JP6236478B2 - 血清アミロイドｐ成分に特異的な抗原結合タンパク質 - Google Patents

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Description

本発明は、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）、そのような抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記抗原結合タンパク質を含んでなる医薬組成物、および製造方法に関する。本発明はまた、全身性アミロイドーシス、局所性アミロイドーシス、アルツハイマー病および２型糖尿病を含んでなるアミロイド沈着を伴う疾患の治療または予防におけるそのような抗原結合タンパク質の使用にも関する。
アミロイドーシスは、アミロイド原線維として知られる異常な不溶性タンパク質繊維が組織の細胞外に蓄積することによって引き起こされる重篤かつ通常は致死性の疾患である。これらは、その疾患の種々の形態において２０種を超える異なるタンパク質に由来するが、すべてのアミロイド原線維が、共通のクロスβコア構造を共有し、そのすべてが、正常では可溶性の前駆体タンパク質のミスフォールディングによってもたらされる（Ｐｅｐｙｓ，Ｍ．Ｂ．（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，５７：２２３−２４１）。正常な非原線維の血漿タンパク質である血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）も、すべてのタイプのアミロイド原線維に対する高度に特異的なカルシウム依存性結合を理由にアミロイド沈着物中に常に存在する（Ｐｅｐｙｓ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３８：２８４−２９３、Ｐｅｐｙｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｍｙｌｏｉｄ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４：２７４−２９５）。
ヒトＳＡＰは、およそ２０〜４０ｍｇ／ｌの濃度で血漿中に存在する構成タンパク質であり（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２００：１９１−２００）、正常個体とアミロイドーシス以外の疾患を有する患者との両方の血漿と血管外コンパートメントとを混合したものにおいて合計約５０〜１００ｍｇのＳＡＰが存在する（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６：１８６２−１８６９）。アミロイドーシスを有する患者では、ＳＡＰは、アミロイド沈着物中に特に濃縮されており、広範な全身性アミロイドーシスを有する個体では、アミロイド中に２０，０００ｍｇものＳＡＰが存在することがあり（Ｐｅｐｙｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ，９１：５６０２−５６０６）、原線維に可逆的に結合し、体液相のＳＡＰプールと平衡状態で存在する場合がある。循環ＳＡＰの正常な生理学的機能については十分に理解されていないが、動物実験およびインビトロ研究から、宿主の防御における役割が示唆されている（Ｎｏｕｒｓａｄｅｇｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ，９７：１４５８４−１４５８９）。ＳＡＰは、弾性線維および糸球体基底膜に関連する正常組織のマトリックス成分でもあるが、それらのその部分における機能は不明である。
アミロイドーシスでは、細胞外のアミロイド沈着物は、構造を損傷するまで、ゆえにそれが占有するすべての組織の機能を損傷するまで、進行性蓄積による疾患を引き起こす（Ｐｅｐｙｓ，Ｍ．Ｂ．（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，５７：２２３−２４１）。組織で局所的に見られるかまたは炎症の全身性マーカーによって示唆されるアミロイド沈着に対する任意の炎症性反応または「異物」反応は、非常に稀である。全身性アミロイドーシスは、いずれの器官も関わることができ、通常、致死性であり、先進国では１０００例あたり約１例の死亡を引き起こしている。単一の解剖学的位置または組織タイプに限局される局在アミロイドもまた、非常に深刻であり得、例えば、脳アミロイドアンギオパチーは、出血性脳卒中の重要な原因である。アミロイドーシスの臨床像は、極めて多種多様であり、かなりの器官損傷を呈する前に診断されることは稀である。２０種を超える異なるアミロイド原線維タンパク質が、種々の形態のアミロイドーシスに関与するが、それぞれのアミロイド原線維前駆体タンパク質の存在量を実質的に減少させる治療は、アミロイドの蓄積を停止し、沈着物を消失させ得る。残念ながら、有効な測定法が必ずしも利用可能であるとは限らず、そのような測定法が存在したとしても、毒性または有害であり、作用するのに手間取る（Ｐｅｐｙｓ，Ｍ．Ｂ（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，５７：２２３−２４１）。ゆえに、確立されたアミロイド沈着物のクリアランスを安全に促進する治療について未だ満たされていない大きな医学上のニーズが存在する。さらに、アミロイド沈着物が常に存在する他の状態（最も重要なものとして、アルツハイマー病（ＡＤ）および２型真性糖尿病）が存在するが、それらにおいては、疾患の病原（具体的には、それぞれ認知機能および膵島機能の喪失）に対するアミロイド沈着の関与は不明である（Ｐｅｐｙｓ，Ｍ．Ｂ．（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，５７：２２３−２４１）。しかしながら、体内のどこのアミロイド沈着物も確実に病原性であり、ＡＤにおける大脳の沈着物および２型糖尿病における膵島のアミロイド沈着物も有害である可能性が高い。全身性アミロイドーシスにおいてアミロイド沈着物を除去する治療は、間違いなく治療に役立つので（Ｐｅｐｙｓ，Ｍ．Ｂ．（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，５７：２２３−２４１）、ＡＤおよび２型糖尿病においてアミロイド沈着物を除去することも、臨床上有益であるはずである。
ＳＡＰの結合は、アミロイド原線維を安定化し、インビトロではそれらをタンパク質分解から保護し（Ｔｅｎｎｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＰＮＡＳ，９２：４２９９−４３０３）、インビトロではアミロイド原線維形成を増強することができ（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５：２３１１−２３２１）、インビボでは全身性アミロイドーシスの病原の一因となる（Ｂｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３：８５５−８５９）。すべてのアミロイド沈着物にＳＡＰが普遍的に存在することに加えて、ＳＡＰのこれらの特性のおかげで、ＳＡＰは魅力的な治療標的となる。
欧州特許出願ＥＰ０９１５０８８には、アミロイド原線維へのＳＡＰの結合の競合的阻害剤であるＤ−プロリン誘導体化合物、ならびにその製造方法が開示されている。欧州特許出願ＥＰ０９１５０８８に開示されている好ましい化合物は、（Ｒ）−１−［６−［（Ｒ）−２−カルボキシ−ピロリジン−１−イル］−６−オキソオキソヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸（ＣＰＨＰＣ）である。
国際公開第０３／０５１８３６号には、Ｄ−プロリン誘導体化合物のプロドラッグが開示されている。
国際公開第２００４／０９９１７３号には、アミロイド原線維へのＳＡＰの結合の競合的阻害剤である、グリセロール環状ピルビン酸塩（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｃｙｃｌｉｃ ｐｙｒｕｖａｔｅ）誘導体が開示されている。
国際公開第０４／０５９３１８号には、ＳＡＰに結合する組成物の提供を含む、線維細胞の形成を増強すると断定されている方法が記載されている。そのような組成物は、抗ＳＡＰ抗体およびＣＰＨＰＣを含む。国際公開第０４／０５９３１８号には、アミロイド沈着を伴う疾患の治療は開示されていない。さらに、ＳＡＰもその枯渇も、ヒトの線維症に対して何ら影響しないという有力な臨床上の証拠およびインビボの証拠が存在する（Ｔｅｎｎｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，５６：２０１３−２０１７、Ｐｅｐｙｓ，Ｍ．Ｂ．，Ｔｅｎｎｅｎｔ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ Ｄｅｎｔｏｎ，Ｃ．Ｐ．（２００７）Ｒｅｐｌｙ ｔｏ Ｌｅｔｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｐｉｌｌｉｎｇ，Ｄ．，Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｃ．Ｄ．，Ｓａｌｍｏｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｇｏｍｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｃｏｍｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ａｒｔｉｃｌｅ ｂｙ Ｔｅｎｎｅｎｔ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，５６：４２２９−４２３０）。
上に列挙された特許で開示されたビス−Ｄ−プロリン化合物であるＣＰＨＰＣは、高親和性でヒトＳＡＰに結合され、インビボにおいてアミロイド沈着物からＳＡＰを除去し、それによりそれらのクリアランスを促進する薬物として意図された。ＳＡＰによるＣＰＨＰＣの結合は、肝臓によるその複合体の迅速なクリアランスを誘発し、その薬物が投与されている限り、ほとんどすべての循環ＳＡＰを枯渇させ、アミロイドに結合したＳＡＰのすべてではないが多くを除去する（Ｐｅｐｙｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１７：２５４−２５９）。最初の臨床研究では（Ｇｉｌｌｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２１４１．２００９．０８０３６．ｘ）、ＣＰＨＰＣの投与は、アミロイドの蓄積を停止するとみられたが、アミロイドの退縮をもたらさず、ＣＰＨＰＣはアミロイド沈着物からすべてのＳＡＰを完全に除去するわけではないので、別のアプローチが必要である。
国際公開第２００９／０００９２６号には、アミロイドーシスを治療または予防するための、ＳＡＰに特異的な抗体と併用される、循環からＳＡＰを枯渇させる化合物（例えば、Ｄ−プロリン誘導体、特に、ＣＰＨＰＣ）の使用が開示されている。
関連する国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１１１３５は、アミロイドーシスを治療または予防するための、循環からＳＡＰを枯渇させる化合物（例えば、Ｄ−プロリン誘導体、特に、ＣＰＨＰＣ）と併用して使用され得る様々なマウスモノクローナル抗体に関する。
欧州特許出願第０９１５０８８号明細書 国際公開第０３／０５１８３６号パンフレット 国際公開第２００４／０９９１７３号パンフレット 国際公開第０４／０５９３１８号パンフレット 国際公開第２００９／０００９２６号パンフレット ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１１１３５
Pepys,M.B.(2006)Annu.Rev.Med.,57:223-241 Pepys et al.(1979)Clin.Exp.Immunol.,38:284-293 Pepys et al.(1997)Amyloid:Int.J.Exp.Clin.Invest.,4:274-295 Nelson et al.(1991)Clin.Chim.Acta,200:191-200 Hawkins et al.(1990)J.Clin.Invest.,86:1862-1869 Pepys et al.(1994)PNAS,91:5602-5606 Noursadeghi et al.(2000)PNAS,97:14584-14589 Tennent et al.,(1995)PNAS,92:4299-4303 Myers et al.,(2006),Biochemistry,45:2311-2321 Botto et al.,(1997)Nature Med.,3:855-859 Tennent et al.,(2007)Arthritis Rheum.,56:2013-2017 Pepys, M.B., Tennent, G.A. and Denton, C.P. (2007) Reply to Letter from Pilling, D., Buckley, C.D., Salmon, M. and Gomer, R.G., Serum amyloid P and fibrosis in systemic sclerosis:comment on the article by Tennent et al. Arthritis Rheum., 56: 4229-4230 Pepys et al., (2002) Nature, 417: 254-259 Gillmore et al., (2010) Brit. J. Haematol., doi:10.1111/j.1365-2141.2009.08036.x
したがって、器官の機能を保存するためおよび延命するために、ＳＡＰを特異的に標的にし、かつアミロイド沈着を伴う疾患を有する患者、特に、ヒト患者において改善された治療効果を提供する、抗体、特に、ヒト化抗体またはヒト抗体が当該分野において必要とされている。
本発明は、第１の態様において、ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号７の重鎖可変領域配列および配列番号９の軽鎖可変領域配列を含む参照抗体とＳＡＰへの結合について競合する、抗原結合タンパク質を提供する。
本発明の第２の態様では、ＳＡＰに結合し、かつ配列番号３に示されるＣＤＲＨ３またはＣＤＲＨ３の機能的変異体を含んでなる、抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の第３の態様では、ＳＡＰに特異的に結合する抗原結合タンパク質が提供され、ここで、その抗原結合タンパク質は、配列番号７の可変ドメイン配列の対応するＣＤＲＨ３またはＣＤＲＨ３の機能的変異体を含んでなる、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
本発明の第４の態様では、ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号７のＫａｂａｔ残基９５〜１０１を含んでなる結合単位Ｈ３または結合単位Ｈ３の機能的変異体を含んでなる、抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の第５の態様では、ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号２７〜３１から選択される重鎖可変領域、および／もしくは配列番号３４〜３６から選択される軽鎖可変領域、または７５％以上の配列同一性を有する変異体重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の第６の態様では、ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号６２の重鎖、および／もしくは配列番号６４の軽鎖、または７５％以上の配列同一性を有する変異体重鎖もしくは軽鎖を含んでなる、抗原結合タンパク質が提供される。
本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子、それを含んでなる発現ベクター、および本発明の抗原結合タンパク質を産生することができる宿主細胞を提供する。
本発明のさらなる態様では、本明細書中で定義されるような抗原結合タンパク質を含んでなる医薬組成物が提供される。本発明はまた、アミロイド沈着を伴う疾患に罹患しやすいまたは罹患している被験体を予防および／または治療する方法を提供し、その方法は、予防的または治療的に有効な量の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与する工程を包含する。アミロイド沈着を伴う疾患に罹患しやすいまたは罹患している被験体を予防および／または治療するための本明細書中で定義されるような抗原結合タンパク質の使用が提供される。アミロイド沈着を伴う疾患に罹患しやすいまたは罹患している被験体を予防および／または治療するための医薬を製造するための本明細書中で定義されるような抗原結合タンパク質の使用もまた提供される。
図１は、１μｇ／ｍＬのコーティング濃度のヒトＳＡＰにおけるマウス抗体ＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋに対する結合曲線を示している。 図２は、５μｇ／ｍＬのコーティング濃度のヒトＳＡＰにおけるマウス抗体ＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋに対する結合曲線を示している。 図３は、キメラ抗体ｃＳＡＰ−ＥおよびｃＳＡＰ−Ｋに対する結合曲線を示している。それらのキメラ抗体に対する曲線のプロファイルは、相当するハイブリドーマのプロファイルと同じである。 図４は、ＳＡＰ−Ｋキメラと比較されたＳＡＰ−Ｋ Ｈ０Ｌ０、ＳＡＰ−Ｋ Ｈ１Ｌ０、ＳＡＰ−Ｋ Ｈ２Ｌ０およびＳＡＰ−Ｋ Ｈ３Ｌ０、ならびにＳＡＰ−Ｅキメラと比較されたＳＡＰ−Ｅ Ｈ１Ｌ１に対する結合曲線を示している。無関係なヒトＩｇＧ１カッパー抗体もまた、ネガティブコントロールとして試験した。 図５は、ＳＡＰ−Ｅキメラとの競合ＥＬＩＳＡにおける、精製ＳＡＰ−Ｋマウスモノクローナル抗体および精製ＳＡＰ−Ｅマウスモノクローナル抗体を示している。 図６は、ＳＡＰ−Ｋキメラとの競合ＥＬＩＳＡにおける精製ＳＡＰ−Ｋマウスモノクローナル抗体および精製ＳＡＰ−Ｅマウスモノクローナル抗体を示している。 図７は、固定化されたヒツジポリクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体によって捕捉されたヒトＳＡＰに対するモノクローナルマウス抗体ＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋの結合についてのイムノラジオメトリックアッセイを示している。 図８Ａは、モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体ＳＡＰ−Ｅについてのエピトープマッピングを示している。 図８Ｂは、モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体ＳＡＰ−Ｅについてのエピトープマッピングを示している。 図８Ｃは、モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体ＳＡＰ−Ｅについてのエピトープマッピングを示している。 図８Ｄは、モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体ＳＡＰ−Ｅについてのエピトープマッピングを示している。 図９は、ＳＡＰ−Ｋ（Ａ，黒色で強調されている）およびＳＡＰ−Ｅ（Ｂ，白で示されている）によって認識されるヒトＳＡＰ上のエピトープの位置を示している。 図１０は、ヒト全血清中のヒト化モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体によるＣ３活性化を示している。 図１１は、ヒト全血清中の低用量ヒト化モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体によるＣ３活性化を示している。 図１２は、純粋ヒトＳＡＰが補充されたマウス全血清中のヒト化モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体によるＣ３活性化を示している。
本発明は、特異的抗原として、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）、例えば、ヒトＳＡＰに結合する抗原結合タンパク質（すなわち、ＳＡＰ結合タンパク質）を提供する。その抗原結合タンパク質は、本発明の治療的適用において、組織からの異常な残屑をクリアランスするための身体の強力な機構を活性化する。その抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、モノクローナル抗体であり得る。本発明の抗原結合タンパク質は、マウス抗体ではない。ある実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、マウス抗原結合タンパク質ではない。特に、本発明の抗原結合タンパク質は、キメラ、ヒト化またはヒト抗原結合タンパク質である。
「血清アミロイドＰ成分」または「ＳＡＰ」とは、ペントラキシンファミリーのホモ五量体の血漿糖タンパク質のことを指す。各分子は、５つの同一のプロトマーから構成され、その各々は、環状五量体の対称性を有する円盤様の環として非共有結合的に会合された扁平なβ−ゼリーロールフォールドおよび単一のアルファヘリックスを有する（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６：４８２−４９３）、Ｐｅｐｙｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１７：２５４−２５９）。用語「ＳＡＰ」は、本明細書中で使用されるとき、ヒト遺伝子ＡＰＣＳ（染色体：１、位置：１ｑ２１−ｑ２３）または他の生物における相同遺伝子によってコードされる個別のサブユニット、例えば、配列番号４３に示されるような配列を有するヒトＳＡＰポリペプチドサブユニット、ならびにＳＡＰの天然の五量体型、ならびにインビボにおいてアミロイド原線維に結合する生物学的活性を保持するＳＡＰの任意のフラグメントおよび変異体も含んでなる。
本発明のＳＡＰ結合タンパク質は、上に記載された種々の形態のＳＡＰのいずれか１つまたは任意の組み合わせに結合することができる。特定の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、ヒトＳＡＰに結合する。本発明のＳＡＰ結合タンパク質は、ＳＡＰが、任意のタイプかつ体内の任意の細胞外の位置のアミロイド原線維に結合されているとき、そのＳＡＰに結合することができる。本発明の抗原結合タンパク質は、結合されていない天然のＳＡＰにも結合し得る。
治療方法において本発明のＳＡＰ結合タンパク質を利用する本質的な局面は、循環中のＳＡＰの濃度が、ＳＡＰ結合タンパク質の投与前の通常値よりも少なくとも９０％減少しなければならない局面である。具体的には、これは、循環ＳＡＰの量を減少させる化合物、および特に、本明細書中で「ＳＡＰ枯渇化合物」として定義される、循環ＳＡＰの枯渇をもたらす化合物によって達成することができる。そのような化合物は、ＳＡＰに結合されるリガンドであり、アミロイド原線維へのＳＡＰの結合の競合的インヒビター（例えば、Ｄ−プロリン誘導体およびグリセロール環状ピルビン酸塩誘導体）である。Ｄ−プロリン誘導体は、ＥＰ０９１５０８８（その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されており、用語「Ｄ−プロリン誘導体」は、国際公開第０３／０５１８３６号（これもその全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されているプロドラッグなどのプロドラッグを含む。以下の式のＤ−プロリン：
Figure 0006236478
または
Figure 0006236478
（式中、Ｒは、
Figure 0006236478
であり、基
Ｒ１は、水素またはハロゲンであり、
Ｘは、−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ（Ｒ２）（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ２ＮＨ−、−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ−、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−、またはチアゾール−２，５−ジイル、−Ｏ−であり、
Ｙは、−Ｓ−Ｓ−、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ［ＣＨ２Ｃ６Ｈ３（ＯＣＨ３）２］−、−Ｎ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）−、−Ｎ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）−、−Ｎ（アルコキシアルキル）−、Ｎ（シクロアルキル−メチル）−、２，６−ピリジル、２，５−フラニル、２，５−チエニル、１，２−シクロヘキシル、１，３−シクロヘキシル、１，４−シクロヘキシル、１，２−ナフチル、１，４−ナフチル、１，５−ナフチル、１，６−ナフチル、または１，２−フェニレン、１，３−フェニレンおよび１，４−フェニレンであり、ここで、そのフェニレン基は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシル、カルボキシ、−ＣＯＯ−低級アルキル、ニトリロ、５−テトラゾール、（２−カルボン酸ピロリジン−１−イル）−２−オキソ−エトキシ、Ｎ−ヒドロキシカルバミミオジル、５−オキソ［１，２，４オキサジアゾリル、２−オキソ［１，２，３，５］オキサチアジアゾリル、５−チオキソ［１，２，４］オキサジアゾリルおよび５−ｔｅｒｔ−ブチルスルファニル−［１，２，４］オキサジアゾリルから選択される１〜４個の置換基で必要に応じて置換されてもよく、
Ｘ’は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣＨ（Ｒ２）−、−（ＣＨ２）ｎＯＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ＝Ｃ（Ｒ２）−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、またはチアゾール−２，５−ジイル、−Ｏ−であり、
Ｒ２は、低級アルキル、低級アルコキシまたはベンジルであり、
ｎは、０〜３であり、ここで、
アルキルまたは低級アルキルは、Ｃ１−６アルキルであり、アルコキシまたは低級アルコキシは、Ｃ１−６アルコキシであり、シクロアルキルは、Ｃ３−６シクロアルキル（ｃｙｃｌｏｃａｌｋｙｌ）であり、ハロゲンは、Ｆ、ＣｌまたはＢｒであり、式中の点線で表されている位置は、単結合または二重結合である）、
あるいはその薬学上許容される塩またはモノエステルもしくはジエステルが企図される。
上記の式Ｉ−ＡのＤ−プロリンは、リガンド−リンカー−リガンドと記載することができ、ここで、式（ｆｏｒｍａｌ）Ｉ−ＡのＸ−Ｙ−Ｘ’部分が、リンカーを形成する。リンカー（Ｘ−Ｙ−Ｘ’）は、４〜１５個の線状の炭素原子、５〜１０個の線状の炭素原子および６〜８個の線状の炭素原子の長さを含む、４〜２０個の線状の炭素原子の長さであり得る。そのリンカーは、直鎖状もしくは分枝状であり得るか、または１つ以上の環構造を必要に応じて形成し得るが、ただし、少なくとも４つの線状または直鎖の炭素原子が、そのリンカーに存在する。その線状または直鎖のＣ原子の少なくとも１つは、Ｎ、ＯまたはＳ、好都合にはＯまたはＳ、好都合にはＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子で必要に応じて置換されてもよい。
したがって、「必要に応じて置換されてもよいリンカー」は、分枝をもたらす１つ以上の置換および／またはリンカーの線状もしくは直鎖の炭素原子の１つ以上の置換を有し得る（例えば、リンカーは、エーテルまたは置換エーテルであり得る）。
（Ｒ）−１−［６−［（Ｒ）−２−カルボキシ−ピロリジン−１−イル］−６−オキソ−ヘキサノイル］ピロリジン−２−カルボン酸（ＣＰＨＰＣ）は、本発明によって企図される特定のＤ−プロリンである。特定の実施形態において、ＣＰＨＰＣは、ヒト患者に投与される。
グリセロール環状ピルビン酸塩（Ｇｙｌｃｅｒｏｌ ｃｙｃｌｉｃ ｐｙｒｕｖａｔｅ）誘導体は、国際公開第２００４／０９９１７３号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示される。
本明細書中で使用される用語「抗原結合タンパク質」は、ＳＡＰに結合することができる抗体、抗体フラグメントおよび他のタンパク質構築物（例えば、ドメイン）のことを指す。
用語「抗体」は、免疫グロブリン様ドメインを有する分子のことを指すために最も広い意味において本明細書中で使用され、それには、モノクローナル抗体、組換え抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体およびヘテロ結合体抗体、単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合フラグメント、免疫学的に有効なフラグメント、一本鎖Ｆｖ、ダイアボディ、ＴａｎｄａｂｓＴＭなどが含まれる（別の「抗体」の形式の概要については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，Ｖｏｌ ２３，Ｎｏ．９，１１２６−１１３６を参照のこと）。
句「単一可変ドメイン」とは、異なる可変領域または可変ドメインとは無関係に、抗原またはエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）のことを指す。
「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、抗原に結合することができる「単一可変ドメイン」と同じであると考えてよい。単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであり得るが、げっ歯類などの他の種由来の単一の抗体の可変ドメイン（例えば、国際公開第００／２９００４号に開示されているようなもの）、コモリザメおよびラクダ科のＶＨＨ ｄＡｂも含む。ラクダ科のＶＨＨは、本来軽鎖を有しない重鎖抗体を生成する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。そのようなＶＨＨドメインは、当該分野において利用可能な標準的な手法に従ってヒト化されることがあり、そのようなドメインは、「ドメイン抗体」であると考えられる。本明細書中で使用されるとき、ＶＨには、ラクダ科のＶＨＨドメインが含まれる。
本明細書中で使用されるとき、用語「ドメイン」とは、そのタンパク質の残りの部分とは独立した三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造のことを指す。一般に、ドメインは、タンパク質の別々の機能的特性に関与し、多くの場合、そのタンパク質および／またはドメインの残部の機能喪失を起こさずに、付加され得るか、除去され得るか、または他のタンパク質に移され得る。「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。ゆえに、単一可変ドメインには、例えば、１つ以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列もしくは短縮された抗体可変ドメインで置き換えられているか、またはＮもしくはＣ末端の伸長、ならびに完全長ドメインの結合活性および特異性を少なくとも保持する可変ドメインの折り畳まれたフラグメントを含む、完全な抗体可変ドメインおよび改変された可変ドメインが含まれる。ドメインは、異なる可変領域または可変ドメインとは無関係に抗原またはエピトープに結合することができる。
抗原結合フラグメントは、ドメインなどの非抗体タンパク質足場に１つ以上のＣＤＲを配置することによって提供され得る。そのドメインは、ドメイン抗体であってもよいし、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ＧｒｏＥｌ、トランスフェリン、ＧｒｏＥＳおよびフィブロネクチン／アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）からなる群から選択される足場の誘導体であるドメイン（天然リガンド以外のＳＡＰなどの抗原への結合性を獲得するためにタンパク質工学に供されたドメイン）であってもよい。
抗原結合フラグメントまたは免疫学的に有効なフラグメントは、部分的な重鎖可変配列または軽鎖可変配列を含み得る。フラグメントは、少なくとも５、６、７、８、９または１０アミノ酸長である。あるいは、そのフラグメントは、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも７５または少なくとも１００アミノ酸長である。
抗原結合タンパク質に関して本明細書全体を通じて使用される用語「特異的に結合する」は、その抗原結合タンパク質が、他の任意のタンパク質（ヒトにおいて残基アミノ酸配列相同性について５５％の厳密な残基を共有し、かつ本質的に同じタンパク質の折り畳みを有する、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）などの密接な関係がある分子を含む）に結合せずに、または他の任意のタンパク質にほんのわずかに結合しつつ、ＳＡＰに結合することを意味する。
抗原結合タンパク質とＳＡＰとの相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）は、１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下であり得る。あるいは、そのＫＤは、５〜１０ｎＭ、または１〜２ｎＭであり得る。そのＫＤは、１ｐＭ〜５００ｐＭ、または５００ｐＭ〜１ｎＭであり得る。
結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ、例えば、第一級アミンカップリングおよびこの表面上への抗体の捕捉によってカルボキシメチルデキストラン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｄｅｘｔｒａｎ）チップ上に結合されたＳＡＰを用いた抗原捕捉によって測定され得る。あるいは、結合親和性は、ＣＭ５チップ上に固定化されたＯ−ホスホエタノールアミンによって捕捉される、ヒトＳＡＰへの抗ＳＡＰ抗体の結合によってＢＩＡｃｏｒｅＴＭで測定され得る。実施例８に記載されるＢＩＡｃｏｒｅＴＭ法は、結合親和性を測定するために使用され得る。
解離速度定数（ｋｄ）は、１×１０−３ｓ−１以下、１×１０−４ｓ−１以下または１×１０−５ｓ−１以下であり得る。ｋｄは、１×１０−５ｓ−１〜１×１０−４ｓ−１、または１×１０−４ｓ−１〜１×１０−３ｓ−１であり得る。低ｋｄは、抗原結合タンパク質−リガンド複合体の遅い解離およびアミロイドに結合したＳＡＰの複合体の改善されたクリアランスをもたらし得る。
用語「由来」は、それがその材料に対する物理的起源であるという意味における供給源を定義するだけでなく、その材料と構造的に同一であるが言及している供給源が起源でない材料も定義すると意図されることは、当業者に明らかであろう。したがって、「ドナー抗体に見られる残基」は、必ずしもドナー抗体から洗練されている必要はない。
「単離」は、抗原結合タンパク質などの分子が、それが天然に見られ得る環境から取り出されていることを意図している。例えば、その分子は、それが天然において通常存在し得る物質から精製されているかもしれない。例えば、サンプル中のその分子の質量は、総質量の９５％であり得る。
「キメラ抗体」とは、ドナー抗体に由来する天然に存在する可変領域（軽鎖および重鎖）を、アクセプター抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域と併せて含む、操作された抗体の１タイプのことを指す。
「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するＣＤＲを有する操作された抗体の１タイプのことを指し、その分子の残りの免疫グロブリンに由来する部分は、１つ以上のヒト免疫グロブリンに由来する。さらに、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するように変更され得る（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３２（１９８９）、Ｈｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１（１９９１）を参照のこと）。好適なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同性によって、従来のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴ（登録商標）データベース、Ｌｏｓ ＡｌａｍｏｓデータベースおよびＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから選択されるものであり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性（アミノ酸基準）を特徴とするヒト抗体は、ドナーＣＤＲを挿入するための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適し得る。軽鎖定常領域または軽鎖可変フレームワーク領域を供与することができる好適なアクセプター抗体は、同様の様式で選択され得る。アクセプター抗体の重鎖と軽鎖とは、同じアクセプター抗体が起源である必要はないことに注意すべきである。従来技術には、そのようなヒト化抗体を作製するいくつかの方法が記載されている（例えば、ＥＰ−Ａ−０２３９４００およびＥＰ−Ａ−０５４９５１を参照のこと）。
用語「ドナー抗体」とは、その可変領域、ＣＤＲまたはそれらの他の機能的フラグメントもしくはアナログのアミノ酸配列を第１の免疫グロブリンパートナーに提供する抗体のことを指す。ゆえに、そのドナーは、変更された免疫グロブリンコード領域、ならびにドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する、結果として発現される変更された抗体を提供する。
用語「アクセプター抗体」とは、その重鎖フレームワーク領域および／もしくは軽鎖フレームワーク領域ならびに／またはその重鎖定常領域および／もしくは軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列のすべて（または任意の一部）を第１の免疫グロブリンパートナーに提供する、ドナー抗体とは異種の抗体のことを指す。ヒト抗体は、アクセプター抗体であり得る。
用語「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列に由来する抗体のことを指す。これらの完全なヒト抗体は、免疫原性の低い治療用抗体の起源として、再操作されたまたは脱免疫された（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）げっ歯類モノクローナル抗体（例えば、ヒト化抗体）に対する代替物を提供し、それらは通常、ファージディスプレイまたはトランスジェニックマウスプラットフォームのいずれかを用いて作製される。ある実施形態において、本発明の抗体は、ヒト抗体である。
用語「ＶＨ」および「ＶＬ」は、それぞれ抗原結合タンパク質の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のことを指すために本明細書中で使用される。
「ＣＤＲ」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義される。これらは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。したがって、本明細書中で使用される「ＣＤＲ」は、３つすべての重鎖ＣＤＲ、３つすべての軽鎖ＣＤＲ、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのすべて、または少なくとも２つのＣＤＲのことを指す。
本明細書全体を通じて、可変ドメインの配列および完全長抗体の配列におけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングの慣習に従ってナンバリングされる。同様に、実施例において使用される用語「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」は、Ｋａｂａｔナンバリングの慣習に従っている。さらなる情報については、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７）を参照のこと。
しかしながら、本発明者らは、本明細書全体を通じて、可変ドメインの配列および完全長抗体の配列におけるアミノ酸残基についてＫａｂａｔナンバリングの慣習を使用するが、可変ドメインの配列および完全長抗体の配列におけるアミノ酸残基について代替のナンバリングの慣習が存在することは当業者には明らかであろう。ＣＤＲ配列に対する代替のナンバリングの慣習も存在する（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３に示されるもの）。抗体の構造およびタンパク質フォールディングは、他の残基もＣＤＲ配列の一部であると考えられることを意味し得、当業者によってそのように理解され得る。
ＣＤＲ配列に対する当業者に利用可能な他のナンバリングの慣習には、「ＡｂＭ」法（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）および「ｃｏｎｔａｃｔ」法（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）が含まれる。Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡｂＭ法およびｃｏｎｔａｃｔ法のうちの少なくとも２つを用いたときの最小重複領域が、「最小結合単位」をもたらすと判断することができる。最小結合単位は、ＣＤＲの一部であり得る。
下記の表１は、ＣＤＲまたは結合単位の各々に対して各ナンバリング慣習を用いたときの１つの定義を表している。表１では、可変ドメインのアミノ酸配列をナンバリングするためにＫａｂａｔナンバリングスキームが使用されている。ＣＤＲの定義のいくつかは、使用される個別の出版物に応じて変動することがあることに注意すべきである。
Figure 0006236478
本明細書中で使用されるとき、用語「抗原結合部位」とは、抗原に特異的に結合することができる抗原結合タンパク質上の部位のことを指す。これは、単一ドメイン（例えば、エピトープ結合ドメイン）または一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ドメインであってもよいし、標準的な抗体に見ることができるような対になったＶＨ／ＶＬドメインであってもよい。
本明細書中で使用される用語「エピトープ」は、抗原結合タンパク質の特定の結合ドメインと接触する抗原の一部のことを指す。エピトープは、抗原由来の線状（本質的に線状を含む）のアミノ酸配列であり得る。あるいは、エピトープは、立体構造をとっていてもよいし、不連続であってもよい。例えば、立体構造エピトープは、構造的に拘束するエレメントを必要とするアミノ酸残基を含む。立体構造エピトープの場合、上記残基は、ペプチド鎖の種々の領域に由来し得るが、それらは、抗原の３次元構造において近接し得る。ＳＡＰなどの多量体の抗原の場合、立体構造エピトープは、その抗原の３次元構造において近接し得る異なるペプチド鎖由来の残基を含み得る。そのような構造的に隣接する残基は、コンピュータモデリングプログラム、またはＸ線結晶構造解析などの当該分野で公知の方法によって得られた３次元構造によって決定することができる。
不連続なエピトープは、他の配列によって分断された、すなわち、抗原の１次配列では連続した配列ではないアミノ酸残基を含む。抗原の３次および４次構造の文脈において、不連続なエピトープの残基は、抗原結合タンパク質によって結合されるのに互いに十分近い。
ある実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、ヒトＳＡＰの残基１４０〜１５８内のエピトープに結合する。
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列について、用語「同一」または「配列同一性」とは、最適にアラインメントされ、適切な挿入または欠失を用いて比較されたときの、２つの核酸配列間または２つのアミノ酸配列間の一致の程度のことを指摘する。
２つの配列間の同一性パーセントは、その２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れたときの、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数に１００を乗じた値）。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの算出は、下に記載されるような数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウェイトを使用した、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて算出することができる。２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントもまた、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２というギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）および４というギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を使用した、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））を用いて算出することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４というギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６というレングスウェイトを使用した、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用いて算出することができる。
例として、あるポリヌクレオチド配列は、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号８、１０、１８、２０、４５〜４８、５１〜６１、６３、６５〜７３を参照のこと）と同一、すなわち、１００％同一であり得るか、または参照配列と比べてある特定の整数までのヌクレオチドの変更を含み得る（例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一）。そのような変更は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換（変化およびトランスバージョンを含む）または挿入から選択され、ここで、前記変更は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端の位置、またはそれらの末端の位置の間の任意の位置（その任意の位置は、参照配列内のヌクレオチドの間に個別に散在しているか、または参照配列内の１つ以上の連続した群内に散在している）において生じ得る。ヌクレオチドの変更の数は、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号８、１０、１８、２０、４５〜４８、５１〜６１、６３、６５〜７３を参照のこと）内のヌクレオチドの総数にそれぞれの同一性パーセントの数値的なパーセント（１００で除した値）を乗じて、その積を本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号８、１０、１８、２０、４５〜４８、５１〜６１、６３、６５〜７３を参照のこと）内のヌクレオチドの前記総数から減算することによって、すなわち：
ｎｎ≦ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
によって算出される（式中、ｎｎは、ヌクレオチドの変更の数であり、ｘｎは、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号８、１０、１８、２０、４５〜４８、５１〜６１、６３、６５〜７３を参照のこと）内のヌクレオチドの総数であり、ｙは、５０％の場合０．５０、６０％の場合０．６０、７０％の場合０．７０、７５％の場合０．７５、８０％の場合０．８０、８５％の場合０．８５、９０％の場合０．９０、９５％の場合０．９５、９８％の場合０．９８、９９％の場合０．９９または１００％の場合１．００であり、・は、乗算演算子のシンボルであり、ここで、ｘｎおよびｙの任意の非整数の積は、それをｘｎから減算する前に、最も近い整数に端数が切り捨てられる）。
同様に、あるポリペプチド配列は、本明細書中に記載されるようなポリペプチド参照配列（例えば、配列番号１〜７、９、１１〜１７、１９、２１〜２４、２７〜３１、３４〜４２、６２、６４、７４を参照のこと）と同一、すなわち、１００％同一であり得るか、または％同一性が１００％未満（例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一）であるように、参照配列と比べてある特定の整数までのアミノ酸の変更を含み得る。そのような変更は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）または挿入からなる群から選択され、ここで、前記変更は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置、またはそれらの末端の位置の間の任意の位置（その任意の位置は、参照配列内のアミノ酸の間に個別に散在しているか、または参照配列内の１つ以上の連続した群内に散在している）において生じ得る。所与の％同一性に対するアミノ酸の変更の数は、本明細書中に記載されるようなポリペプチド参照配列によってコードされるポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜７、９、１１〜１７、１９、２１〜２４、２７〜３１、３４〜４２、６２、６４、７４を参照のこと）内のアミノ酸の総数にそれぞれの同一性パーセントの数値的なパーセント（１００で除した値）を乗じて、次いで、その積を本明細書中に記載されるようなポリペプチド参照配列（例えば、配列番号１〜７、９、１１〜１７、１９、２１〜２４、２７〜３１、３４〜４２、６２、６４、７４を参照のこと）内のアミノ酸の前記総数から減算することによって、すなわち：
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
によって算出される（式中、ｎａは、アミノ酸の変更の数であり、ｘａは、本明細書中に記載されるような参照ポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜７、９、１１〜１７、１９、２１〜２４、２７〜３１、３４〜４２、６２、６４、７４を参照のこと）内のアミノ酸の総数であり、ｙは、５０％の場合０．５０、６０％の場合０．６０、７０％の場合０．７０、７５％の場合０．７５、８０％の場合０．８０、８５％の場合０．８５、９０％の場合０．９０、９５％の場合０．９５、９８％の場合０．９８、９９％の場合０．９９または１００％の場合１．００であり、・は、乗算演算子のシンボルであり、ここで、ｘａおよびｙの任意の非整数の積は、それをｘａから減算する前に、最も近い整数に端数が切り捨てられる）。
％同一性は、配列の長さ全体にわたって算出され得る。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」の各々は、２つ以上のアミノ酸残基を含む分子のことを指す。ペプチドは、単量体または重合体であり得る。
ある特定のアミノ酸置換が「保存的」であると見なされることは、当該分野において十分に認識されている。アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられ、抗原結合タンパク質の結合親和性のすべてまたは実質的にすべてを維持する群内での置換は、保存的置換と見なされる。下記の表２を参照のこと：
Figure 0006236478
本抗原結合タンパク質は、配列番号７の重鎖可変領域配列および配列番号９の軽鎖可変領域配列を含んでなる参照抗体とＳＡＰへの結合について競合し得る。あるいは、本抗原結合タンパク質は、配列番号１７の重鎖可変領域配列および配列番号１９の軽鎖可変領域配列を含んでなる参照抗体とＳＡＰへの結合について競合し得る。
本抗原結合タンパク質と参照抗体との競合は、競合ＥＬＩＳＡ、ＦＭＡＴまたはＢＩＡｃｏｒｅによって測定され得る。競合する抗原結合タンパク質は、同じエピトープ、重複するエピトープまたは参照抗体が結合するエピトープに近位のエピトープに結合し得る。
本発明はまた、ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号３のＣＤＲＨ３またはその変異体ＣＤＲを含んでなる、抗原結合タンパク質も提供する。その抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号１）、ＣＤＲＨ２（配列番号２）、ＣＤＲＬ１（配列番号４）、ＣＤＲＬ２（配列番号５）およびＣＤＲＬ３（配列番号６）、またはそれらの変異体から選択される１つ以上のＣＤＲまたはすべてのＣＤＲを任意の組み合わせでさらに含み得る。
例えば、上記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号３）およびＣＤＲＨ１（配列番号１）またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号３）およびＣＤＲＨ２（配列番号２）またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号１）およびＣＤＲＨ２（配列番号２）およびＣＤＲＨ３（配列番号３）またはそれらの変異体を含み得る。
上記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１（配列番号４）およびＣＤＲＬ２（配列番号５）またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ２（配列番号５）およびＣＤＲＬ３（配列番号６）またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１（配列番号４）、ＣＤＲＬ２（配列番号５）およびＣＤＲＬ３（配列番号６）またはそれらの変異体を含み得る。
上記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号３）およびＣＤＲＬ３（配列番号６）またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号３）、ＣＤＲＨ２（配列番号２）およびＣＤＲＬ３（配列番号６）またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号３）、ＣＤＲＨ２（配列番号２）、ＣＤＲＬ２（配列番号５）およびＣＤＲＬ３（配列番号６）またはそれらの変異体を含み得る。
上記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号１）、ＣＤＲＨ２（配列番号２）、ＣＤＲＨ３（配列番号３）、ＣＤＲＬ１（配列番号４）、ＣＤＲＬ２（配列番号５）およびＣＤＲＬ３（配列番号６）またはそれらの変異体を含み得る。
本発明はまた、ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号１３のＣＤＲＨ３またはその変異体ＣＤＲを含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。その抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号１１）、ＣＤＲＨ２（配列番号１２）、ＣＤＲＬ１（配列番号１４）、ＣＤＲＬ２（配列番号１５）およびＣＤＲＬ３（配列番号１６）、またはそれらの変異体から選択される１つ以上のＣＤＲまたはすべてのＣＤＲを任意の組み合わせでさらに含み得る。
本発明はまた、ＳＡＰに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供し、ここで、その抗原結合タンパク質は、配列番号７の可変ドメイン配列の対応するＣＤＲＨ３または変異体ＣＤＲＨ３を含んでなるキメラ抗体またはヒト化抗体である。
そのキメラ抗原結合タンパクまたはヒト化抗原結合タンパク質は、配列番号７もしくは配列番号９の可変ドメイン配列から選択される対応するＣＤＲまたはその変異体ＣＤＲの１つ以上またはすべてをさらに含み得る。
例えば、上記抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３および対応するＣＤＲＨ１またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３および対応するＣＤＲＨ２またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ１、対応するＣＤＲＨ２および対応するＣＤＲＨ３、またはそれらの変異体を含み得る。
上記抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＬ１および対応するＣＤＲＬ２またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＬ２および対応するＣＤＲＬ３またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＬ１、対応するＣＤＲＬ２および対応するＣＤＲＬ３またはそれらの変異体を含み得る。
上記抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３および対応するＣＤＲＬ３またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３、対応するＣＤＲＨ２および対応するＣＤＲＬ３またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３、対応するＣＤＲＨ２、対応するＣＤＲＬ２および対応するＣＤＲＬ３またはそれらの変異体を含み得る。
上記抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ１、対応するＣＤＲＨ２、対応するＣＤＲＨ３、対応するＣＤＲＬ１、対応するＣＤＲＬ２および対応するＣＤＲＬ３またはそれらの変異体を含み得る。
上記の対応するＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ法（１９８９）、ＡｂＭ法もしくはｃｏｎｔａｃｔ法、またはこれらの方法の組み合わせを参照することにより定義することができる。それらの各方法の１つの定義は、表１に見ることができ、対応するＣＤＲを判定するために、参照重鎖可変ドメイン配列番号７および参照軽鎖可変ドメイン配列番号９に適用することができる。
本発明はまた、ＳＡＰに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供し、ここで、その抗原結合タンパク質は、配列番号１７の可変ドメイン配列の対応するＣＤＲＨ３または変異体ＣＤＲＨ３を含んでなるキメラ抗体またはヒト化抗体である。
そのキメラ抗原結合タンパク質またはヒト化抗原結合タンパク質は、配列番号１７もしくは配列番号１９の可変ドメイン配列から選択される対応するＣＤＲまたはそれらの変異体ＣＤＲの１つ以上またはすべてをさらに含み得る。
本発明はまた、ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号７のＫａｂａｔ残基９５〜１０１を含んでなる結合単位Ｈ３または変異体Ｈ３を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。その抗原結合タンパク質は、配列番号７のＫａｂａｔ残基３１〜３２を含んでなるＨ１、配列番号７のＫａｂａｔ残基５２〜５６を含んでなるＨ２、配列番号９のＫａｂａｔ残基３０〜３４を含んでなるＬ１、配列番号９のＫａｂａｔ残基５０〜５５を含んでなるＬ２および配列番号９のＫａｂａｔ残基８９〜９６を含んでなるＬ３、または変異体結合単位から選択される１つ以上またはすべての結合単位をさらに含み得る。
例えば、上記抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ３および結合単位Ｈ１またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ３および結合単位Ｈ２またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ１、結合単位Ｈ２および結合単位Ｈ３、またはそれらの変異体を含み得る。
上記抗原結合タンパク質は、結合単位Ｌ１および結合単位Ｌ２またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、結合単位Ｌ２および結合単位Ｌ３またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、結合単位Ｌ１、結合単位Ｌ２および結合単位Ｌ３、またはそれらの変異体を含み得る。
上記抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ３および結合単位Ｌ３またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ３、結合単位Ｈ２および結合単位Ｌ３、またはそれらの変異体を含み得る。上記抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ３、結合単位Ｈ２、結合単位Ｌ２および結合単位Ｌ３、またはそれらの変異体を含み得る。
上記抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ１、結合単位Ｈ２、結合単位Ｈ３、結合単位Ｌ１、結合単位Ｌ２および結合単位Ｌ３、またはそれらの変異体を含み得る。
本発明はまた、ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号１７のＫａｂａｔ残基９５〜１０１を含んでなる結合単位Ｈ３または変異体Ｈ３を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。その抗原結合タンパク質は、配列番号１７のＫａｂａｔ残基３１〜３２を含んでなるＨ１、配列番号１７のＫａｂａｔ残基５２〜５６を含んでなるＨ２、配列番号１９のＫａｂａｔ残基３０〜３４を含んでなるＬ１、配列番号１９のＫａｂａｔ残基５０〜５５を含んでなるＬ２および配列番号１９のＫａｂａｔ残基８９〜９６を含んでなるＬ３、または変異体結合単位から選択される１つ以上またはすべての結合単位をさらに含み得る。
ＣＤＲ変異体または変異体結合単位は、少なくとも１つのアミノ酸によって改変されたアミノ酸配列を含み、ここで、前記改変は、化学的であり得るか、またはアミノ酸配列の部分的な変更（例えば、１０アミノ酸以下の変更）であり得、その改変によって、変異体が未改変配列の生物学的特徴を保持することが可能になる。例えば、その変異体は、ＳＡＰに特異的に結合し、かつ組織由来のアミロイドに結合したＳＡＰの複合体のクリアランスを活性化する、機能的変異体である。ＣＤＲのアミノ酸配列の部分的な変更は、１個から数個のアミノ酸の欠失もしくは置換、または１個から数個のアミノ酸の付加もしくは挿入、あるいはそれらの組み合わせ（例えば、１０アミノ酸以下）であり得る。そのＣＤＲ変異体または結合単位変異体は、アミノ酸配列において、１、２、３、４、５または６アミノ酸の置換、付加または欠失を任意の組み合わせで含み得る。ＣＤＲ変異体または結合単位変異体は、アミノ酸配列において、１、２または３アミノ酸の置換、挿入または欠失を任意の組み合わせで含み得る。アミノ酸残基の置換は、保存的置換、例えば、１つの疎水性アミノ酸を代替の疎水性アミノ酸の代わりに用いることであり得る。例えば、ロイシンは、バリンまたはイソロイシンで置換され得る。
本明細書中に記載されるＣＤＲ、対応するＣＤＲ、変異体ＣＤＲまたは結合単位の１つ以上は、ヒトフレームワークの文脈において、例えば、ヒト化可変ドメインまたはキメラ可変ドメインとして存在することがある。本明細書中に記載されるＣＤＲ、対応するＣＤＲ、変異体ＣＤＲまたは結合単位の１つ以上を含んでなる完全ヒト抗体も企図され、それは、本発明の範囲内である。
ＣＤＲのＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２は、有限数の主鎖コンフォメーションのうちの１つを構造的に示す傾向がある。ＣＤＲの特定の基準の構造クラスは、ＣＤＲとフレームワーク領域の両方において重要な位置に位置する残基（構造上決定的な残基またはＳＤＲ）によって決定されるループパッキングとＣＤＲの長さとの両方によって定義される。ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００−８１５）は、「重要な残基」の基準テンプレートを規定する自動的な方法を生み出した。クラスター解析を用いることにより、ＣＤＲのセットに対する基準のクラスが定義され、次いで、埋もれている疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｓ）、水素結合している残基、ならびに保存されたグリシンおよびプロリンを解析することによって、基準テンプレートが特定される。抗体配列のＣＤＲは、それらの配列を重要な残基テンプレートと比較し、同一性または類似性の行列を用いて各テンプレートをスコアリングすることによって、基準のクラスに割り当てることができる。
本発明の範囲内のＣＤＲの基準の例を下記に示す。使用されるアミノ酸のナンバリングは、Ｋａｂａｔである。
配列番号１に示されるようなＣＤＲＨ１、その変異体、配列番号７のＣＤＲＨ１または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ｔｙｒ３２は、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、ＧｌｕまたはＡｓｐに対して置換されており、Ａｓｎ３３は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＶａｌに対して置換されており、Ｍｅｔ３４は、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＴｒｐに対して置換されており、および／またはＨｉｓ３５は、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒに対して置換されている。
配列番号２に示されるようなＣＤＲＨ２、その変異体、配列番号７のＣＤＲＨ２または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ｔｙｒ５０は、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＡｌａに対して置換されており、Ｉｌｅ５１は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎに対して置換されており、Ｔｙｒ５２は、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＳｅｒに対して置換されており、Ｇｌｙ５３は、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、ＴｈｒまたはＡｓｎに対して置換されており、Ａｓｐ５４は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＬｙｓまたはＧｌｙに対して置換されており、Ａｓｎ５６は、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＡｌａに対して置換されており、および／またはＡｓｎ５８は、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＴｙｒに対して置換されている。
配列番号３に示されるようなＣＤＲＨ３、その変異体、配列番号７のＣＤＲＨ３または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ｓｅｒ１０２は、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＡｓｐまたはＧｌｙに対して置換されている。
配列番号４に示されるようなＣＤＲＬ１、その変異体、配列番号９のＣＤＲＬ１または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ａｓｎ２８は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、ＴｈｒまたはＧｌｕに対して置換されており、Ｉｌｅ２９は、Ｖａｌに対して置換されており、Ｔｙｒ３０は、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、ＧｌｙまたはＴｈｒに対して置換されており、Ｓｅｒ３１は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、ＬｙｓまたはＧｌｙに対して置換されており、Ｔｙｒ３２は、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＡｒｇに対して置換されており、Ｌｅｕ３３は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＰｈｅに対して置換されており、および／またはＡｌａ３４は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＶａｌまたはＰｈｅに対して置換されている。
配列番号５に示されるようなＣＤＲＬ２、その変異体、配列番号９のＣＤＲＬ１または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ａｌａ５１は、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＶａｌに対して置換されている。
配列番号６に示されるようなＣＤＲＬ３、その変異体、配列番号９のＣＤＲＬ１または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ｇｌｎ８９は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＬｅｕに対して置換されており、Ｈｉｓ９０は、ＧｌｎまたはＡｓｎに対して置換されており、Ｈｉｓ９１は、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＶａｌに対して置換されており、Ｔｙｒ９２は、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＡｓｐに対して置換されており、Ｇｌｙ９３は、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＡｒｇまたはＡｌａに対して置換されており、Ａｌａ９４は、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＳｅｒに対して置換されており、および／またはＬｅｕ９６は、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＰｈｅに対して置換されている。
配列番号１１に示されるようなＣＤＲＨ１、その変異体、配列番号１７のＣＤＲＨ１または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ｔｙｒ３２は、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、ＧｌｕまたはＡｓｐに対して置換されており、Ｔｒｐ３３は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＶａｌに対して置換されており、Ｍｅｔ３４は、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＴｒｐに対して置換されており、および／またはＨｉｓ３５は、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒに対して置換されている。
配列番号１２に示されるようなＣＤＲＨ２、その変異体、配列番号１７のＣＤＲＨ１または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ｍｅｔ５０は、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＡｌａに対して置換されており、Ｉｌｅ５１は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎに対して置換されており、Ｈｉｓ５２は、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＴｙｒに対して置換されており、Ａｓｎ５３は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＴｈｒに対して置換されており、Ｓｅｒ５４は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｙに対して置換されており、Ａｓｎ５６は、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＡｌａに対して置換されており、および／またはＡｓｎ５８は、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＴｙｒに対して置換されている。
配列番号１３に示されるようなＣＤＲＨ３、その変異体、配列番号１７のＣＤＲＨ１または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ｖａｌ１０２は、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｙに対して置換されている。
配列番号１４に示されるようなＣＤＲＬ１、その変異体、配列番号１９のＣＤＲＬ１または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ａｓｎ２８は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、ＴｈｒまたはＧｌｕに対して置換されており、Ｖａｌ２９は、Ｉｌｅに対して置換されており、Ａｓｎ３０は、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、ＧｌｙまたはＴｈｒに対して置換されており、Ｓｅｒ３１は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、ＬｙｓまたはＧｌｙに対して置換されており、Ａｓｎ３２は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＡｒｇに対して置換されており、Ｖａｌ３３は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｈｅに対して置換されており、Ａｌａ３４は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＶａｌまたはＰｈｅに対して置換されている。
配列番号１５に示されるようなＣＤＲＬ２、その変異体、配列番号１９のＣＤＲＬ１または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ａｌａ５１は、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＶａｌに対して置換されている。
配列番号１６に示されるようなＣＤＲＬ３、その変異体、配列番号１９のＣＤＲＬ１または対応するＣＤＲに対する基準の例は、以下である：Ｇｌｎ８９は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＬｅｕに対して置換されており、Ｇｌｎ９０は、ＡｓｎまたはＨｉｓに対して置換されており、Ｃｙｓ９１は、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＶａｌに対して置換されており、Ａｓｎ９２は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＡｓｐに対して置換されており、Ａｓｎ９３は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＡｒｇまたはＡｌａに対して置換されており、Ｔｙｒ９４は、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＳｅｒに対して置換されており、および／またはＰｈｅ９６は、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、ＩｌｅまたはＴｒｐに対して置換されている。
ＣＤＲ１つにつき、対応するＣＤＲ１つにつき、結合単位１つにつき、重鎖可変領域または軽鎖可変領域１つにつき、重鎖または軽鎖１つにつき、および抗原結合タンパク質１つにつき複数の変異体ＣＤＲの基準の位置が存在し得るので、本発明の抗原結合タンパク質がＳＡＰに特異的に結合することができるようにＣＤＲの基準構造が維持されるならば、任意の組み合わせの置換が、その抗原結合タンパク質に存在してもよい。
上で論じられたように、ＣＤＲの特定の基準の構造クラスは、ＣＤＲとフレームワーク領域の両方における重要な位置に位置する残基によって決定されるループパッキングとＣＤＲの長さとの両方によって定義される。
したがって、配列番号１〜６もしくは１１〜１６に列挙されるＣＤＲ、配列番号７、９、１７もしくは１９のＣＤＲ、対応するＣＤＲ、結合単位またはそれらの変異体に加えて、本発明の抗原結合タンパク質の基準のフレームワーク残基は、（Ｋａｂａｔナンバリングを使用して）：
重鎖：２位にＶａｌ、ＩｌｅまたはＧｌｙ、４位にＬｅｕもしくはＶａｌ、２０位にＬｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔもしくはＶａｌ、２２位にＣｙｓ、２４位にＴｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＧｌｙもしくはＳｅｒ、２６位にＧｌｙ、２９位にＩｌｅ、Ｐｈｅ、ＬｅｕもしくはＳｅｒ、３６位にＴｒｐ、４７位にＴｒｐもしくはＴｙｒ、４８位にＩｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌもしくはＬｅｕ、６９位にＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＭｅｔもしくはＶａｌ、７１位にＶａｌ、ＡｌａもしくはＬｅｕ、７８位にＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＴｙｒもしくはＰｈｅ、８０位にＬｅｕもしくはＭｅｔ、９０位にＴｙｒもしくはＰｈｅ、９２位にＣｙｓ、および／または９４位にＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＨｉｓもしくはＡｓｎ
軽鎖：２位にＩｌｅ、ＬｅｕもしくはＶａｌ、３位にＶａｌ、Ｇｌｎ、ＬｅｕもしくはＧｌｕ、４位にＭｅｔもしくはＬｅｕ、２３位にＣｙｓ、３５位にＴｒｐ、３６位にＴｙｒ、ＬｅｕもしくはＰｈｅ、４６位にＬｅｕ、ＡｒｇもしくはＶａｌ、４９位にＴｙｒ、Ｈｉｓ、ＰｈｅもしくはＬｙｓ、７１位にＴｙｒもしくはＰｈｅ、８８位にＣｙｓ、および／または９８位にＰｈｅ
を含み得る。
特定の実施形態において、重鎖フレームワークは、以下の残基：２位にＶａｌ、４位にＬｅｕ、２０位にＶａｌ、２２位にＣｙｓ、２４位にＡｌａ、２６位にＧｌｙ、２９位にＰｈｅ、３６位にＴｒｐ、４７位にＴｒｐ、４８位にＭｅｔ、６９位にＩｌｅ、７１位にＡｌａ、７８位にＡｌａ、８０位にＭｅｔ、９０位にＴｙｒ、９２位にＣｙｓおよび９４位にＡｒｇを含み、軽鎖フレームワークは、以下の残基：２位にＩｌｅ、３位にＧｌｎ、４位にＭｅｔ、２３位にＣｙｓ、３５位にＴｒｐ、３６位にＴｙｒ、４６位にＬｅｕ、４９位にＨｉｓ、７１位にＰｈｅ、８８位にＣｙｓおよび９８位にＰｈｅを含んでなる。
上に記載されたフレームワーク位置のいずれか１つ、任意の組み合わせまたはすべてが、本発明の抗原結合タンパク質に存在し得る。重鎖可変領域または軽鎖可変領域１つにつき、重鎖または軽鎖１つにつき、および抗原結合タンパク質１つにつき複数の変異体フレームワークの基準の位置が存在し得るので、フレームワークの基準構造が維持されるならば、任意の組み合わせが、本発明の抗原結合タンパク質に存在してもよい。
ヒト化重鎖可変ドメインは、フレームワーク領域内において、配列番号２５のヒトアクセプター可変ドメイン配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアクセプター抗体フレームワーク内に配列番号１〜３に列挙されるＣＤＲ、変異体ＣＤＲ、配列番号７内の対応するＣＤＲ、結合単位、またはその変異体を含み得る。ヒト化軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域内において、配列番号３２のヒトアクセプター可変ドメイン配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアクセプター抗体フレームワーク内に配列番号４〜６に列挙されるＣＤＲ、変異体ＣＤＲ、配列番号９内の対応するＣＤＲ、結合単位、またはその変異体を含み得る。
ヒト化重鎖可変ドメインは、フレームワーク領域において、配列番号２５のヒトアクセプター可変ドメイン配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアクセプター抗体フレームワーク内に配列番号１１〜１３に列挙されるＣＤＲ、変異体ＣＤＲ、配列番号１７の対応するＣＤＲ、結合単位、またはそれらの変異体を含み得る。ヒト化軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域内において、配列番号３２のヒトアクセプター可変ドメイン配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアクセプター抗体フレームワーク内に配列番号１４〜１６に列挙されたＣＤＲ、変異体ＣＤＲ、配列番号１９の対応するＣＤＲ、結合単位、またはそれらの変異体を含み得る。
本発明はまた、ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号２７〜３１のうちのいずれか１つから選択される重鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。その抗原結合タンパク質は、配列番号３４〜３６のうちのいずれか１つから選択される軽鎖可変領域を含み得る。その重鎖可変領域のいずれかとその軽鎖可変領域のいずれかとが組み合され得る。
上記抗原結合タンパク質は、以下の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせのいずれか１つを含み得る：Ｈ０Ｌ０（配列番号２７および配列番号３４）、Ｈ０Ｌ１（配列番号２７および配列番号３５）、Ｈ０Ｌ２（配列番号２７および配列番号３６）、Ｈ１Ｌ０（配列番号２８および配列番号３４）、Ｈ１Ｌ１（配列番号２８および配列番号３５）、Ｈ１Ｌ２（配列番号２８および配列番号３６）、Ｈ２Ｌ０（配列番号２９および配列番号３４）、Ｈ２Ｌ１（配列番号２９および配列番号３５）、Ｈ２Ｌ２（配列番号２９および配列番号３６）、Ｈ３Ｌ０（配列番号３０および配列番号３４）、Ｈ３Ｌ１（配列番号３０および配列番号３５）、Ｈ３Ｌ２（配列番号３０および配列番号３６）、Ｈ４Ｌ０（配列番号３１および配列番号３４）、Ｈ４Ｌ１（配列番号３１および配列番号３５）またはＨ４Ｌ２（配列番号３１および配列番号３６）。
本発明はまた、ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号３７〜４０のうちのいずれか１つから選択される重鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。その抗原結合タンパク質は、配列番号４１、配列番号４２または配列番号７４の軽鎖可変領域を含み得る。その重鎖可変領域のいずれかとその軽鎖可変領域のいずれかとが組み合され得る。
上記抗原結合タンパク質は、以下の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせのいずれか１つを含み得る：Ｈ０Ｌ０（配列番号３７および配列番号４１）、Ｈ０Ｌ１（配列番号３７および配列番号４２）、Ｈ１Ｌ０（配列番号３８および配列番号４１）、Ｈ１Ｌ１（配列番号３８および配列番号４２）、Ｈ２Ｌ０（配列番号３９および配列番号４１）、Ｈ２Ｌ１（配列番号３９および配列番号４２）、Ｈ３Ｌ０（配列番号４０および配列番号４１）またはＨ３Ｌ１（配列番号４０および配列番号４２）。
Ｌ０（配列番号４１）は、Ｌ０ ９１Ａ（配列番号７４）で置換され得る。
上記の抗体重鎖可変領域は、配列番号２８に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有し得る。上記の抗体軽鎖可変領域は、配列番号３５に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有し得る。
上記の抗体重鎖可変領域は、配列番号４０に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有し得る。上記の抗体軽鎖可変領域は、配列番号４１に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有し得る。上記の抗体軽鎖可変領域は、配列番号７４に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有し得る。
上記の抗体重鎖可変領域は、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸の置換、挿入または欠失を含んでなる、配列番号２７〜３１のうちのいずれか１つの変異体であり得る。上記の抗体軽鎖可変領域は、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸の置換、挿入または欠失を含んでなる、配列番号３４〜３６のうちのいずれか１つの変異体であり得る。
上記の抗体重鎖可変領域は、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸の置換、挿入または欠失を含んでなる、配列番号３７〜４０のうちのいずれか１つの変異体であり得る。上記の抗体軽鎖可変領域は、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸の置換、挿入または欠失を含んでなる、配列番号４１、４２または７４の変異体であり得る。
例えば、上に記載された基準ＣＤＲおよび基準フレームワーク残基の置換は、少なくとも７５％同一であるかまたは３０アミノ酸までの置換を含んでなる変異体配列として、変異体重鎖可変領域または変異体軽鎖可変領域にも存在し得る。
上記重鎖可変領域のいずれかが、好適なヒト定常領域と組み合わされ得る。上記軽鎖可変領域のいずれかが、好適な定常領域と組み合わされ得る。
本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号６２の重鎖および／または配列番号６４の軽鎖可変領域を含み得る。
上記の抗体重鎖は、配列番号６２に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有し得る。上記の抗体軽鎖は、配列番号６４に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有し得る。
上記の抗体重鎖は、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸の置換、挿入または欠失を含んでなる、配列番号６２のいずれか１つの変異体であり得る。上記の抗体軽鎖は、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸の置換、挿入または欠失を含んでなる、配列番号６４のいずれか１つの変異体であり得る。
円盤様のＳＡＰ分子は、２つの面を有する。５つの各プロトマー上に存在する単一のアルファヘリックスは、Ａ面上に位置する。各プロトマーのカルシウム依存性リガンド結合ポケットは、Ｂ面上に位置し、ゆえに、この面は、ＳＡＰがアミロイド原線維に結合していると塞がれる。治療的有用性を有する本発明の抗原結合タンパク質の場合、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質によって認識されるエピトープは、望ましくは、ＳＡＰがアミロイド沈着物に結合しているときにＳＡＰに接近しやすいものであるので、ＳＡＰ分子のＡ面または縁に位置する。そして、本抗原結合タンパク質は、アミロイドと結合したＳＡＰを認識することができ、アミロイドと結合したＳＡＰに結合することができ、その結果、身体の効率的なマクロファージ依存性クリアランス機構の引き金を引く補体の活性化をもたらす。したがって、本発明の実施形態では、本抗原結合タンパク質は、インビボにおいてアミロイド原線維に結合したヒトＳＡＰに結合する。本発明の別の実施形態では、本抗原結合タンパク質は、ヒトＳＡＰのＡ面に結合する。
本抗原結合タンパク質は、ラット、マウス、ウサギ、ラクダ（または関連するラクダ科の種）または霊長類（例えば、カニクイザル、旧世界ザル、大型類人猿またはヒト）に由来し得る。特定の実施形態において、本抗原結合タンパク質は、マウスに由来する。別の実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ヒトに由来する。本抗原結合タンパク質は、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。本抗原結合タンパク質は、ヒト抗体であり得る。本抗原結合タンパク質は、マウス抗体ではない。
本抗原結合タンパク質は、任意のアイソタイプまたはサブクラスであり得る定常領域を含み得る。その定常領域は、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体であり得る。本抗原結合タンパク質の定常領域は、ＩｇＧ１であり得る。
本発明の特定の実施形態において、本抗原結合タンパク質は、補体の活性化において機能的な定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３の定常領域を含む。
本発明の別の実施形態において、本抗原結合タンパク質は、マクロファージへの結合において機能的な定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３の定常領域を含む。
本発明のさらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は、補体の活性化とマクロファージへの結合の両方において機能的な定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３の定常領域を含む。
本抗原結合タンパク質は、その抗体が、変更されたエフェクター機能／ＡＤＣＣおよび／または補体の活性化を有するように変異された定常ドメインから選択される１つ以上の改変を含み得る。好適な改変の例は、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２００１）２７６：６５９１−６６０４、Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（２００６）１０３：４００５−４０１０およびＵＳ６７３７０５６、国際公開第２００４０６３３５１号および国際公開第２００４０２９２０７号に記載されている。
本抗原結合タンパク質は、その抗原結合タンパク質が、変更されたエフェクター機能／ＡＤＣＣおよび／または補体の活性化を有するように変更されたグリコシル化プロファイルを有する定常ドメインを含み得る。変更されたグリコシル化プロファイルを有する抗原結合タンパク質を生成するのに適した方法の例は、国際公開第２００３／０１１８７８号、国際公開第２００６／０１４６７９号およびＥＰ１２２９１２５に記載されている。
本発明の実施形態では、抗原結合に関与する領域（例えば、ＣＤＲ）内にアミド分解を受けやすい残基を有しない抗原結合タンパク質が選択される。本発明のさらなる実施形態では、補体の活性化に関与する領域内にアミド分解を受けやすい残基を有しない抗原結合タンパク質が選択される。
本発明はまた、本明細書中に記載されるような抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。その核酸分子は、重鎖可変配列または重鎖完全長配列と、軽鎖可変配列または軽鎖完全長配列の両方をコードする配列を含み得る。あるいは、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、重鎖可変配列もしくは重鎖完全長配列、または軽鎖可変配列もしくは軽鎖完全長配列をコードする配列を含み得る。
重鎖可変領域をコードする核酸分子は、配列番号５１または５３〜５７のうちのいずれか１つを含み得る。軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、配列番号５２または５８〜６０のうちのいずれか１つを含み得る。
上記重鎖をコードする核酸分子は、配列番号６１を含み得る。上記軽鎖をコードする核酸分子は、配列番号６３を含み得る。
上記重鎖可変領域をコードする核酸分子は、配列番号６５または６７〜７０のうちのいずれか１つを含み得る。上記軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、配列番号６６または７１〜７３のうちのいずれか１つを含み得る。
上記核酸分子はまた、コードされる重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列を変更しない１つ以上のヌクレオチド置換を含み得る。
本発明はまた、本明細書中に記載されるような核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本明細書中に記載されるような発現ベクターを含む組換え宿主細胞もまた提供される。
本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、好適な宿主細胞において産生され得る。本明細書中に記載されるような抗原結合タンパク質を生成するための方法は、本明細書中に記載されるような宿主細胞を培養する工程および抗原結合タンパク質を回収する工程を包含し得る。形質転換された、トランスフェクトされたまたは形質導入された組換え宿主細胞は、少なくとも１つの発現カセットを含み得、ここで、前記発現カセットは、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。あるいは、形質転換された、トランスフェクトされたまたは形質導入された組換え宿主細胞は、少なくとも１つの発現カセットを含み得、ここで、第１の発現カセットが、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２のカセットを含む。安定的に形質転換された宿主細胞は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の重鎖および／または軽鎖をコードする１つ以上発現カセットを含むベクターを含み得る。例えば、そのような宿主細胞は、軽鎖をコードする第１のベクターおよび重鎖をコードする第２のベクターを含み得る。
宿主細胞は、真核生物、例えば、哺乳動物の細胞であり得る。そのような細胞株の例としては、ＣＨＯまたはＮＳ０が挙げられる。宿主細胞は、培養液、例えば、無血清培養液中で培養され得る。本抗原結合タンパク質は、宿主細胞によって培養液中に分泌され得る。本抗原結合タンパク質は、本抗原結合タンパク質を含む前記培養液に対して少なくとも９５％以上（例えば、９８％以上）に精製することができる。
本抗原結合タンパク質および薬学上許容される担体を含んでなる医薬組成物が提供され得る。使用するための指示書とともに医薬組成物を備えるキットオブパーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）が提供され得る。便宜のために、そのキットは、使用するための指示書とともに、所定量の試薬を備え得る。
抗体の構造
インタクトな抗体
ほとんどの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパーおよびラムダと呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てることができる。ヒト抗体は、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、５つの異なるクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＧおよびＩｇＡは、さらに、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２に細分することができる。少なくともＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを有するマウスおよびラットにおいて種変異体が存在する。
可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。インタクトな重鎖および軽鎖の可変ドメインの各々は、３つのＣＤＲに接続された４つのＦＲを含む。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によって共に近位に保持され、他の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
定常領域は、抗体と抗原との結合に直接関わらないが、走化性作用、オプソニン作用、および潜在的には、生細胞の抗原標的の場合、補体の細胞溶解作用をもたらす様々なエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合によるファゴサイトーシス、胎児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、およびＣ１ｑ成分を介した補体の活性化）を示す。ＩｇＧ１クラスのヒト抗体は、補体系の活性化において最も強力であり、ゆえに、本発明の抗体を治療に適用するために望ましいアイソタイプである。
ヒトＩｇＧ２定常領域は、古典経路によって補体を活性化する能力または抗体依存性細胞傷害を媒介する能力を本質的に欠くと報告されている。ＩｇＧ４定常領域は、古典経路によって補体を活性化する能力を欠くと報告されており、抗体依存性細胞傷害をほんの弱く媒介する。これらのエフェクター機能を本質的に欠く抗体は、「非溶解性」抗体と呼ばれることがある。
ヒト抗体
ヒト抗体は、当業者に公知のいくつかの方法によって生成され得る。ヒト抗体は、ヒトミエローマ細胞株またはマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株を用いたハイブリドーマ法によって生成することができる（Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３，３００１およびＢｒｏｄｅｕｒ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，１９８７）を参照のこと）。代替方法としては、ファージライブラリーまたはトランスジェニックマウス（その両方ともがヒト可変領域レパートリーを使用する）の使用が挙げられる（Ｗｉｎｔｅｒ（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：４３３−４５５；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３を参照のこと）。
マウス免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントで置き換えられたいくつかの系統のトランスジェニックマウスが、現在入手可能である（Ｔｏｍｉｚｕｋａ（２０００）ＰＮＡＳ ９７：７２２−７２７；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６を参照のこと）。抗原チャレンジの際、そのようなマウスは、ヒト抗体のレパートリーを産生することができ、そのレパートリーから目的の抗体を選択することができる。
ヒト抗原結合タンパク質（およびそのフラグメント）を生成するために、ファージディスプレイ技術を用いることができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ １３：３２４５−３２６０を参照のこと）。
親和性成熟の手法（Ｍａｒｋｓ Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ（１９９２）１０：７７９−７８３）を用いることにより、結合親和性が改善されることがあり、ここで、重（Ｈ）鎖可変領域および軽（Ｌ）鎖可変領域を天然に存在する変異体で順次置き換え、改善された結合親和性に基づいて選択することによって、最初のヒト抗体の親和性が改善される。この手法の変法（例えば、「エピトープインプリンティング」）もまた、現在利用可能である（例えば、国際公開第９３／０６２１３号；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６を参照のこと）。
キメラ抗体およびヒト化抗体
キメラ抗体は、通常、組換えＤＮＡ法を用いて作製される。その抗体をコードするＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）を、従来の手順を用いて（例えば、抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）単離し、配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの典型的な起源として役立つ。そのＤＮＡは、いったん単離されると、発現ベクターに配置され、次いでその発現ベクターを、別途、免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞またはミエローマ細胞）にトランスフェクトすることにより、抗体の合成がもたらされる。そのＤＮＡは、ヒトのＬ鎖およびＨ鎖に対するコード配列で、対応する非ヒト（例えば、マウス）Ｈ定常領域およびＬ定常領域を置換することによって、改変され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８４）ＰＮＡＳ ８１：６８５１を参照のこと）。
免疫原性の大幅な低下は、非ヒト（例えば、マウス）抗体（「ドナー」抗体）のＣＤＲだけをヒトフレームワーク（「アクセプターフレームワーク」）およびヒト定常領域に移植してヒト化抗体を作製することによって達成することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。しかしながら、ＣＤＲ移植自体では、抗原結合特性が完全に保持されない可能性があり、かなりの抗原結合親和性を回復するべきである場合、ドナー抗体のいくつかのフレームワーク残基（時折、「復帰突然変異」と呼ばれる）をヒト化分子において保存する必要があることが頻繁にみられる（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＰＮＡＳ ８６：１０，０２９−１０，０３３：Ｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５１：５０１−５０２を参照のこと）。この場合、ヒトフレームワーク（ＦＲ）をもたらすために、非ヒトドナー抗体と最も高い配列相同性を示すヒト可変領域をデータベースから選択する。ヒトＦＲの選択は、ヒトコンセンサス抗体または個別のヒト抗体のいずれかから行うことができる。必要ならば、ドナー抗体の重要な残基をヒトアクセプターフレームワークに置換することによって、ＣＤＲのコンフォメーションを保存することができる。そのような構造的に重要な残基の特定を助けるために、抗体のコンピュータモデリングを用いてもよい（国際公開第９９／４８５２３号を参照のこと）。
あるいは、ヒト化は、「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」のプロセスによって行ってもよい。独特のヒトおよびマウスの免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の統計解析から、露出される残基の正確なパターンが、ヒト抗体およびマウス抗体において異なり、ほとんどの個別の表面の位置が、少数の種々の残基に対して強い優先性を有することが明らかになった（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８；およびＰｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：９５９−９７３を参照のこと）。ゆえに、そのフレームワーク領域内の、ヒト抗体に通常見られる残基とは異なる露出残基を置き換えることによって、非ヒトＦｖの免疫原性を低下させることが可能である。タンパク質の抗原性は、表面への接近可能性と相関し得るので、表面残基の置換は、マウス可変領域をヒト免疫系に対して「見えなく」するのに十分であり得る（Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１１３：Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１０５−１３４もまた参照のこと）。このヒト化の手順は、抗体の表面だけを変更して、支持残基はそのまま保つので、「ベニアリング」と呼ばれる。さらなる代替アプローチとしては、国際公開第０４／００６９５５号に示されているアプローチ、および細菌発現系を使用し、配列においてヒト生殖系列に近い抗体を生成するＨｕｍａｎｅｅｒｉｎｇＴＭ（Ｋａｌｏｂｉｏｓ）の手順（Ａｌｆｅｎｉｔｏ−Ｍ Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｊａｎｕａｒｙ ２００７，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。
二重特異性抗原結合タンパク質
二重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗原結合タンパク質である。そのような抗原結合タンパク質を作製する方法は、当該分野で公知である。従来、二重特異性抗原結合タンパク質の組換え作製は、２つの免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対の同時発現に基づき、ここで、その２つのＨ鎖は、異なる結合特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５３９；国際公開第９３／０８８２９号；およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ １０：３６５５−３６５９を参照のこと）。Ｈ鎖とＬ鎖とのランダムな組み合わせを理由に、潜在的に１０個の異なる抗体構造の混合物（そのうちの１つだけが、所望の結合特異性を有する）が生成される。代替アプローチは、所望の結合特異性を有する可変ドメインを、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む重鎖定常領域と融合することを含む。軽鎖結合に必要な部位を含むＣＨ１領域は、その融合物の少なくとも１つに存在し得る。これらの融合物および所望であればＬ鎖をコードするＤＮＡが、別個の発現ベクターに挿入され、次いで、好適な宿主生物に同時トランスフェクトされる。にもかかわらず、２つまたは３つすべての鎖に対するコード配列を１つの発現ベクターに挿入することも可能である。１つのアプローチにおいて、二重特異性抗体は、一方の腕における第１の結合特異性を有するＨ鎖、および他方の腕における第２の結合特異性を提供するＨ−Ｌ鎖対から構成される（国際公開第９４／０４６９０号を参照のこと）。Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０もまた参照のこと。
抗原結合フラグメント
定常領域を欠くフラグメントは、古典経路によって補体を活性化する能力または抗体依存性細胞傷害を媒介する能力を欠く。従来、そのようなフラグメントは、例えば、パパイン消化による、インタクトな抗体のタンパク分解性の消化によって生成されるが（例えば、国際公開第９４／２９３４８号を参照のこと）、組換え的に形質転換された宿主細胞から直接産生されてもよい。ＳｃＦｖの生成については、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６を参照のこと。さらに、抗原結合フラグメントは、下に記載されるような種々の操作手法を用いて生成されてもよい。
Ｆｖフラグメントは、Ｆａｂフラグメントよりも低いその２本の鎖の相互作用エネルギーを有するとみられる。ＶＨドメインとＶＬドメインとの会合を安定化するために、それらは、ペプチド（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ ８５（１６）：５８７９−５８８３）、ジスルフィド架橋（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１３６２−１３６７）および「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅ）」変異（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，６：７８１−７８８）を用いて連結された。ＳｃＦｖフラグメントは、当業者に周知の方法によって作製することができる（Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２：９７−１０５およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：１９５−２１７を参照のこと）。ＳｃＦｖは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞または真核細胞において産生されることがある。ＳｃＦｖの欠点の１つは、その生成物が一価であること（そのせいで、多価の結合によるアビディティーの増強が妨げられる）および半減期が短いことである。これらの問題を克服する試みとしては、化学的結合（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃａｎ．Ｒｅｓ ５３：４０２６−４０３４；およびＭｃＣａｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：３０１−３１４）によるか、または対になっていないＣ末端のシステイン残基を含むＳｃＦｖの自発的な部位特異的二量体化（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ ２６：１８７−２０４を参照のこと）による、追加のＣ末端システインを含むＳｃＦｖから作製される二価（ＳｃＦｖ’）２が挙げられる。あるいは、ペプチドリンカーを３〜１２残基に短縮することによってＳｃＦｖが多量体を形成せざるを得なくすることにより、「ダイアボディ」を形成することができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：６４４４−６４４８を参照のこと）。そのリンカーの短縮は、なおもさらにＳｃＦｖ三量体（「トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）」、Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １０：４２３−４３３を参照のこと）および四量体（「テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）」、Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，４５３：１６４−１６８を参照のこと）をもたらすことができる。二価のＳｃＦｖ分子の構築は、タンパク質二量体化モチーフとの遺伝的融合によって「ミニ抗体」（Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９−１５８４を参照のこと）および「ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）」（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１を参照のこと）を形成することによっても行うことができる。ＳｃＦｖ−Ｓｃ−Ｆｖタンデム（（ＳｃＦＶ）２）は、２つのＳｃＦｖ単位を第３のペプチドリンカーによって連結することによっても生成され得る（Ｋｕｒｕｃｚ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｏｌ．１５４：４５７６−４５８２を参照のこと）。１つの抗体由来のＶＨドメインが別の抗体のＶＬドメインに短いリンカーによって接続されたものからなる２つの一本鎖融合産物を非共有結合的に会合することによって、二重特異性ダイアボディを作製することができる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ ７７：７６３−７７２を参照のこと）。そのような二重特異性ダイアボディの安定性は、前に記載されたようなジスルフィド架橋もしくは「ノブ・イン・ホール」変異を導入することによって、または一本鎖ダイアボディ（ＳｃＤｂ）を形成することによって増強することができ、ここで、２つのハイブリッドＳｃＦｖフラグメントは、ペプチドリンカーを介して接続される（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２６：１７９−１８８を参照のこと）。四価の二重特異性分子は、例えば、ＳｃＦｖフラグメントを、ヒンジ領域を介してＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインまたはＦａｂフラグメントに融合することによって、入手可能である（Ｃｏｌｏｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−１６３を参照のこと）。あるいは、四価の二重特異性分子は、二重特異性の一本鎖ダイアボディの融合によって作り出された（Ａｌｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４５４：９０−９４を参照のこと）。ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフを含むリンカーを用いたＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデムの二量体化（ＤｉＢｉミニ抗体、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４３２：４５−４９を参照のこと）または分子内の対形成を防止する配向で４つの抗体可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を含む一本鎖分子の二量体化（タンデムダイアボディ、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１−５６を参照のこと）によって、より小さい四価の二重特異性分子を形成することもできる。Ｆａｂ’フラグメントの化学的結合によるか、またはロイシンジッパーを介したヘテロ二量体化によって、二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作り出すことができる（Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５；およびＫｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照のこと）。単離されたＶＨおよびＶＬドメイン（Ｄｏｍａｎｔｉｓ ｐｌｃ）もまた利用可能である（ＵＳ６，２４８，５１６；ＵＳ６，２９１，１５８；およびＵＳ６，１７２，１９７を参照のこと）。
ヘテロ結合体抗体
ヘテロ結合体抗体は、任意の好都合な架橋方法を用いて形成される、２つの共有結合的に結合された抗体から構成される。例えば、ＵＳ４，６７６，９８０を参照のこと。
他の改変
本発明の抗原結合タンパク質は、そのエフェクター機能を増強または変更する他の改変を含み得る。抗体のＦｃ領域と様々なＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体の固定、ファゴサイトーシスおよび抗体の半減期／クリアランスを含む、抗体のエフェクター機能を媒介すると考えられている。抗体のＦｃ領域に対する様々な改変は、所望の特性に応じて行われ得る。例えば、別途溶解性の抗体を非溶解性にするＦｃ領域における特定の変異は、ＥＰ０６２９２４０およびＥＰ０３０７４３４に詳述されているものであるか、またはサルベージ受容体に結合するエピトープを抗体に組み込むことにより、血清半減期を延長し得る（ＵＳ５，７３９，２７７を参照のこと）。ヒトＦｃγ受容体としては、ＦｃγＲ（Ｉ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび胎児型ＦｃＲｎが挙げられる。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１−６６０４では、ＩｇＧ１残基の共通のセットが、すべてのＦｃγＲへの結合に関わるが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、この共通セットの外側の異なる部位を利用することが立証された。１つの群のＩｇＧ１残基は、アラニンに変更されたとき、すべてのＦｃγＲへの結合性を低下させた：Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７およびＰｒｏ−２３９。そのすべてが、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインに存在し、ＣＨ１およびＣＨ２を結合するヒンジ付近に密集している。ＦｃγＲＩは、結合のためにＩｇＧ１残基の共通セットだけを利用するが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、その共通セットに加えて異なる残基と相互作用する。いくつかの残基の変更によって、ＦｃγＲＩＩ（例えば、Ａｒｇ−２９２）またはＦｃγＲＩＩＩ（例えば、Ｇｌｕ−２９３）に対する結合だけが低下した。いくつかの変異体は、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩに対して改善された結合性を示したが、他方の受容体への結合性に影響しなかった（例えば、Ｓｅｒ−２６７Ａｌａは、ＦｃγＲＩＩへの結合性を改善したが、ＦｃγＲＩＩＩへの結合性は影響されなかった）。他の変異体は、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩに対する改善された結合性を示し、他方の受容体への結合性を低下させた（例えば、Ｓｅｒ−２９８Ａｌａは、ＦｃγＲＩＩＩへの結合性を改善し、ＦｃγＲＩＩへの結合性を低下させた）。ＦｃγＲＩＩＩａについては、最もよく結合するＩｇＧ１変異体は、Ｓｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３およびＬｙｓ−３３４においてアラニン置換を組み合わせていた。胎児型ＦｃＲｎ受容体は、抗体のクリアランスと組織を越えたトランスサイトーシスの両方にかかわると考えられている（Ｊｕｎｇｈａｎｓ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ １６：２９−５７；およびＧｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９−７６６を参照のこと）。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用すると判定されたヒトＩｇＧ１残基としては、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５が挙げられる。この項に記載される位置のいずれにおける置換も、血清半減期の延長および／または抗体のエフェクター特性の変更を可能にし得る。
他の改変としては、抗体のグリコシル化変異体が挙げられる。定常領域内の保存された位置における抗体のグリコシル化は、抗体の機能、特に、上に記載された機能などのエフェクター機能に対して著明な影響を有すると知られている（例えば、Ｂｏｙｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８を参照のこと）。１つ以上の炭水化物部分が付加、置換、削除または改変された、抗体またはその抗原結合フラグメントのグリコシル化変異体が企図される。アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−トレオニンモチーフを導入することにより、炭水化物部分を酵素的に結合するための潜在的な部位が作り出されるので、それを用いて、抗体のグリコシル化を操作してもよい。Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：８８６８−８８７６では、ベータ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｃｅ）および／またはアルファ，２，３シアリルトランスフェラーゼを用いた再ガラクトシル化（ｒｅｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ）および／または再シアル化（ｒｅｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）のプロセスによって、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端のシアル化（ｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）が増加した。末端のシアル化の増加は、免疫グロブリンの半減期を延長させると考えられる。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と同様に、通常、グリコフォームの混合物として生成される。この混合物は、抗体が真核生物、特に、哺乳動物の細胞において産生されるとき、特に明らかである。規定のグリコフォームを製造する種々の方法が開発されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：３７１：Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３４４；Ｗａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：５７９；Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ ３４：７２７を参照のこと）。本明細書中に記載されるような抗体（例えば、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１の抗体）は、規定数（例えば、７つ以下、例えば、５つ以下、例えば、２つまたは１つ）のグリコフォームを含み得る。
抗体は、非タンパク質性（ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎａｅｏｕｓ）ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）に結合されてもよい。タンパク質とＰＥＧとの結合体化は、タンパク質の半減期を延長するため、ならびにタンパク質の抗原性および免疫原性を低下させるための、確立された手法である。種々の分子量およびスタイル（線状または分枝状）を有するＰＥＧ化の使用が、インタクトな抗体ならびにＦａｂ’フラグメントを用いて調べられている（Ｋｏｕｍｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．１９８：８３−９５を参照のこと）。
生成方法
抗原結合タンパク質は、トランスジェニック生物（例えば、ヤギ（Ｐｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７−１５７を参照のこと）、ニワトリ（Ｍｏｒｒｏｗ（２０００）Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ ２０：１−５５を参照のこと、マウス（Ｐｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）または植物（Ｄｏｒａｎ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１９９−２０４；Ｍａ（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：６０１−６０６；Ｂａｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＢｉｏＰｈａｒｍ １３：５０−５４；Ｓｔｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：５８３−５９０を参照のこと））において産生され得る。
抗原結合タンパク質は、化学合成によっても生成され得る。しかしながら、抗原結合タンパク質は、通常、当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて生成される。抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、単離され、複製可能なベクター（例えば、さらなるクローニング（増幅）または発現のためのプラスミド）に挿入される。特に、宿主細胞がＣＨＯまたはＮＳ０である場合、１つの発現系は、グルタメート合成酵素系（例えば、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓが販売するもの）である。抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、従来の手順（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）を用いて、容易に単離され、配列決定される。使用され得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体が挙げられ、その中でもプラスミドが通常使用される。一般に、そのようなベクターは、発現を促進するために、抗原結合タンパク質ポリヌクレオチドに作動可能に連結された、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列をさらに含む。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別個のベクターに挿入され、同じ宿主細胞に同時にもしくは連続的に導入されてもよいし（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは形質導入によって）、所望であれば、重鎖と軽鎖の両方を、前記導入の前に同じベクターに挿入してもよい。
コドン最適化は、その配列でトランスフェクトされたときのレベルと比較して、コドン最適化された遺伝子でトランスフェクトされたときに宿主細胞によって産生されるタンパク質の総レベルをより高くする目的で使用されることがある。いくつかの方法が公開されている（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２１４−２１５；Ｗ０９８／３４６４０；Ｗ０９７／１１０８６）。遺伝暗号の重複性に起因して、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドに対する代替のポリヌクレオチド（特に、所与の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されたもの）もまた、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質をコードし得る。ゆえに、本発明の抗原結合タンパク質のコドン使用頻度は、転写物および／または生成物の収量を増大するように、宿主細胞のコドンバイアスに適応するように改変することができる（例えば、Ｈｏｅｋｅｍａ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９８７ ７（８）：２９１４−２４）。コドンの選択は、発現のために使用される宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
シグナル配列
抗原結合タンパク質は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的な切断部位を有する異種のシグナル配列との融合タンパク質として生成されてもよい。そのシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされるべきである。原核生物の宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーであり得る。酵母による分泌の場合、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダーであり得る（例えば、国際公開第９０／１３６４６号を参照のこと）。哺乳動物細胞系では、単純ヘルペスｇＤシグナルなどのウイルスの分泌リーダー、および天然の免疫グロブリンシグナル配列が好適であり得る。通常、シグナル配列は、抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡに読み枠でライゲートされる。配列番号７９に示されるシグナル配列などのマウスシグナル配列が使用され得る。
複製起点
複製起点は、当該分野で周知である（ほとんどのグラム陰性菌に適するｐＢＲ３２２、ほとんどの酵母に適する２μプラスミド、およびほとんどの哺乳動物細胞に適する様々なウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ））。一般に、複製起点の構成要素は、哺乳動物の発現ベクターにとって必要とされないが、ＳＶ４０は、初期プロモーターを含むので、使用されることがある。
選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、または（ｂ）栄養要求性の（ａｕｘｉｏｔｒｏｐｈｉｃ）欠損を補完するか、もしくは複合培地において利用可能でない栄養分を供給するタンパク質、あるいは（ｃ）それらの両方の組み合わせをコードする。選択スキームは、宿主細胞の成長の停止を含み得る。抗原結合タンパク質をコードする遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、例えば、同時に送達された選択マーカーによって付与された薬物耐性に起因して、生存する。一例は、ＤＨＦＲ選択マーカーであり、ここで、形質転換体は、メトトレキサートの存在下において培養される。目的の外来性遺伝子のコピー数を増幅させるために、メトトレキサートの存在下において、そのメトトレキサートの量を増加させながら細胞を培養することができる。ＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲ選択にとって特に有用な細胞株である。さらなる例は、グルタメート合成酵素発現系（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）である。酵母において使用するための選択遺伝子の例は、ｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３８を参照のこと）。
プロモーター
抗原結合タンパク質の発現に適したプロモーターは、その抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに作動可能に連結される。原核生物宿主用のプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン、ならびにＴａｃなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。酵母細胞における発現に適したプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｒｈｙｄｅ）３リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグルコキナーゼが挙げられる。誘導性酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、メタロチオネイン、および窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用に関与する酵素が挙げられる。
哺乳動物細胞系における発現用のプロモーターとしては、ウイルスプロモーター（例えば、ポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（特に、前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよび初期または後期サルウイルス４０）が挙げられる。当然のことながら、プロモーターの選択は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づく。第１のプラスミドは、ＲＳＶおよび／またはＳＶ４０および／またはＣＭＶプロモーター、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡ、ネオマイシンおよびアンピシリン耐性選択マーカーとともにκＣ領域を含み得、第２のプラスミドは、ＲＳＶまたはＳＶ４０プロモーター、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡ、γ１定常領域をコードするＤＮＡ、ＤＨＦＲおよびアンピシリン耐性マーカーを含み得る。
エンハンサーエレメント
必要に応じて、例えば、高等真核生物における発現のために、ベクター内のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたエンハンサーエレメントを使用してもよい。哺乳動物のエンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン由来のエンハンサーエレメントが挙げられる。あるいは、真核（ｅｕｋａｒｏｙｔｉｃ）細胞ウイルス由来のエンハンサーエレメント（例えば、ＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０におけるもの）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマ（ｐｏｌｙｍａ）エンハンサー、バキュロウイルスエンハンサー）またはマウスＩｇＧ２ａ遺伝子座（国際公開第０４／００９８２３号を参照のこと）を使用してもよい。エンハンサーは、ベクター上のプロモーターに対して上流の部位に配置され得る。あるいは、エンハンサーは、他の位置、例えば、非翻訳領域内またはポリアデニル化シグナルの下流に配置され得る。エンハンサーの選択および位置決めは、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
ポリアデニル化／終結
真核生物系において、ポリアデニル化シグナルは、本抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに作動可能に連結される。そのようなシグナルは、通常、オープンリーディングフレームの３’に配置される。哺乳動物系において、非限定的な例としては、成長ホルモン、伸長因子−１アルファおよびウイルス（例えば、ＳＶ４０）遺伝子に由来するシグナル、またはレトロウイルスの末端反復配列が挙げられる。酵母系において、ポリアデニル化（ｐｏｌｙｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）／終結シグナルの非限定的な例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ）遺伝子に由来するものが挙げられる。原核生物系において、ポリアデニル化シグナルは、通常必要とされず、その代わりにより短くかつより明確なターミネーター配列を使用することが通例である。ポリアデニル化／終結配列の選択は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
高収量のための他の方法／エレメント
上記に加えて、収量を増加させるために使用することができる他の特徴としては、クロマチンリモデリングエレメント、イントロンおよび宿主細胞特異的なコドンの改変が挙げられる。
宿主細胞
抗原結合タンパク質をコードするクローニングベクターまたは発現ベクターに適した宿主細胞は、原核（ｐｒｏｋａｒｏｙｔｉｃ）細胞、酵母細胞または高等真核細胞である。好適な原核細胞としては、真正細菌、例えば、腸内細菌科（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＡＴＣＣ３１，４４６；３１，５３７；２７，３２５））、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓおよびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＤＤ２６６７１０を参照のこと））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。酵母宿主細胞のうち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、ＡＴＣＣ１６，０４５；１２，４２４；２４１７８；５６，５００）、ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２、２２６）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３０７０、Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０８：１８５−１９２もまた参照のこと）、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４２３４）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、ＴｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ）もまた企図される。
高等真核生物宿主細胞としては、哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児腎株２９３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ．１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ ＮＯ：ＣＲＬ１０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ ＮＯ．ＣＲＬ１５７３）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ ＮＯ：ＣＣＬ６１、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞株（例えば、ＤＧ４４）（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５−５５６を参照のこと）、特に、懸濁培養に適合されたＣＨＯ細胞株、マウスセルトリ細胞、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ＨｅｐＧ２およびミエローマまたはリンパ腫細胞、例えば、ＮＳ０（ＵＳ５，８０７，７１５を参照のこと）、Ｓｐ２／０、Ｙ０）が挙げられる。
そのような宿主細胞は、抗原結合タンパク質の質、機能および／または収量を改変するようにさらに操作され得るか、または適合され得る。非限定的な例としては、特定の修飾（例えば、グリコシル化）酵素およびタンパク質フォールディングシャペロンの発現が挙げられる。
細胞培養方法
抗原結合タンパク質をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知の任意の方法によって培養され得る。宿主細胞は、スピナーフラスコ、ローラーボトルまたは中空糸システムにおいて培養され得るが、大規模生成の場合、特に懸濁培養のために撹拌槽反応器が使用される。その撹拌タンカー（ｓｔｉｒｒｅｄ ｔａｎｋｅｒｓ）は、例えば、スパージャー、バッフルまたは低剪断インペラーを用いた通気に適合され得る。バッフルカラムおよびエアリフト反応器の場合、空気または酸素バブルによる直接的な通気が使用され得る。宿主細胞が、無血清培養液中で培養される場合、その培地には、通気プロセスの結果としての細胞損傷の防止を助ける細胞保護剤（例えば、プルロニックＦ−６８）が補充される。宿主細胞の特徴に応じて、足場依存性細胞株に対する増殖基質としてマイクロ担体を使用してもよいし、細胞を懸濁培養（これが典型的である）に適合してもよい。宿主細胞の培養、特に、無脊椎動物宿主細胞の培養では、種々の操作上の様式（例えば、流加培養法、反復バッチ処理（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）（Ｄｒａｐｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１０３−１０９を参照のこと）、拡張バッチ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｂａｔｃｈ）プロセスまたは灌流培養）を利用してよい。組換え的に形質転換された哺乳動物宿主細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）などの血清含有培地中で培養され得るが、そのような宿主細胞は、必要に応じてエネルギー源（例えば、グルコース、および組換えインスリンなどの合成成長因子）が補充された、合成無血清培地（例えば、Ｋｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１５３−１６３に開示されているもの）または商業的に入手可能な培地（例えば、ＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭまたはＵｌｔｒａＣＨＯＴＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ ＮＪ，ＵＳＡ））中で培養され得る。宿主細胞の無血清培養は、それらの細胞が無血清条件において生育するように適合されていることが求められる場合がある。１つの適合アプローチは、そのような宿主細胞を血清含有培地中で培養し、その宿主細胞が無血清条件に適合できるようになるように、その培養液の８０％を無血清培地と繰り返し交換することである（例えば、Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ２１ｓｔ ｃｅｎｔｕｒｙ（Ｂｅｕｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ，６１９−６２３，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照のこと）。
培地中に分泌される抗原結合タンパク質は、意図された用途に適した精製の程度をもたらす種々の手法を用いて回収および精製され得る。例えば、ヒト患者を治療するための抗原結合タンパク質の使用では、通常、少なくとも９５％の純度、より通常では、９８％または９９％以上の純度（粗培養液と比べて）が要求される。その培養液由来の細胞残屑は、通常、遠心分離に続く、例えば、精密濾過、限外濾過および／または深層濾過を用いた、上清の清澄化工程によって除去される。種々の他の手法（例えば、透析およびゲル電気泳動、ならびにクロマトグラフィー法（例えば、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティークロマトグラフィー（必要に応じて、ポリヒスチジンなどの親和性タグ化システムを含む）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、ＵＳ５，４２９，７４６を参照のこと））も利用可能である。様々な清澄化工程の後の抗体は、プロテインＡまたはＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて捕捉することができる。さらなるクロマトグラフィー工程（例えば、イオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーおよび硫酸アンモニウム沈殿）を続けることができる。様々なウイルス除去工程（例えば、ＤＶ−２０フィルターを用いた、例えば、ナノ濾過）も用いてもよい。これらの様々な工程の後、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ以上、または１００ｍｇ／ｍｌ以上の抗原結合タンパク質を含む精製された（例えば、モノクローナル）調製物が提供される。そのような調製物は、凝集型の抗原結合タンパク質を実質的に含まない。
抗原結合フラグメントの発現のために、細菌系が使用され得る。そのようなフラグメントは、細胞内、周辺質内に局在化され得るか、または細胞外に分泌され得る。不溶性タンパク質が、抽出され、再度折り畳まれることにより、当業者に公知の方法に従って活性なタンパク質を形成することができる（Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：１３−２０；およびＣｕｐｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｌｅｔｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２９：２７３−２７７を参照のこと）。
アミド分解は、アミド官能基が除去される化学反応である。生化学では、その反応は、アミノ酸のアスパラギンおよびグルタミンのアミド含有側鎖を損傷するので、タンパク質の分解において重要である。アスパラギンは、イソアスパルテートとアスパルテートとの混合物に変換される。グルタミン残基のアミド分解は、かなり低比率でしか生じない。アミド分解反応は、タンパク質の有用な寿命を制限し得る要因の１つであると考えられており、治療用タンパク質の製造中に生じる最も一般的な翻訳後修飾の１つでもある。例えば、インビトロまたはインビボにおける生物学的活性の低下または喪失は、組換えヒトＤＮＡｓｅおよび組換え可溶性ＣＤ４について報告されているのに対し、他の組換えタンパク質は、影響されないとみられる。
医薬組成物
本明細書中に記載されるような抗原結合タンパク質の精製された調製物は、本明細書中に記載されるヒトの疾患、障害および状態の治療において使用するために医薬組成物に組み込まれ得る。疾患、障害および状態という用語は、交換可能に使用される。上記医薬組成物は、アミロイド沈着物が組織に存在し、臨床上の疾病に至る構造的および機能的な損傷に関与する、任意の疾患の治療において使用することができる。ＳＡＰは、インビボにおいてアミロイド沈着物のすべてに常に存在し、治療有効量の本明細書中に記載される抗原結合タンパク質を含む医薬組成物は、その組織からのアミロイド沈着物のクリアランスに応答する疾患の治療において使用することができる。
上記医薬調製物は、薬学上許容される担体とともに抗原結合タンパク質を含み得る。その抗原結合タンパク質は、単独で投与されてもよいし、医薬組成物の一部として投与されてもよい。
通常、そのような組成物は、公知であるような、かつ基準に合った薬務によって求められているような、薬学上許容される担体を含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．を参照のこと）。そのような担体の例としては、必要に応じて好適な緩衝剤で５〜８の範囲内のｐＨに緩衝される、滅菌された担体（例えば、食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液またはデキストロース溶液）が挙げられる。
医薬組成物は、注射または持続注入（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内または門脈内）によって投与され得る。そのような組成物は、好適には、目に見える粒子状物質を含まない。医薬組成物、具体的にはＣＰＨＰＣを含む医薬組成物は、経口的にも投与され得る。
医薬組成物は、１ｍｇ〜１０ｇの抗原結合タンパク質、例えば、５ｍｇ〜１ｇの抗原結合タンパク質を含み得る。あるいは、その組成物は、５ｍｇ〜５００ｍｇ、例えば、５ｍｇ〜５０ｍｇを含み得る。
そのような医薬組成物を調製するための方法は、当業者に周知である。医薬組成物は、必要に応じて、使用するための指示書とともに、単位剤形として１ｍｇ〜１０ｇの抗原結合タンパク質を含み得る。医薬組成物は、当業者に周知または明らかな方法に従った、投与前の再構成用に凍結乾燥（フリーズドライ）され得る。抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプを有する場合、銅のキレート剤（例えば、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）またはＥＤＴＡまたはヒスチジン）を医薬組成物に加えることにより、このアイソタイプの抗体の銅によって媒介される分解の程度を低下させてもよい（ＥＰ０６１２２５１を参照のこと）。医薬組成物は、アルギニン塩基などの可溶化剤、ポリソルベート８０などの界面活性剤／抗凝集剤、および不活性ガス（例えば、バイアルのヘッドスペースの酸素を置き換える窒素）も含むことがある。
本抗原結合タンパク質を投与するための有効量および治療レジメンは、通常、経験的に決定され、患者の年齢、体重および健康状態、ならびに治療される疾患または障害などの因子に依存し得る。そのような因子は、主治医の範囲内である。適切な用量を選択する際の指針は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ（１９７７）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見られることがある。
被験体に投与される抗原結合タンパク質の投与量は、通常、１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１〜２５ｍｇ／ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重である。例えば、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／ｋｇであり得る。本抗原結合タンパク質は、非経口的に、例えば、皮下に、静脈内にまたは筋肉内に投与され得る。
ＳＡＰ枯渇化合物は、その活性に応じて０．１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。ＳＡＰ枯渇化合物は、被験体の体重あたりの用量の比とは無関係に、固定された用量で投与され得る。ＳＡＰ枯渇化合物は、１回以上の別々の、同時のまたは連続的な非経口の、１００ｍｇ以下、５０ｍｇ以下、２５ｍｇ以下または１０ｍｇ以下の用量で、投与され得る。
所望であれば、有効な１日量の治療用組成物は、その日のうちに、必要に応じて単位剤形で、適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６つまたはそれ以上の分割用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅｓ）で投与され得る。
本抗原結合タンパク質は、単一の大用量で投与されてもよいし、より低用量で繰り返し投与されてもよい。
１用量の投与は、２〜２４時間（例えば、２〜１２時間または２〜６時間）の時間にわたるゆっくりとした持続注入によるものであり得る。これにより、毒性の副作用が減少することがある。
１用量の投与は、必要であれば１回以上繰り返され得る（例えば、１日に３回、１日に１回、２日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月おきに１回、６ヶ月おきに１回または１２ヶ月おきに１回）。本抗原結合タンパク質は、維持療法によって、例えば、６ヶ月以上にわたって１週間に１回、投与され得る。本抗原結合タンパク質は、例えば３〜６ヶ月にわたる間欠療法、次いで、３〜６ヶ月間は投与せず、その後、再度、３〜６ヶ月にわたる抗原結合タンパク質の投与など、周期的に投与され得る。
例えば、１４または２８日おきに１回、各投与日において複数の分割用量の形態で皮下に投与され得る。
本抗原結合タンパク質は、治療を特定部位に対して標的にするような方法で被験体に投与され得る。例えば、抗原結合タンパク質は、組織内の限局性の局所アミロイド塊に局所的に注射されてもよいし、アミロイドが存在する器官への輸血用血液中に注入されてもよい。
本抗原結合タンパク質は、本明細書中に記載される疾患を治療するための１つ以上の他の治療的に活性な薬剤、具体的にはＳＡＰ枯渇化合物と併用して使用されなければならない。ＳＡＰ結合タンパク質の投与が完全かつ効果的に行われるために、循環からのＳＡＰの効果的な枯渇は、ＳＡＰ結合タンパク質の投与前に達成されなければならない。
最初にＳＡＰ枯渇化合物が投与されて、ほぼすべての循環ＳＡＰが除去される。これにより、組織においてアミロイド沈着物と会合した相当量のＳＡＰが残されるので、続いて抗ＳＡＰ抗原結合タンパク質を投与することによって、アミロイド沈着物への局在化および特異的な結合がその迅速かつ広範な退縮を促進することが可能になる。好適には、その抗ＳＡＰ抗原結合タンパク質は、ＳＡＰ枯渇化合物による治療を開始してから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０または２５日以上後に投与され得る。
上記の連続的な投与は、ＳＡＰ枯渇化合物による２回以上の連続的治療の後の抗ＳＡＰ抗原結合タンパク質による２回以上の連続的治療を含むことがある。
上記の連続的な投与は、ＳＡＰ枯渇化合物による１回の治療の後の抗ＳＡＰ抗原結合タンパク質による１回の連続的治療、次いでそれを１回以上繰り返す治療を含み得る。
上記の連続的／その後の用量は、最初の／その前の用量より多い量であってもよいし、最初の／その前の用量より少ない量であってもよい。
最初の用量のＳＡＰ枯渇化合物タンパク質の投与の後に、１回以上の連続的な（例えば、その後の）用量のＳＡＰ枯渇化合物および／または抗ＳＡＰ抗原結合タンパク質が投与され得、ここで、前記１回以上の連続的な用量は、最初の用量とほぼ同じであるかまたはそれより少ない量であり得る。
循環ＳＡＰの最初の枯渇の後、さらなる用量のＳＡＰ枯渇化合物および第１の用量の抗ＳＡＰ抗原結合タンパク質の投与に続いて、１回以上の連続的な（例えば、その後の）用量が投与され得、ここで、その後の用量の少なくとも１つは、最初の用量よりも多い量である。
したがって、投与は、所定または通例の投与スケジュールを使用してもよく、それにより、用量投与の間に所定の指定期間がもたらされる。そのスケジュールは、予め定められている限り、同じまたは異なる長さの期間を包含してもよい。適切なスケジュールが、ある特定の日の投与を含むと前もって定められている限り、任意の特定の組み合わせが、そのスケジュールによって網羅されるだろう。
医薬組成物は、他の医薬とともに（必要に応じて、使用するための指示書とともに）、抗原結合タンパク質のキットオブパーツを構成し得る。便宜のため、そのキットは、使用するための指示書とともに、所定量の試薬を備え得る。
用語「個体」、「被験体」および「患者」は、本明細書中で交換可能に使用される。被験体は、霊長類（例えば、マーモセットまたはサル）であり得る。被験体は、通常、ヒトである。
治療は、治療的、予防的または防止的であり得る。被験体は、治療の必要のある者であり得る。治療の必要のある者には、将来、特定の医学的疾患を発症し得る者に加えて、すでにその疾患に罹患している個体が含まれる場合がある。
したがって、ＳＡＰ枯渇化合物に続く本明細書中に記載されるＳＡＰ抗原結合タンパク質は、予防的または防止的な治療のために使用することができる。この場合、本明細書中に記載される連続的治療は、疾患の１つ以上の態様または症状の発生を予防するためまたは遅延させるために個体に施される。アミロイド沈着物は、臨床症状をもたらすのに十分な損傷を引き起こす前にある期間にわたって組織に存在し、蓄積すると知られているので、被験体は、無症候性でいることができるか、またはその疾患に対する遺伝的素因を有している可能性がある。そのような無症候性のアミロイド沈着は、組織生検材料の組織学的検査または非侵襲性のイメージング手技（放射標識されたＳＡＰのシンチグラフィー、心エコー検査および心臓磁気共鳴画像法を含む）によって検出することができる。まず循環ＳＡＰを除去した後、予防的に有効な量の抗原結合タンパク質をそのような個体に投与する。予防的に有効な量は、本明細書中に記載される疾患の１つ以上の態様または症状の発生を予防するかまたは遅延させる量である。
本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、治療方法においても使用され得る。用語「治療」は、ある疾患の少なくとも１つの態様または症状の軽減、減少または防止を包含する。例えば、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質を用いることにより、本明細書中に記載される疾患の１つ以上の態様または症状が回復または減少し得る。
本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、治療的、予防的または防止的な治療のために有効な量で使用される。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の治療有効量は、疾患の１つ以上の態様または症状を回復または減少させるのに有効な量である。また、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質を用いることによって、本明細書中に記載される疾患が治療、予防または治癒され得る。
本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、被験体の健康状態に対して一般に有益な効果を有することができ、例えば、それは、被験体の予想寿命を延ばすことができる。
本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、完治に作用する必要はないか、またはその疾患のすべての症状もしくは徴候を皆無にして、実現可能な治療的治療の構成要素となる必要はない。関連分野において認識されているように、治療薬として使用される薬物は、所与の疾患状態の重症度を低下させることがあるが、有用な治療薬と見なされるためにその疾患のすべての徴候を無くす必要はない。同様に、予防的に施される治療は、実現可能な予防薬の構成要素となるために、疾患の発生の防止において完全に有効である必要はない。単に疾患の影響を減少させること（例えば、その症状の数もしくは重症度を減少させることによって、または別の治療の有効性を高めることによって、または別の有益な効果をもたらすことによって）、またはその疾患が被験体において生じる可能性（例えば、その疾患の発生を遅延させることによって）もしくは悪化する可能性を低下させることで十分である。
本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、アミロイド沈着を伴う疾患、すなわち、アミロイドーシスの治療または予防において使用されることがある。
「アミロイドーシス」は、身体の様々な器官および組織におけるアミロイドの細胞外の蓄積を特徴とする任意の疾患である。
用語「アミロイド」とは、特徴的な超微細構造的形態であるクロス−βシートコア構造、およびアルカリ性アルコール溶液からのコンゴーレッド色素に結合して、強い交差偏光において顕微鏡で観察するときに赤緑二色性を与えるという特徴的な組織化学的着色特性を有する原線維から構成される不溶性タンパク質繊維の組織における細胞外の沈着物のことを指す。約２５の種々の無関係なタンパク質が、ヒト組織に沈着するアミロイド原線維を形成すると知られており、それらは、これらの典型的な特性のすべてを共有する。脳実質（ｂｒａｉｎ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）におけるアミロイド沈着物である大脳アミロイドは、それが常に限局的であり、微視的なサイズであり、通常はアミロイド斑と呼ばれるという点において、体内の他の箇所のアミロイド沈着物とはいくらか異なる。
組織におけるアミロイドの沈着によって直接引き起こされる疾患であるアミロイドーシスは、局所性アミロイドーシス（沈着物が１つの解剖学的領域および／または１つの組織もしくは器官系に限局されるアミロイドーシス）と全身性アミロイドーシス（沈着物が、血管および結合組織を含む体内の任意の器官または組織に生じ得るアミロイドーシス）の両方を含む。アミロイドーシスの原因は、後天性または遺伝性であり得る。後天性アミロイドーシスは、先行する病状（それ自体が後天性または遺伝性であり得る）の合併症として生じる。したがって、アミロイドＡタンパク質（ＡＡ）タイプとして知られる反応性全身性アミロイドーシスは、慢性活動性炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、クローン病、慢性感染症および慢性敗血症）および遺伝性周期性発熱症候群（例えば、家族性地中海熱、マックル・ウェルズ症候群およびＣＩＮＣＡ症候群）の合併症である。透析関連アミロイドーシスは、末期腎不全の結果としてのβ２−ミクログロブリンの蓄積によって引き起こされる。モノクローナル免疫グロブリン軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスは、多発性骨髄腫またはそれでなければ良性Ｍ蛋白血症（ｂｅｎｉｇｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ）（意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｃｅｒｔａｉｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ），ＭＧＵＳ）の合併症である。トランスサイレチンタイプの後天性アミロイドーシスは、いかなる先行する疾病もなしに発生することができ、単に老齢の合併症である。遺伝性アミロイドーシスは、アミロイド原線維を形成する性質の強い変異体タンパク質の発現をコードする様々なタンパク質に対する遺伝子の変異によって引き起こされ、それには、トランスサイレチン、アポリポタンパク質ＡＩ、ゲルゾリン、リゾチーム、シスタチンＣおよびアミロイドβ−タンパク質によって引き起こされる疾患が含まれる。種々の形態のすべてのアミロイドーシスおよび関わるタンパク質の包括的な説明は、教科書および科学文献において入手可能である（Ｐｅｐｙｓ，Ｍ．Ｂ．（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，５７：２２３−２４１；Ｐｅｐｙｓ ａｎｄ Ｈａｗｋｉｎｓ（２００３）Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｖｏｌ．２，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．１６２−１７３；Ｐｅｐｙｓ ａｎｄ Ｈａｗｋｉｎｓ（２００１）Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｓａｍｔｅｒ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｉｘｔｈ Ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．４０１−４１２）。
１つの器官または組織に限局された局所的なアミロイド沈着は、臨床的に無症状であることもできるし、重篤な組織損傷および疾患を引き起こすこともできる。例えば、血管のアミロイド沈着物がＡβタンパク質から構成される脳アミロイドアンギオパチーは、他の任意の病態が存在しない場合では理解されない理由によって生じる通常は孤発性後天性の状態であり、かつ脳出血および脳卒中の主因である。いくつかの非常に重要かつ罹患頻度の高い疾患、特に、アルツハイマー病（ＡＤ）および２型糖尿病が存在し、それらにおいては、アミロイド沈着物が常に存在するが、これらのそれぞれの疾患を引き起こす正確な機序は未だ不明である。それにもかかわらず、アルツハイマー病における脳内および脳血管内、ならびに糖尿病における膵島内のアミロイドの局所的な沈着は、病態および疾患を悪化させる可能性が非常に高い。したがって、本発明は、本明細書中に開示されるような抗原結合タンパク質を用いた、アルツハイマー病と２型糖尿病の両方、実際には、組織内のアミロイド沈着物の存在を伴う任意の状態の治療を含む。
伝達性海綿状脳症（プリオン病）の多くの形態は、脳内のアミロイド沈着物を伴っているので、本発明は、これらの状態のすべて（ヒトにおける変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、クロイツフェルト・ヤコブ病自体、クールーおよび他の様々な形態のヒトプリオン病、ならびにウシ海綿状脳症、ミュールジカおよびエルクの慢性消耗病、ならびにミンクの伝達性脳症も含む）に関する。
有用な診断方法
本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、診断目的で、生物学的サンプル中のＳＡＰをインビトロまたはインビボにおいて検出するために使用され得る。例えば、抗ＳＡＰ抗原結合タンパク質は、血清中のＳＡＰ、またはアミロイド（例えば、アミロイド斑）と会合したＳＡＰを検出するために使用することができる。そのアミロイドは、まず、ヒトまたは動物の身体から取り出され得る（例えば、生検）。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学または免疫沈降を含む従来のイムノアッセイが使用され得る。
本抗原結合タンパク質は、１つ以上の抗原結合タンパク質、検出可能な標識、およびキットを使用するための指示書を備える診断キットとして提供されることがある。便宜上、そのキットは、使用するための指示書とともに、所定量の試薬を備えることがある。
本発明は以下の態様を含む。
［項目１］
ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号７の重鎖可変領域配列および配列番号９の軽鎖可変領域配列を含んでなる参照抗体とＳＡＰへの結合について競合する、非マウス抗原結合タンパク質。
［項目２］
ＳＡＰに結合し、かつ配列番号３に示されるＣＤＲＨ３またはＣＤＲＨ３の機能的変異体を含んでなる、非マウス抗原結合タンパク質。
［項目３］
ＣＤＲＨ１（配列番号１）、ＣＤＲＨ２（配列番号１２、ＣＤＲＬ１（配列番号４）、ＣＤＲＬ２（配列番号５）およびＣＤＲＬ３（配列番号６）、またはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２もしくはＣＤＲＬ３の機能的変異体から選択される１つ以上またはすべてのＣＤＲをさらに含んでなる、項目２に記載の抗原結合タンパク質。
［項目４］
前記ＣＤＲＨ３機能的変異体が、配列番号３の変異体であり、ここで、Ｓｅｒ１０２は、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＡｓｐまたはＧｌｙに対して置換されている、項目２または３に記載の抗原結合タンパク質。
［項目５］
（ａ）前記ＣＤＲＨ１機能的変異体が、配列番号１の変異体であり、ここで、Ｔｙｒ３２は、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、ＧｌｕまたはＡｓｐに対して置換されており、Ａｓｎ３３は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＶａｌに対して置換されており、Ｍｅｔ３４は、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＴｒｐに対して置換されており、および／またはＨｉｓ３５は、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒに対して置換されており、
（ｂ）前記ＣＤＲＨ２機能的変異体が、配列番号２の変異体であり、ここで、Ｔｙｒ５０は、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＡｌａに対して置換されており、Ｉｌｅ５１は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎに対して置換されており、Ｔｙｒ５２は、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＳｅｒに対して置換されており、Ｇｌｙ５３は、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、ＴｈｒまたはＡｓｎに対して置換されており、Ａｓｐ５４は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＬｙｓまたはＧｌｙに対して置換されており、Ａｓｎ５６は、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＡｌａに対して置換されており、および／またはＡｓｎ５８は、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＴｙｒに対して置換されており、
（ｃ）前記ＣＤＲＬ１機能的変異体は、配列番号４の変異体であり、ここで、Ａｓｎ２８は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、ＴｈｒまたはＧｌｕに対して置換されており、Ｉｌｅ２９は、Ｖａｌに対して置換されており、Ｔｙｒ３０は、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、ＧｌｙまたはＴｈｒに対して置換されており、Ｓｅｒ３１は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、ＬｙｓまたはＧｌｙに対して置換されており、Ｔｙｒ３２は、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＡｒｇに対して置換されており、Ｌｅｕ３３は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＰｈｅに対して置換されており、および／またはＡｌａ３４は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＶａｌまたはＰｈｅに対して置換されており、
（ｄ）前記ＣＤＲＬ２機能的変異体は、配列番号５の変異体であり、ここで、Ａｌａ５１は、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＶａｌに対して置換されており、および／または
（ｅ）前記ＣＤＲＬ３機能的変異体は、配列番号６の変異体であり、ここで、Ｇｌｎ８９は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＬｅｕに対して置換されており、Ｈｉｓ９０は、ＧｌｎまたはＡｓｎに対して置換されており、Ｈｉｓ９１は、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＶａｌに対して置換されており、Ｔｙｒ９２は、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＡｓｐに対して置換されており、Ｇｌｙ９３は、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＡｒｇまたはＡｌａに対して置換されており、Ａｌａ９４は、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＳｅｒに対して置換されており、および／またはＬｅｕ９６は、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＰｈｅに対して置換されている、
項目３または４に記載の抗原結合タンパク質。
［項目６］
ＳＡＰに特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、ここで、該抗原結合タンパク質は、配列番号７の可変ドメイン配列の対応するＣＤＲＨ３またはＣＤＲＨ３の機能的変異体を含んでなる、キメラ抗体またはヒト化抗体である、抗原結合タンパク質。
［項目７］
配列番号７の可変ドメイン配列のＣＤＲＨ１もしくはＣＤＲＨ２、または配列番号９の可変ドメイン配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、またはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２もしくはＣＤＲＬ３の機能的変異体から選択される対応するＣＤＲの１つ以上またはすべてをさらに含んでなる、項目６に記載の抗原結合タンパク質。
［項目８］
ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号７のＫａｂａｔ残基９５〜１０１を含んでなる結合単位Ｈ３または結合単位Ｈ３の機能的変異体を含んでなる、抗原結合タンパク質。
［項目９］
配列番号７のＫａｂａｔ残基３１〜３２を含んでなるＨ１、配列番号７のＫａｂａｔ残基５２〜５６を含んでなるＨ２、配列番号９のＫａｂａｔ残基３０〜３４を含んでなるＬ１、配列番号９のＫａｂａｔ残基５０〜５５を含んでなるＬ２、および配列番号９のＫａｂａｔ残基８９〜９６を含んでなるＬ３、または結合単位Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３の機能的変異体から選択される１つ以上またはすべての結合単位をさらに含んでなる、項目８に記載の抗原結合タンパク質。
［項目１０］
前記抗原結合タンパク質が、重鎖および／または軽鎖を含んでなり、ここで：
（ａ）重鎖フレームワークが、以下の残基：２位にＶａｌ、ＩｌｅもしくはＧｌｙ、４位にＬｅｕもしくはＶａｌ、２０位にＬｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔもしくはＶａｌ、２２位にＣｙｓ、２４位にＴｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＧｌｙもしくはＳｅｒ、２６位にＧｌｙ、２９位にＩｌｅ、Ｐｈｅ、ＬｅｕもしくはＳｅｒ、３６位にＴｒｐ、４７位にＴｒｐもしくはＴｙｒ、４８位にＩｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌもしくはＬｅｕ、６９位にＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＭｅｔもしくはＶａｌ、７１位にＶａｌ、ＡｌａもしくはＬｅｕ、７８位にＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＴｙｒもしくはＰｈｅ、８０位にＬｅｕもしくはＭｅｔ、９０位にＴｙｒもしくはＰｈｅ、９２位にＣｙｓ、および／または９４位にＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＨｉｓもしくはＡｓｎを含んでなり、ならびに／あるいは
（ｂ）軽鎖フレームワークが、以下の残基：２位にＩｌｅ、ＬｅｕもしくはＶａｌ、３位にＶａｌ、Ｇｌｎ、ＬｅｕもしくはＧｌｕ、４位にＭｅｔもしくはＬｅｕ、２３位にＣｙｓ、３５位にＴｒｐ、３６位にＴｙｒ、ＬｅｕもしくはＰｈｅ、４６位にＬｅｕ、ＡｒｇもしくはＶａｌ、４９位にＴｙｒ、Ｈｉｓ、ＰｈｅもしくはＬｙｓ、７１位にＴｙｒもしくはＰｈｅ、８８位にＣｙｓ、および／または９８位にＰｈｅを含んでなる、
項目１〜９のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質。
［項目１１］
前記重鎖フレームワークが、以下の残基：２位にＶａｌ、４位にＬｅｕ、２０位にＶａｌ、２２位にＣｙｓ、２４位にＡｌａ、２６位にＧｌｙ、２９位にＰｈｅ、３６位にＴｒｐ、４７位にＴｒｐ、４８位にＭｅｔ、６９位にＩｌｅ、７１位にＡｌａ、７８位にＡｌａ、８０位にＭｅｔ、９０位にＴｙｒ、９２位にＣｙｓおよび９４位にＡｒｇを含んでなり、および／または前記軽鎖フレームワークが、以下の残基：２位にＩｌｅ、３位にＧｌｎ、４位にＭｅｔ、２３位にＣｙｓ、３５位にＴｒｐ、３６位にＴｙｒ、４６位にＬｅｕ、４９位にＨｉｓ、７１位にＰｈｅ、８８位にＣｙｓおよび９８位にＰｈｅを含んでなる、項目１〜１０のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質。
［項目１２］
配列番号２５に示されるようなフレームワーク領域に対して７５％以上の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン抗体フレームワーク、および／または配列番号３２に示されるようなフレームワーク領域に対して７５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン抗体フレームワークをさらに含んでなる、項目１〜１１のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質。
［項目１３］
ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号２７〜３１から選択される重鎖可変領域、および／もしくは配列番号３４〜３６から選択される軽鎖可変領域、または７５％以上の配列同一性を有する変異体重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質。
［項目１４］
ＳＡＰに特異的に結合し、かつ配列番号６２の重鎖、および／もしくは配列番号６４の軽鎖、または７５％以上の配列同一性を有する変異体重鎖もしくは軽鎖を含んでなる、抗原結合タンパク質。
［項目１５］
前記ＳＡＰが、インビボにおいてアミロイド原線維に結合されているヒトＳＡＰである、項目１〜１４のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質。
［項目１６］
前記抗原結合タンパク質が、ヒトＳＡＰのＡ面に結合する、項目１〜１５のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質。
［項目１７］
前記抗原結合タンパク質が、ヒト補体系を活性化する、項目１〜１６のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質。
［項目１８］
キメラ、ヒト化またはヒトにおけるものである、項目１〜５、８、９または１５〜１７のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質。
［項目１９］
前記抗原結合タンパク質が、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒト定常ドメインを含んでなる、項目１〜１８のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質。
［項目２０］
項目１〜１９のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。
［項目２１］
前記核酸配列が、配列番号５４および／または配列番号５９を含んでなる、項目２０に記載の核酸分子。
［項目２２］
前記核酸配列が、配列番号６１および／または配列番号６３を含んでなる、項目２１に記載の核酸分子。
［項目２３］
項目２０〜２２のいずれか一つに記載の核酸分子を含んでなる、発現ベクター。
［項目２４］
項目２３に記載の発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
［項目２５］
項目１〜１９のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質を生成するための方法であって、項目２４に記載の宿主細胞を培養する工程および前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなる、方法。
［項目２６］
項目１〜１９のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質と、薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
［項目２７］
アミロイド沈着を伴う疾患に罹患している被験体を治療する方法であって、治療有効量の項目１〜１９のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質または項目２６に記載の組成物を前記被験体に投与する工程を含んでなる、方法。
［項目２８］
被験体におけるアミロイド沈着を伴う疾患を予防する方法であって、予防的に有効な量の項目１〜１９のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質または項目２６に記載の組成物を前記被験体に投与する工程を含んでなる、方法。
［項目２９］
前記抗原結合タンパク質が、ＳＡＰ枯渇化合物とともに投与される、項目２７または２８に記載の方法。
［項目３０］
アミロイド沈着を伴う疾患を治療または予防する際に使用するための、項目１〜１９のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質であって、ここで、前記抗原結合タンパク質は、ＳＡＰ枯渇化合物とともに投与される、抗原結合タンパク質。
［項目３１］
アミロイド沈着を伴う疾患を治療または予防する際に使用するためのＳＡＰ枯渇化合物であって、ここで、前記ＳＡＰ枯渇化合物は、項目１〜１９のいずれか一つに記載の抗原結合タンパク質とともに投与される、ＳＡＰ枯渇化合物。
［項目３２］
前記抗原結合タンパク質およびＳＡＰ枯渇化合物の投与が連続的である、項目２７、２８もしくは２９に記載の方法、項目２９に記載の抗原結合タンパク質、または項目３１に記載のＳＡＰ枯渇化合物。
［項目３３］
前記ＳＡＰ枯渇化合物が最初に投与される、項目３２に記載の方法、抗原結合タンパク質またはＳＡＰ枯渇化合物。
［項目３４］
前記抗原結合タンパク質が、被験体内を循環しているＳＡＰの実質的にすべてが除去されたときに投与される、項目３３に記載の方法、抗原結合タンパク質またはＳＡＰ枯渇化合物。
［項目３５］
前記疾患が、全身性アミロイドーシス、局所性アミロイドーシス、アルツハイマー病、２型糖尿病、透析関連アミロイドーシス、モノクローナル免疫グロブリン鎖（ＡＬ）アミロイドーシスおよび脳アミロイドアンギオパチーからなる群から選択される、項目２７、２８、２９、３１、３３もしくは３４に記載の方法、項目３０、３２、３３もしくは３４に記載の抗原結合タンパク質、または項目３１、３２、３３もしくは３４に記載のＳＡＰアンタゴニスト化合物。
［項目３６］
前記ＳＡＰ枯渇化合物が、Ｄ−プロリン誘導体またはグリセロール環状ピルビン酸塩誘導体である、項目２７、２８、２９、３２、３３、３４もしくは３５に記載の方法、項目３０、３２、３３、３４もしくは３５に記載の抗原結合タンパク質、または項目３１、３２、３３、３４もしくは３５に記載のＳＡＰ枯渇化合物。
［項目３７］
前記Ｄ−プロリン誘導体が、ＣＰＨＰＣである、請求項３６に記載の方法、抗原結合タンパク質またはＳＡＰ枯渇化合物。
実施例１−ハイブリドーマ可変ドメインの配列決定：ＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋ
ＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋは、抗ＳＡＰモノクローナルの２つの群に由来し、その各群が、インビトロにおいてヒトＳＡＰへの結合について別個に試験された。ＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋは、それらの群のうちＳＡＰへの最も強い結合性を示し、種々のアッセイにおいて互いに比較された。
第１の群の抗体には、精製ヒトＳＡＰ（下記に示される配列番号４３）（ヒトＳＡＰを精製するための方法の詳細は、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８４，３０８−３１６に示されている）での１回の従来の免疫および融合プロトコルにおいて作製された７種のハイブリドーマに由来する抗体が含まれ、それらをＳＡＰ−ＡからＳＡＰ−Ｇと命名する。これらの抗体のうちの２つであるＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｂは、ＩｇＧ２ａアイソタイプであり、その他のものはすべてＩｇＧ１アイソタイプである（実施例１３、表１１を参照のこと）。
第２の群の抗体には、精製ヒトＳＡＰ（下記に示される配列番号４３）（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８４，３０８−３１６）での免疫および通例の方法によってクローン化されるハイブリドーマを作製する従来の融合から標準的な手法によって得られた６種の異なるＩｇＧ２ａモノクローナル（ＳＡＰ−ＨからＳＡＰ−Ｍ）が含まれた。
ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＳＡＰ成熟アミノ酸配列（配列番号４３）
ＨＴＤＬＳＧＫＶＦＶＦＰＲＥＳＶＴＤＨＶＮＬＩＴＰＬＥＫＰＬＱＮＦＴＬＣＦＲＡＹＳＤＬＳＲＡＹＳＬＦＳＹＮＴＱＧＲＤＮＥＬＬＶＹＫＥＲＶＧＥＹＳＬＹＩＧＲＨＫＶＴＳＫＶＩＥＫＦＰＡＰＶＨＩＣＶＳＷＥＳＳＳＧＩＡＥＦＷＩＮＧＴＰＬＶＫＫＧＬＲＱＧＹＦＶＥＡＱＰＫＩＶＬＧＱＥＱＤＳＹＧＧＫＦＤＲＳＱＳＦＶＧＥＩＧＤＬＹＭＷＤＳＶＬＰＰＥＮＩＬＳＡＹＱＧＴＰＬＰＡＮＩＬＤＷＱＡＬＮＹＥＩＲＧＹＶＩＩＫＰＬＶＷＶ
比較する目的で、ヒトＳＡＰと６９．４％の同一性を有するマウスＳＡＰ配列を下記に示す。
ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＳＡＰ成熟タンパク質（配列番号４４）
ＱＴＤＬＫＲＫＶＦＶＦＰＲＥＳＥＴＤＨＶＫＬＩＰＨＬＥＫＰＬＱＮＦＴＬＣＦＲＴＹＳＤＬＳＲＳＱＳＬＦＳＹＳＶＫＧＲＤＮＥＬＬＩＹＫＥＫＶＧＥＹＳＬＹＩＧＱＳＫＶＴＶＲＧＭＥＥＹＬＳＰＶＨＬＣＴＴＷＥＳＳＳＧＩＶＥＦＷＶＮＧＫＰＷＶＫＫＳＬＱＲＥＹＴＶＫＡＰＰＳＩＶＬＧＱＥＱＤＮＹＧＧＧＦＱＲＳＱＳＦＶＧＥＦＳＤＬＹＭＷＤＹＶＬＴＰＱＤＩＬＦＶＹＲＤＳＰＶＮＰＮＩＬＮＷＱＡＬＮＹＥＩＮＧＹＶＶＩＲＰＲＶＷ
全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙキット（＃７４１０６）を用いておよそ１０６個の細胞のハイブリドーマ細胞ペレットから抽出した。ＡｃｃｅｓｓＱｕｉｃｋ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａ１７０２）を使用し、マウス免疫グロブリン遺伝子リーダー配列およびマウスＩｇＧ２ａ／Ｋ定常領域に特異的な縮重プライマーを用いて可変重鎖領域および可変軽鎖領域のｃＤＮＡを生成した。精製されたＲＴ−ＰＣＲフラグメントを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＴＡクローニングキット（Ｋ２０００−０１）を用いてクローニングした。配列アラインメント、およびＫＡＢＡＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））に列挙されている公知の免疫グロブリン可変配列とのアラインメントによって各ハイブリドーマに対するコンセンサス配列を得た。ＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋに対するコンセンサス配列を下記に示す。
ＳＡＰ−Ｅ配列
ＳＡＰ−Ｅ ＣＤＲＨ１（配列番号１）
ＴＹＮＭＨ
ＳＡＰ−Ｅ ＣＤＲＨ２（配列番号２）
ＹＩＹＰＧＤＧＮＡＮＹＮＱＱＦＫＧ
ＳＡＰ−Ｅ ＣＤＲＨ３（配列番号３）
ＧＤＦＤＹＤＧＧＹＹＦＤＳ
ＳＡＰ−Ｅ ＣＤＲＬ１（配列番号４）
ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ
ＳＡＰ−Ｅ ＣＤＲＬ２（配列番号５）
ＮＡＫＴＬＡＥ
ＳＡＰ−Ｅ ＣＤＲＬ３（配列番号６）
ＱＨＨＹＧＡＰＬＴ
ＣＤＲに下線を引いたＳＡＰ−Ｅ Ｖ Ｈ アミノ酸配列（配列番号７）
ＱＡＳＬＱＱＳＧＴＥＬＶＲＳＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＦＴＦＡＴＹＮＭＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＤＧＮＡＮＹＮＱＱＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＩＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＤＦＤＹＤＧＧＹＹＦＤＳＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
ＳＡＰ−Ｅ Ｖ Ｈ ＤＮＡ配列（配列番号８）
ＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＡＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＡＴＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＴＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＣＤＲに下線を引いたＳＡＰ−Ｅ Ｖ Ｌ アミノ酸配列（配列番号９）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＱＧＲＳＰＱＬＬＶＨＮＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＶＳＧＳＧＳＧＴＨＦＳＬＫＩＮＧＬＱＰＥＤＦＧＮＹＹＣＱＨＨＹＧＡＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
ＳＡＰ−Ｅ Ｖ Ｌ ＤＮＡ配列（配列番号１０）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡ
ＳＡＰ−Ｋ配列
ＳＡＰ−Ｋ ＣＤＲＨ１（配列番号１１）
ＳＹＷＭＨ
ＳＡＰ−Ｋ ＣＤＲＨ２（配列番号１２）
ＭＩＨＰＮＳＶＮＴＮＹＮＥＫＦＫＳ
ＳＡＰ−Ｋ ＣＤＲＨ３（配列番号１３）
ＲＮＤＹＹＷＹＦＤＶ
ＳＡＰ−Ｋ ＣＤＲＬ１（配列番号１４）
ＫＡＳＱＮＶＮＳＮＶＡ
ＳＡＰ−Ｋ ＣＤＲＬ２（配列番号１５）
ＳＡＳＹＲＹＳ
ＳＡＰ−Ｋ ＣＤＲＬ３（配列番号１６）
ＱＱＣＮＮＹＰＦＴ
ＣＤＲに下線を引いたＳＡＰ−Ｋ Ｖ Ｈ アミノ酸配列（配列番号１７）
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＩＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＶＮＴＮＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＲＮＤＹＹＷＹＦＤＶＷＧＴＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＳＡＰ−Ｋ Ｖ Ｈ ＤＮＡ配列（配列番号１８）
ＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＡＴＧＡＴＴＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＴＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＧＡＡＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＣＤＲに下線を引いたＳＡＰ−Ｋ Ｖ Ｌ アミノ酸配列（配列番号１９）
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＶＴＣＫＡＳＱＮＶＮＳＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＴＮＶＱＳＥＤＬＡＥＹＦＣＱＱＣＮＮＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
ＳＡＰ−Ｋ Ｖ Ｌ ＤＮＡ配列（配列番号２０）
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＴＴＣＣＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＧＴＡＡＣＡＡＣＴＡＴＣＣＡＴＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ。
実施例２：キメラ抗体の構築
ＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋについて、ヒトＩｇＧ１／κ野生型定常領域に移植された親マウス可変ドメインを含むキメラ抗体をＰＣＲクローニングによって構築した。コンセンサス配列に基づいて、哺乳動物発現ベクターへのクローニングを容易にするために必要な制限酵素認識部位を組み込んで、マウス可変ドメインを増幅するプライマーを設計した。ＦＲ４（フレームワーク領域４（ＣＤＲ３の後ろかつ第１定常ドメインの前のＶ−領域配列））に制限酵素認識部位を導入することによって、ＳＡＰ−ＥにおけるＶＨアミノ酸配列を、配列番号７に示されるようなＴＴＬＴＶＳＳからＴＬＶＴＶＳＳに変更し、ＳＡＰ−ＫにおけるＶＨアミノ酸配列を、配列番号１７に示されるようなＴＴＶＴＶＳＳからＴＬＶＴＶＳＳに変更した。ＳＡＰ−Ｋ可変軽鎖では、ＣＤＲＬ１に内部のＥｃｏＲＩ部位が存在するので、１塩基対を変更することによって（これによりアミノ酸配列は変化しなかった）、この望まれない内部のＥｃｏＲＩ部位を除去する突然変異誘発プライマーを設計した。
ＳＡＰ−Ｅキメラ抗体（ｃＳＡＰ−Ｅ）の完全長重鎖タンパク質配列および完全長軽鎖タンパク質配列を、それぞれ配列番号２１および配列番号２２に示す。ＳＡＰ−Ｋキメラ抗体（ｃＳＡＰ−Ｋ）の完全長重鎖タンパク質配列および完全長軽鎖タンパク質配列を、それぞれ配列番号２３および配列番号２４に示す。
ＳＡＰ−Ｅ ＶＨキメラヌクレオチド配列（配列番号４５）
ＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＡＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＡＴＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＴＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧ
ＳＡＰ−Ｅ ＶＨキメラアミノ酸配列（配列番号２１）
ＱＡＳＬＱＱＳＧＴＥＬＶＲＳＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＦＴＦＡＴＹＮＭＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＤＧＮＡＮＹＮＱＱＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＩＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＤＦＤＹＤＧＧＹＹＦＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＳＡＰ−Ｅ ＶＬキメラヌクレオチド配列（配列番号４６）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣ
ＳＡＰ−Ｅ ＶＬキメラアミノ酸配列（配列番号２２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＱＧＲＳＰＱＬＬＶＨＮＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＶＳＧＳＧＳＧＴＨＦＳＬＫＩＮＧＬＱＰＥＤＦＧＮＹＹＣＱＨＨＹＧＡＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＳＡＰ−Ｋ ＶＨキメラヌクレオチド配列（配列番号４７）
ＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＡＴＧＡＴＴＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＴＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＧＡＡＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧ
ＳＡＰ−Ｋ ＶＨキメラアミノ酸配列（配列番号２３）
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＩＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＶＮＴＮＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＲＮＤＹＹＷＹＦＤＶＷＧＴＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＳＡＰ−Ｋ ＶＬキメラヌクレオチド配列（配列番号４８）
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＴＴＣＣＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＧＴＡＡＣＡＡＣＴＡＴＣＣＡＴＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣ
ＳＡＰ−Ｋ ＶＬキメラアミノ酸配列（配列番号２４）
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＶＴＣＫＡＳＱＮＶＮＳＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＴＮＶＱＳＥＤＬＡＥＹＦＣＱＱＣＮＮＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
実施例３：ヒト化ストラテジー
マウス抗体由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を好適なヒトフレームワーク配列に移植するプロセスによって、ヒト化抗体を作製した。
ＳＡＰ−Ｅのヒト化ストラテジー
ＳＡＰ−Ｅ重鎖のヒト化
ＳＡＰ−Ｅマウス可変重鎖配列に対しては、ＪＨ１ミニ遺伝子（Ｋａｂａｔ：ＡＥＹＦＱＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２６））とともに、マウスＳＡＰ−Ｅ可変重鎖配列（配列番号７）と６０％の同一性（ＣＤＲを含む）を有するヒト生殖系列アクセプターフレームワークを選択した（ＩＧＨＶ１−６９，配列番号２５）。ＪＨ１ミニ遺伝子残基の最初の６残基は、ＣＤＲ３領域の範囲に含まれ、ドナー抗体由来の新しく入ったＣＤＲで置き換えられた。
配列比較および抗体機能に対して考えられる影響に基づいて、５つのヒト化変異体を作製した。構築物Ｈ０は、上で選択されたヒトアクセプターフレームワークにマウスＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義を使用するときのもの）をそのまま移植したもの（ｓｔｒａｉｇｈｔ ｇｒａｆｔ）だった。構築物Ｈ１は、残基２７および３０に追加の復帰突然変異を有する。構築物Ｈ２およびＨ３は、Ｈ１に基づき、かつ残基２（Ｈ２）ならびに４８および６７（Ｈ３）に追加の復帰突然変異を有する。構築物Ｈ４は、Ｈ３に基づき、かつ残基６９、７３および９１に追加の復帰突然変異を有する。表３を参照のこと。
Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４のヒト化可変重鎖ドメインの配列を下記に示す（それぞれ配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１）。
Figure 0006236478
ＳＡＰ−Ｅ軽鎖のヒト化
ＳＡＰ−Ｅマウス可変軽鎖配列に対しては、配列類似性に基づいて、Ｊ−領域カッパー２ミニ遺伝子（Ｋａｂａｔ：ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ，配列番号３３））とともに、マウスＳＡＰ−Ｅ可変軽鎖配列（配列番号９）と６８％の同一性（ＣＤＲを含む）を有するヒト生殖系列アクセプターフレームワークを選択した（ＩＧＫＶ１−３９，配列番号３２）。ＪＫ−２ミニ遺伝子残基の最初の２残基は、ＣＤＲ３領域の範囲に含まれ、ドナー抗体由来の新しく入ったＣＤＲで置き換えられた。
配列比較および抗体機能に対して考えられる影響に基づいて、３つのヒト化変異体を作製した。構築物Ｌ０は、上で選択されたヒトアクセプターフレームワークにマウスＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義を使用するときのもの）をそのまま移植したものだった。構築物Ｌ１は、残基４９に復帰突然変異を有し、構築物Ｌ２は、４８および４９位に復帰突然変異を有する。表４を参照のこと。
Ｌ０、Ｌ１およびＬ２のヒト化可変軽鎖ドメインの配列を下記に示す（それぞれ配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６）。
Figure 0006236478
ＳＡＰ−Ｋのヒト化ストラテジー
ＳＡＰ−Ｋ重鎖のヒト化
ＳＡＰ−Ｋマウス可変重鎖配列に対しては、ＪＨ１ミニ遺伝子（Ｋａｂａｔ：ＡＥＹＦＱＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２６））とともに、マウスＳＡＰ−Ｋ可変重鎖配列（配列番号１７）と６５％の同一性（ＣＤＲを含む）を有するヒト生殖系列アクセプターフレームワークを選択した（ＩＧＨＶ１−６９，配列番号２５）。ＪＨ１ミニ遺伝子残基の最初の６残基は、ＣＤＲ３領域の範囲に含まれ、ドナー抗体由来の新しく入ったＣＤＲで置き換えられた。
配列比較および抗体機能に対して考えられる影響に基づいて、４つのヒト化変異体を作製した。構築物Ｈ０は、上で選択されたヒトアクセプターフレームワークにマウスＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義を使用するときのもの）をそのまま移植したものだった。構築物Ｈ１は、残基２７および３０に追加の復帰突然変異を有する。構築物Ｈ２は、Ｈ１に基づき、かつ残基４８および６７に追加の復帰突然変異を有する。構築物Ｈ３は、Ｈ２に基づき、かつ残基６９および７１に追加の復帰突然変異を有する。表５を参照のこと。
Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３のヒト化可変重鎖ドメインの配列を下記に示す（それぞれ配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９および配列番号４０）。
Figure 0006236478

ＳＡＰ−Ｋ軽鎖のヒト化
ＳＡＰ−Ｋマウス可変軽鎖配列に対しては、配列類似性に基づいて、Ｊ−領域カッパー２ミニ遺伝子（Ｋａｂａｔ：ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ，配列番号３３）とともに、マウスＳＡＰ−Ｋ可変軽鎖配列（配列番号１９）と６３％の同一性（ＣＤＲを含む）を有するヒト生殖系列アクセプターフレームワークを選択した（ＩＧＫＶ１−３９，配列番号３２）。ＪＫ−２ミニ遺伝子残基の最初の２残基は、ＣＤＲ３領域の範囲内に含まれ、ドナー抗体由来の新しく入ったＣＤＲで置き換えられた。
配列比較および抗体機能に対して考えられる影響に基づいて、２つのヒト化変異体を作製した。構築物Ｌ０は、上で選択されたヒトアクセプターフレームワークにマウスＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義を使用するときのもの）をそのまま移植したものだった。構築物Ｌ１は、残基４６に復帰突然変異を有する。
Ｌ０およびＬ１のヒト化可変軽鎖ドメインの配列を下記に示す（それぞれ配列番号４１および配列番号４２）。
Figure 0006236478
ヒト化抗体ベクターの構築
ヒト化可変領域ＤＮＡ配列の配列最適化を行った。ヒト化された可変重鎖領域および可変軽鎖領域をコードするＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲベースのストラテジーおよび重複するオリゴヌクレオチドを用いて新規に構築した。そのＰＣＲ産物を、それぞれヒトガンマ１定常領域およびヒトカッパー定常領域を含む哺乳動物発現ベクターにクローニングした。これは、野生型Ｆｃ領域である。
ＩＧＨＶ１−６９ヒト可変重鎖生殖系列アクセプターヌクレオチド配列（配列番号４９）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＴＣＣＣＴＡＴＣＴＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡ
（ＩＧＨＶ１−６９ヒト可変重鎖生殖系列アクセプターアミノ酸配列（配列番号２５））
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ＩＧＫＶ１−３９ヒト可変重鎖生殖系列アクセプターヌクレオチド配列（配列番号５０）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＣＣＴ
ＩＧＫＶ１−３９ヒト可変重鎖生殖系列アクセプターアミノ酸配列（配列番号３２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰ
ＪＨ１ミニ遺伝子（配列番号２６）
ＡＥＹＦＱＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
Ｊκ２ミニ遺伝子（配列番号３３）
ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
コドン最適化されていないＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ０ヌクレオチド配列（配列番号５１）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＣＡＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＴＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
コドン最適化されていないＳＡＰ−Ｅヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ０ヌクレオチド配列（配列番号５２）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ０ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号５３）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＴＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ０アミノ酸配列（配列番号２７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＰＧＤＧＮＡＮＹＮＱＱＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＦＤＹＤＧＧＹＹＦＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ１ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号５４）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＴＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ１アミノ酸配列（配列番号２８）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＡＴＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＰＧＤＧＮＡＮＹＮＱＱＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＦＤＹＤＧＧＹＹＦＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ２ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号５５）
ＣＡＧＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＴＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ２アミノ酸配列 配列番号２９
ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＡＴＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＰＧＤＧＮＡＮＹＮＱＱＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＦＤＹＤＧＧＹＹＦＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ３ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号５６）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＴＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ３アミノ酸配列（配列番号３０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＡＴＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＤＧＮＡＮＹＮＱＱＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＦＤＹＤＧＧＹＹＦＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ４ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号５７）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＴＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ４アミノ酸配列（配列番号３１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＡＴＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＤＧＮＡＮＹＮＱＱＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＤＦＤＹＤＧＧＹＹＦＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＡＰ−Ｅヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ０ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号５８）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＴＡＣＧＧＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ
ＳＡＰ−Ｅヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ０アミノ酸配列 配列番号３４
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＮＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＨＹＧＡＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＳＡＰ−Ｅヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ１ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号５９）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＴＡＣＧＧＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ
ＳＡＰ−Ｅヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ１アミノ酸配列（配列番号３５）
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ＳＡＰ−Ｅヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ２ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号６０）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＴＡＣＧＧＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ
ＳＡＰ−Ｅヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ２アミノ酸配列（配列番号３６）
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ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｈ１の完全な成熟ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号６１）
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ＳＡＰ−Ｅヒト化重鎖Ｈ１の完全な成熟アミノ酸配列（配列番号６２）
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ＳＡＰ−Ｅヒト化軽鎖Ｌ１の完全な成熟ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号６３）
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ＳＡＰ−Ｅヒト化軽鎖Ｌ１の完全な成熟アミノ酸配列（配列番号６４）
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コドン最適化されていないＳＡＰ−Ｋヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ０ヌクレオチド配列（配列番号６５）
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コドン最適化されていないＳＡＰ−Ｋヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ０ヌクレオチド配列（配列番号６６）
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ＳＡＰ−Ｋヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ０ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号６７）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
ＳＡＰ−Ｋヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ０アミノ酸配列（配列番号３７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＭＩＨＰＮＳＶＮＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＮＤＹＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＡＰ−Ｋヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ１ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号６８）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
ＳＡＰ−Ｋヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ１アミノ酸配列（配列番号３８）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＭＩＨＰＮＳＶＮＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＮＤＹＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＡＰ−Ｋヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ２ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号６９）
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ＳＡＰ−Ｋヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ２アミノ酸配列（配列番号３９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＶＮＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＮＤＹＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＡＰ−Ｋヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ３ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号７０）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
ＳＡＰ−Ｋヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ３アミノ酸配列（配列番号４０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＶＮＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＮＤＹＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＡＰ−Ｋヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ０ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）配列番号７１）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＡＴＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ
ＳＡＰ−Ｋヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ０アミノ酸配列（配列番号４１）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＮＳＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＣＮＮＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＳＡＰ−Ｋヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ１ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号７２）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＡＴＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ
ＳＡＰ−Ｋヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ１アミノ酸配列（配列番号４２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＮＳＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＣＮＮＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＳＡＰ−Ｋヒト化Ｈ３重鎖ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号７５）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧ
ＳＡＰ−Ｋヒト化Ｈ３重鎖アミノ酸配列（配列番号７６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＶＮＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＮＤＹＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＳＡＰ−Ｋヒト化Ｌ０軽鎖ヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号７７）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＡＴＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣ
ＳＡＰ−Ｋヒト化Ｌ０軽鎖アミノ酸配列（配列番号７８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＮＳＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＣＮＮＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
免疫グロブリン鎖に対するリーダー配列（配列番号７９）
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ。
実施例４：−抗体の発現
組換え抗体の発現
キメラ抗体またはヒト化抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれコードする発現プラスミドを、Ｆｅｃｔｉｎ２９３を使用した脂質トランスフェクションによってＨＥＫ２９３６Ｅ細胞に一過性に同時トランスフェクトした。細胞を、１０％プルロニックＦ６８および５０ｍｇ／ｍｌジェネテシンを含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ発現培地２９３中で３７度Ｃ、５％ＣＯ２で７２〜１２０時間生育し、上清を遠心分離によって回収した。いくつかの場合では、上清材料を結合アッセイにおける被験物質として使用した。他の場合では、上清材料を無菌濾過し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲＥカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーに続くＰＢＳへの透析によって抗体を回収した。
ハイブリドーマの抗体発現
ハイブリドーマ細胞を、４ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘおよび１０％低ＩｇＧ ＦＣＳが補充されたＥｘ６２０培地の入った振盪フラスコ内で生育した。その細胞を継代し、無血清培地中で十分生育するまで血清を除去した。次いで、その細胞を１０Ｌのｗａｖｅｂａｇ用の種として使用した。その細胞を、生存率が３０％に低下するまで、そのｗａｖｅｂａｇ内で２２回の振盪／分、３７度Ｃ、５％ＣＯ２＠０．１Ｌ／分で生育した。培養上清を無菌濾過によって回収した。組換えＰｒｏｔｅｉｎ Ａを使用したアフィニティークロマトグラフィーに続くＰＢＳへの透析によって、抗体を回収した。
実施例５〜７：ハイブリドーマおよび／またはキメラｍＡｂおよび／またはヒト化Ｍａｂの間の比較データ
実施例５：ヒトＳＡＰ結合ＥＬＩＳＡにおけるＳＡＰ−ＫハイブリドーマとＳＡＰ−Ｅハイブリドーマとの比較
１μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬのヒトＳＡＰを、ＥＬＩＳＡプレート上に直接固定化し、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ２０でブロッキングした。精製された材料からの抗ＳＡＰ抗体を、そのプレートの端から端へ漸増させた。ウマ−ラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ，Ｐ０２６０）で処理することによって、結合した抗体を検出した。Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ，Ｐ９１８７）を用いて、ＥＬＩＳＡを発色させた。
図１は、１μｇ／ｍＬのコーティング濃度のヒトＳＡＰにおけるマウス抗体ＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋに対する結合曲線を示している。
図２は、５μｇ／ｍＬのコーティング濃度のヒトＳＡＰにおけるマウス抗体ＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋに対する結合曲線を示している。
５μｇ／ｍＬのコーティング濃度では、ＳＡＰ−ＫおよびＳＡＰ−Ｅは、固定化されたヒトＳＡＰに対して類似の結合性を示したのに対し、１μｇ／ｍＬのより低い密度のコーティングでは、ＳＡＰ−Ｋが、ＳＡＰ−Ｅよりも高い結合性を示した。この形式を用いたその後のヒトＳＡＰ結合ＥＬＩＳＡのすべてにおいて、それら２つの抗体の結合特性を区別するために、低密度の１μｇ／ｍＬのコーティング濃度を使用した。
実施例６：ヒトＳＡＰ結合ＥＬＩＳＡにおけるＳＡＰ−Ｋキメラ／ヒト化ｍＡｂとＳＡＰ−Ｅキメラ／ヒト化ｍＡｂとの比較
１μｇ／ｍＬのヒトＳＡＰを、ＥＬＩＳＡプレート上に直接固定化し、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ２０でブロッキングした。試験上清または精製された材料からの抗ＳＡＰ抗体を、そのプレートの端から端へ漸増させた。ヤギ抗ヒトカッパー軽鎖ペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ，Ａ７１６４）で処理することによって、結合した抗体を検出した。Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ，Ｐ９１８７）を用いて、ＥＬＩＳＡを発色させた。
図３は、キメラ抗体ｃＳＡＰ−ＥおよびｃＳＡＰ−Ｋに対する結合曲線を示している。それらのキメラ抗体に対する曲線のプロファイルは、相当するハイブリドーマのプロファイルと同じである。
図４は、ＳＡＰ−Ｋキメラと比較されたＳＡＰ−Ｋ Ｈ０Ｌ０、ＳＡＰ−Ｋ Ｈ１Ｌ０、ＳＡＰ−Ｋ Ｈ２Ｌ０およびＳＡＰ−Ｋ Ｈ３Ｌ０、ならびにＳＡＰ−Ｅキメラと比較されたＳＡＰ−Ｅ Ｈ１Ｌ１に対する結合曲線を示している。無関係なヒトＩｇＧ１カッパー抗体もまた、ネガティブコントロールとして試験した。このデータは、ＳＡＰ−Ｋ抗体をヒト化することによって、ヒトＳＡＰへの結合活性が親ＳＡＰ−Ｋキメラと比べておよそ２倍失われたのに対し、ヒト化ＳＡＰ−Ｅ抗体は、親ＳＡＰ−Ｅキメラに匹敵する結合活性を保持したことを示している。
実施例７−競合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍＬ（ＳＡＰ−Ｋキメラとの競合の場合）または５μｇ／ｍＬ（ＳＡＰ−Ｅキメラとの競合の場合）のヒトＳＡＰでコーティングし、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。一定濃度のキメラ抗ＳＡＰｍＡｂを、段階希釈された（１：１）量のマウス抗ＳＡＰｍＡｂと混合した。プレートを洗浄し、固定化されたヒトＳＡＰに結合したキメラ抗体の量を、ヤギ抗ヒトカッパー軽鎖ペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ，Ａ７１６４）を用いて検出した。Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ，Ｐ９１８７）を用いて、ＥＬＩＳＡを発色させた。
図５は、ＳＡＰ−Ｅキメラとの競合ＥＬＩＳＡにおける、精製ＳＡＰ−Ｋマウスモノクローナル抗体および精製ＳＡＰ−Ｅマウスモノクローナル抗体を示している。
図６は、ＳＡＰ−Ｋキメラとの競合ＥＬＩＳＡにおける精製ＳＡＰ−Ｋマウスモノクローナル抗体および精製ＳＡＰ−Ｅマウスモノクローナル抗体を示している。
図５と図６の両方において、ＳＡＰ−Ｅ抗体とＳＡＰ−Ｋ抗体との間に競合は観察されないことから、それらの２つの抗体が、ヒトＳＡＰ分子上の異なるエピトープに結合することが示される。
実施例８：結合動態の測定
ヒト化抗ＳＡＰ抗体変異体と精製ヒトＳＡＰおよび精製カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ＳＡＰとの結合のＢｉａｃｏｒｅ解析
製造者の指示書に従って、ヒトおよびカニクイザルのＳＡＰを第一級アミンカップリングによってＢｉａｃｏｒｅ Ｃ１チップ上に固定化した。培養上清中に含まれるヒト化抗ＳＡＰ抗体および５１２ｎＭの精製キメラ抗体を、ヒトＳＡＰ表面とカニクイザルＳＡＰ表面の両方の上を通過させ、結合センサーグラム（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｎｓｏｇｒａｍｓ）を得た。すべてのランを、ヒト表面上およびカニクイザルＳＡＰ表面上への、精製サンプルに対しては緩衝液の注入、または上清サンプルに対しては培地で２回較正（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて２５℃で解析を行った。３Ｍ ＭｇＣｌ２の存在下で表面の再生を行ったが、その再生は、抗体がその後のサイクルにおいてヒトＳＡＰに再結合する能力に影響しなかった。ＢｉａｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェア内の１対１解離モデルを用いて、データを解析した。
表６ａおよび６ｂに生成されたデータは、それぞれヒト化ＳＡＰ−Ｅ抗体上清およびヒト化ＳＡＰ−Ｋ抗体上清の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅｓ）（ｋｄ）を示している。これらの値は、単一の曲線に基づき、ヒトＳＡＰへの結合について種々の構築物をランク付けする目的で使用された。ヒト化ＳＡＰ−Ｅ抗体は、ヒトＳＡＰへの結合について、ヒト化ＳＡＰ−Ｋ抗体よりも優れた解離速度を示した。いくつかのＳＡＰ−Ｋヒト化抗体変異体は、カニクイザルＳＡＰへの結合を示した（注意：ＳＡＰ−ＫキメラはカニクイザルＳＡＰに結合した）のに対し、ヒト化ＳＡＰ−Ｅ抗体変異体は、カニクイザルＳＡＰに結合しなかった（注意：同様にＳＡＰ−Ｅキメラはカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ＳＡＰに結合しなかった）。そのまま移植されたヒト化重鎖（Ｈ０）もしくはそのまま移植されたヒト化軽鎖（Ｌ０）またはその両方の組み合わせを含むヒト化ＳＡＰ−Ｅ変異体は、最も成績の悪い解離速度を示した。ＳＡＰ−Ｅヒト化Ｌ１軽鎖は、最も良い軽鎖変異体であり、そのＬ１とＨ１重鎖変異体との組み合わせによって、復帰突然変異の数を最小限に維持しつつ、許容可能な解離速度を有するヒト化抗体がもたらされた。ヒト化ＳＡＰ−Ｋ変異体の解離速度のランク付けにより、そのまま移植されたＬ０が最も優れたヒト化軽鎖変異体であり、そのまま移植されたＨ０が最も成績の悪いヒト化重鎖変異体であることが示された。
Figure 0006236478
Figure 0006236478
固相支持体上に直接固定化された精製ヒトＳＡＰへの抗ＳＡＰ抗体の結合のＢｉａｃｏｒｅ解析
製造者の指示書に従って、ヒトＳＡＰを第一級アミンカップリングによってＢｉａｃｏｒｅＣＭ３チップ上に固定化した。抗ＳＡＰ抗体を、５１２、１２８、３２、８、２、０．５ｎＭでこの表面の上に通過させ、結合センサーグラムを得た。すべてのランを、ヒトＳＡＰ表面上への、緩衝液の注入によって２回較正した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて２５℃で解析を行った。数分間にわたってその表面上に緩衝液を流すことによって表面の再生を行ったが、その再生は、ヒトＳＡＰがその後のサイクルにおいて抗体に再結合する能力に影響しなかった。ＢｉａｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアに固有の二価のアナライトモデルを用い、１２８〜０．５ｎＭのランのデータを解析した。
生成され、表７に編集されたデータは、構築物間の比較用であり、このアッセイではＳＡＰ−Ｋ抗体がより優れた会合速度を有し、ＳＡＰ−Ｅ抗体がより優れた解離速度を示すことを示している。さらに、ヒト化によってＳＡＰ−Ｅ抗体の結合動態が変化しなかったのに対し、ＳＡＰ−Ｋについては、ヒト化の後に会合速度および解離速度の低下が観察された。
Figure 0006236478
固定化されたＯ−ホスホエタノールアミン上に捕捉された精製ヒトＳＡＰへの抗ＳＡＰ抗体の結合のＢｉａｃｏｒｅ解析
製造者の指示書に従って、Ｏ−ホスホエタノールアミンを第一級アミンカップリングによってＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５チップ上に固定化した。次いで、インビボにおいてアミロイド原線維に結合したＳＡＰ分子の正確な配向をインビトロのＢｉａｃｏｒｅ系において再現するために、ヒトＳＡＰを塩化カルシウムの存在下でその表面上に捕捉した。次いで、抗ＳＡＰ抗体を２５６、６４、１６、４、１ｎＭでこの表面の上に通過させ、結合センサーグラムを得た。ランニング緩衝液として４％ＢＳＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％界面活性物質Ｐ２０、０．０２％ＮａＮ３，ｐＨ８．０を用いて２５℃で解析を行った。結合したヒトＳＡＰを除去するが、その後の固定化されたホスホエタノールアミンへのＳＡＰの結合に有意に影響しない、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）の２回のパルスを用いて、再生を行った。生成されたデータを、ヒトＳＡＰ表面上への緩衝液の注入によって２回較正し、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアにおける二価のアナライトモデルを用いて解析した。
表８に示されるような生成されたデータは、単に構築物間の比較用と意図されたものである。それらは、そのアッセイ形式における固有のアビディティー作用によって結合が改変された可能性に起因して、正確な動態学的値を構成していない。アビディティーは、抗体の解離速度に影響した可能性が高く、それにより、ＫＤ値がより低く算出された。さらに、すべてのＳＡＰ−Ｅ抗体に対して、得られた解離速度（ｋｄ）が、Ｂｉａｃｏｒｅ測定範囲の限度外である。それにもかかわらず、それらの結果は、本発明の治療標的であるインビボにおけるアミロイド沈着物におけるような、固相リガンドとＳＡＰとの相互作用によって固定化されたヒトＳＡＰへの抗ＳＡＰ抗体の強い結合を示唆する。
Figure 0006236478
実施例９：ＳＡＰ−Ｋ Ｌ０ヒト化軽鎖の９１位のアミノ酸スキャン
部位特異的飽和突然変異誘発を用い、９１位においてＮＮＫをコードする突然変異誘発プライマーを使用することによって（ここで、Ｎは、アデノシンまたはシチジンまたはグアノシンまたはチミジンをコードし、Ｋは、グアノシン（ｇｕａｎｉｓｉｎｅ）またはチミジンをコードする）、単一の反応において９１位のシステイン残基（Ｋａｂａｔナンバリング）が潜在的に他の１９種のアミノ酸のすべてで置換された変異体のパネルを作製した。作製された変異体の抗体上清に対して行われたＢｉａｃｏｒｅ解離速度のランク付けから、ＨＥＫ２９３６Ｅ細胞におけるスケールアップおよび精製のために４つを選択した。実施例７に詳述されたようなＯ−ホスホエタノールアミン法を用いたＢｉａｃｏｒｅ動態解析は、９１位にアラニンを有する変異体（配列番号４３）が、野生型と比べて改善された親和性を有することを示した；それぞれ０．４３６ｎＭおよび３６．８ｎＭというＫＤ値が測定された。注意：すべての変異体が、表７に示される結果をもたらすために使用された同じ実験において試験された。
他の変異体、例えば、グリシン、セリンおよびバリンも、Ｈ３Ｌ０と比べて結合性を改善したが、アラニンほどではなかった。さらに、軽鎖がＨ１と対にされたとき、これらの４つの変異体がＬ０よりも良好な結合特性を有したという事実もまた、結合ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ解離速度ランク付け実験において観察された。
ＳＡＰ−Ｋヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ０ ９１Ａヌクレオチド配列（コドン最適化された配列）（配列番号７３）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＡＴＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ
ＳＡＰ−Ｋヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ０ ９１Ａアミノ酸配列（配列番号７４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＮＳＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＮＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
実施例１０：抗ＳＡＰ抗体によるアミロイドクリアランスの補体依存性
補体欠損のマウスと補体が十分な正常動物とにおける治療の効率を比較することによって、抗ＳＡＰ抗体によるアミロイドクリアランスにおける補体の役割を調べた。Ｃ１ｑに対する遺伝子の標的化欠失は、Ｃ１ｑと抗体抗原複合体との結合によって惹起される補体古典経路の活性化を阻止するが、走化性およびオプソニン化に関与する中心的な機能工程であり、補体の主要な生物学的機能であるＣ３の活性化はなおも、副経路およびレクチン経路を介して、ならびに非補体セリンプロテイナーゼによる直接的なＣ３の切断によって、進むことができる。Ｃ３に対する遺伝子の標的化欠失は、これらの機能を完全に無くす。
ＡＡアミロイドーシスの誘導
補体欠損マウスの２つの群：Ｃ３ノックアウト（ｎ＝１４）およびＣ１ｑノックアウト（ｎ＝１２）ならびに１５匹の野生型マウスにおいて、ＡＡアミロイドーシスを誘導し、確認した。すべてのマウスが、純系のＣ５７ＢＬ／６だった。アミロイド原線維を含むアミロイド性組織の抽出物である単一用量のアミロイド増強因子（Ｂａｌｔｚ ｅｔ ａｌ，（１９８６）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１１５−１２１）を静脈内注射によって各マウスに投与し、その４日後に、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中の溶液としての１０％ｗ／ｖカゼインを１２日間にわたる連日の１０回の皮下注射によって投与した（Ｂｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３：８５５−８５９）。カゼインは、持続的な急性炎症、および血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ）産生の持続性の増加を誘発し、それにより、すべての動物においてＡＡアミロイド沈着をもたらす。最後のカゼイン注射の７日後に、すべてのマウスの飲料水にＫＩを導入し、３日後に、標準的な用量の１２５Ｉ標識ヒトＳＡＰ（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，（１９９０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６：１８６２−１ ８６９およびＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６７：９０３−９１３）を各マウスに静脈内注射した。すべてのマウスにおいて、トレーサー注射の２４時間後および４８時間後に全身放射能計測を行うことにより、全身のアミロイド負荷の正確な指標である放射能の保有を測定した。１２５Ｉ−ＳＡＰトレーサー注射の１０日後に、マウス１匹あたり１０ｍｇの単離された純粋なヒトＳＡＰの単回の腹腔内注射によって、すべてのマウスにヒトＳＡＰを「負荷」した。アミロイドを有するマウスに注射されたヒトＳＡＰは、アミロイド沈着物に局在し、その位置において約３〜４日の半減期で存続するのに対し、アミロイドに結合していない任意のヒトＳＡＰは、約３〜４時間の半減期で循環から除去される（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，，１６７：９０３−９１３およびＰｅｐｙｓ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１ ７：２５４−２５９）。
単離された純粋なヒトＳＡＰを注射した後のアミロイドを有するマウスの脾臓における抗ヒトＳＡＰ抗体での免疫組織化学的染色は、典型的な辺縁帯分布ですべてのアミロイド沈着物が強く陽性染色されることを示す。この結合したヒトＳＡＰは、本発明に係る治療用の抗ＳＡＰ抗体の標的である。
抗ＳＡＰ治療
ヒトＳＡＰがもはや循環中で検出可能でなくなるヒトＳＡＰ注射の３日後に、各補体ノックアウト群における２匹を除くすべてのマウスに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の溶液として５０ｍｇ／ｍｌの単一特異的なヒツジ抗ヒトＳＡＰ抗血清の１ｍｌの全ＩｇＧ画分（ｂａｔｃｈ ｎｏ．２８６６）（７ｍｇ／ｍｌの実際の抗ＳＡＰ抗体を含む）の単回の腹腔内注射を行った。その抗血清は、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｌｔｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫによって、ヒトＳＡＰ（厳密には、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ ａｎｄ Ａｃｕｔｅ Ｐｈａｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓにおいて１００％まで精製されたもの）および専売の免疫化手順を用いて製造されたものだった。次いで、アルカリ性かつアルコール性のコンゴーレッド染色（Ｐｕｃｈｔｌｅｒ，Ｈ．，Ｓｗｅａｔ，Ｆ．ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．（１９６２）Ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ ｂｙ ａｍｙｌｏｉｄ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，１０：３５５−３６４）によるアミロイド負荷の組織学的評価のために、すべての動物を抗ＳＡＰ投与の１５日後に殺傷した。すべての動物の脾臓および肝臓のコンゴーレッド切片が、各マウスが受けた治療について知らされていない１人以上の専門の観察者によって独立して検査され、以前に報告されたように（Ｂｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３：８５５−８５９）、存在するアミロイドの量についてスコア付けされた。１〜５のスコアは、１（特定の器官のいくつかの切片における１または２個の小さいアミロイドの斑に対応する）から、５（グレード１（Ｂｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３：８５５−８５９）よりも約１０，０００倍多いアミロイドを含む大量の広範な沈着物に対応する）までの、底が１０の対数のおよそのランキングスケールである。数人の観察者は、整数の中間の．５のスコアも使用したが、異なる観察者のスコアは、常に高度に一致していた。各動物の各器官に対するすべての観察者のスコアの算術平均を統計解析に使用した。
結果
補体が十分な野生型マウスにおけるアミロイド沈着物の効果的なクリアランスと大いに異なって、補体欠損動物の両群には、なおも大量のアミロイドが存在したが、各タイプの２匹のコントロール補体欠損マウスよりも断片化された外観を呈する傾向があった。脾臓アミロイドスコアの中央値、範囲は、以下だった：野生型、１．１７、０．０〜１．５、ｎ＝１５；Ｃ３ノックアウト、１．９２、１．１７〜４．３３、ｎ＝１２；Ｃ１ｑノックアウト、１．２５、１．１７〜３．５、ｎ＝１０（クラスカル・ワリスノンパラメトリックＡＮＯＶＡ，Ｐ＜０．００１）。野生型コントロールと両方の補体欠損群との差は、有意だった（Ｃ３ノックアウトについてはＰ＜０．００１およびＣ１ｑノックアウトについてはＰ＝０．０３６（多重比較のためのボンフェローニの補正後））が、Ｃ３ノックアウトとＣ１ｑノックアウトとの差は、有意でなかった（Ｐ＝０．３１４（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定））。
考察
Ｃ１ｑまたはＣ３を欠くマウスでは、抗ＳＡＰ治療は、補体が十分な野生型マウスにおけるものと同程度には効率的にアミロイド沈着物を除去しなかった。したがって、抗ＳＡＰの治療効果は、極めて実質的に補体依存的であり、理論的にはＦｃ（γ）受容体を介して食細胞が関わり得るＩｇＧ抗体結合だけによって媒介されるものではない。それにもかかわらず、補体欠損マウスにおいて持続性のアミロイド沈着物がより断片化された外観を呈したことは、抗体単独の少なくともいくらかの影響を示唆した。また、Ｃ３欠損動物よりもＣ１ｑ欠損におけるクリアランスのほうが大きいという傾向は、Ｃ３活性化が重要であること、およびいくらかの補体の活性化がＣ１ｑの非存在下において生じている可能性があることを示唆した。
実施例１１：インタクトなＩｇＧ抗ＳＡＰ抗体の必要性
ＩｇＧ抗体による補体の活性化には、Ｆｃ領域を含むそのインタクトな分子全体が必要であり、その活性化は、Ｃ１ｑの結合によって惹起される古典経路を介して進む。しかしながら、いくつかの抗体抗原系では、Ｆ（ａｂ）２フラグメントによって、副経路を介した補体の活性化が媒介され得る。抗ＳＡＰ抗体によるアミロイド除去の補体依存性を確認するため、およびその抗体のＦｃ領域に対する潜在的な必要性を調べるために、Ｆ（ａｂ）２抗ＳＡＰ抗体（ヒツジポリクローナル抗ヒトＳＡＰ抗血清（ｂａｔｃｈ２８６６）のＩｇＧ画分のｐＨ４．０におけるペプシン切断によって生成され、標準的な方法によって精製されたもの）の作用を試験した。
ＡＡアミロイドーシスの誘導および治療
上記の実施例１０に詳述されたように野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＡＡアミロイドーシスを誘導し、確認した。実施例１０に詳述されたようにアミロイド沈着物にヒトＳＡＰを負荷した後、マウスの群を、ヒツジポリクローナル抗ヒトＳＡＰ抗血清の全ＩｇＧ画分、緩衝液ビヒクル単独またはＩｇＧ画分のＦ（ａｂ）２フラグメントで治療した。注射された抗ＳＡＰ抗体活性の用量は、Ｆ（ａｂ）２を投与されたマウス１匹あたり７．２８ｍｇ、および全ＩｇＧを投与されたマウス１匹あたり７ｍｇ（通常５０ｍｇの全ＩｇＧ）だった。コンゴーレッド染色によるアミロイド負荷の評価のために、１４日後にすべてのマウスを殺傷した。
結果
アミロイド沈着物のクリアランスは、ビヒクル単独を投与されたコントロールマウスにおける大量のアミロイド沈着物と比べて、ＩｇＧ抗ＳＡＰ抗体を投与されたマウスではほぼ完全だった。Ｆ（ａｂ）２を投与されたマウスは、無処置コントロールよりも少ないアミロイドを有したが、全ＩｇＧ抗ＳＡＰ抗体で処置されたマウスよりもなおも実質的に多かった（表９）。
Figure 0006236478
クラスカル・ワリス検定：脾臓，Ｐ＜０．００１；肝臓Ｐ＜０．００１
マン・ホイットニー検定＊＊：１対２、脾臓と肝臓の両方，Ｐ＜０．００１；１対３、脾臓と肝臓の両方，Ｐ＝０．００１；２対３，脾臓，Ｐ＝０．２８４；肝臓，Ｐ＝０．０１９
＊群２における単一の域外値は、ＩｇＧ抗ＳＡＰ処置にもかかわらず脾臓アミロイドが多かった。この動物を除くと、ＩｇＧ処置の有効性とＦ（ａｂ）２抗ＳＡＰ抗体処置の有効性との間に高度な有意差がもたらされる。＊＊多重比較に起因して、０．０１以下のＰ値が有意性のために必要とされる。
考察
本研究において使用されたＦ（ａｂ）２抗ＳＡＰ抗体のモル用量は、全ＩｇＧよりもＦ（ａｂ）２フラグメントの分子量が小さいことに起因して、ＩｇＧ抗体のモル用量よりも約３分の１多かった。アミロイドクリアランスに対する最適な作用のために、Ｆｃが必要とされる。補体が十分なマウスにおけるＦ（ａｂ）２よりも補体欠損マウスにおける全ＩｇＧが有効でなかったので、これは、Ｆｃ（γ）受容体による細胞認識の直接的な関与が理由ではない。投与された高用量のＦ（ａｂ）２が、副経路を介していくらかの補体を活性化することができた可能性がある。
実施例１２：マクロファージの必要性
ＵＳ２００９／０１９１１９６に記載されている組織学的研究および組織化学的研究は、抗ＳＡＰ抗体で処置されたマウスにおいてアミロイド沈着物を浸潤し、包囲し、貪食する細胞がマクロファージであることを示している。実際にマクロファージがアミロイドのクリアランスに関与していることを確認するために、ヒツジポリクローナル抗ヒトＳＡＰ抗血清（ｂａｔｃｈ２８６６）の全ＩｇＧ画分による処置の効果を、リポソームのクロドロネートの投与によってすべてのマクロファージ活性が阻害されたマウスにおいて試験した。試薬、実験プロトコル、およびリポソームのクロドロネートのマクロファージ機能に対する作用は、十分に確立されており、広く実証されている（Ｖａｎ Ｒｏｏｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｖｏｌ．１２．Ｐｐ，８１−９４）。
ＡＡアミロイドーシスの誘導および処置
上記の実施例１０に詳述されたプロトコルを用いて野生型マウスにおいてＡＡアミロイドーシスを誘導し、確認した後、すべての動物に、１０ｍｇという単一の腹腔内用量の単離された純粋なヒトＳＡＰを投与することにより、その沈着物にヒトＳＡＰを負荷した。次いで、直ちにならびにその２、７および１４日後に、０．３ｍｌのリポソームのクロドロネートを試験群の腹腔内に投与した。ヒトＳＡＰ注射の３日後に、１つのコントロール群および試験群に、５０ｍｇという単一の腹腔内用量のヒツジ抗ヒトＳＡＰ抗血清のＩｇＧ画分を投与した。第２のコントロール群には、抗ＳＡＰ処置および他の追加の処置を行わなかった。試験群および抗体コントロール群に抗ＳＡＰを投与した１４日後に、コンゴーレッド染色によるアミロイド負荷の評価のために、すべてのマウスを殺傷した。
結果
抗ＳＡＰによる処置は、抗体を投与されなかった群と比べて、アミロイド沈着物のほぼ完全なクリアランスをもたらした。対照的に、マクロファージ機能を完全に無くすと知られるレジメンでリポソームのクロドロネートを投与されたマウスでは、アミロイド沈着物のクリアランスが見られなかった（表１０）。
Figure 0006236478
クラスカル・ワリス検定：脾臓，Ｐ＜０．００１；肝臓Ｐ＜０．００１
ボンフェローニの補正を伴うマン・ホイットニー検定：１対２：脾臓と肝臓の両方，Ｐ＜０．００３；１対３：脾臓，Ｐ＝０．０７８；肝臓，Ｐ＝０．４１１；２対３，脾臓と肝臓の両方，Ｐ＜０．００３．
考察
この特定の実験における結果から、マクロファージの機能が、抗ヒトＳＡＰ抗体によるアミロイド沈着物のクリアランスに必要であることが確認された。
実施例１３：マウスの全身性ＡＡアミロイド沈着物の除去におけるマウスモノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体ＳＡＰ−Ｅの有効性
様々なモノクローナル抗体がヒトＳＡＰを含むマウスのＡＡアミロイド沈着物のクリアランスを媒介する能力を、ポジティブコントロールとしての標準的なヒツジポリクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体との比較において詳しく調べた。
ＡＡアミロイドーシスの誘導および処置
マウスＳＡＰ遺伝子が欠失した純系のＣ５７ＢＬ／６動物（Ｂｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３：８５５−８５９）を、ヒトＳＡＰトランスジーンを有するＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｙａｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３６：２４８−２５０およびＧｉｌｌｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１２：２５５−２６４）と交雑することによって、ヒトＳＡＰをトランスジェニックしたＳＡＰノックアウトＣ５７ＢＬ／６マウスを作出した。したがって、これらのマウスは、マウスＳＡＰを欠くが、ヒトで見られる濃度よりも有意に高い濃度でヒトＳＡＰを発現する。ヒトＳＡＰトランスジェニックマウスＳＡＰノックアウトマウスにおいて、実施例１０に記載されたように全身性ＡＡアミロイドーシスを誘導し、それらのマウスへの最後のカゼイン注射の９日後に、トレーサー用量の１２５Ｉ−標識ヒトＳＡＰの注射後のアミロイドの全身放射能計測によって通常通り、アミロイド沈着の存在および程度を確認した。すべてのマウスが実質的かつ比較可能な量のアミロイドを有し、種々の処置を行うために、それらのマウスを密接にマッチした群に割り当てた。トレーサー注射の１週間後に、５ｍｇという単一用量のＣＰＨＰＣを腹腔内注射によって各マウスに投与することにより、循環ヒトＳＡＰを枯渇させ、続いて、５時間後に同じ経路を介して、標準的なヒツジポリクローナル抗ヒトＳＡＰ ＩｇＧ画分（ｂａｔｃｈ２８６６，７ｍｇ／ｍｌの抗ヒトＳＡＰ抗体を含む５０ｍｇ／ｍｌの総タンパク質における１ｍｌ）または５ｍｇの９つの異なる単離された純粋なモノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体のうちの１つを投与した（表１１）。抗体注射の２１日後にすべてのマウスを殺傷し、その脾臓のコンゴーレッド組織学的検査によってアミロイド負荷を測定した。
Figure 0006236478
試験されたモノクローナル抗体のうち、ＳＡＰ−Ｅだけが、アミロイド沈着物のクリアランスをもたらしたが、その効果は、ヒツジポリクローナル抗体の高度に再現性のある劇的な作用と同じだった。重要なことには、ＳＡＰ−Ｅは、マウス補体を活性化すると知られるマウスＩｇＧ２ａアイソタイプであるが、ＳＡＰ−Ｂを除く他のモノクローナルのすべてが、補体を活性化しないマウスＩｇＧ１アイソタイプだった。ＳＡＰ−Ｂは、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプであるが、そのインビトロにおけるＳＡＰへの結合は、ＳＡＰ−Ｅの結合よりも著しく低く、明らかにインビボにおいて有効であるには十分でなかった。
考察
これらの結果から、十分に強く補体を活性化するＩｇＧ２ａマウスモノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体が、インビボにおいてヒツジポリクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体と同程度に効率的にアミロイドクリアランスを媒介することが実証される。
実施例１４：モノクローナルマウス抗ヒトＳＡＰ抗体であるＳＡＰ−ＫおよびＳＡＰ−Ｅのインビトロにおける比較による特徴付け
ＳＡＰ−Ｋは、精製ヒトＳＡＰでの免疫、および通例の方法によってクローン化されるハイブリドーマを生成する従来の融合から標準的な手法によって得られた、異なる６つの最も強く結合するマウスＩｇＧ２ａモノクローナルから選択された。これらのＩｇＧ２ａ抗体のうち、ＳＡＰ−Ｋは、固定化されたヒトＳＡＰに対して最も強い結合を示した。これは、ヒトＳＡＰが、プラスチック表面上に、非特異的付着もしくは共有結合によって直接固定化されるか、または固定化されたリガンド（それがアミロイド原線維であるか小分子リガンドのホスホエタノールアミンであるかを問わない）へのＳＡＰの特異的なカルシウム依存性結合によって直接固定化されるかに関係ない例である。また、ＳＡＰ−Ｋは、カルシウムの存在下または非存在下において、およびＳＡＰがＣＰＨＰＣと予め複合体化されて十量体のＳＡＰ−ＣＰＨＰＣ複合体において共有結合的に「固定」されている場合に、直接固定化されたＳＡＰに十分結合した（Ｐｅｐｙｓ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４１７：２５４−２５９；Ｋｏｌｓｔｏｅ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｂｙ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０６：７６１９−７６２３）。ＳＡＰ−Ｅもまた、これらの異なる配置のすべてにおいてヒトＳＡＰに十分に結合した。しかしながら、これら２つの抗体は、ヒトＳＡＰが低密度にしか利用可能でないとき、例えば、コーティングのためにプレートがほんの１μｇ／ｍｌのヒトＳＡＰにしか曝露されていないとき、ＳＡＰ−Ｅよりもかなり多くのＳＡＰ−Ｋが結合するようになるのに対し、より大量の固定化されたＳＡＰが存在するとき、例えば、コーティング溶液が１００μｇ／ｍｌのＳＡＰを含むとき、ＳＡＰ−ＫよりもＳＡＰ−Ｅが多く結合したという点において大きく異なる。この差異は、２以上のＳＡＰ分子が別のＳＡＰ分子と接近して会合した状態であるとき、ＳＡＰ−Ｅが最適に結合する一方で、ＳＡＰ−Ｋは、孤立した単一のＳＡＰ分子に強く結合することを示唆する。この機構は、ポリクローナルヒツジ抗ヒトＳＡＰ（ｂａｔｃｈ２８６６）でコーティングされたプレート上への捕捉によってヒトＳＡＰが固定化されて、それによって、各ヒツジＩｇＧ抗体分子の２本の腕において共に接近して保持されるＳＡＰ分子の対がもたらされたとき、ＳＡＰ−Ｅが、ヒトＳＡＰ投入の全レベルにおいてＳＡＰ−Ｋよりも良好に結合したという知見によって裏づけられる（図７）。
図７は、固定化されたヒツジポリクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体によって捕捉される、ヒトＳＡＰに対するモノクローナルマウス抗体の結合についてのイムノラジオメトリックアッセイを示している。提供されたヒトＳＡＰのすべての濃度において、ＳＡＰ−Ｋよりも実質的に多いＳＡＰ−Ｅが結合した。各点は、３回の反復の平均値である。
非常に重要なことには、ＳＡＰ−ＥとＳＡＰ−Ｋの両方が、天然ヒトＳＡＰに明らかに等しく十分に結合した（これは、単離された純粋なヒトＳＡＰとヒト全血清との両方に対するアガロースゲルでの二重免疫拡散法において両方の抗体が類似の免疫沈降を示したことによって示された）。これらの２つのマウスモノクローナル抗体の類似の結合性は、チップ上に共有結合的に固定化されたヒトＳＡＰを用いてＢｉａｃｏｒｅ装置（ＢＩＡｃｏｒｅＸ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）において測定された類似のパラメータとして反映された（表１２）。
Figure 0006236478
示された値は、３回の反復測定の平均値およびＳＤである。
対照的に、両方の抗体が、生理学的緩衝液におけるアガロースゲル電気泳動後のウエスタンブロッティングにおいて未変性ヒトＳＡＰに結合したが、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥからのウエスタンブロッティングではＳＡＰ−ＥだけがヒトＳＡＰに結合した。したがって、ＳＡＰ−Ｅは、変性したヒトＳＡＰを認識するが、ＳＡＰ−Ｋは、未変性ヒトＳＡＰだけを認識し、立体構造エピトープに結合していると考えられる。
ヒトＳＡＰのＣＮＢｒ消化によって、１５９Ｍと１６０Ｗとの間で切断が生じる（これにより、１５９位がメチオニンからホモセリンラクトンに変換された新しいペプチド（１５０−１５８−ホモセリンラクトンと呼ばれる）がもたらされる）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥからのウエスタンブロッティングにおいて、ＳＡＰ−Ｅは、残基Ｍｅｔ１５９におけるＳＡＰのＣＮＢｒ切断によって放出されたＮ末端の１−１５８−ホモセリンラクトンポリペプチドに結合したが、カルシウムの非存在下におけるキモトリプシン消化によって放出された１−１４０フラグメントとはほとんど反応しなかった（図８）。ゆえに、ＳＡＰ−Ｅの結合が、溶液中のペプチド１３６〜１４７、１３８〜１４９、１４０〜１５１および１１２〜１１９によって強く阻害されないので、ＳＡＰ−Ｅによって認識されるエピトープは、いくらか変性に抵抗性の二次構造を明らかに含む領域１４０〜１５８に存在すると考えられる。これは、ＳＡＰの変性に対する動態安定性および抵抗性と一致する（Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｍ．ａｎｄ Ｃｏｌｏｎ，Ｗ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３：１１２４８−１１２５４）。
図８は、モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体ＳＡＰ−Ｅについてのエピトープマッピングを示している。Ａ，７０％ＴＦＡ中のＣＮＢｒによって切断される点（残基１５９Ｍ）およびカルシウムの非存在下における重炭酸アンモニウム中での還元／カルバミドメチル化（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）なしのキモトリプシンによって切断される点（残基１４０Ｙおよび１４４Ｆ）を示しているヒトＳＡＰの完全なアミノ酸配列。Ｂ，ＣＮＢｒで切断されたＳＡＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。左パネル：クマシーブルー染色；レーン１，未処理コントロールＳＡＰ；レーン２，ほんのわずかな未切断のインタクトな残留プロトマー、ならびにそれぞれおよそ２０ｋＤ（残基１−１５８−ホモセリン−ラクトン）および５ｋＤ（１６０−２０４）の予想フラグメントを示している、ＣＮＢｒ切断後のＳＡＰ。これらは、質量分析によって正確に確認された。右パネル：レーン１（１００ｎｇ充填）および２（１０ｎｇ）には、インタクトな未処理ＳＡＰの強い染色、ならびにレーン３（６００ｎｇ）、４（１３０ｎｇ）および５（６４ｎｇ）には、ＣＮＢｒで切断されたＳＡＰにおけるインタクトな残留ＳＡＰおよびより大きい残基１−１５８−ホモセリン−ラクトンフラグメントを示している、ＳＡＰ−５でのウエスタンブロット。レーン６には、ＳＡＰ−５が全く反応しない単離された純粋なヒトＣＲＰが含まれていた。Ｃ，キモトリプシンで消化されたＳＡＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。左パネル：クマシーブルー染色；レーン１，未処理コントロールＳＡＰ；レーン２，残基１〜１４０および１４５〜２０４に対応する主要な予想フラグメントを示している、キモトリプシン消化後のＳＡＰ。これらは、質量分析によって正確に確認された。右パネル：レーン１（５００ｎｇ充填）および２（１００ｎｇ）には、インタクトな未処理ＳＡＰの強い染色、ならびにレーン３および４には、キモトリプシンで消化された異なる充填量のＳＡＰを含むインタクトな残留ＳＡＰを示している、ＳＡＰ−Ｅによるウエスタンブロット。残基１〜１４０フラグメントへのＳＡＰ−Ｅの非常に弱い結合が、最も多く充填されたレーン３にだけ見られる。レーン５（５００ｎｇ）および６（１００ｎｇ）には、ＳＡＰ−Ｅが全く反応しない単離された純粋なヒトＣＲＰが含まれていた。Ｄ，ヒトＳＡＰ（ｈ）とマウスＳＡＰ（ｍ）との残基１３６〜１４７に対する配列比較。上パネル，マウス配列中に黒で示される残基によって差異を上に示した。下パネル，ヒトＳＡＰの３Ｄサブユニット構造において白色で示された頂部に１４０Ｙを有するこの伸長されたループの位置。マウス配列において異なる残基が黒色で示されている。灰色の球形は、リガンド結合ポケットに結合したカルシウム原子を表している。
ＳＡＰ−Ｋによって認識される立体構造エピトープは、ＣＬＩＰＳ（登録商標）技術のエピトープマッピング（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｐｒｅｓｔｏ ＢＶ）によって、円盤様の五量体の天然ＳＡＰ分子の周縁における外側の露出されるループである残基１２１〜１３１と特定された。
図９は、ＳＡＰ−Ｋによって認識されるヒトＳＡＰ上のエピトープ（Ａ，黒色で強調されている、ＣＬＩＰＳ（登録商標）技術によって決定された部分）およびＳＡＰ−Ｅによって認識されるヒトＳＡＰ上のエピトープ（Ｂ，白色で示されている、ＳＡＰのＣＮＢｒ切断産物およびカルシウムの非存在下におけるキモトリプシン消化によって放出されたフラグメントとの結合の結果によって決定された１４０〜１５８）の位置を示している。
実施例１５：マウスＡＡアミロイドーシスモデルにおけるインビボのアミロイド沈着物の除去におけるＳＡＰ−Ｋマウスモノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体の有効性
ＳＡＰ−Ｋの効力を、マウスにおける確立された全身性ＡＡアミロイド沈着物の除去における標準的なヒツジポリクローナル抗体の作用と比較した。
ＡＡアミロイドーシスの誘導および処置
上記の実施例１０に詳述されたように野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＡＡアミロイドーシスを誘導し、確認した。実施例１０に詳述されたようにアミロイド沈着物にヒトＳＡＰを負荷した後、ヒツジポリクローナル抗ヒトＳＡＰ抗血清の全ＩｇＧ画分（ｂａｔｃｈ２８６６）としてマウス１匹あたり５０ｍｇの全ＩｇＧ（７ｍｇという用量の実際の抗ＳＡＰ抗体をもたらす）、マウス１匹あたり５ｍｇという用量の単離精製ＳＡＰ−Ｋ、マウス１匹あたり１ｍｇという用量の単離精製ＳＡＰ−Ｋ、およびネガティブコントロールとして、無関係なヒト抗原に特異的かつヒトＳＡＰまたは任意のマウス抗原に非反応性の単離、精製されたモノクローナルマウスＩｇＧ２ａ抗体でマウスの群を処置した。コンゴーレッド染色によるアミロイド負荷の評価のために、１７日後にすべてのマウスを殺傷した。
結果
５ｍｇのＳＡＰ−Ｋで処置されたマウスは、７ｍｇの用量のヒツジポリクローナル抗体を用いたときに見られるものと同じ顕著な脾臓および肝臓のアミロイド沈着物のクリアランスを示した。無関係なコントロールマウスＩｇＧ２ａ抗体を投与されたすべての動物における広範な脾臓および肝臓のアミロイド沈着物とははっきり異なって、処置されたマウスの脾臓には微量のアミロイドの斑だけしか残らず、肝臓の多くでは何も検出されなかった（表１３）。マウス１匹あたり１ｍｇ、０．５ｍｇおよび０．１ｍｇ（０．５ｍｇおよび０．１ｍｇについてはデータ示さず）という低用量のＳＡＰ−Ｋでは、有意な効果がなかった。
Figure 0006236478
クラスカル・ワリス検定：脾臓，Ｐ＜０．００１；肝臓Ｐ，０．００１
マン・ホイットニー検定＊：１対２，脾臓，Ｐ＝０．００２；肝臓，Ｐ＝０．００２；１対３，脾臓，Ｐ＝０．１７３；肝臓，Ｐ＝０．０８３；１対４，脾臓，Ｐ＜０．００１；肝臓，Ｐ＜０．００１；２対３，脾臓，Ｐ＝０．０．００１；肝臓，Ｐ＝０．０１９；２対４，脾臓，Ｐ＝０．５１３；肝臓，Ｐ＝０．７６８；３対４，脾臓，Ｐ＜０．００１；肝臓，Ｐ＝０．００４。＊多重比較に起因して、０．０１以下のＰ値が有意性のために必要とされる。
考察
これらの結果から、立体構造エピトープを特異的に認識する、補体を活性化するマウスＩｇＧ２ａアイソタイプのモノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体のインビボでのアミロイド沈着物の除去における有効性が立証される。したがって、本発明に係る使用のためのモノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体は、主に配列エピトープ（例えば、抗体ＳＡＰ−Ｅ）、または全体的に立体構造エピトープ（例えば、ＳＡＰ−Ｋ）に対して抗体産生され得る。
実施例１６：マウスの全身性ＡＡアミロイド沈着物の除去におけるＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋの有効性の比較、ならびに血漿中の抗ＳＡＰ抗体濃度の推定
ＡＡアミロイドーシスの誘導および処置
上記の実施例１０に詳述されたように野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＡＡアミロイドーシスを誘導し、確認した。実施例１０に詳述されたようにアミロイド沈着物にヒトＳＡＰを負荷した後、マウス１匹あたり３ｍｇおよび１ｍｇの２つの異なる抗体で、マウスの群を処置した。アミロイドを誘導されたコントロール群には、抗体の代わりに単なるＰＢＳを投与し、さらなる２つの群には、５ｍｇ／マウスという公知の有効量の各抗体を投与した。抗体を投与した１、５および１５日後に、循環抗ＳＡＰ抗体のアッセイのためにすべてのマウスから採血し、コンゴーレッド染色によるアミロイド負荷の評価のために、２１日目にすべてを殺傷した。既知濃度で正常マウス血清に加えられたそれぞれ精製ＳＡＰ−Ｅおよび精製ＳＡＰ−Ｋで標準化された頑強なイムノラジオメトリックアッセイを用いて、すべての血清を抗ＳＡＰ活性についてアッセイした。
結果
調べられた各組織の情報について全員が知らされていない４人の独立した専門の観察者によって、アミロイド負荷がスコア付けされた。すべての観察者のスコアは、通常のとおり高度に一致しており、統計解析のために、各マウスの脾臓と肝臓の両方に対するすべての観察者の総スコアを合計した。両方の抗体が、先に証明されたように有効であり、明らかな用量依存性の作用が存在したが、より低用量ではＳＡＰ−Ｅが、ＳＡＰ−Ｋよりも明らかに強力だった。
Figure 0006236478
クラスカル・ワリス検定：Ｐ＜０．００１
マン・ホイットニー検定＊：Ｋ５対Ｅ５，Ｐ＝０．０９５；Ｋ３対Ｅ３，Ｐ＝０．６８４；Ｋ１対Ｅ１，Ｐ＝０．００１；Ｋ５対Ｋ３，Ｐ＝０．５９４；Ｋ５対Ｋ１，Ｐ＝０．００１；Ｋ３対Ｋ１，Ｐ＜０．００１；Ｅ５対Ｅ３，Ｐ＝０．００８；Ｅ５対Ｅ１，Ｐ＝０．００１；Ｅ３対Ｅ１，Ｐ＝０．００４；Ｋ５対Ｃ，Ｐ＝０．００１；Ｅ５対Ｃ，Ｐ＝０．００１；Ｋ３対Ｃ，Ｐ＜０．００１；Ｅ３対Ｃ，Ｐ＜０．００１；Ｋ１対Ｃ，Ｐ＝０．０４３；Ｅ１対Ｃ，Ｐ＜０．００１。＊多重比較に起因して、０．０１以下のＰ値が有意性のために必要とされる。
すべての動物に単一用量が投与された後、より低用量の各群における１匹の外れた個体は別として、循環抗ＳＡＰ抗体活性の濃度は一貫して強く用量依存性だった。マウス１匹あたり１ｍｇが投与された１日後でさえ、ほとんどのマウスにおいてバックグラウンドを超えるものは概して検出可能でなかった。対照的に、５ｍｇが投与された１５日後でも大量の抗体が存在し、３ｍｇが投与された５日後には、ほとんどのマウスが循環抗体を有したが、１５日後はより少なくなった（表１５）。ＳＡＰ−Ｅに対するパターンとＳＡＰ−Ｋに対するパターンとの間に有意差はなかった。
Figure 0006236478
＊１７μｇ／ｍｌ未満という見かけの抗ＳＡＰ抗体の濃度が、このアッセイに対するバックグラウンドであり、真の活性に相当するわけではない。
考察
一対一での直接的な比較において、ＳＡＰ−Ｅが、わずかであるがＳＡＰ−Ｋよりも有意に強力であるという一貫した証拠が存在する。マウス１匹あたり１ｍｇを投与した後、循環抗ＳＡＰ抗体の活性は、１日後には検出可能でなかったことから、明らかにすべてが、アミロイド沈着物内のヒトＳＡＰに局在化した。３ｍｇを投与した後、大量の抗ＳＡＰが、１日後には循環中に存在し、５日後にも存在した。マウス１匹あたり５ｍｇを投与した後は、１５日後であっても血液中にかなり濃度の抗ＳＡＰが存在した。これらの観察結果から、アミロイドクリアランスを誘発するのに、低用量の抗ＳＡＰ抗体の反復投与で十分であり得ることが示唆される。
実施例１７：マウスにおいて全身性ＡＡアミロイド沈着物を除去する際の低用量のＳＡＰ−ＥおよびＳＡＰ−Ｋの有効性の比較
ＡＡアミロイドーシスの誘導および処置
上記の実施例１０に詳述されたように野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＡＡアミロイドーシスを誘導し、確認した。実施例１０に詳述されたようにアミロイド沈着物にヒトＳＡＰを負荷した後、マウス１匹あたり０．５ｍｇおよび１ｍｇという単一用量の２つの異なる抗体、または３もしくは４日間隔で投与される０．１５ｍｇという６回の反復用量で、マウスの群（各々ｎ＝１０）を処置した。アミロイドを誘導されたコントロール群（ｎ＝９）には、抗体の代わりに単なるＰＢＳを投与し、さらなる２つの群（各々ｎ＝３）には、５ｍｇ／マウスという公知の有効量の各抗体を投与した。コンゴーレッド染色によるアミロイド負荷の評価のために、２９日目にすべてを殺傷した。
結果
低用量（非常に低い反復用量を含む）は、特に肝臓におけるアミロイド負荷の減少において有意な有効性を示した。また、ＳＡＰ−Ｅは、ＳＡＰ−Ｋよりも明らかに強力だった。
Figure 0006236478
クラスカル・ワリス検定：脾臓，Ｐ＜０．００１；肝臓，Ｐ＝０．００１
マン・ホイットニー検定＊：Ｅ１対Ｃ：脾臓，Ｐ＜０．００１；肝臓Ｐ＜０．００１；Ｅ０．５対Ｃ：脾臓，Ｐ＝０．６０４；肝臓Ｐ＝０．００４；Ｅｒｅｐ対Ｃ：脾臓、Ｐ０．００２；肝臓，Ｐ＜０．００１；Ｋ１対Ｃ：脾臓，Ｐ＝０．０６５；肝臓，Ｐ＝０．００１；Ｋ０．５対Ｃ：脾臓，Ｐ＝０．０２２；肝臓，Ｐ＝０．００１；Ｋｒｅｐ対Ｃ：脾臓，Ｐ＝０．０７９；肝臓，Ｐ＜０．００１；Ｅ１対Ｅ０．５：脾臓，Ｐ＝０．００５；肝臓Ｐ＝０．１４３；Ｅ１対Ｅｒｅｐ：脾臓，Ｐ＝０．０４３；肝臓，Ｐ＝０．２８０；Ｅ０．５対Ｅｒｅｐ：脾臓，Ｐ＝０．０１９；肝臓，Ｐ＝０．０４３；Ｋ１対Ｋ０．５：有意差なし；Ｋ１対Ｋｒｅｐ：有意差なし；Ｋ０．５対Ｋｒｅｐ：有意差なし；Ｅ１対Ｋ１：脾臓，Ｐ＝０．０１５；肝臓，Ｐ＝０．３５３；Ｅ０．５対Ｋ０．５：有意差なし；Ｅｒｅｐ対Ｋｒｅｐ：有意差なし。＊多重比較に起因して、０．０１以下のＰ値が有意性のために必要とされる。
考察
ＳＡＰ−Ｋよりも有意に高いＳＡＰ−Ｅの効力は、再現性があるとみられる。繰り返し投与されるときの非常に低い用量の効果、および脾臓よりも肝臓アミロイド沈着物に対するより大きな作用に関する示唆は、興味深く、潜在的に臨床的に有意である。
実施例１８：インビトロにおけるヒト化モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体による補体の活性化
補体の活性化は、本発明に係る抗ヒトＳＡＰ抗体によるアミロイド除去の有効性にとって不可欠である。３０ｍｇ／ｌのＳＡＰ濃度を含むヒト全血清、または単離された純粋なヒトＳＡＰをこの同じ濃度まで加えたマウス全血清に種々の量の単離された純粋な抗体を加えることによって、ヒト化モノクローナル抗体であるＳＡＰ−Ｅ Ｈ１Ｌ１およびＳＡＰ−Ｋ Ｈ３Ｌ０がヒト血清中およびマウス血清中でＣ３を活性化する能力をインビトロにおいて比較した。両方の場合において、血清は、新鮮でありかつ補体が十分に存在し、実験条件は、希釈剤として補体結合試験緩衝液（ＣＦＴ）を用いた補体の活性化について最適だった。
Figure 0006236478
すべてのチューブを３７℃で２時間インキュベートすることにより、補体の活性化を進めた。血清中では、ゆっくりとした自発的な活性化が常に起こっているので、Ｍ９およびＨ９の複製物でありＭ１０およびＨ１０と命名された２つの追加のコントロールを提供した（これらは、インキュベートされなかったが、混合後に直ちに−８０℃で凍結し、次いで、Ｃ３切断についてアッセイする直前に解凍した）。Ｍ／Ｈ９とＭ／Ｈ１０とを比較することにより、自発的なＣ３切断と、抗ＳＡＰ抗体によってもたらされた任意の追加の活性化、ならびにマウス血清にヒトＳＡＰだけを加えたときの任意の作用とを区別することが可能である。
ヒトＣ３に対する単一特異的な抗体を用いた二次元免疫電気泳動によって、ヒト血清中のＣ３切断をアッセイした。マウスＣ３の種々の電気泳動移動度が、ヒトＣ３を用いた場合よりも信頼性をもって区別しにくいので、この方法は、マウスＣ３切断に対しては低感度である。ゆえに、アガロースゲル電気泳動後の単一特異的な抗マウスＣ３抗体を用いた免疫ブロッティングによって、マウスＣ３の切断をアッセイした。
結果
両方のヒト化抗体がヒト補体を効率的に活性化し（Ｃ３の主な用量依存性の切断によって証明される）、それによって、未変性Ｃ３の免疫沈降ピークのより遅い移動度のサイズが減少し、より速い切断されたＣ３ｃピークのサイズが増加した（図１０）。
図１０は、ヒト全血清中のヒト化モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体によるＣ３活性化を示している。
サンプルＨ１０におけるベースラインＣ３切断に対するコントロールを含むアッセイにおいて、両方の抗ＳＡＰ抗体の最も低い用量でさえ、抗体なしの自発的な切断コントロールに見られるものよりも多いＣ３切断をもたらすことが明らかである（図１１）。
図１１は、ヒト全血清中の低用量ヒト化モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体によるＣ３活性化を示している。
ヒトＳＡＰが補充されたマウス全血清中のマウスＣ３の切断について非常に類似した結果が得られた。両方の抗体が、遅い移動度の未変性Ｃ３バンドの強度の低下およびより速い移動度の活性化型の強度の増加をもたらす、未変性マウスＣ３の用量依存性の切断を示した。また、各抗体の最も低い用量でさえ、抗体なしの自発的な活性化コントロールに見られるものよりも多いＣ３切断をもたらした（図１２）。
図１２は、純粋なヒトＳＡＰが補充されたマウス全血清中のヒト化モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体によるＣ３活性化を示している。
考察
両方のヒト化モノクローナル抗ヒトＳＡＰ抗体が、ヒトＳＡＰの存在下において補体を効率的に活性化するので、それらは、本発明に係る、全身性アミロイドーシスおよび組織における細胞外のアミロイド沈着物によって引き起こされる他の任意の疾患の治療における使用に適した候補である。
Figure 0006236478
Figure 0006236478
Figure 0006236478

Claims (10)

  1. 抗体の軽鎖をコードする第１のベクターと重鎖をコードする第２のベクターとを含む安定的に形質転換された宿主細胞であって、前記重鎖が配列番号２８の重鎖可変領域を含み、前記軽鎖が配列番号３５の軽鎖可変領域を含み、前記抗体がヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３定常ドメインを含む、宿主細胞。
  2. 抗体の軽鎖をコードする第１のベクターと重鎖をコードする第２のベクターとを含む安定的に形質転換された宿主細胞であって、前記抗体が、ＳＡＰ（血清アミロイドＰ成分）に特異的に結合し、かつ配列番号６２の重鎖および配列番号６４の軽鎖を含む、宿主細胞。
  3. 宿主細胞が真核生物である、請求項１又は２に記載の安定的に形質転換された宿主細胞。
  4. 宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３に記載の安定的に形質転換された宿主細胞。
  5. 第２のベクターが配列番号５４の核酸分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定的に形質転換された宿主細胞。
  6. 第１のベクターが配列番号５９の核酸分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定的に形質転換された宿主細胞。
  7. 第１のベクターが配列番号５９の核酸分子を含み、第２のベクターが配列番号５４の核酸分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定的に形質転換された宿主細胞。
  8. 第２のベクターが配列番号６１の核酸分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定的に形質転換された宿主細胞。
  9. 第１のベクターが配列番号６３の核酸分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定的に形質転換された宿主細胞。
  10. 第１のベクターが配列番号６３の核酸分子を含み、第２のベクターが配列番号６１の核酸分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定的に形質転換された宿主細胞。
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