KR20080080644A - Ｎｏｇｏ에 유도되는 면역글로불린 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 NOGO에 대한 항체, 상기 항체를 포함하는 약제 제형 및 신경 질환/장애의 치료 및/또는 예방에서의 그러한 항체의 용도와 관련이 있다.

Description

ＮＯＧＯ에 유도되는 면역글로불린{IMMUNOGLOBULINS DIRECTED AGAINST NOGO}
발명의 분야
본 발명은 면역글로불린, 특히 NOGO에 결합하며 이의 활성을 중화시키는 항체, 그러한 항체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 항체를 포함하는 약제 제형 및 신경 질환(neurological diseases)의 치료 및/또는 예방에 있어서 상기 항체의 용도와 관련이 있다. 본 발명의 다른 양상, 목적 및 이점은 하기 기재로부터 명백해질 것이다.
발명의 배경
뇌졸중은 서구 사회에서 사망 및 장애의 주요한 원인이다. 발병 3시간 이내에 투여되어야 하며 그후 내출혈을 배제하기 위해 컴퓨터토모그래피(CT) 스캔을 하여야 하는 조직 플라스미노젠(t-PA) 이외에 뇌졸중 치료를 위한 승인된 치료법은 없다. 현재까지 급성 뇌졸중 치료(즉, 신경 보호)를 지향하여 온 대부분의 치료 제제는, 주로 급성 세포 사멸에 연루되어 있는 것으로 공지된 글루타메이트 수용체(receptor)와 이들의 다운 스트림 신호전달 경로를 표적으로 삼는 것과 관련이 있었다. 그러나, 현재까지 이러한 전략들은 임상적 시험에서 성공을 거두지 못하였으며 종종 용량-제한적 부작용과 연관되어 있다(Hill & Hachinski, The Lancet, 352:(suppl III) 10-14(1998)). 따라서, 혈류 중단 후 세포 사멸의 개선을 지향하는 신규한 접근법에 대한 요구가 존재한다. 신경보호는 상해 또는 질환 과정에 반 응하여 신경 세포 손실을 예방하거나 개선시키는 치료제의 활성이다. 이는 뉴런을 직접 또는 간접적으로 표적으로 삼아 글리아(희소돌기아교세포를 포함함) 세포 손실을 예방함으로써 달성될 수 있다.
뇌졸중의 발병 후, 다수의 환자에서 어느 정도의 자발적인 기능 회복이 관찰되었는데, 이는 뇌가 손상 후 복구 및/또는 재구성(remodeling)할 수 있는 능력(있기는 하나 제한적임)을 지닌다는 것을 시사한다. 따라서 이러한 회복을 향상시킬 수 있는 잠재력을 지니는 제제는 대뇌허혈의 발병 후 훨씬 더 나중에 개입이 가능하도록 할 수 있다. 급성 신경보호를 제공하고 기능적인 회복을 강화할 수 있는 제제는 현재의 유력한 신경보호전략을 뛰어 넘는 상당한 이점을 제공할 것이다.
알츠하이머병(AD)은 병리학의 2가지 진단학적 특징에 의해 특징지워진다. 각각, 결집된(aggregated) 베타-아밀로이드 펩티드(Aβ40 및 Aβ42) 및 고인산화된(hyperphosphorylated) 타우(tau)로 구성된 아밀로이드 플라크 및 신경섬유의 다발성 병변(neurofibrillary tangles)이다(Dawbarn & Allen 2001 Neurobiology of Alzheimer's Disease OUP).
종합적인 연구는 환자에 있어서 베타-아밀로이드 축적 및 인지 감퇴 사이의 강한 연관을 보여준다(Naslund et al., JAMA, March 22/29, 2000, Vol.283, No;12, page. 1571-1577). 이는 APP와 프리세닐린 유전자들의 몇몇 돌연변이들은 조기 발병 AD에 걸리기 쉽게 할 수 있다는 유전학적 및 역학적 연구와 부합하는데, 상기 돌연변이들은 또한 Aβ40와 Aβ42 펩티드의 비율을 포함하여, 이들의 수준을 강화시킨다.
베타- 와 감마-세크리타제로 지정된 2개의 독특한 프로테아제들에 의한 타입 I 막관통 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 절단이 베타-아밀로이드 펩티드의 형성에 필요하다. 아스파르틸-프로테아제 Asp2/BACE1로서 베타-세크리타제의 분자적 동일성이 확인되었다(Hussain et al. Mol. Cell. NeuroSci. 16, 609-619(2000); Vassar et al., Science(1999), Oct.22; 286(5440):735-741). 감마-세크리타제의 특성은 여전히 몇몇 논쟁거리의 근원이 되며 적어도 하기 단백질들로 이루어진 고 분자량 복합체를 구성할 가능성이 있다: 프리세닐린, Aph1, Pen2 및 니카스트린(nicastrin)(다음 문헌에서 검토되었음: Medina & Dotti Cell Signalling 2003 15(9):829-41).
CNS 내부에서 APP의 가공은 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상세포 및 미세아교세포를 포함하는 수많은 유형의 세포들 내에서 일어날 것으로 생각된다. 이러한 세포들에서 전반적인 APP 가공 비율(rate)은 APP, BACE1/Asp2, 프리세닐린-1 및 -2, Aph1, Pen2 및 니카스트린의 상대적인 발현 수준에 의해 영향받을 것이다.
더욱이, APP의 세포내이입을 차단하는 APP 세포질 도메인내의 YENP 모티프의 돌연변이가 베타-아밀로이드 생성을 감소시킨다는 발견에 의해 제시되는 것과 같이 APP의 세포하(subcellular) 위치를 조절하는 추가적인 인자들이 또한 APP의 가공에 영향을 미칠 수 있다(Perez et al. 1999 J Biol Chem 274(27) 18851-6). KKQN 유지(retention) 모티프의 부가에 의한 ER 내 APP-베타-CTF의 유지는 트랜스펙션된 세포에서 아밀로이드 생성을 감소시키는데 충분하다(Maltese et al. 2001 J Biol Chem 276(23) 20267-20279). 반대로, Rab5의 과발현에 의한, 세포내이입의 증가는 트랜스펙션된 세포로부터 아밀로이드 분비를 증가시키는데 충분하다(Grbovic et al. 2003 J Biol Chem 278(33) 31261-31268).
이러한 발견과 합치되는 추가의 연구는 세포내 콜레스테롤 수준의 감소(AD에 관한 잘 알려진 위험 인자)가 베타-아밀로이드 형성을 감소시킨다는 것을 보여주었다. 이러한 변화는 우성 네가티브 디나민(dynamin) 돌연변이체(K44A)의 사용과 Rab5 GTP아제(GTPase) 활성화 단백질 RN-Tre의 과발현에 의해 입증된 것과 같이 변형된 세포내이입에 의존적이었다(Ehehalt et al. 2003 J Cell Biol 160(1) 113-123).
콜레스테롤 풍부 마이크로도메인(microdomains) 또는 래프트(rafts)가 또한 베타-아밀로이드 생성에 관한 중요한 세포내 부위이며 APP, BACE1 및 감마-세크리타제 복합체의 성분들은 모두 래프트 내부에서 일시적으로 존재하는 것으로 나타났다. 콜레스테롤 풍부 래프트에 대한 APP와 BACE1의 항체 교차 결합은 베타-아밀로이드 생성을 향상시킬 수 있었다(Ehehalt et al. 2003 J Cell Biol 160(1) 113-123). 전적으로 지질 래프트를 표적으로 삼는, GPI-고정(anchored) BACE1의 발현은 유사하게 APP 절단과 베타-아밀로이드 생성을 향상시킬 수 있다(Cordy et al. 2003 PNAS 100(20) 11735-11740).
뇌졸중 또는 기타 신경손상 사건 또는 질환 후의 기능적 회복을 명백히 보여주는 메카니즘은, 현재까지 알려져 있지 않다. 손상 또는 비손상 액손의 발아(sprouting)는 한 가능한 메카니즘으로 제안되어 왔다. 그러나, 생체내 연구가 향신경성 인자(neurotrophic factors)를 이용한 척수 손상 또는 뇌졸중의 치료가 결과적으로 향상된 기능적 회복과 소정의 액손 발아를 초래한다는 것을 밝혀내었을지라도, 이러한 연구들은 액손 발아 정도(degree)와 기능적 회복 범위(extent) 사이의 직접적인 연관성에 대해 입증하지 못한다(Jakeman, et al. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata et al. 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA., 94:8179-8184, Ribotta, et al. 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152). 더욱이, 액손 발아는 생존가능한 뉴런을 필요로한다. 대규모 세포 사멸과 연관되어 있는 뇌졸중과 같은 질환에서, 뇌졸중 발병 후 투여된 제제에 의해 제공되는 기능적 회복의 향상은 따라서 내생성 줄기 세포의 분화, 잉여(redundant) 경로의 활성화, 수용체 분포 또는 뉴런 또는 글리아의 흥분도(excitability)에서의 변화와 같은 액손 발아 이외의 다른 메카니즘을 통해 이루어질 수 있다(Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Homer & Gage, 2000, Nature 407 963-970).
손상 후 복구에 관한 중추신경계(CNS)의 제한된 능력은 부분적으로 액손 발아에 대한 억제 효과(신경돌기 과성장)를 지니는 CNS 환경 내부의 분자들에 기인하는 것으로 생각된다. CNS 미엘린이 억제 분자를 포함하는 것으로 생각된다(Schwab ME and Caroni P(1988) J. Neurosci. 8, 2381-2193). 2종류의 미엘린 단백질, 미엘린-연관 당단백질(MAG) 및 NOGO가 클로닝되었으며 신경돌기 과성장의 추정되는 억제자로서 확인되었다(Sato S. et al.(1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163, 1473-1480; McKerracher L et al.(1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G et al.(1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K and Lundborg G(1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer et al.(1996) Neuron 16, 1107-1113; WO9522344; WO9701352; Prinjha R et al.(2000) Nature 403, 383-384; Chen MS et al.(2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T et al.(2000) Nature 403, 439-444; US005250414A; WO200005364A1; WO0031235).
인간 NOGO의 3가지 형태가 확인되었다: 1192개의 아미노산 잔기를 갖는 NOGO-A(젠뱅크 접근 번호 AJ251383); 추정되는 세포외 도메인의 잔기 186 내지 1004가 결여된 스플라이스 변이체인, NOGO-B(젠뱅크 접근 번호 AJ251384) 및 잔기 186 내지 1004가 결여되어 있으며 또한 더 작은, 대안적인 아미노 말단 도메인을 지니는, 더 짧은 스플라이스 변이체인, NOGO-C(젠뱅크 접근 번호 AJ251385)(Prinjha et al.(2000) 전게서).
NOGO와 같은 CNS 억제 단백질의 억제는 뉴런의 손상을 개선시키고 뉴런의 복구와 성장을 촉진하며 그로 인하여 뇌졸중에서 경험하게 되는 뉴런의 손상으로부터 잠재적으로 회복을 보조할 수 있는 치료적 수단을 제공할 수 있다. 그러한 NOGO 억제자의 예는 작은 분자, 펩티드 및 항체를 포함할 수 있다.
NI-220/250[신경돌기 성장의 유력한 억제자(NOGO-A의 단편인 것으로 후에 밝혀짐)인 미엘린 단백질]에 대항하여 생성된, 뮤린(murine) 단일클론 항체, IN-1이 액손 재생성을 촉진한다는 것이 보고되었다(Caroni, P and Schwab, ME(1988) Neuron 185-96; Schnell, L and Schwab, ME(1990) Nature 343 269-272; Bregman, BS et al.(1995) Nature 378 498-501 and Thallmair, M et al.(1998) Nature Neuroscience 1 124-131). 또한 NOGO-A가 IN-1에 대한 항원이라는 것이 보고되었다(Chen et al.(2000) Nature 403 434-439). 척수 절개가 진행된 래트에 대한 IN- 1 Fab 단편 또는 인간화 IN-1의 투여가 회복을 향상시켰다(Fiedler, M et al.(2002) Protein Eng 15 931-941 ; Brosa㎖e, C et al.(2000) J. Neuroscience 20 8061-8068).
NOGO에 결합하는 단일클론 항체는 국제공개공보 WO04/052932호 및 WO2005028508호에 소개되어 있다. 국제공개공보 WO04/052932호는 특정 형태의 인간 NOGO에 고친화력으로 결합하는 뮤린 항체 11C7에 대해 개시하고 있다.
특허 출원 WO05/061544호는 또한, 뮤린 단일클론 항체 2A10을 포함하는, 고친화력 단일클론 항체를 소개하고 있으며, 일반적으로 상기 항체의 인간화 변이체, 예를 들어, H1L11(H1 및 L11에 관한 서열은 각각 서열번호 33과 34으로 제공된다(VH 또는 VL 서열 만))을 소개하고 있다. 소개된 항체들은 인간 NOGO-A에 고친화력으로 결합한다. 뮤린 2A10 항체(및 이의 CDR-이식(grafted) 인간화 변이체)는 이들의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 내의 하기 상보성결정지역(CDR) 서열에 의해 특징지워진다[카바트 방법(Kabat et al.(1991) "Sequences of proteins of immunological interest"; Fifth Edition; US Department of Health and Human Services; NIH 공개번호 91-3242)을 이용하여 결정됨]:
Figure 112008051203250-PCT00001
Figure 112008051203250-PCT00002
국제공개공보 WO05/061544호는 추가로 상기 표 1 및 표 2의 CDR을 포함하는 항체의 "유사체", 예컨대, 해당 항체들이 유래된 도너(donor) 항체와 동일한 항원 결합 특정성 및/또는 중화 활성을 지니는 "유사체"에 대해 소개한다.
고친화력 항-NOGO 항체를 제공하는 종래 기술에도 불구하고, 인간 NOGO에 결합하고 상기 NOGO의 활성을 억제하는, 대안적이거나, 개선된, 치료학적으로 유용한 단일클론 항체를 동정하고 개발하려는 매우 요망되는 목표가 여전히 존재한다.
신경퇴행의 과정은, 이에만 국한되는 것은 아니나, 뇌졸중(허혈성 또는 내출혈성), 트라우마성 뇌 손상 및 척수 손상과 같은 급성 질환뿐만 아니라, 알츠하이머병, 전두측두치매(타우파시), 말초신경장애, 파킨슨병, 크로이츠펠트 야콥병(CJD), 정신분열증, 근위축성 측삭경화증(ALS), 다발성경화증, 헌팅톤병, 다발성경화증 및 봉입체 근염을 포함하는 만성질환을 포함하는 많은 신경 질환/장애를 명백히 나타낸다. 결과적으로, 본 발명의 항-NOGO 단일클론 항체, 및 이와 유사물은, 이러한 질환/장애의 치료에 유용할 수 있다. 위에 언급된 질환/장애의 치료를 위한 항체가 본 발명에 의해 제공되며 하기에서 상세히 설명된다.
본 발명의 간단한 요약
본 발명은 특정 중쇄 가변 영역, 및 상기 특정 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 이의 항체 또는 단편을 제공하는데, 상기 경쇄 가변 영역은 상기 중쇄 가변 영역과 쌍을 이룰 때, Fv 이량체가 인간 NOGO-A에 고친화력으로 결합하게 하고, 그로 인하여 인간 NOGO-A의 활성을 중화시킨다.
본 발명의 중쇄 가변 영역은, 통상적인 면역글로불린 방식으로(예를 들어, 인간 IgG, IgA, IgM 등) 또는 인간 NOGO-A에 결합하는 임의의 다른 단편 또는 "항체-유사" 형태로[예를 들어, 단일쇄 Fv, 디아바디(diabodies), Tandabs™ 등(대안적인 "항체" 형태에 대한 요약과 관련하여 다음 문헌을 참고하라: Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, VoI 23, No. 9, 1126-1136)], 인간 NOGO-A에 결합하도록 하기 위해 경쇄 가변 영역과 함께, 형상화(formatting)될 수 있다.
중쇄 가변 영역은 필수적으로 아민노산 잔기 GQGY를 포함하는 제 3의 CDR을 포함하는데, 여기서, 상기 CDR은 상기 GQGY 코어 서열 내부에 하나 이상의 치환을 내포함을 특징으로 하며, 상기 치환은 하기 치환으로부터 선택된다: 첫번째 위치 G가 R, I, W 또는 M으로 대체되고; 두번째 위치의 Q가 D, I, A, L, V 또는 S로 대체되며; 세번째 위치의 G가 W, N, Y, S, L 또는 F로 대체되고; 네번째 위치의 Y가 W로 대체된다.
또 다른 구체예에서, 상기 제 3의 중쇄 CDR(CDR H3)은 단지 1개의 치환을 내포하여 하기 CDR H3를 생산한다: RQGY(서열번호 75), IQGY(서열번호 76), MQGY(서열번호 45), GDGY(서열번호 77), GIGY(서열번호 78), GSGY(서열번호 79), GQNY(서열번호 80), GQYY(서열번호 81 ), GQSY(서열번호62), GQLY(서열번호 82), GQFY(서 열번호 83), GQGW(서열번호 84), WQGY(서열번호 86), GAGY(서열번호 87), GLGY(서열번호 88), GVGY(서열번호 89), GQWY(서열번호 90).
또 다른 구체예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 표 2에 나열된 다른 CDR, 즉, CDR H1(서열번호 1) 및 CDR H2(서열번호 2)를 내포한다.
본 발명의 항체, 또는 이의 단편은, ELISA 및 비아코어(Biacore) 실험에서 측정된 것과 같은 활성의 측면에서, CDR H3:GQGY를 포함하는 항체의 인간 NOGO 결합 활성을 보유하며, 상기 실험들 중 몇몇 경우에 있어서 활성은 증가된다.
G95M를 내포하는 인간 또는 인간화 중쇄 가변 영역(카바트에 의한 치환 넘버링)
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 표 3에 정의된 CDR을 포함한다(카바트에 의해 정의된 바에 따름):
Figure 112008051203250-PCT00003
본 발명의 한 구체예에서, 표 3에 나열된 각각의 CDR을 포함하는 인간 또는 인간화 중쇄 가변 영역이 제공된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 더 거대한 인간 중쇄 가변 영역 서열의 내부에 표 3에 나열된 CDR을 포함하는 인간화 중쇄 가변 영역이 제공된다. 아직 또 다른 구체예에서, 인간화 중쇄 가변 영역은 뮤린 2A10 도너 항체 중쇄 가변 영역(서열번호 7)에 대하여 프레임워크 영역에 있어서 40% 이 상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 65% 이상의 동일성을 갖는 수용체 항체 프레임워크(framework) 내부에 표 3에 나열된 CDR을 포함한다.
표 3의 CDR 모두가 사용될 경우, 한 구체예에서, 상기 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 66으로 제공되는 서열 H98이다(H98 VH는 H1에서 발견되는 바와 같이 H98에서 GQGY 대신 MQGY라는 점에서만 상이한 H1 VH(서열번호 33)의 등가물이다).
본 발명의 한 양상에서, 항체는 위치 38, 40, 48, 67, 68, 70, 72, 74, 및 79 중 하나 이상의 위치에 다수의 치환을 추가로 포함하는 서열번호 66(H98 가변 영역)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는데; 여기서 각각의 치환된 아미노산 잔기는 서열번호 7(도너 항체 2A10의 중쇄 가변 영역)의 동등한 위치(equivalent position)의 아미노산 잔기로 대체되며 치환의 갯수는 1 내지 9이다. 다른 구체예에서, 치환의 갯수는 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8 또는 9이다.
이 문맥에서, 소개된 치환은 "역-돌연변이(back-mutations)"에 대한 개념과 일치하는데, 여기서 H98 서열 내부의 특정 위치의 인간 프레임워크 아미노산 잔기는 2A10 도너 항체 서열 내부의 동등한 위치의 아미노산 잔기로 역-돌연변이된다.
본원에서와 반대로 달리 특별히 언급하지 않는 한, 예를 들어, "위치 12"와 같이, 특정 서열 내에서 발견된 아미노산 잔기의 수치적 위치가 본 명세서에서 언급된 경우, 통상의 기술자가 서열 내의 첫 번째 아미노산을 위치 "1"로 할당하고 위치 1로부터 셈을 세어 요망되는 위치 내에 존재하는 아미노산, 상기 예에서는 상기 서열에서 12번째 아미노산 잔기를 식별할 수 있도록 의도된다. 통상의 기술자 는 이러한 넘버링 체계가 항체 서열 내에서 아미노산 위치를 정의하는데 흔히 사용되는 카바트 넘버링 체계와 합치하지 아니한다는 것을 알아챌 것이다.
최적의 결합 친화력을 위해, 생쥐 항체 2A10(서열번호 7인 VH)의 인간화(humanisation)를 위해, 위치 48과 68에서 아미노산 잔기의 쌍은, 각각 I 및 A(이들 아미노산이 2A10에 존재하는 경우) 또는 각각 M 및 V(이들 아미노산이 H98에 존재하는 경우)이어야 한다는 것이 확인되었다. 상기 발견은 또한 2A10의 G95M 변이체의 인간화와 관련이 있을 것으로 예상된다.
하기 표는 본 발명의 항체의 일부분을 형성할 3가지 중쇄 가변(VH) 영역에 대한 상세한 내용을 포함한다. 개시된 각각의 VH는 표(표 4)에 언급된 치환을 추가로 포함하는 H98 VH(서열번호 66)에 기초하고 있는데, 여기서 적절한 위치의 H98 잔기는 상기 위치에서 2A10 잔기로 치환된다(표에서, "-"는 상기 위치에는 치환이 없으며, 그래서 잔기가 H98의 서열내의 잔기 그대로 유지된다는 것을 의미한다):
Figure 112008051203250-PCT00004
따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 중쇄 가변 영역(VH)은 H26 VH(서열번호 47), H27 VH(서열번호 48) 및 H28 VH(서열번호 49)이다.
서열번호 47: VH 인간화 작제물 H26
Figure 112008051203250-PCT00005
서열번호 48: VH 인간화 작제물 H27
Figure 112008051203250-PCT00006
서열번호 49: VH 인간화 작제물 H28
Figure 112008051203250-PCT00007
G101S를 포함하는 인간 또는 인간화 중쇄 가변 영역(카바트에 의한 치환 넘버링)
본 발명의 또 다른 구체예에서, 표 5에 정의된 CDR을 포함하는 인간 또는 인간화 중쇄 가변 영역이 제공된다:
Figure 112008051203250-PCT00008
한 구체예에서, 표 5의 CDR은 인간 중쇄 가변 영역 서열 내부에 통합된다. 또 다른 구체예에서, 인간화 중쇄 가변 영역은 뮤린 2A10 도너 항체 중쇄 가변 영역(서열번호 7)에 대하여 프레임워크 영역에 있어서 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 65% 이상의 동일성을 갖는 수용체 항체 프레임워크 내부에 표 5 에 나열된 CDR을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 표 5의 CDR은 인간 중쇄 가변 영역에 삽입되어 하기 서열(H99)을 지닌다:
Figure 112008051203250-PCT00009
다른 구체예에서, 추가의 역 돌연변이가 위치(수치적 잔기 위치에 의해 표기됨) 38, 40, 48, 67, 68, 70, 72, 74 또는 79 중 어느 한 위치에서 H99 VH 서열에 부가되는데: 여기서 각각의 치환된 아미노산 잔기는 서열 번호 7(도너 항체 2A10의 중쇄 가변 영역)의 동등한 위치에서 아미노산 잔기로 대체되며 치환의 갯수는 1 내지 9이다. 다른 구체예에서, 치환의 갯수는 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8 또는 9이다. H99 VH는 CDR H3가 H1에서 발견되는 것과 마찬가지로 GQGY 대신 H99의 MQGY이라는 점에서만 상이한 H1 VH(서열번호33)의 등가물이다.
최적의 결합 친화력을 위해, 생쥐 항체 2A10(서열번호 7인 VH)의 인간화(humanisation)를 위해, 위치 48과 68의 아미노산 잔기의 쌍은, 각각 I 및 A(이들 아미노산이 2A10에 존재하는 경우) 또는 각각 M 및 V(이들 아미노산이 H98에 존재하는 경우)이어야 한다는 것이 확인되었다. 상기 발견은 또한 2A10의 G95M 변이체의 인간화와 관련있을 것으로 예상된다.
한 구체예에서, 역 돌연변이는 하기 표 6에 표시된 위치에 자리하게 되는데, 여기서 적절한 위치에서 H99 잔기가 상기 위치에서 2A10 잔기로 대체된다(표에서, "-"는 상기 위치에는 치환이 없으며, 그래서 잔기가 H1의 서열내의 잔기 그대로 유지된다는 것을 의미한다):
Figure 112008051203250-PCT00010
인간 또는 인간화 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 단편
본 발명의 VH 작제물은 경쇄와 쌍을 이루어 임의 형태의 인간 NOGO-A 결합 유닛(Fv)을 형성할 수 있는데, 상기 형태에는 전장 길이(FL) 가변 및 불변 도메인 중쇄 서열을 지니는 통상적인 IgG 항체 형태가 포함된다. 본 발명의 VH 작제물 및 비분해성(non-lytic) 항체가 되게 하는 위치 235와 237(EU 인덱스 넘버링)에서의 불활성화 돌연변이를 포함하는 전장 길이(FL) IgG1 중쇄 서열의 예는 서열번호 53, 54 및 55이다.
서열번호 53: 중쇄 인간화 작제물 H26
Figure 112008051203250-PCT00011
서열번호 54: 중쇄 인간화 작제물 H27
Figure 112008051203250-PCT00012
서열번호 55: 중쇄 인간화 작제물 H28
Figure 112008051203250-PCT00013
본 발명의 중쇄 가변 영역 서열과 함께 Fv를 형성하는 경쇄 가변 영역 서열은 상기 Fv가 인간 NOGO-A에 결합할 수 있게 하는 임의의 서열일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역이 2A10 경쇄(국제공개공보 WO 05/061544호 참조)인데, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8 또는 이의 인간화 변이 체로서 제공된다. 2A10 경쇄의 인간화 변이체는 바람직하게는 인간 경쇄 가변 영역 수용체 프레임워크에 이식된 표 1에 기재된 모든 경쇄 가변 영역 CDR을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화 경쇄 가변 영역은 L11(서열번호 34), L13(서열번호 13) 또는 L16(서열번호 14)이다. 카바트 위치 37 및/또는 45에 특정 치환을 포함하는, L13 및 L16에 기초한 대안적인 경쇄 가변 영역은 표 7에 제공된다.
Figure 112008051203250-PCT00014
또 다른 구체예에서, 전장 길이(FL) 경쇄 서열은 L11FL(서열번호 36), L13FL(서열번호 17) 또는 L16FL(서열번호 18)이다.
또 다른 구체예에서, 항체, 이의 단편 또는 기능적 등가체는, H26, H27, H28, H100, H101 및 H102 중에서 선택되는 VH 서열을 포함하는데, 상기 VH 서열은 하기 VL 서열 중 어느 하나와 조합된다: L11, L13, L16, L100, L101, L102, L103, L104, 및 L105. 이는 나열된 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 가능한 모든 조합을 특이적으로 개시하기 위해 의도된 것이다(예를 들어, H28L104 등).
특별한 구체예에서, 항체, 이의 단편 또는 기능적 등가체는 하기 가변 영역 쌍을 포함한다:
H27L16(서열번호 48 + 서열번호 14)
H28L13(서열번호 49 + 서열번호 13)
H28L16(서열번호 49 + 서열번호 14).
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 하기 전장 길이 서열을 포함한다:
H27FL L16FL(서열번호 54 + 서열번호 18)
H28FL L13FL(서열번호 55 + 서열번호 17)
H28FL L16FL(서열번호 55 + 서열번호 18).
한 구체예에서, 본 발명의 항체는 H27L16(서열번호 48 + 서열번호 14)을 포함하거나 전장 길이 항체 H28FL L16FL(서열번호 55 + 서열번호 18)이다.
또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 단편은 H28L16과 동일한 인간 NOGO 에피토프에 결합하거나, 인간 NOGO에 대한 H28L16의 결합과 경쟁하는데, 상기 두 경우에 있어서, 경쟁적인 항체, 또는 이의 단편은, 뮤린 항체 2A10 또는 서열 GQGY(서열번호 3)을 갖는 CDR H3 또는 상기 CDR H3내에 1개의 아미노산 치환을 내포하는 서열을 포함하는 이의 인간 또는 인간화 변이체가 아니라는 점에서 특색이 있다.
특별한 구체예에서, 항체, 이의 단편 또는 기능적 등가체는 하기 가변 영역 쌍을 포함한다:
H100L16(서열번호 63 + 서열번호 14)
H101L13(서열번호 64 + 서열번호 13)
H102L16(서열번호 65 + 서열번호 14)
에피토프 맵핑 및 동일한 에피토프에 결합하는 추가의 항체
또 다른 구체예에서, ELISA 검정에서, 인간 NOGO 단백질에 결합할 수 있는, 항체, 또는 이의 단편, 또는 이의 단편(예컨대, GST-NOGO-A56 단백질(서열번호 32))이 제공되는데, 여기서 항체, 또는 이의 단편의 인간 NOGO 단백질, 또는 이의 단편에 대한 결합은 ELISA 검정에서 다음 서열 VLPDIVMEAPLN(서열번호 60)을 지니는 펩티드의 존재시 감소되며, 무관한(irrelevant) 펩티드, 예를 들어, 서열번호60(예컨대, 서열번호 85, YESIKHEPENPPPYEE)와 중접되지 아니하는 인간 NOGO로부터의 펩티드의 존재시 감소되지 아니하는데, 상기 항체 또는 이의 단편은 CDR H3에 아미노산 잔기 GQGY 또는 1개의 아미노산 치환을 지니는 이의 유사체로 구성되는 CDR H3를 지니는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체가 아니라는 점을 특징으로 한다. 대안적으로, 경쟁 펩티드는 TPSPVLPDIVMEAPLN(서열번호 73) 또는 VLPDIVMEAPLNSAVP(서열번호 74)이다. 또한, 상기 항체, 또는 이의 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 표 1과 2에 나열된 모든 CDR을 포함하지 아니하는 항체이거나 조합된 표 1과 2 또는 단독의 표 1 또는 2에 나열된 CDR과 80% 이상의 상 동성을 지니는 CDR의 세트를 포함하는 임의의 항체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, ELISA 검정에서 폴리펩티드 서열 VLPDIVMEAPLN(서열번호 60)로 구성된 인간 NOGO 단백질의 영역에 결합할 수 있는, 항체 또는 이의 단편이 제공되는데, 상기 항체, 또는 이의 단편은 아미노산 잔기 GQGY로 구성된 CDR H3 또는 상기 CDR H3내에 1개의 아미노산 치환을 지니는 이의 유사체로 구성된 CDR H3를 지니는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항체가 아님을 특징으로 한다. 대안적으로, 상기 항체 또는 이의 단편은 TPSPVLPDIVMEAPLN(서열번호 73) 또는 VLPDIVMEAPLNSAVP(서열번호 74)에 결합할 수 있다. 또한, 상기 항체, 또는 이의 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 표 1과 2에 나열된 모든 CDR을 포함하지 아니하는 항체이거나 조합된 표 1과 2 또는 단독의 표 1 또는 2에 나열된 CDR과 80% 이상의 상동성을 지니는 CDR의 세트를 포함하는 임의의 항체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 인간 NOGO 에피토프 VLPDIVMEAPLN(서열번호 60)에 결합하는 항체, 또는 이의 결합 단편을 획득하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 상기 펩티드로 포유동물을 면역화(immunising)시키는 단계 및 상기 펩티드에 결합하는 항체를 생산할 수 있는 세포를 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 인간 NOGO 에피토프 VLPDIVMEAPLN(서열번호 60)에 결합하는, 동정된 항체, 또는 이의 결합 단편을 획득하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 복수의 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 각각의 항체 또는 이의 결합 단편은 NOGO 에피토프 VLPDIVMEAPLN(서열번호 60)에 대한 상기 항체, 또는 이의 결합 단편의 결합에 의해, 상기 항체 또는 이의 결합 단편을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열과 더불어 상기 라이브러리로부터 동정됨을 특징으로 한다.
약제 조성물
본 발명의 추가 양상은 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 더불어 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 등가체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 뇌졸중(특히, 허혈성 뇌졸중) 및 기타 신경 질환, 특히 알츠하이머병의 치료 또는 예방 방법, 및 인간에서, CNS에 대한 기계적 트라우마로(예컨대, 척수 손상) 고통받고 있는 환자에 대한 치료법을 제공하는데, 치료가 요구되는 상기 인간에게 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 기능적 단편을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 뇌졸중(특히, 허혈성 뇌졸중) 및 기타 신경 질환, 특히 알츠하이머병의 치료 또는 예방을 위한 약제 및 CNS에 대한 기계적 트라우마로(예컨대, 척수 손상) 고통받고 있는 환자에 대한 치료를 위한 약제 제조시의 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 기능적 단편의 용도를 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 뇌졸중(특히, 허혈성 뇌졸중) 또는 다른 신경학적 질환, 특히 알츠하이머병을 앓고 있거나, 상기 질환에 대한 발병 위험을 지니고 있는 인간 환자에서 신경퇴행을 억제하고/하거나 기능적 회복을 촉진하는 방법 및 CNS에 대한 기계적 트라우마로(예컨대, 척수 손상) 고통받고 있는 환자에 대한 치 료법을 제공하는데, 치료가 필요한 상기 인간에게 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 기능적 단편을 투여하는 단계를 포함한다.
아직 추가의 양상에서, 본 발명은 뇌졸중(특히, 허혈성 뇌졸중) 또는 다른 신경학적 질환, 특히 알츠하이머병을 앓고 있거나, 발병 위험을 지니고 있는 인간 환자에서 신경퇴행을 억제하고/하거나 기능적 회복을 촉진하기 위한 약제 및 CNS에 대한 기계적 트라우마로(예컨대, 척수 손상) 고통받고 있는 환자의 치료를 위한 약제 제조시의 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 기능적 단편의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 양상 및 이점은 상세한 설명 및 이의 바람직한 구체예에서 추가로 설명된다.
본 발명의 중쇄 가변 영역은 천연 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 등가물의 구조로 형상화될 수 있다. 따라서, 항체는 적절한 경쇄와 쌍을 이루게 될 때, 전장 길이 항체, (Fab)2 단편, Fab 단편, 또는 이의 등가물(예컨대, scFV, 이량체, 삼량체, 또는 사량체, 탄댑(Tandabs) 등)로 구성된 본 발명의 VH 영역를 포함할 수 있다. 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4; 또는 IgM; IgA, IgE 또는 IgD 또는 이의 변형된 변이체일 수 있다. 항체 중쇄의 불면 영역은 적절히 선택될 수 있다. 경쇄 불변 도메인은 카파 또는 람다 불변 도메인일 수 있다. 더욱이, 항체는 모든 부류의 변이, 예를 들어, IgG 이량체, Fc 수용체에 더이상 결합하지 못하거나 CIq 결합을 더 이상 조절하지 못하는 Fc 돌연변이체를 포함할 수 있다. 항체는 또한 국제공개공보 WO86/01533호에 소개된 유형의 키메라 항체일 수 있는데, 상기 항체는 항원 결합 영역 및 비-면역글로불린 영역을 포함한다.
불변 영역은 요구되는 기능성(functionality)에 따라서 선택된다. 정상적으로, IgG1은 보체(complement)에 대한 결합을 통해 분해(lytic) 활성을 나타내고/내거나 ADCC(antibody dependent cell cytotoxicity)를 매개할 것이다. 비-세포독성 블록킹 항체가 요구되는 경우 IgG4가 바람직할 것이다. 그러나, Ig4 항체는 생성시 불안정성을 나타낼 수 있으며 따라서 일반적으로 더 안정한 IgG1을 변형시키는 것이 더 바람직할 수 있다. 제안된 변이는 EP0307434호에 소개되어 있으며, 바람직한 변이는 위치 235 및 237에서의 변이를 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체의 분해 또는 비분해 형태를 제공한다.
따라서, 바람직한 형태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 중쇄 가변 영역을 지니는 전장 길이(즉, H2L2 사량체) 비분해성 IgG1 항체이다.
추가 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 것과 같은 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
"NOGO"는, 변이체 형태를 포함하는, 임의의 NOGO 폴리펩티드를 의미한다. 이것은, 이에만 국한되는 것은 아니지만, 1192개의 아미노산 잔기(젠뱅크 접근 번호 AJ251383)를 지니는 NOGO-A; 추정되는 세포외 도메인(젠뱅크 접근 번호 AJ251384) 내의 잔기 186 내지 1004가 결여된 스플라이스 변이체인, NOGO-B 및 잔기 186 내지 1004가 역시 결여되어 있고 또한 더 작은, 또 다른 아미노 말단 도메인(젠뱅크 접근 번호 AJ251385)(Prinjha et al.(2000) 전게서)을 지니는, 더 짧은 스플라이스 변이체인, NOGO-C를 포함한다. 본원에서 "NOGO"에 대한 모든 레퍼런스는, 특정 형태가 명시되지 아니한 경우, 임의 형태 및 모든 형태의 NOGO 변이체(예컨대, NOGO-A)와 기재된 스플라이스 변이체를 포함한다는 것이 이해된다.
"중화(Neutralising)" 및 이의 문법적 변형표현은, 뉴런에 대한 NOGO의 결합 및 신경돌기 성장의 억제를 포함하는, NOGO 기능의, 전체적 또는 부분적, 억제를 의미한다.
용어 Fv, Fc, Fd, Fab, 또는 F(ab)2는 이들의 통상의 의미로 사용된다(참조예: Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,(1988)).
"키메라 항체"는 수용체 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 연결되는 도너 항체로부터 유래된 천연적으로 생성되는 가변 영역(경쇄 및 중쇄)을 포함하는 조작된 항체의 유형을 의미한다.
"인간화된 항체"는 비인간 도너 면역글로불린으로부터 유래된 항체의 CDR을 지니는 조작된 항체의 유형을 의미하는데, 상기 항체 분자의 나머지 면역글로불린-유래 부분은 하나(또는 그 이상)의 인간 면역글로불린(들)로부터 유래된다. 또한, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화력을 유지하도록 변형될 수 있다(예를 들어, 다음 문헌을 참조하라: Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032(1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421(1991)). 적당한 인간 수용체 항체는, 도너 항체(이 경우, 뮤린 도너 항체 2A10)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 의해, 통상적인 데이터베이스, 예를 들어, 카바트(KABAT®) 데이터베이스, 로스 알라모스(Los Alamos) 데이터베이스, 및 스위스 프로테인(Swiss Protein) 데이터베이스로부터 선택된 항체일 수 있다. 도너 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동성으로 특징지워지는 인간 항체는(아미노산 기초) 도너 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하기 위해 적합화될 수 있다(수용체 프레임워크로 삽입하기 위한 2A10 CDR에 관해 표 1을 참조하라). 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 공여(donating)할 수 있는 적당한 수용체 항체가 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 수용체 항체 중쇄 및 경쇄는 동일한 수용체 항체로부터 기원될 필요가 없다는 것에 주목하여야 한다. 종래 기술은 그러한 인간화 항체를 생산하기 위한 몇몇 방법을 소개하고 있다 - 예를 들어, 다음 문헌을 참조하라: EP-A-0239400호 및 EP-A-054951호.
용어 "도너 항체"는 이의 가변 영역, CDR, 또는 기타 기능적 단편 또는 유사체의 아미노산 서열을 인간화 항체에 부여(contribution)하고, 그에 따라 상기 도너 항체의 특징인 항원 특이성 및 중화 활성을 상기 인간화 항체에 제공하는 비인간 항체를 의미한다.
용어 "수용체 항체"는 도너 항체와 이종기원의 항체를 의미하는데, 이의 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 이의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 인간화된 항체에 제공한다. 수용체 항체는 임의의 포유동물에서 유래될 수 있는데, 단 인간에서 비-면역원성임을 조건으로 한다. 바람직하게는, 수용체 항체는 인간 항체이다.
대안적으로, 인간화는 "버니어링(veneering)" 과정에 의해 이루어질 수 있다. 특유한 인간 및 뮤린 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 통계적 분석은 노출된 잔기들의 정밀한 패턴들이 인간과 뮤린 항체에서 서로 다르며, 개별 표면 위치의 대부분은 소수의 상이한 잔기들에 대한 강한 선호도를 지닌다는 것을 밝혀내었다(하기 문헌 참조바람: Padlan E. A. et al.(1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 및 Pedersen J. T. et al.(1994) J. Mol. Biol. 235; 959-973). 따라서, 비인간 Fv의 면역원성은 이의 프레임워크 영역의 노출된 잔기들을 인간 항체에서 일반적으로 발견되는 잔기들과 상이한 잔기들로 대체함으로써 감소시키는 것이 가능하다. 단백질 항원성은 표면 접근성(surface accessibility)과 상호관련이 있을 수 있으므로, 표면 잔기들의 대체는 인간 면역 체계에 의해 "분간할 수 없는(invisible)" 생쥐 가변 영역이 되게 하는데 충분할 수 있다(다음 문헌을 또한 참조바람: Mark G. E. et al.(1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp105-134). 이러한 인간화 과정은 "버니어링"으로 지칭되는데, 단지 항체의 표면만 변형되고, 지지 잔기들은 비변형된(undisturbed) 상태로 유지되기 때문이다. 추가의 대안적인 접근법은 국제공개공보 WO04/006955호에 설명되어 있다.
"CDR"은 항체의 상보성결정지역 아미노산 서열로 정의되는데, 상기 CDR은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고도가변(hypervariable) 영역이다. 다음 문헌을 참고하라: 예를 들어, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health(1987). 면역글로불린의 가변 부분에 3가지 중쇄 및 3가지 경쇄 CDR(또는 CDR 영역)이 존재한다. 따라서, 본원에 사용된 "CDR"은 3가지 모든 중쇄 CDR, 또는 3가지 모든 경쇄 CDR(또는, 적절한 경우, 3가지 중쇄 및 3가지 경쇄 CDR 둘 모두)를 의미한다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 다른 잔기들이 항원 결합 영역의 일부분으로 고려된다는 것을 의미할 수 있으며 따라서 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 다음 문헌을 참조하라: 예를 들어, Chothia et al.,(1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883.
이특이성(Bispecific) 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 항체이다. 그러한 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이특이성 항체의 재조합적 생산은 2개의 면역글로불린 H 사슬-L 사슬 쌍의 동시발현(coexpression)에 기초하는데, 여기서 상기 2개의 H 사슬은 상이한 결합 특이성을 지닌다(다음 문헌을 참조하라: Millstein et al., Nature 305 537-539(1983), WO93/08829호 및 Traunecker et al. EMBO, 10, 1991, 3655-3659). H 및 L 사슬의 무작위 분류(assortment)로 인해, 10가지 상이한 항체 구조물의 잠잭적 혼합체가 생산되는데, 단지 한개만 요망되는 결합 특이성을 지닌다. 대안적인 접근법은 요망되는 결합 특이성을 지니는 가변 도메인을 적어도 힌지 영역의 일부분, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역에 융합시키는 것을 포함한다. 융합체(fusions) 중 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 CH1 영역을 지니는 것이 바람직하다. 이러한 융합체를 엔코딩하는 DNA, 및 요망되는 경우, L 사슬이 별개의 발현 벡터에 삽입되며, 이후 적당한 숙주 개체로 코트랜스펙션(cotransfection)된다. 2개 또는 3개 모두의 사슬에 대한 코딩 서열을 한개의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다. 바람직한 한 접근법에서, 이특이성 항체는 한쪽 팔(arm)에 제 1 결합 특이성을 갖는 H 사슬 및, 다른 한쪽 팔에 제 2 결합 특이성을 제공하는, H-L 사슬 쌍으로 구성된다(국제공개공보 WO94/04690호를 참조하라). 또한 다음 문헌을 참조하라: Suresh et al. Methods in Enzymology 121, 210, 1986.
본 발명의 한 구체예에서, 이특이성 치료 항체가 제공되는데, 여기서 적어도 하나의 결합 특이성을 보유한 상기 항체는 서열번호 60으로 기재된 에피토프에서 인간 NOGO에 결합한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 이특이성 항체는 중쇄 가변 영역 CDR H3 서열 MQGY(서열번호 45)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이특이성 항체는 하기 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 쌍을 포함한다: H27L16(서열번호 48 + 서열번호 14), H28L13(서열번호 49 + 서열번호 13) 또는 H28L16(서열번호 49 + 서열번호 14).
본 발명의 항체는 본 발명의 항체에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 트랜스펙션시킴으로써 생산될 수 있다. 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는 숙주 세포 내에서 복제와 발현을 조절하고/하거나, 숙주 세포로부터 분비를 조절할 수 있는 통상의 제어 조절 서열(regulatory control sequence)과 작동적으로 연결되게 항체에 대한 이러한 코딩 서열을 배치함으로써 생산된다. 조절 서열은 프로모터 서열, 예를 들어, CMV 프로모터, 및 신호 서열(이는 공지의 다른 항체로부터 유래될 수 있음)을 포함한다. 유사하게, 상보적인 항체 경쇄 또는 중쇄를 엔코딩하는 DNA 서열을 지니는 제 2 발현 벡터가 생산될 수 있다. 바람직하게, 이 제 2 발현 벡터는, 각각의 폴리펩티드 사슬이 가능한한 확실하게 기능적으로 발현되도록 하기 위해, 코딩 서열과 선별 마커와 관련된 경우를 제외하고, 제 1 발현 벡터와 동일하다. 대안적으로, 변형된 항체에 관한 중쇄 및 경쇄 코딩 서열은 단일의 벡터에 놓일 수 있다.
선택된 숙주 세포는 제 1 및 제 2 벡터 둘 모두를 통상적인 기술로 코트랜스펙션시켜(또는 단순히 단일의 벡터로 트랜스펙션시켜) 재조합 또는 합성 경쇄 및 중쇄 둘 모두를 포함하는 본 발명의 트랜스펙션된 숙주 세포를 제조할 수 있다. 트랜스펙션된 세포는 이후 통상의 기술로 배양되어 본 발명의 조작된 항체를 생산한다. 재조합 중쇄 및/또는 경쇄 둘 모두의 결합을 포함하는 항체는 적절한 검정, 예컨대, ELISA 또는 RIA에 의해 배양물로부터 스크리닝된다. 유사한 통상의 기술이 다른 변형된 항체 및 분자를 제작하는데 이용될 수 있다.
한가지 유용한 발현 시스템은 글루타메이트 합성효소 시스템(예컨대, 론자 바이올로지즈(Lonza Biologies) 사(社)에 의해 판매되는 시스템)인데, 특히 숙주 세포는 CHO 또는 NSO이다(하기 참조). 항체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 이용함으로써 용이하게 동정되며 시퀀싱된다(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브). 사용될 수 있는 벡터는 플라스미드, 바이러스, 파지, 트랜스포손, 미니염색체를 포함하며, 이들 중 전형적인 구체예는 플라스미드이다. 일반적으로 그러한 벡터는 발현을 촉진하기 위해 추가로 경쇄 및/또는 중쇄 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 엘리먼트, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 경쇄 및 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 별개의 벡터에 삽입되고 동일한 숙주 세포로 도입(예를 들어, 전기천공에 의해)되거나, 요망되는 경우, 중쇄 및 경쇄 둘 모두가 트랜스펙션을 위한 동일한 벡터를 통해 숙주 세포내로 삽입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에 따라, 본 발명의 치료 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 및/또는 중쇄를 엔코딩하는 벡터를 제작하기 위한 방법이 제공되는데, 상기 방법은 벡터내로 본 발명의 치료 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 둘 중 어느 하나를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 서열번호 47, 48 또는 49로 기재되는 서열을 지니는 인간화 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 구체예에서, 서열번호 53, 54 또는 55로 기재되는 서열을 지니는 인간화 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
당업계의 통상의 기술자는 유전자 코드의 잉여성(redundancy)으로 인해, 본원에 소개된 폴리뉴클레오티드에 대한 대안적인 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는데 유용할 것임을 즉각적으로 인지할 것이다.
본 발명의 방법과 조성물 작제에 이용되는 적당한 클로닝과 서브클로닝 단계는 당업계의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 통상적인 클로닝 벡터의 pUC 시리즈가 사용될 수 있다. 한 벡터, pUC19는 공급 업체, 예컨대, Amersham(Buckinghamshire, 영국) 또는 Pharmacia(Uppsala, 스웨덴)으로부터 구매할 수 있다. 추가적으로, 용이하게 복제시킬 수 있고, 충분한 클로닝 부위 및 선별 유전자(예를 들어, 항생제 내성 유전자)를 지니며, 손쉽게 조작되는, 임의의 벡터가 클로닝에 사용될 수 있다. 따라서, 클로닝 벡터의 선택은 본 발명에 있어서 제한 요소가 아니다.
다른 바람직한 벡터 서열은 폴리A(poly A) 신호 서열, 예컨대, 소 성장 호르몬(BGH) 및 베타클로빈 프로모터 서열(베타글로프로(betaglopro))로부터 유래된 신호 서열을 포함한다. 본원에서 유용한 발현 벡터는 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 기술로 합성될 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메쏘트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나 (b) 영양요구성 결핍을 보충하거나 복합 배지에서 이용할 수 없는 영양성분을 공급하는 단백질을 엔코딩한다. 선별 체계(Selection scheme)는 숙주 세포의 성장을 지체시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 치료 항체를 엔코딩하는 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는, 예를 들어, 선별 마커에 의해 부여된 약제 내성으로 인해 살아남게 된다. 또 다른 예는 소위 DHFR 선별 마커인데, 형질전환체는 메쏘트렉세이트의 존재하에 배양된다. CHO 세포는 DHFR 선별에 특히 유용한 세포주이다. 형질전환된 숙주 세포를 선별하고 도입유전자(transgene)의 세포 복제수를 증폭시키는 방법은 DHFR 시스템을 사용하는 것을 포함한다(다음 문헌을 참조하라: Kaufman R.J. et al. J. Mol. Biol.(1982) 159, 601-621.; 검토를 위해, 다음 문헌을 참고하라: Werner RG, Noe W, Kopp K.ScH1uter M," Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug). 추가적인 예는 글루타메이트 합성효소 발현 시스템(Lonza Biologies)이 있다. 효모에서 사용하기 적당한 선별 유전자는 trp1 유전자이다(다음 문헌을 참조하라: Stinchcomb et al. Nature 282, 38, 1979).
이와 같은 벡터의 성분들, 예를 들어, 레플리콘, 선별 유전자, 인핸서, 프로모터, 신호 서열 등은 상업적 또는 천연적 공급원으로부터 획득되거나 선택된 숙주 내에서 재조합 DNA 생성물의 발현 및/또는 분비를 유도하는데 이용되는 공지의 절차에 의해 합성될 수 있다. 포유동물, 박테리아, 곤충, 효모, 및 진균 발현용으로 당업계에 공지되어 있는 수많은 유형의 다른 적절한 발현 벡터가 이러한 목적을 위해 선택될 수도 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 등가물의 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드로 트랜스펙션된 세포주를 포함한다. 이러한 클로닝 벡터의 클로닝 및 기타 조작에 유용한 숙주 세포는 또한 통상적인 것이다. 그러나, 가장 바람직하게는, 다양한 대장균 종에서 나온 세포가 클로닝 벡터의 복제단계 및 본 발명의 변형된 항체 제작시의 다른 단계에 사용된다.
본 발명의 항체의 발현에 적당한 숙주 세포 또는 세포주는 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대, NSO, Sp2/0, CHO(예를 들어, DG44), COS, 섬유아세포(예를 들어, 3T3), 및 골수종 세포이고, 더 바람직하게는 CHO 또는 골수종 세포이다. 인간 세포가 사용될 수 있는데, 그에 따라 분자는 인간 당화 패턴을 지니도록 변형될 수 있다. 대안적으로, 다른 진핵생물 세포주가 이용될 수 있다. 적당한 포유동물 숙주 세포의 선별 및 형질변형, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생산을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 다음 문헌을 참고하라: 예를 들어, 위에서 인용된 샘브룩 등의 문헌(Sambrook et al.).
박테리아 세포는 본 발명의 항체 또는 이의 단편(예컨대, 재조합 Fab 또는 ScFv)의 발현에 적당한 숙주 세포로서 유용할 것이다(다음 문헌을 참고하라: 예를 들어, Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188(1992)). 그러나, 박테리아 세포에서 발현된 단백질은 비폴딩된 형태 또는 부적절하게 폴딩된 형태 또는 비-당화된 형태로 되는 경향으로 인하여, 박테리아 세포에서 생산된 임의의 재조합 단편은 항원 결합 활성의 보유에 대해 스크리닝되어야만 할 것이다. 박테리아 세포에 의해 발현된 분자가 적절히 폴딩된 형태로 생산된다면, 그러한 박테리아 세포는 바람직한 숙주가 될 것이다. 예를 들어, 발현에 사용되는 다양한 대장균 종이 생물공학 분야에서 숙주 세포로서 잘 알려져 있다. 다양한 종의 바실러스 섭틸리스(B. subtilis), 스트렙토미세스(Streptomyces), 다른 바실리(bacilli) 등이 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
요망되는 경우, 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 효소 세포 종이 또한 숙주 세포로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 곤충 세포, 예를 들어, 초파리 (Drosophila) 및 인시류(Lepidoptera) 및 바이러스 발현 시스템이 이용될 수 있다. 예를 들어, 밀러 등의 논문(Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press(1986)) 및 본원에서 인용된 참고문헌들을 참조하라.
벡터를 제작할 수 있는 일반적인 방법, 본 발명의 숙주 세포를 생산하기 위해 필요한 트랜스펙션 방법, 및 상기 숙주 세포로부터 본 발명의 항체를 생산하는데 필요한 배양 방법은 모두 관용 기술이다. 전형적으로, 본 발명의 배양 방법은 무혈청 배양 방법인데, 일반적으로 세포를 무혈청 현탁액 중에서 배양시킨다. 이와 마찬가지로, 일단 생산된, 본 발명의 항체는, 암모늄설페이트 침전, 친화력 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당업계의 표준 절차에 따라 세포 배양 내용물로부터 정제될 수 있다. 그러한 기술은 당업계의 공지 기술 이내의 것이고 본 발명을 제한하지 아니한다. 예를 들어, 항체의 제조법은 국제공개공보 WO 99/58679호와 WO 96/16990호에 소개되어 있다.
그러나 항체의 발현을 위한 또 다른 방법은 미국 특허 제 4,873,316호에 소개 된 방법과 같은, 유전자도입 동물에서의 발현을 활용할 수 있다. 이 방법은 동물의 카세인(casein) 프로모터를 이용한 발현 시스템과 관련되어 있는데, 상기 프로모터는, 유전자도입적으로(transgenically) 포유동물에 통합된 경우, 암컷으로 하여금 이의 유액(milk)으로 요망되는 재조합 단백질을 생산하도록 한다.
본 발명의 추가 양상에서, 본 발명의 항체를 생산하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 엔코딩하는 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 그에 따라 생산된 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 항체를 엔코딩하는 벡터를 클로닝하거나 발현시키는데 적당한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 세포 또는 고등한 진핵 세포이다. 적당한 원핵 세포는 진정세균(eubacteria), 예를 들어, 장내세균과(enterobacteriaceae), 예컨대, 대장균과(Escherichia)[예를 들어, 대장균(E. coli)(예를 들어, ATCC 31,446; 31,537; 27,325)], 엔테로박터(Enterobacter), 에르비니아(Erwinia), 크랩시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella)[예를 들어, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)], 세라티아(Serratia)[예를 들어, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)] 및 시겔라(Shigella)를 포함할 뿐만 아니라, 바실리(Bacilli)[예컨대, 바실러스 섭틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis)(DD 266 710호 참조)], 슈도모나스(Pseudomonas)[예컨대, 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa)] 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 효모 숙주 세포 중, 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스(Kluyveromyces)[예를 들어 ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500], 야로이야(yarrowia)(EP 402,226호), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070호, 및 펭 등(Peng et al. J. Biotechnol. 108(2004) 185-192)의 논문 참조), 칸디다(Candida), 트리코더마 리제이(Trichoderma reesia)(EP 244,234), 페니실린(Penicillin), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주[예컨대, 아스퍼질러스 니둘란스(A. nidulans) 및 아스퍼질러스 니거(A. niger)가 또한 고려된다.
원핵 및 효모 숙주 세포가 본 발명에서 특별하게 고려될지라도, 그러나, 전형적으로, 본 발명의 숙주 세포는 척추동물 세포이다. 적당한 척추동물 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대 COS-1(ATCC No. CRL 1650) COS-7(ATCC No. CRL 1651), 인간 배아 신장세포주 293, 새끼 햄스터 신장 세포(BHK)(ATCC CRL.1632), BHK570(ATCC NO. CRL 10314), 293(ATCC NO. CRL 1573), 중국 햄스터 난소 세포 CHO(예를 들어, CHO-K1(ATCC No. CCL 61), DHFR-CHO 세포주(예컨대, DG44(우르라웁 등의 논문 참조(Urlaub et al.,(1986) Somatic cell Mol. Genet. 12, 555-556)), 특히 현탁 배양에 적합한 그러한 CHO 세포주, 생쥐 세르톨리(Sertoli) 세포, 생쥐 신장 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(ATCC No. CRL-1587), HELA 세포, 갯과동물 신장 세포(ATCC No. CCL 34), 인간 폐 세포(ATCC No. CCL 75), Hep G2 및 골수종 또는 림프종 세포[예를 들어, NSO(미국 특허 제5,807,715호 참조), Sp2/0, YO]를 포함한다.
따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 본원에 소개된 것과 같은 치료 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 엔코딩하는 벡터를 포함하는 안정하게 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 전형적으로, 그러한 숙주 세포는 경쇄를 엔코딩하는 제 1 벡터 및 상기 중쇄를 엔코딩하는 제 2 벡터를 포함한다.
본 발명의 치료 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 엔코딩하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법으로 배양될 수 있다. 숙주 세포는 스피너(spinner) 플라스크, 롤러 병 또는 속빈(hollow) 섬유 시스템에서 배양될 수 있으나, 대규모 생산을 위해 현탁 배양에 특히 유용한 연속교반식 탱크 반응기(stirred tank reactors)를 사용하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 연속교반식 탱커는, 예를 들어, 공기취입기(spargers), 배플(baffles) 또는 저 전단응력 임펠러(low shear impellers)를 사용하여 에어레이션(aeration)에 적합하다. 기포 컬럼 및 공수반응기(airlift reactors)의 경우, 공기 또는 산소 기포를 이용한 에어레이션이 사용될 수 있다. 숙주 세포가 무혈청 배양 배지에서 배양될 경우, 에어레이션 과정의 결과에 따른 세포 손상을 방지하기 위해 상기 배지에 세포 보호제, 예컨대, 플루로닉(pluronic) F-68을 첨가하는 것이 바람직하다. 숙주 세포 특성에 따라서, 세포주 의존적 고착(anchorage)을 위한 성장 기질로서 미세담체(microcarriers)가 사용되거나 상기 세포들은 현탁 배양(전형적임)에 적합하게 될 수 있다. 숙주 세포, 특히 척추동물 숙주 세포의 배양은 다양한 작동 모드, 예컨대, 유가-배양(fed-batch), 반복적인 회분식 공정(드라피우 등의 문헌 참조(Drapeau et al.(1994) cytotechnology 15: 103-109)), 연장된 회분식 공정 또는 관류 공정(perfusion culture)을 활용할 수 있다. 재조합적으로 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 혈청-함유 배지, 예컨대, 송아지 태아 혈청(FCS)에서 배양될 수 있지만, 그러한 숙주 세포는 무혈청 합성 배지[예컨대, 킨 등의 문헌(Keen et al.(1995) Cytotechnology 17:153-163)에 소개된 배지], 또는 상업적으로 시판되고 있는 배지[예컨대, ProCHO-CDM 또는 UltraCHO™(Cambrex NJ, USA)]에서 배양되는 것이 바람직한데, 상기 배지에는, 필요한 경우, 글루코오스와 같은 에너지원 및 재조합 인슐린과 같은 합성 성장 인자가 보충된다. 숙주 세포의 무혈청 배양은 그러한 세포가 무혈청 조건에서 성장하도록 적응될 필요가 있을 수 있다. 한 적응 방법은 혈청을 함유한 배지에서 그러한 숙주 세포를 배양하고 반복적으로 80%의 배양 배지를 무혈청 배지로 교환하여 숙주 세포가 무혈청 조건에 적응하할 수 있게 학습시키는 것이다(참조: 예를 들어, 샤르펜베르그 등의 문헌(Scharfenberg K et al.(1995) in Animal cell technology: Developments towards the 21st century(Beuvery E. C. et al. eds), pp.619-623, Kluwer Academic publishers)).
배지내로 분비되는 본 발명의 항체는 회수되고 의도된 용도에 적합한 정제도를 제공할 수 있는 다양한 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 인간 환자의 치료를 위해 사용되는 본 발명의 치료 항체는 95% 이상의 순도, 더 전형적으로는 98% 또는 99% 순도를 요구한다. 첫번째 경우에, 배양 배지로부터의 세포 파쇄물(debris)은 전형적으로 원심분리에 뒤이어 미세여과, 한외여과(ultrafiltration) 및/또는 심층 여과(depth filtration)를 이용하여 상등액의 정화(clarification) 단계에 의해 제거된다. 다양한 다른 기술들, 예컨대, 투석 및 겔 전기영동 및 크로마토그래피 기술[예컨대, 수산화인회석(HA), 친화력 크로마토그래피(선택적으로 폴리히스티딘과 같은 친화력 태그 시스템을 포함함)] 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC, 미국 특허 제 5,429,746호 참조)를 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 다양한 정화 단계를 거친 후, 본 발명의 항체는 단백질 A 또는 G를 사용한 친화력 크로마토그래피를 실행한 후 뒤이어 추가의 크로마토그래피 단계[예컨대, 이온 교환 및/또는 HA 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피 및 황산암모늄 침전]에 의해 포획된다. 전형적으로, 다양한 바이러스 제거 단계가 또한 채택될 수 있다(예: 예를 들어, DV-20 필터를 사용한 나노여과). 이러한 다양한 단계를 거친 후, 본 발명의 항체 또는 이의 결합 단편을 75mg/㎖ 이상 또는 예를 들어, 100mg/㎖ 이상 포함하는 정제된(전형적으로, 단일클론) 제조물이 제공되며, 따라서 본 발명의 구체예가 된다. 적합하게는, 그러한 제조물은 결집된 형태의 본 발명의 항체가 실질적으로 결여되어 있다.
본 발명에 따라서, 인간 NOGO-A에 특이적으로 결합하고 이의 활성을 중화시키는 본 발명의 항-NOGO 항체를 생산하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상기 항체의 중쇄를 엔코딩하는 제 1 벡터를 제공하는 단계;
(b) 상기 항체의 경쇄를 엔코딩하는 제 2 벡터를 제공하는 단계;
(c) 상기 제 1 및 제 2 벡터로 포유동물 숙주 세포(예를 들어, CHO)를 형질전환시키는 단계;
(d) 숙주 세포로부터 배양 배지내로 항체 분비가 유도되는 조건하에서 단계 (c)의 숙주 세포를 배양하는 단계;
(e) 단계 (d)의 분비된 항체를 수확하는 단계.
요망되는 방법에 의해 일단 발현된, 항체는 이후 적절한 검정을 이용하여 시험관내 활성에 대해 평가가 진행된다. 현재까지의 통상적인 ELISA 형태의 검정이 NOGO에 대한 항체의 질적 및 정량적 결합을 평가하는데 이용된다. 추가적으로, 또한 일반적인 소거 메카니즘에도 불구하고 체내에서 항체의 지속성을 평가하기 위해 수행되는 연이은 인간 임상 연구에 앞서 항체의 중화 효능을 입증하기 위해 다른 시험관내 검정을 이용할 수 있다.
본 발명의 항체에 대한 다른 변형은 본 발명의 항체의 당화 변이체를 포함한다. 항체의 불변 영역 내에 보존된 위치에서 항체의 당화는 항체 기능, 특히, 위에 기재한 것들과 같은 이팩터(effector) 기능에 중대한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 보이드 등의 문헌(Boyd et al.(1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318)을 참조하라). 하나 이상의 탄수화물 모이어티가 부가, 치환, 결실 또는 변형된, 본 발명의 치료 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 당화 변이체가 고려된다. 아스파라긴-X-세린 또는 아스파라긴-X-트레오닌 모티프의 도입은 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 잠재적인 부위를 생성시키고 그에 따라 항체의 당화를 조작하는데 이용될 수 있다. 라주 등의 문헌(Raju et al., 2001) Biochemistry 40, 8868-8876)에서, TNFR-IgG 면역어드헤신(immunoadhesin)의 말단 시알일화(sialyation)는 베타-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 및/또는 알파, 2,3-시알일트랜스퍼라제(sialyltransferase)를 이용한 재갈락토실화 및/또는 재시알일화의 과정을 거쳐 증가되었다. 말단 시알일화의 증가는 면역글로불린의 반감기를 증가시키는 것으로 생각된다. 대부분의 당단백질을 공통적으로 지니는, 항체는 전형적으로 천연에서 당화형태의 혼합물로서 생산된다. 이러한 혼합물은 항체가 진핵 세포, 특히 포유동물 세포에서 생산되는 경우 특히 명백하다. 규정된 당화형태를 제조하기 위한 다양한 방법이 개발되었다(다음 문헌을 참조하라: Zhang et al. Science(2004), 303, 371, Sears et al., Science,(2001) 291, 2344, Wacker et al.(2002) Science, 298 1790, Davis et al.(2002) Chem. Rev. 102, 579, Hang et al.(2001) Acc. Chem. Res 34, 727). 따라서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 당화형태(들)을 규정된 갯수(예를 들어 7개 이하, 예를 들어, 5개 이하(예컨대, 2개 또는 1개)로 포함하는, 본원에 소개된 것과 같은 복수의 치료(전형적으로, 단일클론) 항체(IgG 아형(isotype), 예를 들어, IgG1일 수 있음)에 관심을 집중한다.
본 발명의 치료 제제는 예방 제제로서 또는 뇌졸중 사건의 발생후/임상적 증상의 발병 후, 또는 달리 필요에 따라, 투여될 수 있다. 용량 및 치료 지속기간은 본 발명의 분자의 인체 순환시의 상대적인 지속 기간과 관련되어 있으며, 치료되어야 하는 병태 및 환자의 전반적인 건강 상태에 따라서 당업계의 통상의 기술자에 의해 조정될 수 있다. 연장된 기간(예들 들어, 4 내지 6개월) 내내 반복된 투여(예를 들어, 1주에 1회 또는 2주마다 1회)는 최적의 치료 효능을 달성하는데 필요할 수 있다.
본 발명의 치료 제제의 투여 양상은 숙주에 상기 제제를 전달하는데 적당한 임의의 경로를 택할 수 있다. 본 발명의 항체, 및 약제 조성물은 비경구 투여, 즉, 피하로(s.c), 척수내로(intrathecally), 복막내로(i.p.), 근육내로(i.m.), 정맥내로(i.v.), 또는 비내로(i.n.) 투여하는데 특히 유용하다.
본 발명의 치료 제제는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 유효 성분으로서 유효량의 본 발명의 항체를 함유한 약제 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 예방 제제에서, 조작된 항체(바람직하게는 주사를 위해 준비된 형태로, 생리적 pH에서 완충된 항체)를 포함한 수성 현탁액 또는 용액이 바람직하다. 비경우 투여를 위한 조성물은 약제학적으로 허용된 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해된 본 발명의 항체 또는 이의 칵테일 용액을 공통적으로 포함할 것이다. 다양한 수성 담체가 사용될 수 있는데, 예를 들어, 0.9% 염수, 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 멸균되며 일반적으로 미립자 물질이 결여되어 있다. 이러한 용액은 통상적인, 널리 알려져 있는 멸균 기술(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리 조건에 근접시킬 필요가 있음에 따라, pH 조정제 및 완충제 등과 같은 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 포함할 수 있다. 그러한 약제 제형에서 본 발명의 항체의 농도는 폭넓게 다양할 수 있는데, 즉, 중량 기준으로 약 0.5% 이하, 일반적으로 1% 또는 약 1% 이상으로부터 15 또는 20% 정도까지 다를 수 있으며, 선택된 특정 투여 양상에 따라서, 유체 부피, 점성 등에 주로 기초하여 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제 조성물은 1㎖ 멸균 완충수, 및 약 1ng 내지 약 100㎎, 예를 들어, 약 50ng 내지 약 30㎎ 또는 더 바람직하게는, 약 5㎎ 내지 약 25㎎의 본 발명의 항체를 포함하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주사를 위한 본 발명의 약제 조성물은 약 250㎖의 링거 용액, 및 링거 액 ㎖ 당 1㎎ 내지 약 30㎎, 바람직하게는 5㎎ 내지 약 25㎎의 본 발명의 조작된 항체를 포함하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제적인 방법은 널리 알려져 있거나 당업계의 통상의 기술자에게 자명할 것이며, 예를 들어, 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 더 상세히 기재되어 있다. 정맥내로 투여가능한 본 발명의 항체 제형의 제조를 위해 다음 문헌을 참조하라: Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products," Pharma. Sci. Tech. today, page 129-137, Vol.3(3rd April 2000); Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals," Int. J. Pharm 185(1999) 129-188; Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahem T. J., Manning M. C, New York, NY: Plenum Press(1992), Akers. M. J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations," J. Pharm Sci 91(2002) 2283-2300; Imamura, K et al. "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state," J Pharm Sci 92(2003) 266-274; lzutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying," J Pharm. Pharmacol, 54(2002) 1033-1039; Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization," J. Pharm. Sci, 91(2002) 914-922.
문헌(Ha, E Wang W, Wang YJ. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264(2002))의 전체 내용은 본원에서 참고문헌으로 인용되며 이의 독자들에 의해 특별히 참조된다.
약제 제조물에서, 본 발명의 지료 제제는 단위 용량 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 치료적으로 적절한 유효 용량은 당업계의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 것이다. 인간에서 뇌졸중 및 다른 신경 질환을 효과적으로 치료하기 위해, 본 발명의 항체는 70kg의 체중 당 700 내지 3500㎎ 범위내의 용량으로 비경구적으로, 바람직하게는, 피하로(s.c), 정맥내로(i.v.), 또는 근육내로(i.m.) 투여될 것으로 생각된다. 그러한 용량은, 필요하다면, 내과의사에 의해 적절하게 선택된 적절한 시간 간격으로 반복 투여될 수 있다.
본원에 기재된 항체는 저장을 위해 동결건조될 수 있으며 사용전에 적당한 담체 중에서 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린에 유효한 것으로 제시되었으며 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 이용될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 뇌졸중 및 다른 신경 질환의 치료 또는 예방을 위해 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 기능적 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
아직 추가의 양상에서, 본 발명은 뇌졸중 또는 다른 신경학적 질환으로 고통받고 있거나, 뇌졸중 또는 다른 신경학적 질환에 걸릴 위험이 있는 인간 환자에서, 신경퇴행을 억제하고/하거나 기능적 회복을 촉진하기 위한 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 기능적 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 기능적 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 인간의 뇌졸중(특히 허혈성 뇌졸중) 및 다른 신경 질환/장애, 특히 알츠하이머병의 치료 또는 예방 방법을 제공하는데, 상기 방법은 치료가 필요한 상기 인간에게 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 기능적 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 항체는 알츠하이머병의 진행(progression) 및/또는 발병을 지연시키거나 정지시키기 위한 치료 방법으로 또한 인간 환자에 있어서 기존의 질환을 치료하기 위한 치료 방법으로(또는 대안책으로) 사용될 수 있다.
추가로 본 발명은 뇌졸중 및 다른 신경 질환/장애, 특히 알츠하이머병의 치료 또는 예방을 위한 약제 제조시, 본 발명의 항-NOGO 항체, 또는 이의 기능적 단편의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 뇌졸중 또는 다른 신경학적 질환/장애, 특히 알츠하이머병으로 공통받고 있거나, 뇌졸중 또는 다른 신경학적 질환/장애, 특히 알츠하이머병에 걸린 위험이 있는 인간 환자에서, 신경퇴행을 억제하고/하거나 기능적 회복을 촉진하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 치료가 필요한 상기 인간 환자에게 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 기능적 단편을 투여하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 뇌졸중 및 다른 신경학적 질환/장애, 특히 알츠하이머병으로 고통받고 있거나 뇌졸중 및 다른 신경학적 질환/장애, 특히 알츠하이머병에 걸릴 위험이 있는 인간 환자에서 신경퇴행을 억제하고/하거나 기능적 회복을 촉진하기 위한 약제 제조시, 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 기능적 단편의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 인간의 뇌졸중 및 다른 신경학적 질환/장애, 특히 알츠하이머병의 치료 또는 예방 방법을 제공하는데, 상기 방법은 치료학적으로 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체의 비경구적 투여 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 항-NOGO 항체는 정맥내로 투여된다.
위에서 언급된 신경 질환 또는 장애는, 이에만 국한되는 것은 아니나, 트라우마성 뇌 손상, 척수 손상, 전두측두치매(타우파시), 말초신경장애, 파킨슨병, 헌팅톤병, 및 특히 알츠하이머병, 다발성경화증 또는 근위축성 측삭경화증(ALS)을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-NOGO 항체를 인간 액손에 접촉시키는 단계를 포함하는 액손 발아를 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있는데, 바람직하게는 상기 방법은 생체내에서 수행된다.
따라서, 추가 양상에서, 인간 환자에 있어서 뇌졸중(특히 허혈성 뇌졸중), 뇌 손상, 척수 손상, 전두측두치매(타우파시), 말초신경장애, 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성경화증 및 특히 알츠하이머병을 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 치료학적으로 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체의 정맥내 투여를 포함한다.
본 발명의 추가 양상에서, 인간 피검체(예를 들어, 환자)의 중추신경계 내부의 뉴런의 액손 발아를 촉진하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 치료학적으로 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체를 투여하는 단계(예를 들어, 정맥내로 투여하는 단계)를 포함한다.
본 발명의 추가 양상에서, 인간 환자에 있어서 뇌졸중(특히 허혈성 뇌졸중), 뇌 손상, 척수 손상, 전두측두치매(타우파시), 말초신경장애, 파킨슨병, 헌팅톤병, 및 특히 알츠하이머병, 다발성경화증 또는 근위축성 측삭경화증(ALS)의 치료를 위한 정맥내로 투여가능한 약제 제조시, 본 발명의 항-NOGO 항체(예를 들어, 본원에서 설명된 CDR을 포함하는 항-NOGO 항체)의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가 양상에서, 뇌졸중(특히 허혈성 뇌졸중), 뇌 손상, 척수 손상, 전두측두치매(타우파시), 말초신경장애, 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성경화증 및 특히 알츠하이머병으를 앓고 있는 인간 환자에 있어서 중추신경계의 뉴런의 액손 프로세스를 재생시키는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 치료학적으로 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체를 투여하는 단계(예를 들어, 정맥내로)를 포함한다.
본 발명의 추가 양상에서, 뇌졸중(특히 허혈성 뇌졸중), 뇌 손상, 척수 손상, 전두측두치매(타우파시), 말초신경장애, 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성경화증 및 특히 알츠하이머병(에 걸리기 쉽거나)으를 앓고 있는 인간 환자에 있어서 중추신경계의 뉴런의 액손 프로세스를 재생시키기 위한 정맥내로 투여가능한 약제 조성물의 제조시 본 발명의 항-NOGO 항체의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가 양상에서, 아밀로이드 형성(amyloidogenic) 펩티드의 생성을 조절하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 아밀로이드 형성 펩티드가 유래되는 전구체 및 NOGO 폴리펩티드(예를 들어, 인간 NOGO-A)를 발현하는 세포를 본 발명의 항-NOGO 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 전형적인 구체예에서, 전구체는 APP이다. 추가의 전형적인 구체예에서, 아밀로이드 형성 펩티드는 Aβ, 가장 바람직하게는 Aβ40, Aβ42 또는 상기 둘의 조합체이다.
본원에서 사용된, 용어 "기능적 회복"은 예를 들어, 허혈성 사건 또는 손상 또는 임상적 증상의 발병 후, 피검체에서 운동(motor) 및/또는 감각 및/또는 행동 개선을 의미한다. 인간에서 기능적 회복은 기초적인 신경학적 기능[예컨대, 운동 강도, 감지(sensation) 및 조정(coordination)], 인지 기능[예컨대, 기억, 언어 및 방향을 추적하는 능력], 및 기능적 능력(capacities)[예컨대, 기본적인 일상 생활 능력 또는 도구활용 능력]을 측정하기 위해 디자인된 장비에 의해 평가될 수 있다. 기초적인 신경학적 기능의 회복은 NIH 뇌졸중 스케일(NIHSS)과 같은 장비를 이용하여 측정될 수 있고, 인지 기능의 회복은 신경심리학적 테스트[예컨대, 보스톤 명명 검사(Boston Naming Test), 선-추적 검사(Trail-making Tests), 및 캘리포니아 언어 학습 검사(California Verbal Learning Test)]를 이용하여 측정될 수 있으며, 및 일상 생활 능력은 ADCS/ADL(Alzheimer's Disease Clinical Studies/Activities of Daily Living) 스케일 또는 브리스톨 일상생활 능력 스케일(Bristol Activities of Daily Living Scale)과 같은 장비를 이용하여 측정될 수 있는데, 상기 모든 검사 및 스케일은 당업계에 공지되어 있다.
하기 실시예들은 설명을 위해 기재된 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1. 인간화 항-NOGO 항체의 제작 및 발현
RId 및 RIn 포유동물 발현 벡터(또는 포유동물 세포에서 단백질의 발현에 적당한 임의의 다른 발현 벡터)내로의 클로닝을 위한 제한효소 부위뿐만 아니라, 인간 신호 서열을 포함하는 중첩(overlapping) 올리고뉴클레오티드를 구축하여 인간화 VH 및 VL 작제물을 새롭게(de novo) 제조하였다. ADCC 및 CDC 활성(L235A 및 G237A - EU 인덱스 넘버링 시스템)을 억제하기 위해 돌연변이된 인간 γ1 불변 영역을 내포하는 RId내로의 클로닝을 위한 캄패스(CAMPATH)-1H 신호 서열을 내포하는 VH 도메인을 만들기 위해 HindⅢ와 SpeI 제한효소 부위를 도입하였다. 인간 카파 불변 영역을 내포하는 RIn으로의 클로닝을 위한 캄패스-1H 신호 서열을 내포하는 VL 도메인을 만들기 위해 HindⅢ와 BsiWI 제한효소 부위를 도입하였다.
캄패스-1H 신호 서열: MGWSCIILFLVATATGVHS(서열번호:31)
CDR이 표 2에 기재된 CDR인, 인간 IgG 중쇄 아미노산 서열을 엔코딩하는 플라스미드를 생산하였다. CDR이 표 3에 기재된 CDR인, 인간 IgG 중쇄 아미노산 서열을 엔코딩하는 플라스미드를 퀵체인지(Quickchange) 키트(Stratagene)를 사용하여, 단일의 점 돌연변이, G95M(Kabat 넘버링)을 도입함으로써 기존의 초기 플라스미드로부터 생산하였다.
하기 표는 어떤 전장 길이 중쇄 단백질 서열이 플라스미드 벡터내에 만들어져 있는지와 어떤 서열들이 쌍을 이루었는지를 개시하고 있는데, 쌍을 이룬 전장 길이(FL) 중쇄 서열의 아미노산 서열에서 유일한 차이점은 가변 영역의 CDR H3 내부의 G95M(Kabat 넘버링)에서의 치환이었다:
Figure 112008051203250-PCT00015
중쇄를 엔코딩하는 플라스미드를 이후 다음 전장 길이 경쇄 서열 중 어느 하나와 함께 CHO 세포에 코트랜스펙션시켰다(상세한 내용에 대해서는 실시예 2 참조): L11 FL(서열번호 36), L13 FL(서열번호 17), 또는 L16 FL(서열번호 18).
병행하여, HcLc로 명명된 키메라(2A10(서열번호 9 및 10 - 2A10 뮤린 VH(서열번호 7) 및 VL(서열번호 8) 및 인간 IgG 불변 영역)을 포함하는 전장 길이 사슬) 의 키메라임)를 생산하였다.
실시예 2. CHO 세포에서 항체 발현
각각 엔코딩 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 RId 및 RIn 플라스미드(또는 포유동물 세포에서 사용하는데 적당한 다른 벡터)를 CHO 세포에 일시적으로 코트랜스펙션시키고 항체를 생산하기 위해 소규모 또는 대규모로 발현시켰다. 대안적으로, 동일한 플라스미드를 전기천공법에 의해 DHFR-CHO 세포에 코트랜스펙션시키고 적절한 항체를 발현하는 안정한 폴리클론 세포군을 무-뉴클레오시드(nucleoside-free) 배지를 사용하여 선별하였다(RId는 DHFR 유전자를 내포하고, RIn은 네오마이신 선별 마커를 내포한다). 몇몇 검정에서, 항체를 조직 배양물 상등액으로부터 직접적으로 평가하였다. 다른 검정에서, 재조합 항체를 회수하고 단백질 A 세파로즈 상의 친화력 크로마토그래피로 정제하였다.
실시예 3. NOGO에 결합하는 인간화 항-NOGO 항체
PBS 중에서 0.05-1㎍/㎖로 GST-인간 NOGO-A56(실시예 5 참조)을 밤새 4℃에서 눈크 면역흡착 플레이트(Nunc Immunosorp plates)(웰당 100㎕)에 코팅시켰다. 웰을 BS + 0.05% Tween(TBST)으로 한번 헹구고 나서 비특정 결합 부위를 차단하기 위해 실온에서 1시간 동안 TBST 중의 2% BSA와 함께 인큐베이션하였다. 항체를 TBST + 2% BSA 중에서 10㎍/㎖로 희석하고 이것으로부터 1/2 희석액을 제조하였다. 항체를 2회 반복하여 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 TBST로 3회 세척하고 나서 1시간 동안 항-인간 카파 퍼옥시다제 컨주게이트(1:2000)와 함께 인큐베이션하였다. 상기 웰을 TBST로 3회 세척하고 난 다음 10 분 동안 웰당 100㎕의 OPD 퍼옥시다제 기질(Sigma)과 함께 인큐베이션하였다. 착색 반응(Colour reaction)을 25㎕의 농축 H2SO4를 첨가하여 중단시켰다. 플레이트 판독기를 사용하여 490nm에서 광학밀도를 측정하였다. 항체를 지니지 않는 웰로부터 판독한 백그라운드 값을 제하였다.
도 1-4는 ELISA 검정에서 키메라(2A10의 키메라(2A10 뮤린 VH(서열번호 7) 및 VL(서열번호 8) 및 인간 IgG 불변 영역)을 포함함)인 HcLc로 명명됨)와 비교하여 GST-인간 NOGO-A56(상세한 내용과 관련하여 실시예 5를 참조)에 대한 인간화 항체의 용량-의존적 결합을 설명한다. Y-축은 웰에 포획된 항체에 대한 정량적 척도인, 490nm에서 측정된 광학 밀도(OD)를 나타낸다. X-축은 각각의 데이터 지점에서 웰 당 사용된 항체의 농도(mcg/㎖)를 나타낸다.
도 1-4에 사용된 항체 물질은 폴리클론 발현 시스템 또는 대규모 일시적 트랜스펙션에 의해 생산된 항체를 정제한 것이다. 이러한 경우에 있어서, IgG 레벨을 ELISA와 광학 밀도로 정량하였다.
도 1-4에 제시된 실험들로부터 획득한 결과는 포함된 G95M 돌연변이가 항체의 성능을 개선시킨다는 것을 보여준다. 유일한 예외는 매우 불완전하게 수행된 도 3과 4에 제시된 H27L16이다. 본 발명자들은 상기 데이터가 H27L16 검정에 수반된 미확인된 기술적 문제로 인해 초래된 것으로 생각하고 있는데, 그 이유는 H27L16는 다른 검정에서 상기 검정과 달리 합치되어 잘 수행되었기 때문이다(도 1과 2에 제시된 ELISA 에서, 그리고 비아코어 검정에서(표 9와 10)). H27L16는 또 한 추후 실험에서 매우 잘 작용하는 것으로 나타났다(도 11과 12 참조).
실시예 4. 항체 정량 프로토콜
눈크 면역흡착 플레이트에 중탄산염 완충액(Sigma #C3041) 중에서 염소 항-인간 IgG 사슬 포획 항체(Sigma #13382)를 2㎍/㎖로 코팅시키고 상기 플레이트를 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% Tween20(TBST)을 함유한 TBS로 2회 세척하고 실온에서 1시간 동안 2%(또는 1-3%) BSA(블록 완충액)를 함유한 200㎕ TBST로 블록킹시켰다. 플레이트를 TBST로 2회 세척하였다. 블록 완충액으로의 2-배 희석 단계에서 항체를 함유한 조직 포획 상등액에 상기 플레이트를 통과시켜 적정하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBST로 3회 세척하였다. HRP 컨주게이트된 항체 H23(염소 항-인간 카파 사슬, Sigma #A7164)을 TBST 중에서 1:2000으로 희석하고 각각의 웰에 100㎕를 첨가하였다. 플레이트들 실온에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBST로 3회 세척하고 100㎕의 Fast-OPD 기질(Sigma #P9187)로 성장(development)시켰다. 25㎕ 3M H2SO4로 ELISA를 종결시킨 바로 그 시간 이후, 5-10분 동안 색이 나타나게 하였다. 49Onm에서의 흡광도를 플레이트 판독기로 판독하고 표준 곡선을 레퍼런스 로 하여 항체 농도를 결정하였다.
실시예 5. NOGO-A 단편의 생성(NOGO-A56. 서열번호:32)
GST-인간-NOGO-A56로 지정된 GST-태그된 융합 단백질을 제조하기 위해, 인간 NOGO-A의 아미노산 586-785을 엔코딩하는 cDNA를 pGEX-6P1의 BamHI-Xhol 부위에 클로닝함으로써 인간 NOGO-A의 아미노산 586-785 및 GST 태그(서열번호 32)를 포함하 는 폴리펩티드를 엔코딩하는 cDNA 서열을 제작하였다. 플라스미드를 100㎍/㎖의 암피실린을 처리하고 3시간 동안 37℃에서 IPTG로 유도하여 2XTY 배지 중에서 BL21 세포내에서 발현시켰다. 세포 펠렛을 초음파분쇄로 분해하고 융합단백질을 제조업자의 지시사항에 따라 글루타치온-세파로즈(Amersham Pharmacia)를 사용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 감소된 글루타치온을 사용하여 용리시키고 PBS에 대해 완전히 투석시키고, BSA 표준(standards) 및 BioRad 쿠사미에 기반한 단백질 검정을 이용하여 정량하고 나서 -80℃에서 앨리쿼트로 저장하였다.
실시예 6. 인간화 항 NOGO 단일클론 항체에 대한 비아코어(BiaCore) 분석
재조합적으로 발현된 GST-인간 NOGO-A에 대한 항-NOGO 단일클론 항체(mAb)의 결합 동역학을 비아코어 3000 바이오센서 또는 비아코어 T100을 사용하여 분석하였다. hNOGO-A 칩을 하기와 같이 제조하였다:
방법
GST-인간 NOGO-A56을 목표로 삼은 고착 레벨을 위한 디자인된 비아코어 위저드 프로그램(Biacore Wizard program)을 사용하여 커플링된 1차 아민에 의해 CM5 칩에 고정시켰다. CM5 센서 표면을 5OmM N-히드록시-석신이미드(NHS) 및 20OmM N-에틸-N'-디메틸아미노프로필 카보나이드(EDC)의 용액에 통과시켜 활성화시켰다. 이후 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.0 또는 pH 4.5) 중의 GST-인간 NOGO-A56을 칩에 통과시켜 고착시켰다. 고착이 완료된 후, 임의의 여전히 활성화되어 에스터를 1M 에탄올아민 히드로클로라이드(pH 8.5)를 주입하여 블록킹시켰다.
항-NOGO mAb를 비아코어 3000의 경우에는 HBS-EP(1OmM HEPES, pH 7.4, 15OmM NaCI, 3mM EDTA, 및 0.005% P-20 계면활성제) 중에서 또는 T100의 경우에는 HBS-EP+(1OmM HEPES, pH 7.4, 15OmM NaCl, 3mM EDTA, 및 0.05% P-20 계면활성제) 중에서 희석시키고 결합 연구를 규정된 범위의 항체 농도에서 수행하였다. 모든 작업은 블랭크된 센서 표면(앞서 기재한 바와 같이 활성화 및 블록킹되었으나 리간드가 부가되지 아니한 표면)에 대해 대조되었다. 결합에 대한 분석을 비아코어 3000의 경우에는 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 동력학 분석 소프트웨어 버전 4.1을 사용하고 본 발명의 다른 항체에 대한 비아코어 분석의 경우에는 T100 동역학 분석 소프트웨어 버전 1.0을 사용하여 수행하였는데, 본원에 기재된 것과 동일한 프로토콜을 본질적으로 준수하였다. 달리 특별히 언급하지 않는한, 비아코어 실험은 25℃에서 수행되었다.
하기 결과 부분에서, 각각의 데이터 표는 개별 실험으로부터 획득한 결과를 나타낸다.
Figure 112008051203250-PCT00016
Figure 112008051203250-PCT00017
Figure 112008051203250-PCT00018
실시예 7: 오프-레이트 랭킹을 이용한 항 NOGO 단일클론 항체의 비아코어 분석
동역학 분석을 위한 용도로 GST-인간 NOGO-A56 칩을 제조하였다. 세포 상등 액을 일시적으로 트랜스펙션된 CHO-K1 세포에서 직접적으로 취했다. 상기 상등액을 센서 표면에 직접적으로 가하고 반응을 측정하였다. 조직 배양 배지로 인한 인위결과(artefacts)를 제거하기 위하여 이중 대조(double referencing)를 위한 목(mock) 트랜스펙션된 세포 상등액을 사용하였다. 모든 작업은 블랭크된 센서 표면(앞서 기재한 바와 같이 활성화 및 블록킹되었으나 리간드가 부가되지 아니한 표면)에 대해 대조되었다. 비아이밸류에이션 동역학 분석 소프트웨어 버전 4.1을 사용하여 결합에 대한 분석을 수행하였다.
실시예 8 : 펩티드 맵핑
GST-인간 NOGO-A56 도메인(서열번호 32)의 NOGO-A56 부분과 걸쳐 있는 47개의 중첩되는 펩티드를 입수하였다(Mimotope™로부터). 상기 펩티드는 C-말단에 GSG-비오시틴(biocytin)을 지니는 제 1 펩티드를 제외하고 인접 펩티드(각각의 펩티드는 N-말단에 비오틴-SGSG 서열을 추가로 포함함)와 중첩되는 12개의 아미노산을 수반하여 16개 아미노산 길이다. 상기 펩티드를 2A10 및 H28L16의 결합 부위, 에피토프를 맵핑하는데 사용하였다.
에피토프 맵핑 방법:
멸균수 중의 스트렙트아비딘을 5㎍/㎖로 37℃에서 밤새 눈크 면역흡착 플레이트 상에 코팅시켰다(웰당 100㎕). 플레이트를 0.05% Tween(PBST)를 함유하는 PBS로 3회 헹구고 나서 PBST 중의 3% BSA로 밤새 4℃에서 블로킹시켰다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 이후 펩티드를 대략 10㎍/㎖(PBST 중의 3% BSA로 희석됨)의 농도로 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 나서 PBST 중의 3% BSA로 5㎍/㎖까지 희석시킨 항-NOGO 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 나서 1시간 동안 항-인간 또는 항-생쥐 카파 퍼옥시다제 컨주게이트(1:1000, PBST 중에서 3% BSA로 희석시킴)와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 나서 10분 동안 웰 당 100㎕의 OPD 퍼옥시다제 기질(Sigma)와 함께 인큐베이션하였다. 50㎕ 3M H2SO4를 첨가하여 색 반응을 종결시켰다. 플레이트 판독기를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 5(H28L16를 사용한 에피토프 맵핑), 도 6(2A10를 사용한 에피토프 맵핑)에 제시되어 있다. 도 5와 6은 각각 2A10 및 H28L16의 에피토프 맵핑 결과를 보여준다. 제시된 데이터는 2A10과 H28L16이 펩티드 6과 7에 결합한다는 것을 나타내는데, 상기 펩티드의 NOGO 특이 부분은 각각 서열번호 73과 서열번호 74로 제시되어 있으며, 상기 서열 둘 모두는 서열 VLPDIVMEAPLN를 포함한다. 이러한 결과는 VLPDIVMEAPLN(서열번호 60)이 2A10과 H28L16의 결합 에피토프를 포함한다는 것을 제시한다.
실시예 9: CDR H3의 G95M 돌연변이를 포함하는 HcLc와 HcLc의 비교
HcLc의 변형된 변이체를 퀵체인지 키트(Stratagene)를 사용하여, 단일의 점 돌연변이, G95M(Kabat 넘버링)을 도입함으로써 기존의 발현 플라스미드로부터 제작하였다. 중쇄 가변 도메인 Hc(G95M) 단백질의 단백질 서열은 서열번호 59로 주어진다.
Hc(G95M)Lc를 이전에 기재한 바대로 CHO 세포에서 발현시켰다. 항체를 실시예 4에 기재한 바대로 정량하였다. 도 7과 도 8은 인간 NOGO-A 결합 ELISA를 사용하여 결정된 Hc(G95M)Lc와 HcLc의 결합 활성 비교를 보여주는데, 이때 NOGO는 눈크 면역흡착 플레이트에 0.05(도 7) 및 1㎍/㎖(도 8)로 코팅되었다. 하기 표는 Hc(G95M)Lc와 HcLc의 결합 친확력 비교를 보여준다.
Figure 112008051203250-PCT00019
상기 데이터는 CDR H3내부의 G95M 치환이 인간화 항체(H6L13)뿐만 아니라, 뮤린 도너 항체 2A10(HcLc)의 결합 활성을 증가시킨다는 것을 입증한다.
실시예 10 : CDR H3내에 치환을 내포하는 NOGO 항체의 제작 및 검사
90개 중쇄 가변 영역 한 패널을 CDR H3내에 내포된 잔기, 또는 선행하는 류신에서의 단일의 점 돌연변이에 의해 제작하였다. 구체적으로, 중쇄(H6FL, 서열번호 15에 기초함)를 엔코딩하는 벡터를 제작하였는데, 상기 벡터는 CDR H3내의 각각의 아미노산 잔기 및 선행하는 류신이, 시스테인을 제외한, 다른 모든 천연적으로 생성되는 아미노산으로 치환되며(퀵체이지 키트(Stratagene)를 사용함), 90개의 상이한 항체를 생성시키기 위해 경쇄(L13FL, 서열번호 17)와 접합되어 발현되는, 중쇄 가변 영역을 엔코딩한다. ELISA와 비아코어 실험에서 상기 항체를 사용하여 NOGO에 대한 결합을 검정하였다.
도 9와 10은 H6FL L13FL와 비교하여 H6FL 변이체들의 결합 활성 비교 결과를 보여준다. 표 14와 15는 비아코어로 측정한 오프-레이트 동역학의 비교결과를 보여준다 - 비아코어 검정에서 측정가능한 오프 레이트를 지니며 ELISA에서 H6L13에 대한 비교가능한 결합 활성을 지니는 그러한 항체들에 대한 결과만 제시되어 있다.
Figure 112008051203250-PCT00020
결론
상기 결과는 뮤린 2A10, 및 GQGY를 내포하는 항체 H6L13의 결합 특성을 보유하는 항체가, 하기 CDR H3를 내포하는 항체임을 제시한다: RQGY1 IQGY, MQGY, GDGY, GIGY, GSGY, GQNY, GQYY, GQSY, GQLY, GQFY, GQGW, WQGY, GAGY, GLGY, GVGY, GQWY.
실시예 11. GQGY를 내포하는 mab(H20L16)와 G95M 변이체 mab(H27L16 및 H28L13 및 H28L16)의 비교
표 15에 나열된 항체를 위에 기재한 대로 제조하였다.
Figure 112008051203250-PCT00021
시험관내 결합 특성
항체 순위를 결정하기 위한 시도에서, ELISA, 역전된 형식의(reverse format) ELISA, 경쟁적 ELISA, 비아코어를 포함하는 검정 및 유세포분석에 의한 검정의 범위내에서 항체들의 결합 특성을 조사하였다.
11.1 ELISA에서 재조합 인간 NOGO-A에 대한 결합
재조합 인간 Nogo-A(GST-인간 Nogo-A 56)에 결합하는 항체의 활성을 다양한 관련된 ELISA 검정(실시예 3에 기재된 프로토콜과 관련이 있으나, 조금 상이한 프로토콜로 실행하였음)으로 조사하였다. 첫번째 검정에서, 재조합 Nogo-A를 상이한 다양한 항원 농도로 플레이트에 직접적으로 코팅시켰다. 항원이 1mcg/㎖ 또는 0.05mcg/㎖로 로딩되었을 때의 직접 결합 ELISA 결과가 도 11A와 도 11B에 각각 제 시되어있다. 데이터는 키메라 형태의 모 항체(HcLc)와 비교할 때 모든 항체가 재조합 인간 NOGO-A에 대하여 상당한 결합 활성을 나타낸다는 것을 확신시켜준다. 더 높은 항원 코팅 농도에서, 모든 항체가 유사한 EC50 값을 나타내었다. 대조적으로, 더 낮은 항원 코팅 농도에서, 검정은 항체를 구별할 수 있었다. 포화 곡선이 획득되지는 않았지만, 곡선에 대한 경향 분석은 하기 등급 순서를 드러내었다: H27L16 > H28L16, H28L13, H20L16.
병행 실험에서, 검정 형식은 역전되었다. 상기 검정 형식에서, 항체를 플레이트에 포획되게 하고 GST 태그를 사용하여 재조합 인간 Nogo-A(GST-인간 Nogo-A-56)의 결합을 검출하였다. 역전된 형식의 ELISA의 결과는 도 12에 제시되어 있다. 데이터는 키메라 형태의 모 항체(HcLc)와 비교할 때, 모든 항체가 재조합 인간 Nogo-A에 대한 상당한 결합 활성을 나타낸다는 것을 확신시켜준다. 상기 형태의 결합 ELISA는 항체들을 구별하지 못하였다.
11.2 경쟁적 ELISA
인간 Nogo-A 상의 동일한 에피토프에 대해 모 항체와 직접적으로 경쟁하는 항체의 활성을 경쟁적 ELISA를 이용하여 평가하였다. 재조합 인간 Nogo-A(GST-인간 Nogo-A 56)를 플레이트에 코팅시켰다. 모 항체 2A10 및 인간화 항체를 플레이트에 부가하기 전에 사전 혼합하였다. 2A10의 결합을 항-생쥐 IgG-HRP 컨주게이트(Dakocytomation, #P0260)를 사용하여 정량하였다. 도 13에 제시된 결과는 4개 항체 모두가 2A10와 경쟁할 수 있다는 것을 확신시킨다. 이는 인간화 항체와 모 항체가 인간 Nogo-A 상의 중첩되는 에피토프를 인지한다는 것을 시사한다. 더욱 이, 인간화 항체의 활성은 키메라 HcLc와 대등하거나 더 뛰어나다. 결과는 H27L16, H28L16 및 H28L13가 H20L16보다 더 강력하다는 것을 보여준다.
11.3 비아코어 친화력 측정
비아코어를 사용하여 친화력을 결정하였고 2가지 서로 다른 방법을 이용하여 항체의 순위를 결정하였다. 첫번째 방법에서, 재조합 Nogo-A를 칩의 표면에 커플링시키고 항-Nogo-A 항체를 상기 표면에 적용하였다. 두번째 방법에서, 단백질 A를 재조합 GST-인간 Nogo-A56가 적용된(passed over) 상기 칩의 표면 상에서 항체를 포획하기 위해 사용하였다. 표 16에 제시된 결과는 항원을 표면에 커플링시킴으로써 획득되었으며 4개의 항체 모두가 모 항체(HcLc)와 거의 동등한/더 나은 친화력을 나타낸다는 것을 확신시킨다. 6회 독립된 실행의 평균에 기초하여, 전반적인 친화력의 관점에서 항체를 다음과 같은 순서로 순위를 결정하였다: H27L16 > H28L16 > H28L13 > H20L16(이 순서는 직접 결합 ELISA(도 11 B)의 순위 순서와도 합치한다). H27L16와 H28L16의 경우에, 인간화 항체는 모 항체(HcLc)의 친화력의 2-3배 더 높은 친화력을 나타낸다.
표 16 - 비아코어 T100을 사용하여 결정된 재조합 인간 Nogo-A(GST-인간 Nogo-A 56)에 대한 항-Nogo-A 인간화 항체의 결합 동역학. 항원을 1차 아민 커플링에 의해 CMS 칩에 결합시켰다. 항체를 다양한 농도로(0.125-8nM) 흘려주었다. 값은 2회 반복하여 실행된 6회 독립 실험의 평균 및 표준 편차(괄호)를 나타낸다. 각각의 완벽한 데이터 세트를 상기 평균과 표준편차를 계산하기에 앞서 독립적으로 분석하였다. **1개 세트는 분석불가능하였으로 단지 11개의 데이터 세트만 분석되 었다.
Figure 112008051203250-PCT00022
ELISA에 관하여 유사한 방법으로, 재조합 인간 Nogo-A(GST-인간 Nogo-A 56)에 대한 항체 결합의 동역학을 또한 역전된 형식으로 평가하였다(실시예 11.1을 참조하라). 이 검정에서, 인간화 항체는 단백질 A에 의해 CM5 칩 상에서 포획되었다. 6회 독립 실행에 대하여 평균을 낸 결과가 표 17에 제시되어 있다. 역전된 형식의 ELISA와 합치되면서, 모든 인간화 Nogo-A 항체는 역전된 형식의 비아코어에서 키메라(HcLc)에 대한 유사한 결합 동역학을 보여준다.
표 17 - 비아코어 T100 을 사용하여 결정된 재조합 인간 Nogo -A( GST Nogo -A 5+6)에 대한 항- Nogo -A 인간화 항체의 역전된 형식의 결합 동역학. 단백질 A를 1차 아민으로 대략 4000RU로 고착시키고 200-300RU의 샘플 항체를 포획하는데 사용하였다. 재조합 인간 Nogo-A를 다양한 농도로(0.125-8nM) 적용하였다. 값은 2회 반복하여 실행된 3회 독립 실험의 평균 및 표준 편차(괄호)를 나타낸다. 각각의 데이터 세트를 평균과 표준편차를 계산하기에 앞서 독립적으로 분석하였다.
Figure 112008051203250-PCT00023
11.4 천연 인간 NOGO 에 대한 결합
인간화 항체가 모 항체와 거의 동등한 프로파일을 지니는 천연 인간 Nogo-A에 결합하는지를 입증하기 위해, 2가지 유세포분석에 기반한 검정을 개발하였다. 첫번째 검정에서, 세포 표면 상의 인간 Nogo-A 세포외 도메인을 발현하는 CHO-K1-기반 세포주를 제조하였다. 인간화 항-Nogo-A 항체의 결합을 PE-표지된 항-인간 IgG(Sigma, #P8047)을 사용한 유세포분석으로 평가하였다. 아래 도 14는 CHO-Nogo-A 세포주에 대한 항-Nogo-A 항체의 전형적인 프로파일을 보여준다. 검정이 항체들을 구별하는데 충분히 민감하지는 아니하였지만, 결과는 4개 항체 모두가 키메라의 수준과 거의 동등한 수준으로 세포 표면에 발현된 인간 Nogo-A를 인지할 수있다는 것을 확신시킨다. 항체 중 어느 것도 모 세포주를 인지하지 못하였다(CHO-K1 - 데이터 미제시).
두번째 검정에서, 천연 Nogo-A에 결합하는 인간화 항체의 능력을 인간 신경아세포종 세포주-IMR32-를 사용하여 평가하였다. 상기 세포주는 높은 Nogo-A 단백질의 높은 세포내 수준/낮은 세포 표면 수준을 특징으로 한다. 결합 신호를 증가시키기 위한 시도에서, 세포내 Nogo-A(ER-거주)를 검출하기 위해 검정을 셋업하였 다. IMR32 세포의 투과성을 변화시키고 항-Nogo-A 인간화 항체로 염색하기 전에 고정시켰다. Nogo-A에 대한 항체의 결합을 항-인간 IgG-PE 표지된 2차 항체(Sigma, #P8047)를 사용하여 검출하였다. 아래 도 15에 제시된, 결과는 모든 항체가 모 항체 HcLc와 거의 동등한 수준 또는 더 높은 수준으로 세포내 Nogo-A에 결합한다는 것을 확신시킨다. CHO-Nogo-A 세포주에서 얻은 결과와 함께 고려할 때, 이러한 데이터는 인간화 항체가 키메라, HcLc와 거의 동등한 수준 또는 더 나은 수준으로 보다 천연 형태의 Nogo-A 단백질을 인지할 수 있다는 것을 확신시킨다. 검정은 항체 패널의 순서를 매길 수 있을 정도로 충분히 민감하지 아니하였다.
11.5 신경돌기-과성장 검정
인간화 항-Nogo-A 항체를 이전에 기재한 바와 같이 정량화 NO에 기반한 검정에서 Nogo-A의 신경돌기-과성장(NO) 억제 활성을 중화시키는 이들의 활성에 관해 시험하였다. 검정에서 시험된 항체를 Nogo-A에 대한 이들의 결합 동역학에 기반하여 선별하였다. 고친화력 인간화 항체, 즉, H28L16, H27L16, H20L16 및 참조를 위한 이들의 모 항체 2A10(생쥐 단일클론) 및 HcLc(인간 생쥐 키메라)를 Nogo-A 중화에 관해 시험하였다. 비교를 위해, 항체 11 C7(실시예 13 참조)를 또한 이 검정에서 시험하였다.
선별된 인간화 항체의 중화 활성을 시험하기 위해, 웰을 인간 재조합 GST-인간 Nogo-A56로 코팅시키고 소뇌 과립층 뉴런(CGNs)을 첨가하기에 앞서 37℃에서 1시간 동안 다양한 농도의 항체로 처리하였다. 대조군 웰을 HBSS로 처리하였다. 신경돌기 당 평균 신경돌기 길이를 각각의 웰에 대해 측정하였다. 도 16은 검정에 서 시험된 인간화 항체에 대한 결과를 보여준다. 대조군 항체의 패널(대조군 IgG, 정제된 생쥐 IgG; 캄패스 및 또 다른 무관한 인간화 항체)를 활성의 특이성을 확증하는데 사용하였다. 추가의 대조군으로서, 동일한 인간화 항체를 GST로 코팅된 플레이트 상에 적정시켰다. 결과는 신경돌기 과도성장에 대한 H28L16, H27L16 및 H20L16 역전 Nogo-A-매개 억제가 모 항체(2A10 및 HcLc)에 대해 관찰된 것과 유사한 정도였음을 확신시킨다. 효과는 확고하며 안정적인 것으로 보이며 H28L16를 이용한 11회의 독립된 신경돌기-과성장 실험에서 8회 확인되었다. 대조적으로, 인간화 항체는 GST로 코팅된 플레이트 상에서 신경돌기-과성장을 증가시키지 아니하였으며 대조군 항체의 패널은 임의의 용량 의존적 역전된 억제를 나타내지 아니하였는데, 이는 인간화 항체의 효과가 Nogo-A-매개 억제에 특이적임을 확신시킨다. 신경돌기 과성장에 관해 제시된 데이터는 다수의 반복된 실험으로부터 선택되었다. 제시되지 아니한 다수의 반복실험이 천연에서 달라질 수 있을 것으로 보이지만, 제시된 데이터는 신경돌기 과도성장 검정에서 NOGO의 억제 효과를 감소시키는 본 발명의 항체의 실제 활성을 반영하는 것으로 생각된다.
실시예 12. H28L16의 추가적인 특성결정
12.1 전장 길이 재조합 Nogo -A에 대한 결합
전장 길이 세포외 도메인 재조합 인간 Nogo-A(GST-인간 Nogo-A-ECD)에 결합하는 항체의 활성을 직접 결합 ELISA 검정으로 조사하였다. 이 경우에, ECD는 인간 NOGO A의 대략 위치 186-1004인 영역(DETFAL(서열번호 95)로 시작하고 ELSKTS(서열번호 96)로 종결되는 부분)) 내에 속하는 스플라이스 변이체이었다.
재조합 GST-인간 Nogo-A-ECD를 1㎍/㎖로 직접적으로 플레이트에 코팅시켰다. 도 17에 제시된 데이터는 H28L16이 모(HcLc) 또는 H20L16와 거의 동등하거나 더 나은 수준으로 GST-인간 Nogo-A-ECD를 인지할 수 있다는 것을 확신시킨다.
12.2 Fc 기능성의 억제
후보자의 안정성 프로파일을 개선하기 위해, 중쇄 불변 영역의 CH2 도메인 내부의 잔기 L235 및 G237(EU Index System)을 알라닌 잔기로 돌연변이시켜 항체-매개 면역학적 이팩터 기능의 촉발 가능성을 감소시켰다. 감소된 인간 C1q 결합을 Fc 기능성 억제를 위한 대리체(surrogate)로 사용하였다. 하기 도 18은 H28L16이, 캄패스-lgG1(야생형)과 비교하였을 때, 돌연변이(Fc-돌연변이된 항체(Fc-))를 지니는 캄패스 IgG1 작제물 및 캄패스 lgG4와 거의 동등한, 상당히 감소된 C1q 결합 활성을 지님을 보여준다. 이러한 데이터는 H28L16에 존재하는 CH2-도메인 돌연변이가 Fc 매개 이팩터 기능을 촉발시킬 가능성을 상당히 감소시킬 것임을 제시한다.
12.3 오르쏘로그(Orthologue) 결합
H28L16이, 모 항체(HcLc)의 활성과 거의 동등한, Nogo-A의 다양한 오르쏘로그에 대한 결합 활성을 나타낸다는 것을 입증하기 위해, 일련의 결합 검정을 실행하였다. 하기 도 19A-D는 각각 래트(서열번호 94), 치노몰구스(서열번호 92), 마모셋(서열번호 93) 및 다람쥐 원숭이(서열번호 91)로부터의 재조합 NOGO(GST-인간 Nogo-A 56)에 대한 직접 결합 ELISA의 결과를 보여준다. 모든 경우에서, H28L16은 키메라 항체(HcLc)와 거의 동등하거나 더 나은 활성을 나타내었다. 계산된 EC50 값은 인간 재조합 Nogo-A에 대한 결합에 관해 계산된 값과 거의 유사하였다.
HcLc 및 11C7와 비교하여 Nogo-A의 다양한 오르쏘로그에 대한 H28L16의 결합 동역학을 비아코어를 사용하여 결정하였다. 하기 표 18과 표 19는 2가지 상이한 형식의 검정에서 결합 동역학을 보여준다. 재조합 Nogo-A가 CM5 칩에 직접적으로 커플링되었을 경우(표 18), 래트, 치노몰구스 원숭이, 다람쥐 원숭이 및 마모셋에 대한 결합 동역학은 인간의 동역학(범위 = 0.33-0.67nM)과 매우 유사하였다. 검정의 형식을 역전시켰으며 단백질 A를 사용한 칩에 항체가 포획되었을 때(표 19), 래트 Nogo-A에 대한 H28L16의 결합 친화력은 인간 Nogo-A에 대한 결합 친화력보다 대략 4배 더 낮았다. 유사한 경향이 치노몰구스 Nogo-A(인간에 대한 결합 친화력보다 8.5배 더 낮음) 및 다른 영장류 오르쏘로그(인간에 대한 결합 친화력보다 12-17배 더 낮음)에서 관찰되었다. 키메라 항체 HcLc는 두 방향의 검정에서 Nogo-A의 오르쏘로그에 대한 유사한 결합 프로파일을 나타내었다. 어떤 형식의 검정이 생체내 상황을 가장 잘 나타내는지 불분명하였기 때문에, 본 연구에서 도출될 수 있는 일차적인 결론은 1) H28L16이 키메라 항체 HcLc와 연관된 오르쏘로그 교차-반응성 프로파일을 보유하며 2) 래트 및 치노몰구스 Nogo-A에 대한 HcLc의 친화력은 인간 Nogo-A에 대한 친화력의 4-배 내지 8.5배 이내이며 특정 조건하에서는 매우 비슷할 수 있다는 것이다.
표 18 - 비아코어 T100 을 사용하여 결정된 인간 Nogo -A의 재조합 오르쏘 로그에 대한 H28L16, 11Cl 및 HcLc의 결합 동역학. 1차 아민 커플링에 의해 대략 140-180RU의 다양한 Nogo-A 오르쏘로그가 CM5 칩에 포획되었다. 항체를 다양한 농도(0.125-8 nM )로 흘려주었다. 값은 2회 반복하여 실행된 1-2회의 독립된 실험의 평균 및 표준 편차(괄호)를 나타내는데, 각각의 데이터 세트를 상기 평균과 표준편차를 계산하기에 앞서 독립적으로 분석하였다. **한 세트의 곡선은 항체 11 C7 에 대한 해석불가능한 곡선으로 인하여 폐기되었다.
Figure 112008051203250-PCT00024
표 19 - 비아코어 T100 을 사용하여 결정된 인간 Nogo -A의 재조합 오르쏘로그 에 대한 H28L16 , 11 C7 및 HcLc 의 역전된 형식의 결합 동역학. 단백질 A를 약 4000RU로 표면에 고착시켰으며 항- Nogo -A 항체는 대략 300-400 RU 에서 포획되었다. 재조합 단백질( GST - NOGO -A56)을 작제물에 따라 다양한 농도(0.125-64 nM )로 흘려주었다. 모든 실험을 2회 반복하여 수행하였다. 값은 2회 반복하여 실행된 1-3회 독립된 실험의 평균 및 표준 편차(괄호)를 나타내며, 각각의 데이터 세트를 상기 평균과 표준편차를 계산하기에 앞서 독립적으로 분석하였다.
Figure 112008051203250-PCT00025
12.4 물리적 특성
H28L16 및 H20L16의 물리화학적 특성을 SEC-HPLC 및 SDS-PAGE로 평가하였다. SEC-HPLC를 214nm와 280nm에서의 검출과 함께 10OmM 인산나트륨, 40OmM 염화나트륨, pH 6.8, 및 TSK G3000 SW x1 30cm x 7.8mm 스테인리스 강철 컬럼을 사용하여 1.O㎖/분에서 실행하였다. SDS-PAGE를 10μg 생성물 로딩 및 Sypro Ruby 염색과 함께 4-20% Novex Tris-HCL 겔 상에서 실행하였다. C-IEF를 pH 3.5-10 암포린(ampholines)을 사용하여 Beckman MDQ 상에서 수행하였다.
하기 결과를 획득하였다:
표 20 - 항-Nogo-A 항체에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) HPLC 분석. 제시된 값은 상이한 3종류의 종들 각각에 할당된 항체의 백분율이다.
Figure 112008051203250-PCT00026
표 21 - 항-Nogo-A 항체에 대한 SDS-PAGE 분석. 제시된 값은 주요 밴드에서 확인된 항체의 백분율이다.
Figure 112008051203250-PCT00027
SEC-HPLC 데이터는 H20L16가 H28L16(H28L16)보다 집합체형성(aggregation)에 더 민감하다는 것을 제시한다. 본원에 보고된 데이터가 대규모로 반복되었다면, 이는 임상적 용도로 적합한 품질의 물질을 생산하기 위한 제조 공정의 능력에 강한 영향을 줄 수 있을 것이다(> 95% 단량체). SDS-PAGE 데이터는 두 후보자들이 전형적인 프로파일을 나타내는 후보자로 인정될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 13. H28L16와 11C7의 비교
11C7로 지정된 뮤린 항-Nogo-A 항체가 국제공개공보 WO2004052932호에 소개되어 있는데, 상기 항체는 펩티드 에피토프에 대해 양산되었다. 키메라 11C7을 국 제공개공보 WO2004052932호에서 제공된 서열 정보에 근거하여 제조하였다. 2A10 및 11C7의 결합 에피토프를 비교하기 위해, 경쟁적 ELISA를 구축하여 11C7 및 2A10가 Nogo-A 상의 중첩되는 에피토프를 인지할 수 있는지 여부를 조사하였다. 하기 도 20에 제시된 바와 같이, HcLc(2A10의 키메라 형태)는 인간 재조합 Nogo-A에 대한 결합에 대해 2A10와 경쟁할 수 있었으며, 한편 11C7은, 최대 100mcg/㎖의 농도에서 조차, 2A10와 경쟁을 나타내지 아니하였다.
실시예 14: NOGO H28L16에 대한 결합에 관해 인간 NOGO-5+6와 직접적으로 경쟁하는 펩티드의 활성을 입증하기 위한 경쟁적 ELISA
경쟁적 ELISA를 위한 방법
NOGO H28L16에 대한 결합에 관하여 NOGO-A(GST-인간 Nogo-A56)와 직접적으로 경쟁하는 펩티드의 활성을 경쟁적 ELISA를 사용하여 평가하였다. 중탄산염 완충액 중에서 5g/㎖로 래빗 항-인간 IgG(Sigma, #I-9764)를 4℃에서 밤새 눈크 면역흡착 플레이트(웰당 100㎕)에 코팅시켰다. 플레이트를 0.05% Tween을 함유하는 TBS(TBST)로 3회 헹구고 나서 실온에서 1시간 동안 TBST 중의 1 % BSA로 블록킹시켰다. 이후 H28L16는 실온에서 1시간 동안 플레이트 상에서 포획되었다(1㎍/㎖, TBST 중의 1% BSA로 희석됨, 웰당 5O㎕). 플레이트를 TBST로 3회 세척하였다. 펩티드(0에서부터 100g/㎖까지) 및 1㎍/㎖(TBST 중의 1% BSA로 희석됨) 농도의 GST-인간 NOGO-A56를 상기 웰에 첨가하기에 앞서 사전 혼합하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBST로 3회 세척하고 나서 래빗 항-GST 퍼옥시다제 컨주게이트(Sigma, #A7340, 1:2000, TBST 중의 1% BSA로 희석됨)와 함께 1시간 동 안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBST로 3회 세척하고 나서 웰 당 50ℓ의 퍼옥시다제 기질(Sigma)과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 착색 반응을 25ℓ의 농축된 H2SO4의 첨가로 종결시켰다. 490nm에서 흡광도를 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
도 21에 제시된 결과는 에피토프 맵핑 ELISA(실시예 8)에서 양성반응을 나타내었던, 펩티드 6과 7이 H28L16에 대한 GST-인간 NOGO-A56의 결합과 경쟁할 수 잇다는 것을 확신시킨다. 이는 에피토프 맵핑 연구에서 양성반응을 나타낸 펩티드가 H28L16 결합을 위한 에피토프를 내포한다는 것을 시사한다. 제안된 에피토프를 내포하진 않는, 펩티드 16 및 17(NOGO 펩티드를 내포하지만, 펩티드 6 또는 7과 중첩되지 아니함)은 NOGO-5+6과 경쟁하지 아니하였다.
실시예 15 : NOGO 항체 변이체 G101S/O37R에 기반한 인간화 항 NOGO 단일클론 항체에 대한 ELISA 분석
G101S(H100(서열번호 63)MD로도 알려져 있음), H6(서열번호 11)의 중쇄 가변 영역의 변형된 변이체를 위에 기재한 바와 같이 단일의 치환, G101S(Kabat 넘버링)를 CDR H3으로 도입함으로써 제조하였다. 유사하게, 단일의 치환(Kabat 넘버링 Q37R)을 프레임워크 영역(L100을 형성하기 위해)내로 도입함으로써 Q37R, L13(서열번호 13)의 경쇄 가변 영역의 변형된 변이체를 제조하였다. 경쇄 가변 도메인 Q37R의 단백질 서열은 서열번호 67로 주어진다.
G101S/Q37R 치환을 내포하는 중쇄 및 경쇄의 전장 길이 버전을 엔코딩하는 유전자를 이전에 기재한 바와 같이 CHO 세포에서 발현시키고 이전에 기재한 바와 같이 직접 결합 ELISA로 검정하였다.
항원이 0.05㎍/㎖로 로딩되었을 때의 직접 결합 ELISA의 결과가 도 22에 제시되어 있다. 데이터는 항체 H100L100가 H27L16과 비교하였을 때 재조합 GST-인간 NOGO-A56에 대한 상당한 결합 활성을 나타내며, H100L100가 H6L13과 비교하였을 때 개선된 결합 프로파일을 지닌다는 것을 보여준다. 상응하는 EC50 값이 하기 표에 제시되어 있다:
표 22: H6L13 및 H27L16 과 비교한 G101S / Q37R 변이체에 대한 EC50 측정
Figure 112008051203250-PCT00028
실시예 16: CDR H3 변이체 G101S에 기반한 인간화 항 NOGO 단일클론 항체의 비아코어 분석
단일의 치환, G101S(Kabat 넘버링)을 CDR H3내로 도입함으로써 H100, H6의 중쇄 가변 영역의 변형된 변이체(서열번호 11)를 제조하였다. 중쇄 가변 도메인 H 100 단백질의 단백질 서열은 서열번호 63으로 주어진다. 유사하게, 단일의 치환(Kabat 넘버링, 각각, Q37R 및 Q45R)을 프레임워크 영역내로 도입함으로써 L100 및 L101, L13의 경쇄 가변 영역의 변형된 변이체(서열번호 13)를 제조하였다. 경쇄 가변 도메인 L1OO 및 L101 단백질의 단백질 서열은 각각 서열번호 67 및 서열번 호 68로 주어진다.
전장 길이 버전의 H100L100 및 H100L101을 이전에 기재한 바와 같이 CHO 세포에서 발현시켰다. 표 23은 H100L100 및 H100L101과 비교한 H6L13의 결합 친화력을 보여주며, H100L100과 H100L101이 H6L13과 비교하였을 때 개선된 결합 친화력을 지닌다는 것을 보여준다. 이 실시예에서, 실시예 6에 기재된 것과 본질적으로 동일하게 본 발명의 방법이 실행되었는데, CM5 칩은 NHS와 EDC 용액을 7분 동안 5㎕/㎖로 상기 칩에 흘려 줌으로써 활성화되었으며 NOGO는 상기 칩에 인도되기 전에 1OnM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5) 중에 현탁되었다.
표 23 - H6L13과 비교한 L13 가변 경쇄의 변이체와 조합된 H6 가변 중쇄의 G101S 변이체에 대한 비아코어 측정.
Figure 112008051203250-PCT00029
NOGO 항체 서열 요약(표 24)
Figure 112008051203250-PCT00030
Figure 112008051203250-PCT00031
Figure 112008051203250-PCT00032
서열
서열번호 1: 2A10 CDR-H1
Figure 112008051203250-PCT00033
서열번호 2: 2A10 CDR-H2
Figure 112008051203250-PCT00034
서열번호 3: 2A10 CDR-H3
Figure 112008051203250-PCT00035
서열번호 4: 2A10 CDR-Ll
Figure 112008051203250-PCT00036
서열번호 5: 2A10 CDR-L2
Figure 112008051203250-PCT00037
서열번호 6: 2A10 CDR-L3
Figure 112008051203250-PCT00038
서열번호 7: 2A10, VH(뮤린)
Figure 112008051203250-PCT00039
서열번호 8: 2AlO, VL(뮤린)
Figure 112008051203250-PCT00040
서열번호 9: 키메라 중쇄 Hc
Figure 112008051203250-PCT00041
서열번호 10 : 키메라 경쇄 Lc
Figure 112008051203250-PCT00042
서열번호 11: 2A10 VH 인간화 작제물 H6
Figure 112008051203250-PCT00043
서열번호 12: 2A10 VH 인간화 작제물 H16
Figure 112008051203250-PCT00044
서열번호 13: 2A10 VL 인간화 작제물 L13
Figure 112008051203250-PCT00045
서열번호 14: 2A10 VL 인간화 작제물 L16
Figure 112008051203250-PCT00046
서열번호 15: 2A10 중쇄 인간화 작제물 H6
Figure 112008051203250-PCT00047
서열번호 16: 2A10 중쇄 인간화 작제물 H16
Figure 112008051203250-PCT00048
서열번호 17: 2A10 경쇄 인간화 작제물 L13
Figure 112008051203250-PCT00049
서열번호 18: 2A10 경쇄 인간화 작제물 L16
Figure 112008051203250-PCT00050
서열번호 19: 2A10, VH(뮤린) 서열번호: 7을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00051
서열번호 20: 2A10, VL(뮤린) 서열번호: 8을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00052
서열번호 21: 키메라 중쇄 Hc 서열번호: 9를 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00053
서열번호 22: 키메라 경쇄 Lc 서열번호: 10을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00054
서열번호 23: 2A10 VH 인간화 작제물 H6 서열번호: 11을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00055
서열번호 24: 2A10 VH 인간화 작제물 H16 서열번호: 12를 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00056
서열번호 25: 2A10 VL 인간화 작제물 L13 서열번호: 13을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00057
서열번호 26: 2A10 VL 인간화 작제물 L16 서열번호: 14을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00058
서열번호 27: 2A10 중쇄 인간화 작제물 H6 서열번호: 15를 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00059
서열번호 28: 2A10 중쇄 인간화 작제물 H16 서열번호: 16을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00060
서열번호 29: 2A10 경쇄 인간화 작제물 L13 서열번호: 17을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00061
서열번호 30: 2A10 경쇄 인간화 작제물 L16 서열번호: 18을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00062
서열번호 31: 캄패스 선도 서열
Figure 112008051203250-PCT00063
서열번호 32: GST에 융합된 인간 NOGO A(NOGO-A56)의 아미노산 586-785
Figure 112008051203250-PCT00064
서열번호 33: 2A10 VH 인간화 작제물 H1
Figure 112008051203250-PCT00065
서열번호 34: 2A10 VL 인간화 작제물 L11
Figure 112008051203250-PCT00066
서열번호 35: 2A10 중쇄 인간화 작제물 H1
Figure 112008051203250-PCT00067
서열번호 36: 2A10 경쇄 인간화 작제물 L11
Figure 112008051203250-PCT00068
서열번호 37: 2A10 VH 인간화 작제물 H1 서열번호: 33을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00069
서열번호 38: 2A10 VL 인간화 작제물 L11 서열번호: 34를 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00070
서열번호 39: 2A10 인간화 중쇄 H1 서열번호: 35를 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00071
서열번호 40: 2A10 인간화 경쇄 작제물 L11 서열번호: 36을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00072
서열번호 41: 2A10 VH 인간화 작제물 H20
Figure 112008051203250-PCT00073
서열번호 42: 2A10 중쇄 인간화 작제물 H20
Figure 112008051203250-PCT00074
서열번호 43: 2A10 VH 인간화 작제물 H20 서열번호: 41을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00075
서열번호 44: 2A10 중쇄 인간화 작제물 H20 서열번호: 42를 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00076
서열번호 45: 2A10 CDR-H3(G95M)
Figure 112008051203250-PCT00077
서열번호 46: 마모셋 NOGO-A 단편의 아미노산 서열
Figure 112008051203250-PCT00078
서열번호 47: VH 인간화 작제물 H26
Figure 112008051203250-PCT00079
서열번호 48: VH 인간화 작제물 H27
Figure 112008051203250-PCT00080
서열번호 49: VH 인간화 작제물 H28
Figure 112008051203250-PCT00081
서열번호 50: VH 인간화 작제물 H26 서열번호: 47을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00082
서열번호 51: VH 인간화 작제물 H27 서열번호: 48을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00083
서열번호 52: VH 인간화 작제물 H28 서열번호: 49를 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00084
서열번호 53: 중쇄 인간화 작제물 H26
Figure 112008051203250-PCT00085
서열번호 54: 중쇄 인간화 작제물 H27
Figure 112008051203250-PCT00086
서열번호 55: 중쇄 인간화 작제물 H28
Figure 112008051203250-PCT00087
서열번호 56: 중쇄 인간화 작제물 H26 서열번호: 53을 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00088
서열번호 57: 중쇄 인간화 작제물 H27 서열번호: 54를 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00089
서열번호 58: 중쇄 인간화 작제물 H28 서열번호: 55를 엔코딩하는 PN
Figure 112008051203250-PCT00090
서열번호 59: 중쇄 Hc(G95M)
Figure 112008051203250-PCT00091
서열번호 60: 에피토프
Figure 112008051203250-PCT00092
서열번호 61: 2A10 VH 인간화 작제물 H99
Figure 112008051203250-PCT00093
서열번호 62: CDR H3
Figure 112008051203250-PCT00094
서열번호 63: VH 인간화 작제물 H1OO
Figure 112008051203250-PCT00095
서열번호 64: VH 인간화 작제물 H101
Figure 112008051203250-PCT00096
서열번호 65: VH 인간화 작제물 H102
Figure 112008051203250-PCT00097
서열번호 66: 2A10 VH 인간화 작제물 H98
Figure 112008051203250-PCT00098
서열번호 67
Figure 112008051203250-PCT00099
서열번호 68
Figure 112008051203250-PCT00100
서열번호 69
Figure 112008051203250-PCT00101
서열번호 70
Figure 112008051203250-PCT00102
서열번호 71
Figure 112008051203250-PCT00103
서열번호 72
Figure 112008051203250-PCT00104
서열번호 73
Figure 112008051203250-PCT00105
서열번호 74
Figure 112008051203250-PCT00106
서열번호 75
Figure 112008051203250-PCT00107
서열번호 76
Figure 112008051203250-PCT00108
서열번호 77
Figure 112008051203250-PCT00109
서열번호 78
Figure 112008051203250-PCT00110
서열번호 79
Figure 112008051203250-PCT00111
서열번호 80
Figure 112008051203250-PCT00112
서열번호 81
Figure 112008051203250-PCT00113
서열번호 82
Figure 112008051203250-PCT00114
서열번호 83
Figure 112008051203250-PCT00115
서열번호 84
Figure 112008051203250-PCT00116
서열번호 85
Figure 112008051203250-PCT00117
서열번호 86
Figure 112008051203250-PCT00118
서열번호 87
Figure 112008051203250-PCT00119
서열번호 88
Figure 112008051203250-PCT00120
서열번호 89
Figure 112008051203250-PCT00121
서열번호 90
Figure 112008051203250-PCT00122
서열번호 91
Figure 112008051203250-PCT00123
서열번호 92
Figure 112008051203250-PCT00124
서열번호 93
Figure 112008051203250-PCT00125
서열번호 94
Figure 112008051203250-PCT00126
서열번호 95
Figure 112008051203250-PCT00127
서열번호 96
Figure 112008051203250-PCT00128
SEQUENCE LISTING <110> Paul Andrew Hamblin Jonathon Henry Ellis Volker Germaschewski Ruth Mcadam Rabinder Kumar Prinjha Stephanie Jane Clegg George Kapsidas <120> Immunoglobulins <130> VB61773FF <160> 96 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Gln Gly Tyr 1 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric Ab comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 9 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Glu Leu Gly Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 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Sequence <220> <223> Humanized Ab construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 13 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu 85 90 95 Val Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Ab construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 14 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 16 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 16 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 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ggctactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca 339 <210> 20 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 gatattgtga taacccagga tgaactctcc aatcctgtca cttctggaga atcagtttcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tataaggatg ggaagacata cttgaattgg 120 tttctgcaga gaccaggaca atctcctcag ctcctgatct atttgatgtc cacccgtgca 180 tcaggagtct cagaccggtt tagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac cctggaaatc 240 agtagagtga aggctgagga tgtgggtgtg tattactgtc aacaacttgt agagtatccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 21 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimaeric antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 21 atgggatgga gctgtatcat cctctttttg gtagcagcag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtccaactgc agcagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggaaatatt aatcctagca atggtggtac taactacaat 240 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt attgtgaact gggacagggc 360 tactggggcc aaggcacact agtcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389 <210> 22 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimaeric antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 22 atgaggtgct ctcttcagtt tctgggggtg cttatgttct ggatctctgg agtcagtggg 60 gatattgtga taacccagga tgaactctcc aatcctgtca cttctggaga atcagtttcc 120 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tataaggatg ggaagacata cttgaattgg 180 tttctgcaga gaccaggaca atctcctcag ctcctgatct atttgatgtc cacccgtgca 240 tcaggagtct cagaccggtt tagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac cctggaaatc 300 agtagagtga aggctgagga tgtgggtgtg tattactgtc aacaacttgt agagtatccg 360 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgta cggtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggacaa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720 <210> 23 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 23 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactgga tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatcggaaat attaatccta gcaatggtgg tactaactac 180 aatgagaagt tcaagagcag agccaccatg accagggaca cgtccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtga actgggacag 300 ggctactggg gccagggaac actagtcaca gtctcctca 339 <210> 24 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 24 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaaacagcga 120 cctggacaag ggcttgagtg gatcggaaat attaatccta gcaatggtgg tactaactac 180 aatgagaagt tcaagagcaa agccaccctc accgtcgaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtga actgggacag 300 ggctactggg gccagggaac actagtcaca gtctcctca 339 <210> 25 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 25 gatattgtga tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tataaggatg ggaagacata cttgaattgg 120 tttcagcaga ggccaggcca atctccacag ctcctaattt atttgatgtc cacccgtgca 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcggt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgcc aacaacttgt agagtatccg 300 ctcacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336 <210> 26 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 26 gatattgtga tgacccagtc tccactctcc aaccccgtca cccttggaca gccggtctcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tataaggatg ggaagacata cttgaattgg 120 tttctccaga ggccaggcca atctccacag ctcctaattt atttgatgtc cacccgtgca 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcggt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgcc aacaacttgt agagtatccg 300 ctcacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336 <210> 27 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 27 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc 120 tgcaaggcat ctggatacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat cggaaatatt aatcctagca atggtggtac taactacaat 240 gagaagttca agagcagagc caccatgacc agggacacgt ccacgagcac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgaact gggacagggc 360 tactggggcc agggaacact agtcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 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caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389 <210> 29 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 29 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgat 60 attgtgatga cccagtctcc actctccctg cccgtcaccc ttggacagcc ggcctccatc 120 tcctgcaggt ctagtaagag tctcctatat aaggatggga agacatactt gaattggttt 180 cagcagaggc caggccaatc tccacagctc ctaatttatt tgatgtccac ccgtgcatct 240 ggggtcccag acagattcag cggcggtggg tcaggcactg atttcacact gaaaatcagc 300 agggtggagg ctgaggatgt tggggtttat tactgccaac aacttgtaga gtatccgctc 360 acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggacaacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 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agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 717 <210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 31 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 32 <211> 439 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 32 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe 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atctgaggac acggccgtgt attactgtga actgggacag 300 ggctactggg gccagggaac actagtcaca gtctcctca 339 <210> 38 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 38 gatattgtga taacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tataaggatg ggaagacata cttgaattgg 120 tttcagcaga ggccaggcca atctccacag ctcctaattt atttgatgtc cacccgtgca 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcggt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgcc aacaacttgt agagtatccg 300 ctcacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336 <210> 39 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 39 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc 120 tgcaaggcat ctggatacac cttcaccagc tactggatgc 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<400> 76 Ile Gln Gly Tyr 1 <210> 77 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 77 Gly Asp Gly Tyr 1 <210> 78 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 78 Gly Ile Gly Tyr 1 <210> 79 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 79 Gly Ser Gly Tyr 1 <210> 80 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 80 Gly Gln Asn Tyr 1 <210> 81 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 81 Gly Gln Tyr Tyr 1 <210> 82 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 82 Gly Gln Leu Tyr 1 <210> 83 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 83 Gly Gln Phe Tyr 1 <210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 84 Gly Gln Gly Trp 1 <210> 85 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 85 Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 15 <210> 86 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo sapiens <400> 86 Trp Gln Gly Tyr 1 <210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody construct comprising sequences from mus musculus and homo 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Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu 210 215 220 Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Val Ala 225 230 235 240 Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val 245 250 255 Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser 260 265 270 Ala Val Ala Ser Ala Val Gln Pro Ser Leu Ser Pro Leu Glu Ala Ser 275 280 285 Ser Val 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Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu 210 215 220 Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Lys Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu 225 230 235 240 Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe 245 250 255 Glu Glu Ser 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<213> Callithrix jacchus <400> 93 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu 210 215 220 Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Val Gln Asp Ser Leu Cys Pro Val Ala 225 230 235 240 Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val 245 250 255 Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser 260 265 270 Ala Gly Ala Ser Ala Val Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser 275 280 285 Ser Val Asn Phe Glu Ser Val Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro 290 295 300 Tyr Glu Glu Ala Met Asn Val Ser Arg Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys 305 310 315 320 Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Ser Ile Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr 325 330 335 Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys 340 345 350 Leu Ser Ala Glu Pro Thr Pro Asp Phe Ser Ser Tyr Ser Glu Met Ala 355 360 365 Lys Val Glu Gln Pro Leu Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser 370 375 380 Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro 385 390 395 400 Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Ala Val Ile Leu Val Lys Glu Thr 405 410 415 Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu His Glu Asn Lys Leu 420 425 430 Glu Arg Pro His Arg Asp 435 <210> 94 <211> 432 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 94 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 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Pro Glu Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro 385 390 395 400 Glu Val Pro Gln Thr Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser 405 410 415 Leu Thr Glu Val Ser Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu 420 425 430 <210> 95 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 95 Asp Glu Thr Phe Ala Leu 1 5 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 96 Glu Leu Ser Lys Thr Ser 1 5

Claims (17)

  1. 아미노산 잔기 GQGY로 필수적으로 구성되는 제 3의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, 상기 CDR은 상기 GQGY 코어 서열 내부에 하나 이상의 치환을 포함하며, 상기 치환은 하기 치환으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역:
    첫번째 위치의 G가 R, I, W 또는 M으로 대체되고;
    두번째 위치의 Q가 D, I, A, L, V 또는 S로 대체되며;
    세번째 위치의 G가 W, N, Y, S, L 또는 F로 대체되고;
    네번째 위치의 Y는 W로 대체된다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 GQGY 서열에 대한 단일한 치환이 하기 CDR H3 중 어느 하나를 생산하기 위한 것임을 특징으로 하는 중쇄 가변 영역:
    RQGY(서열번호 75), IQGY(서열번호 76), MQGY(서열번호 45), GDGY(서열번호 77), GIGY(서열번호 78), GSGY(서열번호 79), GQNY(서열번호 80), GQYY(서열번호 81), GQSY(서열번호62), GQLY(서열번호 82), GQFY(서열번호 83), GQGW(서열번호 84), WQGY(서열번호 86), GAGY(서열번호 87), GLGY(서열번호 88), GVGY(서열번호 89), GQWY(서열번호 90).
  3. 제 2항에 있어서, 상기 CDR H3가 MQGY 또는 GQSY임을 특징으로 하는 중쇄 가변 영역.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이 CDR H1(서열번호 1)으로 서열 SYWMH를 포함하며, CDR H2(서열번호2)로 NINPSNGGTNYNEKFKS를 포함함을 특징으로 하는 중쇄 가변 영역.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이 인간화 서열임을 특징으로 하는 중쇄 가변 영역.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 수용체(receptor) 중쇄 가변 영역 서열이 서열번호 7로 주어진 2A10 도너(donor) 항체 중쇄 가변 영역 서열에 대하여 프레임워크(framework) 영역에서 40% 이상의 동일성을 지님을 특징으로 하는 중쇄 가변 영역.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이, 수치적 위치 38, 40, 67, 68, 70, 72, 74, 및 79 중 하나 이상에서 다수의 치환을 추가로 포함하는, 서열번호 66(H98 가변 영역) 또는 서열번호 61(H99 가변 영역)의 아미노산 서열을 가지며; 각각의 치환된 아미노산 잔기가 서열번호 7의 동등한 위치의 아미노산 잔기로 치환됨을 특징으로 하는 중쇄 가변 영역.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 47(H26), 서열번호 48(H27), 서열번호 49(H28), 서열번호 63(H100), 서열번호 54(H101), 서열번호 65(H102)로 주어진 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 중쇄 가변 영역.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 청구된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 NOGO-A에 결합할 수 있는, 동정된 항체, 또는 이의 단편.
  10. 하기 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 쌍을 포함하는 제 7항에 청구된 것과 같은 정된 항체 또는 이의 단편: H27L16(서열번호 48 + 서열번호14), H28L13(서열번호 49 + 서열번호 13), H28L16(서열번호 49 + 서열번호 14).
  11. 하기 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 동정된 항체: H27FL L16FL(서열번호 54 + 서열번호 18), H28FL L13FL(서열번호 55 + 서열번호 17), H28FL L16FL(서열번호 55 + 서열번호 18).
  12. 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께, 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 청구된 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-NOGO 항체 또는 이의 단편, 또는 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 청구된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약제 조성물.
  13. 뇌졸중 및 다른 신경 질환/장애의 치료 또는 예방을 위한 약제 제조에 있어 서 또는 중추 또는 말초 신경계에 대한 기계적 트라우마(mechanical trauma)를 앓고 있는 환자의 치료를 위한 약제 제조에 있어서, 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 청구된 항-NOGO 항체 또는 이의 단편, 또는 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 청구된 항체 또는 이의 단편의 용도.
  14. 치료학적으로 유효한 양의 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 청구된 항-NOGO 항체 또는 이의 단편, 또는 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 청구된 항체 또는 이의 단편을 비경구 투여하는 단계를 포함하는, 인간에 있어서, 뇌졸중 및 다른 신경 질환/장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법 또는 중추 또는 말초 신경계에 대한 기계적 트라우마(mechanical trauma)를 앓고 있는 환자의 치료하기 위한 방법.
  15. VLPDIVMEAPLN(서열번호 60)의 폴리펩티드 서열로 구성된 인간 NOGO 단백질의 영역에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편으로서, 아미노산 잔기 GQGY 또는 한 개의 아미노산 치환을 지니는 이의 유사체로 구성된 CDR H3를 지니는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체가 아님을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 단편.
  16. 서열번호 47, 48, 49, 53, 54 또는 55로 지정된 서열을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  17. ELISA 검정에서 인간 NOGO 단백질에 결합할 수 있는 항체, 또는 이의 단편으로서, 인간 NOGO 단백질에 대한 상기 항체, 또는 이의 단편의 결합은 다음 서열 VLPDIVMEAPLN(서열번호 60)을 지니는 펩티드 존재시 감소되며, 무관한 펩티드(irrelevant peptide) 존재시 비감소되며, 상기 항체 또는 이의 단편은 아미노산 잔기 GQGY 또는 한 개의 아미노산 치환을 지니는 이의 유사체로 구성된 CDR H3를 지니는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체가 아님을 특징으로 하는, 항체, 또는 이의 단편.
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