BRPI0709843A2 - anticorpos de anti-igf-1r e usos dos mesmos - Google Patents

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Abstract

<B>ANTICORPOS DE ANTI-IGF-1 R E USOS DOS MESMOS<D>A presente invenção refere-se a anticorpos que ligam a receptor de fator-1 de crescimento semelhante à insulina (IGF-1R) e uso dos mesmos, em particular na diagnose e tratamento de câncer. Os anticorpos monocIonais humanos e murinos específicos que inibem a pró-sobrevivência mediada por IGF-1R e vias de proliferação do tumor, e variantes, fragmentos, e derivados dos mesmos, são fornecidos. Também fornecidos são anti-corpos monoclonais humanos e murinos específicos que bloqueiam a habilidade dos ligandos, fator-1 de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) e fator-2 de crescimento semelhante à insulina (IGF-2) de ligarem a IGF-1 R, como também fragmentos, variantes e derivados de tais anticorpos. A invenção também inclui polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou fragmentos acima, variantes ou derivados dos mesmos, como também vetores e células hospedeiras que compreendem tais polinucleotídeos. A invenção tam- bém inclui métodos de diagnosticar e tratar câncer usando anticorpos da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR-POS DE ANTI-IGF-1R E USOS DOS MESMOS".
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Vários estudos epidemiológicos mostraram que níveis circulan-tes mais altos que normais de IGF-1 são associados a risco aumentado paravários cânceres comuns, incluindo mama (Hankinson et al, Lancet 1998.351:1393-6), próstata (Chan et al, Sciencè. 1998. 279:563-6), pulmão (Yu etal, J. Natl. Câncer Inst. 1999. 91:151-6) e cânceres colorretais (Ma et al, J.Natl. Câncer Inst. 1999. 91:620-5). Níveis circulantes elevados de IGF-2 fo-ram também mostrados ser associados a risco aumentado para câncer en-dometrial (Jonathan et al, Câncer Biomarker & Prevention. 2004. 13:748-52).Pelo contrário, correlação inversa foi observada com níveis elevados de umadas proteínas Iigadoras de IGF, IGF-BP3, e risco de câncer. Além disso, ní-veis elevados de IGFs têm também sido encontrados em pacientes de cân-cer (Peyrat et al Eur. J. Câncer. 1993. 351:1393-6; Jonathan et al, CâncerBiomarker & Prevention. 2004. 13:748-52).
Sistema de IGF desempenha um papel importante na regulaçãoda proliferação, diferenciação, apoptose e transformação das células (Joneset al, Endocrinology Rev. 1995. 16:3-34). O sistema de IGF compreende doistipos de receptores não relacionados, receptor de fator de crescimento insu-lino-símile 1 (IGF-1R; CD221) e receptor de fator de crescimento insulino-símile 2 (IGF-2R; CD222); dois ligantes, fator de crescimento insulino-símile1 (IGF-1 e IGF-2); várias proteínas Iigadoras de IGF (IGFBP-1 a IGFBP-6).Além disso, um grupo grande de IGFBP proteases (por exemplo: caspases,metaloproteinases, antígeno próstata-específico) hidrolizam IGF ligado aIGFBP para liberar IGFs livres que depois interagem com IGF-1 R e IGF-2R.O sistema de IGF é também intimamente conectado à insulina e ao receptorde insulina (InsR) (Moschos et al. Oncology 2002. 63:317-32; Baserga et al.,Int J. Câncer. 2003. 107:873-77; Pollak et al., Nature Reviews Câncer. 2004.4:505-516).
Em uma célula cancerosa, receptor de tirosina cinases (TK) re-presenta um papel importante na conexão do microambiente tumoral extra-celular com as vias de sinalização intracelulares que controlam as diversasfunções celulares, tais como, ciclo de divisão celular, sobrevivência, apopto-se, expressão de gene, arquitetura citoesquelética, adesão das células, emigração celular. Uma vez que os mecanismos que controlam a sinalizaçãocelular estão melhores entendidos, estratégias terapêuticas de interromperuma ou mais destas funções celulares poderiam ser desenvolvidas alvejan-do no nível da ligação do ligante, expressão/reciclagem do receptor, ativaçãodo receptor e as proteínas envolvidas nos eventos de sinalização (Hanahane Weinberg, Cell 2000. 100:57-70).
O receptor de fator de crescimento insulino-símile do tipo I (IGF-1R, CD221) pertence à família do receptor de tirosina cinase (RTK), (Ullrichet al., Cell. 1990, 61:203-12). IGF-1R é expresso amplamente e seus Iigan-tes, IGF-1 e IGF-2 representam um papel significativo no desenvolvimentopré e pós-natal, responsividade do hormônio de crescimento, transformaçãodas células, sobrevivência, e foi implicado na aquisição de um fenótipo detumor invasivo e metastático (Baserga, Cell. 1994. 79:927-30; Baserga et al.,Exp. Cell Res. 1999. 253:1-6, Baserga et al., Int J. Câncer. 2003. 107:873-77). Estudos imunoistoquímicos mostraram que vários tumores humanosexpressam níveis mais altos de IGF-1R.
A arquitetura molecular de IGF-1 R compreende duas subunida-des α extracelulares (130-135 kD) e duas subunidades β que atravessam amembrana (95 kD) que contêm o domínio da cinase catalítica citoplásmica.IGF-1 R, como o receptor de insulina (InsR), difere dos outros membros dafamília de RTK tendo estruturas diméricas covalentes (α2β2). Estruturalmen-te, IGF-1 R é relacionado altamente com InsR (Pierre De Meyts e Whittaker,Nature Reviews Drug Discovery. 2002, 1: 769-83). IGF-1 R contém 84 %deidentidade de seqüência a InsR no domínio da cinase, enquanto que a jus-tamembrana e as regiões c-terminais compartilham 61 %e 44 %de identida-de de seqüência, respectivamente (Ulrich et al., EMBO J., 1986, 5:2503-12;Blakesley et al., Cytokine Growth Factor Rev., 1996. 7:153-56).
O IGF-1 e IGF-2 são os dois Iigantes de ativação de IGF-1 R. Aligação de IGF-1 e IGF-2 à cadeia α induz alterações conformacionais queresultam em autofosforilação de cada cadeia β nos resíduos de tirosina es-pecíficos, convertendo o receptor do estado não-fosforilado para o estadoativo. A ativação de três resíduos de tirosina na alça de ativação (resíduosde Tyr em 1131, 1135 e 1136) do domínio de cinase leva ao aumento naatividade cataiítica que desencadeia atracagem e fosforilação dos substratostais como proteínas adaptadoras de IRS-1 e Shc. Ativação destes substratosleva à fosforilação de proteínas adicionais envolvidas na cascata de sinaliza-ção de sobrevivência (PI3K, AKT1 TOR, S6) e/ou proliferação (proteína cina-se ativada por mitógeno, p42/p44) (Pollak et al., Nature Reviews Câncer.2004. 4:505-516; Baserga et al., Biochem Biophys Act. 1997. 1332:F105-F126; Baserga et al, Int. J. Câncer. 2003. 107:873-77).
Apesar do grau alto de homologia entre IGF-1R e InsR, evidên-cia sugere que os dois receptores têm papéis biológicos distintos; InsR é umregulador fundamental das funções fisiológicas tais como transporte de gli-cose e biossíntese de glicogênio e gordura, enquanto que o IGF-1R é umregulador potente de crescimento e diferenciação das células. Em contrastecom InsR, IGF-1R é ubiquamente expresso em tecidos onde representa umpapel no crescimento de tecido, sob o controle do hormônio de crescimentoJ (GH), que modula IGF-1. Embora a ativação de IGF-1R tenha sido mostradapromover crescimento de células normais, evidência experimental sugereque IGF-1 R não seja um requerimento absoluto (Baserga et al, Exp CellRes. 1999. 253:1-6; Baserga et al, Int. J. Câncer. 2003. 107:873-77).
IGFs representam um papel crucial na regulação da proliferação,diferenciação e apoptose das células. Inibição da sinalização mediada porIGF-1 R foi mostrada reduzir a taxa de crescimento do tumor, aumentar a -poptose, aumentar morte dos tumores por quimioterapia e outras terapiasmoleculares alvos (revisado em Pollak et al., Nature Reviews Câncer. 2004.4:505-516; Zhang et al., Breast Câncer Res. 2000. 2:170-75; Chakravarti etal, Câncer Res. 2002. 62:200-07).
Métodos experimentais empreendidos para inibir a função deIGF-1 R em tumores forneceram encorajamento mas sucesso limitado, e suaeficácia em tratar câncer ainda é para ser determinada na clínica. Os méto-dos experimentais incluem: anticorpos para IGF-1R (Kull et al., J. Biol.Chem. 1983, 258:6561-66; Kalebic et al., Câncer Res. 1994. 54:5531-4), an-ticorpos de neutralização para IGF-1 ou IGF-2 (Fang et al, Mol. Câncer The-rapy. 2006. 5:114-20; Miyamoto et al, Clin. Câncer Res. 2005, 11:3494-502),inibidores de tirosina cinase de molécula pequena (Garcia-Escheverria et al,Câncer Cell. 2004. 5:231-9; Scotlandi et al, Câncer Res. 2005. 65:3868-76),oligonucleotídeos de anti-sentido (Shapiro et al, J. Clin. Invest. 1994.94:1235-42; Wraight et al. Nature Biotech. 2000. 18:521-26; Scotlandi et al,Câncer Gene Therapy. 2002. 9:296-07), mutantes negativos dominantes deIGF-1R (Prager et al, Proc. Natl. Acad. Sei. 1994, 91:2181-85; Kalebic et al.,Int. J. Câncer 1998. 76:223-7; Scotlandi et al., Int. J. Câncer. 2002:101:11-6),análogos do Iigante de IGF (Pietrzkowski et al, Mol. Cell. Biol. 1992.12:3883-89), proteínas Iigadoras de IGF recombinante (Yee et al. 8804-9386Cell Growth Differ. 1994. 5:73-77; Van Den Berg et al, Eur. J. Câncer. 1997,33:1108-1113; Jerome et al AACR 2004, Abstract #5334), antagonistas dohormônio de liberação de GH, GHRH (Szereday et al, Câncer Res. 2003.63:7913-19; Letsh et al, Proc Natl. Acad. Sei. USA. 2003. 100:1250-55) e GH(Kopchick et al, 2002. Endocr. Rev. 23, 623-46).
A habilidade de um anticorpo para inibir a função de IGF-1 R foidemonstrada primeiro com um anticorpo monoclonal de camundongo (a-IR3)alvejando um epítopo desconhecido na subunidade α de IGF-1 R (Kull et al.,J. Biol. Chem. 1983, 258:6561-66). Subseqüentemente outros anticorposdesenvolvidos para a subunidade α de IGF-1 R foram mostrados inibir a fun-ção de IGF-1 R em graus variados em diferentes modelos experimentais decâncer (Maloney et al. Câncer Res. 2003. 63: 5073-83; Burtrum et al, CâncerRes. 2003. 63:8912-21; Sachdev D et al, Câncer Res.2003. 63, 627-35; Co-hen et al, Clin. Câncer Res. 2005. 11:3065-74; Goetsch et al, Intl. J. Câncer.2005. 113:316-28. Lu et al, J. Biol. Chem. 2004. 280:19665-72).
Em uma célula de câncer, além da sinalização de pró-sobrevivência e proliferativa, ativação de IGF-1 R foi também mostrada estarenvolvida na motilidade e invasão (Ress et al., Oncogene 2001. 20:490-00,Nolan et al, Int. J. Câncer. 1997.72:828-34, Stracke et al, J. Biol. Chem.1989. 264:21544-49; Jackson et al, Oncogene, 2001. 20:7318-25).
Células tumorais foram mostradas produzir um ou mais doscomponentes do sistema de IGF (IGF-1, IGF-2, IGF-1R, IGF-2R e IGF-bps).Embora estudos in vitro indicassem que tumores podem produzir IGF-1 ouIGF-2, estudos translacionais indicam que IGF-2 é o IGF mais relevante ecomumente expresso nos tumores. Isto é devido à perda de gravação (LOI)do alelo de IGF-2 silenciado no tumor por alterações epigenéticas, resultan-do na expressão bialélica do gene de IGF-2 (Fienberg et al., Nat. Rev. Cân-cer 2004. 4:143-53; Giovannucci et al, Horm. Metab. Res. 2003. 35:694-04;De Souza et al, FASEB J. et al, 1997. 11:60-7). Isto por sua vez resulta emfornecimento de IGF-2 aumentado para células de câncer e para o microam-biente suportando o crescimento do tumor.
Os tumores sensíveis a IGF-1 R recebem os sinais da ativaçãodo receptor de IGF-1 da circulação (produzidos pelo fígado) e de IGF-2 dotumor, e desse modo, os métodos visados no rompimento da atividade bio-lógica mediada por IGF-1 e IGF-2 deveriam fornecer uma resposta anti-tumor melhor. Portanto, os métodos de anticorpo de anti-IGF-1R que efi-cazmente bloqueiam as funções biológicas mediadas por IGF-1 e IGF-2 po-dem fornecer uma eficácia melhorada sobre os outros métodos que não efi-cientemente bloqueiam as funções biológicas da sinalização de IGF-1 R me-diada tanto por IGF-1 como por IGF-2 no microambiente de tumor.
Com respeito à segurança, IGF-1 R é ubiquamente expresso e,desse modo, os anticorpos que alvejam IGF-1 R deveriam ter função efetoramínima ou nenhuma para evitar as toxicidades que resultam das atividadesde ADCC e CDC nos tecidos normais. Uma possibilidade de desenvolvertais anticorpos é ter a forma não-glicosilada da região de Fc gama 4 humanaque não medeia as funções de ADCC ou CDC.
IGF-1 R está envolvido na transformação celular mediada poroncogene.
Ativação de IGF/IGF-1R medeia sinalização mitogênica e de pró-sobrevivência em célula de câncer.
Ativação de IGF-1 R também promove motilidade e metástasedas células.
IGF-1R é supra-expresso em muitos cânceres.
Indivíduos com níveis de IGF circulante mais altos que normalaumentaram o risco para câncer em desenvolvimento.
Níveis de plasma aumentados de IGF 1 & 2 foram encontradosem muitos pacientes de câncer.
Tumores humanos produzem IGF-2 como um fator de cresci-mento autócrino.
Inibição do crescimento tumoral foi demonstrada como agentesimples e em combinação com agentes quimioterapêuticos e biológicos.
Continua uma necessidade na técnica por anticorpos de IGF-1Rcom características diferentes ou melhoradas de ligação, eficácia, e de segu-rança para o tratamento de várias doenças neoplásticas incluindo câncer esua metástase.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção é com base no papel importante do sistemade IGF na regulação da proliferação, diferenciação, apoptose e transforma-ção das células. Em particular, receptor de fator de crescimento insulino-símile do tipo I (IGF-1R) e seus ligantes, IGF-1 e IGF-2, representam umpapel significativo no desenvolvimento pré e pós-natal, responsividade dohormônio de crescimento, transformação da célula, sobrevivência, e foi im-plicado na aquisição de um fenótipo de tumor invasivo e metastático. A in-venção refere-se em geral a anticorpos de IGF-1 R, fragmentos de ligação deantígeno ou derivados dos mesmos. Certos anticorpos de IGF-1 R e frag-mentos ligação de antígeno inibem a função de IGF-1 R ou bloqueiam asfunções biológicas da sinalização de IGF-1 R mediada por IGF-1 e IGF-2.Adicionalmente, a invenção em geral refere-se a métodos para tratar váriasdoenças neoplásticas incluindo câncer e metástase, como também váriasdoenças, distúrbios ou lesões hiperproliferativas associadas à sinalização deIGF-1 R.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamenteliga ao mesmo epítopo de IGF-R1 como um fragmento do anticorpo de Fabmonocional de referência selecionado do grupo que consiste em M13-C06,M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo mo-nocional de referência produzido por um hibridoma selecionado do grupoque consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11,Ρ1 E2.3B12, e P1G10.2B8.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamenteliga a IGF-R1 onde o anticorpo ou fragmento competitivamente inibe umfragmento de anticorpo de Fab monocional de referência selecionado dogrupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, eM12-G04, ou um anticorpo monocional de referência produzido por um hibri-doma selecionado do grupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8,Ρ1 A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8 de ligar a IGF-R1.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamenteliga a IGF-R1 onde o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende umdomínio de ligação de antígeno idêntico ao de um fragmento monocional deanticorpo de Fab selecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monocio-nal produzido por um hibridoma selecionado do grupo que consiste emP2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1 onde a re-gião variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo ou fragmento do mesmocompreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 %idêntica a umaseqüência de aminoácido de referência selecionada do grupo que consisteem: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ IDNO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48,SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 63.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1 onde a re-gião variável de cadeia leve (VL) do anticorpo ou fragmento do mesmo com-preende uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 %idêntica a uma se-qüência de aminoácido de referência selecionada do grupo que consiste em:SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ IDNO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108,SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 118.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VHdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de ami-noácido idêntica, com exceção de 20 ou menos substituições conservadorasde aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de referência selecionadado grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ IDNO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 63.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VLdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de ami-noácido idêntica, com exceção de 20 ou menos substituições conservadorasde aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de referência selecionadado grupo que consiste em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78,SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ IDNO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 118.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VHdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de ami-noácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ IDNO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, eSEQ ID NO: 63.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VLdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de ami-noácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 68, SEQ IDNO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93,SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, e SEQID NO: 118.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VHe VL do anticorpo ou fragmento do mesmo compreendem, respectivamente,as seqüências de aminoácido pelo menos 90 %idênticas às seqüências deaminoácido de referência selecionadas do grupo que consiste em: SEQ IDNO: 4 e SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 eSEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 e SEQ IDNO: 88; SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 98;SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 108; SEQID NO: 53 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 113; e SEQ IDNO: 63 e 118.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VHe VL do anticorpo ou fragmento do mesmo compreendem, respectivamente,as seqüências de aminoácido idênticas, com exceção de 20 ou menos subs-tituições conservadoras de aminoácido cada, às seqüências de aminoácidode referência selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4 e SEQID NO: 68; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO:78; SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 88;SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 98; SEQ IDNO: 43 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO:53 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 113; e SEQ ID NO: 63e 118.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VHe VL do anticorpo ou fragmento do mesmo compreendem, respectivamente,as seqüências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em: SEQID NO: 4 e SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14e SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 e SEQID NO: 88; SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO:98; SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 108;SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 113; eSEQ ID NO: 63 e 118.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VHdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de ami-noácido da região de determinação de complementaridade de cadeia pesa-da de Kabat 1 (VH-CDR1) idêntica, com exceção de duas ou menos substi-tuições de aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de VH-CDR1 dereferência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33,SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ IDNO: 59, e SEQ ID NO: 64. Em outras modalidades, a seqüência de aminoá-cido de VH-CDR1 é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ IDNO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54,SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO: 64.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VHdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de ami-noácido da região de determinação de complementaridade de cadeia pesa-da de Kabat 2 (VH-CDR2) idêntica, com exceção de quatro ou menos substi-tuições de aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de VH-CDR2 dereferência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34,SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ IDNO: 60, e SEQ ID NO: 65. Em outras modalidades, a seqüência de aminoá-cido de VH-CDR2 é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ IDNO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55,SEQ ID NO: 60, e SEQ ID NO: 65.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VHdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de ami-noácido da região de determinação de complementaridade de cadeia pesa-da de Kabat 3 (VH-CDR3) idêntica, com exceção de quatro ou menos substi-tuições de aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de VH-CDR3 dereferência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 7, SEQ IDNO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35,SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ IDNO: 61, e SEQ ID NO: 66. Em outras modalidades, a seqüência de aminoá-cido de VH-CDR3 é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ IDNO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56,SEQ ID NO: 61, e SEQ ID NO: 66.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VLdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de ami-noácido da região de determinação de complementaridade de cadeia leve deKabat 1 (VL-CDR1) idêntica, com exceção de quatro ou menos substituiçõesde aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de VL-CDR1 de referênciaselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74,SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ IDNO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114, e SEQ ID NO:119. Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido de VL-CDR1 éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74,SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ IDNO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114, e SEQ ID NO:119.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VLdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de ami-noácido da região de determinação de complementaridade de cadeia leve deKabat 2 (VL-CDR2) idêntica, com exceção de duas ou menos substituiçõesde aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de VL-CDR2 de referênciaselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75,SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ IDNO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115, e SEQ IDNO: 120. Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido de VL-CDR2é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75,SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ IDNO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115, e SEQ IDNO: 120.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VLdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de ami- noácido da região de determinação de complementaridade de cadeia leve deKabat 3 (VL-CDR3) idêntica, com exceção de quatro ou menos substituiçõesde aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de VL-CDR3 de referênciaselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76,SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ IDNO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116, e SEQ IDNO: 121. Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido de VL-CDR3é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76,SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ IDNO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116, e SEQ IDNO: 121.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VHdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende seqüências de aminoáci-do de VH-CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3 selecionadas do grupo que consis-te em: SEQ ID NOs: 5, 6, e 7; SEQ ID NOs: 10, 11, e 12; SEQ ID NOs: 15,16, e 17; SEQ ID NOs: 21, 22, e 23; SEQ ID NOs: 27, 28, e 29; SEQ ID NOs:33, 34, e 35; SEQ ID NOs: 39, 40, e 41;. SEQ ID NOs: 44, 45, e 46; SEQ IDNOs: 49, 50, e 51; SEQ ID NOs: 54, 55, e 56; SEQ ID NOs: 59, 60, e 61; eSEQ ID NOs: 64, 65, e 66, com exceção de uma, duas, três, ou quatro subs-tituições de aminoácido em pelo menos uma das ditas VH-CDRs.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VHdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende seqüências de aminoáci-do de VH-CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3 selecionadas do grupo que consis-te em: SEQ ID NOs: 5, 6, e 7; SEQ ID NOs: 10, 11, e 12; SEQ ID NOs: 15,16, e 17; SEQ ID NOs: 21, 22, e 23; SEQ ID NOs: 27, 28, e 29; SEQ ID NOs:33, 34, e 35; SEQ ID NOs: 39, 40, e 41;. SEQ ID NOs: 44, 45, e 46; SEQ IDNOs: 49, 50, e 51; SEQ ID NOs: 54, 55, e 56; SEQ ID NOs: 59, 60, e 61; eSEQ ID NOs: 64, 65, e 66.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VLdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende as seqüências de amino-ácido de VL-CDR1, VL-CDR2, e VL-CDR3 selecionadas do grupo que con-siste em: SEQ ID NOs: 69, 70, e 71; SEQ ID NOs: 74, 75, e 76; SEQ IDNOs: 79, 80, e 81; SEQ ID NOs: 84, 85, e 86; SEQ ID NOs: 89, 90, e 91;SEQ ID NOs: 94, 95, e 96; SEQ ID NOs: 99, 100, e 101; SEQ ID NOs: 104,105, e 106; SEQ ID NOs: 109, 110, e 111; SEQ ID NOs: 114, 115, e 116; eSEQ ID NOs: 119, 120, e 121, com exceção de uma, duas, três, ou quatrosubstituições de aminoácido em pelo menos uma das ditas VL-CDRs.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo iso-lado ou fragmento do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde a VLdo anticorpo ou fragmento do mesmo compreende as seqüências de amino-ácido de VL-CDR1, VL-CDR2, e VL-CDR3 selecionadas do grupo que con-siste em: SEQ ID NOs: 69, 70, e 71; SEQ ID NOs: 74, 75, e 76; SEQ IDNOs: 79, 80, e 81; SEQ ID NOs: 84, 85, e 86; SEQ ID NOs: 89, 90, e 91;SEQ ID NOs: 94, 95, e 96; SEQ ID NOs: 99, 100, e 101; SEQ ID NOs: 104,105, e 106; SEQ ID NOs: 109, 110, e 111; SEQ ID NOs: 114, 115, e 116; eSEQ ID NOs: 119, 120, e 121.
Em várias modalidades dos anticorpos acima descritos ou frag-mentos dos mesmos, as regiões de estrutura de VH e/ou regiões de estrutu-ra de VL são humanas, com exceção de cinco ou menos substituições deaminoácido.
Em algumas modalidades, os anticorpos acima descritos oufragmentos dos mesmos ligam a um epítopo linear ou um epítopo de con-formação não-linear.
Em algumas modalidades, os anticorpos acima descritos oufragmentos dos mesmos são muItivalentes, e compreendem pelo menos du-as cadeias pesadas e pelo menos duas cadeias leves.
Em algumas modalidades, os anticorpos acima descritos oufragmentos dos mesmos são multiespecíficos. Em outras modalidades, osanticorpos acima descritos ou fragmentos dos mesmos são biespecíficos.
Em várias modalidades dos anticorpos acima descritos ou frag-mentos dos mesmos, os domínios variáveis de cadeia pesada e leve sãocompletamente humanos. Em outras modalidades, os domínios variáveis decadeia pesada e leve são de um fragmento monoclonal de anticorpo de Fabselecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04.
Em várias modalidades dos anticorpos acima descritos ou frag-mentos dos mesmos, os domínios variáveis de cadeia pesada e leve sãomurinos. Em outras modalidades, os domínios variáveis de cadeia pesada eleve são de um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma selecio-nado do grupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11,20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8.
Em várias modalidades, os anticorpos acima descritos ou frag-mentos dos mesmos são humanizados.
Em várias modalidades, os anticorpos acima descritos ou frag-mentos dos mesmos são quiméricos.
Em várias modalidades, os anticorpos acima descritos ou frag-mentos dos mesmos são de primatas.
Em várias modalidades, os anticorpos acima descritos ou frag-mentos dos mesmos são completamente humanos.Em certas modalidades, os anticorpos acima descritos ou frag-mentos dos mesmos são fragmentos Fab1 fragmentos Fab1, fragmentosF(ab)2, ou fragmentos Fv.
Em certas modalidades, os anticorpos acima descritos são anti-corpos de cadeia simples.
Em certas modalidades, os anticorpos acima descritos ou frag-mentos dos mesmos compreendem regiões constantes de cadeia leve sele-cionadas do grupo que consiste em uma região constante capa humana eum região constante Iambda humana.
Em certas modalidades, os anticorpos acima descritos ou frag-mentos dos mesmos compreendem uma região constante de cadeia pesadaou fragmento da mesma. Em outras modalidades, a região constante de ca-deia pesada ou fragmento da mesma é lgG4 humana. Em certas outras mo-dalidades, a lgG4 é mutagenizada para remover os sítios de glicosilação.Em outras modalidades, as mutações de lgG4 compreendem S241P eT318A, usando o sistema de numeração de Kabat.
Em algumas modalidades, os anticorpos acima descritos oufragmentos dos mesmos especificamente ligam a um polipeptídeo de IGF-R1 ou fragmento do mesmo, ou uma variante de polipeptídeo de IGF-R1,com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) queé menor que a K0 para o dito anticorpo monoclonal de referência. Em outrasmodalidades, a constante de dissociação (K0) não é maior que 5 χ 10"2 Μ,10~2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10'5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ,10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ,10"10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ 10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, ΙΟ-14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em algumas modalidades, os anticorpos acima descritos oufragmentos dos mesmos preferencialmente ligam a um polipeptídeo de IGF-R1 humano ou fragmento do mesmo, com relação a um polipeptídeo de IGF-R1 murino ou fragmento do mesmo ou um polipeptídeo de IGF-R1 primatanão-humano ou fragmento do mesmo.
Em certas outras modalidades, os anticorpos acima descritos oufragmentos dos mesmos ligam a polipeptídeo de IGF-R1 humano ou frag-mento do mesmo, e também ligam a um polipeptídeo de IGF-R1 primatanão-humano ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, os anticorpos acima descritos oufragmentos dos mesmos ligam a IGF-R1 expressado na superfície de umacélula. Em outras modalidades, a célula é uma célula maligna, uma célulaneoplástica, uma célula tumoral, ou uma célula metastática.
Em algumas modalidades, os anticorpos acima descritos oufragmentos dos mesmos bloqueiam fator de crescimento de insulina de ligara IGF-R1. Em outras modalidades, o fator de crescimento de insulina é fatorde crescimento de insulina-1 (IGF-1) ou fator de crescimento de insulina-2(IGF-2). Em certas modalidades, os anticorpos acima descritos ou fragmen-tos dos mesmos bloqueiam IGF-1 e IGF-2 de ligarem a IGF-R1.
Em algumas modalidades, os anticorpos acima descritos oufragmentos dos mesmos inibem proliferação de célula mediada por IGF-R1,fosforilação de IGF-R1 mediada por IGF-1 ou IGF-2, crescimento de célulatumoral, ou internalização de IGF-R1.
Em outras modalidades, os anticorpos acima descritos ou frag-mentos dos mesmos também compreendem um polipeptídeo heterólogofundido com este.
Em algumas modalidades, os anticorpos acima descritos oufragmentos dos mesmos são conjugados com um agente selecionado dogrupo que consiste em agente citotóxico, um agente terapêutico, agente ci-toestático, uma toxina biológica, um pró-medicamento, um peptídeo, umaproteína, uma enzima, um vírus, um lipídio, um modificador de resposta bio-lógica, agente farmacêutico, uma linfocina, um anticorpo heterólogo ou frag-mento do mesmo, uma marcação detectável, polietileno glicol (PEG), e umacombinação de dois ou mais de qualquer dito agente. Em outras modalida-des, o agente citotóxico é selecionado do grupo que consiste em um radio-nuclídeo, uma biotoxina, uma toxina enzimaticamente ativa, um agente cito-estático ou terapêutico citotóxico, uns pró-medicamentos, um ligando imuno-Iogicamente ativo, um modificador de resposta biológica, ou uma combina-ção de dois ou mais de qualquer dito agente citotóxico. Em outras modalida-des, a marcação detectável é selecionada do grupo que consiste em umaenzima, uma marcação fluorescente, uma marcação quimioluminescente,uma marcação bioluminescente, uma marcação radioativa, ou uma combi-nação de dois ou mais de qualquer dita marcação detectável.
Em modalidades adicionais, a invenção inclui composiçõescompreendendo os anticorpos acima descritos ou fragmentos dos mesmos,e um veículo.
Certas modalidades da invenção incluem um polinucleotídeoisolado compreendendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo deVH de anticorpo onde a seqüência de aminoácido do polipeptídeo de VH épelo menos 90 %idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência se-lecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ IDNO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38,SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, e SEQ IDNO: 63; e onde um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mes-mo especificamente compreendendo o polipeptídeo de VH liga a IGF-R1.Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido do polipeptídeo de VH éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, e SEQID NO: 63.
Em certas modalidades, a seqüência de nucleotídeo que codificao polipeptídeo de VH é otimizada para expressão aumentada sem alterar aseqüência de aminoácido do polipeptídeo de VH. Em outras modalidades, aotimização compreende identificação e remoção dos sítios doadores de spli-ce e aceitantes de splice e/ou otimização do uso do códon para as célulasque expressam o polinucleotídeo. Em outras modalidades, o ácido nucléicocompreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que con-siste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ IDNO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 47,SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 57, e SEQ ID NO: 62.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um polinucleotí-deo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeode VL de anticorpo, onde a seqüência de aminoácido do polipeptídeo de VLé pelo menos 90 %idêntica a uma seqüência de aminoácido de referênciaselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73,SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ IDNO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO:118; e onde um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmoespecificamente compreendendo o polipeptídeo de VL liga a IGF-R1. Emoutras modalidades, a seqüência de aminoácido do polipeptídeo de VL éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73,SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ IDNO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO:118.
Em certas modalidades, a seqüência de nucleotídeo que codificao polipeptídeo de VL é otimizada para expressão aumentada sem alterar aseqüência de aminoácido do dito polipeptídeo de VL. Em outras modalida-des, a otimização compreende identificação e remoção dos sítios doadoresde splice e aceitantes de splice e/ou otimização do uso do códon para ascélulas que expressam o polinucleotídeo. Em outras modalidades, o ácidonucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupoque consiste em: SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 77, SEQ IDNO: 82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 102,SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 112, e SEQ ID NO: 117.
Em certas outras modalidades, a invenção fornece um polinu-cleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica um poli-peptídeo de VH de anticorpo onde a seqüência de aminoácido do polipeptí-deo de VH é idêntica, com exceção de 20 ou menos substituições conserva-doras de aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de referência sele-cionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ IDNO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38,SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, e SEQ IDNO: 63; e onde um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mes-mo especificamente compreendendo o dito polipeptídeo de VH liga a IGF-R1.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um polinucleotí-deo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeode VL de anticorpo, onde a seqüência de aminoácido do polipeptídeo de VLé idêntica, com exceção de 20 ou menos substituições conservadoras deaminoácido, a uma seqüência de aminoácido de referência selecionada dogrupo que consiste em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78,SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ IDNO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 118; e em queum anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo especifica-mente compreendendo o dito polipeptídeo de VL liga a IGF-R1.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um polinucleotí-deo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma seqüênciade aminoácido de VH-CDR1 idêntica, com exceção de duas ou menos subs-tituições de aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de VH-CDR1 dereferência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33,SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ IDNO: 59, e SEQ ID NO: 64; e onde um anticorpo ou fragmento de ligação deantígeno do mesmo especificamente compreendendo a VH-CDR1 liga aIGF-R1. Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido de VH-CDR1 éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, e SEQID NO: 64.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um polinucleotí-deo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma seqüênciade aminoácido de VH-CDR2 idêntica, com exceção de quatro ou menossubstituições de aminoácido, a uma referência seqüência de aminoácido deVH-CDR2 selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34,SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ IDNO: 60, e SEQ ID NO: 65; e onde um anticorpo ou fragmento de ligação deantígeno do mesmo especificamente compreendendo a VH-CDR2 liga aIGF-R1. Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido de VH-CDR2 éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60, e SEQID NO: 65.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um polinucleotí-deo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma seqüênciade aminoácido de VH-CDR3 idêntica, com exceção de quatro ou menossubstituições de aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de VH-CDR3de referência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 7, SEQ IDNO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35,SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ IDNO: 61, e SEQ ID NO: 66; e onde um anticorpo ou fragmento de ligação deantígeno do mesmo especificamente compreendendo a VH-CDR3 liga aIGF-R1. Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido de VH-CDR3 éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61, e SEQID NO: 66.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um polinucleotí-deo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma seqüênciade aminoácido de VL-CDR1 idêntica, com exceção de quatro ou menossubstituições de aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de VL-CDR1de referência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 69, SEQID NO: 74, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114, eSEQ ID NO: 119; e onde um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo especificamente compreendendo a VL-CDR1 liga a IGF-R1. Emoutras modalidades, a seqüência de aminoácido de VL-CDR1 é selecionadado grupo que consiste em: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 79,SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQ IDNO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114, e SEQ ID NO: 119.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um polinucleotí-deo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma seqüênciade aminoácido de VL-CDR2 idêntica, com exceção de duas ou menos subs-tituições de aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de VL-CDR2 dereferência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 70, SEQ IDNO: 75, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95,SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115, eSEQ ID NO: 120; e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antíge-no do mesmo especificamente compreendendo a dita VL-CDR2 liga a IGF-R1. Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido de VL-CDR2 é se-lecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115, e SEQ ID NO:120.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um polinucleotí-deo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma seqüênciade aminoácido de VL-CDR3 idêntica, com exceção de quatro ou menossubstituições de aminoácido, a uma seqüência de aminoácido de VL-CDR3de referência selecionada do grupo que consiste ém: SEQ ID NO: 71, SEQID NO: 76, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116, eSEQ ID NO: 121; e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antíge-no do mesmo especificamente compreendendo a dita VL-CDR3 liga a IGF-R1. Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido de VL-CDR3 é se-lecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116, e SEQ ID NO:121.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um polinucleotí-deo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeode VH de anticorpo onde o polipeptídeo de VH compreende seqüências deaminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3 selecionadas do grupoque consiste em: SEQ ID NOs: 5, 6, e 7; SEQ ID NOs: 10, 11, e 12; SEQ IDNOs: 15, 16, e 17; SEQ ID NOs: 21, 22, e 23; SEQ ID NOs: 27, 28, e 29;SEQ ID NOs: 33, 34, e 35; SEQ ID NOs: 39, 40, e 41;. SEQ ID NOs: 44, 45,e 46; SEQ ID NOs: 49, 50, e 51; SEQ ID NOs: 54, 55, e 56; SEQ ID NOs: 59,60, e 61; e SEQ ID NOs: 64, 65, e 66; e onde um anticorpo ou fragmento deligação de antígeno do mesmo especificamente compreendendo a VL-CDR3liga a IGF-R1.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um polinucleotí-deo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeode VL de anticorpo, em que o dito polipeptídeo de VL compreende seqüên-cias de aminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3 selecionadas dogrupo que consiste em: SEQ ID NOs: 69, 70, e 71; SEQ ID NOs: 74, 75, e76; SEQ ID NOs: 79, 80, e 81; SEQ ID NOs: 84, 85, e 86; SEQ ID NOs: 89,90, e 91; SEQ ID NOs: 94, 95, e 96; SEQ ID NOs: 99, 100, e 101; SEQ IDNOs: 104, 105, e 106; SEQ ID NOs: 109, 110, e 111; SEQ ID NOs: 114, 115,e 116; e SEQ ID NOs: 119, 120, e 121; e em que um anticorpo ou fragmentode ligação de antígeno do mesmo especificamente compreendendo a ditaVL-CDR3 Iigaa IGF-R1.
Em algumas modalidades, os polinucleotídeos acima descritostambém compreendem um ácido nucléico que codifica um peptídeo sinalfundido ao polipeptídeo de VH de anticorpo ou ao polipeptídeo de VL de an-ticorpo.
Em certas outras modalidades, os polinucleotídeos acima descri-tos também compreendem um ácido nucléico que codifica um domínio deCH1 da região constante de cadeia pesada fundido ao polipeptídeo de VH,codificando um domínio de CH2 da região constante de cadeia pesada fun-dido ao polipeptídeo de VH, codificando um domínio de CH3 da região cons-tante de cadeia pesada fundido ao polipeptídeo de VH1 ou codificando umaregião de dobradiça de cadeia pesada fundida ao dito polipeptídeo de VH.Em outras modalidades, a região constante de cadeia pesada é lgG4 huma-na. Em certas outras modalidades, a lgG4 é mutagenizada para remover ossítios de glicosilação. Em outras modalidades, as mutações de lgG4 com-preendem S241P e T318A usando o sistema de numeração de Kabat.
Em algumas modalidades, os polinucleotídeos acima descritoscompreendem um ácido nucléico que codifica um domínio da região cons-tante de cadeia leve fundido ao dito polipeptídeo de VL. Em outras modali-dades, a região constante de cadeia leve é capa humana.
Em várias modalidades dos polinucleotídeos acima descritos, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendoum polipeptídeo especificamente codificado pelo ácido nucléico liga o mes-mo epítopo de IGF-R1 como um fragmento de anticorpo de Fab monoclonalde referência selecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11,M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclonal dereferência produzido por um hibridoma selecionado do grupo que consisteem P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, eP1G10.2B8.
Em várias outras modalidades dos polinucleotídeos acima des-critos, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compre-endendo um polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico competitivamenteinibe um fragmento de anticorpo de Fab monoclonal de referência selecio-nado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01,M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclonal de referência produzidopor um hibridoma selecionado do grupo que consiste em P2A7.3E11,20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8.
Em várias modalidades dos polinucleotídeos acima descritos, asregiões de estrutura do polipeptídeo de VH ou polipeptídeo de VL são hu-manas, com exceção de cinco ou menos substituições de aminoácido.
Em várias modalidades dos polinucleotídeos acima descritos, ainvenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno domesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico queliga a um epítopo linear ou um epítopo conformacional não-linear.
Em várias modalidades dos polinucleotídeos acima descritos, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é multivalente, e compreendepelo menos duas cadeias pesadas e pelo menos duas cadeias leves.
Em certas modalidades dos polinucleotídeos acima descritos, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é multiespecífico. Em outras mo-dalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com-preendendo o polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é biespecífico.
Em várias modalidades dos polinucleotídeos acima descritos, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico compreende domínios variáveisde cadeia pesada e leve que são completamente humanos. Em outras mo-dalidades, os domínios variáveis de cadeia pesada e leve são idênticos à-queles de um fragmento monoclonal de anticorpo de Fab selecionado dogrupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, eM12-G04.
Em certas outras modalidades dos polinucleotídeos acima des-critos, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compre-endendo o polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico compreende domíniosvariáveis de cadeia pesada e leve que são murinos. Em outras modalidades,os domínios variáveis de cadeia pesada e leve são idênticos àqueles de umanticorpo monoclonal produzido por um hibridoma selecionado do grupo queconsiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, eP1G10.2B8.
Em várias modalidades dos polinucleotídeos acima descritos, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é humanizado.
Em várias modalidades dos polinucleotídeos acima descritos, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é de primata.
Em várias modalidades dos polinucleotídeos acima descritos, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é quimérico.
Em algumas modalidades dos polinucleotídeos acima descritos,o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendoo polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é completamente humano.
Em várias modalidades dos polinucleotídeos acima descritos, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é um fragmento de Fab, umfragmento de Fab11 um fragmento de F(ab)2, ou um fragmento de Fv. Em cer-tas modalidades dos polinucleotídeos acima descritos, o anticorpo ou frag-mento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo o polipeptídeo co-dificado pelo ácido nucléico é um anticorpo de cadeia simples.
Em algumas modalidades dos polinucleotídeos acima descritos,o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendoo polipeptídeo especificamente codificado pelo ácido nucléico liga a um poli-peptídeo de IGF-R1 ou fragmento do mesmo, ou uma variante de polipeptí-deo de IGF-R1, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dis-sociação (K0) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ 10*11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ 10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15M.
Em algumas modalidades dos polinucleotídeos acima descritos,o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendoo polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico preferencialmente liga a umpolipeptídeo de IGF-R1 humano ou fragmento do mesmo, com relação a umpolipeptídeo de IGF-R1 murino ou fragmento do mesmo ou um polipeptídeode IGF-R1 primata não-humano ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades dos polinucleotídeos acima descritos,o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendoo polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico liga a um polipeptídeo de IGF-R1 humano ou fragmento do mesmo, e também liga a um polipeptídeo deIGF-R1 primata não-humano ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades dos polinucleotídeos acima descritos,o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendoo polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico liga a IGF-R1 expressado nasuperfície de uma célula. Em outras modalidades, a célula é uma célula ma-ligna, uma célula neoplástica, uma célula tumoral, ou uma célula metastáti-ca.
Em algumas modalidades dos polinucleotídeos acima descritos,o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendoo polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléico bloqueia o fator de cresci-mento de insulina de ligar a IGF-R1. Em outras modalidades, o fator decrescimento de insulina é fator de crescimento de insulina-1 (IGF-1) ou fatorde crescimento de insulina-2 (IGF-2). Em certas outras modalidades do poli-nucleotídeo acima descrito, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo bloqueia IGF-1 e IGF-2 de ligarem a IGF-R1.
Em algumas modalidades dos polinucleotídeos acima descritos,o um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreen-dendo o polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico inibe proliferação de cé-lula mediada por IGF-R1, inibe fosforilação de IGF-R1 mediada por IGF-1 ouIGF-2, inibe crescimento de célula tumoral ou inibe internalização de IGF-R1.
Em algumas modalidades, os polinucleotídeos acima descritostambém compreendem um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo hete-rólogo.
Em algumas modalidades dos polinucleotídeos acima descritos,o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendoo polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é conjugado com um agenteselecionado do grupo que consiste em agente citotóxico, um agente terapêu-tico, agente citoestático, uma toxina biológica, um pró-medicamento, umpeptídeo, uma proteína, uma enzima, um vírus, um lipídio, um modificadorde resposta biológica, agente farmacêutico, uma linfocina, um anticorpo he-terólogo ou fragmento do mesmo, uma marcação detectável, polietileno gli-col (PEG), e uma combinação de dois ou mais de qualquer dito agente. Emoutras modalidades, o agente citotóxico é selecionado do grupo que consisteem um radionuclídeo, uma biotoxina, uma toxina enzimaticamente ativa, umagente citoestático ou terapêutico citotóxico, uns pró-medicamentos, um li-gando imunologicamente ativo, um modificador de resposta biológica, ouuma combinação de dois ou mais de qualquer dito agente citotóxico. Em cer-tas outras modalidades, a marcação detectável é selecionada do grupo queconsiste em uma enzima, uma marcação fluorescente, uma marcação qui-mioluminescente, uma marcação bioluminescente, uma marcação radioativa,ou uma combinação de dois ou mais de qualquer dita marcação detectável.
Em algumas modalidades, a invenção fornece composiçõescompreendendo os polinucleotídeos acima descritos.
Em certas outras modalidades, a invenção fornece vetores quecompreendem os polinucleotídeos acima descritos. Em outras modalidades,os polinucleotídeos são operavelmente associados a um promotor. Em mo-dalidades adicionais, a invenção fornece células hospedeiras compreenden-do tais vetores. Em outras modalidades, a invenção fornece vetores onde opolinucleotídeo é operavelmente associado a um promotor.
Em modalidades adicionais, a invenção fornece um método deproduzir um anticorpo ou fragmento do mesmo que especificamente ligaIGF-1R, compreendendo cultivar uma célula hospedeira contendo um vetorque compreende os polinucleotídeos acima descritos, e restabelecer o ditoanticorpo, ou fragmento do mesmo. Em outras modalidades, a invenção for-nece um polipeptídeo isolado produzido pelo método acima descrito.
Em algumas modalidades, a invenção fornece polipeptídeos iso-lados codificados pelos polinucleotídeos acima descritos.
Em outras modalidades dos polipeptídeos acima descritos, oanticorpo ou fragmento do mesmo especificamente compreendendo o poli-peptídeo liga a IGF-1R. Outras modalidades incluem o anticorpo isolado oufragmento do mesmo compreendendo os polipeptídeos acima descritos.
Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composiçãoque compreende um polinucleotídeo de codificação de VH isolado e um poli-nucleotídeo de codificação de VL isolado, onde o polinucleotídeo de codifi-cação de VH e o polinucleotídeo de codificação de VL, respectivamente,compreendem ácidos nucléicos que codificam seqüências de aminoácidopelo menos 90 %idênticas às seqüências de aminoácido de referência sele-cionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 68; SEQID NO: 8 e SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 eSEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 e SEQ IDNO: 103; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO:103; SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 113; e SEQ ID NO: 63 e 118; e onde umanticorpo ou fragmento do mesmo codificado pelos polinucleotídeos de codi-ficação de VH e VL especificamente liga IGF-R1. Em outras modalidades, opolinucleotídeo de codificação de VH e o dito polinucleotídeo de codificaçãode VL, respectivamente, compreendem ácidos nucléicos que codificam se-qüências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em: SEQ IDNO: 4 e SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 eSEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 e SEQ IDNO: 88; SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 98;SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 108; SEQID NO: 53 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 113; e SEQ IDNO: 63 e 118.
Em certas outras modalidades, a invenção fornece uma compo-sição que compreende um polinucleotídeo de codificação de VH isolado eum polinucleotídeo de codificação de VL isolado, onde o polinucleotídeo decodificação de VH e o polinucleotídeo de codificação de VL, respectivamen-te, compreendem ácidos nucléicos que codificam seqüências de aminoácidoidênticas, com exceção de menos de 20 substituições conservadoras de a -minoácido, às seqüências de aminoácido de referência selecionadas do gru-po que consiste em: SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 e SEQID NO: 73; SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO:83; SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 93;SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 103; SEQID NO: 48 e SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 103; SEQ IDNO: 58 e SEQ ID NO: 113; e SEQ ID NO: 63 e 118; e onde um anticorpo oufragmento do mesmo codificado pelos polinucleotídeos de codificação de VHe VL especificamente liga IGF-R1. Em outras modalidades, o polinucleotídeode codificação de VH codifica um polipeptídeo de VH que compreende se- qüências de aminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3 selecionadasdo grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 5, 6, e 7; SEQ ID NOs: 10, 11, e 12;SEQ ID NOs: 15, 16, e 17; SEQ ID NOs: 21, 22, e 23; SEQ ID NOs: 27, 28, e29; SEQ ID NOs: 33, 34, e 35; SEQ ID NOs: 39, 40, e 41;. SEQ ID NOs: 44,45, e 46; SEQ ID NOs: 49, 50, e 51; SEQ ID NOs: 54, 55, e 56; SEQ ID NOs:59, 60, e 61; e SEQ ID NOs: 64, 65, e 66; onde o polinucleotídeo de codifi-cação de VL codifica um polipeptídeo de VL que compreende as seqüênciasde aminoácido de VL-CDR1, VL-CDR2, e VL-CDR3 selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 69, 70, e 71; SEQ ID NOs: 74, 75, e 76; SEQID NOs: 79, 80, e 81; SEQ ID NOs: 84, 85, e 86; SEQ ID NOs: 89, 90, e 91;SEQ ID NOs: 94, 95, e 96; SEQ ID NOs: 99, 100, e 101; SEQ ID NOs: 104,105, e 106; SEQ ID NOs: 109, 110, e 111; SEQ ID NOs: 114, 115, e 116; eSEQ ID NOs: 119, 120, e 121; e onde um anticorpo ou fragmento do mesmo codificado pelos polinucleotídeos de codificação de VH e VL especificamenteliga IGF-R1.
Em várias modalidades das composições acima descritas, o po-linucleotídeo de codificação de VH também compreende um ácido nucléicoque codifica um peptídeo sinal fundido ao polipeptídeo de VH de anticorpo. Em várias modalidades das composições acima descritas, o po-linucleotídeo de codificação de VL também compreende um ácido nucléicoque codifica um peptídeo sinal fundido ao polipeptídeo de VL de anticorpo.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, opolinucleotídeo de codificação de VH também compreende um ácido nucléi- co que codifica um domínio de CH1 da região constante de cadeia pesadafundido ao polipeptídeo de VH, também compreende um ácido nucléico quecodifica um domínio de CH2 da região constante de cadeia pesada fundidoao polipeptídeo de VH, também compreende um ácido nucléico que codificaum domínio de CH3 da região constante de cadeia pesada fundido ao poli-peptídeo de VH1 ou também compreende um ácido nucléico que codificauma região de dobradiça de cadeia pesada fundida ao polipeptídeo de VH.
Em outras modalidades, a região constante de cadeia pesada é lgG4 huma-na. Em certas outras modalidades, a lgG4 é mutagenizada para remover ossítios de glicosilação. Em outras modalidades, as mutações de lgG4 com-preendem S241P e T318A usando o sistema de numeração de Kabat.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, opolinucleotídeo de codificação de VL também compreende um ácido nucléi-co que codifica um domínio da região constante de cadeia leve fundido aopolipeptídeo de VL. Em outras modalidades, a região constante de cadeialeve é capa humana.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento do mesmo codificado pelos polinucleotídeos de codi-ficação de VH e VL especificamente liga o mesmo epítopo de IGF-R1 comoum fragmento de anticorpo de Fab monoclonal de referência selecionado dogrupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, eM12-G04, ou um anticorpo monoclonal de referência produzido por um hibri-doma selecionado do grupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8,Ρ1 A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento do mesmo codificado pelos polinucleotídeos de codi-ficação de VH e VL competitivamente inibe um fragmento de anticorpo deFab monoclonal de referência selecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpomonoclonal de referência produzido por um hibridoma selecionado do grupoque consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11,P1E2.3B12, e P1G10.2B8 de ligar a IGF-R1.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, asregiões de estrutura dos polipeptídeos de VH e VL são humanas, com exce-ção de cinco ou menos substituições de aminoácido.Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento do mesmo codificado pelos polipeptídeos de codifi-cação de VH e VL liga a um epítopo linear ou um epítopo conformacionalnão-linear.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento do mesmo codificado pelos polipeptídeos de codifi-cação de VH e VL é multivalente, e compreende pelo menos duas cadeiaspesadas e pelo menos duas cadeias leves.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento do mesmo codificado pelos polipeptídeos de codifi-cação de VH e VL é multiespecífico. Em outras modalidades, o anticorpo oufragmento do mesmo codificado pelos polipeptídeos de codificação de VH eVL é biespecífico.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento do mesmo codificado pelos polipeptídeos de codifi-cação de VH e VL compreende domínios variáveis de cadeia pesada e leveque são completamente humanos. Em outras modalidades, os domínios va-riáveis de cadeia pesada e leve são idênticos àqueles de um fragmento mo-noclonal de anticorpo de Fab selecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento do mesmo codificado pelos polipeptídeos de codifi-cação de VH e VL compreende domínios variáveis de cadeia pesada e leveque são murinos. Em outras modalidades, os domínios variáveis de cadeiapesada e leve são idênticos àqueles de um anticorpo monoclonal produzidopor um hibridoma selecionado do grupo que consiste em P2A7.3E11,20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8.
Em várias modalidades das composições acima descritas, o an-ticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é humanizado.
Em várias modalidades das composições acima descritas, o an-ticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é de primata.
Em várias modalidades das composições acima descritas, o an-ticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é quimérico.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é completamente humano.
Em várias modalidades das composições acima descritas, o an-ticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é um fragmento de Fab1 umfragmento de Fab1, um fragmento de F(ab)2, ou um fragmento de Fv. Em cer-tas modalidades das composições acima descritas, o anticorpo ou fragmentode ligação de antígeno do mesmo compreendendo o polipeptídeo codificadopelo ácido nucléico é um anticorpo de cadeia simples.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo especificamente codificado pelo ácido nucléico liga a um poli-peptídeo de IGF-R1 ou fragmento do mesmo, ou uma variante de polipeptí-deo de IGF-R1, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dis-sociação (K0) não maior que 5 χ 10-2 Μ, 10-2 Μ, 5 χ 10-3 Μ, 10-3 Μ, 5 χ 10-4Μ, 10-4 M1 5 χ 10-5 Μ, 10-5 Μ, 5 χ 10-6 Μ, 10-6 Μ, 5 χ W7 Μ, 10-7 Μ, 5 χ 10-8Μ, 10-8 Μ, 5 χ 10-9 Μ, 10-9 Μ, 5 χ IO-10 Μ, 10-10 Μ, 5 χ 10-11 Μ, 10-11 Μ, 5 χ 10-12 Μ, 10-12 Μ, 5 χ ΙΟ'13 Μ, 10-13 Μ, 5 χ 10-14 Μ, 10-14 Μ, 5 χ 10-15 Μ, ou 10-15Μ.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico preferencialmente liga a um poli-peptídeo de IGF-R1 humano ou fragmento do mesmo, com relação a umpolipeptídeo de IGF-R1 murino ou fragmento do mesmo ou um polipeptídeode IGF-R1 primata não-humano ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico liga a um polipeptídeo de IGF-R1humano ou fragmento do mesmo, e também liga a um polipeptídeo de IGF-R1 primata não-humano ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico liga a IGF-R1 expressado na su-perfície de uma célula. Em outras modalidades, a célula é uma célula malig-na, uma célula neoplástica, uma célula tumoral, ou uma célula metastática.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléico bloqueia o fator de cresci-mento de insulina de ligar a IGF-R1. Em outras modalidades, o fator decrescimento de insulina é fator de crescimento de insulina-1 (IGF-1) ou fatorde crescimento de insulina-2 (IGF-2). Em certas outras modalidades dascomposições acima descritas, o anticorpo ou fragmento de ligação de antí-geno do mesmo bloqueia IGF-1 e IGF-2 de ligarem a IGF-R1.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oum anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreenden-do o polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico inibe proliferação de célulamediada por IGF-R1, inibe fosforilação de IGF-R1 mediada por IGF-1 ouIGF-2, inibe crescimento de célula tumoral ou inibe internalização de IGF-R1.
Em algumas modalidades, as composições acima descritas, opolinucleotídeo de codificação de VH, o polinucleotídeo de codificação deVL, ou os polinucleotídeos de codificação de VH e VL também compreen-dem um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo heterólogo.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo opolipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é conjugado com um agente se-lecionado do grupo que consiste em agente citotóxico, um agente terapêuti-co, agente citoestático, uma toxina biológica, um pró-medicamento, um pep-tídeo, uma proteína, uma enzima, um vírus, um lipídio, um modificador deresposta biológica, agente farmacêutico, uma linfocina, um anticorpo heteró-logo ou fragmento do mesmo, uma marcação detectável, polietileno glicol(PEG)1 e uma combinação de dois ou mais de qualquer dito agente. Em ou-tras modalidades, o agente citotóxico é selecionado do grupo que consisteem um radionuclídeo, uma biotoxina, uma toxina enzimaticamente ativa, umagente citoestático ou terapêutico citotóxico, uns pró-medicamentos, um li-gando imunologicamente ativo, um modificador de resposta biológica, ouuma combinação de dois ou mais de qualquer dito agente citotóxico. Em cer-tas outras modalidades, a marcação detectável é selecionada do grupo queconsiste em uma enzima, uma marcação fluorescente, uma marcação qui-mioluminescente, uma marcação bioluminescente, uma marcação radioativa,ou uma combinação de dois ou mais de qualquer dita marcação detectável.
Em algumas modalidades das composições acima descritas, opolinucleotídeo de codificação de VH é contido em um primeiro vetor e o po-linucleotídeo de codificação de VL é contido em um segundo vetor. Em ou-tras modalidades, o polinucleotídeo de codificação de VH é operavelmenteassociado a um primeiro promotor e o polinucleotídeo de codificação de VL éoperavelmente associado a um segundo promotor. Em certas outras modali-dades, os primeiro e segundo promotores são cópias do mesmo promotor.Em outras modalidades, os primeiro e segundo promotores são não-idênticos.
Em várias modalidades das composições acima descritas, oprimeiro vetor e o segundo vetor são contidos em uma célula hospedeirasimples.
Em certas outras modalidades das composições acima descri-tas, o primeiro vetor e o segundo vetor são contidos em umas células hos-pedeiras separadas.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um método deproduzir um anticorpo ou fragmento do mesmo que especificamente ligaIGF-1R, compreendendo cultivar as células hospedeiras acima descritas, erestabelecer o anticorpo, ou fragmento do mesmo.
Em outras modalidades, a invenção fornece um método de pro-duzir um anticorpo ou fragmento do mesmo que especificamente liga IGF-1R, compreendendo co-cultivar células hospedeiras separadas, e restabele-cer o anticorpo, ou fragmento do mesmo. Em outras modalidades do métodoacima descrito, a invenção fornece combinar os polipeptídeos de codificaçãode VH e VL, e restabelecer o anticorpo, ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo oufragmento do mesmo que especificamente liga IGF-1R, produzido pelos mé-todos acima descritos.
Em algumas modalidades, a invenção fornece composições on-de o polinucleotídeo de codificação de VH e o polinucleotídeo de codificaçãode VL estão no mesmo vetor, como também os vetores neles.
Em várias modalidades dos vetores acima descritos, o polinu-cleotídeo de codificação de VH e o polinucleotídeo de codificação de VL sãocada operavelmente associados a um promotor.
Em várias modalidades dos vetores acima descritos, o polinu-cleotídeo de codificação de VH e o polinucleotídeo de codificação de VL sãofundidos na estrutura, co-transcritos de um promotor simples operavelmenteassociados a este, e cotransladados em um anticorpo de cadeia simples oufragmento de ligação de antígeno do mesmo.
Em várias modalidades dos vetores acima descritos, o polinu-cleotídeo de codificação de VH e o dito polinucleotídeo de codificação de VLsão co-transcritos de um promotor simples operavelmente associados a es-te, mas transladados separadamente. Em outras modalidades, os vetorestambém compreendem uma seqüência de IRES disposta entre o polinucleo-tídeo de codificação de VH e o polinucleotídeo de codificação de VL. Emcertas outras modalidades, o polinucleotídeo que codifica uma VH e o poli-nucleotídeo que codifica uma VL são transcritos separadamente, cada sendooperavelmente associado a um promotor separado. Em outras modalidades,os promotores separados são cópias do mesmo promotor ou os promotoresseparados são não-idênticos.
Em algumas modalidades, a invenção fornece células hospedei-ras compreendendo os vetores acima descritos.
Em outras modalidades, a invenção fornece um método de pro-duzir um anticorpo ou fragmento do mesmo que especificamente liga IGF-1R, compreendendo cultivar as células hospedeiras acima descritas, e res-tabelecer o anticorpo, ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo oufragmento do mesmo que especificamente liga IGF-1R, produzido pelos mé-todos acima descritos.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um método paratratar um distúrbio hiperproliferativo em um animal, compreendendo adminis-trar a um animal em necessidade de tratamento uma composição compre-endendo: a) um anticorpo isolado ou fragmento como descrito acima; e b)um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outras modalida-des, a doença ou distúrbio hiperproliferativo é selecionado do grupo queconsiste em câncer, um neoplasma, um tumor, uma malignidade, ou umametástase dos mesmos.
Em várias modalidades dos métodos acima descritos, o anticor-po ou fragmento do mesmo especificamente liga a IGF-1R expressado nasuperfície de uma célula maligna. Em outras modalidades, a ligação do anti-corpo ou fragmento do mesmo à célula maligna resulta na inibição do cres-cimento da célula maligna.
Em várias modalidades dos métodos acima descritos, o anticor-po ou fragmento do mesmo inibe IGF de ligar à célula maligna. Em outrasmodalidades, o IGF é IGF-1 ou IGF-2.
Em várias modalidades dos métodos acima descritos, o anticor-po ou fragmento do mesmo inibe IGF-1 de ligar à dita célula maligna masnão inibe IGF-2. Em certas outras modalidades, o anticorpo ou fragmento domesmo inibe IGF-2 de ligar a dita célula maligna mas não inibe IGF-1.
Em várias modalidades dos métodos acima descritos, o anticor-po ou fragmento do mesmo promove internalização de IGF-1 R na célula ma-ligna.
Em várias modalidades dos métodos acima descritos, o anticor-po ou fragmento do mesmo inibe fosforilação do IGF-1 R ou inibe proliferaçãoda célula tumoral. Em outras modalidades, a proliferação de célula tumoral éinibida através da prevenção ou retardamento do crescimento metastático.
Em várias modalidades dos métodos acima descritos, o anticor-po ou fragmento do mesmo inibe migração da célula tumoral. Em outras mo-dalidades, a proliferação de célula tumoral é inibida através da prevenção ouretardamento da expansão do tumor para tecidos adjacentes.
Em várias modalidades dos métodos acima descritos, a doençaou distúrbio hiperproliferativo é um neoplasma localizado em: próstata, có-lon, abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritôneo,glândula ad-renal, glândula da paratiróide, glândula pituitária, testículos, ová-rio, timo, tiróide, olho, cabeça, pescoço, sistema nervoso central, sistemanervoso periférico, sistema linfático, pélvis, pele, tecido macio, baço, regiãotorácica, ou trato urogenital.
Em várias modalidades dos métodos acima descritos, a doençahiperproliferativa é câncer, o dito câncer selecionado do grupo que consisteem: câncer de célula escamosa epitelial, melanoma, leucemia, mieloma,câncer de estômago, câncer de cérebro, câncer de pulmão, câncer pancreá-tico, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga,câncer de mama, câncer de cólon, câncer renal, câncer de próstata, câncertesticular, câncer da tiróide, e câncer de cabeça e pescoço. Em outras mo-dalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de es-tômago, câncer renal, câncer de cérebro, câncer de bexiga, câncer de cólon,câncer de pulmão, câncer de mama, câncer pancreático, câncer ovariano, ecâncer de próstata.
Em várias modalidades dos métodos acima descritos, o animal éum mamífero. Em outras modalidades, o mamífero é um ser humano.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
FIGURA 1: Atividade de ligação de Fabs específicos para IGF-1R. (a) Ligação de anticorpos de Fab purificados de anti-IGF1R à proteínade IGF1 R-his e de IGFIR-Fc recombinante por ELISA, (b) Ligação de anti-corpos de Fab para purificados de anti-IGF1R a IGF1R humano expressoem 3T3 através de fluxocitometria.
FIGURA 2: Atividade de ligação de Fabs a IGF-1R expresso emcélulas MCF-7.
FIGURA 3: Fabs de anti-IGF-1 R inibiu a fosforilação induzida por(a) IGF-1 e (b) IGF-2 em células MCF7
FIGURA 4: Ligação de anticorpos de fragmento de Fab de IGF-1R a IGF-1R solúvel (a) e INSR (b) por ELISA.
FIGURA 5: O nucleotídeo e a seqüência de aminoácido das ver-sões originais e modificadas das cadeias de VH e VL de M13-C06, M14-G11, M14-C03 e M14-B01. (a) (SEQ ID NO: 13) mostra a seqüência de DNAunifilamentar de cadeia pesada M13-C06. (b) (SEQ ID NO: 77) mostra a se-qüência de DNA unifilamentar de cadeia leve M13-C06. (c) (SEQ ID NO: 14)mostra a seqüência de aminoácido de cadeia pesada M13-C06. (d) (SEQ IDNO: 78) mostra a seqüência de aminoácido de cadeia leve M13-C06. (e)(SEQ ID NO: 25) mostra a seqüência de DNA unifilamentar de cadeia pesa-da M14-C03. (f) (SEQ ID NO: 87) mostra a seqüência de DNA unifilamentarde cadeia leve M14-C03. (g) (SEQ ID NO: 26) mostra a seqüência de ami-noácido de cadeia pesada M14-C03. (h) (SEQ ID NO: 88) mostra a seqüên-cia de aminoácido de cadeia leve M14-C03. (i) (SEQ ID NO: 31) mostra aseqüência de DNA unifilamentar de cadeia pesada M14-G11. (j) (SEQ IDNO: 92) mostra a seqüência de DNA unifilamentar de cadeia leve M14-G11.(k) (SEQ ID NO: 32) mostra a seqüência de aminoácido de cadeia pesadaM14-G11. (I) (SEQ ID NO: 93) mostra a seqüência de aminoácido de cadeialeve M14-G11. (m) (SEQ ID NO: 19) mostra a seqüência de DNA unifilamen-tar de cadeia pesada M14-B01. (n) (SEQ ID NO: 82) mostra a seqüência deDNA unifilamentar de cadeia leve M14-B01. (o) (SEQ ID NO: 20) mostra aseqüência de aminoácido de cadeia pesada M14-B01. (p) (SEQ ID NO: 83)mostra a seqüência de aminoácido de cadeia leve M14-B01. (q) (SEQ IDNO: 18) mostra a seqüência de DNA unifilamentar de cadeia pesada otimi-zada em seqüência M13-C06. (r) (SEQ ID NO: 14) mostra a seqüência deaminoácido de cadeia pesada otimizada em seqüência M13-C06. (s) (SEQID NO: 30) mostra a seqüência de DNA unifilamentar de cadeia pesada oti-mizada em seqüência M14-C03. (t) (SEQ ID NO: 26) mostra a seqüência deaminoácido de cadeia pesada otimizada em seqüência M14-C03. (u) (SEQID NO: 36) mostra a seqüência de DNA unifilamentar de cadeia pesada oti-mizada em seqüência M14-G11. (v) (SEQ ID NO: 32) mostra a seqüência deaminoácido de cadeia pesada otimizada em seqüência M14-G11. (w) (SEQID NO: 24) mostra a seqüência de DNA unifilamentar de cadeia pesada oti-mizada em seqüência M14-B01. (x) (SEQ ID NO: 20) mostra a seqüência deaminoácido de cadeia pesada otimizada em seqüência M14-B01. (y) (SEQID NO: 153) mostra a seqüência de DNA unifilamentar de domínio constantede cadeia leve. (z) (SEQ ID NO: 154) mostra a seqüência de aminoácido dedomínio constante de cadeia leve. (aa) (SEQ ID NO: 155) mostra a seqüên-cia de DNA unifilamentar de domínios constantes de cadeia pesada a-gly.lgG4.P. (bb) (SEQ ID NO: 156) mostra a seqüência de aminoácido dedomínios constantes de cadeia pesada aglylgG4.P.
FIGURA 6: Análise de SDA PAGE não-reduzida e reduzida dasversões de G4.P.agly de anticorpos M13-C06 e M14-C03 completamentehumanos.
FIGURA 7: A atividade de ligação das versões de anticorpos deanti-IGF-1R de G4.P (a) e G4.P.agly (b) completamente humanos como de-terminado por ELISA.
FIGURA 8: A ligação dos anticorpos completamente humanos aIGF-1R expresso em célula de MCF-7 (8.a), IGF-1R/3T3 (8.b) foi determina-da através de fluxocitometria. A EC50 de ligação em MCF-7 variou entre 2,7-12 χ 10"10 nM.
FIGURA 9: A habilidade das versões de G4 de anticorpos com-pletamente humanos para bloquear IGF-1 (a) e IGF-2 (b) ligando a IGF-1Rfoi determinada por um RIA.
FIGURA 10: (a) Inibição da proliferação de célula tumoral H-23em resposta a IGF-1 através das versões de G4 de anticorpos completa-mente humanos; (b) Inibição da proliferação de célula tumoral H-23 em res-posta a IGF-2 através das versões de G4 de anticorpos completamente hu-manos; (c) Inibição da proliferação de célula tumoral Calu-6 em resposta aIGF-1 através de G4 de anticorpos completamente humanos.
FIGURA 11: Inibição de IGF-1 (a) e IGF-2 (b) dirigiu a fosforila-ção do receptor por anticorpos de M13.C06.G4.P.agly, M14.C03.G4.P.agly eM14.G11.P.
FIGURA 12: Inibição da sinalização a jusante porM13.C06.G4.P.agly. (a). Fosfo Akt (Thr308) e Akt total foram mostrados nasfileiras do topo e do fundo, respectivamente, (b) Fosfo p44/42 MAPK ep44/42 MAPK total mostrados na fileira do topo e do fundo, respectivamente.
FIGURA 13: Internalização de IGF-1R através de anticorpos deanti-IGF-1R humanos. A internalização de IGF-1R através de anticorpo deM13-C06.G4.P.agly (a) foi observada no tempo O, 15 e 60 min através demicroscopia confocal. Clone de anticorpo de IGF-1R de anti-camundongo24-31 foi o controle positivo (b) e anticorpo de 7F2 de camundongo e umanticorpo de G4.P humano IDEC-151.G4.P foram os controles negativosequiparados por isótipo (c) para o experimento.
FIGURA 14: Inibição do crescimento de célula tumoral mediadopor IGF-1 através de mAbs de IGF-1R selecionados, (a) H23; (b) Calu-6; (c)Panc-1; (d) BxPC3; (e) MaPaCa; e (f) Colo205. Barras mostram médias eSD.
FIGURA 15: Inibição da proliferação de células de H-23 dirigidacom IGF-1 e IGF-2 através de anticorpos de anti-IGF-1R.
FIGURA 16: Inibição da proliferação de célula de BxPC3 (dirigi-da com IGF-1 e IGF-2 humanos recombinantes) através de anticorpo deM13-C06.G4.P.agly.
FIGURA 17: Inibição da proliferação de célula de NCI-H23 (diri-gida com IGF-1 e IGF-2 humanos recombinantes) através de anticorpo deM13-C06.G4.P.agly.
FIGURA 18: Inibição da proliferação de célula de A549 (dirigidacom IGF-1 e IGF-2 humanos recombinantes) através de anticorpo de M13-C06.G4.P.agly.
FIGURA 19: Inibição da fosforilação de Akt induzida por IGF-1 eIGF-2 no resíduo de aminoácido Ser473 por um anticorpo de IGF-1 R com-pletamente humano.
FIGURA 20: Anticorpo de M13.C06.G4.P.agly completamentehumano exibe inibição do crescimento de tumor dose-dependente in vivo emum modelo de câncer pancreático.
FIGURA 21: Anticorpo de M13.C06.G4.P.agly completamentehumano exibe inibição do crescimento de tumor dose-dependente in vivo emum modelo de câncer de pulmão.
FIGURA 22: Anticorpo de M13.C06.G4.P.agly completamentehumano administrado em combinação com gencitabina exibe eficácia au-mentada em inibir crescimento do tumor.
FIGURA 23: Anticorpo de M13.C06.G4.P.agly completamentehumano liga a IGF-1R expresso em uma linhagem celular de fibroblasto ci-nomólogo estabelecido.
FIGURA 24: Análise de ligação de competição cruzada dos epí-topos de ligação de anticorpo de IGF-1R.
FIGURA 25: Co-imunoprecipitação de IRS-1 e p85 (subunidadereguladora de PI3K) demonstra inibição mediada por M13-C06.G4.P.agly datransdução de sinal de IGF-1R.
FIGURA 26: Imunoprecipitação de IGF-1R e INSR em célulasmamíferas demonstra ligação de anticorpo de M13.C06.G4.P.agly a IGF-1Rmas não ao receptor de insulina. IGF-1R e proteínas de INSR foram detec-tados através de análise de imunotingimento (western blot) com IR anti-humano de camundongo (A) ou IGF-1R anti-humano de camundongo (B).
FIGURA 27. Medições da afinidade de ligação relativa de Fab deM13-C06 a (A) hlGF-1R-Fc e (B) mlGF-1R-Fc. As escalas dos eixos χ e ysão idênticas a (A) e (B). Os resíduos para os ajustes de ligação estão mos-trados ao fundo de cada painel para indicar a aplicabilidade do modelo deligação 1:1 na determinação das afinidades relativas de M13-C06 para cadareceptor.
FIGURA 28: Exemplos de ligação de anticorpo de M13.C06 aoscontroles hlGF-1 R-Fc e mlGF-1 R-Fc no ensaio de SPR comparado à ligaçãode anticorpo às proteínas mutantes de IGF-1 R SD006 (ligação positiva) eSD015 (ligação negativa).
FIGURA 29: REPRESENTAÇÕES ESTRUTURAIS DE IGF-1 R EINSR: A) DIAGRAMA ESQUEMÁTICO DA ESTRUTURA DE IGF-1R. A) Fnl-II-2 contém estrutura de alça que é proteoliticamente processado in vivo co-mo mostrado no diagrama. A região de transmembrana é mostrada comouma alça helicoidal que atravessa um esquemático de uma bicamada defosfolipídeo. A localização do sítio de ligação de IGF-1/IGF-2 dentro de IGF-1R é mostrada por uma estrela. Foi demonstrado que apenas uma moléculade IGF-1/IGF-2 liga a cada molécula heterodimérica de IGF-1R. B & C) EPÍ-TOPO DE LIGAÇÃO DE IGF-1R DE M13-C06 MAPEADO PARA A SUPER-FÍCIE DA ESTRUTURA DO INSR HOMÓLOGO. O epítopo de ligação deIGF-1R de M13-C06 foi modelado com base na estrutura de cristal de INSRaltamente homóloga. B) Representação de superfície da estrutura de INSRcom posições de resíduo de aminoácido que correspondem às posiçõeshomólogas de V462-H464 em IGF-1R (isto é, L472-K474 em INSR) estásombreada de preto. Os primeiros três domínios correspondendo a IGF-1R(isto é, L1-CR-L2) (tais como estão inclusos na construção de IGF-1R(1-462)-Fc truncada descrita aqui) estão sombreados de cinza. C) Representa-ção de superfície da estrutura de INSR com aqueles resíduos que expõem aárea de superfície ao solvente e que estão dentro de um raio de 14 Á(angstróm) (ou diâmetro de 28 Á) dos resíduos que correspondem a 462-464de IGF-1R (isto é, 472-474 de INSR) estão sombreados de preto. Resíduosque correspondem aos aminoácidos de IGF-1R 462-464 estão sombreadosde cinza para indicar a área de superfície experimentalmente confirmada doepítopo proposto.
FIGURA 30: Análise de imunotingimento (western blot) da ex-pressão de IGF-1R in vivo em tumores de camundongo tratados com anti-corpo de M13.C06.G4.P.agly.
FIGURA 31: Atividade anti-tumor in vivo de M13-C06.G4.P.aglyem tumores gerados de um tumor de cólon humano primário.
FIGURA 32: Atividade anti-tumor in vivo de M13-C06.G4.P.aglyem tumores gerados de células de carcinoma de mama (MCF-7).
FIGURA 33: Anticorpo de M13-C06 não apresenta atividade deADCC in vitro.I. DEFINIÇÕES
É para ser observado que o termo "uma" entidade refere-se auma ou mais daquela entidade; por exemplo, "um anticorpo de IGF-1R", éentendido representar um ou mais anticorpos de IGF-1R. Como tal, os ter-mos "um" (ou "uma"), "um(a) ou mais", e "pelo menos um(a)" podem ser u-sados alternadamente aqui.
Como aqui usado, o termo "polipeptídeo" é intencionado abran-ger um "polipeptídeo" singular como também "polipeptídeos" plurais e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente li-gada através de ligações de amida (também conhecida como ligações depeptídeo). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias dedois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico doproduto. Desse modo, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos,"proteína", "cadeia de aminoácido", ou qualquer outro termo referindo a umacadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos dentro dadefinição de "polipeptídeo", e o termo "polipeptídeo" pode ser usado no lu-gar, ou alternadamente, de qualquer um destes termos. O termo "polipeptí-deo" é também intencionado referir-se aos produtos de modificações de pós-expressão do polipeptídeo, incluindo sem limitação, glicosilação, acetilação,fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio co-nhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação através de aminoácidos deocorrência não-natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fontebiológica natural ou pode ser produzido através de tecnologia recombinante,mas não necessariamente é transladado de uma seqüência de ácido nucléi-co designada. Ele pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo atravésde síntese química.
Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cercade 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 oumais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensionaldefinida, embora eles não necessariamente tenham tal estrutura. Polipeptí-deos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobra-dos, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida,mas do contrário podem adotar um número grande de conformações diferen-tes, e são referidos como desdobrados. Como aqui usado, a termo glicopro-teína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma metade de car-boidrato que está ligada à proteína por meio de uma cadeia lateral contendooxigênio ou uma contendo nitrogênio de um resíduo de aminoácido, por e-xemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.
Por um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variante, ou de-rivado do mesmo é intencionado um polipeptídeo que não está em seu am-biente natural. Nenhum nível particular de purificação é requerido. Por e-xemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativoou natural. Polipeptídeos recombinantemente produzidos e proteínas ex-pressas em células hospedeiras são considerados isolados para o propósitoda invenção, como são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foramseparados, fracionados, ou parcial ou substancialmente purificados porqualquer técnica adequada.
Também incluso como polipeptídeos da presente invenção estãofragmentos, derivados, análogos, ou variantes dos polipeptídeos anteriores,e qualquer combinação dos mesmos. Os termos "fragmento", "variante", "de-rivado" e "análogo" quando referir a anticorpos de IGF-1R ou polipeptídeosde anticorpo da presente invenção incluem qualquer polipeptídeo que rete-nha pelo menos algumas das propriedades de ligação de antígeno do anti-corpo ou polipeptídeo nativo correspondente. Fragmentos de polipeptídeosda presente invenção incluem fragmentos proteolíticos, como também frag-mentos de deleção, além de fragmentos de anticorpos específicos debatidosem outro lugar aqui. Variantes de anticorpos de IGF-1R e polipeptídeos deanticorpo da presente invenção incluem fragmentos como descritos acima, etambém polipeptídeos com seqüências de aminoácido alteradas devido àssubstituições, deleções, ou inserções de aminoácidos. Variantes podem o-correr naturalmente ou ser de ocorrência não-natural. Variantes de ocorrên-cia não-natural podem ser produzidas usando técnicas de mutagênese co-nhecidas na técnica. Polipeptídeos variantes podem compreender substitui-ções, deleções ou adições de aminoácido conservadoras ou não-conservadoras. Derivados de anticorpos de IGF-1R e polipeptídeos de anti-corpo da presente invenção são polipeptídeos que foram alterados para exi-bir características adicionais não encontrados no polipeptídeo nativo. Exem-plos incluem proteínas de fusão. Polipeptídeos variantes podem também serreferidos aqui como "análogos de polipeptídeo". Como aqui usado um "deri-vado" de um anticorpo de IGF-1R ou polipeptídeo de anticorpo refere-se aum polipeptídeo em questão tendo um ou mais resíduos quimicamente deri-vatizados por reação de um grupo lateral funcional. Também incluso como"derivados" são aqueles peptídeos contendo um ou mais derivados de ami-noácido de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrões. Por exemplo,4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode sersubstituída por lisina; 3-metil-histidina pode ser substituída por histidina; ho-mosserina pode ser substituída por serina; e ornitina pode ser substituídapor lisina.
O termo "polinucleotídeo" é intencionado abranger um ácido nu-cléico singular como também ácidos nucléicos plurais, e refere-se a umamolécula ou construção de ácido nucléico isolada, por exemplo, RNA men-sageiro (mRNA) ou DNA de plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo podecompreender uma ligação de fosfodiéster convencional ou uma ligação não-convencional (por exemplo, uma ligação de amida, tal como encontrada emácidos nucléicos de peptídeo (PNA)). O termo "ácido nucléico" refere-se aqualquer um ou mais segmentos de ácido nucléico, por exemplo, DNA oufragmentos de RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucléico oupolinucleotídeo "isolado" é intencionado uma molécula de ácido nucléico,DNA ou RNA que foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, umpolinucleotídeo recombinante que codifica um anticorpo de IGF-1R contidoem um vetor é considerado isolado para o propósito da presente invenção.Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeosrecombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleo-tídeos purificados (parcial ou substancialmente) em solução. Moléculas deRNA isoladas incluem transcrições in vivo ou in vitro de RNA dos polinucleo-tídeos da presente invenção. Polinucleotídeos ou ácidos nucléicos isoladosde acordo com a presente invenção também incluem tais moléculas sinteti-camente produzidas. Além disso, polinucleotídeo ou um ácido nucléico podeser ou incluir um elemento regulador tal como um promotor, sítio de ligaçãode ribossoma, ou um terminador de transcrição.
Como aqui usado, uma "região de codificação" é uma porção deácido nucléico que consiste em códons transladados nos aminoácidos. Em-bora um "códon de parada" (MARCADOR, TGA, ou TAA) não seja transla-dado em um aminoácido, este pode ser considerado fazer parte de uma re-gião de codificação, mas qualquer seqüência de flanqueamento, por exem-plo promotores, sítios de ligação de ribossoma, terminadores transcricionais,íntrons, e outros, não fazem parte de uma região de codificação. Duas oumais regiões de codificação da presente invenção podem estar presentesem uma construção de polinucleotídeo simples, por exemplo, em um vetorsimples, ou em construções de polinucleotídeo separadas, por exemplo, emvetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor possa conter umaregião de codificação simples, ou possa compreender duas ou mais regiõesde codificação, por exemplo, um vetor simples pode separadamente codifi-car uma região variável da imunoglobulina de cadeia pesada e uma regiãovariável de cadeia leve da imunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleo-tídeo, ou ácido nucléico da invenção podem codificar regiões de codificaçãoheterólogas, fundidas ou não com um ácido nucléico que codifica um anti-corpo de IGF-1R ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Regiões decodificação heterólogas incluem sem limitação elementos ou motivos espe-cializados, tais como um peptídeo sinal secretório ou um domínio funcionalheterólogo.
Em certas modalidades, o polinucleotídeo ou ácido nucléico é oDNA. No caso do DNA, um polinucleotídeo que compreende um ácido nu-cléico que codifica um polipeptídeo pode normalmente incluir um promotore/ou outros elementos de controle de transcrição ou translação operavel-mente associados a uma ou mais regiões de codificação. Uma associaçãooperável é quando uma região de codificação para um produto de gene, porexemplo, um polipeptídeo, está associada a uma ou mais seqüências regu-ladoras em um tal modo para colocar a expressão do produto de gene sob ainfluência ou controle da(s) seqüência(s) reguladora(s). Dois fragmentos deDNA (tais como uma região de codificação de polipeptídeo e um promotorassociado a este) estão "operavelmente associadosu" se indução da funçãode promotor resultar na transcrição do mRNA que codifica o produto de genedesejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA nãointerferir com a habilidade das seqüências reguladoras da expressão de di-recionar a expressão do produto de gene ou interferir com a habilidade domodelo de DNA a ser transcrito. Desse modo, uma região de promotor seriaoperavelmente associada a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeose o promotor fosse capaz de realizar a transcrição daquele ácido nucléico.O promotor pode ser um promotor célula-específico que direciona a transcri-ção substancial do DNA apenas nas células predeterminadas. Outros ele-mentos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo inten-sificadores, operadores, repressores, e sinais de terminação de transcrição,podem ser operavelmente associados ao polinucleotídeo para direcionar atranscrição célula-específica. Os promotores adequados e outras regiões decontrole de transcrição são revelados aqui.
Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conheci-da àqueles versados na técnica. Estes incluem, sem limitação, regiões decontrole de transcrição que funciona nas células vertebradas, tais como, masnão limitados a, os segmentos de promotor e de intensificador de citomega-lovírus (o promotor prematuro imediato, junto com o íntron-A), símio vírus 40(o promotor prematuro), e retrovírus (tal como vírus do sarcoma de Rous).Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas dosgenes vertebrados tais como actina, proteína de choque térmico, hormôniode crescimento bovino e β-globina de coelho, como também outras seqüên-cias capazes de controlar a expressão do gene em células eucarióticas. Re-giões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem os promoto-res e intensificadores tecido-específicos como também os promotores indu-zíveis por Iinfocina (por exemplo, promotores induzíveis por interferonas ouinterleucinas).
Similarmente, uma variedade de elementos de controle de trans-lação é conhecida àqueles de habilidade usual na técnica. Estes incluem,mas não são limitados a, sítios de ligação de ribossoma, iniciação de trans-lação e códons de terminação, e elementos derivados de picornavírus (parti-cularmente um sítio de entrada de ribossoma interno, ou IRES, também refe-rido como uma seqüência de CITE).
Em outras modalidades, um polinucleotídeo da presente inven-ção é RNA, por exemplo, na forma de mensageiro RNA (mRNA).
Polinucleotídeo e regiões de codificação de ácido nucléico dapresente invenção podem ser regiões de codificação adicionais associadasàs que codificam peptídeos secretórios ou de sinal, que direcionam a secre-ção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente in-venção. De acordo com a hipótese de sinal, as proteínas segregadas pelascélulas mamíferas têm um peptídeo sinal ou seqüência líder secretória quesão clivados da proteína madura uma vez a exportação da cadeia de proteí-na crescente ao longo do retículo endoplásmico áspero foi iniciada. Aquelesde habilidade usual na técnica estarão atentos que polipeptídeos segrega-dos por células vertebradas em geral têm um peptídeo sinal fundido no tér-mino N do polipeptídeo, que é clivado do polipeptídeo completo ou de "com-primento total" para produzir uma forma do polipeptídeo segregado ou "ma-duro". Em certas modalidades, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, um pep-tídeo sinal de imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leve é usado, ouum derivado funcional daquela seqüência que retém a habilidade para dire-cionar a secreção do polipeptídeo que está operavelmente associado a este.Alternativamente, um peptídeo sinal mamífero heterólogo, ou um derivadofuncional do mesmo, pode ser usado. Por exemplo, a seqüência líder do tiposelvagem pode ser substituída com a seqüência líder do ativador de plasmi-nogênio de tecido humano (TPA) ou β-glucuronidase de camundongo.
A presente invenção é direcionada a certos anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dosmesmos. A menos que especificamente referindo a anticorpos de tamanhototal tais como anticorpos de ocorrência natural, o termo "anticorpos de IGF-1R" abrange anticorpos de tamanho total como também fragmentos de liga-ção de antígeno, variantes, análogos, ou derivados de tais anticorpos, porexemplo, anticorpo de ocorrência natural ou moléculas de imunoglobulina oumoléculas de anticorpo engenheiradas ou fragmentos que ligam antígeno deuma maneira similar às moléculas de anticorpo.
Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados alternada-mente aqui. Um anticorpo ou imunoglobulina compreende pelo menos o do-mínio variável de uma cadeia pesada, e normalmente compreende pelo me-nos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estru-turas de imunoglobulina básicas em sistemas vertebrados são relativamentebem entendidas. Vide, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A LaboratoryManual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2- ed. 1988).
Como será debatido em mais detalhe abaixo, o termo "imuno-globulina" compreende várias classes vastas de polipeptídeos que podemser distinguidos bioquimicamente. Aqueles versados na técnica apreciarãoque cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsí-lon, (γ, μ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre elas (por exemplo, γ1-γ4). Éa natureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG,IgM, IgA IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina(isótipos) por exemplo, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. são bem caracteri-zadas e são conhecidas conferir especialização funcional. Versões modifica-das de cada uma destas classes e isótipos são facilmente discerníveis aoartesão versado em vista da revelação imediata e, conseqüentemente, estãodentro do escopo da invenção imediata. Todas as classes de imunoglobulinaestão claramente dentro do escopo da presente invenção, o debate a seguirserá em geral direcionado à classe de IgG das moléculas de imunoglobulina.Com respeito à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreendedois polipeptídeos de cadeia leve idênticos de peso molecular aproximada-mente de 23.000 Daltons, e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticosde peso molecular de 53.000-70.000. As quatro cadeias são tipicamente u-nidas através de ligações de dissulfeto em uma configuração "Y" em que ascadeias leves agrupam as cadeias pesadas iniciando na boca do "Y" e con-tinuando através da região variável.
Cadeias leve são classificadas como capa ou Iambda (κ, ˄). Ca-da classe de cadeia pesada pode ser ligada com uma cadeia leve capa oulambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadasuma à outra, e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas estão liga-das umas às outras por ligações covalentes ou ligações não-covalentes dedissulfeto quando as imunoglobulinas ou forem geradas por hibridomas, cé-lulas B ou células hospedeiras geneticamente engenheiradas. Na cadeiapesada, as seqüências de aminoácido estendem-se de um término N paraas terminações bifurcadas da configuração em Y para o término C ao fundode cada cadeia.
As cadeias leves e pesadas são divididas em regiões de homo-logia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são funcio-nalmente usados. Nesta consideração, será apreciado que os domínios vari-áveis de ambas porções de cadeia leve (VL) e pesada (VH) determinam oreconhecimento e especificidade do antígeno. Inversamente, os domíniosconstantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) con-ferem propriedades biológicas importantes tais como secreção, mobilidadetransplacentária, ligação do receptor de Fc, ligação do complemento, e ou-tros. Por convenção a numeração dos domínios de região constante aumen-tam à medida que eles ficam mais distais do sítio de ligação de antígeno outérmino amino do anticorpo. A porção N-terminal é uma região variável e aporção C-terminal é uma região constante; os domínios de CH3 e CL naverdade compreendem o término carbóxi da cadeia pesada e leve, respecti-vamente.
Como indicado acima, a região variável permite o anticorpo sele-tivamente reconhecer e especificamente ligar epítopos nos antígenos. Ouseja, o domínio de VL e domínio de VH, ou subconjunto das regiões de de-terminação de complementaridade (CDRs), de um anticorpo combinam paraformar a região variável que define um sítio de ligação de antígeno tridimen-sional. Esta estrutura de anticorpo quaternária forma o sítio de ligação deantígeno presente no término de cada braço do Y. Mais especificamente, osítio de ligação de antígeno é definido por três CDRs em cada uma das ca-deias de VH e VL. Em algumas circunstâncias, por exemplo, certas molécu- las de imunoglobulina derivadas de espécies de camelídeo ou engenheira-das com base nas imunoglobulinas de camelídeo, uma molécula de imuno-globulina completa pode consistir em cadeias pesadas apenas, sem cadeiasleves. Vide, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448(1993).
Em anticorpos de ocorrência natural, as seis "regiões de deter-minação de complementaridade" ou "CDRs" presentes em cada domínio deligação de antígeno são seqüências curtas, não-contíguas de aminoácidosque estão especificamente posicionadas para formar o domínio de ligaçãode antígeno à medida que o anticorpo assume sua configuração tridimensio- nal em um ambiente aquoso. O restante dos aminoácidos nos domínios deligação de antígeno, referido como regiões de "estrutura", mostram variabili-dade menor intermolecular. As regiões de estrutura adotam em grande parteuma conformação de folha β e as CDRs formam alças que conectam, e emalguns casos formam parte de, a estrutura de folha β. Desse modo, as regi- ões de estrutura atuam para formar um andaime que provê posicionamentodas CDRs em orientação correta através de interações não-covalentes deintercadeia. O domínio de ligação de antígeno formado pelas CDRs posicio-nadas define uma superfície complementar para o epítopo no antígeno imu-norreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não-covalente do anticorpo a seu epítopo cognato. Os aminoácidos compreendendo asCDRs e as regiões de estrutura, respectivamente, podem ser identificadosfacilmente por qualquer região variável dada de cadeia pesada ou leve poralguém de habilidade usual na técnica, uma vez que eles foram precisamen-te definidos (vide, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); e Chothiae Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987), que é incorporado aqui por refe-rência em sua totalidade).No caso onde houver duas ou mais definições de um termo queé usado e/ou aceito dentro da técnica, a definição do termo como aqui usadoé intencionada incluir todos tais significados a menos que explicitamente docontrário declarado. Um exemplo específico é o uso do termo "região de de-terminação de complementaridade" ("CDR") para descrever o antígeno não-contíguo que combina os sítios encontrados dentro da região variável dosambos polipeptídeos de cadeia pesada e cadeia leve. Esta região particularfoi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Se-quences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia et al., J.Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que é incorporado aqui por referência, ondeas definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de amino-ácido quando comparados entre si. Não obstante, a aplicação de qualquerdefinição para referir a uma CDR de um anticorpo ou variantes do mesmo éintencionada estar dentro do escopo do termo como aqui definido e usado.Os resíduos de aminoácido apropriados como os que abrangem as CDRsdefinidos por cada uma das referências acima citadas são expostos abaixona TABELA 1 como uma comparação. Os números de resíduo exatos queabrangem uma CDR particular variarão, dependendo da seqüência e tama-nho da CDR. Aqueles versados na técnica podem habitualmente determinarque os resíduos compreendem uma CDR particular dada a seqüência deaminoácido de região variável do anticorpo.TABELA 1. Definições de CDR1
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1 Numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 são de acordo comas convenções de numeração expostas por Kabat et al. (vide abaixo).
Kabat et al. também definiu um sistema de numeração para se-qüências de domínio variável que é aplicável para qualquer anticorpo. Al-guém de habilidade usual na técnica pode de maneira desambigua atribuireste sistema de "numeração de Kabat" a qualquer seqüência de domíniovariável, sem confiança em quaisquer dados experimentais além da própriaseqüência. Como aqui usado, "numeração de Kabat" refere-se ao sistemade numeração exposto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and HumanServices, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menosque do contrário especificado, referências à numeração das posições do re-síduo de aminoácido específico em um anticorpo de IGF-1R ou fragmento deligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da presente invençãosão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
Em espécies de camelídeo, a região variável de cadeia pesada,referida como VHH, forma o domínio de ligação de antígeno inteiro. As dife-renças principais entre as regiões variáveis de VHH de camelídeo e aquelasderivadas de anticorpos convencionais (VH) incluem (a) aminoácidos maishidrofóbicos na superfície de contato da cadeia leve de VH quando compa-rado à região correspondente em VHH, (b) uma CDR3 mais longo em VHH,\ e (c) a ocorrência freqüente de uma ligação de dissulfeto entre CDR1 e C-DR3 em VHH.
Anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ouderivados dos mesmos da invenção incluem, mas não são limitados a, poli-clonal, monoclonal, multiespecífico, humano, humanizado, de primata, ouanticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos de ligaçãode epítopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia simples(scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligado a dissulfeto (sdFv), frag- mentos compreendendo um domínio de VL ou de VH, fragmentos produzi-dos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anticorpos anti-idiotípicos(anti-id) (incluindo, por exemplo, anticorpos de anti-id para anticorpos deIGF-1R revelados aqui). Moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e sãodescritas, por exemplo, na patente US 5.892.019. Moléculas de imunoglobu-Lina ou de anticorpo da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo,IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), classe (por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4,IgAI e lgA2) ou subclasse da molécula de imunoglobulina.Fragmentos de anticorpo, incluindo anticorpos de cadeia simi-ples, podem compreender a(s) região(ões) variável(is) sozinha(s) ou emcombinação com a totalidade ou uma porção dos seguintes: região de do-bradiça, domínios de CH1, CH2, e CH3. Também incluído na invenção estáo fragmentos de ligação de antígeno também compreendendo qualquercombinação da(s) região(ões) variável(is) com uma região de dobradiça,domínio de CH1, CH2, e CH3. Anticorpos ou fragmentos imunoespecíficosdos mesmos da presente invenção podem ser de qualquer origem animalincluindo pássaros e mamíferos. Preferivelmente1 os anticorpos são huma-nos, murinos, anticorpos de jumento, coelho, cabra, cobaia, camelo, lhama,cavalo, ou de galinha. Em outra modalidade, a região variável pode ser con-drictóide em origem (por exemplo, de tubarões). Como aqui usado, anticor-pos "humanos" incluem anticorpos tendo a seqüência de aminoácido de umaimunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imu-noglobulina humanas ou de animais transgênicos para uma ou mais imuno-globulinas humanas e que não expressem imunoglobulinas endógenas, co-mo infra descrito e, por exemplo, na Pat. U. S. No. 5.939.598 por Kucherla-pati et al.
Como aqui usado, o termo "porção de cadeia pesada" inclui se-qüências de aminoácido derivadas de uma cadeia pesada da imunoglobuli-na. Um polipeptídeo compreendendo uma porção de cadeia pesada com-preende pelo menos um dentre: um domínio de CH1, uma domínio de do-bradiça (por exemplo, região de dobradiça mais alta, intermediária, e/oumais baixa), um domínio de CH2, um domínio de CH3, ou uma variante oufragmento do mesmo. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação para o usona invenção pode compreender uma cadeia de polipeptídeo que compreen-de um domínio de CH1; uma cadeia de polipeptídeo que compreende umdomínio de CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, e umdomínio de CH2; uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domíniode CH1 e um domínio de CH3; uma cadeia de polipeptídeo que compreendeum domínio de CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, eum domínio de CH3, ou uma cadeia de polipeptídeo que compreende umdomínio de CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, umdomínio de CH2, e um domínio de CH3. Em outra modalidade, um polipeptí-deo da invenção compreende uma cadeia de polipeptídeo que compreendeum domínio de CH3. Também, um polipeptídeo de ligação para o uso nainvenção pode carecer pelo menos de uma porção de um domínio de CH2(por exemplo, toda ou parte de um domínio de CH2). Como exposto acima,será entendido por alguém de habilidade usual na técnica que estes domí-nios (por exemplo, as porções de cadeia pesadas) podem ser modificadosde modo que eles variem na seqüência de aminoácido da molécula de imu-noglobulina de ocorrência natural.
Em certos anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação deantígeno, variantes, ou derivados dos mesmos revelados aqui, as porçõesdas cadeia pesadas de uma cadeia de polipeptídeo de um multímero sãoidênticas às em uma segunda cadeia de polipeptídeo do multímero. Alterna-tivamente, monômeros contendo porção da cadeia pesada da invenção nãosão idênticos. Por exemplo, cada monômero pode compreender um sítio deligação alvo diferente, formando, por exemplo, um anticorpo biespecífico.
As porções de cadeia pesada de um polipeptídeo de ligação pa-ra o uso nos métodos de diagnóstico e tratamento revelados aqui podem serderivadas das moléculas de imunoglobulina diferentes. Por exemplo, umaporção de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domíniode CH1 derivado de uma molécula de IgGI e uma região de dobradiça deri-vada de uma molécula de lgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeiapesada pode compreender uma região de dobradiça derivada, em parte, deuma molécula de lgG1 e, em parte, de uma molécula de lgG3. Em outro e-xemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma dobradiçaquimérica derivada, em parte, de uma molécula de lgGI e, em parte, de umamolécula de lgG4.
Como aqui usado, o termo "porção de cadeia leve" inclui se-qüências de aminoácido derivadas de uma cadeia leve de imunoglobulina.Preferivelmente, a porção de cadeia leve compreende pelo menos um dentreum domínio de VL ou de CL.Anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno,variantes, ou derivados dos mesmos revelados aqui podem ser descritos ouespecificados em termos do(s) epítopo(s) ou porção(ões) de um antígeno,por exemplo, um polipeptídeo alvo (IGF-1R) que eles reconhecem ou especi-ficamente ligam. A porção de um polipeptídeo alvo que especificamente inte-rage com o domínio de ligação de antígeno de um anticorpo é um "epítopo",ou um "determinante antigênico". Um polipeptídeo alvo pode compreenderum epítopo simples, mas tipicamente compreende pelo menos dois epíto-pos, e pode incluir qualquer número de epítopos, dependendo do tamanho,conformação, e tipo do antígeno. Além disso, deveria ser observado que um"epítopo" em um polipeptídeo alvo pode ser ou incluir elementos de não-polipeptídeo, por exemplo, um "epítopo pode incluir uma cadeia lateral decarboidrato.
É crido que o tamanho mínimo de um epítopo de peptídeo ou depolipeptídeo para um anticorpo é aproximadamente quatro a cinco aminoá-cidos. Epítopos de peptídeo ou polipeptídeo preferivelmente contêm pelomenos sete, mais preferivelmente pelo menos nove e o mais preferivelmenteentre pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Considerando queuma CDR pode reconhecer um peptídeo ou polipeptídeo antigênico em suaforma terciária, os aminoácidos que compreendem um epítopo não são ne-cessariamente contíguos, e em alguns casos, podem nem mesmo estaremna mesma cadeia de peptídeo. Na presente invenção, epítopo de peptídeoou polipeptídeode reconhecidos por anticorpos de IGF-1R da presente in-venção contém uma seqüência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos6, pelo menos 7, mais preferivelmente pelo menos 8, pelo menos 9, pelomenos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, ou entre cerca de15 a cerca de 30 aminoácidos contíguos ou não-contíguos de IGF-1R.
Por "especificamente liga", é em geral significado que um anti-corpo liga a um epítopo por meio de seu domínio de ligação de antígeno, eque a ligação requer alguma complementaridade entre o domínio de ligaçãode antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, um anticorpo é dito"especificamente ligar" a um epítopo quando liga àquele epítopo, por meiode seu domínio de ligação de antígeno mais facilmente do que ligaria a umepítopo aleatório, não relacionado. O termo "especificidade" é aqui usadopara qualificar a afinidade relativa pela qual um certo anticorpo liga a um cer-to epítopo. Por exemplo, anticorpo "A" pode ser julgado ter uma especifici-dade mais alta a um epítopo dado que o anticorpo "B", ou anticorpo "A" podeser dito ligar ao epítopo "C" com uma especificidade mais alta que tem parao epítopo relacionado "D".
Por "preferencialmente liga", é significado que o anticorpo espe-cificamente liga a um epítopo mais facilmente do que ligaria a um epítoporelacionado, similar, homólogo, ou análogo. Desse modo, um anticorpo que"preferencialmente liga" a um epítopo dado mais provavelmente ligará àque-le epítopo que a um epítopo relacionado, embora um tal anticorpo possa re-agir cruzado com o epítopo relacionado.
Por via de exemplo não-limitativo, um anticorpo pode ser consi-derado ligar a um primeiro epítopo preferencialmente se ligar ao dito primeiroepítopo com uma constante de dissociação (Kd) que é menor que a Kd doanticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não-limitativo, um anti-corpo pode ser considerado ligar a um primeiro antígeno preferencialmentese ligar ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma or-dem de magnitude menor que a K0 do anticorpo para o segundo epítopo.Em outro exemplo não-limitativo, um anticorpo pode ser considerado ligar aum primeiro epítopo preferencialmente se ligar ao primeiro epítopo com umaafinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menores que a Kd doanticorpo para o segundo epítopo.
Em outro exemplo não-limitativo, um anticorpo pode ser conside-rado ligar a um primeiro epítopo preferencialmente se ligar ao primeiro epí-topo com uma taxa off (k(off)) que é menor que a k(off) do anticorpo para osegundo epítopo. Em outro exemplo não-limitativo, um anticorpo pode serconsiderado ligar a um primeiro epítopo preferencialmente se ligar ao primei-ro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magnitudemenor que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplonão-limitativo, um anticorpo pode ser considerado ligar a um primeiro epíto-po preferencialmente se ligar ao primeiro epítopo com uma afinidade que épelo menos duas ordens de magnitude menores que a k(off) do anticorpopara o segundo epítopo.
Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ouderivado revelados aqui pode ser dito ligar a um polipeptídeo alvo reveladoaqui ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa off (k(off)) menorou igual a 5 X 10"2 seg"1, 10"2 seg"1, 5 X IO 3 seg"1 ou seg"1 de IO"3. Mais prefe-rivelmente, pode ser dito que um anticorpo da invenção liga a um polipeptí-deo alvo revelado aqui ou um fragmento ou variante do mesmo com umataxa off (k(off)) menor ou igual a 5 X 10"4 seg"1, 10"4 seg"1, 5 X 10"5 seg"1, ou10"5 seg"1 5 X 10 6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 X 10"7 seg"1 ou 10"7 seg"1.
Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ouderivado revelados aqui pode ser dito ligar a um polipeptídeo alvo reveladoaqui ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa on (k(on)) maiorou igual a 103 M"1 seg"1, 5 X 103 M"1 seg"1, 104 M1 seg"1 ou 5 X 104 M1 seg"1.Mais preferivelmente, pode ser dito que um anticorpo da invenção liga a umpolipeptídeo alvo revelado aqui ou um fragmento ou variante do mesmo comuma taxa on (k(on)) maior ou igual a 105 M1 seg"1, 5 X 105 M1 seg"1, 106 M"1seg"1, ou 5 X 106 M"1 seg"1 ou 107 M"1 seg"1.
Um anticorpo é dito competitivamente inibir a ligação de um anti-corpo de referência a um epítopo dado se ligar preferencialmente àqueleepítopo a uma extensão que bloqueia, até certo ponto, ligação do anticorpode referência ao epítopo. Inibição competitiva pode ser determinada porqualquer método conhecido na técnica, por exemplo, ensaios de ELISA decompetição. Um anticorpo pode ser dito competitivamente inibir a ligação doanticorpo de referência a um epítopo dado por pelo menos 90%, pelo menos80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%.
Como aqui usado, o termo "afinidade" refere-se a uma medidada resistência da ligação de um epítopo individual com a CDR de uma molé-cula de imunoglobulina. Vide, por exemplo, Harlow etal., Antibodies: A Labo-ratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2- ed. 1988) nas pági-nas 27-28. Como aqui usado, o termo "avidez" refere-se à estabilidade geraldo complexo entre uma população das imunoglobulinas e um antígeno, istoé, a resistência combinante funcional de uma mistura da imunoglobulina como antígeno. Vide, por exemplo, Harlow nas páginas 29-34. Avidez é relacio-nada tanto à afinidade das moléculas de imunoglobulina individuais na popu-lação com epítopos específicos, como também as valências das imunoglo-bulinas e do antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo mono-clonal bivalente e um antígeno com uma estrutura de epítopo altamente re-petitiva, tal como um polímero, seria uma de avidez alta.
Anticorpos de IGF-1R ou fragmentos de ligação de antígeno,variantes ou derivados dos mesmos da invenção podem também ser descri-tos ou especificados em termos de sua reatividade cruzada. Como aqui usa-do, o termo "reatividade cruzada" refere-se à habilidade de um anticorpo,específico para um antígeno, de reagir com um segundo antígeno; uma me-dida de relatividade entre duas substâncias antigênicas diferentes. Dessemodo, um anticorpo é reativo cruzado se ligar a um epítopo diferente de oque induziu sua formação. O epítopo reativo cruzado em geral contém mui-tas das mesmas características estruturais complementares como o epítopoindutor, e em alguns casos, pode na verdade ajustar-se melhor que o origi-nal.
Por exemplo, certos anticorpos têm algum grau de reatividadecruzada, em que eles ligam epítopos relacionados, mas não-idênticos, porexemplo, epítopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, e pelo menos 50 %de identidade(conforme calculado usando métodos conhecidos na técnica e descritos a -qui) a um epítopo de referência. Pode ser dito que um anticorpo tem peque-na ou nenhuma reatividade cruzada se não ligar a epítopos com menos que95%, menos que 90%, menos que 85%, menos que 80%, menos que 75%,menos que 70%, menos que 65%, menos que 60%, menos que 55%, e me-nos de 50 %de identidade (conforme calculado usando métodos conhecidosna técnica e descritos aqui) a um epítopo de referência. Um anticorpo podeser julgado "altamente específico" para um certo epítopo, se não ligar aqualquer outro análogo, ortólogo, ou homólogo daquele epítopo.
Anticorpos de IGF-1R ou fragmentos ligação de antígeno, vari-antes ou derivados dos mesmos da invenção podem também ser descritosou especificados em termos de sua afinidade de ligação a um polipeptídeoda invenção. Afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com umaconstante de dissociação ou Kd menor que 5 χ 10~2 Μ, 10"2 M1 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10~12 M1 10"12 Μ, 5 χ 10"13 Μ, 10'13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15M, ou 10"15 Μ.
Anticorpos de IGF-1R ou fragmentos ligação de antígeno, vari-antes ou derivados dos mesmos da invenção podem ser "multiespecíficos",por exemplo, biespecíficos, triespecíficos ou de maior multiespecificidade,significando que reconhece e liga a dois ou mais epítopos diferentes presen-tes em um ou mais antígenos diferentes (por exemplo, proteínas) ao mesmotempo. Desse modo, se um anticorpo de IGF-1R for "monoespecífico" ou"multiespecífico", por exemplo, "biespecífico", refere-se ao número de epíto-pos diferentes com os quais um polipeptídeo de ligação reage. Anticorposmultiespecíficos podem ser específicos para epítopos diferentes de um poli-peptídeo alvo descrito aqui ou pode ser específico para um polipeptídeo alvocomo também para um epítopo heterólogo, tal como um polipeptídeo heteró-logo ou material de suporte sólido.
Como aqui usado o termo "valência" refere-se ao número dedomínios de ligação potenciais, por exemplo, domínios de ligação de antíge-no, presentes em um anticorpo de IGF-1R, ligando o polipeptídeo ou anti-corpo. Cada domínio de ligação especificamente liga um epítopo. Quandoum anticorpo de IGF-1R, ligando o polipeptídeo ou anticorpo compreendermais de um domínio de ligação, cada domínio de ligação pode especifica-mente ligar o mesmo epítopo, para um anticorpo com dois domínios de Iiga-ção, denominado "monoespecífico bivalente", ou a epítopos diferentes, paraum anticorpo com dois domínios de ligação, denominado "biespecífico biva-lente". Um anticorpo pode também ser biespecífico e bivalente para cadaespecificidade (denominado "anticorpos biespecíficos tetravalentes"). Emoutra modalidade, minicorpos tetravalentes ou anticorpos de domínios dele-tados podem ser feitos.
Anticorpos bivalentes biespecíficos, e métodos de fazê-los, sãodescritos, por exemplo nas patentes U. S. Nos. 5.731.168; 5.807.706;5.821.333; e Publ. dos Peds. U. S. Nos. 2003/020734 e 2002/0155537, asrevelações de todos são incorporadas aqui por referência. Anticorpos bies-pecíficos tetravalentes, e métodos de fazê-los, são descritos por exemplo,em WO 02/096948 e WO 00/44788, as revelações de ambas são incorpora-das aqui por referência. Vide em geral, publicações de PCT WO 93/17715;WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); Pats. U. S. Nos. 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920;5.601.819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553(1992).
Como previamente indicado, as estruturas da subunidade e con-figuração tridimensional das regiões constantes das várias classes de imu-noglobulina são bem conhecidas. Como aqui usado, o termo "domínio deVH" inclui o domínio variável de amino terminal de uma cadeia pesada daimunoglobulina e o termo "domínio de CH1" inclui o primeiro (mais aminoterminal) domínio da região constante de uma cadeia pesada da imunoglo-bulina. O domínio de CH1 é adjacente ao domínio de VH e é amino terminalpara a região de dobradiça de uma molécula de cadeia pesada de imuno-globulina.
Como aqui usado o termo "domínio de CH2" inclui a porção deuma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca deresíduo 244 a resíduo 360 de um anticorpo usando os esquemas de nume-ração convencionais (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat;e resíduos 231-340, sistema de numeração de EU; vide Kabat EA et al. op.cit. O domínio de CH2 é único em que não está estritamente equiparadocom outro domínio. Do contrário, duas cadeias de carboidrato ramificadas N-ligadas são interpostas entre os dois domínios de CH2 de uma molécula deIgG nativa intacta. Está também bem documentado que o domínio de CH3estende-se do domínio de CH2 ao C-terminal da molécula de IgG e compre-ende aproximadamente 108 resíduos.
Como aqui usado, o termo "região de dobradiça" inclui a porçãode uma molécula de cadeia pesada que une o domínio de CH1 ao domíniode CH2. Esta região de dobradiça compreende aproximadamente 25 resí-duos e é flexível, desse modo permiti as duas regiões de ligação de antígenoN-terminais moverem-se independentemente. As regiões de dobradiça po-dem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobradiça su-perior, meio, e inferior (Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998)).
Como aqui usado o termo "ligação de dissulfeto" inclui a ligaçãocovalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteínacompreende um grupo tiol que pode formar uma ligação de dissulfeto ou emponte com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG de ocor-rência natural, as regiões de CH1 e CL são ligadas por uma ligação de dis-sulfeto e as duas cadeias pesadas são ligadas através de duas ligações dedissulfeto nas posições que correspondem a 239 e 242 usando o sistema denumeração de Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração de EU).
Como aqui usado, o termo "anticorpo quimérico" será mantidopara significar qualquer anticorpo em que a região ou sítio imunorreativo éobtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que podeser intacta, parcial ou modificada de acordo com a invenção imediata) é ob-tida de uma segunda espécie. Em modalidades preferidas, a região ou sítiode ligação alvo será de uma fonte não-humana (por exemplo camundongoou primata) e a região constante é humana.
Como aqui usado, o termo "anticorpo engenheirado" refere-se aum anticorpo em que o domínio variável na cadeia pesada e leve ou ambassão alterados pelo menos por substituição parcial de uma ou mais CDRs deum anticorpo de especificidade conhecida e, se necessário, substituição daregião de estrutura parcial e alteração de seqüência. Embora as CDRs pos-sam ser derivadas de um anticorpo da mesma classe ou até mesmo sub-classe como o anticorpo daquelas regiões de estrutura são derivadas, asCDRs são intencionadas ser derivadas de um anticorpo de classe diferente epreferivelmente de um anticorpo de uma espécie diferente. Um anticorpoengenheirado, em que uma ou mais CDRs do "doador" de um anticorpo não-humano de especificidade conhecida são enxertadas em uma região estrutu-ra de cadeia pesada ou leve humana, é referido aqui como um "anticorpohumanizado". Pode não ser necessário substituir todas as CDRs com asCDRs completas da região variável de doador para transferir a capacidadede ligação do antígeno de um domínio variável para o outro. Do contrário,- pode ser apenas necessário transferir aqueles resíduos que são necessáriospara manter a atividade do sítio de ligação alvo. Dadas as explanações ex-postas, por exemplo, Pat. U. S. Nos. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762, e6.180.370, estará bem dentro da competência daqueles versados na técnica,ou realizando experimentação rotineira ou por testagem de tentativa e erropara obter um anticorpo funcional engenheirado ou humanizado.
Como aqui usado o termo "polipeptídeo corretamente dobrado"inclui polipeptídeos (por exemplo, anticorpos de IGF-1R) em que todos osdomínios funcionais compreendendo o polipeptídeo são distintamente ativos.Como aqui usado, o termo "polipeptídeo impropriamente dobrado" inclui po-lipeptídeos em que pelo menos um dos domínios funcionais do polipeptídeonão é ativo. Em uma modalidade, um polipeptídeo corretamente dobradocompreende cadeias de polipeptídeo ligadas por pelo menos uma ligação dedissulfeto e, inversamente, um polipeptídeo impropriamente dobrado com-preende cadeias de polipeptídeo não ligadas por pelo menos uma ligação dedissulfeto.
Como aqui usado o termo "engenheirado" inclui manipulação demoléculas de ácido nucléico ou de polipeptídeo através de meios sintéticos(por exemplo através de técnicas recombinantes, síntese de peptídeo in vi-tro, por acoplamento enzimático ou químico dos peptídeos ou um pouco dacombinação destas técnicas).
Como aqui usado, os termos "ligado", "fundido" ou "fusão" sãousados alternadamente. Estes termos referem-se à ligação de dois mais e-Iementos ou componentes, por quaisquer meios incluindo meios de conjuga-ção química ou recombinantes. Uma "fusão dentro da estrutura" refere-se àligação de duas ou mais estruturas de leitura aberta (ORFs) do polinucleotí-deo para formar uma ORF mais longa contínua, de uma maneira que man-tenha a estrutura de leitura translacional correta das ORFs originais. Dessemodo, uma proteína de fusão recombinante é uma proteína simples conten-do dois ou mais segmentos que correspondem aos polipeptídeos codificadospelas ORFs original (cujos segmentos não são normalmente assim unidosna natureza). Embora a estrutura de leitura seja desse modo feita contínuaao longo dos segmentos fundidos, os segmentos podem ser física ou espa-cialmente separados por, por exemplo, seqüência de Iigador dentro da estru-tura. Por exemplo, polinucleotídeos que codificam as CDRs de uma regiãovariável de imunoglobulina podem ser fundidos, dentro da estrutura, mas sãoseparados por um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região deestrutura de imunoglobulina ou regiões de CDR adicionais, contanto que asCDRs "fundidas" sejam co-transladadas como parte de um polipeptídeo con-tínuo.
No contexto de polipeptídeos, uma "seqüência linear" ou uma"seqüência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em uma dire-ção terminal de amino para carboxila em que os resíduos que são vizinhosum do outro na seqüência são contíguos na estrutura primária do polipeptí-deo.
O termo "expressão" como aqui usado refere-se a um processopelo qual um gene produz uma bioquímica, por exemplo, um RNA ou poli-peptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional dogene dentro da célula incluindo, sem limitação, choque gênico como tambémexpressão transiente e expressão estável. Este inclui sem limitação transcri-ção do gene para RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA),RNA de alfinete pequeno (shRNA), RNA de interferência pequeno (siRNA)ou qualquer outro produto de RNA, e a translação de tal mRNA no(s) poli-peptídeo(s). Se o produto desejado final for uma bioquímica, expressão in-clui a criação desta bioquímica e qualquer precursor. Expressão de um geneproduz um "produto de gene". Como aqui usado, um produto de gene oupode ser um ácido nucléico, por exemplo, um RNA mensageiro produzidopor transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que é transladado de umatranscrição. Produtos de gene descritos aqui também incluem ácidos nucléi-cos com modificações pós-transcricionais, por exemplo, poliadenilação, oupolipeptídeos com pós modificações translacionais, por exemplo, metilação,glicosilação, a adição de lipídios, associação com outras subunidades deproteína, clivagem proteolítica, e outros.
Como aqui usado, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-sea tratamento terapêutico e medidas profilácticas ou preventivas, em que oobjetivo é impedir ou reduzir a velocidade (diminuir) uma alteração ou distúr-bio fisiológica indesejado, tal como o desenvolvimento ou expansão do cân-cer. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limi-tados a, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado dadoença estabilizado (isto é, sem piora), demora ou redução da progressãoda doença, melhora ou paliação do estado da doença, e perdão (ou parcialou total), quer detectável quer indetectável. "Tratamento" pode também sig-nificar prolongar a sobrevivência quando comparado à sobrevivência espe-rada se não receber tratamento. Aqueles em necessidade de tratamento in-cluem aqueles já com a condição ou distúrbio como também aqueles pro-pensos a ter a condição ou distúrbio ou aqueles em que a condição ou dis-túrbio será impedido.
Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamí-fero", é significado qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero,para quem diagnose, prognose, ou terapia é desejada. Sujeitos mamíferosincluem os seres humanos, animais domésticos, animais de fazenda, e dejardim zoológico, de jogos esportivos, ou animais de estimação tais comocachorros, gatos, cobaias, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, va-cas, e assim por diante.
Como aqui usado, frases tais como "um sujeito que beneficiariada administração de uma molécula de ligação" e "um animal em necessida-de de tratamento" inclui sujeitos, tais como sujeitos mamíferos que beneficia-riam de administração de uma molécula de ligação usados, por exemplo,para detecção de um antígeno reconhecido por uma molécula de ligação(por exemplo, para um procedimento diagnóstico) e/ou de tratamento, isto é,paliação ou prevenção de uma doença tal como câncer, com uma moléculade ligação que especificamente liga uma proteína alvo dado. Como descritoem mais detalhe aqui, a molécula de ligação pode ser usada em forma não-conjungada ou conjugada, por exemplo, para um fármaco, pró-medicamento,ou um isótopo.
Por "doença ou distúrbio hiperproliferativo" é significado todocrescimento e proliferação celulares neoplásticos, quer maligno ou benigno,incluindo todas células e tecidos transformados e todas as células e tecidoscancerosas. Doenças ou distúrbios hiperproliferativas incluem, mas não sãolimitados a, lesões pré-cancerosas, crescimentos de células anormais, tumo-res benignos, tumores malignos, e "câncer". Em certas modalidades da pre-sente invenção, a doença ou distúrbio hiperproliferativo, por exemplo, a le-são pré-cancerosa, crescimento de célula anormal, tumor benigno, tumormaligno, ou "câncer" compreende células que expressam, supra-expressam,ou anormalmente expressam IGF-1R.
Exemplos adicionais de doenças, distúrbios, e/ou condições hi-perproliferativas incluem, mas não são limitados a, neoplasmas, quer benig-no quer maligno, localizado na: próstata, cólon, abdômen, osso, mama, sis-tema digestivo, fígado, pâncreas, peritôneo, glândulas endócrinas (ad-renal,paratiróide, pituitária, testículos, ovário, timo, tiróide), olho, cabeça e pesco-ço, nervoso (central e periférico), sistema linfático, pélvico, pele, tecido ma-cio, baço, torácico, e trato urogenital. Tais neoplasmas, em certas modalida-des, expressam, supra-expressam, ou anormalmente expressam IGF-1R.
Outros distúrbios hiperproliferativos incluem, mas não são Iimita-dos a: hipergamaglobulinemia, distúrbios linfoproliferativos, paraproteinemi-as, púrpura, sarcoidose, Síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Wal-denstron, Doença de Gaucher, histiocitose, e qualquer outra doença hiper-proliferativa, além de neoplasia, localizada em um sistema de órgão listadoacima. Em certas modalidades da presente invenção as doenças envolvemcélulas que expressam, supra-expressam, ou Anormalmente expressamIGF-1R.
Como aqui usado, os termos "tumor" ou "tecido de tumor" refere-se a uma massa anormal de tecido que é o resultado da divisão excessivadas células, em certos casos tecido compreendendo células que expressam,supra-expressam, ou anormalmente expressam IGF-1R. Um tumor ou tecidode tumor compreende "células tumorais" que são células neoplásticas compropriedades de crescimento anormais e nenhuma função corporal útil. Tu-mores, tecido de tumor e células tumorais podem ser benignas ou malignas.
Um tumor ou tecido de tumor podem também compreender "células não-tumorais associadas ao tumor", por exemplo, células vasculares que formamvasos sangüíneos para prover o tumor ou tecido de tumor. Células não-tumorais podem ser induzidas a replicarem-se e desenvolverem-se atravésdas células tumorais, por exemplo, a indução de angiogênese em um tumorou tecido de tumor.
Como aqui usado, o termo "malignidade" refere-se a um tumornão-benigno ou um câncer. Como aqui usado, o termo "câncer" conota umtipo de doença hiperproliferativa que inclui uma malignidade caracterizadapor crescimento celular desregulado ou descontrolado. Exemplos de câncerincluem, mas não são limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, eleucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais particulares de tais cân-ceres são observados abaixo e incluem: câncer de célula escamosa (porexemplo câncer de célula escamosa epitelial), câncer de pulmão incluindocâncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma pulmonar escamoso,câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, gástrico ou câncer de estômagoincluindo câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncercervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma,câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, câncerendometrial ou carcinoma uterino, carcinoma de glândula salivai, rim ou cân-cer renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer tiróide, carcinoma hepá-tico, carcinoma anal, carcinoma peniano, como também câncer de cabeça epescoço. O termo "câncer" inclui células ou tumores malignos primários (porexemplo, aqueles dos quais as células não migraram para os sítios no corpodo sujeito diferente do sítio da malignidade ou tumor original) e células outumores malignos secundários (por exemplo, aqueles surgindo da metásta-se, d migração de células malignas ou células tumorais para sítios secundá-rios que são diferentes do sítio do tumor original). Cânceres conducentesaos métodos de tratamento da presente invenção envolvem células que ex-pressam, supra-expressam, ou anormalmente expressam IGF-1R.
Outros exemplos de cânceres ou malignidades incluem, mas. não são limitados a: Leucemia Linfoblástica Infantil Aguda, Leucemia Linfo-blástica Aguda, Leucemia Linfocítica Aguda, Leucemia Mielóide Aguda, Car-cinoma Adrenocortical, Câncer Hepatocelular Adulto (Primário), Câncer He-pático Adulto (Primário), Leucemia Linfocítica Aguda Adulta, Leucemia Mie-lóide Aguda Adulta, Doença de Hodgkin Adulta, Linfoma de Hodgkin Adulto,Leucemia Linfocítica Adulto, Linfoma de Não-Hodgkin Adulto, Câncer Hepá-tico Adulto Primário, Sarcoma de Tecido Macio Adulto, Linfoma relacionadoa AIDS, Malignidades relacionadas a AIDS, Câncer Anal, Astrocitoma, Cân-cer de Duto Biliar, Câncer de Bexiga, Câncer de Osso, Glioma de TroncoCerebral, Tumores cerebrais, Câncer de Mama, Câncer da Pélvis Renal eUreter, Linfoma do Sistema Nervoso Central (Primário), Linfoma do SistemaNervoso Central, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral, Câncer Cer-vical, Câncer Hepatocelular Infantil (Primário), Câncer Hepático Infantil (Pri-mário), Leucemia Linfoblástica Aguda Infantil, Leucemia Mielóide Aguda In-fantil, Glioma do Tronco Cerebral Infantil, Astrocitoma Cerebelar Infantil, As-trocitoma Cerebral Infantil, Tumores de Célula Germinal Extracraniano Infan-til, Doença de Hodgkin Infantil, Linfoma de Hodgkin Infantil, Glioma Hipota-lâmica e da Via Visual Infantil, Leucemia Linfoblástica Infantil, Meduloblas-toma Infantil, Linfoma de Não-Hodgkin Infantil, Tumores NeuroectodermaisPrimitivos Pineais e Supratentoriais Infantis, Câncer Hepático Primário Infan-til, Rhabdomiossarcoma Infantil, Sarcoma de Tecido Macio Infantil, Gliomada Via Visual e Hipotalâmica Infantil, Leucemia Linfocítica Crônica, LeucemiaMielogenosa Crônica, Câncer de Cólon, Linfoma de Célula T Cutânea, Car-cinoma Endócrino de Célula da Ilhota do Pâncreas, Câncer Endometrial, E-pendimoma, Câncer Epitelial, Câncer Esofagiano, Sarcoma de Ewing e Tu-mores Relacionados, Câncer Pancreático Exócrino, Tumor de Célula Germi-nal Extracraniana1 Tumor de Célula Germinal Extragonadal1 Câncer do DutoBiliar Extra-hepático, Câncer de Olho1 Câncer de Mama Feminino, Doençade Gaucher1 Câncer da Vesícula Biliar, Câncer Gástrico, Tumor CarcinóideGastrintestinal, Tumores Gastrintestinais, Tumores de Célula Germinal, Tu-mor Trofoblástico Gestational, Leucemia de Célula Cabeluda, Câncer daCabeça e Pescoço, Câncer Hepatocelular, Doença de Hodgkin1 Linfoma deHodgkin1 Hipergamaglobulinemia1 Câncer Hipofaringeano, Cânceres Intesti-nais, Melanoma lntraocular, Carcinoma de Célula da Ilhota, Câncer Pancreá-tico de Célula da Ilhota, Sarcoma de Kaposi, Câncer de Rim, Câncer Larín-geo, Câncer de Lábio e Cavidade Oral, Câncer de Fígado, Câncer de Pul-mão, Distúrbios Linfoproliferativos, Macroglobulinemia, Câncer de MamaMasculino, Mesotelioma Maligno, Timoma Maligno, Meduloblastoma, Mela-noma, Mesotelioma, Câncer Escamoso de Pescoço Primário Oculto Metas-tático, Câncer Escamoso de Pescoço Primário Metastático, Câncer Escamo-so de Pescoço Metastático, Mieloma Múltiplo, Mieloma Múltiplo/Neoplasmade Célula do Plasma, Síndrome Mielodisplástica, Leucemia Mielogenosa,Leucemia Mielóide, Distúrbios Mieloproliferativos, Câncer de Mama da Cavi-dade Nasal e Paranasal1 Câncer Nasofaringeano, Neuroblastoma, Linfomade Não-Hodgkin Durante a Gravidez, Câncer de Pele de Não-Melanoma,Câncer de pulmão de Célula Não-Pequena, Câncer Escamoso de PescoçoMetastático Primário Oculto, Câncer Orofaringeano, Osteo-/Sarcoma FibrosoMaligno, Osteossarcoma/Histiocitoma Maligno Fibroso, Osteossarco-ma/Histiocitoma Maligno Fibroso de Osso, Câncer Epitelial Ovariano, Tumorde Célula Germinal Ovariano, Tumor de Potencial Maligno Ovariano Baixo,Câncer Pancreático, Paraproteinemias, Púrpura, Câncer de Paratiróide,Câncer Peniano1 Feocromocitoma, Tumor Pituitário, Neoplasma de CélulaPlasmática/Mieloma Múltiplo, Linfoma de Sistema Nervoso Central Primário,Câncer Hepático Primário, Câncer de Próstata, Câncer Retal, Câncer de Cé-lula Renal, Câncer de Pélvis Renal e Ureter, Retinoblastoma, Rhabdomios-sarcoma, Câncer de Glândula Salivai, Sarcomas de Sarcoidose, Síndromede Sezary, Câncer de Pele, Câncer de Pulmão de Célula Pequena, Câncerde Intestino Delgado, Sarcoma de Tecido Macio, Câncer Escamoso de Pes-coço, Câncer de Estômago, Tumores Supratentoriais NeuroectodérmicosPrimitivos e Pineais, Linfoma de Célula T1 Câncer Testicular, Timoma, Cân-cer de Tiróide, Câncer de Célula Transitiva da Pélvis Renal e Ureter, Câncerde Pélvis Renal e Ureter Transitivo1 Tumores Trofoblásticos, Câncer de Cé-lula de Ureter e Pélvis Renal, Câncer Uretral1 Câncer Uterino, Sarcoma Ute-rina, Câncer Vaginal1 Glioma da Via Visual e Hipoftálmica, Câncer Vulvar,Macroglobulinemia de Waldenstrom1 Tumor de Wilms1 e qualquer outra do-ença hiperproIiferativa1 além de neoplasia, localizado em um sistema de ór-gão listado acima.
O método da presente invenção pode ser usado para tratar con-dições pré-malignas e impedir progressão para um estado neoplástico oumaligno, incluindo mas não limitado àqueles distúrbios descritos acima. Taisusos são indicados nas condições conhecidas ou suspeitas de preceder aprogressão para neoplasia ou câncer, em particular, onde crescimento decélula não-neoplástica que consiste em hiperplasia, metaplasia, ou mais par-ticularmente, displasia ocorrida (para revisão de tais condições de cresci-mento anormais, vide Robbins e Angell, Basic Pathology, 2- Ed., W. B.Saunders Co., Filadélfia, págs. 68-79 (1976). Tais condições, em que as cé-lulas começam a expressar, supra-expressar, ou anormalmente expressarIGF-1R, são particularmente tratáveis pelos métodos da presente invenção.
Hiperplasia é uma forma de proliferação de célula controlada,envolvendo um aumento em número de célula em um tecido ou órgão, semalteração significativa na estrutura ou função. Distúrbios hiperplásticos quepodem ser tratados pelo método da invenção incluem, mas não são Iimita-dos a, hiperplasia de Iinfonodo mediastinal angiofolicular, hiperplasia angio-linfóide com eosinófilos, hiperplasia melanocítica atípica, hiperplasia de célu-la basal, hiperplasia de Iinfonodo gigante benigno, hiperplasia de cimento,hiperplasia ad-renal congênita, hiperplasia sebácea congênita, hiperplasiacística, hiperplasia cística da mama, hiperplasia de dentadura, hiperplasiaductal, hiperplasia endometrial, hiperplasia fibromuscular, hiperplasia epiteli-al focai, hiperplasia gengival, hiperplasia fibrosa inflamatória, hiperplasia pa-pilar inflamatória, hiperplasia endotelial papilar intravascular, hiperplasia no-dular de próstata, hiperplasia nodular regenerativa, hiperplasia pseudoepite-liomatosa, hiperplasia sebácea senil, e hiperplasia verrucosa.
Metaplasia é uma forma de crescimento celular controlado emque um tipo de célula adulta ou completamente diferenciada substitui poroutro tipo de célula adulta. Distúrbios metaplásticos que podem ser tratadospelo método da invenção incluem, mas não são limitados a, metaplasia mie-lóide agnogênica, metaplasia apócrina, metaplasia atípica, metaplasia auto-parenquimatosa, metaplasia de tecido conjuntivo, metaplasia epitelial, meta-plasia intestinal, anemia metaplástica, ossificação metaplástica, pólipos me-taplásticos, metaplasia mielóide, metaplasia mielóide primária, metaplasiamielóide secundária, metaplasia escamosa, metaplasia escamosa de âmnio,e metaplasia mielóide sintomática.
Displasia freqüentemente é precursor de câncer, e é encontradoprincipalmente nos epitélios; é a forma mais desordenada de crescimento decélula não-neoplástica, envolvendo uma perda na uniformidade da célulaindividual e na orientação arquitetônica das células. Células displásicas fre-qüentemente têm núcleos anormalmente grandes, profundamente tingidos, eapresentam pleomorfismo. Displasia ocorre caracteristicamente onde existeirritação ou inflamação crônica. Distúrbios displásicos que podem ser trata-dos pelo método da invenção incluem, mas não são limitados a, displasiaectodérmica anidrótica, displasia anterofacial, displasia torácica asfixiante,displasia atriodigital, displasia broncopulmonar, displasia cerebral, displasiacervical, displasia condroectodérmica, displasia cleidocraniana, displasiaectodérmica congênita, displasia craniodiafisial, displasia craniocarpotarsal, displasia craniometafisial, displasia de dentina, displasia diafisial, displasiaectodérmica, displasia de esmalte, displasia encéfalo-oftálmica, displasiaepiphysialis hemimelia, displasia epiphysialis multiplex, displasia epiphysialispunctata, displasia epitelial, displasia faciodigitogenital, displasia fibrosa fa-milial das mandíbulas, displasia branca familial dobrada, displasia fibromus-cular, displasia fibrosa de osso, displasia óssea florida, displasia renal-retinalhereditário, displasia ectodérmica hidrótica, displasia ectodérmica hipoidróti-ca, displasia tímica linfopênica, displasia mamária, displasia mandibulofacial,displasia metafisial, displasia de Mondini1 displasia fibrosa monostótica, dis-plasia mucoepitelial, displasia epifisial múltipla, displasia oculoauriculoverte-bral, displasia oculodentodigital, displasia oculovertebral, displasia odonto-gênica, displasia oftalmomandibulomélica, displasia cemental periapical, dis-plasia fibrosa poliostótica, displasia espondiloepifisial pseudoacondroplásti-ca, displasia retinal, displasia septo-ótica, displasia espondiloepifisial, e dis-plasia ventriculoradial.
Distúrbios pré-neoplásticos adicionais que podem ser tratadospelo método da invenção incluem, mas não são limitados a, distúrbios dis-proliferativos benignos (por exemplo, tumores benignos, condições fibrocísti-cas, hipertrofia de tecido, pólipos intestinais, pólipos de cólon, e displasiaesofagiana), leucoplaquia, ceratosos, doença de Bowen, Pele de Farmer,queilite solar, e ceratose solar.
Em modalidades preferidas, o método da invenção é usado parainibir o crescimento, progressão, e/ou metástase de cânceres, em particularaqueles listados acima.
Doenças, distúrbios, e/ou condições hiperproliferativas adicio-nais incluem, mas não são limitados a, progressão, e/ou metástase das ma-lignidades e distúrbios relacionados tais como leucemia (incluindo Ieucemiasagudas (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda(incluindo mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, e eritro-leucemia)) e Ieucemias crônicas (por exemplo, leucemia mielocítica crônica(granulocítica) e leucemia linfocítica crônica)), policitemia vera, Iinfomas (porexemplo, doença de Hodgkin e doença de não-Hodgkin), mieloma múltiplo,macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada, e tumoressólidos incluindo, mas não limitados a, sarcomas ecarcinomas tais comofibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma os-teogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma,linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, Ieio-miossarcoma, rhabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, câncer pancreático,câncer de mama, câncer ovariano, câncer de próstata, carcinoma de célulaescamosa, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma deglândula de suor, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, ade-nocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinomabroncogênico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma de duto bili-ar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, cân-cer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar decélula pequena, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocito-ma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangio-blastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma,neuroblastoma, e retinoblastoma.
II. IGF-1R
Receptor de fator de crescimento insulino-símile de ocorrêncianatural (IGF-1R) IGF-1R é uma glicoproteína de membrana plasmática hete-rotetramérica composta de duas subunidades α (130 kDa cada) e duas su-bunidades β (90 kDa cada) ligadas através de ligações de dissulfeto. Mas-sagué, J., e Czech, Μ. P. J. Biol. Chem. 257:5038-5045 (1992). IGF-1R étambém conhecido na técnica pelos nomes CD221 e JTK13. A seqüência deácido nucléico do mRNA de IGF-1R humano está disponível sob Número deAcesso do GenBank NM_000875, e é apresentada aqui como SEQ ID NO:1.
SEQ ID NO: 1
>giI11068002|ref|NM_000875.2I receptor de fator de cresimento 1 insulino-símile de Homo sapiens (IGFlR), mRNA
TTTTTTTTTTTTTTGAGAAAGGGAATTTCATCCCAAATAAAAGGAATG AAGTC TGGC TCCGGAGGAGGGTCCCCGACCTCGCTGTGGGGGCTCCTGTTTCTCTCCGCCGCGCTCTCGCTCTGGCCGACGAGTGGAGAAATCTGCGGGCCAGGCATCGACATCCGCAACGACTATCAGCAGCTGAAGCGCCTGGAGAACTGCACGGTGATCGAGGGCTACCTCCACATCCTGCTCATCTCCAAGGCCGAGGACTACCGCAGCTACCGCTTCCCCAAGCTCACGGTCATTACCGAGTACTTGCTGCTGTTCCGAGTGGCTGGCCTCGAGAGCCTCGGAGACCTCTTCCCCAACCTCACGGTCATCCGCGGCTGGAAACTCTTCTACAACTACGCCCTGGTCATCTTCGAGATGACCAATCTCAAGGATATTGGGCTTTACAACCTGAGGAACATTACTCGGGGGGCCATCAGGATTGAGAAAAATGCTGACCTCTGTTACCTCTCCACTGTGGACTGGTCCCTGATCCTGGATGCGGTGTCCAATAACTACATTGTGGGGAATAAGCCCCCAAAGGAATGTGGGGACCTGTGTCCAGGGACCATGGAGGAGAAGCCGATGTGTGAGAAGACCACCATC AACAATGAGTACAACTACCGCTGCTGGACCACAAACCGCTGCCAGAAAATGTGCCCAAGCACGTGTGGG AAGCGGGCGTGCACCGAGAACAATGAGTGCTGCCACCCCGAGTGCCTGGGCAGCTGCAGCGCGCCTGACAACGACACGGCCTGTGTAGCTTGCCGCCACTACTACTATGCCGGTGTCTGTGTGCCTGCCTGCCCGCCCAACACCTACAGGTTTGAGGGCTGGCGCTGTGTGGACCGTGACTTCTGCGCCAACATCCTCAGCGCCGAGAGCAGCGACTCCGAGGGGTTTGTGATCCACGACGGCGAGTGCATGCAGGAGTGCCCCTCGGGCTTCATCCGCAACGGCAGCCAGAGCATGTACTGCATCCCTTGTGAAGGTCCTTGCCCGAAGGTCTGTGAGGAAGAAAAGAAAACAAAGACCATTGATTCTGTTACTTCTGCTCAGATGCTCCAAGGATGCACCATCTTCAAGGGCAATTTGCTCATTAACATCCGACGGGGGAATAACATTGCTTCAGAGCTGGAGAACTTCATGGGGCTC ATCGAGGTGGTGACGGGCTACGTGAAGATCCGCCATTCTCATGCCTTGGTCTCCTTGTCCTTCCTAAAAAACCTTCGCCTCATCCTAGGAGAGGAGCAGCTAGAAGGGAATTACTCCTTCTACGTCCTCGACAACCAGAACTTGCAGCAACTGTGGGACTGGGACCACCGCAACCTGACCATCAAAGCAGGGAAAATGTACTTTGCTTTCAATCCCAAATTATGTGTTTCCGAAATTTACCGCATGGAGGAAGTGACGGGGACTAAAGGGCGCCAAAGCAAAGGGGACATAAACACCAGGAACAACGGGGAGAGAGCCTCCTGTGAAAGTGACGTCCTGCATTTCACCTCCACCACCACGTCGAAGAATCGCATCATCATAACCTGGCACCGGTACCGGCCCCCTGACTACAGGGATCTCATCAGCTTCACCGTTTACTACAAGGAAGCACCCTTTAAGAATGTCACAGAGTATGATGGGCAGGATGCCTGCGGCTCCAACAGCTGGAACATGGTGGACGTGGACCTCCCGCCCAACAAGGACGTGGAGCCCGGCATCTTACTACATGGGC TG AAGCCCTGGACTCAGTACGCCGTTTACGTCAAGGCTGTGACCCTCACCATGGTGGAGAACGACCATATCCGTGGGGCCAAGAGTGAGATCTTGTACATTCGCACCAATGCTTCAGTTCCTTCCATTCCCTTGGACGTTC TTTCAGCATCGAACTCCTCTTCTCAGTTAATCGTGAAGTGGAACCCTCCCTCTCTGCCCAACGGCAACCTGAGTTACTACATTGTGCGCTGGCAGCGGCAGCCTCAGGACGGCTACCTTTACCGGCACAATTACTGCTCCAAAGACAAAATCCCCATCAGGAAGTATGCCGACGGCACCATCGACATTGAGGAGGTCACAGAGAACCCCAAGACTGAGGTGTGTGGTGGGGAGAAAGGGCCTTGCTGCGCCTGCCCCAAAACTGAAGCCGAGAAGCAGGCCGAGAAGGAGGAGGC TG AATACCGCAAAGTCTTTGAGAATTTCCTGCACAACTCCATC TTCGTGCCCAGACCTGAAAGGAAGCGGAGAGATGTCATGCAAGTGGCCAACACCACCATGTCCAGCCGAAGCAGGAACACCACGGCCGCAGACACCTACAACATCACCGACCCGGAAGAGCTGGAGACAGAGTACCCTTTCTTTGAGAGCAGAGTGGATAACAAGGAGAGAACTGTCATTTCTAACCTTCGGCCTTTCACATTGTACCGCATCGATATCCACAGCTGCAACCACGAGGCTGAGAAGCTGGGCTGCAGCGCCTCCAACTTCGTCTTTGCAAGGACTATGCCCGCAGAAGGAGCAGATGACATTCCTGGGCCAGTGACCTGGGAGCCAAGGCCTGAAAACTCCATCTTTTTAAAGTGGCCGGAACCTGAGAATCCCAATGGATTGATTCTAATGTATGAAATAAAATACGGATCACAAGTTGAGGATCAGCGAGAATGTGTGTCCAGACAGGAATACAGGAAGTATGGAGGGGCCAAGCTAAACCGGCTAAACCCGGGGAACTACACAGCCCGGATTCAGGCCACATCTCTCTCTGGGAATGGGTCGTGGACAGATCCTGTGTTCTTCTATGTCCAGGCCAAAACAGGATATGAAAACTTCATCCATCTGATCATCGCTCTGCCCGTCGCTG TCCTGTTGATCGTGGGAGGGTTGGTGATTATGCTGTACGTCTTCCATAGAAAGAGAAATÁACAGCAGGCTGGGGAATGGAGTGCTGTATGCCTCTGTGAACCCGGAGTACTTCAGCGCTGCTGATGTGTACGTTCCTGATGAGTGGGAGG TGGCTC GGGAGAAGATCACCATGAGCCGGGAACTTGGGCAGGGGTCGTTTGGGATGGTCTATGAAGGAGTTGCCAAGGGTGTGGTGAAAGATGAACCTGAAACCAGAGTGGCCATTAAAACAGTGAACGAGGCCGCAAGCATGCGTGAGAGGATTGAGTTTCTCAACGAAGCTTC TGTGATG AAGGAGTTCAATTGTCACCATGTGGTGCGATTGCTGGGTGTGGTGTCCCAAGGCCAGCCAACACTGGTCATCATGGAACTGATGACACGGGGCGATCTCAAAAGTTATCTCCGGTCTCTGAGGCCAGAAATGGAGAATAATCCAGTCCTAGCACCTCCAAGCCTGAGCAAGATGATTCAGATGGCCGGAGAGATTGCAGACGGCATGGCATACCTCAACGCCAATAAGTTCGTCCACAGAGACCTTGCTGCCCGGAATTGCATGGTAGCCGAAGATTTCACAGTCAAAATCGGAGATTTTGGTATGACGCGAGATATCTATGAGACAGACTATTACCGGAAAGGAGGCAAAGGGC TGC TGCCCGTGCGCTGGATGTCTCCTGAGTCCCTCAAGGATGGAGTCTTCACCACTTACTCGGACGTCTGGTCCTTCGGGGTCGTCCTCTGGGAGATCGCCACACTGGCCGAGCAGCCCTACCAGGGCTTGTCCAACGAGCAAGTCCTTCGCTTCGTCATGGAGGGCGGCCTTCTGGACAAGCCAGACAACTGTCCTGACATGCTGTTTGAACTGATGCGCATGTGCTGGCAGTATAACCCCAAGATGAGGCCTTCCTTCCTGGAGATCATCAGCAGCATCAAAGAGGAGATGGAGCCTGGCTTCCGGGAGGTCTCCTTCTACTACAGCGAGGAGAACAAGCTGCCCGAGCCGGAGGAGCTGGACCTGGAGCCAGAGAACATGGAGAGCGTCCCCCTGGACCCCTCGGCCTCCTCGTCCTCCCTGCCACTGCCCGACAGACACTCAGGACACAAGGCCGAGAACGGCCCCGGCCCTGGGGTGCTGGTCCTCCGCGCCAGCTTCGACGAGAGACAGCCTTACGCCCACATGAACGGGGGCCGCAAGAACGAGCGGGCCTTGCCGCTGCCCCAGTCTTCGACCTGCTGATCCTTGGATCCTGAATC TGTGC AAACAGTAACGTGTGCGCACGCGCAGCGGGGTGGGGGGGGAGAGAGAGTTTTAACAATCCATTCACAAGCCTCCTGTACCTCAGTGGATCTTCAGTTCTGCCCTTGCTGCCCGCGGGAGACAGCTTC TC TGCAGTAAAACACATTTGGGATGTTCCTTTTTTC AATATGCAAGCAGCTTTTTATTCCCTGCCCAAACCCTTAACTGACATGGGCCTTTAAGAACCTTAATGACAACACTTAATAGCAACAGAGCACTTGAGAACCAGTCTCCTCACTCTGTCCCTGTCCTTCCCTGTTCTCCCTTTCTCTCTCCTCTCTGCTTCATAACGGAAAAATAATTGCCACAAGTCCAGCTGGGAAGCCCTTTTTATCAGTTTGAGGAAGTGGCTGTCCCTGTGGCCCCATCCAACCACTGTACACACCCGCCTGACACCGTGGGTCATTACAAAAAAACACGTGGAGATGGAAATTTTTACCTTTATCTTTCACCTTTCTAGGGACATGAAATTTACAAAGGGCCATCGTTCATCCAAGGCTGTTACCATTTTAACGCTGCCTAATTTTGCCAAAATCCTGAACTTTC TCCCTCATCGGCCCGGCGCTGATTCCTCGTGTCCGGAGGCATGGGTGAGCATGGCAGCTGGTTGCTCCATTTGAGAGACACGCTGGCGACACACTCCGTCCATCCGACTGCCCCTGC TGTGC TGCTC AAGGCCACAGGCACACAGGTCTCATTGCTTCTGACTAGATTATTATTTGGGGGAACTGGACACAATAGGTC TTTCTC TCAGTG AAGGTGGGGAGAAGCTGAACCGGC
A seqüência de polipeptídeo de precursor está disponível sobNúmero de Acesso do GenBank NP_000866, e é apresentada aqui comoSEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 2
>gi|4557665|ref|NP_000866.1| receptor de fator de crescimento 1 insulino-símile [Homo sapiens]
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDY
RSYTIFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYOTALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGA
IRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYRCWTTNR
CQKMC PSTCGKRACTENNECCHPEC LGSC S APDNDTAC VAC RH YYYAGVCVPAC P PNTYRF EGWRC VDRD
FCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQML
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LETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTW
EPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQ EYRKYGG AK LNRLNPGNYTARIQATSL
SGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEY
FSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKGWKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNE
ASVMKEFNCHHWRLLGWSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIA
DGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFT
TYSDVWSFGWLWEIATLAEQ PYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFL
EIISSIKEEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEELDLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRHSGHKAENGPG
PGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTC
Aminoácidos 1 a 30 da SEQ ID NO: 2 são relatados codificar oPeptídeo sinal de IGF-1R, aminoácidos 31 a 740 da SEQ ID NO: 2 são rela-tados para codificar a subunidade α de IGF-1R, e aminoácidos 741 a 1367da SEQ ID NO: 2 são relatados codificar a subunidade β de IGF-1R. Estas eoutras características de IGF-1R humano reladas na entrada de GenBankNP_000866 são apresentadas na TABELA 2.TABELA 2
<table>table see original document page 78</column></row><table>
A presente invenção é também direcionada a anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dosmesmos que especificamente liga, preferencial, ou competitivamente a pro-teínas de IGF-1R não-humano, por exemplo, IGF-1R de roedores ou prima-tas não-humanos.
IGF-1R é expresso em um número grande de células tumorais,incluindo, mas não limitado a certo dos seguintes: tumores de bexiga (Hum.Pathol. 34:803 (2003)); tumores cerebrais (Clinicai Câncer Res. 8:1822(2002)); tumores de mama (Eur. J. Câncer 30:307 (1994) e Hum Pathol.36:448-449 (2005)); tumores de cólon, por exemplo, adenocarcinomas, me·tástase, e adenomas (Hum Pathol. 30:1128 (1999), Virchows. Are. 443:139(2003), e Clinicai Câncer Res. 10:843 (2004)); tumores gástricos (Clin. Exp.Metastasis 21:755 (2004)); tumores de rim, por exemplo, célula clara, cromó-fobo e RCC papilar (AM. J. Clin. Pathol. 122:931-937 (2004)); tumores pul-monares (Hum. Pathol. 34:803-808 (2003) e J. Câncer Res. Clinic Oncol.119:665-668 (1993)); tumores ovarianos (Hum. Pathol. 34:803-808 (2003));tumores pancreáticos, por exemplo, adenocarcinoma ductal (Digestive Dise-ases. Sei. 48:1972-1978 (2003) e Clinicai Câncer Res. 11:3233-3242(2005)); e tumores de próstata (Câncer Res. 62:2942-2950 (2002)).
III. ANTICORPOS DE IGF-1R
Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a anti-corpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou deri-vados dos mesmos. Por exemplo, a presente invenção inclui pelo menos osdomínios de ligação de antígeno de certos anticorpos monoclonais, e frag-mentos, variantes, e derivados dos mesmos mostrados nas TABELAS 3 E 4.TABELA 3 lista as regiões de Fab de IGF-1R anti-humano humano identifi-cadas de uma biblioteca de apresentação de fago e várias propriedades deligação dos anticorpos, descritas em mais detalhe nos Exemplos. TABELA 4lista anticorpos monoclonais murinos de IGF-1R anti-humano identificadospor tecnologia de hibridoma, e várias propriedades de ligação dos anticor-pos, descritas em mais detalhe nos Exemplos.
TABELA 3: Propriedades funcionais de Fabs específicos para IGF-1R.
<table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table>Linhagens celulares de Ovário de Hamster Chinês expressandoo anticorpo de comprimento total de M13-C06 e M14-C03 foram depositadascom a American Type Culture Collection ("ATCC") no dia 28 de março de2006, e foram dados Números de Depósito da ATCC PTA-7444 e PTA-7445,respectivamente. Linhagens celulares de Ovário de Hamster Chinês que ex-pressam fragmento de anticorpo de Fab M14-G11 foram depositadas com a_ American Type Culture Collection ("ATCC") no dia 29 de agosto de 2006, efoi dado Número de Depósito da ATCC PTA-7855.
Linhagem celular de hibridoma que expressa P2A7.3E11,20C8.3B8, e P1A2.2B11 para anticorpos humanos de comprimento total foidepositada junto à ATCC no dia 28 de março de 2006, 13 de junho de 2006,e 28 de março de 2006, respectivamente, e foram dados Números de Depó-sito da ATCC PTA-7458, PTA-7732, e, PTA-7457, respectivamente. Linha-gens celulares de hibridoma que expressam anticorpos humanos de com-primento total 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8 foram depositadasjunto à ATCC no dia 28 de março de 2006, 11 de julho de 2006, e 11 de ju-lho de 2006, respectivamente, e foram dados Números de Depósito daATCC PTA-7456, PTA-7730, e PTA-7731, respectivamente. Vide, TABELADE DEPÓSITO DA ATCC (abaixo) para correlação dos anticorpos e Iinha-gens celulares depositadas.
A ATCC fica localizada em 10801 University Boulevard, Manas-sas, VA 20110-2209, EUA. Os depósitos da ATCC foram feitos de acordocom os termos do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento interna-cional do depósito de microorganismos para propósitos de procedimento depatente.
Certas modalidades da invenção foram depositadas junto à A-merican Type Culture Collection como mostrado na tabela a seguir ("TABE-LA DE DEPÓSITO DA ATCC").TABELA DE DEPÓSITO DA ATCC
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Como aqui usado, o termo "domínio de ligação de antígeno" in-clui um sítio que especificamente liga um epítopo em um antígeno (por e-xemplo, um epítopo de IGF-1R). O domínio de ligação de antígeno de umanticorpo tipicamente inclui pelo menos uma porção de uma região variável5° de cadeia pesada da imunoglobulina e pelo menos uma porção de uma regi-ão variável de cadeia leve da imunoglobulina. O sítio de ligação formado porestas regiões variáveis determinam a especificidade do anticorpo.
A presente invenção mais especificamente é direcionada a umanticorpo de IGF-1R, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou deri-vados do mesmo, onde o anticorpo de IGF-1R especificamente liga aomesmo epítopo de IGF-R1 como um fragmento de anticorpo de Fab mono-clonal de referência selecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclo-nal de referência produzido por um hibridoma selecionado do grupo queconsiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, eP1G10.2B8.
A invenção é também estendida a um anticorpo de IGF-1R, oufragmento de ligação de antígeno, variante ou derivados do mesmo, onde oanticorpo de IGF-1R competitivamente inibe um fragmento de anticorpo deFab monoclonal de referência selecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpomonoclonal de referência produzido por um hibridoma selecionado do grupoque consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11,P1E2.3B12, e P1G10.2B8 de ligar a IGF-1R.
A invenção é também estendida a um anticorpo de IGF-1R, oufragmento de ligação de antígeno, variante ou derivados do mesmo, onde oanticorpo de IGF-1R compreende um domínio de ligação de antígeno idênti-co ao de um fragmento monoclonal de anticorpo de Fab selecionado do gru-po que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, eM12-G04, ou um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma selecio-nado do grupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11,20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8.
Métodos de fazer anticorpos são bem conhecidos na técnica edescritos aqui. Uma vez anticorpos para vários fragmentos, ou para o IGF-1R de comprimento total sem a seqüência sinal, foi produzido, determinaçãode quais aminoácidos, ou epítopo, de IGF-1R aos quais o anticorpo ou frag-mento de ligação de antígeno se liga pode ser determinada por protocolosde mapeamento de epítopo como descritos aqui como também métodos co-nhecidos na técnica (por exemplo ELISA intercalado de anticorpo duplo co-mo descrito no "Capítulo 11 - Imunologia", Current Protocols in MolecularBiology, Ed. Ausubel et ai, v. 2, John Wiley & Sons, Inc. (1996)). Protocolosde mapeamento de epítopo adicionais podem ser encontrados em Morris, G.Epitope Mapping Protocols, New Jersey: Humana Press (1996), que sãoambos incorporados aqui por referência em suas totalidades. Mapeamentode epítopo pode também ser executado através de meios comercialmentedisponíveis (isto é ProtoPROBE, Inc. (Milwaukee, Wisconsin)).
Adicionalmente, os anticorpos produzidos que ligam a qualquerporção de IGF-1R podem depois ser triados para sua capacidade de atuarcomo antagonista de IGF-1R por exemplo, inibir a ligação de fator de cres-cimento de insulina, por exemplo, IGF-1, IGF-2, ou IGF-1 e IGF-2 para IGF-1R, promover internalização de IGF-1 R, inibir fosforilação de IGF-1 R, inibirfosforilação a jusante, por exemplo, de Akt ou P42/44 MAPK, ou inibir prolife-ração, motilidade ou metástase da célula tumoral. Anticorpos podem ser tri-ados para estas e outras propriedades de acordo com os métodos descritosem detalhes nos Exemplos. Outras funções de anticorpos da presente in-venção podem ser testadas usando outros ensaios como descritos nos E-xemplos aqui.
Em outras modalidades, a presente invenção inclui um anticor-po, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmoque específica ou preferencialmente liga pelo menos um epítopo de IGF-1 Ronde o epítopo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste empelo menos cerca de quatro a cinco aminoácidos da SEQ ID NO: 2, pelomenos sete, pelo menos nove, ou entre pelo menos cerca de 15 a cerca de30 aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Os aminoácidos de um epítopo dado daSEQ ID NO: 2 como descrito pode ser, mas não necessitam ser, contíguosou lineares. Em certas modalidades, pelo menos um epítopo de IGF-1Rcompreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um epítopo não-linear formado pelo domínio extracelular de IGF-1R como expresso na su-perfície de uma célula ou como um fragmento solúvel, por exemplo, fundidoem uma região de Fc de IgG. Desse modo, em certas modalidades pelo me-nos um epítopo de IGF-1R compreende, consiste essencialmente em, ouconsiste em pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelomenos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelomenos 25, entre cerca de 15 a cerca de 30, ou pelo menos 10, 15, 20, 25,30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 aminoácidoscontíguos ou não-contíguos da SEQ ID NO: 2, onde os aminoácidos não-contíguos formam um epítopo através de dobramento de proteína.
Em outras modalidades, a presente invenção inclui um anticor-po, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmoque específica ou preferencialmente liga pelo menos um epítopo de IGF-1R,onde o epítopo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em,além de uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais aminoácidos contíguosou não-contíguos da SEQ ID NO: 2 como descrito acima, e uma metade adi-cional que modifica a proteína, por exemplo, uma metade de carboidrato po-de ser incluída de modo que o anticorpo de IGF-1R ligue com afinidade maisalta à proteína alvo modificada que a uma versão inalterada da proteína. Al-ternativamente, o anticorpo de IGF-1R não liga a versão inalterada da prote-ína alva.
Em certos aspectos, a presente invenção é direcionada a umanticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado domesmo, que especificamente liga a um polipeptídeo de IGF-1R ou fragmentodo mesmo, ou uma variante de polipeptídeo de IGF-1R, com uma afinidadecaracterizada por uma constante de dissociação (K0) que é menor que a Kdpara um anticorpo monoclonal de referência dado.Em certas modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligaçãode antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção especificamenteliga a pelo menos um epítopo de IGF-1R ou fragmento ou variante descritoacima, isto é, liga a um tal epítopo mais facilmente do que ligaria a um epíto-po não relacionado, ou aleatório; liga preferencialmente a pelo menos umepítopo de IGF-1R ou fragmento ou variante descritos acima, isto é, liga aum tal epítopo mais facilmente do que ligaria a um epítopo relacionado, simi-lar, homólogo, ou análogo; competitivamente inibe ligação de um anticorpode referência que específica ou preferencialmente liga a um certo epítopo deIGF-1R ou fragmento ou variante descritos acima; ou liga pelo menos umepítopo de IGF-1R ou fragmento ou variante descritos acima com uma afini-dade caracterizada por uma constante de dissociação K0 de menos que cer-ca de 5 χ 10"2 Μ, cerca de 10"2 M, cerca de 5 χ 10"3 Μ, cerca de 10"3 M, cercade 5 χ 10"4 M, cerca de 10"4 M, cerca de 5 χ 10~5 Μ, cerca de 10"5 M, cercade 5 χ 10"6 M, cerca de 10"6 M, cerca de 5 χ 10"7 Μ, cerca de 10"7 M, cercade 5 χ 10"8 M, cerca de 10"8 M, cerca de 5 χ 10"9 Μ, cerca de 10"9 M, cercade 5 χ 10"10 M, cerca de 10"10 M, cerca de 5 χ 10"11 Μ, cerca de 10~11 M, cer-ca de 5 χ 10"12 Μ, cerca de 10"12 M, cerca de 5 χ 10"13 Μ, cerca de 10"13 M,cerca de 5 χ 10"14 Μ, cerca de 10"14 M, cerca de 5 χ 10"15 Μ, ou cerca de 10'15 M. Em um aspecto particular, o anticorpo ou fragmento do mesmo prefe-rencialmente liga a um polipeptídeo de IGF-1R humano ou fragmento domesmo, com relação a um polipeptídeo de IGF-1R murino ou fragmento domesmo. Em outro aspecto particular, o anticorpo ou fragmento do mesmopreferencialmente liga a um ou mais polipeptídeos de IGF-1R ou fragmentosdos mesmos, por exemplo, um ou polipeptídeos de IGF-1R mais mamíferos,mas não liga aos polipeptídeos de receptor de insulina (InsR). Embora nãoestando preso por teoria, os polipeptídeos de receptor de insulina são co-nhecidos ter um pouco de similaridade de seqüência com os polipeptídeosde IGF-1R, e os anticorpos que reagem cruzado com InsR podem produzirefeitos colaterais indesejados in vivo, por exemplo, interferindo com o meta-bolismo de glicose.
Como usado no contexto de constantes de dissociação de liga-ção de anticorpo, o termo "cerca de" permite o grau de variação inerente nosmétodos utilizados para medir a afinidade do anticorpo. Por exemplo, de-pendendo do nível de precisão da instrumentação usada, erro padrão combase no número de amostras medidas, e erro de arredondamento, o termo"cerca de 10"2 M" poderia incluir, por exemplo, de 0,05 M a 0,005 M.
Em modalidades específicas, um anticorpo, ou fragmento de li-gação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção liga os po-lipeptídeos de IGF-1R ou fragmentos ou variantes dos mesmos com umataxa off (k(off)) menor ou igual a 5 X 10"2 seg"1, 10"2 seg"1, 5 X IO"3 seg"1 ou I0"3 seg"1. Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antíge-no, variante, ou derivado do mesmo da invenção liga os polipeptídeos deIGF-1R ou fragmentos ou variantes dos mesmos com uma taxa off (k(off))menor ou igual a 5 X 10~4 seg"1, 10"4 seg"1, 5 X 10"5 seg"1, ou 10"5 seg"1 5 X10"6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 X 10 7 seg"1 ou 10 7 seg"1.
Em outras modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligaçãode antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção liga os polipeptí-deos de IGF-1R ou fragmentos ou variantes dos mesmos com uma taxa on(k(on)) maior ou igual a 103 M1 seg"1, 5 X 103 M1 seg"1, 104 M1 seg"1 ou 5 X104 M1 seg"1. Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento de ligação deantígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção liga os polipeptídeosde IGF-1R ou fragmentos ou variantes dos mesmos com uma taxa on (k(on))maior ou igual a 105 M"1 seg"1, 5 X 105 M1 seg"1, 106 M"1 seg"1, ou 5 X 106 M"1seg"1 ou 107 M"1 seg"1.
Em várias modalidades, um anticorpo de IGF-1R, ou fragmentode ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo como descrito aquié antagonista da atividade de IGF-1 R. Em certas modalidades, por exemplo,ligação de um anticorpo de IGF-1 R de antagonista a IGF-1 R como expressoem uma célula tumoral inibe a ligação do fator de crescimento de insulina,por exemplo, IGF-1, IGF-2, ou IGF-1 e IGF-2 a IGF-1 R, promove a internali-zação de IGF-1 R assim inibindo sua capacidade de transdução de sinal, ini-be a fosforilação de IGF-1 R, inibe a fosforilação das moléculas a jusante navia de transdução de sinal, por exemplo, Akt ou P42/44 MAPK, ou inibe aproliferação, motilidade ou metástase da célula tumoral.
A menos que especificamente seja observado, como aqui usadoum "fragmento do mesmo" em referência a um anticorpo refere-se a umfragmento de ligação de antígeno, isto é, uma porção do anticorpo que es-pecificamente liga ao antígeno. Em uma modalidade, um anticorpo de IGF-1R, por exemplo, um anticorpo da invenção é um anticorpo de IGF-1R bies-pecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico, minicorpo, anticorpo dele-tado no domínio, ou proteína de fusão tendo especificidade de ligação paramais de um epítopo, por exemplo, mais de um antígeno ou mais de um epí-topo no mesmo antígeno. Em uma modalidade, um anticorpo de IGF-1R bi-específico tem pelo menos um domínio de ligação específico para pelo me-nos um epítopo em um polipeptídeo alvo revelado aqui, por exemplo, IGF-1R. Em outra modalidade, um anticorpo de IGF-1R biespecífico tem pelomenos um domínio de ligação específico para um epítopo em um polipeptí-deo alvo e pelo menos um domínio de ligação alvo específico para um fár-maco ou toxina. Em ainda outra modalidade, um anticorpo de IGF-1R bies-pecífico tem pelo menos um domínio de ligação específico para um epítopoem um polipeptídeo alvo revelado aqui, e pelo menos um domínio de ligaçãoespecífico para um pró-medicamento. Um anticorpo de IGF-1R biespecíficopode ser um anticorpo tetravalente tendo dois domínios de ligação alvos es-pecíficos para um epítopo de um polipeptídeo alvo revelado aqui e dois do-mínios de ligação alvos específicos para um segundo alvo. Desse modo, umanticorpo de IGF-1R biespecífico tetravalente pode ser bivalente para cadaespecificidade.
Anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno,variantes, ou derivados dos mesmos da invenção, como conhecidos por a-queles de habilidade usual na técnica, podem compreender uma regiãoconstante que medeia uma ou mais funções efetoras. Por exemplo, ligaçãodo componente de C1 de complemento a um região constante do anticorpopode ativar o sistema do complemento. Ativação do complemento é impor-tante na opsonização e Iise dos patógenos de célula. A ativação do comple-mento também estimula a resposta inflamatória e pode também estar envol-vida em hipersensibilidade autoimune. Também, anticorpos ligam a recepto-res em várias células por meio da região de Fc1 com um Sítio de ligação de. receptor de Fc na região de Fc do anticorpo que liga a um receptor de Fc(FcR) em uma célula. Há vários receptores de Fc que são específicos paraclasses diferentes de anticorpo, incluindo IgG (receptores gama), IgE (recep-tores epsílon), IgA (receptores alfas) e IgM (receptores mu). Ligação de anti-corpo a receptores de Fc em superfícies das células desencadeia váriasrespostas biológicas importantes e diversas incluindo deglutição e destruiçãodas partículas revestidas com anticorpo, liberação de complexos imunes, Iisedas células alvas revestidas com anticorpo através das células assassinas(chamadas citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo, ouADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária econtrole da produção de imunoglobulina.
Conseqüentemente, certas modalidades da invenção incluemum anticorpo de IGF-1R, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ouderivado do mesmo em que pelo menos uma fração de um ou mais dos do-mínios de região constante foram deletados ou do contrário alterados parafornecer características bioquímicas desejadas tais como funções efetorasreduzidas, a habilidade para não-covalentemente dimerizar, habilidade au-mentada para localizar no sítio de um tumor, meia-vida em soro reduzida, oumeia-vida em soro aumentada quando comparado com um todo, anticorpoinalterado de aproximadamente a mesma imunogenicidade. Por exemplo,certos anticorpos para o uso nos métodos de diagnóstico e tratamento des-critos aqui são anticorpos deletados no domínio que compreendem uma ca-deia de polipeptídeo similar a uma cadeia pesada da imunoglobulina, masque carece pelo menos de uma porção de um ou mais domínios de cadeiapesada. Por exemplo, em certos anticorpos, será deletado um domínio intei-ro da região constante do anticorpo modificado, por exemplo, todo ou partedo domínio de CH2 será deletada. Em outras modalidades, certos anticorpospara o uso nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos aqui têm umaregião constante, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada delgG4 que é alterada para eliminar a glicosilação referida em outro lugar aquicomo anticorpos de "agly". Embora não estando preso à teoria, é acreditadoque anticorpos de "agly" podem ter uma segurança e perfil de estabilidade invivo melhorados.
Em certos anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação deantígeno, variantes, ou derivados dos mesmos descritos aqui, a porção deFc pode ser mutada para diminuir a função efetora usando técnicas conheci-das na técnica. Por exemplo, a deleção ou inativação (através de mutaçõesde ponto ou outros meios) de um domínio da região constante pode reduzir aligação do receptor de Fc do anticorpo modificado circulante assim aumen-tando a localização do tumor. Em outros casos pode ser que as modifica-ções da região constante consistentes com a invenção imediata moderem aligação do complemento e desse modo reduza o a meia-vida em soro e as-sociação não-específica de uma citotoxina conjugada. Ainda outras modifi-cações da região constante podem ser usadas para modificar as ligações dedissulfeto ou as metades de oligossacarídeo que permitem localização in-tensificada devido à especificidade aumentada do antígeno ou flexibilidadedo anticorpo. O perfil fisiológico, biodisponibilidade e outros efeitos bioquími-cos resultantes das modificações, tais como localização do tumor, biodistri-buição e meia-vida em soro, podem ser facilmente medidos e quantificadosusando técnicas imunológicas bem conhecidas sem experimentação impró-pria.
Formas modificadas de anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos deligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção po-dem ser feitas de anticorpos precursores inteiros ou de origem usando técni-cas conhecidas na técnica. Técnicas exemplares são debatidas em maisdetalhe aqui.
Em certas modalidades ambas as regiões variáveis e constantesdos anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes,ou derivados dos mesmos são completamente humanas. Anticorpos comple-tamente humanos podem ser feitos usando técnicas que são conhecidas natécnica e como descritas aqui. Por exemplo, anticorpos completamente hu-manos contra um antígeno específico podem ser preparados administrandoo antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir taisanticorpos em resposta ao desafio antigênico, mas cujos Ioci endógenos fo-- ram inválidos. Técnicas exemplares que podem ser usadas para fazer taisanticorpos são descritas nas patentes US: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140.
Outras técnicas são conhecidas na técnica. Anticorpos completamente hu-manos podem ser igualmente produzidos através de várias tecnologias deexibição, por exemplo, apresentação de fago ou outros sistemas de exibiçãovirais, como descrito em outro lugar em mais detalhe aqui.
Anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno,variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser feitos ou fabri-cados usando técnicas que são conhecidas na técnica. Em certas modalida-des, moléculas de anticorpo ou fragmentos das mesmas são "recombinan-temente produzidas", isto é, são produzidas usando tecnologia de DNA re-combinante. Técnicas exemplares para fazer moléculas de anticorpo oufragmentos das mesmas são debatidas em outro lugar em mais detalhe aqui.
Anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno,variantes, ou derivados dos mesmos da invenção também incluem derivadosque são modificados, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipode molécula ao anticorpo de modo que a ligação covalente ao anticorpo nãoimpeça de especificamente ligar a seu epítopo de cognato. Por exemplo,mas não por via de limitação, os derivados de anticorpo incluem anticorposque foram modificados, por exemplo, através de glicosilação, acetilação, pe-gilação, fosforilação, amidação, derivatização através de grupos de prote-ção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um Iigante celularou outra proteína, etc. Quaisquer de numerosas modificações químicas po-dem ser realizadas através de técnicas conhecidas, incluindo, mas não limi-tadas a, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese meta-bólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um oumais aminoácidos não-clássicos.
Em certas modalidades, os anticorpos de IGF-1R, ou fragmentosde ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invençãonão suscitarão uma resposta imune deletéria no animal a ser tratado, porexemplo, em um humano. Em uma modalidade, anticorpos de IGF-1R, oufragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos dainvenção são modificados para reduzir sua imunogenicidade usando técni-cas reconhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser huma-nizados, podem ser feitos de primata, desimunizados, ou anticorpos quiméri-cos. Estes tipos de anticorpos são derivados de um anticorpo não-humano,tipicamente um anticorpo murino ou de primata que retém ou substancial-mente retém as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo de origem,mas que é menos imunogênico em seres humanos. Isto pode ser alcançadoatravés de vários métodos, incluindo (a) enxertar os domínios variáveis não-humanos inteiros nas regiões constantes humanas para gerar anticorposquiméricos; (b) enxertar pelo menos uma parte de uma ou mais das regiõesde determinação de complementaridade não-humanas (CDRs) em uma es-trutura humana e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos deestrutura críticos; ou (c) transplantar os domínios variáveis não-humanosinteiros, mas "mascarando" os mesmo com uma seção semelhante à huma-na mediante substituição dos resíduos de superfície. Tais métodos são reve-lados em Morrison etal., Proc. Natl. Acad. Sei. 81:6851-6855 (1984); Morri-son et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan,Molec. Immun. 31:169-217 (1994), e Pats. U. S. Nos. 5.585.089, 5.693.761,5.693.762, e 6.190.370 todas estas são por este meio incorporadas por refe-rência em sua totalidade.
Desimunização pode também ser usada para diminuir a imuno-genicidade de um anticorpo. Como aqui usado, o termo "desimunização"inclui alteração de um anticorpo para modificar epítopos de célula T (vide,por exemplo, W09852976A1, W00034317A2). Por exemplo, seqüências deVH e VL são analisadas do anticorpo de partida e um "mapeamento" dosepítopos de T célula humanos de cada região V mostrando a localização dosepítopos em relação a regiões de determinação de complementaridade (C-DRs) e outros resíduos fundamentais dentro da seqüência. Epítopos de célu-la T individuais são analisados do mapeamento de epítopos de célula T paraidentificar as substituições de aminoácido alternativas com um baixo risco dealterar a atividade do anticorpo final. Uma faixa de seqüências de VH e deVL alternativas compreendendo combinações de substituições de aminoáci-do é projetada e estas seqüências são subseqüentemente incorporadas emuma faixa de polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos específicospara IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos para o uso nosmétodos de diagnóstico e tratamento revelados aqui, que são depois testa-dos quanto à função. Tipicamente, entre 12 e 24 anticorpos variantes sãogerados e testados. Genes de cadeia pesada e leve completos compreen-dendo regiões de V e C humanas modificadas são depois clonados nos ve-tores de expressão e os plasmídeos subseqüentes introduzidos nas linha-gens celulares para a produção de anticomprimento total. Os anticorpos sãodepois comparados em ensaios bioquímicos e biológicos apropriados, e avariante ótima é identificada.
Anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno,variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser gerados porqualquer método adequado conhecido na técnica. Anticorpos policlonais pa-ra um antígeno de interesse podem ser produzidos por vários procedimentosbem conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo de IGF-1R, por e-xemplo, um polipeptídeo de ligação, por exemplo, um anticorpo específicopara IGF-1R ou fragmento imunoespecífico do mesmo pode ser administra-do a vários animais hospedeiros incluindo, mas não limitados a, coelhos,camundongos, ratos, galinhas, hamsters, cabras, burros, etc., para induzir aprodução de soros contendo anticorpos policlonais específicos para o antí-geno. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imu-nológica, dependendo das espécies hospedeiras, e incluem mas não sãolimitados a, Freund (complete e incompleto), géis minerais tais como hidróxi-do de alumínio, substâncias ativas de superfície tais como lisolecitina, polióisplurônicos, poliânios, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianinas de lapa,dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (ba-cille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Tais adjuvantes são tam-bém bem conhecidos na técnica.Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando umaampla variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo o uso de tec-nologias de hibridoma, recombinantes, e de apresentação de fago, ou umacombinação dos mesmos. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem serproduzidos usando técnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas natécnica e ensinados, por exemplo, em Proc. Natl. Acad. Sei. 87:6851-6855(1984); Morrison et ai, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen etal.,Science 239:1534-1536 (1988); Padlan1 Molec. Immun. 28:489-498 (1991);Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994) (as ditas referências incorporadaspor referência em suas totalidades). O termo "anticorpo monoclonal" comoaqui usado não é limitado a anticorpos produzidos através de tecnologia dehibridoma. O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que éderivado de um clone simples, incluindo clone eucariótico, procariótico, oude fago, e não o método pelo qual é produzido. Desse modo, o termo "anti-corpo monoclonal" não é limitado a anticorpos produzidos através de tecno-logia de hibridoma. Anticorpos monoclonais podem ser preparados usandocamundongos modificados em IGF-1R para aumentar as regiões de reco-nhecimento de epítopo. Anticorpos monoclonais podem ser preparados u-sando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo ouso de tecnologia de hibridoma e recombinante e de apresentação de fagocomo descrito em outro lugar aqui.
Usando protocolos reconhecidos na técnica, em um exemplo, osanticorpos são suscitados em mamíferos através de múltiplas injeções sub-cutâneas ou intraperitoneais do antígeno relevante (por exemplo, IGF-1Rpurificado ou células ou extratos celulares compreendendo IGF-1R) e umadjuvante. Esta imunização tipicamente suscita uma resposta imune com-preendendo a produção de anticorpos reativos ao antígeno de esplenócitosou linfócitos ativados. Embora os anticorpos resultantes possam ser colhidosdo soro do animal para fornecer preparações policlonais, é freqüentementedesejável isolar os linfócitos individuais do baço, Iinfonodos ou sangue peri-férico para fornecer preparações homogêneas de anticorpos monoclonais(MAbs). Preferivelmente, os linfócitos são obtidos do baço.Neste processo bem conhecido (Kohler et al., Nature 256:495(1975)) os linfócitos relativamente de vida curta, ou mortais, de um mamíferoque foi injetado com antígeno, são fundidos com uma linhagem de célulatumoral imortal (por exemplo uma linhagem celular de mieloma), desse mo-do, produzindo células híbridas, ou "hibridomas", que são imortais e capazesde produzir o anticorpo geneticamente codificado da célula B. Os híbridosresultantes são segregados em cepas genéticas simples por seleção, dilui-ção, e re-desenvolvimento com cada cepa individual compreendendo os ge-nes específicos para a formação de um anticorpo simples. Eles produzemanticorpos que são homogêneos contra um antígeno desejado e, em refe-rência à sua ascendência genética pura, são denominados "monoclonais".
Células de hibridoma desse modo preparadas são semeadas ecrescidas em um meio de cultura adequado que preferivelmente contenhauma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência dascélulas de mieloma parentais não-funidadas. Aqueles versados na técnicaapreciarão que reagentes, linhagens celulares e meios para a formação, se-leção e crescimento dos hibridomas estão comercialmente disponíveis devárias fontes e protocolos padronizados estão bem estabelecidos. Em geral,meio de cultura em que as células de hibridoma estão cultivando é ensaiadopara a produção de anticorpos monoclonais contra o antígeno desejado.
Preferivelmente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonaisproduzidos pelas células de hibridoma é determinada por ensaios in vitro taiscomo imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorven-te ligado a enzima (ELISA). Após células de hibridoma serem identificadasque produzem os anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade de-sejadas, os clones podem ser subclonados limitando os procedimentos dediluição e crescidos através de métodos padrões (Goding, Monoclonal Anti-bodies: Principies and Practice, Academic Press, págs. 59-103 (1986)).Também será apreciado que os anticorpos monoclonais segregados pelosubclona podem ser separados de meio de cultura, fluido ou soro de ascitesatravés de procedimentos de purificação convencionais tais como, por e-xemplo, proteína-A, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel,diálise ou cromatografia de afinidade.
Fragmentos de anticorpo que reconhecem os epítopos específi-cos podem ser gerados através de técnicas conhecidas. Por exemplo, frag-mentos de Fab e F(ab')2 podem ser recombinantemente produzidos ou porclivagem proteolítica das moléculas de imunoglobulina, usando enzimas taiscomo papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzirfragmentos F(ab')2). Fragmentos de F(ab')2 contêm a região variável, a regi-ão constante de cadeia leve e o domínio de CH1 da cadeia pesada.
Aqueles versados na técnica também apreciarão que anticorposde codificação de DNA ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, sítios deligação de antígeno) podem também ser derivados das bibliotecas de anti-corpo, tais como bibliotecas de apresentação de fago. Em um particular, talfago pode ser utilizado para exibir domínios de ligação de antígeno expres-sos de um repertório ou biblioteca combinatória de anticorpo (por exemplo,humano ou murino). Fago que expressa um domínio de ligação de ligaçãode antígeno o antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificadocom o antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligadoou capturado a uma superfície sólida ou conta. Fago usado nestes métodosé tipicamente fago filamentoso incluindo domínios de ligação de fd e M13expressos do fago com Fab, Fv OE DAB (região de Fv individual de cadeiasleves ou pesadas) ou domínios de anticorpo de Fv estabilizado em dissulfetorecombinantemente fundidos ou ao gene Ill do fago ou à proteína do genede VIII. Métodos exemplares estão expostos, por exemplo, na EP 368 684B1; patente U. S. 5.969.108, Hoogenboom, H. R. e Chames, Immunol. To-day 21:371 (2000); Nagy et al. Nat. Med. 8:801 (2002); Huie et al., Proc. Na-tl. Acad. Sei. USA 98:2682 (2001); Lui et al., J. Mol. Bioi 315:1063 (2002),cada uma destas é incorporadas aqui por referência. Várias publicações (porexemplo, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)) descreveram aprodução de anticorpos humanos de afinidade alta por embaralhamento decadeia, como também infecção combinatória e recombinação in vivo comouma estratégia para construir bibliotecas de fago grandes. Em outra modali-dade, exibição ribossômica pode ser usada para substituir o bacteriófagocomo a plataforma de apresentação (vide, por exemplo, Hanes et ai, Nat.BiotechnoL 18:1287 (2000); Wilson et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA 98:3750(2001); ou Irving et ai, J. Immunol. Methods 248:31 (2001)). Em ainda outramodalidade, as bibliotecas de superfície de célula podem ser tríadas paraanticorpos (Boder et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA 97:10701 (2000); Dau-gherty et al., J. Immunol. Methods 243:211 (2000)). Tais procedimentos pro-vêem alternativas às técnicas de hibridoma tradicionais para o isolamento eclonagem subseqüente dos anticorpos monoclonais.
Em métodos de apresentação de fago, domínios de anticorpofuncionais são exibidos na superfície das partículas de fago que carregam asseqüências de polinucleotídeo que os codificam. Por exemplo, seqüênciasde DNA que codificam regiões de VH e de VL são amplificadas ou do contrá-rio isoladas das bibliotecas de cDNA animais (por exemplo, bibliotecas decDNA humanas ou murinas de tecidos linfóides) ou bibliotecas de cDNA sin-téticas. Em certas modalidades, o DNA que codifica as regiões de VH e VL éunido por um Iigador de scFv por PCR e clonado em um vetor de fagemídeo(por exemplo, ρ CANTAB 6 ou pComb 3 HSS). O vetor é eletroporado em £.coli e o E. coli é infetado com fago ajudante. O fago usado nestes métodos étipicamente fago filamentoso incluindo fd e M13 e as regiões de VH e VLusualmente são recombinantemente fundidas ou no gene Ill do fago ou nogene VIII. Fago que expressa um domínio de ligação de ligação de antígenoa um antígeno de interesse (isto é, um polipeptídeo de IGF-1R ou um frag-mento do mesmo) pode ser selecionado ou identificado com antígeno, porexemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado emuma superfície sólida ou conta.
Exemplos adicionais de métodos de apresentação de fago quepodem ser usados para fazer os anticorpos incluem aqueles revelados emBrinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Im-munol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol.24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advan-ces in Immunology 57:191-280 (1994); Pedido de Patente PCT No.PCT/GB91/01134; publicações de PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; ePats. U. S. Nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908;5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225;5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108; cada um destes é incorporado aqui porreferência em sua totalidade.
Como descrito nas referências acima, após seleção do fago, asregiões de codificação de anticorpo do fago podem ser isoladas e usadaspara gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ou qualqueroutro fragmento de ligação de antígeno desejado, e expressado em qualquerhospedeiro desejado, incluindo células mamíferas, células de inseto, célulasvegetais, levedura, e bactérias. Por exemplo, técnicas para recombinante-mente produzir fragmentos de Fab, Fab' e F(ab')2 podem também ser em-pregadas usando métodos conhecidos na técnica tais como aqueles revela-dos na publicação de PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques12(6):864-869 (1992); e Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); e Better et al.,Science 240:1041-1043 (1988) (as ditas referências incorporadas por refe-rência em suas totalidades).
Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvse anticorpos de cadeia simiples incluem aquelas descritas nas Pats. U. S.Nos. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science240:1038-1040 (1988). Para alguns usos, incluindo uso in vivo de anticorposem humanos e ensaios in vitro de detecção, pode ser preferível usar anticor-pos quiméricos, humanizados, ou humanos. Um anticorpo quimérico é umamolécula em que porções diferentes do anticorpo são derivadas de espéciesanimais diferentes, tais como anticorpos tendo uma região variável derivadade um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobu-lina humana. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidosna técnica. Vide, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al.,BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202(1989); Pats. U. S. Nos. 5.807.715; 4.816.567; e 4.816397 que são incorpo-radas aqui por referência em suas totalidades. Anticorpos humanizados sãomoléculas de anticorpo do anticorpo de espécie não-humana que liga o antí-geno desejado tendo uma ou mais regiões de determinação de complemen-. taridade (CDRs) das espécies não-humanas e regiões de estrutura de umamolécula de imunoglobulina humana. Freqüentemente, os resíduos de estru-tura nas regiões de estrutura humanas serão substituídos com o resíduo cor-respondente do anticorpo doador de CDR para alterar, preferivelmente me-lhorar, a ligação do antígeno. Estas substituições de estrutura são identifica-das por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, modelagem dasinterações do CDR e os resíduos de estrutura para identificar resíduos deestrutura importantes para a ligação de antígeno e comparação da seqüên-cia para identificar os resíduos de estrutura incomuns nas posições particula-res. (Vide, por exemplo, Queen et al., Pat. U. S. No. 5.585.089; Riechmannet al., Nature 332:323 (1988) que são incorporadas aqui por referência emsuas totalidades). Os anticorpos podem ser humanizados usando uma vari-edade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, exerto deCDR (EP 239.400; publicação de PCT WO 91/09967; Pats. U. S. Nos.5.225.539; 5.530.101; e 5.585.089), vereering ou resurfacing (EP 592.106;EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Stud-nicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS91:969-973 (1994)), e embaralhamento de cadeias (Pat. U. S. No.5.565.332).
Anticorpos completamente humanos são particularmente dese-jáveis para tratamento terapêutico de pacientes humanos. Anticorpos huma-nos podem ser feitos por uma variedade de métodos conhecidos na técnicaincluindo métodos de apresentação de fago descritos acima usando bibliote-cas de anticorpo derivadas de seqüências de imunoglobulina humanas. Videtambém, Pats. U. S. Nos. 4.444.887 e 4.716.111; e publicações de PCT WO98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO96/33735, e WO 91/10741; cada uma destas é incorporada aqui por referên-cia em sua totalidade.
Anticorpos humanos podem também ser produzidos usando ca-mundongos transgênicos que são incapazes de expressar imunoglobulinasendógenas funcionais, mas que pode expressar genes de imunoglobulinahumana. Por exemplo, os complexos de gene de imunoglobulina humana decadeia pesada e leve podem ser introduzidos fortuitamente ou por recombi-nação homóloga nas células-tronco embrionárias de camundongo. Alternati-vãmente, a região variável humana, região constante, e região de diversida-de podem ser introduzidas nas células-tronco embrionárias de camundongoalém dos genes de cadeia pesada e leve humanos. Os genes de imunoglo-bulina de cadeia leve e pesada de camundongo podem ser dados não-funcionais separada ou simultaneamente com a introdução dos Ioci de imu-noglobulina humana através de recombinação homóloga. Em particular, de-leção homozigota da região de JH impede a produção de anticorpo endóge-no. As células-tronco embrionárias modificadas são expandidas e microinje-tadas nos blastocistos para produzir camundongos quiméricos. Os camun-dongos quiméricos são depois criados para produzir descendência homozi-gota que expressa anticorpos humanos. Os camundongos transgênicos sãoimunizados na maneira normal com um antígeno selecionado, por exemplo,toda ou uma porção de um polipeptídeo alvo desejado. Anticorpos monoclo-nais direcionados contra o antígeno podem ser obtidos dos camundongostransgênicos imunizados usando tecnologia de hibridoma convencional. Ostransgenes de imunoglobulina humana abrigados pelos camundongos trans-gênicos se rearranjam durante a diferenciação de célula B, e subseqüente-mente sofrem a troca de classe e mutação somática. Desse modo, usandouma tal técnica, é possível produzir anticorpos de IgG, IgA, IgM e IgE tera-peuticamente úteis. Para uma visão geral desta tecnologia para produzir an-ticorpos humanos, vide Lonberg e Huszar Int. Rev. Immunol. 13:65-93(1995). Para um debate detalhado desta tecnologia para produzir anticorposhumanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir taisanticorpos, vide, por exemplo, Publicações de PCT WO 98/24893; WO96/34096; WO 96/33735; Pats. U. S. Nos. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425;5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; e 5.939.598, que são incorpo-radas aqui por referência em sua totalidade. Além disso, companhias taiscomo Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) e GenPharm (San Jose, Calif.) podemser engajadas para fornecer anticorpos humanos direcionados contra umantígeno selecionado usando tecnologia similar àquela descrita acima.
Anticorpos completamente humanos podem ser gerados quereconhecem um epítopo selecionado usando uma técnica referida como "se-leção com guia". Neste método, um anticorpo monoclonal não-humano sele-cionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar aseleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmoepítopo. (Jespers et al., Bio/Technology 12:899-903 (1988). Vide também,patente U. S. No. 5.565.332.)
Também, anticorpos para alvejar polipeptídeos da invenção po-dem, por sua vez, ser utilizados para gerar anticorpos anti-idiotipo que "mi-metizam" os polipeptídeos alvos usando técnicas bem conhecidas àquelesversados na técnica. (Vide, por exemplo, Greenspan & Bona, FASEB J.,7(5):437-444 (1989) e Nissinoff, J. Immunoi 147(8):2429-2438 (1991)). Porexemplo, anticorpos que ligam e competitivamente inibem multimerização dopolipeptídeo e/ou ligação de um polipeptídeo da invenção a um ligando po-dem ser usados para gerar anti-idiotipos que "mimetizam" a multimerizaçãodo polipeptídeo e/ou domínio de ligação e, como uma conseqüência, ligam eneutralizam o polipeptídeo e/ou seu ligante. Tais anti-idiotipos de neutraliza-ção ou fragmentos de Fab de tais anti-idiotipos podem ser usados em regi-mes terapêuticos para neutralizar a ligação do polipeptídeo. Por exemplo,tais anticorpos anti-idiotípicos podem ser usados para ligar um polipeptídeoalvo desejado e/ou ligar seus ligantes/receptores, e assim bloquear sua ati-vidade biológica.
Em outra modalidade, anticorpos de codificação de DNA mono-clonais desejados podem ser facilmente isolados e seqüenciados usandoprocedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas deOligonucleo-tídeo que são capazes de ligar especificamente aos genes que codificam ascadeias pesadas e leves dos anticorpos murinos). As células de hibridomaisoladas e subclonadas servem como uma fonte preferida de tal DNA. Umavez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão que sãodepois transfeccionados para as células hospedeiras procarióticas ou euca-rióticas tais como, mas não limitadas, células de E. coli, células de COS desímio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mielomaque do contrário não produzem imunoglobulinas. Mais particularmente, oDNA isolado (que pode ser sintético como descrito aqui) pode ser usado pa-ra clonar seqüências de região constante e variáveis para fabricação dosanticorpos como descrito em Newman et al., Pat. U. S. No. 5.658.570, depo-sitada em 25 de janeiro de 1995, que é incorporada aqui por referência. Es-sencialmente, isto requer extração de RNA das células selecionadas, con-versão para cDNA, e amplificação por PCR usando iniciadores Ig-específicos. Iniciadores adequados para este propósito são também descri-tos na Pat. U. S. No. 5.658.570. Como será debatido em mais detalhe abai-xo, células transformadas que expressam o anticorpo desejado podem sercrescidas em quantidades relativamente grandes para fornecer materiaisclínicos e comerciais da imunoglobulina.
Em uma modalidade, um anticorpo de IGF-1R da invenção com-preende pelo menos uma CDR de cadeia pesada ou leve de uma moléculade anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo de IGF-1R da invençãocompreende pelo menos duas CDRs de uma ou mais moléculas de anticor-po. Em outra modalidade, um anticorpo de IGF-1R da invenção compreendepelo menos três CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outramodalidade, um anticorpo de IGF-1R da invenção compreende pelo menosquatro CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade,um anticorpo de IGF-1R da invenção compreende pelo menos cinco CDRsde uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpode IGF-1R da invenção compreende pelo menos seis CDRs de uma ou maismoléculas de anticorpo. Moléculas de anticorpo exemplares que compreen-dem pelo menos uma CDR que pode ser incluída nos anticorpos de IGF-1Rem questão são descritos aqui.
Em uma modalidade específica, a seqüência de aminoácido dosdomínios variáveis de cadeia pesada e/ou leve podem ser inspecionadaspara identificar as seqüências das regiões de determinação de complemen-taridade (CDRs) por métodos que são bem conhecidos na técnica, por e-xemplo, por comparação às seqüências de aminoácido conhecidas de outrasregiões variáveis de cadeia pesada e leve para determinar as regiões dehipervariabilidade da seqüência. Usando técnicas de DNA recombinante ro-tineiras, uma ou mais do CDRs podem ser inseridas dentro das regiões deestrutura, por exemplo, em regiões de estrutura humanas para humanizarum anticorpo não-humano. As regiões de estrutura podem ser de ocorrêncianatural ou regiões de estrutura de consenso, e preferivelmente regiões deestrutura humanas (vide, por exemplo, Chothia et al., J. Moi Biol. 278:457-479 (1998) para uma listagem das regiões de estrutura humanas). Preferi-velmente, o polinucleotídeo gerado pela combinação das regiões de estrutu-ra e CDRs codifica um anticorpo que especificamente liga pelo menos umepítopo de um polipeptídeo desejado, por exemplo, IGF-1R. Preferivelmente,uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas dentro das regi-ões de estrutura, e, preferivelmente, as substituições de aminoácido melho-ram a ligação do anticorpo a seu antígeno. Adicionalmente, tais métodospodem ser usados para fazer substituições ou deleções de aminoácido deum ou mais resíduos de cisteína de região variável que participam em umaligação de dissulfeto intracadeia para gerar moléculas de anticorpo que ca-recem de uma ou mais ligações de dissulfeto intracadeia. Outras alteraçõespara o polinucleotídeo são abrangidas pela presente invenção e dentro dahabilidade da técnica.
Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticor-pos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Nati Acad. Sei. 81:851-855 (1984);Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) mediante splicing dos genes de uma molécula de anticorpo decamundongo de especificidade de antígeno apropriada junto com genes deuma molécula de anticorpo humano de atividade biológica apropriada podemser usadas. Como aqui usado, um anticorpo quimérico é uma molécula emque diferentes porções são derivadas de espécies animais diferentes, taiscomo aquelas tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclo-nal murino e uma região constante da imunoglobulina humana, por exemplo,anticorpos humanizados.Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticor-pos de cadeia simples (Pat. U. S. No. 4.694.778; Bird, Science 242:423-442(1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883 (1988); eWard et al., Nature 334:544-554 (1989)) podem ser adaptadas para produziranticorpos de cadeia simples. Anticorpos de cadeia simples são formadosligando os fragmentos de cadeia pesada e leve da região de Fv por meio deuma ponte de aminoácido, resultando em um anticorpo de cadeia simples.Técnicas para a montagem de fragmentos Fv funcionais em E. coli podemtambém ser usadas (Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)).
Ainda outras modalidades da presente invenção compreendem ageração de anticorpos humanos ou substancialmente humanos em animaistransgênicos (por exemplo, camundongos) que são incapazes de produzirimunoglobulina endógena (vide por exemplo, Pats. U. S. Nos. 6.075.181,5.939.598, 5.591.669 e 5.589.369 cada uma destas é incorporada aqui porreferência). Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota da região dejunção de cadeia pesada do anticorpo em camundongos quiméricos e mu-tantes de linhagem germinal resulta na inibição completa da produção deanticorpo endógena. Transferência de um arranjo de gene de imunoglobulinahumana para tais camundongos mutantes de linhagem germinal resultará naprodução de anticorpos humanos sob desafio do antígeno. Outros meiospreferidos de gerar anticorpos humanos usando camundongos de SCID sãorevelados na Pat. U. S. No. 5.811.524, que é incorporada aqui por referên-cia. Será apreciado que o material genético associado a estes anticorposhumanos pode também ser isolado e manipulado como descrito aqui.
Ainda outros meios altamente eficientes para gerar anticorposrecombinantes são revelados por Newman, Biotechnology 10: 1455-1460(1992). Especificamente, esta técnica resulta na geração de anticorpos deprimata contendo domínios variáveis de macaco e seqüências constanteshumanas. Esta referência é incorporada aqui por referência em sua totalida-de. Além disso, esta técnica é também descrita nas Pats. U. S. comumentedesignada Nos. 5.658.570, 5.693.780 e 5.756.096 cada uma destas é incor-porada aqui por referência.Em outra modalidade, linfócitos podem ser selecionados por mi-cromanipulação e os genes variáveis isolados. Por exemplo, células mono-nucleares de sangue periférico podem ser isoladas de um mamífero imuni-zado e cultivadas durante cerca de 7 dias in vitro. As culturas podem ser tri-adas para IgGs específicas que satisfazem os critérios da triagem. As célu-las podem ser isoladas de poços positivos. Células B produtoras de Ig indivi-duais podem ser isoladas por FACS ou identificando-as em um ensaio deplaca hemolítica mediada com complemento. Células B produtoras de Ig po-dem ser micromanipuladas em um tubo e amplificadas nos genes de VH e VL usando, por exemplo, RT-PCR. Genes de VH e VL podem ser clonadosem um vetor de expressão de anticorpo e transfeccionados para as células(por exemplo, células eucarióticas ou procarióticas) para expressão.
Alternativamente, linhagens celulares produtoras de anticorpopodem ser selecionadas e cultivadas usando técnicas bem conhecidas ao artesão versado. Tais técnicas são descritas em uma variedade de manuaisde laboratório e publicações primárias. Neste respeito, técnicas adequadaspara o uso na invenção como descrita abaixo são descritas em Current Pro-tocols in Immunoloy, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates andWiley-lnterscience, John Wiley and Sons, Nova Iorque (1991), que é aquiincorporada por referência em sua totalidade, incluindo suplementos.
Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos porqualquer método conhecido na técnica para a síntese dos anticorpos, emparticular, através de síntese química ou preferivelmente, através de técni-cas de expressão recombinante como descritas aqui.
Em uma modalidade, um anticorpo de IGF-1R, ou fragmento deligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção compre-ende uma região constante sintética em que um ou mais domínios são par-cial ou completamente deletados ("anticorpos com domínios excluídos"). Emcertas modalidades, os anticorpos modificados compatíveis compreenderãoconstruções com domínios excluídos ou variantes em que o domínio de CH2inteiro foi removido ((construções de CH2). Para outras modalidades, umpeptídeo de conexão curto pode ser substituído pelo domínio deletado paraprover flexibilidade e liberdade de movimento para a região variável. Aquelesversados na técnica apreciarão que tais construções são particularmentepreferidas devido às propriedades reguladoras do domínio de CH2 sobre ataxa catabólica do anticorpo. Construções com domínio deletado podem serderivadas usando um vetor codificando um domínio de constante humano delgG1 (vide, por exemplo, WO 02/060955A2 e WO02/096948A2). Este vetor écriado para excluir o domínio de CH2 e fornecer um vetor sintético que ex-pressa uma região constante de lgGI com domínio excluído.
Em certas modalidades, os anticorpos de IGF-1R, ou fragmentosde ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invençãosão minicorpos. Minicorpos podem ser feitos usando métodos descritos natécnica (vide por exemplo, Patente US 5.837.821 ou WO 94/09817A1).
Em uma modalidade, um anticorpo de IGF-1R, ou fragmento dèligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção compre-ende uma cadeia pesada de imunoglobulina tendo deleção ou substituiçãode alguns ou até mesmo um único aminoácido contanto que permita a asso-ciação entre as subunidades monoméricas. Por exemplo, a mutação de umaminoácido simples nas áreas selecionadas do domínio de CH2 pode ser osuficiente para substancialmente reduzir a ligação de Fc e assim aumentarlocalização do tumor. Similarmente, pode ser desejável simplesmente dele-tar aquela parte de um ou mais domínios de região constante que controlama função efetora (por exemplo ligação do complemento) a ser modulada.Tais deleções parciais das regiões constantes podem melhorar as caracte-rísticas selecionadas do anticorpo (meia-vida em soro) enquanto deixandoas outras funções desejáveis associadas ao domínio de região constante emquestão intactas. Além disso, como aludido acima, as regiões constantesdos anticorpos revelados podem ser sintéticas através da mutação ou substi-tuição de um ou mais aminoácidos que intensificam o perfil da construçãoresultante. Neste respeito pode ser possível romper a atividade fornecida porum sítio de ligação conservado (por exemplo ligação de Fc) ao mesmo tem-po substancialmente mantendo a configuração e perfil imunogênicos do anti-corpo modificado. Ainda outras modalidades compreendem a adição de umou mais aminoácidos à região constante para intensificar as característicasdesejáveis, tais como função efetora ou prover mais fixação da citotoxina oudo carboidrato. Em tais modalidades pode ser desejável inserir ou replicar asseqüências específicas derivadas dos domínios de região constante selecio-nados.
A presente invenção também fornece anticorpos que compreen-dem, consistem essencialmente em, ou consistem em, variantes (incluindoderivados) das moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões de VH e/ouregiões de VL) descritas aqui cujos anticorpos ou fragmentos dos mesmosimunoespecificamente ligam a um polipeptídeo de IGF-1R ou fragmento ouvariante do mesmo. Técnicas padrões conhecidas àqueles de habilidade natécnica podem ser usadas para introduzir mutações na seqüência de nucleo-tídeo que codifica um anticorpo de IGF-1R, incluindo, mas não limitado a,mutagênese dirigido e mutagênese mediado com PCR1 que resulta nassubstituições de aminoácido. Preferivelmente, as variantes (incluindo deriva-dos) codificam menos de 50 substituições de aminoácido, menos de 40substituições de aminoácido, menos de 30 substituições de aminoácido, me-nos de 25 substituições de aminoácido, menos de 20 substituições de ami-noácido, menos de 15 substituições de aminoácido, menos de 10 substitui-ções de aminoácido, menos de 5 substituições de aminoácido, menos de 4substituições de aminoácido, menos de 3 substituições de aminoácido, oumenos de 2 substituições de aminoácido com relação à região de VH de re-ferência, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, região de VL, VL-CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3. Uma "substituição de aminoácido conservadora" é umaem que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoáci-do tendo uma cadeia lateral com uma carga similar. Famílias de resíduos deaminoácido tendo cadeias laterais com cargas similares foram definidas natécnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas(por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exem-pio, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares descarrega-das (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina,cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina,isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais a-romáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternati-vamente, mutações podem ser introduzidas fortuitamente ao longo de todaou parte da seqüência de codificação, tal como através de mutagênese desaturação, e os mutantes resultantes podem ser triados para atividade bioló-gica para identificar os mutantes que retêm a atividade (por exemplo, a habi-lidade para ligar um polipeptídeo de IGF-1R).
Por exemplo, é possível introduzir mutações apenas nas regiõesde estrutura ou apenas nas regiões de CDR de uma molécula de anticorpo.Mutações introduzidas podem ser mutações sem sentido silenciosas ou neu-tras, isto é, têm nenhum, ou pequeno, efeito na habilidade de um anticorpopara ligar antígeno, de fato algumas tais mutações não alteram em nada aseqüência de aminoácido. Estes tipos de mutações podem ser úteis paraotimizar o uso de códon, ou melhorar a produção de anticorpo de um hibri-doma. Regiões de codificação otimizadas no códon que codificam os anti-corpos de IGF-1R da presente invenção são reveladas em outro lugar aqui.Alternativamente, as mutações sem sentido não-neutras podem alterar ahabilidade de um anticorpo para ligar o antígeno. A localização das muta-ções sem sentido mais silenciosas e neutras é provável de estar nas regiõesde estrutura, enquanto a localização da maioria das mutações sem sentidonão-neutras é provável de estar na CDR, entretanto isto não é um requeri-mento absoluto. Alguém de habilidade na técnica poderia projetar e testarmoléculas mutantes com propriedades desejadas tais como nenhuma alte-ração na atividade de ligação de antígeno ou alteração na atividade de liga-ção (por exemplo, melhorias na atividade de ligação de antígeno ou altera-ção na especificidade do anticorpo). Seguindo mutagênese, a proteína codi-ficada pode ser habitualmente expressada e a atividade funcional e/ou bioló-gica da proteína codificada, (por exemplo, habilidade para imunoespecifica-mente ligar pelo menos um epítopo de um polipeptídeo de IGF-1R) pode serdeterminada usando as técnicas descritas aqui ou habitualmente modifican-do as técnicas conhecidas na técnica.IV. POLINUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM ANTICORPOS DE IGF-1R
A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucléi-co que codificam anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antíge-no, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polinucle-otídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consis-tindo em um ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia pe-sada da imunoglobulina (VH), onde pelo menos uma das CDRs da regiãovariável de cadeia pesada ou pelo menos duas das VH-CDRs da região va-riável de cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90 %ou 95 %idênticasàs seqüências de aminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2, ou de VH-CDR3 decadeia pesada de referência dos anticorpos de IGF-1R monoclonais revela-dos aqui. Alternativamente, as regiões de VH-CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3da VH são pelo menos 80%, 85%, 90 %ou 95 %idênticas às seqüências deaminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3 de cadeia pesada de refe-rência dos anticorpos de IGF-1R monoclonais revelados aqui. Desse modo,de acordo com esta modalidade uma região variável de cadeia pesada dainvenção tem seqüências de polipeptídeo de VH-CDR1, VH-CDR2, ou VH-CDR3 relacionadas às seqüências de polipeptídeo mostradas na TABELA 5:109
TABELA 5: Seqüências de aminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2. e VH-CDR3de referência*
<table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table><table>table see original document page 113</column></row><table><table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table><table>table see original document page 116</column></row><table><table>table see original document page 117</column></row><table>
* Determinada pelo sistema de Kabat (vide supra).
N = Seqüência de nucleotídeo, P = seqüência de polipeptídeo.
Como conhecido na técnica, "identidade de seqüência" entredois polipeptídeos ou dois polinucleotídeos são determinados comparando oaminoácido ou seqüência de ácido nucléico de um polipeptídeo ou polinu-cleotídeo à seqüência de um segundo polipeptídeo ou polinucleotídeo.Quando debatido aqui, se qualquer polipeptídeo particular for pelo menoscerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %ou95 %idêntico a outro polipeptídeo pode ser determinado usando métodos eprogramas/software de computador conhecidos na técnica tais como, masnão limitados a, programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Packa-ge, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University ResearchPark, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). BESTFIT usa o algoritmo dehomologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics2:482-489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entreduas seqüências. Quando usar BESTFIT ou qualquer outro programa dealinhamento de seqüência para determinar se uma seqüência particular é,por exemplo, 95 %idêntica a uma seqüência de referência de acordo com apresente invenção, os parâmetros são ajustados, claro, de modo que a por-centagem de identidade seja calculada no comprimento total da seqüênciade polipeptídeo de referência e que intervalos em homologia de até 5 %donúmero total de aminoácidos na seqüência de referência sejam permitidos.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno compreendendo a VH específica ou preferencialmente codifica-da pelo polinucleotídeo liga a IGF-1R. Em certas modalidades a seqüênciade nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de VH é alterada sem alterar aseqüência de aminoácido assim codificada. Por exemplo, a seqüência podeser alterada para uso de códon melhorado em uma espécie dada, para re-mover sítios de splice, ou remover sítios da enzima de restrição. Otimiza-ções das seqüências tais como estas são descritas nos exemplos e são bemconhecidas e habitualmente realizadas por aqueles de habilidade usual natécnica.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinu-cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con-sistindo em um ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeiapesada da imunoglobulina (VH) em que as regiões de VH-CDR1, VH-CDR2,e de VH-CDR3 têm seqüências de polipeptídeo que são idênticas aos gru-pos de VH-CDR1, VH-CDR2, e de VH-CDR3 mostrados na TABELA 5. Emcertas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenocompreendendo a VH específica ou preferencialmente codificada pelo poli-nucleotídeo liga a IGF-1R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima específica ou preferencialmente liga ao mesmo epítopo deIGF-R1 como um fragmento de anticorpo de Fab monoclonal de referênciaselecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclonal de referência pro-duzido por um hibridoma selecionado do grupo que consiste em P2A7.3E11,20C8.3B8, Ρ1 A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8, ou competi-tivamente inibirá um tal anticorpo monoclonal ou fragmento de ligar a IGF-1R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima específica ou preferencialmente liga a um polipeptídeo deIGF-1R ou fragmento do mesmo, ou uma variante de polipeptídeo de IGF-1R, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0)não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ10'5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ10"9 Μ, ΙΟ-9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ,5 χ 10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinu-cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con-sistindo em um ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeialeve da imunoglobulina (VL), onde pelo menos uma das VL-CDRs da regiãovariável de cadeia leve ou pelo menos duas das VL-CDRs da região variávelde cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90 %ou 95 %idênticas às se-qüências de aminoácido de VL-CDR1, VL-CDR2, ou de VL-CDR3 de cadeialeve de referência dos anticorpos de IGF-1R monoclonais revelados aqui.
Alternativamente, as regiões de VL-CDR1, VL-CDR2, e VL-CDR3 da VL sãopelo menos 80%, 85%, 90 %ou 95 %idênticas a seqüências de aminoácidode VL-CDR1, VL-CDR2, e VL-CDR3 de cadeia leve de referência dos anti-corpos de IGF-1R monoclonais revelados aqui. Desse modo, de acordo comesta modalidade uma região variável de cadeia leve da invenção tem se-qüências de polipeptídeo de VL-CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3 relacionadasàs seqüências de polipeptídeo mostradas na TABELA 6:
TABELA 6: Seqüências de aminoácido de VL-CDR1, VL-CDR2. e VL-CDR3de referência*
<table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table><table>table see original document page 122</column></row><table>Anticorpo Seqüência de VL PN/PP (seqüências de VL-CDRl, VL-CDR2, e VL-CDR3 subli- nhadas ) CDRl de VL CDR2 de VL CDR3 de VLP1A2.2Bll GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTATCT GCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGG GCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTAT CAGCAGAAACCAGATGGAACTATTAAACTCCTGATC TACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCA AGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCT CTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATTTTGCC ACTTACTTTTGCCAACAGGGTAAAACGCTTCCGTGG ACGTTCGGTGGAGGCAC CAAGC TGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 107) DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWY QQKPDGTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYS LTISNLEQEDFATYFCQQGKTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 108) RASQDISN- TSRLHS QQGKTLPWT YLN (SEQ ID NO: 109) (SEQ ID NO: 110) (SEQ ID NO: 111)20D8.24B11 O MESMO QUE 20C8 PlGlO.2B8 GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCT GCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGG GCAAGTCAGGACATTAGTAATTATTTAAATTGGTAT CAGCAGAAACCAGATGGATCTGTTAAACTCCTGATC TACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCA AGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCT CTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATATTGCC ACTTACTTTTGCCAACAGGGAAAGACGCTTCCGTGG ACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 112) DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWY QQKPDGSVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYS LTISNLEQEDIATYFCQQGKTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 113) RASQDISN- TSRLH QQGKTLPWT YLN (SEQ ID NO: 114) (SEQ ID NO: 115) (SEQ ID NO: 116)P1E2.3B12 GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCA GTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGG TC TAGTAAGAGTC TC CTACATAGTAATGGCATCACT TATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCT CCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCC TCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCA GGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAG GCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAAT CTAGAACTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAG CTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 117) DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGIT YLYWYLQK PGQ SPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGS GTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGT- KLEIK (SEQ ID NO: 118) RSSKSL- QMSNLAS AQNLELPYT LHSNGIT- (SEQ ID NO: 120) (SEQ ID NO: 121) YLY (SEQ ID NO: 119)
* Determinada pelo sistema de Kabat (vide supra).
PN = Seqüência de nucleotídeo, PP = seqüência polipeptídeo.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno compreendendo a VL específica ou preferencialmente codifica-da pelo polinucleotídeo liga a IGF-1R.Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinu-cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con-sistindo em um ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeialeve da imunoglobulina (VL) em que as regiões de VL-CDR1, VL-CDR2, eVL-CDR3 têm seqüências de polipeptídeo que são idênticas aos grupos deVL-CDR1, VL-CDR2, e de VL-CDR3 mostrados na TABELA 6. Em certasmodalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreen-dendo a VL específica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeoliga a IGF-1R.
Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um polinu-cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con-sistindo em um ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeialeve da imunoglobulina (VL) em que as regiões de VL-CDR1, VL-CDR2, eVL-CDR3 são codificados por seqüências de nucleotídeo que são idênticasàs seqüências de nucleotídeo que codificam os grupos de VL-CDR1, VL-CDR2, e de VL-CDR3 mostrados na TABELA 6. Em certas modalidades, umanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VL especí-fica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo liga a IGF-1R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des-critos acima específica ou preferencialmente liga ao mesmo epítopo de IGF-R1 como um fragmento de anticorpo de Fab monoclonal de referência sele-cionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01,M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclonal de referência produzidopor um hibridoma selecionado do grupo que consiste em P2A7.3E11,20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8, ou competi-tivamente inibirá um tal anticorpo monoclonal ou fragmento de ligar a IGF-1R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des-critos acima específica ou preferencialmente liga a um polipeptídeo de IGF-1R ou fragmento do mesmo, ou uma variante de polipeptídeo de IGF-1R,com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) nãomaior que 5 χ W2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 M1 10"4 Μ, 5 χ 10"5Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 M1 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10 10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 M1 5 χ 10"12 Μ, 10"12 M1 5 χ10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ IO-15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli-nucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em um ácido nucléico que codifica uma VH pelo menos 80%,85%, 90 %95 %ou 100 %idêntica a uma seqüência de polipeptídeo de VH dereferência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 9, 14, 20,26, 32, 38, 43, 48, 53, 58, e 63. Em certas modalidades, um anticorpo oufragmento de ligação de antígeno compreendendo a VH específica ou prefe-rencialmente codificada pelo polinucleotídeo liga a IGF-1R.
Em outro aspecto, a presente invenção inclui um polinucleotídeoisolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo emuma seqüência de ácido nucléico que codifica uma VH tendo uma seqüênciade polipeptídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 9,14, 20, 26, 32, 38, 43, 48, 53, 58, e 63. Em certas modalidades, um anticor-po ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VH específica oupreferencialmente codificada pelo polinucleotídeo liga a IGF-1R.
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli-nucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em um ácido nucléico de codificação de VH pelo menos 80%,85%, 90 %95 %ou 100 %idêntico a uma seqüência de ácido nucléico de re-ferência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 8, 13, 18,19, 24, 25, 30, 31, 36, 37, 42, 47, 52, 57, e 62. Em certas modalidades, umanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VH especí-fica ou preferencialmente codificada por tais polinucleotídeos liga a IGF-1R.
Em outro aspecto, a presente invenção inclui um polinucleotídeoisolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo emuma seqüência de ácido nucléico que codifica uma VH da invenção onde aseqüência de aminoácido da VH é selecionada do grupo que consiste emSEQ ID NOs: 4, 9, 14, 20, 26, 32, 38, 43, 48, 53, 58, e 63. A presente inven-ção também inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindoessencialmente em, ou consistindo em uma seqüência de ácido nucléico quecodifica uma VH da invenção onde a seqüência do ácido nucléico é selecio-nada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 8, 13, 18, 19, 24, 25, 30, 31,36, 37, 42, 47, 52, 57, e 62. Em certas modalidades, um anticorpo ou frag-mento de ligação de antígeno compreendendo a VH específica ou preferen-cialmente codificada por tais polinucleotídeos liga a IGF-1R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima específica ou preferencialmente liga ao mesmo epítopo deIGF-R1 como um fragmento de anticorpo de Fab monoclonal de referênciaselecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclonal de referência pro-duzido por um hibridoma selecionado do grupo que consiste em P2A7.3E11,20C8.3B8, Ρ1 A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8, ou competi-tivamente inibirá um tal anticorpo monoclonal ou fragmento de ligar a IGF-1R, ou competitivamente inibirá um tal anticorpo monoclonal de ligar a IGF-1R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima específica ou preferencialmente liga a um polipeptídeo deIGF-1R ou fragmento do mesmo, ou uma variante de polipeptídeo de IGF-1R, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Ko)não maior que 5 χ 10-2 Μ, 10-2 Μ, 5 χ 10-3 Μ, 10-3 Μ, 5 χ 10-4 Μ, 10-4 Μ, 5 χ10-5 Μ, 10-5 Μ, 5 χ 10-6 Μ, 10-6 Μ, 5 χ 10-7 Μ, 10-7 Μ, 5 χ 10-8 Μ, 10-8 Μ, 5 χ10-9 Μ, 10-9 Μ, 5 χ 10-10 Μ, 10-10 Μ, 5 χ 10-11 Μ, 10-11 Μ, 5 χ 10-12 Μ, 10-12 Μ,5 χ 10-13 Μ, 10-13 Μ, 5 χ 10-14 Μ, 10-14 Μ, 5 χ 10-15 Μ, ou 10-15 Μ.Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli-nucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em um ácido nucléico que codifica uma VL pelo menos 80%,85%, 90 %95 %ou 100 %idêntica a uma seqüência de polipeptídeo de VL dereferência tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo queconsiste em SEQ ID NOs: 68, 73, 78, 83, 88, 93, 98, 103, 108, 113, e 118.Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um polinucleotídeoisolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo emum ácido nucléico de codificação de VL pelo menos 80%, 85%, 90 %95 %ou100 %idêntico a uma seqüência de ácido nucléico de referência selecionadado grupo que consiste em SEQ ID NOs: 67, 72, 77, 82, 87, 92, 97, 102, 107,112, e 117. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno compreendendo a VL específica ou preferencialmente codifica-da por tais polinucleotídeos liga a IGF-1R.
Em outro aspecto, a presente invenção inclui um polinucleotídeoisolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo emuma seqüência de ácido nucléico que codifica uma VL tendo uma seqüênciade polipeptídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 68, 73,78, 83, 88, 93, 98, 103, 108, 113, e 118. A presente invenção também incluium polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em,ou consistindo em uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma VL dainvenção onde a seqüência do ácido nucléico é selecionada do grupo queconsiste em SEQ ID NOs: 67, 72, 77, 82, 87, 92, 97, 102, 107, 112, e 117.Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenocompreendendo a VL específica ou preferencialmente codificada por taispolinucleotídeos liga a IGF-1R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des-critos acima específica ou preferencialmente liga ao mesmo epítopo de IGF-R1 como um fragmento de anticorpo de Fab monoclonal de referência sele-cionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01,Μ12-Ε01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclonal de referência produzido"por um hibridoma selecionado do grupo que consiste em P2A7.3E11,20C8.3B8, Ρ1 A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8, ou competi-tivamente inibirá um tal anticorpo monoclonal ou fragmento de ligar a IGF-1R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des-critos acima específica ou preferencialmente liga a um polipeptídeo de IGF-1R ou fragmento do mesmo, ou uma variante de polipeptídeo de IGF-1R,com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) nãomaior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10'7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ1013M, 10-13M, 5 χ 10 14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 1015 Μ.
Quaisquer dos polinucleotídeos descritos acima pode tambéminclui ácidos nucléicos adicionais, codificando, por exemplo, um peptídeosinal para direcionar a secreção do polipeptídeo codificado, regiões constan-tes de anticorpo como descritas aqui, ou outros polipeptídeos heterólogoscomo descritos aqui.
Também, como descrito em outro lugar em mais detalhe aqui, apresente invenção inclui composições compreendendo os polinucleotídeoscompreendendo um ou mais dos polinucleotídeos descritos acima. Em umamodalidade, a invenção inclui composições compreendendo um primeiropolinucleotídeo e segundo polinucleotídeo em que o dito primeiro polinucleo-tídeo codifica um polipeptídeo de VH como descrito aqui e em que o dito se-gundo polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de VL como descrito aqui.Especificamente uma composição que compreende, consiste essencialmen-te em, ou consiste em um polinucleotídeo de VH, e um polinucleotídeo deVL, em que o polinucleotídeo de VH e o polinucleotídeo de VL codificam ospolipeptídeos, respectivamente pelo menos 80%, 85%, 90 %95 %ou 100%idêntico às seqüências de aminoácido de polipeptídeo de VL e VL de refe-rência selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4 e 68, 8 e 73,14 e 78, 20 e 83, 26 e 88, 32 e 93, 38 e 98, 43 e 103, 48 e 108, 53 e 103, 58e 113, e 63 e 118. Ou alternativamente, uma composição que compreende,consiste essencialmente em, ou consiste em um polinucleotídeo de VH, eum polinucleotídeo de VL pelo menos 80%, 85%, 90 %95 %ou 100 %idênti-co, respectivamente, às seqüências de ácido nucléico de VL e VL de refe-rência selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3 e 67, 8 e 72,13 e 77, 18 e 77, 19 e 82, 24 e 82, 25 e 87, 30 e 87, 31 e 92, 36 e 92, 37 e97, 42 e 102, 47 e 107, 58 e 102, 57 e 112, e 62 e 117. Em certas modalida-des, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo aVH e VL específica ou preferencialmente codificada pelos polinucleotídeosem tais composições liga a IGF-1R.
A presente invenção também inclui fragmentos dos polinucleotí-1 deos da invenção, como descritos em outro lugar. Adicionalmente polinucle-otídeos que codificam polinucleotídeos de fusão, fragmentos de Fab, e ou-tros derivados, como descritos aqui, são também contemplados pela invenção.
Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados porqualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a seqüência de nu-cleotídeo do anticorpo for conhecida, um polinucleotídeo que codifica o anti-corpo pode ser montado de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados(por exemplo, como descrito em Kutmeier et al., BioTechniques 17:242(1994)) que, brevemente, envolve a síntese de sobrepor oligonucleotídeoscontendo porções da seqüência que codifica o anticorpo, anelamento e Iiga-ção daqueles oligonucleotídeos, e depois amplificação dos oligonucleotídeosligado por PCR.
Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpode IGF-1R, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado domesmo pode ser gerado de ácido nucléico de uma fonte adequada. Se umclone contendo um ácido nucléico que codifica um anticorpo particular nãoestiver disponível, mas a seqüência da molécula de anticorpo for conhecida,um ácido nucléico que codifica o anticorpo pode ser sintetizado quimicamen-te ou pode ser obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma bibliotecade cDNA de anticorpo, ou uma biblioteca de cDNA gerada, ou ácido nucléi-co, de preferivelmente poly A+RNA, isolado de qualquer tecido ou célulasque expressam o anticorpo ou outro anticorpo de IGF-1R, tais como célulasde hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo) por amplificação dePCR usando iniciadores sintéticos hidrolizáveis nas terminações 3' e 5' daseqüência ou clonagem usando uma sonda de oligonucleotídeo específicapara a seqüência de gene particular identificar, por exemplo, um clone decDNA de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo ou outro anticorpode IGF-1R. Ácidos nucléicos amplificados gerados por PCR podem ser de-pois clonados em vetores de clonagem replicáveis usando qualquer métodobem conhecido na técnica.
Uma vez a seqüência de nucleotídeo e seqüência de aminoácidocorrespondente do anticorpo de IGF-1R, ou fragmento de ligação de antíge-no, variante, ou derivado do mesmo é determinado, sua seqüência de nucle-otídeo pode ser manipulada usando métodos bem conhecidos na técnicapara a manipulação de seqüências de nucleotídeo, por exemplo, técnicas deDNA recombinante, mutagênese loco-dirigida, PCR, etc. (vide, por exemplo,as técnicas descritas em Sambrook et al., Sambrook et al., Molecular Clo-ning, A Laboratory Manual, 2- Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold S-pring Harbor, N.Y. (1990) e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecu-lar Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), ambas são incorporadas aqui porreferência em suas totalidades), para gerar anticorpos tendo uma seqüênciade aminoácido diferente, por exemplo para criar substituições, deleções,e/ou inserções de aminoácidos.
Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de IGF-1 R, oufragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode sercomposto de qualquer polirribonucleotídeo ou polideoxrribonucleotídeo, quepode ser RNA ou DNA inalterados ou RNA ou DNA modificados. Por exem-plo, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo de IGF-1 R, ou fragmento deligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser composto deDNA uni ou bifilamentar, DNA que é uma mistura de regiões uni e bifilamen-tares, RNA uni e bifilamentar, e RNA que é mistura de regiões uni e bifila-mentares, moléculas híbridas compreendendo o DNA e RNA que podem serunifilamentares ou, mais tipicamente, bifilamentares ou uma mistura de regi-ões uni e bifilamentares. Além disso, um polinucleotídeo que codifica umanticorpo de IGF-1R, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou deri-vado do mesmo pode ser composto de regiões trifilamentares compreen-dendo RNA ou DNA ou RNA e DNA. Um polinucleotídeo que codifica umanticorpo de IGF-1R, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou deri-vado do mesmo pode também contém uma ou mais bases modificadas oucadeias principais de DNA ou RNA modificadas para estabilidade ou por ou-tras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas ebases incomuns tais como inosina. Uma variedade de modificações pode serfeita no DNA e RNA; desse modo, "polinucleotídeo" abrange formas química,enzimática, ou metabolicamente modificadas.
Um polinucleotídeo isolado codifica uma variante não-natural deum polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, uma porçãode cadeia pesada ou porção de cadeia leve da imunoglobulina) pode sercriado introduzindo uma ou mais substituições, adições ou deleções de nu-cleotídeo na seqüência de nucleotídeo da imunoglobulina de modo que umaou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido sejam introduzi-das na proteína codificada. Mutações podem ser introduzidas por técnicaspadrões, tais como mutagênese dirigida e mutagênese mediada por PCR.Preferivelmente, substituições conservadoras de aminoácido são feitas emum ou mais resíduos de aminoácido não-essenciais.
V. POLIPEPTÍDEOS DE ANTICORPO DE IGF-1R
A presente invenção é também direcionada a polipeptídeos iso-lados que compõem os anticorpos de IGF-1R, e polinucleotídeos que codifi-cam tais polipeptídeos. Anticorpos de IGF-1R da presente invenção compre-endem polipeptídeos, por exemplo, seqüências de aminoácido que codificamantígeno específico para IGF-1R que liga regiões derivadas das moléculasde imunoglobulina. Uma seqüência de polipeptídeo ou de aminoácido "deri-vada de" uma proteína designada refere-se à origem do polipeptídeo tendouma certa seqüência de aminoácido. Em certos casos, a seqüência de poli-peptídeo ou de aminoácido que é derivada de uma seqüência de polipeptí-deo ou de aminoácido de partida particular tem uma seqüência de aminoáci-do que é essencialmente idêntica à da seqüência de partida, ou uma porçãoda mesma, em que a porção consiste em pelo menos 10-20 aminoácidos,pelo menos 20-30 aminoácidos, pelo menos 30-50 aminoácidos, ou que é docontrário identificável a alguém de habilidade usual na técnica como tendosua origem na seqüência de partida.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polipeptí-deo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindoem uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH), onde pelomenos uma das VH-CDRs da região variável de cadeia pesada ou pelo me-nos duas das VH-CDRs da região variável de cadeia pesada são pelo me-nos 80%, 85%, 90 %ou 95 %idênticas às seqüências de aminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2 ou de VH-CDR3 de cadeia pesada de referência dos anti-corpos de IGF-1R monoclonais revelados aqui. Alternativamente, as regiõesde VH-CDR1, VH-CDR2 e de VH-CDR3 da VH são pelo menos 80%, 85%,90 %ou 95 %idênticas às seqüências de aminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2 e de VH-CDR3 de cadeia pesada de referência dos anticorpos deIGF-1R monoclonais revelados aqui. Desse modo, de acordo com esta mo-dalidade uma região variável de cadeia pesada da invenção tem seqüênciasde polipeptídeo de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 relacionadas aos gru-pos mostrados na TABELA 5, supra. Embora a TABELA 5 mostre as VH-CDRs definidas pelo sistema de Kabat, outras definições de CDR, por e-xemplo, VH-CDRs definidas pelo sistema de Chothia, são também incluídasna presente invenção. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmentode ligação de antígeno que específica ou preferencialmente compreende aVH Iigaa IGF-1R.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipep-tídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistin-do em uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH) emque a regiões de VH-CDR1, VH-CDR2 e de VH-CDR3 têm seqüências depolipeptídeo que são idênticas aos grupos de VH-CDR1, VH-CDR2 e de VH-~ CDR3 mostrados na TABELA 5. Em certas modalidades, um anticorpo oufragmento de ligação de antígeno que específica ou preferencialmente com-preende a VH liga a IGF-1R.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipep-tídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistin-do em uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH) emque a regiões de VH-CDR1, VH-CDR2 e de VH-CDR3 têm seqüências depolipeptídeo que são idênticas aos grupos de VH-CDR1, VH-CDR2 e de VH-CDR3 mostrados na TABELA 5, com exceção de uma, duas, três, quatro,cinco, ou seis substituições de aminoácido em qualquer uma VH-CDR. EmCDRs maiores, por exemplo, VH-CDR-3, substituições adicionais podem serfeitas na CDR, contanto que uma VH que específica ou preferencialmentecompreende a VH-CDR liga a IGF-1R. Em certas modalidades as substitui-ções de aminoácido são conservadoras. Em certas modalidades, um anti-corpo ou fragmento de ligação de antígeno que específica ou preferencial-mente compreende a VH liga a IGF-1 R.
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli-peptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con-sistindo em um polipeptídeo de VH pelo menos 80%, 85%, 90 %95 %ou 100%idêntico a uma seqüência de aminoácido de polipeptídeo de VH de refe-rência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 4,9, 14, 20, 26, 32, 38, 43, 48, 53, 58, e 63. Em certas modalidades, um anti-corpo ou fragmento de ligação de antígeno que específica ou preferencial-mente compreende o polipeptídeo de VH liga a IGF-1 R.
Em outro aspecto, a presente invenção inclui um polipeptídeoisolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo emum polipeptídeo de VH selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs:SEQ ID NOs: 4, 9, 14, 20, 26, 32, 38, 43, 48, 53, 58, e 63. Em certas modali-dades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que específica oupreferencialmente compreende o polipeptídeo de VH liga a IGF-1 R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em um ou mais dos polipeptídeos de VH descritos acima especí-fica ou preferencialmente liga ao mesmo epítopo de IGF-R1 como um frag-mento de anticorpo de Fab monoclonal de referência selecionado do grupoque consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclonal de referência produzido por um hibridomaselecionado do grupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11,20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8, ou competitivamente inibirá um talanticorpo monoclonal ou fragmento de ligar a IGF-1R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em um ou mais dos polipeptídeos de VH descritos acima especí-fica ou preferencialmente liga a um polipeptídeo de IGF-1R ou fragmento domesmo, ou uma variante de polipeptídeo de IGF-1R, com uma afinidade ca-racterizada por uma constante de dissociação (KD) não maior que 5 x 10-2 Μ,10-2 Μ, 5 x 10-3 Μ, 10-3 Μ, 5 x 10-4 Μ, 10-4 Μ, 5 x 10-5 Μ, 10-5 Μ, 5 x 10-6 Μ,10-6 Μ, 5 x 10-7 Μ, 10-7 Μ, 5 x 10-8 Μ, 10-8 Μ, 5 x 10-9 Μ, 10-9 Μ, 5 x 10-10 Μ,10-10 Μ, 5 x 10-11 Μ, 10-11 Μ, 5 x 10-12 Μ, 10-12 Μ, 5 x 10-13 Μ, 10-13 Μ, 5 x 10-14 Μ, 10-14 Μ, 5 x 10-15 Μ, ou 10-15 Μ.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipep-tídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistin-do em uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL), onde pelomenos uma das VL-CDRs da região variável de cadeia leve ou pelo menosduas das VL-CDRs da região variável de cadeia leve é pelo menos 80%,85%, 90 %ou 95 %idênticas às seqüências de aminoácido de VL-CDR1, VL-CDR2 ou de VL-CDR3 de cadeia leve de referência dos anticorpos de IGF-1R monoclonais revelados aqui. Alternativamente, as regiões de VL-CDR1,VL-CDR2 e VL-CDR3 da VL são pelo menos 80%, 85%, 90 %ou 95 %idênti-cas às seqüências de aminoácido de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 decadeia leve de referência dos anticorpos de IGF-1R monoclonais reveladosaqui. Desse modo, de acordo com esta modalidade uma região variável decadeia leve da invenção tem seqüências de polipeptídeo de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 relacionadas aos polipeptídeos mostrados na TABELA 6,supra. Embora a TABELA 6 mostre que as VL-CDRs definidas pelo sistemade Kabat, outras definições de CDR, por exemplo, VL-CDRs definidas pelosistema de Chothia1 são também inclusas na presente invenção. Em certasmodalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que especí-fica ou preferencialmente compreende o polipeptídeo de VL liga a IGF-1R.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipep-tídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistin-do em uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL) em que aregiões de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 têm seqüências de polipeptídeoque são idênticas aos grupos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 mostradosna TABELA 6. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de liga-ção de antígeno que específica ou preferencialmente compreende o polipep-tídeo de VL liga a IGF-1R.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipep-tídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistin-do em uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VL) em quea regiões de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 têm seqüências de polipeptí-deo que são idênticas aos grupos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 mos-trados na TABELA 6, com exceção de uma, duas, três, quatro, cinco, ou seissubstituições de aminoácido em qualquer uma VL-CDR. Em CDRs maiores,substituições adicionais podem ser feitas na VL-CDR, contanto que a umaVL que específica ou preferencialmente compreende a VL-CDR liga a IGF-1R. Em certas modalidades as substituições de aminoácido são conservado-ras. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antí-geno que específica ou preferencialmente compreende a VL liga a IGF-1R.
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli-peptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con-sistindo em um polipeptídeo de VL pelo menos 80%, 85%, 90 %95 %ou 100%idêntica a uma seqüência de polipeptídeo de VL de referência selecionadado grupo que consiste em SEQ ID NOs: 68, 73, 78, 83, 88, 93, 98, 103, 108,113, e 118. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno que específica ou preferencialmente compreende o polipeptídeo- de VLIigaa IGF-1R.
Em outro aspecto, a presente invenção inclui um polipeptídeoisolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um polipeptídeo de VL selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs:68, 73, 78, 83, 88, 93, 98, 103, 108, 113, e 118. Em certas modalidades, umanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que específica ou preferenci-almente compreende o polipeptídeo de VL liga a IGF-1R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, umou mais dos polipeptídeos de VL descrito acima específica ou preferencial-mente liga ao mesmo epítopo de IGF-R1 como um fragmento de anticorpode Fab monoclonal de referência selecionado do grupo que consiste emM13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anti-corpo monoclonal de referência produzido por um hibridoma selecionado dogrupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11,P1E2.3B12, e P1G10.2B8, ou competitivamente inibirá um tal anticorpo mo-noclonal ou fragmento de ligar a IGF-1R.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em um ou mais dos polipeptídeos de VL descritos acima especí-fica ou preferencialmente liga a um polipeptídeo de IGF-1 R ou fragmento domesmo, ou uma variante de polipeptídeo de IGF-1 R, com uma afinidade ca-racterizada por uma constante de dissociação (Kd) não maior que 5 χ 10"2 Μ,10"2 Μ, 5 χ 10'3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10'4 Μ, 10'4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ TO"6 Μ,10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, ΙΟ-7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ,10"10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ 10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em outras modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo compreende, consiste essencialmente em ou consis-te em um polipeptídeo de VH, e um polipeptídeo de VL onde o polipeptídeode VH e o polipeptídeo de VL, respectivamente é pelo menos 80%, 85%, 90%95 %ou 100 %idêntico às seqüências de aminoácido de polipeptídeo deVL e VL de referência selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs:4 e 68, 8 e 73, 14 e 78, 20 e 83, 26 e 88, 32 e 93, 38 e 98, 43 e 103, 48 e108, 53 e 103, 58 e 113, e 63 e 118. Em certas modalidades, um anticorpoou fragmento de ligação de antígeno que compreende estes polipeptídeosde VH e VL específica ou preferencialmente liga a IGF-1R.
Quaisquer dos polipeptídeos descritos acima podem tambémincluir polipeptídeos adicionais, por exemplo, um peptídeo sinal para direcio-nar secreção do polipeptídeo codificado, regiões constantes de anticorpocomo descritas aqui, ou outros polipeptídeos heterólogos como descritosaqui. Adicionalmente, os polipeptídeos da invenção incluem fragmentos depolipeptídeo como descrito em outro lugar. Adicionalmente polipeptídeos dainvenção incluem polipeptídeo de fusão, fragmentos de Fab, e outros deriva-dos, como descritos aqui.
Também, como descrito em outro lugar em mais detalhe aqui, apresente invenção inclui composições compreendendo os polipeptídeosdescritos acima.
Também será entendido por alguém de habilidade usual na téc-nica que polipeptídeos de anticorpo de IGF-1R como revelados aqui podemser modificados de modo que eles variem em seqüência de aminoácido dopolipeptídeo de ligação de ocorrência natural da que eles foram derivados.Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeo ou aminoácido derivada deuma proteína designada pode ser similar, por exemplo, ter um certo percen-tual de identidade à seqüência de partida, por exemplo, pode ser 60%, 70%,75%, 80%, 85%, 90%, ou 95 %idêntica à seqüência de partida.
Além disso, substituições, deleções, ou inserções de nucleotídeoou aminoácido que levam a substituições ou alterações conservadoras nasregiões de aminoácido "não-essenciais" podem ser feitas. Por exemplo, umaseqüência de polipeptídeo ou aminoácido derivada de uma proteína desig-nada pode ser idêntica à seqüência de partida com exceção de uma ousubstituições, inserções, ou deleções de aminoácido individuais, por exem-plo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, quinze, vinteou mais substituições, inserções, ou deleções de aminoácido individuais.Uma seqüência de polipeptídeo ou aminoácido derivada de uma proteínadesignada pode ser idêntica à seqüência de partida com exceção de um oumais substituições, inserções, ou deleções de aminoácido individuais, porexemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, quinze,vinte ou mais substituições, inserções, ou deleções de aminoácido individu-ais. Em outras modalidades, uma seqüência de polipeptídeo ou aminoácidoderivada de uma proteína designada pode ser idêntica à seqüência de parti-da com exceção de duas ou menos, três ou menos, quatro ou menos, cincoou menos, seis ou menos, sete ou menos, oito ou menos, nove ou menos,dez ou menos, quinze ou menos, ou vinte ou menos substituições, inser-ções, ou deleções de aminoácido individuais. Em certas modalidades, umaseqüência de polipeptídeo ou aminoácido derivada de uma proteína desig-nada tem uma a cinco, uma a dez, uma a quinze, ou uma a vinte substitui-ções, inserções, ou deleções de aminoácido individuais com relação à se-qüência de partida.
Certos polipeptídeos de anticorpo de IGF-1R da presente inven-ção compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em umaseqüência de aminoácido derivada de uma seqüência de aminoácido huma-na. Porém, certos polipeptídeos de anticorpo de IGF-1R compreendem umou mais aminoácidos contíguos derivados de outras espécies mamíferas.Por exemplo, um anticorpo de IGF-1R da presente invenção pode incluiruma porção de cadeia pesada primata, porção de dobradiça, ou região deligação de antígeno. Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos derivadosmurinos podem estar presentes em um polipeptídeo de anticorpo não-murino, por exemplo, em um sítio de ligação de antígeno de um anticorpo deIGF-1R. Em outro exemplo, o sítio de ligação de antígeno de um anticorpode IGF-1R é completamente murino. Em certas aplicações terapêuticas, an-ticorpos específicos para IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno,variantes, ou análogos dos mesmos são projetados para não serem imuno-gênicos no animal ao qual o anticorpo é administrado.
Em certas modalidades, um polipeptídeo de anticorpo de IGF-1compreende uma seqüência de aminoácido ou uma ou mais metades nor-malmente não associadas a um anticorpo. Modificações exemplares sãodescritas em mais detalhe abaixo. Por exemplo, um fragmento de anticorpofv de cadeia simiples da invenção pode compreender uma seqüência de Ii-gador flexível, ou pode ser modificado para adicionar uma metade funcional(por exemplo, PEG, um fármaco, uma toxina, ou uma marcação).
Um polipeptídeo de anticorpo de IGF-1 da invenção pode com-preender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma proteína de fu-são. Proteínas de fusão são moléculas quiméricas que compreendem, porexemplo, um domínio de ligação de antígeno da imunoglobulina com pelomenos um sítio de ligação alvo, e pelo menos uma porção heteróloga, isto é,uma porção com a qual não está ligado naturalmente na natureza. As se-qüências de aminoácido podem normalmente existir em proteínas separadasque são reunidas no polipeptídeo de fusão ou elas podem normalmente exis-tir na mesma proteína mas são colocadas em um arranjo novo no polipeptí-deo de fusão. Proteínas de fusão podem ser criadas, por exemplo, atravésde síntese química, ou criando e transladando um polinucleotídeo em que asregiões de peptídeo são codificadas na relação desejada.
O termo "heterólogo" como aplicado a um polinucleotídeo ou umpolipeptídeo, significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo é derivado deuma entidade distinta daquela do resto da entidade à qual está sendo com-parado. Por exemplo, como aqui usado, um "polipeptídeo heterólogo" a serfundido a um anticorpo de IGF-1R, ou um fragmento de ligação de antígeno,variante, ou análogo do mesmo é derivado de um polipeptídeo de não-imunoglobulina da mesma espécie, ou um polipeptídeo de imunoglobulina oude não-imunoglobulina de uma espécie diferente.
Uma "substituição de aminoácido conservadora" é uma em queo resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendouma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadei-as laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias lateraisbásicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas(por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polaresdescarregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina,tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina,leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias late-rais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeiaslaterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).Desse modo, um resíduo de aminoácido não-essencial em um polipeptídeode imunoglobulina é preferivelmente substituído com outro resíduo de ami-noácido da mesma família de cadeia lateral. Em outra modalidade, uma ca-deia de aminoácidos pode ser substituída com uma cadeia estruturalmentesimilar que difere em ordem e/ou composição dos membros da família decadeia lateral.
Alternativamente, em outra modalidade, mutações podem serfortuitamente introduzidas ao longo de toda ou parte da seqüência de codifi-cação de imunoglobulina, tal como através de mutagênese de saturação, eos mutantes resultantes podem ser incorporados nos anticorpos de IGF-1Rpara o uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento revelados aqui etriados para sua habilidade para ligar ao antígeno desejado, por exemplo,IGF-1R.
VI. PROTEÍNAS DE FUSÃO E CONJUGADOS DE ANTICORPO
Como debatido em outro lugar em mais detalhe aqui, anticorposde IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivadosdos mesmos da invenção podem também ser recombinantemente fundidoscom um polipeptídeo heterólogo no término N ou C ou quimicamente conju-gados (incluindo conjugações covalentes e não-covalentes) para os polipep-tídeos ou outras composições. Por exemplo, anticorpos de IGF-1R específi-cos para IGF-1R podem ser recombinantemente fundidos ou conjugadoscom moléculas úteis como marcações nos ensaios de detecção e moléculasefetoras tais como polipeptídeos heterólogos, fármacos, radionuclídeos, outoxinas. Vide, por exemplo, Publicações de PCT WO 92/08495; WO91/14438; WO 89/12624; patente U. S. No. 5.314.995; e EP 396.387.
Anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno,variantes, ou derivados dos mesmos da invenção incluem derivados que sãomodificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula parao anticorpo de modo cuja ligação covalente não impede o anticorpo de ligarIGF-1R. Por exemplo, mas não por via de limitação, os derivados de anticor-po incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, através de glico-silação, acetilação, pegilação, fosfilação, fosforilação, amidação, derivatiza-ção através de grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolíti-ca, ligação a um Iigante celular ou outra proteína, etc. Quaisquer de numero-sas modificações químicas podem ser realizadas através de técnicas conhe-cidas, incluindo, mas não limitadas à clivagem química específica, acetila-ção, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, oderivado pode conter um ou mais aminoácidos não-clássicos.
Anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno,variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser compostos deaminoácidos unidos uns aos outros por ligações de peptídeo ou ligações depeptídeo modificadas, isto é, isósteres de peptídeo, e podem conter aminoá-cidos diferente dos 20 aminoácidos codificados pelo gene. Anticorpos espe-cíficos para IGF-1R podem ser modificados por processos naturais, tais co-mo processamento pós-translacional, ou por técnicas de modificação quími-ca que são bem conhecidas na técnica. Tais modificações são bem descritasem textos básicos e em monografias mais detalhadas, como também emuma literatura de pesquisa volumosa. Modificações podem ocorrer em qual-quer lugar no anticorpo específico para IGF-1 R, incluindo a cadeia principaldo peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e os términos amino ou car-boxil, ou em metades tais como carboidratos. Será apreciado que o mesmotipo de modificação pode estar presente nos mesmos graus ou variados emvários sítios em um anticorpo específico para IGF-1 R dado. Também, umanticorpo específico para IGF-1 R dado pode conter muitos tipos de modifi-cações. Anticorpos específicos para IGF-1 R podem ser ramificados, por e-xemplo, como resultado de ubiquitinação, e eles podem ser cíclicos, com ousem ramificação. Anticorpos específicos para IGF-1 R cíclicos, ramificados, ecíclicos ramificados podem ser o resultado dos processos de pós-translaçãonatural ou podem ser feitos através de métodos sintéticos. Modificações in-cluem acetilação, acilação, PAD-ribosilação, amidação, ligação covalente deflavina, ligação covalente de uma metade de heme, ligação covalente de umnucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ouderivado de lipídio, ligação covalente de fosfotidiIinositol, reticulação, cicliza-ção, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de reticula-ções covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formila-ção, gama-carboxilação, glicosilação, formação de atracagem de GPI, hidro-xilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, pegilação, processa-mento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfa-tação, adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência para prote-ínas tais como arginilação, e ubiquitinação. (Vide, por exemplo, Proteins -Structure And Molecular Properties, Τ. E. Creighton, W. H. Freeman andCompany, Nova Iorque 2a Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modifica-tion Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, págs. 1-12 (1983); Seifter et ai, Meth Enzymol 702:626-646 (1990); Rattan et al.,Ann NYAcad Sci 663:48-62 (1992)).
A presente invenção também fornece proteínas de fusão com-preendendo um anticorpo de IGF-1R, ou fragmento de ligação de antígeno,variante, ou derivado do mesmo, e um polipeptídeo heterólogo. O polipeptí-deo heterólogo ao qual o anticorpo é fundido pode ser útil para função ou éútil para alvejar as células de expressão de polipeptídeo de IGF-1R. Em umamodalidade, uma proteína de fusão da invenção compreende, consiste es-sencialmente em, ou consiste em, um polipeptídeo tendo a seqüência deaminoácido de qualquer uma ou mais das regiões de VH de um anticorpo dainvenção ou a seqüência de aminoácido de qualquer uma ou mais das regi-ões de VL de um anticorpo da invenção ou fragmentos ou variantes domesmo, e uma seqüência de polipeptídeo heteróloga. Em outra modalidade,uma proteína de fusão para uso nos métodos de diagnóstico e tratamentorevelados aqui compreende, consiste essencialmente em, ou consiste emum polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido de qualquer uma, duas,três do VH-CDRs de um anticorpo específico para IGF-1R, ou fragmentos,variantes, ou derivados do mesmo, ou a seqüência de aminoácido de qual-quer uma, duas, três do VL-CDRs de um anticorpo específico para IGF-1R,ou fragmentos, variantes, ou derivados do mesmo, e uma seqüência de poli-peptídeo heteróloga. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreendeum polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido de uma VH-CDR3 de umanticorpo específico para IGF-1R da presente invenção, ou fragmento, deri-vado, ou variante do mesmo, e uma seqüência de polipeptídeo heteróloga,cuja proteína de fusão especificamente liga pelo menos um epítopo de IGF-1R. Em outra modalidade, uma proteína de fusão compreende um polipeptí-deo tendo a seqüência de aminoácido de pelo menos uma região de VH deum anticorpo específico para IGF-1R da invenção e a seqüência de aminoá-cido de pelo menos uma região de VL de um anticorpo específico para IGF-1R da invenção ou fragmentos, derivados ou variantes do mesmo, e umaseqüência de polipeptídeo heteróloga. Preferivelmente, as regiões de VH eVL da proteína de fusão correspondem a um anticorpo de fonte simples (oufragmento de scFv ou de Fab) que especificamente liga pelo menos um epí-topo de IGF-1R. Em ainda outra modalidade, uma proteína de fusão parauso nos métodos de diagnóstico e tratamento revelados aqui compreendeum polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido de qualquer uma, duas,três ou mais das VH CDRs de um anticorpo específico para IGF-1R e a se-qüência de aminoácido de qualquer uma, duas, três ou mais das VL CDRsde um anticorpo específico para IGF-1 R, ou fragmentos ou variantes domesmo, e uma seqüência de polipeptídeo heteróloga. Preferivelmente, dias,três, quatro, cinco, seis, ou mais da(s) VH-CDR(s) ou VL-CDR(s) correspon-dem a anticorpo de fonte simples (ou fragmento de scFv ou de Fab) da in-venção. Moléculas de ácido nucléico que codificam estas proteínas de fusãosão também abrangidas pela invenção.
Proteínas de fusão exemplares relatadas na literatura incluemfusões do receptor de célula T (Gascoigne et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et ai, Nature 337:525-531 (1989); Trau-necker et ai., Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl et ai., DNA Cell Biol. USA9:347-353 (1990); e Byrn et ai, Nature 344:667-670 (1990)); L-selectin (hom-ing receptor) (Watson et ai, J. Cell. Biol. 7 70:2221-2229 (1990); e Watson etal, Nature 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et ai, Cell 61:1303-1313(1990)); CD28 e B7 (Linsley et ai, J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et ai, J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et ai,Cell 66. 1133-1144 (1991)); receptor de TNF (Ashkenazi et ai, Proc. NatiAcad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et ai, Eur. J. Immunol.27:2883-2886 (1991); e Peppel et ai, J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)); ereceptor a de IgE (Ridgway e Gorman, J. Celi Bioi Voi 115, Abstract No.1448 (1991)).
Como debatido em outro lugar aqui, anticorpos de IGF-1R, oufragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos dainvenção podem ser fundidos em polipeptídeos heterólogos para aumentar ameia-vida in vivo dos polipeptídeos ou para uso em imunoensaios usandométodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, PEGpode ser conjugado aos anticorpos de IGF-1R da invenção para aumentarsua meia-vida in vivo. Leong1 S.R., et al., Citocina 16:106 (2001); Adv. InDrug Deliv: Rev. 54:531 (2002); ou Ridgway et al., Biochem. Soe. Transacti-ons 30:512 (2002).
Além disso, os anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligaçãode antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem serfundidos em seqüências de marcador, tais como um peptídeo para facilitarsua purificação ou detecção. Em modalidades preferidas, a seqüência deaminoácido de marcador é um peptídeo de hexa-histidina, tal como o mar-cador fornecido em um vetor de pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue,Chatsworth, Calif., 91311), entre outros muitos dos quais estão comercial-mente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., Proc. Nati Acad. Sei.USA 86:821-824 (1989), por exemplo, hexa-histidina fornece purificaçãoconveniente da proteína de fusão. Outros marcadores de peptídeo úteis parapurificação incluem, mas não são limitados a, o marcador "HA" que corres-ponde a um epítopo derivado da proteína de hemaglutinina de influenza(Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) e o marcador "flag".
Proteínas de fusão podem ser preparadas usando métodos quesão bem conhecidos na técnica (vide por exemplo patentes US Nos.5.116.964 e 5.225.538). O sítio preciso no qual a fusão é feita pode ser sele-cionado para otimizar empiricamente as características de secreção ou liga-ção da proteína de fusão. DNA que codifica a proteína de fusão é depoistransfeccionado para uma célula hospedeira para expressão.
Os anticorpos de IGF-1R da presente invenção podem ser usa-dos em forma não-conjugada ou conjugada para pelo menos uma de umavariedade de moléculas, por exemplo, para melhorar as propriedades tera-pêuticas da molécula, para facilitar detecção alvo, ou para imageamento outerapia do paciente. Anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de an-tígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser marca-dos ou conjugados antes ou após purificação, quando purificação for executada.
Em particular, anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligaçãode antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem serconjugados com agentes terapêuticos, pró-medicamentos, peptídeos, prote-ínas, enzimas, vírus, lipídios, modificadores de resposta biológicas, agentesfarmacêuticos, Ou PEG.
Aqueles versados na técnica apreciarão que conjugados podemtambém ser montados usando uma variedade de técnicas dependendo doagente selecionado a ser conjugado. Por exemplo, conjugados com biotinasão preparados por exemplo reagindo um polipeptídeo de ligação com uméster ativado de biotina tal como o éster de N-hidroxissuccinimida de biotina.Similarmente, conjugados com um marcador fluorescente podem ser prepa-rados na presença de um agente de acoplamento, por exemplo aqueles Iis-tados aqui, ou por reação com um isotiocianato, preferivelmente fluoresceí-na-isotiocianato. Conjugados dos anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos deligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção sãopreparados de uma maneira análoga.
A presente invenção também abrange anticorpos de IGF-1R, oufragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos dainvenção conjugados com um agente diagnóstico ou terapêutico. Os anticor-pos de IGF-1R podem ser usados diagnosticamente para, por exemplo, mo-riitorar o desenvolvimento ou progressão de uma doença neurológica comoparte de um procedimento de testagem clínica para, por exemplo, determinara eficácia de um tratamento e/ou regime de prevenção dado. Detecção podeser facilitada acoplando o anticorpo de IGF-1R, ou fragmento de ligação deantígeno, variante, ou derivado do mesmo a uma substância detectável. E-xemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéti-cos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais biolumines-centes, materiais radioativos, metais emissores de pósitron usando váriastomografias de emissão de pósitron, e íons metálicos paramagnéticos não-radioativos. Vide, por exemplo, Pat. U. S. No. 4.741.900 para íons metálicosque podem ser conjugados com anticorpos para o uso como diagnósticos deacordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas adequadas incluemperoxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolines-terase; exemplos de complexos de grupos proféticos adequados incluemestreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentesadequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína,rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansil ou ficoeritri-na; um exemplo de um material Iuminescente inclui luminol; exemplos demateriais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e e-xemplos de material radioativo adequado incluem 1251,131I1111In ou 99Tc.
Um anticorpo de IGF-1R, ou fragmento de ligação de antígeno,variante, ou derivado do mesmo pode também ser detectavelmente marcadoacoplando-o a um composto quimioluminescente. A presença do anticorpode IGF-1R quimioluminescente marcado é depois determinada detectando apresença de luminescência que surge durante o curso de uma reação quími-ca. Exemplos de compostos de marcação quimioluminescentes particular-mente úteis são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol,sal de acridínio e éster de oxalato.
Um dos modos em que um anticorpo de IGF-1R, ou fragmentode ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser detecta-velmente marcado é ligando o mesmo a uma enzima e usando o produtoligado em um imunoensaio de enzima (EIA) (Voller, A., "The Enzyme LinkedImmunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publi-" cation, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978)); Voller et ai, J.Clin. Pathol. 37:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523(1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme lmunoensaio, CRC Press, Boca Raton,Fla., (1980); Ishikawa, E. et ai, (eds.), Enzyme lmunoensaio, Kgaku Shoin,Tokyo (1981). A enzima que é ligada ao anticorpo de IGF-1R reagirá comum substrato apropriado, preferivelmente um substrato cromogênico, emuma tal maneira para produzir uma metade química que pode ser detectada,por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou visuais. En-zimas que podem ser usadas para a marcação detectável do anticorpo in-cluem, mas não são limitadas a, malato desidrogenase, nuclease estafilocó-cica, delta-5-esteróide isomerase, álcool desidrogenase de levedura, alfa-glicerofosfato, desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidase,ribonuclease, uréase, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glucoamila-se e acetilcolinesterase. Adicionalmente, a detecção pode ser realizada pormétodos colorimétricos que empregam um substrato cromogênico para aenzima. Detecção pode também ser realizada por comparação visual da ex-tensão da reação enzimática de um substrato comparado com padrões simi-Iarmente preparados.
Detecção pode também ser realizada usando qualquer de umavariedade de outros imunoensaios. Por exemplo, radioativamente marcandoo anticorpo de IGF-1R, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ouderivado do mesmo, é possível detectar o anticorpo através do uso de umradioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Ra-dioimmunoassays, Seventh Training Course on RadioHgand Assay Techni-ques, The Endocrine Society, (março, 1986)) que é incorporado aqui por re-ferência). O isótopo radioativo pode ser detectado através de meios incluin-do, mas não limitados a, contador gama, contador de cintilação, ou auto-radiografia.
Um anticorpo de IGF-1R, ou fragmento de ligação de antígeno,variante, ou derivado do mesmo pode também ser detectavelmente marcadousando metais emissores de fluorescência tais como 152Eu, ou outros da sé-rie de lantanídeo. Estes metais podem ser ligados ao anticorpo usando taisgrupos quelantes de metal como ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA)ou ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA).
Técnicas para conjugar várias metades para um anticorpo deIGF-1R, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado domesmo são bem conhecidas, vide, por exemplo, Arnon et al., "MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclo-nal Antibodies And CancerTherapy, Reisfeld etal. (eds.), págs. 243-56 (AlanR. Liss, Inc. (1985); Hellstrom etal., "Antibodies For Drug Delivery", em Con-trolled Drug Delivery {2- Ed.), Robinson et al. (eds.), Mareei Dekker, Inc.,págs. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cân-cer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clini-cai Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Re-sults, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Anti-body In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer DetectionAnd Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press págs. 303-16 (1985), eThorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates", lmmunol. Rev. 62:119-58 (1982).
Em particular, moléculas de ligação, por exemplo, polipeptídeosde ligação, por exemplo, anticorpos específicos para IGF-1R ou fragmentosimunoespecíficos dos mesmos para o uso nos métodos de diagnóstico etratamento revelados aqui podem ser conjugados com citotoxinas (tais comoradioisótopos, fármacos citotóxicos, ou toxinas) agentes terapêuticos, agen-tes citoestáticos, toxinas biológicas, pró-medicamentos, peptídeos, proteí-nas, enzimas, vírus, lipídios, modificadores de resposta biológica, agentesfarmacêuticos, Iigantes imunologicamente ativos (por exemplo, Iinfocinas ououtros anticorpos em que a molécula resultante liga à célula neoplástica euma célula efetora tal como uma célula T), ou PEG. Em outra modalidade,uma molécula de ligação, por exemplo, um polipeptídeo de ligação, por e-xemplo, um anticorpo específico para IGF-1R ou fragmento imunoespecíficodo mesmo para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento revelados aquipode ser conjugado com uma molécula que diminui a vascularização dostumores. Em outras modalidades, as composições reveladas podem com-preender moléculas de ligação, por exemplo, polipeptídeos de ligação, porexemplo, anticorpos específicos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecífi-cos dos mesmos acoplados a fármacos ou pró-medicamentos. Ainda outrasmodalidades da presente invenção compreendem o uso de moléculas deligação, por exemplo, polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos es-pecíficos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos conju-gados com biotoxinas específicas ou seus fragmentos citotóxicos tais comoricina, gelonina, exotoxina de pseudomonas ou toxina de difteria. A seleçãodestas moléculas conjugadas ou não-conjugadas para o uso dependerá dotipo e estágio do câncer, uso do tratamento adjunto (por exemplo, quimiote-rapia ou radiação externa) e condição do paciente. Será apreciado que al-guém versado na técnica poderia facilmente fazer uma tal seleção em vistados ensinamentos aqui.
Será apreciado que, em estudos anteriores, os anticorpos anti-tumor marcados com isótopos foram usados de forma bem sucedida paradestruir as células em tumores sólidos como também linfomas/leucemias emmodelos animais, e em alguns casos em seres humanos. Radioisótopos e-xemplares incluem: 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho,177Lu, 186Re e 188Re. Os radionuclídeos atuam produzindo radiação ionizanteque causa múltiplos rompimentos de filamento no DNA nuclear, levando àmorte da célula. Os isótopos usados para produzir conjugados terapêuticostipicamente produzem partículas de energia alta α ou β que têm um compri-mento de trajetória curto. Tais radionuclídeos matam as células que estãoem proximidade íntima, por exemplo células neoplásticas às quais o conju-gado ligou-se ou entrou. Eles têm pequeno ou nenhum efeito sobre as célu-las não-localizadas. Radionuclídeos são essencialmente não-imunogênicos.
Com respeito ao uso de conjugados radiomarcados juntamentecom a presente invenção, as moléculas de ligação, por exemplo, os polipep-tídeos de ligação, por exemplo, os anticorpos específicos para IGF-1R oufragmentos imunoespecíficos dos mesmos, podem ser diretamente marca-dos (tais como através de iodação) ou podem ser indiretamente marcadosatravés do uso de um agente quelante. Como aqui usado, as frases "marca-ção indireta" e "método de marcação indireta" ambos significam que um a-gente quelante é covalentemente ligado a uma molécula de ligação e pelomenos um radionuclídeo é associado ao agente quelante. Tais agentes que-Iantes são tipicamente referidos como agentes quelantes bifuncionais comoeles ligam o polipeptídeo e o radioisótopo. Agentes quelantes particularmen-te preferidos compreendem ácido 1-isotiocicmatobenzil-3-metildioteleno tri-aminopentaacético ("MX-DTPA") e de derivados ácido cicloexil dietilenotria-mino pentaacético ("CHX-DTPA"). Outros agentes quelantes compreendemderivados de P-DOTA e EDTA. Radionuclídeos particularmente preferidospara marcação indireta incluem 111In e 90Y.
Como aqui usado, as frases "marcação direta" e "método demarcação direta" ambas significam que um radionuclídeo é covalentementeligado diretamente a um polipeptídeo (tipicamente por meio de um resíduode aminoácido). Mais especificamente, estas tecnologias de ligação incluemmarcação aleatória e marcação sítio-direcionada. No caso posterior, a mar-cação é direcionada em sítios específicos no polipeptídeo, tais como os re-síduos de açúcar N-Iigados presentes apenas na porção de Fc dos conjuga-dos. Também, várias técnicas e protocolos de marcação direta são compatí-veis com a invenção imediata. Por exemplo, polipeptídeos marcados comtecnétio-99 podem ser preparados através de processos de permuta de Ii-gante, reduzindo o pertecnato (TCO4 ) com solução de íon estanhoso, que-Iando o tecnétio reduzido sobre uma coluna de Sephadex e aplicando ospolipeptídeos de ligação a esta coluna, ou através de técnicas de marcaçãoem bateladas, por exemplo incubando pertecnato, um agente redutor tal co-mo SnCfe, uma solução de tampão tal como uma solução de sódio-ftalato depotássio, e os anticorpos. Em todo caso, os radionuclídeos preferidos paradiretamente marcar os anticorpos são bem conhecidos na técnica e um ra-dionuclídeo particularmente preferido para marcação direta é 131I covalente-mente ligada por meio de resíduos de tirosina. Moléculas de ligação, por e-xemplo, polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos específicos paraIGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos para o uso nos méto-dos de diagnóstico e tratamento revelados aqui podem ser derivados, porexemplo, com iodeto de sódio ou potássio radioativo e um agente oxidantequímico, tal como hipocloreto de sódio, cloramina T ou outros, ou um agenteoxidante enzimático, tal como lactoperoxidase, glicose e glicose oxidase.
Patentes relativas a quelantes e conjugados de quelantes sãoconhecidas na técnica. Por exemplo, patente U. S. No. 4.831.175 de Gan-sow são direcionada para quelatos de ácido dietilenotriaminopentaacéticopolissubstituído e conjugados de proteína contendo os mesmos, e métodospara sua preparação. Patentes U. S. Nos. 5.099.069, 5.246.692, 5.286.850,5.434.287 e 5.124.471 de Gansow também referem-se a quelatos polissubs-tituídos de DTPA. Estas patentes são incorporadas aqui por referência emsuas totalidades. Outros exemplos de quelantes de metal compatíveis sãoácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentaacético(DPTA), 1,4,8,11-tetraazatetradecano, ácido 1,4,8,11-tetraazatetradecano-1,4,8,11 -tetraacético, ácido 1 -oxa-4,7,12,15-tetraazaeptadecano-4,7,12,15-tetraacético, ou outros. CicIoexiI-DTPA ou CHX-DTPA são particularmentepreferidos e são extensivamente exemplificados abaixo. Ainda outros que-lantes compatíveis, incluindo aqueles ainda a serem descobertos, podem serfacilmente discernidos por um artesão versado e estão claramente dentro doescopo da presente invenção.
Quelantes compatíveis, incluindo o quelante bifuncional específi-co usado para facilitar quelação, Pats. U. S. Nos. 6.682.134, 6.399.061, e5.843.439, incorporadas aqui por referência em suas totalidades, são prefe-rivelmente selecionados para prover afinidade alta para metais trivalentes,exibir razões de tumor-para-não-tumor aumentadas e absorção de osso di-minuída como também maior retenção in vivo de radionuclídeo nos sítiosalvos, isto é, sítios de tumor de Iinfoma de células B. Porém, outros quelan-tes bifuncionais que podem ou não possuir todas estas características sãoconhecidos na técnica e podem também ser benéficos na terapia do tumor.
Será também apreciado que, de acordo com os ensinamentosaqui, moléculas de ligação podem ser conjugadas com radiomarcações dife-rentes para propósitos de diagnóstico e terapêutico. Para este fim, as paten-* tes U. S. Nos. 6.682.134, 6.399.061, e 5.843.439 acima mencionadas reve-lam conjugados terapêuticos radiomarcados para "imageamento" diagnósti-co de tumores antes da administração do anticorpo terapêutico. Conjugadode "ln2B8" compreende um anticorpo monoclonal murino, 2B8, específicopara o antígeno de CD20 humano que é ligado a 111In por meio de um que-Lante bifuncional, isto é, MX-DTPA (ácido dietilenotriaminopentaacético) quecompreende uma mistura 1:1 de 1-isotiocianatobenzil-3-metil-DTPA e 1-metil-3-isotiocianatobenzil-DTPA. 111In é particularmente preferido como umradionuclídeo de diagnóstico porque entre cerca de 1 a cerca de 10 mCi po-dem ser administrados seguramente sem toxicidade detectável; e os dadosde imageamento são em geral prognosticativos da distribuição do anticorpomarcado com 90Y subseqüente. A maioria estudos de imageamento utilizammCi de anticorpo marcado com 111In, porque esta dose é tanto segura co-15 mo eficiência aumentada de imageamento comparada com doses mais bai-xas, com ótimo imageamento ocorrendo a três a seis dias após administra-ção do anticorpo. Vide, por exemplo, Murray, J. Nuc. Med. 26: 3328 (1985) eCarraguillo et al., J. Nuc. Med. 26: 67 (1985).
Como indicado acima, uma variedade de radionuclídeos é apli-cável à presente invenção e aqueles versados podem determinar facilmenteque radionuclídeo é muito apropriado sob várias circunstâncias. Por exem-plo, 131I é um radionuclídeo bem conhecido usado para imunoterapia alveja-da. Porém, a utilidade clínica de 131I pode ser limitada por vários fatores in-cluindo: meia-vida física de oito dias; desalogenação do anticorpo iodado nosangue e nos sítios do tumor; e características de emissão (por exemplo,componente gama grande) que podem ser subótimas para deposição dedose localizada no tumor. Com o advento de agentes quelantes superiores,a oportunidade para ligar grupos quelantes de metal às proteínas aumentouas oportunidades para utilizar outros radionuclídeos tais como 111In e 90Y. 90Yprovê vários benefícios para utilização nas aplicações radioimunoterapêuti-cas: a meia-vida de 64 horas de 90Y é bastante longa para permitir acumula-ção de anticorpo através do tumor e, diferente por exemplo, de 131I, 90Y é umemissor beta puro de energia alta sem irradiação gama acompanhante nasua decadência, com uma faixa em tecido de diâmetros de 100 a 1.000 célu-las. Além disso, a quantidade mínima de radiação penetrante permite admi-nistração de paciente externo dos anticorpos marcados com 90Y. Adicional-mente, a internalização dos anticorpos marcados não é requerida para mataras células, e a emissão local da radiação ionizante deveria ser letal para ascélulas tumorais adjacentes sem a molécula alva.
Agentes preferidos adicionais para conjugação com moléculasde ligação, por exemplo, polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorposespecíficos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos sãofármacos citotóxicos, particularmente aqueles que são usados para terapiade câncer. Como aqui usado, "uma citotoxina ou agente citotóxico" significaqualquer agente que é prejudicial ao crescimento e à proliferação das célu-las e pode agir para reduzir, inibir ou destruir uma célula ou malignidade.Citotoxinas exemplares incluem, mas não são limitadas a, radionuclídeos,biotoxinas, toxinas enzimaticamente ativas, agentes terapêuticos citoestáti-cos ou citotóxicos, pró-medicamentos, Iigantes imunologicamente ativos emodificadores de resposta biológica tais como citocinas. Qualquer citotoxinaque atue para retardar ou reduzir o crescimento de células imunorreativas oucélulas malignas está dentro do escopo da presente invenção.
Citotoxinas exemplares incluem, em geral, agentes citoestáticos,agentes de alquilação, anti-metabólitos, agentes anti-proliferativos, agentesde ligação de tubulina, hormônios e antagonistas hormonais, e outros. Cito-estáticos exemplares que são compatíveis com a presente invenção incluemsubstâncias de alquilação, tais como mecloretamina, trietilenofosforamida,ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucil, bussulfano, melfalano ou triaziquona,também compostos de nitrosouréia, tais como carmustina, lomustina, ousemustina. Outras classes preferidas de agentes citotóxicos incluem, porexemplo, a família de fármacos maitansinóides. Outras classes preferidas deagentes citotóxicos incluem, por exemplo, a família fármacos antraciclina, osfármacos de vinca, as mitomicinas, as bleomicinas, os nucleosídeos citotóxi-cos, a família de fármacos pteridina, diinenos, e o podofilotoxinas. Particu-larmente os membros úteis daquelas classes incluem, por exemplo, adriami-cina, carminomicina, daunorrubicina (daunomicina), doxorrubicina, aminopte-rina, metotrexato, metopterina, mitramicina, estreptonigrina, diclorometotre-xato, mitomicina C, actinomicina-D, porfiromicina, 5-fluorouracila, floxuridina,ftorafur, 6-mercaptopurina, citarabina, arabinosídeo de citosina, podofilotoxi-na, ou derivados de podofilotoxina tais como etoposide ou fosfato de etopo-side, melfalano, vinblastina, vincristina, leurosidina, vindesina, Ieurosina eoutros. Ainda outras citotoxinas que são compatíveis com os ensinamentosaqui incluem taxol, taxano, citocalasina B1 gramicidina D, brometo de etídio,emetina, tenoposide, colquicina, antracina de diidróxi diona, mitoxantrona,procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou ho-mólogos dos mesmos. Hormônios e antagonistas hormonais, tais como cor-ticosteróides, por exemplo prednisona, progestinas, por exemplo hidroxipro-gesterona ou medroprogesterona, estrogênios, por exemplo dietilstilbestrol,antiestrogênios, por exemplo tamoxifeno, andrógeno, por exemplo testoste-rona, e inibidores de aromatase, por exemplo aminoglutetimida são tambémcompatíveis com os ensinamentos aqui. Alguém versado na técnica podefazer modificações químicas no composto desejado para tornar as reaçõesdeste composto mais convenientes para propósitos de preparar os conjuga-dos da invenção.
Um exemplo de citotoxinas particularmente preferidas compre-ende membros ou derivados da família de enediina de antibióticos anti-tumor, incluindo caliqueamicina, esperamicinas ou dinemicinas. Estas toxi-nas são extremamente potentes e atuam clivando o DNA nuclear, levando àmorte da célula. Toxinas de proteína distintas que podem ser clivadas in vivopara dar muitos fragmentos de polipeptídeo inativos mas imunogênicos, to-xinas tais como caliqueamicina, esperamicinas e outras enediinas são molé-culas pequenas que são essencialmente não-imunogênicas. Estas toxinasde não-peptídeo são quimicamente ligadas aos dímeros ou tetrâmeros portécnicas que foram previamente usadas para a marcação dos anticorposmonoclonais e outras moléculas. Estas tecnologias de ligação incluem liga-ção sítio-específica por meio dos resíduos de açúcar N-Iigados presentesapenas na porção de Fc das construções. Tais métodos de ligação sítio-direcionada têm a vantagem de reduzir os possíveis efeitos da ligação naspropriedades da ligação das construções.
Como previamente aludido, as citotoxinas compatíveis para pre-paração de conjugados podem compreender um pró-medicamento. Comoaqui usado, o termo "pró-medicamento" refere-se a um precursor ou formade derivado de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos cito-tóxica para células tumorais comparado ao fármaco de origem e é capaz deser enzimaticamente ativado ou convertido na forma de origem mais ativa.Pró-medicamentos compatíveis com a invenção incluem, mas não são limi-tados a, pró-medicamentos contendo fosfato, pró-medicamentos contendotiofosfato, pró-medicamentos contendo sulfato, pró-medicamentos contendopeptídeo, pró-medicamentos contendo β-lactam, pró-medicamentos conten-do fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-medicamentos con-tendo fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outrospró-medicamentos de 5-fluorouridina que podem ser convertidos no fármacocitotóxico mais ativo, livre. Outros exemplos de fármacos citotóxicos que po-dem ser derivatizados em uma forma de pró-medicamento para o uso napresente invenção compreendem aqueles agentes quimioterapêuticos des-critos acima.
Entre outras citotoxinas, será apreciado que as moléculas deligação, por exemplo, polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos es-pecíficos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos revela-dos aqui podem também ser associados ou conjugados com uma biotoxinatal como subunidade de ricina A, abrina, toxina de diptheria, botulino, ciangi-nosinas, saxitoxina, shigatoxina, tétano, tetrodotoxina, tricoteceno, verruco-lógeno ou uma enzima tóxica. Preferivelmente, tais construções serão feitasusando técnicas de engenharia genética que permitem expressão direta daconstrução de anticorpo-toxina. Outros modificadores de resposta biológicaque podem ser associados às moléculas de ligação, por exemplo, polipeptí-deos de ligação, por exemplo, anticorpos específicos para IGF-1R ou frag-mentos imunoespecíficos dos mesmos revelados aqui compreendem citoci-nas tais como Iinfocinas e interferonas. Em vista da revelação imediata que é' submetida aquele versado na técnica poderia facilmente formar tais constru-ções usando técnicas convencionais.
Outra classe de citotoxinas compatíveis que podem ser usadasem associação ou conjugadas com as moléculas de ligação reveladas, porexemplo, polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos específicos paraIGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos, são fármacos radios-sensíveis que podem ser eficazmente direcionados para tumor ou célulasimunorreativas. Tais fármacos intensificam a sensibilidade à radiação ioni-zante, assim aumentando a eficácia da radioterapia. Um conjugado de anti-corpo interiorizado pela célula tumoral liberaria o radiossensibilizador maispróximo do núcleo onde a radiosensitização seria máxima. O radiossensibili-zador não-ligado ligado às moléculas de ligação da invenção seria removidorapidamente do sangue, localizando o agente de radiossensibilização restan-te no tumor alvo e fornecendo absorção mínima nos tecidos normais. Apósliberação rápida do sangue, radioterapia adjunto seria administrada em umdentre os três modos: 1.) radiação de feixe externo especificamente direcio-nada para o tumor, 2.) radioatividade implantada diretamente no tumor ou 3.)radioimunoterapia sistêmica com o mesmo anticorpo alvo. Uma variaçãopotencialmente atrativa deste método seria a ligação de um radioisótopo te-rapêutico ao imunoconjugado radiossensibilizado, assim fornecendo a con-veniência de administrar ao paciente um fármaco simples.
Em certas modalidades, uma metade que intensifica a estabili-dade ou eficácia de uma molécula de ligação, por exemplo, um polipeptídeode ligação, por exemplo, um anticorpo específico para IGF-1R ou fragmentoimunoespecífico do mesmo pode ser conjugada. Por exemplo, em uma mo-dalidade, PEG pode ser conjugado com as moléculas de ligação da inven-ção para aumentar sua meia-vida in vivo. Leong, S. R., et al., Cytokine16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); ou Weir et al., Bio-chem. Soe. Transaction 30:512 (2002).
A presente invenção também abrange o uso de moléculas deligação, por exemplo, polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos es-pecíficos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos conjugado com umagente diagnóstico ou terapêutico. As moléculas de ligação podem ser usa-das de forma diagnosticável para, por exemplo, monitorar o desenvolvimentoou progressão de um tumor como parte de um procedimento de testagemclínica para, por exemplo, determinar a eficácia de um tratamento dado e/ouregime de prevenção. Detecção pode ser facilitada acoplando a molécula deligação, por exemplo, polipeptídeo de ligação, por exemplo, anticorpo espe-cífico para IGF-1R ou fragmento imunoespecífico do mesmo para uma subs-tância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias en-zimas, grupos proféticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes,materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais de emissão de pó-sitron usando várias tomografias de emissão de pósitron, e íons de metalparamagnético não-radioativo. Vide, por exemplo, Pat. U. S. No. 4.741.900para íons de metal que podem ser conjugados com anticorpos para o usocomo diagnósticos de acordo com a presente invenção. Exemplos de enzi-mas adequadas incluem peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de gruposproféticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exem-plos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceí-na, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinila-mina, cloreto de dansil ou ficoeritrina; um exemplo de um material Iumines-cente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem Iucife-rase, luciferina, e aequorina; e exemplos de material radioativo adequadoincluem 1251,131Il111In ou 99Tc.
Uma molécula de ligação, por exemplo, um polipeptídeo de liga-ção, por exemplo, um anticorpo específico para IGF-1R ou fragmento imu-noespecífico do mesmo pode também ser detectavelmente marcado aco-plando-o a um composto quimioluminescente. A presença da molécula deligação quimioluminescente marcada é depois determinada detectando apresença de luminescência que surge durante o curso de uma reação quími-ca. Exemplos de compostos de marcação quimioluminescentes particular-mente úteis são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol,sal de acridínio e éster de oxalato.
Um dos modos em que uma molécula de ligação, por exemplo,um polipeptídeo de ligação, por exemplo, um anticorpo específico para IGF-1R ou fragmento imunoespecífico do mesmo pode ser detectavelmente mar-cada é ligar a mesma a uma enzima e usar o produto ligado em um imuno-ensaio de enzima (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent As-say (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville,Md., Diagnostic Horizons 2Λ -7 (1978)); Voller et ai, J. Clin. Pathoi 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enrymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E.(ed.), Enzyme lmmunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishika-wa, E. et ai, (eds.), Enzyme lmmunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981). Aenzima que está ligada à molécula de ligação reagirá com um substrato a-propriado, preferivelmente um substrato cromogênico, em uma tal maneira aproduzir uma metade química que pode ser detectada, por exemplo, pormeios espectrofotométricos, fluorimétricos ou visuais. Enzimas que podemser usadas a marcação detectável do anticorpo incluem, mas não são limita-das a, malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, delta-5-esteróide iso-merase, álcool desidrogenase de levedura, alfa-glicerofosfato, desidrogena-se, triose fosfato isomerase, peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, as-paraginase, glicose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, uréase, cata-lase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetilcolinesterase.
Adicionalmente, a detecção pode ser realizada por métodos colorimétricosempregando um substrato cromogênico para a enzima. Detecção pode tam-bém ser realizada por comparação visual da extensão da reação enzimáticade um substrato comparado com padrões similarmente preparados.
Detecção pode também ser realizada usando qualquer de umavariedade de outros imunoensaios. Por exemplo, por marcar radioativamentea molécula de ligação, por exemplo, polipeptídeo de ligação, por exemplo,anticorpo específico para IGF-1R ou fragmento imunoespecífico do mesmo,é possível detectar antígenos de câncer através do uso de um radioimuno-ensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmuno-assays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, TheEndocrine Society, (março, 1986)) que é incorporado aqui por referência). Oisótopo radioativo pode ser detectado através de meios incluindo, mas nãolimitado a, contador gama, contador de cintilação, ou auto-radiografia.
Uma molécula de ligação, por exemplo, um polipeptídeo de Iiga-ção, por exemplo, um anticorpo específico para IGF-1R ou fragmento imu-noespecífico do mesmo pode também ser detectavelmente marcada usandometais emissores de fluorescência tais como 152Eu, ou outros da série delantanídeos. Estes metais podem ser ligados ao anticorpo usando tais gru-pos quelantes de metal como ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) ouácido etilenodiaminotetraacético (EDTA).
Técnicas para conjugar várias metades para uma molécula deligação, por exemplo, um polipeptídeo de ligação, por exemplo, um anticorpoespecífico para IGF-1R ou fragmento imunoespecífico do mesmo, são bemconhecidas, vide, por exemplo, Arnon et ai, "Monoclonal Antibodies For Im-munotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies AndCâncer Therapy, Reisfeld et ai (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc.(1985); Hellstrom et ai, "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled DrugDelivery(2nd Ed.), Robinson et ai (eds.), Mareei Dekker, Inc., págs. 623-53(1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy: AReview", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications,Pinchera et a!, (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And FutureProspective Of The Therapeutie Use Of Radiolabeled Antibody In CâncerTherapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy,Baldwin et al. (eds.), Academic Press págs. 303-16 (1985), e Thorpe et ai,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol. Rev. 62.119-58 (1982).
VII. EXPRESSÃO DE POLIPEPTÍDEOS DE ANTICORPO
Como é bem conhecido, RNA pode ser isolado das células dehibridoma originais ou de outras células transformadas através de técnicaspadrões, tais como extração de isotiocianato de guanidínio e precipitaçãoseguidas por centrifugação ou cromatografia. Onde desejável, mRNA deRNA total podem ser isolados através de técnicas padrões tais como croma-tografia em celulose de oligo dT. Técnicas adequadas são familiarizadas natécnica.
Em uma modalidade, cDNAs que codificam as cadeias pesadase leves do anticorpo podem ser feitos, simultânea ou separadamente, usan-do transcriptase reversa e DNA polimerase de acordo com os métodos bemconhecidos. PCR pode ser iniciada através de iniciadores de região constan-te de consensos ou através de iniciadores mais específicos com base nasseqüências de DNA e aminoácido publicadas de cadeia pesada e leve. Co-mo debatido acima, PCR pode também ser usada para isolar os clones deDNA codificando as cadeias leves e pesadas do anticorpo. Neste caso queas bibliotecas podem ser tríadas por iniciadores de consenso ou sondas ho-mólogas maiores, tais como sondas de região constante de camundongo.
DNA1 tipicamente DNA de plasmídeo, pode ser isolado das célu-las usando técnicas conhecidas na técnica, restrição mapeada e seqüencia-da de acordo com as técnicas padrões bem conhecidas expostas em deta-lhes, por exemplo, nas referências anteriores com relação às técnicas deDNA recombinante. Claro que, o DNA pode ser sintético de acordo com apresente invenção em qualquer ponto durante o processo de isolamento ouanálise subseqüente.
Seguindo a manipulação do material genético isolado para for-necer anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos de ligação de antígeno, varian-tes, ou derivados dos mesmos da invenção, os polinucleotídeos que codifi-cam os anticorpos de IGF-1R são tipicamente inseridos em um vetor de ex-pressão para introdução nas células hospedeiras que podem ser usadaspara produzir a quantidade desejada de anticorpo de IGF-1R.
Expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento, deriva-do ou análogo do mesmo, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de umanticorpo que liga a uma molécula alvo descrita aqui, por exemplo, IGF-1 R,requer construção de um vetor de expressão contendo um polinucleotídeoque codifica o anticorpo. Uma vez um polinucleotídeo que codifica uma mo-lécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou por-ção da mesma (preferivelmente contendo o domínio variável de cadeia pe-sada ou leve), da invenção foi obtido, o vetor para a produção da moléculade anticorpo pode ser produzido através de tecnologia de DNA recombinanteusando técnicas bem conhecidas na técnica. Desse modo, métodos parapreparar uma proteína expressando um polinucleotídeo contendo um anti-corpo que codifica a seqüência de nucleotídeo são descritos aqui. Métodosque são bem conhecidos àqueles versados na técnica podem ser usadospara construção de vetores de expressão contendo as seqüências de codifi-cação de anticorpo e sinais de controle transcricionais e translacionais apro-priados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinan-te in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. A invenção,desse modo, fornece vetores replicáveis que compreendem uma seqüênciade nucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo da invenção, ou umacadeia pesada ou leve dos mesmos, ou um domínio variável de cadeia pe-sada ou leve, operavelmente ligado a um promotor. Tais vetores podem in-cluir a seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante da moléculade anticorpo (vide, por exemplo, Publicação de PCT WO 86/05807; Publica-ção de PCT WO 89/01036; e Pat. U. S. No. 5.122.464) e o domínio variáveldo anticorpo pode ser clonado em um tal vetor para expressão da cadeiapesada inteira ou leve.
A célula hospedeira pode ser co-transfeccionada com dois veto-res de expressão da invenção, o primeiro vetor codificando um polipeptídeoderivado da cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptídeoderivado da cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecio-náveis idênticos que permitem expressão igual dos polipeptídeos de cadeiapesada e leve. Alternativamente, um vetor simples pode ser usado que codi-fica ambos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Em tais situações, a ca-deia leve é vantajosamente colocada antes da cadeia pesada para evitar umexcesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Ko-hler, Proc. Natí. Acad. Sei. USA 77:2197 (1980)). As seqüências de codifica-ção para as cadeias pesadas e leves podem compreender cDNA ou DNAgenômico.
O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é aqui usado para signi-ficar vetores usados de acordo com a presente invenção como um veículopara introduzir e expressar um gene desejado em uma célula hospedeira.Como conhecido àqueles versados na técnica, tais vetores podem facilmen-te ser selecionados do grupo que consiste em plasmídeos, fagos, vírus eretrovírus. Em geral, vetores compatíveis com a invenção imediata compre-enderão um marcador de seleção, sítios de restrição apropriados para facili-tar a clonagem do gene desejado e a habilidade para entrar e/ou replicar emcélulas eucarióticas ou procarióticas.
Para o propósito desta invenção, numerosos sistemas de vetorde expressão podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetorutiliza elementos de DNA que são derivados de vírus animais tais como vírusde papiloma bovino, vírus de polioma, adenovírus, vírus de vacínia, baculoví-rus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus de SV40. Outros envolvemo uso de sistemas policistrônicos com sítios de ligação de ribossoma inter-nos. Adicionalmente, células que integraram o DNA em seus cromossomospodem ser selecionadas introduzindo um ou mais marcadores que permitema seleção de células hospedeiras transfeccionadas. O marcador pode proverprototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocidas (por exemplo,antibióticos) ou resistência a metais pesados tais como cobre. O gene mar-cador selecionável ou pode ser ligado diretamente às seqüências de DNA aserem expressas, ou introduzidos na mesma célula através de cotransfor-mação. Elementos adicionais podem também ser necessários para síntesede mRNA ótima. Estes elementos podem incluir seqüências de sinal, sinaisde splice, como também os promotores transcricionais, intensificadores, esinais de terminação.
Em modalidades particularmente preferidas os genes clonadosda região variável são inseridos em um vetor de expressão juntamente comos genes de cadeia pesada e leve da região constante (preferivelmente hu-manos) sintéticos como debatido acima. Em uma modalidade, isto é realiza-do usando um vetor de expressão particular de Biogen IDEC, Inc., referidocomo NEOSPLA (revelado na patente U. S. 6.159.730). Este vetor contém opromoter/intensificador de citomegalovírus, o promotor principal de globinabeta de camundongo, a origem de replicação de SV40, a seqüência de poli-adenilação de hormônio de crescimento bovina, neomicina fosfotransferasedo éxon 1 e éxon 2, o gene de diidrofolato reductase e seqüência líder. Estevetor foi observado resultar em expressão de nível muito alto dos anticorpossob incorporação de genes de regiões variável e constante, transfecção sobcélulas CHO, seguido por seleção em meio contendo G418 e amplificaçãode metotrexato. Claro que, qualquer vetor de expressão que seja capaz desuscitar expressão em células eucarióticas pode ser usado na presente in-venção. Exemplos de vetores adequados incluem, mas não são limitados a,plasmídeos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS,pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, e pZe-oSV2 (disponíveis de Invitrogen, San Diego, CA), e plasmídeo pCI (disponí-vel de Promega, Madison, Wl). Em geral, números grandes de triagem dascélulas transformadas para aquelas que expressam níveis adequadamentealtos, se as cadeias pesadas e leves da imunoglobulina forem experimenta-ção rotineira, que pode ser realizada, por exemplo, através de sistemas ro-bóticos. Sistemas de vetor são também ensinados nas Pats. U. S. Nos.5.736.137 e 5.658.570, cada uma destas é incorporada aqui por referênciaem sua totalidade. Este sistema provê níveis de expressão altos, por exem-plo, > 30 pg/célula/dia. Outros sistemas de vetor exemplares são revelados,por exemplo, na patente U. S. 6.413.777.
Em outras modalidades preferidas os anticorpos de IGF-1R, oufragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos dainvenção podem ser expressos usando construções policistrônicas tais comoaquelas reveladas na Publicação do Pedido dos Estados Unidos No. 2003-0157641 A1, depositado em 18 de novembro de 2002 e incorporado aqui emsua totalidade. Nestes novos sistemas de expressão, múltiplos produtos degene de interesse tais como cadeias pesadas e leves de anticorpos podemser produzidos de uma construção policistrônica simples. Estes sistemasvantajosamente usam um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) parafornecer níveis relativamente altos de anticorpos de IGF-1R, por exemplo,polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos específicos para IGF-1Rou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos em células hospedeiras euca-rióticas. Seqüências de IRES compatíveis são reveladas na Pat. U. S. No.6.193.980 que é também incorporada aqui. Aqueles versados na técnica a-preciarão que tais sistemas de expressão podem ser usados para eficaz-mente produzir a faixa total de anticorpos de IGF-1R revelada na aplicaçãoimediata.
Mais em geral, uma vez a seqüência de vetor ou de DNA quecodifica uma subunidade monomérica do anticorpo de IGF-1R foi preparada,o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apro-priada. Introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser realizada porvárias técnicas bem conhecidas àqueles de habilidade na técnica. Estas in-cluem, mas não são limitadas a, transfecção (incluindo eletroforese e eletro-poração), fusão de protoplasto, precipitação de fosfato de cálcio, fusão decélula com DNA envelopado, microinjeção, e infecção com vírus intacto. Vi-de, Ridgway, A. A. G."Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodriguez eDenhardt, Eds., Butterworths, Boston, Mass., Capítulo 24.2, págs. 470-472(1988). Tipicamente, introdução de plasmídeo no hospedeiro é por meio deeletroporação. As células hospedeiras que abrigam a construção de expres-são são crescidas sob condições apropriadas para a produção das cadeiasleves e cadeias pesadas, e ensaiadas para síntese protéica de cadeia pesa-da e/ou leve. Técnicas de ensaio exemplares incluem ensaio imunoabsor-vente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ou análise de sepa-rador celular ativado por fluorescência (FACS), imunoistoquímica e outros.
O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeirapor técnicas convencionais e as células transfeccionadas são depois cultiva-das através de técnicas convencionais para produzir um anticorpo para ouso nos métodos descritos aqui. Desse modo, a invenção inclui células hos-pedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da inven-ção, ou uma cadeia pesada ou leve dos mesmos, operavelmente ligado aum promotor heterólogo. Em modalidades preferidas para a expressão deanticorpos de cadeias duplas, vetores que codificam tanto cadeias pesadascomo leves podem ser co-expressados na célula hospedeira para expressãoda molécula de imunoglobulina inteira, como detalhado abaixo.
Como aqui usado, "células hospedeiras" referem-se às célulasque abrigam vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante ecodificando pelo menos um gene heterólogo. Nas descrições dos processospara isolamento de anticorpos de hospedeiros recombinantes, os termos"célula" e "cultura de célula" são usados para alternadamente denotar a fon-te de anticorpo a menos que do contrário seja claramente especificado. Emoutras palavras, restabelecimento do polipeptídeo das "células" pode signifi-car ou de células inteiras de giro, ou da cultura de células contendo o meio eas células suspensas.
Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedei-ro pode ser utilizada para expressar moléculas de anticorpo para o uso nosmétodos descritos aqui. Tais sistemas de expressão de hospedeiro repre-sentam veículos pelos quais as seqüências de codificação de interesse po-dem ser produzidas e subseqüentemente purificadas, mas também repre-sentam células que podem, quando transformadas ou transfeccionadas comas seqüências de codificação de nucleotídeo apropriadas, expressar umamolécula de anticorpo da invenção in situ. Estes incluem mas não são limi-tados a, microorganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subti-lis) transformadas com DNA recombinante de bacteriófago, vetores de ex-pressão DNA de plasmídeo ou de DNA de cosmídeo contendo seqüênciasde codificação de anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia)transformada com vetores de expressão de levedura recombinantes conten-do as seqüências de codificação de anticorpo; sistemas de célula de insetoinfetados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo,baculovírus) contendo seqüências de codificação de anticorpo; sistemas decélula de planta infetados com vetores de expressão de vírus recombinantes(por exemplo, vírus do mosaico de couve-flor, CaMV; vírus do mosaico detabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeorecombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo seqüências de codifi-cação de anticorpo; ou sistemas de células mamíferas (por exemplo, célulasCOS, CHO, BLK, 293, 3T3) abrigando construções de expressão recombi-nantes contendo os promotores derivadas do genoma de células mamíferas(por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus mamíferos (por e-xemplo, promotor de adenovírus tardio; promotor de vírus de vaccinia de 7,5K). Preferivelmente1 células bacterianas tais como Escherichia coli, e maispreferivelmente, células eucarióticas, especialmente para a expressão damolécula de anticorpo recombinante inteiro, são usadas para a expressão deuma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células mamíferastais como células de ovário de hamster chinês (CHO), junto com um vetor talcomo o elemento de promotor de gene prematuro intermediário principal decitomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos(Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2(1990)).
A linhagem de célula hospedeira usada para expressão de pro-teína é freqüentemente de origem mamífera; aqueles versados na técnicasão creditados com habilidade para determinar as linhagens de célula hos-pedeira particulares que são melhores preferencialmente adaptadas para oproduto de gene desejado a ser expresso nele. Linhas de célula hospedeiraexemplares incluem, mas não são limitadas a, CHO (Ovário de HamsterChinês), DG44 e DUXB11 (linhagens de Ovário de Hamster Chinês, DHFRmenos), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linhagem de rim de maca-co), COS (um derivado de CVI com antígeno de SV40 T), VERY, BHK (rimde hamster filhote), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblasto de Hamster chi-nês) BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linhagem de rim dehamster), SP2/0 (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma decamundongo), BFA-1c1BPT (células endoteliais bovinas), RAJI (linfócitohumano) e 293 (rim humano). Células CHO são particularmente preferidas.Linhas de célula hospedeira estão tipicamente disponíveis de serviços co-merciais, da American Type Cell Culture ou da literatura publicada.
Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser seleciona-da que modula a expressão das seqüências inseridas, ou modifica e proces-sa o produto de gene na maneira específica desejada. Tais modificações(por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) dosprodutos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Cé-lulas hospedeiras diferentes têm característica e mecanismos específicospara o processamento pós-translacional e modificação das proteínas e pro-dutos de gene. Linhagens celulares ou sistemas de hospedeiro apropriadospodem ser selecionados para assegurar a modificação e processamentocorretos da proteína estranha expressada. Para este fim, células hospedei-ras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para processamento a-propriado da transcrição primária, glicosilação, e fosforilação do produto degene podem ser usadas.
Para a produção de rendimento alto a longo prazo das proteínasrecombinantes, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens celu-lares que estavelmente expressam a molécula de anticorpo podem ser en-genheiradas. Ao invés usar vetores de expressão contendo origens virais dereplicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA con-trolado através de elementos de controle de expressão apropriados (por e-xemplo, promotor, intensificador, seqüências, terminadores de transcrição,sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Seguindo a in-trodução do DNA estranho, células engenheiradas podem ser deixadascrescer durante 1-2 dias em um meio enriquecido, e depois é trocado paraum meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante con-fere resistência à seleção e permite as células estavelmente integrarem oplasmídeo em seus cromossomos e crescerem para formar focos que porsua vez podem ser clonados e expandidos nas linhagens celulares. Estemétodo pode vantajosamente ser usado para criar linhagens celulares queestavelmente expressam a molécula de anticorpo.
Vários sistemas de seleção podem ser usados, incluindo masnão limitados a genes de timidina cinase de vírus do herpes simples (Wigleret al., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szy-balska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:202 (1992)), e adeninafosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:817 1980) podem ser emprega-dos em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Também, resistência aanti-metabólito pode ser usada como a base da seleção para os genes aseguir: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad.Sei. USA 77:357 (1980); O1Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1527(1981)); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072 (1981)); neo, que confere resistência aaminoglicosido G-418 Clinicai Pharmacy 12.488-505; Wu e Wu, Biotherapy3:87-95 (1991); Tolstoshev, Anrt. Rev. Pharmacoi Toxicoi 32573-596(1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); e Morgan e Anderson, Ann.Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); TIB TECH 11(5): 155-215 (maio, 1993); ehigro, que confere resistência a higromicina (Santerre et ai, Gene 30:147(1984). Métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNArecombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et ai (eds.),Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Krie-gler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press,NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et ai (eds), Current Protocolsin Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et ai,J. Moi Biol. 750:1 (1981), que é são incorporados aqui por referência emsuas totalidades.
Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podemser aumentados por amplificação de vetor (para uma revisão, vide Bebbing-ton e Hentschel, The use ofvectors based on gene amplification for the ex-pression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, AcademicPress, Nova Iorque, Vol. 3. (1987)). Quando um marcador no sistema devetor que expressa anticorpo for amplificável, aumento no nível de inibidorpresente na cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias dogene marcador. Considerando que a região amplificada é associada ao genede anticorpo, produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., MoiCeli Biol. 3:257 (1983)).
Produção in vitro permite graduar para dar quantidades grandesdos polipeptídeos desejados. Técnicas para cultivo de célula mamífera sobcondições de cultura de tecido são conhecidas na técnica e incluem culturade suspensão homogênea, por exemplo em um reator do tipo air-lift ou emum reator de agitador contínuo, ou cultura de célula imobilizada ou captura-da, por exemplo em fibras ocas, microcápsulas, em microcontas de agaroseou cartuchos de cerâmica. Se necessário e/ou desejado, as soluções de po-lipeptídeos podem ser purificadas pelos métodos de cromatografia habituais,por exemplo filtração em gel, cromatografia de permuta iônica, cromatografiaem DEAE-celulose ou (immuno-) cromatografia de afinidade, por exemplo,após biossíntese preferencial de um polipeptídeo de região de dobradiçasintético ou antes ou subseqüente à etapa de cromatografia de HIC descritaaqui.
Genes que codificam anticorpos de IGF-1R, ou fragmentos deligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podetambém ser expressados em células não-mamíferas tais como bactérias oucélulas de inseto ou levedura ou de planta. Bactérias que facilmente absor-vem ácidos nucléicos incluem os membros das Enterobacteriaceae, tais co-mo cepas de Escherichia coii ou Salmonelia; Bacillaceae1 tais como Baciliussubtilis; Pneumococcus; Streptoeoeeus, e Haemophilus influenzae. Tambémserá apreciado que, quando expressados em bactérias, os polipeptídeosheterólogos tipicamente se torne parte dos corpos de inclusão. Os polipeptí-deos heterólogos devem ser isolados, purificados e depois montados emmoléculas funcionais. Onde formas tetravalentes de anticorpos forem dese-jadas, as subunidades depois auto-montam em anticorpos tetravalentes(W002/096948A2).
Em sistemas bacterianos, vários vetores de expressão podemser vantajosamente selecionados dependendo do uso intencionado para amolécula de anticorpo sendo expressada. Por exemplo, quando uma quanti-dade grande de uma tal proteína for para produzida, para a geração decomposições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que dire-cionam a expressão de níveis altos dos produtos de proteína de fusão quesão facilmente purificados podem ser desejáveis. Tais vetores incluem, masnão são limitados a, vetor de expressão de E. coii pUR278 (Ruther et al.,EMBO J. 2:1791 (1983)) em que a seqüência de codificação do anticorpopode ser ligada individualmente no vetor na estrutura com a região de codifi-cação de IacZ de forma que uma proteína de fusão é produzido; vetores pIN(Inouye & lnouye, Nucleic Acid Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & S-chuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); e outros. Vetores pGEX po-dem também ser usados para expressar polipeptídeos estranhos como pro-teínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínasde fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células lisadaspor adsorção e ligando a umas contas de glutationa-agarose de matriz se-guido por elução na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são pro-jetados para incluir sítios de clivagem de trombina ou Fator Xa protease deforma que o produto de gene alvo clonado possa ser liberado da metade deGST.
Além de procariotos, micróbios eucarióticos podem também serusados. Saccharomyees eerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é o co-mumente usado entre os microorganismos eucarióticos embora várias outrascepas estejam comumente disponíveis, por exemplo, Piehia pastoris.
Para expressão em Saeeharomyees, o plasmídeo YRp7, por e-xemplo, (Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)) são comumente usa-dos. Este plasmídeo já contém o gene de TRP1 que provê um marcador deseleção para uma cepa mutante de levedura que carece da habilidade paracrescer em triptofano, por exemplo ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones, Ge-neties 85:12 (1977)). A presença da lesão de trpl como uma característica dogenoma de célula hospedeira de levedura depois provê um ambiente eficazpara detectar transformação através de crescimento na ausência de triptofa-no.
Em um sistema de inseto, vírus de poliedrose nuclear de Auto-grapha caiiforniea (AcNPV) é tipicamente usado como um vetor para expres-sar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. Aseqüência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente emregiões não-essenciais (por exemplo o gene de poliedrina) do vírus e colo-cada sob controle de um promotor de AcNPV (por exemplo o promotor depoliedrina).
Uma vez uma molécula de anticorpo da invenção foi recombi-nantemente expressa, pode ser purificada por qualquer método conhecidona técnica por purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo,através de cromatografia (por exemplo, permuta de íons, afinidade, particu-larmente por afinidade para o antígeno específico após Proteína A, e croma-tografia de coluna por tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, oupor qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Alternati-vamente, um método preferido para aumentar a afinidade dos anticorpos dainvenção é revelado na US 2002 0123057 A1.
VIII. MÉTODOS DE TRATAMENTO USANDO ANTICORPOS IGF-1R-ESPECÍFICOS TERAPÊUTICOS, OU FRAGMENTOS IMUNOESPECÍFICOS DOS MESMOS
Uma modalidade da presente invenção prove métodos para tra-tar uma doença ou distúrbio hiperproliferativo, por exemplo, câncer, uma ma-lignidade, um tumor, ou uma metástase do mesmo, em um animal sofrendode tal doença ou predisposto a contrair tal doença, o método compreenden-do, consistindo essencialmente em, ou consistindo em administrar ao animaluma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento imunoespecífico domesmo, que liga a IGF-1R ou uma variante de IGF-1R. Anticorpos adequa-dos incluem todos os anticorpos e fragmentos antígeno-específicos dosmesmos descritos aqui. Exemplos incluem, mas não são limitados a, um an-ticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especifi-camente liga ao mesmo epítopo de IGF-R1 como um fragmento monoclonalde anticorpo de Fab de referência selecionado do grupo que consiste emM13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anti-corpo monoclonal de referência produzido por um hibridoma selecionado dogrupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11,P1E2.3B12, e P1G10.2B8, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação deantígeno do mesmo que especificamente liga a IGF-R1 onde o anticorpo oufragmento do mesmo competitivamente inibe um fragmento de anticorpo deFab monoclonal de referência selecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpomonoclonal de referência produzido por um hibridoma selecionado do grupoque consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11,Ρ1 E2.3B12, e P1G10.2B8 de ligar a IGF-R1, ou um anticorpo isolado oufragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga a IGF-R1, onde o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um domínio deligação de antígeno idêntico ao de um fragmento monoclonal de anticorpo deFab selecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03,M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclonal produzido porum hibridoma selecionado do grupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8,Ρ1 A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8.
Em certas modalidades, um anticorpo da presente invenção queespecificamente liga a IGF-1R ou uma variante do mesmo inibe um ou maisfatores de crescimento de insulina, por exemplo, IGF-1, IGF-2 ou IGF-1 eIGF-1 de ligar a IGF-1 R. Em outras modalidades, um anticorpo da presenteinvenção que especificamente liga a IGF-1 R ou uma variante do mesmo ini-be fosforilação de IGF-1 R ao ligar um ou mais fatores de crescimento deinsulina. Em uma outra modalidade, um anticorpo da presente invenção queespecificamente liga a IGF-1 R ou uma variante do mesmo expresso em umacélula, em particular, uma célula tumoral, inibe fosforilação das moléculas detransdução de sinal a jusante envolvidas na proliferação, motilidade e/oumetástase celulares. Tais moléculas incluem, mas não são limitadas a, Akt eP42/44 MAPK. Em uma outra modalidade, um anticorpo da presente inven-ção que especificamente liga a IGF-1 R ou uma variante do mesmo expres-sado em uma célula promove internalização de IGF-1 R expresso na superfí-cie, limitando sua disponibilidade para interagir com IGF. Em ainda uma ou-tra modalidade, um anticorpo da presente invenção que especificamente ligaa IGF-1 R ou uma variante do mesmo expressado em uma célula, em parti-cular, uma célula tumoral, inibe proliferação, motilidade, e/ou metástase ce-lulares.
Um anticorpo da presente invenção que especificamente liga aIGF-1 R ou uma variante do mesmo, a ser usado nos métodos de tratamentorevelados aqui, pode ser preparado e usado como um agente terapêuticoque pára, reduz, impede, ou inibe as atividades celulares envolvidas na hi-perproliferação celular, por exemplo, atividades celulares que induzem o pa-drão de vascularização alterado ou anormal que é freqüentemente associa-do às doenças ou distúrbios hiperproliferativos.
Anticorpos ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos dapresente invenção incluem, mas não são limitados a anticorpos monoclo-nais, quiméricos ou humanizados, e fragmentos de anticorpos que especifi-camente ligam às proteínas associadas ao tumor tais como IGF-1R. Os anti-corpos podem ser monovalentes, bivalentes, polivalentes, ou anticorpos bi-funcionais, e os fragmentos de anticorpo incluem FAB, F(ab')2, e Fv.
Anticorpos terapêuticos de acordo com a invenção podem serusados nas formas não-marcadas ou não-conjugadas, ou podem ser aco-plados ou ligados às metades citotóxicas tais como radiomarcações e citoto-xinas bioquímicas para produzir agentes que exercem efeitos terapêuticos.
Em certas modalidades, um anticorpo, ou fragmento imunoespe-cífico do mesmo da invenção inclui um domínio de ligação de antígeno. Umdomínio de ligação de antígeno é formado através de regiões variáveis deanticorpo que variam de um anticorpo para outro. Anticorpos de ocorrêncianatural compreendem pelo menos dois domínios de ligação de antígeno, istoé, eles são pelo menos bivalentes. Como aqui usado, o termo "domínio deligação de antígeno" inclui um sítio que especificamente liga um epítopo emum antígeno (por exemplo, uma superfície de célula ou antígeno solúvel). Odomínio de ligação de antígeno de um anticorpo tipicamente inclui pelo me-nos uma porção de uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulinae pelo menos uma porção de uma região variável de cadeia leve da imuno-globulina. O sítio de ligação formado por estas regiões variáveis determinama especificidade do anticorpo.
A presente invenção provê métodos para tratar vários distúrbiosI hiperproliferativos, por exemplo, inibindo crescimento do tumor, em um ma-mífero, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo emadministrar ao mamífero uma quantidade eficaz de um anticorpo ou frag-mento de ligação do antígeno do mesmo que específica ou preferencialmen-te liga a IGF-R1, por exemplo, IGF-R1 humano.A presente invenção mais especificamente é direcionada a ummétodo de tratar uma doença hiperproliferativa, por exemplo, inibindo ouimpedindo a formação do tumor, crescimento do tumor, invasidade do tumor,e/ou formação de metástase, em um animal, por exemplo, um mamífero, porexemplo, um humano, compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em administrar a um animal em necessidade do mesmo umaquantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento imunoespecífico do mesmoque específica ou preferencialmente liga a um ou mais epítopos de IGF-1R.
Em outras modalidades, a presente invenção inclui um métodopara tratar uma doença hiperproliferativa, por exemplo, inibindo a formaçãodo tumor, crescimento do tumor, invasidade do tumor, e/ou formação de me-tástase em um animal, por exemplo, um paciente humano onde o métodocompreende administrar a um animal em necessidade de tal tratamento umaquantidade eficaz de uma composição compreendendo, consistindo essen-cialmente em, ou consistindo em, além de um veículo farmaceuticamenteaceitável, um anticorpo, ou fragmento imunoespecífico do mesmo para es-pecificamente ligar pelo menos um epítopo de IGF-1R, onde o epítopo com-preende, consiste essencialmente em, ou consiste em pelo menos cerca dequatro a cinco aminoácidos da SEQ ID NO: 2, pelo menos sete, pelo menosnove, ou entre pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos da SEQID NO: 2. Os aminoácidos de um epítopo dado da SEQ ID NO: 2 como des-crita podem ser, mas não necessitam ser, contíguos. Em certas modalida-des, o pelo menos um epítopo de IGF-1 R compreende, consiste essencial-mente em, ou consiste em um epítopo não-linear formado pelo domínio ex-tracelular de IGF-1 R como expresso na superfície de uma célula. Desse mo-do, em certas modalidades o pelo menos um epítopo de IGF-1 R compreen-de, consiste essencialmente em, ou consiste em pelo menos 4, pelo menospelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10,pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, entre cerca de 15 a cerca de30, ou pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80,85, 90, 95, ou 100 aminoácidos contíguos ou não-contíguos da SEQ ID NO:2, onde aminoácidos não-contíguos formam um epítopo através do dobra-mento das proteínas.
Em outras modalidades, a presente invenção inclui um métodopara tratar uma doença hiperproliferativa, por exemplo, inibindo formação dotumor, crescimento do tumor, invasidade do tumor, e/ou formação de metás-tase em um animal, por exemplo, um paciente humano, onde o métodocompreende administrar a um animal em necessidade de tal tratamento umaquantidade eficaz de uma composição compreendendo, consistindo essen-cialmente em, ou consistindo em, além de um veículo farmaceuticamenteaceitável, um anticorpo, ou fragmento imunoespecífico do mesmo que espe-cificamente liga pelo menos um epítopo de IGF-1R, onde o epítopo compre-ende, consiste essencialmente em, ou consiste em, além de um, dois, três,quatro, cinco, seis ou mais aminoácidos contíguos ou não-contíguos da SEQID NO: 2 como descrita acima, e uma metade adicional modificando a prote-ína, por exemplo, uma metade de carboidrato pode ser incluída de modo quea molécula de ligação ligue com afinidade mais alta à proteína alva modifi-cada que transforma em uma versão inalterada da proteína. Alternativamen-te, a molécula de ligação de forma alguma liga a versão inalterada da proteí-na alvo.
Mais especificamente, a presente invenção fornece um métodode tratar câncer em um humano, compreendendo administrando a um hu-mano em necessidade de tratamento uma composição compreendendo umaquantidade eficaz de um anticorpo específico para IGF-1R ou fragmento i-munoespecífico do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tiposde câncer a serem tratados incluem, mas não são limitados a, câncer de es-tômago, câncer renal, câncer de cérebro, câncer de bexiga, câncer de cólon,câncer de pulmão, câncer de mama, câncer pancreático, câncer ovariano, ecâncer de próstata.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento do mesmoespecificamente liga a pelo menos um epítopo de IGF-1R ou fragmento ouvariante descritos acima, isto é, liga a um tal epítopo mais facilmente do queligaria a um epítopo não relacionado, ou aleatório; liga preferencialmente apelo menos um epítopo de IGF-1R ou fragmento ou variante descritos aci-ma, isto é, liga a um tal epítopo mais facilmente do que ligaria a um epítoporelacionado, similar, homólogo, ou análogo; competitivamente inibe a ligaçãode um anticorpo de referência que específica ou preferencialmente liga a umcerto epítopo de IGF-1R ou fragmento ou variante descritos acima; ou ligapelo menos um epítopo de IGF-1R ou fragmento ou variante descritos acimacom uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação KD demenos que cerca de 5 χ 10-2 Μ, cerca de 10-2 M, cerca de 5 χ 10-3 Μ, cercade 10-3 M, cerca de 5 χ 10-4 Μ, cerca de 10-4 M, cerca de 5 χ 10-5 Μ, cercade 10-5 M, cerca de 5 χ 10-6 Μ, cerca de 10-6 M, cerca de 5 χ 10-7 Μ, cercade 10-7 M, cerca de 5 χ 10-8 Μ, cerca de 10-8 M, cerca de 5 χ 10-9 Μ, cercade 10-9 M, cerca de 5 χ 10-10 Μ, cerca de 10-10 M, cerca de 5 χ 10-11 Μ, cercade 10-11 M, cerca de 5 χ 10-12 Μ, cerca de 10-12 M, cerca de 5 χ 10-13 Μ, cer-ca de 10-13 M, cerca de 5 χ 10-14 Μ, cerca de 10-14 M, cerca de 5 χ 10-15 M,ou cerca de 10-15 M. Como usado no contexto de constantes de dissociaçãode ligação de anticorpo, o termo "cerca de" permite o grau de variação ine-rente nos métodos utilizados para medir afinidade de anticorpo. Por exem-plo, dependendo do nível de precisão da instrumentação de erro usada, pa-drão com base no número de amostras medidas, e erro de arredondamento,o termo "cerca de 10-2 M" poderia incluir, por exemplo, de 0,05 M a 0,005 M.Em certas modalidades, anticorpos e fragmentos dos mesmos da presenteinvenção reagem cruzado com as proteínas de IGF-1R de outras espéciesdas quais foram suscitados, por exemplo, um anticorpo ou fragmento domesmo que especificamente liga a IGF-1R humano também liga a primataIGF-1R e/ou IGF-1R murino. Outros anticorpos adequados ou fragmentosdos mesmos da presente invenção incluem aqueles que são espécies alta-mente específicas.
Em modalidades específicas, anticorpos ou fragmentos imuno-específicos dos mesmos revelados aqui ligam polipeptídeos de IGF-1R oufragmentos ou variantes dos mesmos com uma taxa off (k(off)) menor ouigual a 5 X 10-2 seg-1, 10-2 seg-1, 5 X 1O-3 seg-1 ou seg-1 de 1O-3. Outros anti-corpos ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos revelados aqui ligampolipeptídeos de IGF-1R ou fragmentos ou variantes dos mesmos com umataxa off (k(off)) menor ou igual a 5 X 10"4 seg"1, 10"4 seg'1, 5 X 10"5 seg'1, ou10"5 seg"1 5 X 10 6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 X 10"7 seg"1 ou 10"7 seg"1.
Em outras modalidades, anticorpos ou fragmentos imunoespecí-ficos dos mesmos revelados aqui ligam polipeptídeos de IGF-1R ou frag-mentos ou variantes dos mesmos com uma taxa on (k(on)) maior ou igual a103 M"1 seg"1, 5 X 103 M"1 seg1, 104 M"1 seg"1 ou 5 X 104 M"1 seg"1. Outrosanticorpos ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos para o uso nos mé-todos de diagnóstico e tratamento revelados aqui ligam polipeptídeos deIGF-1R ou fragmentos ou variantes dos mesmos com uma taxa on (k(on))maior ou igual a 105 M"1 seg"1, 5 X 105 M"1 seg'1, 106 M"1 seg"1, ou 5 X 106 M1seg"1 ou 107 M1 seg"1.
Em várias modalidades, uma ou mais moléculas de ligação co-mo descritas acima são antagonista da atividade de IGF-1R, por exemplo,ligação de um anticorpo de IGF-1R de antagonista a IGF-1R quando expres-so em uma célula tumoral inibe a ligação do fator de crescimento de insulina,por exemplo, IGF-1, IGF-2, ou IGF-1 e IGF-2 a IGF-1 R, promove internaliza-ção de IGF-1 R assim inibindo sua capacidade de transdução de sinal, inibefosforilação de IGF-1 R, inibe fosforilação das moléculas a jusante na via detransdução de sinal, por exemplo, Akt ou P42/44 MAPK, ou inibe prolifera-ção, motilidade ou metástase da célula tumoral.
IX. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS OU PROGNÓSTICOS USANDO MOLÉ-CULAS DE LIGAÇÃO IGF-1 R-ESPECÍFICAS E ENSAIOS DE AMPLIFICA-CÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO
Anticorpos específicos para IGF-1 R, ou fragmentos, derivados,ou análogos dos mesmos, podem ser usados para propósitos de diagnósticopara detectar, diagnosticar, ou monitorar doenças, distúrbios, e/ou condiçõesassociadas à expressão e/ou atividade aberrantes de IGF-1 R. Expressão deIGF-1 R é aumentada no tecido de tumor e outras condições neoplásticas.
Anticorpos específicos para IGF-1 R ou fragmentos dos mesmos,são úteis para diagnose, tratamento, prevenção e/ou prognose de distúrbioshiperproliferativos em mamíferos, preferivelmente seres humanos. Tais dis-túrbios incluem, mas não são limitados a, câncer, neoplasmas, tumores e/oucomo descrito em outro lugar sob aqui, especialmente cânceres associadosa IGF-1R tais como câncer de estômago, câncer renal, câncer de cérebro,câncer de bexiga, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama,câncer pancreático, câncer ovariano, e câncer de próstata.
Por exemplo, como revelado aqui, expressão de IGF-1R é asso-ciada a pelo menos tecidos de tumor de estômago, renal, cérebro, bexiga,cólon, pulmão, mama, pancreático, ovariano, e de próstata. Conseqüente-mente, anticorpos (e fragmentos de anticorpo) direcionados contra IGF-1Rpodem ser usados para detectar tecidos particulares que expressam níveisaumentados de IGF-1R. Estes ensaios de diagnósticos podem ser executa-dos in vivo ou in vitro, tais como, por exemplo, em amostras de sangue, teci-do de biópsia ou tecido de autópsia.
Desse modo, a invenção fornece um método de diagnóstico útildurante diagnose de uns cânceres e outros distúrbios hiperproliferativos, queenvolve medir o nível de expressão da proteína de IGF-1R ou transcrição emtecido ou outras células ou fluido do corpo de um indivíduo e comparar onível de expressão medido com uns níveis padrões de expressão de IGF-1Rem tecido normal ou fluido do corpo por meio do qual um aumento no nívelde expressão comparado ao padrão é indicativo de um distúrbio.
Uma modalidade fornece um método de detectar a presença decélulas hiperproliferativas anormais, por exemplo, células pré-cancerosas oucancerosas, em um fluido ou amostra de tecido, compreendendo ensaiar aexpressão de IGF-1R em tecido ou amostras de fluidos do corpo de um indi-víduo e comparar a presença ou nível de expressão de IGF-1 R na amostracom a presença ou nível de expressão de IGF-1 R em um painel de tecidopadrão ou amostras de fluidos do corpo, onde a detecção da expressão deIGF-1 R ou um aumento na expressão de IGF-1 R acima dos padrões sãoindicativos de crescimento aberrante de células hiperproliferativas.
Mais especificamente, a presente invenção fornece um métodode detectar a presença de células hiperproliferativas anormais em um fluidodo corpo ou amostra de tecido, compreendendo (a) ensaiar para a expres-são de IGF-1 R em tecido ou amostras de fluidos do corpo de um indivíduousando anticorpos específicos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficosdos mesmos da presente invenção, e (b) comparar a presença ou nível deexpressão de IGF-1R na amostra com uma presença ou nível de expressãode IGF-1R em um painel de tecido padrão ou amostras de fluidos do corpo,por meio do qual detecção de expressão de IGF-1R ou um aumento na ex-pressão de IGF-1R acima dos padrões são indicativos de crescimento aber-rante de células hiperproliferativas.
Com respeito a câncer, a presença de uma quantidade relativa-mente alta de proteína de IGF-1R no tecido submetido à biopsia de um indi-víduo pode indicar a presença de um tumor ou outro crescimento maligno,pode indicar uma predisposição para o desenvolvimento de tais malignida-des ou tumores, ou pode prover um meio para detectar a doença antes doaparecimento dos sintomas clínicos atuais. Uma diagnose mais definitivadeste tipo pode permitir os profissionais de saúde empregar medidas pre-ventivas ou tratamento agressivo mais cedo assim impedindo o desenvolvi-mento ou progressão adicional do câncer.
Anticorpos específicos para IGF-1R da presente invenção po-dem ser usados em níveis de proteína de ensaio em uma amostra biológicausando métodos imuno-histológicos clássicos conhecidos àqueles de habili-dade na técnica (por exemplo, vide Jalkanen, et al., J. CeH Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)). Outros mé-todos baseados em anticorpo úteis para detectar expressão da proteína in-cluem imunoensaios, tais como o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima(ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). Marcações de ensaio de anticorpo a-dequadas são conhecidas na técnica e incluem marcações de enzima, taiscomo, glicose oxidase; radioisótopos, tais como iodo (125I, 121I), carbono(14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (112In), e tecnétio (99Tc); marcações Iu-minescentes, tais como luminol; e marcações fluorescentes, tais como fluo-resceína e rodamino, e biotina. Ensaios adequados são descritos em outrolugar em mais detalhe aqui.
Um aspecto da invenção é um método para a detecção ou diag-nose in vivo de uma doença hiperproliferativa ou distúrbio associado à ex-pressão aberrante de IGF-1R em um animal, preferivelmente um mamífero emais preferivelmente um ser humano. Em uma modalidade, diagnose com-preende: a) administrar (por exemplo, parenteral, subcutânea, ou intraperito-nealmente) a um sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo marcado oufragmento do mesmo da presente invenção que especificamente liga a IGF-1R; b) esperar por um intervalo de tempo seguindo a administração parapermitir a molécula de ligação marcada concentrar preferencialmente nossítios no sujeito onde IGF-1R é expressado (e para molécula marcada não-ligada ser limpada para nível base); c) determinar o nível base; e d) detectara molécula marcada no sujeito, acima de modo que detecção da moléculamarcada indica o nível base que o sujeito tem uma doença particular ou dis-túrbio associado à expressão aberrante de IGF-1R. Nível base pode ser de-terminado através de vários métodos incluindo comparar a quantidade demolécula marcada detectada a um valor padrão previamente determinadopara um sistema particular.
Será entendido na técnica que o tamanho do sujeito e o sistemade imageamento usado determinarão a quantidade de metade de imagea-mento necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de umametade de radioisótopo, para um sujeito humano, a quantidade de radioati-vidade injetada normalmente varia de cerca de 5 a 20 milicuries, por exem-plo, de "Tc. A molécula de ligação marcada, por exemplo, anticorpo oufragmento de anticorpo, depois preferencialmente se acumulará na localiza-ção das células contendo a proteína específica. Imageamento de tumor invivo é descrito em S. W. Burchiel et ai, "Immunopharmacokinetics of Radio-labeled Antibodies and Their Fragments." (Capítulo 13 em Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Câncer, S. W. Burchiel e B. A. Rhodes,eds., Masson Publishing Inc. (1982).
Dependendo de várias variáveis, incluindo o tipo de marcaçãousado e o modo de administração, o intervalo de tempo seguindo a adminis-tração para permitir a molécula marcada concentrar-se preferencialmentenos sítios no sujeito e para molécula marcada não-ligada ser limpada paranível base é 6 a 48 horas ou 6 a 24 horas ou 6 a 12 horas. Em outra modali-dade o intervalo de tempo seguindo administração é 5 a 20 dias ou 7 a 10dias.
Presença da molécula marcada pode ser detectada no pacienteusando métodos conhecidos na técnica para varredura in vivo. Estes méto-dos dependem do tipo de marcação usado. Artesãos versados poderão de-terminar o método apropriado para detectar uma marcação particular. Méto-dos e dispositivos que podem ser usados nos métodos diagnósticos da in-venção incluem, mas não são limitados a, tomografia computadorizada (CT),varredura de corpo inteiro tais como tomografia de emissão de pósitrons(PET), imageamento por ressonância magnética (MRI), e sonografia.
Em uma modalidade específica, a molécula de ligação é marca-da com um radioisótopo e é detectada no paciente usando um instrumentocirúrgico responsivo à radiação (Thurston et al., Pat. U. S. No. 5.441.050).Em outra modalidade, a molécula de ligação é marcada com um compostofluorescente e é detectada no paciente usando um instrumento de varreduraresponsivo à fluorescência. Em outra modalidade, a molécula de ligação émarcada com um metal emissor de pósitrons e é detectada na patente u-sando tomografia de emissão de pósitron. Em ainda outra modalidade, amolécula de ligação é marcada com uma marcação paramagnética e é de-tectada em um paciente usando imageamento por ressonância magnética(MRI).
Marcações ou marcadores de anticorpo para imageamento invivo da expressão de IGF-1R incluem aqueles detectáveis pore radiografia,imageamento por ressonância magnética nuclear (RMN), MRI, varreduras deCAT ou imageamento por ressonância de giro de elétrons (ESR). Para ra-diografia, marcações adequadas incluem radioisótopos tais como bário oucésio que emitem radiação detectável mas não são de forma manifesta pre-judiciais ao sujeito. Marcadores adequados para RMN e ESR incluem aque-les com um giro característico detectável, tais como deutério, que pode serincorporado no anticorpo por marcação de nutrientes para o hibridoma rele-vante. Onde imageamento in vivo for usado para detectar níveis intensifica-dos da expressão de IGF-1R para diagnose em seres humanos, pode serpreferível usar anticorpos humanos ou "humanizados" anticorpos monoclo-nais quiméricos como descritos em outro lugar aqui.
Em uma modalidade relacionada àquelas descritas acima, moni-toramento de uma doença ou distúrbio já diagnosticado é realizado repetindoqualquer um dos métodos para diagnosticar a doença ou distúrbio, por e-xemplo, um mês após diagnose inicial, seis meses após diagnose inicial, umano após diagnose inicial, etc.
Onde uma diagnose de um distúrbio, incluindo diagnose de umtumor, já foi feita de acordo com os métodos convencionais, métodos de de-tecção como revelados aqui são úteis como um indicador de prognóstico,por meio do qual os pacientes que continuam a exibir expressão de IGF-1Rintensificada experimentarão um resultado clínico pior com relação aos paci-entes cujo nível de expressão diminui mais próximo do nível padrão.
Por "ensaio do nível de expressão do polipeptídeo de IGF-1Rassociado ao tumor" é intencionado qualitativa ou quantitativamente medirou estimar o nível de polipeptídeo de IGF-1R em uma primeira amostra bio-lógica ou diretamente (por exemplo, determinando ou estimando o nível deproteína absoluto) ou relativamente (por exemplo, comparando ao nível depolipeptídeo de câncer associado por uma segunda amostra biológica). Pre-ferivelmente, nível de expressão de polipeptídeo de IGF-1R na primeira a-mostra biológica é medido ou estimado e comparado a um nível de polipep-tídeo de IGF-1R padrão, o padrão sendo tirado de uma segunda amostrabiológica obtida de um indivíduo não tendo o distúrbio ou sendo determinadoníveis ponderados de uma população de indivíduos não tendo o distúrbio.Como será apreciado na técnica, uma vez o nível "padrão" de polipeptídeode IGF-1R é conhecido, pode ser usado repetidamente como um padrãopara comparação.
Por "amostra biológica" é intencionado qualquer amostra biológi-ca obtida de um indivíduo, linhagem celular, cultura de tecido, ou outra fontede células que potencialmente expressam IGF-1R. Como indicado, amostrasbiológicas incluem fluidos do corpo (tais como soros, plasma, urina, fluidosinovial e fluido espinhal), e outras fontes de tecido contendo células quepotencialmente expressam IGF-1R. Métodos para obter biópsias de tecido efluidos do corpo de mamíferos são bem conhecidos na técnica.
Em uma modalidade adicional, anticorpos, ou fragmentos imu-noespecíficos de anticorpos direcionados para um epítopo conformacional de IGF-1R podem ser usados quantitativa ou qualitativamente para detectara presença de produtos de gene de IGF-1R gene ou variantes conservadasou fragmentos de peptídeo dos mesmos. Isto pode ser realizado, por exem-plo, por técnicas imunofluorescentes que empregam um anticorpo fluores-centemente marcado acoplado com detecção microscópica leve, citométrica de fluxo ou fluorimétrica.
Cânceres que podem ser diagnosticados, e/ou prognosticadosusando os métodos descritos acima incluem mas não são limitados, câncerde estômago, câncer renal, câncer de cérebro, câncer de bexiga, câncer decólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer pancreático, câncer ova- riano, e câncer de próstata.
X. IMUNOENSAIOS
Anticorpos específicos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecí-ficos dos mesmos revelados aqui podem ser ensaiados para ligação imuno-específica por qualquer método conhecido na técnica. Os imunoensaios que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, sistemas de ensaioscompetitivo e não-competitivo usando técnicas tais como Western blot, ra-dioimunoensaios, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a enzima), imuno-ensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipi-tina, reações de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, en- saios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imuno-radioméricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, paracitar alguns. Tais ensaios são rotineiros e bem conhecidos na técnica (vide,por exemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, Vol. 1 (1994) que é incorporado aqui por referência em sua totalidade). Imunoensaios exemplares são brevemen-te descritos abaixo (mas não são intencionados por via de limitação).
Protocolos de imunoprecipitação em geral compreendem Iisaruma população de células em um tampão de Iise tal como tampão de RIPA(1 %NP-40 ou Triton X-100, 1 %deoxicolato de sódio, 0,1 %SDS, 0,15 MNaCI, 0,01 M fosfato de sódio em pH 7,2, 1 %Trasylol) suplementado cominbidores de proteína fosfatase e/ou protease (por exemplo, EDTA, PMSF,aprotinina, vanadato de sódio), acrescentando o anticorpo de interesse aoIisado de célula, incubando durante um período de tempo (por exemplo, 1-4horas) a 4 graus C, adicionando contas de sepharose de proteína A e/ouproteína G ao Iisado de célula, incubando durante cerca de uma hora oumais a 4 graus C, lavando as contas em tampão de Iise e ressuspendendoas contas em tampão de SDS/amostra. A habilidade do anticorpo de interes-se para imunopreciptar um antígeno particular pode ser avaliada por, porexemplo, análise de Western blot. Alguém de habilidade na técnica seriainstruído sobre os parâmetros que podem ser modificados para aumentar aligação do anticorpo a um antígeno e diminuir a base (por exemplo, pré-limpando a célula Iisada com contas de sepharose). Para mais debate comrelação aos protocolos de imunoprecipitação vide, por exemplo, Ausubel etai, eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., No-va Iorque, Vol. 1 (1994) em 10.16.1.
Análise de Western blot em geral compreende preparar as a -mostras de proteína, eletroforese das amostras de proteína em um gel depoliacrilamida (por exemplo, 8%-20 %SDS-PAGE dependendo do peso mo-lecular do antígeno), transferir a amostra de proteína do gel de poliacrilamidapara uma membrana tal como nitrocelulose, PVDF ou náilon, bloquear amembrana na solução de bloqueio (por exemplo, PBS com 3 %BSA ou leitesem gordura), lavar a membrana no tampão de lavagem (por exemplo, PBS-Tween 20), bloquear a membrana com anticorpo primário (o anticorpo deinteresse) diluído no tampão de bloqueio, lavar a membrana no tampão delavagem, bloquear a membrana com um anticorpo secundário (reconhecen-do o anticorpo primário, por exemplo, um anticorpo anti-humano) conjugadocom um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de raiz-forte ou fos-fatase alcalina) ou molécula radioativa (por exemplo, 32p ou 125I) diluído notampão de lavagem, lavar a membrana em tampão de lavagem, e detectar apresença do antígeno. Alguém de habilidade na técnica seria instruído sobreos parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectadoe reduzir o ruído de fundo. Para mais debate com relação aos protocolos deWestern blot vide, por exemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Mo-lecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque Vol. 1 (1994) em10.8.1.
ELISAs compreendem preparar o antígeno, revestir o poço deuma placa de microtitulação de 96 poços com o antígeno, acrescentar o an-ticorpo de interesse conjugado com um composto detectável tal como umsubstrato enzimático (por exemplo, peroxidase de raiz-forte ou fosfatase al-calina) ao poço e incubar durante um período de tempo, e detectar a pre-sença do antígeno. Em ELISAs o anticorpo de interesse não tem que serconjugado com um composto detectável; do contrário, um segundo anticorpo(que reconhece o anticorpo de interesse) conjugado com um composto de-tectável pode ser adicionado ao poço. Também, em vez de revestir o poçocom o antígeno, o anticorpo pode ser revestido no poço. Neste caso, umsegundo anticorpo conjugado para um composto detectável seguinte podeser adicionado à adição do antígeno de interesse ao poço revestido. Alguémde habilidade na técnica seria instruído sobre os parâmetros que podem sermodificados para aumentar o sinal detectado como também outras variaçõesde ELISAs conhecidas na técnica. Para mais debate com relação a ELISAsvide, por exemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Bio-logy, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, Vol. 1 (1994) em 11.2.1.
A afinidade da ligação de um anticorpo a um antígeno e a taxaoff de uma interação de anticorpo-antígeno podem ser determinadas atravésde ensaios de ligação competitivos. Um exemplo de um ensaio de ligaçãocompetitivo é um radioimunoensaio que compreende a incubação do antíge-no marcado (por exemplo, 3H ou 125I) com o anticorpo de interesse na pre-sença de quantidades crescentes de antígeno não-marcado, e a detecçãodo anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade do anticorpo de inte-resse a um antígeno particular e a taxa off de ligação podem ser determina-da dos dados por análise gráfica de Scatchard. Competição com um segun-do anticorpo pode também ser determinada usando radioimunoensaios.Neste caso, o antígeno é incubado com anticorpo de interesse, é conjugadocom um composto marcado (por exemplo, 3H ou 125I) na presença de quanti-dades crescentes de um segundo anticorpo não-marcado.
Anticorpos específicos para IGF-1R podem, adicionalmente, serempregados histologicamente, como em imunofluorescência, microscopia deimunoelétron ou ensaios não-imunológicos, para detecção in situ de produ-tos de gene de antígeno de câncer ou variantes conservadas ou fragmentosde peptídeo dos mesmos. Detecção in situ pode ser realizada removendoum espécime histológico de um paciente, e aplicando um anticorpo específi-co para IGF-1R marcado ou fragmento para este dos mesmos, preferivel-mente aplicado revestindo o anticorpo marcado (ou fragmento) sobre umaamostra biológica. Através do uso de um tal procedimento, é possível não sódeterminar a presença da proteína de IGF-1R, ou variantes conservadas oufragmentos de peptídeo, mas também sua distribuição no tecido examinado.Usando a presente invenção, aqueles de habilidade usual perceberão facil-mente que qualquer de uma ampla variedade de métodos histológicos (taiscomo procedimentos de tingimento) pode ser modificada para alcançar taldetecção in situ.
Imunoensaios e não-imunoensaios para produtos de gene deIGF-1R ou variantes conservadas ou fragmentos de peptídeo dos mesmostipicamente compreenderão incubar uma amostra, tal como um fluido bioló-gico, um extrato de tecido, células recentemente colhidas, ou Iisados de cé-lulas que foram incubados na cultura de célula, na presença de um anticorpodetectavelmente marcado capaz de ligar a IGF-1R ou variantes conservadasou fragmentos de peptídeo do mesmo, e detectando o anticorpo ligado porquaisquer de várias técnicas bem conhecidas na técnica.
A amostra biológica pode ser colocada em contato e imobilizadasobre um suporte de fase sólida ou um veículo tal como nitrocelulose, ououtro suporte sólido que é capaz de imobilizar as células, partículas de célu-la ou proteínas solúveis. O suporte pode depois ser lavado com tampõesadequados seguido por tratamento com o anticorpo específico para IGF-1Rdetectavelmente marcado. O suporte de fase sólida pode ser depois lavadocom o tampão uma segunda vez para remover o anticorpo não-ligado. Op-cionalmente o anticorpo é subseqüentemente marcado. A quantidade demarcação ligada no suporte sólido pode ser depois detectada através demeios convencionais.
Por "suporte de fase sólida ou veículo" é intencionado qualquersuporte capaz de ligar um antígeno ou um anticorpo. Suportes ou veículosbem conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dex-trana, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas,gabros, e magnetita. A natureza do veículo pode ser até certo ponto solúvelou insolúvel para o propósito da presente invenção. O material de suportepode ter virtualmente qualquer possível configuração estrutural desde que amolécula acoplada seja capaz de ligar a um antígeno ou anticorpo. Dessemodo, a configuração de suporte pode ser esférica, como em uma conta, oucilíndrica, como no lado de dentro da superfície de um tubo de teste, ou asuperfície externa de um bastão. Alternativamente, a superfície pode serplana tal como uma folha, tira de teste, etc. Suportes preferidos incluem con-tas de poliestireno. Aqueles versados na técnica conhecerão muitos outrosveículos adequados para ligar anticorpo ou antígeno, ou poderão apurar osmesmos mediante o uso de experimentação rotineira.
A atividade de ligação de um lote dado de anticorpo específicopara IGF-1R pode ser determinada de acordo com os métodos bem conhe-cidos. Aqueles versados na técnica poderão determinar operação e condi-ções de ensaio ótimas para cada determinação empregando experimenta-ção rotineira.
Há uma variedade de métodos disponíveis para medir a afinida-de de uma interação de anticorpo-antígeno, mas relativamente poucos paradeterminar constantes de taxa. A maioria dos métodos conta com anticorpode marcação ou antígeno, que inevitavelmente complicam as medições roti-neiras e introduzem incertezas nas quantidades medidas.
Ressonância de plasmon de superfície (SPR) como executadaem BIAcore oferece várias vantagens em métodos convencionais de medir aafinidade das interações de anticorpo-antígeno: (i) nenhum requerimentopara marcar anticorpo ou antígeno; (ii) anticorpos não necessitam ser purifi-cados com antecedência, sobrenadante de cultura de célula pode ser usadodiretamente; (iii) medições de tempo real, permitindo comparação semi-quantitativa rápida das interações de anticorpos monoclonais diferentes, sãopermitidas e são suficientes para muitos propósitos de avaliação; (iv) super-fície bioespecífica pode ser regenerada de forma que uma série de anticor-pos monoclonais diferentes possa ser facilmente comparada sob condiçõesidênticas; (v) procedimentos analíticos são completamente automatizada, esérie extensiva das medições pode ser executada sem intervenção do usuá-rio. BlAappIications Handbook, versão AB (reimpressa em 1998), BIACOREcódigo No. BR-1001-86; BIAtechnoIogy Handbook, versão AB (reimpressaem 1998), BIACORE código No. BR-1001-84.
Estudos de ligação com base em SPR requerem o membro deum par de ligação que seja imobilizado em uma superfície de sensor. O parde ligação imobilizado é referido como o ligante. O par de ligação na soluçãoé ,referido como o analito. Em alguns casos, o ligante está indiretamente li-gado à superfície através de ligação à outra molécula imobilizada que é refe-rida como a molécula capturadora. Resposta de SPR reflete uma alteraçãona concentração de massa na superfície detectora à medida que os analitosse ligam ou dissociam-se.
Com base em SPR, medições de BIAcore de tempo real monito-ram interações diretamente à medida que elas ocorrem. A técnica é bemadaptada para determinação de parâmetros cinéticos. Classificação de afini-dade comparativa é extremamente simples de executar, e ambas constantescinéticas e de afinidade podem ser derivadas dos dados de sensograma.
Quando o analito for injetado em um pulso distinto do outro ladode uma superfície do ligante, o sensograma resultante pode ser dividido emtrês fases essenciais: (i) Associação de analito com ligante durante a injeçãode amostra; (ii) Equilíbrio ou estado fixo durante a injeção de amostra, ondea taxa de ligação de analito é equilibrada através de dissociação do comple-xo; (iii) Dissociação de analito da superfície durante o fluxo de tampão.As fases de associação e dissociação fornecem informação so-bre a cinética de interação de ligação de analito (ka e kd, as taxas de forma-ção complexa e dissociação, kd/ka = KD). A fase de equilíbrio fornece infor-mação sobre a afinidade da interação de ligação de analito (KD).
Software de BIAevaIuation provê instalações inclusivas para a-juste de curva usando integração numérica e algoritmos de ajuste globais.Com análise adequada dos dados, taxa separada e constantes de afinidadepara interação podem ser obtidas de investigações de BIAcore simples. Afaixa de afinidades mensurável por esta técnica varia de modo muito vastode mM a pM.
Especificidade do epítopo é uma característica importante de umanticorpo monoclonal. Mapeamento de epítopo com BIAcore, em contrastecom as técnicas convencionais usando radioimunoensaio, ELISA ou outrosmétodos de adsorção de superfície, não requer marcação ou anticorpos puri-ficados, e permite testes de especificidade de sítios múltiplos usando umaseqüência de vários anticorpos monoclonais. Adicionalmente, númerosgrandes de análises podem ser processados automaticamente.
Experimentos de ligação em pares testam a habilidade de doisMAbs para ligar simultaneamente ao mesmo antígeno. MAbs direcionadoscontra epítopos separados ligar-se-ão independentemente, enquanto queMAbs direcionados contra epítopos idênticos ou estritamente relacionadosinterferirão com cada outra ligação. Estes experimentos de ligação com BIA-core são diretos para realizar.
Por exemplo, pode-se usar uma molécula de captura para ligar oprimeiro Mab, seguido seqüencialmente por adição de antígeno e o segundoMAb. Os sensogramas revelarão: 1. quanto do antígeno liga ao primeiroMab, 2. até que ponto o segundo MAb liga ao antígeno ligado à superfície, 3.se o segundo MAb não liga, se invertendo a ordem do teste em pares alteraos resultados.
Inibição do peptídeo é outra técnica usada para mapeamento deepítopo. Este método pode complementar os estudos de ligação em paresde anticorpo, e pode relatar epítopos funcionais para características estrutu-rais quando a seqüência primária do antígeno for conhecida. Os peptídeosou fragmentos de antígeno são testados quanto à inibição de ligação deMAbs diferentes ao antígeno imobilizado. Peptídeos que interferem com aligação de um MAb dado são assumidos ser estruturalmente relacionados aoepítopo definido por aquele MAb.
XI. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE ADMINISTRACAO
Métodos de preparar e administrar anticorpos específicos paraIGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos a um sujeito em ne-cessidade dos mesmos são bem conhecidos ou são facilmente determina-dos por aqueles versados na técnica. A rota de administração da moléculade ligação, por exemplo, ligação de polipeptídeo, por exemplo, anticorpo es-pecífico para IGF-1R ou fragmento imunoespecífico do mesmo, pode ser,por exemplo, oral, parenteral, através de inalação ou tópica. O termo paren-teral como aqui usado inclui, por exemplo, administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, retal ou vaginal. Emboratodas estas formas de administração sejam claramente contempladas comoestando dentro do escopo da invenção, uma forma para administração seriauma solução para injeção, em particular para injeção intravenosa ou intra-arterial ou gotejamento. Usualmente, uma composição farmacêutica ade-quada para injeção pode compreender um tampão (por exemplo tampão deacetato, fosfato ou citrato), um tensoativo (por exemplo polissorbato), opcio-nalmente um agente estabilizante (por exemplo albumina humana), etc. Po-rém, em outros métodos compatíveis com os ensinamentos aqui, as molécu-Las de ligação, por exemplo, polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticor-pos específicos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmospodem ser liberados diretamente no sítio da população celular adversa as-sim aumentando a exposição do tecido doente ao agente terapêutico.
Preparações para administração parenteral incluem soluções,suspensões, e emulsões aquosas ou não-aquosas estéreis. Exemplos desolventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetaistais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato deetila. Veículos aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensõesalcoólicas/aquosas, incluindo solução salina e meios tamponados. Na inven-ção em questão, os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, masnão são limitados a, 0,01-0,1 M e preferivelmente 0,05M tampão de fosfatoou 0,8 %solução salina. Outros veículos parenterais comuns incluem solu-ções de fosfato de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio,Ringer tratada com lactato, ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluemfluido e repositores de nutrientes, repositores de eletrólitos, tais como aque-les com base em dextrose de Ringer, e outros. Conservantes e outros aditi-vos podem também estar presentes tal como por exemplo, antimicrobianos,antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes e outros.
Mais particularmente, as composições farmacêuticas adequadaspara uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (onde solúvel em á-gua) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de solu-ções ou dispersões injetáveis estéreis. Em tais casos, a composição deveser estéril e deveria ser fluida na proporção que seringabilidade fácil exista.Deveria ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e de-veria ser preferivelmente preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solventeou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por e-xemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e outros), e mis-turas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, porexemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção dotamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoati-vos. Formulações adequadas para uso nos métodos terapêuticos reveladosaqui são descritas em Remington1S Pharmaceutical Sciences, Mack Publi-shing Co., 16§ ed. (1980).
Prevenção da ação de microorganismos pode ser alcançada porvários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clo-robutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e outros. Em muitos casos, serápreferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, taiscomo manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolon-gada das composições injetáveis pode ser provocada incluindo na composi-ção um agente de retardo de absorção, por exemplo, monoestearato de a-lumínio e gelatina.
Em todo caso, soluções injetáveis estéreis podem ser prepara-das incorporando um composto ativo (por exemplo, uma molécula de liga-ção, por exemplo, um polipeptídeo de ligação, por exemplo, um anticorpoespecífico para IGF-1R ou fragmento imunoespecífico do mesmo, por si sóou em combinação com outros agentes ativos) na quantidade requerida emum solvente apropriado com um ou uma combinação de componentes enu-merados aqui, como requerido, seguido por esterilização filtrada. Em geral,dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículoestéril contendo um meio de dispersão básico e os outros componentes re-queridos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação desoluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são seca-gem a vácuo e secagem por refrigeração, que rende um pó de um compo-nente ativo mais qualquer componente desejado adicional de uma soluçãopreviamente filtrada estéril do mesmo. As preparações para injeções sãoprocessadas, enchidas em recipientes tais como ampolas, sacos, garrafas,seringas ou frascos, e vedadas sob condições assépticas de acordo com osmétodos conhecidos na técnica. Também, as preparações podem ser empa-cotadas e vendidas na forma de um kit tal como aqueles descritos emU.S.S.N co-pendente. 09/259.337 (US-2002-0102208 A1) que é incorporadaaqui por referência em sua totalidade. Tais artigos de fabricação preferivel-mente têm marcações ou inserções de pacote que indicam que as composi-ções associadas são úteis para tratar um sujeito sofrendo de, ou predispostoa, distúrbios autoimunes ou neoplásticos.
Doses eficazes das composições da presente invenção, paratratamento de distúrbios hiperproliferativos como descritos aqui variam, de-pendendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração,sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um a-nimal, outras medicações administradas, e se o tratamento é profiláctico outerapêutico. Usualmente, o paciente é um ser humano mas mamíferos não-humanos incluindo mamíferos transgênicos podem também ser tratados.Dosagens de tratamento podem ser tituladas usando métodos rotineiros co-nhecidos àqueles de habilidade na técnica para otimizar segurança e eficá-cia.
Para tratamento de distúrbios hiperproliferativos com um anti-corpo ou fragmento do mesmo, a dosagem pode variar, por exemplo, decerca de 0.0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente 0,01 a 5 mg/kg (por exem-plo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.),do peso do corpo hospedeiro. Por exemplo dosagens podem ser 1 mg/kg dopeso do corpo ou 10 mg/kg do peso do corpo ou dentro da faixa de 1-10mg/kg, preferivelmente pelo menos 1 mg/kg. Doses intermediárias nas faixasacima são também intencionadas estar dentro do escopo da invenção. Taisdoses podem ser administradas diariamente aos sujeitos, em dias alternati-vos, semanalmente ou de acordo com qualquer outra horário determinadopor análise empírica. Um tratamento exemplar requer administração em do-sagens múltiplas em um período prolongado, por exemplo, de pelo menosseis meses. Regimes de tratamento exemplares adicionais requerem admi-nistração uma vez a cada duas semanas ou uma vez ao mês ou uma vez acada 3 a 6 meses. Horários de dosagem exemplares incluem 1-10 mg/kg ou15 mg/kg em dias sucessivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kgsemanalmente. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonaiscom especificidades de ligação diferentes são administrados simultanea-mente, em cujo caso a dosagem de cada anticorpo administrado enquadra-se nas faixas indicadas.
Anticorpos específicos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecí-ficos dos mesmos revelados aqui podem ser administrados em ocasiõesmúltiplas. Intervalos entre dosagens simples podem ser semanais, mensaisou anualmente. Intervalos podem também ser irregulares conforme indicadomedindo os níveis de sangue de polipeptídeo alvo ou molécula alvo no paci-ente. Em alguns métodos, dosagem é ajustada para alcançar uma concen-tração de polipeptídeo de plasma de 1-1000 μg/ml e em alguns métodos 25-300 μg/ml. Alternativamente, as moléculas de ligação podem ser administra-das como uma formulação de liberação contínua, em cujo caso administra-ção menos freqüente é requerida. Dosagem e freqüência variam, dependen-do da meia-vida do anticorpo no paciente. A meia-vida de uma molécula deligação pode também ser prolongada por meio de fusão com um polipeptí-deo ou metade estáveis, por exemplo, albumina ou PEG. Em geral, anticor-pos humanizados apresentam a meia-vida mais longa, seguido por anticor-pos quiméricos e anticorpos não-humanos. Em uma modalidade, as molécu-las de ligação da invenção podem ser administradas na forma não-conjugada. Em outra modalidade, as moléculas de ligação, por exemplo,polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos específicos para IGF-1Rou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos para o uso nos métodos reve-lados aqui, podem ser administradas múltiplas vezes na forma conjugada.Em ainda outra modalidade, as moléculas de ligação da invenção podem seradministradas na forma não-conjugada, depois na forma conjugada, ou vice-versa.
A dosagem e freqüência de administração podem variar, depen-dendo se o tratamento for profiláctico ou terapêutico. Em aplicações profilác-ticas, composições compreendendo anticorpos ou um coquetel dos mesmossão administradas a um paciente não já no estado de doença ou em um es-tado de pré-doença para intensificar a resistência do paciente. Uma tal quan-tidade é definida ser uma "dose eficaz profiláctica". Neste uso, as quantida-des precisas dependem novamente do estado de saúde do paciente e imu-nidade geral, mas em geral varia de 0,1 a 25 mg por dose, especialmente0,5 a 2,5 mg por dose. Uma dosagem relativamente baixa é administrada emintervalos relativamente infreqüentes em um período longo de tempo. Algunspacientes continuam recebendo tratamento para o resto de suas vidas.
Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta(por exemplo, de cerca de 1 a 400 mg/kg de molécula de ligação, por exem-plo, anticorpo por dose, com dosagens de 5 a 25 mg sendo mais comumenteusadas para radioimunoconjugados e doses mais altas para moléculas con-jugadas com citotoxina-fármaco) em intervalos relativamente curtos às vezesé requerida até a progressão da doença ser reduzida ou terminada, e prefe-rivelmente até que o paciente mostre melhora parcial ou completa dos sin-tomas da doença. Depois disso, a patente pode ser administrada em um re-gime profiláctico.
Em uma modalidade, um sujeito pode ser tratado com uma mo-lécula de ácido nucléico que codifica um anticorpo específico para IGF-1Rou fragmento imunoespecífico do mesmo (por exemplo, em um vetor). Do-ses para ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos variam de cerca de10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 pg a 10 mg, ou 30-300 pg DNA por pacien-te. Doses para vetores virais infecciosos variam de 10-100, ou mais, virionspor dose.
Agentes terapêuticos podem ser administrados por meios paren-terais, tópicos, intravenosos, orais, subcutâneos, intraarteriais, intracrania-nos, intraperitoneais, intranasais ou intramusculares para tratamento profi-láctico e/ou terapêutico. Em alguns métodos, agentes são diretamente inje-tados em um tecido particular onde células de expressão de IGF-1R acumu-laram-se, por exemplo injeção intracraniana. Injeção intramuscular ou infu-são intravenosa são preferidas para administração do anticorpo. Em algunsmétodos, anticorpos terapêuticos particulares são diretamente injetados nocrânio. Em alguns métodos, os anticorpos são administrados como umacomposição ou dispositivo de liberação contínua, tal como um dispositivo deMedipad™.
Anticorpos de IGF-1R ou fragmentos dos mesmos da invençãopodem ser opcionalmente administrados em combinação com outros agen-tes que são eficazes no tratamento do distúrbio ou condição em necessidadede tratamento (por exemplo, profiláctico ou terapêutico).
Dosagens de tratamento simples eficazes (isto é, quantidadesterapeuticamente eficazes) de polipeptídeos de ligação marcados com 90Yvariam de entre cerca de 5 e cerca de 75 mCi, mais preferivelmente entrecerca de 10 e cerca de 40 mCi. Dosagens ablativas eficazes de não-medulade tratamento simples de anticorpos marcados com 131I variam de entre cer-ca de 5 e cerca de 70 mCi, mais preferivelmente entre cerca de 5 e cerca de40 mCi. Dosagens ablativas eficazes de tratamento simples (isto é, poderequerer transplantação de medula óssea autóloga) de anticorpos marcadoscom 131I variam de entre cerca de 30 e cerca de 600 mCi, mais preferivel-mente entre cerca de 50 e menos que cerca de 500 mCi. Junto com um anti-corpo quimérico, devido à meia-vida circulante longa vis-a-vis anticorpos mu-rinos, um dosagens ablativas eficazes de não-medula de tratamento simplesde anticorpos quiméricos marcados com iodo-131 variam de entre cerca de5 e cerca de 40 mCi, mais preferivelmente menos que cerca de 30 mCi. Cri-térios de imageamento para, por exemplo, marcação com 111In são tipica-mente menos que cerca de 5 mCi.
Embora tenha sido ganho muito experiência clínica com 131I e90Y, outras radiomarcações são conhecidas na técnica e foram usadas parapropósitos similares. Ainda outros radioisótopos são usados para imagea-mento. Por exemplo, radioisótopos adicionais que são compatíveis com oescopo da invenção imediata incluem, mas não são limitados a, 123I1125I, 32P,57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I, 197Hg, 203Pb,206Bi, 177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 225Ac,211At, e 213Bi. Neste respeito, emissores alfa, gama e beta são todos compa-tíveis com a invenção imediata. Também, em vista da revelação imediata ésubmetido que alguém versado na técnica poderia facilmente determinar queradionuclídeos são compatíveis com um curso selecionado de tratamentosem experimentação imprópria. Para este fim, os radionuclídeos adicionaisque já foram usados em diagnose clínica incluem 125I, 123I1 99Tc, 43K, 52Fe,67Ga, 68Ga, como também 111In. Anticorpos têm também sido marcados comuma variedade de radionuclídeos para uso potencial em imunoterapia alve-jada (Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987)). Estes radionu-clídeos incluem 188Re e 186Re como também 199Au e 67Cu menos. Patente U.S. No. 5.460.785 fornece dados adicionais com relação a tais radioisótopose é incorporada aqui por referência.
Se ou não anticorpos específicos para IGF-1R ou fragmentosimunoespecíficos dos mesmos revelados aqui são usados em uma formaconjugada ou não-conjugada, será apreciado que uma vantagem principalda presente invenção é a habilidade para usar estas moléculas em pacientesmielo-suprimidos, especialmente aqueles que estão sofrendo, ou sofreu, te-rapias adjuntas tais como radioterapia ou quimioterapia. Ou seja, o perfil deliberação benéfico (isto é, tempo de permanência no soro relativamente cur-to, afinidade de ligação alta e localização intensificada) das moléculas astorna particularmente úteis para tratar pacientes que tiveram as reservas demedula vermelha reduzidas e são sensíveis a mielotoxicidade. Nesta consi-deração, o único perfil de liberação das moléculas as torna muito eficazespara a administração de conjugados radiomarcados para pacientes de cân-cer mielo-suprimidos. Como tal, os anticorpos específicos para IGF-1R oufragmentos imunoespecíficos dos mesmos revelados aqui são úteis em umaforma conjugada ou não-conjugada em pacientes que previamente sofreramterapias adjuntas tais como radiação de feixe externo ou quimioterapia. Emoutras modalidades preferidas, moléculas de ligação, por exemplo, polipep-tídeos de ligação, por exemplo, anticorpos específicos para IGF-1R ou frag-mentos imunoespecíficos dos mesmos (novamente em uma forma conjuga-da ou não-conjugada) podem ser usados em um regime terapêutico combi-nado com agentes quimioterapêuticos. Aqueles versados na técnica aprecia-rão que tais regimes terapêuticos podem compreender a administração se-qüencial, simultânea, concorrente ou co-extensiva dos anticorpos reveladosou outras moléculas de ligação e um ou mais agentes quimioterapêuticos.Modalidades particularmente preferidas deste aspecto da invenção compre-enderão a administração de um polipeptídeo de ligação radiomarcado.
Embora anticorpos específicos para IGF-1R ou fragmentos imu-noespecíficos dos mesmos possam ser administrados como descrito imedia-tamente acima, deve ser enfatizado que em outras modalidades moléculasde ligação conjugadas e não-conjugadas podem ser administradas do con-trário em pacientes saudáveis como um agente terapêutico de primeira linha.Em tais modalidades, as moléculas de ligação podem ser administradas apacientes tendo reservas de medula vermelha normais ou médias e/ou parapacientes que não têm, e não estão, sofrendo terapias adjuntas tais comoradiação de feixe externo ou quimioterapia.
Porém, como debatido acima, as modalidades selecionadas dainvenção compreendem a administração de anticorpos específicos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos para pacientes mielo-suprimidos ou em combinação ou conjunção com uma ou mais terapias ad-juntas tais como radioterapia ou quimioterapia (isto é um regime terapêuticocombinado). Como aqui usado, a administração de anticorpos específicospara IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos em conjunção oucombinação com uma terapia adjunta significa administração seqüencial,simultânea, co-extensiva, simultânea, concomitante ou contemporânea ouaplicação da terapia e das moléculas de ligação reveladas. Aqueles versa-dos na técnica apreciarão que a administração ou aplicação dos vários com-ponentes do regime terapêutico combinado pode ser com hora marcada pa-ra intensificar a eficácia geral do tratamento. Por exemplo, agentes quimiote-rapêuticos poderiam ser administrados em cursos padrões bem conhecidosde tratamento seguido dentro de algumas semanas por radioimunoconjuga-dos descritos aqui. Inversamente, moléculas de ligação conjugadas com ci-totoxina poderiam ser administradas intravenosamente seguido por radiaçãode feixe externo localizada no tumor. Em ainda outras modalidades, molécu-las de ligação podem ser administradas simultaneamente com um ou maisagentes quimioterapêuticos selecionados em uma única visita ao consultório.Artesão versado (por exemplo oncologista experiente) seria facilmente capazde discernir regimes terapêuticos combinados eficazes sem experimentaçãoimprópria com base na terapia adjunta selecionada e nos ensinamentos daespecificação imediata.
Nesta consideração, será apreciado que a combinação de umamolécula de ligação (com ou sem citotoxina) e o agente quimioterapêuticopode ser administrado em qualquer ordem e dentro de qualquer estrutura dehorário que fornece um benefício terapêutico ao paciente. Ou seja, o agentequimioterapêutico e anticorpo específico para IGF-1R ou fragmento imuno-específico do mesmo, pode ser administrado em qualquer ordem ou simulta-neamente. Em modalidades selecionadas, os anticorpos específicos paraIGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos da presente invençãoserão administrados a pacientes que previamente sofreram quimioterapia.Em ainda outras modalidades, anticorpos específicos para IGF-1R ou frag-mentos imunoespecíficos dos mesmos da presente invenção serão adminis-trados substancialmente de modo simultâneo ou simultaneamente com otratamento quimioterapêutico. Por exemplo, ao paciente pode ser dada amolécula de ligação enquanto sofrendo um curso de quimioterapia. Em mo-dalidades preferidas a molécula de ligação será administrada dentro de 1ano de qualquer agente ou tratamento quimioterapêutico. Em outras modali-dades preferidas, o polipeptídeo será administrado dentro de 10, 8, 6, 4, ou 2meses de qualquer agente ou tratamento quimioterapêutico. Em ainda ou-tras modalidades preferidas, a molécula de ligação será administrada dentrode 4, 3, 2 ou 1 semana de qualquer agente ou tratamento quimioterapêutico.Em ainda outras modalidades, a molécula de ligação será administrada den-tro de 5, 4, 3, 2 ou 1 dia do agente ou tratamento quimioterapêutico selecio-nado. Também ser apreciado que os dois agentes ou tratamentos podem seradministrados ao paciente dentro de uma questão de horas ou minutos (istoé substancialmente de forma simultânea).
Além disso, de acordo com a presente invenção um pacientemielossuprimido será retido para significar qualquer paciente exibindo conta-gens de glóbulos diminuídas. Aqueles versados na técnica apreciarão quehá vários parâmetros de contagem de glóbulos convencionalmente usadoscomo indicadores clínicos de mielossupressão e alguém pode facilmentemedir até que ponto a mielossupressão está ocorrendo em um paciente. E-xemplos de técnica aceitas de medições de mielossupressão são ContagemAbsoluta de Neutrófilos (ANC) ou contagem de plaquetas. Tal mielossupres-são ou mieloablação parcial podem ser um resultado de vários distúrbios oudoenças bioquímicas ou, mais provavelmente, como o resultado da quimio-terapia ou radioterapia anterior. Neste respeito, aqueles versados na técnicaapreciarão que pacientes que sofreram quimioterapia tradicional tipicamenteexibem reservas de medula vermelha reduzidas. Como debatido acima, taissujeitos freqüentemente não pode ser tratados usando níveis de citotoxinaótimos (isto é, radionuclídeos) devido aos efeitos colaterais inaceitáveis taiscomo anemia ou imunossupressão, que resultam em mortalidade aumenta-da ou morbidez.
Mais especificamente anticorpos específicos para IGF-1R conju-gados ou não-conjungados ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos dapresente invenção podem ser eficazmente usados para tratar pacientes ten-do ANCs menores que cerca de 2000/mm3 ou contagens de plaquetas me-nores que cerca de 150.000/mm3. Mais preferivelmente anticorpos específi-cos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos da presenteinvenção podem ser usados tratar pacientes tendo ANCs de menos que cer-ca de 1500/mm3, menos que cerca de 1000/mm3 ou até mesmo mais prefe-rivelmente menos que cerca de 500/mm3. Similarmente, anticorpos específi-cos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos da presenteinvenção podem ser usados para tratar pacientes tendo uma contagem deplaquetas de menos que cerca de 75.000/mm3, menos que cerca de50.000/mm3 ou até mesmo menos que cerca de 10.000/mm3. Em um sentidomais geral, aqueles versados na técnica facilmente poderão determinarquando um paciente é mielossuprimido usando as diretrizes e procedimen-tos implementados pelo governo.
Como indicado acima, muitos pacientes mielossuprimidos sofre-ram cursos de tratamento incluindo quimioterapia, radioterapia de implanteou radioterapia de feixe externo. No último caso, uma fonte de radiação ex-terna é para irradiação local de uma malignidade. Para métodos de implan-tação de radioterapia, reagentes radioativos são cirurgicamente localizadosdentro da malignidade, assim seletivamente irradiando o sítio da doença. Emtodo caso, anticorpos específicos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecífi-cos dos mesmos da presente invenção podem ser usados para tratar distúr-bios em pacientes que exibem mielossupressão independente da causa.
Nesta consideração também será apreciado que anticorpos es-pecíficos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos da pre-sente invenção podem ser usados em conjunção ou combinação com qual-quer agente ou agentes quimioterapêuticos (por exemplo para fornecer umregime terapêutico combinado) que elimina, reduz, inibe ou controla o cres-.cimento de células neoplásticas in vivo. Como debatido, tais agentes fre-qüentemente resultam na redução de reservas de medula vermelha. Estaredução pode ser compensada, ao todo ou em parte, pela mielotoxicidadediminuída dos compostos da presente invenção que vantajosamente permiteo tratamento agressivo de neoplasias em tais pacientes. Em outras modali-dades, imunoconjugados radiomarcados revelados aqui podem ser usadoseficazmente com radiossensibilizadores que aumentam a suscetibilidade dascélulas neoplásticas para radionuclídeos. Por exemplo, compostos de radio-ssensibilização podem ser administrados após a molécula de ligação radio-marcada ser grandemente clareada da circulação sangüínea mas aindapermaneceu em níveis terapeuticamente eficazes no sítio do tumor ou tumo-res.
Com respeito a estes aspectos da invenção, agentes quimiote-rapêuticos exemplares que são compatíveis com a invenção imediata inclu-em agentes de alquilação, alcalóides de vinca (por exemplo, vincristina evinblastina), procarbazina, metotrexato e prednisona. A combinação deMOPP de quatro fármacos (mecletamino (mostarda de nitrogênio), vincristi-na (Oncovina), procarbazina e prednisona) é muito eficaz no tratamento vá-rios tipos de Iinfoma e compreende uma modalidade preferida da presenteinvenção. Em pacientes resistentes a MOPP, combinações de ABVD (porexemplo, adriamicina, bleomicina, vinblastina e dacarbazina), ChIVPP (clo-rambucil, vinblastina, procarbazina e prednisona), CABS (lomustina, doxor-rubicina, bleomicina e estreptozotocina), MOPP mais ABVD, MOPP maisABV (doxorrubicina, bleomicina e vinblastina) ou BCVPP (carmustina, ciclo-fosfamida, vinblastina, procarbazina e prednisona) podem ser usadas. Ar-nold S. Freedman e Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, em Harrison'sPrincipies of Internai Medicine 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher et aí., eds., 13ãed. 1994) e V. T. DeVita et al., (1997) e as referências nele citadas para do-seamento e programação padrões. Estas terapias podem ser usadas inalte-radas, ou alteradas quando necessário para um paciente particular, emcombinação com um ou mais anticorpos específicos para IGF-1R ou frag-mentos imunoespecíficos dos mesmos da presente invenção.
Regimes adicionais que são úteis no contexto da presente in-venção incluem o uso de agentes de alquilação simples tais como ciclofos-famida ou clorambucila, ou combinações tais como CVP (ciclofosfamida,vincristina e prednisona), CHOP (CVP e doxorrubicina), C-MOPP (ciclofos-famida, vincristina, prednisona e procarbazina), CAP-BOP (CHOP mais pro-carbazina e bleomicina), m-BACOD (CHOP mais metotrexato, bleomicina eleucovorina), ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ci-clofosfamida, etoposide e leucovorina mais MOPP padrão), ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposide, citarabina,bleomicina, vincristina, metotrexato e leucovorina) e MACOP-B (metotrexato,doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona de dose fixa, bleomici-na e leucovorina). Aqueles versados na técnica poderão facilmente determi-nar as dosagens e programação padrões para cada um destes regimes.CHOP tem também sido combinado com bleomicina, metotrexato, procarba-zina, mostarda de nitrogênio, arabinosídeo de citosina e etoposide. Outrosagentes quimioterapêuticos compatíveis incluem, mas não são limitados a,2-clorodeoxiadenosina (2-CDA), 2'-deoxicoformicina e fludarabina.
Para pacientes com malignidades de grau intermediário e alto,que falharam em alcançar remissão ou reincidência, terapia de resgate éusada. Terapias de resgate empregam fármacos tais como arabinosídeo decitosina, cisplatina, carboplatina, etoposide e ifosfamida dados sozinhos ouem combinação. Em formas de recaída ou agressivas de certos distúrbiosneoplásticos, os protocolos a seguir são freqüentemente usados: IMVP-16(ifosfamida, metotrexato e etoposide), MIME (metil-amordace, ifosfamida,metotrexato e etoposide), DHAP (dexametasona, citarabina de dose alta ecisplatina), ESHAP (etoposide, metilpredisolona, citarabina de HD, cisplati-na), CEPP(B) (ciclofosfamida, etoposide, procarbazina, prednisona e bleo-micina) e cAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina e prednisona) cada umcom taxas de doseamento e horários bem conhecidos.
A quantidade de agente quimioterapêutico a ser usado em com-binação com os anticorpos específicos para IGF-1R ou fragmentos imuno-específicos dos mesmos da presente invenção pode variar por sujeito oupode ser administrado de acordo com o que é conhecido na técnica. Videpor exemplo, Bruce A Chabner et ai, Antineoplastic Agents, em Goodman &GiIman1S The Pharmacological Basis of Therapeuties 1233-1287 (Joel G.Hardman et ai, eds., 9ê ed. (1996)).
Em outra modalidade, um anticorpo específico para IGF-1R oufragmento imunoespecífico do mesmo da presente invenção é administradojunto com um biológico. Biológicos úteis no tratamento de cânceres são co-nhecidos na técnica e uma molécula de ligação da invenção pode ser admi-nistrada, por exemplo, junto com tais biológicos conhecidos.
Por exemplo, a FDA aprovou os biológicos a seguir para o tra-tamento de câncer de mama: Herceptin® (trastuzumab, Genentech Inc., SãoFrancisco do Sul, CA; um anticorpo monoclonal humanizado que tem ativi-dade anti-tumor em câncer de mama HER2-positivo); Faslodex® (fulvestrant,AstraZeneca Pharmaceuticals, LP, Wilmington, DE; um antagonista de re-ceptor de estrogênio usado para tratar câncer de mama); Arímidex® (anas-trozol, AstraZeneca Pharmaceuticals, LP; um inibidor de aromatase não-esteroidal que bloqueia aromatase, uma enzima necessária para fazer es-trogênio); Aromasin® (exemestane, Pfizer Inc., Nova Iorque, NY; um inativa-dor de aromatase irreversível, esteróide usado no tratamento de câncer demama); Femara® (letrozol, Novartis Pharmaceuticals, Hanover Oriental, NJ;um inibidor de aromatase não-esteroidal aprovado pela FDA para tratar cân-cer de mama); e Nolvadex® (tamoxifeno, AstraZeneca Pharmaceuticals, LP;um antiestrogênio não-esteroidal aprovado pela FDA para tratar câncer demama). Outros biológicos com os quais as moléculas de ligação da invençãopodem ser combinadas incluem: Avastin™ (bevacizumab, Genentech Inc.; a primeira terapia aprovada pela FDA projetada para inibir angiogênese); eZevalin® (ibritumomab tiuxetan, Biogen Idec, Cambridge, MA; um anticorpomonoclonal radiomarcado correntemente aprovado para o tratamento delinfomas de células B).
Além disso, a FDA aprovou os biológicos a seguir para o trata-mento de câncer colorretal: Avastin™; Erbitux™ (cetuximab, ImCIone Sys-tem Inc., Nova lorque, NY, e Bristol-Myers Squibb, Nova Iorque, NY; é umanticorpo monoclonal direcionado contra o receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR)); Gleevec® (mesilato de imatinib; um inibidor de proteínacinase); e Ergamisol® (cloridrato de levamisol, Janssen Pharmaceutica Pro-ducts, LP1 Titusville, NJ; um imunomodulador aprovado pela FDA em 1990como um tratamento adjuvante em combinação com 5-fluorouracil após res-seção cirúrgica em pacientes com câncer de cólon de Estágio C de Dukes).
Para o uso em tratamento de terapias correntemente aprovadasde Linfomas de Não-Hodgkin incluem: Bexxar® (tositumomab e tositumomabde iodo 1-131, GIaxoSmithKIina, Researcu Triangle Park, NC; um tratamentode multi-etapas que envolve um anticorpo monoclonal de camundongo (tosi-tumomab) ligado a uma molécula radioativa (iodo 1-131)); Intron® A (interfe-rona alfa-2b, Schering Corporation, Kenilworth, NJ; um tipo de interferonaaprovada para o tratamento do Iinfoma de não-Hodgkin folicular junto comquimioterapia de combinação contendo antraciclina (por exemplo, ciclofos-famida, doxorrubicina, vincristina, e prednisona [CHOP])); Rituxan® (rituxi-mab, Genentech Inc., São Francisco do Sul, CA, e Biogen Idec, Cambridge,MA; um anticorpo monoclonal aprovado para o tratamento do Iinfoma denão-Hodgkin; Ontak® (denileucin diftitox, Ligand Pharmaceuticals Inc., SanDiego, CA; uma proteína de fusão que consiste em um fragmento de toxinade difteria geneticamente fundido com interleucina-2); e Zevalin® (ibritumo-mab tiuxetan, Biogen Idec; um anticorpo monoclonal radiomarcado aprovadopela FDA para o tratamento dos Iinfomas de não-Hodgkin de célula B).
Para tratamento de Leucemia, biológicos exemplares que podemser usados em combinação com as moléculas de ligação da invenção inclu-em Gleevec®; Campath®-1 H (alemtuzumab, Berlex Laboratories, Richmond,CA; um tipo de anticorpo monoclonal usado no tratamento de Leucemia Iin-focítica crônica). Além disso, Genasense (oblimersen, Genta Corporation,Berkley Heights, NJ; uma terapia de anti-sentido de BCL-2 sob desenvolvi-mento para tratar leucemia pode ser usada (por exemplo, sozinho ou emcombinação com um ou mais fármacos de quimioterapia, tais como fludara-bina e ciclofosfamida) pode ser administrada com as moléculas de ligaçãoreivindicadas.
Para o tratamento de câncer de pulmão, biológicos exemplarincluem Tarceva™ (erlotinib HCL, OSI Pharmaceuticals Inc., Melville, NY;uma molécula pequena projetada para alvejar a via do receptor do fator decrescimento epidérmico humano 1 (HER1)).
Para o tratamento de mieloma múltiplo, biológicos exemplaresincluem Velcade® Velcade (bortezomib, Milenum Pharmaceuticals, Cam-bridge MA; um inibidor de proteassoma). Biológicos adicionais incluem Tha-lidomid® (talidomida, Clegene Corporation, Warren, NJ; um agente imuno-modulador e parece ter ações múltiplas, incluindo a habilidade para inibir ocrescimento e sobrevivência de células de mieloma e anti-angiogênese).
Outros biológicos exemplares incluem MOAB IMC-C225, desen-volvido por ImCIone Systems, Inc., Nova Iorque, NY.
Como previamente debatido, anticorpos específicos para IGF-1Rou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos da presente invenção, ou re-combinantes dos mesmos podem ser administrados em uma quantidadefarmaceuticamente eficaz para o tratamento in vivo de distúrbios hiperprolife-rativos mamíferos. Nesta consideração, será apreciado que os anticorposrevelados serão formulados para facilitar a administração e promover a es-tabilidade do agente ativo. Preferivelmente, as composições farmacêuticasde acordo com a presente invenção compreendem um veículo farmaceuti-camente aceitável, não-tóxico, estéril tal como tampões salinos, não-tóxicosfisiológicos, conservantes e outros. Para o propósito da aplicação imediata,uma quantidade farmaceuticamente eficaz de anticorpos específicos paraIGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos da presente invenção,ou recombinante dos mesmos, conjugados ou não-conjugados com um a-gente terapêutico, será detida para significar uma quantidade suficiente paraalcançar ligação eficaz a um alvo e alcançar um benefício, por exemplo, paramelhorar os sintomas de uma doença ou distúrbio ou detectar uma substân-cia ou uma célula. No caso de células tumorais, a molécula de ligação prefe-rivelmente será capaz de interagir com antígenos imunorreativos seleciona-dos em células neoplásticas ou imunorreativas, ou em células não-neoplásticas, por exemplo, células vasculares associadas às células neo-plásticas e provê um aumento na morte daquelas células. Claro que, ascomposições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradasem doses simples ou múltiplas para fornecer uma quantidade farmaceutica-mente eficaz da molécula de ligação.
De acordo com o escopo da revelação presente, os anticorposespecíficos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos dapresente invenção podem ser administrados a um animal humano ou outrode acordo com os métodos acima mencionados de tratamento em umaquantidade suficiente para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico. Osanticorpos específicos para IGF-1R ou fragmentos imunoespecíficos dosmesmos da presente invenção podem ser administrados a tal animal huma-no ou outro em uma forma de dosagem convencional preparada combinandoo anticorpo da invenção com um veículo ou diluente farmaceuticamente a-ceitável convencional de acordo com as técnicas conhecidas. Será reconhe-cido por alguém de habilidade na técnica que a forma e caráter do veículo oudiluente farmaceuticamente aceitável são ditados pela quantidade de com-ponente ativo com o qual será combinado, a rota de administração e outrasvariáveis bem conhecidas. Aqueles versados na técnica também apreciarãoque um coquetel compreendendo uma ou mais espécies de moléculas deligação de acordo com a presente invenção pode provar ser particularmenteeficaz.
A prática da presente invenção empregará, a menos que do con-trário indicado, técnicas convencionais de biologia celular, cultura de célula,biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante, eimunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas sãoexplicadas completamente na literatura. Vide, por exemplo, Molecular Clo-ning A Laboratory Manual, 2- Ed., Sambrook et ai, ed., Cold Spring HarborLaboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambro-ok et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, Nova Iorque (1992), DNACloning, D. N. Glover ed., Volumes I e Il (1985); Oligonucleotide Synthesis,M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. Pat. U.S. No: 4.683.195; Nucleic Acid Hy-bridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription AndTranslation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture OfAnimaI Cel-ls, R. I. Freshney, Alan R. Liss1 Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);o tratado, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N. Y.; Gene Trans-fer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller e Μ. P. Calos eds., Cold SpringHarbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155 (Wu etaí. eds.); Immunochemieal Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer eWalker, eds., Aeademic Press, London (1987); Handbook Of ExperimentalImmunology, Volumes l-IV, D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds., (1986); Ma-nipuiating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N. Y., (1986); e em Ausubel et al., Current Protocols in Mo-lecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).
Princípios gerais de engenharia de anticorpos são expostos emAntibody Engineering, 2- edição, C. A. K. Borrebaeck, Ed., Oxford Univ.Press (1995). Princípios gerais de engenharia de proteína são expostos emProtein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al., Eds., IRLPress na Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995). Princípios gerais de liga-ção de anticorpos e anticorpo-hapteno são expostos em: Nisonoff, A., Mole-cular Immunology, 2- ed., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); eSteward, M. W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman e Hall1Nova Iorque, NY (1984). Adicionalmente, métodos padrões em imunologiaconhecidos na técnica e não especificamente descritos são em geral segui-dos como em Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NovaIorque; Stites et al. (eds), Basic and Clinicai -Immunology (8- ed.), Appleton& Lange, Norwalk, CT (1994) e Mishell e Shiigi (eds), Selected Methods inCellular Immunology, W. H. Freeman and Co., Nova Iorque (1980).
Trabalhos de referência padrões expondo os princípios gerais deimunologia incluem Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons,Nova Iorque; Klein, J., Immunology; The Science of Self-Nonself Discrimina-tion, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1982); Kennett, R., et al., eds., Mono-clonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Ple-num Press, Nova Iorque (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Tech-nology" em Burden, R., -et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology, Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby Immu-nology A- ed. Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt e Barbara A. Os-borne, H. Freemand & Co. (2000); Roitt, I., Brostoff, J. e Male D., Immunol-ogy 6- ed. Londres: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. e Lichtman, A., Cellu-lar and Molecular Immunology Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division(2005); Kontermann e Dubel, Antibody Engineering, Springer Verlan (2001);Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold SpringHarbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow e Lane,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffen-bach e Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003).
Todas as referências citadas acima, como também todas as re-ferências citadas aqui, são incorporadas aqui por referência em suas totali-dades.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1
SELEÇÃO DE Fabs ESPECÍFICOS PARA IGF-1R DE BIBLIOTECAS DEFAGO
Ectodomínio de IGF-1R humano recombinante foi usado paratriar uma biblioteca de Fab de fagemídeo puro humano contendo 3,5 χ 1010clones únicos (Hoet, R. M., et al. Nat Biotechnol. 23(3):344-8 (2005), ("Hoetet al".) que é incorporado aqui por referência em sua totalidade). Dois braçosde panning distintos foram seguidos usando proteína de IGFIR-His eIGFIR-Fc biotinilado. As proteínas foram capturadas em contas magnéticasrevestidas com estreptavidina antes da incubação com a biblioteca de fago.No caso de IGFIR-Fc, um anticorpo de anti-Fc biotinilado foi capturado nascontas magnéticas, seguido por captura da proteína de fusão de Fc. Sele-ções foram executadas como descrito em Hoet et al. Após 3 ciclos de pan-ning, o coto de gene Ill de 479 bp foi removido através de digestão de MIul,e o vetor foi religado para expressão de Fab solúvel em células de TG1.Análise de ELISA de 920 clones do braço de IGF1 R-his biotinilado rendeu593 clones positivos, contendo 33 seqüências únicas. Análise de ELISA de920 clones do braço de IGFIR-Fc rendeu 163 clones positivos, contendo 12seqüências únicas. Análise de seqüência de todos os clones determinou 12clones foram isolados em ambos os braços da estratégia de panning. Osclones únicos foram purificados e ligação foi reconfirmada para o ectodomí-nio de IGF-1R humano recombinante por ELISA como também células 3T3estavelmente transfeccionadas com IGF-1R humano de comprimento total(FIGURA 1A & 1B). Com base nos dados de ligação, 6 dos 12 clones únicosisolados foram selecionados em ambos os braços para análise adicional.EXEMPLO 2
ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DE Fabs PARA IGF-1R EXPRESSO EM CÉLU-
LAS TUMORAIS.
A habilidade dos Fabs para ligar ao IGF-1R do tipo selvagem foideterminada através de fluxocitometria usando Linhagem tumoral de célulade MCF-7.
Células MCF-7 (Adenocarcinoma de Mama Humana de NCI)foram separadas 24 horas antes da organização do ensaio para obter 70%de monocamada confluente. Habitualmente, a linhagem celular de MCF-7foi mantida dentro de 20 passagens. As células foram estimuladas com tam-pão de dissociação de célula (Catálogo de Gibco #13151-014), contadas,lavadas e ajustadas para 1x106 células/ml e um ml de células foi depois adi-cionado a cada tubo (tubo de 12x75mm, catálogo de Falcão #352054). Célu-las foram empelotadas e o sobrenadante removido por centrifugação a 1200rpm por 5 min e 100 μΙ de anticorpos diluídos foram depois adicionados àpelota de células. Fabs purificados foram testados a uma concentração inici-al de ou 210 ou 60 pg/ml com 1:3 diluições em tampão de FACS, até 0,001pg/ml. Tampão de FACS usado ao longo do ensaio foi PBS (semCa++/Mg++) contendo 1 %BSA (Catálogo de Sigma #A-7906) e 0,1 %Azidade Sódio (Catálogo de Sigma #S2002). Como um controle positivo IR3 umanticorpo murino (Ab-1; Calbiochem #GR11L) foi usado. As amostras foramdeixadas incubar em gelo durante 1 hora e 15 minutos depois lavadas com 2ml de tampão de FACS e centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos a 49C. O sobrenadante foi aspirado e 100 μΙ do anticorpo de detecção secundá-rio foram adicionados a cada tubo correspondente no tampão de FACS. A-mostras foram depois incubadas por 30 minutos em gelo, na escuridão. Ascélulas foram lavadas como descrito acima, depois, re-suspensas em 250 μΙde tampão de FACS por tubo/amostra.
Fabs ligados à célula foram detectados usando IgG anti-humanade cabra específica para fragmento de F(ab')2 purificado por afinidade conju-gado com FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratory, catálogo #109-096-006; usado a 5 pg/ml), enquanto o anticorpo de controle murino positivo foidetectado usando a IgG de anti-camundongo de cabra de conjugado comFITC de F(ab')2 (H + L) (Jackson ImmunoResearch, catálogo #115-096-062;usado a 5 Mg/ml). Células foram tingidas para determinação de células vivascom solução de tingimento de Iodeto de Propídio (PI para exclusão das célu-las mortas; catálogo de BD Pharmingen #51-66211E ou 556463; usado a1:500 final no tampão de FACS). As amostras foram operadas no instrumen-to de FACSCaIibur (Becton Dickinson) com 10.000 eventos vivos colhidospor amostra. Análise dos dados foi feita usando software GraphPad Prismversão 4.0 (www.graphpad.com) (GraphPad Software, Inc., 11452 El CaminoReal, #215, San Diego, CA 92130 USA).
Uma vez amostras foram operadas e as médias geométricasdeterminadas, concentração de anticorpo (eixo X) vs. média geométrica (ei-xo Y) foi representada em gráfico para o Iog10, usando programa de repre-sentação em gráfico Graphpad Prim (Prism Graph). Conjuntos de dados fo-ram depois transformados (conjunto de dados de valor X = concentração deanticorpo) para X = Log(X) e representados em gráfico usando um ajuste decurva de regressão não-linear, dose-resposta sigmoidal. Valores de EC50 evalores de R2 foram gerados usando o software Prism Graph.
Todos os 6 Fabs mostraram atividade de ligação boa para IGF-1R do tipo selvagem expressado em células tumorais de MCF-7 (FIGURA2). O EC50 da ligação variou entre 9 a 42 nM (Tabela 3).
EXEMPLO 3
INIBICÂO DA LIGAÇÃO DE LIGANDO A IGF-1R POR Fabs.
A habilidade dos Fabs para bloquear a ligação de IGF-1 e Iigan-tes de IGF-2 a IGF-1R foi determinada usando um radioimunoensaio (RIA).210Ensaio de bloqueio de Iigante (RIA). IGF-1 humano recombinan-te (Cat #291-G1), IGF-2 (Cat #292-G2), insulina (Cat #Custom02), Receptorde Insulina Humano (Cat #1544-1R) foram comprados de R&D Systems,Inc., Mineápolis, MN. Insulina (Arg-lnsulina, Cat #01-207) foi comprada deUpstate Cell Signaling Solutions (Lake Placid, NY (agora parte de Millipore,Concord, MA (USA)). 125NrhIGF-I (Cat #IM172), 125l-rhlGF-2 (Cat #IM238) e125l-rhlnsulina (Cat #IM166) foram comprados de Amersham Biosciences(Piscataway, NJ). IgG anti-humana de cabra de AffiPure1 fragmento de anti-corpos específicos para Fcy (Cat #109-005-098, Jackson ImmunoResearch,West Grove, PA) foram usados para captura de IGF-IR-Fc. Como anticorpode detecção, IgG anti-camundongo de cabra HRP (Cat #1030-05, SouthernBiotech Birmingham, AL) foi usado.
Como controles positivos para bloquear IGF-1 e IGF-2, IR3 (Ab-1, Cat. #GR11LSP5, Calbiochem, La Jolla, CA) e 1H7 (Monoclonal de Ca-mundongo específico para cadeia α de IGF-1 R, sc-461, IgGI Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA) foram respectivamente usados. Anticorposespecíficos para a subunidade α do receptor de insulina humana, Clone 83-14, (Cat #AHR0221, Biosource International, Inc., Camarillo, CA) e o 47-9(Cat #E55502M, Biodesign International, Saco, ME) foram usados como blo-queio dos controles positivos dos experimentos de ligação do receptor deinsulina-insulina. Proteína de fusão de IGF-IR-Fc recombinante foi produzi-da em Biogen Idec (Cambridge, MA).
Como anticorpos de controles negativos de camundongo equipa-rados com isótipo, 2B8 (a-CD20.lgGi murino) e 2B8 mkm.G2a (MAb de a-CD20 murino, IgG23, Biogen Idec, Lote #NB3304-87, San Diego, CA) foi u-sado. O controle negativo para Fabs foi R001-1B fornecido por ChristilynGraff (Biogen Idec, Cambridge, MA). PBS usado nos tampões foi de Bio-Whittaker (Cat. #17-513F, Walkersville, MD).
IGF-1 R humano recombinante (versão marcada com Histidina)ou IGF-IR-Fc foi revestido sobre tiras de Removawell de IMMULON2 HB(ligação alta) (Dynex Technology, Inc., Cat. #6302) diluído com tampão decobertura de carbonato pH 9,5 para uma concentração de 250 ng/poço. A-pós incubação durante a noite a 4S C, os poços foram lavados três vezescom tampão de lavagem (0,05 %Tween 20 / PBS) depois bloqueados comtampão de bloqueio (3 %BSA / PBS) durante uma hora em temperatura am-biente. O tampão de bloqueio foi removido e os poços lavados mais três ve-zes. Preparações de anticorpo, Fab, ou Iigante foram diluídas para concen-tração desejada com tampão de diluição (1 %BSA/0,05 %Tween 20 / PBS) ebanhados em 50 μΙ por poço em duplicata. Após 45 minutos em temperaturaambiente, 100.000 cpm de qualquer um de [125I] rhlGF-1 ou [125I] rhlGF-2 em50 μl tampão de diluição foram adicionados por poço. Este foi incubado emtemperatura ambiente durante mais uma hora. Os poços foram novamentelavados mais três vezes e deixados sem líquido após a última lavagem. Ospoços secados ao ar foram contados com o Contador de Isodata Gama.
Alternativamente, Fabs foram avaliados por um ensaio de captu-ra modificado onde o IGF-IR-Fc foi capturado usando IgG anti-humana imo-bilizada em uma placa, !mobilização foi realizada por incubação durante anoite de IgG anti-humana de cabra, anticorpo específico para fragmento deFcy (200 ng/poço) em tampão de cobertura de carbonato. Os poços foramlavados, bloqueados e 250 ng de IGF-1 R-Fc foram adicionados por poço.
A habilidade de 6 Fabs diferentes para bloquear a ligação deIGF-1 ou IGF-2, ou ambos os Iigantes está mostrada na Tabela 3. O 6 Fabsdo topo com atividade de bloqueio diferente foram selecionados para outraanálise.
EXEMPLO 4
Fabs INIBIRAM FOSFORILACÂO DE IGF-1 R MEDIADA POR IGF-1 E IGF-25 2,
Linhagens celulares: IGF1R que expressa MCF-7 para linhagemcelular de carcinoma de mama humana (NCI) foi mantido a 37e C e 5 %C02em MEM Eagle (ATCC) contendo 10 %FBS, 1X aminoácidos não-essenciais, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio e 1000U/ml penicilinae estreptomicina. As células foram sub-cultivadas duas vezes por semanapara manutenção e ensaio, e usadas com um máximo de 12 passagens.
Células MCF-7 foram banhadas em 2 ml de meios de crescimen-to a 2 X 105 a 4,0 X 105 células/poço em placas de 12 poços revestidos comPloy-D-lisina (BD Biosciences, #35-6470) e cultivadas a 37- C, 5 %C02. Em48 horas, removeu-se os meios e as células privadas de soro durante a noitea 37-C, 5 %C02. Os meios livres de soro foram removidos e anticorpos decontrole ou de teste foram adicionados na concentração indicada em 350 ulde meios frescos livres de soro e incubados durante 1 hora em temperaturaambiente, ou alternadamente a 37-C. Fabs foram testados em concentraçãode 200 nM, 20 nM e 2nM e os mAbs foram testados a 67, 6,7 e 0,67 nM. Oanticorpo de controle de anti-IGF-1R comercial usado foi alR3 (EMD Biosci-ences, produtos de Pesquisa da Oncogene, #D27249). IGF-1 recombinantehumano a 13 nM ou IGF-2 a 27nM (R & D Systems, #291-G1, #292-G2) adi-cionados aos poços em 35 ul de meios livres de soro e incubados a 37e Cdurante 15 minutos. Ligante foi incubado em temperatura ambiente para ex-perimentos de anticorpo a 37- C. Células foram Iisadas em 1X tampão delise de célula (Cell Signal Technologies, #9803) com 1 mM PMSF durante 1hora em temperatura ambiente.
Os Iisados das células foram adicionados às placas de ELISApré-revestidas com anticorpo de IGF-IRp (Clone 1-2, Biosource Internatio-nal, #AHR0361) e incubados durante 2 horas. Seguindo, estas placas foramlavadas e o receptor fosforilado ligado à placa foi detectado com a anticorpomarcado com anti-fosfotirosina de biotina 4G10 (Catálogo #16-103, UpstateCell Signaling Solutions (Lake Placid, NY (agora parte de Millipore, Concord,MA (USA)) e estreptavidina-HRP (BD Pharmingen, #554066). Ensaio é de-senvolvido por adição de substrato de TMB (Kierkegaard & Perry, #50-76-00) e coloração parada mediante adição de 4N H2S04.4 (Lab-Chem,Cat#LC25830-1). Densidade óptica é medida a 450 nM usando umaleitora de placa de Molecular Devices e porcentagem de inibição sobre ocontrole de Iigante é calculada para cada amostra de anticorpo-ligante.
Tabela 3 resume a inibição de Fosforilação de IGF-1R mediadapor IGF-1 e IGF-2 em células MCF-7 por Fabs. Um total de 16 Fabs de IGF-1R foram triados para inibição de fosforilação de receptor por ELISA. Noveanticorpos mostraram resposta positiva de "+" ou melhor em uma concentra-ção de 200 nM contra IGF-1, IGF-2 ou ambos. Estes anticorpos foram sele-cionados para quantidades graduadas e testados novamente para respostainibidora dependente de dose. Com base na habilidade para inibir ligação deligante e fosforilação de receptor, quatro Fabs foram selecionados comocandidatos líderes para conversão do anticorpo de comprimento total (vide,EXEMPLO 6).
FIGURA 3 (A & B), mostra a Inibição de fosforilação de IGF-1Rdo material graduado dos 6 Fabs de IGF-1R de topo.
EXEMPLO 5
ESPECIFICIDADES DE LIGAÇÃO DE ANTICORPO E AFINIDADES PARAIGF-1R VERSUS INSR
PARTE I: ANÁLISE DA LIGAÇÃO DE ANTICORPO A IGF-1R SOLÚVELVERSUS INSR SOLÚVEL USANDO ENSAIOS IMUNOABSORVENTES LI-GADOS A ENZIMA (ELISA)
Os ensaios de ELISA foram executados para determinar a liga-ção específica dos anticorpos de fragmento de Fab a IGF-1 R solúvel no re-ceptor de insulina. As placas foram revestidas com 10 ug/ml de rh-IGF-1R (R& D Systems, #305-GR) ou rh-INSR (R & D Systems, #1544-IR) durante anoite e bloqueadas com 5 %de leite. Os anticorpos foram adicionados a umafaixa de 2 μΜ - 0,2 nM para Fabs ou 667 - 0,067 nM para MAbs murinos emuma diluição serial 1:10 e incubados 1 hora em temperatura ambiente. Anti-corpo ligado foi detectado com α-humano capa de cabra marcado com HR-PO (Southern Biotechnology Associates, #2060-05) para Fabs e Fcy de IgGde α-camundongo de cabra (Jackson Immunoresearch, #115-035-164) paraMAbs murinos. Desenvolvimento de cor foi interrompido mediante adição de4 N H2SO4 e densidade óptica é medida a 450 nM usando uma leitora deplaca de Molecular Devices e curvas de ligação são geradas.
Fabs de IGF-1R não mostraram nenhuma ligação específica aoreceptor de insulina solúvel em qualquer concentração (TABELA 3) enquan-to, como esperado, eles mostraram ligação boa a IGF-1R-Fc.
FIGURA 4 (A & B) ilustra as curvas de ligação representativasobtidas com Fabs M14-B01, M14-C03 e M12-G04. Padrões de ligação simi-lares foram observados para M13-C06, M14-G11 e M12-E01 (dados nãomostrados).
PARTE II: ANÁLISE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPO A IGF-1R SOLÚVELVERSUS INSR SOLÚVEL USANDO RESSONÂNCIA DE PLASMON DESUPERFÍCIE (SPR) E TRANSFERÊNCIA DE ENERGIA DE RESSONÂN-CIA POR FLUORESCÊNCIA TEMPO-RESOLVIDA (TR-FRET)
As afinidades de ligação dos anticorpos M13-C06, M14-C03, eM14-G11 para ectodomínios de IGF-1R humano e de receptor de insulinasolúvel foram comparadas usando ressonância de plasmon de superfície(Biacore) e transferência de energia de ressonância por fluorescência tem-po-resolvida (tr-FRTE); demonstrando também que o anticorpo de M13-C06não exibe reatividade cruzada significativa com o receptor de insulina, IGF-1R murino, ou uma versão truncada de IGF-1R humano (isto é, resíduos deaminoácido de hlGF-1R 1-462 contendo apenas os primeiros e segundosdomínios repetidos ricos em Ieucina como também o domínio repetido ricoem cisteína, mas carecendo dos três domínios de fibronectina do tipo Ill deIGF-1 R's).
ANÁLISES DE RESSONÂNCIA DE PLASMON DE SUPERFÍCIE (SPR)
Análises de SPR foram executadas usando um Biacore3000. Oinstrumento foi ajustado para 259 C e os ensaios executados com tampãooperacional HBS-EP pH 7,2 comprado de Biacore (Biacore, Cat. No. BR-1001-88). Os anticorpos completamente humanos, M13-C06, M14-C03, eM14-G11 foram imobilizados em 1-110.000 RU em superfícies de CM5 Re-search Grade circuito integrado de sensor de Biacore usando a química rea-tiva de NHS/EDC-amina padrão de acordo com os protocolos providos porBiacore. Para imobilização, os anticorpos foram diluídos a 40 pg/ml em umtampão de 10 mM de acetato pH 4,0. Para investigar a cinética relativa daassociação e dissociação dos ectodomínios de comprimento total de IGF-1 R(1-902)-His-10 humano (hlGF-1 R-HiS10 (R&D Systems)) e INSR(28-956)-HiS10 humano (INSR (R&D Systems)) para cada um dos anticorpos huma-nos, concentrações crescentes de hIGF-1R-HiS10 ou INSR foram injetadasnas superfícies do circuito integrado de sensor. A série de concentração dehlGF-1 R-HiSio variou de 1,0 nM a 250 nM enquanto as concentrações deINSR variaram de 1,0 nM a 2 μΜ. Todas as superfícies do anticorpo foramconfiantemente regeneradas com 100 mM Glicina, pH 2,0. Regeneraçõesrepetidas não levaram a perdas da atividade para quaisquer das superfíciesdo anticorpo. Taxas de fluxo foram 20 μΙ/min. ("His-io" denota um marcadorde histidina de 10 resíduos no término C das construções).
ENSAIO DE TRANSFERÊNCIA DE ENERGIA DE RESSONÂNCIA PORFLUORESCÊNCIA TEMPO-RESOLVIDA (TR-FRET)
hlGF-1 R-HÍS10 e M13-C06 foram covalentemente conjugadoscom Cy5 e um quelato de Európio, respectivamente, usando química deNHS padrão de acordo com os protocolos do fabricante da tintura. Diluiçõesseriais de vários competidores do receptor de ectodomínio solúvel não-marcado, (1) hlGF-1 R-His10, (2) IGF-1R(1-903)-FlagHisi0 humano (hlGF-1R-FIagHis10, Biogen Idec), (3) IGF-1R(1-903)-Fc humano (hlGF-1R-Fc, BiogenIdec), (4) IGF-1 R(1-462)-Fc humano (hlGF-1 R(1-462)-Fc, Biogen Idec), (5)IGF-1 R(1-903)-Fc murino (mlGF-1R-Fc, Biogen Idec) ou (6) INSR, iniciandoem 6,25 pg (50 μΙ de 125 pg/ml solução de matéria-prima) foram misturadoscom 0,1 μg hlGF1 R-His10-Cy5 (25 μΙ de 4 μg/ml solução de matéria-prima) e0,075 pg Eu-C06 (25 μΙ de 3 μg/ml solução de matéria-prima) em placas demicrotitulação de 96 poços (preto de Costar). Os níveis de conjugação parahlGF-1 R-His10-Cy5 foram 6,8:1 (Cy5:IGF-1 R-His10), e para Eu-C06 foram10,3:1 (Eu:C06) como determinado pela absorbância de cada tintura comrespeito à concentração de proteína. O volume total foi 100 μΙ para cadaamostra. As placas foram incubadas por 1 h em temperatura ambiente emum agitador de placa. Medições de fluorescência foram realizadas em umaleitora de placa fluorescente Wallac Victor2 (Perkin Elmer) usando o protoco-lo de LANCE com o comprimento de onda de excitação a 340 nm e compri-mento de onda de emissão a 665 nm. Todas as construções foram submeti-das à amostragem com pelo menos duas réplicas.
Todas as construções do ectodomínio de receptor de IGF-1 Rsolúvel derivado de Biogen Idec foram subclonadas em vetores de PV-90 deBiogen Idec para expressão de CHO usando a metodologia descrita (Bre-zinsky et al., 2003). Cada receptor contendo um marcador de IgG-Fc C-terminal foi purificado por afinidade usando uma etapa de A SEPHAROSEFF™ de proteína simples (GE Heathcare) como previamente descrito. hlGF-1 R-FIagHiSio foi purificado usando Ni2+-agarose (Qiagen) como previamentedescrito (Demarest et al., 2006).
RESULTADOS:
Os anticorpos de anti-IGF-1R completamente humanos, M13-C06, M14-C03, e M14-G11, foram avaliados para suas atividades de ligaçãocomparativas a construções de ectodomínio de IGF-1R e INSR solúvel u-sando ressonância de plasmon de superfície (SPR). hlGF-1 R-HiSi0 e INSRforam injetados em superfícies de anticorpo imobilizado usando protocolosidênticos. hlGF-1R-Hisi0 demonstrou ligação a todos os três anticorpos deanti-IGF-1R mesmo em concentração mais baixa, 0,5 nM (dados não mos-trados: concentrações variaram de 1 a 250 nM e a fase de injeção de recep-tor foi 400-2200 segundos seguida por uma fase de dissociação de tampão eregeneração subseqüente com glicina, pH 2,0). Ligação de hlGF-1R-Hisio foimais forte à superfície de M13-C06. Em contraste, INSR demonstrou peque-na atividade para a superfície de M13-C06 até mesmo a uma concentraçãotão alta quanto 2 μΜ de receptor (>1000 mais alta para que foi observadopara ligação de IGF-1R (dados não mostrados: concentrações variaram de1,0 nM a 2 μΜ e a fase de injeção de receptor foi 500-1000 segundos segui-da por uma fase de dissociação de tampão). As superfícies de M14-C03 ede M14-G11 também demonstraram pequena atividade de ligação a INSR.
Em seguida, as afinidades de várias construções de IGF-1R e deINSR recombinantes para M13-C06 foram determinadas usando um ensaiode TR-FRET baseado em competição. Curvas de ligação de melhor ajustepara todas as construções de receptor recombinante (descritas abaixo) fo-ram determinadas (dados não mostrados). Todos os dados foram ajustadosa um modelo de ligação de um sítio do qual os valores de IC5o correspon-dentes foram determinados. As três construções de ectodomínio de IGF-1Rhumanas de comprimento total (hlGF-1R-Fc, hlGF-1R-HiSi0, e hlGF-1R-FlagHis-I0) todas competiram em uma concentração maneira-dependentecom os valores de IC50 de 2,9, 2,0, 5,2 pg/ml, respectivamente. A construçãode IGF-1R(1-462)-Fc humano truncado, a construção de IGF-IR-Fc de ca-mundongo de comprimento total, e a construção de INSR-Hisio humano decomprimento total não inibiram hlGF-1 R-Hisio marcado com Cy5 em concen-trações de 100 vezes acima da IC50 das construções de IGF-1R humano decomprimento total recombinante, sugerindo estas construções anteriores nãoexibem reatividade de ligação significativa para M13-C06 comparado ao úl-timo IGF-1R humano de comprimento total.
PARTE III: AFINIDADE DE LIGAÇÃO RELATIVA DE ANTICORPO DE M13-C06 PARA IGF-1 R SOLÚVEL HUMANO VERSUS MURINO.
A afinidade de ligação relativa de M13-C06 para IGF-1 R murinoversus humano foi comparada. Ressonância de plasmon de superfície (SPR)foi usada para determinar a afinidade de M13-C06 para Fc de IGF-1 R muri-no e Fc de IGF-1 R humano. Os experimentos foram executados em um Bia-core 3000 ajustado para 25°C usando HBS-EP (Biacore, Cat. No. BR-1001-88) como o tampão operacional. Um anticorpo de IgG-Fc anti-humano (2C11de Biogenesis, Cat. No. 5218-9850) foi imobilizado para saturação em umasuperfície de circuito integrado de Biacore CM5 (Cat. No. BR-1000-14) porinjeção a 500 nM em tampão de HBS-EP. mlGF-1R-Fc ou hlGF-1R-Fc foicapturado na superfície de circuito integrado injetando 40 μΙ de 20 nM dereceptor a 3pL/min. Seguindo a captura do receptor, 40 μΙ de Fab de M13-C06 foram injetados a 3 μl/μm. Dissociação de Fab foi medida durante1-127 minutos. Fab foi serialmente diluído de 25 a 0,4 nM para obter as cur-vas de ligação cinética dependente de concentração. Regeneração da su-perfície de circuito integrado entre cada série de injeção foi executada usan-do 3x10 μl de injeções de 100 mM de glicina pH 2,0 a 60 μl/min. Cada curvafoi duplamente referida usando (1) dados obtidos de uma superfície de cir-cuito integrado de CM5 destituída do anticorpo de anti-lgG 2C11 e (2) dadosde uma injeção primária de receptor seguido por uma injeção secundária detampão de HBS-EP. A série de concentração de Fab de M13-C06 para cadareceptor foi ajustada para o modelo de ligação 1:1 fornecido dentro do soft-ware de BiaEvaIuation do fabricante. Para obter a kd da ligação de M13-C06a mlGF-1R-Fc, o experimento foi repetido com Fab de M13-C06 a 25 nM emlGF-1 R-Fc a 20 nM com a única alteração no protocolo original sendo umaextensão do período de dissociação para três horas.
RESULTADOS:
Fab de M13-C06 foi aplicado às superfícies de Biacore contendohlGF-1R-Fc ou mlGF-1R-Fc para determinar a afinidade relativa do anticor-po em duas espécies de receptor. A presença do marcador de IgGI-Fc C-terminal resulta em multimerização adicional das construções de receptor deIGF-IR-Fc (dados não mostrados); portanto, os ajustes do modelo de Iiga-ção provêem uma medida das afinidades relativas ou evidentes de M13-C06para cada receptor. A afinidade de Fab de M13-C06 para o Fc de IGF-1Rhumano e murino foi observada ser 0,978 nM e 89,1 nM, respectivamente. Adiminuição de 100 vezes na ligação a IGF-1R murino é facilmente evidenteao comparar a FIGURA 27 A & B que exibe as curvas de associação e dis-sociação, constantes de taxa cinética, e constantes de dissociação de equi-líbrio. FIGURA 27A mostra as características de ligação dependentes deconcentração de Fab de M13-C06 a IGF-1R humano (ka (1/Ms) = 8,52e5 M1s"1; kd (1/s) = 8,33e-4 s"1; e, K0 = 9.78e-10 M). FIGURA 27B mostra as carac-terísticas de ligação de associação e dissociação lentas de M13-C06 amlGF-1 R-Fe (ka (1/Ms) = 471 M-1 s"1; kd (1/s) = 4,20e-5 s"1; K0 = 8,91e-8 M).Devido à dissociação extremamente lenta de Fab de M13-C06 do mlGF-1R-Fc, a constante de taxa de dissociação cinética, kd, não pôde ser determina-da usando o conjunto de dados inicial. Um segundo experimento foi execu-tado usando um período de dissociação de 3 h para obter a constante detaxa de dissociação, kd de 4,20e-5 s"\ que foi usada para obter a constantede dissociação de equilíbrio K0, (descrita acima) do conjunto de dados origi-nal. A presença do marcador de IgGI-Fc C-terminal resulta em multimeriza-ção adicional das construções de receptor de IGF-IR-Fc (dados não mos-trados); portanto, a os ajustes de modelo de ligação provêem uma medidadas afinidades relativas ou evidentes de M13-C06 para cada receptor.
PARTE IV: ANTICORPO DE M13-C06 DE COMPRIMENTO TOTAL ESPE-CIFICAMENTE LIGA IGF-1R MAS NÃO A INSR EXPRESSO EM CÉLULASMAMÍFERAS.
Receptor de IGF-1R recombinante e insulina (IR) foi indepen-dentemente expresso em células mamíferas (3T3 ou CHO). As células foramsolubilizadas com 1 %Triton X-100 e o receptor foi imunopreciptado comcontas de proteína-A/G acopladas a um anticorpo de controle negativo (I-DEC-151), anticorpo de M13.C06.G4.P.agly (C06), anticorpo de M14-G11.G4.P.agly (G11), ou um anticorpo de INSR ((-IR). Complexos de anti-corpo/antígeno foram liberados das contas através de tratamento de ácido,aplicado a géis de SDS-PAGE de Tris-glicina e tingidos com membranas denitrocelulose. Detecção foi executada usando o IR anti-humano de camun-dongo (FIGURA 26A) ou IGF-1R anti-humano de camundongo (FIGURA26B) e IgG de α-camundongo de cabra. Resultados: anticorpo deM13.C06.G4.P.agly liga a IGF-1R mas não a INSR expresso em célulasmamíferas.
EXEMPLO 6:
CONSTRUÇÃO DE IaGs DE ANTI-IGF-1R DE COMPRIMENTO TOTAL
Quatro Fabs foram convertidos para a versão de lgG4.P.agly eexpressos em células CHO. Seqüências de DNA que codificam quatro Fabsanti-IGF-1 R distintos - M13-C06 (FIGURAS 5 (A)-(D)), M14-C03 (FIGURAS5(E)-(H)), M14-G11 (FIGURAS 5(I)-(L)), e M14-B01 (FIGURAS 5(M)-(P)) fo-ram selecionados de uma biblioteca de fago de anticorpo humano (DyaxCorp) por biopanning contra um ectodomínio de IGF-1R-proteína de fusãode Fc humana recombinante. Cada um dos quatro Fabs anti-IGF-1 R conti-nha a estrutura de linhagem germinal de cadeia pesada humana de Vh3-23e eram cadeias leves capa. As seqüências de gene de Fab foram usadaspara construir plasmídeos de expressão que codificam anticorpos de anti-IGF-R1 de comprimento total usando o sistema de vetor de expressão depV90AS para produção de anticorpo em células mamíferas. pV90AS é umvetor de expressão de pV90 modificado projetado para gerar duas transcri-ções de um promotor simples através de splicing alternado de uma transcri-ção primária (Referência: Pedido de Patente USPTO W02005/089285). Odoador de splice de CMV natural ou é submetido a splicing para um aceitan-te de splice parcialmente lesado para gerar uma transcrição de codificaçãode cadeia leve do anticorpo, ou para um aceitante de splice de CMV naturalpara gerar a transcrição de codificação de cadeia pesada do anticorpo. Oaceitante de splice parcialmente lesado foi engenheirado para resultar emquantidades similares das transcrições de cadeia tanto pesada como leve.Regiões variável (VL) e constante (CL) de cadeia leve (SEQ ID NOS: 153 e154, FIGURA 5(Y)-(Z)) de cada Fab anti-IGF-1R (M13-C06; M14-C03; M14-G11 e M14-B01) foram amplificadas por PCR. (TABELA 7). O iniciador dePCR de cadeia leve de 5' IGF1R-FK incluiu um sítio de endonuclease derestrição de Sfi I seguido por seqüência que codifica um peptídeo sinal decadeia leve de imunoglobulina MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ IDNO: 157) em estrutura para as seqüências que correspondem ao términoamino da região de VL de acordo com os métodos descritos em NakamuraT, et al., Int J Immunopharmacol. 22:131-41 (2000) que é incorporado aquipor referência em sua totalidade. Todas as quatro das seqüências madurasde cadeia leve de IGRF1R tiveram términos amino idênticos. O iniciador dePCR de cadeia leve de 3' IGF1R-RK incluiu seqüência que corresponde aotérmino carboxila da região de CL e um sítio Asc I. O produto de PCR foipurificado por eletroforese em gel de agarose e extração usando o protocolodo kit de QIAquick GeIExtration (QIAGEN CA), digerido com endonucleasesde restrição de Sfi I e Asc I e ligado com o vetor de pHLP025 digerido comSfi l/Asc I (Holly Prentice). O vetor de pHLP025 contém sítios de Sfi l/Asc Ide endonuclease de restrição para receber a cadeia leve do anticorpo (pep-tídeo sinal-VL-CL) como um fragmento de PCR digerido com Sfi l/Asc I alémda seqüência de sítio doador de splice de CMV natural, uma seqüência desítio aceitante de splice parcialmente lesada, e uma seqüência sinal poly A(Referência: Pedido USPTO W02005/089285).
A região variável de cadeia pesada (VH) de cada Fab anti-IGF-1R (M13-C06; M14-C03; M14-G11 e M14-B01) foi amplificada por PCR. Oiniciador de VH de cadeia pesada de 5' de PCR IGF1R-FH incluiu um sítiode endonuclease de restrição Nco I seguido por seqüência codificando pep-tídeo sinal de cadeia pesada sintética MGWSLILLFLVAVATRVLS (SEQ IDNO: 122) em estrutura para seqüências que correspondem ao término aminoda região de VH como descrita acima. O iniciador de PCR de VH de cadeiapesada de 3' IGF1R-RH incluiu seqüência que corresponde ao término car-boxila da região de VH e um sítio de Sfi I. O produto de PCR foi purificado por eletroforese em gel de agarose e extração usando o protocolo do kit deQIAquick GeIExtration (QIAGEN, CA), digerido com endonucleases de res-trição Nco I e Sfi I e ligado com o vetor de pHLP029 digerido com Nco I / Sfi I(Holly Prentice). O vetor de pHLP029 contém os siticos de Nco I / Sfi I parareceber o peptídeo sinal de anticorpo-seqüência de VH como um fragmento de PCR digerido com Nco I / Sfi I além de uma seqüência sinal de poly A amontante, uma seqüência de sítio aceitante de splice de CMV natural, e umaseqüência sinal de poly A a jusante (Referência: Pedido USPTOWO2005/089285).
As seqüências de gene que codificam para (sítio de Sfi I - peptí- deo sinal de cadeia leve - VL e CL de anti-IGF-1 R) em pHLP025 e (peptídeosinal de cadeia pesada - VH de anti-IGF-1R - sítio de Sfi I) em pHLP029 fo-ram montadas em um fragmento de DNA simples por amplificação de PCRatravés das seqüências de sobreposição comuns presentes em ambos osvetores usando os iniciadores de PCR de IGF1R-FK de cadeia leve de 5' e IGF1R-RH de VH de cadeia pesada de 3' descritos acima. O produto dePCR resultante foi purificado por eletroforese em gel de agarose e extraçãousando o protocolo do kit de QIAquick GeIExtration (QIAGEN, CA), digeridocom endonuclease de restrição de Sfi I e ligado com o vetor de pXWU007digerido com Dra III. Brevemente, pXWU007 foi primeiro construído subclo- nando um fragmento de região constante de lgG4 humana de Age I / BamHIcontendo uma mutação de S228P na região de dobradiça de lgG4 e umamutação de T299A no domínio de CH2, sistema de numeração EU (Kabat,E, Wu, TT, Perry, HM, Gottesman, KS, Foeller, C: Sequences of Proteins ofImmunological lnterest. Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH, 1991) (SEQ ID NOs: 155 e 156, FIGURA 5 (AA)-(BB)) doplasmídeo pEAG1808 (fornecido por Ellen Garber) no vetor de pHLP028 di-gerido com Age I / BamHI. pHLP028 é um vetor de lgG4 de pV90 modificadopara conter um sítio de Dra Ill para receber o produto de PCR digerido comSfi I simples descrito acima (Referência: Pedido USPTO W02005/089285).
O plasmídeo resultante produz uma transcrição de precursor bi-cistrônico que sob splicing alternativo resulta em mRNAs de anticorpo decadeia pesada e leve transacionalmente ativo em quantidades aproximada-mente estequiométricas. Intermediário e vetores de expressão para produziranticorpos de lgG4.P humano de anti-IGF-1R aglicosilado de comprimentototal estão mostrados na TABELA 8. Seqüências corretas foram confirmadaspor análise de seqüência de DNA. Expressão dos anticorpos de comprimen-to total dos plasmídeos pXWU020, pXWU022, pXWU024, e pXWU025 emcélulas mamíferas resulta em produção de anticorpos de lgG4.P humanoestável, aglicosilado.
TABELA 7. Oliqonucleotídeos para amplificacão de PCR dos domínios deanticorpo humano.
Iniciador de PCR de cadeia leve de 5' direto inclui um sítio de Sfi I de endo-nuclease de restrição (sublinhado) e seqüência que codifica o peptídeo sinalde cadeia leve;
Iniciador de PCR de cadeia leve de 3' reverso inclui um sítio Asc I (sublinhado).
Iniciador de PCR variável de cadeia pesada de 5' direto inclui um sítio deendonuclease de restrição de Nco I (sublinhado) e seqüência que codifica opeptídeo sinal de cadeia pesada.
Iniciador de PCR variável de cadeia pesada de 3' reverso inclui um sítio deSfi I (sublinhado).<table>table see original document page 224</column></row><table>
TABELA 8. Intermediário e plasmídeos de expressão que codificam anticor-pos de anti-IGF-1 R.
EXEMPLO 7
CONSTRUÇÃO DE IgGs DE ANTI-IGF-1 R DE COMPRIMENTO TOTALPARA EXPRESSÃO MELHORADA EM CÉLULAS MAMÍFERAS.Para melhorar os rendimentos de expressão de anticorpo e qua-lidade do produto as seqüências de gene de VH originais de Fabs de anti-IGF-1R M13-C06, M14-C03, M14-G11, e M14-B01 foram modificadas. Pri-meiro, seqüências de VH de anti-IGF-1R foram analisadas para seqüênciascontendo sítios de splice putativos com programa público de reconhecimentode seqüência (www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html (The Institute forGenomic Research, 9712 Medicai Center Drive, Rockville, MD 20850),www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html). (Martin G. Reese e Frank H. Eeck-man, Lawrence Berkeley National Laboratory, Genome Informatics Group, 1Cyclotron Road, Berkeley, CA, 94720; vide também, Reese MG, Eeckman,FH, Kulp, D, Haussler, D, 1997. "Improved Splice Site Detection in Genie". JComp Biol 4(3), 311-23). Segundo, os códons na região variável de cadeiapesada dos Fabs de anti-IGF-1 R foram substituídos com códons que corres-pondem às posições de Kabat idênticas dos anticorpos que foram de formabem sucedida expressos em células CHO sem encontrar qualquer alteraçãona seqüência de polipeptídeo de VH de anti-IGF-1 R original. Esta segundaetapa remove principalmente os sítios de splice putativos mas uma análisedo sítio de splice adicional seguida por permuta de códons sinônimos foramexecutadas para reduzir a probabilidade prognosticada de um sítio de spliceputativo estando presente.
Fragmentos de DNA que codificam líder de cadeia pesada sinté-tica em estrutura com as seqüências de VH otimizadas em seqüência dosFabs de anti-IGF-1 R - M13-C06 (SEQ ID NO: 18, FIGURA 5(Q)), M14-C03(SEQ ID NO: 30, FIGURA 5(S», M14-G11 (SEQ ID NO: 36, FIGURA 5(U)), eM14-B01 (SEQ ID NO: 24, FIGURA 5(W)) foram obtidos como seqüênciasde DNA bifilamentar quimicamente sintetizadas de um fornecedor comercial(Blue Heron Biotechnology, Inc. Bothell WA). Os sítios de endonuclease derestrição de Nco I e Sfi I em 5' e 3' foram incluídos nos fragmentos sintetiza-dos. Os fragmentos do líder e da região de VH otimizada em seqüência deanti-IGF1R foram clonados no vetor de pHLP029 digerido com Nco l/Sfi Icomo descrito acima no EXEMPLO 6. Recombinação com as cadeias levescorrespondentes apropriadas em pHLP025 e clonagem subseqüente dofragmento simples em pXWU007 são como descritas acima no EXEMPLO 6.Construções de expressão que produzem os anticorpos de lgG4.P de anti-IGF-1R humano aglicosilado de comprimento total otimizado em seqüênciasão mostradas na TABELA 9. Seqüências corretas foram confirmadas poranálise de seqüência de DNA. Expressão dos anticorpos de comprimentototal do plasmídeo série pXWU029-pXWU032 em células mamíferas resultaem produção de anticorpos de lgG4.P humano aglicosilado estáveis.
TABELA 9. Plasmídeos de expressão otimizados em seqüência que codifi-cam anticorpos de anti-IGF-1R. Seqüências de cadeia pesada otimizadassão precedidas com um "m".
<table>table see original document page 226</column></row><table>
EXEMPLO 8
EXPRESSÃO TRANSIENTE E CARACTERIZAÇÃO DOS ANTICORPOS DEIGF-1R.
DNAs de plasmídeo foram usados para transformar células deDG44 de CHO para produção transiente da proteína de anticorpo. 20 pg deDNA de plasmídeo foram combinados com 4 χ 106 células em um volume de0,4 ml de 1 χ PBS. A mistura foi adicionada a uma cubeta de 0,4 cm (BioRad)e colocada em gelo por 15 min. As células foram eletroporadas a 600 uF e350 volts com um eletroporador Gene Pulser (BioRad). As células foram co-locadas em um frasco de T-25 contendo meios de CHO-SSFM Il mais 100uM Hipoxantina e 16 uM Timidina e incubas a 37° durante 4 dias. Os sobre-nadantes foram colhidos e bioquimicamente caracterizados através de Wes-tern blot e testados para ligação de antígeno por ELISA.
Alternativamente, Fabs selecionados também converteram paraa versão de lgG4.P humano de comprimento total e expressos usando umsistema de vetor diferente por um método descrito abaixo. As seqüências deDNA que codificam cinco anticorpos de Fab de anti-IGF1R distintos, M12-E01, M12-G04, M13-C06, M14-C03, e M14-G11, foram transferidas paravetores para expressão de lgG4.P humano de comprimento total. Todos oscinco anticorpos usam o fragmento de linhagem germinal de cadeia pesadahumana de VH3-23. A cadeia pesada variável foi removida do vetor de ex-pressão de Fab solúvel através de digestão com enzimas de restrição Mfel eBstEII. O fragmento resultante foi purificado através de eletroforese em gelde agarose usando o kit de Extração de Gel QIAquick (Qiagen, CA) e ligadono vetor de pRR253 digerido com Mfel/BstEII (Rachel Rennard). O plasmí-deo resultante contém o peptídeo sinal de cadeia pesada (MG WSC11LFLVA-TATGAHS, SEQ ID NO: 127) seguido por regiões de VH de anti-IGF1R econstantes para lgG4.P humano.
Quatro dos cinco anticorpos, M12-G04, M13-C06, M14-C03, eM14-G11, continham cadeias leves capa. A cadeia leve variável foi amplifi-cada por PCR com iniciadores para apresentar um sítio de EcoRV 5" e umBsgl 3' para a região variável. O fragmento de PCR resultante foi purificadoatravés de eletroforese em gel de agarose usando o kit de Extração de GelQIAquick (Qiagen, CA) e ligado em vetor T0P02.1 TA (Invitrogen, CA). Acadeia leve capa variável foi removida do vetor TOPO através de digestãocom enzimas de restrição EcoRVe Bsgl e purificado. O fragmento foi ligadoem vetor de pRR237 digerido com EcoRVIBsgI contendo o peptídeo sinal decadeia leve da imunoglobulina (MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC, SEQ IDNO: 128) e o domínio capa constante. O vetor resultante foi digerido comBamHI e Notl e o cassete de expressão inteiro (seqüência sinal, variável edomínios capa constantes) foi purificado e ligado em pRR223 digerido comBamHHNoti
O anticorpo de M12-E01 contém uma cadeia leve lambda. A ca-deia leve variável foi amplificada por PCR com iniciadores para introduzir umsítio de Agel 5' da região variável. O fragmento de PCR resultante foi purifi-cado através de eletroforese em gel de agarose usando o kit de Extração deGel QIAquick (Qiagen, CA) e ligado em vetor T0P02.1 TA (Invitrogen, CA).A cadeia leve Iambda variável foi removida do vetor TOPO através de diges-tão com enzimas de restrição Agel e Avrll e purificado. O fragmento foi liga-do em vetor de pxW347 digerido com Agel/Avrll (xin Wang) contendo o pep-tídeo sinal de cadeia leve da imunoglobulina (METDTLLLWVLLLWVPGSTG,SEQ ID NO: 129) e o domínio Iambda constante. O vetor resultante foi dige-rido com Notl e o cassete de expressão inteiro (seqüência sinal, variável edomínios Iambda constantes) foi purificado e ligado em pRR223 digeridocom NotL
DNa de plasmídeo foi usado para transfeccionar células 293Epara expressão transiente da proteína de anticorpo. 1,2 pg de cada DNA deplasmídeo (pesada e leve) foi transfeccionado em 2 χ 106 células com o Pro-tocolo de Transfecção de Effectene de Qiagen (Qiagen, CA). As células fo-ram incubadas a 37Q C durante 3 dias. Sobrenadante foi colhido e anticorpode comprimento total confirmado por métodos de Western blot e de ELISA. Ahabilidade de lgG4.P completo para ligar a IGF-1R foi confirmada por ELISA.
EXEMPLO 9
DESENVOLVIMENTO DE ANTICORPO DE ANTI-IGF-1R PRODUZINDOLINHAGEM CELULAR DE CHO
Este exemplo dá uma descrição detalhada da expressão do an-ticorpo de anti-IGF-1R que compreende o domínio de ligação do anticorpode M13-C06 de Fab como agly modificado dobrado de comprimento totalgama 4, capa (referido aqui como "agly.lgG4.P" ou "G4.P.agly"). Os outrosFabs descritos aqui, isto é, aqueles listados na Tabela 3, foram expressadosde uma maneira similar. As regiões variáveis e constantes de M13-C06 sãode origem da seqüência humana. As regiões variáveis de cadeia leve e ca-deia pesada inteiras são derivadas de um Fab gerado contra IGF-1R huma-no pela tecnologia de exibição de fago de DYAx. As regiões variáveis, comotambém as constantes de cadeia leve foram subclonadas em um vetor deexpressão de splice alternado. A configuração de splice alternada liga a ca-deia leve e pesada através do uso de um doador de splice simples com doisaceitantes de splice onde cada aceitante de splice gera uma transcrição quecodifica uma das duas cadeias. O DNA de vetor de expressão que codificaos genes da imunoglobulina foi eletroporado em células de ovário de hams-ter chinês insulino-independentes (CHO DG44i). Um transfectoma de CHO(linhagem celular 40B5) foi selecionado para propósitos de produção.
pxWU007 - um vetor de expressão "vazio" contém uma regiãoconstante humana gama 4 (cadeia pesada) como também intensificadoresde promotor separados e regiões de poliadenilação para expressão de geneem células mamíferas, mas não contém domínios variáveis. Quando expres-sado e transladado o polipeptídeo de cadeia pesada contém duas substitui-ções de aminoácido, S228P e T299A, para reduzir a formação de "meio-anticorpo" e eliminar glicosilação N-ligada, respectivamente.
DNA complementar dos domínios variáveis (VL) e constante(CL) correspondentes do gene de cadeia leve de M13-C06 e o domínio dogene de cadeia pesada variável (VH) de M13-C06 foi clonado no vetor deexpressão pxWU007. O vetor pxWU007 contém sítios de clonagem parainserir os cDNAs de cadeia leve e pesado variável inteiros diretamente amontante da região constante de cadeia pesada humana. Além dos genesde Ig, este vetor de expressão contém um gene de diidrofolato reductase(DHFR) que pode ser usado para seleção em células mamíferas.
O vetor de expressão resultante foi depois transfeccionado emcélulas CHO para iniciar a geração das linhagens celulares de CHO segre-gantes de anti-IGF-1R (40B5).
PxWU022 foi eletroporado em células CHO. Iniciadores de PCRespecíficos para cadeia leve da imunoglobulina foram usados para amplificarpor PCR o cDNA de cadeia leve de Fab. A seqüência de oligo específica de5' incluiu o peptídeo sinal nativo da cadeia leve da molécula de anti-CD23Biogen ldec. Os oligos de 5' e 3' contêm seqüências de reconhecimento deendonuclease de restrição Sfi I e Asc I, respectivamente, para subclonar emum vetor intermediário (pHLP025). O cDNA de VH foi amplificado por PCRusando um oligo de 5' que incluiu um peptídeo sinal de cadeia pesada sinté-tico. Os oligos de 5' e 3' contêm seqüências de reconhecimento de endonu-clease de restrição de Nco I e Sfi I, respectivamente, para subclonar em umvetor intermediário (pHLP029).
PCR de sobreposição usando os oligos de 5' de cadeia leve e 3'de VH foi empregada e pHLP025 e pHLP029 como modelos para combinara região de cadeia leve e de VH como um segmento de cDNA. O produtoresultante foi subclonado no sítio de Dra Ill de pxWU007 desse modo crian-do o vetor de expressão de splice alternado final, pxWU022. A configuraçãode splice alternada gera duas transcrições de um promotor simples atravésde splicing alternado da transcrição primária. O doador de splice de CMVnatural ou é submetido a splicing com um aceitante de splice sub-ótimo paragerar uma transcrição de codificação de cadeia leve, ou com um aceitantede splice de CMV natural para gerar a transcrição de codificação de cadeiapesada. O aceitante de splice sub-ótimo foi projetado para gerar quantidadessimilares de ambas as transcrições.
O vetor de DNA (pxWU022) foi preparado em tampão de HEBSa uma concentração de 1~1 700 ng/μί. antes da eletroporação para célulasCHO. Foram executados cinco eletroporação usando várias concentraçõesde DNA (15, 20, 30, 40, e 45 pg). Cada eletroporação foi feita em uma cube-ta descartável de 0,4 cm (Invitrogen) contendo 4 χ 106 células CHO de faseIog em 0,7 ml de tampão de HEBS estéril e DNA em 0,1 ml de HEBS (0,8 mlde volume total). Células foram chocadas usando um Bio-Rad Gene PulserxCELL, ajustado em 290 volts, 950 micro Faradays. As células chocadasforam depois deixadas repousar em temperatura ambiente por 10 minutosdepois misturadas com 10 ml de meio de CHOM16 livre de insulina em tem-peratura ambiente, centrifugadas (3' @ 1000 rpm), e aspiradas. Células fo-ram depois re-suspensas em 12 ml (temperatura ambiente) de meio deCHOM16 livre de insulina e transferidas para um frasco de cultura de tecidoT-75.
Células e Meios: antes da eletroporação as células CHO foramcrescidas em meios livres de soro (CHOM24) com a adição de 1x nucleosí-deos. CHOM24 é uma formulação de meios interno quimicamente definidanão contendo nenhum componente animal. Seleção de metotrexato foi exe-cutada em meios quimicamente definidos de CHOM16 e CHOM24 livres denucleosídeo.
Seguindo eletroporação, 4 χ 106 células CHO foram agrupadasem um frasco de T-75. Seleção para expressão de DHFR começou imedia-tamente assim que as células foram inoculadas em meio livre de nucleosí-deo. As células foram eventualmente expandidas para frascos de agitaçãode 125 ml em CHOM24 (~3 semanas). Para isolar as linhagens celularesclonais, os fundos gerais estáveis transfeccionados foram diluídos e banha-dos a 1 célula/poço em 200 μΙ de CHOM16 em quatro placas de 96 poços.As placas foram mantidas a 36s C até que elas fossem tríadas para titulaçãode anticorpo.
Colônias de CHO foram tríadas para produção de imunoglobuli-na através de sobrenadantes de célula ensaiando usando uma ELISA espe-cífica para a cadeia capa humana (dia 21 a dia 28 após colocação em pla-ca). O anticorpo de captura usado na ELISA era uma IgG anti-humana decabra policlonal (SouthernBiotech) e o anticorpo de detecção era um anti-humano de cabra policlonal capa conjugado para peroxidase de raiz-forte(SouthernBiotech). As colônias segregando a quantidade mais alta de imu-noglobulina foram expandidas.
Um total de 381 poços quase confluentes dos 1920 poços se-meados foi ensaiado. Dos 381 poços, 60 foram expandidos para mais estu-do e destes 60, 4 foram selecionados para amplificação (15A7, 40B3, 40B5,40F6).
EXEMPLO 10
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS DE IGG4.P.AGLYDE ANTI-IGF-1R COMPLETAMENTE HUMANOS:
O anticorpo produzido em células CHO foi purificado e caracteri-zado pelos métodos descritos abaixo.
Captura de Proteína A: Pré-equilibrar a coluna de Proteína Acom 1x PBS (tampão de equilibração) a 100-150 cm/hr com 3 volumes decoluna. Carregar o sobrenadante a 150 cm/hr com um máximo de 10 mg dealGF-1 R por mililitro de resina. Após carregar, lavar a coluna com 5 volumesde coluna de tampão de equilibração. Depois, a etapa elui em uma direçãode fluxo ascendente com 100 mM de Glicina, pH 3,0. Colher as frações de-sejadas e titular em pH neutro com 2M de base de Tris. Submeter à diáliseas frações colhidas contra 1x PBS e material concentrado para preparar aetapa por exclusão de tamanho.
Etapa de remoção agregado de SUPERDEx™ 200 (Exclusão deTamanho) envolveu equilibração de SUPERDEx™ 200 com 1x PBS com 1,5volume de coluna a uma taxa de fluxo de 36 cm/hr seguida carregando aproteína e colhendo as frações desejadas.Teste de identidade executado como segue
1). Análise de massa intacta por espectrometria de massa ondeas medições de massa molecular foram executadas em um espectrômetrode massa de eletropulverização (ESI-MSD). Antes da análise, a amostra foireduzida para remover as ligações de dissulfeto. O espectro de massa dedesconvoluto representa as massas das cadeias pesadas e leves.
2). Análise de seqüência N-terminal foi executada através dedegradação de Edman usando um seqüenciador de proteína de ABI equipa-do com um analisador de PTH em-linha. As seqüências foram identificadaspara os aminoácidos iniciais da cadeia leve e cadeia pesada.
3). Mapeamento de peptídeo com análise espectrométrica demassa: Mapas de peptídeo tríptico e/ou EndoLysC foram executados paraobter cobertura de seqüência completa por análise dos dados de LC/MS ge-rados de cada peptídeo. Além disso, determinação dos sítios e quantidadesde oxidação e desamidação foi detectada.
Teste de pureza foi executado por; 1) SDS-PAGE ou CE-SDS:amostras reduzidas e não-reduzidas, esta técnica é usada para medir afragmentação, agregação e impurezas do anticorpo, 2) Técnica SEC-HPLCcom LS e Rl foi usada para medir agregação e fragmentação e difração deluz determina a massa molar dos componentes da amostra. 3) Método degel de SDS ou IEF capilar foi usado para determinar o padrão de focalizaçãoisoelétrica e distribuição de pl das isoformas de carga que podem ser o re-sultado da heterogeneidade C e N-terminal e/ou desamidação.
Por fim, as concentrações de endotoxina foram medidas pelométodo turbidométrico cinético de amebócito de Limulus Iisado (LAL).
FIGURA 6 mostra análise de SDS PAGE não-reduzida e reduzi-da das versões de G4.P.agly dos anticorpos de M13-C06 e M14-C03 com-pletamente humanos. Ambas versões de G4.P e G4.P.agly dos anticorposM13-C06, M14-C03, M14-B01, e M14-G11. M12-E01 e M12-G04 foram pro-duzidas como na versão de G4.P.
EXEMPLO 11
ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DOS ANTICORPOS DE ANTI-IGF-1R COMPLE-TAMENTE HUMANOS
A atividade de ligação para IGF-1R solúvel das versões deG4.P.agly e de G4.P dos anticorpos testados por ELISA. Proteína de fusãode receptor de IGF-1 solúvel (Biogen Idec) a 2,5 pg/ml em 0,025 M de tam-pão de carbonato, pH 9,6 foi revestida para 50 μΙ/poço em uma placa de 96poços (IMMULON2 HB, Dynex Technologies, Inc., Cat. #3455) e incubadadurante a noite a 49 C. A placa foi lavada com solução salina tamponada defosfato (PBS, Irvine Scientific, Cat#9240), pH 7,4 mais 0,025 %Tween 20 naSkan Washer 300 (Skatron Instruments), bloqueada com tampão contendo 1%de leite sem gordura, 0,05 %de Tween 20 em PBS, pH 7,4, e depois incu-bada em temperatura ambiente durante 1 hora. Após a placa de incubaçãoter sido lavada com PBS mais 0,025 %Tween 20 na Skan Washer 300. Parao ensaio, a placa revestida com receptor de IGF-1 solúvel foi incubada emseguida com os anticorpos de controle e de teste de concentrações varia-das, diluídos em 1 %de leite sem gordura, 0,05 %de Tween 20 em PBS a 50μΙ/poço. Seguindo uma incubação de uma hora em temperatura ambiente, aplaca foi lavada com PBS mais 0,025 %Tween 20 na Skan Washer 300.
Uma diluição de 2000 vezes em 1 %de leite sem gordura, 0,05 %de Tweenem PBS anti-humano de cabra capa - HRP (Southern Biotech Cat#2060-05) foi adicionada a 50 μΙ/poço para detectar anticorpo ligado. A placa incu-bada durante 1 hora em temperatura ambiente foi lavada com PBS mais0,025 %Tween 20 na Skan Washer 300. Solução de TMB (KIRKEGAARD &PERRY LABS, INC. Cat: 50-76-00) foi adicionada a 100 μΙ/poço, e a reaçãofoi parada com 50 ul/poço de 4N H2SO4 (LabChem, Cat#LC25830-1) apósdois minutos. A absorbância foi medida a 450 nm, base 540 nm para TMBusando a leitora de placa de Molecular Devices. Os dados foram analisadosusando o pacote de software SOFTMAx PRO versão 4.3 LS (Molecular De-vices Corp.).
FIGURA 7 (A) mostra a ligação dependente de concentração daversão de G4 de M13-C06, M14-C03, M14-G11, M12-E01 e M12-G04, en-quanto que o anticorpo de controle, IDEC-151 (G4.P) novamente não mostranenhuma ligação a IGF-1R.Fc.
FIGURA 7 (B) mostra a ligação dependente de concentração deversão de G4.P.agly de M13-C06, M14-C03 e M14-B01 para IGF-1R.Fc so-lúvel por ELISA. Um anticorpo de G4.P de especificidade irrelevante (IDEC-151) usado como um controle negativo não mostrou nenhuma ligação a IGF-1 R.Fc.
A atividade de ligação de anticorpos humanos para IGF-1R dotipo selvagem expressos em células tumorais foi determinada através decitometria de fluxo. Linhagens de células tumorais MCF-7 e Calu-6 foramcultivadas em Meio Essecial Mínimo Eagle (ATCC, Cat#30-2003) suplemen-tado com 10 %soro bovino fetal (FBS) (Irvine Scientific, Cat#3000A) e 50μ/ml gentamicina (Gibco Invitrogen, Cat#15750-060). Panc-1, Colo-205, NCI-H23 e ZR-75 foram cultivados em RPMI-1640 (ATCC, Cat#30-2001) suple-mentado com 10 %FBS e 50 pg/ml gentamicina. Solução de tripsina-EDTA(Sigma, Cat#T4049) foi usada para remoção das células aderentes dos va-sos de cultura.
As células foram enxaguadas duas vezes com solução salinatamponada de fosfato (PBS) (Irvine Scientific, Cat #9240), pH 7,4, tripsina-das e lavadas uma vez em PBS e 10 %FBS. As células foram ajustadas pa-ra 107 células/ml em tampão de FACS (0,05 %azida de sódio, 2 %FBS, 10%soro de cabra normal e 100 Mg/ml IgG de cabra normal em PBS) e coloca-das em gelo por pelo menos 15 minutos. Anticorpos de controle e de testeforam aliquotados em uma placa Corning 3790. As células a 50 μΙ/poço fo-ram adicionadas a uma placa de Corning 3799. Anticorpos primários da pla-ca de Corning 3790 foram adicionados a 50 μΙ/poço aos respectivos poçosda placa de Corning 3799. Em seguida, as células (0,5 χ 106 célu-las/amostra) foram incubadas 45 min em gelo. Seguindo incubação, as pla-cas de incubação foram centrifugadas a 1500 rpm durante 4 minutos e de-pois os sobrenadantes aspirados. Células foram re-suspensas em 150 μΙ detampão de FACS. As placas foram centrifugadas a 1500 rpm por 4 minutos eos sobrenadantes foram aspirados. Uma diluição de 750 vezes em tampãode FACS de IgG anti-humana de cabra-RPE (Southern Biotech Cat#2040-09) foi adicionada 100 μΙ/poço. Em seguida, as células (0,5 χ 106 célu-las/anticorpo secundário) foram incubadas 45 min em gelo. Uma diluição de500 vezes em tampão de FACS de 7AAD (Molecular Probes, Cat#A1310) foiadicionada 50 μΙ/poço e incubada durante 5 minutos em gelo. Seguindo in-cubação, as placas são giradas a 1500 rpm durante 4 minutos e depois ossobrenadantes foram aspirados. Células foram re-suspensas em 150 μΙ detampão de FACS. As placas foram centrifugadas a 1500 rpm por 4 minutos eos sobrenadantes foram aspirados. Células foram re-suspensas em 100μl/poço de tampão de FACS. As células foram transferidas para tubos deFACS de 12 χ 75 mm com 200 μΙ de tampão de FACS. Por fim, as célulasforam examinadas para intensidade de fluorescência em um FACSCaIiburusando software de CeIIQuest (ambos de Becton Dickinson).
FIGURA 8 mostra a ligação dependente de concentração deM13-C06.G4.P.agly, M14-C03.G4.P.agly e M14-G11.G4.P a IGF-1R expres-so em células MCF-7 (FIGURA 8(A)). A especificidade de ligação de célula-superfície dos anticorpos foi confirmada testando ligação para transfectantesde IGF-1R/3T3 e células 3T3 de origem. Todos os anticorpos líderes mostra-ram reatividade específica para IGF-1R expressando 3T3 mas não para cé-lulas 3T3 (Figura 8(B)).
EXEMPLO 12
INIBIÇÃO DE LIGAÇÃO DE LIGANTE A IGF-1R ATRAVÉS DE ANTICOR-POS COMPLETAMENTE HUMANOS
A habilidade das versões de G4.P.agly e de G4.P dos anticorposhumanos para bloquear ligação de IGF-1 e IGF-2 a IGF-IR-Fc solúvel foideterminada. As versões de lgG4 de M13-C06, M14-G11, M14-B01, M12-E01 e M12-G04 bloquearam ligação de IGF-1 e IGF-2 a IGF-1R, enquantoque M14-C03 apenas bloqueou IGF-2 (FIGURA 9 (A) E (B)).
A habilidade de bloqueio de ligação do anticorpo de anti-IGF-1Rfoi determinada por um método de captura de RIA de fase sólida como des-crito no EXEMPLO 3. Brevemente, os anticorpos em concentrações variadasforam (100 nM-0,01nM) co-incubados com 100.000 cpm de IGF-1 125I-marcado ou 125l-IGF-2 nos poços de uma placa de IMMULON2 de 96 poços,em que IGF-IR-Fc humano foi previamente imobilizado (200 ng/poço). Após1 hora de incubação em temperatura ambiente, os poços foram lavados econtados para radioatividade ligada por um Contador Gama. Um controle deanticorpo negativo equiparado com isótipo, IDEC-151 (G4 humano), foi usa-do. Porcentagem (%) de inibição foi calculada como = [1-(Ave.CPM com Ab)(Ave.CPM com tampão)] χ 100%.
O resultado demonstra que os anticorpos completamente huma-nos M13-C06.G4.P, M13-C06.G4.P.agly, M14-G11.G4.P, M14-G11.G4.P.agly, M14-B01.G4.P.agly, M12-E01 .G4.P, e M12-G04.G4.P blo-quearam IGF-1 e IGF-2 ligando a IGF-1 R, enquanto que, os anticorpos M14-C03.G4.P e M14-C03.G4.P.agly bloquearam apenas IGF-2 ligando a IGF-1R. Vide, FIGURA 9(A)-(B).
EXEMPLO 13
INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULA TUMORAL ATRAVÉS DE AN-TICORPOS DE ANTI-IGF-1R COMPLETAMENTE HUMANOS
A habilidade dos anticorpos para bloquear crescimento de célulatumoral dirigido por IGF-1 e IGF-2 foi testada usando um ensaio de viabilida-de celular.
Linhagens de tumor NCI-H23, Calu-6, Colo-205, Panc-1, BxPC-3(ATCC) foram compradas de ATCC. Linhagens celulares foram crescidasem meio de crescimento completo contendo RPMI-1640 (ATCC), 10 %sorobovino fetal (Irvine Scientific Inc.) e 50 pg/ml de Gentamicina (Gibco, Invitro-gen). Solução de tripsina-EDTA (Sigma) foi usada para remoção das célulasaderentes dos vasos de cultura. Solução salina tamponada de fosfato, pH7,2, foi de MediaTech Inc. As placas de fundo claro de 96 poços para ensaioIuminescente foi comprada de Wallac Inc.
Células crescidas para 80 %de monocamadas foram tripsinadas,lavadas, re-suspensas e banhadas em placas de 96 poços em 200 μΙ de 2%meio de crescimento a 8x103 células/poço para células de NCI-H23 e deColo-205; e 5x103 células/poço para células de Calu-6, Panc-1 e BxPC-3.Após 24 horas, o meio de cultura foi substituído com 100 μΙ de meio livre desoro (SFM), e 50 μΙ de anticorpos serialmente diluídos em 4x concentraçãoforam adicionados. Seguindo outra hora de incubação a 379 C, 50 μΙ de IGF-1 ou IGF-2 em 4x concentração foram adicionados e incubados a 379 C até48 horas para medir o crescimento de célula. Todos os tratamentos foramfeitos em triplica. Crescimento da célula foi medido usando o Ensaio de Via-bilidade Celular Luminescente CELL TITER-GLO™ (Promega, Madison, Wl).A mistura 1:1 de reagente e SFM foi adicionada a 200 μΙ/poço. Luminescên-cia foi detectada na leitora de placa Wallac (Boston, MA).
As várias versões de lgG4 humana dos anticorpos de anti-IGF-1R exibiram inibição da proliferação de célula dirigida por IGF-1 e IGF-2 emcélulas de H-23 (IGF-1 e IGF-2) Calu-6 (IGF-2) (FIGURA IO(A)-(C)). Outraslinhagens celulares exibiram tendências comparáveis (vide por exemplo,EXEMPLO 20)
EXEMPLO 14
INTERNALIZACÃO DE IGF-1 R ATRAVÉS DE ANTICORPOS DE ANTI-IGF-1R COMPLETAMENTE HUMANOS
Células MCF-7 foram semeadas em 50.000 células por poço emlâminas de câmara de 8 poços (Becton Dickinson, lâminas de cultura reves-tidas com Colágeno Tipo 1, BD BioCoat™ #354630) 48 horas antes dos pro-cedimentos de tingimento. As células foram habitualmente mantidas abaixode 20 passagens. No dia dos procedimentos de tingimento, os meios de cul-tura foram descartados de cada poço e substituídos com 500 μΙ de tampãode incubação a frio (MEM Eagle ATCC #30-2003 + 1 %BSA). As células fo-ram lavadas 2x com este tampão por 3 min cada lavagem. 250 μΙ de cadamAb ou anticorpo de G4.P.agly humano a ser testado foram depois adicio-nados ao poço apropriado a uma concentração de 10 μg/ml, diluídos emmeios de incubação, e incubados em gelo durante 1 hora. Um anticorpo deIGF-1R anti-humano de murino (Lab Vision/NeoMarkers, clone 24-31 Cat#MS-641) foi usado como um anticorpo de controle positivo para comparar ograu de internalização. Após a incubação de 1 hora em gelo, o tempo zero (t= 0') a lâmina foi lavada 3x com 500 μΙ de tampão de lavagem frio (PBS + 1%BSA + 2 %soro de cabra) por 3 min cada lavagem (lâminas sempre manti-das em gelo!). Em t = 0 a lâmina foi depois fixadacom 500 μΙ de 4 %parafor-maldeído (diluído com PBS de 16 %matéria-prima; EMS #15710) durante 15minutos em temperatura ambiente. Em t = 0 a lâmina foi depois lavada 3xnovamente com tampão de lavagem frio durante 3 minutos cada lavagem,depois deixada em gelo. Enquanto isso, as lâminas restantes foram postasem uma incubadora a 37e C para seus pontos de tempo designados (15 e 60minutos). Ao término de seu tempo de incubação, cada lâmina seguiu osmesmos procedimentos acima como - lavagens e fixação, e colocadas emgelo. Todas as lâminas foram depois permeabilizadas com 200 μΙ de tampãode permeabilização frio (tampão de lavagem + 0,5 %Triton-x) durante 10 mi-nutos em gelo. Todas as lâminas foram depois lavadas 3x com 500 μΙ detampão de lavagem frio durante 3 minutos cada lavagem. O anticorpo se-cundário foi preparado a uma diluição de 1:1000 (AIexaFIuor 488 IgG de an-ti-camundongo de Cabra (H + L), Molecular Probes #A11029 para os mAbse AIexaFIuor 488 IgG anti-humana de cabra (H + L), Molecular Probes#A11013 para anticorpos de G4) em tampão de lavagem, após um giro inici-al do frasco de matéria-prima a 10.000 rpm por 10min a 4S C. 250 μΙ do anti-corpo secundário diluído foram adicionados a cada poço e incubados por 40min em temperatura ambiente na escuridão (cobertos). As lâminas foramlavadas novamente 3x com 500 μΙ de tampão de lavagem frio. Na lavagemfinal, o tampão foi descartado e todos os poços foram deixados vazios. Ascâmaras foram depois desmontadas da lâmina usando a ferramenta de se-paração fornecida, e as lâminas de cobertura foram montadas com meio demontagem de Vectashield contendo DAPI (Vector #H-1500, Hard Set™). Aslâminas foram armazenadas a A- C na escuridão durante a noite para permi-tir o meio de montagem secar.Fotos das lâminas foram tiradas com um microscópio confocalusando o programa LaserSharp 2000 (BioRad v5.2) e representadas comouma fusão de componentes azuis e verdes de meios Kalman 10.
M13-C06.G4.P.agly mostrou internalização rápida de IGF-1R em60 min como mostrado na FIGURA 13A. M14-C03.G4.P.agly e M14-G11.4.Ptodos mostraram propriedade de internalização similar ao anticorpo de M13-C06.G4.P.agly (dados não mostrados). Como esperado o controle positivo,clone 24-31, também interiorizou o receptor enquanto que os controles nega-tivos equiparados com isótipo (camundongo 7F2 e G4 humano, IDEC-152.G.P (anticorpo de primata)) não ligam ou interiorizaram (FIGURA 13(B)-(C)).
Além disso, a taxa de internalização do receptor foi medida porum método baseado em FACS para certos dos anticorpos monoclonais mu-rinos. Células MCF-7 foram crescidas para 70 %conf!uentes monocamadasforam deixadas retiradas do frasco com tampão de dissociação de célula(Catálogo de Gibco #13151-014). As células re-suspensas foram adiciona-das em meios e 5x106 células em tubo de 12x75mm (catálogo de Falcon#352054), onde cada tubo representa um mAb diferente a ser testado. 10Mg/ml de mAb foram adicionados a seu tubo correspondente em 0,5 ml detampão de FACS não contendo nenhuma azida (PBS + 1 %BSA) como tam-bém um tubo de controle sem anticorpo para medir erro de internalizaçãoexperimental. Os tubos foram incubados em gelo por 1 hora e 15 minutos,depois lavados e reconstituídos em 1 ml de tampão de FACS. 100 μΙ de ca-da amostra foram removidos em 1 poço de uma placa de fundo-u de 96 po-ços (NUNC #163320) mantida em gelo para impedir internalização e deno-minado tempo zero (t = 0). Esta foi usada como um controle ligado de 100%Ab. Tubos foram depois transferidos para um banho de água a 37e C e100 μl de amostras removidas em tempo (t) = 5, 10, 20, 40, e 60 minutos(depois alterados para 5, 10, 15, 30 e 60 minutos) e colocadas em poçosseparados de uma placa de fundo-u de 96 poços em gelo. Uma vez todas asamostras foram colhidas, as placas foram giradas a 1200 rpm em uma cen-trífuga 4°C para empelotar as células. Anticorpo adicionado para detectarinternalização do receptor foi anti-CD221-PE (Cat de BD Pharmingen#555999 - anti-IGF-1R; 10 μ/100 μΙ de amostra) para detectar os receptoresque permanecem na superfície de célula, ou PE de anti-camundongo de ca-bra (Jackson ImmunoResearch Lab cat#115-116-146; 5 μg/ml) pra detectaro anticorpo que permanece na superfície da célula. As amostras foram incu-badas 1 hora em tampão de FACS contendo 0,1 %Azida de Sódio, x1 lava-das, e tragas para um volume final de 200 μΙ em tampão de FACS contendoazida. Amostras foram depois corridas e colhidas usando um FACSArray(BD) e as médias geométricas determinaram. Também correr as contas deQuantibrite marcadas com PE (BD #340495) para quantificar o número demoléculas de PE ligadas à superfície da célula onde a conta de Quantibrite écorrida no mesmo ajuste de FL2 que as amostras. O número de moléculasde PE ligadas à conta é dado em seu empacotamento, permitindo a quantifi-cação do número de moléculas de PE ligadas à superfície da célula usandomédias geométricas da amostra e das contas. O ensaio de FACS mostrouque os anticorpos monoclonais murinos testados promoveram internalizaçãode IGF-1R (dados não mostrados).
EXEMPLO 15
INIBICÂO DE SINALIZAÇÃO MEDIADA POR IGF-1R ATRAVÉS DE ANTI-
CORPOS COMPLETAMENTE HUMANOS
PARTE I: INIBIÇÃO DE TRANSDUÇÃO DE SINAL EM CÉLU-LAS DE MCF-7
O efeito dos anticorpos de anti-IGF-1R humano na sinalizaçãode IGF-1R foi avaliado usando células MCF-7 (células de adenocarcinomade mama humana). A habilidade dos anticorpos para bloquear fosforilaçãode receptor de IGF-1R mediado por IGF-1 e IGF-2 foi determinada comodescrito no EXEMPLO 4. Todas as versões de lgG4 dos anticorpos comple-tamente humanos mostraram inibição boa (EC50 < 1 nM) e inibiram a fosfo-rilação de IGF-1 R (FIGURA 11 (A & B).
Para detectar o efeito na sinalização a jusante, Iisados de célulaforam gerados como descrito no EXEMPLO 4. Para controle dos experimen-tos de sinalização e os anticorpos de teste foram adicionados após privaçãode soro a 100 nM, 15 nM, 5 nM e 1 nM em 350 μl de meios frescos livres desoro e incubados durante 1 hora a 37- C. IGF-1 recombinante humano a 13nM ou IGF-II a 27 nM (R & D Systems, #291-G1 e #292-G2) foram adiciona-dos aos poços em 35 μΙ de meios livres de soro e incubados em temperaturaambiente durante 15 minutos. As células foram Iisadas e restabelecidas deamostra separada usando um gel de 4-12 %Bis-Tris e imobilizadas em nitro-celulose (Invitrogen Corp.). A via de sinalização de IGF-1R foi detectada comfosfo-Akt no sítio Thr308 (Cell Signaling Technologies, #4056) e MAPK defosfo-p44/42 no sítio Thr202/Tyr204 (Cell Signaling Technologies, #9101) eIgG-HRP de anti-coelho (Cell Signaling Technologies, #7071). As bandasforam visualizadas usando reagente de ECL Iuminol (Amersham Bioscien-ces, #RPN2109) e auto-radiografia. Cada borrão foi tirado respectivamentedo anticorpo e re-sondado para Akt total (Cell Signaling Technologies,#9272) ou MAPK de p44/42 total (Cell Signaling Technologies, #9102) e IgG-HRP de anti-coelho. Bandas visualizadas usando reagente de Iuminol deECL e auto-radiografia.
O efeito do anticorpo em eventos de sinalização de fluxo des-cendente tal como fosforilação de Akt e de MAPK foi determinado. Usadosde célula de autofosforilação foram imunopreciptados com conjugado de an-ticorpo de IGF-1 Ρβ policlonal-agarose (Santa Cruz Biotechnology, #SC-713).Proteína de receptor restabelecida foi separada usando um gel de 4-12%Tris-glicina e imobilizada em nitrocelulose (Invitrogen Corp.). Receptor foidetectado com sítio de anti-fosfo-IGF-1R Tyrl 131 (Cell Signaling Technolo-gies, #3021) ou anti-IGF-1Rp (Santa Cruz Biotechnology, #SC-9038) e IgG-HRP de anti-coelho (Cell Signaling Technologies, #7071). As bandas foramvisualizadas usando Reagente de ECL Iuminol (Amersham Biosciences,#RPN2109) e auto-radiografia. (FIGURA 12A E 12B).
FIGURAS 12 A & B mostram que M13.C06.G4.P.agly inibiu fos-forilação mediada por IGF-1 e IGF-2 de Akt e P42/44 MAPK em uma dosemaneira-dependente. Em particular, o anticorpo de IGF-1 R de M13-C06.G4.P.agly inibiu sinalização induzida por ligante de Akt em célulasMCF7 em todas as concentrações testadas (isto é, 1-100 nM), como de-monstrado por inibição de fosforilação induzida por IGF-1 e IGF-2 de Akt noresíduo de aminoácido Ser473 (FIGURA 19). Os anticorpos de controle fo-ram testados a 100 nM, enquanto que M13-C06.G4.P.agly foi testado a 100,15, 5 e 1 nM. Anticorpo IDEC-152, uma versão de G4 humana de um anti-corpo de especificidade irrelevante, foi usado como um controle negativo.Anticorpo IR3, um anticorpo monoclonal murino para IGF-1R, foi usado co-mo um controle positivo. Além disso, anticorpos de M14-C03.G4.P.agly eM14.G11.G4.P de comprimento total também inibiram sinalização de Aktdirigida por IGF-1 e IGF-2 e ativação de P42/44 MAPK (dados não mostrados).
PARTE II: INIBIÇÃO DA TRANSDUCÀO DE SINAL EM CÉLULAS DE A549.CALU-6. E H1299
A habilidade de M13-C06.G4.P.agly para romper a associaçãodo substrato de receptor de insulina (IRS-1) com subunidade reguladora p85de 3-cinase de fosfoinositida (PI3K), foi determinada em linhagens de célulatumoral por um ensaio de co-imunoprecipitação. Em particular, IRS-1 liga àsubunidade p85 de PI3K de uma maneira IGF-1 R-dependente em linhagenscelulares de NSCLC sensíveis ao anticorpo de M13-C06.G4.P.agly. Dessemodo, duas linhagens celulares de célula não-pequena de carcinoma pul-monar (NSCLC) A549 e H1299 (responsivas a M13-C06.G4.P.agly) e umalinhagem celular de NSCLC, Calu-6 (menos responsiva a M13-C06.G4.P.agly) foram crescidas na presença de M13.C06.G4.P.agly ou anti-corpo de controle (IDEC-151) durante 24 horas. Lisados de célula foram i-munoprecipitados com um anticorpo de anti-p85 e submetidos à análise dewestern blot com anticorpos de anti-IRS-1 (borrão do topo) e anti-p85 (bor-rão do fundo) (FIGURA 25).
Para este ensaio, as linhagens de célula tumoral pulmonar hu-manas células de A549, Calu-6, e NCI-1299 de foram compradas ATCC emantidas em meio de RPMI 1640 contendo 10 %de soro bovino fetal (FBS).As células foram semeadas em 3x106 células por prato em pratos de 100mM, cultivadas durante 24 horas, e depois tratadas com 100 nM de M13-C06.G4.P.agly ou IDEC-151 (anticorpo de controle negativo de G4.P huma-no equiparado com isótipo) durante 24 horas na presença de 5 %FBS. Usa-dos das células foram preparados em tampão de Iise a 1 %Triton x-100 deCell Signaling Technologies, Inc. (Danvers, MA USA)). Para imunoprecipita-ção, o anticorpo de anti-p85 (Cat #06-649, Upstate Cell Signaling Solutions(agora parte de Millipore, Concord, MA (USA)) foi adicionado ao Iisado (4 ugde anticorpo por 1-2 mg de lisado) e incubado a 4- C durante a noite. O imu-nocomplexo foi depois capturado misturando com contas de agarose de pro-teína G durante 2 horas a 4Q C. Os imunopreciptados foram lavados comtampão de Iise esfriado em gelo e fervidos em tampão de amostra de 2xLDS (Sulfato de Dodecila de Lítio) antes da separação por eletroforese emgel a 4-12 %Bis-Tris de NuPAGE® Novex (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA(USA)), e transferir as membranas de nitrocelulose. Anticorpos de IRS-1 (Cat#06-248, Upstate) e p85 (Cat #06-649, Upstate) foram comprados de Millipo-re e imunotingimento foi executado de acordo com os protocolos do fabrican-te.
RESULTADO:
M13-C06.G4.P.agly inibiu a associação de IRS-1 com a subuni-dade reguladora de p85 de PI3K na presença de soro em linhagens celula-res de em A549 e H1299 mas não em Calu-6 (FIGURA 25).EXEMPLO 16
REATIVIDADE CRUZADA DO ANTICORPO PARA IGF-1R DE PRIMATANÂO-HUMANO
A habilidade de anticorpos de IGF-1R anti-humano para reco-nhecer o IGF-1R de primatas não-humanos foi testada. Primeiro IGF-1R demacaco Reso e cinomólogo foi clonado e expressado em células CHO. Aligação de todos os anticorpos foi determinada através de citometria de fluxoe confirmada através de microscopia confocal. M13.C06.G4.P.agly,M14.C03.G4.P.agly e M14.G11.G4.P todos mostraram atividade de ligaçãoespecífica para IGF-1R Reso e cinomólogo (dados não mostrados). Estudosde reatividade cruzada das espécies também mostraram ligação deM14.G11.G4.P e M14.C03.G4.P.agly a IGF-1R murino expressando célulasCHO (dados não mostrados).Além IGF-1R de cinomólogo expressado em células CHO1 o an-ticorpo de M13.C06.G4.P.agly também reage cruzado com IGF-1R de ma-caco cinomólogo expressado em granulócitos e monócitos desta espécie.(Especificidade de ligação foi demonstrada pela habilidade de IGF-1R hu-mano recombinante solúvel para bloquear ligação de anticorpo deM13.C06.G4.P.agly (dados não mostrados)). Similarmente, o anticorpo deM13.C06.G4.P.agly também liga a uma linhagem celular de fibroblasto ci-nomólogo estabelecida. (Vide, EXEMPLO 26, FIGURA 23). Estes resultadosindicam que macaco cinomólogo é uma espécie não-roedora ideal em que oteste de toxicidade foi executado.
Em contraste com os resultados com o receptor de IGF-1R emprimatas, M13.C06.G4.P.agly não mostrou reatividade cruzada para IGF-1Rde rato ou camundongo expressado em células imunes (granulócitos, monó-citos, linfócitos) como avaliado por análise de FACS.
EXEMPLO 17
GERAÇÃO DE MABS MURINOS ESPECÍFICOS PARA IGF-1R
Anticorpos monoclonais murinos específicos para IGF-1R huma-no foram gerados através de tecnologia de hibridoma padrão. Esplenócitosde camundongos Balb/c foram imunizados com IGF-1 R expressando fibro-blasto 3T3 e proteína fusão de NIH e IGF-1 R.Ig foram usados para fusão decélula somática induzida por PEG. Tabela 4 resume as propriedades dosanticorpos monoclonais murinos de anti-IGF-1R.
A habilidade dos anticorpos murinos selecionados para inibircrescimento dependente de IGF/IGF-1R in vitro de várias linhagens de tumorhumano (Pulmão, H-23, Calu-6; Pâncreas, BxPc-3, Panc-1, MiaPaCa e Có-Ion Colo205) foi medida por uma proliferação como descrito no EXEMPLO13. FIGURA 14(A)-(F) mostra os efeitos inibidores dependentes da concen-tração de anticorpo de oito dos anticorpos murinos em crescimento de célulatumoral na presença de IGF-1 a 100 ng/ml.
A habilidade dos anticorpos para bloquear crescimento de célulatumoral dirigido por IGF-1 e IGF-2 foi comparada usando a linhagem de célu-la tumoral pulmonar de NCI-H23. FIGURA 15 dá um exemplo dos efeitosinibidores de crescimento vistos com três dos MAbs murinos (P2A7-3E11,20C8-3E8, P1A2-2B11) e um do anticorpo completamente humano, M13-C06.G4.P.agly. Todos os anticorpos mostraram inibição de Crescimento detumor dirigido por IGF-1 e IGF-2. Como controle positivo IR3, um anticorpode anti-IGF-1R comercialmente disponível foi usado. IgG de camundongo(anti-IDectin, IgG 1) e a versão gama humana 4 de anticorpo de IDEC-152 deespecificidade irrelevante foram usadas como controles equiparados comisótipo para os experimentos.EXEMPLO 18
CLONAGEM DE mABs DE IGF-1R ANTI-HUMANO MURINO
Clonagem de mABs das regiões variáveis de imunoglobulina deP2A7.3E11 de hibridoma murino de anti-IGF-1R
RNA celular total de células de hibridoma murino foi preparadousando um Kit Qiagen RNeasy Mini seguindo o protocolo recomendado dofabricante. cDNAs que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas eleves foram clonadas por RT-PCR de RNA celular total usando o kit de Sín-tese de cDNA de Primeiro Filamento de Pharmacia Biotech seguindo o pro-tocolo recomendado pelo fabricante usando hexâmeros aleatórios para pre-paração.
A clonagem e quimerização dos domínios variáveis deP2A7.3E11 serão descritas em detalhes como um exemplo (outros domíniosvariáveis de mAb foram clonados e quimerizados através de métodos simila-res, mas não serão descritos em detalhes por motivos de brevidade, umavez que as técnicas de biologia molecular padrões familiares àqueles versa-dos na técnica de engenheirar anticorpo foram usadas). Para amplificaçãode PCR dos domínios variáveis de imunoglobulina murina com seqüênciassinais intactas, um coquetel de iniciadores diretos degenerados que hibridamcom as seqüências sinais murinas múltiplas da família do gene de imunoglo-bulina e um iniciador reverso simples específico para terminação 5' do domí-nio constante murino como descrito em Current Protocols in Immunology(Wiley and Sons, 1999) foi usado. Condições de PCR usando a Taq polime-rase de Clontech Advantage foram: desnaturação inicial por 2 min a 94Q, se-guido por 30 ciclos de desnaturação 1 min a 94° recozimento de 1 min a45Q, e alongamento de 1 min a 72Q. O domínio variável de cadeia pesada deP2A7 foi amplificado com os iniciadores a seguir: 5' GGG GAT ATC CACCAT GGR ATG SAG CTG KGT MAT SCT CTT 3' (M=A/C, K=G/T, R=A/G, eS=C/G) (SEQ ID NO: 130) e 5' AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGGRRC CAG TGG ATA GAC 3' (R=A/G, e Y=C/T). (SEQ ID NO: 131). O domí-nio variável de cadeia leve de P2A7 com sua seqüência sinal foi amplificadocom os iniciadores a seguir: 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGA TTT TCAGGT GCA GAT TTT CAG 3' (SEQ ID NO: 132) e 5' GCG TCT AGA ACTGGA TGG TGG GAG ATG GA 3' (SEQ ID NO: 133). Os produtos de PCRforam purificados em gel usando um Kit de extração em gel de Qiagen Qia-quick seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Os produtos dePCR purificados foram subclonados no vetor de pCR2.1TOPO de Invitrogenusando seu kit de clonagem de TOPO seguindo o protocolo recomendadopelo fabricante. Inserções de múltiplos subclones independente foram se-qüenciadas para vigiar contra erros de PCR.
Analise de Blast das seqüências de domínio variável confirmousua identidade da imunoglobulina. O domínio variável de cadeia pesada deP2A7 é um membro do subgrupo murino II(A). A seqüência do domínio vari-ável de cadeia pesada de P2A7 madura, com suas CDRs sublinhadas (comas CDRs, regiões de determinação de complementaridade, com base nasdesignações de Kabat) é mostrada abaixo:
1 QVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGNTFT DYVINWVKQR TGQGLEWIGE
51 IYPGNENTYY NEKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSED SAVYFCARGI
25 101 YYYGSRTRTM DYWGQGTSVT VSS (SEQ ID NO:38)
A região variável de cadeia leve de P2A7 é um membro do sub-grupo IV capa murino. A seqüência do domínio variável de cadeia leve ma-dura de P2A7, com suas CDRs sublinhadas, é mostrada abaixo:
1 EWLTQSPTA MAASPGEKIT ITCSASSTLS SNYLHWYQQK PGFSPKLLIY
30 51 RTSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYCQ QGSSIPLTFG
101 AGTKLELK (SEQ ID NO:98)
CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DE chP2A7cDNAs que codifica as regiões variáveis de cadeias pesadas eleves murinas de P2A7 foram usadas para vetores de construção para ex-pressão de quimeras murinas-humanas (chP2A7) em que as regiões variá-veis de muP2A7 foram ligadas a lgG4 humana e regiões capa constantes.
Para construção da quimera de cadeia pesada, um fragmento de 0,47 kb deNotl-BsmB\ do subclone de cadeia pesada de P2A7 pCN363 e o fragmentode 1,0 kb de BsmBI-NotI de pEAG1995 (um plasmídeo contendo um cDNAde domínio constante de cadeia pesada de hulgG4 variante deS228P/T299A aglicosilado confirmado por seqüência (Nomenclatura de Ka-bat EU) com o resíduo de Iisina C-terminal de lgG4 removido geneticamente)foram subclonados na cadeia principal Iinearizada com Notl tratada com fos-fatase de 6,1 kb do vetor pV90 (um vetor de expressão particular de BiogenIdec baseado em PUC confirmado por seqüência contendo um marcadorselecionável de dhfr dirigido por promotor de SV40 precoce em que expres-são de gene heteróloga é controlada por um promotor de CMV-IE e um sinalde poliadenilação de hormônio de crescimento humano). A seqüência decDNA de cadeia pesada no plasmídeo pEAG2045 resultante foi confirmadaatravés de seqüenciação de DNA. A seqüência da inserção do cDNA quimé-rico de P2A7 de cadeia pesada (do iniciador da seqüência sinal ATG até oterminador TGA) é mostrada abaixo como SEQ ID NO: 134:
1 ATGGAATGGA GCTGTGTCAT GCTCTTCATC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT51 CCACTCCCAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTA GTGAAGCCTG101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGAAACAC ATTCACTGAC151 TATGTTATAA ACTGGGTGAA GCAGAGAACT GGACAGGGCC TTGAGTGGAT201 TGGAGAGATT TATCCTGGAA ATGAAAATAC TTATTACAAT GAGAAGTTCA251 AGGGCAAGGC CACACTGACT GCAGACAAAT CCTCCAACAC AGCCTACATG301 CAGCTCAGTA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT TCTGTGCAAG351 AGGGATTTAT TACTACGGTA GTAGGACGAG GACTATGGAC TACTGGGGTC401 AAGGAACCTC AGTCACCGTC TCCTCAGCCT CCACCAAGGG CCCATCCGTC451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGATCTACC TCCGAGAGCA CAGCCGCCCT501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA551 ACTCAGGCGC CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG651 CTTGGGCACG AAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA701 CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGTCCAAAT ATGGTCCCCC ATGCCCACCG751 TGCCCAGCAC CTGAGTTCCT GGGGGGACCA TCAGTCTTCC TGTTCCCCCC801 AAAACCCAAG GACACTCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC901 GTGGATGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA951 GTTCAACAGC GCGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC1051 CCGTCCTCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA1101 GCCACAAGTG TACACCCTGC CCCCATCCCA GGAGGAGATG ACCAAGAACC1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC1251 TCCCGTCCTC GATTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AGGCTAACCG1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG GAGGGGAATG TCTTCTCATG CTCCGTGATG1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCT1401 GGGTTGA
A seqüência de proteína de cadeia pesada de chP2A7 maduraprognosticada é mostrada abaixo como SEQ ID NO: 135:
1 QVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGNTFT DYVINWVKQR TGQGLEWIGE51 IYPGNENTYY NEKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSED SAVYFCARGI101 YYYGSRTRTM DYWGQGTSVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC151 LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS WTVPSSSLG201 TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP PCPAPEFLGG PSVFLFPPKP251 KDTLMISRTP EVTCVWDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN301 SAYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ351 VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV401 LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLG
O domínio variável murino são os resíduos 1-122, o domínioconstante de cadeia pesada de lgG4 humana são os resíduos 123-459. Asubstituição de dobradiça de S228P designada por Kabat EU (para corrigir atendência de lgG4 de formar meio-anticorpos) é o resíduo acima 231, en-quanto a substituição de T299A em CH2 para remover glicosilação geneti-camente N-Iigada é o resíduo 302 na seqüência acima.
Para construção da quimera de cadeia leve, a cadeia leve deP2A7 amplificada por PCR foi submetida à mutagênese dirigida usando umkit mutagênese de alteração rápida de STRATAGENE® seguindo o protoco-lo recomendado pelo fabricante, com os iniciadores mutagênicos 5' CGCCAG TGT GCG GCC GCT GGA ATT CGC CCT TG 3'(SEQ ID NO: 136) eseu complemento reverso, que introduziu um sítio de Notl único 5' da se-qüência sinal de cadeia pesada e 5' GGA CCA AGC TGG AGC TGA AGCGTA CGG ATG CTG CAC CAA CTG TAT CC 3' (SEQ ID NO: 137) e seucomplemento reverso, que introduziu um sítio de BsiWI único imediatamentea jusante da junção de domínio variável/constante capa de cadeia leve.Plasmídeos mutados foram identificados triando as alterações do sítio deNotl e BsiWI introduzidos. A seqüência de cadeia leve foi confirmada atravésde seqüenciação de DNA. O fragmento de domínio variável de 0,42 kb deNotI-BsiWI de cadeia leve produzido como descrito acima, e o fragmento de0,34 kb de BsiWI-NotI do plasmídeo pEAG1572, contendo um cDNA de do-mínio constante de cadeia leve capa anti-LTbR humanizado confirmado porseqüência, foram subclonados no sítio de Notl do vetor de expressão pE-AG1256 (um vetor de expressão baseado em pUC confirmado por seqüên-cia contendo um marcador selecionável de neo dirigido por promotor de fos-foglicerocinase em que a expressão do gene heterólogo é controlada por umpromotor de CMV-IE e um sinal de poliadenilação de crescimento hormonalhumano). A seqüência de cDNA de cadeia leve no plasmídeo resultante foiconfirmada através de seqüenciação de DNA. A seqüência da inserção decDNA de cadeia leve de P2A7 quimérica (do iniciador da seqüência sinalATG ao terminador TAG) é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 138):
1 ATGGATTTTC AGGTGCAGAT TTTCAGCTTG CTGCTAATCA GTGTCACAGT51 CATAGTGTCT AATGGAGAAG TTGTGCTCAC CCAGTCTCCA ACCGCCATGG101 CTGCATCTCC CGGGGAGAAG ATCACTATCA CCTGCAGTGC CAGCTCAACT151 TTAAGTTCCA ATTACTTGCA TTGGTATCAG CAGAAGCCAG GATTCTCCCC201 TAAACTCTTG ATTTATAGGA CATCCAATCT GGCCTCTGGA GTCCCAGGTC251 GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATTGGCACC301 ATGGAGGCTG AAGATGTTGC CACTTACTAC TGCCAGCAGG GTAGTAGTAT351 ACCGCTCACG TTCGGTGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAAG CGTACGGTGG401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AAC TTC TATC CCAGAGAGGC501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA701 GGGGAGAGTG TTAG
A seqüência de proteína madura de cadeia leve de chP2A7prognosticada é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 139):
1 EWLTQSPTA MAASPGEKIT ITCSASSTLS SNYLHWYQQK PGFSPKLLIY
51 RTSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYCQ QGSSIPLTFG
101 AGTKLELKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASWCLLNNF YPREAKVQWK
151 VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ
201 GLSSPVTKSF NRGEC
O domínio variável murino são os resíduos 1-108 acima, en-quanto o domínio constante capa humano são os resíduos 109-215 na se-qüência acima.
O vetor de expressão de cadeia pesada de chP2A7 e o vetor deexpressão de cadeia leve de chP2A7 foram co-transfeccionados para célulasde 293-EBNA e as células transfeccionadas foram testadas para secreção eespecificidade do anticorpo. Células transfeccionadas de vetor vazio e lgG4de hu5c8-S228P/T299A (um mAb CD40L-específico molecularmente clona-do) serviram como controles. Análise de western blot (desenvolvida com an-ticorpos anti-humanos de cadeia pesada e leve) de meio condicionado indi-cou que as células transfeccionadas com chP2A7 sintetizaram e eficiente-mente segregaram cadeias pesadas e leves. Análise de FACS de células deadenocarcinoma mamário humano de MCF7 de expressão de IGF-1R tingi-das com meio condicionado de células transfeccionadas indicou que o anti-corpo de chP2A7 ligado e produziu padrões de tingimento similares aos demuP2A7, enquanto o meio condicionado de células transfeccionadas demock e hu5c8 não tingiram as células de MCF7 (detectado com anticorposde cadeia pesada e leve anti-humanos conjugados com PE). Titulação dediluição indicou que tingimento específico com o meio condicionado conten-do mAb de chP2A7 demonstrou uma resposta de dose. As células CHO fo-ram co-transfeccionadas com o vetor de expressão de cadeia pesada dechP2A7 e o vetor de expressão de cadeia leve de chP2A7 para gerar linha-gens estáveis expressando hulgG4 aglicosilado de P2A7- quimérico, mAbcapa.
Clonagem das regiões variáveis de imunoqlobulina de 20C8.3B8 de hibrido-ma murino anti-IGF-1R
Domínios variáveis de outros mAbs de anti-IGF-1R foram clona-dos e quimerizados através de técnicas de DNA recombinante padrões simi-lares às descritas para o mAb de P2A7.
A seqüência madura prognosticada do domínio variável de ca-deia pesada de mAb de 20C8.3B8, pertencendo ao subgrupo I(A) murino, émostrada abaixo com suas CDRs sublinhadas:
1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG101 YGYRSAYYFD YWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO:43)
A seqüência madura prognosticada do domínio variável de ca-deia leve de 20C8, pertencendo ao subgrupo Ill capa murino, é mostradaabaixo:
1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSAYSYMHWY QQKPGQPPKL51 LIYLASNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELPY101 TFGGGTKLEI K (SEQ ID NO:103)
Vetores de expressão para cDNAs de cadeia pesada e leve de20C8 quiméricos foram construídos como descrito acima. A seqüência decDNA de imunoglobulina nas inserções dos plasmídeos foi confirmada atra-vés de seqüenciação de DNA. A seqüência da inserção de cDNA de cadeiapesada de 20C8 quimérico (do iniciador da seqüência sinal ATG ao termina-dor TGA) é mostrada abaixo como SEQ ID NO: 140:1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC51 CCACTCCGAC GTCCAACTGC AGGAGTCTGG ACCTGACCTG GTGAAACCTT101 CTCAGTCACT TTCACTCACC TGCACTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT151 GGTTATAGCT GGCACTGGAT CCGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG201 GATGGGCTAC ATACACTACA GTGGTGGCAC TAACTACAAC CCATCTCTCA
2 51 AAAGTCGAAT CTCTATCACT CGAGACACAT CCAAGAACCA GTTCTTCCTC301 CAGTTGAATT CTGTGACTAC TGAGGACACA GCCACATATT ACTGTGCAAG351 ATCGGGGTAC GGCTACAGGA GTGCGTACTA TTTTGACTAC TGGGGCCAAG401 GGACCACGGT CACCGTCTCC TCAGCTTCCA CCAAGGGCCC ATCCGTCTTC451 CCCCTGGCGC CCTGCTCCAG ATCTACCTCC GAGAGCACAG CCGCCCTGGG501 CTGCCTGGTC AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT551 CAGGCGCCCT GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCGGCTGT CCTACAGTCC601 TCAGGACTCT ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAGCTT651 GGGCACGAAG ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA701 AGGTGGACAA GAGAGTTGAG TCCAAATATG GTCCCCCATG CCCACCGTGC751 CCAGCACCTG AGTTCCTGGG GGGACCATCA GTCTTCCTGT TCCCCCCAAA801 ACCCAAGGAC ACTCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG851 TGGTGGACGT GAGCCAGGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG901 GATGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTT951 CAACAGCGCG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCG1051 TCCTCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAGCC1101 ACAAGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCAGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC1251 CGTCCTCGAT TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAGG CTAACCGTGG1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGGAG GGGAATGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACACAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCTGGG1401 TTGA
A seqüência de proteína de cadeia pesada de ch20C8 maduraprognosticada é mostrada abaixo como SEQ ID NO: 141:
1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG101 YGYRSAYYFD YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK251 DTLMISRTPE VTCVWDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS301 AYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLG
O domínio variável murino são os resíduos 1-122, o domínioconstante de cadeia pesada de lgG4 humana são os resíduos 123-459.
A seqüência da inserção de cDNA de cadeia leve de 20C8 qui-mérica (do iniciador da seqüência sinal ATG ao terminador TAG) é mostradaabaixo como SEQ ID NO: 142:
1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GTTATGGGTA CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG51 TTCCACTGGT GACATTGTGC TGACACAGTC TCCTGCTTCC TTAGCTGTAT101 CTCTGGGGCA GAGGGCCACC ATCTCATGCA GGGCCAGCAA AAGTGTCAGT151 ACATCTGCCT ATAGTTATAT GCACTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC201 ACCCAAACTC CTCATCTATC TTGCATCCAA CCTAGAATCT GGGGTCCCTG251 CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT301 CCTGTGGAGG AGGAGGATGC TGCAACCTAT TACTGTCAGC ACAGTAGGGA351 GCTTCCGTAT ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATC AAACGTACGG401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC651 C TGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA701 ACAGGGGAGA GTGTTAG
A seqüência de proteína de cadeia leve de ch20C8 maduraprognosticada é mostrada abaixo como SEQ ID NO: 143:
1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSAYSYMHWY QQKPGQPPKL51 LIYLASNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELPY101 TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
O domínio variável murino são os resíduos 1-111 acima, en-quanto o domínio constante de capa humano são os resíduos 112-218 naseqüência acima.
O vetor de expressão de cadeia pesada de ch20C8 e vetor deexpressão de cadeia leve de ch20C8 foram co-transfeccionados em células293-EBNA e as células transfeccionadas foram testadas para secreção eespecificidade do anticorpo. Células transfeccionadas de vetor vazio e lgG4de hu5c8-S228P/T299A (um mAb CD40L-específico molecularmente clona-do) serviram como controles. Análise de western blot (desenvolvida com an-ticorpos anti-humanos de cadeia pesada e leve) de meio condicionado indi-cou que as células transfeccionadas com ch20C8 sintetizaram e eficiente-mente segregaram cadeias pesadas e leves. Análise de FACS de células deadenocarcinoma mamário humano de MCF7 de expressão de IGF-1R tingi-das com meio condicionado de células transfeccionadas indicou que o anti-corpo de ch20C8 ligou com uma resposta de dose titulável, enquanto o meiocondicionado de células transfeccionadas de mock e hu5c8 não tingiram ascélulas MCF7 (detectado com anticorpos anti-humanos de cadeia pesada eleve conjugados com PE). Células CHO foram co-transfeccionadas com ovetor de expressão de cadeia pesada de ch20C8 e vetor de expressão decadeia leve de ch20C8 para gerar linhagens estáveis expressando hulgG4aglicosilado de 20C8 quimérico, mAb capa.Clonagem das regiões variáveis de imunoglobulina de 20D8.24B11 de mAbde anti-IGF-1 R
O 20D8.24B11 de mAb parece ser um clone irmão de 20C8.3B8(ambos foram derivados da fusão 7): compartilhando uma cadeia leve co-mum e tendo uma cadeia pesada que difere da de 20C8 por um resíduosimples em FR4. A seqüência madura prognosticada do domínio variável decadeia pesada de mAb de 20D8.24B11, pertencendo ao subgrupo I(A) muri-no, é mostrada abaixo com suas CDRs sublinhadas:1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG
51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG
101 YGYRSAYYFD YWGQGTTLTV SS (SEQ ID NO:53)
Um alinhamento dos domínios variáveis de cadeia pesada de20D8 (superior) e 20C8 (inferior), realçando a diferença conservadora sim-ples que corresponde ao resíduo de FR4 Kabat 109 (resíduo 118 abaixo) émostrado abaixo:
1 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLiTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMG 50 (SEQID NO:53)
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll1 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMG 50 (SEQID NO:43)
51 YIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSG 100 (SEQID NO:53)
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll51 YIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSG 100 (SEQID NO:43)
101 YGYRSAYYFDYWGQGTTLTVSS 122 (SEQ ID NO:53)
lllllllllllllllll-llll101 YGYRSAYYFDYWGQGTTVTVSS 122 (SEQ ID NO:43)
Um vetor de expressão para cDNA de 20D8 de cadeia pesadaquimérico foi construído e o cDNA de cadeia pesada inserido no plasmídeopCN380 foi confirmado através de seqüenciação de DNA. A seqüência dainserção do cDNA de 20D8 de cadeia pesada quimérico (do iniciador da se-qüência sinal ATG ao terminador TGA) é mostrada abaixo como SEQ ID NO:144:
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC51 CCACTCCGAC GTCCAACTGC AGGAGTCTGG ACCTGACCTG GTGAAACCTT
101 CTCAGTCACT TTCACTCACC TGCACTGTCA CTGGCTACTC CATCAC CAGT151 GGTTATAGCT GGCAC TGGAT CCGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG201 GATGGGCTAC ATACACTACA GTGGTGGCAC TAACTACAAC CCATCTCTCA251 AAAGTCGAAT CTCTATCACT CGAGACACAT CCAAGAACCA GTTCTTCCTC301 CAGTTGAATT CTGTGACTAC TGAGGACACA GCCACATATT ACTGTGCAAG351 ATCGGGGTAC GGCTACAGGA GTGCGTACTA TTTTGACTAC TGGGGCCAAG401 GGACCACGTT GACAGTCTCC TCAGCTTCCA CCAAGGGCCC ATCCGTCTTC451 CCCCTGGCGC CCTGCTCCAG ATCTACCTCC GAGAGCACAG CCGCCCTGGG501 CTGCCTGGTC AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT551 CAGGCGCCCT GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCGGCTGT CCTACAGTCC601 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt651 gggcacgaag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca701 aggtggacaa gagagttgag tccaaatatg gtcccccatg cccaccgtgc751 ccagcacctg agttcctggg gggaccatca gtcttcctgt tccccccaaa801 acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg851 tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg901 gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt951 caacagcgcg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact1001 ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg1051 tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagagcc1101 acaagtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc aagaaccagg1151 tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg1201 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc1251 cgtcctcgat tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg1301 acaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat1351 gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctctggg1401 ttga
A seqüência de proteína de cadeia pesada de ch20D8 maduraprognosticada codificada pela seqüência acima é mostrada abaixo comoSEQ ID NO: 145:
1 Dvqlqesgpdlvkpsqslsl tctvtgysit sgyswhwirq fpgnklewmg
51 yihysggtny npslksrisi trdtsknqff lqlnsvtted tatyycarsg101 ygyrsayyfd ywgqgttltv ssastkgpsv fplapcsrst sestaalgcl151 vkdyfpepvt vswnsgalts gvhtfpavlq ssglyslssv vtvpssslgt201 ktytcnvdhk psntkvdkrv eskygppcpp cpapeflggp svflfppkpk251 dtlmisrtpe vtcvwdvsq edpevqfnwy vdgvevhnak tkpreeqfns301 ayrwsvltv lhqdwlngke ykckvsnkgl pssiektisk akgqprepqv351 ytlppsqeem tknqvsltcl vkgfypsdia vewesngqpe nnykttppvl401 dsdgsfflys rltvdksrwq egnvfscsvm healhnhytq kslslslg
O domínio variável murino são os resíduos 1-122, o domínioconstante de cadeia pesada de lgG4 humana de S228P/T299A são os resí-duos 123-458.A seqüência variável de cadeia leve 20D8 é idêntica à de 20C8:por favor vide a informação previamente descrita para 20C8.Clonagem das regiões variáveis de imunoglobulina de P1G10.2B8 de mAbde anti-IGF-1R
A seqüência prognosticada do domínio variável de cadeia pesa-da de P1G10 maduro é mostrada abaixo como SEQ ID NO: 58, com suasCDRs sublinhadas:
1 QIQLVQSGPD LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKDLKWMGW51 INTNTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCASPL101 YYRNGRYFDV WGAGTTVTVS S
P1G10 parece pertencer ao subgrupo II(A) de domínio variávelde cadeia pesada murina, mas com apenas 55 %de identidade à seqüênciade consenso II(A) pesada.
Um vetor de expressão para o cDNA de cadeia pesada deP1G10 quimérico foi construído e sua inserção de cDNA foi confirmada cmoseqüência. A seqüência da inserção de cDNA de cadeia pesada de P1G10quimérico (do iniciador da seqüência sinal ATG ao terminador TGA) é mos-trada abaixo como SEQ ID NO: 146:
1 ATGGGTTGGA TCTGTATCTT TCTATTCTTG GTGGCAGCTG CCCAAAGTGC51 CCAAGCACAG ATCCAGTTGG TGCAGTCTGG ACCTGACCTG AAGAAGCCTG
101 GAGAGACAGT CAAGATCTCC TGCAAGGCTT CTGGGTATAC CTTCACAAAC151 CATGGAATGA ACTGGGTGAA GCAGGCTCCA GGAAAGGATT TAAAGTGGAT201 GGGCTGGATA AACACCAACA CTGGAGAGCC AACATATGCT GATGACTTCA251 AGGGACGGTT TGCCTTCTCT TTGGAAACCT CTGCCAGCAC TGCCTATTTG301 CAGATCAACA ACCTCAAAAA TGAGGACACG GCTACATATT TCTGTGCAAG351 TCCCCTCTAC TATAGGAACG GGCGATACTT CGATGTCTGG GGCGCAGGGA401 CCACGGTCAC CGTCTCCTCA GCTTCCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC451 CTGGCGCCCT GCTCCAGATC TACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG551 GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG651 CACGAAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACAC CAAGG701 TGGACAAGAG AGTTGAGTCC AAATATGGTC CCCCATGCCC ACCGTGCCCA751 GCACCTGAGT TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAAACC801 CAAGGACACT CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG851 TGGACGTGAG CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT901 GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA951 CAGCGCGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC1001 TGAACGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC1051 TCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAGCCACA1101 AGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCAGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA1151 GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG1201 TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT1251 CCTCGATTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAGGCTA ACCGTGGACA1301 AGAGCAGGTG GCAGGAGGGG AATGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG1351 GCTCTGCACA ACCACTACAC ACAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCTGGGTTG1401 A
A seqüência de proteína de cadeia pesada de chP1G10 maduraprognosticada codificada pela seqüência acima é mostrada abaixo comoSEQ ID NO: 147:
1 QIQLVQSGPD LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKDLKWMGW51 INTNTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCASPL101 YYRNGRYFDV WGAGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSW TVPSSSLGTK201 TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD251 TLMISRTPEV TCVWDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNSA301 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY351 TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD401 SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLG
O domínio variável murino são os resíduos 1-121, o domínioconstante de cadeia pesada de lgG4 humana de S228P/T299A são os resí-duos 122-457.
A seqüência prognosticada do domínio variável de cadeia levede P1G10 madura, pertencendo ao subgrupo V capa murino, é mostradaabaixo como SEQ ID NO: 113, com suas CDRs sublinhadas:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGSVKLLIYY51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GKTLPWTFGG101 GTKLEIK
Um vetor de expressão para o cDNA de cadeia leve de P1G10quimérico foi construído e sua inserção de cDNA foi confirmada por seqüên-cia. A seqüência da inserção de cDNA de cadeia leve de P1G10 quimérico(do iniciador da seqüência sinal ATG ao terminador TAG) é mostrada abaixocomo SEQ ID NO: 148:
1 ATGAGGTCCC CTGCTCAGTT TCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG51 TGCCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT
101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGT151 AATTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGATCTG TTAAACTCCT201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTC C CATCA AGGTTCAGTG251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAA301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAAAGACGC TTCCGTGGAC351 GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT401 CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC451 TC TGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA501 GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA551 CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG601 CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC651 CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT701 GTTAG
A seqüência de proteína de cadeia leve de chP1G10 maduraprognosticada codificada pela seqüência acima é mostrada abaixo comoSEQ ID NO: 149:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGSVKLLIYY51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GKTLPWTFGG101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG201 LSSPVTKSFN RGECOs resíduos do domínio variável murino são 1-107 acima, en-quanto o domínio constante capa humano são os resíduos 108-214 na se-qüência acima.
O vetor de expressão de cadeia pesada de chP1G10 e o vetorde expressão de cadeia leve de chP1G10 foram co-transfeccionados emcélulas 293-EBNA e as células transfeccionadas foram testadas para secre-ção e especificidade dos anticorpos (células transfeccionadas de vetor vazioe lgG4 de hu5c8-S228P/T299A (um mAb CD40L específico molecularmenteclonado) serviram como controles). Análise de western blot (desenvolvidacom anticorpos anti-humanos cadeia pesada e leve) de meio condicionadoindicou que as células transfeccionadas com chP1G10 sintetizaram e efici-entemente segregaram cadeias pesadas e leves. Análise de FACS de célu-las de adenocarcinoma mamário humano de MCF7 de expressão de IGF-1Rtingidas com meio condicionado das células transfeccionadas indicou que oanticorpo de chP1G10 ligou com uma resposta de dose titulável, enquanto omeio condicionado de células transfeccionadas com mock e hu5c8 não tingi-ram as células MCF7 (detectado com anticorpos anti-humanos de cadeiapesada e leve conjugados com PE). As células CHO foram co-transfeccionadas com o vetor de expressão de cadeia pesada de chP1G10 eo vetor de expressão de cadeia leve de chP1G10 para gerar linhagens está-veis que expressam hulgG4 aglicosilado com P1G10 quimérico, mAb capa.CLONAGEM DAS REGIÕES VARIÁVEIS DE IMUNOGLOBULINA DEΡ1 A2.2B11 DE mAb DE ANTI-IGF-1R
A seqüência prognosticada do domínio variável de cadeia pesa-da de P1A2 maduro, pertencendo ao subgrupo II(A) murino, é mostrada a-baixo como SEQ ID NO: 48:
1 QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKGLKWMGW
51 NTSTGEPTYA DDFKGRFAFS LETSASTAFL QINNLKNEDT ASYFCASPLY
101 YMYGRYIDVW GAGTAVTVS S
A cadeia pesada de P1A2 é 92,6 %idêntica à de P1G10 (ambosforam derivados da fusão 5), com uma diferença FR1, uma de FR2, duas deCDR2, duas de FR3, duas de CDR3, e de 1 FR4. O alinhamento dos domí-nios variáveis de cadeia pesada de P1A2 (linha superior) e P1G10 (maisinferior) é mostrado abaixo:
1 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNHGMNWVKQAPGKGLKWMGW 50 (SEQID NO:4 8)
Illilllll--IllllllllllllllMllllllllllIIIIII 11 Il 11
1 QIQLVQSGPDLKKPGETVKISCKASGYTFTNHGMNWVKQAPGKDLKWMGW 50 (SEQID NO:58)
51 .NTSTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTASYFCASPL 99 (SEQID NO:48)
M-MMMMMlllMllMMIIIhMIMIMMM-MIMM
51 INTNTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCASPL 100 (SEQID NO:58)
100 YYMYGRYIDVWGAGTAVTVSS 120 (SEQ ID NO: 48)Il Ml IIIMII IMII
101 YYRNGRYFDVWGAGTTVTVSS 121 (SEQ ID NO:58)
Um vetor de expressão para a cadeia pesada de P1A2 quiméri-co é construído pelos métodos descritos acima. A seqüência prognosticadada cadeia pesada de chP1A2 codificada por aquele plasmídeo (SEQ ID NO:150) é:
1 QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKGLKWMGW
51 NTSTGEPTYA DDFKGRFAFS LETSASTAFL QINNLKNEDT ASYFCASPLY
25 101 YMYGRYIDVW GAGTAVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK
151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT
201 YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT
251 LMISRTPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSAY
301 RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
30 351 LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
401 DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
O domínio variável murino são os resíduos 1-120, o domínioconstante de cadeia pesada de lgG4 humana de S228P/T299A são os resí-duos 121-456.
A seqüência prognosticada do domínio variável de cadeia levede P1A2 madura, pertencendo ao subgrupo V capa murino, é mostrada a-baixo como SEQ ID NO: 108, com suas CDRs sublinhadas:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTIKLLIYY
51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDFATYFCQQ GKTLPWTFGG
40 101 GTKLEIKA cadeia leve de P1A2 é 97,2 %idêntica à de P1G10 (ambosforam derivados da fusão 5), com duas diferenças de FR2 e uma de FR3,mas compartilhando CDRs idênticas. O alinhamento dos domínios variáveisde cadeia leve de P1A2 (linha superior) e P1G10 (linha inferior) é mostradoabaixo:
1 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYY 50 (SEQ ID
NO:10 8)
I i I I I I I ί I! I 11 i 111 i 1111 I 111 ί 11111111111S111 - ^ 111111
1 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGSVKLLIYY 50 (SEQ ID
NO:113)
51 TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGKTLPWTFGG 100 (SEQ IDNO:10 8)
! Illll!! Il! IIM MIIIIM MIIIMM 111111111111 M I M
51 TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKTLPWTFGG 100 (SEQ IDNO:113)
101 GTKLEIK 107 (SEQ ID NO:108)
Mlllll
101 GTKLEIK 107 (SEQ ID NO:113)
Um vetor de expressão para o cDNA quimérico de cadeia levede P1A2 foi construído e sua inserção de cDNA foi confirmada por seqüên-cia. A seqüência da inserção de cDNA quimérico de cadeia leve de P1A2 (doiniciador da seqüência sinal ATG ao terminador TAG) é mostrada abaixocomo SEQ ID NO: 151:
1 ATGAGGTCCC CTGCTCAGTT TCTTGGAGAC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTATCTGCCT
101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTA TTAAACTCCT201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAA301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTAAAACGC TTCCGTGGAC351 GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT401 CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC451 TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA501 GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA551 CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG601 CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC651 CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT701 GTTAG
A seqüência de proteína de cadeia leve de chP1A2 maduraprognosticada codificada por pCN379 é mostrada abaixo como SEQ ID NO:152:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTIKLLIYY51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDFATYFCQQ GKTLPWTFGG101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG201 LSSPVTKSFN RGEC
O domínio variável murino são os resíduos 1-107 acima, en-quanto o domínio constante capa humano são os resíduos 108-214 na se-qüência acima.
CLONAGEM DAS REGIÕES VARIÁVEIS DE IMUNOGLOBULINA DEΡ1 E2.3B12 DE mAb DE ANTI-IGF-1R
Clonagem dos domínios variáveis P1E2 é realizada pelos méto-dos descritos acima.
EXEMPLO 19
ANTICORPOS DE Fab DE IGF-1R LIGAM IGF-1R SOLÚVEL COM AFINI-DADE ALTA
Método: A atividade de ligação de Fabs de M13-C06, M14-C03,e M14-G11 para IGF-1R solúvel foi medida usando ressonância de plasmonde superfície. Anticorpo de PENTA-his biotinilado (Qiagen, Inc.) foi imobili-zado sobre um circuito integrado de sensor revestido com Estreptavidina.Ectodomínio de IGF-1R-his solúvel/dimérica (R&D Systems, Inc.) foi captu-rado na superfície por meio do anticorpo de PENTA-his. Injeções secundá-rias de Fabs de M13-C06, M14-C03, ou M14-G11 (0,5 nM - 1000 nM) foramexecutadas. As superfícies foram regeneradas com três injeções curtas deacetato, pH 4,0.
Resultados: O Fab de IGF-1R de M13-C06 recombinante ligoucom a afinidade mais alta em KD = 1,3 nM, enquanto que Fab de M14-G11ligou com uma KD = 4,0 nM, e Fab de M14-C03 ligou com uma KD = 4,9 nM(dados não mostrados).EXEMPLO 20
INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULA TUMORAL ESTIMULADO COMIGF-1 E IGF-2 ATRAVÉS DE ANTICORPOS DE IGF-1R COMPLETAMEN-TE HUMANOS
Método: O efeito do anticorpo sobre o crescimento de tumor invitro foi medido usando um ensaio de CELL TITER-GLO™ (Promega Corpo-ration, 2800 Woods Hollow Rd., Madison, Wl 53711 USA). As células deBxPC3 em 10 %de FBS contendo meio de RPMI foram cultivadas em placasde fundo claro tratadas com TC de 96 poços de Wallac (8000 célula/poço).Após 24 horas, o meio de cultura foi alterado para condição livre de soro eos anticorpos em concentrações diferentes (100 nM, 10 nM, 1 nM, e 0,1 nM)foram adicionados. Seguindo incubação de 30 minutos, IGF-1 ou IGF-2 fo-ram adicionados a 100 ng/ml. As células foram incubadas durante outras 48horas até que Iisadas para determinar a quantidade de ATP presente usandoo reagente de CELL TITER-GLO™. Inibição foi calculada como [I-(Ab-SFM)/ (IGF - SFM)] χ 10°%. Um anticorpo equiparado com isótipo, IDEC-151 (G4humano), anticorpo foi usado como um controle negativo.
Resultados: Anticorpos completamente humanos M13-C06.G4.P.agly, M14-G11.G4.P e M14-C03.G4.P.agly inibiram proliferaçãode célula de BxPC3 (adenocarcinoma de pâncreas humano) dirigida comIGF-1 e IGF-2 humanos recombinantes (FIGURA 16). Resultadosde inibiçãode crescimento similares foram obtidos com estes anticorpos contra prolife-ração de célula dirigida com IGF-1 e IGF-2 IGF-1 humanos recombinantesem linhagem celular de câncer de pulmão humana NCI-H23 (FIGURA 17;anticorpo de M13-C06.G4.P.agly) e linhagem celular de câncer de pulmãohumana A549 (FIGURA 18; anticorpo de M13-C06.G4.P.agly). Em todas astrês linhagens celulares M14-G11 .G4.P.agly mostrou resultados similarescomo versão de M14.G11 .G4.P (dados não mostrados).
EXEMPLO 21
DETENÇÃO DO CICLO CELULAR DE CRESCIMENTO DE CÉLULA TU-MORAL IN VlTRO ATRAVÉS DE ANTICORPOS DE IGF-1 R COMPLETAMENTE HUMANOSMétodo: A habilidade dos anticorpos de IGF-1R completamentehumanos para deter progressão do ciclo da célula foi avaliada por análise deFACS; monitorando a incorporação de iodeto de propídio em células BxPC3cultivadas. Células BxPC3 (4 χ 105 células/poço) foram banhadas em placasde 6 poços. Após 24 horas, as células foram alteradas para meios livres desoro (SFM) para as seguintes 24 horas. Em seguida os anticorpos de IGF-1R para uma concentração final de 133,3 nM (20 microgramas/ml) e IGF-1 a200 ng/ml foi adicionado aos meios. Após 24 horas, as células foram tripsi-nadas e fixadas com etanol. Conteúdo de DNA foi tingido com iodeto de pro-pídio (PI) antes da análise de FACS. Um anticorpo equiparado com isótipo,IDEC-151 (G4 humano), foi usado como um controle negativo.
Resultados: anticorpos completamente humanos M13-C06.G4.P.agly (TABELA 11), M14-G11 .G4.P.agly e M14-C03.G4.P.agly de-tiveram as células tumorais de BxPC3 na fase de G0/G1 do ciclo celular.
TABELA 11:
<table>table see original document page 265</column></row><table>
EXEMPLO 22
INIBIÇÃO IN VIVO DO CRESCIMENTO DE TUMOR EM UM MODELO DECÂNCER PANCREÁTICO.
Métodos: eficácia in vivo de agente simples do anticorpo deM13.C06.G4.P.agly foi avaliada em um sistema modelo câncer pancreáticode xenoenxerto usando células BxPC3 (câncer pancreático). Camundongosde SCID CB17 foram inoculados com 2 χ 106 células e monitorados paracrescimento do tumor. Volume de tumor médio ao início da terapia foi 1~1200 mm3. O anticorpo de M13.C06.G4.P.agly foi administrado intraperitone-almente (i.p.) a 60, 30 e 15 mg/kg administrado uma vez por semana durantesemanas. Um anticorpo equiparado com isótipo, IDEC-151 (G4 humano),foi administrado como um controle negativo a 60 mg/kg uma vez por semanadurante 5 semanas. Os tumores foram extraídos em intervalos indicadospós-inoculação (FIGURA 20) e o volume de tumor total foi medido.
Resultados: O anticorpo de M13.C06.G4.P.agly completamentehumano inibiu crescimento de tumor em uma dose maneira-dependente (FI-GURA 20). O anticorpo demonstrou eficácia de agente simples significativaestatisticamente a 60, 30 e 15 mg/kg semanalmente administrado durante 5semanas. Além disso, o anticorpo foi eficaz em doses tão baixas quanto 15mg/kg administrado uma vez uma semana (FIGURA 20).EXEMPLO 23
INIBIÇÃO IN VIVO DO CRESCIMENTO DE TUMOR EM UM MODELO DECÂNCER DE PULMÃO.
Métodos: eficácia in vivo de agente simples do anticorpo deM13.C06.G4.P.agly foi avaliada em um sistema modelo de câncer de pul-mão de xenoenxerto usando células A549 (câncer de pulmão). Camundon-gos de SCID CB17 foram inoculados com 3-5 χ 106 células e monitoradospara crescimento do tumor. Volume de tumor médio ao início da terapia foi1~1 150 mm3. O anticorpo de M13.C06.G4.P.agly foi administrado intraperi-tonealmente (i.p.) a 30 e 15 mg/kg administrado duas vezes por semana du-rante 4 semanas. Um anticorpo equiparado com isótipo, IDEC-151 (G4 hu-mano), foi administrado como um controle negativo a 30 mg/kg. Os tumoresforam extraídos nos intervalos indicados pós-inoculação (FIGURA 21) e vo-lume de tumor total foi medido.
Resultados: O anticorpo de M13.C06.G4.P.agly completamentehumano inibiu crescimento do tumor em uma dose maneira-dependente (Fl-GURA 21). O anticorpo demonstrou eficácia de agente simples significativaestatisticamente em doses de 30 e 15 mg/kg administradas em um períodode 4 semanas (FIGURA 21). Estudos adicionais executados neste modelomostraram que CÜ6 é eficaz em doses tão baixas quanto 7,5 mg/kg de inje-ções semanais (dados não mostrados).EXEMPLO 24
INIBICÃO IN VIVO DO CRESCIMENTO DE TUMOR USANDO TERAPIA DECOMBINAÇÃO
Método: A eficácia do anticorpo de M13.C06.G4.P.agly inibindocrescimento de tumor em combinação com gencitabina (um fármaco comu-mente usado para tratar câncer de pulmão de célula não-pequena, câncerpancreático, bexiga e de mama) foi testada em um modelo de xenoenxertode BxPC3. A eficácia do anticorpo de M13.C06.G4.P.agly administrado in-traperitonealmente (i.p.) duas vezes por semana a 30 mg/kg durante 7 se-manas (dados não mostrados) ou uma vez por semana a 60 mg/kg durante5 semanas (FIGURA 22) foi avaliada em combinação com gencitabina admi-nistrada de acordo com o padrão atual de cuidado (isto é, 80 mg/kg a cada 3dias durante 4 semanas). Gencitabina sozinha, anticorpo deM13.C06.G4.P.agly sozinho, e injeções falsas do veículo de liberação sozi-nho foram administradas como controles negativos. Volume do tumor ao iní-cio da terapia foi aproximadamente 200 mm3.
Resultados: anticorpo de M13-C06.G4.P.agly e gencitabina co-mo um agente simples (isto é, administrado sozinho) mostrou eficácia simi-lar. Em combinação com Gencitabina, o anticorpo de M13-C06.G4.P.agly a30 mg/kg em programação de duas vezes por semana (dados não mostra-dos) ou 60 mg/kg em uma programação semanal (FIGURA 22) mostrou efi-cácia aditiva comparada aos tratamentos de agente simples. Além disso,combinação com 15 mg/kg também mostrou eficácia aditiva (dados nãomostrados).EXEMPLO 25
ANTICORPO DE IGF-1R COMPLETAMENTE HUMANO LIGA A LINHAGEMCELULAR DE FIBROBLASTO DEC MACACO CINOMÓLOGO
Métodos: O anticorpo de M13.C06.G4.P.agly liga a uma linha-gem celular de fibroblasto estabelecida de macaco cinomólogo. A linhagemcelular de fibroblasto foi gerada de uma biópsia da pele. Ligação de anticor-po foi avaliada suspendendo as células de fibroblasto com tampão de disso-ciação de célula e incubando com M13.C06.G4.P.agly biotinilado durante 45minutos a 4S C. Após lavar as células, estreptavidina-PE foi adicionado eincubado por 30 minutos adicionais a A- C na escuridão. As células foramdepois lavadas e 200 ul de PBS frio foram adicionados seguido por fixaçãocom 1 %de formaldeído e vórtice suave. Ligação de anticorpo foi avaliadapor análise de FACS.
Resultados: O anticorpo de M13-C06.G4.P.agly liga a IGF-1Rexpressado na linhagem celular de fibroblasto cinomólogo em uma concen-tração maneira-dependente (FIGURA 23).EXEMPLO 26
PARTE I: SUMÁRIO DAS CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DO ANTI-CORPO DE M13.C06.G4.P.AGLY COMPLETAMENTE HUMANO
Características biológicas avaliadas são apresentadas para anti-corpo de M13.C06.G4.P.agly completamente humano nas Tabelas 11 e 12.Estas características foram apuradas através de métodos, experimentos, eexemplos descritos aqui e/ou como pode ser determinado habitualmente pormeio de métodos e experimentos conhecidos e podem ser executados poraqueles de habilidade usual na técnica.
TABELA 11:
<table>table see original document page 268</column></row><table><table>table see original document page 269</column></row><table>
MEIA-VIDA EM SORO DE ANTICORPO M13.C06.G4.P.AGLY
Um estudo farmacocinético (PK) em camundongos não portandotumor foi executado usando 3 mg/kg de anticorpo de M13.C06.G4.P.agly(um nível de dose, injeções intraperitoneal) em camundongos de SCID. Anti-corpo de M13.C06.G4.P.agly em soro de camundongo de SCID foi detecta-do usando ELISA IgG-específico. IgG anti-humana de cabra (100 ng/poço)foi imobilizada em placas de Immulon. Soros foram titulados em triplicatainiciando a 1:25 com diluições seriais de duas vezes. Ligação foi determina-da usando o capa-HRP de anti-humano de cabra. Resultados deste estudoindicam uma meia-vida em soro de 1-111.5 dias neste sistema modelo decamundongo (dados não mostrados).
As concentrações de soro foram avaliadas deM13.C06.G4.P.agly após injeções intraperitoneais em animais portando tu-mor MCF-7 (anticorpo a 30 ug/kg) e animais portando tumor de BxPC3 (anti-corpo a 15 ug/kg). Ligação do anticorpo de M13.C06.G4.P.agly a IgG anti-humana de cabra (100 ng/poço) imobilizado em 96 poços (IMMULON2 HB,Dynax Technology, Inc., Cat. #3455) foi medida por meio de ELISA. Curvaspadrões foram tituladas iniciando em 10 ug/ml com diluições seriais de 3 ve-zes. Soro foi titulado iniciando em diluições 1:25 com diluições seriais de 2vezes. Anticorpo de M13.C06.G4.P.agly foi detectado usando o capa-HRPanti-humano de cabra, pacote de software SOFTMAx PRO versão 4.3 LS(Molecular Devices Corp.) foi usado para determinar as concentrações doanticorpo.
Concentrações de soro médias foram observadas como mostra-do abaixo:
<table>table see original document page 270</column></row><table> Os farmococinéticos de anticorpo de M13.C06.G4.P.agly foramtambém investigados em macacos cinomólogo após injeções de dose de 10mg/kg e 25 mg/kg onde a meia-vida em soro foi observada ser 1-1 10 a 12dias (dados não mostrados).
Tabelas 12 e 13 mostram a inibição dose-dependente (porcen-tagem de inibição) de crescimento de célula in vitro observado para váriaslinhagens de célula tumoral de pulmão, pâncreas, e cólon quando o anticor-po de M13-C06.G4.P.agly for adicionado aos meios de cultura de célula su-plementados com IGF-1 ou IGF-2 (TABELA 12) ou suplementados com 10%soro de bezerro fetal (FCS) ou soro bovino fetal (FBS) (TABELA 13).
TABELA 12:
<table>table see original document page 271</column></row><table>
TABELA 13:
<table>table see original document page 271</column></row><table>Parte II: MEDIÇÕES DE AFINIDADE DE ANTICORPOOBJETIVO:
O objetivo foi medir a afinidade de ligação dos anticorpos deIGF-1R.
MÉTODOS:
Preparação de Fabs de M13-C06, M14-C03, e M14-G11
Anticorpos de Fab de M13-C06, M14-C03, e M14-G11 forampreparados através de digestão com papaína imobilizada (Pierce Cat. No.20341). A resina de papaína foi lavada com 20 mM fosfato de sódio pH 7,0;10 mM EDTA; 20 mM Cisteína. Anticorpos foram misturados com a resina depapaína em 500 mM EDTA, 100 mM Cisteína pH 7,0 e digeridos durante trêshoras em um banho de água a 37Q C seguido misturando em um agitador deinversão durante a noite em temperatura ambiente. Conclusão de cada di-gestão foi determinada através de cromatografia por exclusão de tamanhoanalítica (SEC). A resina foi removida da proteína digerida com um filtro defunil de vidro sinterizado e lavada com 20 mM acetato pH 5,0. O fluxo foi co-lhido e diluído 10 vezes com 20 mM acetato pH 5,0. Fragmentos de Fab fo-ram purificados através de cromatografia de permuta de cátion S-SEPHAROSE™ usando um gradiente de sal linear. SEC analítica foi execu-tada nas frações eluídas e as frações desejadas foram agrupadas e subme-tidas à diálise em PBS. Os Fabs foram subseqüentemente alquilados parainibir a re-formação de dissulfetos de dobradiça resultante na produção de(Fab)2. Alquilação foi realizada diluindo 1 M Tris; 200 mM Iodoacetato pH 8,510 vezes nas soluções de Fab. As misturas foram incubadas em um agitadorde invenção durante vinte minutos em temperatura ambiente seguido pordiálise exaustiva em 1xPBS. Purificação final de cada Fab foi executada u-sando cromatografia preparativa por exclusão de tamanho.
MEDIÇÕES DE AFINIDADE POR RESSONÂNCIA DE PLASMON DE SU-PERFÍCIE (SPR)
Todos os experimentos de ressonância de plasmon de superfície(SPR) foram executados em um Biacore 3000 ajustado para 25õ C usandoHBS-EP (Biacore, Cat. No. BR-1001-88) como o tampão operacional. Umanticorpo de anti-HisTag marcado com biotina (biotina-PENTA-his, Cat deQiagen. No. 34440) foi imobilizado para saturação em uma superfície de cir-cuito integrado de Biacore SA (Cat. No. BR-1000-32) por injeção a 500 nMem tampão de HBS-EP. IGF-1 R-IOHis humano recombinante (R&D Sys-tems, Cat. No. 305-GR-050) foi capturado na superfície de biotina-PENTA-his injetando 20 μΙ de 40 nM proteína a 2 pL/min. Subseqüente às injeçõesde IGF-1R, as taxas de fluxo foram aumentadas para 20 pL/min. Uma se-gunda injeção de 130 μΙ de anticorpo de anti-IGF-1R ou Fab foi executadapara investigar as interações com o receptor. Cada anticorpo e Fab foramserialmente diluídos de 64 nM para 0,5 nM para obter curvas de ligação ci-néticas dependentes da concentração. Cada série de injeção foi regeneradausando 3x10 μl injeções de 10 mM acetato, pH 4,0, a 20 pL/min. Cada curvafoi duplamente referida usando (1) dados obtidos de uma superfície de es-treptavidina destituída de IGF-1R e (2) dados de uma injeção primária deIGF-1R seguida por uma injeção secundária de tampão de HBS-EP. A sériede concentração para cada anticorpo e Fab foi ajustada ao modelo de liga-ção 1:1 fornecido dentro do software de BiaEvaIuation do fabricante.
RESULTADOS
Três anticorpos de anti-IGF-1R recombinantes, M13-C06, M14-C03, e M14-G11, foram testados para ligação a IGF-1R usando ressonânciade plasmon de superfície como descrito acima. Todos os três anticorposdemonstraram ligação forte ao receptor. Ligação dependente de concentra-ção de cada anticorpo (64 nM serialmente diluído a 0,5 nM) para IGF-1Rhumano recombinante imobilizado foi observada (dados não mostrados). Astaxas nas quais os anticorpos acumulam-se na superfície revestida de IGF-1R quando aplicados em várias concentrações como também nas taxas nasquais eles dissociam-se durante as aplicações de tampão puro foram inves-tigadas ajustando os dados a um modelo de ligação 1:1. As constantes detaxa cinética aproximada e constante de dissociação de equilíbrio foram cal-culadas (TABELA 14).TABELA 14
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TABELA 15
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Para obter afinidades distintas, fragmentos Fab de cada anticor-po foram gerados usando digestão de papaína como descrita acima. Devidoà presença de um sítio de ligação de antígeno simples, os Fabs uniforme-mente demonstraram ligação monofásica e curvas de dissociação quandoaplicados ao receptor de IGF-1R em uma maneira idêntica como descritapara os anticorpos de comprimento total (dados não mostrados). As afinida-des de cada Fab para IGF-1R são fornecidas na TABELA 15.
EXEMPLO 27
PARTE I: ANTICORPO DE M13.C06.G4.P.AGLY TEM CARACTERÍSTICASDE LIGAÇÃO DE EPÍTOPO ÚNICAS COMPARADO A OUTROS ANTI-CORPOS DE IGF-1R
Um estudo de ligação de anticorpo de competição foi executadopara comparar os epítopos de ligação de anticorpo de IGF-1R deM13.C06.G4.P.agly e outros anticorpos de IGF-1R. Vide, FIGURA 24. Anti-corpos competidores não-marcados foram analisados para sua habilidadepara competir cruzado com cinco anticorpos marcados diferentes para ligar aIGF-1R solúvel. Os cinco anticorpos marcados usados foramM13.C06.G4.P.agly marcado com biotina ("Biotina-C06"), M14-G11 marcadocom biotina ("Biotina-G11"), P1B10-1A10 marcado com zenon ("Zenon-O"),20C8-3B4 marcado com zenon ("Zenon-M"), ou anticorpo de IR3 marcadocom zenon ("Zenon-IR3"). Vide, FIGURA 24.
Anticorpos foram marcados com Biotina usando um kit de biotini-lação de Pierce Chemical (#21335).
Marcação de Zenon foi executada usando kit de marcação deIgG de camundongo de Zenon de Molecular Probes (Z25000).
+++++ = competição de ligação de anticorpo com relação para simesmo (90-100%)
++++ = 70-90 %de competição
+++ = 50-70 %de competição
++ = 30-50 %de competição
+ = 10-30 %de competição
+/- = 0-10 %de competição
N/A = resultados não disponíveis.
Os resultados desta análise indicam que anticorpos deM13.C06.G4.P.agly e M14.C03.G4.P.agly ligam à mesma região ou umasimilar de IGF-1R, que é distinta de todos os outros anticorpos testados. Emparticular, apenas anticorpo de M13.C06.G4.P.agly marcado com biotina foicompetido eficazmente de ligar a IGF-1R por M13.C06.G4.P.agly não-marcado ou por M14.C03.G4.P.agly não-marcado. É também notável queM13.C06.G4.P.agly não compete cruzado com o anticorpo de IR3 bem estu-dado. Conseqüentemente, estes dois anticorpos, em particular, ligam a epí-topos de IGF-1R diferentes.
PARTE II: M13-C06 ALOSTERICAMENTE DIMINUI A AFINIDADE DE LI-GAÇÃO DE IGF-1 A IGF-1R POR MEIO DE LIGAÇÃO DE ANTICORPO NAREGIÃO N-TERMINAL DO DOMÍNIO DE Fnltl-1OBJETIVO:
O objetivo foi elucidar o epítopo de ligação de anticorpo de M13-C06 em IGF-1 R e o mecanismo atrás da inibição da ligação de IGF-1/IGF-2a IGF-1 R.
ANTECEDENTES:
IGF-1 R consiste em 6 domínios (FIGURA 29A). Foi publicadoque mutações nos primeiros três domínios de IGF-1 R, denotadas L1 (domí-nio 1 repetido rico em leucina), CR (domínio repetido rico em cisteína), e L2,como também uma região de alça peptídica no domínio 5 (Fnlll-2, domínio 2de Fibronectina do tipo III) têm um impacto negativo sobre ligação de IGF-1e IGF-2 (Whittaker 2001; Sorensen 2004). Aqui, nós demonstramos que an-ticorpo de M13-C06 não bloqueia ligação de IGF-1 e IGF-2 a IGF-1R porcompetitivamente interagir com o sítio de ligação de fator de crescimento,mas do contrário liga a Fnlll-1 e alostericamente inibe sinalização de IGF-1/IGF-2. É acreditado que Fnlll-1 facilite a homodimerização do receptor deIGF-1 R e INSR (McKern 2006) e, ao ligar o ligante, transmite um sinal ativa-dor através da região de transmembrana para os domínios de tirosina cinaseC-terminais por meio de uma alteração da estrutura quaternária. Os dadosdeste exemplo sugerem que anticorpo de M13-C06 inibem alterações con-formacionais induzidas por IGF-1/IGF-2 que leva à sinalização do receptor ajusante.
MÉTODOS:
EXPERIMENTOS DE LIGAÇÃO DE IGF-1/IGF-1R NA PRESENÇA E AU-SÊNCIA DE ANTICORPO DE M13-C06
Várias construções foram usadas para investigar ligação de anti-corpo/IGF-1 ao receptor de IGF-1 R ou receptor de insulina: IGF-1 R(1-902)-His10 humano (denotado hlGF-1 R-His10, de R&D Systems), INSR(28-956)-His10 humano (denotado INSR, de R&D Systems), IGF-1 R(1-903)-Fc huma-no (denotado hlGF-1R-Fc, gerado por Biogen Idec), IGF-1 R(1-462)-Fc hu-mano (denotado hlGF-1R(1-462)-Fc, gerado por Biogen Idec), e IGF-1 R(1-903)-Fc murino (denotado mlGF-1R-Fc, gerado por Biogen Idec). "His10" de-nota um marcador de histidina de 10 resíduos no término C das construções."Fc" denota um marcador de IgGI-Fc humano C-terminal.
IGF-1 humano foi comprado de Millipore. A afinidade de IGF-1para hlGF-1 R-His10 foi determinada usando ressonância de plasmon de su-perfície (SPR). Um anticorpo de anti-His Tag marcado com biotina (biotina-PENTA-his, Cat de Qiagen. No. 34440) foi imobilizado para saturação emuma superfície de circuito integrado de Biacore SA (Cat. No. BR-1000-32)por injeção a 500 nM em tampão de HBS-EP. Para cada sensograma, hlGF-IR-His10 (descrito no EXEMPLO 5 (PARTE Il)) foi capturado na superfície debiotina-PENTA-his injetando 20 μΙ de 40 nM de proteína a 2 pLVmin. Subse-qüente à injeção de hlGF-1R-His10, a taxa de fluxo foi aumentada para 20μL/min. Uma segunda, injeção de 130 μl contendo IGF-1 foi executada parainvestigar a interação do hormônio de crescimento com seu receptor. IGF-1foi serialmente diluído de 64 nM para 0,125 nM para obter curvas de ligaçãocinética dependentes da concentração. Cada série de injeção foi regeneradausando 3x10 μl de injeções de 10 mM Acetato, pH 4,0, a 20 μL/min. Cadacurva foi referida duplamente usando (1) dados obtidos de uma superfície deestreptavidina destituída de PENTA-his anticorpo e (2) dados de uma injeçãoprimária de hlGF-1R-His10 seguido por uma injeção secundária de tampãode HBS-EP. A série de concentração para IGF-1 foi ajustada ao modelo deligação 1:1 fornecido dentro do software de BiaEvaIuation do fabricante. Doisconjuntos de dados foram obtidos, um na ausência e outra na presença de400 nM M13-C06 no tampão operacional, tampão de injeção de hlGF-1R-His10, e tampão de injeção de IGF-1.
ANÁLISE DE ENFRAQUECIMENTO E DE WESTERN BLOT DE COMPLE-XOS TERNÁRIOS DE ANTICORPO DE IGF-1/IGF-1R/M13-C06
Contas de A/G de proteína re-suspensa (300 μl, Pierce Cat. No.20422) foram lavadas com 1xPBS e misturadas com 1,0 mg M13-C06 emum tubo de Eppendorf de 1,5 ml em um agitador rotativo durante duas horasem temperatura ambiente. Em um tubo separado, 12 μg hlGF-1R-His10(R&D Systems) e 460 ng IGF-1 humano (Chemicon Cat Internacional. No.GF006) foram misturados (razão de proteína:proteína 1:1) durante uma horaem temperatura ambiente. Proteína A/G com M13-C06 ligado foi lavada comPBS e incubada com a mistura de hlGF-1R-His10/IGF-1 durante 30 minutosem temperatura ambiente. Proteína A/G com proteína ligada foi lavada comPBS seguido por elução da proteína ligada com 300 μΙ de 100 mM glicina,pH 3.0. Para o controle negativo, a adição de 12 pg de IGF-1R(1-902)-His10humano foi omitida. Proteínas eluídas foram detectadas através de Westernblot com um anticorpo de IGF-1 anti-humano (Biotina de IGF-1 anti-humanode coelho, Cat de USBiological. No. 17661-01B) e um anticorpo de IGF-1Ranti-humano (IGF-1Ra 1H7, Santa Cruz Biotechnology Cat. No. sc-461) co-mo anticorpos primários seguido por estreptavidina marcada com HRP (Cat.de Nothern Biotech No. 7100-05) e IgG de anti-camundongo de cabra mar-cado com HRP (Cat de USBiological. No. I1904-40J) como anticorpos se-cundários. Para demonstrar a habilidade de IGF-1/IGF-1R/M13-C06 paraformar um complexo ternário as concentrações do IGF-1 e IGF-1R usadasneste experimento estavam bastante em excesso (>15 vezes acima) dosníveis fisiológicos normais destas proteínas (particularmente IGF-1 no soro)como também a constante de dissociação de equilíbrio medida para IGF-1R/IGF-1. Vide, por exemplo, Hankinson et al., 1997.CONSTRUÇÃO DE ESTUDOS DE LIGAÇÃO DE IGF-1 R(1-462)-FC E AN-TICORPO COMPARATIVO VERSUS O ECTODOMÍNIO DO RECEPTORDE COMPRIMENTO TOTAL
Construção dos domínios de ligação de IGF-1/IGF-2, L1-CR-L2(resíduos 1-462), de IGF-1 R humano foi previamente publicada (McKern1997). Utilizando esta informação, subclonamos resíduos 1-462 de IGF-1 Rhumano (junto com a seqüência sinal N-terminal) no mesmo vetor de PV90interno que foi usado para produzir o ectodomínio humano de comprimentototal (resíduos 1-903, hlGF-1R-Fc). Expressão em CHO foi facilitada usandoos métodos previamente descritos (Brezinsky 2003). A proteína foi purificadados sobrenadantes de CHO através de passagem em uma coluna de afini-dade de proteína AA como previamente descrito para outras proteínas defusão de Fc (Demarest 2006). A construção da proteína é denotada hlGF-1 R(1-462)-Fc.
A habilidade dos anticorpos de M13-C06, M14-C03, e M14-G11para ligar hlGF-1 R(1-462)-Fc e a construção de ectodomínio de comprimen-to total, hlGF-1 R-Fc, foi determinada por SPR usando um Biacore3000. Oinstrumento foi ajustado para 25s Ceo tampão operacional era HBS-EP, pH7,2 (Biacore, Cat. No. BR-1001-88). Os anticorpos completamente humanos,M13-C06, M14-C03, e M14-G11, foram imobilizados a 1-110.000 RU emsuperfícies de Biacore CM5 Research Grade Sensorchip (Cat. No. BR-1000-14) usando a química reativa de NHS/EDC-amina padrão de acordo com osprotocolos providos por Biacore. Para imobilização, os anticorpos foram dilu-ídos a 40 pg/ml em um tampão de 10 mM Acetato pH 4,0. Para investigar acinética relativa de associação e dissociação de hlGF-1R-Fc e hlGF-1R(1-462)-Fc para cada um dos anticorpos humanos, concentrações crescentesde cada construção de receptor foram injetadas nas superfícies de circuitointegrado de sensor. A série de concentração de hlGF-1R-Fc variou de 1,0nM para 100 nM enquanto a série de concentração de hlGF-1R(1-462)-Fcvariou de 1,0 nM para 2 μΜ. Todas as superfícies de anticorpo foram rege-neradas confiantemente com 100 mM Glicina1 pH 2,0. Regenerações repeti-das não levaram a perdas de atividade para quaisquer das superfícies deanticorpo. Taxas de fluxo foram 20 μΙ/min.
MUTAÇÕES DE MAPEAMENTO DE EPÍTOPO
A escolha de mutantes para sonda para o epítopo de anticorpode M13-C06 em IGF-1R foi com base na observação que a afinidade de li-gação de M13-C06 para IGF-1R de camundongo foi significativamente redu-zida ou não-detectável em experimentos de ligação Biacore e FRET (E-XEMPLO 5 (PARTE Ill)). IGF-IRs de camundongo e humano compartilham95 %de identidade de seqüência de aminoácido primária. IGF-1R humano eINSR humano compartilham 57 %de identidade (73 %de similaridade). Nósidentificamos 33 resíduos que diferem entre o IGF-1R de camundongo ehumano no ectodomínio (TABELA 16). Vinte destes resíduos foram alveja-dos para mutação porque as posições homólogas dentro do ectodomínio deINSR foram expostas a solvente com base na recente estrutura de cristal deINSR (código de pub. 2DTG, McKern 2006). As áreas de superfície acessí-veis foram calculadas usando StrucTooIs(http://molbio.info.nih.gov/structbio/basic.html) com um raio de sonda de 1,4Á. Quatro resíduos adicionais não na estrutura de INSR foram também esco-lhidos para mutagênese visto que eles residiam na região de alça não-estruturada do domínio de Fnlll-2, que se demonstrou ser importante paraligação de IGF-1/IGF-2 (Whittaker 2001; Sorensen 2004). A lista das 24 mu-tações selecionadas para o estudo de mapeamento de epítopo é mostradana TABELA 17.
TABELA 16: DIFERENÇAS DE AMINOÁCIDO ENTRE IGF-1R HUMANO EDE CAMUNDONGO. Acessibilidade do solvente de cada posição do resíduofoi determinada com base no estrutura publicamente disponível do ectodo-mínio de INSR homólogo. Resíduos mostrados em negrito/itálico expõemmais gue 30 %de sua área de superfície para solvente e foram mutageniza-dos para triar para o epítopo de IGF-1R de M13-C06.
<table>table see original document page 280</column></row><table><table>table see original document page 281</column></row><table>
A biblioteca de mapeamento de epítopos de 24 mutantes foiconstruída mutagenizando o plasmídeo de PV-90 de hlGF-1 R-Fc do tipo sel-vagem usando o kit de mutagênese dirigida de Stratagene seguindo os pro-tocolos do fabricante. Incorporação de cada mutante (ou mutante duplo nocaso dos membros da biblioteca SD004, SD011, SD014, SD016, e SD019)no vetor de PV-90 foi confirmada por nossa instalação de seqüenciação deDNA interna. Plasmídeos foram mini-preparados e maxi-preparados usandoo Kit de Qiagen Miniprep e Qiagen Endotoxin-free Maxikits, respectivamente.200 pg de cada plasmídeo mutante foram transientemente transfectados em100 ml de células T de HEK293 a 2x106 células/mL usando o kit de transfec-ção PoIyFect (Qiagen) para secreção da proteína solúvel nos meios. As cé-lulas foram cultivadas em DMEM (IvrineScientific), 10 %FBS (soro bovino deIgG baixo, Invitrogen - também esvaziado de IgG bovina através de passa-gem em uma coluna de proteína AA de 20 ml) a 37 0C em uma incubadorade CO2. Após 7 dias, os sobrenadantes contendo cada mutante de IGF-1R-Fc foram colhidos através de centrifugação a 1200 rpm e filtração através deum filtro de 0,2 pm. Cada mutante foi purificada por afinidade mediante pas-sagem dos sobrenadantes em uma coluna de 1,2 ml de proteína A Sepharo-se FF pré-equilibrada com 1xPBS. Os mutantes foram eluídos da coluna u-sando 0,1 M glicina, pH 3,0, neutralizados com 1 M Tris, pH 8,5, 0,1 %Twe-en-80, e concentrados a 1-1300 μΙ usando dispositivos de concentraçãocentrífuga VivaSpin 6 MWCO 30.000 (Sartorius, Cat. No. VS0621).
ANÁLISE DE WESTERN BLOT DE MUTANTES DE IGF-1R
Amostras mutantes de hlGF-1R-Fc foram passadas em 4-20%géis de Tris-glicina (Cat de Invitrogen. No. EC6028) usando Xcell Sure-Lock Mini Cell (Cat de Invitrogen. No. EI0001) seguindo o protocolo padrãodo fabricante. As amostras foram transferidas para nitrocelulose usando oiBlot Dry Blotting System (Cat de Invitrogen. No. IB1001) e Transfer Stacks(Cat de Invitrogen. No. IB3010-01 ou 3010-02) seguindo o protocolo padrãodo fabricante. As membranas foram bloqueadas durante a noite a 49 C entre25 ml de PBST; 5 mg/ml leite seco sem gordura. Após bloquear, as mem-branas foram lavadas uma vez com 25 ml PBST por 5 min em temperaturaambiente. As membranas foram incubadas com um anticorpo de anti-lGF-1Rß primário (Santa Cruz Biotechnology Cat. No. sc-9038) a 1:100 em 10 mlPBST por 1 h em temperatura ambiente. As membranas foram subseqüen-temente lavadas três vezes em 25 ml PBST por 5 min. Para detecção, asmembranas foram incubadas com um anticorpo de IgG-Fc de anti-coelho decabra conjugado com HRP secundário (Cat. de US Biological No. I1904-40J)a uma diluição de 1:1000 em 10 ml PBST por 1 h em temperatura ambiente.As membranas foram lavadas três vezes em 25 ml PBST por 5 min seguidopor uma lavagem em 25 ml PBST por 20min. As bandas de proteína foramdetectadas usando Amersham ECL Western Blotting Analysis System (Cat.de GE Healthcare No. RPN2108) seguindo o protocolo padrão do fabricante.ANÁLISE DE BIACORE DA BIBLIOTECA MUTANTE DE IGF-1R-FC
MIGF-1R-Fc e hlGF-1R-Fc ligam com afinidade evidente alta àssuperfícies de circuito integrado de sensor M13-C06, M14-C03, e M14-G11descritas acima devido a sua natureza altamente multivalente induzida pelaincorporação de duas regiões homodiméricas separadas (IGF-1R e IgGI-Fc). Para distinguir entre a ligação de afinidade alta atual de hlGF-1 R-Fc aM13-C06 e a ligação de afinidade baixa de mlGF-1R-Fc a M13-C06, as fu-sões de receptor-Fc foram capturadas na superfície de circuito integrado desensor de M13-C06 seguido por um evento de ligação de Fab de M13-C06solúvel adicional. Construções de receptor-Fc foram capturadas em superfí-cie de circuito integrado de M13-C06 (preparadas como descrito acima) porinjeção de 60 μΙ do material concentrado purificado por afinidade a uma taxade fluxo de 1 μΙ/min. Após, conclusão da etapa de carregamento de recep-tor-Fc, as taxas de fluxo foram elevadas para 5 μΙ/min. Concentrações deFab de M13-C06 de 10 nM, 3 nM, e 1 nM foram injetadas (50 μΙ) subseqüen-te ao carregamento de cada construção de receptor-Fc. Ao término de cadasensograma, a taxa de fluxo foi elevada para 30 μΙ/min e a superfície de cir-cuito integrado foi regenerada por injeções de 2x10 μΙ de 0,1 M glicina M, pH 2.
ENSAIO DE TRANSFERÊNCIA DE ENERGIA DE RESSONÂNCIA PORFLUORESCÊNCIA TEMPO-RESOLVIDA (TR-FRET) PARA TRIAGEM DEMUTANTE DE IGF-1R-FC
Diluições seriais de receptor mutante, iniciando a 0,25-0,5 pg (25μl) foram misturadas com 0,05 pg IGF1R-Hisi0-Cy5 (12,5 μl) e 0,00375 μgEu:C06 (12,5 μl) em placas de microtitulação de 384 poços (branco de Cos-tar). Os níveis de conjugação para IGF1 R-HiSio-Cy5 foram 6,8:1 Cy5:IGF1R-His10, e para Eu-C06 foram 10,3:1 Eu:C06. O volume total foi 50 μl para ca-da amostra. As placas foram incubadas por 1 h em temperatura ambienteem um agitador de placa. Medições de fluorescência foram realizadas emuma leitora de placa fluorescente Wallac Victor2 (Perkin Elmer) usando oprotocolo de LANCE com o comprimento de onda de excitação a 340 nm ecomprimento de onda de emissão a 665 nm. Todos os dados foram ajusta-dos em um modelo de ligação de um sítio dos quais os valores de IC50 cor-respondentes foram determinados.
RESULTADOS
Inibição da ligação de IGF-1 e/ou IGF-2 a hlGF-1R-Fc por M13-C06 foi previamente demonstrada como descrito no EXEMPLO 3. Até mes-mo nas condições de saturação, a maioria dos anticorpos não inibe ligaçãode IGF-1 ou IGF-2 a hlGF-1R-Fc completamente. Particularmente para M13-C06, levantamos a hipótese que a inibição de ligação de Iigante poderia sernão-competitiva ou alostérica. Para testar esta hipótese, nós determinamosa afinidade de IGF-1 por hlGF-1 R-HiSi0 na presença e ausência de 400 nManticorpo de M13-C06 (1-1 4000 vezes acima da afinidade do anticorpo pa-ra hlGF-1 R-His10). Usando SPR hlGF-1 R-His10 foi imobilizado em superfíciesde circuito integrado usando um anticorpo de anti-Histag seguido por injeçãode concentrações crescentes de IGF-1 (até 64 nM). Ligação de IGF-1 ahlGF-1 R-His10 foi evidente na ausência e presença de 400 nM M13-C06.(Dados não mostrados: ressonância de plasmon de superfície demonstrandoligação de IGF-1 a hlGF-1 R-His10 na ausência e presença de 400 nM M13-C06. A fase de associação de SPR foi entre 1400-1800 segundos enquantoa fase de dissociação foi entre 1800-3000 segundos. Na ausência de M13-C06, IGF-1 ligou a hIGF-1 R-HiSi0 com K0 =17 nM (ka = 2,4 χ 10"5/M*s). Napresença, de 400 nM M13-C06, IGF-1 ligou a hlGF-1R-Hisi0 com K0 = 59nM (ka =7,1 χ 10"4/M*s)). A taxa da constante de associação cinética da liga-ção de IGF-1 a hIGF-1 R-Hisi0 foi aproximadamente reduzida 3 vezes napresença de M13-C06, sugerindo que M13-C06 alostericamente reduz a afi-nidade do Iigante pelo receptor.
Evidência de suporte que M13-C06 não compete diretamentecom IGF-1 para ligar a hlGF-1 R-HiSi0 foi gerada executando uma co-imunoprecipitação de hlGF-1 R-HiSi0 e IGF-1 usando M13-C06 em concen-trações bem acima das afinidades evidentes de IGF-1 e M13-C06 parahIGF-1 R-His10. Análise de western blot demonstrou que 1-170-100 %do ma-terial de IGF-1 misturado com hlGF-1 R-His10 foi enfraquecido com M13-C06,assim demonstrando que co-engaste de M13-C06 e IGF-1 com hlGF-1R-His10 para formar o complexo ternário é possível (dados não mostrados).Estes resultados demonstram a natureza alostérica de inibição da ligação deM13-C06 de IGF-1 a IGF-1 em concentrações normais de soro e sugeremque o sítio de ligação de M13-C06 não sobrepõe com a bolsa de ligação deIigante de IGF-1 R.
Em seguida, investigamos se M13-C06 liga os domínios de liga-ção de ligando putativos de IGF-1 R (L1-CR-L2). Geramos uma versão trun-cada do receptor contendo os três domínios N-terminais (resíduos 1-462)fundidos em um IgGI-Fc e comparamos sua habilidade para ligar M13-C06,M14-C03, e M14-G11 à da construção do ectodomínio de receptor de com-primento total, hIGF-1R-Fc, usando ressonância de plasmon de superfície(SPR). M14-G11 demonstrou ligação equivalente à versão truncada do re-ceptor, enquanto a ligação de M13-C06 e M14-C03 foi dramaticamente re-duzida. (Dados não mostrados: anticorpos de M13-C06, M14-C03, e M14-G11 imobilizados na superfície foram testados para ligar a hIGF-1R(1-903)Fc e hlGF-1R(1-462)-Fc truncado em concentrações que variam de 2μΜ, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 5 nM e 1 nM. A fase de associação de SPR foientre 480-960 segundos enquanto a fase de dissociação foi entre 960-1170segundos). Ligação residual foi evidente para M13-C06 e M14-C03; porém, os dados sugerem que pelo menos uma porção boa dos epítopos destesanticorpos residem em uma região de IGF-1R fora dos domínios de ligaçãode ligante.
Nós utilizamos o fato que IGF-1R murino não liga nenhum anti-corpo de M13-C06 para projetar uma biblioteca de mutações de camundon-go dentro de hlGF-1R-Fc para avaliar a localização do sítio de ligação deM13-C06 em IGF-1R. As várias mutações em hlGF-1R testado são mostra-das na TABELA 17. Análise de western blot foi usada para confirmar expres-são de cada hlGF-1R-Fc mutante e desenvolver uma curva padrão para a-proximar à concentração relativa de cada proteína mutante; usando hlGF- 1R-Fc purificado como um controle positivo (dados não mostrados).
TABELA 17: EFEITOS DAS MUTAÇÕES NA LIGAÇÃO DE IGF-1R A M13-C06. SD015 está em negrito como foi o único resíduo a demonstrar pouca anenhuma ligação a M13-C06 nos dois formatos de ensaio. ND = não deter-minado.
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SPR e tr-FRET foram usados para triar mutações que inibem aligação de IGF-IR-Fc a M13-C06. Com exceção do SD015 mutante, todasas construções de IGF-1R mutante demonstraram atividade de ligação deM13-C06, ou atividade de ligação de Fab de M13-C06 nos experimentos deSPR. Vide: Figura 28; Tabela 17; e, dados não mostrados (análise de inibi-ção competitiva foi usada para estabelecer as curvas de ligação para deslo-camento de Eu-Ml3-C06 ligado a IGF1R marcado com Cy5 aumentando asconcentrações das construções de hlGF1R-Fc não-marcado (SDWT),IGF1 R-Fc de camundongo (mlGF1 R-Fc) e de hlGF1 R-Fc mutante).
Havia algum desvio nos valores de IC5o determinados usando tr-FRET e resistências de ligação relativa determinadas usando SPR devido àsvariações naturais na expressão e quantificação através de Western blot;porém, SD015 foi o único mutante a não demonstrar virtualmente nenhumaatividade de ligação a M13-C06 em ensaios e em paralelo os resultados de-terminados para o controle de mlGF-1R-Fc. His464 está localizado nos 2aminoácidos C-terminal na seqüência de aminoácido primária para o términoC da versão truncada da construção de hlGF-1R-Fc (isto é, hlGF-1R(1-462)-Fc). A atividade de ligação residual de M13-C06 para hlGF-1R(1-462 trunca-do) sugere que o epítopo de ligação de M13-C06's de maneira mínima a-branja os resíduos Val462-His464. Resíduos adicionais estão provavelmenteenvolvidos na interação de ligação de anticorpo-epítopo como evidência in-dica que o epítopo de M13-C06's é conformationalmente dependente. Nota-velmente, porém, os resíduos Val462 e His464 são prognosticados residir nasuperfície exterior do domínio de Fnlll-1 (FIGURA 29).
Em uma tentativa para caracterizar a extensão do epítopo deM13-C06 (isto é, que resíduos periféricos a 462-464 são importantes paraligação e atividade do anticorpo), nós tomamos um método de modelagemestrutural. IGF-1R humano e INSR humano compartilham 57 %de identidade(73 %similaridade) e uma estrutura terciária similar. Análises anteriores dassuperfícies de ligação de antígeno:anticorpo de proteína da estrutura de cris-tal de raio X sugeriram uma superfície de ligação média de 700 A2 (angstrõmao quadrado) com um raio aproximado de 14 Á do centro do epítopo de liga-ção (Davies 1996). Usando a estrutura de cristal de raio X do ectodomíniohomólogo de INSR (2DTG codificado por pdb, (McKern 2006)), calculamosos resíduos na superfície do domínio de Fnlll-1 dentro de um raio de 14 Ádos resíduos 462-464 mapeando os resíduos de V462 de IGF-1R através deH464 para resíduos de L472 e K474 de INSR. O corte de distâncias foi apli-cado para qualquer distância de átomo-para-átomo dentro de 14 Á, enquan-to a distância média foi calculada da distância de Ca para Ca de L472 eK474 para cada resíduo dentro do remendo de superfície. A distância médiacalculada é listada como 14 Á para resíduos para os quais a distância de Capara Ca foi maior que 14 À mas em que as cadeias laterais estão dentro docorte de 14 Á. Resíduos de provável importância para ligação e atividade deM13-C06 são listados na Tabela 18.
TABELA 18. RESÍDUOS DENTRO DE IGF-1R PROGNOSTICADO SERIMPORTANTE PARA LIGAÇÃO E ATIVIDADE DE M13-C06. Resíduos 462e 464 são marcados em itálico visto que estes representam o centro prog-nosticado do epítopo de ligação de IGF-1R e dados experimentais demons-tram a importância destes resíduos na ligação de M13-C06.TABELA 18
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Trabalho publicado mostrou que os anticorpos que reconhecem
os resíduos 440-586 podem ser inibidores e agonísticos para ligação de IGF-1 (Soos 1992; Keynhanfar 2007). 440-586 representam todos dos L2 e Fnlll-1 com muitas superfícies de não-sobreposição potenciais acessíveis paraanticorpos de anti-IGF-1R. Nosso estudo é o primeiro estudo que estamosatentos donde o epítopo inibidor de IGF-1R foi mapeado para um resíduo(s)particular. Uma estrutura de INSR recente foi co-cristalizada com anticorpode anti-INSR conhecido inibir ligação de insulina a seu receptor (Soos 1986;McKern 2006). O resíduo homólogo para His464 de IGF-1R (K474 de INSR)faz parte da superfície de ligação deste anticorpo com INSR. É possível queM13-C06 compartilhe um mecanismo inibidor similar para inibir ligação deIGF-1 a IGF-1R como o anticorpo de anti-INSR antagonístico.EXEMPLO 28
ANTICORPO DE M13.C06.G4.P.AGLY LOCALIZA IN VIVO EFICAZMENTEEM CÉLULAS TUMORAIS, INIBE EXPRESSÃO DE KI67, E INFRA-REGULA EXPRESSÃO DE IGF-1 R
ANTICORPO DE M13.C06.G4.P.AGLY LOCALIZA EFICAZMENTE EM CÉ-LULAS TUMORAIS IN VIVO
MÉTODOS: camundongos Beige de SCID foram injetados com2x106 células MCF-7 (em matrigel) na presença de estrogênio (pelota de0,36 mg, 90 dias de liberação (Innovative Research of America)). Tumoresforam crescidos para 300-500 mm3 depois os camundongos foram injetadosintraperitonealmente com 30 mg/kg de anticorpo de M13.C06.G4.P.agly. oscamundongos foram sacrificados e os tumores foram removidos em 2, 6, 12,24, e 48 horas pós-injeção gelada em OCT e seccionados em 6 μιτι paraanálise imuno-histoquímica (IHC). Um tumor sem injeção de anticorpo foiexcisado como um controle. Tumores foram congelados em OCT e seccio-nados em 6 pm para IHC. Substrato é Vector VIP, uma coloração roxa. Anti-corpo ligado foi detectado usando o IgG anti-humano de cabra H+L (kit deHuman Elite ABC, Vector Labs) em tumores tratados comM13.C06.G4.P.agly ou IDEC151 (anticorpo de controle negativo). Expressãode IGF-1 R foi detectada usando um Mab de a-IGF-1R (clone 24-31, Neo-Markers/Lab Vision) em M13.C06.G4.P.agly ou tumores tratados com I-DEC151. Estudos similares foram conduzidos em modelo de xenoenxerto decâncer pancreático de BxPC3.
RESULTADOS (dados não mostrados): experimentos de eficá-cia in vivo usando uns modelos de xenoenxerto de tumor de mama de MCF-7 ou pancreáticos de BxPC3 de camundongo revelaram que injeção intrape-ritoneal de M13.C06.G4.P.agly foi eficaz para inibir crescimento de célulatumoral a 30 e 15mg/kg. Um experimento de tempo-curso foi executado paraestudar as farmacodinâmicas de uma dose simples de 30 mg/kg ou 15mg/kg de M13.C06.G4.P.agly em camundongos portando tumor de MCF-7ou Bx-Pc3, respectivamente. M13.C06.G4.P.agly localizado nos tumores jáem 6 horas pós-tratamento, com localização máxima a 48 horas como de-terminado por análise imuno-histoquímica (IHC). A expressão de IGF-1Rcomo determinado por análise Western de IHC mostrou perda significativade IGF-1R em tumores tratados com M13.C06.G4.P.agly 6 horas pós-tratamento, com perda quase completa de IGF-1R em 24 horas. Nenhumaalteração foi observada em tumores tratados com anticorpo de controle e-quiparado com isótipo. Análise dos Iisados de tumor para vias de sinalizaçãorevelou redução transiente de Erk e Akt fosforilados em 2-12 horas.
ANTICORPO DE M13.C06.G4.P.AGLY INIBE EXPRESSÃO DE KI67
Tingimento de Ki67 de tumores tratados comM13.C06.G4.P.agly também mostrou um número reduzido de células prolife-rativas comparado aos tumores tratados com anticorpo de controle (dadosnão mostrados). Estes dados indicam que M13.C06.G4.P.agly localiza-seeficazmente nos tumores in vivo, e inibe crescimento do tumor por infra-regulação de IGF-1R e inibição da sinalização mediada por IGF-1R.
M13.C06.G4.P.aqlv INFRA-REGULA E DEGRADA IGF-1R EM TUMORES
IGF-1 R foi imunotingido de Iisados de tumores de SCID de ca-mundongo gerados com células pancreáticas humanas (BxPC3; FIGURA30(A)) e células de câncer de mama (MCF-7; FIGURA 30(B)). Os tumoresforam excisados em pontos de tempo designados após tratamento comM13.C06.G4.P.agly ou anticorpo de controle negativo de IDEC-151. Tumo-res foram repentinamente congelados, pulverizados e lisados. Concentraçãode proteína dos lisados de célula tumoral foi normalizada e separada em 4-12 %gel de NuPAGE® (Invitrogen Inc., SD, CA). O gel foi tingido para filtrode nítrocelulose, sondado com anti-IGF-1R3 policlonal e detectado atravésde reação enzimática com anticorpo de peroxidase de raiz forte de anti-coelho. Resultados mostram que M13.C06.G4.P.agly resultou em infra-regulação e degradação de IGF-1 R comparado com anticorpo de controlenegativo.
EXEMPLO 29
ANTICORPO DE M13.C06.G4.P.AGLY DEMONSTRA ATIVIDADE DE ANTI-TUMOR IN VIVO EM UMA VARIEDADE DE SISTEMAS MODELOS DETUMOR.
Além da inibição in vivo do crescimento de tumor demonstradopara M13.C06.G4.P.agly em sistemas modelos de pulmão e pancreáticoscomo descrito nos EXEMPLOS anteriores, os experimentos a seguir tambémdemonstram a diversidade dos modelos de célula tumoral em queM13.C06.G4.P.agly exibe atividade.
ATIVIDADE ANTI-TUMORAL DE M13.C06.G4.P.AGLY EM TUMORES GE-RADOS COM CÉLULAS DE CARCINOMA PANCREÁTICO DE MiaPaCa2.
Camundongos fêmeas de SCID foram inoculados no flanco direi-to com 2x106 células de carcinoma pancreático de MiaPaCa2 em 50 %Ma-trigel (BD Biosciences)/PBS. Os tumores foram deixados alcançar um volu-me de 150 mm3 (LxW2/2) e camundongos foram classificados e dosadosintraperitonealmente com agente simples (anticorpo sozinho) e tratamentosde combinação (anticorpo de M13.C06.G4.P.agly e gencitabina). Gencitabi-na sozinha (20 mg/kg, Q4D χ 3) e em combinação com M13.C06.G4.P.agly(30 mg/kg) como também M13.C06.G4.P.agly sozinho (tanto em 15 mg/kgcomo em 30 mg/kg; 1 χ semana χ 6) inibiu crescimento do tumor.
Além da gencitabina, muitas outras terapias de combinaçãotambém poderiam ser testados e usadas juntamente com anticorpos da pre-sente invenção. Por exemplo, terapias de combinação dos compostos nascategorias a seguir, para listar uma amostragem exemplar pequena, poderi-am ser utilizadas com anticorpos da presente invenção:
Inibidores de EGFR tirosina cinase, por exemplo:
Tarceva (ErIotinib)
Iressa (Gefitinib)
Anticorpos de EGFR, por exemplo:
Erbitux (cetuximab)
Victibix (panitumumab)
Inibidores de mTOR, por exemplo:
temsirolimus,
rapamicinae outros compostos anti-câncer, por exemplo:
Gleevec (Imatinib)
Sutent (Sunitinib)
Sorafenib (Bay-439006)
SAHA (inibidor de HDAC)
Inibidores de HSP90
M200 (Volociximab).
ATIVIDADE ANTI-TUMORAL DE M13.C06.G4.P.AGLY EM TUMORES GE-RADOS COM CÉLULAS DERIVADAS DE UM ADENOCARCINOMA PRI-MÁRIO DE CÓLON HUMANO.
Camundongos fêmeas de SCID foram inoculados no flanco direi-to com 1 mm3 de fragmentos de tumor de cólon. O fragmento de tumor foiderivado através de passagem serial (5x) do tecido do tumor de cólon se-guindo resseção cirúrgica obtida de um tumor de um paciente com adeno-carcinoma do cólon. Os tumores foram deixados alcançar um volume de 150mm3 (LxW2/2) e os camundongos foram classificados e dosados com ostratamentos indicados (n=6) (FIGURA 31). Anticorpos a 15 mg/kg ou 30mg/kg foram dosados intraperitonealmente 1 χ semanalmente.
RESULTADOS: M13.C06.G4.P.aqlv EFICAZMENTE INIBIU CRESCIMEN-TO DO TUMOR DE CÓLON PRIMÁRIO (CT3) EM CAMUNDONGOS DESCID (FIGURA 31).
ATIVIDADE ANTI-TUMORAL DE M13.C06.G4.P.AGLY EM TUMORES GE-RADOS COM CÉLULAS DE CARCINOMA DE MAMA DE MCF-7.
Camundongos Beige SCID fêmeas foram inoculados no flancodireito com 2x106 células de MCF-7 (dependente de estrogênio) em 50 %deMatrigel/PBS. Uma pelota de estradiol foi implantada no flanco esquerdo 24horas antes da inoculação da célula (0,36 mg de pelota estradiol, liberaçãode 90 dias (Innovative Research of American)). Os tumores foram permitidosalcançar um volume de 150 mm3 (LxW2/2) e os camundongos foram classi-ficados e dosados com os tratamentos indicados (n=10) (FIGURA 32). Anti-corpos foram dosados intraperitonealmente 1x/semana, enquanto Citrato deTamoxifeno (Sigma Inc.) em óleo de amendoim foi dosado sub-cutaneamente 5 vezes por semana para cada regime. Análise estatística foiexecutada usando um teste t de Student em pares.
RESULTADOS: M13.C06.G4.P.aqlv eficazmente inibiu crescimento de tumo-res de carcinoma de mama MCF-7 (FIGURA 32).
Claro que, os anticorpos de eficácia de inibição de tumor da in-venção poderiam também ser testados facilmente em numerosos outros ti-pos de célula de câncer (tais como: linhagens celulares de câncer de pulmãoH-1299, H-460, H-23; linhagens celulares de câncer de cólon Colo205 e HT-29; linhagens celulares de câncer pancreático tal como Panc-1; e, linhagenscelulares de câncer de próstata tal como PC-3 para citar uma amostragemexemplar pequena).EXEMPLO 30
ANTICORPO DE M13.C06.G4.P.AGLY NÃO APRESENTA ATIVIDADE DEADCC IN VITRO.MÉTODO:
Células mononucleares humanas de sangue periférico forampurificadas de sangue total heparinizado através de separação de Ficoll-paque padrão. As células foram re-suspensas em meios de RPMI1640 deGIBCO™ contendo 10 %FBS e 200 U/ml de IL-2 humano e incubadas du-rante a noite a 37°C. O dia seguinte, as células foram colhidas e lavadasuma vez em meios de cultura e re-suspensas a 1 χ 107 células/ml.
Células alvas (MCF-7, células de carcinoma de mama) foramincubadas com 100 pCi 51Cr durante 1 hora a 37°C. As células alvo foramlavadas uma vez para remover o 51Cr não incorporado, e banhadas a umvolume de 1 χ 104 células/poço. As células alvo foram incubadas com 50 μΙde células efetoras e 50 μΙ de anticorpo. Um razão alvo para efetora 1:50 foiusada ao longo dos experimentos. Controles incluídos foram incubados come sem anticorpos, estes incluem M13.C06.G4.P.agly, Herceptina (controlepositivo) e IDEC-151 (controle negativo - anticorpo monoclonal de IgGI demacaco/humana quimérico específico para CD4). Seguindo uma incubaçãode 4 horas a 37°C, os sobrenadantes foram colhidos e contados com umcontador gama (lsodata Gamma Counter, Packard Instruments). A %lise foideterminada usando o cálculo a seguir:
%Lise = [Liberação da Amostra (CPM) - Liberação Espontânea(CPM)] ÷ [Liberação Máxima (CPM) - Liberação Espontânea (CPM)] χ 100%RESULTADOS: em contraste com o controle positivo de anticor-po de Herceptin, nem os anticorpos M13-C06 nem os de IDEC-151 exibiramatividade de ADCC, assim indicando uma carência da função efetora paraestes anticorpos posteriores (FIGURA 33).
EXEMPLO 31
TRATAMENTO DE CÂNCER HUMANO USANDO ANTICORPOS DE ANTI-IGF-1R
Este exemplo descreve métodos para tratar câncer usando anti-corpos contra IGF-1R para alvejar células malignas, por exemplo, célulashiperproliferativas em que a expressão de IGF-1R foi detectada.
Em certas modalidades, anticorpo de M13.C06.G4.P.agly (ououtro anticorpo da presente invenção) é purificado e formulado com um veí-culo farmacêutico adequado para injeção. Um paciente humano com um dis-túrbio hiperproliferativo é dado doses múltiplas de anticorpo deM13.C06.G4.P.agly (ou outro anticorpo da presente invenção) por infusãointravenosa em cerca de 1 mg/kg do peso do corpo a cerca de 100 mg/kg dopeso do corpo, por exemplo, uma vez a cada duas semanas ou uma vez pormês, durante pelo menos seis meses. Intervalos podem também ser irregu-lares como indicado medindo os indicadores prognósticos no paciente.
Anticorpos podem ser administrados antes, simultaneamente, ouapós os regimes de radioterapia padrões como descrito aqui. O paciente émonitorado para determinar se o tratamento resultou em uma resposta anti-tumor, por exemplo, com base na regressão do tumor, redução nas incidên-cias de tumores novos, expressão do antígeno de tumor mais baixo, ou ou-tros meios de avaliar prognose da doença.REFERÊNCIAS:
Brezinsky, S. C. G., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Sha-piro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., e Thill, G. (2003). "A simple method forenriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specificproductivity." J. Immunol. Methods 277: 141-155.
Davies, D. R., e Cohen, G. H. (1996). "Interactions of protein an-tigens with antibodies." Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 7-12.
Demarest, S. J., Chen1 G., Kimmel1 B. E., Gustafson1 D., Wu1 J.,Salbato, J., Poland1 J., Short1 J., Hansen1 G. (2006) Protein Engng. Des. Se-lect. 19, 325-336.
Demarest, S. J., Hopp, J., Chung1 J., Hathaway, K., Mertsching,E., Cao, X., George, J., Miatkowski1 K., LaBarre1 M. J., Shields1 M., e Kehry1M. R. (2006). "An intermediate pH unfolding transition abrogates the ability ofIgE to interact with its high affinity receptor FceRIa." J. Biol. Chem. 281:30755-30767.
Keynhanfar, M., Booker, G. W., Whittaker, J., Wallace1 J. C., eForbes, Β. E. (2007). "Precise mapping of an IGF-1-binding site on IGF-1R."Biochem. J. 401: 269-277.
McKern, N. M., Lawrence1 M. C., Streltsov1 V. A., Lou1 M.-Z., Ad-ams, T. E., Lovrecz, G. O., Elleman, T. C., Richards, K. M., Bentley, J. D.,Pilling, P., Hoyne, Ρ. A., Cartledge1 Κ. A., Pham1 T. M., Lewis1 J. L., Sank-ovich, S. E., Stoichevska, V., Da Silva1 E., Robinson1 C. P., Frenkel1 M. J.,Sparrow, L. G., Fernley1 R. T., Epa1 V. C., e Ward1 C. W. (2006). "Structure ofthe insulin receptor ectodomain reveals a folded-over conformation." Nature443: 218-221.
McKern1 N. M., Lou. M., Frenkel1 M. J., Verkuylen1 A., Bentley, J.D., Lovrecz, G. O., Ivancie1 N., Elleman1 T. C., Garrett, Τ. P. J., Cosgrove1 L.J., e Ward, C. W. (1997). "Crystallization of the first three domains of the hu-man insulin-like growth factor-1 receptor." Protein Sei. 6: 2663-2666.
Soos, Μ. A., Field1 C. E., Lammers1 R., Ullrich1 A., Zhang1 B.,Roth1 R. A., Andersen1 A. S., Kjeldsen1 T., Siddle1 K. (1992). "A panei of mo-noclonal antibodies for the type I insulin-like growth factor receptor." J. Biol.Chem. 267: 12955-12963.
Soos, Μ. A., Siddle1 K., Baron, M. D., Heward, J. M., Luzio1 J. P.,Bellatin, J., e Lennox1 E. S. (1986). "Monoclonal antibodies reacting with mul-tiple epitopes on the human insulin receptor." Biochem. J. 235: 199-208.Sorensen, H., Whittaker, L., Hinrichsen1 J., Groth, Α., e Whitta-ker, J. (2004). "Mapping of the insulin-like growth factor Il binding site of theType I insulin-like growth factor receptor by alanine scanning mutagenesis."FEBS Lett. 565: 19-22.
Whittaker, J., Groth, Α. V., Mynarcik, D. C., Pluzek, L., Gadsboll,V. L., e Whittaker, L. J. (2001). "Alanine scanning mutagenesis of a type 1insulin-like growth factor receptor Iigand binding site." J. Biol. Chem. 276:43980-43986.

Claims (266)

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que especificamente liga ao mesmo epítopo de receptor de fator-1de crescimento semelhante à insulina (IGF-R1) como um fragmento de anti-corpo de Fab monoclonal de referência selecionado do grupo que consisteem M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou umanticorpo monoclonal de referência produzido por um hibridoma selecionadodo grupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11,Ρ1 E2.3B12, e P1G10.2B8.
2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que especificamente liga a IGF-R1, em que o dito anticorpo ou frag-mento do mesmo competitivamente inibe um fragmento de anticorpo de Fabmonoclonal de referência selecionado do grupo que consiste em M13-C06,M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo mo·noclonal de referência produzido por um hibridoma selecionado do grupoque consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11,P1 E2.3B12, e P1G10.2B8 de ligar a IGF-R1.
3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que especificamente liga a IGF-R1, em que o dito anticorpo ou frag-mento do mesmo compreende um domínio de ligação de antígeno idêntico ade um fragmento de anticorpo de Fab monoclonal selecionado do grupo queconsiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04,ou um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma selecionado dogrupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11,P1E2.3B12.eP1G10.2B8.
4. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especificamen-te liga a IGF-R1, em que a região variável de cadeia pesada (VH) do ditoanticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de aminoá-cido pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de referênciaselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, e SEQID NO: 63.
5. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especificamen-te liga a IGF-R1, em que a região variável de cadeia leve (VL) do dito anti-corpo ou fragmento do mesmo compreende uma seqüência de aminoácidopelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência se-lecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:- 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 118.
6. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especificamen-te liga a IGF-R1, em que a VH do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende uma seqüência de aminoácido idêntica, com exceção de 20 oumenos substituições de aminoácido conservadoras, a uma seqüência deaminoácido de referência selecionada do grupo que consiste em: SEQ IDNO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ IDNO: 53, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 63.
7. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especificamen-te liga a IGF-R1, em que a VL do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende uma seqüência de aminoácido idêntica, com exceção de 20 oumenos substituições de aminoácido conservadoras, a uma seqüência deaminoácido de referência selecionada do grupo que consiste em: SEQ IDNO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88,SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ IDNO: 113, e SEQ ID NO: 118.
8. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especificamen-te liga a IGF-R1, em que a VH do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que con-siste em: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ IDNO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 63.
9. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especificamen-te liga a IGF-R1, em que a VL do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que con-siste em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83,SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ IDNO: 108, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 118.
10. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VH e VL do dito anticorpo ou fragmento domesmo compreende, respectivamente, seqüências de aminoácido pelo me-nos 90% idênticas às seqüências de aminoácido de referência selecionadasdo grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 eSEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 e SEQ IDNO: 83; SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 93;SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 103; SEQID NO: 48 e SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 103; SEQ IDNO: 58 e SEQ ID NO: 113; e SEQ ID NO: 63 e 118.
11. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VH e VL do dito anticorpo ou fragmento domesmo compreende, respectivamente, seqüências de aminoácido idênticas,com exceção de 20 ou menos substituições de aminoácido conservadorascada, às seqüências de aminoácido de referência selecionadas do grupoque consiste em: SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 e SEQ IDNO: 73; SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 83;SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 93; SEQ IDNO: 38 e SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO:-48 e SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 eSEQ ID NO: 113; e SEQ ID NO: 63 e 118.
12. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VH e VL do dito anticorpo ou fragmento domesmo compreende, respectivamente, seqüências de aminoácido selecio-nadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 68; SEQ IDNO: 8 e SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 eSEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 e SEQ IDNO: 93; SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO:-103; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 103;SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 113; e SEQ ID NO: 63 e 118.
13. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VH do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende uma seqüência de aminoácido de uma região-1 de determina-ção de complementaridade de cadeia pesada de Kabat (VH-CDR1) idêntica,a uma seqüência de aminoácido de VH-CDR1 de referência selecionada dogrupo que consiste em, com exceção de duas ou menos substituições deaminoácido: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:-21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO: 64.
14. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 13, em que a dita seqüência de aminoácido de VH-CDR1 é selecio-nada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:-15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO:
15. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VH do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende uma seqüência de aminoácido de região-2 de determinação decomplementaridade de cadeia pesada de Kabat (VH-CDR2) idêntica, a umaseqüência de aminoácido de VH-CDR2 de referência selecionada do grupoque consiste em, com exceção de quatro ou menos substituições de amino-ácido: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:-50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60, e SEQ ID NO: 65.
16. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 15, em que a dita seqüência de aminoácido de VH-CDR2 é selecio-nada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:-16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60, e SEQ ID NO:-65.
17. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VH do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende uma seqüência de aminoácido de região-3 de determinação decomplementaridade de cadeia pesada de Kabat (VH-CDR3) idêntica, a umaselecionada do grupo que consiste em, com exceção de quatro ou menossubstituições de aminoácido: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:-17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61, e SEQ ID NO:-66.
18. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 17, em que a dita seqüência de aminoácido de VH-CDR3 é selecio-nada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:-17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61, e SEQ ID NO:-66.
19. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VL do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende uma seqüência de aminoácido de região-3 de determinação decomplementaridade de cadeia leve de Kabat (VL-CDR1) idêntica, a uma se-qüência de aminoácido de VL-CDR1 de referência selecionada do grupo queconsiste em, com exceção de quatro ou menos substituições de aminoácido:SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ IDNO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109,SEQ ID NO: 114, e SEQ ID NO: 119.
20. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 19, em que a dita seqüência de aminoácido de VL-CDR1 é seleciona-da do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:-79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114, e SEQ ID NO: 119.
21. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VL do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende uma seqüência de aminoácido de região-2 de determinação decomplementaridade de cadeia leve de Kabat (VL-CDR2) idêntica, a uma se-qüência de aminoácido de VL-CDR2 de referência selecionada do grupo queconsiste em, com exceção de duas ou menos substituições de aminoácido:SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ IDNO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO:-110, SEQ ID NO: 115, e SEQ ID NO: 120.
22. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 21, em que a dita seqüência de aminoácido de VL-CDR2 é seleciona-da do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO:-80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100, SEQID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115, e SEQ ID NO: 120.
23. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VL do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende uma seqüência de aminoácido de região-3 de determinação decomplementaridade de cadeia leve de Kabat (VL-CDR3), a uma seqüênciade aminoácido de VL-CDR3 de referência selecionada do grupo que consis-te em, com exceção de quatro ou menos substituições de aminoácido: SEQID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO:-91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111,SEQ ID NO: 116, e SEQ ID NO: 121.
24. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 23, em que a dita seqüência de aminoácido de VL-CDR3 é seleciona-da do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:-81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101, SEQID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116, e SEQ ID NO: 121.
25. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VH do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende seqüências de aminoácido VH-CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 5, 6, e 7; SEQ IDNOs: 10, 11, e 12; SEQ ID NOs: 15, 16, e 17; SEQ ID NOs: 21, 22, e 23;SEQ ID NOs: 27, 28, e 29; SEQ ID NOs: 33, 34, e 35; SEQ ID NOs: 39, 40, e-41; SEQ ID NOs: 44, 45, e 46; SEQ ID NOs: 49, 50, e 51; SEQ ID NOs: 54,-55, e 56; SEQ ID NOs: 59, 60, e 61; e SEQ ID NOs: 64, 65, e 66, com exce-ção de uma, duas, três, ou quatro substituições de aminoácido em pelo me-nos uma das as ditas VH-CDRs.
26. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VH do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende seqüências de aminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2, e VH-CDRS selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 5, 6, e 7; SEQID NOs: 10, 11, e 12; SEQ ID NOs: 15, 16, e 17; SEQ ID NOs: 21, 22, e 23;SEQ ID NOs: 27, 28, e 29; SEQ ID NOs: 33, 34, e 35; SEQ ID NOs: 39, 40, e-41; SEQ ID NOs: 44, 45, e 46; SEQ ID NOs: 49, 50, e 51; SEQ ID NOs: 54,-55, e 56; SEQ ID NOs: 59, 60, e 61; e SEQ ID NOs: 64, 65, e 66.
27. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VL do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende seqüências de aminoácido de VL-CDR1, VL-CDR2, e VL-CDR3selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 69, 70, e 71; SEQ IDNOs: 74, 75, e 76; SEQ ID NOs: 79, 80, e 81; SEQ ID NOs: 84, 85, e 86;SEQ ID NOs: 89, 90, e 91; SEQ ID NOs: 94, 95, e 96; SEQ ID NOs: 99, 100,e 101; SEQ ID NOs: 104, 105, e 106; SEQ ID NOs: 109, 110, e 111; SEQ IDNOs: 114, 115, e 116; e SEQ ID NOs: 119, 120, e 121, com exceção de u-ma, duas, três, ou quatro substituições de aminoácido em pelo menos umadas as ditas VL-CDRs.
28. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que especifica-mente liga a IGF-R1, em que a VL do dito anticorpo ou fragmento do mesmocompreende seqüências de aminoácido de VL-CDR1, VL-CDR2, e VL-CDR3selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 69, 70, e 71; SEQ IDNOs: 74, 75, e 76; SEQ ID NOs: 79, 80, e 81; SEQ ID NOs: 84, 85, e 86;SEQ ID NOs: 89, 90, e 91; SEQ ID NOs: 94, 95, e 96; SEQ ID NOs: 99, 100,e 101; SEQ ID NOs: 104, 105, e 106; SEQ ID NOs: 109, 110, e 111; SEQ IDNOs: 114, 115, e 116; e SEQ ID NOs: 119, 120, e 121.
29. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 28, em que as regiões de estrutura de VH sãohumanas, com exceção de cinco ou menos substituições de aminoácido.
30. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 29, em que as regiões de estrutura de VL sãohumanas, com exceção de cinco ou menos substituições de aminoácido.
31. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30 que liga a um epítopo conformacional não-linear.
32. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que especificamente liga a um epítopo de IGF-R1 que compreenderesíduo de aminoácido valina-462.
33. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que especificamente liga a um epítopo de IGF-R1 que compreenderesíduo de aminoácido histidina-464.
34. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que especificamente liga a um epítopo de IGF-R1 que compreenderesíduos de aminoácido valina-462 e histidina-464.
35. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que especificamente liga a um epítopo de IGF-R1 que compreendeum raio de superfície acessível de solvente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13 ou 14 angstrõms de resíduo valina-462.
36. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que especificamente liga a um epítopo de IGF-R1 que compreendeum raio de superfície acessível de solvente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11,-12, 13 ou 14 angstrõms de resíduo histidina-464.
37. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que especificamente liga a um epítopo de IGF-R1 que compreendeum raio de superfície acessível de solvente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13 ou 14 angstrõms de resíduos valina-462 e histidina-464.
38. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que especificamente liga a um epítopo de IGF-R1 que compreendeum raio de superfície acessível de solvente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13 ou 14 angstrõms do centro de resíduos valina-462 e histidina-464 deIGF-1R humano.
39. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 30, que liga a um epítopo linear.
40. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 39, que é um multivalente e compreende pelomenos duas cadeias pesadas e pelo menos duas cadeias leves.
41. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 40, que é multiespecífico.
42. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 41, que é biespecífico.
43. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 42, que é biespecífico.
44. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 43, em que os domínios variáveis de cadeia pe-sada e leve são completamente humanos.
45. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 44, em que os domínios variáveis de cadeia pesada e leve são de umfragmento de anticorpo de Fab monoclonal selecionado do grupo que con-siste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04.
46. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 43, em que os domínios variáveis de cadeia pe-sada e leve são murinos.
47. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 46, em que os domínios variáveis de cadeia pesada e leve são de umanticorpo monoclonal produzido por um hibridoma selecionado do grupo queconsiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, Ρ1A2.2B11, 20D8.24B11, Ρ1E2.3B12, eP1G10.2B8.
48. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 43 e 46-47, que é humanizado.
49. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 43 e 46-47, que é quimérico.
50. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 43 e 46-47, que é primatizado.
51. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 45, que é completamente o humano.
52. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 51, que é um fragmento de Fab.
53. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 51, que é o fragmento de um Fab.
54. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 51, que é um fragmento de F(ab)2.
55. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 51, que é um fragmento de Fv.
56. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 51, que é um anticorpo de cadeia simples.
57. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações que 1 a 54 e 56, que compreende umas regiõesconstantes de cadeia leve selecionadas do grupo que consiste em uma regi-ão constante humana de kappa e uma região constante humana lambda.
58. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 54 e 56, que compreende a uma região constan-te de cadeia pesada ou fragmento da mesma.
59. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 58, em que a dita região constante de cadeia pesada ou fragmento damesma é lgG4 humana.
60. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 59, em que a dita lgG4 é mutagenizada para remover os sítios de gli-cosilação.
61. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 60, em que as ditas mutações compreendem S241P e T318A usandoo sistema de numeração de kabat.
62. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 61, que especificamente liga a um polipeptídeode IGF-R1 ou fragmento do mesmo, ou uma variante de polipeptídeo deIGF-R1, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação(KD) que é menor que a KD para o dito anticorpo monoclonal de referência.
63. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 62, que especificamente liga a um polipeptídeode IGF-R1 ou fragmento do mesmo, ou uma variante de polipeptídeo deIGF-R1 com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação(KD) não maior que 5 x 10-2 Μ, 10-2 Μ, 5 x 10-3 Μ, 103 Μ, 5 x 10-4 Μ, 10-4 Μ,-5 x 10-5 Μ, 10-5 Μ, 5 x 10-6 Μ, 10-6 Μ, 5 x 10-7 Μ, 10-7 Μ, 5 x 10-8 Μ, 10-8 Μ, 5x 10-9 Μ, 10-9 Μ, 5 x 10-10 Μ, 10-10 Μ, 5 x 10-11 Μ, 10-11 Μ, 5 x 10-12 Μ, 10-12Μ, 5 x 10-13 Μ, 10-13 Μ, 5 x 10-14 Μ, 10-14 Μ, 5 x 10-15 Μ, ou 10-15 Μ.
64. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 63, em que a dita afinidade é caracterizada poruma constante de dissociação (KD) em uma faixa de cerca de 1 x 10-10 acerca de 5 x 10-9 M.
65. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 64, em que a dita afinidade é caracterizada poruma constante de dissociação (KD) selecionada do grupo que consiste em:(a) cerca de 1,1 x 10-10 M;(b) cerca de 1,3 x 10-10M;(c) cerca de 3,6 x 10-10 Μ;(d) cerca de 1,3 x 10-9 Μ;(e) cerca de 4,0 x 10-9 Μ; e,(f) cerca de 4,9 x 10-9 Μ.
66. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 65, em que a dita afinidade é caracterizada poruma constante de dissociação (KD) selecionada do grupo que consiste em:(a) 1,1 x 10-10 M; (b) 1,3x10-10 M; (c) 3,6 x 10-10 M; (d) 1,3 x 10-9 Μ; (e) 4,0 x-10-9 Μ; e, (f) 4,9 x 10-9 Μ.
67. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 66, que preferencialmente liga a um polipeptídeode IGF-R1 humano ou fragmento do mesmo, com relação a um polipeptídeode IGF-R1 murino ou fragmento do mesmo ou um polipeptídeo de IGF-R1primata não-humano ou fragmento do mesmo.
68. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 66, que liga a um polipeptídeo de IGF-R1 huma-no ou fragmento do mesmo, e também liga a um polipeptídeo de IGF-R1primata não-humano ou fragmento do mesmo.
69. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações que 1 a 68, que liga a IGF-R1 expressado na super-fície de uma célula.
70. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 69, em que a dita célula é uma célula maligna, uma célula neoplásti-ca, uma célula tumoral, ou uma célula metastática.
71. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 70, que bloqueia fator de crescimento de insulinade ligara IGF-R1.
72. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 71, em que o dito fator de crescimento de insulina é fator-1 de cresci-mento de insulina (IGF-1).
73. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 71, em que o dito fator de crescimento de insulina é fator-2 de cresci-mento de insulina (IGF-2).
74. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 71, que bloqueia IGF-1 e IGF-2 de ligar a IGF-R1.
75. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 74 que inibe proliferação celular mediada porIGF-R1.
76. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 75 que inibe fosforilação de IGF-R1 mediada porIGF-1 ou IGF-2.
77. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 76, que inibe crescimento de célula tumoral.
78. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 77, que inibe internalização de IGF-R1.
79. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 78, também compreendendo um polipeptídeoheterólogo fundido a este.
80. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 79, em que o dito anticorpo é conjugado com umagente selecionado do grupo que consiste em agente citotóxico, um agenteterapêutico, agente citoestático, uma toxina biológica, um pró-fármaco, umpeptídeo, uma proteína, uma enzima, um vírus, um lipídio, um modificadorde resposta biológica, agente farmacêutico, uma linfocina, um anticorpo he-terólogo ou fragmento do mesmo, uma marcação detectável, polietileno gli-col (PEG), e uma combinação de dois ou mais de qualquer um do dito agen-te.
81. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 80, em que o dito agente citotóxico é selecionado do grupo que con-siste em um radionuclídeo, uma biotoxina, uma toxina enzimaticamente ati-va, um agente terapêutico citoestático ou citotóxico, uns pró-fármacos, umligando imunologicamente ativo, um modificador de resposta biológica, ouuma combinação de dois ou mais de qualquer dos ditos agentes citotóxicos.
82. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindi-cação 80, em que o dito rótulo detectável é selecionada do grupo que con-siste em uma enzima, um rótulo fluorescente, um rótulo quimioluminescente,um rótulo bioluminescente, um rótulo radioativo, ou uma combinação de doisou mais de qualquer das ditas marcações detectáveis.
83. Composição compreendendo o anticorpo ou fragmento domesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 82, e um ve-ículo.
84. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica um polipeptídeo de VH de anticorpo, em que a seqüência deaminoácido do dito polipeptídeo de VH é pelo menos 90% idêntica a umaseqüência de aminoácido de referência selecionada do grupo que consisteem: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ IDNO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48,SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 63; e em que um anticorpoou fragmento de ligação de antígeno do mesmo especificamente compreen-dendo o dito polipeptídeo de VH iiga a IGF-R1.
85. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 84, em que aseqüência de aminoácido do dito polipeptídeo de VH é selecionada do grupoque consiste em: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ IDNO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43,SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 63.
86. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 84 ou 85, emque a seqüência de nucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo de VH é o-timizada para expressão aumentada sem alterar a seqüência de aminoácidodo dito polipeptídeo de VH.
87. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 86, em que adita otimização compreende identificação e remoção de sítios doadores deencaixe e aceitantes de encaixe.
88. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 86 ou 87, emque a dita otimização compreende otimização de uso de códon para as célu-las que expressam o dito polinucleotídeo.
89. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 84 a 88, em que o dito ácido nucléico compreende uma seqüência denucleotídeo selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ IDNO: 37, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 57, eSEQ ID NO: 62.
90. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica um polipeptídeo de VL de anticorpo, em que a seqüência deaminoácido do dito polipeptídeo de VL é pelo menos 90% idêntica a umaseqüência de aminoácido de referência selecionada do grupo que consisteem: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO:-108, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 118; e em que um anticorpo ou frag-mento de ligação de antígeno do mesmo especificamente compreendendo odito polipeptídeo de VL liga a IGF-R1.
91. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 90, em que aseqüência de aminoácido do dito polipeptídeo de VL é selecionada do grupoque consiste em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ IDNO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103,SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 118.
92. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 90 ou 91, emque a seqüência de nucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo de VL é oti-mizada para expressão aumentada sem alterar a seqüência de aminoácidodo dito polipeptídeo de VL.
93. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 92, em que adita otimização compreende identificação e remoção de sítios doadores deencaixe e aceitantes de encaixe.
94. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 92 ou 93, emque a dita otimização compreende otimização de uso de códon para as célu-las que expressam o dito polinucleotídeo.
95. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 90 a 94, em que o dito ácido nucléico compreende uma seqüência denucleotídeo selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 67, SEQ IDNO: 72, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 92,SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 112, e SEQID NO: 117.
96. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica um polipeptídeo de VH de anticorpo, em que a seqüência deaminoácido do dito polipeptídeo de VH é idêntica, com exceção de 20 oumenos substituições de aminoácido conservadoras, a uma seqüência deaminoácido de referência selecionada do grupo que consiste em: SEQ IDNO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ IDNO: 53, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 63; e em que um anticorpo ou frag-mento de ligação de antígeno do mesmo especificamente compreendendo odito polipeptídeo de VH liga a IGF-R1.
97. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica um polipeptídeo de VL de anticorpo, em que a seqüência deaminoácido do dito polipeptídeo de VL é idêntica, com exceção de 20 oumenos substituições de aminoácido conservadoras, a uma seqüência deaminoácido de referência selecionada do grupo que consiste em: SEQ IDNO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88,SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ IDNO: 113, e SEQ ID NO: 118; e em que um anticorpo ou fragmento de liga-ção de antígeno do mesmo especificamente compreendendo o dito polipep-tídeode VLIigaa IGF-R1.
98. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica uma seqüência de aminoácido de VH-CDR1 idêntica, com ex-ceção de duas ou menos substituições de aminoácido, a uma seqüência deaminoácido de VH-CDR1 de referência selecionada do grupo que consisteem: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO:-49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO: 64; e em que um anti-corpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo especificamente com-preendendo a dita VH-CDR1 liga a IGF-R1.
99. Polinucleotídeo ou fragmento do mesmo de acordo com areivindicação 98, em que a dita seqüência de aminoácido de VH-CDR1 éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:-39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, e SEQID NO: 64.
100. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica uma seqüência de aminoácido de VH-CDR2 idêntica, com ex-ceção de quatro ou menos substituições de aminoácido, a uma seqüência deaminoácido de VH-CDR2 de referência selecionada do grupo que consisteem: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:-50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60, e SEQ ID NO: 65; e em que um anti-corpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo especificamente com-preendendo a dita VH-CDR2 liga a IGF-R1.
101. Polinucleotídeo ou fragmento do mesmo de acordo com areivindicação 100, em que a dita seqüência de aminoácido de VH-CDR2 éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60, e SEQID NO: 65.
102. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica uma seqüência de aminoácido de VH-CDR3 idêntica, com ex-ceção de quatro ou menos substituições de aminoácido, a uma seqüência deaminoácido de VH-CDR3 de referência selecionada do grupo que consisteem: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:"15 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61, e SEQ ID NO: 66; e em que um anti-corpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo especificamente com-preendendo a dita VH-CDR3 liga a IGF-R1.
103. Polinucleotídeo ou fragmento do mesmo de acordo com areivindicação 102, em que a dita seqüência de aminoácido de VH-CDR3 éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61, e SEQID NO: 66.
104. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica uma seqüência de aminoácido de VL-CDR1 idêntica, com exce-ção de quatro ou menos substituições de aminoácido, a uma seqüência deaminoácido de VL-CDR1 de referência selecionada do grupo que consisteem: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO:-109, SEQ ID NO: 114, e SEQ ID NO: 119; e em que um anticorpo ou frag-mento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VL-CDR1especificamente liga a IGF-R1.
105. Polinucleotídeo ou fragmento do mesmo de acordo com areivindicação 104, em que a dita seqüência de aminoácido de VL-CDR1 éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74,SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ IDNO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114, e SEQ ID NO:-119.
106. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica uma seqüência de aminoácido de VL-CDR2 idêntica, com exce-ção de duas ou menos substituições de aminoácido, a uma seqüência deaminoácido de VL-CDR2 de referência selecionada do grupo que consisteem: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO:-110, SEQ ID NO: 115, e SEQ ID NO: 120; e em que um anticorpo ou frag-mento de ligação de antígeno do mesmo especificamente compreendendo adita VL-CDR2 Iigaa IGF-R1.
107. Polinucleotídeo ou fragmento do mesmo de acordo com areivindicação 106, em que a dita seqüência de aminoácido de VL-CDR2 éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75,SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ IDNO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115, e SEQ IDNO: 120.
108. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica uma seqüência de aminoácido de VL-CDR3 idêntica, com exce-ção de quatro ou menos substituições de aminoácido, a uma seqüência deaminoácido de VL-CDR3 de referência selecionada do grupo que consisteem: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO:-111, SEQ ID NO: 116, e SEQ ID NO: 121; e em que um anticorpo ou frag-mento de ligação de antígeno do mesmo especificamente compreendendo adita VL-CDR3 liga a IGF-R1.
109. Polinucleotídeo ou fragmento do mesmo de acordo com areivindicação 108, em que a dita seqüência de aminoácido de VL-CDR3 éselecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76,SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ IDNO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116, e SEQ IDNO: 121.
110. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica um polipeptídeo de VH de anticorpo, em que o dito polipeptídeode VH compreende seqüências de aminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2, eVH-CDR3 selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 5, 6, e 7;SEQ ID NOs: 10, 11, e 12; SEQ ID NOs: 15, 16, e 17; SEQ ID NOs: 21, 22, e-23; SEQ ID NOs: 27, 28, e 29; SEQ ID NOs: 33, 34, e 35; SEQ ID NOs: 39,-40, e 41; SEQ ID NOs: 44, 45, e 46; SEQ ID NOs: 49, 50, e 51; SEQ ID NOs:-54, 55, e 56; SEQ ID NOs: 59, 60, e 61; e SEQ ID NOs: 64, 65, e 66; e emque um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo especifi-camente compreendendo a dita VL-CDR3 liga a IGF-R1.
111. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléicoque codifica um polipeptídeo de VL de anticorpo, em que o dito polipeptídeode VL compreende seqüências de aminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2, eVH-CDR3 selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 69, 70, e-71; SEQ ID NOs: 74, 75, e 76; SEQ ID NOs: 79, 80, e 81; SEQ ID NOs: 84,-85, e 86; SEQ ID NOs: 89, 90, e 91; SEQ ID NOs: 94, 95, e 96; SEQ BDNOs: 99, 100, e 101; SEQ ID NOs: 104, 105, e 106; SEQ ID NOs: 109, 110,e 111; SEQ ID NOs: 114, 115, e 116; e SEQ ID NOs: 119, 120, e 121; e emque um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo especifi-camente compreendendo a dita VL-CDR3 liga a IGF-R1.
112. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 111, também compreendendo um ácido nucléico que codificaum peptídeo sinal fundido com o dito polipeptídeo de VH de anticorpo.
113. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 111, também compreendendo um ácido nucléico que codificaum peptídeo sinal fundido com o dito polipeptídeo de VL de anticorpo.
114. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 113, também compreendendo um ácido nucléico que codificaum domínio de CH1 de região constante de cadeia pesada fundido com odito polipeptídeo de VH.
115. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 114, também compreendendo um ácido nucléico que codificaum domínio de CH2 de região constante de cadeia pesada fundido com odito polipeptídeo de VH.
116. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 115, também compreendendo um ácido nucléico que codificaum domínio de CH3 de região constante de cadeia pesada fundido com odito polipeptídeo de VH.
117. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 116, também compreendendo um ácido nucléico que codificauma região de dobradiça de cadeia pesada fundido com o dito polipeptídeode VH.
118. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 114 a 117, em que a dita região constante de cadeia pesada é lgG4humana.
119. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 118, em quea dita lgG4 é mutagenizada para remover os sítios de glicosilação.
120. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 119, em queas ditas mutações compreendem S241P e T318A usando o sistema de nu-meração de kabat.
121. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 120, também compreendendo um ácido nucléico que codificaum domínio de região constante de cadeia leve fundido com o dito polipeptí-deo de VL.
122. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 121, em quea dita região constante de cadeia leve é capa humana.
123. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 122, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo um polipeptídeo codificado pelo dito ácido nu-cléico especificamente liga ao mesmo epítopo de IGF-R1 como um fragmen-to de anticorpo de Fab monoclonal de referência selecionado do grupo queconsiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04,ou um anticorpo monoclonal de referência produzido por um hibridoma sele-cionado do grupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11,- 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8.
124. Polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivin-dicações 84 a 123, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antíge-no do mesmo compreendendo um polipeptídeo codificado pelo dito ácidonucléico competitivamente inibe um fragmento de anticorpo de Fab mono-clonal de referência selecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclo-nal de referência produzido por um hibridoma selecionado do grupo queconsiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, Ρ1 A2.2B11, 20D8.24B11, Ρ1 E2.3B12, eP1G10.2B8.
125. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 124, em que as regiões de estrutura do dito polipeptídeo de VHsão humanas, com exceção de cinco ou menos substituições de aminoácido.
126. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 125, em que as regiões de estrutura do dito polipeptídeo de VLsão humanas, com exceção de cinco ou menos substituições de aminoácido.
127. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 126, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoliga a um epítopo linear.
128. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 126, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoliga a um epítopo conformacional não-linear.
129. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 128, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoé um multivalente, e compreende pelo menos duas cadeias pesadas e pelomenos duas cadeias leves.
130. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 129, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoé multiespecífico.
131. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 130, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoé biespecífico.
132. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 131, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicocompreende domínios variáveis de cadeia pesada e leve que são completa-mente humanos.
133. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 132, em queos ditos domínios variáveis de cadeia pesada e leve são idênticos àquelesde um fragmento de anticorpo de Fab monoclonal selecionado do grupo queconsiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04.
134. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 131, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicocompreende domínios variáveis de cadeia pesada e leve que são murinos.
135. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 134, em queos ditos domínios variáveis de cadeia pesada e leve são idênticos àquelesde um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma selecionado dogrupo que consiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11,P1E2.3B12, e P1G10.2B8.
136. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 131 e 134 a 135, em que um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno dos mesmos compreendendo o polipeptídeo codificado pelo ditoácido nucléico é humanizado.
137. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 131 e 134 a 135, em que um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno dos mesmos compreendendo o polipeptídeo codificado pelo ditoácido nucléico é quimérico.
138. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 131 e 134 a 135, em que um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno dos mesmos compreendendo o polipeptídeo codificado pelo ditoácido nucléico é primatizado.
139. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 133, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoé completamente humano.
140. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 139, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoé um fragmento de Fab.
141. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 139, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoé o fragmento de um Fab.
142. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 139, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoé um fragmento de F(ab)2.
143. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 139, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoé um fragmento de Fv.
144. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 139, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoé um anticorpo de cadeia simples.
145. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 144, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoespecificamente liga a um polipeptídeo de IGF-R1 ou fragmento do mesmo,ou uma variante de polipeptídeo de IGF-R1, com uma afinidade caracteriza-da por uma constante de dissociação (KD) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ,- 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 M1 10"5 M1 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5χ 10"7 Μ, 10~7 Μ, 5 χ 10~8 M1 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5χ 10"11, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ 10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ,- 5 χ 10"15 M1 ou 10"15 Μ.
146. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 145, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado preferencialmente pelodito ácido nucléico liga a um polipeptídeo de IGF-R1 humano ou fragmentodo mesmo, com relação a um polipeptídeo de IGF-R1 murino ou fragmentodo mesmo ou um polipeptídeo de IGF-R1 primata não-humano ou fragmentodo mesmo.
147. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 145, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoliga a um polipeptídeo de IGF-R1 humano ou fragmento do mesmo, e tam-bém liga a um polipeptídeo de IGF-R1 primata não-humano ou fragmento domesmo.
148. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 147, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoliga a IGF-R1 expressado na superfície de uma célula.
149. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 148, em quea dita célula é uma célula maligna, uma célula neoplástica, uma célula tumo-ral, ou uma célula metastática.
150. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 149, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoque bloqueia fator de crescimento de insulina de ligar a IGF-R1.
151. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 150, em queo dito fator de crescimento de insulina é fator-1 de crescimento de insulina(IGF-1).
152. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 150, em queo dito fator de crescimento de insulina é fator-2 de crescimento de insulina(IGF-2).
153. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 150, quebloqueia IGF-1 e IGF-2 de ligar a IGF-R1.
154. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 153, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoinibe proliferação celular mediada por IGF-R1.
155. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 154, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoinibe fosforilação de IGF-R1 mediada por IGF-1 ou IGF-2.
156. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 155, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoinibe crescimento de célula tumoral.
157. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 156, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoinibe internalização de IGF-R1.
158. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 157, também compreendendo um ácido nucléico que codificaum polipeptídeo heterólogo.
159. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 a 158, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléicoé conjugado com um agente selecionado do grupo que consiste em agentecitotóxico, um agente terapêutico, agente citoestático, uma toxina biológica,um pró-medicamento, um peptídeo, uma proteína, uma enzima, um vírus,um lipídio, um modificador de resposta biológica, agente farmacêutico, umalinfocina, um anticorpo heterólogo ou fragmento do mesmo, uma marcaçãodetectável, polietileno glicol (PEG), e uma combinação de dois ou mais dequalquer um do dito agente.
160. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 159, em queo dito agente citotóxico é selecionado do grupo que consiste em um radionu-clídeo, uma biotoxina, uma toxina enzimaticamente ativa, um agente tera-pêutico citoestático ou citotóxico, uns pró-fármaco, um Iigante imunologica-mente ativo, um modificador de resposta biológica, ou uma combinação dedois ou mais de qualquer dos ditos agentes citotóxicos.
161. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 159, em queo dito rótulo detectável é selecionada do grupo que consiste em uma enzi-ma, um rótulo marcação fluorescente, um rótulo quimioluminescente, umrótulo bioluminescente, um rótulo radioativa, ou uma combinação de dois oumais de qualquer dos ditos rótulos detectáveis.
162. Composição compreendendo o polinucleotídeo como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 84 a 161, e um veículo.
163. Vetor compreendendo o polinucleotídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 84 a 161.
164. Vetor de acordo com a reivindicação 163, em que o ditopolinucleotídeo está operavelmente associado a um promotor.
165. Célula hospedeira compreendendo o vetor como definidoem reivindicação 163 ou 164.
166. Método de produzir um anticorpo ou fragmento do mesmoque especificamente liga IGF-1R, compreendendo cultivar a célula hospedei-ra como definido em reivindicação 165, e restabelecer o dito anticorpo, oufragmento do mesmo.
167. Polipeptídeo isolado produzido pelo método como definidoem reivindicação 166.
168. Polipeptídeo isolado codificado pelo polinucleotídeo comodefinido em qualquer uma das reivindicações 84 a 161.
169. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 168,em que um anticorpo ou fragmento do mesmo especificamente compreen-dendo o dito polipeptídeo liga a IGF-1R.
170. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo compreendendoo polipeptídeo como definido na reivindicação 168 ou 169.
171. Composição compreendendo um polinucleotídeo de codifi-cação de VH isolado e um polinucleotídeo de codificação de VL isolado, emque o dito polinucleotídeo de codificação de VH e o dito polinucleotídeo decodificação de VL, respectivamente, compreendem ácidos nucléicos quecodificam seqüências de aminoácido pelo menos 90% idênticas às seqüên-cias de aminoácido de referência selecionadas do grupo que consiste em:SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 73; SEQ IDNO: 14 e SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26e SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 e SEQID NO: 98; SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 e SEQ IDNO: 108; SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO:113; e SEQ ID NO: 63 e 118; e em que um anticorpo ou fragmento do mes-mo codificado pelos polinucleotídeos de codificação de VH e VL que especi-ficamente liga IGF-R1.
172. Composição de acordo com a reivindicação 171, em que odito polinucleotídeo de codificação de VH e o dito polinucleotídeo de codifi-cação de VL, respectivamente, compreendem ácidos nucléicos que codifi-cam seqüências de aminoácido selecionados do grupo que consiste em:SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 73; SEQ IDNO: 14 e SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26e SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 e SEQID NO: 98; SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 e SEQ IDNO: 108; SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO:113; e SEQ ID NO: 63 e 118.
173. Composição compreendendo um polinucleotídeo de codifi-cação de VH isolado e um polinucleotídeo de codificação de VL isolado, emque o dito polinucleotídeo de codificação de VH e o dito polinucleotídeo decodificação de VL, respectivamente, compreendem ácidos nucléicos quecodificam seqüências de aminoácido idênticas, com exceção de menos de-20 substituições de aminoácido conservadoras, para seqüências de aminoá- cido de referência selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4 eSEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 e SEQ IDNO: 78; SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 88;SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 98; SEQ IDNO: 43 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: -53 e SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 113; e SEQ ID NO: 63e 118; e em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificado pelos poli-nucleotídeos de codificação de VH e VL que especificamente liga IGF-R1.
174. Composição compreendendo um polinucleotídeo de codifi-cação de VH isolado e um polinucleotídeo de codificação de VL isolado, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VH codifica um polipeptídeo deVH que compreende seqüências de aminoácido de VH-CDR1, VH-CDR2, eVH-CDR3 selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 5, 6, e 7;SEQ ID NOs: 10, 11, e 12; SEQ ID NOs: 15, 16, e 17; SEQ ID NOs: 21, 22, e-23; SEQ ID NOs: 27, 28, e 29; SEQ ID NOs: 33, 34, e 35; SEQ ID NOs: 39, -40, e 41; SEQ ID NOs: 44, 45, e 46; SEQ ID NOs: 49, 50, e 51; SEQ ID NOs:-54, 55, e 56; SEQ ID NOs: 59, 60, e 61; e SEQ ID NOs: 64, 65, e 66; em queo dito polinucleotídeo de codificação de VL codifica um polipeptídeo de VLque compreende seqüências de aminoácido de VL-CDR1, VL-CDR2, e VL-CDR3 selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 69, 70, e 71; SEQ ID NOs: 74, 75, e 76; SEQ ID NOs: 79, 80, e 81; SEQ ID NOs: 84, 85, e-86; SEQ ID NOs: 89, 90, e 91; SEQ ID NOs: 94, 95, e 96; SEQ ID NOs: 99,-100, e 101; SEQ ID NOs: 104, 105, e 106; SEQ ID NOs: 109, 110, e 111;SEQ ID NOs: 114, 115, e 116; e SEQ ID NOs: 119, 120, e 121; e em que umanticorpo ou fragmento do mesmo codificado pelos polinucleotídeos de codi- ficação de VH e VL que especificamente liga IGF-R1.
175. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 - 174, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VH tambémcompreende um ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal fundido com odito polipeptídeo de VH de anticorpo.
176. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171-174, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VL tambémcompreende um ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal fundido com odito polipeptídeo de VL de anticorpo.
177. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 176, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VH tambémcompreende um ácido nucléico que codifica um domínio de CH1 de regiãoconstante de cadeia pesada fundido com o dito polipeptídeo de VH.
178. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 177, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VH tambémcompreende um ácido nucléico que codifica um domínio de CH2 de regiãoconstante de cadeia pesada fundido com o dito polipeptídeo de VH.
179. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 178, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VH tambémcompreende um ácido nucléico que codifica um domínio de CH3 de regiãoconstante de cadeia pesada fundido com o dito polipeptídeo de VH.
180. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 179, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VH tambémcompreende um ácido nucléico que codifica uma região de dobradiça de ca-deia pesada fundido com o dito polipeptídeo de VH.
181. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 177 a 180, em que a dita região constante de cadeia pesada é lgG4humana.
182. Composição da reivindicação 181, em que a dita lgG4 émutagenizada para remover os sítios de glicosilação.
183. Composição da reivindicação 182, em que as ditas muta-ções compreendem S241P e T318A usando o sistema de numeração dekabat.
184. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 183, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VL tambémcompreende um ácido nucléico que codifica um domínio de região constantede cadeia leve fundido com o dito polipeptídeo de VL.
185. Composição da reivindicação 174, em que a dita regiãoconstante de cadeia leve é capa humana.
186. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 185, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos polinucleotídeos de codificação de VH e VL que especificamente liga omesmo epítopo de IGF-R1 como um fragmento de anticorpo de Fab mono-clonal de referência selecionado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclo-nal de referência produzido por um hibridoma selecionado do grupo queconsiste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, Ρ1 A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, eP1G10.2B8.
187. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 185, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL que especificamenteinibem um fragmento de anticorpo de Fab monoclonal de referência selecio-nado do grupo que consiste em M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01,M12-E01, e M12-G04, ou um anticorpo monoclonal de referência produzidopor um hibridoma selecionado do grupo que consiste em P2A7.3E11,20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, e P1G10.2B8 de ligar aIGF-R1.
188. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 187, em que as regiões de estrutura dos ditos polipeptídeos deVH e VL são humanas, com exceção de cinco ou menos substituições deaminoácido.
189. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 188, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL liga a um epítopolinear.
190. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 188, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL liga a um epítopoconformacional não-linear.
191. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 188, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é multivalente, ecompreende pelo menos duas cadeias pesadas e pelo menos duas cadeiasleves.
192. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 191, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é multiespecífico.
193. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 192, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é biespecífico.
194. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 193, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL compreende domí-nios variáveis de cadeia pesada e leve que são completamente humanos.
195. Composição da reivindicação 194, em que os ditos domí-nios variáveis de cadeia pesada e leve são idênticos àqueles de um frag-mento de anticorpo de Fab monoclonal selecionado do grupo que consisteem M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, e M12-G04.
196. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 193, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL compreende domí-nios variáveis de cadeia pesada e leve que são murinos.
197. Composição da reivindicação 196, em que os ditos domí-nios variáveis de cadeia pesada e leve são idênticos àqueles de um anticor-po monoclonal produzido por um hibridoma selecionado do grupo que con-siste em P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, eP1G10.2B8.
198. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 193 e 196 a 197, em que um anticorpo ou fragmento do mesmocodificado pelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é humani-zado.
199. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 193 e 196 a 197, em que um anticorpo ou fragmento do mesmocodificado pelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é quiméri-co.
200. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 193 e 196 a 197, em que um anticorpo ou fragmento do mesmocodificado pelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é primati-zado.
201. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 195, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é completamentehumano.
202. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 201, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é um fragmento deFab.
203. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 201, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é um fragmento deFab1.
204. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 201, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é um fragmento deF(ab)2.
205. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 201, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é um fragmento deFv.
206. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 201, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é um anticorpo decadeia simples.
207. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 206, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos polinucleotídeos de codificação de VH e VL que especificamente liga aum polipeptídeo de IGF-R1 ou fragmento do mesmo, ou uma variante depolipeptídeo de IGF-R1, com uma afinidade caracterizada por uma constantede dissociação (KD) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ-10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ-10"8 Μ, W8 Μ, 5 χ 10'9 Μ, W9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ 10"1\ 10"11 Μ, 5 χ-10"12 Μ, ΙΟ-12 Μ, 5 χ 1013 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"-15 Μ.
208. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 207, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL preferencialmenteliga a um polipeptídeo de IGF-R1 humano ou fragmento do mesmo, com re-lação a um polipeptídeo de IGF-R1 murino ou fragmento do mesmo ou umpolipeptídeo de IGF-R1 primata não-humano ou fragmento do mesmo.
209. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 207, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL liga a um polipeptí-deo de IGF-R1 humano ou fragmento do mesmo, e também liga a um poli-peptídeo de IGF-R1 primata não-humano ou fragmento do mesmo.
210. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 209, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL liga a IGF-R1 ex-pressado na superfície de uma célula.
211. Composição da reivindicação 210, em que a dita célula éuma célula maligna, uma célula neoplástica, uma célula tumoral, ou umacélula metastática.
212. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 211, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL bloqueia o fator decrescimento de insulina de ligar a IGF-R1.
213. Composição da reivindicação 212, em que o dito fator decrescimento de insulina é fator-1 de crescimento de insulina (IGF-1).
214. Composição da reivindicação 212, em que o dito fator decrescimento de insulina é fator-2 de crescimento de insulina (IGF-2).
215. Composição da reivindicação 212 que bloqueia tanto IGF-1e IGF-2 de ligar a IGF-R1.
216. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 215, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL inibe proliferaçãocelular mediada por IGF-R1.
217. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 216, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL inibe fosforilação deIGF-R1 mediada por IGF-1 ou IGF-2.
218. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 217, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL inibe crescimento decélula tumoral.
219. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 218, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL inibe internalizaçãode IGF-R1.
220. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 219, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VH, o ditopolinucleotídeo de codificação de VL, ou os ditos polinucleotídeos de codifi-cação de VH e VL também compreendem um ácido nucléico que codifica umpolipeptídeo heterólogo.
221. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 220, em que um anticorpo ou fragmento do mesmo codificadopelos ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL é conjugado com umagente selecionado do grupo que consiste em agente citotóxico, um agenteterapêutico, agente citoestático, uma toxina biológica, um pró-fármaco, umpeptídeo, uma proteína, uma enzima, um vírus, um lipídio, um modificadorde resposta biológica, agente farmacêutico, uma linfocina, um anticorpo he-terólogo ou fragmento do mesmo, uma marcação detectável, polietileno gli-col (PEG), e uma combinação de dois ou mais de qualquer um dos ditos a-gentes.
222. Composição da reivindicação 221, em que o dito agentecitotóxico é selecionado do grupo que consiste em um radionuclídeo, umabiotoxina, uma toxina enzimaticamente ativa, um agente terapêutico citoestá-tico ou citotóxico, uns pró-fármacos, um Iigante imunologicamente ativo, ummodificador de resposta biológica, ou uma combinação de dois ou mais dequalquer dos ditos agentes citotóxicos.
223. Composição da reivindicação 221, em que o dito rótulo de-tectável é selecionado do grupo que consiste em uma enzima, rótulo fluores-cente, rótulo quimioluminescente, rótulo bioluminescente, rótulo radioativo,ou uma combinação de dois ou mais de quaisquer dos ditos rótulos detectá-veis.
224. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 223, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VH é conti-do em um primeiro vetor e o dito polinucleotídeo de codificação de VL é con-tido em um segundo vetor.
225. Composição da reivindicação 224, em que o dito polinu-cleotídeo de codificação de VH está operavelmente associado a um primeiropromotor e o dito polinucleotídeo de codificação de VL está operavelmenteassociado a um segundo promotor.
226. Composição da reivindicação 225, em que os ditos primeiroe segundo promotores são cópias do mesmo promotor.
227. Composição da reivindicação 225, em que os ditos primeiroe segundo promotores são não-idênticos.
228. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 224 a 227, em que o dito primeiro vetor e o dito segundo vetor são con-tidos em uma célula hospedeira simples.
229. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 224 a 227, em que o dito primeiro vetor e o dito segundo vetor são con-tidos em umas células hospedeiras separadas.
230. Método de produzir um anticorpo ou fragmento do mesmoque especificamente liga IGF-1R, compreendendo cultivar a célula hospedei-ra da reivindicação 228, e restabelecer o dito anticorpo, ou fragmento domesmo.
231. Método de produzir um anticorpo ou fragmento do mesmoque especificamente liga IGF-1R, compreendendo co-cultivar as célulashospedeiras separadas da reivindicação 229, e restabelecer o dito anticorpo,ou fragmento do mesmo.
232. Método de produzir um anticorpo ou fragmento do mesmoque especificamente liga IGF-1R, compreendendo cultivar as células hospe-deiras separadas da reivindicação 229, combinar os ditos polipeptídeos decodificação de VH e VL, e restabelecer o dito anticorpo separadamente, oufragmento do mesmo.
233. Anticorpo ou fragmento do mesmo que especificamente ligaIGF-1R, produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivin-dicações 230 a 232.
234. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 171 a 223, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VH e o ditopolinucleotídeo de codificação de VL estão no mesmo vetor.
235. Vetor da reivindicação 234.
236. Vetor da reivindicação 235, em que o dito polinucleotídeode codificação de VH e o dito polinucleotídeo de codificação de VL são cadaoperavelmente associados a um promotor.
237. Vetor da reivindicação 235, em que o dito polinucleotídeode codificação de VH e o dito polinucleotídeo de codificação de VL são fun-didos na estrutura, são co-transcritos de um promotor simples operavelmen-te associado a eles, e são co-transladados em um anticorpo de cadeia sim-ples ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
238. Vetor da reivindicação 235, em que o dito polinucleotídeode codificação de VH e o dito polinucleotídeo de codificação de VL são co-transcritos de um promotor simples operavelmente associados a eles, massão transladados separadamente.
239. Vetor da reivindicação 238, também compreendendo umaseqüência de IRES disposta entre o dito polinucleotídeo de codificação deVH e o dito polinucleotídeo de codificação de VL.
240. Vetor da reivindicação 235, em que o dito polinucleotídeoque codifica um VH e o dito polinucleotídeo que codifica uma VL são trans-critos separadamente, cada um estando operavelmente associado a umpromotor separado.
241. Vetor da reivindicação 240, em que os ditos promotoresseparados são cópias do mesmo promotor.
242. Vetor da reivindicação 240, em que os ditos promotoresseparados são não-idênticos.
243. Célula hospedeira compreendendo o vetor como definidoem qualquer uma das reivindicações 235 a 242.
244. Método de produzir um anticorpo ou fragmento do mesmoque especificamente liga IGF-1R, compreendendo cultivar a célula hospedei-ra como definida na reivindicação 243, e restabelecer o dito anticorpo, oufragmento do mesmo.
245. Anticorpo ou fragmento do mesmo que especificamente ligaIGF-1R, produzido pelo método como definido na reivindicação 244.
246. Método para tratar um distúrbio hiperproliferativo em umanimal, compreendendo administrar a um animal em necessidade de trata-mento uma composição que compreende:a) o anticorpo isolado ou fragmento do mesmo como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 82, 170, 233 e 245; eb) um veículo farmaceuticamente aceitável.
247. Método de acordo com a reivindicação 246, em que a ditadoença ou distúrbio hiperproliferativo é selecionado do grupo que consisteem câncer, um neoplasma, um tumor, uma malignidade, ou uma metástasedos mesmos.
248. Método de acordo com a reivindicação 247, em que o ditoanticorpo ou fragmento do mesmo especificamente liga a IGF-1R expressa-do na superfície de uma célula maligna.
249. Método de acordo com a reivindicação 248, em que ligaçãodo dito anticorpo ou fragmento do mesmo à dita célula maligna resulta eminibição de crescimento da dita célula maligna.
250. Método de qualquer uma das reivindicações 246 a 249, emque o dito anticorpo ou fragmento do mesmo inibe IGF de ligar à dita célulamaligna.
251. Método de acordo com a reivindicação 250, em que o ditoIGF é IGF-1.
252. Método de acordo com a reivindicação 250, em que o ditoIGF é IGF-2.
253. Método de acordo com a reivindicação 250, em que o ditoIGF é IGF-1 e IGF-2.
254. Método de acordo com a reivindicação 253, em que o ditoanticorpo ou fragmento do mesmo inibe IGF-1 de ligar à dita célula malignamas não inibe IGF-2.
255. Método de acordo com a reivindicação 253, em que o ditoanticorpo ou fragmento do mesmo inibe IGF-2 de ligar à dita célula malignamas não inibe IGF-1.
256. Método de qualquer uma das reivindicações 246 a 249, emque o dito anticorpo ou fragmento do mesmo promove internalização de IGF--1R na dita célula maligna.
257. Método de qualquer uma das reivindicações 246 a 249, emque o dito anticorpo ou fragmento do mesmo inibe fosforilação de IGF-1 R.
258. Método de qualquer uma das reivindicações 246 a 249, emque o dito anticorpo ou fragmento do mesmo inibe proliferação de célula tu-moral.
259. Método de acordo com a reivindicação 258, em que prolife-ração de célula tumoral é inibida através da prevenção ou retardamento decrescimento metastático.
260. Método de qualquer uma das reivindicações 246 a 249, emque o dito anticorpo ou fragmento do mesmo inibe migração de célula tumo-ral.
261. Método de acordo com a reivindicação 258, em que prolife-ração de célula tumoral é inibida através da prevenção ou retardamento depropagação de tumor para tecidos adjacentes.
262. Método de acordo com a reivindicação 247, em que a ditadoença ou distúrbio hiperproliferativo é um neoplasma localizado na: prósta-ta, cólon, abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peri-tôneo, glândula ad-renal, glândula paratiróide, glândula pituitária, testículos,ovário, timo, tiróide, olho, cabeça, pescoço, sistema nervoso central, sistemanervoso periférico, sistema linfático, pélvis, pele, tecido macio, baço, regiãotorácica, ou trato urogenital.
263. Método de acordo com a reivindicação 247, em que a ditadoença hiperproliferativa é câncer, o dito câncer selecionado do grupo queconsiste em: câncer de célula escamosa epitelial, melanoma, leucemia, mie-loma, câncer de estômago, câncer de cérebro, câncer de pulmão, câncerpancreático, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer debexiga, câncer de mama, câncer de cólon, câncer renal, câncer de próstata,câncer testicular, câncer de tiróide, e câncer de cabeça e pescoço.
264. Método de acordo com a reivindicação 263, em que o ditocâncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de estômago, câncerrenal, câncer de cérebro, câncer de bexiga, câncer de cólon, câncer de pul-mão, câncer de mama, câncer pancreático, câncer ovariano, e câncer depróstata.
265. Método de qualquer uma das reivindicações 246 a 264, emque o dito animal é um mamífero.
266. Método de acordo com a reivindicação 265, em que o ditomamífero é um ser humano.
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Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080152649A1 (en) * 2002-03-01 2008-06-26 Xencor, Inc. Optimized igf-1r antibodies and methods of using the same
ES2397441T5 (es) 2006-02-13 2022-09-14 Daiichi Sankyo Co Ltd Secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas implicadas en el proceso de remodelación ósea
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
EP1999149A4 (en) * 2006-03-28 2010-01-20 Biogen Idec Inc ANTI-IGF-1R ANTIBODIES AND USES THEREOF
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
CL2007002502A1 (es) * 2006-08-31 2008-05-30 Hoffmann La Roche Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer.
GB0702888D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Glaxo Group Ltd Novel Antibodies
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
AU2008282331A1 (en) * 2007-07-27 2009-02-05 Facet Biotech Corporation Pharmaceutical combinations comprising a tyrosine kinase inhibitor and an antibody against integrin alpha 1 beta 5 (CD49E)
WO2009032145A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-igf-1r antibodies and uses thereof
AU2008296386A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of IGF-1R
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
AU2008307579A1 (en) * 2007-10-03 2009-04-09 Osi Pharmaceuticals, Inc. Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
AU2008307634A1 (en) * 2007-10-03 2009-04-09 Osi Pharmaceuticals, Inc. Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
MX2010007101A (es) * 2007-12-26 2011-07-01 Biotest Ag Metodos y agentes para mejorar el reconocimiento de celulas de tumor que expresan cd138.
JP5817034B2 (ja) * 2007-12-26 2015-11-18 バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト Ｃｄ１３８を標的とする免疫複合体及びその使用
US20110195911A1 (en) * 2008-03-28 2011-08-11 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health & Human Services Synthetic analogs of the juxtamembrane domain of igf1r and uses thereof
TWI564021B (zh) 2008-04-11 2017-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Repeated binding of antigen to antigen binding molecules
CN102065895A (zh) * 2008-04-11 2011-05-18 比奥根艾迪克Ma公司 抗-igf-1r抗体和其它化合物的治疗联合
US9029508B2 (en) 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
PE20100092A1 (es) 2008-06-03 2010-03-12 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
SG2014010573A (en) * 2008-11-12 2014-04-28 Merck Sharp & Dohme ßGI-IGG INTRON FOR ENHANCED ANTI-IGF1 R EXPRESSION
HUE026374T2 (en) 2008-12-12 2016-05-30 Boehringer Ingelheim Int Anti-IGF antibody
EP2381774A4 (en) * 2008-12-23 2012-07-18 Salk Inst For Biological Studi METHOD OF TREATING NEURODEGENERATIVE DISEASE
EP2400990A2 (en) * 2009-02-26 2012-01-04 OSI Pharmaceuticals, LLC In situ methods for monitoring the emt status of tumor cells in vivo
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US8926976B2 (en) * 2009-09-25 2015-01-06 Xoma Technology Ltd. Modulators
PL2493922T3 (pl) 2009-10-26 2017-07-31 F.Hoffmann-La Roche Ag Sposób wytwarzania glikozylowanych immunoglobulin
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
WO2011090492A1 (en) * 2010-01-19 2011-07-28 Immunomedics, Inc. Novel class of monospecific and bispecific humanized antibodies that target the insulin-like growth factor type i receptor (igf-1r)
CA2783665A1 (en) * 2010-03-03 2011-09-09 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
WO2011161119A1 (en) * 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
MY160445A (en) 2010-08-03 2017-03-15 Abbvie Inc Dual Variable Domain Immunoglobulins And Uses Thereof
DE102010035003B4 (de) * 2010-08-20 2015-08-06 PicoQuant GmbH. Unternehmen für optoelektronische Forschung und Entwicklung Räumlich und zeitlich hochauflösende Mikroskopie
MX365235B (es) 2010-11-30 2019-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de unión a antígeno capaz de unir repetidamente a la pluralidad de moléculas de antígeno.
WO2012106556A2 (en) 2011-02-02 2012-08-09 Amgen Inc. Methods and compositons relating to inhibition of igf-1r
WO2012149014A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 OSI Pharmaceuticals, LLC Use of emt gene signatures in cancer drug discovery, diagnostics, and treatment
US9700619B2 (en) 2011-11-11 2017-07-11 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
MX358680B (es) 2011-12-08 2018-08-31 Biotest Ag Usos de inmunoconjugados dirigidos a cd138.
US9249224B2 (en) * 2011-12-22 2016-02-02 Rinat Neuroscience Corp. Human growth hormone receptor antagonist antibodies and methods of use thereof
CA2875543A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind igf1r
JP6268173B2 (ja) * 2012-07-19 2018-01-24 第一三共株式会社 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
EP3597747B1 (en) 2012-08-24 2023-03-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse fcgammarii-specific fc antibody
MX371442B (es) 2012-08-24 2020-01-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd VARIANTE DE LA REGION FC ESPECIFICA PARA FCyRIIB.
WO2014107165A1 (en) * 2013-01-05 2014-07-10 R-PHARM, CJSC (Closed Joint Stock Company) Fully human antibodies against human receptor igf-1r
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
EP3783017A1 (en) 2013-04-02 2021-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
KR101895634B1 (ko) 2013-05-31 2018-09-05 한미약품 주식회사 변이된 힌지 영역을 포함하는 IgG4 Fc 단편
ES2841249T3 (es) * 2014-04-25 2021-07-07 Pf Medicament Anticuerpo IGF-1R y su utilización como un vehículo de direccionamiento para el tratamiento del cáncer
CA2963760A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Yoshinao Ruike Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
EA201791754A1 (ru) 2015-02-05 2019-01-31 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся АНТИТЕЛА, СОДЕРЖАЩИЕ ЗАВИСЯЩИЙ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН, ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ, IL-8-СВЯЗЫВАЮЩИЕ АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
TWI716400B (zh) * 2015-04-27 2021-01-21 法商皮爾法伯製藥公司 新穎的igf-1r抗體及其用於癌症診斷之用途（二）
TWI740824B (zh) * 2015-04-27 2021-10-01 法商皮爾法伯製藥公司 新穎的ｉｇｆ－１ｒ抗體及其用於癌症診斷之用途（一）
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
CA3026050A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for prophylaxis or treatment of il-8 related diseases
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
WO2019060601A1 (en) * 2017-09-21 2019-03-28 University Of Miami METHOD OF TREATING MYELOID LEUKEMIA
EP3765494A4 (en) 2018-03-15 2022-03-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-DENGUE VIRUS ANTIBODIES WITH CROSS-REACTIVITY AGAINST ZIKA VIRUS AND METHODS OF USE
JP2022511471A (ja) * 2018-12-03 2022-01-31 フュージョン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 放射性免疫複合体とｄｎａの損傷および修復阻害剤の併用療法
CN114874333A (zh) * 2021-10-18 2022-08-09 深圳科兴药业有限公司 一种生长激素融合蛋白及其应用
CN117347626B (zh) * 2023-12-06 2024-03-12 安徽惠邦生物工程有限公司 人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5587458A (en) * 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
DE669986T1 (de) * 1992-11-13 1996-10-10 Idec Pharma Corp Völlig unfunktionelle konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung.
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US6262238B1 (en) 1997-01-14 2001-07-17 Roche Diagnostic, Gmbh Process for modifying the stability of antibodies
EP1918303A3 (en) 1999-04-09 2008-05-14 Universität Zürich method for the stabilization of chimeric immunoglobulins or immunoglobulin fragments, and stabilized anti-egp-2 scfv fragment
EP1299419A2 (en) 2000-05-24 2003-04-09 Imclone Systems, Inc. Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
AU2001297872B2 (en) * 2000-11-17 2006-11-09 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
OA12589A (en) * 2001-01-05 2006-06-08 Abgenix Inc Antibodies to insulin-like growth factor i receptor.
US7553485B2 (en) * 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
KR101086533B1 (ko) * 2002-05-24 2011-11-23 쉐링 코포레이션 중화 사람 항-ｉｇｆｒ 항체, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 조성물
US8034904B2 (en) * 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
BRPI0408317A (pt) * 2003-03-14 2006-03-07 Pharmacia Corp anticorpos do receptor de igf-i para o tratamento de cáncer
WO2004087756A2 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
JP2007535895A (ja) * 2003-05-01 2007-12-13 イムクローン システムズ インコーポレイティド ヒトインシュリン様成長因子−１受容体に対する完全ヒト抗体
AR046071A1 (es) * 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
WO2005058967A2 (en) * 2003-12-16 2005-06-30 Pierre Fabre Medicament Novel anti-insulin/igf-i hybrid receptor or anti-insulin/igf-i hybrid receptor and igf-ir antibodies and uses thereof
US7569362B2 (en) 2004-03-15 2009-08-04 Biogen Idec Ma Inc. Methods and constructs for expressing polypeptide multimers in eukaryotic cells using alternative splicing
DK1755660T3 (da) * 2004-05-07 2010-07-19 Univ North Carolina Fremgangsmåde til forbedring eller hæmning af insulin-lignende vækstfaktor-I
AU2005272848A1 (en) * 2004-08-12 2006-02-23 Dyax Corp. Tie complex binding proteins
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
WO2006074399A2 (en) 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Multispecific binding molecules comprising connecting peptides
US7786273B2 (en) 2005-03-14 2010-08-31 Medimmune, Llc Macromolecules comprising a thioether cross-link
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
EP1999149A4 (en) 2006-03-28 2010-01-20 Biogen Idec Inc ANTI-IGF-1R ANTIBODIES AND USES THEREOF
AU2008296386A1 (en) 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of IGF-1R
WO2009032145A1 (en) 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-igf-1r antibodies and uses thereof
CN102065895A (zh) 2008-04-11 2011-05-18 比奥根艾迪克Ma公司 抗-igf-1r抗体和其它化合物的治疗联合

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