BRPI0808087A2 - anticorpo ou fragmento de ligante de antÍgeno do mesmo, cÉlula hospedeira recombinante transformada, transfectada ou transduzida, mÉtodo para a produÇço de anticorpo ou de fragmento de ligante de antÍgeno do mesmo, composiÇço farmacÊutica, kit-de-partes, mÉtodo para tratar paciente humano afligido com cÂncer, e, uso de anticorpo ou fragmento de ligante de antÍgeno do mesmo - Google Patents

Abstract

"ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGANTE DE ANTÍGENO DO MESMO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE TRANSFORMADA, TRANSFECTADA OU TRANSDUZIDA, MÉTODO PARA A PRODUÇçO DE ANTICORPO OU DE FRAGMENTO DE LIGANTE DE ANTÍGENO DO MESMO, COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA, KIT-DE-PARTES, MÉTODO PARA TRATR UM PACIENTE HUMANO AFLIGIDO COM CÂNCER, E, USO DE ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGANTE DE ANTÍGENO DO MESMO". A presente invenção refere-se aos anticorpos ou aos fragmentos de ligante de antígeno dos mesmos que especificamente se ligam em IGF-1R, especialmente hIGF-1R. Também são reveladas preparações de anticorpo compreendendo anticorpos ou fragmentos de ligante de antígeno. Métodos de produção de tais anticorpos ou fragmentos de ligante de antígeno e usos dos mesmos também estão incluídos dentro do escopo da presente invenção.

Description

"ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGANTE DE ANTiGENO DO MESMO, CELULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE TRANSFORMADA, TRANSFECTADA OU TRANSDUZIDA, METODO PARA A PRODUgAO DE ANTICORPO OU DE FRAGMENTO DE LIGANTE DE ANTIGENO DO MESMO, COMPOSigAO FARMACEimCA, KIT-DE-PARTES, E, USO DE ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGANTE DE ANTIGENO DO MESMO"

A presente inven9ao refere-se aos anticorpos e seus fragmentos de ligante de antigeno que especificamente se ligam em Receptor de Fator de Crescimento Insulina-semelhante de humano (hlGF-lR). A presente ίηνεηςδο tambem concerne aos metodos de tratar doen9as ou disturbios com ditos anticorpos e seus fragmentos de ligante de antigeno, composi9des farmaceuticas compreendendo ditos anticorpos e seus fragmentos de ligante de antigeno e metodos de manufatura. Fundamentos

O receptor de fator de crescimento insulina-semelhante de humano (tambem conhecido como IGF-IR5 CD221 ou EC 2.7.112) e um receptor de tirosina quinase com 70% de homologia com ο receptor de insulina. O receptor e ativado por dois ligantes - IGF-I e IGF-II que se ligam no receptor com afinidade alta. O receptor e um dimero αβ ligado por dissulfeto, denotado (αβ)2. A cadeia-α e inteiramente extracelular enquanto que a cadeia-β atravessa a memtwana e tem tanto um dominio extracelular quanto um dominio de sinaliza5ao intracelular. A ativa9§o de receptor mediada por ligante aciona eventos intracelulares das rotas de MAPK e PI3K- proteina quinase B. Embora IGF-IR seja conhecido por ter um papel essencial em desenvolvimento e crescimento fetal e pos-natal normais, tambem e assumido um papel importante em biologia de cancer e tem estado implicado em numerosas rotas biologicas tais como mitogenese, transforma9ao e protegao contra apoptose (revisto extensivamente em Baserga et al. (1997) Endocrine, 7(1):99-102, Baserga (2003) Int J Cancer, 107(6):873-7, Larsson et al. (2005) Br J Cancer, 92(12):2097-101, Romano (2003) Drug News Perspect, 16(8):525-31). Ademais e sabido que os niveis de expressao de receptor estao supra-regulados em uma variedade de tipos de tumor (revisto por Khandwala et al. (2000) Endocr Rev., 21(3):215-44) e niveis aumentados do ligante IGF-I estao associados com um risco aumentado de desenvolver cancer de prostata (Chan et al. (1998) Science, 279(5350):563-6).

Sao conhecidos antagonistas da rota de sinalizagSo de IGF-IR por causa de seus efeitos de anti-tumor in vitro e in vivo (revisto em Hofmann et al. (2005) Drug Discov Today, 10(15): 1041-7 e Zhang et al. (2004) Expert Opin Investig Drugs, 13(12): 1569-77). Abordagens incluem anticorpos neutralizadores (veja Kull et al. (1983) J Biol Chem., 258(10):6561-6 e Li et al., (1993) Cancer Immunol Immunother., 49(4-5):243-52, Xiong et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A., 89(12):5356-60, Burtrum et al. (2003) Cancer Res., 63(24):8912-21, Cohen et al. (2005) Clin Cancer Res., 11(5):2063-73, Maloney et al. (2003) Cancer Res., 63(16):5073-83, Jackson-Booth et al. (2003) Horm Metab Res., 35(11-12):850-6), anti-senso (veja Resnicoff et al. (1994) Cancer Res., 54(18):4848-50, Lee et al. (1996) Cancer Res., 56(13):3038-41, Muller et al. (1998) Int J Cancer., 77(4):567-71, Trojan et al. (1993) Science, 259(5091 ):94-7, Shapiro et al. (1994) J Clin Invest., 94(3): 1235-42), mutantes negativos dominantes (Prager et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A., 91(6):2181-5) e inibidores de tirosina quinase de molecula pequena (veja Hopfiier et al. (2006) Biochem Pharmacol. 2006, 71(10):1435- 48 e proteinas ligantes de IGF (IGFBPs - veja Nickerson et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun., 237(3):690-3). Anticorpos monoclonais conhecidos incluem aqueles descritos em: W099/60023, W003/100008, W002/053596, W004/071529, EP0629240B, W003/059951, W003/106621,

W004/083248, W004/087756, US2006452167A. Contudo, ha uma necessidade de anticorpos com funfao efetora aperfeigoada, por exemplo com fun9ao de CDC e/ou de ADCC aperfeigoada.

Estruturas de anticorpo sao bem conhecidas na tecnica e em particular e sabido que a regiao constante de cadeia pesada tem uma cadeia de a?ucar glicosilada, esta pode ser uma cadeia de a?\icar ligada por N-glicosideo por exemplo N-acetil-glicosamina e pode ou nao estar fucosilada.

Metodos para medir os niveis de fucosilafao sao bem conhecidos na tecnica por exemplo, para uma popula9ao de anticorpos, hidrolise acida pode ser usada para remover os monossacarideos da cadeia de a9iicar glicosilada do anticorpo e estas podem ser marcadas com um corante tal como acido 2-amino-benzoico (2-AA). Cromatografia liquida de desempenho alto em fase reversa com detec9ao por fluorescencia pode ser entao realizada e uma curva padrao construida para quantificagao de amostra. A razao de fucose para manose por popula^So de anticorpos pode ser entao calculada.

Descrifao Breve das Figuras

Figura 1: Ligafao de anticorpos monoclonais murinos purificados para IGF-IR de humano detectado por ELISA.

Figuras 2A-E: Liga?ao de anticorpos humanizado 6E11 e quimerico 6E11 purificado em IGF-IR de humano determinada por ELISA. Em Figura 2A, a curva de ligafao para HOLO foi deslocada para a direita devido ao fato de que ο anticorpo estava em concentra9ao muito baixa e nao pode ser acuradamente quantificado. Em Figura 2D, embora a tendencia geral fosse similar, ο sinal foi reduzido comparado com outros ensaios.

Figura 3: Regulafao negativa de receptor IGF-IR apos incuba9ao de celulas 3T3/LISN c4 por 24 horas com anticorpo monoclonal murino 6E11 para IGF-IR de humano.

Figura 4: RegulagSo negativa de receptor IGF-IR apos

incubafao de celulas NCI-H838 por ate 24 horas com anticorpo HOLO humanizado para IGF-IR de humano. Figura 5: Regulafao negativa de receptor IGF-IR e receptor de Insulina apos incubagao de celulas NCI-H838 por 24 horas com HOLO, HOLO IgGlm(AA) ou IgG de humano nao-selecionadora.

Figura 6: Histograma de intensidade fluorescente para niveis IGF-IR em popula9oes de granulocitos e linfocitos apos incuba^ao com HOLO a4°Ce37°C.

Figura 7: Histograma de intensidade fluorescente para niveis de IGF-IR em popula9oes de linfocitos e granulocitos apos incuba^So com HOLO a 4°C e 37°C comparado com um controle de isotipo.

Figura 8: Inibiq^o de fosforilafao de receptor mediada por anticorpos monoclonais murinos purificados 6E11, 5G4 e 15D9.

Figura 9: mostra um exemplo da inibi^So de fosforilafao de receptor mediada por HlLO em compara9ao com ο 6E1 lc.

Figura 10: mostra um exemplo da inibi^ao de fosforila9ao de receptor mediada por HOLO e HOLO IgGlm(AA) e HlLO e HlOLO IgGlm(AA).

Figura 11 A: mostra um exemplo da atividade de varios anticorpos monoclonais murinos purificados no ELISA de competigSo.

Figura 1 IB: mostra um exemplo da atividade de HlLO no ELISA de competifao em comparafao com 6E1 lc.

Figura 12A-C: ELISA de competigSo para demonstrar a capacidade de anticorpos humanizado 6E11 ou quimerico 611 ou monoclonal murino 6E11 para inibir a liga9ao de receptor IGF-IR em um segundo anticorpo neutralizador.

Figura 13A: LigagSo de anticorpos monoclonais murinos purificados em IGF-IR de macaco cinomolgo recombinante determinada por ELISA.

Figura 13B: Ligagao de anticorpos monoclonais humanizados purificados em IGF-IR de macaco cinomolgo recombinante em comparagao com a quimera 6E11 (6Ellc).

Figura 14: Elisa de liga^ao de recepto de insulina usando anticorpos monoclonais murinos purificados.

Figura 15: Elisa de liga^ao de recepto de insulina usando anticorpos humanizados purificados.

Figura 16: Ensaio de FACS para demonstrar que os anticorpos reconhecem a linhagem de celula de tumor Colo205.

Figura 17: Ensaio de FACS para demonstrar que os anticorpos reconhecem a linhagem de celula de tumor de carcinoma de pulmao NCI- H838.

Figura 18: Ensaio de FACS para demonstrar que os anticorpos reconhecem a linhagem de celula de tumor de carcinoma MCF7 e de celula de carcinoma de pulmao A549.

Figura 19: Imuno-histoquimica de amostras de tecido congeladas de amostras de prostata normal e de tumor usando anticorpo monoclonal murino purificado.

Figura 20: Imuno-histoquimica de amostras de tecido congeladas de amostras de tumor de mama usando anticorpo monoclonal murino purificado.

Figura 21: Imuno-histoquimica de amostras de tecido congeladas de amostras de tumor de mama usando anticorpos monoclonais quimerico 6E11 e humanizado Hl LO.

Figura 22: Imuno-histoquimica de amostras de tecido de tumor congelado de amostras de tumor de mama usando anticorpo HOLO biotinilado.

Figura 23: Inibi9ao de proliferaq^o de celulas 3T3/LISN c4 mediada por IGF-IR inibida por anticorpos monoclonais murinos purificados

Figura 24: Inibigao de proliferafao de celulas 3T3/LISN c4 mediada por IGF-IR inibida por anticorpos monoclonais quimerico 6E11 ou humanizado HlLO purificados. Figura 25A-E: InibigSo de proliferate» de celulas 3T3/LISN c4 mediada por IGF-IR inibida anticorpos monoclonais 6E11 murinos purificados ou humanizados purificados.

Figura 26: InibigSo de ciclo celular mediado por IGF por anticorpos monoclonais murinos purificados determinada por coloragao com iodeto de propidio e citometria de fluxo.

Figura 27: Reversao de proteyao mediada por IGF-I de apoptose induzida por camptotecina em celulas NCI-H838 por anticorpo monoclonal 6E11 murino.

Figura 28: : Reversao de prote^ao mediada por IGF-I de apoptose mediada por camptocetina em celulas A549 por anticorpos selecionados.

Figura 29: Ausencia de atividade agonistica de anticorpo monoclonal murino purificado na presen9a de anticorpo de liga^ao cruzada.

Figura 30: Atividade de anticorpo HOLO em pre-adipocitos diferenciados em niveis basais de fosfo-AKT comparado com um anticorpo de controle negativo.

Figura 31: Atividade de anticorpo HOLO em niveis basais de fosfo-AKT em celulas A549.

Figura:32 Atividade de anticorpos humanizados em niveis basais de fosforila?ao de receptor IGF-IR em celulas 3T3/LISNc4.

Figura:33 Atividade de anticorpos humanizados cruzadamente ligados em niveis basais de fosforila9ao de receptor IGF-IR em celulas 3T3/LISn c4.

Figura:34 Atividade de anticorpos humanizados sobre a proliferafao de celulas NCI-H929 na ausencia de estimulafao de ligante.

Figura 35: Inibi9ao de crescimento de tumor 3T3/LISN em camundongos nus apos tratamento com anticorpo monoclonal 6E11. Figura 36: Inibigao de crescimento de tumor 3T3/LISN c4 em camundongos nus apos tratamento com anticorpo monoclonal 6E11.

Figura 37: InibigSo de crescimento de tumor 3T3/LISN c4 em camundongos nus apos tratamento com anticorpos monoclonais humanizado e 6E11.

Figura 38: Inibifao de crescimento de tumor Colo205 em camundongos nus apos tratamento com anticorpo monoclonal 6E11.

Figura 39: Cinetica de ligafao de receptor usando celulas NCI -H838 incubadas com HOLO.

Figura 40: IGF - Ensaio de IigagSo de heterodimero 1R/IR usando celulas Colo-205 e celulas NIH-3T3 recombinantes contra anticorpo 6E11, 6E1 Ic e HOLO mlgG(AA).

Figura 41: Proliferafao de celulas NCI - H929 na presenga de

6E11 e HOLO.

Figura 42: Determinayao de estabilidade de HOLO em soro. Figura 43 : RegulagSo negativa de IGR-IR in vivo em celulas LISN/3T3 c4 apos tratamento com HOLO ou 6E11. Descrigao Breve das Tabelas.

Tabela 1: SEQ ID NO's das cadeias pesada e Ieve variaveis de

hibridoma.

Tabela 2: Valores de IC50 para anticorpos selecionados em ensaios de fosforilafao.

Tabela 2a: Valores de IC50 para anticorpos selecionados em ensaios de fosforilafao s.

Tabela 3: Dados cineticos para anticorpos monoclonais

murinos.

Tabela 4: Dados cineticos para anticorpos monoclonais

humanizados.

Tabela 5: Dados cineticos para anticorpos monoclonais humanizados ambos de Fc inabilitado e de tipo selvagem. Tabela 6: Dados cineticos para anticorpos monoclonals

humanizados.

Tabela 7: Dados cineticos para anticorpos monoclonais

humanizados.

Tabela 8: Dados cineticos para anti-IGF-lR versus IGF-IR de humano e de macaco cinomolgo.

Tabela 9: Valores de inibigao para a superficie de 200 RU's

IGF-1.

Tabela 10: Valores de inibigSo para a superficie de 4000 RU's

IGF-1.

Tabela 11: Neutralizagao de IigagSo de receptor em ligante. Tabela 12: Sumario de analise de imuno-histoquimica de microarranjo de tecido turnout.

Tabela 13: Atividade de varios anticorpos em ensaio de fosforila9ao de AKT.

Tabela 14: Atividade de varios anticorpos em ensaio de fosforila9ao de AKT. Sumario da Invenfao

Em uma modalidade a invenfao fornece um anticorpo ou fragment。de ligante de antigeno do mesmo que especificamente se Iiga em IGF-IR compreendendo CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1 ou uma sua variante que contem 1 ou 2 substituifoes de aminoacido na CDRH3.

Em uma modalidade a inven9ao fornece um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que especificamente se Iiga em IGF-1R, especificamente hlGF-lR e neutraliza a atividade de hlGF-lR, que compreende um dominio variavel de cadeia pesada compreendendo CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1 ou suas variantes nas quais um ou dois residuos de aminoacido dentro de CDRH3 diferem dos residuos de aminoacido na posi?ao correspondente em SEQ. ID. NO: 1. Tambem e fornecido um metodo de produzir um anticorpo como aqui descrito compreendendo expressar em uma linhagem celular um anticorpo ou fragment。de ligante de antigeno do mesmo.

Em outra modalidade e fornecido um kit-de-partes compreendendo a composifao aqui descrita junta com instrufoes para uso.

Tambem e fornecido um metodo para tratar um paciente humano afligido com cancer cujo metodo compreende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da preparayao de anticorpo aqui descrita.

Descri9ao Detalhada da Inven9ao

A presente invenfao fornece um anticorpo ou fragment。de ligante de antigeno do mesmo que especificamente se Iiga em IGF-1R, por exemplo que especificamente se Iiga em hlGF-lR.

Em outra modalidade da presente inven9ao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que especificamente se Iiga em hlGF-lR e neutraliza a atividade de hlGF-lR, que compreende um dominio variavel de cadeia pesada que especificamente se Iiga em IGF-IR compreendendo CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1 ou suas variantes nas quais um ou dois residuos de aminoacido dentro de CDRH3 diferem dos residuos de aminoacido na posigSo correspondente em SEQ. ID. NO: 1.

Em outra modalidade da presente ΐηνεηφδο estas diferenfas em residuos de aminoacido sao substitui^des conservativas.

Em outra modalidade da inven9ao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que especificamente se Iiga em IGF-IR e compreende uma CDRH3 que e uma variante da sequencia mostrada em SEQ ID NO:l na qual um ou dois residuos dentro de dita CDRH3 de dita variante difere(m) do residuo na posi^So correspondente em

SEQ ID NO:l em posigao 7 e/ou posi^So 9 (onde ο primeiro residuo esta em posi9ao 1, W, e onde ο ύΐϋηιο residuo, V, esta em posi9ao 14). Em uma outra modalidade da invengao e fornecido um anticorpo ou fragment。de ligante de antigeno do mesmo que especificamente se Iiga em IGF-IR e compreende uma CDRH3 que e uma variante da sequencia mostrada em SEQ ID NO:l na qual um ou dois residuos dentro de dita CDRH3 de dita variante difere(m) do residuo na posigSo correspondente em SEQ ID NO: 1 por uma substitui?ao de R em S na posigao 7, ou por uma substitui9ao de K em R na posigao 9, ou por uma substitui9ao de R em S na posi9ao 7 e K em R na posiq^o 9.

Em outra modalidade da inven9ao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo adicionalmente compreendendo uma ou mais das seguintes seqiiencias CDRH2 como mostrada em SEQ. ID. NO: 2, CDRHl como mostrada em SEQ. ID. NO: 3, CDRLl como mostrada em SEQ. ID. NO: 4, CDRL2 como mostrada em SEQ. ID. NO: 5, e CDRL3 como mostrada em SEQ. ID. NO: 6.

Em uma modalidade da invengao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo sendo que CDRH1, H2 e H3 e CDRLl e L3 sao de 6E11 e CDR L2 e de 9C7.

Em outra modalidade da presente inven?ao uma ou mais das CDR's do anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo podem compreender variantes das CDR's mostradas nas seqiiencias listadas acima. Cada CDR variante compreendera um ou dois residuos de aminoacido que diferem do residuo de aminoacido na posigSo correspondente na sequencia listada. Tais substitui9oes em residuos de aminoacido por substitui9oes conservativas, por exemplo, substituindo um aminoacido hidrofobico por um aminoacido hidrofobico alternative», por exemplo substituindo Leucina por Valina, ou Isoleucina.

Em uma outra modalidade da invengao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreendendo CDRH3 e adicionalmente compreende uma ou mais das seguintes seqiiencias CDRH2: SEQ. ID. NO: 2, CDRHl: SEQ. ID. NO: 3’ CDRL1: SEQ. ID. NO: 4, CDRL2: SEQ. ID. NO: 7, e CDRL3: SEQ. ID. NO: 6.

Em ainda uma outra modalidade da invengSo e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreendendo CDRH3 e adicionalmente compreende uma ou mais das seguintes seqiiencias CDRH2: SEQ. ID. NO: 2, CDRHl: SEQ. ID. NO: 3, CDRL1: SEQ. ID. NO: 4，CDRL2: SEQ. ID. NO: 7, e CDRL3: SEQ. ID. NO: 6 sendo que uma ou mais das CDR's podem ser substituidas por uma sua variante, cada CDR variante contendo 1 ou 2 substituigSes de aminoacido.

Em uma modalidade ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo da presente invenfao compreende CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1 e CDRHl de SEQ. ID. NO: 3. Em uma outra modalidade ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreende CDRH3 de SEQ ID NO: 1 e CDR L2 de SEQ. ID. NO: 7. Em ainda uma outra modalidade ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo da presente invenfao compreende CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1 e CDRHl de SEQ. ID. NO: 3. e CDR L2 de SEQ. ID. NO: 7.

Em outra modalidade da presente inven9ao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo de acordo com a inven9ao aqui descrita e adicionalmente compreendendo as seguintes CDR's: CDRHl: SEQ. ID. NO: 3 CDRH2: SEQ. ID. NO: 2 CDRH3: SEQ. ID. NO: 1 CDRL1: SEQ. ID. NO: 4 CDRL2: SEQ. ID. NO: 7 CDRL3: SEQ. ID. NO: 6

Em outra modalidade da invengao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que especificamente se Iiga em IGF-IR e compreende CDR's que sao variantes das sequencias mostradas acima.

Em outra modalidade da presente invenfao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que especificamente se Iiga em IGF-IR e compreende um dominio variavel de cadeia pesada de SEQ. ID. NO: 8 e um dominio variavel de cadeia Ieve de SEQ. ID. NO: 9, ou um dominio variavel de cadeia pesada de SEQ. ID. NO: 10 e um dominio variavel de cadeia Ieve de SEQ. ID. NO: 11, ou um dominio variavel de cadeia pesada de SEQ. ID. NO: 12 e um dominio variavel de cadeia Ieve de SEQ. ID. NO: 13, ou um dominio variavel de cadeia pesada de SEQ. ID. NO: 14 e um dominio variavel de cadeia Ieve de SEQ. ID. NO: 16, ou um dominio variavel de cadeia pesada de SEQ. ID. NO: 15 e um dominio variavel de cadeia Ieve de SEQ. ID. NO: 16.

Em outra modalidade da inver^ao e fornecido um dominio variavel de cadeia pesada isolado de um anticorpo compreendendo SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15, por exemplo ele compreende SEQ ID NO: 12.

Em outra modalidade da presente inver^ao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreendendo CDR's de acordo com a inver^ao aqui descrita, ou dominios variaveis de cadeia pesada ou Ieve de acordo com a inven^ao aqui descrita, sendo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo e de rato, camundongo, primata (e.g. macaco cinomolgo, macaco do Velho Mundo ou Macaco Antropoide Grande) ou humano.

Em outra modalidade da presente invei^ao ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo aqui descrito adicionalmente se Iiga em IGF-IR de primata, por exemplo IGF-IR de macaco cinomolgo.

Em outra modalidade da presente inven9ao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreendendo uma ou mais das seguintes CDR1 s: CDRH3 como mostrada em como mostrada em SEQ. ID. NO: 1, CDRH2 como mostrada em SEQ. ID. NO: 2, CDRHl como mostrada em SEQ. ID. NO: 3, CDRLl como mostrada em SEQ. ID. NO: 4, CDRL2 como mostrada em SEQ. ID. NO: 5 e CDRL3 como mostrada em SEQ. ID. NO: 6 no contexto de um molde humano, por exemplo como um anticorpo humanizado ou quimerico.

Em outra modalidade da presente inven9ao ο dominio variavel de cadeia pesada humanizada compreende as CDR's listadas em SEQ ID NO: 1-3 dentro de um molde de anticorpo aceptor tendo mais do que 80% de identidade nas regioes de molde, ou mais do que 85%, ou mais do que 90%, ou mais do que 95%, ou mais do que 98%, ou mais do que 99% de identidade nas regioes de molde com a seqiiencia aceptora humana em SEQ ID NO: 59.

Em outra modalidade da presente ΐηνεηςδο ο dominio variavel de cadeia Ieve humanizada compreende as CDR's listadas em SEQ ID NO: 4- 6 dentro de um molde de anticorpo aceptor tendo mais do que 80% de identidade nas regioes de molde, ou mais do que 85%, ou mais do que 90%, ou mais do que 95%, ou mais do que 98%, ou mais do que 99% de identidade nas regioes de molde com a seqiiencia aceptora humana em SEQ ID NO: 60.

Em SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60 a posi^o das sequencias de CDR tem sido denotadas como Xaa's.

Em uma modalidade da invenfao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreendendo CDR's de acordo com a ίηνεηςδο aqui descrita, ou dominios variaveis de cadeia pesada ou cadeia Ieve de acordo com a invenyao aqui descrita sendo que ο anticorpo tem uma meia-vida de pelo menos 5 dias, ou pelo menos 7 dias ou pelo menos 9 dias em um modelo animal murino.

Em outra modalidade da presente invenfao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreendendo CDR's de acordo com a invengao aqui descrita, ou dominios variaveis de cadeia pesada ou Ieve de acordo com a inven?ao descrita sendo que ο anticorpo adicionalmente compreende uma regiao constante, que pode ser qualquer isotipo ou subclasse. Em uma modalidade a regiao constante de cadeia pesada e do isotipo IgG, por exemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 ou suas variantes. Em uma modalidade ο anticorpo e IgGl.

Em outra modalidade da presente invenfao e fornecido um anticorpo de acordo com a invengSo aqui descrita e compreendendo uma regiao constante de tal modo que ο anticorpo tem funcionalidade efetora ou de ativa^ao de complemento e/ou ADCC reduzida. Em uma tal modalidade a regiao constante de cadeia pesada pode compreender uma regiao constante naturalmente inabilitada de isotipo IgG2 ou IgG4 ou uma regiao constante de IgGl mutada. Exemplos de modifica9oes adequadas sao descritos em EP0307434. Um exemplo compreende as substitui9oes de residuos de alanina nas posi9oes 235 e 237 (numera?ao de indice EU). Em outra modalidade da presente invenpao e fornecido um

anticorpo de acordo com a inven9ao aqui descrita sendo que ο anticorpo e capaz de pelo menos alguma funfao efetora por exemplo sendo que ele e capaz de alguma ίυηςδο de ADCC e/ou CDC. Em outra modalidade da presente inven9ao e fornecido um anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante que especificamente se Iiga em IGF-1R, por exemplo IGF-IR de humano compreendendo CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1 ou sua variante que contem 1 ou 2 substitui9oes de aminoacido na CDRH3, por exemplo um anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante compreendendo CDR's selecionadas de CDRHl: SEQ. ID. NO: 3, CDRH2: SEQ. ID. NO: 2, CDRH3: SEQ. ID. NO: 1, CDRL1: SEQ. ID. NO: 4, CDRL2: SEQ. ID. NO: 7 e CDRL3: SEQ. ID. NO: 6, e que adicionalmente

compreende uma regiao constante de IgGl de tipo selvagem, IgG2 de tipo selvagem, IgG3 de tipo selvagem, IgG4 de tipo selvagem ou suas versoes aperfeigoadas.

Em outra modalidade da presente inven^ao ο anticorpo aqui descrito compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante, especificamente se Iiga em um receptor de fator de crescimento selecionado de IGF-1R, EGFR, HER-2 ou HER-3.Por exemplo que especificamente se Iiga em HER-2 ou HER-3 ou por exemplo que especificamente se Iiga em IGF-IR ou EGRF, por exemplo IGF-IR de humano.

Em uma modalidade ο anticorpo da presente invensao esta ligado em um ou mais anticorpos de dominio com especificidade por VEGF ou EGFR.

Em outra modalidade da presente inven^ao e fornecido um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo de acordo com a inven9ao aqui descrita que compreende uma ou mais mutafoes em sua regiao constante de cadeia pesada de tal modo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tern fun^ao efetora aperfeigoada. Por exemplo, sendo que ele tem ADCC aperfei?oada ou CDC aperfei?oada ou sendo que ele tem ambas fun9oes efetoras de ADCC e de CDC aperfei?oadas. Exemplos de modificafoes adequadas sao descritos em Shields et al. J. Biol. Chem (2001) 276:6591-6604, Lazar et al. PNAS (2006) 103:4005-4010 e US6737056, W02004063351 e W02004029207. Em outra modalidade da presente invenyao e fornecido um anticorpo compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligada em uma regiao constante de cadeia pesada que especificamente se Iiga em IGF-1R, por exemplo IGF-IR de humano. O anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo pode compreender CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1 ou suas variantes nas quais um ou dois residuos de aminoacido dentro de CDRH3 diferem dos residuos de aminoacido na posi9ao correspondente em SEQ. ID. NO: 1 e compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada mutada de tal modo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo tem fun^ao efetora aperfei^oada comparado com ο tipo selvagem. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que especificamente se Iiga em IGF-IR compreendendo CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1，por exemplo um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreendendo CDR's selecionadas de CDRHl: SEQ. ID. NO: 3，CDRH2: SEQ. ID. NO: 2, CDRH3: SEQ. ID. NO: 1, CDRL1: SEQ. ID. NO: 4, CDRL2: SEQ. ID. NO: 7 e CDRL3: SEQ. ID. NO: 6 e compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada mutada de tal modo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo tem fun9ao efetora aperfei^oada comparado com ο tipo selvagem. Em outra modalidade da presente inven9ao, tais muta9oes estao em uma ou mais posi9oes selecionadas de 239, 332 e 330 (IgG 1), ou posi9oes equivalentes em outros isotipos de IgG. Exemplos de muta9oes adequadas sao S239D e I332E e A330L. Em uma modalidade ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno esta mutado nas posi9oes 239 e 332, por exemplo S239D e I332E, por exemplo esta mutado em tres ou mais posi9oes selecionadas de 239 e 332 e 330, por exemplo S239D e I332E e A3 3 OL.

Em outra modalidade da presente invenpao e fornecido um anticorpo compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligada em uma regiao constante de cadeia pesada de acordo com a ίηνεηςδο aqui descrita e compreendendo uma regiao constante selecionada daquelas mostradas em SEQ ID NO: 64 e SEQ ID. NO: 66, por exemplo um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno compreendendo os dominios variaveis de SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15 junto com a regiao constante de cadeia pesada como mostrada em SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 66, por exemplo um anticorpo compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada ou fragmento de Iigante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 64. Em uma outra modalidade da presente invengSo e fornecido um anticorpo compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de cadeia pesada de acordo com a ΐηνεηφδο aqui descrita e compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada selecionada daquelas mostradas em SEQ ID NO: 64 e SEQ ID. NO: 66, por exemplo anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreendendo os dominios variaveis de SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16 junto com a regiao constante de cadeia pesada como mostrada em SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 66, por exemplo um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreendendo SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 64.

Em outra modalidade da presente invenfao e fornecido um anticorpo compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de cadeia pesada de acordo com a inven9ao aqui descrita que compreende uma regiao constante de cadeia pesada com um perfil de glicosila9ao alterado de tal modo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo tem fun9ao efetora aperfeigoada. Por exemplo, sendo que ele tem ADCC aperfeigoada ou CDC aperfei^oada ou sendo que ele tem ambas as fun9oes efetoras de ADCC e CDC aperfei^oadas. Exemplos de tais metodologias para produzir anticorpos com um perfil de glicosila^ao alterado sao descritos em W02003011878, W02006014679 e EP1229125.

Em outra modalidade da presente inver^o e fornecido um anticorpo compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de cadeia pesada de acordo com a invenySo aqui descrita que especificamente se Iiga em IGF-1R, por exemplo IGF-IR de humano. O anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo pode compreender CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1 ou suas variantes nas quais um ou dois residuos de aminoacido dentro de CDRH3 diferem dos residuos de aminoacido na posi9ao correspondente em SEQ. ID. NO: 1 e compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada com um perfil de glicosila^So alterado de tal modo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tem funfao efetora aperfeifoada quando comparado com ο tipo selvagem.

Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que especificamente se Iiga em IGF-1R, por exemplo IGF-IR de humano compreendendo CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1, por exemplo um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreendendo CDR's selecionadas de CDRHl: SEQ. ID. NO: 3, CDRH2: SEQ. ID. NO: 2, CDRH3: SEQ. ID. NO: 1, CDRL1: SEQ. ID. NO: 4，CDRL2: SEQ. ID. NO: 7 e CDRL3: SEQ. ID. NO: 6 e compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada com um perfil de glicosilaq;ao alterado de tal modo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tem ίύης^ο efetora aperfeigoada quando comparado com ο tipo selvagem.

Em uma modalidade a ϊηνεηςδο fornece uma prepara9ao de anticorpo sendo que a razao de fucose para manose em dita prepara9ao de anticorpo e 0,8:3 ou menos, por exemplo e 0,7:3 ou menos, ou e 0,6:3 ou menos ou e 0,5:3 ou menos ou e 0,4:3 ou menos ou e 0,3:3 ou menos, ou e 0,2:3 ou menos ou e 0,1:3 ou menos. Em uma modalidade a prepara9ao de anticorpo contem fucose nao ligada ou desprezivel.

Em outra modalidade da presente inven^ao e fornecida uma prepara9ao de anticorpo compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo compreendendo os dominios variaveis de SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16 e sendo que a razao de fucose para manose em dita prepara9ao de anticorpo e 0,8:3 ou

menos, por exemplo e 0,7:3 ou menos, ou e 0,6:3 ou menos ou e 0,5:3 ou menos ou e 0,4:3 ou menos ou e 0,3:3 ou menos, ou e 0,2:3 ou menos ou e 0,1:3 ou menos. Em uma modalidade a preparafao de anticorpo contem fucose nao ligada ou desprezivel.

Em outra modalidade da presente invengao e fornecido um anticorpo compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de cadeia pesada de acordo com a inven9ao aqui descrita que compreende uma regiao constante de cadeia pesada mutada e um perfil de glicosila?ao alterado de tal modo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tem ίΐιης^ο efetora aperfeigoada, por exemplo sendo que ele tem uma ou mais das seguintes fUr^Ses，ADCC aperfei^oada ou CDC aperfeigoada, por exemplo sendo que ele tem fiinfao de ADCC aperfei^oada.

Em uma modalidade da inven^ao e fornecida uma preparagao de anticorpo compreendendo anticorpos como aqui descrito que compreende uma regiao constante de cadeia pesada de imunoglobulina, ou seus fragmentos de ligante de antigeno que estao ligados em uma regiao constante de cadeia pesada de imunoglobulina sendo que dita regiao constante de cadeia pesada de imunoglobulina concede uma fun9ao efetora ao anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno, e sendo que dito anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno especificamente se Iiga em um receptor de fator de crescimento e sendo que dita regiao constante de cadeia pesada de imunoglobulina esta mutado em pelo menos 2 posi^Ses e tem um perfil de glicosila9ao alterado de tal modo que a razao de fucose para manose e 0,8:3 ou menos de modo que dito anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tem uma funfao efetora aperfei9oada em comparayao com um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno equivalente com uma regiao constante de cadeia pesada de imunoglobulina faltante de ditas muta9oes e perfil de glicosilayao alterado. O perfil de glicosilagao alterado de dita preparagao de anticorpo nao e uma conseqiiencia de ditas mutafoes em cadeia pesada de imunoglobulina. Por exemplo, tais anticorpos ou fragmentos de ligante de antigeno especificamente se ligam em IGF-1R, por exemplo IGF-IR de humano e compreendem CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1, por exemplo um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno compreendendo CDR's selecionadas de CDRHl: SEQ. ID. NO: 3, CDRH2: SEQ. ID. NO: 2, CDRH3: SEQ. ID. NO: 1, CDRL1: SEQ. ID. NO: 4, CDRL2: SEQ. ID. NO: 7 e CDRL3: SEQ. ID. NO: 6 e compreendem uma regiao constante de cadeia pesada mutada e tem um perfil de glicosilagao alterado de tal modo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tem fun9ao efetora aperfei9oada. Por exemplo tais anticorpos ou fragmentos de ligante de antigeno pode compreender os dominios variaveis de SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16.

Em uma tal modalidade, as muta9oes estao em uma ou mais das posi9oes selecionadas de 239, 332 e 330 (IgG 1), ou posi^oes equivalentes em outros isotipos de IgG. Exemplos de muta9oes adequadas sao S239D e I332E e A330L. Em uma modalidade ο anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante tem uma mutagao em 239 e 332, por exemplo S239D e I332E ou adicionalmente pode compreender muta9oes em tres ou mais posi9oes selecionadas de 239 e 332 e 330, por exemplo S239D e I332E e A330L.

Em uma modalidade a razao de fucose para manose em dita preparagao de anticorpo e 0,8:3 ou menos, por exemplo e 0,7:3 ou menos, ou e 0,6:3 ou menos ou e 0,5:3 ou menos ou e 0,4:3 ou menos ou e 0,3:3 ou menos, ou e 0,2:3 ou menos ou e 0,1:3 ou menos. Em uma modalidade a preparafao de anticorpo contem fucose nao ligada ou desprezivel.

Em outra modalidade da presente invengao e fomecido um anticorpo compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de cadeia pesada de acordo com a inven9ao aqui descrita que compreende uma regiao constante de cadeia pesada quimerica por exemplo sendo que ele compreende pelo menos um dominio CH2 de IgG3 de tal modo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tem fun9ao efetora aperfeifoada, por exemplo sendo que ele tem uma ou mais das seguintes fun9oes, ADCC aperfeifoada ou CDC aperfeigoada, por exemplo sendo que ele tem CDC aperfei9oada. Por exemplo ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno pode compreender um dominio CH2 de IgG3 ou ambos dominios CH2 podem ser de IgG3.

Em uma outra modalidade da presente ίηνεηςδο e fornecido um anticorpo compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de cadeia pesada de acordo com a inven9ao aqui descrita que compreende uma regiao constante de cadeia pesada quimerica e mutada por exemplo sendo que ele compreende pelo menos um dominio CH2 de IgG3 e um dominio CH2 de IgGl sendo que ο dominio CH2 de IgGl tem uma ou mais muta9oes nas posiq^es selecionadas de 239 e 332 e 330, por exemplo as muta9oes sao selecionadas de S239D e I332E e A33OL de tal modo que ο anticorpo tem funfao efetora aperfei^oada, por exemplo sendo que ele tem uma ou mais das seguintes fun9oes, ADCC aperfeigoada ou CDC aperfei9oada, por exemplo sendo que ele tem ADCC aperfei?oada e CDC aperfei9oada. Em uma modalidade ο dominio CH2 de IgGl tem as mutates S239D e I332E.

Em outra modalidade da presente invengao e fornecido um anticorpo compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de cadeia pesada de acordo com a ΐηνεηςδο aqui descrita que compreende uma regiao constante de cadeia pesada quimerica e um perfil de glicosila9ao alterado de tal modo que a regiao constante de cadeia pesada compreende pelo menos um dominio CH2 de IgG3 e um dominio CH2 de IgGl e que tern um perfil de glicosila9ao alterado de tal modo que a razao de fUcose para manose e 0,8:3 ou menos de modo que dito anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tem uma fun^ao efetora aperfei?oada em compara9ao com um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno equivalente com uma regiao constante de cadeia pesada de imunoglobulina faltante de ditas muta9oes e perfil de glicosilapSo alterado, de tal modo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tem funfao efetora aperfei9oada, por exemplo sendo que ele tem uma ou mais das seguintes fun9oes, ADCC aperfei9oada ou CDC aperfeigoada, por exemplo sendo que ele tem ADCC aperfei?oada e CDC aperfeigoada.

Em uma modalidade alternativa ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tem pelo menos um dominio CH2 de IgG3 e pelo menos um dominio constante de cadeia pesada de IgGl sendo que ambos os dominios CH2 de IgG estao mutados de acordo com as limitagdes aqui descritas.

Em outra modalidade da presente invenfao e fornecida uma preparagao de anticorpo compreendendo um anticorpo compreendendo uma regiao constante de cadeia pesada ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de cadeia pesada que compreende uma regiao constante de cadeia pesada quimerica e mutada sendo que dita preparaQao de anticorpo tem um perfil de glicosila?ao alterado de tal modo que ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tem funfao efetora aperfeifoada, por exemplo sendo que ele tem uma ou mais das seguintes fun9oes, ADCC aperfei^oada ou CDC aperfeifoada. Em uma modalidade as muta?5es sao selecionadas de posigdes 239 e 332 e 330, por exemplo as muta9oes sao selecionadas de S239D e I332E e A330L. Em uma outra modalidade a regiao constante de cadeia pesada compreende pelo menos um dominio CH2 de IgG3 e um dominio CH2 de IgGl. Em uma modalidade a regiao constante de cadeia pesada tem um perfil de glicosilafao alterado de tal modo que a razao de fucose para manose e 0,8:3 ou menos de modo que dito anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno tem uma flmsao efetora aperfeifoada em comparagao com um anticorpo nao quimerico equivalente ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo com uma regiao constante de cadeia pesada de imunoglobulina faltante de ditas mutafoes e perfil de glicosila9ao alterado.

Em outra modalidade da presente inver^ao e fornecido uma celula hospedeira recombinante transformada, transfectada ou transduzida compreendendo pelo menos um cassete de expressao, por exemplo onde ο cassete de expressao compreende um polinucleotideo codificador de uma cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo de acordo com a inven9ao aqui descrita e adicionalmente compreende um polinucleotideo codificador de uma cadeia Ieve de um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo de acordo com a invenfao aqui descrita ou onde ha dois cassetes de expressao e ο 1° codifica a cadeia Ieve e ο segundo codifica a cadeia pesada. Por exemplo em uma modalidade ο primeiro cassete de expressao compreende um polinucleotideo codificador de uma cadeia pesada de um anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de acordo com a inven9ao aqui descrita e adicionalmente compreende um segundo cassete compreendendo um polinucleotideo codificador de uma cadeia Ieve de um anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de acordo com a invenfao aqui descrita por exemplo ο primeiro cassete de expressao compreende um polinucleotideo codificador de uma cadeia pesada selecionada de SEQ. ID. NO: 40, SEQ. ID. NO: 41 ou SEQ. ID. NO: 67 ou SEQ. ID. NO: 70 e um segundo cassete de expressao compreendendo um polinucleotideo codificador de uma cadeia Ieve selecionada de SEQ. ID. NO: 42 ou SEQ. ID. NO: 69.

Em outra modalidade da inver^ao e fornecido uma celula hospedeira estavelmente transformada compreendendo um vetor compreendendo um ou mais cassetes de expressao codificadores de uma cadeia pesada e/ou uma cadeia Ieve do anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante como aqui descrito. Por exemplo tais celulas hospedeiras podem compreender um primeiro vetor codificador da cadeia Ieve e um segundo vetor codificador da cadeia pesada, por exemplo ο primeiro vetor codifica uma cadeia pesada selecionada de SEQ. ID. NO: 37, SEQ. ID. NO: 38 ou SEQ. ID. NO: 68 e um segundo vetor codificador de uma cadeia Ieve por exemplo a cadeia Ieve de SEQ ID NO: 39.

Em outra modalidade da presente ίηνεηςδο e fornecida uma celula hospedeira de acordo com a invenfao aqui descrita sendo que a celula e eucariotica, por exemplo onde a celula e de mamifero. Exemplos de tais linhagens de celula incluem CHO ou NSO.

Em outra modalidade da presente inver^ao e fornecido um m^todo para a produfao de um anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de acordo com a inven9ao aqui descrita cujo metodo compreende a etapa de cultivar uma celula hospedeira em um meio de cultura, por exemplo meio de cultura livre de soro. Tambem e fornecido um metodo de produzir um anticorpo como aqui descrito compreendendo expressar em uma linhagem celular um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que tern sido adaptado para regular a presen^a ou ausencia de ligagao de iucose em uma cadeia de agiicar ligada em N-glicosideo que se Iiga na molecula imunologicamente ilmcional.

Em outra modalidade da presente inver^ao e fornecido um metodo de acordo com a invengao aqui descrita sendo que dito anticorpo e adicionalmente purificado para pelo menos 95% ou mais (e.g. 98% ou mais) com respeito ao dito anticorpo contendo meio de cultura livre de soro.

Em outra modalidade da presente invengao e fornecida uma composi^ao farmaceutica compreendendo um anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de acordo com a inver^So aqui descrita e um veiculo farmaceuticamente aceitavel.

Em outra modalidade da presente inverts。e fornecido um kit- de-partes compreendendo a composi9ao de acordo com a inven9ao aqui descrita junto com instrufoes para uso.

Em outra modalidade da presente invengao e fornecido um metodo para tratar um paciente humano afligido com artrite reumatoide cujo metodo compreende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de acordo com a invengao aqui descrita. O anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante pode estar em combinafao com um veiculo farmaceuticamente aceitavel.

Em outra modalidade da presente invengao e fornecido um metodo para tratar um paciente humano afligido com cancer cujo metodo compreende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de acordo com a invenfao aqui descrita. O anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante pode estar em combina^So com um veiculo farmaceuticamente

aceitavel. Em outra modalidade da presente inven9ao e fornecido um metodo para tratar um paciente humano afligido com retinopatia diabetica cujo metodo compreende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de acordo com a inven9ao aqui descrita. O anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante pode estar em combinafao com um veiculo farmaceuticamente aceitavel.

Em outra modalidade da presente inven9ao e fornecido um metodo para tratar um paciente humano afligido com degenera?ao macular cujo metodo compreende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de acordo com a invenfao aqui descrita. O anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante pode estar em combinafao com um veiculo farmaceuticamente aceitavel.

Em uma outra modalidade da presente ίηνβηςδο e fornecido um metodo para tratar um paciente humano afligido com cancer cujo metodo compreende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composi9ao farmaceutica compreendendo um anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de acordo com a inven^ao aqui descrita e um veiculo farmaceuticamente aceitavel.

Em outra modalidade da presente inven^ao e fornecido ο uso de um anticorpo compreendendo uma regiao constante ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo que esta ligado em uma regiao constante de acordo com a invenfao aqui descrita na manufatura de um medicamento para ο tratamento de uma doenfa ou um distiirbio selecionada(o) do grupo consistindo de doen9as neovasculariza9ao tais como Retinopatia Diabetica Proliferativa, glaucoma neovascular e Degenera^ao Macular Relacionada com a Idade (AMD) tambem doengas ou distiirbios selecionadas(os) do grupo consistindo de; Artrite reumatoide, Psoriase ou Canceres por exemplo: Leucemia Linfoblastica Aguda, Carcinoma Adrenocortical, Canceres Relacionados com AIDS, Linfoma Relacionado com AIDS, Cancer Anal, Astrocitoma Cerebelar da Infancia, Astrocitoma Cerebral da Infancia, Cancer Colorretal, Carcinoma de Celula Basal, Cancer de Duto Biliar Extra-hepatico, Cancer de Bexiga, Osteossarcorna/Cancer Osseo Histocitoma Fibroso Maligno, Tumores Cerebrais (e.g., Glioma de Tronco Cerebral, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral/Glioma Maligno, Ependimoma, Meduloblastoma, Tumores Neuroectodermais Primitivos Supratentoriais, Glioma Hipotalamico e de Via Visual), Cancer de Mama, Carcinoides/Adenocarcinomas Bronquiais, Linfoma de Burkitt, Tumor Carcinoide, Tumor Carcinoide Gastrointestinal, Carcinoma de Sitio Primario Desconhecido, Carcinoma de Sistema Nervoso Central Primario, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral/Glioma Maligno, Cancer Cervical, Canceres da Infancia, Leucemia Linfocitica Cronica, Leucemia Mielogena Cronica, Disturbios Mieloproliferativos Cronicos, Cancer de Colon, Cancer Colorretal, Linfoma de Celula-T Cutanea, Cancer Endometrial, Ependimoma, Cancer Esofagico, Familia de Tumores de Ewing, Tumor de Celula Germinativa Extracranial, Tumor de Celula Germinativa Extragonadal, Cancer de Duto Biliar Extra-hepatico, Cancer Ocular Melanoma Intraocular, Cancer Ocular Retinoblastoma, Cancer de Vesicula Biliar, Cancer Gastrico (Estomago), Tumor Carcinoide Gastrointestinal, Tumores de Celula Germinativa (e.g., Extracranial, Extragonadal, e Ovariano), Tumor Trofoblastico Gestacional, Glioma (e.g., Adulto, Tronco Cerebral da Infancia, Astrocitoma Cerebral da

Infancia, de Via Visual da Infancia e Hipotalamico), Leucemia de Celula Pilosa, Cancer de Cabefa e Pesco?o, Cancer Hepatocelular (Figado), Linfoma de Hodgkin, Cancer Hipofaringeo, Glioma de Via Visual e Hipotalamico, Melanoma Intraocular, Carcinoma de Celula das Ilhotas (Pancreas Endocrino), Sarcoma de Kaposi, Cancer de Rim (Celula Renal), Cancer Laringeo, Leucemia (e.g., Linfoblastica Aguda, Mieloide Aguda, Linfocitica Cronica, Mielogena Cronica, e Celula Pilosa), Cancer de Cavidade Oral e de Labio, Cancer de Figado, Cancer de Pulmao de Celula Nao-Pequena, Cancer de Pulmao de Celula Pequena, Linfoma (e.g., Relacionado com AIDS, de Burkitt, de Celula-T Cutanea, de Hodgkin, de Nao-Hodgkin, e Sistema Nervoso Central Primario), Macroglobulinemia de Waldenstrom, Histiocitoma Fibroso Maligno de Osso/Osteossarcoma, Meduloblastoma, Melanoma, Melanoma Intraocular (Olho), Melanoma de Celula de Merkel, Mesotelioma, Cancer de Pescc^o Escamoso Metastatico com Sindrome de Neoplasia Endocrima Miiltipla, Primaria Oculta, Neoplasma de Celula Plasmatica/Mieloma Miiltiplo, Micose Fungoide, Sindromes Mieloplasticas, Doen^as Mieloproliferativas/Mielodisplasticas, Leucemia Mielogena, Leucemia Mieloide Cronica, Linfoma Multiplo, Distiirbios Mieloproliferativos Cronicos, Cancer de Sino Paranasal e Cavidade Nasal, Cancer Nasofaringeo, Neuroblastoma, Cancer Oral, Cancer Orofaringeo Osteossarcoma/Histiocitoma Fibroso Maligno de Osso, Cancer Ovariano, Cancer Epitelial Ovariano, Tumor de Celula Germinativa Ovariana, Tumor Potencial Maligno Baixo Ovariano, Cancer Pancreatico, Cancer Pancreatico de Celula das Ilhotas, Cancer de Cavidade Nasal e de Sino Paranasal, Cancer de Paratiroide, Cancer de Penis, Feocromocitoma, Pineoblastoma, Tumor de Pituitaria, Neoplasma de Celula Plasmatica/Linfoma ΜύΜρΙο, Blastoma Pleuropulmonar, Linfoma de Sistema Nervoso Central Primario, Cancer de Prostata, Cancer Retal, Cancer de Celula Renal (Rim), Cancer de Celula Transicional de Uretra e de Pelvis Renal, Retinoblastoma,

Rabdomiossarcoma, Cancer de Glandula Salivar, Sarcoma de Tecido Mole, Sarcoma Uterino, Sindrome de Sezary, Cancer de Pele Nao-Melanoma, Carcinoma de Pele de Celula de Merkel, Cancer de Intestino Delgado, Sarcoma de Tecido Mole, Carcinoma de Celula Escamosa, Linfoma de Celula-T Cutanea, Cancer Testicular, Timoma, Carcinoma Timico, Cancer de Tiroide, Tumor Trofoblastico Gestacional, Carcinoma de Sitio Primario Desconhecido, Cancer de Sitio Primario Desconhecido, Cancer de Uretra, Cancer Uterino Endometrial, Sarcoma Uterino, Cancer Vaginal, Glioma Hipotalamico e de Via Visual, Cancer Vulvar, Macroglobulinemia de Waldenstrom, e Tumor de Wilms.

Em outra modalidade da presente invengao e fornecido um metodo de acordo com a invengao aqui descrita sendo que ο paciente esta afligido com um ou mais de: Retinopatia Diabetica Proliferativa, Degenera^ao Macular Relacionada com a Idade (AMD), glaucoma neovascular, Artrite reumatoide, Psoriase, Cancer Colorretal, Cancer de Mama, Cancer de Prostata, Cancer de Pulmao ou Mieloma Definifoes

O termo "anticorpo” e aqui usado no sentido mais amplo e especificamente cobre anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecificos (e.g. anticorpos biespecificos), e fragmentos de anticorpo desde que exibam a atividade biologica desejada. Estes sao explicados mais tarde com mais detalhe.

O termo "anticorpo monoclonal" como aqui usado refere-se a um anticorpo obtido de uma populagao de anticorpos substancialmente homogeneos i.e. os anticorpos individuals compreendendo a popula9ao sao identicos exceto para as possiveis muta9oes naturalmente ocorrentes que podem estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais sao elevadamente especificos sendo direcionados contra um sitio de IigagSo antigenica iinico. Ademais, em contraste com as prepara9oes de anticorpo policlonal que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes (epitopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal e direcionado contra um iinico determinante no antigeno.

"Identidade," significa, para polinucleotideos e polipeptideos, conforme for ο caso, a comparagao calculada usando um algoritmo derivado de (1) e (2) abaixo:

(1) Identidade para polinucleotideos e calculada pela multiplicafao do niimero total de nucleotideos em uma dada seqiiencia pelo niimero inteiro defmindo a identidade percentual dividido por 100, e entao subtra9ao daquele produto de dito niimero total de nucleotideos em dita seqiiencia, ou:

nn < xn - (xn · y) sendo que nn e ο niimero de altera9oes em nucleotideo, xn έ ο niimero total de nucleotideos em uma dada seqiiencia, y e 0,95 para 95%, 0,97 para 97% ou 1,00 para 100%, e · e ο simbolo para ο operador de multiplica9ao, e sendo que qualquer produto nao-inteiro de xn e y e arredondado para baixo para ο niimero inteiro mais proximo antes da sua subtra9ao de xn. Altera9oes de uma seqiiencia de polinucleotideo codificadora de um polipeptideo podem criar muta9oes de deslocamento de fase, de nonsense, ou missense nesta seqiiencia codificadora e deste modo alterar ο polipeptideo codificado pelo polinucleotideo apos tais altera9oes.

(2) Identidade de polipeptideos e calculada pela multiplica9ao do niimero total de aminoacidos pelo niimero inteiro defmindo a identidade percentual dividida por 100 e entao subtra9ao daquele produto de dito niimero total de aminoacidos, ou:

na < xa - (xa · y) sendo que na έ ο niimero de altera9oes de aminoacido, xa έ ο niimero total de aminoacidos na seqiiencia, y e 0,95 para 95%, 0,97 para 97% ou 1,00 para 100%, e · e ο simbolo para ο operador de multiplicagao, e sendo que qualquer produto nao-inteiro de xa e y e arredondado para baixo para ο numero inteiro mais proximo antes de sua subtra9ao de xa.

O termo "Variante(s)" como aqui usado, refere-se a um polinucleotideo ou polipeptideo que difere de um polinucleotideo ou polipeptideo de referencia respectivamente, mas mantem propriedades essenciais. Uma variante tipica de um polinucleotideo difere em sequencia de nucleotideos do outro polinucleotideo de referencia. Mudan?as na sequencia de nucleotideos da variante podem ou nao alterar a sequencia de aminoacidos de um polipeptideo codificado pelo polinucleotideo de referencia. Mudangas de nucleotideo podem resultar em substituifoes, adi9oes, delegdes de aminoacido, proteinas de fusao e truncamentos no polipeptideo codificado pela sequencia de referencia, como discutido abaixo. Uma variante tipica de um polipeptideo difere em sequencia de aminoacidos do outro polipeptideo de referencia. Geralmente, diferen^as sao limitadas de modo que as sequencias do polipeptideo de referencia e da variante sejam aproximadamente similares no total e, em muitas regiSes, identicas. Uma variante e polipeptideo de referencia podem diferir em sequencia de aminoacidos por uma ou mais substitui9oes, adi^es, dele9oes em qualquer combina^ao. Um residuo de aminoacido substituido ou inserido pode ou nao ser um codificado pelo codigo genetico. E bem reconhecido na tecnica que certas substituifSes de aminoacido sao consideradas como sendo "conservativas". Aminoacidos sao divididos em grupos baseados em propriedades de cadeia lateral comuns e substitui9oes dentro de grupos que mantem toda ou substancialmente toda a afinidade de liga9ao do anticorpo da invenfao ou fragment。de ligante de antigeno do mesmo sao consideradas como substituigoes conservativas, veja tabela abaixo:

Cadeia Lateral Membros Hidrofobica Met, Ala, Val5 Leu, lie Hidrofilica Neutra Cys5 Ser, Thr Acida Asp, Glu Basica Asn, Gin, His, Lys，Arg Residuos que influenciam a orienta?So da cadeia Gly, Pro Aromatica Trp, Tyr，Phe Em alguns aspectos da invengao variantes nas quais varios, por exemplo 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 residuos de aminoacido ou 1 residuo de aminoacido estao substituidos, deletados, ou adicionados em qualquer combina^ao podem estar incluidos. Uma variante de um polinucleotideo ou polipeptideo pode ser uma naturalmente ocorrente tal como uma variante alelica, ou pode ser uma variante que e desconhecida em ocorrer naturalmente. Variantes nao-naturalmente ocorrentes de polinucleotideos e polipeptideos podem ser preparadas por tecnicas de mutagenese, por sintese direta，e por outros metodos recombinantes conhecidos por tecnicos experientes.

"Isolado" significa alterado "pela mao do homem" de seu estado natural, tendo sido modificado ou removido de seu ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleotideo ou um polipeptideo naturalmente presente em um organismo vivo esta nao "isolado", mas ο mesmo polinucleotideo ou polipeptideo separado dos materials coexistentes de seu estado natural esta "isolado", incluindo mas nao limitado a quando tal polinucleotideo ou polipeptideo e introduzido de volta em uma celula, ate mesmo se a celula for da mesma especie ou do mesmo tipo da qual ο polinucleotideo ou polipeptideo foi separado.

Em todo ο presente relatorio descritivo e nas reivindica9oes acompanhantes ο termo "compreendendo" e "compreende" incorpora "consistindo de e "consiste de". Isto e, estas palavras sao intencionadas para cobrirem a inclusao possivel de outros elementos ou numeros inteiros nao especificamente citados, onde ο context。permite.

O termo "perfil de glicosilaySo” como aqui usado refere-se aos niveis de glicosilafao em uma populafao de anticorpos.

O termo "especificamente se Iiga em" como usado em todo ο presente relatorio descritivo em rela^ao aos anticorpos e seus fragmentos de ligante de antigeno da inven?ao significa que ο anticorpo se Iiga em IGF-IR de humano (hlGF-lR) com nenhuma liga?ao ou ligagao insignificante em outras proteinas de humano. O termo contudo nao exclui ο fato de que os anticorpos da invenfao tambem podem reagir cruzadamente com outras formas de IGF-1R, por exemplo IGF-IR de primata.

O termo "neutraliza" como usado em todo ο presente relatorio descritivo em rela^o aos anticorpos e seus fragmentos de ligante de antigeno da invenfao significa que a atividade biologica de IGF-IR e reduzida na presenga dos anticorpos e seus fragmentos de ligante de antigeno da presente invenfao em compara^o com a atividade de IGF-IR na ausencia de tais anticorpos e seus fragmentos de ligante de antigeno. Neutraliza^o pode ser devido mas nao e limitada a um ou mais de bloqueio de ligafao de ligante, prevengao de ativafao do receptor pelo ligante, regulafao negativa do IGF-IR ou afetagao da funcionalidade efetora. Niveis de neutraliza^ao podem ser medidos em varias maneiras，por exemplo pelo uso dos ensaios como mostrados nos exemplos abaixo, por exemplo em um ensaio de proliferafao de celula LISN que pode ser realizado por exemplo como descrito em Exemplo 23. A neutralizafao de IGF-IR neste ensaio e medida por avalia^o da prolifera9ao de celula de tumor decrescida na presenga de anticorpo neutralizador.

Niveis de neutralizayao tambem podem ser medidos, por exemplo em um ensaio de fosforilafao de receptor que pode ser realizado por exemplo como descrito em Exemplo 13. A neutraliza^o de IGF-IR neste ensaio e medida pela avalia^ao da inibifao de fosforila9ao de receptor na presenga de anticorpo neutralizador.

Se um anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo e capaz de neutraliza^ao entao isto e indicativo de inibigSo da interafao entre proteinas ligantes de IGF-IR de humano por exemplo hlGF-I ou hlGF-II e seu receptor. Anticorpos que sao considerados em ter atividade neutralizadora contra IGF-IR de humano teriam uma IC50 menor do que 10 microgramas/ml, ou menor do que 5 microgramas/ml, ou menor do que 2 microgramas/ml, ou menor do que 1 micrograma/ml no ensaio de prolifera9ao de celula LISN ou ensaio de fosforilagSo de receptor como mostrado em Exemplos 23 e Exemplo 13 respectivamente.

Em um aspecto alternativo da presente inven^So sao fornecidos anticorpos ou seus fragmentos de ligante de antigeno que tem atividade neutralizadora equivalente a dos anticorpos aqui exemplificados, por exemplo anticorpos que retem atividade neutralizadora de HOLO e HOLO IgGlm(AA) e HlLOe HlOLO IgGlm(AA) no ensaio de proliferaq^o de celula LISN ou ensaio de fosforilayao de receptor como mostrado em Exemplos 23 e 13 respectivamente.

Em todo este relatorio descritivo, residuos de aminoacido em sequencias de anticorpo sao numerados de acordo com ο esquema de Kabat. Similarmente, os termos "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3" seguem ο sistema de numeraQao de Kabat como mostrado em Kabat et al.; "Sequences of proteins of Immunological Interest" NIH, 1987. Sera evidente para aquelas pessoas experientes na tecnica que ha defini9oes alternativas de sequencias de CDR tais como por exemplo aquelas mostradas em Chothia et al. (1989).

Sera evidente para aquelas pessoas experientes na tecnica que ο termo "derivado" e intencionado para definir nao apenas a fonte no sentido de ela ser de origem fisica para ο material mas tambem para definir material que e estruturalmente identico (em termos de sequencia de aminoacidos primaria) ao material mas que nao se origina da fonte de referenda. Assim "residuos" encontrados no anticorpo doador do qual CDRH3 e derivada nao precisam necessariamente terem sido purificados do anticorpo doador.

O termo "estabilidade" como usado em todo ο presente relatorio descritivo em rela?ao aos anticorpos e seus fragmentos de ligante de

antigeno da ίηνεηςδο significa que a atividade do anticorpo ou fragmento de Iigante de antigeno quando determinada por ELISA de Iiga^So direta e comparavel 12 dias apos incubafao em soro com valores iniciais de EC-50 a - 20°C, 4。C ou 37°C.

Um "anticorpo quimerico" refere-se a um tipo de anticorpo engenhado que contem um dominio variavel naturalmente ocorrente (cadeia Ieve e cadeias pesadas) derivado de um anticorpo doador em associa9ao com regiSes constantes de cadeias Ieve e pesada derivadas de um anticorpo aceptor.

Um "anticorpo humanizado" refere-se a um tipo de anticorpo engenhado tendo suas CDRs derivadas de uma imunoglobulina doadora de nao-humano, as partes derivadas de imunoglobulina restantes da molecula sendo derivadas de uma (ou mais) imunoglobulina(s) de humano. Em adi?ao, residuos de suporte de molde podem ser alterados para preservar a afinidade de ligafao (veja, e.g., Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al·, Bio/Technology, 9:421 (1991)). Um anticorpo aceptor de humano adequado pode ser um selecionado de um banco de dados convencional, e.g., ο banco de dados KABAT®, banco de dados Los Alamos, e banco de dados Swiss Protein, por homologia com as sequencias de nucleotideos e de aminoacidos do anticorpo doador. Um anticorpo de humano caracterizado por uma homologia com as regioes de molde do anticorpo doados (em uma base de aminoacido) pode ser adequado para fornecer uma regmo constante de cadeia pesada e/ou uma regiao de molde variavel de cadeia pesada para inserfao das CDRs de doador. Um anticorpo aceptor adequado capaz de doar regioes de molde variaveis ou constantes de cadeia Ieve pode ser selecionado em uma maneira similar. Deve ser notado que nao e exigido que as cadeias Ieve e pesada do anticorpo aceptor se originem do mesmo anticorpo aceptor. A tecnica anterior descreve varias maneiras de produzir tais anticorpos humanizados - veja por exemplo EP-A-0239400 e EP-A-054951. O termo "anticorpo doador" refere-se a um anticorpo (monoclonal, e/ou recombinante) que contribui com as sequencias de aminoacidos de seus dominios variaveis, CDRs, ou outros fragmentos funcionais ou analogos dos mesmos para um primeiro parceiro de imunoglobulina, de modo a fornecer a regiao codificadora de imunoglobulina alterada e resultando ο anticorpo alterado expressado com a especificidade antigenica e atividade neutralizadora caracteristicas do anticorpo doador.

O termo "anticorpo aceptor" refere-se a um anticorpo (monoclonal e/ou recombinante) heterologo ao anticorpo doador, que contribui com todas (ou qualquer porgSo, mas preferivelmente todas) as sequencias de aminoacidos codificadoras de suas regiSes de molde de cadeia pesada e/ou Ieve e/ou suas regioes constantes de cadeia pesada e/ou Ieve com ο primeiro parceiro de imunoglobulina. O anticorpo de humano e ο anticorpo aceptor.

"CDRs" sao defmidas com as sequencias de aminoacidos de regiao determinante de complementaridade de um anticorpo que sao dominios hipervariaveis de cadeias pesada e Ieve de imunoglobulina. Veja, e.g., Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)· Ha tres CDRs de cadeia pesada e tres CDRs de cadeia Ieve (ou regioes de CDR) na ροΓς^ο variavel de uma imunoglobulina. Assim, "CDRs" como aqui usado refere-se a todas as tres CDRs de cadeia pesada, ou todas as tres CDRs de cadeia Ieve (ou ambas todas as CDRs de cadeia pesada e todas as CDRs de cadeia leve, se apropriadas). A estrutura e ο dobramento de proteina do anticorpo podem significar que outros residuos sao considerados parte da regiao ligante de antigeno e seriam entendidas em serem assim por uma pessoa experiente. Veja por exemplo Chothia et al., (1989) "Conformations of immunoglobulin hypervariable domains"; Nature 342, p877-883. CDRs fornecem a maioria dos residuos de contato para a ligafao do anticorpo no antigeno ou epitopo. CDRs de interesse nesta ΐηνεηςδο sao derivadas de sequencias de cadeias Ieve e pesada variaveis doadoras de anticorpo, e incluem analogos das CDRs naturalmente ocorrentes, cujos analogos tambem compartilham ou retem a mesma especificidade de liga^ao de antigeno e/ou capacidade de neutraliza^o que as do anticorpo doador do qual foram derivadas.

Os termos "VH" e "VL" sao aqui usados para se referirem ao dominio variavel de cadeia pesada e ao dominio variavel de cadeia Ieve respectivamente de um anticorpo.

O termo "Fun9ao Efetora" como aqui usado refere-se a uma ou mais respostas mediadas por Atividade Citotoxica Mediada por Celula Dependente de Anticorpo (ADCC) e Atividade Citotoxica Dependente de Complemento (CDC), fagocitose mediada por Fc e reciclo de anticorpo via ο receptor FcRn. Acredita-se que a intera^o entre a regiao constante de um anticorpo e varios receptores Fc (FcR) medeiam as fun9oes efetoras do anticorpo. Efeitos biologicos significativos podem ser uma consequencia de funcionalidade efetora, em particular, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fixa9ao de complemento (citotoxicidade dependente de complemento ou CDC), fagocitose (fagocitose mediada por celula dependente de anticorpo ou ADCP) e depurafao/meia-vida de do anticorpo. Costumeiramente, a capacidade para mediar firngao efetora exige Iiga^So do anticorpo em um antigeno e nem todos os anticorpos mediarao cada fun9ao efetora.

Fun^ao efetora pode ser medida em numerosas maneiras incluindo por exemplo via ligafao do FcyRIII em celulas Matadoras Naturais ou via FcyRJ em monocitos/macrofagos para medir funfao efetora de ADCC. Por exemplo ο anticorpo ou fragmento de ligante de antigeno da presente invensao tem uma funfao efetora de ADCC aumentada quando medida contra O anticorpo de tipo selvagem equivalente ou fragmento de ligante de antigeno do mesmo em um ensaio de celula Matadora Natura. Exemplos de tais ensaios podem ser encontrados em Shields et al., 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604; Chappel et al., 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131; Lazar et al., 2006 PNAS, 103; 4005-4010.

Exemplos de ensaios para determinar a fun9ao de CDC incluem aqueles descritos em 1995 J Imm Meth 184:29-38.

Varios modifica9oes na regiao constante de cadeia pesada de anticorpos podem ser realizadas dependendo da propriedade efetora desejada. Regioes constantes de humano que essencialmente sao faltantes das funfoes de a) ativa9ao de complemento pela via classica; e b) mediafao de citotoxicidade celular dependente de anticorpo incluem a regiao constante de IgG4 e a regiao constante de IgG2. Tem sido separadamente descrito que as regioes constantes de IgGl contendo mutagdes especificas reduzem a ligagao em receptores Fc e portanto reduzem ADCC e CDC (Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund etal. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton e Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1_84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). Tambem tem sido descrito que regiSes constantes de IgGl de humano contendo muta^5es especificas ou glicosila^o alterada em residuo Asn297 intensificam a ligafao em receptores Fe. Tambem tem sido mostrado que estas intensificam ADCC e CDC, em alguns casos (Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604; Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817).

Para anticorpos IgG, funcionalidades efetoras incluindo ADCC e ADCP sao mediadas pela interagao da regiao constante de cadeia pesada com uma familia de receptores Fcy presentes sobre a superficie de celulas imunes. Em humanos estes incluem FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD 16). Intera9ao entre ο anticorpo ligado em antigeno e a formafao do complexo Fc/Fcy induz uma variedade de efeitos incluindo citotoxicidade, ativafao de celula imune, fagocitose e liberafao de citocinas inflamatorias. E sabido que substituifoes especificas na regiao constante (incluindo S239D/I332E) aumentam a afinidade da regiao constante de cadeia pesada por certos receptores Fe, aperfei^oando assim a funcionalidade efetora do anticorpo (Lazar et al. PNAS 2006). 1. Estruturas de anticorpo 1.1 Anticorpos intactos

Anticorpos intactos incluem glicoproteinas heteromultimericas compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. A parte de IgM, anticorpos intactos sao costumeiramente glicoproteinas heterotetramericas de aproximadamente 150Kda, compostas de duas cadeias leves (L) identicas e duas cadeias pesadas (H) identicas. Tipicamente, cada cadeia Ieve esta ligada em uma cadeia pesada por uma ligado de dissulfeto covalente enquanto que varia ο niimero de liga^oes de dissulfeto entre as cadeias pesadas de isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e Ieve tambem tem pontes de dissulfeto intracadeias. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um dominio variavel (Vh) seguido por numerosas regioes constantes (CH1, CH2, CH3). Cada cadeia Ieve tem um dominio variavel (Vl) e uma regiao constante em sua outra extremidade; a regiao constante de cadeia pesada da cadeia Ieve esta alinhada com a primeira regiao constante da cadeia pesada e ο dominio variavel de cadeia Ieve esta alinhado com ο dominio variavel da cadeia pesada. As cadeias leves de anticorpos da maioria das especies de vertebrado podem ser designadas para um de dois tipos chamados de Kappa e Lambda baseado na sequencia de aminoacidos da regiSo constante. Dependendo da sequencia de aminoacidos da regiao constante de cadeia pesada de suas cadeias pesadas, anticorpos de humano podem ser designados para cinco classes diferentes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM· IgG e IgA podem ser adicionalmente subdivididos em subclasses, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4; e IgAl e IgA2. Variantes de especie existem com camundongo e rato tendo pelo menos IgG2a, IgG2b. O dominio variavel do anticorpo concede especificidade de liga^o ao anticorpo com certas regioes exibindo variabilidade particular chamadas de regioes determinantes de complementaridade (CDRs). As porfoes mais conservadas do dominio varidvel sao chamadas de regioes de Molde (FR). Os dominios variaveis de cadeias pesada e Ieve intactas compreendem, cada um, quatro FR conectadas por tres CDRs. As CDRs em cada cadeia sao mantidas juntas em proximidade intima pelas regioes FR e com as CDRs da outra cadeia contribuem para a formagao do sitio de liga?a〇 de antigeno de anticorpos. As regides constantes nao estao diretamente envolvidas na ligafao do anticorpo no antigeno mas exibem varias funfoes efetoras tais como participayao em citotoxicidade mediada por celula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose via liga?ao em receptor Fcy, taxa de depura^ao / meia-vida via receptor Fc neonatal (FcRn) e citotoxicidade dependente de complemento via ο componente Clq da cascata de complemento. 1-1-2 Anticorpos de humano

Anticorpos de humano podem ser produzidos por numerosos metodos conhecidos por aquelas pessoas experientes na tecnica. Anticorpos de humano podem ser preparados pelo metodo de hibridoma usando linhagens de celula de hetero-Mieloma de camundongo-humano ou de Mieloma de humano, veja Kozbor J.Immunol 133, 3001, (1984) e Brodeur Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. pp51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987). Metodos alternatives incluem ο uso de bibliotecas de fago ou camundongos transgenicos ambos os quais utilizam repertorios de dominio variavel de humano (veja Winter G, (1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J.Immunol.methods 231, 11-23).

Estao agora disponiveis varias cepas de camundongos transgenicos sendo que seus loci de imunoglobulina de camundongo tem sido substituidos por segmentos de gene de imunoglobulina de humano (veja Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156).

Sob desafio de antigeno tais camundongos sao capazes de produzir um repertorio de anticorpos de humano do qual anticorpos de interesse podem ser selecionados. De nota particular e ο sistema Trimera™ (veja Eren Retal, (1998) Immunology 93:154-161) onde linfocitos de humano sao transplantados em camundongos irradiados, ο Sistema de Anticorpo de Linfocito Selecionado (SLAM, veja Babcook et ai, PNAS (1996) 93:7843- 7848) onde linfocitos de humano (ou outra especie) sao efetivamente determinados atraves de um procedimento de gera9ao reunida massiva de anticorpo in vitro seguido por procedimento deconvulado, de diluifao limitada e selefao e ο Xenomouse II™ (Abgenix Inc). Uma abordagem alternativa esta disponivel na Morphotek Inc usando a tecnologia Morphodoma™.

Tecnologia de exibigao de fago pode ser usada para produzir anticorpos de humano (e seus fragmentos), veja McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990) e Griffiths AD et al. (1994) EMBO 13:3245-3260. De acordo com esta tecnica genes de dominio variavel de anticorpo sao clonados em matriz em uma capa quer maior quer menor de gene de proteina de um bacteriofago filamentoso tal como Ml3 ou fd e exibidos (costumeiramente com ο auxilio de um fago auxiliador) como seus fragmentos de ligante de antigeno fbncionais sobre a superficie da particula de fago. Seleses baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo resultam em sele?ao do gene codificador do anticorpo exibindo aquelas propriedades. A tecnica de exibi9ao de fago pode ser usada para selecionar anticorpos especiflcos para antigeno de bibliotecas preparadas a partir de celulas B de humano obtidas de individuos afligidos com uma doen^a ou um disturbio descrita(o) acima ou

20

25 alternativamente de doadores humanos nao-imunizados (veja Marks; J.Mol.Bio. 222,581-597, 1991). Onde um anticorpo intacto de humano e desejado compreendendo um dominio constante e necessario reclonar ο fragmento derivado exibido de fago em um vetor de expressao de mamifero compreendendo as regioes constantes desejadas e estabelecer as linhagens celulares de expressao estavel.

A tecnica de matura^So de afinidade (Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992)) pode ser usada para melhorar a afinidade de ligagao sendo que a afinidade do anticorpo primario de humano e melhorada por substitui9ao seqiiencial dos dominios de variaveis de cadeias H e L por variantes naturalmente ocorrentes e selefao baseada nas afinidades de ligafao melhoradas. Variantes desta tecnica tal como "impressao de epitopo" tambem estao disponiveis, veja WO 93/06213. Veja tambem Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993). 1.2 Anticorpos quimericos e humanizados

O uso de anticorpos intactos de nao-humano no tratamento de doen9as ou distiirbios de humano traz consigo ο potencial para os problemas de imunogenicidade agora bem estabelecidos, isto e ο sistema imune do paciente pode reconhecer ο anticorpo intacto de nao-humano como nao- proprio e montar uma resposta neutralizadora. Isto e particularmente evidente sob administra9ao miiltipla do anticorpo de nao-humano a um paciente humano. Varios tecnicas tem sido desenvolvidas no decorrer dos anos para suplantar estes problemas e geralmente envolvem redufao de uma composifao de seqiiencias de aminoacidos de nao-humano no anticorpo intacto enquanto se retem a facilidade relativa na obtenfao de anticorpos de nao-humano a partir de um animal imunizado e.g. camundongo, rato ou coelho. Amplamente duas abordagens tem sido usadas para realizar isto. A primeira e de os anticorpos quimericos, que geralmente compreendem um dominio variavel de nao-humano (e.g. roedor tal como camundongo) fusionado em uma regiao constante de humano. Devido ao fato de ο sitio de liga9ao em antigeno de um anticorpo estar localizado dentro dos dominios variaveis, ο anticorpo quimerico retem sua afinidade de liga?ao pelo antigeno mas adquire as fun^oes efetoras da regiao constante de humano e e portanto caPaz de realizar ftinfoes efetoras tais como descritas supra. Anticorpos quimericos sao tipicamente produzidos usando metodos de DNA recombinante. DNA codificador dos anticorpos (e.g. cDNA) e isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (e.g. pelo uso de sondas de oligonucleotideo que sao capazes de ligaqao especificamente nos genes codificadores das cadeias H e L do anticorpo da inven^ao. Celulas de hibridoma servem como uma fonte tipica de tal DNA. Uma vez isolado, ο DNA e posicionado em vetores de expressao que sao entao transferidos para den仕ο de celulas hospedeiras tais como Ε. coli, celulas COS, celula CHO ou c^lulas de Mieloma que nao produzem de outra maneira proteina imunoglobulina para obter sintese do anticorpo. O DNA pode ser modificado por substitui9ao das correspondentes regioes constantes HeLde nao-humano (e.g. murina) por sequencia codificadora de cadeias L e H de humano, veja e.g. Morrison; PNAS 81, 6851 (1984).

A segunda abordagem envolve a gerafao de anticorpos humanizados sendo que ο teor de nao-humano do anticorpo e reduzido por humaniza9ao dos dominios variaveis. Duas tecnicas para humaniza?ao tem ganho popularidade. A primeira e humaniza9ao por enxerto de CDR. CDRs desenvolvem al?as fechadas na termina9ao-N do anticorpo onde formam uma superficie montada em uma arma9ao fornecida pelas regioes de molde. Especificidade de ligagao em antigeno do anticorpo e principalmente defmida pela topografia e pelas caracteristicas quimicas de sua superficie de CDR. Estas fei9oes sao por sua vez determinadas pela conformagao das CDRs individuals, pela disposifao relativa das CDRs, e pelas natureza e disposi9ao das cadeias laterals dos residuos compreendendo as CDRs. Um decrescimo grande em imunogenicidade pode ser alcan^ado por enxerto apenas das CDRs de anticorpos de nao-humano (e.g. murino) (anticorpos "doadores") em molde de humano ("molde aceptor") e regioes constantes (veja Jones et al. (1986) Nature 321,522-525 e Verhoeyen M et al. (1988) Science 239, 1534-1536). Contudo, enxerto de CDR por si nao pode resultar na retengao completa de propriedades de ligafao em antigeno e e freqiientemente verificado que alguns residuos de molde (algumas vezes chamados de "retro-mutafoes") do anticorpo doador necessitam ser preservados na molecula humanizada se afmidade de IigagSo em antigeno significativa for para ser recuperada (veja Queen C et al. (1989) PNAS 86，10,029-10,033, Co, M et al. (1991) Nature 351, 501-502). Neste caso, dominios variaveis de humano mostrando a mais elevada homologia de seqiiencia com ο anticorpo doador de nao-humano sao escolhidos de um banco de dados com ο proposito de fornecer um molde de humano (FR). A sele^ao de FRs de humano pode ser feita de anticorpos quer de humano individuals quer de consenso de humano. Onde necessario residuos chave do anticorpo doador sao substituidos no molde aceptor de humano para preservar as conforma9oes de CDR. Modelagem por computador do anticorpo pode ser usada para ajudar a identificar tais residuos estruturalmente importantes, veja W099/48523.

Alternativamente, humaniza9ao pode ser alcan^ada por um processo de “veneering” (modificafao superficial). Uma analise estatistica de dominios variaveis de cadeias Ieve e pesada de imunoglobulina murina e de humano iinicos revelou que os padroes precisos de residuos expostos sao diferentes em anticorpos murino e de humano, e as posiq^es de superficie mais individuals tem uma preferencia forte por um niimero pequeno de residuos diferentes (veja Padlan E.A. et al; (1991) Mol.Immunol, 28, 489-498 e Pedersen J.T. et al. (1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973).

Portanto e possivel reduzir a imunogenicidade de um Fv de nao-humano pela substituifao de residuos expostos em suas regioes de molde que diferem daqueles costumeiramente encontrados em anticorpos de humano. Devido ao fato de a antigenicidade de proteina poder estar correlacionada com acessibilidade de superficie, substituifao dos residuos de superficie pode ser suficiente para tornar ο dominio variavel de camundongo "invisivel" para ο sistema imune de humano (veja tambem Mark G.E. et al. (1994) em Handbook of Experimental Pharmacology vol, 113: "The pharmacology of monoclonal antibodies", Springer-Verlag, pp 105-134). Este procedimento de humaniza^ao e chamado de “veneering” (modificafao superficial) porque apenas a superficie do anticorpo e alterada, os residuos de suporte permanecem inalterados. 1 -3 Anticorpos biespecificos

Um anticorpo biespecifico e um anticorpo tendo especificidades e liga?ao por pelo menos dois epitopos diferentes. Metodos de preparafao de tais anticorpos sao conhecidos na tecnica. Tradicionalmente, a produ9ao recombinante de anticorpos biespecificos e baseada na co-expressao de dois pares de cadeia L - cadeia H de imunoglobulina, onde as duas cadeias H tem especificidades de liga9ao diferentes, veja Millstein et al., Nature 305 537-539 (1983), W093/08829 e Traunecker et al. EMBO, 10, 1991, 3655- 3659. Devido ao fato da selegSo aleatoria das cadeias H e L, e produzida uma mistura potencial de dez estruturas de anticorpo diferentes das quais apenas uma delas tem a especificidade de IigagSo desejada. Uma abordagem alternativa envolve a fusao dos dominios variaveis com as especificidades de ligafao desejadas na regiao constante de cadeia pesada compreendendo pelo menos parte da regiao de dobradi^a, as regioes CH2 e CH3. Em uma modalidade a regiao CHl contendo ο sitio necessario para a liga?ao de cadeia Ieve esta presente em pelo menos uma das fusoes. DNA codificador destas fusoes, e se desejado a cadeia L sao inseridos em vetores de expressao separados e entao sao co-transfectados em um organismo hospedeiro

adequado. Nao obstante e possivel inserir as seqiiencias codificadoras de duas ou de todas as três seqüências em um vetor de expressão. Em uma abordagem, o anticorpo biespecífico é composto de uma cadeia H com uma primeira especificidade de ligação e um braço e uma par de cadeias H-L, fornecendo uma segunda especificidade de ligação no outro braço, veja W094/04690. Também veja Suresh et al. Methods in Enzymology 121, 210, 1986.

Em uma modalidade da invenção é fornecido um anticorpo biespecífico sendo que pelo menos uma especificidade de ligação de dito anticorpo é para hlGF-lR, e dito anticorpo neutraliza a atividade de hlGF-lR. Tais anticorpos podem adicionalmente compreender uma região constante de humano do isótipo IgG, e.g. IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Anticorpos da presente invenção também podem ser multiespecíficos, por exemplo anticorpos multiespecíficos formados pela montagem de numerosos fragmentos de ligante de antígeno. 1.4 Fragmentos de ligante de antígeno

Tais fragmentos de ligante de antígeno compreendem uma seqüência variável de cadeia leve ou pesada parcial (e.g., deleções menores na terminação amino ou carboxila do domínio variável de imunoglobulina) que retém a mesma especificidade de antígeno ou a mesma capacidade de neutralização similar que a do anticorpo do qual o fragmento foi derivado.

Em certas modalidades da invenção são fornecidos fragmentos de ligante de antígeno que neutralizam a atividade de hlGF-lR. Tais fragmentos podem se fragmentos funcionais ligantes de antígeno de anticorpos intactos e/ou humanizados e/ou quiméricos tais como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv dos anticorpos descritos supra. Tradicionalmente tais fragmentos são produzidos por digestão proteolítica de anticorpos intactos por e.g. digestão por papaína (veja por exemplo, WO 94/29348) mas podem ser produzidos diretamente de células hospedeiras recombinantemente transformadas. Para a produção de ScFv, veja Bird et al.; (1988) Science, 242, 423-426. Em adição, fragmentos de ligante de antígeno podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas de engenharia descritas abaixo.

Fragmentos Fv parecem ter energia de interação de suas duas cadeias mais baixa do que os fragmentos Fab. Para estabilizar a associação dos domínios Vh e VL, têm sido ligados com peptídeos (Bird et al., (1988) Science 242, 423-426, Huston et al., PNAS, 85, 5879-5883), pontes de dissulfeto (Glockshuber et al., (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) e mutações "knob in hole" (Zhu et al. (1997), Protein Sci., 6, 781-788). Fragmentos ScFv podem ser produzidos por métodos bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na técnica veja Whitlow et al. (1991) Methods Companion Methods Enzymol, 2, 97-105 e Huston et al. (1993) Int.Rev.Immunol 10, 195-217. ScFv pode ser produzido em células bacterianas tal como E. coli mas são mais preferivelmente produzidos em células eucarióticas. Uma desvantagem de ScFv é a monovalência do produto, que impede uma avidez aumentada devido à ligação polivalente, e sua meia- vida curta. Tentativas para suplantar estes problemas incluem (ScFv1)2 bivalente produzido a partir de ScFV contendo uma cisteína C terminal adicional por copulação química (Adams et al. (1993) Can.Res 53, 4026-4034 e McCartney et al. (1995) Protein Eng. 8, 301-314) ou por dimerização espontânea sítio-específica de ScFv contendo um resíduo de cisteína C terminal não pareado (veja Kipriyanov et al. (1995) Cell. Biophys 26, 187- 204).

Alternativamente, ScFv pode ser forçado a formar multímeros por encurtamento do ligante de peptídeo para 3 a 12 resíduos para formar "diacorpos", veja Holliger et al. PNAS (1993), 90, 6444-6448. Redução do ligante ainda mais pode resultar em trímeros de ScFV ("triacorpos", veja Kortt et al. (1997) Protein Eng, 10, 423-433) e tetrâmeros ("tetracorpos", veja Le Gall et al. (1999) FEBS Lett, 453, 164-168). Construção de moléculas bivalentes de ScFV também pode ser realizada por fusão genética com motivos de dimerização de proteína para formar "minianticorpos" (veja Pack et al. (1992) Biochemistry 31, 1579-1584) e "minicorpos" (veja Hu et al. (1996), Câncer Res. 56, 3055-3061). ScFv-Sc-Fv tandens ((ScFV)2) também podem ser produzidos por ligação de duas unidades de ScFv por um terceiro ligante peptídeo, veja Kurucz et al. (1995) J. Immol5154, 4576-4582. Diacorpos biespecíficos podem ser produzidos através da associação não- covalente de dois produtos de fusão de cadeia única consistindo de domínio Vh de um anticorpo conectado por um ligante curto no domínio Vl de outro anticorpo, veja Kipriyanov et al. (1998), Int. J.Can 77,763-772. A estabilidade de tais diacorpos biespecíficos pode ser aperfeiçoada pela introdução de pontes de dissulfeto ou mutações "knob in hole" como descrito supra ou pela formação de diacorpos de cadeia única (ScDb) sendo que dois fragmentos de ScFv híbridos são conectados através de um ligante peptídeo veja Kontermann et al. (1999) J. ImmunoLMethods 226 179-188. Moléculas biespecíficas tetravalentes estão disponíveis por e.g. fusão de um fragmento ScFv no domínio CH3 de uma molécula IgG ou em um fragmento Fab através da região de dobradiça veja Coloma et al. (1997) Nature Biotechnol. 15, 159- 163. Alternativamente, moléculas biespecíficas tetravalentes têm sido criadas pela fusão de diacorpos de cadeia única biespecíficos (veja Alt et al., (1999) FEBS Lett 454, 90-94. Moléculas biespecíficas tetravalentes menores também podem ser formadas por dimerização quer de ScFv-ScFv tandems com um ligante contendo um motivo de hélice-alça-hélice (minianticorpos DiBi, veja Muller et al. (1998) FEBS Lett 432, 45-49) quer de uma molécula de cadeia única compreendendo quatro domínios variáveis (VH e VL) de anticorpo em uma orientação prevenindo pareamento intramolecular (diacorpo em tandem, veja Kipriyanov et al., (1999) J.Mol.Biol. 293, 41-56). Fragmentos biespecíficos F(ab')2 podem ser criados por copulação química de fragmentos Fab' ou por heterodimerização através de zíperes de leucina (veja Shalaby et al., (1992) J.Exp.Med. 175, 217-225 e Kostelny et al. (1992), J.Immunol. 148, 1547-1553). A frase um "domínio variável único de imunoglobulina" refere- se a um domínio variável de anticorpo (VH, Vhh, Vl) que especificamente se liga em um antígeno ou epitopo independentemente de um domínio ou região V diferente. Um domínio variável único de imunoglobulina pode estar presente em um formato (e.g., homo- ou hetero-multímero) com outras regiões variáveis diferentes ou outros domínios variáveis onde as outras regiões ou os outros domínios não são exigidas(os) para ligação de antígeno pelo domínio variável de imunoglobulina único (i.e., onde o domínio variável único de imunoglobulina se liga em antígeno independentemente dos domínios variáveis adicionais).

Também estão disponíveis domínios Vh e Vl isolados (Domantis plc), veja US 6.248.516; US 6.291.158; US 6. 72.197 estes são conhecidos como anticorpos de domínio. Um "anticorpo de domínio" ou "dAb" é igual a um "domínio variável único de imunoglobulina" que é capaz de se ligar em um antígeno como o termo é aqui usado. Um domínio variável único de imunoglobulina pode ser um domínio variável de anticorpo de humano, mas também inclui domínios variáveis de anticorpo único de outras espécies tal como roedor (por exemplo, como revelado em WO 00/29004, Vhh dAbs de Camelídeo e de lambaru (nurse shark). Vhh de Camelídeo são polipeptídeos de domínio variável único de imunoglobulina que são derivados de espécies incluindo camelo, lhama, alpaca, dromedário e guanaco, que produzem anticorpos de cadeia pesada naturalmente destituídos de cadeias leves. Tais domínios Vhh podem ser humanizados de acordo com técnicas padrão disponíveis na técnica, e tais domínios ainda são considerados "anticorpos de domínio" de acordo com a invenção. Como aqui usado "VH" inclui domínios VHh de Camelídeo.

Em uma modalidade é fornecido um fragmento de ligante de antígeno (e.g. ScFv, Fab, Fab', F(ab')2) ou um fragmento engenhado ligante de antígeno como descrito supra que especificamente se liga em hlGF-lR neutraliza a atividade de hlGF-lR. O fragmento de ligante de antígeno pode compreender uma ou mais das seguintes seqüências CDRH3 como mostrada em SEQ. ID. NO: 1, CDRH2 como mostrada em SEQ. ID. NO: 2, CDRHl como mostrada em SEQ. ID. NO: 3, CDRLl como mostrada em SEQ. ID. NO: 4, CDRL2 como mostrada em SEQ. ID. NO: 5, e CDRL3 como mostrada em SEQ. ID. NO: 6.

1.5 Anticorpos heteroconjugados

Anticorpos heteroconjugados também formam uma modalidade da presente invenção, anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos covalentemente unidos formados usando quaisquer métodos de ligação cruzada convenientes. Veja, por exemplo, US 4.676.980. Adicionalmente, combinações de anticorpos e fragmentos de ligante de antígeno estão incluídas dentro da presente invenção por exemplo, um ou mais anticorpos de domínio e ou ScFv ligados em um anticorpo monoclonal.

1.6 Outras modificações

Acredita-se que a interação entre a região constante de um anticorpo e vários receptores Fc (FcyR) medeia as funções efetoras que incluem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fixação de complemento, fagocitose e meia-vida/depuração do anticorpo. Várias modificações na região constante de anticorpos da invenção podem ser realizadas dependendo da propriedade desejada. Por exemplo, mutações específicas na região constante para tornar não-lítico um anticorpo que sob outras condições é lítico, são detalhadas em EP 0629240B1 e EP 0307434B2 ou pode-se incorporar um epitopo de ligação de receptor de salvamento no anticorpo para aumentar a meia-vida em soro veja US 5.739.277. Há cinco receptores Fcy de humano correntemente reconhecidos, FcyR (I), FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa e FcRn neonatal. Shields et al., (2001) J.Biol.Chem 276, 6591-6604 demonstraram que um conjunto comum de resíduos de IgGl está envolvido em ligação de todos FcyRs, enquanto que FcyRII e FcyRIII utilizam sítios distintos fora deste conjunto comum. Um grupo de resíduos de IgGl reduziu a ligação em todos FcyRs quando alterado para alanina: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 e Pro-239. Todos estão no domínio IgG CH2 e agrupados próximos da união de dobradiça CHl e CH2. Embora FcyRI utilize apenas o conjunto comum de resíduos de IgGl para ligação, FcyRII e FcyRIII interagem com resíduos distintos em adição ao conjunto comum. Alteração de alguns resíduos reduziu ligação apenas em FcyRII (e.g. Arg-292) ou FcyRIII (e.g. Glu-293). Algumas variantes mostraram ligação aperfeiçoada em FcyRII ou FcyRIII mas não afetaram a ligação no outro receptor (e.g. Ser-267Ala aperfeiçoou a ligação em FcyRII mas ligação em FcyRIII não foi afetada). Outras variantes exibiram ligação aperfeiçoada em FcyRII ou FcyRIII com redução em ligação no outro receptor (e.g. Ser-298Ala aperfeiçoou ligação em FcyRIII e reduziu ligação em FcyRII). Para FcyRIIIa, as variantes de IgGl de melhor ligação tinham substituições de alanina combinadas em Ser-298, Glu- 333 e Lys-334. Acredita-se que o receptor neonatal FcRn está envolvido em ambos depuração de anticorpo e a transcitose através de tecidos (veja Junghans R.P (1997) Immunol.Res 16. 29-57 e Ghetie et ai. (2000) Annu.Rev. Immunol. 18, 739-766). Resíduos de IgGl de humano determinados em interagem diretamente com FcRn de humano incluem Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435. Mudanças em qualquer uma destas posições descritas nesta seção podem permitir meia-vida em soro aumentada e/ou propriedades efetoras alteradas de anticorpos da invenção.

Outras modificações incluem variantes de glicosilação dos anticorpos da invenção. E sabido que glicosilação de anticorpos em posições conservadas em suas regiões constantes tem um efeito profundo sobre a função de anticorpo, particularmente funções efetoras tais como aquelas descritas acima, veja por exemplo, Boyd et ai. (1996), MoL Immunol. 32, 1311-1318. Variantes de glicosilação dos anticorpos ou seus fragmentos de ligante de antígeno da presente invenção as quais um ou mais grupos carboidrato estão adicionados, substituídos, deletados ou modificados são contempladas. Introdução de um motivo de asparagina-X-serina ou asparagina-X-treonina cria um sítio potencial para ligação enzimática de grupos carboidrato e pode portanto ser usada para manipular a glicosilação de um anticorpo. Em Raju et al. (2001) Biochemistry 40, 8868-8876 a sialiação terminal de uma imunoadesina TNFR-IgG foi aumentada através de um processo de regalactosilação e/ou ressialilação usando beta-1,4- galactosiltransferase e/ou alfa-2,3-sialiltransferase. Acredita-se que o aumento da sialilação terminal prolonga a meia-vida da imunoglobulina. Anticorpos, em comum com a maioria das glicoproteínas, são tipicamente produzidos como uma mistura de glicoformas. Esta mistura é particularmente evidente quando anticorpos são produzidos em células eucarióticas, particularmente células de mamífero. Uma variedade de métodos tem sido desenvolvida para manufaturar glicoformas definidas, veja Zhang et al. Science (2004), 303, 371, Sears et al., Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al. (2002) Science, 298 1790, Davis et al. (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al. (2001) Acc.Chem.Res 34, 727. Portanto a invenção contempla uma pluralidade de anticorpos (monoclonais) (que talvez possam ser do isótipo IgG, e.g. IgGl) como aqui descrito compreendendo um número definido (e.g. 7 ou menos, por exemplo 5 ou menos tal como duas ou uma) glicoforma(s) de ditos anticorpos ou seus fragmentos de ligante de antígeno.

Outras modalidades da invenção incluem anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligante de antígeno copulados em um polímero não-proteínico tal como poli(etileno-glicol) (PEG), poli(propileno- glicol) ou polioxialquileno. Conjugação de proteínas em PEG é uma técnica estabelecida para prolongar a meia-vida de proteínas, bem como reduzir antigenicidade e imunogenicidade de proteínas. O uso de PEGuilação com estilos (linear ou ramificado) e pesos moleculares diferentes tem sido investigado com anticorpos intactos bem como fragmentos Fab', veja Koumenis I.L. et al. (2000) Int.J.Pharmaceut. 198:83-95. 2. Métodos de produção

Anticorpos da invenção podem ser produzidos como uma população policlonal mas são mais preferivelmente produzidos como uma população monoclonal (isto é como uma população substancialmente homogênea de anticorpos idênticos direcionados contra um sítio de ligação de antígeno específico). Naturalmente será evidente para aquelas pessoas experientes na técnica que uma população implica mais do que uma entidade de anticorpo. Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos em organismos transgênicos tais como cabras (veja Pollock et al. (1999), J.Immunol.Methods 231:147-157), galinhas (veja Morrow KJJ (2000) Genet.Eng.News 20:1-55, camundongos (veja Pollock et al) ou plantas (veja Doran PM, (2000) Curr.Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J et al., BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al; (2000) Plant Mol.Biol. 42:583-590). Anticorpos também podem ser produzidos por síntese química. Contudo, anticorpos da invenção são tipicamente produzidos usando tecnologia de cultura de célula recombinante bem conhecida por aquelas pessoas experientes na técnica. Um polinucleotídeo codificador do anticorpo é isolado e inserido em um vetor replicável tal como um plasmídeo para clonagem (amplificação) ou expressão adicional. Um sistema de expressão útil é um sistema de glutamato sintetase (tal como vendido por Lonza Biologies), particularmente onde a célula hospedeira é CHO ou NSO (veja abaixo). Polinucleotídeo codificador do anticorpo é prontamente isolado e seqüenciado usando procedimentos convencionais (e.g. sondas de oligonucleotídeo). Vetores que podem ser usados incluem plasmídeo, vírus, fago, transposons, minicromossomos dos quais plasmídeos são uma modalidade típica. Geralmente tais vetores adicionalmente incluem uma seqüência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e seqüências de terminação de transcrição operacionalmente ligados no polinucleotídeo de cadeia leve e/ou pesada de modo a facilitar a expressão. Polinucleotídeo codificador das cadeias leve e pesada pode ser inserido em vetores separados e transfectado para dentro da mesma célula hospedeira ou, se desejado ambas as cadeias leve e pesada podem ser inseridas no mesmo vetor para transfecção para dentro da célula hospedeira. Assim de acordo com um aspecto da presente invenção é fornecido um processo de construção de um vetor codificador de cadeias leve e/ou pesada de um anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo da invenção, cujo método compreende inserção em um vetor, de um polinucleotídeo codificador de qualquer uma cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo da invenção.

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E conhecido por aquelas pessoas experientes na técnica que genes sintéticos, que codificam a mesma proteína como um gene de tipo selvagem ou naturalmente ocorrente, podem ser planejados pela modificação dos códons que são usados no gene.

Estas técnicas de planejamento envolvem substituição daqueles códons em um gene que são raramente usados em genes de mamífero por códons que são mais freqüentemente usados para aquele aminoácido em gene de mamífero. Este processo, chamado de otimização de códon, é usado com a intenção de que o nível total de proteína produzida pela célula hospedeira é maior quando transfectada com o gene de códon- otimizado em comparação com o nível quando transfectada com a seqüência de tipo selvagem. Vários métodos têm sido publicados (Nakamura et. al., Nucleic Acids Research 1996, 24: 214-215; W098/34640; W097/11086).

Freqüências de códon podem ser derivadas de fontes da literatura para genes elevadamente expressados de muitas espécies (veja e. g. Nakamura et al. Nucleic Acids Research 1996,24 : 214-215). Tabelas de uso de códons para humanos também têm sido publicadas (W02005025614). Será imediatamente evidente para aquelas pessoas experientes na técnica que devido à redundância do código genético, polinucleotídeos alternativos àqueles aqui revelados (particularmente aqueles de códon- otimizado para expressão em uma dada célula hospedeira) também estão disponíveis que codificarão os polipeptídeos da invenção. 3.1 Seqüências de sinal

Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos como uma proteína de fusão com uma seqüência de sinal heteróloga tendo um sítio de clivagem específico na terminação N da proteína madura. A seqüência de sinal deve ser reconhecida e processada pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas, a seqüência de sinal pode ser por exemplo uma fosfatase alcalina líder, penicilinase líder, ou enterotoxina II termicamente estável líder. Para secreção por levedura as seqüências de sinal podem ser por exemplo uma invertase líder de levedura, um fator líder ou fosfatase ácida líder veja e.g. W090/13646. Em sistemas de célula de mamífero, líderes secretórios virais, tais como sinal gD do herpes simples e uma seqüência de sinal de imunoglobulina nativa podem ser adequadas. Tipicamente a seqüência de sinal está ligada em matriz de leitura no DNA codificador do anticorpo da invenção.

3.2 Origem de replicação

Origens de replicação são bem conhecidas na técnica com pBR322 adequada para a maioria das bactérias gram-negativas, plasmídeo 2μ e várias origens virais tais como SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV para a maioria das células de mamífero. Geralmente o componente origem de replicação não é necessário para vetores de expressão em mamífero mas o SV40 pode ser usado porque contém o promotor precoce.

3.3 Marcador de seleção

Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) concedem resistência a antibióticos ou outras toxinas e.g. ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina ou (b) complementam deficiências auxotróficas ou fornecem nutrientes não disponíveis nos meios complexos. O esquema de seleção pode envolver parada do crescimento da célula hospedeira. Células, que têm sido bem sucedidamente transformadas com os genes codificadores do anticorpo da presente invenção, sobrevivem devido a e.g. resistência à droga concedida pelo marcador de seleção. Outro exemplo é o denominado marcador de seleção DHFR no qual transformantes são cultivados na presença de metotrexato. Em modalidades típicas, células são cultivadas na presença de quantidades crescentes de metotrexato para amplificar o número de cópias do gene exógeno de interesse. Células CHO são uma linhagem celular particularmente útil para a seleção de DHFR. Um outro exemplo é o sistema de expressão de glutamato sintetase (Lonza Biologies). Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trpl, veja Stinchcomb et al. Nature 282, 38, 1979. 3.4 Promotores

Promotores adequados para expressão de anticorpos da invenção estão operacionalmente ligados em DNA/polinucleotídeo codificador do anticorpo. Promotores para hospedeiros procarióticos incluem promotor phoA, sistemas de promotor de Beta-Iactamase e lactose, fosfatase alcalina, triptofano e promotores híbridos tal como Tac. Promotores adequados para expressão em células de levedura incluem 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas e.g. enolase, gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose 6 fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase e glicoquinase. Promotores de levedura induzíveis incluem álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, metalotioneína e enzimas responsáveis pelo metabolismo de nitrogênio ou pela utilização de maltose/galactose. Promotores para expressão em sistemas de célula de mamífero incluem promotores virais tais como polioma, epitelioma contagioso e adenovírus (e.g. adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma de ave, citomegalovírus (em particular o promotor de gene precoce imediato), retro vírus, vírus de hepatite B, actina, promotor do vírus do sarcoma de rous (RSV) e o vírus 40 de Símio precoce ou tardio. Naturalmente a escolha do promotor é baseada na compatibilidade adequada com a célula hospedeira usada para expressão. Em uma modalidade portanto é fornecido um primeiro plasmídeo compreendendo um promotor RSV e/ou SV40 e/ou CMV, DNA codificador de domínio variável de cadeia leve (Vl) da invenção, região kC junto com marcadores de seleção de resistência à neomicina e ampicilina e um segundo plasmídeo compreendendo um promotor RSV ou SV40, DNA codificador do domínio variável de cadeia pesada (Vh) da invenção, DNA codificador da região constante γΐ, DHFR e marcadores de resistência à ampicilina.

3.5 Elemento intensificador

Onde apropriado, e.g. para expressão em eucariotos superiores, um elemento intensificador operacionalmente ligado no elemento promotor em um vetor pode ser usado. Seqüências de intensificador de mamífero adequadas incluem elementos intensificadores de globina, elastase, albumina, fetoproteína e insulina. Alternativamente, pode-se usar um elemento intensificador de um vírus de célula eucariótica tal como intensificador SV40 (a pb 100-270), intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, intensificador de polima, intensificador baculoviral ou locus IgG2a murino (veja W004/009823). O intensificador pode estar localizado no vetor em um sítio a montante do promotor. 3.5.5 Sinais de poliadenilação

Em sistemas eucarióticos, sinais de poliadenilação estão operacionalmente ligados em DNA/polinucleotídeo codificador do anticorpo desta invenção. Tais sinais estão tipicamente localizados 3' da matriz de leitura aberta. Em sistemas de mamífero, exemplo não limitante inclui sinais derivados de hormônios de crescimento, fator-1 alfa de alongamento e genes virais (eg SV40) ou repetições terminais longas retrovirais. Em sistemas de levedura exemplos não limitantes de sinais de terminação / poliadenilação incluem aqueles derivados dos genes de fosfoglicerato quinase (PGK) e álcool desidrogenase 1 (ADH). Em sistema de procarioto sinais de poliadenilação são tipicamente não exigidos e é em vez disso costumeiro o emprego de seqüências de terminador mais curtas e mais definidas. Naturalmente a escolha das seqüências de terminação / poliadenilação é baseada em compatibilidade adequada com a célula hospedeira usada para expressão. 3.6 Células hospedeiras

Células hospedeiras adequadas para vetores de expressão ou clonagem codificadores de anticorpos da invenção são células procarióticas, de levedura ou eucarióticas superiores. Células procarióticas adequadas incluem eubactéria e.g. enterobacteriaceae tais como Escherichia e.g. E. coli (por exemplo ATCC 31,446; 31,537; 27,325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella e.g. Salmonella typhimurium, Serratia e.g. Serratia marcescans e Shigella bem como Bacilli tais como B.subtilis e B.Iicheniformis (veja DD 266.710), Pseudomonas tais como P.aeruginosa e Streptomyces. Das células hospedeiras de levedura, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (e.g. ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), yarrowia (EP402, 226), Pichia Pastoris (EP183, 070, veja também Peng et al. J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Trichoderma reesia (EP244, 234), Penicillin, Tolypocladium e hospedeiras Aspergillus tais como A.nidulans e A.niger também são contempladas.

Embora células hospedeiras procarióticas e de levedura sejam especificamente contempladas pela invenção, células hospedeiras da presente invenção são células eucarióticas superiores. Células eucarióticas superiores adequadas incluem células de mamífero tais como COS-I (ATCC NO:CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), linhagem 293 de rim embrionário de humano, células de rim de hamster bebê (BHK) (ATCC CRL. 1632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO:CRL 1573), células de ovário de hamster chinês CHO (e.g. CHO-Kl, ATCC NO: CCL 61, linhagem celular DHFR-CHO como DG44 (veja Urlaubetal, (1986) Somatic Cell Mol.Genet,12, 555-556)), particularmente aquelas linhagens de célula CHO adaptadas para cultura em suspensão, células Sertoli de camundongo, células de rim de macaco, célula de rim de macaco verde africano (ATCC CRL- 1587), células HELA, células de rim de canino (ATCC CCL 34), células de pulmão de humano (ATCC CCL 75), células Hep G2 e Mieloma ou Linfoma e.g. NSO (veja US 5.807.715), Sp2/0,Y0.

Assim em uma modalidade da invenção é fornecida uma célula hospedeira estavelmente transformada compreendendo um vetor codificador de uma cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo como aqui descrito. Tais células hospedeiras compreendem um primeiro vetor codificador da cadeia leve e um segundo vetor codificador de dita cadeia pesada. Fermentação bacteriana

Sistemas bacterianos são particularmente adequados para a expressão de fragmentos de ligante de antígeno. Tais fragmentos estão localizados intracelularmente ou dentro do periplasma. Proteínas periplásmicas INSOluble podem ser extraídas e redobradas para formar proteínas ativas de acordo com métodos conhecidos por aquelas pessoas experientes na técnica, veja Sanchez et al. (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20 e Cupit PM et al. (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277. 3.7 Métodos de cultura de célula

Células hospedeiras transformadas com vetores codificadores de anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligante de antígeno podem ser cultivados por qualquer método conhecido por aquelas pessoas experientes na técnica. Células hospedeiras podem ser cultivadas em frascos rotativos, garrafas giratórias sobre roletes ou sistemas de fibra oca, mas para produção em grande escala reatores de tanque agitado são usados para culturas em suspensão. Preferivelmente os tanques agitados estão adaptados para aeração usando e.g. borrifadores, defletores ou hélices de impulsão cisalhamento baixo. Para colunas de borbulhadores e reatores aeróbicos aeração direta com bolhas de ar ou oxigênio pode ser usada. Onde as células hospedeiras são cultivadas em um meio de cultura livre de soro, o meio é suplementado com um agente protetor de célula tal como pluronic F-68 para ajudar a prevenir dano celular como um resultado do processo de aeração. Dependendo das características da célula hospedeira, quer microssuportes podem ser usados como substratos de crescimento para linhagens de células dependentes de ancoragem quer as células podem ser adaptadas para a cultura em suspensão (que é típica). A cultura das células hospedeiras, particularmente células hospedeiras de invertebrado pode utilizar uma variedade de modos operacionais tais como processamento por batelada alimentada, por batelada repetida (veja Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109), processo em batelada prolongada ou cultura de perfusão. Embora células hospedeiras de mamífero recombinantemente transformadas possam ser cultivadas em meio contendo soro tal como soro fetal bovino (FCS), por exemplo tais células hospedeiras são cultivadas em meio sintético livre de soro tal como revelado em Keen et al. (1995) Cytotechnology 17:153- 163, ou meio comercialmente disponível tal como ProCHO-CDM ou UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), suplementado onde necessário com uma fonte de energia tal como glicose e fatores de crescimento sintéticos tal como insulina recombinante. A cultura livre de soro de células hospedeiras pode exigir que aquelas células sejam adaptadas para crescerem em condições livres de soro. Uma abordagem de adaptação é cultivar tais células hospedeiras em meio contendo soro e repetidamente trocar 80% do meio de cultura por meio livre de soro de modo que as células hospedeiras aprendam a se adaptar em condições livres de soro (veja e.g. Scharfenberg K et al. (1995) em Animal Cell Technology: Developments towards the 2 Ist century (Beuvery E.C. et al. eds), pp619-623, Kluwer Academic Publishers).

Anticorpos da invenção secretados para dentro do meio podem ser recuperados e purificados usando uma variedade de técnicas para proporcionar um grau de purificação adequado para o uso intencionado. Por exemplo o uso de anticorpos da invenção para o tratamento de pacientes humanos tipicamente exige pelo menos 95% de pureza, mais tipicamente 98% ou 99% ou mais de pureza (comparado com o meio de cultura cru). Na primeira situação, fragmentos celulares do meio de cultura são tipicamente removidos usando centrifugação seguida por uma etapa de clarificação do sobrenadante usando e.g. microfiltração, ultrafiltração e/ou filtração profunda. Está disponível uma variedade de outras técnicas tais como diálise e eletroforese em gel e técnicas cromatográficas tais como cromatografia em hidróxi-apatita (HA), cromatografia de afinidade (opcionalmente envolvendo um sistema de etiquetação de afinidade tal como poli-histidina) e/ou cromatografia por interação hidrofóbica (HIC, veja US 5.429.746). Em uma modalidade, os anticorpos da invenção, após várias etapas de clarificação, são capturados usando cromatografia de afinidade em Proteína A ou G seguida por outras etapas de cromatografia tais como cromatografia HA e/ou de troca iônica, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de exclusão de tamanho e precipitação por sulfato de amônio. Tipicamente, várias etapas de remoção de vírus também são utilizadas (e.g. nanofiltração usando e.g. um filtro DV-20). Após estas várias etapas, uma preparação purificada (preferivelmente monoclonal) compreendendo pelo menos 75 mg/ml ou mais e.g. 100 mg/ml ou mais de anticorpo da invenção ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo é fornecida e portanto forma uma modalidade da invenção. Adequadamente tais preparações estão substancialmente livres de formas agregadas de anticorpos da invenção. 4. Composições farmacêuticas

Preparações purificadas de anticorpos da invenção (particularmente preparações monoclonais) como descritas supra, podem ser incorporadas em composições farmacêuticas para uso no tratamento de doenças e distúrbios de humano tais como Artrite reumatóide, Psoríase ou Cânceres e.g; Leucemia Linfoblástica Aguda, Carcinoma Adrenocortical, Cânceres Relacionados com AIDS, Linfoma Relacionado com AIDS, Câncer Anal, Astrocitoma Cerebelar da Infância, Astrocitoma Cerebral da Infância, Câncer Colorretal, Carcinoma de Célula Basal, Câncer de Duto Biliar Extra- hepático, Câncer de Bexiga, Osteossarcorna/Câncer Ósseo Histocitoma Fibroso Maligno, Tumores Cerebrais (e.g., Glioma de Tronco Cerebral, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral/Glioma Maligno, Ependimoma, Meduloblastoma, Tumores Neuroectodermais Primitivos Supratentoriais, Glioma Hipotalâmico e de Via Visual), Câncer de Mama, Carcinóides/Adenocarcinomas Bronquiais, Linfoma de Burkitt, Tumor Carcinóide, Tumor Carcinóide Gastrointestinal, Carcinoma de Sítio Primário Desconhecido, Carcinoma de Sistema Nervoso Central Primário, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral/Glioma Maligno, Câncer Cervical, Cânceres da Infância, Leucemia Linfocítica Crônica, Leucemia Mielógena Crônica, Distúrbios Mieloproliferativos Crônicos, Câncer de Cólon, Câncer Colorretal, Linfoma de Célula-T Cutânea, Câncer Endometrial, Ependimoma, Câncer Esofágico, Família de Tumores de Ewing, Tumor de Célula Germinativa Extracranial, Tumor de Célula Germinativa Extragonadal, Câncer de Duto Biliar Extra-hepático, Câncer Ocular Melanoma Intraocular, Câncer Ocular Retinoblastoma, Câncer de Vesícula Biliar, Câncer Gástrico (Estômago), Tumor Carcinóide Gastrointestinal, Tumores de Célula Germinativa (e.g., Extracranial, Extragonadal, e Ovariano), Tumor Trofoblástico Gestacional, Glioma (e.g., Adulto, Tronco Cerebral da Infância, Astrocitoma Cerebral da Infância, de Via Visual da Infância e Hipotalâmico), Leucemia de Célula Pilosa, Câncer de Cabeça e Pescoço, Câncer Hepatocelular (Fígado), Linfoma de Hodgkin, Câncer Hipofaríngeo, Glioma de Via Visual e Hipotalâmico, Melanoma Intraocular, Carcinoma de Célula das Ilhotas (Pâncreas Endócrino), Sarcoma de Kaposi, Câncer de Rim (Célula Renal), Câncer de Laríngeo, Leucemia (e.g., Linfoblástica Aguda, Mielóide Aguda, Linfocítica Crônica, Mielógena Crônica, e Célula Pilosa), Câncer de Cavidade Oral e de Lábio, Câncer de Fígado, Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena, Câncer de Pulmão de Célula Pequena, Linfoma (e.g., Relacionado com AIDS, de Burkitt, de Célula-T Cutânea, de Hodgkin, de Não-Hodgkin, e Sistema Nervoso Central Primário), Macroglobulinemia de Waldenstrom, Histiocitoma Fibroso Maligno de Osso/Osteossarcoma, Meduloblastoma, Melanoma, Melanoma Intraocular (Olho), Melanoma de Célula de Merkel, Mesotelioma, Câncer de Pescoço Escamoso Metastático com Síndrome de Neoplasia Endócrima Múltipla, Primária Oculta, Neoplasma de Célula Plasmática/Mieloma Múltiplo, Micose Fungóide, Síndromes Mieloplásticas, Doenças Mieloproliferativas/Mielodisplásticas, Leucemia Mielógena, Leucemia Mielóide Crônica, Linfoma Múltiplo, Distúrbios Mieloproliferativos Crônicos, Câncer de Sino Paranasal e Cavidade Nasal, Câncer Nasofaríngeo, Neuroblastoma, Câncer Oral, Câncer Orofaríngeo Osteossarcoma/Histiocitoma Fibroso Maligno de Osso, Câncer Ovariano, Câncer Epitelial Ovariano, Tumor de Célula Germinativa Ovariana, Tumor Potencial Maligno Baixo Ovariano, Câncer Pancreático, Câncer Pancreático de Célula das Ilhotas, Câncer de Cavidade Nasal e de Sino Paranasal, Câncer de Paratiróide, Câncer de Pênis, Feocromocitoma, Pineoblastoma, Tumor de Pituitária, Neoplasma de Célula Plasmática/Linfoma Múltiplo, Blastoma Pleuropulmonar, Linfoma de Sistema Nervoso Central Primário, Câncer de Próstata, Câncer Retal, Câncer de Célula Renal (Rim), Câncer de Célula Transicional de Uretra e de Pélvis Renal, Retinoblastoma, Rabdomiossarcoma, Câncer de Glândula Salivar, Sarcoma de Tecido Mole, Sarcoma Uterino, Síndrome de Sezary, Câncer de Pele Não-Melanoma, Carcinoma de Pele de Célula de Merkel, Câncer de Intestino Delgado, Sarcoma de Tecido Mole, Carcinoma de Célula Escamosa, Linfoma de Célula-T Cutânea, Câncer Testicular, Timoma, Carcinoma Tímico, Câncer de Tiróide, Tumor Trofoblástico Gestacional, Carcinoma de Sítio Primário Desconhecido, Câncer de Sítio Primário Desconhecido, Câncer de Uretra, Câncer Uterino Endometrial, Sarcoma Uterino, Câncer Vaginal, Glioma Hipotalâmico e de Via Visual, Câncer Vulvar, Macroglobulinemia de Waldenstrom, e Tumor de Wilms.

Tipicamente tais composições compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável como conhecido e chamado pela prática farmacêutica adequada, veja e.g. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, (1980), Mack Publishing Co. Exemplos de tais veículos incluem solução salina, solução de Ringe ou solução de dextrose, tamponada com tampões adequados para um pH dentro da faixa de 5 a 8. Composições farmacêuticas para injeção (e.g. por intravenosa, intraperitoneal, intradermal, subcutânea, intramuscular ou intraportal) ou infusão contínua estão adequadamente livres de material particulado visível e podem compreender entre 0,1 ng e IOOmg de anticorpo, por exemplo entre 5mg e 25mg de anticorpo. Métodos para a preparação de tais composições farmacêuticas são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na técnica. Em uma modalidade, composições farmacêuticas compreendem entre 0,1 ng e IOOmg de anticorpos da invenção em forma de dosagem unitária, opcionalmente junto com instruções para uso. Composições farmacêuticas da invenção podem estar liofilizadas (secas por congelamento) para reconstituição antes da administração de acordo com métodos bem conhecidos ou evidentes por aquelas pessoas experientes na técnica. Onde modalidades da invenção compreendem anticorpos da invenção com um isótipo IgGl, um agente quelante de cobre tal como citrato (e.g. citrato de sódio) ou EDTA ou histidina pode ser adicionado na composição farmacêutica para reduzir o grau de degradação mediada por cobre dos anticorpos deste isótipo, veja EP0612251.

Doses e regimes de tratamento eficazes para administração do anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo da invenção são geralmente determinadas(os) empiricamente e são dependentes de fatores tais como a idade, peso e estado de saúde do paciente e doença ou distúrbio a ser tratada(o). Tais fatores estão dentro da competência do médico atendente. Orientação sobre seleção de doses apropriadas pode ser encontrada em e.g. Smith et al. (1977) "Antibodies in human diagnosis and therapy", Raven Press, New York mas em geral estará entre Img e IOOOmg.

Convenientemente, uma composição farmacêutica compreendendo um kit de partes do anticorpo da invenção ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo junto com outros medicamentos com instruções para uso também é contemplada pela presente invenção.

A invenção adicionalmente contempla uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo como aqui descrito para uso no tratamento de doenças responsivas à neutralização da interação entre IGF-I e IGF-IR ou IGF-II e IGF-IR.

De acordo com a presente invenção é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal humanizado cujo anticorpo compreende um domínio Vh selecionado do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 14 e a domínio Vl selecionado do grupo consistindo de: SEQIDNO:16.

De acordo com a presente invenção é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal humanizado cujo anticorpo compreende um domínio Vh selecionado do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 15 e um domínio Vl selecionado do grupo consistindo de: SEQ IDNOrl6.

Convenientemente, uma composição farmacêutica compreendendo um kit de partes do anticorpo da invenção ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo junto com tais outros medicamentos opcionalmente junto com instruções para uso também é contemplada pela presente invenção.

A invenção adicionalmente contempla uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo monoclonal ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo como aqui descrito para uso no tratamento de doenças responsivas à neutralização da atividade de IGF-IR.

Em outra modalidade da invenção uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo em combinação com outros agentes terapêuticos ou terapia de radiação, por exemplo em combinação com outras classes de droga incluindo inibidores mitóticos, agentes de alquilação, anti- metabólitos, antibióticos intercaladores, inibidores de fator de crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores de topoisomerase, agentes de anti-sobrevivência, modificadores de resposta biológica, agentes anti- hormônios e anti-angiogênese, incluindo anti-antagonistas de receptor de fator de crescimento incluindo trastuzumab (Herceptin), Erbitux (cetuximab), anticorpos anti-fator de crescimento tais como bevacizumab (Avastin), antagonistas de receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR), fator de crescimento de nervo (NGFR), receptor de fator de crescimento de fibroblasto (FGFR), inibidor de tirosina quinase molecular pequena por exemplo lapatinib, gefitinib, etc, agentes quimioterapêuticos incluindo gencitabine, irinotecan, paclitaxel, cisplatin, doxorubicin, topotecan, ciclofosfamida, melfalan, dacarbazine, daunorubicin, aminocamptotecin, etoposide, teniposide, adriamicin, 5-Fluorouracil, citosina arabinosídeo (Ara- C), Tiotepa, Taxotere, Buslfan, Citoxin, Txaol, Metotrexato, Vimblastine, Bleomicin, Ifosfamide, Mitomicin C, Mitoxantrone, Vincreistine, Vinorelbine, Carboplatin, Carminomicin, Aminopterin, Dactinomicin, usados no tratamento de doenças e distúrbios de humano tais como Artrite reumatóide, Psoríase ou Cânceres tais como: Leucemia Linfoblástica Aguda, Carcinoma Adrenocortical, Cânceres Relacionados com AIDS, Linfoma Relacionado com AIDS, Câncer Anal, Astrocitoma Cerebelar da Infância, Astrocitoma Cerebral da Infância, Câncer Colorretal, Carcinoma de Célula Basal, Câncer de Duto Biliar Extra-hepático, Câncer de Bexiga, Osteossarcorna/Câncer Ósseo Histocitoma Fibroso Maligno, Tumores Cerebrais (e.g., Glioma de Tronco Cerebral, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral/Glioma Maligno, Ependimoma, Meduloblastoma, Tumores Neuroectodermais Primitivos Supratentoriais, Glioma Hipotalâmico e de Via Visual), Câncer de Mama, Carcinóides/Adenocarcinomas Bronquiais, Linfoma de Burkitt, Tumor Carcinóide, Tumor Carcinóide Gastrointestinal, Carcinoma de Sítio Primário Desconhecido, Carcinoma de Sistema Nervoso Central Primário, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral/Glioma Maligno, Câncer Cervical, Cânceres da Infância, Leucemia Linfocítica Crônica, Leucemia Mielógena Crônica, Distúrbios Mieloproliferativos Crônicos, Câncer de Cólon, Câncer Colorretal, Linfoma de Célula-T Cutânea, Câncer Endometrial, Ependimoma, Câncer Esofágico, Família de Tumores de Ewing, Tumor de Célula Germinativa Extracranial, Tumor de Célula Germinativa Extragonadal, Câncer de Duto Biliar Extra- hepático, Câncer Ocular Melanoma Intraocular, Câncer Ocular Retinoblastoma, Câncer de Vesícula Biliar, Câncer Gástrico (Estômago), Tumor Carcinóide Gastrointestinal, Tumores de Célula Germinativa (e.g., Extracranial, Extragonadal, e Ovariano), Tumor Trofoblástico Gestacional, Glioma (e.g., Adulto, Tronco Cerebral da Infância, Astrocitoma Cerebral da Infância, de Via Visual da Infância e Hipotalâmico), Leucemia de Célula Pilosa, Câncer de Cabeça e Pescoço, Câncer Hepatocelular (Fígado), Linfoma de Hodgkin, Câncer Hipofaríngeo, Glioma de Via Visual e Hipotalâmico, Melanoma Intraocular, Carcinoma de Célula das Ilhotas (Pâncreas Endócrino), Sarcoma de Kaposi, Câncer de Rim (Célula Renal), Câncer de Laríngeo, Leucemia (e.g., Linfoblástica Aguda, Mielóide Aguda, Linfocítica Crônica, Mielógena Crônica, e Célula Pilosa), Câncer de Cavidade Oral e de Lábio, Câncer de Fígado, Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena, Câncer de Pulmão de Célula Pequena, Linfoma (e.g., Relacionado com AIDS, de Burkitt, de Célula-T Cutânea, de Hodgkin, de Não-Hodgkin, e Sistema Nervoso Central Primário), Macroglobulinemia de Waldenstrom, Histiocitoma Fibroso Maligno de Osso/Osteossarcoma, Meduloblastoma, Melanoma, Melanoma Intraocular (Olho), Melanoma de Célula de Merkel, Mesotelioma, Câncer de Pescoço Escamoso Metastático com Síndrome de Neoplasia Endócrima Múltipla, Primária Oculta, Neoplasma de Célula Plasmática/Mieloma Múltiplo, Micose Fungóide, Síndromes Mieloplásticas, Doenças Mieloproliferativas/Mielodisplásticas, Leucemia Mielógena, Leucemia Mielóide Crônica, Linfoma Múltiplo, Distúrbios Mieloproliferativos Crônicos, Câncer de Sino Paranasal e Cavidade Nasal, Câncer Nasofaríngeo, Neuroblastoma, Câncer Oral, Câncer Orofaríngeo Osteossarcorna/Histiocitoma Fibroso Maligno de Osso, Câncer Ovariano, Câncer Epitelial Ovariano, Tumor de Célula Germinativa Ovariana, Tumor Potencial Maligno Baixo Ovariano, Câncer Pancreático, Câncer Pancreático de Célula das Ilhotas, Câncer de Cavidade Nasal e de Sino Paranasal, Câncer de Paratiróide, Câncer de Pênis, Feocromocitoma, Pineoblastoma, Tumor de Pituitária, Neoplasma de Célula Plasmática/Linfoma Múltiplo, Blastoma Pleuropulmonar, Linfoma de Sistema Nervoso Central Primário, Câncer de Próstata, Câncer Retal, Câncer de Célula Renal (Rim), Câncer de Célula Transicional de Uretra e de Pélvis Renal, Retinoblastoma, Rabdomiossarcoma, Câncer de Glândula Salivar, Sarcoma de Tecido Mole, Sarcoma Uterino, Síndrome de Sezary, Câncer de Pele Não-Melanoma, Carcinoma de Pele de Célula de Merkel, Câncer de Intestino Delgado, Sarcoma de Tecido Mole, Carcinoma de Célula Escamosa, Linfoma de Célula-T Cutânea, Câncer Testicular, Timoma, Carcinoma Tímico, Câncer de Tiróide, Tumor Trofoblástico Gestacional, Carcinoma de Sítio Primário Desconhecido, Câncer de Sítio Primário Desconhecido, Câncer de Uretra, Câncer Uterino Endometrial, Sarcoma Uterino, Câncer Vaginal, Glioma Hipotalâmico e de Via Visual, Câncer Vulvar, Macroglobulinemia de Waldenstrom, e Tumor de Wilms.

O anticorpo ou seus fragmentos de ligante de antígeno da presente invenção podem ser usados por exemplo em combinação com um ou mais agentes terapeuticamente ativos ou radiação por exemplo em combinação com outras classes de droga incluindo inibidores mitóticos, agentes de alquilação, anti-metabólitos, antibióticos intercaladores, inibidores de fator de crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores de topoisomerase, agentes de anti-sobrevivência, modificadores de resposta biológica, agentes anti-hormônios e anti-angiogênese, incluindo anti- antagonistas de receptor de fator de crescimento incluindo trastuzumab (Herceptin), Erbitux (cetuximab), anticorpos anti-fator de crescimento tais como bevacizumab (Avastin), antagonistas de receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR), fator de crescimento de nervo (NGFR), receptor de fator de crescimento de fibroblasto (FGFR), agentes anti-IGF-lR de molécula pequena, inibidor de tirosina quinase molecular pequena incluindo lapatinib, gefitinib, etc, agentes quimioterapêuticos incluindo gencitabine, irinotecan, paclitaxel, cisplatin, doxorubicin, topotecan, ciclofosfamida, melfalan, dacarbazine, daunorubicin, aminocamptotecin, etoposide, teniposide, adriamicin, 5-Fluorouracil, citosina arabinosídeo (Ara- C), Tiotepa, Taxotere, Buslfan, Citoxin, Txaol, Metotrexato, Vimblastine, Bleomicin, Ifosfamide, Mitomicin C, Mitoxantrone, Vincreistine, Vinorelbine, Carboplatin, Carminomicin, Aminopterin, Dactinomicin. A invenção assim fornece, em uma outra modalidade, o uso de uma tal combinação no tratamento de doenças onde sinalização de receptor de IGF-I contribui para a doença ou onde neutralização da atividade do receptor será benéfica e o uso do anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo na manufatura de um medicamento para a terapia de combinação de distúrbios tais como Artrite reumatóide, Psoríase ou Cânceres tais como: Leucemia Linfoblástica Aguda, Carcinoma Adrenocortical, Cânceres Relacionados com AIDS, Linfoma Relacionado com AIDS, Câncer Anal, Astrocitoma Cerebelar da Infância, Astrocitoma Cerebral da Infância, Câncer Colorretal, Carcinoma de Célula Basal, Câncer de Duto Biliar Extra-hepático, Câncer de Bexiga, Osteossarcorna/Câncer Ósseo Histocitoma Fibroso Maligno, Tumores Cerebrais (e.g., Glioma de Tronco Cerebral, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral/Glioma Maligno, Ependimoma, Meduloblastoma, Tumores Neuroectodermais Primitivos Supratentoriais, Glioma Hipotalâmico e de Via Visual), Câncer de Mama, Carcinóides/Adenocarcinomas Bronquiais, Linfoma de Burkitt, Tumor Carcinóide, Tumor Carcinóide Gastrointestinal, Carcinoma de Sítio Primário Desconhecido, Carcinoma de Sistema Nervoso Central Primário, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral/Glioma Maligno, Câncer Cervical, Cânceres da Infância, Leucemia Linfocítica Crônica, Leucemia Mielógena Crônica, Distúrbios Mieloproliferativos Crônicos, Câncer de Cólon, Câncer Colorretal, Linfoma de Célula-T Cutânea, Câncer Endometrial, Ependimoma, Câncer Esofágico, Família de Tumores de Ewing, Tumor de Célula Germinativa Extracranial, Tumor de Célula Germinativa Extragonadal, Câncer de Duto Biliar Extra-hepático, Câncer Ocular Melanoma Intraocular, Câncer Ocular Retinoblastoma, Câncer de Vesícula Biliar, Câncer Gástrico (Estômago), Tumor Carcinóide Gastrointestinal, Tumores de Célula Germinativa (e.g., Extracranial, Extragonadal, e Ovariano), Tumor Trofoblástico Gestacional, Glioma (e.g., Adulto, Tronco Cerebral da Infância, Astrocitoma Cerebral da Infância, de Via Visual da Infância e Hipotalâmico), Leucemia de Célula Pilosa, Câncer de Cabeça e Pescoço, Câncer Hepatocelular (Fígado), Linfoma de Hodgkin, Câncer Hipofaríngeo, Glioma de Via Visual e Hipotalâmico, Melanoma Intraocular, Carcinoma de Célula das Ilhotas (Pâncreas Endócrino), Sarcoma de Kaposi, Câncer de Rim (Célula Renal), Câncer de Laríngeo, Leucemia (e.g., Linfoblástica Aguda, Mielóide Aguda, Linfocítica Crônica, Mielógena Crônica, e Célula Pilosa), Câncer de Cavidade Oral e de Lábio, Câncer de Fígado, Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena, Câncer de Pulmão de Célula Pequena, Linfoma (e.g., Relacionado com AIDS, de Burkitt, de Célula-T Cutânea, de Hodgkin, de Não-Hodgkin, e Sistema Nervoso Central Primário), Macroglobulinemia de Waldenstrom, Histiocitoma Fibroso Maligno de Osso/Osteossarcoma, Meduloblastoma, Melanoma, Melanoma Intraocular (Olho), Melanoma de Célula de Merkel, Mesotelioma, Câncer de Pescoço Escamoso Metastático com Síndrome de Neoplasia Endócrima Múltipla, Primária Oculta, Neoplasma de Célula Plasmática/Mieloma Múltiplo, Micose Fungóide, Síndromes Mieloplásticas, Doenças Mieloproliferativas/Mielodisplásticas, Leucemia Mielógena, Leucemia Mielóide Crônica, Linfoma Múltiplo, Distúrbios Mieloproliferativos Crônicos, Câncer de Sino Paranasal e Cavidade Nasal, Câncer Nasofaríngeo, Neuroblastoma, Câncer Oral, Câncer Orofaríngeo Osteossarcorna/Histiocitoma Fibroso Maligno de Osso, Câncer Ovariano, Câncer Epitelial Ovariano, Tumor de Célula Germinativa Ovariana, Tumor Potencial Maligno Baixo Ovariano, Câncer Pancreático, Câncer Pancreático de Célula das Ilhotas, Câncer de Cavidade Nasal e de Sino Paranasal, Câncer de Paratiróide, Câncer de Pênis, Feocromocitoma, Pineoblastoma, Tumor de Pituitária, Neoplasma de Célula Plasmática/Linfoma Múltiplo, Blastoma Pleuropulmonar, Linfoma de Sistema Nervoso Central Primário, Câncer de Próstata, Câncer Retal, Câncer de Célula Renal (Rim), Câncer de Célula Transicional de Uretra e de Pélvis Renal, Retinoblastoma, Rabdomiossarcoma, Câncer de Glândula Salivar, Sarcoma de Tecido Mole, Sarcoma Uterino, Síndrome de Sezary, Câncer de Pele Não-Melanoma, Carcinoma de Pele de Célula de Merkel, Câncer de Intestino Delgado, Sarcoma de Tecido Mole, Carcinoma de Célula Escamosa, Linfoma de Célula-T Cutânea, Câncer Testicular, Timoma, Carcinoma Tímico, Câncer de Tiróide, Tumor Trofoblástico Gestacional, Carcinoma de Sítio Primário Desconhecido, Câncer de Sítio Primário Desconhecido, Câncer de Uretra, Câncer Uterino Endometrial, Sarcoma Uterino, Câncer Vaginal, Glioma Hipotalâmico e de Via Visual, Câncer Vulvar, Macroglobulinemia de Waldenstrom, e Tumor de Wilms.

Quando o anticorpo ou seus fragmentos de ligante de antígeno da presente invenção são usados em combinação com outros agentes terapeuticamente ativos, os componentes podem ser administrados quer juntos quer separadamente, seqüencialmente ou simultaneamente por qualquer rota conveniente.

As combinações referidas acima podem ser convenientemente apresentadas para uso na forma de uma formulação farmacêutica e assim formulações farmacêuticas compreendendo uma combinação como definida acima otimamente junto com um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável compreende uma outra modalidade da invenção. Os componentes individuais de tais combinações podem ser administrados quer juntos quer separadamente, seqüencialmente ou simultaneamente em formulações farmacêuticas combinadas ou separadas.

Quando combinados na mesma formulação será reconhecido que os dois componentes precisam ser estáveis e compatíveis entre si e com os outros componentes da formulação e podem ser formulados para administração. Quando formulados separadamente podem ser fornecidos em qualquer formulação conveniente, convenientemente em uma tal maneira como as conhecidas para anticorpos e seus fragmentos de ligante de antígeno na técnica.

Quando em combinação com um segundo agente terapêutico ativo contra a mesma doença, a dose de cada componente pode diferir daquela quando o anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo é usado sozinho. Doses apropriadas serão prontamente estimadas por aquelas pessoas experientes na técnica.

A invenção assim fornece, em uma outra modalidade, uma combinação compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo da presente invenção junto com outro agente terapeuticamente ativo.

A combinação referida acima pode ser convenientemente apresentada para uso na forma de uma formulação farmacêutica e assim formulações farmacêuticas compreendendo uma combinação como definida acima junta com um veículo farmaceuticamente aceitável da mesma representa uma outra modalidade da invenção.

Os seguintes exemplos ilustram vários aspectos da invenção. Estes exemplos não limitam o escopo desta invenção que é definido pelas reivindicações anexadas. Exemplos

Exemplo 1 - Geração de anticorpos monoclonais

Anticorpos monoclonais (mAbs) foram produzidos por células de hibridoma de acordo com o método descrito em E Harlow e D Lane, Antibodies a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Camundongos SJL foram inicialmente inoculados e reforçados por injeção intraperitoneal com IGF-IR recombinante de humano (R&D Systems, #305- GR) em adjuvante RIBI. Baços dos animais respondedores foram colhidos e fusionados em células de Mieloma X63Ag8653GFPlL5 para gerar hibridomas. O material sobrenadante de hibridoma foi selecionado para ligação em IGF-IR usando FMAT (ABI8200) e BIAcore A100. O ABI8200 foi usado para confirmar ligação em IGF-IR recombinante (R&D Systems - 305-GR-050 e 391-GR-050) e IGF-IR de humano expressado por HEK293T, IGF-IR de macaco cinomolgo expressado por HEK293T e ausência de ligação em receptor de insulina de humano expressado por HEK293T. O BIAcore AlOO foi usado para estimar a cinética de ligação de anticorpos produzidos por hibridoma em IGF-IR recombinante (R&D Systems, #305- GR). Anticorpos foram capturados sobre a pastilha usando uma IgG de coelho anti-camundongo (BR-1005-14, Biacore AB). Hibridomas de interesse foram monoclonados usando meios semi-sólido (solução de metil-celulose), Omnitrays e o sistema ClonePix FL.

Exemplo 2 - Aumento de escala e purificação de material de hibridoma e anticorpos monoclonais.

Hibridomas a terem escala aumentada foram crescidos em cultura de tecido para a escala de 4 frascos confluentes de 225cm2. Neste ponto as células foram colhidas por centrifiigação a 400g por 5 minutos. A pelota foi ressuspensa com 100 mL de meio livre de soro (JRH610) para lavar as células. As células foram então centrifugadas a 400g por 5 minutos. O sobrenadante foi aspirado e jogado fora. 150 mL de meio livre de soro novo foram usados para ressuspender a pelota celular. A suspensão de células foi então transferida para um frasco novo de 225cm2 e deixada em uma incubadora por um período de 5 dias. O sobrenadante foi então colhido e centrifugado a 400g por 20 minutos. O sobrenadante foi colhido e esterilmente filtrado com um filtro de 0,2 μιη em preparação para purificação. O anticorpo foi purificado usando colunas de resina de proteína A. O anticorpo purificado foi dialisado contra PBS pH7,4. Exemplo 3- Construção de vetores de expressão de IGF-IR Geração de cassete de expressão para IGF-IR de humano de comprimento total

O cassete de expressão de cDNA de IGF-IR de humano foi idêntico ao Genbank X04434 exceto para uma mudança no nucleotídeo 3510. Esta resulta na mudança silenciosa do códon para glicina 1170 de "GGC" para "GGG". cDNA de IGF-IR de humano foi expressado do vetor pcDNA3,l(-) (Invitrogen). A seqüência do IGF-IR de humano é mostrada em SEQ ID NO 44.

Geração de cassete de expressão para IGF-R murino de comprimento total

O cassete de expressão de cDNA de IGF-IR murino foi idêntico ao Genbank AF056187 exceto para uma mudança em nucleotídeo 3522. Esta resultou na mudança silenciosa do códon para glicina 1174 de "GGT" para "GGG". Os cDNAs de IGF-IR murino foram expressados de vetores pcDNA3.1D-V5-His TOPO (Invitrogen). A seqüência de IGF-IR murino é mostrada em SEQ ID NO 46.

Geração de cassete de expressão para IGF-IR de macaco cinomolgo (Macaca fascicularis) de comprimento total

A seqüência nova para cIGF-lR de macaco cinomolgo foi clonada por PCR de uma biblioteca de cDNA de rim de macaco cinomolgo. Iniciadores foram baseados na entrada de banco de dados de IGF-IR de humano, NM 000875. Iniciadores de PCR foram planejados com um motivo de Kozak na extremidade 5' e com sítios de restrição BamHI e NotI flanqueando. O produto de BamHI-NotI PCR foi clonado em pCDNA3.1 D com as seqüências de vetor Tl próximas da extremidade 5' da seqüência codificadora de IGF-IR. O cDNA obtido é 99,6% idêntico a uma seqüência de humano em nível de proteína (diferenças de 4aa em relação à seqüência humana). A seqüência de IGF-IR de macaco cinomolgo é mostrada em SEQ IDNO 45.

Geração de cassete de expressão para receptor de Insulina de humano de comprimento total (Tipo B)

Um cassete de DNA codificador de receptor de insulina de humano de tipo B (SEQ ID NO 53) foi clonado em pcDNA3.1 (Invitrogen). Para comparação, a seqüência codificadora de SEQ ID NO 53 é idêntica à seqüência dada em entrada de GenbankrMl0051, exceto pelas seguintes mudanças: A numeração de nucleotídeo é baseada em "A" da metionina de iniciação sendo nucleotídeo 1 (que corresponde à posição 139 da seqüência de nucleotídeos em M10051).

Nucleotídeo Aminoácido SEQ ID No 53 M10051 511 171 TAC (Tyr) CAC (His) 783 261 GAT (Asp) GAC (Asp) 909 303 CAG (Gln) CAA (Gln) 1343 448 ATC (Ile) ACC (Thr) 1474 492 CAG (Gln) AAG (Lys) 1638 546 GAC(Asp) . GAT (Asp) 1650 550 GCA (Ala) GCG (Ala) 3834 1278 AAC (Asn) AAG (Lys)

Vetores para IGF-IRs de humano, murino e de macaco

cinomolgo e receptor de insulina de tipo B foram expressados transientemente em células 293 HEK-T usando protocolos padrão e reagente Lipofectamine (Invitrogen).

Exemplo 4 - Geração de e expressão de proteínas recombinantes usando BacMam

Construção de estrutura principal de vetor pFastBacMam

pFastBac 1 (Invitrogen) foi digerido com SnaBI e Hpal para remover o promotor de poliedrina. Este foi ligado com um fragmento Nrul- Bstl 1071 de 3,Ikb de pcDNA3 (Invitrogen) que contém o promotor precoce imediato de Citomegalovírus (CMV IE) com um poliligante e sítio BGH poli Aeo promotor SV40 dirigindo a expressão do gene de resistência a G418. Este vetor permitirá a produção de um baculovírus que expressa um gene sob o controle do promotor CMV em células de mamífero. Também é possível selecionar derivados estáveis para por as células sob seleção de G418. Proteína de fusão de IGF-IR de humano - Fc

Foi construído um plasmídeo planejado para expressar seqüências de domínio extracelular de IGF-IR de humano fusionadas em um sítio de clivagem de fator Xa e seqüências de Fc de humano de IgGl. Seqüências codificadoras do domínio extracelular (aminoácidos 1-935) do cDNA de IGF-IR de humano foram amplificadas por PCR e fusionadas em um sítio de clivagem de Fator Xa e seqüências Fc de IgGl de humano. O inserto inteiro foi então subclonado como um fragmento HindIII-BamHI no vetor de expressão pFastBacMam. A seqüência de IGF-IR de humano - proteína de fusão Fc é mostrada em SEQ ID NO 47.

Proteína de fusão de IGF-IR de macaco cinomolgo (Macaca fascicularis ) - Fc

Foi construído um plasmídeo planejado para expressar seqüências de domínio extracelular de IGF-IR de macaco cinomolgo fusionadas em um sítio de clivagem de fator Xa e seqüências de Fc de humano de IgGl. O plasmídeo de expressão de IGF-IR de humano foi modificado pela remoção de um fragmento XbaI de 82 pb da estrutura principal do vetor por corte com Xbal e re-ligação. Isto remove um segundo sítio NotI. A seqüência codificadora do domínio extracelular de IGF-IR de macaco cinomolgo (aminoácidos 1-935) foi amplificada por PCR como um fragmento HindIII-NotI e ligada no plasmídeo de expressão de IGF-IR modificado que havia sido cortado com HindIII e NotI para remover as seqüências de humano. A seqüência de IGF-IR de macaco cinomolgo - proteína de fusão Fc é mostrada em SEQ ID NO 48. Expressão de proteínas recombinantes usando BacMam

Vetores plasmídeo codificadores de seqüências de domínio extracelular de IGF-IR de macaco cinomolgo e de humano fusionadas em um sítio de clivagem de Fator Xa e seqüências Fc de IgGl de humano foram usados para dirigir a expressão de proteína usando o sistema BacMam. Baculovírus foram gerados usando o sistema Invitrogen Bac-to-Bac. O estoque de PO inicial foi escalado para um estoque Pl de um litro usando procedimentos padrão. Produção de proteína foi iniciada por infecção de 1-5 litros de células HEK293-F em cultura em suspensão com o vírus BacMam exigido (tipicamente em uma multiplicidade de infecção (MOI)) de 10 para 100 para 1 embora isto fosse costumeiramente otimizado para maximizar a produção de proteína). Após cultura de 2-3 dias o sobrenadante de cultura celular foi colhido, células foram removidas por centrifugação e a proteína expressada foi então purificada do sobrenadante clarificado. Exemplo 5 - Construção de plasmídeos de expressão de ligante de IGF-IR

Seqüências de gene para as formas processadas de IGF-I (aminoácidos 49-118, Swiss-prot P01343) e IGF-II (aminoácidos 25-91, Swiss-prot PO1344) fora códon-otimizadas para expressão em E.coli. Os genes foram preparados de novo por desenvolvimento de oligonucleotídeos de recobrimento e clonados nos sítios NdeI-BamHI de pET-21b (Novagen). Para a produção de ligantes de IGF-IR biotinilados, uma seqüência de etiqueta de biotinilação de 15 aminoácidos C-terminal (GLNDIFEAQKIEWHE, ref: Schatz (1993) Biotechnology (Ν Y), 11(10):1138-43) SEQ ID NO: 17 foi incluída no desenvolvimento do gene.

As seqüências de ligante IGF-I e de ligante IGF-II de humano são mostradas em SEQ ID NO 49. e SEQ ID NO 51 respectivamente. Exemplo 6 - Expressão e purificação de ligantes de IGF-IR

Plasmídeos foram transformadas em células de E. coli BL21(DE3) então expressão foi realizada usando meio LB coml00μg/ml de ampicilina após indução com IPTG ImM a 37°C por 16 horas. As pelotas celulares foram colhidas por centrifugação. Ligantes IGF-IR foram isolados como corpos de inclusão insolúveis por ressuspensão de pelotas celulares em Tris 5OmM pH8,0, NaCl 200mM, EDTA ImM, DTT 5mM, lisados por sonificação e recuperados na fração de corpos de inclusão por centrifugação. Ligantes IGF-IR solúveis foram produzidos por solubilização dos corpos de inclusão em Tris 50mM pH8,0, Cloridrato de Guanidina 6M, então rapidamente diluindo em um excesso de volume de 100 vezes de Tris 50mM pH8,0, glutationa oxidada ImM, glutationa reduzida ImM seguido por misturação por 16 horas a 4°C. Proteína solúvel foi concentrada e centrifugada para remover material insolúvel então ligantes IGF-IR biologicamente ativos foram purificados por HPLC em fase reversa usando uma coluna Spherisorb C6 (Waters) com um gradiente de acetonitrila.

Para ligantes IGF-IR com etiquetas de biotinilação, biotinilação foi realizada pela adição de ATP 5mM, MgCl2 5mM, d-biotina ImM e biotina ligase 1 μΜ nas proteínas purificadas. A mistura foi incubada na temperatura ambiente por 3 horas. Os ligantes IGF-IR biotinilados foram purificados por cromatografia de exclusão de tamanho usando uma coluna Superdex 75 (GE Healthcare). Ligantes IGF-IR purificados foram dialisados contra PBS, quantificados usando padrões BSA e um ensaio de proteína baseado em BioRad coomassie então armazenados em alíquotas a -80°C. Pesos moleculares de proteínas purificadas foram verificados por espectrometria de massa. As seqüências de ligante IGF-I etiquetado e ligante IGF-II etiquetado de humano são mostradas em SEQ ID NO 50. e SEQ ID NO 52 respectivamente.

Exemplo 7. - Seqüenciamento de domínios variáveis de hibridomas

RNA total foi extraído de pelotas de aproximadamente IO6 células para cada clone de hibridoma usando o RNeasy kit de Qiagen (#74106). Promega AccessQuick RT-PCR System (A 1702) foi usado para produzir cDNA das regiões leve e pesada variáveis usando iniciadores degenerados específicos para as seqüências líderes murinas e regiões constantes IgG 1/K ou IgG2b/K murinas. Os fragmentos de RT-PCR purificados foram clonados usando TA cloning kit (Invitrogen (K2030-40)) e uma seqüência de consenso foi obtida para cada hibridoma por alinhamento de seqüências, pesquisa em KABAT (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Os números de listagem de seqüências dos domínios variáveis de hibridomas 6E11, 9C7, 2B9, 15D9 e 5G4 são mostrados em Tabela 1 abaixo:

Hibridoma SEQ ID. NO: de região pesada variável SEQ ID. NO: de região leve variável 6E11 8 9 9C7 18 19 2B9 10 11 5G4 20 21 15D9 22 23

Tabela 1 - SEQ I.D. NO: das regiões pesada e leve variáveis dos hibridomas. Notar que as seqüências mostradas em Tabela 1 não incluem seqüências de sinal.

Exemplo 8: Construção de anticorpos quiméricos

Anticorpos quiméricos, compreendendo domínios variáveis murinos parentais enxertados em regiões constantes de tipo selvagem de IgG 1/k de humano foram construídos por clonagem por PCR. Baseado na seqüência de consenso, iniciadores para amplificar os domínios variáveis murinos foram planejados, incorporando sítios de restrição exigidos para facilitar a clonagem em vetores de expressão em mamífero. As cadeias pesada e leve de comprimento total do anticorpo quimérico 6E11 (6Ellc) são dadas em SEQ I.D. NO: 24 e SEQ I.D. NO: 25. Exemplo 9: Estratégia de humanizacão

Anticorpos humanizados foram gerados por um processo de enxerto de CDRHl, CDRH2, CDRH3, CDRLl e CDRL3 do anticorpo 6E11 murino e CDRL2 do anticorpo 9C7 murino em uma seqüência de molde de humano adequada.

A seqüência do domínio leve variável humanizado de LO é dada em (SEQ I.D. NO: 16).

As seqüências dos domínios pesados variáveis humanizados de HO e Hl são dadas em (SEQ I.D. NO: 14 e SEQ I.D. NO: 15 respectivamente). Seqüências de nucleotídeos otimizadas codificadoras destas seqüências são mostradas em SEQ ID NO:34 (HO), 35 (Hl) e 36 (L0). Seqüências de domínios variáveis LO e HO alternativas são dadas em SEQ ID NO: 61 e 62 respectivamente, seqüências de cadeia leve LO e de cadeia pesada HO alternativas são dadas em SEQ ID NO: 69 e 70. Construção de vetores de anticorpo humanizado

Fragmentos de DNA codificadores de regiões pesada e leve variáveis humanizadas foram construídos de novo usando uma estratégia baseada em PCR e oligonucleotídeos de recobrimento. O produto de PCR foi clonado em vetores de expressão em mamífero contendo a região constante gama 1 de humano e a região constante kappa de humano respectivamente. Esta é a região Fc de tipo selvagem.

Usando uma estratégia similar, as regiões pesadas variáveis foram também clonadas em uma variante da região constante gama 1 de humano que continha duas substituições de alanina L235A e G237A (numeração de índice EU). Estes construtos são aqui chamados de IgGlm(AA). Os dois construtos humanizados que compreendiam a variante IgGlm(AA) são mostrados como HOLO IgGlm(AA) (SEQ ID NO 54 e SEQ ID NO 39) e HlLO IgGlm(AA) (SEQ ID NO 56 e SEQ ID NO 39).

A não ser que seja indicado de outro modo todos os construtos humanizados usando nos exemplos aqui compreendem regiões constantes gama 1 de humano de tipo selvagem.

Exemplo 10 - Expressão de anticorpo recombinante em células CHO

Plasmídeos de expressão codificadores das cadeias pesada e leve respectivamente de anticorpos quiméricos ou humanizados foram transientemente co-transfectados em células CHO-K1. Em algumas situações o material de sobrenadante foi usado como o artigo de teste em ensaios de ligação e de atividade. Em outras situações, o material de sobrenadante foi esterilizado por filtração e o anticorpo foi recuperado por cromatografia de afinidade usando Proteína A. Anticorpos também foram expressados em um sistema de célula CHO policlonal. Vetores de DNA codificadores das cadeias pesada e leve foram co-eletroporados em células CHO em suspensão. Células foram passadas em frascos de agitação em meio seletivo basal MRla 37°C, 5%C02, 130-150rpm até viabilidade celular e contagens de células melhoradas. Células CHO foram então inoculadas em meio seletivo MRl basal x2 e incubadas por 10 a 14 dias a 34°C, 5%C02, 130-150rpm. As células foram pelotizadas por centrifugação e o sobrenadante esterilmente filtrado. Anticorpo foi recuperado por purificação em Proteína A. Dados comparativos entre hibridomas e/ou mAbs quiméricos e/ou Mabs humanizados

Exemplo 11 - ELISA de Ligação de Receptor

O^g/mL de IGF-IR recombinante de humano etiquetado com histidina (R&D Systems, #305-GR-050) foi capturado sobre uma placa de ELISA revestida com 0,5-^g/mL de anticorpo policlonal de coelho para 6xHis (Abeam, #ab9108). Anticorpos Anti-IGF-IR dos sobrenadantes de teste ou material purificado foram titulados através da placa. Os níveis de receptor- ligado foram detectados pelo tratamento com um anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (Dako, P0260) ou anticorpo de cabra anti-Cadeias Leves Kappa de humano conjugado com peroxidase (Sigma, A7164). O ELISA foi revelado usando o substrato de peroxidase dicloridrato de O-fenileno-diamina (OPD) (Sigma, P9187).

Figura 1. mostra as curvas de ligação para anticorpos murinos 6E11, 5G4 e 15D9. Figura 2. mostra as curvas de ligação para HOLO e HlLO e HOLO IgGlrn(AA) e HlLO IgGlm(AA) confirmando que têm atividade de ligação similar quando comparados com a quimera 6E11. Outros anticorpos monoclonais foram testados (dados não mostrados). Exemplo 12 - Regulação negativa de receptor

Células 3T3/LISN c4 (linhagem de célula NIH 3T3 murina expressando IGF-IR de humano, veja Kaleko et al. (1990) Molecular and Cellular Biology, 10 (2): 464-473) foram incubadas com 5 μg/mL de anticorpo a 37°C por 24 horas antes de as células serem colhidas. Lisados destas pelotas de célula foram corridos sobre um gel de SDS PAGE e transferidas para membrana de PVDF (Western blot). IGF-IR foi detectado por tratamento com um anticorpo de coelho anti IGF-IRp C-20 (Santa Cruz Biotechnology, sc-713) seguido pelo tratamento com anticorpo secundário anti-coelho conjugado com HRP (P0217) e detectado usando reagente de quimioluminescência intensificado (ECL) (GE Healthcare).

Figura 3 mostra que a incubação de células 3T3/LISN c4 com anticorpo monoclonal 6E11 resulta em regulação negativa da cadeia IGF-IRp.

Em um experimento similar, níveis de receptor foram ensaiados em células NCI-H838 após tratamento com HOLO. Células NCI- H838 (lxl06/cavidade) expressando IGF-IR de humano foram incubadas com 5Mg/cavidade de HOLO por vários tempos até 24 horas. Células foram então colhidas e as pelotas de célula foram lisadas e corridas sobre um gel de SDS PAGE, transferidas para membrana de PVDF e manchada para IGF-IR usando um anticorpo de coelho anti-IGF-lRp c-20 (Santa Cruz, sc713). Ligação foi detectada com um anticorpo anti-coelho HRP (Dako, P0217). As pistas sobre o Western blot da esquerda para a direita são: Sem anticorpo de controle (colhido em 24 horas), então colheitas em 0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 3, 6 e 24 horas. Figura 4 mostra que HOLO induz degradação tão cedo quanto 30 minutos (0,5h) após exposição, embora exposição continuada de 3 horas seja exigida para níveis de IGF-IR alcançarem um nível basal. Em outro experimento, incubação de células Colo205 com Vários anticorpos incluindo 6E11 parental, 6E11 quimera, HOLO por 24 horas causou uma redução substancial em níveis de receptor determinados por Western blot para o IGF- IR (cadeia-β (dados não mostrados).

Em um experimento de acompanhamento, células de carcinoma de pulmão NCI-H838 foram tratadas com os anticorpos anti-IGF- IR terapêuticos humanizados. Células NCI-H838 foram soro-estioladas por 24 horas e quer não tratadas (controle), quer tratadas por 24 horas com H0L0, HOLO IgGlm(AA) ou IgG de humano não-selecionadora (controle) 120nM. Células foram lavadas duas vezes com PBS gelado e Usadas sobre gelo por 10 minutos com tampão de Iise NP40 1%, clarificadas por centrifugação a 16400rpm por 20 minutos a 4°C e 50μg de proteínas celulares solúveis submetidas à SDS PAGE redutora em geles de poliacrilamida 4 a 12%. Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF e imobilizadas quer para IGF-IR quer para receptor de Insulina. Membranas também foram imunomanchadas para uma α-tubulina para avaliar a carga através de cada pista. Anticorpos secundários fluorescentemente marcados foram usados e as quantidades de IGF-IR, receptor de Insulina e a-tubulina foram quantificadas usando um sistema de imagem LI COR Odyssey. Os anticorpos primário e secundário usados foram selecionados de Alexa680, cabra anti-coelho, Molecular Probes #A-21076. Usado 1/20000 = 0,5ml em IOml (45min a 250C), IRDye800, burro anti-camundongo, Rockland #610- 732-124. Usado 1/10000 = Iml em IOml (45min a 25°C) e IRDye800, burro anti-coelho, Rockland #611-732-127. Usado 1/10000 = 0,5ml em 5ml (45min a 25°C).

A subunidade β de 97kDa de IGF-IR e o IGF-IR de comprimento total de 200kDa e a subunidade β de 95kDa de receptor de Insulina e o receptor de Insulina de comprimento total de 200kDa e a-tubulina de 50kDa são mostrados em figura 5. Incubação com os anticorpos humanizados resultou em níveis significativamente diminuídos de IGF-IR - aproximadamente 80% de redução relativa às amostras tratadas com anticorpo de controle (Figura 5). Isto foi acompanhado por um decréscimo em níveis de receptor de Insulina, mais provavelmente devido à degradação de heterodímeros de receptor de Insulina / IGF-IR.

Regulação negativa de receptor em células LISN/3T3 c4 também foi demonstrada usando um ensaio baseado em FACS em sangue inteiro (empobrecido em células vermelhas do sangue). H0L0 foi adicionado por 24 horas a 4°C ou 37°C em uma amostra de sangue inteiro de um doador (Doador 90263). Figura 6 mostra um histograma de recobrimento de intensidade fluorescente para a população de granulócito e de linfócito (ajustado usando perfis de dispersão lateral e anterior) a 4°C (linha sólida) e 37°C (linha pontilhada). Após incubação, níveis de receptor foram avaliados usando anticorpo 1H7 anti-IGF-lR marcado com PE (BD Pharmingen, #555999). Em um experimento diferente HOLO ou Controle IgG foram adicionados por 24 horas a 4°C ou 37°C em uma amostra de sangue inteiro de um doador diferente (Doador 90691). Figura 7 mostra um histograma de recobrimento da intensidade fluorescente ou da população de granulócito a 4°C e 37°C comparado com um controle isótipo. Em ambos doadores, incubação a 3 7o C por 24 horas causou uma redução marcante na intensidade de fluorescência comparado com a incubação de mesma linhagem celular a 4°C. O ensaio foi repetido com amostras de sangue inteiro de vários outros doadores com um efeito total similar, embora a magnitude de regulação negativa e expressão de receptor variasse de doador para doador. Um número pequeno de doadores mostrou expressão de receptor muito baixa que não foi afetada pela incubação com anticorpo.

Exemplo 13 - Inibição de fosforilação de receptor estimulada por IGF-I ou IGF-II

Células 3T3/LISN c4 foram plaqueadas em uma densidade de 10.000 células/cavidade em placas de 96 cavidades e permitidas crescer por 1- 2 dias em DMEM completo (modificação DMEM-Hepes + 10%FCS). Anticorpos anti-hlGF-lR (sobrenadantes de hibridoma ou anticorpos purificados) foram adicionados nas células e incubados por 1 hora. Qualquer 30-5Ong de rhlGF-l(R&D Systems 291-Gl ou 50ng/ml de rhIGF-1 (veja Exemplo 5 e 6) ou lOOng/ml de rhlGF-2 (R&D Systems 292-G2) (veja Exemplo 5 e 6) foi adicionado nas células tratadas e incubados por mais 20- mins para estimular fosforilação de receptor. Células foram lavadas uma vez em PBS e então lisadas pela adição de tampão de Iise RIPA (NaCl 150mM, Tris HCl 50mM, Desóxicolato de Na 6mM, Tween 20 1%) mais coquetel de inibidor de protease (Roche 11 697 498 001). A placa foi congelada por 30 minutos ou durante a noite. Após descongelamento, lisado de cada cavidade foi transferido para uma placa de ELISA de 96 cavidades pré-revestida com um anticorpo de captura anti IGF-IR (R&D Systems MAB391) a 2μg/ml e bloqueado com 4%BSA/TBS. Em alguns experimentos um anticorpo de captura alternativo foi usado (2B9 SEQ ID NO: 10 e 11 revestido a 1 μg/ml). A placa foi incubada durante a noite a 4°C. A placa foi lavada com TBST (TBS+Tween 200 0,1%) e um anticorpo anti-Fosfotirosina marcado com Európio (PerkinElmer DELFIA Eu-Nl PT66) diluído 1/2500 em 4%BSA/TBS foi adicionado em cada cavidade. Após incubação de 1 hora a placa foi lavada e foi adicionada solução DELFIA Enhancement (PerkinElmer 1244-105). Após incubação de 10 min o nível de fosforilação de receptor foi determinado usando uma leitora de placa ajustada para medir fluorescência resolvida por tempo (TRF) de Európio.

Figura 8 mostra um exemplo da inibição de fosforilação de receptor mediada por anticorpos monoclonais murinos purificados 6E11, 5G4 e 15D9, dados colhidos para experimentos feitos ao mesmo tempo para placas diferentes com experimentos realizados ao mesmo tempo.

Figura 9 mostra um exemplo da inibição de fosforilação de receptor mediada por HlLO em comparação com o anticorpo quimérico 6E11 (6E1 lc).

Figura 10 mostra um exemplo da inibição de fosforilação de receptor mediada por H0L0 e HlLO no contexto de uma região de Fc de IgGl de tipo selvagem e uma região Fc de IgGl substituída (IgGlm(AA)).

Em um conjunto diferente de experimentos usando uma metodologia similar, os valores de IC50 para inibição de fosforilação de receptor foram obtidos e confirmam que o anticorpo parental murino 6E11 e humanizado mostra perfis comparáveis para inibição de fosforilação de receptor mediada por IGF-I e IGF-II (Tabela 2).

Tabela 2 - Valores de IC50 para anticorpos selecionados em ensaios de fosforilação estimulada por IGF-I e IGF-II com intervalos de confiança

inferior e superior de 95%

IC50 de estimulação por IGF-I ^g/ml) IC50 de estimulação por IGF-Il ^g/ml) Anticorpo HOLO 0,06069 0,08145 HlLO 0,08359 0,10546 HOLOIgGlm(AA) 0,08485 0,09968 HlLO IgGlm(AA) 0,08263 0,10546 6E11 Parental 0,02445 n/a

Em um conjunto diferente de experimentos usando uma

metodologia similar, os valores de IC50 para inibição de fosforilação de receptor foram obtidos e confirmam que anticorpo humanizado HOLO e o anticorpo parental murino 6E11 mostram atividade comparável. Em paralelo, a atividade dos anticorpos contra o receptor de insulina foi testada usando uma linhagem de célula 3T3 engenhada para expressar o receptor de insulina de humano. Neste experimento, nenhuns dos anticorpos mostraram inibição de fosforilação de receptor induzida por insulina.

Tabela 2a Valores de IC50 para anticorpos selecionados em ensaios de IGF- IR e IR DELFIA. Cada valor representa a média de dois pontos de dados. O

anticorpo de controle negativo é uma IgGl híbrida.

IGF-IR DELFIA - IC50 (nM) IR DELFIA - IC50 (nM) Anticorpo Placa A Placa B Placa A Placa B H0L0 0,25 0,19 >133nM >133nM 6E11 0,18 0,16 >133nM >133nM Controle Negativo >133nM >133nM >133nM >133nM

Exemplo 14 - ELISA de competição

Placas de ELISA foram revestidas com um anticorpo antagonístico anti-IGF-lR de humano (MAB391, R&D Systems) a 2μg/ml e bloqueadas com 4%BSA/PBS. IGF-IR recombinante de humano etiquetado com Poli-His (R&D Systems #3 05-GR) foi adicionado a 400ng/ml na presença de anticorpos monoclonais purificados e incubado por 1 hora na temperatura ambiente. A placa foi lavada em TBST (TBS+Tween 20 0,1%) antes da adição de anticorpo anti-poli-his marcado com HRP (Sigma A7058- 1VC) a 12-30μg/ml. A placa foi incubada por 1 hora antes de lavagem adicional e revelada com substrato OPD (Sigma P9187). A reação foi interrompida pela adição de Ácido Sulfurico 2M e a absorbância foi medida a 490nm.

Figura IlA mostra um exemplo da atividade de vários anticorpos monoclonais murinos purificados no ELISA de competição. Dados dispostos para experimentos realizados ao mesmo tempo.

Figura IlB mostra um exemplo da atividade de HlLO no ELISA de competição em comparação com o 6E11 quimera (6Ellc). Dados dispostos para experimentos realizados ao mesmo tempo.

Figura 12A mostra um exemplo da atividade de vários anticorpos humanizados purificados no ELISA de competição em comparação com o anticorpo murino parental (6E11) e o anticorpo quimera (6Ellc). Em figura 12A, HOLO e HOLO IgGlm(AA) mostraram um sinal aumentado comparado com os ensaios de repetição mostrados em Figuras 12B e 12C.

Figura 12B-C mostra exemplos da atividade de vários anticorpos humanizados purificados no ELISA de competição. Exemplo 15 - ELISA de ligação de IGF-IR de macaco cinomolgo

Placas de ELISA de 96 cavidades foram revestidas durante a noite com IGF-IR recombinante de macaco cinomolgo (veja Exemplo 4) a 1- 2μg/ml e bloqueadas com 4%BSA/PBS. Anticorpos anti-hlGF-lR purificados foram adicionados e incubados por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram lavadas em TBST e Ig anti-camundongo conjugada com HRP (DAKO #P0260) foi adicionada em cada cavidade a 0,6-1,0 μg/ml. Placas foram incubadas por 1 hora na temperatura ambiente, lavadas com TBST e reveladas com substrato OPD (Sigma P9187) ou substrato TMB (Sigma T8665). A reação foi interrompida com Ácido Sulfurico 2M e o nível de ligação foi determinado por medição da absorbância a 490nm (para OPD) e 450nm (para TMB). Para anticorpos contendo uma região constante IgGl/Ck de humano, o anticorpo de detecção anti-Ig de camundongo conjugado com HRP foi substituído por anticorpo de cabra anti-cadeias leves Kappa de humano conjugado com peroxidase (Sigma, A7164).

Figura 13A mostra um exemplo de anticorpos monoclonais murinos purificados ligando em IGF-IR recombinante de macaco cinomolgo. Dados dispostos para experimentos realizados ao mesmo tempo.

Figura 13B mostra um exemplo de anticorpos monoclonais humanizados purificados ligando em IGF-IR recombinante de macaco cinomolgo em comparação com a quimera 6E11 (6E1 lc). Exemplo 16 - ELISA de ligação de receptor de insulina

Placas de ELISA de 96 cavidades foram revestidas durante a noite com Receptor de Insulina Recombinante de humano (R&D Systems 1544-IR) a O^g/ml e bloqueadas com 4%BSA/PBS. Anticorpos anti-hlGF- IR purificados ou anticorpo de camundongo anti-Receptor de Insulina de humano (R&D Systems MAB15441) foram adicionados nas placas e incubados por 1 hora na temperatura ambiente antes de lavagem com TBST. Anticorpo anti- Ig de camundongo conjugado com HRP (DAKO #P0260) foi adicionada em cada cavidade a 1/500 ou 1/2000 em 4%BSA/PBS e as placas foram incubadas por 1 hora. Placas foram lavadas e reveladas pela adição de substrato TMB (Sigma T8665) ou OPD (Sigma P9187). A reação foi interrompida com Ácido Sulfúrico 2M e a ligação foi detectada por medição de absorbância a 450nm ou 490nm. Para a detecção de anticorpos contendo uma região constante IgGl/Ck de humano, o anticorpo de detecção listado acima (anti-Ig de camundongo conjugado com HRP) foi substituído por anticorpo de cabra anti-cadeias leves Kappa de humano conjugado com peroxidase (Sigma, A7164).

Figura 14 mostra um exemplo de ELISA de ligação de receptor de insulina usando anticorpos monoclonais murinos purificados. Em contraste com o anticorpo de controle positivo (R&D Systems MAB15441), anticorpos purificados 6E11, 5G4 e 15D9 não mostraram ligação no receptor de insulina em concentrações de até ^g/ml. Dados dispostos para experimentos.

Em um experimento diferente, o perfil de ligação de receptor de insulina de vários anticorpos humanizados foi testado usando uma metodologia similar. Embora um anticorpo de controle positivo (R&D systems AF1544) mostrasse ligação boa, não houve ligação detectável dos anticorpos humanizados em receptor de insulina recombinante em concentrações de até 50μg/ml (Figura 15). Exemplo 17 - Determinação de cinética de ligação

A cinética de ligação de anticorpos anti-IGF-lR para IGF-IR de humano foi avaliada usando o sistema Biacore™. A análise de cinética foi realizada usando um método de captura de anticorpo. Resumidamente, um anticorpo anti-IgG de camundongo Biacore, número em catálogo BR-1005- 14) foi usado para análise de anticorpos parentais de camundongo e Proteína A, para anticorpos humanizados. Qualquer um de o anticorpo anti- camundongo ou a Proteína A foi imobilizado em um chip CM5 Biosensor por copulação de amina primária de acordo com os protocolos padrão de Biacore™, utilizando o dispositivo Wizard de imobilização, inerente no programa de computador da máquina, (níveis de 3000-4000 unidades de ressonância (RLPs) foram tipicamente imobilizados). Anticorpos anti-IGF-lR foram então capturados quer diretamente de sobrenadantes de hibridoma quer de material purificado. Os níveis de captura para sobrenadantes dependendo da concentração inicial do hibridoma e estas variaram entre 20RU's e 650RU's. Para o material purificado, o nível capturado para os anticorpos testados estiveram geralmente entre 20 e 600RU's. Após captura, a linha base foi permitida estabilizar antes que IGF-IR recombinante, material etiquetado com histidina de R&D Systems (número em catálogo 305-GR) fosse então passado sobre a superfície em concentrações definidas (costumeiramente dentro da faixa de 0-256nM). Devido à afinidade alta de interação, tempos de dissociação de até uma hora foram usados. Regeneração foi por eluição com ácido usando quer ácido fosfórico IOOmM quer Glicina IOmM, pH 1,5, a regeneração não afetou significativamente a capacidade da superfície em capturar o anticorpo para outra etapa de análise. As corridas foram realizadas ambos a 25 0C e 37°C. Os experimentos foram realizados em sistema TlOO Biacore™, usando o controle T100 e programa de computador de análise. Os dados experimentais foram ajustados para o modelo 1:1 de ligação inerente em programa de computador de análise da máquina.

Tabelas 3-7 mostram uma série de experimentos conduzidos com material sobrenadante e purificado.

Tabela 3 - Dados cinéticos para uma seleção de monoclonais de IGF-IR murinos purificados a 25°C e 37°C

Anticorpo Afinidade(nM) 25 0C (Corrida 1-T0011 R6) Afmidade(nM) 37°C (Corrida 2-T0011 R4) Afmidade(nM) 250C (Corrida 3-T0022 R5) 6E11 0,09 5G4 3,0 15D9 0,233 0,164 5,9 0,558 0,14 Não testado Não testado Tabela 4 - Dados cinéticos para material sobrenadante de um HlLO e H0L0 em comparação com 6E11 c. A corrida (T0037 R3) foi realizada a 37°C. Anticorpos Ka Kd KD(nM) H1L0 7,56e4 6E11 c Sobrenadante 8,14e4 6E1 Ic Purificado 8,52e4 3,52e-5 3,13e-5 3,32e-5 0,47 0,38 0,39

Tabela 5 - Dados cinéticos para material sobrenadante H0L0 e HOLO IgGl m(AA) e HlLO e H10L0 IgGlm(AA) em comparação com 6E1 lc. A corrida (T0040 R2) foi realizada a 37°C.

Corrida 1

Anticorpos Ka Kd KD(nM) HlLO (sobrenadante) 7,56e4 3,52e-5 0,47 6E1 Ic (sobrenadante) 8,14e4 3,13e-5 0,38 6E1 Ic (purificado) 8,52e4 3,32e-5 0,39

Corrida 2 Anticorpos Ka Kd KD (nM)

H1LO (sobrenadante) 6,82e4 4,28e-5 0^63

6E1 Ic (purificado) 7,59e4_3,25e-5_0^43_

(sobrenadantes HlLO são os mesmos para corridas 1 e 2, contudo os 6E1 Ic purificados são bateladas diferentes)

Tabela 6 - Dados cinéticos para HOLO e HlLO purificado em comparação com

a quimera 6E11 (6E1 lc). A corrida (T0041 RI) foi realizada a 37°C._

Anticorpos Ka Kd KD(nM)

HOLO 6,24e4 3,93e-5 0^3

HlLO 6,54e4 2,95e-5 0,45

6Ellc_6,60e4_2,45e-5_0,37_

Tabela 7 - Dados cinéticos para H0L0 e H0L0 IgGlm(AA) e HlLO e H10L0

IgGlm(AA) purificado em comparação com a quimera 6E11 (6Ellc). Três

corridas independentes foram realizadas a 37°C.

Corrida 1 - T0044 R3 Corrida 2 - T0044 R4 Corrida 3 - T0044 R6

Anticorpo KD KD „ , KD

Ka Kd Ka Kd /" Ka í Λ yf\

___(nM)_(nM)_(nM)

H0L0 5,13e4 2,68e-5 0,52 6,62e4 3,97e-5 0,59 6,17e4 5,56e-5 0,90 HOLOIgGlm(AA) 5,40e4 2,67e-5 0,49 7,68e4 4,00e-5 0,52 7,38e4 5,71e-5 0,77 hiLO 4,97e4 2,09e-5 0,42 6,67e4 3,47e-5 0,52 7,04e4 4,18e-5 0,59 HlLOIgGlm(AA) 5,07e4 2,17e-5 0,43 6,61e4 3,22e-5 0,49 6,48e4 4,44e-5 0,69 6Ellc_3,99e4 8,71e-6 0,22 6,78e4 2,29e-5 0,34 6,75e4 4,02e-5 0,60

Em um experimento diferente a seguinte abordagem foi usada. Proteína A foi imobilizada sobre uma superfície CM5 por copulação de amina primária de acordo com os protocolos padrão de fabricantes. Anticorpos contra IGF-IR foram capturados sobre esta superfície e após um período de estabilização IGF-IR recombinante de humano ou cinomolgo foi injetado sobre esta superfície capturada. Geralmente, as concentrações de IGF-IR usadas foram 256-16nM, com uma injeção de OnM (apenas tampão) também usada para referência dupla de acordo com a melhor prática para análise cinética Biacore. Dados foram analisados usando o modelo 1:1 inerente à máquina Biacore, o trabalho foi realizado em T100 usando tampão de corrida HBS-EP a 37°C. Os resultados confirmam que as variantes humanizadas H0L0 e H0L0 IgGlm(AA) mostram afinidade de ligação alta (-300-600pM) em IGF-IR recombinante de humano e de macaco cinomolgo e cinética comparável com a quimera 6E11. Tabela 8 Cinética de anticorpos anti-IGF-lR versus IGF-IR recombinante de humano e IGF-IR de macaco cinomolgo a 37°C. Dados mostrados são de um único experimento.

IGF-1R de humano ka Kd KD(nM) IGF-IR de macaco cinomolgo ka Kd KD CnM) 6E11 quimera HOLO HOLO IgGlm(AA) l,22e5 l,07e5 l,14e5 2,61e-5 2,73e-5 3,20e-5 0,21 0,25 0,28 1,10e5 9,18e4 l,07e5 2,14e-5 2,56e-5 2,73e-5 0,19 0,28 0,25

Tem sido realizado um experimento que confirma que HOLO,

HOLO IgGlm(AA) e 6E11 quimera mostram cinéticas comparáveis de ligação. Contudo a afinidade total foi menor do que a vista em todos os experimentos prévios (a 1,88, 1,84 e l,52nM respectivamente). Os motivos para a diferença evidente são desconhecidos.

Exemplo 18 - Inibição de ligação de ligante determinada usando Biacore

O experimento foi realizado usando duas densidades diferentes de IGF-I biotinilado capturado. Resumidamente qualquer 200 ou 4000 RU's foi estavelmente capturado em um chip sensor de estreptavidina. Para testar a capacidade de neutralização de anticorpos anti-IGF-lR, concentrações diferentes de anticorpos foram pré-misturadas com uma concentração fixa de IGF-IR recombinante. Como um controle IGF-I não biotinilado também foi misturado com a mesma concentração de IGF-IR. Esta mistura foi então passada sobre a superfície de IGF-I e o ponto de associação máxima foi medido. Esta leitura foi então comparada com uma amostra com a mesma concentração de IGF-IR etiquetado com his na ausência de anticorpos anti-IGF-lR. A presença de um anticorpo neutralizador bloqueou a ligação de IGF-IR em IGF-I e reduziu a associação máxima observada. Inibição percentual foi calculada por comparação dos valores. Regeneração foi realizada usando dois pulsos de cloreto de magnésio 4M. Os experimentos foram realizados em um sistema Biacore 3000.

Tabelas 9 e 10 abaixo mostram a inibição percentual obtida e também detalhe das concentrações de anticorpos, IGF-I e IGF-IR usados para obter estes resultados.

Tabela 9 - Valores de inibição para a superfície 200 RU's IGF-I Complexo de Anticorpo + IGF-IR Inibição %

IGFl (125nM) + His IGF-IR (25nM) 69

IGFl (5OOnM) + His IGF-IR (25nM) 89

6E11 (125nM) + His IGF-IR (25nM) 48

6E11 (5OOnM) + His IGF-IR (25nM) 50

Tabela 10 - Valores de inibição para a Superfície 4000 RU's IGF-I

Complexo de Anticorpo + IGF-IR Inibição % IGFl (5μΜ) + His IGF-IR (50nM) 93 IGFl (500nM) + His IGF-IR (50nM) 86 6E11 (500nM) + His IGF-IR (50nM) 48

Em um experimento diferente, a capacidade dos anticorpos humanizados em diretamente bloquear ligação de ligante foi avaliada usando uma metodologia baseada em Biacore usando ligante biotinilado capturado (IGF-I, IGF-2). IGF-I ou IGF-2 biotinilado foi imobilizado sobre chip biossensor de estrepavidina para cerca de 3 OORUs e 3 5ORUs respectivamente. IGF-IR foi passado sobre a superfície a 5 OnM sozinho ou a 5 OnM em uma solução pré-misturada contendo quer 250nM de anticorpos anti-IGF-lR (para os experimentos de IGF-I) quer 500nM de anticorpos anti-IGF-lR (para o experimento de IGF-2). Ligação de IGF-IR também foi realizada na presença dos ligantes naturais IGF-I e IGF-2 (ambos não-biotinilados). A superfície foi regenerada usando ácido fosfórico IOOmM. Os experimentos foram realizados usando tampão HBS-EP a 25°C no Biacore 3000. Nota: a análise dos dados de ensaio de IGF-2 foi complicada pelo fato de que alguns dos anticorpos mostraram ligação não-específica na superfície de IGF-2 sozinha. Para IGF-I imobilizado, o inibidor mais eficiente da ligação de receptor foi IGF-I não- marcado, com IGF-2 e H0L0 mostrando inibição de cerca de 60% (Tabela ll).Para IGF-2 imobilizado, o inibidor mais eficiente da ligação de receptor foi IGF-I ou IGF-2 não-marcado. Neste ensaio, os anticorpos neutralizadores, incluindo H0L0 mostraram inibição parcial de ligação de IGF-2 (Tabela 11). Tabela 11 - Neutralização da ligação de receptor em ligante Amostra Neutralização % de ligação de receptor em IGF-I Neutralização % de ligação de receptor em IGF-2 HOLO 60 37 HOLO IgGlm(AA) 58 17 6E11 Quimera 44 20 IGF-I 87 98 IGF-2 68 92 Exemplo 19 - Análise de separação de célula ativada por fluorescência

(FACS)

Células Colo205 (2x107 células/ml) foram coradas com anticorpos purificados anti MGF-IR a 10μ§/πι1 por 1 hora em tampão FACS (FCS 4% em PBS). Células também foram coradas em um anticorpo de controle de camundongo negativo adequado (Sigma #15154). Células foram lavadas em tampão FACS e então coradas com um anticorpo secundário anti- IgG de camundongo -PE 1:100 (Sigma P8547). Após lavage m em tampão FACS e fixação em Cell Fix (Becton Dickinson) as células foram analisadas por Citometria de fluxo.

Figura 16 demonstra que o anticorpo 6E11 é capaz de reconhecer IGF-IR nativamente expressado sobre a superfície de uma linhagem de célula de tumor de humano.

Em um experimento diferente, os anticorpos humanizados foram testados para sua capacidade para corar várias linhagens de célula de humano que conhecidamente sobre-expressam IGF-IR. Células de carcinoma de pulmão NCI-H838 foram coradas com os anticorpos selecionados a 100μg/ml por 45mins a 4°C. Ligação foi detectada com anticorpo anti-IgG de humano conjugado com PE (Sigma P8047). Amostras foram analisadas por Citometria de fluxo usando um Becton Dickinson FACscan Citometer. Os resultados mostrados em Figura 17 confirmam que as variantes humanizadas podem ligar em NCI-H838. Um resultado similar tem sido obtido para células de carcinoma de mama MCF7 e células de carcinoma de pulmão A549 (Figura 18).

Exemplo 20 - Imuno-histoquímica em seções de tecido congelado Tecidos foram seccionados em lâminas de vidro, fixados com acetona por 2 minutos e então carregados para dentro de um corador de lâmina automático (DakoCitomation S3400). Lâminas foram bloqueadas e coradas com anticorpos murinos (anticorpo primário) e um anticorpo secundário anti-Ig de camundongo - HRP (DakoCitomation Envision Kit) usando métodos de coloração imunoquímica padrão. Após esta incubação secundária, as lâminas foram lavadas e reveladas usando a solução DakoCitomation Envision DAB, enxaguadas e cobertas com lamínula para visualização. Um anticorpo de controle irrelevante (IgGl de camundongo purificado de um hibridoma M0PC21) foi usado como um controle negativo.

Os anticorpos quimérico e humanizado foram analisados em uma maneira similar exceto que estes anticorpos foram biotinilados para facilitar detecção. Contudo, foi verificado que a presença da etiqueta de biotina diminui a atividade destes anticorpos determinada por ELISA (dados não mostrados), portanto a concentração de anticorpo primário usada foi aumentada para até 10(^g/ml. O anticorpo secundário listado acima (DakoCitomation Envision Kit - Anti-Ig de camundongo conjugado com HRP) foi substituído por estreptavidina-HRP, (DakoCitomation Cat# 1016). Um anticorpo irrelevante alternativo também foi biotinilado e usado como um controle negativo (Sigma #15154).

As amostras foram analisadas como segue. Após calibração do instrumento usando o suporte de calibração (#69935000, 05041103097), as lâminas foram carregadas no sistema de imagem celular automático ChromaVison e escaneadas a 10X. Análise de dados foi realizada para calcular a coloração de tecido % (definida como marrom/marrom+azul*100).

Figura 19 e 20 mostram que 6E11 colore amostras de tecido de tumor de humano. Um anticorpo de controle positivo foi incluído como uma referência (Abeam, #4065).

Figura 21 mostra que quimera 6E11 (6E1 lc) e HlLO colorem amostras de tecido de tumor de humano.

Em um experimento separado, HOLO humanizado foi testado para sua capacidade para reconhecer IGF-IR de humano em amostras de tecido de tumor de humano usando um microarranjo de tecido congelado obtido de Citomyxx (arranjo ID: MB-1002). Este arranjo contém cores de tumor de pulmão, 10 cores de tumor de mama, 10 cores de tumor de cólon e 10 cores de tumor de próstata. H0L0 foi biotinilado para facilitar detecção. Uma lâmina de microarranjo congelado (Citomyxx MB-1002) foi fixada com uma solução a 4°C de acetona/etanol (50:50), por 5 minutos, lavada e então tratada com peróxido de hidrogênio 3% por 5 minutos para remover alguma peroxidase endógena. As lâminas foram coradas com H0L0 biotinilado anti-IGF-lR a 7,(^g/ml por 1 hora na temperatura ambiente. Após lavagem, uma estreptavidina peroxidase foi aplicada por 20 minutos e visualizada com DAB (diamino-benzidina) por 2 minutos. Finalmente, as seções foram lavadas e contra-coradas em hematoxilina de Mayer, enxaguadas em água de torneira, desidratadas, clareadas e montadas. As amostras de tumor são as seguintes: Pulmão (Painel Direito: tumor de célula escamosa, Painel Esquerdo: Adenocarcinoma; Mama (Painel Direito: Adenocarcinoma, epitélio dutal, Painel Esquerdo: Adenocarcinoma, invasivo); Cólon (Painel Direito: Adenocarcinoma bem diferenciado, Painel Esquerdo: Adenocarcinoma bem diferenciado; Próstata (Painel Direito: Adenocarcinoma, Painel Esquerdo: Adenocarcinoma). Os resultados confirmam que H0L0 mostrou coloração moderada/forte das seções viáveis como resumido em Tabela 12 abaixo. Imagens representativas de alta capacidade de aumento (200x) dos tumores de pulmão, mama, cólon e próstata são mostradas em Figura 22, confirmando que o anticorpo H0L0 biotinilado predominantemente cora células epiteliais.

Tabela 12- Sumário de análise de imuno-histoquímica de microarranjo de tecido de tumor

Tipo de tumor Coloração positiva (moderada/forte) Sem coloração Amostra perdida Pulmão 4 3 3 Mama 7 3 0 Cólon 6 3 1 Próstata 6 0 4

Exemplo 21 - Inibicão de sinalização de AKT

Placas Costar de 96 cavidades (#3598) foram revestidas com 50 μΐ de Gelatina 2% em PBS e incubadas em uma incubadora a 37°C por pelo menos uma hora. Antes do uso, as placas foram enxaguadas uma vez com PBS. Pré-adipócitos de humano foram tripsinizados, centrifugados e o meio foi sifonado. As células foram ressuspensas com 10 mL de meio de crescimento de Pré-Adipócito aquecido (ZenBio, #PM-1). Densidade de células foi ajustada para 150.000 células por mL de Meio de crescimento de Pré-Adipócito (ZenBio). Dois frascos T225 Costar contendo 50ml de meio foram cada um semeados com 1 milhão de células. As células restantes foram usadas para semear as placas de 96 cavidades revestidas com Gelatina (ΙΟΟμΙ = 15.000 células por cavidade) usando um Multidrop384 ou instrumento similar. As células foram incubadas durante a noite a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2, umidade de 90%. No dia seguinte, o meio foi removido, 200 μΐ de meio de Indução foram adicionados e as placas foram cobertas com filme permeável a gás Breath-Easy (Sigma#Z380059). As placas foram incubadas por 6 dias a 37°C, em uma atmosfera de 5% de CO2, umidade de 90%. Após 6 dias, o meio foi aspirado e 200 μΐ de Meio de Diferenciação foram adicionados, as placas foram cobertas com filme permeável a gás Breath-Easy e incubadas por 7 dias a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2, umidade de 90%. Após a diferenciação das células, o meio foi aspirado e as células enxaguadas mais uma vez com 200 μΐ de PBS. 75 μΐ de Meio Adipocyte Starve foram adicionados e as placas foram cobertas durante a noite a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2, umidade de 90%. Amostras de teste foram diluídas em Meio Adipocyte Starve a 4X a concentração final. 25 μΐ de composto de teste diluído foram adicionados em cada cavidade e incubados a 37°C por 1 hora. Ligante IGF-I (R&D Systems, #291-G1) foi diluído para 30 nM em Meio Adipocyte Starve e 20μΣ de IGF-I 30nM foram adicionados em cada cavidade (concentração final de 5 nM). As placas foram incubadas a 37°C por precisamente 5 min após os quais o sobrenadante foi removido por remoção rápida do meio para dentro de uma pia. As placas foram secas sobre toalhas de papel.

65 μΐ de tampão de Lise Completo (tampão de Lise MSD contendo inibidores de fosfatase e protease) foram adicionados em cada cavidade e a placa foi vedada com um vedador de placa aquecido. As placas foram quer armazenadas a -80°C (para análise posterior) ou deixadas sobre um agitador (aprox. 500 rpm) por 15 min na temperatura ambiente antes do ensaio MSD.

Níveis de AKT fosforilado (pSer473) foram avaliados usando o kit de ensaio de fosforilação MSD (#K111CAD). Resumidamente, 150 μΐ por cavidade de solução de Bloqueio (MSD Blocker A dissolvido em Tampão de Lavagem MSD Tris) foram adicionados em cada cavidade de uma placa de Ensaio MSD. A placa foi vedada e posta sobre um agitador a 300 rpm usando um agitador de placa de topo de bancada por 1 hora na temperatura ambiente. A solução de Bloqueador foi removida da(s) placa(s) MSD e as placas foram lavadas quatro vezes com 200 μΐ/cavidade de Ix Tampão de lavagem MSD Tris. 50μl/cavidade de lisado de células da(s) placa(s) de células foram transferidos para a cavidade correspondente da(s) placa(s) MSD e vedados. As placas foram agitadas a 300 rpm usando um agitador de placa de topo de bancada por 1 hora na temperatura ambiente. As placas MSD foram lavadas quatro vezes com 200 μΐ por cavidade usando Ix tampão de lavagem MSD (ELx405).

μΐ de mistura de anticorpo de detecção diluída (concentração final de 10 nM) foram adicionados em cada cavidade da(s) placa(s) MSD. As placas foram agitadas a 300 φιη usando um agitador de placa de topo de bancada por 1 hora na temperatura ambiente e então lavadas quatro vezes com 200 μΐ por cavidade usando Ix tampão de lavagem MSD Tris (ELx405). 150 mL de Read Buffer T com tensoativo foram adicionados em cada cavidade e as placas foram lidas com leitora MSD 6000 SECTOR. Embora a intensidade de sinal diminuísse com o tempo em Read Buffer, a janela de sinal tipicamente permaneceu estável por aproximadamente 20-30 minutos.

A Tabela 13 mostra um sumário dos dados de três placas independentes e indica que Mabs parental murino, quimérico e humanizado purificados inibem indução mediada por IGF-I de fosforilação de AKT. Placas 1 e 2 foram corridas em paralelo. Placa 3 foi corrida em um dia separado. Os valores são representados como pIC50 (= -IogIO(IC50) em g/ml) Tabela 13 - Atividade de vários anticorpos purificados no ensaio de fosforilação de AKT

Anticorpo Placa 1 Placa 2 Placa 3 6E11 parental 7,75 7,79 7,67 H0L0 7,65 7,76 7,34 HlLO 7,62 7,68 7,30 6E1 Ic 7,59 7,32 7,34 Controle negativo 6,05 6,25 <5,82

Em dois experimentos diferentes, vários anticorpos

humanizados foram testados para inibição de fosforilação de AKT em resposta à estimulação de IGF-I ou insulina. Para resultados de IGF-I mostrados em Tabela 14, os valores são representados como pIC50 médios onde pIC50 = -IoglO(IC50) em g/ml. Vmax = é a inibição máxima expressada como uma percentagem do sinal na ausência de ligante. Experimento 1 é a média de 4 corridas. Experimento 2 é a média de 3 corridas. Experimentos 1 e 2 foram corridos aproximadamente 6 meses separadamente. Para alguns anticorpos (**H0L0), bateladas diferentes de material foram testadas em paralelo. Em comparação com o anticorpo de controle negativo. Todos os anticorpos anti-IGF-lR mostraram uma inibição dependente de dose da fosforilação de AKT com o anticorpo humanizado HOLO mostrando atividade comparável a do anticorpo parental de camundongo 6E11 ou do anticorpo quimérico 6E11 (Tabela 14).

Tabela 14 - Atividade de vários anticorpos purificados no ensaio de

fosforilação de AKT.

Anticorpo Experimento 1 Experimento 2 Média pIC50 Média Vmax Média pIC50 Média Vmax (g/ml) +/- DP (g/ml) +/- DP (g/ml) +/- DP (g/ml) +/- DP 6E11 ND ND 7,58 (0,17) 113 (2,6) parental H0L0** 7,33 (0,11) 107(9,5) 7,42(0,14)** 106( 3,6) 100 HlLO 7,53(0,15)** (7,9) 7,24 (0,14) 116(11,0) ND ND IgGlm(AA) 6E11 7,34 (0,08) 114(14,1) ND ND quimera IR3 7,17(0,15) 105 (7,0) 7,45 (0,07) 108(10,6) Controle 7,17(0,30) 57,2 (9,4) 7,30 (0,89) 52(1,2) negativo Visto que o sistema de ensaio também foi sensível à

fosforilação de AKT mediada por insulina (via o receptor de insulina), o efeito dos anticorpos humanizados sobre a sinalização de insulina foi avaliado em paralelo aos experimentos de IGF-I descritos acima. Em contraste aos

resultados com estimulação por IGF-I, os anticorpos humanizados não mostraram inibição de sinalização de receptor de insulina sobre e acima dos efeitos não específicos observados com os anticorpos de controle negativo (dados não mostrados). Estes resultados são observados em dois experimentos independentes (sete corridas no total). Exemplo 22 - Ensaio de proliferação com células MCF7

Células MCF-7 (ATCC HBT-22) foram semeadas em placas de 96 cavidades em uma densidade de 10000 células/cavidade e crescidas por 2 dias em meio completo (MEM+sais Earles + 10% FCS + 0,lmg/ml de insulina bovina (Sigma 10516)). Células foram lavadas e incubadas em MEM livre de soro (sem soro, sem insulina) por 4 horas. Meio foi removido e reposto com uma faixa de concentrações de anticorpos purificados (0,014 - lí^g/ml) diluídas em meio livre de soro (ΙΟΟμΙ/cavidade). As células foram incubadas por 1 hora antes da adição ulterior de IGF-I (R&D Systems #291- Gl) para uma concentração final de 50ng/ml. Todos os tratamentos foram realizados três vezes. As células foram incubadas por 5 dias a 37°C, 5% CO2. Após incubação, 15μ1 de solução de corante MTT (Promega #G402A) foram adicionados em cada cavidade e as placas foram incubadas por mais 4 horas. ΙΟΟμΙ de solução Interrupção/Solubilização (Promega #G401 A) foram adicionados em cada cavidade e a placa foi agitada suavemente durante a noite na temperatura ambiente. No dia seguinte o nível de proliferação foi determinado por medição da absorbância a 570nm usando uma leitora de placa.

Figura 23 mostra a atividade de vários anticorpos monoclonais de camundongo purificados para inibir a proliferação de células de tumor. Dados dispostos para experimentos. Exemplo 23 - Ensaio de proliferação - células LISN

Células LISN (3T3 hlGF-lR) foram semeadas em placas brancas de 96 cavidades (Corning 3610) em uma densidade de 10.000 células/cavidade e crescidas por 1 dia em meio completo (modificação de DMEM-Hepes + 10% FCS). O meio foi removido e as células foram incubadas em DMEM livre de soro por 4 horas. Meio foi removido e reposto com uma faixa de concentrações (0,0041 -3μ&ιη\ de concentração final) de anticorpos purificados diluídos em meio livre de soro (50μl/cavidade). As células foram incubadas por 1 hora antes da adição ulterior de 50μl/cavidade de IGF-I (R&D Systems 291-Gl ou IGF-I - veja Exemplos 5 e 6) para uma concentração final de 50-60ng/ml. Todos os tratamentos foram realizados três vezes. As células foram incubadas por 0-3 dias a 37°C, 5% CO2. Após incubação, ΙΟΟμΙ de reagente recém-preparado Promega CellTitre-Glo (Promega G7571) foram adicionados em cada cavidade e as placas foram agitadas por 2 min. A placa foi adicionalmente incubada na temperatura ambiente por 10 min para permitir estabilização de sinal antes da medição do sinal de luminescência com uma leitora de placa Wallac Victor.

Figura 24 e 25 A-E mostram a atividade de anticorpo monoclonal murino purificado 6E11, 6Ellc HOLO e HOLO IgGlm(AA) e HlLO e HlLO IgGlm(AA). Os dados confirmam que os H0L0 e HlLO podem inibir proliferação de célula de tumor in vitro. Dados dispostos para experimentos

Exemplo 24 - Inibição de ciclo celular

Células NCI-H838 (ATCC CRL-5844) foram semeadas para dentro de microplacas de 24 cavidades em uma densidade de 2X105 células/cavidade e crescidas durante a noite em 1 ml de RPMI completo (RPMI+10%FCS). No dia seguinte as células foram lavadas com SFM (meio RPMI livre de soro) e incubadas em 1 mL de mesmo meio por 4 horas. O meio foi aspirado das células e 500 μΐ de SFM contendo 20μg/ml de anticorpos purificados foram adicionados (concentração final l(^g/ml). As células foram incubadas por 1 hora. Em algumas cavidades, IGF-I (R&D Systems 291-Gl) em SFM foi adicionado para uma concentração final de 50ng/ml. As células tratadas foram incubadas durante a noite. No dia seguinte as células foram lavadas suavemente em PBS e então colhidas pela adição de 200 μΐ de solução Versene (Invitrogen #15040). As suspensões de célula foram transferidas para uma placa de fundo-V de 96 cavidades. Após pelotização das células por centrifugação elas foram fixadas pela adição de Etanol 80% gelado e incubação sobre gelo por 30min. As células foram pelotizadas e ressuspensas em 200 μΐ de Iodeto de Propídio 5(^g/ml, EDTA 0,1 mM, Triton X-IOO 0,1%, RNAse A 0,05mg/ml. As células foram incubadas sobre gelo no escuro até serem analisadas por Citometria de fluxo.

Figura 26. mostra o estado do ciclo celular de vários grupos de tratamento na presença de IGF-I, as células são induzidas para passar por um ciclo. Na presença de anticorpo 6E11, o ciclo celular foi inibido em níveis comparáveis com aquele de células incubadas na ausência de IGF-I. Exemplo 25 - Proteção contra apoptose

Uma microplaca de 96 cavidades foi semeada com células NCI-H838 (ATCC CRL-5844) em uma densidade de 10.000 células/cavidade em 100μ1 de meio RPMI completo e crescidas por 2 dias. As células foram então lavadas em SFM (RPMI sem soro) e incubadas em 100μ1 de SFM por 4-5 horas. O meio foi removido antes do tratamento com quer nenhum anticorpo, um anticorpo de controle negativo, quer um anticorpo purificado (6E11) anti-hlGF-lR a 20μ^ηι1. As células foram adicionalmente tratadas com quer SFM sozinho, SFM + IGF-I a 20ng/ml, SFM + Camptotecina a 5μΜ quer SFM + Camptotecina a 5μΜ + IGF-I a 20ng/ml. Todos os tratamentos foram testados três vezes em um volume final de ΙΟΟμΙ. A placa foi então incubada por 20 horas. O meio foi aspirado das cavidades e as células foram lisadas pela adição de 200 μΐ de NP-40 0,5% em PBS seguido por incubação de 5 min com agitação na temperatura ambiente. 20μ1 de lisado foram transferidos para uma microplaca preparada do kit Roche Cell Death ELISA e 80μ1 de tampão de incubação foram adicionados. O protocolo descrito neste inserto de kit (Roche, Número em Catálogo: 1.544.675) foi seguido e a absorbância a 405nm foi medida usando uma leitora de placa.

Figura 27 mostra que a presença de IGF-I concede às células NCI-H838 alguma proteção contra apoptose induzida por camptotecina. A adição de 6E11 reverteu a proteção mediada por IGF-I contra apoptose.

Em um experimento diferente, anticorpos selecionados foram testados para sua capacidade para prevenir salvamento de IGF-I da apoptose induzida por camptotecina em células A549. Células A549 foram plaqueadas a IxlO4, crescidas em placas de 96 cavidades e tratadas com 20 μg/ml de anticorpos selecionados em condições livre de soro por 1 hora. IGF-I a 15ng/ml e Camptotecina a 5μg/ml foram adicionados juntos e as células foram incubadas durante a noite. O nível de apoptose foi medido usando um kit Roche Cell Death Detection ELISA (Roche 11774425001) que estima o nível relativo de fragmentação de DNA. Como mostrado em Figura 28, todos os anticorpos humanizados preveniram o salvamento de IGF-I da apoptose induzida por camptotecina.

Exemplo 26 - Ausência de agonismo na presença ou ausência de anticorpos de ligação cruzada

Microplacas de 96 cavidades foram semeadas com células 3T3/LISN c4 em uma densidade de 10.000 células/cavidade em DMEM completo (modificação de DMEM Hepes + 10%FCS) e crescidas por 2 dias. Anticorpos purificados anti IGF-IR foram titulados sobre as células em DMEM completo, cada diluição sendo testada três vezes. Um anticorpo relatado em ter atividade agonística (#556000, BD Biosciences) e/ou 50ng/ml de IGF-I (incubado por 20-30 min) foram incluídos em alguns experimentos como um controle positivo. Controles negativos de anticorpo irrelevante e meio sozinho foram incluídos. Em outros experimentos, um anticorpo de ligação cruzada anti-camundongo (Sigma M8144) ou um anticorpo de ligação cruzada anti-humano (Sigma 13382) foram incluídos na titulação de anticorpo em uma razão de 2:1 [Ab anti IGF-I]:[Ab de ligação cruzada]. Placas foram incubadas por 30 min. Meio foi aspirado e as células foram lavadas suavemente com PBS uma vez antes de serem lisadas com tampão de Iise RIPA (NaCl 150mM, TrisHCl 50mM, Desoxicolato de Na 6mM, Tween 20 1%) mais coquetel inibidor de protease 1 (Roche 11.697.498.001). A placa foi deixada a -20°C durante a noite. Após descongelamento amostras de 100 μΐ de lisado foram transferidas para uma placa ELISA de 96 cavidades pré- revestida com um anticorpo de captura anti IGF-IR (2B9) a 2μg/ml e bloqueado com 4%BSA/TBS. A placa foi incubada durante a noite a 4°C. A placa foi lavada 4 vezes com TBST (TBS+Tween 20 0,1%) e um anticorpo anti-Fosfotirosina marcado com Európio (DELFIA Eu-Nl PT66, PerkinElmer) diluído 1/2500 em 4%BSA/TBS foi adicionado em cada cavidade. Após incubação de 1 hora a placa foi lavada como antes e 100 μΐ de solução DELFIA Enhancement (PerkinElmer 1244-105) foram adicionados. Após incubação de 10 min o nível de fosforilação de receptor foi determinado usando uma leitora de placa ajustada para medir fluorescência resolvida por tempo (TRF) de Európio.

Figura 29. mostra que 6E11 não teve atividade agonística em concentrações de até ^g/ml na presença de anticorpos de ligação cruzada. Dados dispostos para experimentos.

Em um experimento diferente, o sistema de ensaio de pré- adipócito foi usado para determinar se a série-6El 1 de anticorpos anti-IGF-lR purificados modula os níveis basais de fosfo-AKT que pode indicar propriedades agonísticas. Neste experimento, os pré-adipócitos foram diferenciado e tratados como descrito em exemplo 21. Contudo, a etapa de estimulação foi removida com o propósito de avaliar o nível basal de fosforilação de AKT na presença de anticorpo humanizado. Os resultados mostram que os anticorpos humanizados em concentrações de até 20\i%/m[, não houve aumento em fosforilação de AKY basal (Figura 30).

Em um conjunto paralelo de experimentos usando a linhagem celular de carcinoma de pulmão A549, os níveis basais de fosforilação de AKT foram avaliados na presença de 0-20μg/ml de anticorpo e na ausência de ligante. Duas bateladas diferentes de H0L0, uma amostra de controle negativo e IlCll (um anticorpo que mostra ativação moderada da fosforilação de receptor, veja Figura 31). O eixo-y- mostra níveis de fosforilação de AKT em unidades arbitrárias. Consistente com os dados apresentados em exemplo 21, fosforilação de Akt mediada por IGF-I inibida por H0L0 em uma maneira dependente de dose (com IC50S dentro da faixa de 200-500ng/ml, dados não mostrados). Contudo, parece que concentrações crescentes de anticorpo na ausência de ligante causam um aumento pequeno do nível basal de fosfo-Akt. Contudo, o sinal aparece como um platô e alcança não mais do que 3 vezes os níveis latentes com duas bateladas diferentes de material. O motivo para o aumento pequeno em sinal é desconhecido e estes dados não são confirmados por quaisquer outros dados experimentais.

Em um conjunto paralelo de experimentos usando as células LISN-c4 3T3, os efeitos dos anticorpos humanizados sobre níveis basais de fosforilação de receptor foram avaliados na ausência de estimulação de ligante. Células de LISN foram incubadas na presença de anticorpos selecionados em uma faixa de concentrações (27ng/ml -20\i§Jm\) por 30min. Uma titulação de anticorpo agonísticos conhecidos IlCll e BD556000 (Becton Dickinson) também foram incluídos. Cavidades de controle estimuladas com IGF-2 a lOOng/ml foram incluídas. Fosforilação de IGF-IR foi medida usando o ensaio DELFIA descrito previamente. Em contraste com dois anticorpos de controle positivo, IlCll e BD556000, que induziram um aumento dependente de dose em fosforilação de receptor, os anticorpos humanizados não mostraram aumento nos níveis basais de receptor fosforilado (Figura 32). Visto que ligação cruzada de anticorpo ligado em superfície tem o potencial de induzir sinalização de receptor, o experimento foi repetido na presença de anticorpos de ligação cruzada. Células LISN foram incubadas com uma faixa de concentrações de anticorpos selecionados misturados com anticorpos de ligação cruzada apropriados em uma razão de 2:1 por 30min (Sigma 13382 para os anticorpos humanizados e Sigma M8144 para os anticorpos de camundongo). Fosforilação de IGF-IR foi medida usando o ensaio DELFIA previamente descrito. Os resultados mostram que em contraste com IlCll que aumentou os níveis de receptor fosforilado, os anticorpos humanizados não mostraram aumento em níveis basais de receptor fosforilado (Figura 33).

Os efeito da adição de anticorpos humanizados sobre a proliferação de ambas LISN-c4 e NCI-H929 (linhagem de célula de Linfoma Múltiplo de humano) na ausência de ligante também foram testados. Células NCI-H929 foram plaqueadas em uma placa de 96 cavidades a 4x104 células/cavidade em meio livre de soro. Diluições dos anticorpos selecionados foram adicionadas dentro da faixa de 20-0,0\9\ig/m\. Células foram incubadas por 4 dias a 37°C antes de a proliferação ser medida usando um kit de ensaio Promega Cell Titre Blue (Promega G8081). Figura 34 mostra que HOLO não estimula a proliferação de células NCI-H929 em meio livre de soro. Resultados similares foram observados com células LISN-C4 (dados não mostrados).

Exemplo 27 - Modelo de aloenxerto - 3T3/LISN c4

Um modelo de tumor in vivo usando células 3T3/LISN c4 foi usado para estabelecer a capacidade de anticorpo monoclonal murino 6E11 de inibir o crescimento de tumores pré-estabelecidos em camundongos nus atímicos. Tumores foram induzidos por métodos similares àqueles publicados em Cohen et al., Clinicai Câncer Research 11:2063-2073 ((2005). Em resumo, 2,5 xlO6 de células LISN suspensas e 0,lml de Matrigel™ foram subcutaneamente inoculadas em camundongos CDl nu/nu atímicos de 4-6 semanas de idade. Uma vez tendo os tumores alcançado tamanho de aproximadamente 15Omm3, camundongos foram tratados duas vezes por semanas com 250μg de anticorpo em 0,2ml de PBS por injeção intraperitoneal. Tumores foram medidos por compasso de calibre Vernier através de dois diâmetros três vezes por semana e o volume foi calculado usando a fórmula (comprimento χ [largura] 2)/2. Dados foram analisados como segue: Log]0 de volumes de tumor transformados foram analisados usando uma análise de regressão de coeficiente aleatório. Isto estima a intercepção (linha base) e inclinação (taxa de crescimento de tumor) para cada grupo. Comparado com o grupo tratado com PBS, houve uma redução de 31% na taxa de crescimento no grupo de 6E11 (Figura 35, p=0,0007). Em um experimento similar, camundongos nus foram implantados subcutaneamente com 2,5x106 células em Matrigel. Dezoito dias após a implantação, camundongos com volumes de tumor de 100-200 mm3 foram distribuídos aleatoriamente em grupos de 8 animais/grupo de tratamento. Anticorpo 6E11 anti-IGF-lR foi administrado por injeção intraperitoneal em uma dose de 250μg/camundongo e 100μg/camundongo, duas vezes por semana por 3 semanas. Animais de controle receberam solução salina no mesmo horário. Tamanho de tumor e peso de corpo de camundongo foram medidos duas vezes por semana. Comparado com o grupo tratado com solução salina, houve uma redução de 56% e 70% no volume de tumor no dia 35 para os grupos de 100μg/camundongo e 250μg/camundongo respectivamente (Figura 36).

Em um estudo diferente, a atividade de vários anticorpos foi testada em comparação com o grupo de controle negativo de PBS. Camundongos atímicos CDl nu/nu foram, cada um, implantados com 2,5x106 células LISN/3T3-c4 suspensas em Matrigel subcutaneamente e tamanho de tumor foi medido por calibre de compasso e o volume foi calculado pela seguinte equação: Volume de Tumor = comprimento χ (largura)2 χ 0,5 .Tendo os tumores alcançado um volume médio de ~150mm3, os animais foram distribuídos aleatoriamente em grupos com tamanhos de tumor comparáveis e cada animal recebeu 250μg de anticorpo monoclonal apropriado em PBS intraperitonealmente duas vezes por semana durante três semanas. Os grupos de tratamento foram 6E11 (mAb parental de camundongo), duas bateladas diferentes de HOLO IgGm(AA) e H0L0. Tratamento apenas com PBS foi usado como um controle de veículo para estes estudos. Tamanho de grupo para este estudo foi um mínimo de quatorze animais. Dados são apresentados como o volume de tumor médio ± erro padrão versus dias depois de tratamento com anticorpo. Ambos 6E11 e H0L0 mostraram reduções estatisticamente significativas na taxa de crescimento de tumor de 52% (ΡΟ,ΟΟΟΙ) e 60% (Ρ<0,0001) respectivamente (Figura 37). Consistente com um estudo inicial (dados não mostrados), nenhuma batelada de anticorpo H0L0 IgGlm(AA) significativamente alterou a taxa de crescimento de tumor comparado com o grupo de controle de PBS.

Em adição a uma redução em taxa de crescimento de tumor, houve uma melhoria em sobrevivência em tempo-para-separação de camundongos tratados como grupos 6E11 e H0L0 em comparação com o controle de PBS (dados não mostrados). Consistente com os dados de crescimento de tumor, o HOLO IgGm(AA) não mostrou benefício em retardo do tempo-para-separação (dados não mostrados).

Uma repetição deste estudo foi realizada usando anticorpos 6E11 e H0L0 exceto que Matrigel não foi usado. Os resultados deste estudo espelharam aqueles do estudo prévio, com 6E11 e H0L0 mostrando uma redução significativa em taxa de crescimento de tumor de 20% (p=0,0464) e 29,7% (p=0,0037) respectivamente comparado com o controle de PBS. Também houve uma melhoria em sobrevivência em tempo-para-separação de camundongos tratados com grupos 6E11 e H0L0 comparados com o controle de PBS. Um anticorpo irrelevante foi usado como um controle neste experimento e exibiu um perfil similar ao do grupo de PBS (dados não mostrados).

Exemplo 28 - Inibição de crescimento de tumores de célula Colo205 por anticorpo parental de camundongo 6E11

Um modelo de tumor in vivo usando células Colo205 foi usado para estabelecer a capacidade do anticorpo monoclonal 6E11 para inibir o crescimento de tumores pré-estabelecidos em camundongos nu/nu fêmeas HRJLN. Ix IO6 Células Colo205 foram suspensas em Matrigel 50% e subcutaneamente implantadas no flanco dos camundongos nus. Tendo os tumores alcançado tamanho de aproximadamente 80-120mm3 (equivalente a dia 1 em Figura 38), os camundongos foram tratados cada 3 dias com lOmg/kg de anticorpo por injeção intraperitoneal, por um total de 10 injeções. Tumores foram medidos por compassos de calibre e o volume foi calculado usando a fórmula (comprimento χ [largura]2)/2. Dados foram analisados como segue: Log10 de volumes de tumor transformados foram analisados usando uma análise de regressão de coeficiente aleatório. Este estima (linha base) e inclinação (taxa de crescimento de tumor) para cada grupo. Comparado como o controle de veículo (PBS), houve uma redução de 58% na taxa de crescimento no 6E11 (Figura 38, p=0,0019).

Um experimento similar àquele descrito acima foi realizado em uma ocasião separada. Contudo, neste segundo experimento usando células Colo205 não foi observada inibição de crescimento de tumor para os animais tratados com 6E11. Os motivos para a ausência de inibição com 6E11 são desconhecidos (dados não mostrados).

Um experimento similar àquele descrito acima também foi realizado usando camundongos implantados com IxlO7 células A549. Contudo, neste experimento não foi observada inibição do crescimento de tumor para animais tratados com 6E11. Os motivos para a ausência de inibição com 6E11 são desconhecidos (dados não mostrados).

Embora os dados destes dois últimos experimentos pareçam mostrar que os anticorpos da invenção não inibem crescimento de tumor nestes modelos, acredita-se que os primeiros dois modelos de tumor (o modelo de aloenxerto e o primeiro modelo de colo205) são mais robustos. Um anticorpo de controle que deu um sinal positivo (i.e. mostrou inibição de crescimento de tumor) nestes primeiros dois modelos não mostrou inibição no segundo estudo de modelo de tumor Colo205 ou no estudo de modelo de tumor A549, conseqüentemente temos mais confiança de que os dados dos primeiros dois modelos de tumor são mais indicativos de atividade do anticorpo de teste do que aqueles dos segundos dois modelos.

Três estudos de xenoenxerto adicionais têm sido realizados com 6E11 ou humanizado ou suas variantes. No primeiro estudo, a atividade de 6E11 foi comparada com HOLO IgGm(AA) no modelo Colo205. Em contraste com os resultados apresentados em Figura 38, não houve evidência de inibição de crescimento de tumor após tratamento com 6E11 ou HOLO IgGm(AA) comparado com o grupo de controle de PBS. Em um estudo repetido onde os grupos de tratamento foram PBS, 6E11, HOLO, um anticorpo de controle positivo e um anticorpo irrelevante de controle, nenhuns grupos mostraram qualquer evidência de inibição de crescimento de tumor com exceção do controle positivo que mostrou uma redução de 23% na taxa de crescimento de tumor em relação com PBS (p=0,003). Contudo, o anticorpo irrelevante de controle mostrou uma inibição de 15% de crescimento de tumor em comparação com PBS (p=0,053). Nenhuns anticorpos mostraram inibição de crescimento de tumor em relação ao anticorpo irrelevante de controle.

Em um modelo de xenoenxerto diferente (modelo de tumor de mama MCF-7), animais foram tratados como PBS, 6E11, HOLO, um anticorpo de controle positivo e um anticorpo irrelevante de controle. Neste estudo, nenhuns grupos de tratamento foram separados quer de PBS ou quer de anticorpo irrelevante de controle. Em ambos os estudos, tratamento com paclitaxel significativamente inibiu crescimento de tumor (dados não mostrados).

Em uma análise de pós-estudo, amostras de tumor colhidas no final de todos os três foram avaliadas para expressão de receptor por imuno- histoquímica. Não foi observada evidência de expressão de receptor IGF-IR usando uma sonda de HOLO biotinilada enquanto que o mesmo anticorpo marcado positivamente corou uma amostra de tumor LISN/3T3 c4 e amostras de tumor de paciente.

São desconhecidos os motivos para diferença evidente em atividade dos anticorpos entre o estudo Colo205 inicial apresentado em Figura 38, os resultados em-casa do modelo LISN (estudos IGF-IR-11 e IGF-IR-12) e os resultados dos três estudos adicionais que não mostraram inibição mediada por anticorpo de crescimento de tumor. Contudo, o fato de que os tumores derivados de pelo menos algumas das células Colo205 e MCF-7 são negativos para receptor (incluindo o grupo de controle de PBS) no final do estudo acarreta preocupações sobre a validade destes experimentos particulares para avaliar a eficácia in vivo de anticorpos anti-IGF-lR. Exemplo 29 - Cinética de reciclo de receptor

Para investigar o reaparecimento de receptor sob remoção de anticorpo, células NCI-H838 foram incubadas em meio de crescimento na presença de anticorpo HOLO (HOLO) a \,61\ig/m\ apresentado em Figura 39. A primeira amostra de células foi colhida a 0,5 hora após a adição de anticorpo. Todas as outras amostras foram lavadas inteiramente com PBS a 3 horas após a adição de anticorpo antes de retornarem para meio de crescimento. As células foram então colhidas at 3, 4, 5, 6, 7 e 24 horas após a adição de anticorpo e avaliadas para expressão de IGF-IR por Western blot usando um anticorpo de coelho anti-IGF-lRS c20 (Santa Cruz, sc713). Ligação foi detectada usando HRP anticorpo e IgGl kappa foi usada como um anticorpo de controle negativo. Pistas 1 a 7 são colheitas a 0,5, 3, 4, 5, 6, 7, 24 horas. Pistas 8 & 9 são o controle de não-anticorpo e o anticorpo de controle (Sigma 15154) respectivamente e foram colhidas a 3 horas. Magic Mark (Sigma, LC5602) é mostrado em Pista 10. Após remoção de anticorpo (em t=3 horas), o western blot mostra que em t=7 horas (pista 6) hão há evidencia de expressão de IGF-IR. Em contraste aproximadamente em t=24 horas (posta 7, 21 horas após remoção de anticorpo), há uma banda forte consistente com a cadeia IGF-IRp.

Um segundo experimento (dados não mostrados) confirmou que o reaparecimento de receptor foi mantido em 48, 72 e 96 horas. Estes dados sugerem que o reaparecimento da maioria do receptor ocorre dentro das primeiras 4-21 horas após a remoção do anticorpo. Exemplo 30 - Ensaio de ligação de heterodímero IGF-1R/IR

Em células que expressam ambos receptores IGF-IR e de insulina (receptor de Insulina), tem sido mostrado que existe um receptor híbrido IGF-lR:Receptor de Insulina (InsR) (Pandini et al. (1999) Clin Câncer Res., 5(7): 1935-44). Tem sido recentemente mostrado que um anticorpo anti-IGF-lR que não reage cruzadamente contra o receptor de Insulina, reduziu os níveis de receptor de Insulina, mais provavelmente pela incorporação e pela degradação do receptor híbrido (Sachdev et al. (2006) Câncer Res., 66(4):2391-402).

Anticorpos humanizados foram avaliados para sua atividade contra o receptor híbrido usando ensaios de co-imunoprecipitação. No primeiro experimento mostrado em Figura 40A, células de carcinoma de cólon COLO-205 e células recombinantes NIH-3T3 expressando receptor de Insulina de humano foram lisadas sobre gelo por 10 minutos com tampão de Iise NP40 1%, clareadas por centrifugação a 16400rpm por 20 minutos a 4°C. Proteínas celulares solúveis (500μg) foram imunoprecipitadas com 5 μg de anticorpo contra quer IGF-IR (6E11, quimera 6E11, H0L0 IgGlm(AA), IGF- IR beta, receptor (beta) de Insulina, ou IgG de humano não-selecionadora (controle). Proteínas imunoprecipitadas foram submetidas à SDS PAGE redutora em geles de poliacrilamida 4-12%, transferidas para membranas de PVDF e imunomanchadas para quer IGF-IR ou receptor de Insulina. Anticorpos secundários fluorescentemente marcados foram usados e as imagens de imunomanchas de IGF-I R/Receptor obtidas usando um sistema LI COR Odyssey. Em um experimento diferente (Figura 40B) usando uma metodologia similar como descrita acima H0L0 e H0L0 IgGlm(AA) foram comparados. Notar que a fração não ligada refere-se ao material no sobrenadante após a imunoprecipitação. A subunidade β de 97kDa de IGF-IR e IGF-IR de comprimento total de 200kDa e a subunidade β de 95kDa de receptor de Insulina e receptor de Insulina de comprimento total de 200kDa são mostrados em figuras. Como mostrado em Figuras 40A e 40B, os anticorpos humanizados foram capazes de co-imunoprecipitar o receptor de insulina e IGF-IR da linhagem celular de carcinoma de humano Colo205 em níveis comparáveis com a quimera 6E11. Os mesmos anticorpos não imunoprecipitaram o receptor de Insulina na ausência de IGF-IR (veja Figura 40A, quarto painel, pistas 1-5), indicando que os anticorpos não foram reativos contra o receptor de Insulina. Embora uma vasta maioria de IGF-IR fosse removida do lisado celular após imunoprecipitação com os anticorpos anti-IGF-lR indicando adicionalmente que os anticorpos humanizados podem ser ligar em ambos receptores IGF-IRrreceptor de Insulina heterodimérico e IGF-IR homodimérico, (Figura 40B, painel superior, pistas 3-5), uma proporção boa de receptor de Insulina (mais provavelmente a porção homodimérica) permaneceu nos lisados de célula após IP (Figura 40B, painel inferior, pistas 3-5).

Exemplo 31 - Proliferação de celulase NCI-H929

A linhagem de célula de Mieloma de humano NCI-H929 foi estimulada com IGF-I na presença de várias concentrações dos anticorpos selecionados em meio livre de soro. Células NCI-H929 foram lavadas em meio livre de soro e plaqueadas em uma placa de 96 cavidades a 4x104 células/cavidade. Diluições dos anticorpos selecionados foram adicionadas dentro da faixa de 20-0,0\%ug/m\ por 1 h a 37°C antes da adição de uma concentração fixa de IGF-I (25ng/ml). Células foram incubadas por 4 dias a 37°C antes que a proliferação fosse medida usando o kit de ensaio Promega Cell Titre Blue (Promega G8081). Figura 41 mostra a inibição dependente de dose da proliferação conduzida por IGF-I de células NCI-H929 in vitro por HOLO e 6E11 parental. Exemplo 32 - Estabilidade em soro

Para investigar a estabilidade de HOLO em soro de humano, uma alíquota de 500ml de anticorpo a 100μg/ml foi incubada por períodos de até 12 dias em soro de humano 100% a -20°C, 4°C e 37°C. A atividade após 12 dias foi determinada por ELISA de ligação direta. Valores de EC-50 foram calculados e comparados com valores de EC-50 históricos de numerosos ELISAs prévios. Os resultados exibidos abaixo em Figura 42 confirmam que HOLO não mostra queda em atividade quando incubado em soro por um período de até 12 dias a -20°C, 4°C ou 37°C.

Exemplo 33 - Farmacodinâmica de regulação negativa de receptor em modelo de xenoenxerto

Com o objetivo de confirmar que H0L0 pode infra-regular receptor IGF-IR in vivo, um ensaio in vivo baseado em linhagem de célula LISN/3T3 c4 está sendo correntemente desenvolvido baseado nas descobertas de outros (Cohen et al. (2005) Clin Câncer Res., 11(5):2063-73). No primeiro estudo, camundongos CDl nu/nu atímicos foram implantados com 2,5x106 células 3T3/LISN em matrigel (Becton Dickinson). Quando os tumores alcançaram um tamanho de 400-500mm3, os camundongos foram dosados com 125 μg de quer anticorpo de controle quer H0L0. Camundongos foram separados em T= 16, 24, 48, 72 ou 120 horas após a dosagem. Tumores foram excisados e imediatamente congelados em nitrogênio líquido. Amostras de tumor pesadas foram homogeneizadas em tampão RIPA mais inibidores de protease e fosfatase e um ensaio de proteína foi realizado no lisado após centrifugação. Um ensaio DELFIA (veja Exemplo 34) foi conduzido para avaliar os níveis relativos de IGF-IR total nas amostras de tumor. Como mostrado em Figura 43A, tratamento com H0L0 parece ter algum impacto sobre o receptor total no período de tempo de 24-72 horas embora a magnitude do efeito seja substancialmente menor do que tem sido previamente relatada (Cohen, 2005).

Em um segundo estudo, grupos de camundongos (n=6) foram implantados como acima. Quando os tumores alcançaram um tamanho de 400-5OOmm os camundongos foram dosados duas vezes 72 horas separadamente com 25(^g de quer anticorpo de controle quer HOLO 24 horas após a dose final, ^g de IGF-I recombinante de humano foi administrado intravenosamente. Após 10 min, os tumores foram excisados e congelados em nitrogênio líquido. Ensaio DELFIA de IGF-IR total foi realizado como descrito em Exemplo 34. Embora os animais fossem tratados com IGF-I, nenhumas mudanças consistentes nos níveis de receptor fosforilado foram observadas em comparação com o grupo de controle não tratado. Contudo, os grupos tratados com os anticorpos anti-IGF-lR (6E11, H0L0) mostraram uma redução nos níveis totais de receptor (Figura 43B). Um efeito similar foi visto nas amostras de tumor terminal do estudo de eficácia (dados não mostrados). Um estudo combinado que investigou os efeitos sobre fosforilação de receptor e níveis totais de receptor no decorrer do tempo mostrou-se não conclusivo (dados não mostrados).

Exemplo 34 - Ensaio DELFIA de IGF-IR total

100 μΐ de lisado de tumores contendo 10 ou 25 μg de proteína foram carregados em placas de ELISA previamente revestidas com um anticorpo de captura 2B9 anti-IGF-lR (veja exemplo 13). As placas foram incubadas durante a noite a 4°C e então lavadas em TBST. 100μ1 de anticorpo policlonal biotinilado anti-IGF-lR (R&D Systems BAF391) a 400ng/ml em 4%BSA/TBS foram adicionados em cada cavidade e incubados por 1 hora na temperatura ambiente. Placas foram lavadas em TBST e 100μ1 de Estreptavidina marcada com Eu (Perkin Elmer 1244-360) em diluição de 1/1000 foram adicionados em cada cavidade e incubados por 1 hora na temperatura ambiente. Placas foram lavadas em TBST e 100μ1 de solução DELFIA Enhancement (Perkin Elmer 1244-105) foram adicionados em cada cavidade e incubados por IOmin. Um sinal de fluorescência resolvida por tempo foi medido usando uma leitora de placa Wallac Victor multilabel. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> HAMBLIN, Paul Andrew ELLIS, Jonathan Henry SHAH, Radha BURDEN, Neil LEWIS, Alan

<120> Novos Anticorpos

<130> PB62325

<150> GB0702888.9 <151> 2007-02-14

<150> us60/953210 <151> 2007-08-01

<160> 70

<170> FastSEQ para Versão Windows 4.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 1

Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Ser Lys Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10

<210> 2 <211> 17 <212> PRT

<213> Mus Musculus <400> 2

Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1S 10 15

Asp

<210> 3 <211> 5 <212> PRT

<213> Mus Musculus <400> 3

Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5

<210> 4 <211> 16 <212> PRT

<213> Mus Musculus <4 00> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Gln Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT

<213> Mus MuscuIus <400> 5

Arg Ile Ser Asn Arg Phe Ser 1 5

<210> 6 <211> 9 <212> PRT

<213> Mus MuscuIus <400> 6

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5

<210> 7 <211> 7 <212> PRT

<213> Mus MuscuIus

<4 00> 7 Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 8 <211> 123 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 8 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 1 5 Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala 20 Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser 35 40 Ala Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly 50 55 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val 65 70 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser 85 Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly 100 Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr

115 120

Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15 Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr 30 His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val 45 Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 60 Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 75 80 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95 Arg Ser Lys Trp Tyr Phe Asp Val 105 110 Val Ser Ser

<210> 9 <211> 114 <212> PRT

<213> Mus MuscuIus <400> 9

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp His Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Gln Ser

25 30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 no

Arg Ala

<210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> Mus Musculus <4 00> 10 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro 1 5 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser 20 25 Gly Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Ser Pro 35 40 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Ala 50 55 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn 65 70 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Arg Ser Pro Tyr o o Tyr Tyr Arg Ser Ser 100 105 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 115 120

I5

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Hi: 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Let 45

Asp Tyr Asn Ala Ala Phe 11« 60

Ser Lys Ser Gln Val Phe Phi 75 80

Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ali 90 95

Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 110

<210> 11

<211> 109

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<4 00> 11

Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Ile Gly

1 5 io I5

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ser Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

70 75 só

Giu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Asp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 100 105

<210> 12 <211> 123 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Cadeia Pesada Variável Quimérica compreendendo seqüências de mus musculus e homo sapiens

<4 00> 12

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

10 15

Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr

25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val

40 45

Ala Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Ser Lys Trp Tyr Phe Asp Val

1OO 105 no

Trp Gly Thr Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser H5 120

<210> 13 <211> 114 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Cadeia Pesada Variável Quimérica compreendendo seqüências de mus musculus e homo sapiens

<4 00> 13 Asp 1 Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 5 10 15 Asp His Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Gln Ser Asn 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp 65 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser 70 Gly Ser Gly Thr Asp 75 Phe Thr Leu Lys Ile 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His 85 90 95 Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr

<210> 14 <211> 123 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 I0 I5 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 20 25 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr 50 55 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr 65 70 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Ala 85 90 Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Ser 100 105 Trp Gly Arg 115 Gly Thr Leu Val Thr 120 Val Ser

30

Gln Gly Leu Glu Trp Mei 45

Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 60

Ser Thr Ser Thr Ala Ty] 75 80

Thr Ala Val Tyr Tyr Cyi 95

Lys Trp Tyr Phe Asp VaJ 110

<210> 15 <211> 123 <212> PRT <213> Homo Sapiens <4 00> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 1 5 10 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 20 25 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr 50 55 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr 65 70 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp 85 90 Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Ser 100 105 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120

15

Tyr Ala Phe Thr Asp Ty: 30

Gln Gly Leu Glu Trp Me1 45

Asn Tyr Asn Gln Lys Ph« 60

Ser Thr Ser Thr Ala Tya 75 80

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95

Lys Trp Tyr Phe Asp Val 110

<210> 16

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<4 00> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Gln Ser

25 30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1OO 105 110

Arg Thr <210> 17 <211> 15 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência de Etiqueta Biotinilada <4 00> 17

Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 10 15

<210> 18

<211> 123

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<4 00> 18

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1S 10 15

Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr

25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Met

40 45

Ala Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Ser Lys Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 HO

Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 19 <211> 114 <212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 19

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp His Ala Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser 25 Ser Gln Ser Ile Val 30 Gln Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala 85 Glu Asp Leu Gly Val 90 Tyr Tyr Cys Phe Gln 95 Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala

<210> 20 <211> 123 <212> PRT <213> Mus MuscuIus

<4 00> 20

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 I0 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr

25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Thr His Gly Arg Ser Leu Glu Trp Met

40 45

Ala Asn Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Ser Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 HO

Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 21 <211> 114 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 21 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro 1 5 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp 40 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val 50 55 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 85 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly 100 Arg Ala

Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

15

Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser 30

Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 45

Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 60

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

75 80

Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 HO

<210> 22

<211> 123

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 22

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr

25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Met

40 45

Ala Asn Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 HO

Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 I20

<210> 23

<211> 114

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 23

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser

25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 HO

Arg Ala

<210> 24 <211> 472 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Cadeia Pesada Variável Quimérica compreendendo seqüências de mus musculus e homo sapiens

<400> 24

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Phe Phe Leu Leu Ser Glu Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Ser Lys Trp Tyr 115 120 125 Phe Asp 130 Val Trp Gly Thr Gly 135 Thr Leu Val Thr Val 140 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 3io 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

34O 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 25 <211> 238 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Cadeia Pesada Variável Quimérica compreendendo seqüências de mus musculus e horao sapiens

<400> 25

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Val Val Leu Met Phe Trp Ile

1 5 10

Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu

25 30

Ser Leu Gly Asp His Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln

40 45

Val Gln Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ile Ser Asn Arg 65 70 75

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90

Pro Ala 15

Pro Val

Ser Ile

Lys Pro

Phe Ser 80 Phe Thr 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe 100 105 110 Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 165 170 175 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 26

<211> 369

<212> DNA

<213> Mus MuscuIus

<400> 26

gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaggata 60 tcctgtaagg cttctggata cgcgttcact gactactaca tgaactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg ggtggcaaat attaatccca acaatggtgg tactaactac 180 aaccagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca agtcctccaa cacagcctac 240 atggagctcc gcagtctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagatggatt 300 ctttactacg gtcgtagcaa atggtacttc gatgtctggg gcacagggac cacggtcacc 360 gtctcctcg 269

<210> 27

<211> 342

<212> DNA

<213> Mus MuscuIus

<400> 27

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcacgcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagtattgtt caaagtaatg gagacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagaatttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agtagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcagggttc acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacggg ct 342

<210> 28

<211> 369

<212> DNA

<213> Mus MuscuIus

<4 00> 28

gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaggata 60 tcctgtaagg cttctggata cgcgttcact gactactaca tgaactgggt gaaacagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gatggcaaat attaatccca acaatggtgg tactaactac 180 aaccagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca agtcctccaa cacagcctac 240 atggagctcc gcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatggatt 300 ctttactacg gtcgtagcaa gtggtacttc gatgtctggg gcccagggac cacggtcacc 360 gtctcctcg 369

<210> 29 <211> 342 <212> DNA <213> Mus MuscuIus

<400> 29

gatgttttga tgacccaaag tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcacgcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagcattgtt caaagtaatg gagacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct atagagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agtagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcagggttc acatgttccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacggg ct 342

<210> 30 <211> 369 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Cadeia Pesada Variável Quimérica compreendendo seqüências

de mus musculus e homo

sapiens

<400> 30

gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaggata 60 tcctgtaagg cttctggata cgcgttcact gactactaca tgaactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg ggtggcaaat attaatccca acaatggtgg tactaactac 180 aaccagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca agtcctccaa cacagcctac 240 atggagctcc gcagtctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagatggatt

300

- -> ----ZJ--ZSw^w ·_*.·_ ^ ^ ^ ^ ^ ^v-)·^ í-it-i^ut-v^yai-L· \j

ctttactacg gtcgtagcaa atggtacttc gatgtctggg gcacagggac actagtcaca 360

369

gtctcctca

<210> 31 <211> 342 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Cadeia Pesada Variável Quimérica compreendendo seqüências de mus musculus e homo sapiens

<400> 31

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcacgcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagtattgtt caaagtaatg gagacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagaatttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agtagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcagggttc acatgttccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgta cg 342

<210> 32 <211> 1419 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Cadeia Pesada Variável Quimérica compreendendo seqüências de mus musculus e homo sapiens

<400> 32

atgggatgga gctggatctt tttcttcctc ctgtcagaaa ctgcaggtgt cctctctgag 60 gtccagctgc aacaatctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaggatatcc 120 tgtaaggctt ctggatacgc gttcactgac tactacatga actgggtgaa gcagagccat 180 ggaaagagcc ttgagtgggt ggcaaatatt aatcccaaca atggtggtac taactacaac 240 cagaagttca aggacaaggc cacattgact gtagacaagt cctccaacac agcctacatg 300 gagctccgca gtctgacatc tgaggacact gcagtctatt actgtgcaag atggattctt 360 tactacggtc gtagcaaatg gtacttcgat gtctggggca cagggacact agtcacagtc 420 tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1419

<210> 33 <211> 717 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Cadeia Pesada Variável Quimérica compreendendo seqüências de mus musculus e homo sapiens

<400> 33

atgaagttgc ctgttcggct cgtggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca cgcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag tattgttcaa agtaatggag acacctattt agaatggtac 180 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca gaatttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagt 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc agggttcaca tgttccgtac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggacaacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 717

<210> 34

<211> 369

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 34

caggtccagc tggtgcagag cggcgcagag gtgaagaagc ccggagctag cgtcaaggtc 60

tcctgcaagg cttcaggcta cacattcacc gactactaca tgaactgggt gagacaggct 120

ccaggacagg gcctcgagtg gatgggcaac atcaacccca acaatggcgg gacaaactac 180

aaccagaagt tcaaggatcg cgtgaccatg accaccgaca ctagcacctc aacagcctac 240

atggagctga ggtctctgcg gagcgatgac actgccgtgt actactgtgc caggtggatt 300

ctgtactacg ggaggagcaa gtggtacttc gacgtctggg gaagagggac actagtgacc 360 gtgagcagc 369

<210> 35

<211> 369

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 35 caggtccagc tcctgcaagg ccaggacagg aaccagaagt atggagctga ctgtactacg gtgagcagc

tggtgcagag cttcaggcta gcctcgagtg tcaaggatcg ggtctctgcg ggaggagcaa

cggcgcagag cgccttcacc gatgggcaac cgtgaccatg gagcgatgac gtggtacttc

gtgaagaagc gactactaca atcaacccca accaccgaca actgccgtgt gacgtctggg

ccggagctag tgaactgggt acaatggcgg ctagcacctc actactgtgc gaagagggac

cgtcaaggtc 60 gagacaggct 120 gacaaactac 180 aacagcctac 240 caggtggatt 300 actagtgacc 360 369

<210> 36

<211> 342

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 36

gacatcgtca tgacccagag cccactgtca ctccccgtga

atcagctgta gaagctccca gagcatcgtg cagtctaacg

tacctgcaga agcccggaca gtctcctcag ctcctgattt

tccggggtgc ctgatcggtt tagcggctca ggaagcggaa

tcaagggtgg aggctgagga tgtgggcgtg tactactgct

tacaccttcg gacagggcac aaagctcgag attaagcgta

<210> 37

<211> 472

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val

1 5 I0

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 25 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala

40

Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala

50 55

Glu Trp Met Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly 65 70 75

Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr

85 90

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser 100 105 Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly

115 120

Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr

130 135

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 145 150 155

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

165 170

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 180 185 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

195 200

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 210 215 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 225 230 235

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

245 250

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280

cacccggaga gcgataccta accgcgtcag ccgacttcac tccagggatc cg

gcccgctagc 60 cctcgagtgg 120 caatcgcttt 180 cctgaagatc 240 tcacgtgcct 300 342

Ala

Ala

Ser

Pro

60

Gly

Asp

Asp

Arg

Val 140 Ser

Lys

Leu

Leu

Thr 220 Val

Pro

Phe

Val

Thr

Glu

Gly

45

Gly

Thr

Thr

Asp

Ser 125 Ser

Ser

Asp

Thr

Tyr 205 Gln

Asp

Pro

Pro

Thr 285

Ala

Val

30

Tyr

Gln

Asn

Ser

Thr 110 Lys

Ser

Lys

Tyr

Ser 190 Ser

Thr

Lys

Cys

Pro 270 Cys

Thr Gly 15

Lys Lys

Thr Phe

Gly Leu

Tyr Asn 80 Thr Ser 95

Ala Val

Trp Tyr

Ala Ser

Ser Thr 160 Phe Pro 175

Gly Val

Leu Ser

Tyr Ile

Lys Val 240 Pro Ala 255

Lys Pro Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 4 60

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 38

<211> 472

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1S 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe

40 45

Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

100 105 HO

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Ser Lys Trp Tyr

115 120 125

Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 39 <211> 238 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 39

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile

40 45

Val Gln Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 40 <211> 1419 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 40

atgggatggt cctgtatcat cctgtttctg gtggccacag caactggcgt gcactctcag 60 gtccagctgg tgcagagcgg cgcagaggtg aagaagcccg gagctagcgt caaggtctcc 120 tgcaaggctt caggctacac attcaccgac tactacatga actgggtgag acaggctcca 180 ggacagggcc tcgagtggat gggcaacatc aaccccaaca atggcgggac aaactacaac 240 cagaagttca aggatcgcgt gaccatgacc accgacacta gcacctcaac agcctacatg 300 gagctgaggt ctctgcggag cgatgacact gccgtgtact actgtgccag gtggattctg 360 tactacggga ggagcaagtg gtacttcgac gtctggggaa gagggacact agtgaccgtg 420 tccagcgcca gcaccaaggg ccccagcgtg ttccccctgg cccccagcag caagagcacc 480 agcggcggca cagccgccct gggctgcctg gtgaaggact acttccccga accggtgacc 540 gtgtcctgga acagcggagc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc cgtgctgcag 600 agcagcggcc tgtacagcct gagcagcgtg gtgaccgtgc ccagcagcag cctgggcacc 660 cagacctaca tctgtaacgt gaaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaggtg 720 gagcccaaga gctgtgacaa gacccacacc tgccccccct gccctgcccc cgagctgctg 780 ggaggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcctaagg acaccctgat gatcagcaga 840 acccccgagg tgacctgtgt ggtggtggat gtgagccacg aggaccctga ggtgaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aatgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 960 tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020 ggcaaggagt acaagtgtaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccctat cgagaaaacc 1080 atcagcaagg ccaagggcca gcccagagag ccccaggtgt acaccctgcc ccctagcaga 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1260 cctgtgctgg acagcgatgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 1320 agatggcagc agggcaacgt gttcagctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaatcac 1380 tacacccaga agagcctgag cctgtcccct ggcaagtga 1419

<210> 41 <211> 1419 <212> DNA <213> Homo sapiens

60 120 180 240

<400> 41

atgggatggt cctgtatcat cctgtttctg gtggccacag caactggcgt gcactctcag gtccagctgg tgcagagcgg cgcagaggtg aagaagcccg gagctagcgt caaggtctcc tgcaaggctt caggctacgc cttcaccgac tactacatga actgggtgag acaggctcca ggacagggcc tcgagtggat gggcaacatc aaccccaaca atggcgggac aaactacaac cagaagttca aggatcgcgt gaccatgacc accgacacta gcacctcaac agcctacatg 300 gagctgaggt ctctgcggag cgatgacact gccgtgtact actgtgccag gtggattctg 360 tactacggga ggagcaagtg gtacttcgac gtctggggaa gagggacact agtgaccgtg 420 tccagcgcca gcaccaaggg ccccagcgtg ttccccctgg cccccagcag caagagcacc 480 agcggcggca cagccgccct gggctgcctg gtgaaggact acttccccga accggtgacc 540 gtgtcctgga acagcggagc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc cgtgctgcag 600 agcagcggcc tgtacagcct gagcagcgtg gtgaccgtgc ccagcagcag cctgggcacc 660 cagacctaca tctgtaacgt gaaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaggtg 720 gagcccaaga gctgtgacaa gacccacacc tgccccccct gccctgcccc cgagctgctg 780 ggaggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcctaagg acaccctgat gatcagcaga 840 acccccgagg tgacctgtgt ggtggtggat gtgagccacg aggaccctga ggtgaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aatgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 960 tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020 ggcaaggagt acaagtgtaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccctat cgagaaaacc 1080 atcagcaagg ccaagggcca gcccagagag ccccaggtgt acaccctgcc ccctagcaga 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1260 cctgtgctgg acagcgatgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 1320 agatggcagc agggcaacgt gttcagctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaat cac 1380 tacacccaga agagcctgag cctgtcccct ggcaagtga 1419

<210> 42

<211> 717

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 42

atgggatggt

atcgtcatga

agctgtagaa

ctgcagaagc

ggggtgcctg

agggtggagg

accttcggac

atcttccccc

aacaacttct

ggcaacagcc

agcaccctga

acccaccagg

cctgcatcat cccagagccc gctcccagag ccggacagtc atcggtttag ctgaggatgt agggcacaaa ccagcgatga acccccggga aggagagcgt ccctgagcaa gcctgtccag

cctgttcctg actgtcactc catcgtgcag tcctcagctc cggctcagga gggcgtgtac gctcgagatt gcagctgaag ggccaaggtg gaccgagcag ggccgactac ccccgtgacc

gtggcaactg cccgtgacac tctaacggcg ctgatttacc agcggaaccg tactgcttcc aagcgtacgg agcggcaccg cagtggaagg gacagcaagg gagaagcaca aagagcttca

ccactggagt ccggagagcc atacctacct gcgtcagcaa acttcaccct agggatctca tggccgcccc ccagcgtggt tggacaatgc actccaccta aggtgtacgc accggggcga

ccactccgac 60 cgctagcatc 120 cgagtggtac 180 tcgcttttcc 240 gaagatctca 300 cgtgccttac 360 cagcgtgttc 420 gtgtctgctg 480 cctgcagagc 540 cagcctgagc 600 ctgtgaggtg 660 gtgctga 717

<210> 43 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência lider Campath <400> 43

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 I0 I5

Val His Ser

<210> 44 <211> 1367 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 44

Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu

1 5 10 I5

Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile

25 30

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40 45

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50 55 60

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85 90 95

Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe

100 105 HO

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11S 120 125

Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu

130 135 140

Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile 145 150 155 160

Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys

165 170 175

Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys

180 185 190

Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr

!95 200 205

Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys

21° 215 220

Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240

Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr

245 250 255

Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu

260 265 270

Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala

275 280 285

Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met

290 295 300

Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr 305 310 315 320

Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys

325 330 335

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340 345 350

Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn

355 360 365

Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val

370 375 380

Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400

Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly

405 410 415

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Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe

435 440 445

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450 455 460

Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480

Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr

485 490 495

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Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu

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1205 1210 1215

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Pro Gly Pro Gly Val Leu Val Leu Arg Ala Ser Phe Asp Glu Arg Gln

1330 1335 1340

Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro 1345 1350 1355 1360

Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys 1365

<210> 45 <211> 1367 <212> PRT

<213> macaco cinomolgo <4 00> 45

Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu

10 15

Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile

25 30

Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg

40 45

Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile

50 55 60

Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80

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85 90 95

Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe

100 105 110

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115 120 125

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275 280 285

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Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys

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Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly

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Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn

355 360 365

Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val

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Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly

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Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp

420 425 430

Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe

435 440 445

Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu

450 455 460

Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480

Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr

485 490 495

Ser Thr Thr Thr Trp Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr

500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys 545 550 555 560

Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln

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675 680 685

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Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly

995 1000 1005

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1010 1015 1020

Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Val Asn Glu Ala Ala Ser 1025 1030 1035 1040

Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Glu

1045 1050 1055

Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Gln Gly

1060 1065 1070

Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu Met Thr Arg Gly Asp Leu Lys

1075 1080 1085

Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Met Glu Asn Asn Pro Val Leu

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Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile Gln Met Ala Gly Glu Ile Ala 1105 1110 1115 1120

Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu

1125 1130 1135

Ala Ala Arg Asn Cys Met Val Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly

1140 1145 1150

Asp Phe Gly Met Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys

1155 1160 1165

Gly Gly Lys Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu

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Lys Asp Gly Val Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val 1185 1190 1195 1200

Val Leu Trp Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu

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Ser Asn Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp

1220 1225 1230

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1250 1255 1260

Ser Ile Lys Asp Glu Met Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser Phe Tyr 1265 1270 1275 1280

Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Leu Pro Glu Pro Glu Glu Leu Asp Leu Glu

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Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser Ala Ser Ser Ser

1300 1305 1310

Ser Leu Pro Leu Pro Asp Arg His Ser Gly His Lys Ala Glu Asn Gly

1315 1320 1325

Pro Gly Pro Gly Val Leu Val Leu Arg Ala Ser Phe Asp Glu Arg Gln

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Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro 1345 1350 1355 1360

Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys 1365

<210> 46 <211> 1373 <212> PRT

<213> Mus Musculus <400> 46

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180 185 190

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Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Pro Asn Ala

275 280 285

Glu Ser Ser Asp Ser Asp Gly Phe Val Ile His Asp Asp Glu Cys Met 290 295 300 Gln Glu Cys Pro 305

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Thr Ile Asp Ser

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Leu Leu Ile Asn

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Leu Ile Ser Phe

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Val Asp Val Asp 555

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Glu Ile Leu Tyr

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Val Glu Glu Val

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Leu Ile Glu Val

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<210> 47 <211> 1180 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

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Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys

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Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr

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Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn 625 630 635 640 Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr 645 650 655 Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys 660 665 670 Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys 675 680 685 Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys 690 695 700 Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys 705 710 715 720 Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu 725 730 735 Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser 740 745 750 Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Leu 755 760 765 Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn 770 775 780 Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg 785 790 795 800 . Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser 805 810 815 Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp 820 825 830 Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile 835 840 845 Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met 850 855 860 Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val 865 870 875 880 Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu 885 890 895 Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly 900 905 910 Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr 915 920 925 Gly Tyr Glu Asn Phe Ile His Ala Ala Ala Ile Glu Gly Arg Ser Gly 930 935 940 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 945 950 955 960 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 965 970 975 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 980 985 990 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 995 1000 1005 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 1010 1015 1020 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 1025 1030 1035 1040 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 1045 1050 1055 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 1060 1065 1070 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 1075 1080 1085 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 1090 1095 1100 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 1105 1110 1115 1120 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 1125 1130 1135 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 1140 1145 1150

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

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<210> 49 <211> 71 <212> PRT <213> Homo

sapiens

<400> 49 Met Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln 1 5 10 15 Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys 35 40 45 Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro 50 55 60 Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70

<210> 50 <211> 86 <212> PRT <213> Homo

sapiens

<400> 50

Met Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln

10 15

Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr

25 30

Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys

40 45

Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro

50 55 60

Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln 65 70 75 80

Lys Ile Glu Trp His Glu 85

<210> 51 <211> 68 <212> PRT <213> Homo

sapiens

<400> 51

Met Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp

10 15

Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro

25 30

Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys

40 45

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro

50 55 60

Ala Lys Ser Glu 65 <210> 52

<211> 83

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

Met Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp 1 5 10 15 Thr Leu Gln Phe 20 Val Cys Gly Asp Arg 25 Gly Phe Tyr Phe Ser 30 Arg Pro Ala Ser Arg 35 Val Ser Arg Arg Ser 40 Arg Gly Ile Val Glu 45 Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro 50 55 60 Ala Lys Ser Glu Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 65 70 75 80 Trp His Glu

<210> 53 <211> 1382 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 53

Met Gly Thr Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Val

10 15

Ala Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly His Leu Tyr Pro Gly

25 30

Glu Val Cys Pro Gly Met Asp Ile Arg Asn Asn Leu Thr Arg Leu His

40 45

Glu Leu Glu Asn Cys Ser Val Ile Glu Gly His Leu Gln Ile Leu Leu

50 55 60

Met Phe Lys Thr Arg Pro Glu Asp Phe Arg Asp Leu Ser Phe Pro Lys 65 70 75 80

Leu Ile Met Ile Thr Asp Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Tyr Gly Leu

85 90 95

Glu Ser Leu Lys Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Ser

100 105 110

Arg Leu Phe Phe Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Val His Leu

115 120 125

Lys Glu Leu Gly Leu Tyr Asn Leu Met Asn Ile Thr Arg Gly Ser Val

130 135 140

Arg Ile Glu Lys Asn Asn Glu Leu Cys Tyr Leu Ala Thr Ile Asp Trp 145 150 155 160

Ser Arg Ile Leu Asp Ser Val Glu Asp Asn Tyr Ile Val Leu Asn Lys

165 170 175

Asp Asp Asn Glu Glu Cys Gly Asp Ile Cys Pro Gly Thr Ala Lys Gly

180 185 190

Lys Thr Asn Cys Pro Ala Thr Val Ile Asn Gly Gln Phe Val Glu Arg

195 200 205

Cys Trp Thr His Ser His Cys Gln Lys Val Cys Pro Thr Ile Cys Lys

210 215 220

Ser His Gly Cys Thr Ala Glu Gly Leu Cys Cys His Ser Glu Cys Leu 225 230 235 240

Gly Asn Cys Ser Gln Pro Asp Asp Pro Thr Lys Cys Val Ala Cys Arg

245 250 255

Asn Phe Tyr Leu Asp Gly Arg Cys Val Glu Thr Cys Pro Pro Pro Tyr

260 265 270

Tyr His Phe Gln Asp Trp Arg Cys Val Asn Phe Ser Phe Cys Gln Asp

275 280 285

Leu His His Lys Cys Lys Asn Ser Arg Arg Gln Gly Cys His Gln Tyr 290 295 300

Val Ile His Asn Asn Lys Cys Ile Pro Glu Cys Pro Ser Gly Tvr Thr

Λ 310 315 320

Met Asn Ser Ser Asn Leu Leu Cys Thr Pro Cys Leu Gly Pro Cys Pro

325 330 335

Lys Val Cys His Leu Leu Glu Gly Glu Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr

340 345 350

Ser Ala Gln Glu Leu Arg Gly Cys Thr Val Ile Asn Gly Ser Leu Ile 355 360 365

Ile Asn Ile Arg Gly Gly Asn Asn Leu Ala Ala Glu Leu Glu Ala Asn 370 375 380

Leu Gly Leu Ile Glu Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Lys Ile Arg Arg Ser 385 390 395 400

Tyr Ala Leu Val Ser Leu Ser Phe Phe Arg Lys Leu Arg Leu Ile Arg

405 4io 415

Gly Glu Thr Leu Glu Ile Gly Asn Tyr Ser Phe Tyr Ala Leu Asp Asn

420 425 430

Gln Asn Leu Arg Gln Leu Trp Asp Trp Ser Lys His Asn Leu Thr Ile

435 440 445

Thr Gln Gly Lys Leu Phe Phe His Tyr Asn Pro Lys Leu Cys Leu Ser

450 455 460

Glu Ile His Lys Met Glu Glu Val Ser Gly Thr Lys Gly Arg Gln Glu 465 470 475 480

Arg Asn Asp Ile Ala Leu Lys Thr Asn Gly Asp Gln Ala Ser Cys Glu

485 490 495

Asn Glu Leu Leu Lys Phe Ser Tyr Ile Arg Thr Ser Phe Asp Lys Ile

500 505 510

Leu Leu Arg Trp Glu Pro Tyr Trp Pro Pro Asp Phe Arg Asp Leu Leu

515 520 525

Gly Phe Met Leu Phe Tyr Lys Glu Ala Pro Tyr Gln Asn Val Thr Glu 530 535 540

Phe Asp Gly Gln Asp Ala Cys Gly Ser Asn Ser Trp Thr Val Val Asp 545 550 555 560

Ile Asp Pro Pro Leu Arg Ser Asn Asp Pro Lys Ser Gln Asn His Pro

565 570 575

Gly Trp Leu Met Arg Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Ile Phe

580 585 590

Val Lys Thr Leu Val Thr Phe Ser Asp Glu Arg Arg Thr Tyr Gly Ala

595 600 605

Lys Ser Asp Ile Ile Tyr Val Gln Thr Asp Ala Thr Asn Pro Ser Val

610 615 620

Pro Leu Asp Pro Ile Ser Val Ser Asn Ser Ser Ser Gln Ile Ile Leu 625 630 635 640

Lys Trp Lys Pro Pro Ser Asp Pro Asn Gly Asn Ile Thr His Tyr Leu

645 650 655

Val Phe Trp Glu Arg Gln Ala Glu Asp Ser Glu Leu Phe Glu Leu Asp

660 665 670

Tyr Cys Leu Lys Gly Leu Lys Leu Pro Ser Arg Thr Trp Ser Pro Pro

675 680 685

Phe Glu Ser Glu Asp Ser Gln Lys His Asn Gln Ser Glu Tyr Glu Asp

690 695 700

Ser Ala Gly Glu Cys Cys Ser Cys Pro Lys Thr Asp Ser Gln Ile Leu 705 710 715 720

Lys Glu Leu Glu Glu Ser Ser Phe Arg Lys Thr Phe Glu Asp Tyr Leu

725 730 735

His Asn Val Val Phe Val Pro Arg Lys Thr Ser Ser Gly Thr Gly Ala

74O 745 750

Glu Asp Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Ser Leu Gly Asp Val Gly

755 760 765

Asn Val Thr Val Ala Val Pro Thr Val Ala Ala Phe Pro Asn Thr Ser

77O 775 780

Ser Thr Ser Val Pro Thr Ser Pro Glu Glu His Arg Pro Phe Glu Lys 785 790 795 800 Val Val Asn Lys Glu Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu Arg His Phe Thr

805 810 815

Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gln Ala Cys Asn Gln Asp Thr Pro Glu Glu

820 825 830

Arg Cys Ser Val Ala Ala Tyr Val Ser Ala Arg Thr Met Pro Glu Ala

835 840 845

Lys Ala Asp Asp Ile Val Gly Pro Val Thr His Glu Ile Phe Glu Asn

850 855 860

Asn Val Val His Leu Met Trp Gln Glu Pro Lys Glu Pro Asn Gly Leu 865 870 875 880

Ile Val Leu Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Arg Tyr Gly Asp Glu Glu Leu

885 890. 895

His Leu Cys Val Ser Arg Lys His Phe Ala Leu Glu Arg Gly Cys Arg

900 905 910

Leu Arg Gly Leu Ser Pro Gly Asn Tyr Ser Val Arg Ile Arg Ala Thr

915 920 925

Ser Leu Ala Gly Asn Gly Ser Trp Thr Glu Pro Thr Tyr Phe Tyr Val

930 935 940

Thr Asp Tyr Leu Asp Val Pro Ser Asn Ile Ala Lys Ile Ile Ile Gly 945 950 955 960

Pro Leu Ile Phe Val Phe Leu Phe Ser Val Val Ile Gly Ser Ile Tyr

965 970 975

Leu Phe Leu Arg Lys Arg Gln Pro Asp Gly Pro Leu Gly Pro Leu Tyr

980 985 990

Ala Ser Ser Asn Pro Glu Tyr Leu Ser Ala Ser Asp Val Phe Pro Cys

995 1000 1005

Ser Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp Glu Val Ser Arg Glu Lys Ile Thr

1010 1015 1020

Leu Leu Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly 1025 1030 1035 1040

Asn Ala Arg Asp Ile Ile Lys Gly Glu Ala Glu Thr Arg Val Ala Val

1045 1050 1055

Lys Thr Val Asn Glu Ser Ala Ser Leu Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu

1060 1065 1070

Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Gly Phe Thr Cys His His Val Val Arg

1075 1080 1085

Leu Leu Gly Val Val Ser Lys Gly Gln Pro Thr Leu Val Val Met Glu

1090 1095 1100

Leu Met Ala His Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro H05 1110 1115 1120

Glu Ala Glu Asn Asn Pro Gly Arg Pro Pro Pro Thr Leu Gln Glu Met

1125 1130 1135

Ile Gln Met Ala Ala Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala

1140 1145 1150

Lys Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val Ala

1155 1160 1165

His Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg Asp Ile

1170 1175 1180

Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu Leu Pro Val 1185 1190 1195 1200

Arg Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val Phe Thr Thr Ser

1205 1210 1215

Ser Asp Met Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Thr Ser Leu

1220 1225 1230

Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gln Val Leu Lys Phe

1235 1240 1245

Val Met Asp Gly Gly Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Asn Cys Pro Glu Arg

1250 1255 1260

Val Thr Asp Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Phe Asn Pro Asn Met Arg 1265 1270 1275 1280

Pro Thr Phe Leu Glu Ile Val Asn Leu Leu Lys Asp Asp Leu His Pro

1285 1290 1295

Ser Phe Pro Glu Val Ser Phe Phe His Ser Glu Glu Asn Lys Ala Pro 1300 1305 1310

Glu Ser Glu Glu Leu Glu Met Glu Phe Glu Asp Met Glu Asn Val Pro

1315 1320 1325

Leu Asp Arg Ser Ser His Cys Gln Arg Glu Glu Ala Gly Gly Arg Asp

1330 1335 1340

Gly Gly Ser Ser Leu Gly Phe Lys Arg Ser Tyr Glu Glu His Ile Pro 1345 1350 1355 1360

Tyr Thr His Met Asn Gly Gly Lys Lys Asn Gly Arg Ile Leu Thr Leu

1365 1370 1375

Pro Arg Ser Asn Pro Ser 1380

<210> 54 <211> 472 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 54

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

40 45

Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Ser Lys Trp Tyr

115 120 125

Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350 Leu Pro Ala 355 Pro Ile Glu Lys Thr 360 Ile Ser Lys Ala Lys 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 385 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu 390 Thr Cys Leu Val Lys 395 Gly Phe Tyr Pro Ser 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 55 <211> 1419 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 55

atgggatggt cctgtatcat cctgtttctg gtggccacag caactggcgt gcactctcag 60 gtccagctgg tgcagagcgg cgcagaggtg aagaagcccg gagctagcgt caaggtctcc 120 tgcaaggctt caggctacac attcaccgac tactacatga actgggtgag acaggctcca 180 ggacagggcc tcgagtggat gggcaacatc aaccccaaca atggcgggac aaactacaac 240 cagaagttca aggatcgcgt gaccatgacc accgacacta gcacctcaac agcctacatg 300 gagctgaggt ctctgcggag cgatgacact gccgtgtact actgtgccag gtggattctg 360 tactacggga ggagcaagtg gtacttcgac gtctggggaa gagggacact agtgaccgtg 420 agcagcgcca gcaccaaggg ccccagcgtg ttccccctgg cccccagcag caagagcacc 480 agcggcggca cagccgccct gggctgcctg gtgaaggact acttccccga gcccgtgacc 540 gtgtcctgga acagcggagc cctgacaagc ggggtgcaca ccttccccgc cgtgctgcag 600 agcagcggcc tgtacagcct gagcagcgtg gtgacagtgc ccagcagcag cctgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaggtg 720 gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgccccccct gccctgcccc tgaactggcc 780 ggagccccct ccgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 840 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccctga ggtgaagttc 900 aattggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg ggaggaacag 960 tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 1020 ggcaaagaat acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc 1080 atcagcaagg ccaagggcca gcccagggaa ccccaggtgt acaccctgcc cccctcccgg 1140 gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctgg tgaagggctt ctaccccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1260 cctgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 1320 cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380 tacacccaga agagcctgag cctgtccccc ggcaagtga 1419

<210> 56

<211> 472

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn

" 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser

85 9o 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

100 105 HO

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Ser Lys Trp Tyr

115 120 125

Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 I60

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

225 23O 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 4io 4i5

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 46Q

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 57 <211> 1419 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 57

atgggatggt cctgtatcat cctgtttctg gtggccacag caactggcgt gcactctcag 60

gtccagctgg tgcagagcgg cgcagaggtg aagaagcccg gagctagcgt caaggtctcc 120 tgcaaggctt caggctacgc cttcaccgac tactacatga actgggtgag acaggctcca 180 ggacagggcc tcgagtggat gggcaacatc aaccccaaca atggcgggac aaactacaac 240 cagaagttca aggatcgcgt gaccatgacc accgacacta gcacctcaac agcctacatg 300 gagctgaggt ctctgcggag cgatgacact gccgtgtact actgtgccag gtggattctg 360 tactacggga ggagcaagtg gtacttcgac gtctggggaa gagggacact agtgaccgtg 420 agcagcgcca gcaccaaggg ccccagcgtg ttccccctgg cccccagcag caagagcacc 480 agcggcggca cagccgccct gggctgcctg gtgaaggact acttccccga gcccgtgacc 540 gtgtcctgga acagcggagc cctgacaagc ggggtgcaca ccttccccgc cgtgctgcag 600 agcagcggcc tgtacagcct gagcagcgtg gtgacagtgc ccagcagcag cctgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaggtg 720 gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgccccccct gccctgcccc tgaactggcc 780 ggagccccct ccgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 840 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccctga ggtgaagttc 900 aattggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg ggaggaacag 960 tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 1020 ggcaaagaat acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc 1080 atcagcaagg ccaagggcca gcccagggaa ccccaggtgt acaccctgcc cccctcccgg 1140 gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctgg tgaagggctt ctaccccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1260 cctgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 1320 cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380 tacacccaga agagcctgag cctgtccccc ggcaagtga 1419

<210> 58

<211> 717

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 58

atgggatggt cctgcatcat cctgttcctg gtggcaactg ccactggagt ccactccgac 60 atcgtcatga cccagagccc actgtcactc cccgtgacac ccggagagcc cgctagcatc 120 agctgtagaa gctcccagag catcgtgcag tctaacggcg atacctacct cgagtggtac 180 ctgcagaagc ccggacagtc tcctcagctc ctgatttacc gcgtcagcaa tcgcttttcc 240 ggggtgcctg atcggtttag cggctcagga agcggaaccg acttcaccct gaagatctca 300 agggtggagg ctgaggatgt gggcgtgtac tactgcttcc agggatctca cgtgccttac 360 accttcggac agggcacaaa gctcgagatt aagcgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 420 atcttccccc ccagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgcctgctg 480 aacaacttct acccccggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 540 ggcaacagcc aggaaagcgt caccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 600 agcaccctga cactgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaggtg 660 acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgctag 717

<210> 59

<211> 123

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa denota posições de CDR's na seqüência de estrutura

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 Val 5 10 15 Ser Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45 Xaa 50 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 55 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 Xaa Arg Val Thr Met 70 Thr Thr Asp Thr Ser 75 Thr Ser Thr Ala Tyr 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

110

<210> 60 <211> 114 <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Xaa denota posições de CDR's na seqüência de estrutura <400> 60

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 io I5

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa

85 90 95

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 no

Arg Thr

<210> 61

<211> 356

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 61

caggtgcagc

tcctgcaagg

ccaggccagg

aaccagaagt

atggaactgc

ctgtactacg

tggtgcagag ccagcggcta gactggaatg tcaaggaccg ggagcctgag gccggtccaa

cggagccgag caccttcacc gatgggcaac ggtcaccatg aagcgacgac gtggtacttc

gtgaagaagc gactactaca atcaacccca accaccgaca accgccgtgt gacgtgtggg

ctggcgccag tgaactgggt acaacggcgg ccagcaccag actactgcgc gcaggggcac

cgtcaaggtg 60 gcggcaggcc 120 caccaactac 180 caccgcctac 240 ccggtggatc 300 actagt 356

<210> 62

<211> 342

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 62

gacatcgtga

atcagctgca

tatctgcaga

agcggcgtgc

agccgggtgg

tacaccttcg

tgacccagag gaagcagcca agcccggcca ccgacagatt aggccgagga gccagggcac

<210> 63 <211> 1012 <212> DNA <213> Homo sapiens

ccccctgagc ctgcccgtga cccctggcga gcccgccagc 60 gagcatcgtc cagagcaacg gcgacaccta cctggaatgg 120 gtccccccag ctgctgatct acagagtgag caaccggttc 180 cagcggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 cgtgggcgtg tactactgct ttcaaggcag ccacgtgccc 300 caagctggaa atcaagcgta cg 342 <4 00> 63

actagtcacc

cagcaagagc

cgagcccgtg

cgccgtgctg

cagcctgggc

ggacaagaag

ccctgagctg

gatgatcagc

tgaggtgaag

ccgggaggaa

ggactggctg

cgaggaaaag

gcccccctcc

cttctacccc

caagaccacc

cgtggacaag

cctgcacaac

gtgagcagcg

accagcggcg

accgtgagct

cagagcagcg

acccagacct

gtggagccca

ctgggcggac

cggacccccg

ttcaattggt

cagtacaaca

aacggcaaag

accatcagca

cgggacgagc

agcgacatcg

ccccctgtgc

agccggtggc

cactacaccc

ccagcaccaa

gcacagccgc

ggaacagcgg

gcctgtacag

acatctgcaa

agagctgcga

ccgacgtgtt

aggtgacctg

acgtggacgg

gcacctaccg

aatacaagtg

aggccaaggg

tgaccaagaa

ccgtggagtg

tggacagcga

agcagggcaa

agaagagcct

gggccccagc

cctgggctgc

agccctgacc

cctgagcagc

cgtgaaccac

caagacccac

cctgttcccc

cgtggtggtg

cgtggaggtg

ggtggtgtcc

caaggtgtcc

ccagcccagg

ccaggtgtcc

ggagagcaac

cggcagcttc

cgtgttcagc

gagcctgtcc

gtgttccccc

ctggtgaagg

tccggcgtgc

gtggtgaccg

aagcccagca

acctgccccc

cccaagccca

gacgtgagcc

cacaacgcca

gtgctgaccg

aacaaggccc

gaaccccagg

ctgacctgtc

ggccagcccg

ttcctgtaca

tgcagcgtga

cccggcaagt

tggcccccag actacttccc acaccttccc tgcccagcag acaccaaggt cctgccctgc aggacaccct acgaggaccc agaccaagcc tgctgcacca tgcctgcccc tgtacaccct tggtgaaggg agaacaacta gcaagctgac tgcacgaggc ga

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1012

<210> 64

<211> 336

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64 Leu Val Thr 1

Leu Ala Pro

Cys Leu Val 35

Ser Gly Ala 50

Ser Ser Gly 65

Ser Leu Gly

Asn Thr Lys

His Thr Cys 115

Val Phe Leu 130

Thr Pro Glu 145

Glu Val Lys

Lys Thr Lys

Ser Val Leu 195

Lys Cys Lys 210 Ile Ser Lys 225

Pro Pro Ser

Val Ser 5

Ser Ser 20

Lys Asp

Leu Thr

Leu Tyr

Thr Gln 85

Val Asp 100

Pro Pro

Phe Pro

Val Thr

Phe Asn 165 Pro Arg 180

Thr Val Val Ser Ala Lys

Ser Ala Ser Thr Lys Ser Tyr Phe

Leu Val Lys

Asn Gly Gln 275

Ser Asp Gly 290

Arg Asp 245 Gly Phe 260

Pro Glu Ser Phe

Ser Gly

55 Ser Leu 70

Thr Tyr

Lys Lys

Cys Pro

Pro Lys 135 Cys Val 150

Trp Tyr

Glu Glu

Leu His

Asn Lys 215 Gly Gln 230

Glu Leu

Tyr Pro

Asn Asn

Phe Leu 295

Thr Ser

25 Pro Glu 40

Val His

Ser Ser

Ile Cys

Val Glu 105 Ala Pro 120

Pro Lys

Val Val

Val Asp

Gln Tyr 185 Gln Asp 200

Ala Leu

Pro Arg

Thr Lys

Ser Asp 265 Tyr Lys 280

Tyr Ser

Lys Gly Pro 10

Gly Gly Thr

Pro Val Thr

Thr Phe Pro 60

Val Val Thr 75

Asn Val Asn 90

Pro Lys Ser

Glu Leu Leu

Asp Thr Leu 140

Asp Val Ser 155

Gly Val Glu 170

Asn Ser Thr

Trp Leu Asn

Pro Ala Pro 220

Glu Pro Gln 235

Asn Gln Val 250

Ile Ala Val

Thr Thr Pro

Lys Leu Thr 300

Ser Val

Ala Ala

30 Val Ser 45

Ala Val

Val Pro

His Lys

Cys Asp 110 Gly Gly 125

Met Ile

His Glu

Val His

Tyr Arg 190 Gly Lys 205

Glu Glu

Val Tyr

Ser Leu

Glu Trp 270 Pro Val 285

Val Asp

Phe Pro 15

Leu Gly

Trp Asn

Leu Gln

Ser Ser 80 Pro Ser 95

Lys Thr

Pro Asp

Ser Arg

Asp Pro 160 Asn Ala 175

Val Val

Glu Tyr

Lys Thr

Thr Leu 240 Thr Cys 255

Glu Ser Leu Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 305 3io 315 320

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

32S 330 335

<210> 65 <211> 1012 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 65

actagtcacc

cagcaagagc

cgagcccgtg

cgccgtgctg

cagcctgggc

ggacaagaag

ccctgagctg

gatgatcagc

tgaggtgaag

ccgggaggaa

ggactggctg

cgaggaaaag

gcccccctcc

cttctacccc

caagaccacc

cgtggacaag

cctgcacaac

gtgagcagcg

accagcggcg

accgtgagct

cagagcagcg

acccagacct

gtggagccca

ctgggcggac

cggacccccg

ttcaattggt

cagtacaaca

aacggcaaag

accatcagca

cgggacgagc

agcgacatcg

ccccctgtgc

agccggtggc

cactacaccc

ccagcaccaa gcacagccgc ggaacagcgg gcctgtacag acatctgcaa agagctgcga ccgacgtgtt aggtgacctg acgtggacgg gcacctaccg aatacaagtg aggccaaggg tgaccaagaa ccgtggagtg tggacagcga agcagggcaa agaagagcct

gggccccagc cctgggctgc agccctgacc cctgagcagc cgtgaaccac caagacccac cctgttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg ggtggtgtcc caaggtgtcc ccagcccagg ccaggtgtcc ggagagcaac cggcagcttc cgtgttcagc gagcctgtcc

gtgttccccc ctggtgaagg tccggcgtgc gtggtgaccg aagcccagca acctgccccc cccaagccca gacgtgagcc cacaacgcca gtgctgaccg aacaaggccc gaaccccagg ctgacctgtc ggccagcccg ttcctgtaca tgcagcgtga cccggcaagt

tggcccccag actacttccc acaccttccc tgcccagcag acaccaaggt cctgccctgc aggacaccct acgaggaccc agaccaagcc tgctgcacca tgcctctgcc tgtacaccct tggtgaaggg agaacaacta gcaagctgac tgcacgaggc ga

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1012

<210> 66 <211> 336 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66 Leu Val Thr 1

Leu Ala Pro

Cys Leu Val 35

Ser Gly Ala 50

Ser Ser Gly 65

Ser Leu Gly

Asn Thr Lys

His Thr Cys 115

Val Phe Leu 130

Thr Pro Glu 145

Glu Val Lys

Lys Thr Lys

Ser Val Leu 195

Lys Cys Lys

Val

Ser 20 Lys

Leu

Leu

Thr

Val 100 Pro

Phe

Val

Phe

Pro 180 Thr

Val

Ser Ser 5

Ser Lys

Asp Tyr

Thr Ser

Tyr Ser 70

Gln Thr 85

Asp Lys

Pro Cys

Pro Pro

Thr Cys 150 Asn Trp 165

Arg Glu Val Leu Ser Asn

Ala Ser

Ser Thr

Phe Pro 40

Gly Val 55

Leu Ser

Tyr Ile

Lys Val

Pro Ala 120 Lys Pro 135

Val Val Tyr Val Glu Gln

Thr

Ser

25

Glu

His

Ser

Cys

Glu 105 Pro

Lys

Val

Asp

Tyr 185 Asp

His Gln 200 Lys Ala Leu

Lys 10 Gly

Pro

Thr

Val

Asn

90

Pro

Glu

Asp

Asp

Gly 170 Asn

Trp

Pro

Gly Pro Ser Val Gly Thr Val Thr

Phe Pro 60

Val Thr 75

Val Asn

Lys Ser

Leu Leu

Thr Leu 140 Val Ser 155

Val Glu Ser Thr Leu Asn Leu Pro

Ala Ala

30 Val Ser 45

Ala Val

Val Pro

His Lys

Cys Asp 110 Gly Gly 125

Met Ile

His Glu

Val His

Tyr Arg 190 Gly Lys 205

Glu Glu

Phe

15

Leu

Trp

Leu

Ser

Pro

95

Lys

Pro

Ser

Asp

Asn 175 Val

Glu

Lys

Pro

Gly

Asn

Gln

Ser 80 Ser

Thr

Asp

Arg

Pro 160 Ala

Val

Tyr

Thr 210 215 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 225 230 Pro Pro Ser Arg Asp 245 Glu Leu Thr Leu Val Lys Gly 260 Phe Tyr Pro Ser Asn Gly Gln 275 Pro Glu Asn Asn Tyr 280 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 290 295 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 305 310 Leu His Asn His Tyr 325 Thr Gln Lys

220

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 235 240

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

250 255

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 265 270

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 285

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 300

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 315 320

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 330 335

<210> 67 <211> 1419 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 67

atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagccag 60 gtgcagctgg tgcagagcgg agccgaggtg aagaagcctg gcgccagcgt caaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctacac cttcaccgac tactacatga actgggtgcg gcaggcccca 180 ggccagggac tggaatggat gggcaacatc aaccccaaca acggcggcac caactacaac 240 cagaagttca aggaccgggt caccatgacc accgacacca gcaccagcac cgcctacatg 300 gaactgcgga gcctgagaag cgacgacacc gccgtgtact actgcgcccg gtggatcctg 360 tactacggcc ggtccaagtg gtacttcgac gtgtggggca ggggcacact agtcaccgtg 420 agcagcgcca gcaccaaggg ccccagcgtg ttccccctgg cccccagcag caagagcacc 480 agcggcggca cagccgccct gggctgcctg gtgaaggact acttccccga gcccgtgacc 540 gtgagctgga acagcggagc cctgacctcc ggcgtgcaca ccttccccgc cgtgctgcag 600 agcagcggcc tgtacagcct gagcagcgtg gtgaccgtgc ccagcagcag cctgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaggtg 720 gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgccccccct gccctgcccc tgagctgctg 780 ggcggacccg acgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 840 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccctga ggtgaagttc 900 aattggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg ggaggaacag 960 tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 1020 ggcaaagaat acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccga ggaaaagacc 1080 atcagcaagg ccaagggcca gcccagggaa ccccaggtgt acaccctgcc cccctcccgg 1140 gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctgg tgaagggctt ctaccccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1260 cctgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 1320 cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380 tacacccaga agagcctgag cctgtccccc ggcaagtga 1419

<210> 68

<211> 472

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn ^ 7O 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

10C 105 no

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Ser Lys Trp Tyr

115 120 125

Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

13O 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

I95 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

26O 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350

Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 69

<211> 717

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 69

atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagcgac 60 atcgtgatga cccagagccc cctgagcctg cccgtgaccc ctggcgagcc cgccagcatc 120 agctgcagaa gcagccagag catcgtccag agcaacggcg acacctacct ggaatggtat 180 ctgcagaagc ccggccagtc cccccagctg ctgatctaca gagtgagcaa ccggttcagc 240 ggcgtgcccg acagattcag cggcagcggc tccggcaccg acttcaccct gaagatcagc 300

cgggtggagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgctttc aaggcagcca cgtgccctac 360

accttcggcc agggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggccgcccc cagcgtgttc 420

atcttccccc ccagcgatga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 480

aacaacttct acccccggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 540

ggcaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 600

agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 660

acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgctga 717

<210> 70 <211> 1422 <212> DNA <213> Homo sapiens

<4 00> 70

atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagccag 60 gtgcagctgg tgcagagcgg agccgaggtg aagaagcctg gcgccagcgt caaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctacac cttcaccgac tactacatga actgggtgcg gcaggcccca 180 ggccagggac tggaatggat gggcaacatc aaccccaaca acggcggcac caactacaac 240 cagaagttca aggaccgggt caccatgacc accgacacca gcaccagcac cgcctacatg 300 gaactgcgga gcctgagaag cgacgacacc gccgtgtact actgcgcccg gtggatcctg 360 tactacggcc ggtccaagtg gtacttcgac gtgtggggca ggggcacact agtgaccgtg 420 tccagcgcca gcaccaaggg ccccagcgtg ttccccctgg cccccagcag caagagcacc 480 agcggcggca cagccgccct gggctgcctg gtgaaggact acttccccga accggtgacc 540 gtgtcctgga acagcggagc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc cgtgctgcag 600 agcagcggcc tgtacagcct gagcagcgtg gtgaccgtgc ccagcagcag cctgggcacc 660 cagacctaca tctgtaacgt gaaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaggtg 720 gagcccaaga gctgtgacaa gacccacacc tgccccccct gccctgcccc cgagctgctg 780 ggaggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcctaagg acaccctgat gatcagcaga 840 acccccgagg tgacctgtgt ggtggtggat gtgagccacg aggaccctga ggtgaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aatgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 960 tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020 ggcaaggagt acaagtgtaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccctat cgagaaaacc 1080 atcagcaagg ccaagggcca gcccagagag ccccaggtgt acaccctgcc ccctagcaga 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1260 cctgtgctgg acagcgatgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 1320 agatggcagc agggcaacgt gttcagctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaatcac 1380 tacacccaga agagcctgag cctgtcccct ggcaagtgat ga 1422

Claims (38)

1. Anticorpo ou fragmento de Iigante de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que especificamente se liga em IGF-IR compreendendo CDRH3 de SEQ. ID. NO: 1 ou sua variante que contém 1 ou 2 substituições de aminoácido na CDRH3.

2. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácido de SEQ. ID. NO: 1 diferem por uma substituição em uma ou mais posições selecionadas de 7 e 9.

3. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácido de SEQ. ID. NO: 1 diferem por uma ou mais substituições selecionadas de R a S na posição 7 e K a R na posição 9.

4. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno adicionalmente compreende uma ou mais das seguintes seqüências CDRH2: SEQ. Π>. NO: 2 ou CDRHl: SEQ. ID. NO: 3, CDRL1: SEQ. ID. NO: 4, CDRL2: SEQ. ID. NCfc 7 e CDRL3: SEQ: Π). NCk 6.

5. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das CDR1S podem ser substituídas por uma variante das mesmas, cada CDR variante contendo 1 ou 2 substituições de aminoácido.

6. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender CDRHl de SEQ. ID. NO: 3.

7. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender CDRL2 de SEQ. ID. NO: 7.

8. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender as seguintes CDRs: CDRHl :SEQ. ID. NO: 3 CDRH2: SEQ. ID. NO: 2 CDRH3: SEQ. ID. NO: 1 CDRLl :SEQ. ID. NO: 4 CDRL2: SEQ. ID. NO: 7 CDRL3: SEQ. Π> NO: 6.

9. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que especificamente se liga em IGF-IR e compreende uma regiãa variável de cadeia pesada de SEQ. ID. NO: 8 e uma região variável de cadeia leve de SEQ. BD. NO: 9.

10. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fata de que especificamente se liga em IGF-IR e compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ. LD. NO: IOe uma região variável de cadeia leve de SEQ. ID. NO: 11.

11. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesma, caracterizado pelo fato de que especificamente se liga em IGF-IR e compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ. ID. NO: 12 e uma região variável de cadeia leve de SEQ. ID. NO: 13.

12. Anticorpo ou-fragmento de ligante de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que especificamente se liga em IGF-IR e compreende um domínio de regiãa variável de cadeia pesada de SEQ. ID. NO: 14 e um domínio de região variável de cadeia leve de SEQ. ID. NO: 16.

13. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que especificamente se liga em IGF-IR e compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ. ID. NO: 15 e uma região variável de cadeia leve de SEQ. ID. NO: 16.

14. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende CDRs como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou regiões variáveis de cadeia pesada ou leve como definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno é de rato, camundongo, primata (eg cinomolgo, macaco do Velho Mundo ou Macaco Antropóide Grande) ou humano.

15. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo - fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado.

16. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno adicionalmente se liga em IGF-IR de primata.

17. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante.

18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante de isótipo IgG.

19. Anticorpo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é IgGl.

20. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 19, caracterizado pelo fato de compreender uma região de domínio constante de tal modo que o anticorpo tem uma ADCC e/ou ativação de complemento ou funcionalidade efetora reduzida.

21. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 19, caracterizado pelo fato de compreender um domínio constante ou domínio constante mutado com um perfil de glicosilação alterado de tal modo que o anticorpo tem ativação de complemento e/ou ADCC / funções efetoras intensificadas.

22. Fragmento de ligante de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o fragmento é um Fab5 Fab1, F(ab')2, Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, minianticorpo, minicorpo, VH isolado ou VL isolado.

23. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou fragmento de ligante de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo é capaz de pelo menos alguma função efetora por exemplo onde ele é capaz de alguma função de ADCC ou CDC.

24. Célula hospedeira recombinante transformada, transfectada ou transduzida, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um cassete de expressão, por meio do qual dito cassete de expressão compreende um polinucleotídeo codificador de uma cadeia pesada de anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com a invenção aqui descrita e adicionalmente compreende um polinucleotídeo codificador de uma cadeia leve de anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com a invenção aqui descrita.

25. Célula hospedeira recombinante transformada, transfectada ou transduzida, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um cassete de expressão, por meio do qual um primeiro cassete de expressão compreende um polinucleotídeo codificador de uma cadeia pesada de anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com a invenção aqui descrita e adicionalmente compreende um segundo cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo codificador de uma cadeia leve de anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com a invenção aqui descrita.

26. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 24 ou reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a célula é eucariótica.

27. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a célula é de mamífero.

28. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a célula é CHO ou NSO.

29. Método para a produção de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou de fragmento de ligante de antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-22, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de cultivar a célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 24-28 em um meio de cultura livre de soro.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é secretado por dita célula hospedeira para dentro do meio de cultura.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo está adicionalmente purificado para pelo menos 95% ou mais (e.g. 98% ou mais) com respeito ao dito anticorpo contendo meio de cultura.

32. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes e um veículo farmaceuticamente aceitável.

33. Kit-de-partes, caracterizado pelo fato de compreender a composição como definida na reivindicação 32 juntamente com instruções para uso.

34. Uso de anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 33 ou de composição como definida na reivindicação 32, caracterizado pelo fato de ser para a produção de um medicamento para o tratamento de um paciente humano afligido com câncer.

35. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o paciente está afligido com câncer de mama.

36. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o paciente está afligido com câncer de próstata.

37. Uso de anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento de uma doença ou de um distúrbio selecionada(o) do grupo consistindo de: artrite reumatóide, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pulmão ou mieloma.

38. Anticorpo ou fragmento de ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que o anticorpo neutraliza a atividade de IGF-IR.