WO2014196658A1 - NMO-IgGに拮抗する抗アクアポリン４抗体 - Google Patents

NMO-IgGに拮抗する抗アクアポリン４抗体 Download PDF

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chain variable
acid sequence
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正人 安井
陽一郎 阿部
馨 宮▲崎▼
浜窪　隆雄
先浜　俊子
宏子 岩成
新井　修
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学校法人慶應義塾
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that binds to the extracellular domain of human aquaporin 4, and further to a therapeutic agent for optic neuritis containing the antibody.
  • Optic neuritis is a demyelinating disease characterized by optic neuritis and acute myelitis. Optic myelitis has been conventionally referred to as a subtype of multiple sclerosis (MS). However, since the discovery of disease-specific autoantibodies (NMO-IgG), it has become clear that multiple sclerosis is another disease with a different onset mechanism. NMO-IgG positive patients are usually ineffective with the treatment used for multiple sclerosis.
  • NMO-IgG anti-aquaporin 4 antibody
  • AQP4 water channel aquaporin 4
  • astrocytes which are the expression cells, are damaged to cause dislocation (see Non-Patent Documents 1 to 3). It is known that symptoms are alleviated by actually removing NMO-IgG in blood by plasma exchange. University of California, Dr. Verkman et al. Have proposed an antibody preparation in which the complement binding ability and the Fc receptor binding ability of NMO-IgG cloned from a patient plasmablast are removed by mutagenesis (see Non-Patent Document 4).
  • the present invention relates to an antibody that antagonizes a higher affinity for NMO-IgG binding that triggers the onset and has no biological activity harmful to the living body, such as complement activation ability and Fc receptor binding ability.
  • the purpose is to develop a new treatment to stop the progression of the disease. Specifically, it aims to provide a monoclonal antibody that binds to aquaporin 4 expressed in astrocytes, inhibits NMO-IgG from binding to aquaporin 4, and does not itself have complement activation ability or the like. To do.
  • NMO optic neuromyelitis
  • an antibody preparation in which the complement binding ability and the Fc receptor binding ability of NMO-IgG are eliminated by mutagenesis has been proposed.
  • an antibody preparation based on NMO-IgG itself obtained from a patient is difficult to obtain that surpasses NMO-IgG in terms of binding affinity for aquaporin 4 (AQP4).
  • the inventors of the present invention have produced a monoclonal antibody that binds to the aquaporin 4 extracellular domain, thereby obtaining an antibody having a higher affinity than NMO-IgG, and humanizing the antibody to clone it from a patient cell.
  • the present invention is as follows.
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6
  • a monoclonal antibody that specifically binds to the extracellular domain of aquaporin 4, or a functional fragment thereof.
  • Heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • a monoclonal antibody that specifically binds to the extracellular domain of aquaporin 4 according to [2] or a functional fragment thereof.
  • Heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 and light chain variable comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6
  • a monoclonal antibody that specifically binds to the extracellular domain of aquaporin 4 of [2] or [3] or a functional fragment thereof, wherein the signal sequence is removed from the region.
  • the signal sequence from the N-terminal to the 20th G of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is removed, and the signal sequence from the N-terminal to the 20th G of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 A monoclonal antibody or a functional fragment thereof that specifically binds to the extracellular domain of aquaporin 4 of [4], which has been removed.
  • a monoclonal that specifically binds to the extracellular domain of aquaporin 4 comprising any of the following heavy chain variable regions (i) to (iii) and any of the light chain variable regions (iv) to (vi): Antibody or functional fragment thereof:
  • Heavy chain variable region CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, heavy chain variable region CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and heavy chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • a heavy chain variable region comprising the variable region CDR3;
  • heavy chain variable region CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • heavy chain variable region CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and heavy chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15
  • a light chain variable region comprising the variable region CDR3; (Vi) a light chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, a light chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 A light chain variable region comprising the variable region CDR3.
  • the constant region is a constant region of a human antibody, which is a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • a therapeutic agent for optic neuromyelitis comprising the monoclonal antibody or functional fragment thereof according to any one of [1] to [12] as an active ingredient.
  • the therapeutic agent for optic neuromyelitis according to [13] which inhibits binding of MNO-IgG causing optic neuritis to aquaporin 4 expressed in astrocytes.
  • a drug kit for the treatment of optic neuromyelitis comprising the optic neuromyelitis treatment drug of [13] or [14] and a steroid agent.
  • the anti-aquaporin 4 monoclonal antibody that recognizes and binds to the extracellular domain of aquaporin 4 of the present invention binds to aquaporin 4 with a greater affinity than NMO-IgG, which is a polyclonal autoantibody against aquaporin 4.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention when administered to a patient who has developed optic neuromyelitis in which NMO-IgG binds to aquaporin 4 and astrocytes expressing aquaporin 4 are damaged,
  • the antibody can inhibit the binding of NMO-IgG to aquaporin 4, and can further replace NMO-IgG already bound to aquaporin 4, thereby eliminating NMO-IgG from binding to aquaporin 4.
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • FIG. 1 is a diagram showing the binding characteristics of purified NMO-IgG derived from NMO patients to aquaporin 4.
  • FIG. 2 is a diagram showing the binding characteristics of established monoclonal antibodies analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of tissue staining using an anti-aquaporin 4 monoclonal antibody.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of immunoprecipitation using an anti-aquaporin 4 monoclonal antibody.
  • FIG. 5 shows the results of Western blotting using anti-aquaporin 4 monoclonal antibody.
  • FIG. 6 is a diagram showing the structure of human aquaporin 4.
  • FIG. 1 is a diagram showing the binding characteristics of purified NMO-IgG derived from NMO patients to aquaporin 4.
  • FIG. 2 is a diagram showing the binding characteristics of established monoclonal antibodies analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of tissue staining using
  • FIG. 7 shows changes in the binding of monoclonal antibodies when amino acids in the extracellular domain of human aquaporin 4 are substituted.
  • FIG. 8 is a diagram showing the influence of anti-aquaporin 4 monoclonal antibody on water permeability of aquaporin 4.
  • FIG. 9 is a diagram showing the binding of an anti-aquaporin 4 monoclonal antibody and aquaporin 4 in an experiment for measuring the water permeability of aquaporin 4.
  • FIG. 10 is a diagram showing inhibition of binding of NMO-IgG to aquaporin 4 expressed on the cell surface by an anti-aquaporin 4 monoclonal antibody.
  • FIG. 11 is a diagram showing substitution of NMO-IgG bound to aquaporin 4 expressed on the cell surface by an anti-aquaporin 4 monoclonal antibody.
  • FIG. 12 shows that anti-aquaporin 4 monoclonal antibody does not have CDC activity in the absence of complement.
  • FIG. 13 is a view showing amino acid sequences of CDRs in the heavy chain variable region, the light chain variable region, and the variable region of the monoclonal antibody produced by the hybridoma clone C9401.
  • FIG. 14 is a view showing amino acid sequences of CDRs in the heavy chain variable region, the light chain variable region, and the variable region of the monoclonal antibody produced by the hybridoma clone D12092.
  • FIG. 15 is a view showing the amino acid sequences of CDRs in the heavy chain variable region, the light chain variable region, and the variable region of the monoclonal antibody produced by the hybridoma clone D15107 (D15129).
  • FIG. 16 is a view showing the affinity of an anti-aquaporin monoclonal antibody when a germinating baculovirus expressing hAQP4 M23 is used.
  • FIG. 17 is a diagram showing the affinity of anti-aquaporin monoclonal antibodies when CHO cells expressing hAQP4 M1 or hAQP4-M23 are used.
  • FIG. 17A shows the result of C9401 antibody
  • FIG. 17B shows the result of D12092 antibody
  • FIG. 17C shows the result of D15107 antibody.
  • FIG. 18 shows the binding characteristics of each monoclonal antibody to the extracellular domain of hAQP4.
  • FIG. 19 shows the affinity of C9401 chimeric antibody.
  • FIG. 20 is a diagram showing the inhibitory effect of C9401 chimeric antibody on complement-dependent cytotoxicity by NMO-IgG.
  • Anti-aquaporin 4 monoclonal antibody of the present invention is an anti-aquaporin 4 antibody that specifically recognizes and binds to the extracellular domain of aquaporin 4.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention specifically binds to the extracellular domain of aquaporin 4 with high affinity.
  • Aquaporin 4 is a six-transmembrane protein that acts as a water channel expressed in astrocyte foot processes at the blood-brain barrier, and there are three extracellular loops, loop A, loop C, and loop E. Aquaporin 4 has two isoforms named M1 and M23.
  • M23 is transcribed from the transcription start site upstream of exon 1 of the gene encoding the aquaporin 4 gene.
  • M1 is transcribed from the upstream of exon 0, spliced in-frame with exon 1, and consists of an amino acid sequence in which 22 amino acids are added to the N-terminus of M23 isoform.
  • Aquaporin 4 constitutes a heterotetramer and forms an orthogonal array structure (orthogonal arrays of particles (OAPs)).
  • the M23 isoform forms OAPs, while the M1 isoform does not form OAPs and breaks conversely.
  • the extracellular domain of aquaporin 4 consists of a loop A consisting of amino acids 60 to 67 of the amino acid sequence of the M23 isoform of human aquaporin 4 represented by SEQ ID NO: 40, and approximately amino acids 138 to 155. Loop C, and loop E consisting of approximately amino acids 210 to 229 (FIG. 6), and these three loops exist in close proximity to form an extracellular domain.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention recognizes the three-dimensional structure of the extracellular domain formed by the assembly of these three loops and binds to the extracellular domain of aquaporin 4.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention recognizes and binds to at least loop A of the extracellular domain.
  • Aquaporin 4 is possessed by humans and other animals, and the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention recognizes and binds to the extracellular domain of M23 isoform and M1 isoform of human aquaporin 4. Further, the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention includes an antibody that recognizes and binds to the M23 isoform of mouse aquaporin 4, but does not recognize and bind to the M1 isoform of mouse aquaporin 4.
  • the anti-aquaporin 4 monoclonal antibody of the present invention can be obtained by a known method for immunizing animals such as mice using human aquaporin 4 as an immunogen.
  • the anti-aquaporin 4 antibody is preferably produced by the baculovirus display method.
  • the baculovirus display method is a method in which an immune antigen is expressed on the surface of a baculovirus membrane, and an antibody is produced by immunization using the baculovirus expressing the antigen as an immunogen. The method is described by Saitoh et al. , J .; Immunol. Methods 322: 104-17.
  • aquaporin 4 has a large amino acid sequence identity between humans and other animals, particularly mice. When human aquaporin 4 is immunized to mice, it may be recognized as self and antibody production may not be induced.
  • a mouse in which a gene encoding aquaporin 4 is knocked out is used, and the mouse is immunized with human aquaporin 4.
  • a mouse in which a gene encoding aquaporin 4 is knocked out can be produced by a known method.
  • a gene encoding aquaporin 4 in a mouse fertilized egg or early embryo is partially or completely obtained by homologous recombination or the like.
  • the fertilized egg or the early embryo may be transferred to the uterus of a foster mother of a mouse and generated.
  • a gene encoding aquaporin 4 of ES cell (embryonic stem cell) or iPS cell (induced pluripotent stem cell) is partially or completely deleted by homologous recombination or the like, and the ES cell or the iPS cell is A gene encoding aquaporin 4 is knocked out by inserting into an early embryo such as a blastocyst, transplanting the embryo into the uterus of a foster parent of a mouse, generating a chimeric mouse, and mating the chimeric mice This can be done by obtaining transformed mice.
  • an animal is immunized with human aquaporin 4, and an anti-human aquaporin 4 antibody-producing hybridoma can be produced using antibody-producing cells such as spleen cells obtained from the animal. From the hybridoma, an anti-human aquaporin 4 monoclonal is produced. Antibodies can be obtained. Clone C9401, D12092, D15107, and D15129 are mentioned as an anti-human aquaporin 4 monoclonal antibody production hybridoma obtained using the mouse
  • Monoclonal antibodies produced by clones C9401 and D12092 recognize and bind to the M1 and M23 isoforms of human aquaporin 4, but do not recognize and bind to mouse aquaporin 4.
  • clone D15107 (D15129) recognizes and binds to the M1 and M23 isoforms of human aquaporin 4, recognizes and binds to the M23 isoform of mouse aquaporin 4, and does not recognize the M1 isoform of mouse aquaporin 4. Do not combine.
  • the heavy chain variable region and light chain variable region of the above clone and the complementarity-determining region (CDR) of the variable region were analyzed.
  • FIGS. 13 to 15 show signal sequences predicted using Signal P of signal sequence prediction software.
  • the signal sequence can be predicted from the amino acid sequence information, and for example, can be predicted using signal sequence prediction software. Examples of signal sequence prediction software include Signal P and PRORT II.
  • FIG. 13 to 15 show signal sequences predicted using Signal P of signal sequence prediction software.
  • the signal sequence can be predicted from the amino acid sequence information, and for example, can be predicted using signal sequence prediction software. Examples of signal sequence prediction software include Signal P and PRORT II.
  • FIG. 13 shows the full-length amino acid sequence including the signal sequence of the heavy chain variable region (C9401 HV) and light chain variable region (C9401 LV) of the antibody produced by clone C9401, and further shows the CDR1, CDR2 and CDR3 of the variable region. Indicates the sequence.
  • the sequence of the part indicated by IgG2b C region in the figure is the sequence of the constant region, and the correct Ig fragment sequence is obtained when the V gene, (D gene), J gene, and C gene are cloned without frame shift. It is displayed to show that it has been obtained. The same applies to FIGS.
  • sequences indicated by Ighv1-66 and Ighv1-84 are sequences having high sequence identity with the C9401 HV sequence among the heavy chain V genes present in 100 or more antibody loci in C57BL / 6 mice, The sequence at a position different from the amino acid sequence of C9401 HV is shown.
  • sequences represented by Igkv3-5 and Igkv3-10 are sequences having high sequence identity with the C9401 LV sequence among light chain V genes present in 100 or more antibody loci in C57BL / 6 mice, The sequence at a position different from the amino acid sequence of C9401 LV is shown. Signal sequences were deduced using Signal P for the sequenced heavy and light chain variable regions.
  • the signal sequence of the heavy chain variable region is from the N-terminus of SEQ ID NO: 25 to the 19th cysteine (C), and the signal sequence of the light chain variable region is the 20th glycine (G ).
  • FIG. 14 shows the full-length amino acid sequence including the signal sequence of the heavy chain variable region (D12092 HV) and light chain variable region (D12092 LV) of the antibody produced by clone D12092, and further shows the CDR1, CDR2 and CDR3 in the variable region. Indicates the sequence.
  • the sequence represented by Ighv2-6 is a sequence having high sequence identity with the sequence of D12092 HV among the heavy chain V genes present in 100 or more antibody loci in C57BL / 6 mice.
  • sequences represented by Igkv3-5 and Igkv3-10 are sequences having high sequence identity with the sequence of D12092 LV among light chain V genes present in 100 or more antibody loci in C57BL / 6 mice, The sequence at a position different from the amino acid sequence of D12092 LV is shown.
  • Signal sequences were deduced using Signal P for the sequenced heavy and light chain variable regions.
  • the signal sequence of the heavy chain variable region is from the N-terminus of SEQ ID NO: 27 to the 19th serine (S), and the signal sequence of the light chain variable region is the 20th glycine (G ).
  • S serine
  • G 20th glycine
  • the sequence represented by Ighv2-9 is a sequence having high sequence identity with the sequence of D15107 HV among the heavy chain V genes present in 100 or more antibody loci in C57BL / 6 mice, and the amino acid sequence of D15107 HV The sequence at a position different from the sequence is shown.
  • the sequence represented by Igkv3-5 is a sequence having high sequence identity with the sequence of D15107 LV among the light chain V genes present in 100 or more antibody loci in C57BL / 6 mice, and the amino acid sequence of D15107 LV The sequence at a position different from the sequence is shown. Signal sequences were deduced using Signal P for the sequenced heavy and light chain variable regions.
  • the signal sequence of the heavy chain variable region is from the N-terminus of SEQ ID NO: 29 to the 19th serine (S), and the signal sequence of the light chain variable region is the 20th glycine (G ).
  • the amino acid sequences of C9410 HV, C9401 LV, D12092 HV, D12092 LV, D15107 HV, and D15107 LV, which partially include the constant region sequences shown in FIGS. 13 to 15, are shown in SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29, respectively. And 30.
  • amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of the hybridoma produced by each clone and the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain variable region and the light chain variable region are shown below.
  • Clone C9401 heavy chain variable region amino acid sequence In the amino acid sequence, the signal sequence from the N-terminal to the 19th C is a putative signal sequence.
  • Clone D12092 Heavy chain variable region amino acid sequence In the amino acid sequence, the signal sequence from the N-terminal to the 19th S is a putative signal sequence.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention comprises a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence obtained by removing a signal sequence from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2, An antibody comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence obtained by removing a signal sequence from the amino acid sequence represented by No. 4 or SEQ ID No. 6.
  • a heavy chain variable region and a light chain variable region consisting of an amino acid sequence from which a signal sequence has been removed are mature without a signal sequence that is secreted into the culture supernatant when DNA encoding the above amino acid sequence is expressed in animal cells.
  • the A from the 20th Q to the 134th A is an amino acid from which the signal sequence has been removed.
  • the 20 th Q to 133 The T is the amino acid from which the signal sequence has been removed
  • the A from the 20th Q to the 134th A is the amino acid from which the signal sequence has been removed.
  • R from the 21st D to the 132nd R is an amino acid from which the signal sequence has been removed
  • from the 21st D to the 132nd amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 R is an amino acid from which the signal sequence has been removed
  • the R from the 21st D to the 132nd R is an amino acid from which the signal sequence has been removed.
  • the combination of the heavy chain variable region and the light chain variable region is not limited, and the combination of the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 2 (hereinafter, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 combinations, combinations of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6, combinations of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 2, combinations of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 4, and combinations of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the combination which the antibody which one clone produces has, ie, the combination of sequence number 1 and sequence number 2, the combination of sequence number 3 and sequence number 4, the combination of sequence number 5 and sequence number 6 is mentioned.
  • the antibody of the present invention is an antibody comprising any one of the following heavy chain variable regions (i) to (iii) and any one of the light chain variable regions (iv) to (vi).
  • Heavy chain variable region CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, heavy chain variable region CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and heavy chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 A heavy chain variable region comprising the variable region CDR3;
  • heavy chain variable region CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • heavy chain variable region CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and heavy chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15
  • heavy chain variable region CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19
  • heavy chain variable region CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20
  • heavy chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 A heavy chain variable region comprising the variable region CDR3.
  • the light chain variable region CDR1 composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, the light chain variable region CDR2 composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and the light chain composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • V a light chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, a light chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • a light chain variable region comprising the variable region CDR3;
  • Vi a light chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, a light chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24
  • a light chain variable region comprising the variable region CDR3.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region of an antibody are composed of 3 CDRs and 4 FRs (framework regions), in the order of FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Located from the amino terminus to the carboxy terminus.
  • the heavy chain variable region and light chain variable region of the antibody of the present invention have the CDR1, CDR2 and CDR3 described above and the antibody variable regions FR1, FR2, FR3 and FR4, and are controlled by these FRs.
  • CDR3 are spatially arranged to act cooperatively and bind to the extracellular domain of aquaporin 4.
  • the combination of the heavy chain variable region and the light chain variable region containing these CDRs is not limited, and the combination of (i) the heavy chain variable region and (iv) the light chain variable region, (i) the heavy chain variable region and (V) light chain variable region combination, (i) heavy chain variable region and (vi) light chain variable region combination, (ii) heavy chain variable region and (iv) light chain variable region combination A combination of the heavy chain variable region of (ii) and the light chain variable region of (v), a combination of the heavy chain variable region of (ii) and the light chain variable region of (vi), and the heavy chain variable region of (iii) (Iv) light chain variable region combination, (iii) heavy chain variable region and (v) light chain variable region combination, (iii) heavy chain variable region and (vi) light chain variable region combination Is mentioned.
  • a combination of antibodies produced by the same clone that is, a combination of (i) heavy chain variable region and (iv) light chain variable region, (ii) heavy chain variable region and (v) light chain
  • a combination of the chain variable region 2 and a combination of the heavy chain variable region of (iii) and the light chain variable region of (vi) can be mentioned.
  • the heavy chain variable region includes not only the heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, but also one or several, for example 1 to 10, preferably A heavy chain variable consisting of an amino acid sequence in which 1 to 5, more preferably 1 or 2, and more preferably 1 amino acid is deleted, substituted or added, and consisting of a protein having the activity of the heavy chain variable region of an antibody. Including area.
  • the light chain variable region includes not only the light chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, but also one or several, for example, 1 to 10, preferably 1 in the amino acid sequence.
  • a light chain variable region comprising a protein having an amino acid sequence in which ⁇ 5, more preferably 1 or 2, more preferably 1 amino acid is deleted, substituted or added, and having the activity of an antibody light chain variable region Including.
  • the protein having the amino acid sequence is substantially the same as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • the present invention further includes an anti-aquaporin 4 antibody that describes the same epitope as the epitope recognized by the above-mentioned anti-aquaporin 4 antibody.
  • the antibody in the present invention is an antibody comprising at least a heavy chain variable region and a light chain variable region, and includes two heavy chains (H chain) having a heavy chain variable region and a heavy chain constant region, a light chain variable region, and a light chain constant.
  • a complete antibody comprising two light chains (L chains) having a normal region as well as functional fragments of antibodies.
  • a functional fragment of an antibody is a fragment of an antibody that can specifically bind to an antigen.
  • Functional fragments include Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, or a single chain Fv (scFv) in which Fv of H chain or L chain is linked by an appropriate linker, diabody, Fv, Fab / c having one Fab and complete Fc, and the like.
  • a functional fragment of an antibody can also be referred to as an antigen binding site.
  • Fab is a fragment obtained by treating an antibody that binds to human aquaporin 4 with papain, a proteolytic enzyme, and has a molecular weight of about 50,000, in which about half of the amino terminal side of the H chain and the entire L chain are bound by a disulfide bond. It is an antibody fragment which has the binding activity with respect to the antigen.
  • F (ab ') 2 Is a fragment obtained by treating IgG with pepsin, a proteolytic enzyme, which is larger than that obtained by binding Fab through a disulfide bond in the hinge region, and having an activity of binding to an antigen having a molecular weight of about 100,000 It is.
  • Fab ′ is the above F (ab ′) 2
  • An antibody fragment having a binding activity to an antigen having a molecular weight of about 50,000, which is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of scFv is obtained by linking one heavy chain variable region (VH) and one light chain variable region (VL), and Vh and Vl are linked via a peptide linker and have an antigen-binding activity.
  • Diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv, and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • dsFv is an antibody fragment having a binding activity to an antigen bound via a disulfide bond between cysteine residues substituted with a polypeptide in which one amino acid residue in VH and VL is substituted with a cysteine residue.
  • the functional fragment of the above antibody can also be produced by synthesis or genetic engineering techniques based on the sequence information of the anti-human aquaporin 4 antibody of the present invention.
  • the present invention relates to a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6. Furthermore, DNA encoding the amino acid sequence of the heavy chain variable region and DNA encoding the amino acid sequence of the light chain variable region are also included.
  • Chimeric or humanized anti-aquaporin 4 antibody The antibody of the present invention is preferably a genetically engineered antibody that has been artificially modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity to humans. Such antibodies include, for example, chimeric antibodies and humanized antibodies. These modified antibodies can be produced by a known method.
  • a chimeric antibody is produced by ligating DNA encoding the variable (V) region of the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention with DNA encoding the constant (C) region of a human antibody, incorporating this into an expression vector and introducing it into a host. Is obtained.
  • a humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody.
  • a humanized antibody is obtained by transplanting the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal such as a mouse antibody into the complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • a portion of the DNA sequence designed to link the CDR of mouse anti-aquaporin 4 antibody and the framework region (FR) of human antibody is overlapped with the terminal regions of both CDR and FR.
  • What is necessary is just to synthesize
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region of the humanized antibody are composed of 3 CDRs and 4 FRs, and from the amino terminus to the carboxy terminus in the order of FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Has been placed.
  • the humanized antibody of the present invention has CDR1, CDR2 and CDR3 specifying the above sequences in the heavy chain variable region and the light chain variable region and the variable regions FR1, FR2, FR3 and FR4 of the human antibody, Regulated by these FRs, CDR1, CDR2, and CDR3 are spatially arranged to act cooperatively and bind to the extracellular domain of aquaporin 4.
  • the FR of the variable region of such a human antibody can be obtained from a published DNA database or the like.
  • constant regions of chimeric antibodies and humanized antibodies human antibodies can be used.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, and C ⁇ 4 may be used for the heavy chain
  • C ⁇ and C ⁇ may be used for the light chain.
  • the constant region of a human antibody may be mutated. Since these chimeric antibodies and humanized antibodies have reduced heteroantigenicity in the human body, they have a long half-life in the human body and are useful as active ingredients of the therapeutic agent of the present invention. 3. Mutant in which CDC activity and / or ADCC activity of anti-aquaporin antibody is lost or reduced Disease-specific autoantibodies (NMO-IgG) that cause neuromyelitis optica (NMO) bind to the extracellular region of human aquaporin 4 and express aquaporin 4 in a complement-dependent or antibody-dependent manner Damages astrocytes.
  • NMO-IgG Disease-specific autoantibodies
  • NMO neuromyelitis optica
  • the antibody of the present invention binds to human aquaporin 4, but preferably does not damage astrocytes in a complement-dependent or antibody-dependent manner. That is, the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention has reduced complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity and / or antibody-dependent cellular-mediated cytotoxicity (ADCC) activity.
  • CDC activity refers to the cytotoxic activity caused by the activation of the complement system by the binding of an antibody to an antigen, and the activated complement system.
  • ADCC activity refers to target cytotoxic activity induced in an antibody-dependent manner by binding the Fc receptor of NK cells or macrophages to the Fc part of the antibody when the antibody binds to the antigen.
  • CDC activity and ADCC activity are known to vary in size depending on the antibody subclass. This is because CDC activity and ADCC activity occur due to the difference in the structure of the constant region of the antibody. For example, among the IgG subclasses, IgG2 has low ADCC activity and IgG4 has low CDC activity. Therefore, by converting the subclass of the anti-aquaporin 4 antibody having the constant region of the human antibody of the present invention to IgG2 or IgG4, an antibody having low CDC activity and / or ADCC activity can be obtained. Moreover, it is also possible to reduce CDC activity or ADCC activity by introducing a mutation into the constant region of an antibody.
  • antibody constant regions L234, L235, D265, D270, K322, P329, P331 (alphabetic characters indicate one-letter amino acids, and numbers indicate the EU index of Kabat et al. (Kabat et al., Sequences). of proteins of Immunological Interest, 1991 Fifth edition), for example, L235 indicates the 235th leucine), etc. have been reported to be involved in the CDC activity of IgG.
  • the CDC activity can be reduced by substituting the amino acid.
  • CDC activity can be reduced by substituting at least one amino acid represented by D270, K322, P329 and P331 with another amino acid such as alanine (A), or represented by P331.
  • CDC activity can be reduced by substituting amino acid with serine (S) or glycine (G).
  • S serine
  • G glycine
  • substitution of the 331st proline (P) to serine (S) is expressed as P331S. 233-239, G316-K338, K274-R301, T407-R416, N297, E318, L234-S239, D265-E269, N297-T299, and A327-I332 may be involved in the binding of IgG and FcR. It has been reported that ADCC activity can be reduced by introducing mutations in this region or position.
  • ADCC activity can be reduced by, for example, substitution of L235E (replacement of 235th leucine (L) with glutamic acid (E)), G237A, L234A, K326W, E333S, or the like. Mutations that reduce CDC activity and / or ADCC activity are described in, for example, US Pat. No. 5,624,821, US Pat. No. 5,648,260, and the like. In addition, the removal of the complement binding ability and Fc receptor binding ability of NMO-IgG by mutagenesis is described in Tradtrantip et al. , 2012, Ann. Neurol. 71, 314-322.
  • K322A can reduce CDC activity
  • K326W, E333S can reduce ADCC activity
  • L234A, L235A can reduce both CDC activity and ADCC activity
  • the antibody of the present invention has a substitution mutation of K322A, L234A, L235A, or a substitution mutation of K326W, E333S, or a substitution mutation of K322A, L234A, L235A, K326W, E333S. have.
  • the method for reducing the above-mentioned CDC activity and ADCC is an example, and the present invention includes an anti-aquaporin 4 antibody in which CDC activity and / or ADCC activity is reduced by any method. CDC activity can be measured by a known method.
  • target cells such as CHO (Chinese hamster ovary) cells expressing human aquaporin 4 and anti-human aquaporin 4 antibody are incubated in the presence of human serum, and the number of living cells It can measure by measuring.
  • ADCC activity can also be measured by known methods.
  • effector cells such as NK-92 cells that express CD16
  • target cells such as CHO cells that express human aquaporin 4, and anti-human aquaporin 4 antibodies are present in human serum. It can be measured by incubating under, then co-culturing with effector cells such as NK-92 cells expressing CD16 and measuring the number of viable cells.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention preferably comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region comprising the above amino acid sequence, or a heavy chain variable region and a light chain variable region having a CDR comprising the above amino acid sequence.
  • a heavy chain variable region and a light chain variable region having a CDR comprising the above amino acid sequence.
  • an antibody excluding the constant region Fc region for example, F (ab ′) 2 which is a functional fragment of an antibody can be used. 4).
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention can also be produced as a monoclonal antibody by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and using gene recombination techniques.
  • DNA encoding the heavy chain variable region, DNA encoding the light chain variable region, DNA encoding the heavy chain variable region and DNA encoding the heavy chain constant region, and encoding the light chain variable region DNA obtained by ligating DNA and DNA encoding the light chain constant region may be operably linked to elements such as a promoter, an enhancer, and a polyadenylation signal.
  • functionally connected means that elements are connected so as to perform their functions.
  • promoters and enhancers cytomegalovirus (CMV), simian virus 40 (SV40), adenovirus-derived promoters and enhancers can be used.
  • a vector for inserting the gene of the present invention a vector that can replicate in a host such as bacteria, yeast or animal cells may be used, and examples thereof include plasmids, phages and the like.
  • An expression vector can be introduced into a host cell by a known method to transform the host cell. Examples include electroporation, DEAE-dextran transfection, and calcium phosphate precipitation.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis and eukaryotic cells such as yeast and animal cells can be used, but eukaryotic cells are preferably used.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae
  • animal cells examples include human embryonic kidney cell line 293 cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, monkey COS cells, mouse fibroblasts, and the like.
  • Purification of the produced antibody can be performed using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, affinity chromatography, other chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis and the like can be performed in appropriate combinations. 5.
  • Properties of anti-aquaporin antibodies of the present invention The anti-aquaporin antibody of the present invention has the following characteristics.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention binds to the extracellular domain of human aquaporin 4 M1 isoform and M23 isoform expressed in astrocytes. Specifically, it binds to the extracellular domain of aquaporin formed by the aggregation of three loops, loop A, loop C and loop E. Further, the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention does not bind to the M1 isoform of mouse aquaporin 4. Furthermore, it does not bind to the M23 isoform of mouse aquaporin 4, or binds with an affinity that is 8 to 16 times or 8 to 18 times lower than the affinity for human aquaporin 4.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention does not inhibit the water channel activity inherent in aquaporin 4 even when bound to the extracellular domain of aquaporin 4. That is, the water permeability of aquaporin 4 is not suppressed.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention specifically binds to aquaporin 4 with high affinity.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention has a K against human aquaporin 4.
  • the affinity for human aquaporin 4 is 5 times or more, preferably 10 times or more that of autoantibody (NMO-IgG) which is a polyclonal antibody against aquaporin 4 possessed by patients with optic neuromyelitis (NMO). Therefore, even when NMO-IgG is already bound to human aquaporin 4, it binds to human aquaporin 4 in a form that replaces NMO-IgG, and once the antibody of the present invention binds to human aquaporin 4, its high affinity. Therefore, NMO-IgG can no longer bind to human aquaporin 4.
  • NMO-IgG autoantibody
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention does not have or decreases CDC (Complement Dependent Cytotoxicity) activity and / or Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) activity. ing. For this reason, astrocytes expressing aquaporin 4 are not damaged by CDC and / or ADCC. For example, CDC activity and / or ADCC activity are reduced compared to NMO-IgG, which is an autoantibody against aquaporin 4.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention includes a PEGylated antibody to which polyethylene glycol (PEG) or the like is bound. By PEGylating the antibody, the blood half-life can be increased. 6).
  • the present invention also includes a therapeutic agent for neuromyelitis optica (NMO) comprising the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention as an active ingredient.
  • NMO neuromyelitis optica
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention inhibits binding of aquaporin 4 to NMO-IgG, which is an autoantibody against aquaporin 4, by binding to aquaporin 4 expressed in astrocytes, or binds to aquaporin 4 It binds to aquaporin 4 in a form that replaces NMO-IgG, and thereafter inhibits NMO-IgG from binding to aquaporin 4.
  • the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention does not have CDC activity and / or ADCC activity, unlike NMO-IgG, astrocytes expressed by aquaporin 4 are not damaged by CDC or ADCC. For this reason, the optic neuromyelitis can be treated with the therapeutic agent containing the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention as an active ingredient, or the symptoms can be alleviated, or recurrence can be prevented, or the progression can be stopped or delayed. Further, the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention does not inhibit the water channel activity that aquaporin 4 originally has, and therefore does not cause side effects.
  • the therapeutic agent for optic neuromyelitis comprising the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention as an active ingredient is preferably administered in the early stage of the onset of optic neuromyelitis. In addition, administration is preferably performed when optic neuromyelitis whose symptoms have been alleviated has recurred.
  • the anti-aquaporin 4 antibody contained in the therapeutic agent of the present invention binds to aquaporin 4 expressed in astrocytes in the onset or relapse phase of optic neuromyelitis, and NMO-IgG, which is an autoantibody against aquaporin 4, becomes aquaporin 4.
  • the therapeutic agent containing the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention is not used alone, but is preferably used in combination with a steroid agent that has been conventionally used as a therapeutic agent for optic neuromyelitis.
  • a therapeutic agent containing anti-aquaporin 4 antibody may be administered for several days to a week, and then a steroid agent may be administered.
  • a steroid may be administered simultaneously with the administration of a therapeutic agent containing anti-aquaporin 4 antibody.
  • the steroid agent include corticosteroid agents such as methylprednisolone, prednisolone, and predonin.
  • the therapeutic agent containing the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention as an active ingredient may be in the form of a sterile aqueous or non-aqueous solution, suspension or emulsion. Furthermore, it may contain pharmaceutically acceptable diluents such as salts, buffers, adjuvants, auxiliaries, carriers and the like.
  • the prophylactic or therapeutic agent can be administered by intravenous, oral, nasal, transmucosal, intramuscular or subcutaneous, intranasal, intratracheal, cutaneous, transdermal or intradermal route. Preferably, intravenous injection is performed by infusion.
  • the dose of the therapeutic agent containing the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention as an active ingredient can be varied depending on the age, sex, severity, etc. of the patient to be administered, but it is 10 ng to several mg once. A single dose may be administered, or may be administered several times over a period of 1 day to 2 weeks.
  • the present invention also includes a pharmaceutical kit for treating optic neuromyelitis comprising the anti-aquaporin 4 antibody of the present invention and a steroid agent.
  • the present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • AQP4 anti-aquaporin 4
  • Isolation of antibodies from NMO patients IgG fractions were obtained from samples generated during plasma exchange of five NMO patients positive for anti-AQP4 antibodies.
  • the use of the patient blood sample was approved by the Ethics Committee of Tohoku University School of Medicine (No. 2007-327).
  • Establishment of monoclonal antibody against human AQP4 extracellular domain Establishment of monoclonal antibody against human AQP4 (hAQP4) extracellular domain was performed according to a previous paper (Saitoh et al., 2007).
  • the cDNA of hAQP4 M23 isoform was inserted into the pBlueBac4.5 plasmid transfer vector.
  • C94, D12, and D15 series were obtained, respectively 1,2,61 clones, of which C9401, D12092, D15107, and D15129 Four clones were selected.
  • Plasmid Construction Wild type human AQP4-M23 isoform cDNA was purchased from Toyobo (Osaka, Japan).
  • Mouse AQP4 (mAQP4) M1 and M23 isoform cDNAs are M1 sense primer 5'-GAAGGCATGAGTGACAGGCTGCGGCAAGG-3 '(SEQ ID NO: 31), or M23 sense primer 5'-ACTATGGTGGCTGTCTGAGTGTGTG 3 ′ (SEQ ID NO: 32) and common antisense primer 5′-TAGTCATACGGAAGACAATACTCTCTCCCGA-3 ′ (SEQ ID NO: 33), after amplification by RT-PCR, pGEM-T vector (Promega, Madison, Madison, WI, USA).
  • the hAQP4 T62S / K64N, M149T, and E228A mutations were introduced by the QuickChange site-directed mutagenesis kit (Agilent, Santa Clare, CA, USA) using the following primer set.
  • 5′-ACCCATCAACTGGGGTGGGATCAGAAAATCCTTTACCGGTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 34) and 5′-CGACCGGTAAAGGATTTTCTGATCCCACCGAGTGATGCGTCGATGGATCGATCGATGCT '(SEQ ID NO: 37) (M149T)
  • 5'-CAGTATTCATGGGAAAATTGGGCAAACACTTGGAATAATTGGGT-3' SEQ ID NO: 38
  • Cell culture and transfection CHO cells were cultured in Ham's F12 medium containing 10% serum, 50 units / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin.
  • the introduction of AQP4 or its derivative cDNA inserted into pIRES2-EGFP into cells was performed by seeding the cells in a 60-cm culture dish at a density of 1 ⁇ 10 5 cells and then using Lipofectamine reagent and plus reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA). , USA). At 48 hours after transfection, the cells were analyzed by flow cytometry.
  • Immunoprecipitation method CHO cells stably expressing hAQP4 that had been grown to a confluent monolayer were scraped from the culture dish, and blue native buffer (1% Triton X-100, 12 mM NaCl, 500 mM 6-aminohexanoic acid, 20 mM bisTris). pH 7.0, 2 mM EDTA, 10% glycerol and a protease inhibitor), vigorously stirred on ice, freeze-thawed at ⁇ 80 ° C., and centrifuged at 4 ° C. and 20,000 ⁇ g for 5 minutes.
  • blue native buffer 1% Triton X-100, 12 mM NaCl, 500 mM 6-aminohexanoic acid, 20 mM bisTris. pH 7.0, 2 mM EDTA, 10% glycerol and a protease inhibitor
  • the supernatant was collected, and the protein concentration was measured using a BCA protein assay kit (Pierce, rockford, IL, USA). 200 mg of the protein extract and 10 mg of rabbit anti-AQP4 C-terminal domain antibody or each monoclonal anti-AQP4 extracellular domain antibody were reacted overnight at 4 ° C. while stirring with a rotator. The next day, 40 ml of nProtein A Sepharose 4 Fast Flow beads (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA) pretreated with wash buffer were added. To isolate immune complexes, each sample bead was centrifuged at 11,000 ⁇ g for 2 minutes at 4 ° C.
  • the protein of interest was revealed by Chemi-Lumi One L system (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) and detected by Image Quant LAS system (GE Healthcare).
  • the antibodies used were polyclonal rabbit anti-AQP4 C-terminal domain antibody (Sigma), HRP-labeled goat anti-mouse antibody and HRP-labeled goat anti-rabbit antibody (Sigma).
  • the water permeability (P f ) of hAQP4 proteoliposomes was determined by the fluorescence quenching reaction of the fluorescent substance carboxyfluorocein encapsulated in the liposomes by instantaneous mixing with a hyperosmotic solution using a stopped-flow apparatus (Zeidel et al., 1992, Biochemistry 31: 7436-40). The first derivative of the first part of the time course of fluorescence intensity decay was replaced with the change in the relative volume of the liposome, and P f was determined from the following equation.
  • AQP4 water permeability P f (dV (t) / dt) / ⁇ (SAV) (MVW) (C in ⁇ C out ) ⁇ * V (t): Liposome relative volume, SAV: Water molar volume (18 cm 3 / mol), C in ⁇ C out : Confirmation of specific binding of solute concentration monoclonal anti-hAQP4 inside and outside liposome to AQP4 in liposome Monoclonal Confirmation of specific binding of antibody to AQP4 in liposomes was performed according to previous reports (Yukutake et al., 2008, Biol. Cell 100: 355-63).
  • AQP4 proteoliposomes were reacted with 20 ⁇ g / ml monoclonal anti-AQP4 extracellular domain antibody for 1 hour at room temperature.
  • the liposomes were collected by centrifugation at 50,000 rpm for 45 minutes and then resuspended in the buffer three times to remove unreacted IgG. Liposomes were solubilized in SDS-PAGE sample buffer containing 16 mg / ml SDS.
  • CHO cells transiently expressing AQP4 and its derivatives were collected by trypsin treatment, resuspended in 100 ml of PBS containing 0.1% BSA, and monoclonal anti-hAQP4 extracellular domain antibody (2 ⁇ g) Alternatively, it was reacted with purified patient-derived antibody (10 ⁇ g) on ice for 1 hour. After washing with PBS containing 0.1% BSA, PE-labeled mouse anti-human IgG (1: 5, Biolegend, San Diego, CA, USA) or PE-labeled goat anti-mouse IgG (1: 100, bio (Legend) and reacted for 1 hour. Bound IgG was evaluated with FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).
  • NMO-IgG To search for epitopes of NMO-IgG, M1 and M23 isoform cDNAs of human and mouse AQP4 (hAQP4 and mAQP4, respectively) and green fluorescent protein (EGFP) enter the internal ribosome.
  • An expression construct linked by site (IRES) was made. In this construct, the fluorescence intensity of EGFP is used to indirectly know the expression level of AQP4.
  • the binding properties of NMO-IgG purified from 5 patient sera were examined using CHO cells expressing AQP4 by transient transfection of these expression constructs. As shown in FIG. 1, all five types of NMO-IgG bound to the cell surface expressing the hAQP4 M23 isoform.
  • NMO-IgG is not homogeneous, indicating that its epitope is diverse .
  • NMO-IgG is conjugated via AQP4.
  • NMO the onset by binding to site. Therefore, it is considered that disease prognosis can be improved by preventing NMO-IgG from binding to AQP4. Therefore, the present inventors attempted to produce a monoclonal antibody that can inhibit the binding of NMO-IgG to AQP4 without affecting the function of AQP4.
  • the baculovirus display method (Saitoh et al., 2007, J. Immunol. Methods 322: 104-17) was used. Four independent clones were obtained by this method, and their binding affinity and specificity for AQP4 were examined by flow cytometry using CHO cells in which AQP4 was transiently expressed.
  • FIG. 4 shows the left panel shows the result of staining with monoclonal antibody D15129
  • the center panel shows the result of staining with rabbit anti-AQP4 C-terminal domain antibody
  • the right panel shows the merged image.
  • these antibodies could be used for immunoprecipitation (FIG. 4)
  • all monoclonal antibodies recognize a three-dimensional structure composed of the extracellular domain of AQP4, and this three-dimensional structure is subtle between mAQP4 and hAQP4, and between M1 and M23. It was concluded that they were different.
  • FIG. 6 shows the structure of human aquaporin 4.
  • mutant hAQP4 M23 in which one of the three extracellular loops was replaced with that of the corresponding mouse. Isoform cDNA was generated and transiently expressed in CHO cells. Differences in amino acid sequences in the extracellular domain of hAQP4 and mAQP4 are as follows.
  • Thr 62 of hAQP4 (the 62nd Thr of the amino acid sequence of the M23 isoform of hAQP4 (SEQ ID NO: 50)) is Ser in mAQP4, Lys 64 of hAQP4 is Asn in mAQP4, and hAQP4 in Loop C Met 140 is Thr in mAQP4, and in loop E, Glu 228 of hAQP4 is Ala in mAQP4.
  • the mutant hAQP4 in which loop C or loop E was replaced with that of the mouse did not affect the binding of C9401 and D12092 (FIGS. 7c, d, g, h), but in the mutant in which loop A was replaced, these antibodies was dramatically reduced (FIG.
  • the inventors established a CHO cell line that stably expresses hAQP4 M23 isoform and EGFP. All five types of NMO-IgG bound to cells expressing the hAQP4 M23 isoform, but not to cells expressing only EGFP. The binding of NMO-IgG to cells was clearly attenuated by the presence of D12092 or D13107. That is, these monoclonal antibodies inhibited the binding of all five types of NMO-IgG having different binding characteristics (FIG. 10). In FIG.
  • the histogram indicated by the black line is a histogram when the anti-aquaporin 4 monoclonal antibody is present
  • the histogram indicated by a gray zone is a histogram when the anti-aquaporin 4 monoclonal antibody is not present. Therefore, whether or not NMO-IgG bound to AQP4 can be replaced by administration of these monoclonal antibodies was examined using CHO cells stably expressing the hAQP4 M23 isoform. First, AQP4-expressing cells were treated with 20 mg of NMO-IgG obtained from patient 1 or patient 2 for 2 hours. At this point NMO-IgG was indeed bound to the cell surface (FIG. 11a).
  • FIG. 12A shows the effect of anti-aquaporin 4 monoclonal antibody produced by hybridoma D15107 on the morphology of cultured mouse astrocytes ((e) to (h)).
  • 12B shows the effect of hybridomas D12092 and D15107 on the morphology of HEK293 cells transiently expressing hAQP4 M23 transfected with the pIRES2-EGFP vector inserted with AQP4 M23 cDNA. Even after 2 hours of antibody addition ((q), (r), (w), (x)), before addition of antibody ((o), (p), (u), (v)), cell morphology changes I did not.
  • EGFP indicates the expression of EGFP, and monoclonal indicates the binding of the antibody to the cells.
  • Example 1 Examination of affinity of monoclonal antibody with aquaporin 4 The affinity of 3 types of antibodies (C9401, D12092, D15107) established in Example 1 for aquaporin 4 was examined.
  • concentration dependency of antibody binding to the budding baculovirus expressing hAQP4 M23 and the CHO cells expressing hAQP4 M1 or hAQP4-M23 (respective clone names are F711 and C313) used in Example 1 was determined by ELISA. Measured with For CHO cells, both fixed with 4% paraformaldehyde and reacted at 4 ° C. over night (fixed) and alive at 37 ° C. for 1 hour (live) were used. Details of the ELISA method are as follows.
  • the germinating baculovirus is suspended in PBS at 0.05 ⁇ g / ⁇ l (as protein amount), and 50 ⁇ l is dispensed into a 96-well plate (2.5 ⁇ g per well) and left at 4 ° C. overnight. As a result, the virus was immobilized. After washing 3 times with PBS-T, blocking was performed with 40% BlockAce in PBS for 1 hour at room temperature, followed by reaction with an antibody diluted with 40% BlockAce in PBS at 4 ° C. overnight.
  • CHO live cells live
  • buffer 5 mM HEPES Na (pH 7.4), 140 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 1.25 mM.
  • FIG. 16 shows the results when a germinating baculovirus expressing hAQP4 M23 is used. In FIG. 16, antibody binding at each concentration of each antibody is expressed as a percentage of the maximum binding of the D15107 antibody.
  • FIG. 17 shows the results when CHO cells are used.
  • FIG. 17A shows the result of C9401 antibody
  • FIG. 17B shows the result of D12092 antibody
  • FIG. 17C shows the result of D15107.
  • FIGS. 17A, B and C the results of fixing with 4% paraformaldehyde and reacting at 4 ° C. overnight (fixed) and those reacting in a living state at 37 ° C. for 1 hour (live) are shown as hAQP4 M1 or Results are shown for CHO cells expressing hAQP4-M23.
  • FIG. 18 shows the binding characteristics of each monoclonal antibody to the extracellular domain of hAQP4. When the concentration-dependent affinity was measured by the above-mentioned ELISA, it approximated the 4-parameter logistic model each time, and the average value of the obtained values was calculated.
  • the antibody cloned by Verkman et al. (Crane JM et al., J. Biol. Chem. 286, 16516-16524) from a patient with optic neuritis (NMO) has a Kd value against cells expressing hAQP4 M23 (live cells). Bound at 44 nM (rAb-53) or 68 nM (rAb-58).
  • the antibody of the present invention bound to live cells expressing hAQP4 M23 with EC50 values of C9401, D12092, and D15107 antibodies at 162 pM, 116 pM, and 150 pM, respectively. This result indicates that the binding affinity of the anti-aquaporin antibody of the present invention is several hundred times that of the antibody of Verkman et al.
  • C9401 chimeric antibody (1) Preparation of C9401 chimeric antibody cDNAs of C9401 H chain and L chain V regions were obtained by RT-PCR from the total RNA of hybridoma clones producing this antibody. Since C9401 is known to be Ig gamma 2b and Ig kappa, 5′-AGGGGCCATGTGATATAGACT-3 ′, which is a partial sequence of the C region, as an antisense primer for obtaining C9401 heavy chain and light chain cDNAs, respectively. (SEQ ID NO: 41) and 5′-GGATACAGTTGGGTGCAGCATC-3 ′ (SEQ ID NO: 42) were used.
  • the DNA was cloned into pGEM-T vector and the nucleotide sequence was determined.
  • the heavy chain is 5′-CAGGTGCAAMTGGMASAGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 43), 5′-CAGRTCCAACTGCAGCAGAYC-3 ′ (SEQ ID NO: 44) and 5′-CAGGCTTATCTGCAGCAGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 45).
  • cDNA encoding a functional antibody was obtained when 5′-GACATTSGMTMGACCCATC-3 ′ (SEQ ID NO: 46) and 5′-GACATCCAGATGAMCGATC-3 ′ (SEQ ID NO: 47) were used.
  • the obtained sequence was compared with genomic information, the original V gene was predicted, a sense primer was newly designed based on the sequence including the start codon, and the entire V region was cloned.
  • the primers used were H ′ chain 5′-TCTAACCATGGGATGGAGCTGGATCTTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 48) and L chain 5′-TCTCAGAGATGGAGACAGACACACTCCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 49).
  • C region cDNA of human Ig kappa was obtained from the HeLa cell genome by PCR using primers 5′-ACTGTGGCTGCACCCATCTTCCTTCATCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 50) and 5′-TCTAACACTCTCCCCCTGTTTGAAGCTCTTTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 51).
  • PFUSE-CHIg-hG1e3 sold by InvivoGen (San Dieg, CA, USA) was used as the cDNA for the C region of human Ig gamma 1.
  • the antisense primers used are 5′-CCGCCGGAGCTAGCTGCAGAGAGAGTGACCAGAGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 52) and 5′-CTCGAGCTTGGTCCTCCCACCGAACGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 53).
  • the XhoI site was also introduced into the human L chain C region by PCR using the sense primer 5′-CTCGGACATCAAACGCGACTTGGCTGCACCCATCTGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 54).
  • the NheI site was already present in the cDNA for the human H chain C region. Using these restriction enzyme sites, H chain and L chain chimeric antibody cDNAs were prepared.
  • the obtained cDNA is inserted into a pcDNA3.1 (+) vector, expressed transiently in CHO cells, and then the culture supernatant is collected and bound to the human AQP4 extracellular domain by immunostaining by the fluorescent antibody method. It was confirmed.
  • the cDNA for the L chain of the C9401 chimeric antibody was inserted into the pIRES2-EGFP vector, transfected into CHO cells, and selected with G418 to obtain a strain that stably expresses the L chain.
  • cDNA for H chain was inserted into pEBMulti-Puro vector, transfected into the above-mentioned stable expression strain, and selected with G418 and puromycin to obtain a CHO cell line stably expressing C9401 chimeric IgG.
  • the obtained CHO cell line was cultured in serum-free CD-CHO medium after amplification for 5 to 7 days, and the supernatant was collected. After concentration by ultrafiltration and buffer exchange by gel filtration, C9401 chimeric IgG was purified by a protein A column.
  • the EC 50 values of C9401 chimeric antibody has 956PM, but 5.8-fold affinity compared to the original antibody (166pM) was reduced and still be attached is shown in high-affinity than existing antibodies .
  • FIG. 20 shows the result. As shown in FIG. 20, it was shown that complement-dependent cytotoxicity by NMO-IgG was suppressed when pre-treated with C9401 chimeric antibody.
  • the anti-aquaporin 4 antibody that binds to the extracellular domain of human aquaporin 4 of the present invention can be used for the treatment of optic neuromyelitis.

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Abstract

　視神経脊髄炎の治療薬の提供。　配列番号１、配列番号３又は配列番号５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号２、配列番号４又は配列番号６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、アクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体又はその機能的断片。

Description

ＮＭＯ−ＩｇＧに拮抗する抗アクアポリン４抗体
　本発明は、ヒトアクアポリン４の細胞外ドメインに結合する抗体に関し、さらに、該抗体を含む視神経脊髄炎の治療薬に関する。
　視神経脊髄炎（ＮＭＯ：Ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｏｐｔｉｃａ）は、視神経炎及び急性脊髄炎を特徴とする脱髄疾患である。視神経脊髄炎は、従来多発性硬化症（ＭＳ）の一亜型といわれていた。しかし、疾患特異的自己抗体（ＮＭＯ−ＩｇＧ）の発見以来、多発性硬化症とは発症機序の異なる別の疾患であることが明らかとなった。ＮＭＯ−ＩｇＧ陽性の患者は通常多発性硬化症に用いられる治療法が無効である。発症機序としてはＮＭＯ−ＩｇＧ（抗アクアポリン４抗体）がそのターゲットである、血液脳関門においてアストロサイト足突起に発現する水チャネルアクアポリン４（ＡＱＰ４）の細胞外領域に結合し、補体依存的にその発現細胞であるアストロサイトを傷害することにより脱随を引き起こすと理解されている（非特許文献１~３を参照）。実際に血漿交換により血中のＮＭＯ−ＩｇＧを除去すると症状が緩和されることが知られている。
　米国カリフォルニア大学Ｄｒ．Ｖｅｒｋｍａｎらにより、患者ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔよりクローン化したＮＭＯ−ＩｇＧの補体結合能、Ｆｃ受容体結合能を変異導入により除去した抗体製剤が提唱されている（非特許文献４を参照）。
Ｓａａｄｏｕｎ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒａｉｎ　１３３：３４９−６１ Ｓａａｄｏｕｎ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２３５：２７−３２ Ｆｕｊｉｈａｒａ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．３０６：１８３−７ Ｔｒａｄｔｒａｎｔｉｐ　ｅｔ　ａｌ．，２０１２，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１，３１４−３２２
　本発明は、発症のきっかけとなるＮＭＯ−ＩｇＧの結合に対し、より高親和性に拮抗し、かつ補体活性化能、Ｆｃ受容体結合能等の生体に有害な生物活性を有さない抗体を作出し、疾患の進行を食い止める新規治療法を開発することを目的とする。具体的には、アストロサイトに発現するアクアポリン４に結合し、ＮＭＯ−ＩｇＧがアクアポリン４に結合するのを抑制し、かつそれ自体は補体活性化能等を有しないモノクローナル抗体の提供を目的とする。
　視神経脊髄炎（ＮＭＯ）の治療薬として、ＮＭＯ−ＩｇＧの補体結合能、Ｆｃ受容体結合能を変異導入により除去した抗体製剤が提唱されている。しかしながら、患者より得られるＮＭＯ−ＩｇＧそのものをもとにした抗体製剤では、アクアポリン４（ＡＱＰ４）に対する結合親和性といった観点では、ＮＭＯ−ＩｇＧを凌駕するものは得難い。
　本発明者らは、アクアポリン４細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を作製することで、ＮＭＯ−ＩｇＧよりも親和性の高い抗体を得、これをヒト化することで、患者細胞よりクローン化した抗体よりもよりＭＮＯ−ＩｇＧへの拮抗作用の強い抗体製剤を得られることを見出し本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］　アクアポリン４の細胞外ド１メインに特異的に結合する、以下の特性を有するモノクローナル抗体又はその機能的断片：
（１）アストロサイトに発現するヒトアクアポリン４の細胞外ドメインに結合し、ヒトアクアポリン４の細胞外ドメインのループＡを構成する、配列番号４０で表されるヒトアクアポリン４のアミノ酸配列の６２番目のＴｈｒ及び／又は６４番目のＬｙｓが形成に関与するエピトープを認識する；
（２）アクアポリン４の細胞外ドメインに結合した場合でも、アクアポリン４の水透過性を抑制しない；及び
（３）アクアポリン４に、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）患者が有するアクアポリン４に対する自己抗体（ＮＭＯ−ＩｇＧ）の５倍以上高いアフィニティーで特異的に結合する。
［２］　配列番号１、配列番号３又は配列番号５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号２、配列番号４又は配列番号６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、アクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
［３］　配列番号１に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号３に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号４に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は配列番号５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［２］のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
［４］　配列番号１、配列番号３又は配列番号５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、並びに配列番号２、配列番号４又は配列番号６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域からシグナル配列が除去されている、［２］又は［３］のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
［５］　配列番号１に表されるアミノ酸配列のＮ末端から１９番目のＣまでのシグナル配列が除去され、配列番号３に表されるアミノ酸配列のＮ末端から１９番目のＳまでのシグナル配列が除去され、配列番号５に表されるアミノ酸配列のＮ末端から１９番目のＳまでのシグナル配列が除去され、配列番号２に表されるアミノ酸配列のＮ末端から２０番目のＧまでのシグナル配列が除去され、配列番号４に表されるアミノ酸配列のＮ末端から２０番目のＧまでのシグナル配列が除去され、配列番号６に表されるアミノ酸配列のＮ末端から２０番目のＧまでのシグナル配列が除去されている、［４］のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
［６］　以下の（ｉ）~（ｉｉｉ）の重鎖可変領域のいずれかと（ｉｖ）~（ｖｉ）の軽鎖可変領域のいずれかを含むアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片：
（ｉ）　配列番号７に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
（ｉｉ）　配列番号１３に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
（ｉｉｉ）　配列番号１９に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２０に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２１に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
（ｉｖ）　配列番号１０に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｖ）　配列番号１６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１８に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｖｉ）　配列番号２２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２３に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２４に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
［７］　（ｉ）　配列番号７に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と（ｉｖ）　配列番号１０に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）　配列番号１３に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と（ｖ）　配列番号１６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１８に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（ｉｉｉ）　配列番号１９に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２０に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２１に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と（ｖｉ）　配列番号２２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２３に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２４に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む［６］のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
［８］　［２］~［７］のいずれかの抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識し、該エピトープの形成にはアクアポリン４の細胞外ドメインを構成するループＡを構成するアミノ酸配列中に含まれ、配列番号４０で表されるヒトアクアポリン４のアミノ酸配列の６２番目のＴｈｒ及び／又は６４番目のＬｙｓが関与している、アクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
［９］　定常領域がヒト抗体の定常領域である、キメラ抗体又はヒト化抗体である、［１］~［８］のいずれかのアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体。
［１０］　定常領域に補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性及び／又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の低減をもたらす１以上のアミノ酸の変異又は置換を有する、［１］~［９］のいずれかのアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体。
［１１］　定常領域のＫａｂａｔらのＥＵインデックスにおけるアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１で表されるアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているか、又はＰ３３１で表されるアミノ酸がセリン若しくはグリシンに置換されている、［１０］のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体。
［１２］　定常領域のＫａｂａｔらのＥＵインデックスにおけるアミノ酸にＫ３２６で表されるアミノ酸がＷに置換され、Ｅ３３３で表されるアミノ酸がＳに置換されている、［１０］又は［１１］のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体。
［１３］　［１］~［１２］のいずれかのモノクローナル抗体又はその機能的断片を有効成分として含む、視神経脊髄炎治療薬。
［１４］　視神経脊髄炎の原因となるＭＮＯ−ＩｇＧがアストロサイトに発現しているアクアポリン４に結合するのを阻害する、［１３］の視神経脊髄炎治療薬。
［１５］　［１３］又は［１４］の視神経脊髄炎治療薬及びステロイド剤を含む、視神経脊髄炎治療用薬剤キット。
［１６］　ステロイド剤が、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン又はプレドニンである、［１５］の視神経脊髄炎治療用薬剤キット。
　本発明のアクアポリン４の細胞外ドメインを認識し結合する抗アクアポリン４モノクローナル抗体は、アクアポリン４に対するポリクローナルな自己抗体であるＮＭＯ−ＩｇＧよりも大きいアフィニティーでアクアポリン４に結合する。そのため、ＮＭＯ−ＩｇＧがアクアポリン４に結合し、アクアポリン４が発現しているアストロサイトが傷害を受けて発症する視神経精髄炎を発症した患者に、本発明の抗アクアポリン４抗体を投与した場合、該抗体はアクアポリン４にＮＭＯ−ＩｇＧが結合するのを阻害し、さらに既にアクアポリン４に結合しているＮＭＯ−ＩｇＧと置換し、ＮＭＯ−ＩｇＧをアクアポリン４への結合から排除し得る。本発明の抗アクアポリン４抗体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を消失させるか、低減させることにより、アストロサイトを傷害することなく、ＮＭＯ−ＩｇＧのアクアポリン４への結合を阻害し、視神経脊髄炎の治療に効果を奏することができる。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願特願２０１３−１２０２３８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１は、ＮＭＯ患者由来の精製ＮＭＯ−ＩｇＧのアクアポリン４への結合特性を示す図である。
　図２は、フローサイトメトリーにより解析した樹立したモノクローナル抗体の結合特性を示す図である。
　図３は、抗アクアポリン４モノクローナル抗体を用いた組織染色の結果を示す図である。
　図４は、抗アクアポリン４モノクローナル抗体を用いた免疫沈降法の結果を示す図である。
　図５は、抗アクアポリン４モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
　図６は、ヒトアクアポリン４の構造を示す図である。
　図７は、ヒトアクアポリン４の細胞外ドメインのアミノ酸を置換したときのモノクローナル抗体の結合の変化を示す図である。
　図８は、抗アクアポリン４モノクローナル抗体のアクアポリン４の水透過性に対する影響を示す図である。
　図９は、アクアポリン４の水透過性を測定する実験における、抗アクアポリン４モノクローナル抗体とアクアポリン４の結合を示す図である。
　図１０は、抗アクアポリン４モノクローナル抗体によるＮＭＯ−ＩｇＧの細胞表面に発現したアクアポリン４への結合の阻害を示す図である。
　図１１は、抗アクアポリン４モノクローナル抗体による細胞表面に発現したアクアポリン４に結合したＮＭＯ−ＩｇＧの置換を示す図である。
　図１２は、補体非存在下で、抗アクアポリン４モノクローナル抗体がＣＤＣ活性を有しないことを示す図である。
　図１３は、ハイブリドーマクローンＣ９４０１が産生するモノクローナル抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域及び可変領域中のＣＤＲのアミノ酸配列を示す図である。
　図１４は、ハイブリドーマクローンＤ１２０９２が産生するモノクローナル抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域及び可変領域中のＣＤＲのアミノ酸配列を示す図である。
　図１５は、ハイブリドーマクローンＤ１５１０７（Ｄ１５１２９）が産生するモノクローナル抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域及び可変領域中のＣＤＲのアミノ酸配列を示す図である。
　図１６は、ｈＡＱＰ４　Ｍ２３を発現する発芽型バキュロウイルスを用いた場合の抗アクアポリンモノクローナル抗体の親和性を示す図である。
　図１７は、ｈＡＱＰ４　Ｍ１又はｈＡＱＰ４−Ｍ２３を発現するＣＨＯ細胞を用いた場合の抗アクアポリンモノクローナル抗体の親和性を示す図である。図１７ＡはＣ９４０１抗体の結果を、図１７ＢはＤ１２０９２抗体の結果を、図１７ＣはＤ１５１０７抗体の結果を示す図である。
　図１８は、ｈＡＱＰ４の細胞外ドメインに対する各モノクローナル抗体の結合特性を示す図である。
　図１９は、Ｃ９４０１キメラ抗体の親和性を示す図である。
　図２０は、ＮＭＯ−ＩｇＧによる補体依存的細胞傷害に対するＣ９４０１キメラ抗体の抑制効果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の抗アクアポリン４モノクローナル抗体
　本発明の抗体は、アクアポリン４の細胞外ドメインを特異的に認識して結合する抗アクアポリン４抗体である。本発明の抗アクアポリン４抗体は、高いアフィニティーでアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合する。
　アクアポリン４は、血液脳関門においてアストロサイト足突起に発現する水チャネルとして作用する、６回膜貫通型タンパク質であり、ループＡ、ループＣ及びループＥの３つの細胞外ループが存在する。
　アクアポリン４には、Ｍ１、Ｍ２３と名付けられた２つのアイソフォームが存在する。Ｍ２３はアクアポリン４遺伝子をコードする遺伝子のエキソン１の上流の転写開始点から転写される。一方、Ｍ１はエキソン０の上流から転写され、エキソン１とインフレームでスプライシングされ、Ｍ２３アイソフォームのＮ末端に２２アミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなる。アクアポリン４はヘテロテトラマーを構成し、ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ａｒｒａｙ構造（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ａｒｒａｙｓ　ｏｆ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＯＡＰｓ））を形成する。Ｍ２３アイソフォームは、ＯＡＰｓを形成するが、Ｍ１アイソフォームはＯＡＰｓを形成せず、逆に破壊する。
　アクアポリン４の細胞外ドメインは、配列番号４０で表されるヒトアクアポリン４のＭ２３アイソフォームのアミノ酸配列のおおよそ第６０番から６７番のアミノ酸からなるループＡ、おおよそ第１３８番から１５５番のアミノ酸からなるループＣ、及びおおよそ第２１０番から２２９番のアミノ酸からなるループＥの３つのループからなり（図６）、これらの３つのループが近接して存在し、細胞外ドメインを形成する。本発明の抗アクアポリン４抗体は、これらの３つのループが集合して形成した細胞外ドメインの立体構造を認識して、アクアポリン４の細胞外ドメインに結合する。本発明の抗アクアポリン４抗体は、少なくとも細胞外ドメインのループＡを認識し、結合する。アクアポリン４はヒト、その他の動物が有しており、本発明の抗アクアポリン４抗体は、ヒトアクアポリン４のＭ２３アイソフォーム及びＭ１アイソフォームの細胞外ドメインを認識し結合する。さらに、本発明の抗アクアポリン４抗体は、マウスアクアポリン４のＭ２３アイソフォームを認識し結合するが、マウスアクアポリン４のＭ１アイソフォームを認識せず結合しない抗体も含まれる。
　本発明の抗アクアポリン４モノクローナル抗体は、ヒトアクアポリン４を免疫原として用いてマウス等の動物を免疫する公知の方法で得ることができる。
　アクアポリン４は、膜貫通タンパク質であるので、抗アクアポリン４抗体は、好ましくはバキュロウイルスディスプレイ法により作製する。バキュロウイルスディスプレイ法は、免疫抗原をバキュロウイルスの膜表面上に発現させて、抗原を発現させたバキュロウイルスを免疫原として免疫を行い抗体を作製する方法である。該方法は、Ｓａｉｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　３２２：１０４−１７の記載に従って行うことができる。
　さらに、アクアポリン４はヒトと他の動物、特にマウスとの間でアミノ酸配列同一性が大きく、ヒトアクアポリン４をマウスに免疫した場合、自己として認識され、抗体産生が誘導されない可能性がある。そこで、好ましくは、アクアポリン４をコードする遺伝子をノックアウトしたマウスを用い、該マウスをヒトアクアポリン４で免疫して作製する。アクアポリン４をコードする遺伝子をノックアウトしたマウスは、公知の方法で作出することができ、例えば、マウスの受精卵や初期胚のアクアポリン４をコードする遺伝子を相同組換え等により部分的に又は完全に欠失させ、該受精卵又は初期胚をマウスの仮親の子宮に移植し、発生させればよい。また、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）又はｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）のアクアポリン４をコードする遺伝子を相同組換え等により部分的に又は完全に欠失させ、該ＥＳ細胞又は該ｉＰＳ細胞を、胚盤胞等の初期胚に挿入し、該初期胚をマウスの仮親の子宮に移植し、発生させ、キメラマウスを得て、キメラマウスを交配することにより、アクアポリン４をコードする遺伝子がノックアウトされた形質転換マウスを得ることにより行うことができる。
　このようにしてヒトアクアポリン４で動物を免疫し、該動物から得た脾臓細胞等の抗体産生細胞を用いて抗ヒトアクアポリン４抗体産生ハイブリドーマを作製することができ、該ハイブリドーマから抗ヒトアクアポリン４モノクローナル抗体を得ることができる。
　このような方法でマウスを用いて得られた、抗ヒトアクアポリン４モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして、クローンＣ９４０１、Ｄ１２０９２、Ｄ１５１０７及びＤ１５１２９が挙げられる。このうち、Ｄ１５１０７及びＤ１５１２９は同じ抗体を産生する。クローンＣ９４０１及びＤ１２０９２が産生するモノクローナル抗体は、ヒトアクアポリン４のＭ１及びＭ２３アイソフォームを認識し結合するがマウスアクアポリン４は認識せず結合しない。一方、クローンＤ１５１０７（Ｄ１５１２９）は、ヒトアクアポリン４のＭ１及びＭ２３アイソフォームを認識し結合し、かつマウスアクアポリン４のＭ２３アイソフォームを認識し結合し、さらにマウスアクアポリン４のＭ１アイソフォームは認識せず結合しない。
　上記クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、並びに可変領域の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）については解析を行った。各クローンの重鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を図１３~１５に示す。また、図１３~１５には、シグナル配列予測ソフトウェアのＳｉｇｎａｌ　Ｐを用いて予測したシグナル配列を示してある。シグナル配列は、アミノ酸配列情報から予測することができ、例えば、シグナル配列予測ソフトウェアを用いて予測することができる。シグナル配列予測ソフトウェアとして、Ｓｉｇｎａｌ　ＰやＰＲＯＲＴ　ＩＩ等がある。
　図１３にはクローンＣ９４０１が産生する抗体の重鎖可変領域（Ｃ９４０１　ＨＶ）及び軽鎖可変領域（Ｃ９４０１　ＬＶ）のシグナル配列を含む全長アミノ酸配列を示し、さらに可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を示す。また、図中ＩｇＧ２ｂ　Ｃ　ｒｅｇｉｏｎで示す部分の配列は定常領域の配列であり、Ｖ遺伝子、（Ｄ遺伝子）、Ｊ遺伝子、Ｃ遺伝子がフレームシフトすること無くクローニングされたことをもって正しいＩｇフラグメントの配列が得られたことを示すために表示してある。図１４~１６においても同様である。図中、Ｉｇｈｖ１−６６及びＩｇｈｖ１−８４で示す配列は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体遺伝子座の１００個以上存在する重鎖Ｖ遺伝子のうち、Ｃ９４０１　ＨＶの配列と配列同一性が高い配列であり、Ｃ９４０１　ＨＶのアミノ酸配列と異なる位置の配列を示してある。また、同様にＩｇｋｖ３−５及びＩｇｋｖ３−１０で示す配列はＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体遺伝子座の１００個以上存在する軽鎖Ｖ遺伝子のうち、Ｃ９４０１　ＬＶの配列と配列同一性が高い配列であり、Ｃ９４０１　ＬＶのアミノ酸配列と異なる位置の配列を示してある。配列決定された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域についてＳｉｇｎａｌ　Ｐを用いてシグナル配列を推定した。その結果、重鎖可変領域のシグナル配列は配列番号２５のＮ末端より１９番目のシステイン（Ｃ）までであり、軽鎖可変領域のシグナル配列は配列番号２６のＮ末端より２０番目のグリシン（Ｇ）までであった。
　図１４にはクローンＤ１２０９２が産生する抗体の重鎖可変領域（Ｄ１２０９２　ＨＶ）及び軽鎖可変領域（Ｄ１２０９２　ＬＶ）のシグナル配列を含む全長アミノ酸配列を示し、さらに可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を示す。図中、Ｉｇｈｖ２−６で示す配列は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体遺伝子座の１００個以上存在する重鎖Ｖ遺伝子のうち、Ｄ１２０９２　ＨＶの配列と配列同一性が高い配列であり、Ｄ１２０９２　ＨＶのアミノ酸配列と異なる位置の配列を示してある。また、同様にＩｇｋｖ３−５及びＩｇｋｖ３−１０で示す配列はＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体遺伝子座の１００個以上存在する軽鎖Ｖ遺伝子のうち、Ｄ１２０９２　ＬＶの配列と配列同一性が高い配列であり、Ｄ１２０９２　ＬＶのアミノ酸配列と異なる位置の配列を示してある。配列決定された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域についてＳｉｇｎａｌ　Ｐを用いてシグナル配列を推定した。その結果、重鎖可変領域のシグナル配列は配列番号２７のＮ末端より１９番目のセリン（Ｓ）までであり、軽鎖可変領域のシグナル配列は配列番号２８のＮ末端より２０番目のグリシン（Ｇ）までであった。
　図１５にはクローンＤ１５１０７及びＤ１５１２９が産生する抗体の重鎖可変領域（Ｄ１５１０７　ＨＶ）及び軽鎖可変領域（Ｄ１５１０７　ＬＶ）のシグナル配列を含む全長アミノ酸配列を示し、さらに可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を示す。当初、クローンＤ１５１０７及びＤ１５１２９は異なるクローンと考えられたが、配列決定を行った結果、同じ抗体を産生するクローンであることが判明した。図中、Ｉｇｈｖ２−９で示す配列は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体遺伝子座の１００個以上存在する重鎖Ｖ遺伝子のうち、Ｄ１５１０７　ＨＶの配列と配列同一性が高い配列であり、Ｄ１５１０７　ＨＶのアミノ酸配列と異なる位置の配列を示してある。また、同様にＩｇｋｖ３−５で示す配列はＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体遺伝子座の１００個以上存在する軽鎖Ｖ遺伝子のうち、Ｄ１５１０７　ＬＶの配列と配列同一性が高い配列であり、Ｄ１５１０７　ＬＶのアミノ酸配列と異なる位置の配列を示してある。配列決定された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域についてＳｉｇｎａｌ　Ｐを用いてシグナル配列を推定した。その結果、重鎖可変領域のシグナル配列は配列番号２９のＮ末端より１９番目のセリン（Ｓ）までであり、軽鎖可変領域のシグナル配列は配列番号３０のＮ末端より２０番目のグリシン（Ｇ）までであった。図１３~１５に示される定常領域の配列を一部含む、Ｃ９４１０　ＨＶ、Ｃ９４０１　ＬＶ、Ｄ１２０９２　ＨＶ、Ｄ１２０９２　ＬＶ、Ｄ１５１０７　ＨＶ及びＤ１５１０７　ＬＶのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び３０に示す。
　以下に、それぞれのクローンが産生するハイブリドーマの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列、並びに重鎖可変領域と軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
クローンＣ９４０１　重鎖可変領域のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　該アミノ酸配列において、Ｎ末端から１９番目のＣまでが推定シグナル配列である。
クローンＣ９４０１　軽鎖可変領域のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　該アミノ酸配列において、Ｎ末端から２０番目のＧまでが推定シグナル配列である。
クローンＤ１２０９２　重鎖可変領域のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　該アミノ酸配列において、Ｎ末端から１９番目のＳまでが推定シグナル配列である。
クローンＤ１２０９２　軽鎖可変領域のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　該アミノ酸配列において、Ｎ末端から２０番目のＧまでが推定シグナル配列である。
クローンＤ１５１０７　重鎖可変領域のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　該アミノ酸配列において、Ｎ末端から１９番目のＳまでが推定シグナル配列である。
クローンＤ１５１０７　軽鎖可変領域のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　該アミノ酸配列において、Ｎ末端から２０番目のＧまでが推定シグナル配列である。
クローンＣ９４０１　重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
クローンＣ９４０１　軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
クローンＤ１２０９２　重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
クローンＤ１２０９２　軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
クローンＤ１５１０７　重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
クローンＤ１５１０７　軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　本発明の抗アクアポリン４抗体は、上記の配列番号１、配列番号３又は配列番号５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号２、配列番号４又は配列番号６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体である。また、本発明の抗アクアポリン４抗体は、上記の配列番号１、配列番号３又は配列番号５に表されるアミノ酸配列からシグナル配列を除去したアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号２、配列番号４又は配列番号６に表されるアミノ酸配列からシグナル配列を除去したアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体である。シグナル配列を除去したアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、上記のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを動物細胞で発現させたときに培養上清中に分泌されるシグナル配列のない成熟体と同等のタンパク質である。ここで、配列番号１に表されるアミノ酸配列において、２０番目のＱから１３４番目のＡがシグナル配列を除去したアミノ酸であり、配列番号３に表されるアミノ酸配列において、２０番目のＱから１３３番目のＴがシグナル配列を除去したアミノ酸であり、配列番号５に表されるアミノ酸配列において、２０番目のＱから１３４番目のＡがシグナル配列を除去したアミノ酸である。また、配列番号２に表されるアミノ酸配列において、２１番目のＤから１３２番目のＲがシグナル配列を除去したアミノ酸であり、配列番号４に表されるアミノ酸配列において、２１番目のＤから１３２番目のＲがシグナル配列を除去したアミノ酸であり、配列番号６に表されるアミノ酸配列において、２１番目のＤから１３２番目のＲがシグナル配列を除去したアミノ酸である。重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せは限定されず、配列番号１に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号２に表される軽鎖可変領域の組合せ（以下、配列番号１と配列番号２の組合せのように表現する）、配列番号１と配列番号４の組合せ、配列番号１と配列番号６の組合せ、配列番号３と配列番号２の組合せ、配列番号３と配列番号４の組合せ、配列番号３と配列番号６の組合せ、配列番号５と配列番号２の組合せ、配列番号５と配列番号４の組合せ及び配列番号５と配列番号６の組合せが挙げられる。好ましくは、１つのクローンが産生する抗体が有する組合せ、すなわち、配列番号１と配列番号２の組合せ、配列番号３と配列番号４の組合せ、配列番号５と配列番号６の組合せが挙げられる。
　さらに、本発明の抗体は、以下の（ｉ）~（ｉｉｉ）の重鎖可変領域のいずれかと（ｉｖ）~（ｖｉ）の軽鎖可変領域のいずれかを含む抗体である。
（ｉ）　配列番号７に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉ）　配列番号１３に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）　配列番号１９に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２０に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２１に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域。
（ｉｖ）　配列番号１０に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（ｖ）　配列番号１６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１８に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（ｖｉ）　配列番号２２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２３に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２４に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
　抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、３個のＣＤＲと４個のＦＲ（フレームワーク領域：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ）で構成され、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置されている。本発明の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、上記のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と抗体の可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を有し、これらのＦＲに制御され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、協働的に作用しアクアポリン４の細胞外ドメインと結合するように、空間的に配置される。
　これらのＣＤＲを含む重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せは限定されず、（ｉ）の重鎖可変領域と（ｉｖ）の軽鎖可変領域の組合せ、（ｉ）の重鎖可変領域と（ｖ）の軽鎖可変領域の組合せ、（ｉ）の重鎖可変領域と（ｖｉ）の軽鎖可変領域の組合せ、（ｉｉ）の重鎖可変領域と（ｉｖ）の軽鎖可変領域の組合せ、（ｉｉ）の重鎖可変領域と（ｖ）の軽鎖可変領域の組合せ、（ｉｉ）の重鎖可変領域と（ｖｉ）の軽鎖可変領域の組合せ、（ｉｉｉ）の重鎖可変領域と（ｉｖ）の軽鎖可変領域の組合せ、（ｉｉｉ）の重鎖可変領域と（ｖ）の軽鎖可変領域の組合せ、（ｉｉｉ）の重鎖可変領域と（ｖｉ）の軽鎖可変領域の組合せが挙げられる。好ましくは、同一のクローンが産生する抗体が有する組合せ、すなわち、（ｉ）の重鎖可変領域と（ｉｖ）の軽鎖可変領域の組合せ、（ｉｉ）の重鎖可変領域と（ｖ）の軽鎖可変領域２の組合せ、（ｉｉｉ）の重鎖可変領域と（ｖｉ）の軽鎖可変領域の組合せが挙げられる。
　重鎖可変領域は配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１~１０個、好ましくは１~５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域の活性を有するタンパク質からなる重鎖可変領域も含む。軽鎖可変領域は配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において１若しくは数個、例えば、１~１０個、好ましくは１~５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の軽鎖可変領域の活性を有するタンパク質からなる軽鎖可変領域も含む。
　このような配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
　また、このような配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
　本発明は、さらに、上記の抗アクアポリン４抗体が認識するエピトープと同じエピトープを記載する抗アクアポリン４抗体を包含する。
　本発明において抗体は、少なくとも重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗体であり、重鎖可変領域と重鎖定常領域を有する２個の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖可変領域と軽鎖定常領域を有する２個の軽鎖（Ｌ鎖）を含む完全抗体も、抗体の機能的断片も含む。抗体の機能的断片は、抗体の断片であって抗原に特異的に結合し得る断片である。機能的断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、又はＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ等が挙げられる。抗体の機能的断片を抗原結合部位ということもできる。
　Ｆａｂは、ヒトアクアポリン４と結合する抗体を蛋白質分解酵素であるパパインで処理して得られる断片であって、Ｈ鎖のアミノ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原に対する結合活性を有する抗体断片である。
　Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素であるペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものより大きい、分子量約１０万の抗原に対する結合活性を有する抗体断片である。
　Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原に対する結合活性を有する抗体断片である。
　ｓｃＦｖは、１個の重鎖可変領域（ＶＨ）と１個の軽鎖可変領域（ＶＬ）を連結したものであり、ＶｈとＶｌはペプチドリンカーを介して連結されている、抗原に対する結合活性を有する抗体断片である。
　ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖを２量体化させた抗体断片であって、２価の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを置換したシステイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた、抗原に対する結合活性を有する抗体断片である。
　上記の抗体の機能的断片は、本発明の抗ヒトアクアポリン４抗体の配列情報に基づいて、合成や遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
　本発明は、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、並びに配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を包含し、さらに、該重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ及び該軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡも包含する。
２．キメラ又はヒト化抗アクアポリン４抗体
　本発明の抗体は、好ましくは、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体である。このような抗体として、例えば、キメラ抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体がある。これらの改変抗体は、公知の方法により作製可能である。
　キメラ抗体は、本発明の抗アクアポリン４抗体の可変（Ｖ）領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常（Ｃ）領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
　ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体ともいう。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も公知である（欧州特許出願公開番号ＥＰ　１２５０２３号公報、ＷＯ　９６／０２５７６号公報参照）。
　具体的には、マウス抗アクアポリン４抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した複数のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成すればよく、例えば、ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法により行うことができる。ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、３個のＣＤＲと４個のＦＲで構成され、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置されている。すなわち、本発明のヒト化抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域において、上記の配列を特定したＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３とヒト抗体の可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を有し、これらのＦＲに制御され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、協働的に作用しアクアポリン４の細胞外ドメインと結合するように、空間的に配置される。このようなヒト抗体の可変領域のＦＲは、公表されたＤＮＡデータベース等から得ることができる。
　キメラ抗体及びヒト化抗体の定常領域としては、ヒト抗体のものを用いることができる。例えば重鎖においては、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を用いればよく、軽鎖においては、Ｃκ、Ｃλを用いればよい。また、後記のように、ヒト抗体の定常領域を変異させてもよい。
　これらのキメラ抗体及びヒト化抗体は、ヒト体内における異種抗原性が低下されているため、ヒト生体内での半減期も長く本発明の治療薬の有効成分として有用である。
３．抗アクアポリン抗体のＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性が消失又は低減した変異体
　視神経脊髄炎（ＮＭＯ：Ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｏｐｔｉｃａ）の原因となる疾患特異的自己抗体（ＮＭＯ−ＩｇＧ）はヒトアクアポリン４の細胞外領域に結合し、補体依存的に又は抗体依存的にアクアポリン４を発現するアストロサイトを傷害する。本発明の抗体は、ヒトアクアポリン４に結合するが、好ましくは補体依存的に、あるいは抗体依存的にアストロサイトを傷害することはない。すなわち、本発明の抗アクアポリン４抗体は、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）活性及び／又は抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性が低減しているか、あるいは消失している抗体である。
　ＣＤＣ活性は抗体が抗原と結合することによって補体系が活性化され、その活性化された補体系によって引き起こされる細胞傷害活性のことをいう。ＡＤＣＣ活性は抗体が抗原と結合するとＮＫ細胞やマクロファージのＦｃ受容体と抗体のＦｃ部が結合し、抗体依存的に誘導される標的細胞傷害活性のことをいう。ＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性は、抗体のサブクラスによって、活性の大きさが異なることが知られている。これは、ＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性が、抗体の定常領域の構造の違いに起因して生じるためである。例えば、ＩｇＧサブクラスの中でＩｇＧ２はＡＤＣＣ活性が低く、ＩｇＧ４はＣＤＣ活性が低い。従って、本発明のヒト抗体の定常領域を有する抗アクアポリン４抗体のサブクラスをＩｇＧ２やＩｇＧ４に変換することにより、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の低い抗体を取得することができる。
　また、抗体の定常領域に変異を導入することにより、ＣＤＣ活性やＡＤＣＣ活性を低減させることも可能である。例えば、抗体の定常領域のＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１で表されるアミノ酸（アルファベットはアミノ酸の一文字表記を示し、数字はＫａｂａｔらのＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ　ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９９１　Ｆｉｆｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）によるアミノ酸の位置を示し、例えばＬ２３５は２３５番目のロイシンを示す）等がＩｇＧのＣＤＣ活性に関与していることが報告されており、これらのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによりＣＤＣ活性を低減することができる。例えば、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９及びＰ３３１で表されるアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸をアラニン（Ａ）等の他のアミノ酸に置換することによりＣＤＣ活性を低減させることができ、あるいは、Ｐ３３１で表されるアミノ酸をセリン（Ｓ）やグリシン（Ｇ）に置換することによりＣＤＣ活性を低減させることができる。なお、本発明において、例えば３３１番目のプロリン（Ｐ）のセリン（Ｓ）への置換をＰ３３１Ｓのように表現する。また、２３３−２３９、Ｇ３１６−Ｋ３３８、Ｋ２７４−Ｒ３０１、Ｔ４０７−Ｒ４１６、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｌ２３４−Ｓ２３９、Ｄ２６５−Ｅ２６９、Ｎ２９７−Ｔ２９９、Ａ３２７−Ｉ３３２はＩｇＧとＦｃＲの結合に関与していることが報告されており、この領域又は位置に変異を導入することにより、ＡＤＣＣ活性を低減させることが可能である。具体的には、例えばＬ２３５Ｅ（２３５番目のロイシン（Ｌ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換）、Ｇ２３７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ｓ等の置換により、ＡＤＣＣ活性を低減させることができる。ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性を低減させる変異については、例えば、米国特許５，６２４，８２１、米国特許５，６４８，２６０等に記載されている。また、ＮＭＯ−ＩｇＧの補体結合能、Ｆｃ受容体結合能を変異導入により除去することがＴｒａｄｔｒａｎｔｉｐ　ｅｔ　ａｌ．，２０１２，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１，３１４−３２２に記載されている。
　例えば、Ｋ３２２ＡはＣＤＣ活性を低減させ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３ＳはＡＤＣＣ活性を低減させ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡはＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性の両方を低減させ得る。従って、例えば、本発明の抗体は、Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの置換変異を有しており、あるいはＫ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ｓの置換変異を有しており、あるいはＫ３２２Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ｓの置換変異を有している。
　上記のＣＤＣ活性やＡＤＣＣを低減させる方法は一例であり、本発明は、あらゆる方法でＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性を低減させた抗アクアポリン４抗体を包含する。
　ＣＤＣ活性は公知の方法で測定することができ、例えば、ヒトアクアポリン４を発現するＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞等の標的細胞と抗ヒトアクアポリン４抗体をヒト血清存在下でインキュベーションし、生細胞数を測定することにより測定することができる。ＡＤＣＣ活性も公知の方法で測定することができ、例えば、ＣＤ１６を発現するＮＫ−９２細胞等のエフェクター細胞とヒトアクアポリン４を発現するＣＨＯ細胞等の標的細胞と抗ヒトアクアポリン４抗体をヒト血清存在下でインキュベーションし、その後ＣＤ１６を発現するＮＫ−９２細胞等のエフェクター細胞と共培養し、生細胞数を測定することにより測定することができる。
　従って、本発明の抗アクアポリン４抗体は、好ましくは、上記のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、或いは上記のアミノ酸配列からなるＣＤＲを有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有し、ヒト定常領域を有するキメラ抗体又はヒト化抗体であり、例えば、定常領域のサブクラスがＩｇＧ４であり、及び／又は定常領域において上記のアミノ酸変異の少なくとも１つを有する抗体である。
　さらに、ＣＤＣ活性を低減した抗アクアポリン４抗体として、定常領域のＦｃ領域を除いた抗体、例えば、抗体の機能的断片であるＦ（ａｂ’）２を用いることができる。
４．抗アクアポリン４抗体の製造
　本発明の抗アクアポリン４抗体は、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させることもできる。
　この際、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、重鎖可変領域をコードするＤＮＡと重鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡと軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡをプロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等のエレメントと機能的に連結してもよい。ここで機能的に連結とは、エレメントがその機能を果たすように連結することをいう。
　プロモータ及びエンハンサーとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス由来のプロモータ及びエンハンサーを用いることができる。
　本発明の遺伝子を挿入するためのベクターとしては、細菌、酵母又は動物細胞等の宿主中で複製可能なものを用いればよく、例えば、プラスミド、ファージ等が挙げられる。例えば、ｐＵＣ１９、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター（プロメガ社）、ｐＵＥＸ２（アマシャム社製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（クロンテック社製）等が挙げられる。発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換することができる。例えば、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法等がある。
　宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や酵母、動物細胞等の真核細胞を用いることができるが、真核細胞を用いることが好ましい。酵母としてはサッカロマイセス・セレビィシエ等が、動物細胞としては、ヒト胎児腎細胞株である２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サルＣＯＳ細胞、マウス線維芽細胞等が挙げられる。
　産生された抗体の精製は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を用いて行うことができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜組み合わせて行うことができる。
５．本発明の抗アクアポリン抗体の特性
　本発明の抗アクアポリン抗体は、以下の特性を有する。
（１）本発明の抗アクアポリン４抗体は、アストロサイトに発現するヒトアクアポリン４のＭ１アイソフォーム及びＭ２３アイソフォームの細胞外ドメインに結合する。具体的には、ループＡ、ループＣ及びループＥの３つのループが集合して形成されるアクアポリンの細胞外ドメインに結合する。
　また、本発明の抗アクアポリン４抗体は、マウスアクアポリン４のＭ１アイソフォームに結合しない。さらに、マウスアクアポリン４のＭ２３アイソフォームに結合しないか、又は結合したとしてもヒトアクアポリン４に対するアフィニティーの８~１６倍又は８~１８倍低いアフィニティーで結合する。
　さらに、配列番号４０で表されるヒトアクアポリン４のＭ２３アイソフォームのループＡを構成するアミノ酸配列の６２番目のＴｈｒ及び／又は６４番目のＬｙｓが形成に関与するエピトープを認識する。
（２）本発明の抗アクアポリン４抗体は、アクアポリン４の細胞外ドメインに結合した場合でも、アクアポリン４が本来有する水チャネル活性は阻害しない。すなわちアクアポリン４の水透過性を抑制しない。
（３）本発明の抗アクアポリン４抗体は、アクアポリン４に高いアフィニティーで特異的に結合する。例えば、本発明の抗アクアポリン４抗体は、ヒトアクアポリン４に対してＫＤが１×１０−７以下、好ましくは１×１０−８以下、さらに好ましくは１×１０−９以下で結合する。ヒトアクアポリン４に対するアフィニティーは、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）患者が有するアクアポリン４に対するポリクローナル抗体である自己抗体（ＮＭＯ−ＩｇＧ）の５倍以上、好ましくは１０倍以上である。このため、ヒトアクアポリン４にＮＭＯ−ＩｇＧが既に結合している場合でも、ＮＭＯ−ＩｇＧに置換する形でヒトアクアポリン４に結合し、本発明の抗体が一旦ヒトアクアポリン４に結合するとその高いアフィニティーのため、ＮＭＯ−ＩｇＧは、もはやヒトアクアポリン４に結合できなくなる。
（４）本発明の抗アクアポリン４抗体は、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）活性及び／又は抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性を有しないか、又は減少している。このため、アクアポリン４が発現しているアストロサイトをＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣにより傷害することがない。例えば、アクアポリン４に対する自己抗体であるＮＭＯ−ＩｇＧに比較して、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性が減少している。
　なお、本発明の抗アクアポリン４抗体はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が結合したＰＥＧ化抗体も含む。抗体をＰＥＧ化することにより、血中半減期を長くすることができる。
６．抗アクアポリン４抗体の治療薬としての使用
　本発明は、本発明の抗アクアポリン４抗体を有効成分として含む視神経脊髄炎（ＮＭＯ：Ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｏｐｔｉｃａ）の治療薬も包含する。本発明の抗アクアポリン４抗体は、アストロサイトに発現するアクアポリン４に結合することにより、アクアポリン４に対する自己抗体であるＮＭＯ−ＩｇＧがアクアポリン４に結合するのを阻害するか、あるいは、アクアポリン４に結合しているＮＭＯ−ＩｇＧに置換する形でアクアポリン４に結合し、それ以後ＮＭＯ−ＩｇＧがアクアポリン４に結合するのを阻害する。本発明の抗アクアポリン４抗体は、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性を有しないのでＮＭＯ−ＩｇＧとは異なり、アクアポリン４が発現するアストロサイトをＣＤＣやＡＤＣＣにより傷害することがない。このため、本発明の抗アクアポリン４抗体を有効成分として含む治療薬により、視神経脊髄炎を治療し、あるいは、症状を緩和し、あるいは再発を防止し、あるいは進行を止めるか遅らせることができる。また、本発明の抗アクアポリン４抗体は、アクアポリン４が本来的に有する水チャネル活性を阻害することはないので、副作用を生じることもない。
　本発明の抗アクアポリン４抗体を有効成分として含む視神経脊髄炎の治療薬は、視神経脊髄炎の発症初期に投与することが好ましい。また、一旦症状が緩和した視神経脊髄炎が再発した際に投与することが好ましい。本発明の治療薬に含まれる抗アクアポリン４抗体が、視神経脊髄炎の発症期又は再発期において、アストロサイトに発現するアクアポリン４に結合し、アクアポリン４に対する自己抗体であるＮＭＯ−ＩｇＧがアクアポリン４に結合するのを阻害し、アストロサイトが傷害されるのを防止することにより、視神経脊髄炎の症状の悪化又は重症化を防ぐことができる。好ましくは、本発明の抗アクアポリン４抗体を含む治療薬は、単独で用いるのではなく、従来から視神経脊髄炎の治療薬として用いられてきたステロイド剤と併用するのが好ましい。例えば、視神経脊髄炎が発症又は再発した場合に、数日から１週間程度抗アクアポリン４抗体を含む治療薬を投与し、その後ステロイド剤を投与すればよい。また、抗アクアポリン４抗体を含む治療薬を投与する際に同時にステロイド剤を投与してもよい。ステロイド剤としては、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニン等の副腎皮質ホルモン剤が挙げられ、これらのステロイド剤は、例えば、点滴により投与すればよい。
　本発明の抗アクアポリン４抗体を有効成分として含む治療薬は、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。該予防又は治療薬は、静脈注射、経口、経鼻、経粘膜、筋肉内又は皮下、鼻腔内、気管内、皮膚、経皮又は皮内の各経路によって投与できる。好ましくは、点滴により静脈注射を行う。
　本発明の抗アクアポリン４抗体を有効成分として含む治療薬の投与量は、投与する患者の年齢、性別、重篤度等により変えることができるが、１回数十ｎｇ~数ｍｇである。単回投与でもよいし、１日から２週間にわたって数回にわたって投与してもよい。
　本発明は、本発明の抗アクアポリン４抗体とステロイド剤を含む、視神経脊髄炎治療用薬剤キットも包含する。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　抗アクアポリン４（ＡＱＰ４）抗体の作製及び特性分析
ＮＭＯ患者から抗体の単離
　抗ＡＱＰ４抗体陽性の５名のＮＭＯ患者の血漿交換の際に生じたサンプルからＩｇＧ画分を得た。患者血液サンプルの使用については東北大学医学部の倫理委員会の承認のもと行った（Ｎｏ．２００７−３２７）。
ヒトＡＱＰ４細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体の樹立
　ヒトＡＱＰ４（ｈＡＱＰ４）細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体の樹立は以前の論文（Ｓａｉｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，２００７）に従って行った。ｈＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームのｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５プラスミドトランスファーベクターに挿入した。ｈＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームとマウスＣ３ｄをともに発現（Ｃ９４及びＤ１５シリーズ）あるいはｈＡＱＰ４　Ｍ２３のみを発現（Ｄ１２シリーズ）する発芽型バキュロウイルスをＰＢＳに懸濁し、百日咳毒素とともにｇｐ６４トランスジェニックマウスの腹腔内に免疫した。ｈＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームを安定発現したＣＨＯ細胞株を用いたフローサイトメトリー（Ｃ９４シリーズ）あるいはＥＬＩＳＡ（Ｄ１２及びＤ１５シリーズ）による一次スクリーニングの結果、Ｃ９４シリーズでは５７６クローン中１クローン、Ｄ１２シリーズでは７５６クローン中１７３クローン、Ｄ１５シリーズでは１１５２クローン中２７１クローンが得られた。ｈＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームを安定発現したＣＨＯ細胞株を用いたフローサイトメトリーによる二次スクリーニングの結果、Ｃ９４、Ｄ１２、Ｄ１５シリーズがそれぞれ１，２，６１クローン得られ、そのうちＣ９４０１，Ｄ１２０９２，Ｄ１５１０７，Ｄ１５１２９の４クローンを選択した。
プラスミドの構築
　野生型ヒトＡＱＰ４−Ｍ２３アイソフォームのｃＤＮＡは東洋紡（日本、大阪）から購入した。マウスＡＱＰ４（ｍＡＱＰ４）Ｍ１及びＭ２３アイソフォームのｃＤＮＡは初代培養アストロサイトから抽出した全ＲＮＡからＭ１用センスプライマー５’−ＧＡＡＧＧＣＡＴＧＡＧＴＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＡＧＧ−３’（配列番号３１）、あるいはＭ２３用センスプライマー５’−ＡＣＴＡＴＧＧＴＧＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＴ−３’（配列番号３２）及び共通のアンチセンスプライマー５’−ＴＡＧＴＣＡＴＡＣＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＣＧＡ−３’（配列番号３３）を用い、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した後、シークエンスを確認するためｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）に挿入した。ｈＡＱＰ４のＴ６２Ｓ／Ｋ６４Ｎ，Ｍ１４９Ｔ，及びＥ２２８Ａ変異はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（アジレント、Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって以下のプライマーセットを用いて導入した。５’−ＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＧＧＴＣＧ−３’（配列番号３４）及び５’−ＣＧＡＣＣＧＧＴＡＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＴＧＧＴ−３’（配列番号３５）（Ｔ６２Ｓ／Ｋ６４Ｎ）、５’−ＡＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＣＧＧＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＣ−３’（配列番号３６）及び５’−ＧＡＴＴＴＣＣＡＴＧＡＡＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＴ−３’（配列番号３７）（Ｍ１４９Ｔ）、５’−ＣＡＧＴＴＡＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＣＡＡＡＣＣＡＴＴＧＧＡＴＡＴＡＴＴＧＧＧＴ−３’（配列番号３８）及び５’−ＡＣＣＣＡＡＴＡＴＡＴＣＣＡＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＣＡＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＡＡＣＴＧ−３’（配列番号３９）（Ｅ２８８Ａ）得られたｃＤＮＡはｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター（クローンテック、Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＮｈｅＩ及びＳａｃＩＩサイトの間に挿入した。
細胞培養とトランスフェクション
　ＣＨＯ細胞は１０％血清、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含んだＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地中で培養した。ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰに挿入したＡＱＰ４あるいはその誘導体ｃＤＮＡの細胞への導入は、細胞を６０−ｃｍの培養皿に１ｘ１０５個という密度で播種した上でリポフェクトアミン試薬及びプラス試薬（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。トランスフェクション後４８時間経過後、細胞はフローサイトメトリーによる解析を行った。ウェスタンブロッティングを行う場合は、同様にトランスフェクションした後、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％トライトンＸ−１００及びＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（ロシュ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を含む２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４）で溶解した。
ＣＨＯ細胞安定発現株の樹立
　ｈＡＱＰ４−Ｍ２３アイソフォームのｃＤＮＡを挿入したｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター、あるいは空のｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターはＡｆｌＩＩで線状化し、それぞれ３５−ｍｍの培養皿に播種したＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間経過後、トリプシン処理をしてはがし、１０枚の１００−ｍｍの培養皿に再度播種し、５００μｇ／ｍｌの濃度のＧ４１８を含む培地で７日から１０日培養した。発現しているＥＧＦＰの蛍光強度を指標にいくつかのコロニーを集め、増殖させた。最終的に各クローンのＡＱＰ４及びＥＧＦＰの発現はウェスタンブロッティングにより確認した。
蛍光抗体法による染色と顕微鏡観察
　マウスの大脳皮質の急性切片（Ｅ１４）は４％パラフォルムアルデヒドを含むＰＢＳで１時間固定し、０．１％トライトンＸ−１００により透過処理し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングを行った。スライスはウサギ抗ＡＱＰ４Ｃ末端ドメイン抗体（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）およびモノクローナル抗ＡＱＰ４細胞外ドメイン抗体と１時間反応させ、ＰＢＳで４回洗浄した後Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（インビトロジェン）と反応させた。
　ｈＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームを安定発現するＣＨＯ細胞は２０ｍｇの患者由来の精製抗体と増殖培地中で３７℃、２時間反応させた。これに１０ｍｇのモノクローナル抗ＡＱＰ４細胞外ドメイン抗体を加え、更に２４時間反応させた。これら細胞は４％パラフォルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した後、ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％トライトンＸ−１００による透過処理、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳによるブロッキングを行った。細胞に結合したＮＭＯ−ＩｇＧとモノクローナル抗体はそれぞれＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧとＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（インビトロジェン）と反応させた。染色したスライスと細胞は共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。
免疫沈降法
　単層でコンフルエントになるまで増殖させた、ｈＡＱＰ４を安定発現したＣＨＯ細胞を培養皿から掻き採り、ブルーネイティブバッファー（１％トライトンＸ−１００、１２ｍＭ　ＮａＣｌ、５００ｍＭ　６−ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、２０ｍＭ　ｂｉｓＴｒｉｓ　ｐＨ７．０、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０％グリセロール及びタンパク質分解酵素阻害剤）で可溶化し、氷上で激しく撹拌した後、一旦−８０℃で凍結融解し、４℃、２０，０００ｘｇで５分間遠心した。上清を回収し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ピアス、ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ウサ）によりタンパク質濃度を測定した。２００ｍｇのタンパク質抽出液と１０ｍｇのウサギ抗ＡＱＰ４Ｃ末端ドメイン抗体あるいはそれぞれのモノクローナル抗ＡＱＰ４細胞外ドメイン抗体とをローテーターで撹拌しながら４℃オーバーナイトで反応させた。翌日、洗浄バッファーであらかじめ処理した４０ｍｌのｎＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗビーズ（ＧＥヘルスケア、Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ，ＵＳＡ）を加えた。免疫複合体を単離するため、各サンプルのビーズを４℃、１１，０００ｘｇで２分間遠心し、洗浄バッファー（０．２％トライトンＸ−１００、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ　ｐＨ７．４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＥＧＴＡ）で４回洗浄したのち、２０ｍｌの３ｘ　Ｌａｅｍｍｌｉバッファーで３７℃、３０分保温し溶出し、得られたタンパク質は、ウェスタンブロッティングにより解析を行った。
ウェスタンブロッティング
　各サンプルはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法により分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写された膜はウサギ抗ＡＱＰ４抗体あるいはモノクローナル抗ＡＱＰ４抗体と反応させた。目的のタンパク質はＣｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ　Ｏｎｅ　Ｌ　ｓｙｓｔｅｍ（ナカライテスク、京都、日本）により顕在化させ、Ｉｍａｇｅ　Ｑｕａｎｔ　ＬＡＳ　ｓｙｓｔｅｍにより検出した（ＧＥヘルスケア）。用いた抗体は、ポリクローナルウサギ抗ＡＱＰ４　Ｃ末端ドメイン抗体（シグマ）、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス抗体およびＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ抗体（シグマ）である。
組換えヒトＡＱＰ４のリポソームへの再構成とＡＱＰ４リポソームの水透過性の測定
　Ｓｆ９細胞／バキュロウイルス系を用いてｈＡＱＰ４を大量発現・精製し、過去の報告（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６：７６２５−３２；Ｙｕｋｕｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４８：１２０５９−６１）に従って、精製ｈＡＱＰ４タンパクの組み込まれたプロテオリポソームを作製した。
　ｈＡＱＰ４プロテオリポソームの水透過性（Ｐｆ）は、ストップトフロー装置を用いた高浸透圧溶液との瞬時混和による、リポソーム内に封入した蛍光物質カルボキシフルオロセインの蛍光消退反応（Ｚｅｉｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１：７４３６−４０）により求めた。蛍光強度消退の時間経過曲線の最初の部分の一次導関数をリポソームの相対容積変化に置換し、以下の式よりＰｆを求めた。
　ＡＱＰ４水透過性Ｐｆ＝（ｄＶ（ｔ）／ｄｔ）／｛（ＳＡＶ）（ＭＶＷ）（Ｃｉｎ−Ｃｏｕｔ）｝
＊Ｖ（ｔ）：リポソーム相対容積、ＳＡＶ：水モル容積（１８ｃｍ３／ｍｏｌ）、Ｃｉｎ・Ｃｏｕｔ：リポソーム内外の溶質濃度
モノクローナル抗ｈＡＱＰ４のリポソーム中のＡＱＰ４への特異的な結合の確認
　モノクローナル抗体のリポソーム中のＡＱＰ４への特異的な結合の確認は以前の報告（Ｙｕｋｕｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ　１００：３５５−６３）に従い行った。ＡＱＰ４プロテオリポソームは２０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＡＱＰ４細胞外ドメイン抗体と室温で１時間反応させた。リポソームは５０，０００ｒｐｍ、４５分間の遠心により回収した後バッファーに再度懸濁させることを３回繰り返すことで未反応のＩｇＧを除去した。リポソームは１６ｍｇ／ｍｌのＳＤＳを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーにて可溶化した。
フローサイトメトリー
　ＡＱＰ４及びその誘導体を一過性に発現させたＣＨＯ細胞はトリプシン処理により回収し、１００ｍｌの０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳに再度懸濁させ、モノクローナル抗ｈＡＱＰ４細胞外ドメイン抗体（２μｇ）、あるいは患者由来精製抗体（１０μｇ）と氷上で１時間反応させた。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄後、ＰＥで標識したマウス抗ヒトＩｇＧ（１：５、バイオレジェンド、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）あるいはＰＥで標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００、バイオレジェンド）と１時間反応させた。結合したＩｇＧはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）で評価した。
ＮＭＯ−ＩｇＧの結合特性の評価
　ＮＭＯ−ＩｇＧのエピトープを探索するため、まずヒト及びマウスＡＱＰ４（それぞれｈＡＱＰ４とｍＡＱＰ４）のＭ１及びＭ２３アイソフォームｃＤＮＡそれぞれと、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）とが内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により連結された発現コンストラクトを作製した。このコンストラクトにおいてはＥＧＦＰの蛍光強度はＡＱＰ４の発現量を間接的に知るために用いられる。５人の患者血清より精製したＮＭＯ−ＩｇＧの結合特性は、これら発現コンストラクトの一過性トランスフェションによりＡＱＰ４を発現したＣＨＯ細胞を用いて検討した。図１に示すように、５種類のＮＭＯ−ＩｇＧは全てｈＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームを発現した細胞表面に結合した。抗体の結合はＥＧＦＰの蛍光強度の上昇にともなって増加した（図１）。５種類のＮＭＯ−ＩｇＧのうち、患者１及び２由来の２種類についてはｍＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームを発現した細胞にも結合した（図１）。図１において、Ｐｔ１~Ｐｔ５は患者を示す。患者１由来のＮＭＯ−ＩｇＧを除く全てのＮＭＯ−ＩｇＧは種の違いに関わらずＭ１アイソフォームを認識しなかった（図１）。これらの結果より、過去の報告（Ｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１１０−３、Ｎｉｃｃｈｉａ　ｅｔ　ａｌ．，２００９，Ｇｌｉａ５７：１３６３−７３、Ｍａｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＰｌｏＳ　ｏｎｅ　２０１０；５：ｅ１０４５５、Ｐｉｓａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：９２１６−２４、Ｃｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：１６５１６−２４、Ｉｏｒｉｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊａｕｔ．２０１２．０７．００８）にもあるように、ＮＭＯ−ＩｇＧは均質ではなく、そのエピトープは多様であることを示している。
ＡＱＰ４細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体の樹立
　最近のレポート（Ｍｉｓｕ　ｅｔ　ａｌ．，２００７，Ｂｒａｉｎ　１３０：１２２４−３４、Ｒｏｅｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，２００７，Ｂｒａｉｎ　１３０：１１９４−２０５、Ｈｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，２００７，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ６９：２２２１−３１、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，２００９，ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ　２０：５０８−５１２、Ｓａｂａｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２１５：３１−５、Ｓａａｄｏｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２３５：２７−３２、Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０１１，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：９４３−５４）によれば、ＮＭＯ−ＩｇＧがＡＱＰ４を介してアストロサイトに結合することによってＮＭＯが発症する。従ってＮＭＯ−ＩｇＧがＡＱＰ４に結合することを防ぐことによって病気の予後を改善することができると考えられる。そこで本発明者らはＮＭＯ−ＩｇＧのＡＱＰ４への結合を、ＡＱＰ４の機能に影響を与えること無く阻害できるモノクローナル抗体の作製を試みた。ＡＱＰ４の細胞外ドメインに対する抗体を作製するにあたり、バキュロウイルスディスプレイ法（Ｓａｉｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３２２：１０４−１７）を用いた。この方法により４種類の独立したクローンを得、それらのＡＱＰ４に対する結合親和性と特異性を、ＡＱＰ４を一過性に発現させたＣＨＯ細胞によるフローサイトメトリーにより調べた。予想された通り、全てのモノクローナル抗体はｈＡＱＰ４のＭ１、Ｍ２３両アイソフォームの細胞外ドメインも認識した（図２ａ，ｂ，ｃ，ｆ，Ｉ，ｊ，ｍ，ｎ）。このうち２つ（Ｃ９４０１とＤ１２０９２）はｈＡＱＰ４のみを認識した（図２ｃ，ｄ，ｇ，ｈ）が、他の２つ（Ｄ１５１０７とＤ１５１２９）はｍＡＱＰ４のＭ２３をも認識した（ｍＡＱＰ４のＭ１は認識しなかった）（図２ｋ，ｌ，ｏ，ｐ）。Ｄ１５１０７とＤ１５１２９のｍＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームに対する親和性は、ｈＡＱＰ４に対するそれよりも８倍~１６倍弱かった。また、段階希釈したＤ１５１０７とＤ１５１２９を用いたフローサイトメトリーにより、これら抗体はｈＡＱＰ４のＭ１とＭ２３に対して同程度の親和性で結合することが分かった（ｄａｔａ　ｎｏｔ　ｓｈｏｗｎ）。
　Ｄ１５１０７とＤ１５１２９はｍＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームを認識したことからこれら抗体がマウス組織の抗体染色に用いることができるか否か調べた。これらの抗体を用いると、マウスの大脳皮質の急性切片の蛍光抗体法による染色において、ウサギ抗ＡＱＰ４　Ｃ末端ドメイン抗体（シグマ）同様、明らかに血管周囲が染まっていた（図３）。図３中、左パネルはモノクローナル抗体Ｄ１５１２９を用いた染色結果、中央パネルはウサギ抗ＡＱＰ４　Ｃ末端ドメイン抗体を用いた染色結果を示し、右パネルはマージした像を示す。これら抗体は免疫沈降法にも用いることが可能であったが（図４）、ウェスタンブロッティングにより、変性したＡＱＰ４は認識しないことが分かった（図５）。
　まとめると、全てのモノクローナル抗体はＡＱＰ４の細胞外ドメインによって構成される三次元構造を認識していること、またこの三次元構造はｍＡＱＰ４とｈＡＱＰ４との間で、またＭ１とＭ２３との間で微妙に異なっていると結論づけられた。図６にヒトアクアポリン４の構造を示す。
　Ｃ９４０１とＤ１２０９２は、ｈＡＱＰ４は認識するが、ｍＡＱＰ４は認識しなかったことから、そのエピトープを同定するため、３つの細胞外ループのうち、１つをそれに相当するマウスのものと置換した変異ｈＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームｃＤＮＡを作製し、ＣＨＯ細胞に一過性に発現させた。ｈＡＱＰ４とｍＡＱＰ４の細胞外ドメインにおけるアミノ酸配列の違いは以下のとおりである。ループＡにおいて、ｈＡＱＰ４のＴｈｒ６２（ｈＡＱＰ４のＭ２３アイソフォームのアミノ酸配列（配列番号５０）の６２番目のＴｈｒ）がｍＡＱＰ４ではＳｅｒであり、ｈＡＱＰ４のＬｙｓ６４がｍＡＱＰ４ではＡｓｎであり、ループＣにおいてｈＡＱＰ４のＭｅｔ１４０がｍＡＱＰ４ではＴｈｒであり、ループＥにおいてｈＡＱＰ４のＧｌｕ２２８がｍＡＱＰ４ではＡｌａである。すると、ループＣあるいはループＥをマウスのものに置換した変異ｈＡＱＰ４ではＣ９４０１及びＤ１２０９２の結合に影響を与えなかった（図７ｃ，ｄ，ｇ，ｈ）が、ループＡを置換した変異体ではこれら抗体の結合が劇的に低下した（図７ｂ，ｆ）。この結果は、これらモノクローナル抗体のエピトープとしてループＡが含まれていることを示している。予想に反し、Ｄ１５１０７とＤ１５１２９はｍＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームを認識できるにもかかわらず、ループＡをマウスのものに置換したｈＡＱＰ４に対する結合が低下した（図７ｊ，ｎ）。この結果は、ループＡのＴｈｒ６２及び／Ｌｙｓ６４が抗ｈＡＱＰ４抗体が認識する３次元構造上のエピトープの形成にかかわっていることを示唆している。
　次に、本発明者らはこれらモノクローナル抗体がＡＱＰ４の水透過性を抑制するか否かについてｈＡＱＰ４を組み込んだリポソームを用いて検討した。結果を図８及び９に示す。図８に見られるように、浸透圧格差によるＡＱＰ４の水透過性はモノクローナル抗体によって阻害されなかった。このアッセイにおける抗体のＡＱＰ４に対する結合はＨＲＰで標識した抗マウスＩｇＧ抗体を用い、ウェスタンブロッティングにより確認した（図９）。アフリカツメガエル卵母細胞を用いた膨張試験によってもモノクローナル抗体がＡＱＰ４の機能を阻害しないことを示している（ｄａｔａ　ｎｏｔ　ｓｈｏｗｎ）。
モノクローナル抗体はＮＭＯ−ＩｇＧの結合を阻害する
　モノクローナル抗体がＡＱＰ４の水チャネルとしての機能に影響しないことが分かったので、本発明者らはこの抗体がＮＭＯ−ＩｇＧのＡＱＰ４への結合を阻害するかどうかについて調べた。この目的のために、本発明者らはｈＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームとＥＧＦＰを安定に発現するＣＨＯ細胞株を樹立した。５種類のＮＭＯ−ＩｇＧは全てｈＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームを発現した細胞に結合したが、ＥＧＦＰのみを発現した細胞には結合しなかった。このＮＭＯ−ＩｇＧの細胞への結合はＤ１２０９２あるいはＤ１３１０７の存在により明らかに減弱した。すなわちこれらモノクローナル抗体は、結合特性が異なる５種類全てのＮＭＯ−ＩｇＧの結合を阻害した（図１０）。図１０中、黒い線で示すヒストグラムが抗アクアポリン４モノクローナル抗体が存在する場合のヒストグラムであり、グレーのゾーンで示すヒストグラムが抗アクアポリン４モノクローナル抗体が存在しない場合のヒストグラムである。そこで、これらモノクローナル抗体の投与によって、ＡＱＰ４に結合したＮＭＯ−ＩｇＧを置換し得るか否かについて、ｈＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームを安定発現したＣＨＯ細胞を用いて検討した。まずＡＱＰ４発現細胞を患者１もしくは患者２から得た２０ｍｇのＮＭＯ−ＩｇＧで２時間処理した。この時点でＮＭＯ−ＩｇＧは確かに細胞表面に結合していた（図１１ａ）。そこで１０μｇのモノクローナル抗体を培地中に添加し、ＮＭＯ−ＩｇＧ存在下で更に２４時間培養した。モノクローナル抗体非存在下でＮＭＯ−ＩｇＧとともに２４時間培養した細胞ではＮＭＯ−ＩｇＧは細胞表面に結合していた（図１１ｂ）。これに対して、培地にＤ１２０９２あるいはＤ１５１０７を添加した場合はＮＭＯ−ＩｇＧの細胞への結合は劇的に減少していた（図１１ｃ，ｄ）。一方、添加したモノクローナル抗体は２４時間の培養後ＡＱＰ４発現細胞の表面に結合していた（図１１ｆ，ｇ）。この結果はモノクローナル抗体が培地中にＮＭＯ−ＩｇＧが共存していてもＡＱＰ４に結合したＮＭＯ−ＩｇＧを置換したということを示している。この実験を通じて、補体の投与をしない限りモノクローナル抗体の添加により細胞の明らかな形態変化は見られなかった。同様に初代培養マウスアストロサイトやｈＡＱＰ４　Ｍ２３を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞においても補体非存在化では少なくとも２時間まではモノクローナル抗体の投与は細胞の形態に影響を及ぼさなかった（図１２）。図１２Ａは、培養マウスアストロサイトの形態に対するハイブリドーマＤ１５１０７の産生する抗アクアポリン４モノクローナル抗体の影響を示す（（ｅ）~（ｈ））。コントロールとして抗体の影響のないアストロサイトの形態（（ａ）~（ｄ））も示す。抗体の添加２時間後（（ｆ））でも、添加前（（ｅ））及び抗体無添加の場合（（ｂ））と形態は変わらなかった。マウスＩｇＧに対する蛍光標識２次抗体により、抗体がアストロサイトに結合していることが確認された（（ｈ））。また、抗アクアポリン４Ｃ末ドメイン抗体により、アストロサイトにアクアポリン４が発現していることが確認された（（ｃ）及び（ｇ））。図１２Ｂは、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターにＡＱＰ４　Ｍ２３ｃＤＮＡを挿入したものでトランスフェクトしたｈＡＱＰ４　Ｍ２３を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞の形態に対するハイブリドーマＤ１２０９２及びＤ１５１０７の影響を示す。抗体添加２時間後でも（（ｑ）、（ｒ）、（ｗ）、（ｘ））、抗体添加前（（ｏ）、（ｐ）、（ｕ）、（ｖ））と細胞の形態は変化しなかった。図中、ＥＧＦＰはＥＧＦＰの発現を、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌは細胞への抗体の結合を示す。
　モノクローナル抗体のアミノ酸配列決定
　実施例１で取得した、４種類のハイブリドーマ（Ｃ９４０１、Ｄ１２０９２、Ｄ１５１０７及びＤ１５１２９）が産生する抗アクアポリン４モノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域のアミノ酸配列及び相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）のアミノ酸配列を決定した。
　配列決定の結果、Ｄ１５１０７及びＤ１５１２９は同一の抗体を産生する同一クローンであることが判明した。
　Ｃ９４０１、Ｄ１２０９２、Ｄ１５１０７／Ｄ１５１２９が産生するモノクローナル抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域及び可変領域中のＣＤＲのアミノ酸配列を図１３~１５に示す。図１３~１５には、定常領域の配列も部分的に示してある。
　モノクローナル抗体のアクアポリン４との親和性の検討
　実施例１で樹立した３種類の抗体（Ｃ９４０１，Ｄ１２０９２，Ｄ１５１０７）のアクアポリン４に対する親和性について検討を行った。
　実施例１で用いたｈＡＱＰ４　Ｍ２３を発現する発芽型バキュロウイルス、並びにｈＡＱＰ４　Ｍ１もしくはｈＡＱＰ４−Ｍ２３を発現するＣＨＯ細胞（それぞれのクローン名は、Ｆ７１１及びＣ３１３）に対する抗体の結合の濃度依存性をＥＬＩＳＡ法で測定した。
　ＣＨＯ細胞については、４％パラフォルムアルデヒドで固定後、４℃　ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔで反応したもの（ｆｉｘｅｄ）と生きた状態で３７℃１時間で反応したもの（ｌｉｖｅ）の両方を用いた。
　ＥＬＩＳＡの方法の詳細は以下のとおりである。
発芽型バキュロウイルスの場合
　発芽型バキュロウイルスを０．０５μｇ／μｌ（タンパク量として）でＰＢＳに懸濁し、５０μｌずつ９６ウェルプレートに分注し（１ｗｅｌｌあたり２．５μｇ）、４℃　ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで静置することにより、ウイルスの固相化を行った。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、４０％　ＢｌｏｃｋＡｃｅ　ｉｎ　ＰＢＳで室温１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇを行い、続いて４０％　ＢｌｏｃｋＡｃｅ　ｉｎ　ＰＢＳで希釈した抗体と４℃　ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで反応させた。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、１０％　ＢｌｏｃｋＡｃｅ　ｉｎ　ＰＢＳで８０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧと室温で１ｈｒ震盪しながら反応させ、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、ＴＭＢ試薬５０μｌと３０分間反応し、Ｓｔｏｐ　ｒｅａｇｅｎｔ　５０μｌで反応を停止後、プレートリーダーにより吸光度を測定した。
ＣＨＯ固定細胞（ｆｉｘｅｄ）の場合
　各細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０５細胞ずつ播種し、２４時間培養後、４％パラフォルムアルデヒドで４℃　ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで固定した。ＰＢＳで２回洗浄後、４０％　ＢｌｏｃｋＡｃｅ　ｉｎ　ＰＢＳで室温１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇを行い、続いて４０％　ＢｌｏｃｋＡｃｅ　ｉｎ　ＰＢＳで希釈した抗体と４℃　ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、１０％　ＢｌｏｃｋＡｃｅ　ｉｎ　ＰＢＳで８０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧと室温で１ｈｒ震盪しながら反応させ、ＰＢＳで５回洗浄後、ＴＭＢ試薬５０μｌと３０分間反応し、Ｓｔｏｐ　ｒｅａｇｅｎｔ　５０μｌで反応を停止後、プレートリーダーにより吸光度を測定した。
ＣＨＯ生細胞（ｌｉｖｅ）の場合
　各細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０５細胞ずつ播種し、２４時間培養後ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　Ｎａ（ｐＨ７．４），１４０ｍＭ　ＮａＣｌ，４ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１．２５ｍＭ　ＣａＣｌ２，１ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，１１ｍＭ　ｇｌｕｃｏｓｅ，０．２％　ＢＳＡ）で希釈した抗体と３７℃　１ｈｒ反応させた。同ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、４％パラフォルムアルデヒドで室温２時間固定した。ＰＢＳで２回洗浄後、４０％　ｂｌｏｃｋＡｃｅ　ｉｎ　ＰＢＳでブロッキングを行い、１０％　ＢｌｏｃｋＡｃｅで８０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧと室温で１ｈｒ震盪しながら反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後ＴＭＢ試薬５０μｌと３０分間反応し、Ｓｔｏｐ　ｒｅａｇｅｎｔ　５０μｌで反応を停止後、プレートリーダーにより吸光度を測定した。
　図１６にｈＡＱＰ４　Ｍ２３を発現する発芽型バキュロウイルスを用いた場合の結果を示す。図１６においては、各抗体各濃度での抗体の結合を、Ｄ１５１０７抗体の最大結合に対する％で表してある。図１７にＣＨＯ細胞を用いた場合の結果を示す。図１７Ａは、Ｃ９４０１抗体の結果を、図１７ＢはＤ１２０９２抗体の結果を、図１７ＣはＤ１５１０７の結果を示す。図１７Ａ、Ｂ及びＣにおいては、４％パラフォルムアルデヒドで固定後、４℃　ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで反応したもの（ｆｉｘｅｄ）と生きた状態で３７℃１時間で反応したもの（ｌｉｖｅ）の結果をｈＡＱＰ４　Ｍ１又はｈＡＱＰ４−Ｍ２３を発現するＣＨＯ細胞についての結果を示す。
　図１８は、ｈＡＱＰ４の細胞外ドメインに対する各モノクローナル抗体の結合特性を示し、上記のＥＬＩＳＡにより濃度依存的な親和性を測定した際に毎回４−パラメーターロジスティックモデルに近似し、求めたものの平均値を示す（ｐＭ）。
　Ｖｅｒｋｍａｎ等（Ｃｒａｎｅ　ＪＭ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６，１６５１６−１６５２４）が視神経脊髄炎（ＮＭＯ）患者よりクローニングした抗体では、ｈＡＱＰ４　Ｍ２３を発現した細胞（生細胞）に対し、Ｋｄ値が４４ｎＭ（ｒＡｂ−５３）又は６８ｎＭ（ｒＡｂ−５８）で結合した。一方、本発明の抗体はｈＡＱＰ４　Ｍ２３を発現する生細胞に対し、ＥＣ５０値でＣ９４０１抗体、Ｄ１２０９２抗体、及びＤ１５１０７抗体は、それぞれ、１６２ｐＭ、１１６ｐＭ、及び１５０ｐＭで結合した。この結果は、本発明の抗アクアポリン抗体の結合親和性はＶｅｒｋｍａｎ等の抗体の数１００倍であることを示している。
　Ｃ９４０１キメラ抗体の作製
（１）Ｃ９４０１キメラ抗体の作製
　Ｃ９４０１のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡはこの抗体を産生するハイブリドーマクローン全ＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲにより得た。Ｃ９４０１はＩｇ　ｇａｍｍａ　２ｂ及びＩｇ　ｋａｐｐａであることが分かっていることから、Ｃ９４０１のＨ鎖及びＬ鎖ｃＤＮＡを得るためのアンチセンスプライマーとしてそれぞれＣ領域の一部配列である５’−ＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧ−３’（配列番号４１）及び５’−ＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号４２）を用いた。Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の予想される配列を元に各１２種類のセンスプライマーを用い、上記アンチセンスプライマーとともにＰＣＲ反応を行い、電気泳動上で予想されるサイズのＰＣＲ産物があった場合、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。Ｃ９４０１の場合、Ｈ鎖は５’−ＣＡＧＧＴＧＣＡＡＭＴＧＭＡＧＳＡＧＴＣ−３’（配列番号４３）、５’−ＣＡＧＲＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＹＣ−３’（配列番号４４）及び５’−ＣＡＧＧＣＴＴＡＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣ−３’（配列番号４５）を用いた場合、Ｌ鎖は、５’−ＧＡＣＡＴＴＳＴＧＭＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ−３’（配列番号４６）及び５’−ＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＭＭＣＡＧＴＣ−３’（配列番号４７）を用いた場合に機能的な抗体をコードするｃＤＮＡが得られたと考えられた。得られた配列をゲノム情報と照らし合わせ、元のＶ遺伝子を予想し、その開始コドンを含む配列をもとに新たにセンスプライマーを設計し、Ｖ領域全長をクローニングした。用いたプライマーはＨ鎖が５’−ＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣ−３’（配列番号４８）、Ｌ鎖が５’−ＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号４９）である。
　ヒトＩｇ　ｋａｐｐａのＣ領域のｃＤＮＡはＨｅＬａ細胞ゲノムからプライマー５’−ＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣ−３’（配列番号５０）及び５’−ＴＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧ−３’（配列番号５１）を用いてＰＣＲにより得た。ヒトＩｇ　ｇａｍｍａ　１のＣ領域のｃＤＮＡはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇ，ＣＡ，ＵＳＡ）から販売されているｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ｅ３を用いた。本プラスミドによりコードされるヒトＩｇ　ｇａｍｍａ　１のＣ領域には、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ΔＧ２３６及びＡ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３２Ｓ変異が導入されており、Ｆｃ・ＲＩとの結合が減弱するとともにＡＤＣＣ及びＣＤＣの誘導が極めて起こりにくい。
　マウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域をそれぞれヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＣ領域と連結するため、マウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖のｃＤＮＡにアミノ酸配列に影響を及ぼさないＮｈｅＩ及びＸｈｏＩサイトをＰＣＲ法により付加した。用いたアンチセンスプライマーは５’−ＣＣＧＣＧＧＡＧＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣ−３’（配列番号５２）及び５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＡＣＧＴＣ−３’（配列番号５３）である。また、ヒトＬ鎖Ｃ領域にもセンスプライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣ−３’（配列番号５４）を用いてＸｈｏＩサイトをＰＣＲにより導入した。なお、ヒトＨ鎖のＣ領域に対するｃＤＮＡには既にＮｈｅＩサイトが存在した。これら制限酵素部位を利用してＨ鎖及びＬ鎖のキメラ抗体ｃＤＮＡを作製した。
　得られたｃＤＮＡはｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに挿入し、ＣＨＯ細胞に一過性に発現させた後、培養上清を回収し、蛍光抗体法による免疫染色によりヒトＡＱＰ４細胞外ドメインに結合することを確認した。
　Ｃ９４０１キメラ抗体のＬ鎖に対するｃＤＮＡはｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターに挿入後、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、Ｇ４１８で選択することにより、Ｌ鎖を安定発現する株を得た。一方、Ｈ鎖に対するｃＤＮＡはｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｐｕｒｏ　ｖｅｃｔｏｒに挿入し、上述の安定発現株にトランスフェクションし、Ｇ４１８とｐｕｒｏｍｙｃｉｎで選択することによりＣ９４０１キメラＩｇＧを安定発現するＣＨＯ細胞株を得た。
　得られたＣＨＯ細胞株は、増幅後無血清のＣＤ−ＣＨＯ培地により５~７日間培養し、上清を回収した。限外濾過により濃縮後、ゲル濾過によりバッファー交換した後、プロテインＡカラムによりＣ９４０１キメラＩｇＧを精製した。
（２）Ｃ９４０１キメラ抗体の親和性
　Ｃ９４０１キメラ抗体の親和性はヒトＡＱＰ４　Ｍ２３アイソフォームを発現した発芽型バキュロウイルスを固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。検出は二次抗体としてＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧ（４０，０００倍希釈）を用いている。
　図１９はオリジナルの抗体（Ｃ９４０１）とキメラ抗体（Ｃ９４０１　ｃｈｉｍａｅｒａ）の容量反応曲線を示している。検出に用いる二次抗体が異なる事から各々最大結合に対するパーセントで表示している。Ｃ９４０１キメラ抗体のＥＣ５０値は９５６ｐＭで、オリジナル抗体（１６６ｐＭ）と比較して５．８倍親和性が低下していたが、なお既存の抗体よりも高親和性に結合することが示された。
（３）ＮＭＯ−ＩｇＧによる補体依存的細胞傷害に対するＣ９４０１キメラ抗体の抑制効果
　ヒトＡＱＰ４　Ｍ１及びＭ２３両方を発現するＣＨＯ細胞株を９６ウェルプレートに１．２ｘ１０４細胞播種し、２４時間後に一部の細胞については９４０１キメラ抗体（２μｇ／ｍｌ）を加え、１２時間培養した。その後、ＮＭＯ−ＩｇＧ（４００μｇ／ｍｌ）とウサギ補体（２％）を加え更に９０分間培養を継続し、１０％のｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｓａｌｔｓ（ＷＳＴ）−８／１−ｍｅｔｈｏｘｙ　ｐｈｅｎａｚｉｎｅ　ｍｅｔｈｏｓｕｌｐｈａｔｅ（ＰＭＳ）溶液を含む培養液と交換後２時間３７℃で反応させ、４５０ｎｍの吸光度を測定し、未処理の細胞に対する細胞生存率を算出した。図２０に結果を示す。
　図２０に示すように、Ｃ９４０１キメラ抗体で前処理をしておくと、ＮＭＯ−ＩｇＧによる補体依存的細胞傷害が抑制される事が示された。
　本発明のヒトアクアポリン４の細胞外ドメインに結合する抗アクアポリン４抗体は、視神経脊髄炎の治療に用いることができる。
配列番号１~３０　合成
配列番号３１~３９　プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (16)

  1. 　アクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合する、以下の特性を有するモノクローナル抗体又はその機能的断片：
    （１）アストロサイトに発現するヒトアクアポリン４の細胞外ドメインに結合し、ヒトアクアポリン４の細胞外ドメインのループＡを構成する、配列番号４０で表されるヒトアクアポリン４のアミノ酸配列の６２番目のＴｈｒ及び／又は６４番目のＬｙｓが形成に関与するエピトープを認識する；
    （２）アクアポリン４の細胞外ドメインに結合した場合でも、アクアポリン４の水透過性を抑制しない；及び
    （３）アクアポリン４に、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）患者が有するアクアポリン４に対する自己抗体（ＮＭＯ−ＩｇＧ）の５倍以上高いアフィニティーで特異的に結合する。
  2. 　配列番号１、配列番号３又は配列番号５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号２、配列番号４又は配列番号６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、アクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
  3. 　配列番号１に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号３に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号４に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は配列番号５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項２記載のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
  4. 　配列番号１、配列番号３又は配列番号５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、並びに配列番号２、配列番号４又は配列番号６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域からシグナル配列が除去されている、請求項２又は３に記載のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
  5. 　配列番号１に表されるアミノ酸配列のＮ末端から１９番目のＣまでのシグナル配列が除去され、配列番号３に表されるアミノ酸配列のＮ末端から１９番目のＳまでのシグナル配列が除去され、配列番号５に表されるアミノ酸配列のＮ末端から１９番目のＳまでのシグナル配列が除去され、配列番号２に表されるアミノ酸配列のＮ末端から２０番目のＧまでのシグナル配列が除去され、配列番号４に表されるアミノ酸配列のＮ末端から２０番目のＧまでのシグナル配列が除去され、配列番号６に表されるアミノ酸配列のＮ末端から２０番目のＧまでのシグナル配列が除去されている、請求項４記載のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
  6. 　以下の（ｉ）~（ｉｉｉ）の重鎖可変領域のいずれかと（ｉｖ）~（ｖｉ）の軽鎖可変領域のいずれかを含む、アクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片：
    （ｉ）　配列番号７に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｉｉ）　配列番号１３に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｉｉｉ）　配列番号１９に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２０に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２１に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｉｖ）　配列番号１０に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
    （ｖ）　配列番号１６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１８に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
    （ｖｉ）　配列番号２２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２３に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２４に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
  7. 　（ｉ）　配列番号７に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と（ｉｖ）　配列番号１０に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
    （ｉｉ）　配列番号１３に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１５に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と（ｖ）　配列番号１６に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１８に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
    （ｉｉｉ）　配列番号１９に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２０に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２１に表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と（ｖｉ）　配列番号２２に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２３に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２４に表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
    を含む請求項６記載のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
  8. 　請求項２~７のいずれか１項に記載の抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識し、該エピトープの形成にはアクアポリン４の細胞外ドメインを構成するループＡを構成するアミノ酸配列中に含まれ、配列番号４０で表されるヒトアクアポリン４のアミノ酸配列の６２番目のＴｈｒ及び／又は６４番目のＬｙｓが関与している、アクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその機能的断片。
  9. 　定常領域がヒト抗体の定常領域である、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１~８のいずれか１項に記載のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体。
  10. 　定常領域に補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性及び／又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の低減をもたらす１以上のアミノ酸の変異又は置換を有する、請求項１~９のいずれか１項に記載のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体。
  11. 　定常領域のＫａｂａｔらのＥＵインデックスにおけるアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１で表されるアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているか、又はＰ３３１で表されるアミノ酸がセリン若しくはグリシンに置換されている、請求項１０記載のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体。
  12. 　定常領域のＫａｂａｔらのＥＵインデックスにおけるアミノ酸にＫ３２６で表されるアミノ酸がＷに置換され、Ｅ３３３で表されるアミノ酸がＳに置換されている、請求項１０又は１１に記載のアクアポリン４の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体。
  13. 　請求項１~１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片を有効成分として含む、視神経脊髄炎治療薬。
  14. 　視神経脊髄炎の原因となるＭＮＯ−ＩｇＧがアストロサイトに発現しているアクアポリン４に結合するのを阻害する、請求項１３記載の視神経脊髄炎治療薬。
  15. 　請求項１３又は１４に記載の視神経脊髄炎治療薬及びステロイド剤を含む、視神経脊髄炎治療用薬剤キット。
  16. 　ステロイド剤が、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン又はプレドニンである、請求項１５記載の視神経脊髄炎治療用薬剤キット。
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