ES2593454T3

ES2593454T3 - Proteínas de unión a antigeno específicas para componente amiloide sérico p

Info

Publication number: ES2593454T3
Application number: ES11705617.6T
Authority: ES
Inventors: Tejinder Kaur Bhinder; Susannah Karen Ford; Volker Germaschewski; Alan Peter Lewis; Mark Brian Pepys
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2010-03-03
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2016-12-09
Anticipated expiration: 2031-03-01
Also published as: CY1118046T1; UA108227C2; ZA201206529B; SMT201600337B; EP2542261A1; KR101817265B1; LT3025729T; JP2013521252A; MX340350B; EA201290671A1; CO6602134A2; HUE028960T2; DK2542261T3; CA2789557A1; JP2016154535A; UY33258A; EA026375B1; EP3025729A1; EP2542261B1; JP5922592B2

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente al SAP, en el que la región variable de cadena pesada es la SEC ID NO: 28, la región variable de cadena ligera es la SEC ID nº 35 y en el que el anticuerpo comprende un dominio constante humano de IgG1 o IgG3 humana.

Description

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La región variable de cadena pesada puede combinarse con una región constante humana adecuada. La región variable de cadena ligera puede combinarse con una región constante adecuada.

El anticuerpo de la invención puede comprender una cadena pesada de SEQ ID NO: 62 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 64.

5 La molécula SAP de tipo disco tiene dos caras. La hélice alfa sencilla presente en cada uno de los 5 protómeros se localiza en la cara A. La cavidad de unión al ligando dependiente del calcio de cada promotor se localiza en la cara B y por lo tanto esta cara está tapada cuando el SAP está unido a fibrillas amiloides. Para que un anticuerpo de la presente invención tengan utilidad terapéutica, el epítope reconocido por anticuerpo descrito en el presente documento es deseablemente accesible en el SAP cuando el SAP está unido a depósitos amiloides y está por lo

10 tanto localizado en la cara A o en los extremos de la molécula SAP. Por tanto, el anticuerpo puede reconocerse y unirse al SAP unido a amiloide, conduciendo a la activación del complemento que desencadena el mecanismo de eliminación dependiente de macrófagos eficaz en el cuerpo. Por consiguiente, en una realización de la invención el anticuerpo se une al SAP humano que está unido a fibrillas amiloides in vivo. En otra realización de la invención, el anticuerpo se une a la cara A del SAP humano.

15 El anticuerpo puede comprender una o más modificaciones seleccionadas de un dominio constante mutado, de manera que el anticuerpo tiene funciones efectoras/CCDA y/o de activación del complemento modificadas. En Shields y col. J. Biol. Chem (2001) 276: 6591-6604, Lazar y col. PNAS (2006) 103: 4005-4010 y en los documentos US6737056, WO2004063351 y WO2004029207, se describen ejemplos de modificaciones adecuados.

El anticuerpo puede comprender un dominio constante con un perfil de glucosilación modificado de manera que el

20 anticuerpo tiene funciones efectoras/CCDA y/o activación del complemento modificadas. En los documentos WO2003/011878, WO2006/014679 y EP1229125, se describen ejemplos de metodologías adecuadas para producir un anticuerpo con un perfil de glucosilación modificado.

La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo como se describe en el presente documento.

25 La molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada puede comprender la SEQ ID NO:

54. La molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera puede comprender la SEQ ID NO:

59.

La molécula de ácido nucleico también puede contener una o más sustituciones de nucleótidos que no modifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y/o ligera codificada.

30 La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento. También se proporciona una célula huésped recombinante, que comprende un vector de expresión como se describe en el presente documento.

El anticuerpo descrito en el presente documento puede producirse en una célula huésped adecuada. Un procedimiento para la producción de anticuerpo como se describe en el presente documento puede comprender la 35 etapa de cultivar una célula huésped como se describe en el presente documento y recuperar el anticuerpo. Una célula huésped recombinante, transformada, transfectada o transducida puede comprender al menos un casete de expresión, mediante la cual dicho casete de expresión comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada de la proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento y adicionalmente comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera del anticuerpo descrito en el presente documento. Como alternativa, una célula 40 huésped recombinante, transformada, transfectada o transducida puede comprender al menos un casete de expresión, mediante la cual un primer casete de expresión comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada del anticuerpo descrito en el presente documento y comprende adicionalmente un segundo casete que comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera del anticuerpo descrito en el presente documento. Una célula huésped establemente transformada puede comprender un vector que comprende uno o más casetes de

45 expresión que codifican una cadena pesada y/o una cadena ligera del anticuerpo descrito en el presente documento. Por ejemplo dichas células huéspedes pueden comprender un primer vector que codifica la cadena ligera y un segundo lector que codifica la cadena pesada.

La célula huésped puede ser eucariota, por ejemplo, de mamífero. Los ejemplos de dichas líneas celulares incluyen CHO o NS0. La célula huésped puede cultivarse en un medio de cultivo, por ejemplo, en un medio de cultivo sin

50 suero. El anticuerpo puede secretarse por la célula huésped en el medio de cultivo. El anticuerpo puede purificarse hasta al menos el 95% o más (por ejemplo el 98% o más) con respecto a dicho medio de cultivo que contiene elanticuerpo.

Puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Puede proporcionarse un kit de partes que comprende la composición farmacéutica junto con

55 instrucciones para su uso. Por comodidad, el kit puede comprender los reactivos en cantidades predeterminadas coninstrucciones para su uso.

Estructuras de Anticuerpos

Anticuerpos intactos

Basándose en la secuencia de aminoácidos de la región constante, las cadenas ligeras de anticuerpos de la mayoría

60 de las especies de vertebrados pueden asignarse a uno o dos tipos denominados kappa y lambda. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos humanos pueden asignarse a cinco clases diferentes IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Adicionalmente, IgG e IgA pueden subdividirse en subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; e IgA1 e IgA2. Existen variantes de especies con ratones y ratas que tienen al

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menos IgG2a, IgG2b.

Las partes más conservadas de la región variable se denominan regiones marco conservadas (FR). Los dominios variables de cada cadena pesada y ligera intacta pueden comprender cuatro FR conectadas por tres CDR. Las CDR en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las regiones FR y con las CDR de la otra cadena contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos.

Las regiones constantes no están directamente implicadas en la unión del anticuerpo al antígeno pero presentandiversas funciones efectoras tales como participación en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA), fagocitosis por la unión al receptor de Fcγ, índice de semivida/eliminación mediante el receptor de Fc neonatal (FcRn) y activación del complemento mediante el componente C1q, conduciendo a la quimiotaxis, opsonización y potencialmente, en el caso de una diana antigénica celular viable, acciones citolíticas del complemento. Los anticuerpos humanos de la clase IgG1 son los más potentes activando el sistema delcomplemento y son por lo tanto el isotipo deseable para la aplicación terapéutica de los anticuerpos de la presenteinvención.

Se ha indicado que la región constante de la IgG2 humana carece esencialmente de la capacidad de activar el complemento mediante la ruta clásica o de mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Se ha indicado que la región constante de la IgG4 carece de la capacidad de activar el complemento mediante la ruta clásica y apenas media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Los anticuerpos que carecen esencialmente de estas funciones efectoras pueden denominarse anticuerpos “no líticos”.

Anticuerpos Quiméricos y Humanizados

Los anticuerpos quiméricos se producen típicamente usando procedimientos de ADN recombinante. El ADN que codifica los anticuerpos (por ejemplo ADNc) se aísla y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo usando sondas oligonucleotídicas que pueden unirse especialmente a genes que codifican las cadenas H y L del anticuerpo. Las células de hibridoma proporcionan una fuente típica de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se introduce en vectores de expresión que después se transfectan en células huéspedes tales como E. coli, células COS, células CHO o células de mieloma que por otro lado no producen la proteína de inmunoglobulina para obtener la síntesis del anticuerpo. El ADN puede modificarse sustituyendo la secuencia codificante para cadenas L y H humanas por las regiones constantes H y L correspondientes no-humanas (por ejemplo murinas) H y L, véase por ejemplo Morrison (1984) PNAS 81: 6851.

Puede conseguirse una gran disminución en inmunogenicidad injertando solamente las CDR de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) (anticuerpos “donantes”) sobre la región marco conservada humana (“región marco conservada aceptora”) y regiones constantes para generar anticuerpos humanizados (véase Jones y col. (1986) Nature 321: 522-525; y Verhoeyen y col. (1988) Science 239: 1534-1536).

Sin embargo, de por sí el injerto de una CDR no puede dar como resultado la conservación completa de las propiedades de unión a antígeno y con frecuencia se observa que algunos restos de la región marco conservada(denominados a veces “retromutaciones”) del anticuerpo donante deben conservarse en la molécula humanizada si debe recuperarse una afinidad de unión a antígeno significativa (véase Queen y col. (1989) PNAS 86: 10,02910,033: Co y col. (1991) Nature 351: 501-502). En este caso, las regiones variables humanas que muestran la mayor homología de secuencia con el anticuerpo donante no-humano se seleccionan de una base de datos para proporcionar la región marco conservada (RF) humana. La selección de las RF humanas puede realizarse a partir de anticuerpos consenso humanos o humanos individuales. Si fuera necesario, para conservar conformaciones CDR, pueden sustituirse restos clave del anticuerpo donante en la región marco conservada aceptora humana. Para ayudar a identificar dichos restos estructuralmente importantes, puede usarse la modelación informatizada de los anticuerpos, véase el documento WO 99/48523.

Como alternativa, la humanización puede conseguirse mediante un proceso de “sustitución en superficie”. Un análisis estadístico de regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana y murina reveló que los patrones exactos de restos expuestos son diferentes en anticuerpos humanos y murinos, y la mayoría de las posiciones superficiales individuales tienen una fuerte preferencia por un pequeño número de restos diferentes (véase Padlan y col. (1991) Mol. Immunol. 28: 489-498; y Pedersen y col. (1994) J. Mol. Biol. 235: 959-973). Por lo tanto es posible reducir la inmunogenicidad de un Fv no humano sustituyendo restos expuestos en sus regiones marco conservadas que difieren de aquellas normalmente encontradas en anticuerpos humanos. Debido a que la antigenicidad de proteína puede correlacionarse con la accesibilidad superficial, la sustitución de los restos en la superficie puede ser suficiente para hacer “invisible” la región variable de ratón para el sistema inmune humano (véase también Mark y col. (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113: The pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, 105-134). Este procedimiento de humanización se denomina “sustitución en superficie” porque solamente se modifica la superficie del anticuerpo, los restos de refuerzo permanecen inalterados. Otras estrategias alternativas incluyen las expuestas en el documento WO04/006955 y en el procedimiento de HumaneeringTM (Kalobios) que utiliza sistemas de expresión bacterianos y produce anticuerpos que están próximos a la línea germinal humana en la secuencia (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California).

Métodos de Producción

Las proteínas de unión a antígeno pueden producirse en organismos transgénicos tales como cabras (véase Pollock y col. (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157), pollos (véase Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55), ratones (véase Pollock y col.) o plantas (véase Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204; Ma (1998) Nat. Med. 4: 601-606; Baez y col. (2000) BioPharm 13: 50-54; Stoger y col. (2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590).

Las proteínas de unión a antígeno también pueden producirse por síntesis química. Sin embargo, las proteínas de

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promotor del virus del sarcoma de Rous (VSR) y el virus del Simio 40 temprano o tardío. Por supuesto la elección del promotor se basa en la compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión. Un primer plásmido puede comprender un promotor del VSR y/o SV40 y/o CMV, ADN que codifica la región variable de cadena ligera (VL), la región kC junto con marcadores de selección de resistencia a neomicina y ampicilina y un segundo plásmido

5 que comprende un promotor de VSR o SV40, ADN que codifica la región variable de cadena pesada (VH), ADN quecodifica la región constante 1, DHFR y marcadores de resistencia a ampicilina.

Elemento amplificador

Cuando resulta apropiado, por ejemplo, para la expresión en eucariotas superiores, en un vector puede usarse un elemento amplificador unido operativamente al elemento promotor. Las secuencias amplificadoras de mamíferos incluyen elementos amplificadores de globina, elastasa, albúmina, fetoproteína e insulina. Como alternativa, puede usarse un elemento amplificador de un virus de una célula eucariota tal como el amplificador del SV40 (en los pb100-270), amplificador del promotor temprano de citomegalovirus, amplificador de polioma, amplificador debaculovirus o el locus de IgG2a murino (véase el documento WO04/009823). El amplificador puede localizarse, en el vector, en un sitio aguas arriba del promotor. Como alternativa, el amplificador puede localizarse en cualquier parte,

15 por ejemplo dentro de la región no traducida o aguas abajo de la señal de poliadenilación. La elección y ubicación del amplificador puede basarse en la compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión.

Poliadenilización/terminación

En sistemas eucariotas, las señales de poliadenilación están unidas operativamente al ADN/polinucleótido que codifica la proteína de unión a antígeno. Dichas señales están típicamente ubicadas en la posición 3’ de la fase de lectura abierta. En sistemas de mamíferos, los ejemplos no limitantes incluyen señales derivadas de hormonas del crecimiento, factor de elongación 1 alfa y genes virales (por ejemplo SV40) o largas repeticiones terminales retrovirales. En sistemas de levaduras, los ejemplos no limitantes de señales de poliadenilación/terminación incluyen los derivados de los genes de fosfoglicerato quinasa (PKG) y alcohol deshidrogenasa 1 (ADH). En sistemas procariotas, típicamente no se necesitan señales de poliadenilación y en su lugar es habitual emplear secuencias

25 terminadoras más cortas y más definidas. La elección de las secuencias de poliadenilación/terminación puede basarse en la compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión.

Otros procedimientos/elementos para mejorar rendimientos

Además de lo indicado anteriormente, otras características que pueden emplearse para mejorar los rendimientos incluyen elementos de remodelación de la cromatina, intrones y modificación de codones específicos de la célula huésped.

Células huéspedes

Las células huéspedes adecuadas para la clonación o vectores de expresión que codifican anticuerpos son células procariotas, de levaduras o de eucariotas superiores. Las células procariotas adecuadas incluyen eubacterias, por ejemplo, enterobacteriáceas tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli (por ejemplo 31,446; 31,537; 27,325 de la

35 CACT), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (véase DD 266 710), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. En cuanto a células huéspedes de levaduras, también se contemplan, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (por ejemplo 16,045; 12,424; 24,178; 56,500 de la CACT), yarrowia (EP402, 226), Pichia pastoris (EP 183 070, véase también Peng y col. (2004) J. Biotechnol. 108: 185-192), Candida, Trichoderma reesia (EP 244 234), Penicilina, Tolypocladium y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células huéspedes eucariotas superiores incluyen células de mamífero tales como COS-1 (CACT Nº CRL 1650) COS-7 (CACT CRL 1651), línea humana de riñón embrionario 293, células de riñón de cría de hámster (BHK) (CACT CRL.1632), BHK570 (CACT Nº: CRL 10314), 293 (CACT Nº CRL 1573), células de ovario de hámster Chino,

45 CHO (por ejemplo CHO-K1, CACT Nº: CCL 61, la línea celular DHFR-CHO tal como DG44 (véase Urlaub y col. (1986) Somatic Cell Mol. Genet.12: 555-556), particularmente las de las líneas celulares de CHO adaptadas para cultivos en suspensión, células de Sertoli de ratón, células de riñón de mono, células de riñón de mono verde Africano (CACT CRL-1587), células HELA, células de riñón canino (CACT CCL 34), células de pulmón humano (CACT CCL 75), Hep G2 y células de mieloma o de linfoma, por ejemplo, NS0 (véase el documento US 5.807.715), Sp2/0, YO.

Además, dichas células huéspedes también pueden modificarse por ingeniería genética o adaptarse para modificar la calidad función y/o rendimiento de la proteína de unión a antígeno. Los ejemplos no limitantes incluyen la expresión de enzimas de modificación específicas (por ejemplo glucosilación) y acompañantes del plegamiento de las proteínas.

55 Procedimientos de Cultivo Celular

Las células huéspedes transformadas con vectores que codifican proteínas de unión a antígeno pueden cultivarse por cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia. Las células huéspedes pueden cultivarse en matraces rotativos, frascos de rodillo o sistemas de fibra hueca pero para la producción a gran escala, para los cultivos en suspensión, se usan particularmente reactores de tanque con agitación. Los tanques de agitación pueden adaptarse para ventilar usando rociadores, deflectores o impulsores de baja cizalla. Para las columnas en burbuja yreactores de transporte aéreo pueden usarse la ventilación directa con aire o burbujas de oxígeno. Cuando las células huéspedes se cultivan en un medio de cultivo sin suero, el medio se complementa con un agente protector celular tal como pluronic F-68 para ayudar a impedir el daño celular como resultado del proceso de ventilación. Dependiendo de las características de la célula huésped, pueden usarse micro transportadores como sustratos de 65 cultivo para las líneas celulares dependientes de anclaje o las células pueden adaptarse a cultivos en suspensión (lo

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que es típico). El cultivo de las células huéspedes, particularmente células huéspedes de invertebrados puede utilizar una diversidad modos funcionales tales como alimentación discontinua, proceso discontinuo repetido (véase Drapeau y col. (1994) Cytotechnology 15: 103-109), proceso discontinuo ampliado o cultivo de perfusión. Aunque las células huéspedes de mamíferos transformadas por recombinación pueden cultivarse en medios que contienen

5 suero tales como suero fetal de ternero (SFT), dichas células huéspedes pueden cultivarse en medios sin suero sintéticos tal como se describe en Keen y col. (1995) Cytotechnology 17: 153-163, o medios disponibles en elmercado tales como ProCHO-CDM o UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), complementados, si fuera necesario, con una fuente de energía tal como glucosa y factores del crecimiento sintéticos tal como insulina recombinante. El cultivo de células huéspedes sin suero puede precisar que las células se adapten al crecimiento en condiciones aséricas. Una estrategia de adaptación consiste en cultivar dichas células huéspedes en medios que contienen suero e intercambiar repetidamente el 80% del medio de cultivo por medio sin suero de manera que las células huéspedes aprendan a adaptarse en condiciones aséricas (véase, por ejemplo, Scharfenberg y col. (1995) in Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery y col. eds, 619-623, Kluwer Academic publishers).

Las proteínas de unión a antígeno secretadas en los medios pueden recuperarse y purificarse usando una

15 diversidad de técnicas para proporcionar un grado de depuración adecuado para el uso deseado. Por ejemplo el uso de proteínas de unión a antígeno para el tratamiento de pacientes humanos exige típicamente una pureza de al menos el 95%, más típicamente del 98% o 99% o una pureza superior (en comparación con el medio de cultivo sin depurar). Los residuos celulares de los medios de cultivo se eliminan típicamente usando centrifugación seguida de una etapa de aclaración del sobrenadante usando, por ejemplo, microfiltración, ultrafiltración y/o filtración intensa. Son posibles otras técnicas diversas, tales como diálisis y electroforesis en gel y técnicas cromatográficas tales como cromatografía en hidroxiapatita (HA), de afinidad (que opcionalmente implica un sistema de marcación por afinidad tal como polihistidina) y/o cromatografía de interacción hidrófoba (CIH, véase el documento US 5.429.746). Después de diversas etapas de aclaración, los anticuerpos pueden capturarse usando cromatografía de afinidad con proteína A o G. Además, pueden proseguir etapas de cromatografía tales como cromatografía por intercambio iónico

25 y/o sobre HA, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía por exclusión por tamaño y precipitación en sulfato de amonio. También pueden emplearse diversas etapas de eliminación de virus (por ejemplo nanofiltración usando, por ejemplo, un filtro DV-20). Después de estas diversas etapas, se proporciona una preparación purificada (por ejemplo una monoclonal) que comprende al menos 75 mg/ml o más o 100 mg/ml o más de la proteína de unión a antígeno. Dichas preparaciones carecen sustancialmente de formas agregadas de proteínas de unión a antígeno.

Para la expresión de fragmentos de unión a antígeno pueden usarse sistemas bacterianos. Dichos fragmentos pueden localizarse intracelularmente dentro del periplasma o secretarse extracelularmente. Pueden extraerse proteínas insolubles y replegarse para formar proteínas activas de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la materia, véase Sanchez y col. (1999) J. Biotechnol. 72: 13-20; y Cupit y col. (1999) Lett Appl Microbiol

35 29: 273-277.

La desamidación es una reacción química en la que se elimina un grupo amida funcional. En bioquímica, la reacción es importante en la degradación de proteínas porque daña las cadenas laterales que contienen amida de los aminoácidos asparragina y glutamina. La asparragina se transforma en una mezcla de isoaspartato y aspartato. La desamidación de restos de glutamina se produce a una velocidad mucho más baja. Se cree que las reacciones de desamidación son uno de los factores que pueden limitar la vida útil conveniente de una proteína, también son una de las modificaciones post-traduccionales más habituales que se producen durante la fabricación de proteínas terapéuticas. Por ejemplo, se ha descrito una reducción o pérdida de actividad biológica in vitro o in vivo para la DNasa humana recombinante y CD4 soluble recombinante, mientras que otras proteínas recombinantes parece que no se ven afectadas.

45 Composiciones Farmacéuticas

Las preparaciones purificadas de un anticuerpo, como se describe en el presente documento, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones humanas,descritas en el presente documento. Los términos enfermedades, trastornos y afecciones se usan indistintamente.La composición farmacéutica puede usarse en el tratamiento de cualquier enfermedad en la que se presenten depósitos amiloides en los tejidos y que contribuyen a producir lesión estructural y funcional, conduciendo a una enfermedad clínica. El SAP siempre está presente en todos los depósitos amiloides in vivo y la composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo descrito en este documento que puede usarse en el tratamiento de enfermedades sensibles a la eliminación de depósitos amiloides de los tejidos.

La preparación farmacéutica puede comprender un anticuerpo en combinación con un vehículo farmacéuticamente 55 aceptable. El anticuerpo puede administrarse solo, o como parte de una composición farmacéutica.

Típicamente dichas composiciones comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable como se conoce y se denomina para la práctica farmacéutica aceptable, véase, por ejemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16ª edición (1980) Mack Publishing Co. Los ejemplos de dichos vehículos incluyen vehículos esterilizados tales como solución salina, solución de Ringer o solución de dextrosa opcionalmente tamponada con tampones adecuados a un pH dentro de un intervalo de 5 a 8.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por inyección o infusión continua (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intramuscular o intraportal). Dichas composiciones carecen adecuadamente de sustancias de partículas visibles. Las composiciones farmacéuticas también puedenadministrarse por vía oral, específicamente las que contienen CPHPC.

65 Las composiciones farmacéuticas pueden comprender entre 1 mg a 10 g de anticuerpo, por ejemplo entre 5 mg y 1 g de anticuerpo. Como alternativa, la composición puede comprender entre 5 mg y 500 mg, por ejemplo, entre 5 mg y 50 mg.

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Los expertos en la materia conocen bien procedimientos para la preparación de dichas composicionesfarmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender entre 1 mg a 10 mg de anticuerpo en forma de dosificación unitaria, opcionalmente junto con instrucciones para su uso. Las composiciones farmacéuticas pueden estar liofilizadas (deshidratadas por congelación) para la reconstitución antes de la administración de acuerdo con

5 los procedimientos bien conocidos o evidentes para los expertos en la materia. Cuando los anticuerpos tienen un isotipo IgG1, puede añadirse un quelante de cobre, tal como citrato (por ejemplo citrato de sodio) o EDTA o histidina,a la composición farmacéutica para reducir el grado de degradación mediada por cobre de anticuerpos de este isotipo, véase el documento EP0612251. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender un solubilizante tal como base de arginina, un detergente/agente anti-agregación, tal como polisorbato 80 y un gas inerte tal como nitrógeno para sustituir el oxígeno del espacio de la cabeza del vial.

Generalmente, las dosis eficaces y los regímenes de tratamiento para administrar el anticuerpo se determinan empíricamente y pueden depender de factores tales como la edad, el peso y el estado de salud del paciente y de la enfermedad o trastorno a tratar. Dichos factores se encuentran dentro del campo de actuación del médico tratante. Pueden encontrarse directrices para la selección de dosis apropiadas, por ejemplo, en Smith y col (1977) Antibodies

15 in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York.

La dosificación de anticuerpo administrada a un sujeto es generalmente entre 1 g/kg a 150 mg/kg, entre 0,1 mg/kgy 100 mg/kg, entre 0,5 mg/kg y 50 mg/kg, entre 1 y 25 mg/kg o entre 1 y 10 mg/kg del peso corporal del sujeto. Porejemplo, la dosis puede ser 10 mg/kg, 30 mg/kg o 60 mg/kg. La proteína de unión a antígeno puede administrarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía subcutánea, intravenosa o intramuscular.

El compuesto reductor de SAP puede administrarse a una dosis de entre 0,1 mg/kg y 2 mg/kg, dependiendo de su actividad. El compuesto reductor de SAP puede administrarse como una dosis fija, independiente de una dosis por proporción de peso del sujeto. El compuesto reductor de SAP puede administrarse en una o más dosis individuales, parenterales simultáneas o secuenciales, de 100 mg o menos, de 50 mg o menos, 25 mg o menos, o 10 mg o menos.

25 Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composición terapéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco,seis o más subdosis administradas individualmente a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitarias.

El anticuerpo puede administrarse en una sola dosis grande o en dosis más pequeñas repetidas.

La administración de una dosis puede ser por infusión continua lenta durante un periodo de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas, o de 2 a 6 horas. Esto puede dar como resultado efectos secundarios tóxicos reducidos.

La administración de una dosis puede repetirse una o más veces según sea necesario, por ejemplo, tres veces al día, una vez al día, una vez cada 2 días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses, una vez cada 6 meses o una vez al año. El anticuerpo puede administrarse por terapia de mantenimiento, por ejemplo, una vez a la semana durante un periodo de 6 meses o más. El anticuerpo puede

35 administrarse por terapia intermitente, por ejemplo, durante un periodo de 3 a 6 meses y después no administrarse la dosis durante 3 a 6 meses, seguido de la administración del anticuerpo de nuevo durante 3 a 6 meses y así sucesivamente en un ciclo.

Por ejemplo, la dosis puede administrarse por vía subcutánea, una vez cada 14 o 28 días en forma de subdosis múltiples cada día de la administración.

El anticuerpo puede administrarse al sujeto como una terapia diana en un sitio particular. Por ejemplo, el anticuerpopuede inyectarse localmente en una masa amiloide local circunscrita en los tejidos, o infundirse en la sangre suministrándose a un órgano amiloidótico.

La proteína de unión a antígeno debe usarse en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticamente activos, especialmente compuestos reductores de SAP, para el tratamiento de las enfermedades descritas en este

45 documento. La reducción eficaz de SAP de la circulación debe conseguirse antes de la administración de la proteína de unión a SAP con objeto de proporcionar más adelante seguridad y eficacia.

Primero se administra el compuesto reductor de SAP de manera que se elimine casi todo el SAP circulante. Dado que esto permite cantidades sustanciales de SAP asociadas con los depósitos amiloides en los tejidos la administración secuencial de una proteína de unión a antígeno anti-SAP permite la localización y la unión específica a los depósitos amiloides para promover su rápida y amplia regresión. De manera adecuada, la proteína de unión a antígeno anti-SAP puede administrarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 o 25 o más días después del comienzo del tratamiento (o tratamientos) con el compuesto reductor de SAP.

La administración secuencial puede implicar dos o más tratamientos secuenciales con compuestos reductores de SAP seguido de dos o más tratamientos secuenciales con la proteína de unión a antígeno anti-SAP.

55 La administración secuencial puede implicar un tratamiento con un compuesto reductor de SAP seguido de un tratamiento secuencial con la proteína de unión a antígeno anti-SAP, que después se repite una o más veces.

La dosis secuencial/posterior puede ser una cantidad que sea mayor que la dosis inicial/previa o menor que la dosis inicial/previa.

La administración de una dosis inicial de la proteína del compuesto reductor de SAP puede continuar con la administración de una o más dosis secuenciales (por ejemplo posteriores) del compuesto reductor de SAP y/o anticuerpo anti-SAP, y en el que dicha una o más dosis secuenciales pueden ser una cantidad que sea aproximadamente la misma o menor que la dosis inicial.

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tisular u orgánico como amiloidosis sistémica en la que los depósitos pueden producirse en cualquier órgano o tejido del cuerpo, incluyendo los vasos sanguíneos y tejido conjuntivo. La causa de la amiloidosis puede ser adquirida o hereditaria. La amiloidosis adquirida se presenta como una complicación de una afección médica anterior, que de por sí puede adquirirse o heredarse. Por tanto, la amiloidosis sistémica reactiva, conocida como tipo de proteína 5 amiloide A (AA) es una complicación de enfermedades inflamatorias activas crónicas, tales como artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Crohn, infecciones crónicas y septicemia crónica, y de síndromes febriles periódicos hereditarios tales como la fiebre Mediterránea familiar, el síndrome de Muckle-Wells y el síndrome CINCA. La amiloidosis relacionada con diálisis está producida por la acumulación de 2-microglobulina como un resultado de fallo renal terminal. La amiloidosis de cadena ligera (AL) de inmunoglobulina monoclonal es una complicación de mieloma múltiple o de otra manera gammapatía monoclonal benigna (gammapatía monoclonal de significado incierto, GMSI). La amiloidosis adquirida de tipo transtirretina puede producirse sin ninguna dolenciaanterior y simplemente es una complicación relacionada con la vejez. La amiloidosis hereditaria está producida por mutaciones en los genes de diversas proteínas que codifican la expresión de proteínas variantes que tienen una propensión aumentada a formar fibrillas amiloides e incluye enfermedades causadas por transtirretina,

15 apolipoproteína Al, gelsolina, lisozima, cistatina C y proteína  amiloide. La comprensión de las descripciones de todas las formas de amiloidosis distintas y las proteínas implicadas se encuentra disponible en los libros de texto y en la bibliografía científica (Pepys, M.B. (2006) Annu. Rev. Med., 57: 223-241; Pepys and Hawkins (2003) Amyloidosis. Oxford Textbook of Medicine, 4th Ed., Vol. 2, Oxford University Press, Oxford, pp. 162-173; Pepys and Hawkins (2001) Amyloidosis. Samter’s Immunologic Diseases, Sixth Ed., Vol. 1, Lippincott Williams & Williams, Philadelphia, pp. 401-412).

La deposición amiloide local, dentro de un órgano o tejido, puede silenciarse clínicamente o puede producir lesión tisular y enfermedades graves. Por ejemplo, la angiopatía cerebral amiloide, en la que los depósitos amiloides vasculares están compuestos por proteína A, es normalmente una afección esporádica adquirida que surge debido a razones que no se comprenden en ausencia de cualquier otra patología, y es una causa principal de hemorragia e

25 ictus cerebral. Existen diversas enfermedades comunes muy importantes, particularmente la enfermedad de Alzheimer (AD) y la diabetes de tipo 2, en las que los depósitos amiloides están siempre presentes pero en las que aún se desconocen los mecanismos exactos causantes de estas enfermedades respectivas. Sin embargo, la deposición local de amiloide en el cerebro y en los vasos sanguíneos cerebrales en la enfermedad de Alzheimer y en los islotes pancreáticos en la diabetes es muy probable que agrave la patología y la enfermedad. Por consiguiente, la presente invención incluye el tratamiento tanto de la enfermedad de Alzheimer como el de la diabetes de tipo 2, además de cualquier afección asociada con la presencia de depósitos amiloides en los tejidos, con las proteínas de unión a antígeno como se desvela en el presente documento.

Muchas formas de encefalopatía espongiforme transmisible (enfermedades priónicas) están asociadas con los depósitos amiloides en el cerebro y por lo tanto, la presente invención está relacionada con todas estas afecciones,

35 que incluyen la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en seres humanos, la propia enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, kuru y otras formas diversas de enfermedades priónicas humanas, y también encefalopatía bovina espongiforme, enfermedad debilitante crónica del ciervo-mula y alce y encefalopatía transmisible del visón.

Procedimientos de uso diagnóstico

El anticuerpo descrito en el presente documento puede usarse para detectar SAP en una muestra biológica in vitro o in vivo con fines diagnósticos. Por ejemplo, el anticuerpo anti-SAP puede usarse para detectar SAP en suero o asociado a amiloide, por ejemplo, en placas amiloideas. El amiloide puede haberse extraído en primer lugar (por ejemplo una biopsia) del cuerpo de un ser humano o de un animal. Pueden emplearse inmunoensayos convencionales, que incluyen ELISA, transferencia de Western, inmunohistoquímica o inmunoprecipitación.

El anticuerpo puede proporcionarse en un kit de diagnóstico que comprende un o más anticuerpos, un marcador de

45 selección e instrucciones para el uso del kit. Por comodidad, el kit puede comprender los reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para su uso.

Ejemplos

Ejemplo 1 -Secuenciación de dominios Variables de Hibridoma: SAP-E y SAP-K

SAP-E y SAP-K pertenecen a dos grupos anti-SAP monoclonales, habiéndose ensayado cada grupo individualmentepara determinar su unión a SAP humano in vitro. SAP-E y SAP-K mostraron la unión más fuerte a SAP, dentro de sus grupos y cuando se compararon entre sí en diferentes ensayos.

El primer grupo de anticuerpos comprende anticuerpos de 7 hibridomas generados en una sola inmunización convencional con SAP humano purificado (SEQ ID NO: 43 mostrada a continuación) (en Hawkins y col. (1991) Clin.Exp. Immunol. 84, 308-316 se proporcionan detalles del procedimiento para purificar SAP humano) y protocolo de

55 fusión y se denominaron SAP-A a SAP-G. Dos de estos anticuerpos SAP-E y SAP-B, son del isotipo IgG2a mientras que los otros son todos del isotipo IgG1 (véase el Ejemplo 13, Tabla 11).

El segundo grupo de anticuerpos comprende 6 IgG2a monoclonales distintos (SAP-H a SAP-M) derivados por técnicas convencionales de inmunización con SAP humano purificado (SEQ ID NO: 43 mostrada a continuación) (Hawkins y col. (1991) Clin. Exp. Immunol. 84, 308-316) y una fusión convencional para producir hibridomas que se clonaron por procedimientos rutinarios.

Secuencia de aminoácidos madura de SAP de Homo sapiens (SEQ ID NO: 43)

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Con fines comparativos, a continuación se proporciona la secuencia de SAP de ratón, que tiene una identidad del 69,4% con el SAP humano.

Proteína madura de SAP de Mus musculus (SEQ ID NO: 44)

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Se extrajo ARN total de sedimentos celulares de hibridoma de aproximadamente 106 usando el kit RNeasy de Qiagen (Nº 74106). Se usó el Sistema RT-PCR AccessQuick (A1702) para producir el ADNc de las regiones variables pesada y ligera usando cebadores degenerados específicos para las secuencias líder del gen de inmunoglobulina murino y para las regiones constantes de IgG2a/ murinas. Los fragmentos de la RT-PCR

10 purificados se clonaron usando el kit de clonación TA de Invitrogen (K2000-01). Para cada hibridoma se obtuvo una secuencia consenso por alineamiento de secuencias y alineamiento con secuencias variables de inmunoglobulina conocidas indicadas en KABAT (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). A continuación se muestran las secuencias consenso para SAP-E y SAP-K.

15 Secuencias de SAP-E CDRH1 de SAP-E (SEQ ID NO: 1) TYNMH CDRH2 de SAP-E (SEQ ID NO: 2) YIYPGDGNANYNQQFKG

20 CDRH3 de SAP-E (SEQ ID NO: 3) GDFDYDGGYYFDS CDRL1 de SAP-E (SEQ ID NO: 4) RASENIYSYLA CDRL2 de SAP-E (SEQ ID NO: 5)

25 NAKTLAE CDRL3 de SAP-E (SEQ ID NO: 6) QHHYGAPLT Secuencia de aminoácidos de VH de SAP-E (SEQ ID NO: 7) con las CDR subrayadas

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30 Secuencia de ADN de VH de SAP-E (SEQ ID NO: 8)

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Secuencia de aminoácidos de VL de SAP-E (SEQ ID NO: 9) con las CDR subrayadas

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Secuencia de ADN de VL de SAP-E (SEQ ID NO: 10)

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5 Secuencias de SAP-K CDRH1 de SAP-K (SEQ ID NO: 11) SYWMH CDRH2 de SAP-K (SEQ ID NO: 12) MIHPNSVNTNYNEKFKS

10 CDRH3 de SAP-K (SEQ ID NO: 13) RNDYYWYFDV CDRL1 de SAP-K (SEQ ID NO: 14) KASQNVNSNVA CDRL2 de SAP-K (SEQ ID NO: 15)

15 SASYRYS CDRL3 de SAP-K (SEQ ID NO: 16) QQCNNYPFT Secuencia de aminoácidos de VH de SAP-K (SEQ ID NO: 17) con las CDR subrayadas

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20 Secuencia de ADN de VH de SAP-K (SEQ ID NO: 18)

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Ejemplo 2: Construcción de anticuerpos quiméricos

Se construyeron anticuerpos quiméricos, que comprendían dominios variables murinos parentales injertados sobre regiones constantes de tipo silvestre de IgG1/ humana por PCR clonando SAP-E y SAP-K. Basándose en la 5 secuencia consenso, se diseñaron cebadores para amplificar los dominios variables murinos, incorporando sitios de restricción necesarios para facilitar la clonación en vectores de expresión mamíferos. Por medio de la introduccióndel sitio de restricción en FR4 (región marco conservada 4 (secuencia de región V a continuación de CDR3 y anterior al primer dominio constante)) la secuencia de aminoácidos de VH en SAP-E se cambió de TTLTVSS, como se muestra en la SEQ ID NO: 7, a TLVTVSS y la secuencia de aminoácidos de VH en SAP-K se cambió de TTVTVSS,

10 como se muestra en la SEQ ID NO: 17, a TLVTVSS. En la cadena ligera variable de SAP-K había un sitio interno EcoRI en la CDRL1 y se diseñaron cebadores de mutagénesis para eliminar este sitio interno EcoRI no deseado cambiando un par de bases -esto no cambió la secuencia de aminoácidos.

Las secuencias de proteína de cadena pesada y ligera de longitud completa del anticuerpo quimérico SAP-E (cSAP-E) se proporcionan en la SEQ ID NO: 21 y en la SEQ ID NO: 22 respectivamente. Las secuencias de proteína de

15 cadena pesada y ligera de longitud completa de anticuerpo quimérico SAP-K (cSAP-K) se proporcionan en la SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 respectivamente.

Secuencia de nucleótidos quimera de VH de SAP-E (SEQ ID NO: 45)

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escisión de C3 que la observada en el control de activación espontánea sin anticuerpo (Figura 12).

La Figura 12 muestra la activación de C3 por anticuerpos anti-SAP humanos monoclonales humanizados en suero de ratón completo complementado con SAP humano puro.

Discusión

Los dos anticuerpos anti-SAP humanos monoclonales humanizados activan eficazmente el complemento en presencia de SAP humano y son por tanto candidatos adecuados para su uso en el tratamiento de amiloidosis sistémica y cualquier otra enfermedad producida por depósitos amiloides extracelulares en los tejidos, de acuerdo con la presente invención.

CONCORDANCIA DE SECUENCIAS

SEQ ID NO: Descripción de la secuencia

1: Secuencia de aminoácidos de CDRH1 de SAP-E

2: Secuencia de aminoácidos de CDRH2 de SAP-E

3: Secuencia de aminoácidos de CDRH3 de SAP-E

4: Secuencia de aminoácidos de CDRL1 de SAP-E

5: Secuencia de aminoácidos de CDRL2 de SAP-E

6: Secuencia de aminoácidos de CDRL3 de SAP-E

7: Secuencia de aminoácidos de VH de SAP-E

8: Secuencia de ADN de VH de SAP-E

9: Secuencia de aminoácidos de VL de SAP-E

10: Secuencia de ADN de VL de SAP-E

11: Secuencia de aminoácidos de CDRH1 de SAP-K

12: Secuencia de aminoácidos de CDRH2 de SAP-K

13: Secuencia de aminoácidos de CDRH3 de SAP-K

14: Secuencia de aminoácidos de CDRL1 de SAP-K

15: Secuencia de aminoácidos de CDRL2 de SAP-K

16: Secuencia de aminoácidos de CDRL3 de SAP-K

17: Secuencia de aminoácidos de VH de SAP-K

18: Secuencia de ADN de VH de SAP-K

19: Secuencia de aminoácidos de VL de SAP-K

20: Secuencia de ADN de VL de SAP-K

21: Secuencia de aminoácidos de la quimera de VH de SAP-E

22: Secuencia de aminoácidos de la quimera de VL de SAP-E

23: Secuencia de aminoácidos de la quimera de VH de SAP-K

24: Secuencia de aminoácidos de la quimera de VL de SAP-K

25: Secuencia de aminoácidos aceptora de la línea germinal de la cadena pesada variable huma de IGHV1-69

26: Minigen JH1

27: Secuencia de aminoácidos de H0 de la variante de VH humanizada de SAP-E

28: Secuencia de aminoácidos de H1 de la variante de VH humanizada de SAP-E

29: Secuencia de aminoácidos de H2 de la variante de VH humanizada de SAP-E

30: Secuencia de aminoácidos de H3 de la variante de VH humanizada de SAP-E

31: Secuencia de aminoácidos de H4 de la variante de VH humanizada de SAP-E

32: Secuencia de aminoácidos aceptora de la línea germinal de la cadena ligera variable humana de IGKV1-39

33: Minigen JK2

34: Secuencia de aminoácidos de L0 de la variante de VL humanizada de SAP-E

46

(continuación)

SEQ ID NO: Descripción de la secuencia

35: Secuencia de aminoácidos de L1 de la variante de VL humanizada de SAP-E

36: Secuencia de aminoácidos de L2 de la variante de VL humanizada de SAP-E

37: Secuencia de aminoácidos de H0 de la variante de VH humanizada de SAP-K

38: Secuencia de aminoácidos de H1 de la variante de VH humanizada de SAP-K

39: Secuencia de aminoácidos de H2 de la variante de VH humanizada de SAP-K

40: Secuencia de aminoácidos de H3 de la variante de VH humanizada de SAP-K

41: Secuencia de aminoácidos de L0 de la variante de VL humanizada de SAP-K

42: Secuencia de aminoácidos de L1 de la variante de VL humanizada de SAP-K

43: Secuencia de aminoácidos de SAP de Homo sapiens

44: Secuencia de aminoácidos de SAP de Mus musculus

45: Secuencia de nucleótidos de la quimera de VH de SAP-E

46: Secuencia de nucleótidos de la quimera de VL de SAP-E

47: Secuencia de nucleótidos de la quimera de VH de SAP-K

48: Secuencia de nucleótidos de la quimera de VL de SAP-K

49: Secuencia aceptora de nucleótidos de la línea germinal de la cadena pesada variable huma de IGHV1-69

50: Secuencia aceptora de nucleótidos de la línea germinal de la cadena pesada variable huma de IGHV1-39

51: Secuencia de nucleótidos de H0 de la variante de la región V de cadena pesada humanizada de SAP-E no optimizada por codones

52: Secuencia de nucleótidos de L0 de la variante de la región V de cadena ligera humanizada de SAP-E no optimizada por codones

53: Secuencia de nucleótidos de H0 de la variante de la región V de cadena pesada humanizada de SAP-E (optimizada por codones)

54: Secuencia de nucleótidos de H1 de la variante de la región V de cadena pesada humanizada de SAP-E (optimizada por codones)

55: Secuencia de nucleótidos de H2 de la variante de la región V de cadena pesada humanizada de SAP-E (optimizada por codones)

56: Secuencia de nucleótidos de H3 de la variante de la región V de cadena pesada humanizada de SAP-E (optimizada por codones)

57: Secuencia de nucleótidos de H4 de la variante de la región V de cadena pesada humanizada de SAP-E (optimizada por codones)

58: Secuencia de nucleótidos de L0 de la variante de la región V de cadena ligera humanizada de SAP-E (optimizada por codones)

59: Secuencia de nucleótidos de L1 de la variante de la región V de cadena ligera humanizada de SAP-E no optimizada por codones

60: Secuencia de nucleótidos de L2 de la variante de la región V de cadena ligera humanizada de SAP-E (optimizada por codones)

61: Secuencia madura completa de nucleótidos de H1 de cadena pesada humanizada de SAP-E (optimizada por codones)

62: Secuencia madura completa de aminoácidos de H1 de cadena pesada humanizada de SAP-E

63: Secuencia madura completa de nucleótidos de L1 de cadena ligera humanizada de SAP-E (optimizada por codones)

64: Secuencia madura completa de aminoácidos de L1 de cadena ligera humanizada de SAP-E

65: Secuencia de nucleótidos de H0 de la variante de la región V de cadena pesada humanizada de SAP-K no optimizada por codones

47

(continuación)

SEQ ID NO: Descripción de la secuencia

66: Secuencia de nucleótidos de L0 de la variante de la región V de cadena ligera humanizada de SAP-K no optimizada por codones

67: Secuencia de nucleótidos de H0 de la variante de la región V de cadena pesada humanizada de SAP-K (optimizada por codones)

68: Secuencia de nucleótidos de H1 de la variante de la región V de cadena pesada humanizada de SAP-K (optimizada por codones)

69: Secuencia de nucleótidos de H2 de la variante de la región V de cadena pesada humanizada de SAP-K (optimizada por codones)

70: Secuencia de nucleótidos de H3 de la variante de la región V de cadena pesada humanizada de SAP-K (optimizada por codones)

71: Secuencia de nucleótidos de L0 de la variante de la región V de cadena ligera humanizada de SAP-K (optimizada por codones)

72: Secuencia de nucleótidos de L1 de la variante de la región V de cadena ligera humanizada de SAP-K (optimizada por codones)

73: Secuencia de nucleótidos de L0 91A de la variante de la región V de cadena ligera humanizada deSAP-K (optimizada por codones)

74: Secuencia de aminoácidos de L0 91A de la variante de la región V de cadena ligera humanizada deSAP-K

75: Secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de H3 humanizada de SAP-K (optimizada por codones)

76: Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de H3 humanizada de SAP-K

77: Secuencia de nucleótidos de cadena ligera de L0 humanizada de SAP-K (optimizada por codones)

78: Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de L0 humanizada de SAP-K

79: Secuencia de señal para cadenas de inmunoglobulina

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Claims

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