》
３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体について、ＳＷ４８０／ｈα９細胞のｎＯＰＮ−ＲＡＡに対する遊走活性に対する阻害作用を検討した。実験は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ，１２：３２１４−３２２５，２００１に記載の細胞遊走阻害試験を基に若干の改変を加えて行った。すなわち、ｎＯＰＮ−ＲＡＡをトランスウェル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）の上層に固定化した後にプレートに取り付け、その後１０％ＦＣＳを含んだＦ１５培地を下層に加えた。上層にマウスＹ９Ａ２抗体またはヒト化Ｙ９Ａ２抗体をＳＷ４８０／ｈα９細胞と一緒に添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。その後、トランスウェルの下層に遊走してきた細胞をＱＣＭ Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ２４−ｗｅｌｌ Ａｓｓａｙキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて定量化した。過剰量である１００μｇ／ｍＬのマウスＹ９Ａ２抗体を添加することにより阻害される遊走活性をα９依存的な遊走活性と定義し（１００％阻害）、各抗体の阻害率を表５に示す。

マウスＹ９Ａ２抗体では、５０μｇ／ｍＬでなければ有意な遊走阻害作用が見られないが、本発明者らによって作製された改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体では、５μｇ／ｍＬとマウスＹ９Ａ２抗体の１／１０の濃度で有意な阻害活性が見られた。なお、有意差検定は、抗体未添加のウェルに対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにて行なった。*: Ｐ＜０．０５、**: Ｐ＜０．０１。

この有意な細胞遊走阻害作用は臨床有効濃度に直結しており、臨床有効濃度が１／１０になることは臨床において投与間隔の拡大（例えば、２週に１回投与が数ヶ月に１回投与になる、等）に繋がり、更に、５μｇ／ｍＬ程度の血中濃度維持であれば皮下注製剤の開発が可能となる。皮下注製剤は現在世界中で自己注射が認められており、慢性疾患においては、特に患者、医療機関双方に取って利便性が格段に向上する。このように本発明による生物学的活性の改善は、その治療有効性のみならず患者コンプライアンスの改善に大きく寄与するものである。

《実施例１１：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体の熱安定性試験》
３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体およびマウスＹ９Ａ２抗体について、７０℃で２時間または１０時間インキュベートした後に、実施例８に記載の細胞接着阻害試験を用いて熱安定性について評価を行った。

４回の実験の平均値を表６に示した。熱処理をしない場合の細胞接着阻害活性を１００％として、熱処理した後の各抗体の活性残存率を示した。マウスＹ９Ａ２抗体では２時間で活性の低下が認められたが、３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体は１０時間インキュベートしても活性が８５％以上残っていた。このように、改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体が極めて熱に対して安定である性質は、臨床開発製剤において室温保存可能な利便性の高い製剤の開発に繋がるといえる。

本発明の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、ドナーマウス抗ヒトα９インテグリン抗体と比較して、活性および／または物性が改善された抗体であり、ヒトα９インテグリンとその複数のリガンドとの相互作用の遮断を通じ、強力な抗炎症作用や骨破壊抑制作用を有するものであり、ヒトα９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療に有用である。
本出願は、日本で出願された特願２００８−００４９７５（出願日：平成２０年１月１１日）および特願２００８−２８２４９６（出願日：平成２０年１０月３１日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (15)

1. 以下のいずれかから選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
   （ａ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
   （ｂ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、または
   （ｃ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
2. 前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１である、請求項１に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
3. 前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、請求項１に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
4. 前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、請求項１に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
5. 配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
6. 配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
7. 配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
8. 請求項１に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
9. 請求項１に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
10. 請求項８に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
11. 請求項１０に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
12. 請求項１１に記載の宿主細胞を培養し、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を発現させる工程を包含する、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を生産する方法。
13. 請求項１〜７のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含む、関節リウマチの治療薬。
14. 請求項１〜７のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、関節リウマチを予防または処置するための方法。
15. 関節リウマチを予防または処置するための医薬の製造における、請求項１〜７のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の使用。

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