CN114106171B - 抗aqp4抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗AQP4抗体及其应用，所述抗AQP4抗体包括SEQ ID NO:32～33、SEQ ID NO:34～35、SEQ ID NO:36～37或SEQ ID NO:38～39所示的氨基酸序列。本发明的抗AQP4抗体CR5‑4、CR5‑12、CR5‑15和CR5‑20与人源AQP4蛋白M1/M23两种亚型均具有显著的结合能力，通过与自身抗体竞争结合AQP4靶点，抑制了CDC作用，配合突变型IgG1恒定区显著降低了不良反应的风险，在改善疾病的临床症状方面具有重要的应用前景。

Description

抗AQP4抗体及其应用
本申请要求申请号为202011522798.8专利申请的优先权(在先申请的申请日为2020年12月21日，发明名称为抗AQP4抗体及其应用)。
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及抗AQP4抗体及其应用。
背景技术
水通道蛋白4(AQP4)是一种分布于中枢神经系统的高选择性水跨膜转运通道蛋白。AQP4单体为一跨膜单肽链，其中，M1亚型含有323个氨基酸，M23亚型含有301个氨基酸，这两种亚型以四聚体形式聚合，M23亚型下游疏水残基相互连接形成正交颗粒矩阵(orthogonalarrays of particles，OAPs)，后者能使AQP4更有效地锚定于胞内蛋白上，并且可能与AQP4在星形胶质细胞足突上的极性分布有关。AQP4的每个单体都具有独立的转运水通道活性。
AQP4主要表达于中枢神经系统，包括脑膜表面、室管膜和脑室周围，在下丘脑视上核、小脑、海马齿状回、中缰核、脉络丛上皮、视网膜及视神经中也有表达。AQP4是中枢神经系统最主要的水通道蛋白，主要表达于星形胶质细胞和室管膜细胞上，尤其在星形胶质细胞面向软脑膜、血脑屏障基底膜、室管膜和神经元一侧的终足上表达最为丰富。AQP4是中枢神经系统的水调节和转运的重要结构基础，不同部位的AQP4发挥各自功能，共同参与脑内水稳态的维持，对于脑脊液的分泌、分布与重吸收、脑内渗透压、细胞外间隙的K+平衡起到重要调节作用。
目前认为视神经脊髓炎(NMO)的病因主要与AQP4自身抗体的存在相关。有文献报道血清NMO-IgG的滴度与NMO疾病活动相关。另外有学者向小鼠同时注射人的补体与人AQP4自身抗体，可以重现NMO的特征性损伤，如免疫复合物沉积、膜攻击复合物形成、炎性细胞浸润、脱髓鞘以及星形胶质细胞GFAP和AQP4丢失。现有治疗技术在缓解NMO症状的同时，也会引发一定的副作用。因此，有必要构建新的抗AQP4抗体降低不良反应风险。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了抗AQP4抗体及其应用，所述抗AQP4抗体能够高亲性地结合AQP4，通过与自身抗体竞争结合AQP4靶点，达到了缓解并改善临床症状的目的。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了抗AQP4抗体，所述抗AQP4抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的CDR3；
所述轻链可变区包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19所示的CDR3。
优选地，所述重链可变区还包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示的CDR1。
优选地，所述重链可变区还包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17所示的CDR2。
优选地，所述轻链可变区还包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14所示的CDR1。
优选地，所述轻链可变区还包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15或SEQID NO:18所示的CDR2。
本发明中，抗体的重链可变区的CDR1～3和轻链可变区的CDR1～3共同决定抗体对抗原的特异性识别结合能力，含有SEQ ID NO:1～6、SEQ ID NO:7～12、SEQ ID NO:1～2、13～16或SEQ ID NO:1、3、14、17～19的CDR的抗体对AQP4蛋白具有显著的结合能力，可以与自身抗体竞争结合AQP4，表现出明显的CDC抑制作用。
在一个具体实施例中，所述抗AQP4抗体CR5-4的重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、SEQ ID NO:3所示的CDR3；
所述抗AQP4抗体CR5-4的轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2、SEQ ID NO:6所示的CDR3；
SEQ ID NO:1：TSGVGVG；
SEQ ID NO:2：LIYWDDDKRYSPSLKS；
SEQ ID NO:3：RSLSSYSSNGKDAFDI；
SEQ ID NO:4：SGSSSNIGSNYLS；
SEQ ID NO:5：ENNKRPS；
SEQ ID NO:6：GTWDSSLSGVV。
本发明中，包含SEQ ID NO:1～3的重链可变区CDR和SEQ ID NO:4～6的轻链可变区CDR的抗AQP4抗体CR5-4具有AQP4蛋白结合活性，表现出明显的CDC抑制作用。
优选地，所述抗AQP4抗体CR5-4的重链可变区包括SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，轻链可变区包括SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:20：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHRSLSSYSSNGKDAFDIWGQGTMVTVSS；
SEQ ID NO:21：
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGSNYLSWYQQLPGKAPKLLIYENNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSGVVFGGGTKLTVLGQP。
在一个具体实施例中，所述抗AQP4抗体CR5-12的重链可变区包括SEQ ID NO:7所示的CDR1、SEQ ID NO:8所示的CDR2、SEQ ID NO:9所示的CDR3；
所述抗AQP4抗体CR5-12的轻链可变区包括SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2、SEQ ID NO:12所示的CDR3；
SEQ ID NO:7：SYGIS；
SEQ ID NO:8：GIIPTFATATYAQNFQG；
SEQ ID NO:9：GYYYSSGFSFYYHYGMDV；
SEQ ID NO:10：SGDKLGDKYVF；
SEQ ID NO:11：QDSKRPS；
SEQ ID NO:12：QAWDSSVGGV。
本发明中，包含SEQ ID NO:7～9的重链可变区CDR和SEQ ID NO:10～12的轻链可变区CDR的抗AQP4抗体CR5-12具有AQP4蛋白结合活性，表现出明显的CDC抑制作用。
优选地，所述抗AQP4抗体CR5-12的重链可变区包括SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，轻链可变区包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:22：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGSFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGGIIPTFATATYAQNFQGRVTITADRSTSTAYMELTSLRSEDTAVYYCAGGYYYSSGFSFYYHYGMDVWGQGTTVTVSS；
SEQ ID NO:23：
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVFWYQQKAGQSPVLVMYQDSKRPSGIPERFSGSTTGNTATLTISGTQAMDEAEYYCQAWDSSVGGVFGGGTKVTVLGQP。
在一个具体实施例中，所述抗AQP4抗体CR5-15的重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、SEQ ID NO:13所示的CDR3；
所述抗AQP4抗体CR5-15的轻链可变区包括SEQ ID NO:14所示的CDR1、SEQ ID NO:15所示的CDR2、SEQ ID NO:16所示的CDR3；
SEQ ID NO:13：RRLDDSSGYYYFDY；
SEQ ID NO:14：TGTSSDVGGYNYVS；
SEQ ID NO:15：DVSKRPS；
SEQ ID NO:16：SSYTSTVV。
本发明中，包含SEQ ID NO:1～2、13的重链可变区CDR和SEQ ID NO:14～16的轻链可变区CDR的抗AQP4抗体CR5-15具有AQP4蛋白结合活性，表现出明显的CDC抑制作用。
优选地，所述抗AQP4抗体CR5-15的重链可变区包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，轻链可变区包括SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:24：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRRLDDSSGYYYFDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:25：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSTVVFGGGTKLTVLGQP。
在一个具体实施例中，所述抗AQP4抗体CR5-20的重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:17所示的CDR2、SEQ ID NO:3所示的CDR3；
所述抗AQP4抗体CR5-20的轻链可变区包括SEQ ID NO:14所示的CDR1、SEQ ID NO:18所示的CDR2、SEQ ID NO:19所示的CDR3；
SEQ ID NO:17：LIYWDDDERYSPSLKS；
SEQ ID NO:18：EVSKRPS；
SEQ ID NO:19：SSYAGSNNYV。
本发明中，包含SEQ ID NO:1、3、17的重链可变区CDR和SEQ ID NO:14、18～19的轻链可变区CDR的抗AQP4抗体CR5-20具有AQP4蛋白结合活性，表现出明显的CDC抑制作用。
优选地，所述抗AQP4抗体CR5-20的重链可变区包括SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，轻链可变区包括SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:26：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDERYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHRSLSSYSSNGKDAFDIWGQGTMVTVSS；
SEQ ID NO:27：
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGSNNYVFGTGTKVTVLGQPK。
优选地，所述抗AQP4抗体还包括恒定区。
优选地，所述恒定区来源于IgG1、IgG2或IgG4中的任意一种。
优选地，所述IgG1具有N297A和/或K322A突变。
本发明中，IgG1上的突变位点N297A和K322A分别用于消除抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。
优选地，所述IgG2具有较低的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)，可具有S257A突变。
优选地，所述IgG4具有S228P突变，有助于提高IgG4的稳定性。
优选地，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包括SEQ IDNO:28所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区包括SEQ ID NO:29～31之一所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:28(IgG1(N297A/K322A))：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
SEQ ID NO:29(CR5-4轻链恒定区)：
KAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS；
SEQ ID NO:30(CR5-12、CR5-15轻链恒定区)：
KAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECS；
SEQ ID NO:31(CR5-20轻链恒定区)：
ANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
本发明中，抗AQP4抗体具有工程化改造Fc段，去除了CDC和ADCC功能，可以与自身抗体竞争结合AQP4靶点，还可以通过较强的内吞作用减少AQP4在星形胶质细胞的膜定位，抑制CDC和ADCC对星形胶质细胞的杀伤作用，显著降低了不良反应发生风险。
作为优选技术方案，所述抗AQP4抗体CR5-4的重链包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，轻链包括SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:32：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHRSLSSYSSNGKDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
SEQ ID NO:33：
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGSNYLSWYQQLPGKAPKLLIYENNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSGVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
作为优选技术方案，所述抗AQP4抗体CR5-12的重链包括SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，轻链包括SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:34：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGSFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGGIIPTFATATYAQNFQGRVTITADRSTSTAYMELTSLRSEDTAVYYCAGGYYYSSGFSFYYHYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
SEQ ID NO:35：
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVFWYQQKAGQSPVLVMYQDSKRPSGIPERFSGSTTGNTATLTISGTQAMDEAEYYCQAWDSSVGGVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECS。
作为优选技术方案，所述抗AQP4抗体CR5-15的重链包括SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，轻链包括SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:36：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRRLDDSSGYYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
SEQ ID NO:37：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSTVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECS。
作为优选技术方案，所述抗AQP4抗体CR5-20的重链包括SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，轻链包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:38：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDERYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHRSLSSYSSNGKDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
SEQ ID NO:39：
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGSNNYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
作为优选技术方案，所述抗AQP4抗体CR5-4/IgG4的重链包括SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，轻链包括SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:41：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHRSLSSYSSNGKDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG；
SEQ ID NO:42：
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGSNYLSWYQQLPGKAPKLLIYENNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSGVVFGGGTKLTVLGQPGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
作为优选技术方案，所述抗AQP4抗体CR5-4/IgG1(N297A)的重链包括SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，轻链包括SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:43：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHRSLSSYSSNGKDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID NO:44：
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGSNYLSWYQQLPGKAPKLLIYENNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSGVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
作为优选技术方案，所述抗AQP4抗体CR5-20/IgG4的重链包括SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，轻链包括SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:45：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDERYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHRSLSSYSSNGKDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG；
SEQ ID NO:46：
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGSNNYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
作为优选技术方案，所述抗AQP4抗体CR5-20/IgG1(N297A)的重链包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，轻链包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:47：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDERYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHRSLSSYSSNGKDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
第二方面，本发明提供了核酸分子，所述核酸分子包括编码第一方面所述的抗AQP4抗体的DNA片段。
第三方面，本发明提供了表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的核酸分子。
第四方面，本发明提供了重组细胞，所述重组细胞表达第一方面所述的抗AQP4抗体。
优选地，所述重组细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述重组细胞包括第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的抗AQP4抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将抗AQP4抗体的编码核酸连接入质粒，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
(2)提取筛选的阳性克隆的表达载体，转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述抗体。
第六方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的抗AQP4抗体。
优选地，所述药物组合物还包括抗肿瘤药物。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。
第七方面，本发明提供了第一方面所述的抗AQP4抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组细胞或第六方面所述的药物组合物在制备疾病检测试剂和/或疾病治疗药物中的应用。
优选地，所述疾病包括视神经脊髓炎。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的抗AQP4抗体CR5-4、CR5-12、CR5-15和CR5-20与AQP4蛋白M1、M23亚型具有显著的结合能力，可以与自身抗体竞争结合AQP4靶点，CDC抑制作用明显，其中，CR5-4相比于对照抗体及其他筛选抗体对AQP4/M1和AQP4/M23均具有更优的结合活性；
(2)本发明的抗AQP4抗体CR5-4和CR5-20与AQP4/M1和AQP4/M23均为强结合性，具有优异的细胞内吞性能；
(3)本发明的抗AQP4抗体具有N297A和/或K322A突变型IgG1恒定区，去除了CDC和ADCC功能，通过较强的内吞作用减少AQP4在星形胶质细胞的膜定位，抑制CDC和ADCC对星形胶质细胞的杀伤作用，显著降低了不良反应的风险；
(4)食蟹猴为抗AQP4抗体CR5-4/IgG4的相关动物种属，与大鼠、小鼠AQP4不结合；
(5)抗AQP4抗体CR5-20/eIgG1和CR5-4/IgG4具有更优的热稳定性，且具有良好的生产性，具有应用于生产实际中的价值。
附图说明
图1为经过5轮筛选获得的AQP4特异性结合肽段的亲和力检测结果；
图2为含有IgG恒定区的AQP4特异性抗体的SDS-PAGE电泳图，其中，M-蛋白分子量Marker，1-CR5-4/eIgG1，2-CR5-12/eIgG1，3-CR5-15/eIgG1，4-CR5-20/eIgG1；
图3为筛选的AQP4抗体结合AQP4 M1亚型和M23亚型的活性的检测结果；
图4A为不同抗体结合AQP4 M1亚型的能力比较结果，图4B为不同抗体结合AQP4M23亚型的能力比较结果；
图5A为CR5-4、CR5-12、CR5-15、CR5-20相比于rAb53竞争结合M23的能力，图5B为CR5-4、CR5-12、CR5-15、CR5-20相比于rAb58竞争结合M1和M23的能力；
图6A为筛选的不同浓度的AQP4抗体较rAb58的CDC抑制效果，图6B为筛选的不同浓度的AQP4抗体较rAb53的CDC抑制效果，图中，上面的基线代表对照抗体(rAb58或rAb53)诱导的CDC活性水平，下面的基线代表背景活性水平；
图7为AQP4抗体与AQP4的结合活性对细胞内吞作用的影响的检测结果；
图8A为食蟹猴脑组织冰冻切片不同抗体或血清的AQP4染色结果；
图8B为大鼠脑组织冰冻切片不同抗体或血清的AQP4染色结果；
图8C为小鼠脑组织冰冻切片不同抗体或血清的AQP4染色结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1AQP4抗体活性肽段的筛选
为了获得具有治疗效果的抗AQP4抗体，本实施例首先从噬菌体抗体库OmniMab中筛选具有特异性结合AQP4活性的肽段。噬菌体抗体库OmniMab(AP Biosciences Inc.)中收集有上百个健康供者的B细胞，并基于Hyperphage(Μ13K07ΔρΙΙΙ，Progen，Heidelberg，Germany)进行抗体展示。全长AQP4参考UniProtKB：P55087，采用瞬时表达AQP4的293细胞从OmniMab库中富集和分离AQP4特异性结合肽段，并以不表达AQP4的293细胞作为对照。
经过5轮筛选(CR5)和富集，AQP4特异性结合肽段采用流式细胞荧光分选技术(FACS)进行鉴定和分离。如图1所示，分离得到若干能特异性识别AQP4的克隆，对筛选的特异性结合片段进行测序分析，确认重链和轻链的序列信息和多样性，其中分离得到4个抗体片段CR5-4(SEQ ID NO:20～21)、CR5-12(SEQ ID NO:22～23)、CR5-15(SEQ ID NO:24～25)和CR5-20(SEQ ID NO:26～27)。
实施例2表达和纯化含有IgG恒定区的AQP4特异性抗体
为了进一步评估AQP4特异性结合肽段形成完整抗体后的理化性质，将实施例1中获得的样品的重链和轻链亚克隆至携带有工程化IgG1(N297A/K322A)(后续称为eIgG1)恒定区的IgG表达载体(AP Biosciences Inc.)上，IgG1上的两个突变位点分别用于消除抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)。
重组质粒经测序鉴定为正确插入有目的片段的阳性克隆后，使用质粒提取试剂盒制备足量无菌重组质粒，经转染试剂(Invitrogen)转染至6×106ExpiCHO中进行抗体表达。将重组ExpiCHO细胞在37℃、5％CO2中培养6天，抗体分泌至无血清细胞培养上清中，采用蛋白质A色谱法(Protein A chromatography)从细胞培养上清中亲和纯化抗体，使用DPBS缓冲液透析浓缩，采用NanoDrop2000检测蛋白浓度，采用SDS-PAGE、在非还原性(non-reducing)和还原性(reducing)条件下进行纯度和完整性检测，蛋白上样量为5μg/泳道，180V跑胶40min。凝胶进行考马斯亮蓝染色后，采用ddH2O清洗。
如图2所示，ExpiCHO细胞分泌的AQP4抗体的完整性和纯度达到95％以上，SDS-PAGE胶中几乎没有可见的片段，说明抗体的筛选、亚克隆、表达、纯化步骤不会影响抗体蛋白的结构稳定性。
实施例3基于FACS的AQP4特异性抗体的结合活性检测
本实施例利用流式细胞荧光分选技术(FACS)检测AQP4抗体与AQP4蛋白亚型M1和M23的特异性结合活性，并设置rAb53(AQP4 M23亚型强亲和性，AQP4 M1亚型弱亲和性)对照组，步骤如下：
为方便实验进行，将实施例1中获得的样品的重链和轻链亚克隆至携带有工程化IgG4(S228P)恒定区的IgG表达载体(AP Biosciences Inc.)上，IgG4上的S228P突变可提高二聚体间稳定性。
IgG4(S228P)恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示：
SEQ ID NO:40：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG。
重组质粒经测序鉴定为正确插入有目的片段的阳性克隆后，使用质粒提取试剂盒制备足量无菌重组质粒，经转染试剂(Invitrogen)转染至6×106个ExpiCHO细胞中进行抗体表达。将重组ExpiCHO细胞在37℃、5％CO2中培养6天，抗体分泌至无血清细胞培养上清中，采用蛋白质A色谱法(Protein A chromatography)从细胞培养上清中亲和纯化抗体。
利用转染试剂将AQP4 M1和M23编码基因分别导入Expi293细胞中，收集3×105个AQP4阳性细胞重悬于含有2％FBS的DPBS中，孵育1h后收集细胞并用DPBS清洗3次；
使用封闭液配制30nM抗体稀释液，加入到AQP4阳性细胞中，共孵育1h后收集细胞沉淀并用DPBS清洗，随后加入Alexa Fluor 488标记羊抗人IgG二抗(Invitrogen)，孵育一段时间后清洗细胞，重悬于DPBS中进行流式检测(Attune NxT Flow Cytometer system，ThermoFisher SCIENTIFIC)。
如图3所示，对照抗体rAb53表现出AQP4 M23强亲和性和AQP4 M1弱亲和性，而CR5-4/IgG4、CR5-12/IgG4、CR5-15/IgG4和CR5-20/IgG4对M1和M23均具有不同程度的结合活性，其中，CR5-4/IgG4对AQP4 M1和M23亚型均有较好的结合活性。
实施例4不同AQP4特异性抗体与M1/M23结合活性的比较
本实施例利用流式细胞荧光分选技术(FACS)比较不同AQP4抗体与AQP4蛋白亚型M1和M23的结合活性，并设置rAb53和rAb58对照组，步骤如下：
将AQP4 M1和M23编码基因分别导入CHO-S细胞中，抗生素筛选得到稳定表达M1的6G10细胞克隆和稳定表达M23的1B10细胞克隆；
收集3×105个AQP4阳性细胞重悬于含有2％FBS的DPBS中，孵育1h后收集细胞并用DPBS清洗3次；
使用封闭液配制梯度稀释的抗体溶液(从900nM开始进行4倍稀释)，加入到AQP4阳性细胞中，共孵育1h后收集细胞并用DPBS清洗，随后加入Alexa Fluor 488标记羊抗人IgG二抗(Invitrogen)，孵育一段时间后清洗细胞，重悬于DPBS中进行流式检测(Attune NxTFlow Cytometer system，ThermoFisher SCIENTIFIC)。
如图4A和图4B所示，CR5-4、CR5-20、CR5-15和rAb58对M1和M23均具有结合能力，其中，CR5-4表现出最强的结合能力；CR5-12和rAb53仅对M1亚型具有非常低的结合能力。
实施例5竞争法检测AQP4抗体与AQP4的结合能力
本实施例利用流式细胞荧光分选技术(FACS)检测AQP4抗体与AQP4对照抗体的竞争结合AQP4的能力，步骤如下：
收集3×105个AQP4 M1阳性细胞/M23阳性细胞重悬于含有2％FBS的DPBS中，孵育1h后收集细胞沉淀并用DPBS清洗3次；
使用封闭液配制200nM AQP4抗体、50nM生物素标记rAb53和50nM生物素标记rAb58(Abcam，cat#ab201796)，加入到AQP4阳性细胞中，共孵育1h后收集细胞沉淀并用DPBS清洗，随后加入Alexa Fluor 488标记链霉亲和素(Abcam，cat#ab7403)，孵育一段时间后清洗细胞，重悬于DPBS中进行流式检测(Attune NxT Flow Cytometer system，ThermoFisherSCIENTIFIC)。
如图5A和图5B所示，相比于rAb53，CR5-4、CR5-12、CR5-15、CR5-20均表现出良好的竞争结合M23的能力；相比于rAb58，只有CR5-4表现出竞争结合M1和M23的能力。
实施例6基于CDC抑制实验检测AQP4抗体的竞争能力
本实施例利用rAb53/IgG1或rAb58/IgG1结合补体激活血清诱导AQP4阳性ExpiCHO细胞发生补体依赖的细胞毒性(CDC)，步骤如下：
将2×104个AQP4阳性ExpiCHO细胞接种于96孔板的每孔中，与中和抗体于室温共孵育20min，随后加入含有10μg/mL rAb53/rAb58和6.25％血清的培养液至终体积为200μL；37℃孵育2h，采用碘化丙啶(propidium iodide)进行死细胞染色，进行流式检测(AttuneNxT Flow Cytometer system，ThermoFisher SCIENTIFIC)。
结果如图6A和图6B所示，在AQP4/M1细胞中，CR5-4和CR5-20均明显抑制了rAb58/IgG1诱导的CDC活性，其中，CR5-4的中和活性最强。然而，CR5-4的这一抑制作用在AQP4/M23细胞中不甚显著；CR5-12、CR5-15和CR5-20相比于rAb53的竞争力也不高。
实施例7细胞对AQP4抗体的内吞作用
为评价AQP4抗体与AQP4的结合活性对细胞内吞作用的影响，本实施例采用pH敏感性染料pHAb(Promega，cat#G9841)标记AQP4抗体，利用SpectraMax iD3 reader定量检测内吞抗体水平。pHAb在内涵体和溶酶体等酸性环境中发出强荧光信号，但在胞外中性环境中(pH约等于7)不发荧光。
稳定表达AQP4 M1或M23的CHO细胞预先接种于标准96孔板中，随后加入不同浓度的pHAb标记AQP4抗体，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育24h促进细胞对AQP4抗体的内吞作用，24h后采用SpectraMax iD3 reader进行荧光检测(Ex:532/Em:580)。
图7所示为AQP4阳性CHO细胞与不同浓度的pHAb标记AQP4抗体共孵育后的pHAb荧光信号，CR5-4和CR5-20在M1和M23 CHO细胞中均表现出优异的内吞性能，这两种抗体对M1和M23亚型均为强结合性。
实施例8基于免疫荧光技术评估AQP4抗体种属相关性
应用免疫荧光技术，通过观察CR5-4/IgG4与不同动物种属(食蟹猴、大鼠和小鼠)脑组织冰冻切片的结合情况，推测CR5-4/IgG4的相关动物种属。试验分为受试物组、阳性血清组(NMO患者AQP4自身抗体阳性血清)、阴性血清组(正常人血清)，各种属的冰冻组织切片在用受试物/阳性血清/阴性血清孵育的同时，需要用AQP4商业抗体和DAPI染料进行复染。主要试验步骤如下：
CR5-4/IgG4、阳性血清、阴性血清分别使用PBST(0.5％Triton X100的PBS溶液)稀释备用，分别作为一抗与切片室温孵育1小时，PBST洗涤3次后，相应二抗使用PBST按1:200稀释，向组织切片中加入，室温孵育30分钟，洗涤后，再用商业抗体作为一抗进行复染。上述步骤结束后，加入DAPI溶液染核，荧光显微镜下观察。
结果见图8A、图8B和图8C，商业抗体在食蟹猴、大鼠及小鼠脑组织上均可检测到阳性荧光信号，而CR5-4/IgG4仅在食蟹猴脑组织上有阳性荧光信号，说明CR5-4/IgG4与食蟹猴AQP4结合，而与大鼠、小鼠AQP4不结合，食蟹猴为CR5-4/IgG4相关动物种属。
实施例9抗体恒定区替换
为比较不同抗体恒定区对理化性质的影响，筛选具备更优可生产性的AQP4抗体，在CR5-4/eIgG1、CR5-20/eIgG1、CR5-4/IgG4和CR5-20/IgG4的基础上，将恒定区替换为IgG1(N297A)，形成CR5-4/IgG1(N297A)、CR5-20/IgG1(N297A)，共计6个抗体，抗体编号与名称的对应关系见表1。
表1
抗体编号 抗体名称
CR5-4-1 CR5-4/eIgG1
CR5-4-2 CR5-4/IgG4
CR5-4-3 CR5-4/IgG1(N297A)
CR5-20-1 CR5-20/eIgG1
CR5-20-2 CR5-20/IgG4
CR5-20-3 CR5-20/IgG1(N297A)
其中，
CR5-4-1(CR5-4/eIgG1)的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；
CR5-4-2(CR5-4/IgG4)的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；
CR5-4-3(CR5-4/IgG1(N297A))的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示；
CR5-20-1(CR5-20/eIgG1)的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
CR5-20-2(CR5-20/IgG4)的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示；
CR5-20-3(CR5-20/IgG1(N297A))的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
将上述抗体进行基因合成构建重组质粒，重组质粒经测序鉴定为正确插入有目的片段的阳性克隆后，使用质粒提取试剂盒制备足量无菌重组质粒，用于瞬时转染生产蛋白样品。
实施例10不同恒定区抗体生产
将CR5-4-1/2/3和CR5-20-1/2/3共计6组无菌重组质粒，经转染试剂(PEI)转染至1.1×106个HEK293F细胞中进行抗体表达。将重组HEK293F细胞在36.5℃、8％CO2中培养7天，抗体分泌至无血清细胞培养上清中。
取培养第7天发酵液检测检测proteinA-HPLC和SEC-HPLC，分析抗体浓度和纯度，结果如表2所示。
表2发酵液中样品浓度和SEC-HPLC纯度
Figure BDA0003384288360000111
Figure BDA0003384288360000121
收取细胞上清液进行纯化，纯化方法如下：
收集培养后的上清液，经过亲和层析柱(Mabselect Prism A)纯化获得所述抗体。
(1)前平衡：使用平衡缓冲液(20mM PB、150mM NaCl，pH 7.4)对层析柱进行前平衡；
(2)上样：上清液上样；
(3)后平衡：使用平衡缓冲液(20mM PB、150mM NaCl，pH 7.4)对层析柱进行后平衡；
(4)预洗：使用预洗缓冲液1(20mM柠檬酸-柠檬酸钠、1M NaCl，pH 5.5)和预洗缓冲液2(20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH 5.5)依次进行预洗；
(5)洗脱：使用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH 3.5)进行洗脱，获得抗体。
纯化后抗体样品，使用紫外分光光度计检测浓度，使用SEC-HPLC检测纯度，结果如表3所示。
表3纯化样品浓度和SEC-HPLC纯度
Figure BDA0003384288360000122
实施例11纯化样品理化性质分析
将样品脱盐后，用蒸馏水稀释至蛋白浓度约为2mg/mL，按以下体系配置(200μL体系)：8μL 2％pharmalyte(GE，Cat#17045601)(pH 3～10)，70μL 1％MC(ProteinSimple，Cat#1018761)，1μL Low pI(ProteinSimple，Cat#102222)，1μL High pI(ProteinSimple，Cat#101996)，100μL 8M尿素(Sigma，Cat#U0631-500G1)，20μL样品。体系配置于离心管后，10000g离心5min，取上清(60～120μL)加入内插管，内插管置于离心管中，10000g离心5min，取出内插管，放于进样瓶中，上机检测，设备为ProteinSimple iCE3。结果显示，实际等电点略高于预测的等电点。
将蛋白样品用30μm超滤离心管(Sartorius，Cat#VS0122)超滤，然后制备样品，70℃加热，上样，25℃下进行CE-SDS分离，设备为SCIEX PA800 Plus，检测器为PDA检测器，在220nm处测定吸光值。最后采用32karat进行数据采集和分析，结果如表4所示，结果显示6个抗体样品纯度均高于90％，可以进行后续实验。
表4
Figure BDA0003384288360000123
Figure BDA0003384288360000131
实施例12抗体的蛋白稳定性检测
本实施例采用蛋白稳定性分析系统
Figure BDA0003384288360000132
(Unchained Labs，Calif.)的Tm&Taggwith optional DLS程序，检测蛋白粒径和稳定性。通过分析结果参数Tm(蛋白熔解温度)、Tagg266(蛋白聚集温度)、Tagg473(蛋白聚集温度)、Z-Ave.Dia(蛋白平均粒径)、PDI(多分散性系数)、Pk1 Mode Dia、Pk1 Mass(％)、Pk2 Mode Dia和Pk2 Mass(％)9个参数，多角度分析蛋白粒度及粒度分布和热稳定性。步骤如下：
取抗体9μL加入uni管(Unchained Labs，Calif.)中，每种抗体重复2个复孔，选定Tm&Tagg with optional DLS程序进行分析。
25℃和95℃粒度结果分别如表5和表6所示，Tm&Tagg结果如表7所示。其中Z-Ave.Dia-样品平均水化动力学直径，反映样品整体粒径情况；PDI-多分散性系数，PDI<0.1表示粒度窄分布，值越大表示粒径分布越不均一，离散程度越高；Fit Var.-拟合偏差，小于0.01表示Z-Ave.Dia和PDI高可信度，值越大表示可信度越低；Pk1 Mode Dia-光强分布显示多峰时，第一个主峰的众数粒径；Pk1 Mass(％)-第一个峰的质量占比。
从表5可以看出，6个抗体的平均水化动力学直径较大，均存在较大粒径成分，且PDI>0.2，推测有聚集体；Pk1 Mass(％)均大于99％；其中CR5-20-3和CR5-4-3的众数粒径(Pk1 Mode Dia)较小。从表6可以看出，由平均水化动力学直径和PDI可知，经过加热后蛋白分子产生明显聚集，与SLS结果一致。从表7可以看出，CR5-20-1Tm较高，推测结构热稳定性较高；CR5-20-2和CR5-4-2的Tagg266均在50℃以下，推测胶体热稳定性较低。
表5 25℃粒度结果
Figure BDA0003384288360000133
Figure BDA0003384288360000141
表6 95℃粒度结果
Figure BDA0003384288360000142
表7 Tm&Tagg结果
Figure BDA0003384288360000143
Figure BDA0003384288360000151
综合分析，CR-20-1和CR5-4-2，即CR5-20/eIgG1和CR5-4/IgG4综合热稳定性较高，可以进行生产性评估。
实施例13CR5-4-2和CR5-20-1生产性评估
CR5-4-2和CR5-20-1两个抗体的表达质粒瞬时转染293细胞，每个抗体使用6个500mL摇瓶进行生产，培养7天后，对全部发酵液进行ProteinA-HPLC检测蛋白表达量。步骤如下：
将发酵液样品用0.22μm滤膜(Sartorius，Cat#17C07FT)过滤后，上样至Poros-20AColumn(Thermo Scientific，Cat#1-5024-12)，25℃下进行ProteinA-HPLC检测，色谱参数见表8，结果如表9所示。
表8 ProteinA-HPLC色谱参数
Figure BDA0003384288360000152
表9 ProteinA-HPLC蛋白表达量
Figure BDA0003384288360000153
Figure BDA0003384288360000161
抽取671FT500(37#)-1和671FT500(37#)-7的发酵液进行SEC-HPLC检测蛋白纯度，步骤如下：
将蛋白样品用0.22μm滤膜(Sartorius，Cat#17C07FT)过滤后，上样至TSKgelG3000 SWXL SEC Column(Tosoh，Cat#008541)，25℃下进行SEC分离，设备为Waters e2695，检测器为Waters 2998 PDA检测器，流动相为50mM磷酸盐+400mM氯化钠缓冲液(pH 7.0)，设置流速为0.5mL/min，进样体积为10μL，在280nm处测定分离的各组分吸光值。最后采用Empower 3进行数据采集和分析，结果如表10所示。
表10发酵液纯度
Figure BDA0003384288360000162
CR5-4-2和CR5-20-1两个抗体的发酵液合批进行PrismA捕获浓缩后，利用紫外分光光度计测定蛋白浓度。步骤如下：
取供试品溶液，以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照。采用1cm的石英吸收池，将样品用空白溶剂进行稀释，将装有样品的石英吸收池放入检测池检测。紫外分光光度计为IMPLEN，型号NP80。
蛋白浓度计算公式如下：
Figure BDA0003384288360000163
式中，X：稀释倍数；
Figure BDA0003384288360000164
：供试品蛋白的吸收系数。
结果如表11所示。
表11纯化样品蛋白浓度
Figure BDA0003384288360000165
CR5-4-2和CR5-20-1两个抗体的发酵液合批进行PrismA捕获浓缩后，进行SEC-HPLC分析其纯度。步骤如下：
将蛋白样品用0.22μm滤膜(Sartorius，Cat#17C07FT)过滤后，用流动相稀释至蛋白浓度约为5mg/mL，上样至TSKgel G3000 SWXL SEC Column(Tosoh，Cat#008541)，25℃下进行SEC分离，设备为Waters e2695，检测器为Waters 2998 PDA检测器，流动相为50mM磷酸盐+400mM氯化钠缓冲液(pH 7.0)，设置流速为0.5mL/min，进样体积为10μL，在280nm处测定分离的各组分吸光值。最后采用Empower 3进行数据采集和分析，结果如表12所示。实验结果表明CR5-4-2和CR5-20-1两个抗体具有较好的生产性。
表12纯化样品SEC-HPLC纯度
Figure BDA0003384288360000171
综上所述，本发明所述的AQP4抗体CR5-4、CR5-12、CR5-15和CR5-20与AQP4蛋白M1、M23亚型具有显著的结合能力，可以与自身抗体竞争结合AQP4靶点，并通过较强的内吞作用减少AQP4在星形胶质细胞的膜定位，抑制CDC和ADCC对星形胶质细胞的杀伤作用，缓解不良反应；半衰期长，溶解性良好，稳定性高，在相关药物的制备中具有重要的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 天士力生物医药股份有限公司
<120> 抗AQP4抗体及其应用
<130> 2021
<160> 47
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
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Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
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Arg Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Asp Ala Phe Asp Ile
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Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Leu Ser
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1 5
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Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val
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Ser Tyr Gly Ile Ser
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Gly Ile Ile Pro Thr Phe Ala Thr Ala Thr Tyr Ala Gln Asn Phe Gln
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Gly
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<213> 人工序列
<400> 9
Gly Tyr Tyr Tyr Ser Ser Gly Phe Ser Phe Tyr Tyr His Tyr Gly Met
1 5 10 15
Asp Val
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Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val Phe
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Gln Ala Trp Asp Ser Ser Val Gly Gly Val
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Arg Arg Leu Asp Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
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Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser
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Ser Ser Tyr Thr Ser Thr Val Val
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Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
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Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser
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Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Tyr Val
1 5 10
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<213> 人工序列
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Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Thr Phe Ala Thr Ala Thr Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ser Ser Gly Phe Ser Phe Tyr Tyr His Tyr
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Thr Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Val Gly Gly
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Arg Leu Asp Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Thr
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
<210> 26
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Asn Asn Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys
<210> 28
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 29
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
1 5 10 15
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
20 25 30
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
35 40 45
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
50 55 60
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
85 90 95
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 30
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
1 5 10 15
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
20 25 30
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
35 40 45
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
50 55 60
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
85 90 95
Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100
<210> 31
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
1 5 10 15
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
20 25 30
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly
35 40 45
Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
65 70 75 80
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
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Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<210> 32
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 32
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
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Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
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Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
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Cys Ala His Arg Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
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Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
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Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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290 295 300
Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455
<210> 33
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 34
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Thr Phe Ala Thr Ala Thr Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ser Ser Gly Phe Ser Phe Tyr Tyr His Tyr
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
130 135 140
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
195 200 205
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
210 215 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
275 280 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys
325 330 335
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455
<210> 35
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Thr Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Val Gly Gly
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
115 120 125
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
130 135 140
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
145 150 155 160
Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
165 170 175
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
180 185 190
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
195 200 205
Pro Ala Glu Cys Ser
210
<210> 36
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 36
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Arg Leu Asp Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 37
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Thr
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Ala Glu Cys Ser
210
<210> 38
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 38
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455
<210> 39
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 39
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Asn Asn Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 40
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 41
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 41
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
325 330 335
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Gly
450
<210> 42
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 42
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 43
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 43
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 44
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 44
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 45
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 45
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
325 330 335
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Gly
450
<210> 46
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 46
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Asn Asn Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 47
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 47
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455

Claims (29)

1.抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述抗AQP4抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQ ID NO:2所示的CDR2、如SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述抗AQP4抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDR1、如SEQ ID NO:5所示的CDR2、如SEQ ID NO:6所示的CDR3；
或，所述抗AQP4抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:7所示的CDR1、如SEQ ID NO:8所示的CDR2、如SEQ ID NO:9所示的CDR3；所述抗AQP4抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:10所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2、如SEQ ID NO:12所示的CDR3；
或，所述抗AQP4抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQ ID NO:2所示的CDR2、如SEQ ID NO:13所示的CDR3；所述抗AQP4抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDR1、如SEQ ID NO:15所示的CDR2、如SEQ ID NO:16所示的CDR3；
或，所述抗AQP4抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQ ID NO:17所示的CDR2、如SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述抗AQP4抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDR1、如SEQ ID NO:18所示的CDR2、如SEQ ID NO:19所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体还包括恒定区。
7.根据权利要求6所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述恒定区来源于IgG1、IgG2或IgG4中的任意一种。
8.根据权利要求7所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区。
9.根据权利要求8所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述重链恒定区包括如SEQ IDNO:28所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述轻链恒定区包括如SEQ IDNO:29～31之一所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链包括如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，轻链包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求10所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链包括如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，轻链包括如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求10所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，轻链包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求10所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，轻链包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求10所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链包括如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，轻链包括如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求10所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，轻链包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求10所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，轻链包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求10所述的抗AQP4抗体，其特征在于，所述抗AQP4抗体的重链包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，轻链包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
19.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1-18中任一项所述的抗AQP4抗体的DNA片段。
20.表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求19所述的核酸分子。
21.重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1-18中任一项所述的抗AQP4抗体。
22.根据权利要求21所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的基因组中整合有权利要求19所述的核酸分子。
23.根据权利要求21所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括权利要求20所述的表达载体。
24.一种权利要求1-18中任一项所述的抗AQP4抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将抗AQP4抗体的编码核酸连接入质粒，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
(2)提取筛选的阳性克隆的表达载体，转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述抗体。
25.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-18中任一项所述的抗AQP4抗体。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括抗肿瘤药物。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。
28.权利要求1-18中任一项所述的抗AQP4抗体、权利要求19所述的核酸分子、权利要求20所述的表达载体、权利要求21-23中任一项所述的重组细胞或权利要求25-27中任一项所述的药物组合物在制备疾病检测试剂中的应用，所述疾病为视神经脊髓炎。
29.权利要求1-18中任一项所述的抗AQP4抗体、权利要求19所述的核酸分子、权利要求20所述的表达载体、权利要求21-23中任一项所述的重组细胞或权利要求25-27中任一项所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用，所述疾病为视神经脊髓炎。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023235666A2 (en) * 2022-05-31 2023-12-07 Vanderbilt University Human antibodies to bordetella pertussis and uses therefor
CN116819072B (zh) * 2023-08-28 2023-11-17 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 一种用于抗aqp4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒
CN117304314A (zh) * 2023-09-28 2023-12-29 首都医科大学宣武医院 Aqp4抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014196658A1 (ja) * 2013-06-06 2014-12-11 学校法人慶應義塾 NMO-IgGに拮抗する抗アクアポリン４抗体
WO2016033509A1 (en) * 2014-08-29 2016-03-03 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Aquaporin-4 antibodies and uses thereof for the treatment of neuromyelitis optica
CN108129563A (zh) * 2018-01-12 2018-06-08 辽宁何氏医学院 一种抗aqp4的小分子抗体及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014196658A1 (ja) * 2013-06-06 2014-12-11 学校法人慶應義塾 NMO-IgGに拮抗する抗アクアポリン４抗体
WO2016033509A1 (en) * 2014-08-29 2016-03-03 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Aquaporin-4 antibodies and uses thereof for the treatment of neuromyelitis optica
CN108129563A (zh) * 2018-01-12 2018-06-08 辽宁何氏医学院 一种抗aqp4的小分子抗体及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lukmanee Tradtrantip等.Anti-aquaporin-4 monoclonal antibody blocker therapy for neuromyelitis optica.《Ann Neurol》.2012,第71卷(第3期),第314-322页. *
武雷等.水通道蛋白4抗体在视神经脊髓炎发病机制中的作用.《中国神经免疫学和神经病学杂志》.2011,第18卷(第06期),第57-60页. *

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