ES2389380T3

ES2389380T3 - Inmunoglobulinas dirigidas contra NOGO

Info

Publication number: ES2389380T3
Application number: ES06830633T
Authority: ES
Inventors: Stephanie Jane Clegg; Jonathan Henry Ellis; Volker Germaschewski; Paul Andrew Hamblin; George Kopsidas; Ruth Mcadam; Rabinder Kumar Prinjha
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2012-10-25
Anticipated expiration: 2026-12-14
Also published as: DK1960429T3; BRPI0619855A2; SI1960429T1; UA96279C2; HK1119720A1; CA2633501A1; NZ569143A; EA200801343A1; US20130287781A1; US20100221260A1; EA015536B1; IL192086A0; KR101355118B1; WO2007068750A3; CR10099A; KR20080080644A; ZA200906162B; AU2006325228B2; MA30041B1; EP2228391A3

Abstract

Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo capaz de unirse a la NOGO-A humana, que comprende unaregión variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 49 y unaregión variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 14.

Description

Inmunoglobulinas dirigidas contra NOGO

Campo de la invención

La presente invención se refiere a inmunoglobulinas, particularmente a anticuerpos que se unen a NOGO y neutralizan su actividad, a polinucleótidos que codifican tales anticuerpos, a formulaciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y al uso de tales anticuerpos en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades neurológicas. Otros aspectos, objetos y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción.

Antecedentes de la Invención

En occidente, el ictus es una causa principal de muerte y discapacidad. Para el tratamiento del ictus no se ha aceptado ninguna terapia que no sea la del plasminógeno tisular (t-PA) el cual debe administrarse en las 3 horas de la aparición tras una exploración por tomografía computarizada (TC) para excluir hemorragia. Hasta ahora la mayoría de los agentes terapéuticos dirigidos hacia el tratamiento de ictus agudo (es decir, neuroprotección), se han implicado predominantemente en dirección a receptores de glutamato y sus rutas de señalización aguas abajo que se sabe que están implicadas en la muerte celular aguda. Sin embargo hasta ahora estas estrategias se han probado sin éxito en ensayos clínicos y a menudo se asocian con efectos secundarios limitantes de la dosis (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (supl III) 10-14 (1998)). Por lo tanto existe una necesidad de nuevas estrategias dirigidas a la mejoría de la muerte celular después del cese del flujo sanguíneo. La neuroprotección es la capacidad de un tratamiento para prevenir o mejorar la pérdida de células neuronales en respuesta a una lesión o proceso de enfermedad. Esto puede conseguirse dirigiendo a las neuronas, directa o indirectamente, impidiendo la pérdida de células gliales (incluyendo oligodendrocitos).

Tras la aparición del ictus, en algunos pacientes se observa cierto grado de recuperación funcional espontánea, lo que sugiere que el cerebro tiene la capacidad (aunque limitada) de restaurarse y/o remodelarse después de una lesión. Por lo tanto, tras la aparición de isquemia cerebral, los agentes que tienen la posibilidad de potenciar esta recuperación pueden permitir realizar la intervención mucho más tarde (posiblemente días). Los agentes que pueden ofrecer neuroprotección aguda y potenciar la recuperación funcional pueden proporcionar ventajas significativas sobre posibles estrategias neuroprotectoras actuales.

La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por la presencia de dos características patognomómicas. Estas son las placas amiloideas y los ovillos neurofibrilares compuestos por el péptido beta-amiloide agregado (Aβ40 y Aβ42) y la tau hiperfosforilada respectivamente (Dawbam & Allen 2001 Neurobiology of Alzheimer’s Disease OUP).

Un estudio exhaustivo realizado en paciente ha demostrado una fuerte relación entre la acumulación de betaamiloide y el deterioro cognitivo (Naslund y col, JAMA, 22/29 de marzo del 2000, Vol.283, No, 12, pág. 15711577). Esto coincide con estudios genéticos y epidemiológicos que sugieren que algunas mutaciones en los genes de la PPA (proteína precursora amiloidea) y de la presenilina pueden predisponer la aparición precoz de la EA, cuyas mutaciones también potencian los niveles del péptido Aβ40y Aβ42, incluyendo su proporción.

La escisión de la proteína precursora amiloidea (PPA) transmembrana de tipo I por dos proteasas distintas denominadas beta-y gamma-secretasa es necesaria para la formación del péptido beta-amiloide. Se ha confirmado la identidad molecular de la beta-secretasa como la aspartil-proteasa Asp2/BACE1 (Hussain y col Mol. Cell. Neurosci. 16, 609-619 (2000); Vassar y col Science (1999), Oct, 22; 286 (5440):735-741). La naturaleza de la gamma-secretasa continua siendo fuente de cierto debate y probablemente consiste en un complejo de alto peso molecular que consiste al menos en las siguientes proteínas: presenilinas, Aph1, Pen2 y nicastrina (revisado en Medina y Dotti Cell Signalling 2003 15 (9) :829-41).

El procesamiento de la PPA en el SNC probablemente sucede dentro de diversos tipos de células incluyendo neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglia. Aunque la tasa de procesamiento global de la PPA en estas células estará influenciada por el nivel de expresión relativo de PPA, BACE1/Asp2, presenilina-1 y -2, Aph1, Pen2 y nicastrina.

Adicionalmente, factores adicionales que regulan la localización subcelular de la PPA también pueden influir en este proceso, como se muestra mediante el hallazgo de que la mutación del motivo YENP, en el dominio citoplásmico de la PPA que bloquea su endocitosis, reduce la producción de beta-amiloide (Pérez y col 1999 J Biol Chem 274 (27) 18851-6). La retención del CTF-beta-PPA en el RE mediante la adición del motivo de retención KRQN es suficiente para reducir la producción amiloide en células transfectadas (Maléese y col, 2001, J. Biol. Chem. 276 (23) 2026720279). A la inversa, la elevación de endocitosis, por sobre expresión de Rab5 es suficiente para elevar la secreción amiloide de células transfectadas (Grbovic y col 2003 J Biol Chem 278 (33) 31261-31268).

Coherente con estos descubrimientos estudios posteriores han demostrado que la reducción celular de niveles de colesterol (un factor de riesgo bien conocido para la AD) reduce la formación del beta-amiloide. Este cambio era dependiente de una endocitosis modificada como se demuestra mediante el uso de mutantes dinámicos dominantes

negativos (K44A) y la sobreexpresión de la proteína RN-Tre activadora de la GTPasa de Rab5 (Ehehalt y col 2003 J Cell Biol 160 (1) 113-123).

Los microdominios o plataformas (rafts) ricos en colesterol son también un sitio celular importante de producción de beta-amiloide y se ha observado que la PPA, BACE1 y todos los componentes del complejo gamma-secretasa residen transitoriamente en las plataformas (rafts). El entrecruzamiento de anticuerpos de PPA y BACE1 contra plataformas ricas en colesterol fueron capaces de elevar la producción de beta-amiloide (Ehehalt y col 2003 J Cell. Biol. 160 (1) 113-123). De manera similar, la expresión de BACE1 anclada a GPI, que se dirige exclusivamente contra plataformas lipídicas, es capaz de elevar la escisión de la PPA y la producción de beta-amiloide (Cordy y col 2003 PNAS 100 (20) 11735-11740).

Actualmente se desconocen los mecanismos de recuperación funcional subyacentes después de un ictus u de otro suceso o enfermedad con daño neuronal. La proliferación de axones dañados o no se ha propuesto como un posible mecanismo. Sin embargo, aunque estudios realizados in vivo han demostrado que el tratamiento de lesiones de la médula espinal o ictus con factores neurotróficos produce una recuperación funcional y un grado de proliferación axonal potenciados, esto no demuestra ninguna relación directa entre el grado de proliferación axonal y la amplitud de recuperación funcional (Jakeman, y col. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata y col. 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA, 94:8179-8184, Ribotta, y col. 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152). Adicionalmente, la proliferación axonal requiere una neurona viable. En enfermedades, tales como ictus, que están asociadas con muerte celular ampliada, la potenciación de la recuperación funcional ofrecida por un agente determinado después de ictus puede por tanto realizarse mediante mecanismos distintos de la proliferación axonal tales como diferenciación de células madre endógenas, activación de rutas redundantes, cambios en la distribución de receptores o excitabilidad de neuronas o glia (Fawcett y Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Homer y Gage, 2000, Nature 407 963970).

Se piensa que la capacidad limitada del sistema nervioso central (SNC) para restaurarse después de una lesión se debe en parte a moléculas dentro del entorno del SNC que tienen un efecto inhibidor sobre la proliferación axonal (crecimiento neurítico). Se piensa que la mielina del SNC contiene moléculas inhibidoras (Schwab ME y carona P (1988) J. Neurosci. 8, 2381-2193). Como supuestos inhibidores del crecimiento neurítico se han clonado e identificado dos proteínas mielínicas, la glicoproteína asociada a mielina (GAM) y la NOGO (Sato S. y col (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163,1473-1480; McKerracher L y col (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G y col (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer y col (1996) Neuron 16, 1107-1113; documento WO9522344; WO9701352; Prinjha R y col (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS y col (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T y col (2000) Nature 403, 439-444; documento US005250414A; WO200005364A1; WO0031235).

Se han identificado tres formas de NOGO humana: NOGO-A que tiene 1192 restos de aminoácidos (Nº de acceso del GenBank AJ251383.); NOGO-B, una variante de corte y empalme que carece de los restos 186 a 1004 en el supuesto dominio extracelular (Nº de acceso de GenBank AJ251384) y una variante de corte y empalme más corta, NOGO-C, que también carece de los restos 186 a 1004 y también tiene un dominio amino terminal alternativo, más pequeño (Nº de acceso de GenBank AJ251385) (Prinjha y col (2000) citado anteriormente).

La inhibición de las proteínas inhibidoras del SNC tales como NOGO puede proporcionar un medio terapéutico para mejorar el daño neuronal y promover la restauración y el crecimiento neuronal posiblemente ayudando así a recuperarse de lesión neuronal tal como la sostenida en ictus. Los ejemplos de tales inhibidores de NOGO pueden incluir pequeñas moléculas, péptidos y anticuerpos.

Se ha descrito que un anticuerpo monoclonal murino, IN-1, suscitado contra NI-220/250, una proteína mielínica que es un fuerte inhibidor del crecimiento neurítico (y posteriormente se demostró que era un fragmento de NOGO-A), promueve la regeneración axonal (Caroni, P y Schwab, ME (1988) Neuron 1 85-96; Schnell, L y Schwab, ME (1990) Nature 343 269-272; Bregman, BS y col (1995) Nature 378 498-501 y Thallmair, M y col (1998) Nature Neuroscience 1 124-131) y la recuperación funcional después de lesión isquémica (Papadopoulos y col (2002) Ann Neurol 51 433441). También se ha descrito que NOGO-A es el antígeno para IN-1 (Chen y col (2000) Nature 403 434439). Bandtlow y col (European Journal of Biochemistry (1996) 468-475 241) describieron un fragmento Fab de IN-1 derivado de Escherichia coli y que era capaz de neutralizar la inhibición del crecimiento neurítico asociada a mielina. La administración del fragmento Fab de IN-1 o de IN-1 humanizado a ratas que se habían sometido a transección de la médula espinal también potenció la recuperación (Fiedler, M y col (2002) Protein Eng. 15 931941; Brösamle, C y col (2000) J. Neurociencias 20 8061-8068).

En los documentos WO 04/052932 y W02005028508 se describen anticuerpos monoclonales que se unen a NOGO. El documento WO 04/052932 desvela un anticuerpo 11C7 murino que se une con alta afinidad a determinadas formas de NOGO humana.

La solicitud de patente WO05/061544 también desvela anticuerpos monoclonales de alta afinidad, incluyendo un anticuerpo 2A10 monoclonal murino y generalmente desvela sus variantes humanizadas, por ejemplo H1L11 (las secuencias para H1 y L11 se proporcionan en las SEC ID Nº 33 y 34 respectivamente (sólo las secuencias de la VH

o VL)). Los anticuerpos desvelados se unen a la NOGO-A humana con alta afinidad. El anticuerpo 2A10 murino (y

sus variantes humanizadas con injertos en CDR) se caracteriza por las siguientes secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por las siglas en inglés Complementarity Determining Region), (determinadas usando la metodología de Kabat (Kabat y col. (1991) “Sequences of proteins of immunological interest”; Quinta edición; US Department of Health and Human Services; publication del NIH (Instituto Nacional de la Salud) Nº 91-3242)) dentro de sus regiones variables de la cadena ligera y pesada:

Tabla 1:secuencias de las CDR de cadenas ligeras del anticuerpo 2A10

CDR: Secuencia

L1: RSSKSLLYKDGKTYLN (SEC ID Nº: 4)

L2: LMSTRAS (SEC ID Nº: 5)

L3: QQLVEYPLT (SEC ID Nº: 6)

Tabla 2: secuencias de las CDR de cadenas pesadas del anticuerpo 2A10

CDR: Secuencia

H1: SYWMH (SEC ID Nº: 1)

H2: NINPSNGGTNYNEKFKS (SEC ID Nº: 2)

H3: GQGY (SEC ID N: 3)

El documento WO05/061544 también desvela “análogos” de los anticuerpos que comprenden las CDR de las Tablas 1 y 2 anteriores, dichos “análogos” tienen la misma especificidad de unión al antígeno y/o capacidad neutralizante que la del anticuerpo donante del cual derivan.

A pesar de que la técnica proporciona anticuerpos anti-NOGO de alta afinidad, sigue existiendo un objetivo muy deseable el aislar y desarrollar anticuerpos monoclonales, alternativos o mejorados, terapéuticamente útiles, que se unan e inhiban la actividad de la NOGO humana.

El proceso de neurodegeneración es la base de muchas enfermedades/trastornos neurológicos que incluyen, pero sin limitación, enfermedades agudas tales como ictus (isquémico o hemorrágico), lesión cerebral traumática y lesión de la médula espinal así como enfermedades crónicas incluyendo la enfermedad de Alzheimer, demencias frontotemporales (tauopatías), neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y miositis con cuerpos de inclusión. Por consiguiente los anticuerpos monoclonales anti-NOGO, y similares, de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de estas enfermedades/trastornos. La presente invención proporciona anticuerpos para el tratamiento de las enfermedades/trastornos mencionados anteriormente y se describe con detalle a continuación.

Breve Sumario de la Invención

La invención proporciona un anticuerpo aislado, o fragmento del mismo, capaz de unirse a la NOGO-A humana, que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 47 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº:

14.

El anticuerpo o fragmento del mismo puede formatearse de una manera de inmunoglobulina convencional (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, etc. humana) o en cualquier otro fragmento o formato “de tipo anticuerpo” que se una a la NOGO-A humana (para un resumen de formatos de “anticuerpos” alternativos véase Holliger y Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol. 23, N º 9, 1126-1136)).

Los anticuerpos de la presente invención, o fragmentos de los mismos, conservan la actividad de unión a la NOGO humana de los anticuerpos que comprenden la H3 de la CDR: GQGY, en cuanto a su actividad medida en experimentos ELISA y Biacore y en algunos casos, en estos experimentos, la actividad aumenta.

Regiones variables de cadena pesada humana o humanizada que contienen G95M (numeración de sustitución por Kabat)

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención comprenden las CDR definidas en la Tabla 3 (definidas por Kabat):

Tabla 3:

CDR: Secuencia

H1: SYWMH (SEC ID Nº: 1)

H2: NINPSNGGTNYNEKFKS (SEC ID Nº: 2)

H3: MQGY (SEC ID Nº: 45)

Los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 66 (región variable H98) que adicionalmente comprende sustituciones en las posiciones 48, 67, 68 y 79; en la que cada resto aminoacídico sustituido se reemplaza por el resto

5 aminoacídico en la posición equivalente en la SEC ID Nº 7 (la región variable de la cadena pesada del anticuerpo donante 2A10).

En este contexto las sustituciones que se describen son equivalentes en concepto a “retro-mutaciones” en las que los restos aminoacídicos del armazón humano en posiciones específicas dentro de la secuencia H98 están retro-mutados por los restos de aminoácidos en la posición equivalente dentro de la secuencia del anticuerpo donante

10 2A10.

Salvo que de otra manera en el presente documento se indique específicamente lo contrario, cuando en este documento se menciona una posición numérica de un resto aminoacídico encontrado dentro de una secuencia específica, la “posición 12”, se refiere, por ejemplo, a que el lector experto asigna el primer aminoácido en la secuencia en la posición “1” y cuenta desde la posición 1 e identifica el aminoácido que está en la posición deseada,

15 en este ejemplo el resto aminoacídico doce en la secuencia. El lector experto observará que este sistema de numeración no se corresponde con el sistema de numeración de Kabat, que con frecuencia se usa para definir las posiciones aminoacídicas dentro de las secuencias de los anticuerpos.

Para una afinidad de unión óptima, se observó que para la humanización del anticuerpo de ratón 2A10 (la VH a la cual corresponde la SEC ID Nº 7) el par de restos aminoacídicos en las posiciones 48 y 68, debería ser I y A

20 respectivamente (como existe en 2A10) o M y V respectivamente (como existe en H98). Se espera que el hallazgo anterior también sea pertinente para la humanización de la variante G95M de 2A10.

La siguiente tabla incluye detalles de tres regiones diferentes variables de cadena pesada (VH). Cada una de las VH desveladas está basada en la VH de H98 (SEC ID Nº 66) que adicionalmente comprende las sustituciones mencionadas en la tabla (Tabla 4) en las que el resto H98 en la posición pertinente se sustituye por el resto 2A10 en

25 esa posición (en la tabla, “-” significa que no existe sustitución en esa posición, y por tanto el resto permanece como en la secuencia de H98):

Tabla 4

VH nueva (SEC ID Nº X): Resto numérico Nº 38 40 48 67 68 70 72 74 79

Nº Kabat: 38 40 48 66 67 69 71 73 78

2A10: K R I K A L V K A

H98: R A M R V M R T V

H26 (47): - - I - A - - - A

H27 (48): K R I K A L V K A

H28 (49): - - I K A - - - A

Por lo tanto, las regiones variables de la cadena pesada (VH) descritas en el presente documento son la VH de H26 (SEC ID Nº 47), la VH de H27 (SEC ID Nº 48) y la VH de H28 (SEC ID Nº 49)

30 SEC ID 47: Construcción H26 humanizada de VH

SEC ID 48: Construcción H27 humanizada de VH

SEC ID 49: Construcción H28 humanizada de VH

Regiones variables de cadena pesada humana o humanizada que incluyen G101S (numeración de sustitución por Kabat)

En el presente documento también se describe una región variable de la cadena pesada humana o humanizada que comprende las CDR definidas en la Tabla 5:

Tabla 5:

CDR: De acuerdo con Kabat

H1: SYWMH (SEC ID Nº: 1)

H2: NINPSNGGTNYNEKFKS (SEC ID Nº: 2)

H3: GQSY (SEC ID Nº: 62)

Las CDR de la Tabla 5 pueden incorporarse dentro de una secuencia de la región variable de la cadena pesada humana. En otra realización, la región variable de la cadena pesada humanizada comprende las CDR indicadas en la Tabla 5 con un armazón de anticuerpo aceptor que tiene una identidad mayor del 40% en las regiones marco conservadas, o una identidad mayor del 50%, o mayor del 60% o mayor del 65% con respecto a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo donante 2A10 murino (SEC ID Nº 7).

En una construcción, las CDR de la Tabla 5 se insertan en una región variable de la cadena pesada humana para dar la siguiente secuencia (H99):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNI

NPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYW

GQGTLVTVSS (SEC ID 61: Construcción H99 humanizada de VH de 2A10)

En otras construcciones, se añaden retromutaciones adicionales a la secuencia de VH de H99 en una cualquiera de las posiciones (indicadas por las posiciones de los restos numéricos) 38, 40. 48, 67, 68, 70, 72, 74 o 79; en la que cada resto aminoacídico sustituido se reemplaza con resto aminoacídico en la posición equivalente en la SEC ID Nº 7 (la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 2A10 donante) y la numeración de las sustituciones está comprendida entre 1 y 9. En otras construcciones el número de sustituciones es de 1 ó 2, ó 3, ó 4, ó 5, ó 6, ó 7, u 8 ó 9. La VH de H99 es el equivalente de la VH de H1 (SEC ID Nº 33) diferenciándose solo por que en H99, la H3 de la CDR es GQSY en vez de GQGY como se encuentra en H1.

Para una afinidad de unión óptima, se observó que para la humanización del anticuerpo de ratón 2A10 (la VH a la cual corresponde la SEC ID Nº 7) el par de restos aminoacídicos en las posiciones 48 y 68, debería ser I y A respectivamente (como existe en 2A10) o M y V respectivamente (como existe en H98). Se espera que el hallazgo anterior también sea pertinente para la humanización de la variante G95M de 2A10.

En una construcción las retromutaciones se localizan en las posiciones indicadas en la siguiente Tabla 6 en la que el resto H99 en la posición pertinente se sustituye con el resto 2A10 en esa posición (en la tabla, “-” significa que no existe sustitución en esa posición, y por tanto el resto permanece como en la secuencia de H1):

Tabla 6

Nueva VH (SEC ID Nº X): Resto numérico Nº 38 40 48 67 68 70 72 74 79

Nº Kabat: 38 40 48 66 67 69 71 73 78

2A10: K R I K A L V K A

H99: R A M R V M R T V

H100 (63): - - I - A - - - A

H101 (64): K R I K A L V K A

H102 (65): - - I K A - - - A

Anticuerpos o fragmentos que comprenden las regiones variables de la cadena pesada humana o humanizada y las regiones variables de la cadena ligera

Las construcciones VH descritas en el presente documento pueden emparejarse con una cadena ligera para formar una unidad de unión a NOGO-A humana (Fv) en cualquier formato, incluyendo un formato de anticuerpo IgG convencional que tiene secuencias de la cadena pesada del dominio variable y constante de longitud completa (FL, Full Length). Los ejemplos de secuencias de la cadena pesada de IgG1 de longitud completa (FL) comprenden las construcciones de VH de la presente invención y mutaciones inactivadoras en las posiciones 235 y 237 (numeración de acuerdo con el índice de EU) para hacer que el anticuerpo no lítico sea las SEC ID Nº 53, 54 y 55.

SEC ID 53: Construcción H26 humanizada de cadena pesada

10 SEC ID 54: Construcción H27 humanizada de cadena pesada

SEC ID 55: Construcción H28 humanizada de cadena pesada

La secuencia de la región variable de la cadena ligera que forma un Fv con las secuencias de la región variable de la

15 cadena pesada descritas anteriormente pueden ser cualquier secuencia que permita que Fv se la NOGO-A humana. Por ejemplo, la región variable de la cadena ligera puede ser la cadena ligera de 2A10 (véase el documento WO 05/061544), cuya región variable de la cadena ligera se proporciona en el presente documento como SEC ID Nº 8, o puede ser una variante humanizada de la misma. Las variantes humanizadas de la cadena ligera de 2A10 preferentemente contienen todas las CDR de la región variable de la cadena ligera que se describen

20 en la Tabla 1 injertadas sobre un armazón aceptor de la región variable de la cadena ligera humana. Las regiones variables de la cadena ligera humanizada incluyen L11 (SEC ID Nº 34), L13 (SEC ID Nº 13) o L16 (SEC ID Nº 14). En la Tabla 7 se proporcionan las regiones variables de la cadena ligera alternativas que se basan en L13 y L16, que comprenden sustituciones específicas en las posiciones de Kabat 37 y/o 45.

Tabla 7

Descripción: SEC ID Nº Secuencia

L100 (L13 + Q37R): 67 DIVMTQSPLSPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ RPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEA EDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK

(continuación)

Descripción: SEC ID Nº Secuencia

L101 (L13 + Q45R): 68 DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQ RPGQFPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKIRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK

L102 (L13 Q37R/G145R): + 69 DIVMTQSPLSLPVTLQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ RPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK

L103 (L16 + Q37R): 70 DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ RPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEA EDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK

L104 (L16 + Q45R): 71 DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQ RPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK

L105 (L16 Q37R/Q45R): + 72 DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ RPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK

Las secuencias de la cadena ligera de longitud completa (FL) son L11FL (SEC ID Nº 36), L13 FL (SEC ID Nº 17) o L16 FL (SEC ID Nº 18).

Composiciones farmacéuticas

5 Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-NOGO de la presente invención o fragmento funcional o equivalente del mismo junto con un diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-NOGO o fragmento del mismo de la presente invención para el tratamiento o profilaxis del ictus (particularmente ictus isquémico) y otras enfermedades

10 neurológicas, en particular enfermedad de Alzheimer, y tratamiento de un paciente que padece un traumatismo mecánico en el sistema nervioso central (tal como lesión en la médula espinal).

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-NOGO de la invención o un fragmento funcional del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis del ictus (particularmente ictus isquémico) y otras enfermedades neurológicas, en particular enfermedad de Alzheimer y tratamiento de un 15 paciente que padece un traumatismo mecánico en el sistema nervioso central (tal como lesión en la médula espinal).

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen adicionalmente en la descripción detallada y en las realizaciones preferidas de la misma.

Descripción detallada de la invención

El anticuerpo o fragmento del mismo puede por tanto comprender las regiones VH de la invención formateadas en

20 un anticuerpo de longitud completa, un fragmento (Fab')2, un fragmento Fab o equivalente del mismo (tal como scFv, bi-tri-o tetra-cuerpos, Tandabs, etc.), cuando se emparejan con una cadena ligera apropiada. El anticuerpo puede ser una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4; o IgM; IgA, IgE o IgD o una de sus variantes modificada. Por consiguiente, el dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo puede seleccionarse. El dominio constante de la cadena ligera puede ser un dominio constante kappa o lambda. Adicionalmente, el anticuerpo puede comprender

25 modificaciones de todas las clases por ejemplo dímeros de IgG, mutantes de Fc que ya no se unan más a los receptores de Fc o medien en la unión de Clq. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo quimérico del tipo descrito en el documento WO86/01533 que comprende una región de unión a antígeno y una región que no es inmunoglobulina.

La región constante se selecciona de acuerdo con la funcionalidad requerida. Normalmente, una IgG1 demostrará capacidad lítica mediante la unión al complemento y/o mediará la CCDA (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Si se requiere un anticuerpo bloqueante no citotóxico, Se preferirá una IgG4. Sin embargo, los anticuerpos de IgG4 pueden demostrar inestabilidad en la producción y por lo tanto puede ser más preferible modificar la IgG1 generalmente más estable. En el documento EP0307434 se describen modificaciones sugeridas, las modificaciones preferidas se incluyen en las posiciones 235 y en las bases de datos, por ejemplo, la base de datos de KABAT®, base de datos de Los Alamos y base de datos de Swiss Protein, por homología con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del anticuerpo donante (en este caso, el anticuerpo donante murino 2A10). Un anticuerpo humano caracterizado por una homología con las regiones marco conservadas del anticuerpo donante (sobre una base de aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de la cadena pesada y/o una región marco conservada variable de cadena pesada para la inserción de las CDR donantes (véase la Tabla para las CDR de 2A10 para la inserción en el armazón aceptor). De manera similar, puede seleccionarse un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar regiones marco conservadas constantes o variables de la cadena ligera. Debe observarse que no es necesario originar las cadenas pesada y ligera del anticuerpo aceptor del mismo anticuerpo aceptor. La técnica anterior describe diversas manera de producir dichos anticuerpos humanizados véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-0239400 y EP-A-054951.

La expresión “anticuerpo donante” se refiere a un anticuerpo no humano que aporta las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables, las CDR, u otros fragmentos funcionales o análogos de los mismos al anticuerpo humanizado y por lo tanto proporciona el anticuerpo humanizado con la especificidad antigénica y actividad neutralizante características del anticuerpo donante.

La expresión “anticuerpo aceptor” se refiere a un anticuerpo heterólogo con respecto al anticuerpo donante, que proporciona las secuencias de aminoácidos de sus regiones marco conservadas de cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes de cadena pesada y/o ligera al anticuerpo humanizado. El anticuerpo aceptor puede derivar de cualquier mamífero siempre que sea no inmunogénico en seres humanos. Preferentemente el anticuerpo aceptor es un anticuerpo humano.

Como alternativa, la humanización puede conseguirse mediante un proceso de “sustitución en superficie”. Un análisis estadístico de regiones únicas variables de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina humana y murina reveló que los patrones exactos de los restos expuestos son diferentes en los anticuerpos humanos y murinos, y que la mayoría de las posiciones individuales en superficie tienen una fuerte preferencia por un pequeño número de restos diferentes (véase Padlan E.A. y col; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 y Pedersen J.T. y col (1994) J. Mol. Biol 235, 959-973). Por lo tanto es posible reducir la inmunogenicidad de un Fv no humano reemplazando restos expuestos en sus regiones marco conservadas que se diferencian de aquellas normalmente encontradas en los anticuerpos humanos. Dado que la antigenicidad de las proteínas puede correlacionarse con la accesibilidad superficial, el reemplazo de los restos de superficie puede ser suficiente para hacer “invisible” la región variable de ratón al sistema inmunitario humano (véase también Mark G.E. y col (1994) en Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, páginas 105134). Este procedimiento de humanización se denomina “revestimiento en chapado” porque solo se modifica la superficie del anticuerpo, los restos de soporte permanecen inalterados. En el documento WO04/006955 se expone una estrategia alternativa adicional.

Las “CDR” se definen como las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de un anticuerpo que son las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª edición, U.S. Departament of Health and Human Services, National Institutes Nacionales of Health (1987). En la parte variable de una inmunoglobulina hay tres CDR (o regiones CDR) de cadena ligera y tres de cadena pesada. Por tanto, las “CDR” como se usa en el presente documento se refiere a las tres CDR de cadena pesada, o a las tres CDR de cadena ligera (o a todas las CDR tanto de cadena ligera como pesada, si fuera apropiado). La estructura y el plegamiento de las proteínas del anticuerpo pueden significar que otros restos se consideran que forma parte de la región de unión al antígeno y así lo entendería un experto en la técnica. Véase, por ejemplo,. Chothia y col, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, págs. 877-883.

Un anticuerpo biespecífico es un anticuerpo que tiene especificidades de unión por al menos dos epítopes diferentes. En la técnica se conocen procedimientos para fabricar tales anticuerpos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena L -cadena H de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas H tienen diferentes especificidades de unión véase Millstein y col, Nature 305 537-539 (1983), el documento WO93/08829 y Traunecker y col EMBO, 10, 1991, 3655-3659. Debido al surtido aleatorio de las cadenas H y L, se produce una posible mezcla de diez estructuras de anticuerpo diferentes de las cuales sólo una tiene la especificidad de unión deseada. Una estrategia alternativa implica la fusión de los dominios variables con las especificidades de unión deseadas con la región constante de la cadena pesada que comprende al menos parte de la región bisagra, regiones CH2 y CH3. Se prefiere que la región CH1 contenga el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. El ADN que codifica estas fusiones, y si se desea la cadena L, se inserta en vectores de expresión separados y después se cotransfecta en un organismo hospedador adecuado. Esto es posible insertando las secuencias codificantes de dos o las tres cadenas en un vector de expresión. En una estrategia preferida, el anticuerpo biespecífico está compuesto por una

cadena H con una primera especificidad de unión en un grupo y proporcionando en el otro grupo un par de cadenas H-L, una segunda especificidad de unión, véase el documento WO94/0469. Véase también Suresh y col Methods in Enzymology 121, 210, 1986.

En el presente documento también se describe un anticuerpo terapéutico biespecífico en el que al menos una especificidad de unión de dicho anticuerpo se une a la NOGO humana en el epítope descrito en la SEC ID Nº 60. El anticuerpo biespecífico puede comprender la secuencia MQGY (SEC ID Nº 45) de la H3 de la CDR de la región variable de la cadena pesada . El anticuerpo biespecífico puede comprender los siguientes pares de regiones variables de cadena pesada y ligera: H27L16 (SEC ID Nº 48 + SEC ID N°14), H28L13 (SEC ID Nº 49 + SEC ID Nº 13) o H28L16 (SEC ID Nº 49 + SEC ID Nº 14).

Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse por transfección de una célula huésped con un vector de expresión que comprenda la secuencia codificante para los anticuerpos de la invención. Un vector de expresión o un plásmido recombinante se produce colocando estas secuencias codificantes para el anticuerpo en asociación operativa con secuencias de control reguladoras convencionales capaces de controlar la replicación y expresión en, y/o secreción de, una célula huésped . Las secuencias reguladoras incluyen secuencias promotoras, por ejemplo, el promotor del CMV y secuencias señal, que pueden derivar de otros anticuerpos conocidos. De manera similar, puede producirse un segundo vector de expresión que tenga una secuencia de ADN que codifique una cadena ligera

o pesada complementaria del anticuerpo. Preferentemente este segundo vector de expresión es idéntico al primero excepto en lo que respecta a los marcadores de selección y a las secuencias codificantes, para garantizar, tanto como sea posible, que cada cadena polipeptídica se exprese funcionalmente. Como alternativa, las secuencias codificantes de la cadena pesada y ligera para el anticuerpo modificado pueden encontrarse en un solo vector.

Una célula huésped seleccionada se co-transfecta mediante técnicas convencionales tanto con el primer como con el segundo vector (o simplemente transfectarse mediante un solo vector) para crear la célula huésped transfectada de la invención que comprende las dos cadenas ligera y pesada sintéticas o recombinantes. La célula transfectada se cultiva después mediante técnicas convencionales para producir el anticuerpo de la invención modificado por ingeniería genética. El anticuerpo que incluye la asociación de ambas cadenas pesada y/o ligera recombinantes se selecciona del cultivo mediante un ensayo apropiado, tal como ELISA o RIA. Para construir otros anticuerpos y moléculas modificados pueden emplearse técnicas convencionales similares.

Un sistema de expresión útil es un sistema glutamato sintetasa (tal como el comercializado por Lonza Biologics), particularmente en el que la célula huésped es CHO o NS0 (véase más adelante). El polinucleótido que codifica el anticuerpo se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, sondas oligonucleotídicas). Los vectores que pueden usarse incluyen plásmidos, virus, fagos, transposones, minicromosomas de plásmidos que son una realización típica. Generalmente tales vectores incluyen adicionalmente una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y secuencias de terminación de la transcripción unidas operativamente al polinucleótido de cadena ligera y/o pesada para facilitar la expresión. El polinucleótido que codifica las cadenas ligera y pesada puede insertarse en vectores separados e introducirse (por ejemplo, por electroporación) en la misma célula huésped o, si se desea, tanto la cadena pesada como la cadena ligera pueden insertarse en el mismo vector para la transfección en la célula huésped. Por tanto, en el presente documento también se describe un proceso de construcción de un vector que codifica las cadenas ligera y/o pesada de un anticuerpo terapéutico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención, cuyo procedimiento comprende insertar en un vector, un polinucleótido que codifica una cadena ligera y/o una cadena pesada de un anticuerpo terapéutico de la invención.

En el presente documento también se describe un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena pesada humanizada que tiene la secuencia expuesta como SEC ID Nº: 47, 48 ó 49, y un polinucleótido que codifica una cadena pesada humanizada que tiene la secuencia expuesta como SEC ID Nº: 53, 54 ó 55.

Será inmediatamente evidente para los expertos en la técnica que, debido a la redundancia del código genético, también se encuentren disponibles en el presente documento polinucleótidos alternativos con respecto a los desvelados en el presente documento que codificarán a los polinucleótidos de la invención.

Para las etapas de clonación y subclonación empleadas en los procedimientos y en la construcción de las composiciones de la presente invención un experto en la técnica puede seleccionar vectores adecuados. Por ejemplo puede usarse la serie pUC convencional de vectores de clonación. Un vector, pUC19, se encuentra disponible en el mercado a partir de distribuidoras, tales como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Adicionalmente, para la clonación, puede usarse cualquier vector que pueda replicarse fácilmente, que tenga abundantes sitios de clonación y genes de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos) y que se manipule fácilmente. Por tanto, la selección del vector de clonación no es un factor limitante en la presente invención. Otras secuencias vectoriales preferibles incluyen una secuencia señal poli A, tal como de la hormona del crecimiento bovina (HCB) y la secuencia promotora de la betaglobina (betaglopro). Los vectores de expresión útiles en el presente documento pueden sintetizarse mediante técnicas bien conocidas por los expertos en esta técnica. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina o (b) complementan deficiencias auxiotróficas

o aportan nutrientes no disponibles en los medios complejo. El esquema de selección puede implicar detener el

crecimiento de la célula huésped . Las células, que se han transformado con éxito con los genes que codifican el anticuerpo terapéutico de la presente invención, sobreviven debido, por ejemplo, a la resistencia a fármacos conferida por el marcador de selección. Otro ejemplo es el marcador de selección denominado DHFR en el que los transformantes se cultivan en presencia de metotrexato. Las células CHO son una línea celular particularmente útil para la selección del DHFR. Los procedimientos de selección de células huésped transformadas y amplificación del número de copias de células del transgen incluyen el uso del sistema de DHFR, véase Kaufman RJ y col J. Mol. (1982) 159, 601-621, para una revisión, véase Werner RG, Noe W, K Kopp, Schluter M, “Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals”, Arzneimittel-Forschung. 48 (8) :870-80, agosto 1998. Un ejemplo adicional es el sistema de expresión da la glutamato sintetasa (Lonza Biologics). Un gen de selección adecuado para su uso en levaduras es el gen trp1; véase Stinchcomb y col Nature 282, 38, 1979.

Los componentes de tales vectores, por ejemplo, replicones, genes de selección, potenciadotes, promotores, secuencias señal y similares, pueden obtenerse a partir de fuentes comerciales o naturales o sintetizarse mediante procedimientos conocidos para su uso en la dirección de la expresión y/o secreción del producto del ADN recombinante en un huésped seleccionado. Para este fin también pueden seleccionarse otros vectores de expresión apropiados de los que se conocen numerosos tipos en la técnica para expresión en mamíferos, bacterias, insectos, levaduras y hongos.

La presente invención también incluye una línea celular transfectada con un plásmido recombinante que contiene las secuencias codificantes de los anticuerpos o equivalentes de la presente invención. También son convencionales las células huésped útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos vectores de clonación. Sin embargo, más deseablemente, se usan células de diversas cepas de E. coli para replicación de los vectores de clonación y otras etapas en la construcción de los anticuerpos modificados de la presente invención.

Las células huésped o líneas celulares adecuadas para la expresión del anticuerpo de la invención son preferentemente células de mamífero tales como NS0, Sp2/0, CHO (por ejemplo, DG44), COS, una célula fibroblástica (por ejemplo, 3T3) y células de mieloma, y más preferentemente una célula CHO o una célula de mieloma. Pueden usarse células humanas, que así permitan que se modifique la molécula con modelos de glicosilación humanos. Como alternativa, pueden emplearse otras líneas celulares eucariotas. La selección de células huésped de mamífero adecuadas y los procedimientos para la transformación, cultivo, amplificación, exploración y producción de productos y purificación se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., citado anteriormente.

Las células bacterianas pueden confirmarse como útiles como células huésped adecuadas para la expresión de los anticuerpos o fragmentos de los mismos (tales como los Fab o los scFv recombinantes) de la presente invención (véase, por ejemplo, Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). Sin embargo, debido a la tendencia de las proteínas expresadas en las células bacterianas a estar en una forma no plegada o incorrectamente plegada o en una forma no glicosilada, cualquier fragmento recombinante producido en una célula bacteriana podría tener que explorarse para determinar la conservación de la capacidad de unión al antígeno. Si la molécula expresada por la célula bacteriana se produce en una forma correctamente plegada, esa célula bacteriana sería un huésped deseable. Por ejemplo, en el campo de la biotecnología, como células huésped , se conocen bien diversas cepas de

E. coli usadas para la expresión. En este procedimiento también pueden emplearse diversas cepas de B. subtilis, Streptomyces, otros bacilos y similares.

Cuando se desee, las cepas de células de levadura, conocidas por los expertos en la materia, también se encuentran disponibles como células huésped, así como células de insecto, por ejemplo, de Drosophila y Lepidoptera y sistemas de expresión virales. Véase, por ejemplo Miller y col., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) y referencias citadas en su interior.

Los procedimientos generales mediante los cuales pueden construirse los vectores, los procedimientos de transfección necesarios para producir las células huésped de la invención y los procedimientos de cultivo necesarios para producir el anticuerpo de la presente invención a partir de tal célula huésped son técnicas todas convencionales. Típicamente, el procedimiento de cultivo de la presente invención es un procedimiento de cultivo asérico, normalmente mediante cultivo de células en suspensión sin suero. Del mismo modo, una vez producidos, los anticuerpos de la invención pueden purificarse del contenido del cultivo celular de acuerdo con procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía de columna, electroforesis en gel y similares. Tales técnicas se incluyen en la experiencia de la técnica y no limitan la presente invención. Por ejemplo, la preparación de anticuerpos se describe en los documentos WO 99/58679 y WO 96/16990.

Otro procedimiento más de expresión de los anticuerpos puede utilizar la expresión en un animal transgénico, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.873.316. Este se refiere a un sistema de expresión que utiliza el promotor de caseína de animales que cuando se incorpora transgénicamente en un mamífero permite que la hembra produzca la proteína recombinante deseada en su leche.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un procedimiento para producir un antígeno de la invención cuyo procedimiento comprende la etapa de cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector

que codifica la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo de la invención y recuperar el anticuerpo así producido.

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican los anticuerpos de la invención son células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Las células procariotas adecuadas incluyen eubacterias, por ejemplo, enterobacteriáceas tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli (por ejemplo, ATCC 31.446; 31.537; 27.325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella , por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella , así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (véase DD 266 710), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa y Streptomyces. De las células huésped de levaduras, también se contemplan Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (por ejemplo, ATCC 16.045; 12.424; 24178; 56500), Yarrowia (EP402. 226), Pichia pastoris (documento EP183.070, véase también Peng y col J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Trichoderma reesia (documento EP244.234), Penicillin, Tolypocladium y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Sin embargo, aunque la invención contempla específicamente células huésped de procariotas y de levadura, típicamente, las células huésped de la presente invención son células de vertebrados. Las células huésped de vertebrados adecuadas incluyen células de mamíferos tales como COS-1 (ATCC Nº CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), la línea embrionaria de riñón humano 293, células renales de cría de hámster (BHK) (ATCC CRL 1632), BHK570 (ATCC Nº CRL 10314), 293 (ATCC Nº CRL 1573), células CHO de ovario de hámster chino (por ejemplo, CHO-K1, ATCC Nº CCL 61, la línea celular CHO-DHFR tal como DG44 (véase Urlaub y col, (1986) Somatic Cell Mol. Genet.12, 555-556)), particularmente aquellas líneas de células CHO adaptadas para cultivos en suspensión, células de Sertoli de ratón, células renales de mono, células renales de mono verde africano (ATCC CRL-1587), células HeLa, células renales caninas (ATCC CCL 34), células pulmonares humanas (ATCC CCL 75), células Hep G2 y de mieloma o linfoma, por ejemplo, NS0 (véase el documento US 5.807.715), Sp2/0, Y0.

Por tanto, en una realización de la invención se proporciona una célula huésped transformada de manera estable que comprende un vector que codifica una cadena pesada y/o cadena ligera del anticuerpo terapéutico o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento. Típicamente dichas células huésped comprenden un primer vector que codifica la cadena ligera y un segundo vector que codifica dicha cadena pesada.

Las células huésped transformadas con los vectores que codifican los anticuerpos terapéuticos de la invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden cultivarse mediante cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia. Las células huésped pueden cultivarse en matraces de centrifugación, frascos rotativos o sistemas de fibra hueca pero, para la producción a gran escala, se prefiere usar particularmente reactores de tanque agitados para cultivos en suspensión. Típicamente los tanques agitados están adaptados para la oxigenación usando, por ejemplo, rociadores, deflectores o impulsores de baja cizalla. Para columnas de burbujas y reactores aerotransportadores puede usarse oxigenación directa con burbujas de aire o de oxígeno que pueden usarse. Cuando las células huésped se cultivan en un medio de cultivo asérico se prefiere complementar el medio con un agente protector de células tal como Pluronic F-68 para ayudar a prevenir el daño celular como resultado del proceso de oxigenación. Dependiendo de las características de la célula huésped, pueden usarse microtransportadores como sustratos para el crecimiento para líneas celulares dependientes de anclaje o las células pueden adaptarse al cultivo en suspensión (que es lo típico). El cultivo de células huésped, particularmente células huésped de vertebrados, puede utilizar una diversidad de modos operativos tales como cultivo semicontinuo, procesamiento discontínuo repetido (véase Drapeau y col (1994) cytotechnology 15: 103-109), proceso discontínuo ampliado o perfusión. Aunque las células huésped de mamífero, transformadas de manera recombinante, pueden cultivarse en medios que contengan suero, tales como medios que comprenden suero fetal de ternero (SFT), se prefiere que tales células huésped se cultiven en medios aséricos sintéticos, tal como se describe en Keen y col (1995) cytotechnology 17:153-163, o en medios disponibles en el mercado, tales como ProCHO-CDM o UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA) complementados, cuando sea necesario, con una fuente de energía, tal como glucosa y factores de crecimiento sintéticos, tales como insulina recombinante. El cultivo asérico de las células huésped puede requerir que estas células se adapten al crecimiento en condiciones aséricas. Una estrategia de adaptación es cultivar tales células huésped en suero que contenga medio y cambiar repetidamente el 80% del medio de cultivo por el medio asérico de tal manera que las células huésped aprendan a adaptarse a las condiciones aséricas (véase, por ejemplo Scharfenberg K. y col (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. y col eds), págs. 619-623, Kluwer Academic publishers).

Los anticuerpos de la invención, secretados en el medio, pueden recuperarse y purificarse del medio usando una diversidad de técnicas para proporcionar un grado de purificación adecuado para el uso que se pretende. Por ejemplo, el uso de los anticuerpos terapéuticos de la invención para el tratamiento de pacientes humanos, exige típicamente una pureza de al menos 95%, más típicamente una pureza del 98% o del 99 %, en comparación con el medio de cultivo que comprende los anticuerpos terapéuticos. En el primer caso, los residuos celulares del medio de cultivo se retiran típicamente usando centrifugación seguido de una etapa de aclarado del sobrenadante usando, por ejemplo, microfiltración, ultrafiltración y/o filtración exhaustiva. Se dispone de una diversidad de técnicas distintas, tales como diálisis y electroforesis en gel y técnicas cromatográficas tales como cromatografía con hidroxiapatita (HA), de afinidad (que opcionalmente implica un sistema de marcaje por afinidad tal como polihistidina) y/o cromatografía de interacción hidrófoba (CIH, véase el documento US 5.429.746). En una realización, los anticuerpos de la invención, después de diversas etapas de aclarado, se capturan usando cromatografía de afinidad con proteína A o G seguido de etapas posteriores de cromatografía tal como cromatografía de intercambio iónico y/o con

HA, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, de exclusión por tamaño y precipitación con sulfato de amonio. Típicamente, también se emplean diversas etapas de retirada de virus (por ejemplo, nanofiltración usando, por ejemplo, un filtro DV-20). Después de estas diversas etapas, se proporciona una preparación purificada (típicamente monoclonal) que comprende al menos 75 mg/ml o más, por ejemplo, 100 mg/ml o más del anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo y por lo tanto forma una realización de la invención. De manera adecuada, dichas preparaciones son sustancialmente libres de formas agregadas de los anticuerpos de la invención.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo anti-NOGO de la presente invención que se une específicamente a, y neutraliza, la actividad de la NOGO-A humana cuyo procedimiento comprende las etapas de:

(a): proporcionar un primer vector que codifique una cadena pesada del anticuerpo;

(b): proporcionar un segundo vector que codifique la cadena ligera del anticuerpo;

(c): transformar una célula huésped de mamífero (por ejemplo, CHO) con dicho primer y segundo vector;

(d): cultivar la célula huésped de la etapa (c) en condiciones que conduzcan a la secreción del anticuerpo a partir de dicha célula huésped en dicho medio de cultivo;

(e): recuperar el anticuerpo secretado de la etapa (d).

Después, una vez expresado el anticuerpo, mediante el procedimiento deseado, se examina para determinar la actividad in vitro usando un ensayo apropiado. Actualmente, para evaluar la unión cualitativa y cuantitativa del anticuerpo a NOGO, se emplean formatos de ensayo ELISA convencionales. Adicionalmente, también pueden usarse otros ensayos in vitro para verificar la eficacia neutralizante antes de realizar estudios clínicos humanos posteriores para evaluar la persistencia del anticuerpo en el organismo pese a los mecanismos de eliminación usuales.

Otras modificaciones para los anticuerpos de la presente invención incluyen variantes de glicosilación de los anticuerpos de la invención. Se sabe que, la glicosilación de los anticuerpos en posiciones conservadas en sus regiones constantes tiene un profundo efecto sobre la función de los anticuerpos, particularmente sobre el funcionamiento efector, tal y como los descritos anteriormente, véase por ejemplo, Boyd y col (1996), Mol. lmmunol. 32, 1311-1318. Se contemplan variantes de glicosilación de los anticuerpos terapéuticos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención en el que se añade, se sustituye, se selecciona o se modifica uno o más restos de hidratos de carbono. La introducción de un motivo asparagina-X-serina o asparaginaX-treonina crea un posible sitio para la unión enzimática de restos de hidratos de carbono y puede por lo tanto usarse para manipular la glicosilación de un anticuerpo. En Raju y col (2001) Biochemistry 40, 8868-8876 la sialilación terminal de una inmunoadhesina TNFR-IgG se aumentó mediante un proceso de regalactosilación y/o resialización usando beta-1,4-galactosiltransferasa y/o alfa, 2,3 sialiltransferasa. Se cree que el aumento de la sialilación terminal aumenta la semivida de la inmunoglobulina. Los anticuerpos, al igual que la mayoría de las glicoproteínas, se producen típicamente en la naturaleza como una mezcla de glicoformas. Esta mezcla es particularmente evidente cuando los anticuerpos se producen en células eucarióticas, particularmente células de mamíferos. Se han desarrollado diversos procedimientos para fabricar glicoformas definidas, véase Zhang y col, Science (2004), 303, 371, Sears y col, Science, (2001) 291, 2344, Wacker y col (2002) Science, 298 1790, Davis y col (2002) Chem. Rev. 102, 579, Hang y col (2001) Acc. Chem. Res 34, 727. Por tanto la invención se refiere a una pluralidad de anticuerpos (típicamente monoclonales) terapéuticos (que pueden ser del isotipo IgG, por ejemplo, IgG1), como se describe en el presente documento, que comprende un número definido (por ejemplo 7 o menos, por ejemplo 5 o menos, tal como dos o una) de glicoforma (o glicoformas) de dichos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Los agentes terapéuticos de la presente invención pueden administrarse como un profiláctico o después de un suceso de ictus / conjunto de síntomas clínicos, o según se requiera de otro modo. La dosis y la duración del tratamiento se refiere a la duración relativa, en la circulación humana, de las moléculas de la presente invención y dependiendo de la afección que vaya a tratarse y de la salud general del paciente un experto en la materia puede ajustarlas. Se contempla que, para conseguir una eficacia terapéutica máxima, puede ser necesaria la dosificación repetida (por ejemplo una vez por semana o una vez cada dos semanas) durante un período de tiempo prolongado (por ejemplo, de cuatro a seis meses).

El modo de administración del agente terapéutico de la invención puede ser cualquier vía adecuada que proporcione el agente al huésped. Los anticuerpos, y las composiciones farmacéuticas de la invención, son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, por vía subcutánea (s.c.), por vía intratecal, por vía intraperitoneal (i.p.), por vía intramuscular (i.m.),por vía intravenosa (i.v.), o por vía intranasal (i.n.).

Los agentes terapéuticos de la invención pueden prepararse como composiciones farmacéuticas que contengan una cantidad eficaz del anticuerpo de la invención como un principio activo en un transportador farmacéuticamente aceptable. En el agente profiláctico de la invención, se prefiere una suspensión o solución acuosa que contenga el anticuerpo modificado por ingeniería genética, preferentemente tamponado a pH fisiológico, en una forma lista para inyección. Las composiciones para administración parenteral comprenderán normalmente una solución del anticuerpo de la invención o un cóctel del mismo disuelto en un transportador farmacéuticamente aceptable,

preferentemente un transportador acuoso. Puede emplearse una diversidad de transportadores acuosos, por ejemplo, solución salina al 0,9%, glicina al 0,3%, y similar. Esas soluciones son estériles y generalmente carecen de materia particulada. Esas soluciones pueden esterilizarse mediante técnicas convencionales de esterilización bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según se requiera, para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes ajustadores del pH y agentes tamponantes, etc. La concentración del anticuerpo de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente 0,5%, normalmente, o al menos aproximadamente, del 1% a como mucho el 15 o el 20% en peso y se seleccionará principalmente en base a volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado.

Por tanto, para inyección intramuscular, podría prepararse una composición farmacéutica de la invención que contuviese 1 ml de agua tamponada estéril y entre aproximadamente de 1 ng a aproximadamente 100 mg, por ejemplo, de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg o más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, de un anticuerpo de la invención. De manera similar, para infusión intravenosa, podría constituirse una composición farmacéutica de la invención que contuviese de aproximadamente 250 ml de solución de Ringer estéril y aproximadamente de 1 a aproximadamente 30 y preferentemente de 5 mg a aproximadamente 25 mg de un anticuerpo de la invención modificado por ingeniería genética por ml de solución de Ringer. Los procedimientos reales para preparar composiciones que puedan administrarse por vía parenteral se conocen bien o serán obvios para los expertos en la materia y se describen con más detalle, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Science, 15ª ed. Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania. Para la preparación de formulaciones de anticuerpos de la invención que puedan administrarse por vía intravenosa véase Lasmar U y Parkins D “The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, págs. 129-137, Vol. 3 (3 de abril del 2000), Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., Nueva York, NY: Plenum Press (1992), Akers,M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K y col ., "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274, Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freezedrying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922. Ha,E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264, (2002).

Se prefiere que, cuando el agente terapéutico de la invención, esté en una preparación farmacéutica, se presente en formas de dosificación unitaria. Los expertos en la técnica determinarán fácilmente las dosis apropiadas, terapéuticamente eficaces. Para tratar eficazmente el ictus y otras enfermedades neurológicas en un ser humano, se contempla administrar, una dosis dentro del intervalo de 700 a 3500 mg por 70 kg de peso corporal de un anticuerpo de la presente invención, por vía parenteral, preferentemente s.c, i.v. o i.m. (intramuscularmente). Dicha dosis puede, si fuera necesario, repetirse a intervalos de tiempo apropiados seleccionados según sea apropiado por un médico.

Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden liofilizarse para su conservación y reconstituirse en un transportador adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con inmunoglobulinas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la materia.

Los anticuerpos de la invención también pueden usarse en procedimientos de tratamiento para disminuir o detener el avance y/o la aparición de la enfermedad de Alzheimer, además de (o como una alternativa a) tratar la enfermedad establecida en un paciente humano.

Las enfermedades o trastornos neurológicos, como se usa anteriormente en el presente documento, incluyen, pero sin limitación, lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal, demencias fronto-temporales (tauopatías), neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y, en particular, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple o esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

Los anticuerpos de la invención también puede usarse en un procedimiento para promover la proliferación axonal que comprende la etapa de poner en contacto un axón humano con un anticuerpo anti-NOGO de la presente invención. Este procedimiento puede realizarse in vitro o in vivo, preferentemente los procedimientos se realizan in vivo.

Los anticuerpos de la invención también pueden usarse en un procedimiento para modular la producción de un péptido amiloidogénico que comprende poner en contacto una célula que está expresando el precursor a partir del cual deriva el péptido amiloidogénico y un polipéptido de NOGO (por ejemplo, NOGO-A humana) con un anticuerpo anti-NOGO de la presente invención. En realizaciones típicas, el precursor es la PPA (proteína precursora amiloidea). En realizaciones típicas adicionales, el péptido amiloidogénico es Aβ, más preferentemente Aβ40, Aβ42

o una combinación de ambos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “recuperación funcional”, se refiere a una mejoría motora y/o sensorial y/o conductual en un sujeto después de, por ejemplo, un suceso isquémico o una lesión isquémica o

conjunto de síntomas clínicos. La recuperación funcional en seres humanos puede evaluarse mediante instrumentos diseñados para medir funciones neurológicas elementales tales como fuerza, sensación y coordinación motora, funciones cognitivas tales memoria, lenguaje y capacidad de seguir instrucciones y capacidades funcionales tales como actividades básicas de la vida diaria o actividades con equipos. La recuperación de la función neurológica elemental puede medirse con instrumentos tales como la escala del ictus del NIH (NIHSS), la recuperación de la función cognitiva puede medirse con ensayos neuropsicológicos tales como el ensayo de designación de Boston, ensayos de trazo, y ensayo de aprendizaje verbal de California y las actividades de la vida diaria pueden medirse con instrumentos tales como la escala de ADCS/ADL (estudios clínicos de enfermedad de Alzheimer/actividades de vida diaria) o la escala de actividades de la vida diaria de Bristol, todos estos ensayos y escalas son conocidos en la técnica.

Los siguientes ejemplos ilustran, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1, Construcción y expresión de anticuerpos anti-NOGO humanizados

Se prepararon de novo construcciones humanizadas de VH y VL acumulando oligonucleótidos solapantes que incluían sitios de restricción para la clonación en vectores de expresión de mamíferos Rid y Rin (o cualquier otro vector de expresión adecuado para la expresión de proteínas en células de mamíferos) así como una secuencia señal humana. Se introdujeron los sitios de restricción Hind III y Spe I para formar el dominio de VH que contenía la secuencia señal CAMPATH-1H para la clonación en RId que contenía la región constante γ1 humana mutada para impedir la actividad ADCC y CDC (L235A y G237A – sistema de numeración según el índice de EU). Se introdujeron los sitios de restricción Hind III y BsiWI para formar el dominio de VL que contenía la secuencia señal CAMPATH-1H para la clonación en Rln que contenía la región constante kappa humana.

Secuencia señal CAMPATH-1H: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEC ID Nº: 31)

Se produjeron plásmidos que codificaban las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de la IgG humana, en la que las CDR eran las descritas en la Tabla 2. A partir de aquellos plásmidos previos existentes se produjeron plásmidos que codificaban las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de la IgG humana, en la que las CDR eran las descritas en la Tabla 3, introduciendo mutaciones puntuales sencillas, G95M (numeración de Kabat), usando el kit QuickChange (Stratagene).

La siguiente tabla desvela que secuencias de proteína de cadena pesada de longitud completa se realizaron en los vectores plasmídicos y que secuencias se emparejaron, en cuanto a que la única diferencia en las secuencias de aminoácidos de las secuencias emparejadas de la cadena pesada de longitud completa (FL) era una sustitución en la posición G95M (numeración de Kabat) dentro de la CDR H3 de la región variable:

Tabla 8

CDR como se definen en la Tabla 2: Sustitución en G95M (para formar la CDR H3 de la Tabla 3)

H1 FL (SEC ID Nº 35): No realizada

H6 FL (SEC ID Nº 15): H26 FL (SEC ID Nº 53)

H16 FL (SEC ID Nº 16): H27 FL (SEC ID Nº 54)

H20 FL (SEC ID Nº 42): H28 FL (SEC ID Nº 55)

Después, los plásmidos que codificaban las cadenas pesadas se co-transfectaron dentro de células CHO (para más detalles véase el Ejemplo 2) con una de las siguientes secuencias de la cadena ligera de longitud completa: L11 FL (SEC ID Nº 36), L13 FL (SEC ID Nº 17) o L16 FL (SEC ID Nº 18).

En paralelo, se produjo una quimera, denominada HcLc, (que es la quimera de 2A10 (SEC ID Nº 9 y 10 -las cadenas de longitud completa que comprende las regiones constantes de la IgG humana y la VL (SEC ID Nº 8) y VH (SEC ID Nº 7) murina de 2A10).

Ejemplos 2: Expresión de anticuerpos en células CHO

Los plásmidos RId y Rln (u otros vectores adecuados para su uso en células de mamíferos) que codificaban respectivamente las cadenas pesada y ligera se co-transfectaron transitoriamente dentro de células CHO y se expresaron a pequeña escala o a gran escala para producir anticuerpos. Como alternativa, los mismos plásmidos se co-transfectaron dentro de células CHO-DHFR por electroporación y, usando un medio sin nucleósidos, se seleccionó una población policlonal estable de células que expresaban el anticuerpo apropiado (Rid contenía el gen de DHFR, Rin contenía un marcador de selección de neomicina). En algunos ensayos, los anticuerpos se evaluaron directamente a partir del sobrenadante de cultivo tisular. En otros ensayos, el anticuerpo recombinante se recuperó y se purificó por cromatografía de afinidad en sefarosa con proteína A.

Ejemplo 3, el anticuerpo anti-NOGO humanizado se une a NOGO

La NOGO-A56 humana marcada con GST (véase el Ejemplo 5) se revistió a 0,05-1 µg/ml en PBS sobre placas Immunosorp Nunc (100 µl por pocillo) a 4°C durante una noche. Los pocillo s se aclararon una vez con TBS + Tween al 0,05% (TBST) y después, para bloquear los sitios de unión no específicos, se incubaron con BSA al 2% en TBST a temperatura ambiente durante 1 hora. Los anticuerpos se diluyeron en TBST + BSA al 2% contra 10 µg/ml y se realizaron diluciones 1/2 a partir de esto. Se añadieron anticuerpos a los pocillos por duplicado y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron tres veces con TBST, después se incubaron con antikappa humano conjugado con peroxidasa (1:2000) durante 1 hora. Los pocillos se lavaron tres veces con TBST y después se incubaron con 100 µl de sustrato de peroxidasa OPD (Sigma) por pocillo durante 10 minutos. La reacción de color se detuvo mediante la adición 25 µl de H2SO4 concentrado. Se midió la densidad óptica a 490 nm usando un lector de placa. Los valores de fondo se leyeron de los pocillos sin sustraer ningún anticuerpo.

Las Figuras 1-4 ilustran la unión dependiente de la dosis de los anticuerpos humanizados en comparación con la quimera (denominada HcLc que es la quimera de 2A10 (que comprenden las regiones constantes de la IgG humana y la VL (SEC ID Nº 8) y VH (SEC ID Nº 7) murina de 2A10) a la NOGO-A56 humana marcada con GST (véase el Ejemplo 5 para más detalles) en un ensayo ELISA. El eje Y muestra la densidad óptica (DO) medida a 490 nm, una medida cuantitativa del anticuerpo capturado en los pocillos. El eje X muestra la concentración del anticuerpo usado (mcg/ml) por pocillo a cada punto de datos.

El material de anticuerpo usado en las Figuras 1-4 es anticuerpo purificado generado por el sistema de expresión policlonal o transfecciones transitorias a gran escala. En estos casos, los niveles de IgG se cuantificaron por ELISA y densidad óptica.

Los resultados de los experimentos mostrados en las Figuras 1-4 muestran que la inclusión de la mutación en G95M mejora el rendimiento del anticuerpo. La única excepción es H27L16 mostrado en la Figura 3 y 4 cuyo rendimiento es muy malo. Se cree que estos datos se obtienen por un problema técnico no identificado con el ensayo de H27L16, ya que, al contrario, en otros ensayos, H27L16 ha dando un buen rendimiento (en ensayos ELISA mostrados en las Figuras 1 y 2 y en ensayos Biacore (Tablas 9 y 10)). También se ha demostrado que H27L16 funciona muy bien en experimentos posteriores (véanse las Figuras 9 y 10).

Ejemplo 4, Protocolo de cuantificación de los anticuerpos

Se revistieron placas Nunc Immunosorp con un anticuerpo de captura anti-cadena de IgG humana de cabra (Sigma Nº I3382) a 2 µg/ml en tampón bicarbonato (Sigma Nº C3041) y se incubaron durante una noche a 4°C. Las placas se lavaron dos veces con TBS que contenía Tween 20 al 0,05% (TBST) y se bloquearon con 200 µl de TBST que contenía BSA al 2% (o del 1-3%) (tampón de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron dos veces con TBST. Los sobrenadantes del cultivo tisular que contenían el anticuerpo se titularon a través de la placa en etapas de dilución 2 veces en tampón de bloqueo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces con TBST. El anticuerpo H23 conjugado con HRP (anti-cadena kappa humana de cabra, Sigma Nº A7164) se diluyó a 1:2.000 en TBST y a cada pocillo se añadieron 100 µl. Las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con TBST y se desarrollaron con 100 µl de sustrato OPD-Fast (Sigma Nº P9187). Se dejó que el color se desarrollase durante un tiempo de 5-10 minutos después del cual se detuvo el ELISA con 25 µl de H2SO4 3M. En un lector de placa se leyó la absorbancia a 490 nm y se determinó la concentración de anticuerpo por referencia a una curva patrón.

Ejemplo 5. Producción del fragmento NOGO-A (NOGO-A56, SEC ID Nº: 32)

Se creó una secuencia de ADNc que codificaba un polipéptido que comprendía los aminoácidos 586-785 y un marcador de GST (SEC ID Nº: 32) de la NOGO-A humana clonando un ADNc que codificaba los aminoácidos 586785 de la NOGO-A humana en los sitios BamHI-XhoI de pGEX-6P1 para generar una proteína de fusión marcada con GST denominada NOGO-A56-humana-marcada con GST. El plásmido se expresó en células BL21 en medio 2XTY con ampicilina 100 µg/ml tras inducción con IPTG a 0,5 mM a 37 °C durant e 3 horas. Los sedimentos celulares se lisaron por tratamiento con ultrasonido y la proteína de fusión se purificó usando glutatión-sefarosa (Amersham Pharmacia) siguiendo las instrucciones del fabricante. La proteína purificada se eluyó usando glutatión reducido y se dializó exhaustivamente frente a PBS, se cuantificó usando patrones de BSA y un ensayo de proteína basado en Coomassie de BioRad y después se conservó en alícuotas a -80ºC.

Ejemplo 6. Análisis por BiaCore de anticuerpos monoclonales anti NOGO humanizados

La cinética de unión del anticuerpo monoclonal (mAb) anti-NOGO, que expresaba de manera recombinante la NOGO-A humana marcada con GST, se analizó usando el biodetector Biacore3000 o BIAcore T100. La microplaca con hNOGO-A se preparó de la siguiente manera:

Procedimiento

La NOGO-A56 humana marcada con GST se inmovilizó en microplaca CM5 por acoplamiento con amina primaria usando el programa Wizard de Biacore diseñado niveles de inmovilización diana. La superficie detectora de CM5 se activó haciendo pasar una solución de N-hidroxi-succinimida (NHS) 50 mM y N-etil-N’-dimetilaminopropil carbonida

5 (EDC) 200 mM. Después se hizo pasar la NOGO-A56 humana marcada con GST en tampón de acetato de sodio, pH 5,0 o pH 4,5, sobre la microplaca y se inmovilizó. Después de completar la inmovilización cualquiera de los ésteres aún activados se bloquearon mediante una inyección de clorhidrato de etanolamina 1M, pH 8,5.

Los mAb anti-NOGO se diluyeron de manera descendente en HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P-20 al 0,005%) para el BIAcore 3000 o en HBS-EP+ (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 10 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P-20 al 0,05%) en el caso del BIAcore T100 y se realizaron estudios de unión a intervalos de concentraciones definidas del anticuerpo. Todos los procesos se relacionaron frente a una superficie detectora en blanco (una que se había activado y bloqueado como se describe al principio pero a la que no se había añadido ligando). El análisis de unión se realizó usando el programa informático de análisis cinético BIAevaluation versión 4,1 para el programa informático de análisis BIAcore 3000 y T100 versión 1,0. Los análisis Biacore de otros

15 anticuerpos de la invención siguieron esencialmente el mismo protocolo que el descrito en el presente documento. A menos que se indique otra cosa, los experimentos Biacore se realizaron a 25°C.

En la siguiente sección de resultados cada tabla de datos representa los resultados obtenidos a partir de un experimento individual.

Resultados -Tabla 9

Anticuerpo: ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM)

HcLc: 3,19E6 2,49E-3 779

H27L13: 6,2E6 1,8E-3 291

H26L13: 3,23E6 3,11 E-3 963

H28L13: 7,26E6 3,3E-3 454

H27L16: 6,24E6 1,21 E-3 194

H27L16: 7,25E6 2,14E-3 296

Resultados -Tabla 10

Anticuerpo: ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)

HcLc (25°C): 2,66E6 3,13E-3 1,18

HcLc (37°C): 5,08E6 7,74E-3 1,46

H16L16 (25°C): 3,43E6 3,72E-3 1,08

H16L16 (37°C): 5,31 E6 6,16E-3 1,16

H20L16 (25ºC): 4,69E6 5,42E-3 1,16

H20L16 (37°C): 7,17E6 1,08e-3 1,51

H27L16 (25°C): 3,94E6 1,50E-3 0,380

H27L16 (37°C): 7,18E6 3,06E-3 0,426

H27L13 (25°C): 3,50E6 2,13E-3 0,606

H27L13 (37°C): 6,58E6 4,22E-3 0,641

H28L16 (25°C): 4,33E6 2,64E-3 0,610

H28L16 (37°C): 7,73E6 5,24E-3 0,678

H28L13 (25°C): 4,16E6 3,89E-3 0,936

H28L13 (37°C): 7,43E6 7,59E-3 1,02

Resultados -Tabla 11 5

Anticuerpos: ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM)

HcLc: 3,17E6 2,33E-3 0,74

H26L13: 3,45E6 2,88E-3 0,87

H27L13: 6,58E6 1,83E-3 0,28

H28L13: 6,97E6 3,17E-3 0,45

H28L16: 6,89E6 1,95E-3 0,28

Ejemplo 7: Análisis BiaCore de anticuerpos monoclonales anti NOGO humanizados usando clasificación de constante de disociación

La microplaca de NOGO-A56 humana marcada con GST se preparó del mismo modo que para el análisis cinético. Los sobrenadantes celulares se tomaron directamente a partir de transfecciones transitorias de células CHO-K1. Estas se hicieron pasar directamente sobre la superficie detectora y se midió la interacción. Se usó un sobrenadante celular transfectado simulado para una doble relación para retirar cualquier artefacto debido al medio de cultivo tisular. Todos los procesos se relacionaron frente a una superficie detectora en blanco (una que se había activado y bloqueado como se ha descrito al principio pero a la que no se había añadido ligando). El análisis de unión se realizó usando el programa informático de análisis cinético BIAevaluation versión 4,1.

Ejemplo 8: Mapeo Peptídico

Se obtuvieron 47 péptidos solapantes que abarcaban la parte de la NOGO-A56 del dominio de la NOGO-A56 humana marcada con GST (SEC ID Nº 32) (de Mimotope™). Los péptidos tenían una longitud de 16 aminoácidos con un aminoácido en la posición solapando con el péptido adyacente (cada péptido comprendía adicionalmente una secuencia SGSG marcada con biotina en el extremo N) con la excepción del primer péptido que tenía un marcador de GSG-biocitina en el extremo C. Los péptidos se usaron para el mapeo epitópico del sitio de unión de 2A10 y H28L16.

Procedimiento para el mapeo epitópico:

Se revistieron con estreptavidina a 5 µg/ml en agua estéril placas Nunc immunosorp (100 µl por pocillo) a 37°C durante una noche. Las placas se aclararon 3 veces con PBS que contenía Tween a 0,05% (PBST) después se bloquearon con BSA al 3% en PBST a 4°C durante una noche. Las placas se lavaron 3 veces con PBST. Después se añadieron los péptidos a los pocillos a una concentración de aproximadamente 10 µg/ml (diluido en BSA al 3% en PBST) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con PBST , después se incubaron durante 1 hora con anticuerpos anti-NOGO diluidos a 5 µg/ml en BSA al 3% en PBST. Las placas se lavaron 3 veces con PBST, después se incubaron con anti-kappa humana o anti-kappa de ratón conjugado con peroxidasa (1:1000, diluido en BSA al 3% en PBST) durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con PBST y después se incubaron con 100 µl de sustrato de peroxidasa OPD (Sigma) por pocillo durante 10 minutos. La reacción del color se detuvo por la adición de 50 µl de H2SO4 3 molar. Usando un lector de placa, se midió la absorbancia a 490 nm.

Los datos indicaron que 2A10 y H28L16 se unían a los péptidos 6 y 7 cuya parte específica NOGO se proporciona en la SEC ID Nº 73 y SEC ID Nº 74 respectivamente, ambas de las cuales contienen la secuencia VLPDIVMEAPLN. Estos resultados indican que VLPDIVMEAPLN (SEC ID N° 60) contiene el epítope de unión de 2A10 y H28L16.

Ejemplo 9: Comparación de HcLc y HcLc que contiene la mutación G95M de la CDR H3

Se construyó una variante modificada de HcLc a partir de plásmidos de expresión existentes introduciendo una mutación puntual sencilla, G95M (numeración de Kabat), usando el kit QuikChange (Stratagene). En la SEC ID Nº 59 se proporciona la secuencia de proteína del dominio variable Hc de la cadena pesada (G95M).

Hc (G95M) Lc se expresó en células CHO como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo se cuantificó como se describe en el Ejemplo 4. Las Figuras 5 y 6 muestran una comparativa de la actividad de unión de Hc (G95M) Lc y HcLc determinada usando un ELISA de unión a NOGO-A humana en el que la NOGO se revistió sobre placas Nunc immunosorp a 0,05 (Figura 5) y 1 µg/ml (Figura 6). La siguiente Tabla 12 muestra una comparativa de las afinidades de unión de Hc (G95M) Lc y HcLc.

Tabla 12, constante de disociación medida por clasificación Biacore en base a un experimento

Anticuerpo: Secuencia ID de la región variable de cadena pesada constante de disociación kd (1/s)

H6L13: 11 1,38E-2

H6 (G95M) L13: 47 4,31E-3

HcLc: 7 2,66E-3

Hc (G95M) Lc: 59 6,14E-4

Los datos demuestran que la sustitución de G95M dentro de la CDR H3 no solamente aumenta la actividad de unión de los anticuerpos humanizados (H6L13), sino también la del anticuerpo donante murino 2A10 (HcLc).

Ejemplo 10: Construcción y ensayo de anticuerpos NOGO que contienen sustituciones en la CDR H3

Se creó un panel de 90 regiones variables de cadena ligera mediante mutaciones puntuales sencillas en los restos contenidos en la CDR H3, o en la leucina precedente. Específicamente, se prepararon vectores que codificaban una cadena pesada (en base a H6FL, SEC ID Nº 15) que codificaban las regiones variables de la cadena pesada en la que se sustituyó cada resto aminoacídico CDR H3 y la leucina precedente (usando el kit QuikChange (Stratagene))

5 con todos los aminoácidos de origen natural restantes, excluyendo la cisteína, y se expresaron junto con una cadena ligera (L13FL, SEC ID Nº 17) para dar 90 anticuerpos diferentes. Estos anticuerpos se sometieron a ensayo con respecto a la unión a NOGO en experimentos ELISA y Biacore.

Las Figuras 7 y 8 muestran una comparativa de la actividad de unión de las variantes de H6FL en comparación con H6FL L13FL. Las Tablas 13 y 14 muestran una comparativa de la cinética de disociación, medida por Biacore – solo

10 se muestran los resultados de aquellos anticuerpos que tuvieron una constante de disociación medible en el ensayo Biacore y que tuvieron una actividad de unión comparable con H6L13 en ELISA.

Tabla 13

Anticuerpo parental: CDR3 VH kd (1/s)

H6L13: MQGY 4,85E-03

HcLc: GQGY 5,58E-03

H6L13: GQNY 9,66E-03

H6L13: GQLY 1,32E-02

H6L13: IQGY 1,72E-02

H6L13: RQGY 1,75E-02

H6L13: GQSY 1,86E-02

H6L13: GQGY 1,98E-02

H6L13: GSGY 2,07E-02

H6L13: GDGY 2,12E-02

H6L13: GQGW 2,16E-02

H6L13: GIGY 2,57E-02

H6L13: GQYY 3,28E-02

H6L13: GQFY 3,35E-02

H6L13: WQGY 1,98E-02

H6L13: GAGY 3,15E-02

H6L13: GLGY 1,90E-02

H6L13: GVGY 1,78E-02

H6L13: GQWY 1,77E-02

Conclusiones

Los resultados indican que los anticuerpos que conservan las propiedades de unión del 2A10 murino, y el anticuerpo 15 H6L13 que contiene GQGY, son los que contienen las CDR H3 siguientes: RQGY, IQGY, MQGY, GDGY, GIGY, GSGY, GQNY, GQYY, GQSY, GQLY, GQFY, GQGW, WQGY, GAGY, GLGY, GVGY, GQWY.

Ejemplo 11, Comparativa de mab que contiene GQGY (H20L16) con los mab de la variante G95M (H27L16 y H28L 13 y H28L16)

Los anticuerpos indicados en la Tabla 14 se fabricaron como se ha descrito anteriormente.

20 Tabla 14 – Anticuerpos anti-NOGO-A 2A10 humanizados que proporcionan el número total de retromutaciones para el anticuerpo completo (2 x cadena pesada + 2 x cadena ligera).

Anticuerpo: Número total de retromutaciones por anticuerpo/tetrámero completo

H20L16: 22

H28L16: 22

H28L13: 16

H27L16: 32

Características de unión in vitro

En un intento de clasificar los anticuerpos, se investigaron sus propiedades de unión en una serie de ensayos que incluían ELISA, ELISA de formato inverso, ELISA competitivo, Biacore y citometría de flujo.

11.1 Unión a NOGO-A humana recombinante en ELISA

Se investigó la capacidad de los anticuerpos para unirse a la NOGO-A humana recombinante (NOGO-A56 humana marcada con GST) mediante diversos ensayos relacionados con ELISA (realizados en un protocolo relacionado, aunque ligeramente diferente, como el descrito en el Ejemplo 3). En el primer ensayo, la placa se revistió directamente con la NOGO-A recombinante a diversas concentraciones de antígeno diferentes. Los resultados del ensayo ELISA de unión directo cuando el antígeno se carga a 1 mcg/ml o 0,05 mcg/ml se muestran en la Figura 9A y Figura 9B respectivamente. Los datos confirman que todos los anticuerpos muestran actividades de unión comparables a las de la NOGO-A humana recombinante cuando se comparan con la forma quimérica del anticuerpo parental (HcLc). A concentraciones de revestimiento de antígeno más altas, todos los anticuerpos producen un valor de CE50 similar. Por otro lado, a una concentración de revestimiento de antígeno inferior el ensayo fue capaz de discriminar entre los anticuerpos. Aunque no se obtuvieron curvas de saturación, un análisis de tendencias sobre las líneas reveló el siguiente orden de clasificación: H27L16> H28L16, H28L13, H20L16.

En un experimento paralelo, se invirtió el formato del ensayo. En este formato, el anticuerpo se capturó sobre la placa y la unión de la NOGO-A humana recombinante (NOGO-A-56 humana-GST) se detectó usando el marcador de GST. Los resultados de este ELISA en formato inverso se muestran en la Figura 10. Los datos confirman que todos los anticuerpos muestran una actividad de unión comparable con la de la NOGO-A humana recombinante cuando se comparan con la forma quimérica del anticuerpo parental (HcLc). Este formato de unión ELISA no distingue entre los anticuerpos.

11.2 ELISA competitivo

Se evaluó la capacidad de los anticuerpos para competir directamente con el anticuerpo parental para el mismo epítope sobre la NOGO-A humana usando un ensayo ELISA competitivo. Las placas de revistieron con NOGO-A humana recombinante (NOGO-A56 humana-GST). El anticuerpo parental 2A10 y los anticuerpos humanizados se mezclaron previamente antes de añadirse a las placas. La unión de 2A10 se cuantificó usando un anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Dakocytomation, Nº P0260). Los resultados mostrados en la Figura 11 confirman que los cuatro anticuerpos pueden competir con 2A10. Esto sugiere que los anticuerpos humanizados y el anticuerpo parental reconocen un epítope solapante sobre la NOGO-A humana. Adicionalmente, la actividad de los anticuerpos humanizados es comparable o mayor a la de la quimera HcLc. Los resultados indican que H27L16, H28L16 y H28L13 son más fuertes que H20L16.

11.3 Mediciones de afinidad por Biacore

Se usó Biacore para determinar afinidades y clasificar anticuerpos usando dos metodologías diferentes. En la primera estrategia, la NOGO-A recombinante se acopló a la superficie de la microplaca y se hizo pasar anticuerpos anti-NOGO-A sobre esta superficie. En la segunda estrategia, se usó proteína A para capturar el anticuerpo sobre la superficie de la microplaca sobre la cual se hizo pasar la NOGO-A56 humana recombinante-GST. Los resultados mostrados en la Tabla 15 se obtuvieron por acoplamiento del antígeno a la superficie y se confirmó que los cuatro anticuerpos mostraban una afinidad comparable/mejor que la del anticuerpo parental (HcLc). Basándose en el promedio de seis procesos independientes, los anticuerpos se clasificaron en el siguiente orden, en lo que respecta a la afinidad global: H27L16> H28L16> H28L13> H20L16, acorde con el orden de clasificación del ELISA de unión directo (Figura 9B). En el caso de H27L16 y H28L16, los anticuerpos humanizados demuestran una afinidad mayor de 2-3x en comparación con la del anticuerpo parental (HcLc).

Tabla 15 -Cinética de unión de los anticuerpos anti-Nogo-A humanizados a laNogo-A humana recombinante (Nogo-A 56 humana-GST) determinada usando Biacore T100. El anticuerpo se unió a la microplaca CM5 por acoplamiento con amina primaria. Los anticuerpos se extendieron a diversas concentraciones (0,125-8 nM). Los valores muestran la media y la desviación típica (entre paréntesis) de seis procesos diferentes realizados por duplicado. Cada conjunto de datos completo se analizó independiente antes del cálculo de la media y desviación típica. ** Solo de analizaron 11 conjuntos de datos para H20L16 ya que un conjunto no pudo analizarse

Anticuerpo: Ka kd KD (nM)

H20L16 **: 5,37E6 (7,65E5) 9,70E-3 (2,65E-3) 1,80 (0,31)

H27L16: 3,96E6 (9,93E5) 2,30E-3 (1,11E-3) 0,56 (0,15)

H28L13: 8,13E6 (1,35E6) 9,10e-3 (2,65E-3) 1,11 (0,18)

H28L16: 6,97E6 (6,62E5) 43E-3 (1,18 E-3) 0,64 (0,15)

HcLc: 3,80E6 (7,11E5) 7,09E-3 (2,22E-3) 1,86 (0,32)

De una manera similar al ELISA, también se evaluó la cinética de unión del anticuerpo a la Nogo-A humana recombinante (Nogo-A 56 humana-GST) en un formato inverso (véase Ejemplo 11.1). En este ensayo, los anticuerpos humanizados se capturaron sobre la microplaca CM5 mediante Proteína A. En la Tabla 16 se muestran los resultados promedio de seis procesos independientes. Coherente con el ELISA en formato inverso, todos los anticuerpos Nogo-A humanizados mostraron cinéticas de unión similares con respecto a la quimera (HcLc) en el Biacore en formato inverso.

Tabla 16 – Cinéticas de unión en formato inverso de los anticuerpos anti-Nogo-A humanizados con respecto a la Nogo-A humana recombinante (Nogo-A56-GST) determinado usando Biacore T100. La proteína A se inmovilizó aproximadamente 4000 RU por amina primaria y se usó para capturar 200-300RU de los anticuerpos de la muestra. La Nogo-A humana recombinante se hizo pasar a través a diversas concentraciones (0,125-8 nM). Los valores muestran la media y la desviación típica (entre paréntesis) de tres procesos independientes por duplicado. Cada conjunto de datos se analizó independientemente antes del cálculo de la media y desviación típica.

Anticuerpo: Ka kd KD (nM)

H20L16: 1,01 E6(1,35E5) 3,13E-4(2,79E-5) 0,31 (0,036)

H27L16: 9,93E5(2,02E4) 3,04E-4(1,83E-5) 0,31(0,019)

H28L13: 1,12E6(1,21 ES) 3,84E-4(3,24E-5) 0,34(0,015)

H28L16: 1,18E6(8,32E4) 4,01E-4 (2,48E-5) 0,34(0,032)

HcLc: 1,38E6(3,70E5) 5,69E-4(1,54E-4) 0,41 (0,062)

11.4 Unión a NOGO humana natural

Para demostrar que los anticuerpos humanizados se unían a la Nogo-A humana natural con un perfil comparable al del anticuerpo parental, se desarrollaron dos ensayos basados en citometría de flujo. En el primer ensayo, se generó una línea celular basada en CHO-K1 que expresaba el dominio extracelular de la Nogo-A humana en la superficie celular. La unión de los anticuerpos anti-Nogo-A humanizados se evaluó por citometría de flujo usando un anti-IgG humana marcado con PE (Sigma, Nº P8047). La Figura 12 más adelante muestra un perfil típico para los anticuerpos anti-Nogo-A en la línea celular CHO-Nogo-A. Aunque el ensayo no es suficientemente sensible para diferenciar entre los anticuerpos, los resultados confirman que los cuatro anticuerpos pueden reconocer la Nogo-A humana expresada en la superficie celular a niveles comparables a los de la quimera. Ningún anticuerpo reconoce la línea celular parental (CHO-K1 – datos no mostrados).

En el segundo ensayo, se evaluó la capacidad de los anticuerpos humanizados para unirse a la Nogo-A natural usando una línea celular de neuroblastoma humana -IMR32. Esta línea celular se caracteriza por altos niveles intracelulares/bajos en la superficie celular de la proteína Nogo-A. En un intento para aumentar la señal de unión, el ensayo se preparó para detectar la Nogo-A intracelular (residente en el RE). Las células IMR32 se hicieron permeables y se fijaron antes de la tinción con los anticuerpos anti-Nogo-A humanizados. La unión de los anticuerpos a la Nogo-A se detectó usando un anti-IgG humana secundario marcado con PE (Sigma, Nº P8047). Los resultados, mostrados más adelante en la Figura 14, confirman que todos los anticuerpos se unían a la Nogo-A intracelular a niveles comparables o superiores a los del anticuerpo parenteral HcLc. Estos datos, junto con los resultados de la línea celular CHO-Nogo-A, confirman que los anticuerpos humanizados pueden reconocer una forma más natural de la proteína Nogo-A a niveles comparables o mejores que los de la quimera, HcLc. Los ensayos no son suficientemente sensibles para clasificar el panel de anticuerpos.

11.5 Ensayo de crecimiento neurítico

Los anticuerpos anti-Nogo-A humanizados se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para neutralizar la actividad inhibidora del crecimiento neurítico (CN) de la Nogo-A en un ensayo que se basaba en la cuantificación del CN como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos analizados en el ensayo se seleccionaron en base a su cinética de unión a Nogo-A. Los anticuerpos humanizados de alta afinidad, concretamente, H28L16, H27L16, H20L16 y por referencia su anticuerpos parentales 2A10 (monoclonal de ratón) y HcLc (quimera de ratón humana) se sometieron a ensayo para determinar la neutralización de Nogo-A. Por comparación, el anticuerpo 11 C7 (véase el Ejemplo 13) también se sometió analizó en el ensayo.

Para analizar la actividad neutralizante de los anticuerpos humanizados seleccionados, se revistieron pocillos con Nogo-A56 humana recombinante-GST y se trataron con diversas concentraciones de anticuerpos a 37 ºC durante 1 hora antes de la adición de neuronas granulares del cerebelo (NGC). Los pocillos de control se trataron con HBSS. Se midió la longitud promedio de las neuritas por neurita para cada pocillo. La Figura 14 muestra el resultado de los anticuerpos humanizados analizados en el ensayo. Se usó un panel de anticuerpos de control (IgG control, IgG de ratón purificada; Campath y otros anticuerpos humanizados irrelevantes) para confirmar la especificidad de la actividad. Como un control adicional, se titularon los mismos anticuerpos humanizados sobre placas revestidas con GST. Los resultados confirmaron que H28L16, H27L16 y H20L16 invertían la inhibición mediada por Nogo A del crecimiento neurítico a un grado similar observado para los anticuerpos parentales (2A10 y HcLc). Los efectos

parecían ser contundentes y estables y se observaron con H28L16 en ocho de once experimentos independientes del crecimiento neurítico. En cambio, los anticuerpos humanizados no aumentaron el crecimiento neurítico en las placas revestidas con GST y el panel de anticuerpos de control no mostró ninguna inversión de la inhibición dependiente de la dosis, confirmando que el efecto de los anticuerpos humanizados es específico para la inhibición mediada por Nogo-A. Los datos presentados para el crecimiento neurítico se seleccionaron a partir de diversos experimentos repetidos. Aunque diversas repeticiones, no mostradas, parecieron ser variables por naturaleza, se piensa que los datos mostrados reflejan una actividad verdadera de los anticuerpos de la presente invención en cuanto a la reducción del efecto inhibidor de NOGO en el ensayo del crecimiento neurítico.

Ejemplo 12, Caracterización adicional de H28L 16

12.1 Unión a Nogo-A recombinante de longitud completa

Se investigó la capacidad de los anticuerpos para unirse a la Nogo-A humana recombinante de dominio extracelular de longitud completa (Nogo-A-humana -GST-ECD) mediante un ensayo ELISA de unión directo. En este caso el ECD (dominio extracelular) fue una variante de corte y empalme incluida en la región de la posición de aproximadamente 186-1004 de la NOGO A humana (en la parte de inicio DETFAL (SEC ID Nº: 95) y final ELSKTS (SEC ID Nº: 96)).

La Nogo-A-humana GST-ECD recombinante se revistió directamente sobre la placa a 1 µg/ml. Los datos mostrados en la Figura 15 confirman que H28L16 podía reconocer a la Nogo-A-humana GST-ECD a niveles comparables o mejores que los parentales (HcLc) o H20L16.

12.2 Inhibición de la Funcionalidad de Fc.

Para mejorar el perfil de seguridad del candidato, los restos L235 y G237 dentro del dominio CH2 de la región constante de la cadena pesada (sistema del índice de EU) se mutaron a restos de alanina reduciendo así la probabilidad de desencadenar funciones efectoras inmunológicas mediadas por anticuerpos. La unión reducida de la C1q humana se usó como un sustituto de inhibición de la funcionalidad de Fc. La Figura 16, más adelante, muestra que H28L16 tiene una actividad de unión a C1 q significativamente reducida en comparación con Campath-IgG1 (tipo silvestre) y comparable a una construcción Campath IgG1 que lleva las mismas mutaciones (anticuerpo con Fc mutado (Fc-)) y Campath IgG4. Estos datos sugieren que las mutaciones del dominio CH2 presentes en H28L16 reducirán significativamente la probabilidad de desencadenar funciones efectoras mediadas por Fc.

12.3 Unión a ortólogos

Para confirmar que H28L16 mostraba afinidad de unión a diversos ortólogos de Nogo-A, comparable a la del anticuerpo parental (HcLc), se realizaron diversos ensayos de unión. La Figura 17 A-D, más adelante, muestra los resultados de un ensayo ELISA de unión directo a la NOGO recombinante (Nogo-A 56 humana-GST) de rata (SEC ID Nº: 94), mono cinomolgo (SEC ID Nº: 92), mono tití (SEC ID Nº: 93) y mono ardilla respectivamente (SEC ID Nº: 91). En todos los casos, H28L16 muestra actividad comparable o mejor que la del anticuerpo quimérico (HcLc). Los valores CE50 calculados son muy similares a los calculados para la unión a la Nogo-A humana recombinante.

Usando Biacore, se determinó la cinética de unión de H28L16 a los diversos ortólogos de Nogo-A en comparación con HcLc y 11C7. Las Tablas 17 y 18, más adelante, muestran la cinética de unión en dos formatos diferentes del ensayo. Cuando la Nogo-A recombinante se acopló directamente a la microplaca CM5 (Tabla 17), las cinéticas de unión para rata, momo cinomolgo, mono ardilla y mono tití son muy similares a las de la humana (intervalo = 0,330,67nM). Cuando el formato del ensayo se invirtió y los anticuerpos se capturaron sobre la microplaca usando Proteína A (Tabla 18), la afinidad de unión de H28L16 a la Nogo-A de rata es aproximadamente 4 veces menor que para la Nogo-A humana. Se observó una tendencia similar para la Nogo-A de mono cinomolgo (afinidad 8,5x menor que la de la humana) y para los otros ortólogos de primates (afinidad 12-17x menor que la humana). El anticuerpo quimérico HcLc muestra un perfil de unión similar a los ortólogos de Nogo-A en las dos orientaciones del ensayo. Dado que no está claro que formato de ensayo representa mejor la situación in vivo, las conclusiones iniciales que pueden extraerse de este estudio son 1) H28L16 ha conservado el perfil de reactividad cruzada del ortólogo asociado con el anticuerpo quimérico HcLc y 2) la afinidad de HcLc por la Nogo-A de rata y de mono cinomolgo está dentro de 4 veces y 8,5 veces de la afinidad para la Nogo-A humana y en determinadas condiciones puede ser muy similar.

Tabla 17 – Cinéticas de unión de H28L 16, 11 C7 y HcLc a los ortólogos recombinantes de la Nogo-A humana determinadas usando Biacore T100. Se capturaron aproximadamente 140-180 RU de los diversos ortólogos de Nogo-A sobre la microplaca CM5 por acoplamiento con amina primaria. Los anticuerpos se extendieron a diversas concentraciones (0,125-8 nM). Los valores muestran la media y la desviación típica (ente paréntesis) o 1-2 procesos independientes realizados por duplicado analizándose independientemente cada conjunto de datos antes del cálculo de la media y desviación típica. *Se descartó un conjunto de curvas debido a curvas no interpretables para el anticuerpo 11C7.

H28L16: 11C7 HcLc

Ortólogo: Ka Kd KD (nM) Ka Kd KD (nM) Ka Kd KD(nM)

Mono cinomolgo (2 procesos)*: 4,65E6 (7,47E5) 3,07E-3 (2,37E-4) 0,67 (0,06) 1,47E6 (1,67E5) 3,40E-4 (4,45E-5) 0,23 (0,01) 2,94E6 (7,13E5) 4,78E-3 (6,34E4) 1,68 (0,35)

Rata (2 procesos): 4,64E6 (2,34E5) 1,54E-3 (3,06E-5) 0,33 (0,01) 8,36E5 (5,58E5) 1,20E-4 (2,14E-5) 0,11 (0,03) 2,53E6 (5,32E4) 2,83E-3 (2,30E5) 1,12 (0,03)

Mono tití (1 proceso): 4,2E6 (2,47E4) 3,02E-3 (5,09E-5) 0,626 (0,000) 1,16E6 (5,37E4) 2,80E-4 (6,15E-6) 0,24 (0,006) 3,13E6 (2,76E4) 4,44E-3 (1,41 E4) 1,419 (0,03)

Mono ardilla (1 proceso): 4,46E6 , (6,08E4) 2,73E-3 (4,95E-6) 0,61 (0,000) 1,10E6 (3,25E4) 2,86E-4 (1,87E-5) 0,26 (0,010) 3,04E6 (1,64E5) 4,68E-3 (2,11 E4) 1,54 (0,15)

Ser humano: 3,97E6 (6,62E5) 4,43E-3 (1,18E-3) 0,64 (0,15) 1,58E6 (6,42E5) 2,64E-4 (5,57E-5) 0,19 (7,96E-2) 3,80E6 (7,11 E5) 7,09E-3 (2,22E3) 1,86 (0,32)

Tabla 18 – Cinéticas de unión en formato inverso de H28L 16, 11 C7 y HcLc a los ortólogos recombinantes de la Nogo-A humana determinadas en Biacore T100. La proteína A se inmovilizó sobre la superficie a aproximadamente 4000 RU y los anticuerpos anti-Nogo-A se capturaron a aproximadamente 300-400 RU. Las proteínas recombinantes ( NOGO-A56-GST) se extendieron a diversas concentraciones (0,125-64 nM) dependiendo de la construcción. Todos los procesos se realizaron por duplicado. Los valores muestran la media y la desviación típica (entre paréntesis) de 1-3 procesos independientes realizados cada uno por duplicado y cada conjunto de datos se analizó independientemente antes de calcular la media y la desviación típica.

H28L16: 11C7 HcLc

Ortólogo: Ka Kd KD (nM) Ka Kd KD (nM) Ka Kd KD (nM)

Mono cinomolgo (3 procesos)*: 3,26E5 (4,06E3) 1,11E-3 (2,23E-5) 3,41 (0,05) 4,02E5 (6,85E4) 2,97E-4 (1,11 E5) 0,76 (0,12) 3,03E5 (4,58 E3) 1,41 E-3 (2,84E-5) 4,66 (0,08)

Rata (3 procesos): 3,80E5 (5,68E3) 16,69E-4 (1,24E-5) 1,76 (0,03) 2,83E5 (4,66E4) 1,77E-4 (1,34E-5) 0,64 (0,09) 5,47 sí (1,20E4) 1,10E-3 (2,86E-5) 2,01 (0,07)

Mono tití (1 proceso): 2,22E5 (3,61 E3) 1,09E-3, (7,35E-5) 4,89 (0,25) 1,91 E5 (2,90E3) 2,54E-4 (3,46E-6) 1,33 (0,00) 3,02tes (9,90E2) 1,36E-3: (7,92E-5) 4,51 (0,28)

Mono ardilla (1 proceso): 1,57E5 (2,69E3) 1,08E-3 (5,02E-5) 16,86 (0,20) 1,03E5 (2,12E3) 2,78E-4 (3,61 E6) 2,69 (0,02) 1,74E5 (2,19E3) 1,29E-3 (7,64E-5) 7,45 (0,34)

Ser humano (1 proceso): 1,20E6 (8,49E4) 4,75E-4 (9,97E-6) 0,40 (0,02) 2,64E5 (3,32E3) 1,49E-4 (1,61 E5) 0,57 (0,07) 1,32E6 (2,71 E5) 7,00E-4 (3,18 E5) 0,54 (0,09)

12.4 Propiedades físicas

Las propiedades físico químicas de H28L16 y H20L16 se evaluaron por SEC-HPLC y SDS-PAGE. La SEC-HPLC se

10 realizó a 1,0 ml/minuto usando fosfato sódico 100 mM, cloruro sódico 400 mM pH 6,8 y una columna de acero inoxidable TSK G3000 SW xl de 30 cm x 7,8 mm con detección a 214 nm y 280 nm. La SDS-PAGE se realizó sobre un gel Tris-HCl Novex al 4-20% cargando 10µg de producto y tinción con Sypro Ruby. La C-IEF se realizó en un Beckman MDQ usando 10 ampholines pH 3,5.

Se obtuvieron los siguientes resultados:

15 Tabla 19 – Análisis HPLC (SEC) Cromatografía por exclusión de tamaño de los anticuerpos anti-Nogo-A. Los valores mostrados son porcentajes del anticuerpo asignado a cada una de las tres especies diferentes.

Anticuerpo: Agregado % Monómero % Fragmento %

H28L16: 0,50 99,50 0,00

H20L16: 14,21 85,75 0,05

Tabla 20 – Análisis SDS-PAGE de los anticuerpos anti-Nogo-A. Los valores mostrados son porcentajes del anticuerpo encontrado en las bandas principales.

Anticuerpo: No reducido Reducido

H28L16: 82,4% HC:67,2%

LC:27,7% H+L:94,9%

H20L16: 84,6% HC: 69,3% LC: 26,4% H+L: 95,7%

20 Los datos SEC-HPLC sugieren que H20L16 es más susceptible a agregación que H28L16 (H28L16). Si los datos indicados en el presente documento tienen que repetirse a gran escala, esto podría influir en la capacidad del proceso de fabricación para producir material de calidad aceptable para el uso clínico (>95% monómero). Los datos de SDS-PAGE muestran que ambos candidatos son aceptables mostrando ambos un perfil típico.

Ejemplo 13, Comparación de H28L16 con 11C7

Se generó un anticuerpo anti-Nogo-A murino denominado 11C7, como se describe en el documento WO2004052932, para un epítope peptídico. Se preparó el 11 C7 quimérico en base a en la información de secuencias proporcionada en el documento WO2004052932. Para comparar los epítopes de unión de 2A10 y 11C7, se estableció un ELISA competitivo para investigar si 11 C7 y 2A10 reconocían un epítope solapante sobre Nogo-A. Como se muestra más adelante en la Figura 20, H28L16 fue capaz de competir con 2A10 con respecto a la unión a la Nogo-A humana recombinante mientras que 11 C7 no mostró competencia con 2A10, incluso a concentraciones de hasta 100 mcg/ml.

Ejemplo 14: ELISA competitivo para demostrar la capacidad de los péptidos para competir directamente con la NOGO-5+6 humana con respecto a la unión a NOGO H28L16

Procedimiento para el ELISA competitivo

La capacidad de los péptidos para competir directamente con la NOGO-A (Nogo-A56 humana-GST) para la unión a NOGO H28L16 se evaluó usando un ELISA competitivo. Durante una noche se revistió anti-IgG humana de conejo (Sigma, Nº I-9764) a 5 g/ml en tampón bicarbonato sobre placas Nunc inmunosorp (100 ul por pocillo) a 4 ºC. Las placas se aclararon 3 veces con TBS que contenía Tween al 0,05% (TBST), después se bloquearon con BSA al 1% en TBST a temperatura ambiente durante 1 hora. Después se capturó H28L16 sobre la placa (1 µg/ml, diluido en BSA al 1% en TBST, 50 ul por pocillo) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con TBST. Antes de la adición a los pocillos, los péptidos (de 0 a 100 g/ml) y la NOGO-A56 humana-GST se mezclaron previamente a una concentración de 1 ug/ml (diluido en BSA al 1% en TBST) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con TBST y después se incubaron durante 1 hora con anti-GST de conejo conjugado con peroxidasa (Sigma, Nº A7340, 1:2000, diluido en BSA al 1% en TBST) durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con TBST y después se incubaron con sustrato de peroxidasa OPD 50 I (Sigma) por pocillo durante 10 minutos. La reacción del color se detuvo por la adición de 25 l de H2SO4 concentrado. Usando un lector de placa se midió la absorbancia a 490 nm.

Los resultados mostrados en la Figura 19 confirman que los péptidos 6 y 7, que fueron positivos en el ELISA de mapeo epitópico (Ejemplo 8) pueden competir con la unión de la NOGO-A56 humana-GST a H28L16. Esto sugiere que los péptidos que fueron positivos en el estudio de mapeo epitópico contienen un epítope para la unión a H28L16. Los péptidos 16 y 17 (que contienen péptidos NOGO, aunque no solapantes con los péptidos 6 o 7), que no contienen el epítope propuesto, no compiten con NOGO-5+6.

Ejemplo 15: Análisis ELISA de un Anticuerpo Monoclonal Anti NOGO Humanizado basado en las variantes G101S/Q37R del anticuerpo NOGO

Se generó G101S (conocido también como H100 (SEC ID Nº: 63)), una variante modificada de la región variable de la cadena pesada de H6 (SEC ID Nº: 11) introduciendo una sustitución sencilla, G101S (numeración de Kabat) en la CDR H3, como se ha descrito anteriormente. De manera similar, se generó Q37R, una variante modificada de la región variable de la cadena ligera de L13 (SEC ID Nº: 13) introduciendo una sustitución sencilla (Q37R según la numeración de Kabat) en la región marco conservada (para formar L100). La secuencia de proteínas del dominio ligero variable de Q37R se proporciona en la SEC ID Nº: 67.

Los genes que codifican versiones de longitud completa de las cadenas pesada y ligera que contienen las sustituciones G101S/Q37R se expresaron en células CHO, como se ha descrito anteriormente, y se sometieron a un ensayo ELISA de unión directo como se ha descrito anteriormente.

En la Figura 20 se muestran los resultados del ensayo ELISA de unión directo cuando se cargó el antígeno a 0,05 ug/ml. Los datos confirman que el anticuerpo H100L100 muestra afinidad de unión comparable a la de la NOGO-A56 humana-GST recombinante cuando se compara con H27L16 y que H100L100 tiene un perfil de unión mejorado cuando se compara con H6L13. Los valores CE50 correspondientes se muestran en la siguiente tabla:

Tabla 21: Mediciones de CE50 para la variante G101S/Q37R en comparación con H6L13 y H27L16

Anticuerpo: Valor de CE50

H6L13: 0,086

H27L16: 0,052

H100/L100: 0,048

Ejemplo 16: Análisis BiaCore de Anticuerpos Monoclonales Anti NOGO humanizados en base a la variante G101S en laCDR H3

Se generó H100, una variante modificada de la región variable de la cadena pesada de H6 (SEC ID Nº: 11) introduciendo una sustitución sencilla, G101S (numeración de Kabat) en la CDR H3. La secuencia de proteína de la

5 proteína H100 del dominio pesado variable se proporciona en la SEC ID Nº: 63. De manera similar, se generaron L100 y L101, variantes modificadas de la región variable de la cadena ligera de L13 (SEC ID Nº: 13) introduciendo una sustitución sencilla (numeración de Kabat Q37R y Q45R respectivamente) en la región marco conservada. Las secuencias de proteína de las proteínas L100 y L101 de los dominios ligeros variables se proporcionan en la SEC ID Nº: 67 y SEC ID Nº: 68 respectivamente.

10 Las versiones de longitud completa de H100L100 y H100L101 se expresaron en células CHO como se ha descrito anteriormente. La Tabla 21 muestra una comparativa de las afinidades de unión de H6L13 con H100L100 y H100L101 e indica que H100L100 y H100L101 tienen una afinidad de unión mejorada cuando se comparan con H6L13. En este ejemplo, el procedimiento se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 6 en el que la microplaca CM5 se activó haciendo pasar soluciones de NHS y EDC sobre la microplaca a 5 µl/ml durante 7 minutos

15 y la NOGO se suspendió en tampón de acetato sódico 10 nM (pH 4,5) antes de pasarla sobre la microplaca.

Tabla 22 – Mediciones por Biacore para las variantes de G101S de la cadena pesada variable H6 en combinación con las variantes de la cadena ligera variable L13 en comparación con H6L13.

Anticuerpo: Constante de asociación ka (1/Ms) Constante de disociación kd (1/s) Afinidad (KD, nM)

H6L13: 1,04E+06 7,22E-03 6,97

H100L100: 1,28E+07 5,07E-03 0,396

H100L101: 1,30E+07 4,29E-03 0,329

Resumen de secuencias de anticuerpos NOGO (Tabla 23)

Descripción: Identificador de secuencia (SEC ID Nº)

Secuencia de aminoácidos: Secuencia de polinucleótidos

2A10, CDR-H1: 1 -

2A10, CDR-H2: 2 -

2A10, CDR-H3: 3 -

2A10, CDR-L1: 4 -

2A10, CDR-L2: 5 -

2A10, CDR-L3: 6 -

2A10, VH (murino): 7 19

2A10, VL (murino): 8 20

Cadena pesada quimérica Hc: 9 21

Cadena ligera quimérica Lc: 10 22

Construcción H6 humanizada VH 2A10: 11 23

Construcción H16 humanizada VH 2A10: 12 24

Construcción L13 humanizada VL 2A10: 13 25

Construcción L16 humanizada VL 2A10: 14 26

Construcción H6 humanizada de cadena pesada 2A10: 15 27

Construcción H16 humanizada de cadena pesada 2A10: 16 28

Construcción L13 humanizada de cadena ligera 2A10: 17 29

Construcción L16 humanizada de cadena ligera 2A10: 18 30

Secuencia líder Campath: 31 -

Aminoácidos 586-785 de NOGO A humana (NOGO-A56) fusionada a GST: 32 -

(continuación)

Descripción: Identificador de secuencia (SEC ID Nº)

Secuencia de aminoácidos: Secuencia de polinucleótidos

Construcción H1 humanizada VH 2A10: 33 37

Construcción L11 humanizada VL 2A10: 34 38

Construcción H1 humanizada cadena pesada 2A10: 35 39

Construcción L11 humanizada cadena ligera 2A10: 36 40

Construcción H20 humanizada VH 2A10: 41 43

Construcción H20 humanizada cadena pesada 2A10 H20: 42 44

2A10, CDR-H3 (G95M): 45

Secuencia del fragmento de NOGO-A de mono tití: 46

Construcción H26 humanizada VH: 47 50

Construcción H27 humanizada VH: 48 51

Construcción H28 humanizada VH: 49 52

Construcción H26 humanizada cadena pesada: 53 56

Construcción H27 humanizada cadena pesada: 54 57

Construcción H28 humanizada cadena pesada: 55 58

Cadena pesada quimérica Hc (G95M): 59

Epítope: 60

Construcción H99 humanizada VH 2A10: 61

CDR (G101S): 62

Construcción H100 humanizada VH: 63

Construcción H101 humanizada VH: 64

Construcción H102 humanizada VH: 65

Construcción H98 humanizada VH: 66

L100 (L13+Q37R): 67

L101 (L13+Q45R): 68

L102(L13+Q37R/Q45R): 69

L103 (L16+Q37R): 70

L104 (L16+Q45R): 71

L105(L16+Q37R/Q45R): 72

Péptido: 73

péptido: 74

Análogo CDR H3: 75

Análogo CDR H3: 76

Análogo CDR H3: 77

Análogo CDR H3: 78

Análogo CDR H3: 79

Análogo CDR H3: 80

Análogo CDR H3: 81

Análogo CDR H3: 82

Análogo CDR H3: 83

Análogo CDR H3: 84

NOGO péptido: 85

(continuación)

Descripción: Identificador de secuencia (SEC ID Nº)

Secuencia de aminoácidos: Secuencia de polinucleótidos

Análogo CDR H3: 86

Análogo CDR H3: 87

Análogo CDR H3: 88

Análogo CDR H3: 89

Análogo CDR H3: 90

NOGO de mono ardilla (A56) más marcador GST: 91

NOGO de mono cinomolgo (A56) más marcador GST: 92

NOGO de mono tití (A56) más marcador GST: 93

NOGO de rata (A56) más marcador GST: 94

Péptido de NOGO humana: 95

Péptido de NOGO humana: 96

Secuencias

SEC ID Nº: 1: 2A10 CDR-H1 SYWMH

5 SEC ID Nº: 2: 2A10 CDR-H2 NINPSNGGTNYNEKFKS SEC ID Nº: 3: 2A10 CDR-H3

GQGY SEC ID Nº: 4: 2A10 CDR-L1. 10 RSSKSLLYKDGKTYLN

SEC ID Nº: 5: 2A10 CDR-L2 LMSTRAS SEC ID Nº: 6: 2A10 CDR-L3

QQLVEYPLT 15 SEC ID Nº: 7: 2A10, VH (murino)

SEC ID Nº: 8: 2A10, VL (murino)

SEC ID Nº: 9: Cadena pesada quimérica Hc

SEC ID Nº: 10: Cadena ligera quimérica Lc

SEC ID 11: Construcción H6 humanizada de VH de 2A10

SEC ID Nº: 12 Construcción H16 humanizada de VH de 2A10

SEC ID Nº: 13: Construcción L13 humanizada de VL de 2A10

SEC ID Nº: 14: Construcción L16 humanizada de VL de 2A10

SEC ID Nº: 15: Construcción H6 humanizada de cadena pesada de 2A10

SEC ID Nº: 16: Construcción H16 humanizada de cadena pesada de 2A10

15 SEC ID Nº: 17: Construcción L13 humanizada de cadena ligera de 2A10

SEC ID Nº: 18: Construcción L16 humanizada de cadena ligera de 2A10

SEC ID Nº: 19: PN que codifica 2A10, SEC ID 7 de VH (murina)

SEC ID Nº: 20: PN que codifica 2A10, SEC ID 8 de VH (murina)

SEC ID Nº: 21: PN que codifica la cadena pesada quimérica Hc SEC ID 9

SEC ID Nº: 22: SEC ID: PN que codifica la cadena ligera quimérica Lc SEC ID:10

SEC ID Nº: 23: PN que codifica la construcción H6 humanizada de VH de 2A10 SEC ID: 11

SEC ID Nº: 24: PN que codifica la construcción H16 humanizada de VH de 2A10 SEC ID: 12

SEC ID Nº: 25: PN que codifica la construcción L13 humanizada de VL de 2A10 SEC ID: 13

SEC ID Nº: 26: PN que codifica la construcción L16 humanizada de VL de 2A10 SEC ID: 14

SEC ID Nº: 27: PN que codifica la construcción H6 humanizada de cadena pesada de 2A10 SEC ID: 15

SEC ID Nº: 28: PN que codifica la construcción H16 humanizada de cadena pesada de 2A10 SEC ID: 16

SEC ID Nº: 29: PN que codifica la construcción L13 humanizada de cadena ligera de 2A10 SEC ID: 17

SEC ID Nº: 30: PN que codifica la construcción L16 humanizada de cadena ligera de 2A10 SEC ID: 18

SEC ID Nº: 31: Secuencia líder Campath MGWSCIILFLVATATGVHS

10 SEC ID Nº: 32: Aminoácidos 586-785 de la NOGO A humana (NOGO-A56) fusionada a GST

SEC ID Nº: 33: Construcción H1 humanizada de VH de 2A10

SEC ID Nº: 34: Construcción L11 humanizada de VL de 2A10

SEC ID Nº: 35: Construcción H1 humanizada de cadena pesada de 2A10

SEC ID Nº: 36: Construcción L11 humanizada de cadena ligera de 2A10

SEC ID Nº: 37: PN que codifica la construcción H1 humanizada de VH de 2A10 SEC ID: 33

SEC ID Nº: 38: PN que codifica la construcción L11 humanizada de VL de 2A10 L11 SEC ID: 34

SEC ID Nº: 39: PN que codifica cadena pesada H1 humanizada de 2A10 SEC ID: 35

SEC ID Nº: 40: PN que codifica la construcción L11 de cadena ligera humanizada de 2A10 SEC ID: 36

SEC ID Nº: 41: Construcción H20 humanizada de VH de 2A10

SEC ID Nº: 42: Construcción H20 humanizada de cadena pesada de 2A10

SEC ID Nº: 43: PN que codifica la construcción H20 humanizada de VH de 2A10 SEC ID: 41

SEC ID Nº: 44: PN que codifica la construcción H20 humanizada de cadena pesada de 2A10 SEC ID: 42

SEC ID Nº: 45: CDR-H3 de 2A10 CDR-H3 (G95M) MQGY

SEC ID Nº: 46: Secuencia de aminoácidos del fragmento NOGO-A de mono titi

SEC ID Nº: 47: Construcción H26 humanizada de VH

SEC ID Nº: 48: Construcción H27 humanizada de VH

SEC ID Nº: 49: Construcción H28 humanizada de VH

SEC ID Nº: 50: PN que codifica la construcción H26 humanizada de VH SEC ID: 47

15 SEC ID Nº: 51: PN que codifica la construcción H27 humanizada de VH SEC ID: 48

SEC ID Nº: 52: PN que codifica la construcción H28 humanizada de VH SEC ID: 49

SEC ID Nº: 53: Construcción H26 humanizada de cadena pesada

SEC ID Nº: 54: Construcción H27 humanizada de cadena pesada

SEC ID Nº: 55: Construcción H28 humanizada de cadena pesada

SEC ID Nº: 56: PN que codifica la construcción H26 humanizada de cadena pesada SEC ID: 53

SEC ID Nº: 57: PN que codifica la construcción H27 humanizada de cadena pesada SEC ID: 54

SEC ID Nº: 58: PN que codifica la construcción de H28 humanizada de cadena pesada SEC ID: 55

SEC ID Nº: 59: Cadena pesada Hc (G95M)

SEC ID 60: Epítope VLPDIVMEAPLN

SEC ID 61: Construcción H99 humanizada de VH de 2A10

SEC ID Nº: 62: CDR H3 GQSY SEC ID Nº: 63: Construcción H100 humanizada de VH

SEC ID Nº: 64: Construcción H101 humanizada de VH

SEC ID Nº: 65: Construcción H102 humanizada de VH

SEC ID Nº: 66: Construcción H98 humanizada de VH de 2A10

SEC ID Nº: 67

SEC ID Nº: 68

15 SEC ID Nº: 69

SEC ID Nº: 70

SEC ID Nº: 71

SEC ID Nº: 72

SEC ID Nº: 73 TPSPVLPDIVMEAPLN

25 SEC ID Nº: 74 VLPDIVMEAPLNSAVP

SEC ID Nº: 75 RQGY

SEC ID Nº: 76 IQGY

SEC ID Nº: 77 GDGY

5 SEC ID Nº: 78 GIGY

SEC ID Nº: 79 GSGY

SEC ID Nº: 80 10 GQNY

SEC ID Nº: 81 GQYY

SEC ID Nº: 82 GQLY

15 SEC ID Nº: 83 GQFY

SEC ID Nº: 84 GQGW

SEC ID Nº: 85 20 YESIKHEPENPPPYEE

SEC ID Nº: 86 WQGY

SEC ID Nº: 87 GAGY

25 SEO ID NO.88 GLGY

SEC ID Nº: 89 GVGY

SEC ID Nº: 90 30 GQWY

SEC ID Nº: 91

SEC ID Nº: 92

SEC ID Nº: 93

SEC ID Nº: 94

5: SEC ID Nº: 95 DETFAL

SEC ID Nº: 96 ELSKTS

10 15: LISTADO DE SECUENCIAS <110> Paul Andrew Hamblin Jonathon Henry Ellis Volker Germaschewski Ruth Mcadam Rabinder Kumar Prinjha Stephanie Jane Clegg George Kapsidas

20: <120> Inmunoglobulinas <130> VB61773FF

<160> 96

25: <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

30: <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 1

35

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

40

<400> 2

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> Mus musculus 5

<400> 3

10 <210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

15 <400> 4

20: <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus

25: <400> 5

30: <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 6

35

40: <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 7

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

<210> 9

<211> 443

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Ab quimérico que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo sapiens

<400> 9 20

<210> 10

<211> 219

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Ab quimérico que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo sapiens

<400> 10 10

<210> 11

<211> 113 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción de anticuerpo humanizado que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo 20 sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 113 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción de Ab humanizado que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo sapiens 10

<400> 12

15 <210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Construcción de Ab humanizado que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 112 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 14

15 <210> 15

<211> 443

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Construcción de anticuerpo humanizado que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo sapiens

<400> 15 25

<210> 16

<211> 443 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción de anticuerpo humanizado que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo 10 sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 218

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

10 <400> 17

<210> 18 15 <211> 218

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

20 <223> Construcción de anticuerpo humanizado que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 339

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 19

<210> 20

<211> 336

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 20

<210> 21

<211> 1389

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Construcción de anticuerpo quimérico que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo sapiens

30 <400> 21

<210> 22 5 <211> 720

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <223> Construcción de anticuerpo quimérico que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 339

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 23

<210> 24 5 <211> 339

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <223> Construcción de anticuerpo humanizado que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 336

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 25

30 <210> 26

<211> 336

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<400> 26 40

<210> 27

<211> 1389 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 27

<210> 28

<211> 1389

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 20

<220>

25 <400> 28

<210> 29

<211> 717 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 29

<210> 30

<211> 717

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<400> 30 25

<210> 31

<211> 19 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 31

15

<210> 32

<211> 439

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

20

<400> 32

<210> 33

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<400> 33 10

<210> 34

<211> 112 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 34

<210> 35

<211> 443

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 30

<220>

35 <400> 35

<210> 36

<211> 218

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

10 <400> 36

<210> 37 15 <211> 339

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 37

<210> 38

<211> 336

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 38

15 <210> 39

<211> 1389

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<400> 39 25

<210> 40

<211> 717

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción de anticuerpo humanizado que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo

sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 113

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 41

20 <210> 42

<211> 443

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<400> 42 30

<210> 43

<211> 339

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 43

10 <210> 44

<211> 1389

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<400> 44 20

<210> 45

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción de anticuerpo humanizado que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo 30 sapiens

<400> 45

<210> 46

<211> 200

<212> PRT

<213> Callithrix jacchus

<400> 46

<210> 47

<211> 113

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 47 <210> 48

<211> 113 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 48

<210> 49

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

25 <400> 49 <210> 50

<211> 339 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 50

<210> 51

<211> 339

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 20

<220>

25 <400> 51

<210> 52 30 <211> 339

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

35 <223> Construcción de anticuerpo humanizado que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo sapiens

<400> 52

5 <210> 53

<211> 443

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<400> 53 15

<210> 54

<211> 443

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 54

<210> 55

<211> 443

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 55 <210> 56

<211> 1389 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 56

<210> 57

<211> 1389

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 20

<220>

25 <400> 57 <210> 58

<211> 1389 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 58 <210> 59

<211> 443 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción de anticuerpo quimérico que comprende secuencias de Mus musculus y de Homo 10 sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

10 <210> 61

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<400> 61 20

<210> 62

<211> 4 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción de anticuerpo humanizado que comprende secuencias de mus musculus y homo sapiens 30

<400> 62

35 <210> 63

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40 <220>

<400> 63 <210> 64

<211> 113 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 64

<210> 65

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

25 <400> 65 <210> 66

<211> 113 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 66

<210> 67

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

25 <400> 67 <210> 68

<211> 112 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 68

<210> 69

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

25 <400> 69 <210> 70

<211> 112 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 70

<210> 71

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

25 <400> 71 <210> 72

<211> 112 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 72

15

<210> 73

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

20

<400> 73

25 <210> 74

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 74 <210> 75

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 75

<210> 76

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 76

<210> 77

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 77

<210> 78

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 78

<210> 79

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 79

<210> 80

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 80

<210> 81

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 81

<210> 82

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 82

<210> 83

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 83

<210> 84

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 84

<210> 85

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 85

<210> 86

<211> 4 <212 PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 86

<210> 87

<211> 4 <212 PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 87

<210> 88

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 88

<210> 89

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 89

<210> 90

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 90

<210> 91

<211> 438

<212> PRT

<213> Saimiri boliviensis

<400> 91 <210> 92

<211> 460

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis

<400> 92

<210> 93

<211> 438

<212> PRT

<213> Callithrix jacchus

<400> 93

<210> 94

<211> 432

<212> PRT

<213> Rattus rattus

<400> 94

5: <210> 95 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 95

10

15: <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 96

20

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo capaz de unirse a la NOGO-A humana, que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 49 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 14.
2.

Un anticuerpo aislado como se reivindica en la reivindicación 1 que tiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 55 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 18.
3.

Un vector de expresión que comprende las secuencias polinucleotídicas codificantes de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.
4.

Una célula huésped que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3.
5.

Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 4, cuya célula comprende un primer vector que codifica la cadena ligera y un segundo vector que codifica la cadena pesada.
6.

Un procedimiento para producir un anticuerpo capaz de unirse a la NOGO-A humana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: transfectar una célula huésped con un vector de expresión que comprenda un primer polinucleótido que codifique una región variable de la cadena pesada que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 49, y un vector de expresión que comprenda un segundo polinucleótido que codifique una región variable de la cadena ligera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 14, y cultivar la célula huésped en condiciones que conduzcan a la secreción del anticuerpo a partir de dicha célula huésped en dicho medio de cultivo.
7.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, que adicionalmente comprende la etapa de recuperar del medio de cultivo el anticuerpo secretado.
8.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en el que el primer y segundo polinucleótido están contenidos en un solo vector de expresión.
9.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-NOGO o un fragmento del mismo como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, junto con un diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable.
10.

El uso de un anticuerpo anti-NOGO o un fragmento del mismo como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis del ictus y de otras enfermedades/trastornos neurológicos o para el tratamiento de un paciente que padece un traumatismo mecánico del sistema nervioso central

o periférico.
11. Un anticuerpo anti-NOGO como se reivindica en la reivindicación 1 o 2 para su uso en el tratamiento o profilaxis del ictus y de otras enfermedades/trastornos neurológicos o para el tratamiento de un paciente que padece un traumatismo mecánico del sistema nervioso central o periférico.