KR20160099087A - 이중특이성 her2 항체 및 사용 방법 - Google Patents

이중특이성 her2 항체 및 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20160099087A
KR20160099087A KR1020167016099A KR20167016099A KR20160099087A KR 20160099087 A KR20160099087 A KR 20160099087A KR 1020167016099 A KR1020167016099 A KR 1020167016099A KR 20167016099 A KR20167016099 A KR 20167016099A KR 20160099087 A KR20160099087 A KR 20160099087A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
antibody
heavy chain
her2
light chain
Prior art date
Application number
KR1020167016099A
Other languages
English (en)
Inventor
레베카 크로스데일
리디아 야스민 뒤르너
구이 게오르게스
토마스 호퍼
랄프 호세
크리스티안 클라인
에케하르트 뫼스너
사무엘 모서
볼프강 섀퍼
위르겐 미하엘 샨처
베르너 쇼이어
클라우디오 저스트만
파블로 우마나
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
Publication of KR20160099087A publication Critical patent/KR20160099087A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 이중특이성 HER2 도메인 II 및 도메인 IV 항체, 신규한 HER2 항체 변이체, 이들의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

이중특이성 HER2 항체 및 사용 방법{BISPECIFIC HER2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 이중특이성 HER2 항체, 신규한 HER2 변이체, 이의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.
종양-연관된 항원에 특이적인 항체는, 이들이 종양 세포의 선택적 파괴를 매개하면서도 건강한 세포 및 조직은 손상되지 않도록 놓아두기 때문에 암 치료법에서 가치있는 접근법이다.
수용체 티로신 키나아제의 ErbB 계열의 구성원은 세포 성장, 분화 및 생존의 중요한 매개자이다. 이러한 수용체 계열은 상피 성장 인자 수용체(EGFR 또는 ErbB1), HER2(ErbB2 또는 pl85"e"), HER3(ErbB3) 및 HER4(ErbB4 또는 tyro2)를 비롯한 4종의 별개의 구성원을 포함한다. HER2는 막간 표면-결합된 수용체 티로신 키나아제이고, 정상적으로 신호 전달 경로에 관여하여 세포 성장 및 분화를 유도한다. HER2는 유방암 환자의 약 1/4에서 과발현되는 것으로 밝혀졌으므로, 이는 유방암의 치료를 위한 유망한 표적이다[반게(Bange) 등의 문헌 "2001, Nature Medicine 7:548"].
뮤린 단일클론성 항체 4D5는 HER2 과발현 암세포에서 HER2를 특이적으로 표적화하지만, HER2를 생리학적 수준으로 발현하는 세포에는 영향을 주지 않는다. 인간화된 (4D5) 단일클론성 항체(hu4D5)는 약물 헤르셉틴(Herceptin: 등록상표)[트라스투추맙(trastuzumab), rhuMAb HER2, 미국 특허 제5,821,337호]으로서 상업적으로 공지되어 있고, 이는 1998년 후반에 FDA 판매 승인을 받았다.
헤르셉틴은 HER2-양성 유방암의 치료를 위해 개발된 최초의 단일클론성 항체였고, 환자의 생존 시간을 증가시켰고, 따라서 이들은 현재 HER2-음성 유방암을 앓는 환자의 경우와 동일하다. 헤르셉틴 치료 이전에, HER2-양성 유방암을 진단받은 환자의 경우 HER2-음성 질환을 진단받은 환자와 비교하여 더 짧은 생존 결과가 예측되었다. 클레오파트라(CLEOPATRA) 연구에서, 헤르셉틴 및 화학요법과 조합된 페르제타(PERJETA)는 이러한 공격성 질환을 앓는 환자에 대해 헤르셉틴에 비해 더욱 생존 시간을 연장시킴을 보여주었다.
페르투추맙(pertuzumab)[페르제타(상표명), rhuMab 2C4, 미국 특허 제7,862,817호]은 인간화된 단일클론성 항체이고, 이는 종양 성장 및 생존에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 믿겨지는 과정인, HER2 수용체가 다른 HER 수용체(EGFR/HER1, HER3 및 HER4)와 세포 표면 상에서 쌍을 이루는 것(이량체화)을 방지하도록 특이적으로 고안된다. 페르제타, 헤르셉틴 및 화학요법의 조합은 HER 신호발송 경로의 더욱 종합적인 봉쇄를 제공하는 것으로 고려된다. 페르제타는 HER2-양성 전이성 또는 국부 재발성 절제불가능 유방암을 앓는 성인 환자에서 헤르셉틴(트라스투추맙) 및 도세탁셀(docetaxel)과 함께 승인되고, 2013년 9월에 신보조 유방암 치료에 대해 FDA 승인을 얻었다. 페르투추맙은 이량체화에 필수적인 HER2의 도메인 II에 결합하는 반면, 트라스투추맙은 HER2의 세포외 도메인 IV에 결합한다.
리(Li) 등(Cancer Research. 2013)은 트라스투추맙 내성을 극복하는 ErbB2에 대한 이중특이성, 2가 항체를 기재한다. 본원에 기재된 이중특이성, 2가 항체는 고유의 트라스투추맙 및 페르투추맙 서열에 기초한다.
놀랍게도 본원의 발명자들은 고유의 트라스투추맙 및 페르투추맙 서열을 최적화하고 이들 최적화된 변이체를 2가지 상이한 개선된 이중특이성, 1가 항체 형식으로 조합한 결과 단일특이성 항체 rhuMab 2C4 및 hu 4D5의 조합과 비교하여 개선된 특성을 유도함을 발견하였다. 추가로 항체는 리(Li) 등의 문헌에 개시된 2가 항체 형식에 비해 탁월한데, 이들이 1가이고 2개의 단일특이성 항체 페르투추맙 및 트라스투추맙과 동일한 분자량을 갖기 때문이다. 그러므로 신규한 이중특이성 형식은 당분야에 공지된 이중특이성 HER2 항체의 탁월한 특징을 고전적 단일특이성 항체의 이점과 조합한다. 본 발명의 신규한 이중특이성 HER2 항체는 2개의 상이한 HER2 에피토프에 대해 1가여서, 2가 모 항체와 동일한 결합활성 효과를 생성한다. 대조적으로, 4가 항체는 세포 상에서 HER2에 대한 이들의 결합활성이 상이할 수 있다. 신규한 이중특이성 HER2 항체의 결합활성 효과는, 예컨대 HER2의 저해 및/또는 ADCC가 요구되지 않는 경우인 정상 조직 또는 심장 조직에서 HER2 발현이 낮은 세포 유형 상에 탁월한 안전 창을 생성할 수 있다.
더욱이, 본원에 기재된 이중특이성 항체는, 모 150KD IgG1 항체의 확산 상수와 부합하는 이들의 천연 IgG 구조에 기인하여 2가 모 항체와 동일한 확산 상수를 갖는다. 더욱이 천연 IgG 구조에 기인하여, 면역원성에 대한 위험 및 항-약물 항체의 형성이 감소될 것으로 예상될 수 있다. 마지막이지만 역시 중요하게도, 4가 이중특이성 항체와 비교하여, 쉐드(shed) HER2 세포외 도메인을 갖는 면역 착체의 형성에 대한 위험은 1가임으로 인해 감소되고 모 항체에 필적할만하다. 면역 착체는 항원 제시 세포에 의해 취해진 착체의 증진된 면역원성을 초래할 수 있고, 궁극적으로 면역 착체가 신장에서 침적된다면 신장 독성을 유도할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, IgG 분자의 Fab 단편중 하나가 교차 Fab 단편에 의해 대체된 1가의 이중특이성 항체가 제공된다. 교차 Fab 단편은 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역 또는 불변성 영역중 하나가 교환된 Fab 단편이다. 교차 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체 형식은, 예를 들면, 국제 특허출원 공개공보 제 WO2009/080252호, 제WO2009/080253호, 제WO2009/080251호, 제WO2009/080254호, 제WO2010/136172호, 제WO2010/145792호 및 제WO2013/026831호에 기재되어 있다. 고유의 트라스투추맙 서열은 자발적 화학 변형에 대한 항체 CDR의 안정성을 개선시키기 위해 이들의 CDR에서 최적화되고, 생성된 서열은 골격구조-그라프팅되어 짝짓기 오류를 방지하고, 이중특이성 항체가 당조작되어, FcgRIII 결합이 증진되면서 HER2에 특이적으로 결합하는 매우 강력한 이중특이성 항체를 생성함으로써 NK 세포 또는 단핵세포/대식세포와 같은 면역 효과기 세포의 보충을 증진시키고; 최종적으로 이들은 종래의 모 Her2 항체와 비교하여 높은 수율 및 부산물의 낮은 백분율로 생산될 수 있다. HER2 이중특이성 크로스맙(CrossMab) 항체 쇄의 경우, 페르투추맙 및 트라스투추맙 둘 다가 필적할만한 골격구조 영역에 기초한다는 사실로부터 초래된 경쇄의 짝짓기 오류는 완전히 신규한 항체 골격구조 상으로 CDR을 그라프팅함으로써 극복되었다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 2개의 결합 부위가 모 트라스투추맙 및 페르투추맙 경쇄의 컨센서스에 기초하여 동일한 경쇄를 포함하고 상응하는 페르투추맙 중쇄가 개조된, HER2의 세포외 도메인 IV 및 II에 특이적으로 결합하는 1가의 이중특이성 항체가 제공된다. 이러한 소위 '공통의 경쇄' 원칙의 사용, 즉 하나의 경쇄를 공유하지만 여전히 별도의 특이성을 갖는 2개의 결합기를 조합함은, 경쇄 짝짓기 오류를 방지하고, 이러한 특정한 경우에 모 항체의 에피토프 특이성을 보유한다. 결과로서, 생산 동안 부산물이 더 적어서, 높은 수율로 HER2 이중특이성 항원 결합 분자를 균일하게 제조함을 용이하게 한다. 놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 1가의 공통 경쇄 형식의 이중특이성 HER2 항체가 모 항체의 조합에 비하여 페르투추맙 에피토프에 대한 증가된 친화도를 갖고, 세포 증식에 대한 탁월한 저해 효과 및 세포 의존성 세포독성(CDC: cell dependent cytotoxicity)의 유도를 나타냄을 발견하였다. 보체 의존성 세포독성(CDC: Complement dependent cytotoxicity)은 최적의 치료학적 단일클론성 항체(mAb) 기능에 매우 중요하고, 화학요법 치료 이후 조차도 완전히 보존된다. 그러나, 이러한 활성은 이들중 모두가 아닌 몇몇 항체에 의해 생성된다.
요약
본 발명은 HER2의 세포외 도메인 II에 대해 특이적인 제1 항원 결합 부위 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 대해 특이적인 제2 항원 결합 부위를 포함하는 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체에 관한 것으로, 여기서 이중특이성 항체는 HER2의 세포외 도메인 II 및 IV 둘 다에 대해 1가이다. 하나의 실시태양에서 이중특이성 항체는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 페르투추맙 또는 트라스투추맙의 조합물에 비해 더욱 높은 정도로 유도한다. 하나의 이러한 실시태양에서, 이중특이성 항체의 보체 의존성 세포독성은 LDH 검정 또는 보체 검정에 의해 결정되고, 동일한 검정에 의해 결정된 페르투추맙 및 트라스투추맙의 조합물의 보체 의존성 세포독성과 비교된다. 하나의 실시태양에서 보체 의존성 세포독성은 시험관내에서 암 세포 상에서, 바람직하게는 유방암 세포 상에서 결정된다. 하나의 양태에서 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는, HER2의 세포외 도메인 II에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 분자 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 분자를 포함하고, 여기서 제1 Fab 분자의 가변성 경쇄의 서열은 제2 Fab 분자의 가변성 경쇄의 서열과 동일하다. 하나의 양태에서 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 (a) 서열 번호 55, 서열 번호 58 및 서열 번호 14로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR1, 서열 번호 77, 서열 번호 15 및 서열 번호 60으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 56 또는 서열 번호 59 및 서열 번호 16으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3을 포함하는 제1 중쇄; (b) 서열 번호 20의 중쇄 CDR1, 서열 번호 29의 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 30 및 서열 번호 79로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3을 포함하는 제2 중쇄; 및 (c) 제1 및 제2 경쇄를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 경쇄의 가변성 경쇄는 서열 번호 89, 서열 번호 90 및 서열 번호 19의 CDR을 포함한다. 하나의 양태에서 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 가변성 경쇄, 서열 번호 64, 서열 번호 70 및 서열 번호 68로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제1 중쇄, 및 서열 번호 92 및 서열 번호 117로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제2 중쇄를 포함한다. 하나의 양태에서 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 HER2의 세포외 도메인 II에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 분자 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 분자를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역 또는 불변성 영역은 교환된다. 하나의 양태에서 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 서열 번호 14의 중쇄 CDR1, 서열 번호 15의 중쇄 CDR2 및 서열 번호 16의 중쇄 CDR3; 및 서열 번호 11의 경쇄 CDR1, 서열 번호 12의 경쇄 CDR2 및 서열 번호 13의 경쇄 CDR3을 포함하는 제1 Fab 분자, 및 서열 번호 20의 중쇄 CDR1, 서열 번호 108의 중쇄 CDR2 및 서열 번호 79의 중쇄 CDR3; 및 서열 번호 107의 경쇄 CDR1, 서열 번호 18의 경쇄 CDR2 및 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는 제2 Fab 분자를 포함한다. 하나의 양태에서 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 서열 번호 14의 중쇄 CDR1, 서열 번호 15의 중쇄 CDR2 및 서열 번호 16의 중쇄 CDR3; 및 서열 번호 11의 경쇄 CDR1, 서열 번호 12의 경쇄 CDR2 및 서열 번호 13의 경쇄 CDR3을 포함하는 제1 Fab 분자, 및 서열 번호 20의 중쇄 CDR1, 서열 번호 29의 중쇄 CDR2 및 서열 번호 79, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 87, 서열 번호 88로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3; 및 서열 번호 104, 서열 번호 103 및 서열 번호 158로 구성된 군에서 선택된 경쇄 CDR1, 서열 번호 18의 경쇄 CDR2 및 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는 제2 Fab 분자를 포함한다. 하나의 양태에서 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 경쇄를 포함하는 제1 Fab 분자를 포함하고, 여기서 제2 Fab 분자는 서열 번호 105의 아미노산 서열 및 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함한다.
두 번째 목적에서 본 발명은 본 발명의 이중특이성 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
세 번째 목적에서 본 발명은 암을 치료하기 위한 본 발명의 이중특이성 항체에 관한 것이다. 또 다른 실시태양에서, 약제로서의 이중특이성 항체의 용도가 제공된다. 바람직하게는 상기 용도는 암을 치료하기 위한 것이다.
추가의 목적에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 항체의 중쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 이중특이성 항체의 경쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 또한 항체가 생산되도록 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 제조 방법이 제공된다.
도 1: 2+2 IgG-scFv 형식의 트라스투추맙 및 페르투추맙 이중특이성 항체에 대한 개략도. 항체는 각각의 항원 결합 부위에 대해 2가이고 ErbB2/HER2 수용체에서 2개의 상이한 파라토프(paratope)에 결합할 수 있다(항원 1 = 트라스투추맙 특이성, 즉 HER2의 세포외 도메인 IV; 항원 2 = 페르투추맙 특이성, HER2의 세포외 도메인 II). (A): 단일 쇄 Fv(scFv)는 VH-VL 순서에서 중쇄에 C-말단으로 축합된다(TvAB12, 서열 번호 123 및 124). (B): 단일 쇄 Fv(scFv)는 VL-VH 순서에서 경쇄에 N-말단으로 축합된다(TvAB13, 서열 번호 125 및 126). (C) 단일 쇄 Fv(scFv)는 VL-VH 순서에서 경쇄에 C-말단으로 축합된다(TvAB16: 서열 번호 127 및 128, TvAB20: 서열 번호 131 및 132). (D): 단일 쇄 Fv(scFv)는 VL-VH 순서에서 중쇄에 C-말단으로 축합된다(TvAB17: 서열 번호 129 및 130).
도 2: 2+2 IgG-scFv 형식의 트라스투추맙 및 페르투추맙 이중특이성 항체의 정제. (A): 26/60 수퍼덱스(Superdex) 200 칼럼 상에서의 TvAb12(서열 번호 123 및 124)의 크기-배제 정제. (B): 크기-배제 크로마토그래피로부터 기원된 주요 피크 분별물의 SDS-파게(Page) 분석(NR = 비-환원, R = 환원 조건).
도 3: 2+2 IgG-scFv 형식의 트라스투추맙 및 페르투추맙 이중특이성 항체의 정제. (A): 26/60 수퍼덱스 200 칼럼 상에서의 TvAb16(서열 번호 127 및 128)의 크기-배제 정제. (B): 크기-배제 크로마토그래피로부터 기원된 주요 피크 분별물의 SDS-파게 분석(NR = 비-환원, R = 환원 조건).
도 4: 2+2 IgG-scFv 형식의 트라스투추맙 및 페르투추맙 이중특이성 항체의 정제. (A): 26/60 수퍼덱스 200 칼럼 상에서의 TvAb20(서열 번호 131 및 132)의 크기-배제 정제. 주요 생성물 피크는 "1"로 표시됨. (B) 크기-배제 크로마토그래피로부터 기원된 주요 피크 분별물의 SDS-파게 분석(NR = 비-환원, R = 환원 조건).
도 5: 샘플을 1, 2, 또는 3 개월 동안 40℃에서 완충액 40 mM 히스티딘, 150 mM NaCl(pH 5.0)에서 항온처리 한 후 SPR 방법[프로테온 인스트루멘트(ProteOn instrument)]에 의해 결정된 트라스투추맙 변이체의 해리 속도. 변이체의 해리 속도는 조사된 시간 기간에 걸쳐 변화되지 않는다. "602": 중쇄에서의 D98E 돌연변이 및 경쇄에서의 T31V 돌연변이.
도 6: 샘플을 1, 2, 또는 3 개월 동안 40℃에서 완충액 40 mM 히스티딘, 150 mM NaCl에서 상이한 pH에서 항온처리 한 후 SPR 방법(프로테온 인스트루멘트)에 의해 결정된 트라스투추맙 변이체의 해리 속도. N30S 변이체의 해리 속도는 매우 느렸고, 따라서 고도의 불확실성을 포함한다. "602": 중쇄에서의 D98E 돌연변이 및 경쇄에서의 T31V 돌연변이, "N30T": 중쇄에서의 D98E 돌연변이 및 경쇄에서의 N30S 돌연변이, "N30S": 중쇄에서의 D98E 돌연변이 및 경쇄에서의 N30S 돌연변이. (A): pH 5.0. (B): pH 6.0, (C): pH 7.4.
도 7: 스트레스 이후 트라스투추맙 및 트라스투추맙 안정화 변이체의 KPL-4 세포로의 결합. 트라스투추맙 및 3개의 상이한 안정화된 트라스투추맙 변이체는 1, 2 및 3 개월 동안 상이한 pH 값을 갖는 완충액에서 40℃에서 항온처리되었다. 스트레스 받은 항체는 유세포 분석기에 의해 KPL-4 세포로의 결합에 대해 0 시점에서의 항체와 비교 시험되었다. "602": 중쇄에서의 D98E 돌연변이 및 경쇄에서의 T31V 돌연변이, "N30T": 중쇄에서의 D98E 돌연변이 및 경쇄에서의 N30T 돌연변이, "N30S": 중쇄에서의 D98E 돌연변이 및 경쇄에서의 N30S 돌연변이.
도 8: 스트레스 이후 트라스투추맙 및 트라스투추맙 안정화 변이체의 KPL-4 세포로의 결합. 트라스투추맙 및 2개의 안정화 변이체 GA602(중쇄에서의 D98E 돌연변이 및 경쇄에서의 T31V 돌연변이) 및 GA603(중쇄에서의 D98E 돌연변이 및 경쇄에서의 T31V 돌연변이 및 FcRN 돌연변이 T307Q 및 N434A)은 1, 2 및 3 개월 동안 완충액 1(40 mM 히스티딘 150 mM NaCl, pH 5.0) 또는 완충액 2(2.40 mM 히스티딘 150 mM NaCl, pH 6.0) 중에서 40℃에서 항온처리되었다. 스트레스 받은 항체는 유세포 분석기에 의해 KPL-4 세포로의 결합에 대해 0 시점에서의 항체와 비교 시험되었다.
도 9: 스트레스 이후 KPL-4 세포 상에서의 트라스투추맙, GA602 및 GA603에 의한 ADCC 유도. 트라스투추맙 및 2개의 안정화 변이체 GA602(중쇄에서의 D98E 돌연변이 및 경쇄에서의 T31V 돌연변이) 및 GA603(중쇄에서의 D98E 돌연변이 및 경쇄에서의 T31V 돌연변이 및 FcRN 돌연변이 T307Q 및 N434A)은 1, 2 및 3 개월 동안 완충액 1(40 mM 히스티딘 150 mM NaCl, pH 5.0) 또는 완충액 2(2.40 mM 히스티딘 150 mM NaCl, pH 6.0) 중에서 40℃에서 항온처리되었다. 스트레스 받은 항체는 4 시간 후 KPL-4 세포 상에서 ADCC 유도에 대해 0 시점에서의 항체와 비교 시험되었다.
도 10: 1+1 형식의 트라스투추맙 및 페르투추맙 이중특이성 항체에 대한 개략도. (A): 단일 쇄 Fab(scFab) 기제 분자, (B): 교차 Fab(xFab) 기제 분자.
도 11: 크로스맙-XPer의 정제(서열 번호 109, 110, 96, 86). (A): 환원 및 비환원 조건하의 정제된 항체 분자를 보여주는 SDS-PAGE. (B): 정제된 크로스맙-XPer의 HP-SEC 분석.
도 12: 항체 분자의 무결성 및 순도를 추정하는 크로스맙-XTra(상부, 서열 번호 119, 120, 121, 122) 및 크로스맙-CDRG(하부, 서열 번호 109, 110, 111, 112)의 스펙트럼에 대한 Q-TOF 질량 분석법 비교.
도 13: 알라마블루(AlamarBlue: 등록상표) 검정에서 측정될 경우 항온처리 5일 이후의 당조작되지 않은 HER2 크로스맙(서열 번호 119, 120, 121, 122)에 의한 증식 저해. (A) BT474 세포, (B) N87 세포.
도 14: (A) KPL-4, (B) T47D 및 (C) Calu-3을 표적 세포로서 사용하는 상이한 HER2 특이적 항체에 의해 유도된 ADCC(E:T = 25:1, 효과기 인간 PBMC, 항온처리 시간 4 시간). "HER2 크로스맙 wt": 서열 번호 119, 120, 121, 122, 당조작되지 않음; "HER2 크로스맙 g2": 서열 번호 119, 120, 121, 122, 당조작됨.
도 15: Calu3 비-소 세포 폐암 이종이식에서의 상이한 항-Her2 항체의 항종양 활성(실험: BispecHer2_PZ_Calu3_001). Calu3 이종이식 종양을 갖는 SCID 베이지색 마우스는 7 주 동안 지시된 투여량으로 주 1회 복강내로 치료받았다. 인간 IgE를 표적화하는 졸레어(Xolair) 인간화된 IgG1 항체가 대조군으로서 사용되었다. 종점(85일)에서의 중간값에 기초한 통계적 분석 결과, 졸레어에 비하여 이중특이성 HER2 항체는 종양 성장을 87.5%(s.); OmniE(서열 번호 145, 146)는 43.7%(n.s.); 크로스맙_003(서열 번호 119, 120, 121, 122, 당조작되지 않음)은 92.1%(s.); TvAb12(서열 번호 123 및 124)는 59.8%(n.s.), TvAb20(서열 번호 131 및 132)은 12.6%(n.s.) 억제하였다. 종양 성장 곡선은 평균 +/- SEM으로 도시된다(각각의 그룹에서 n = 8).
도 16: KPL-4 유방암 이종이식에서의 상이한 항-Her2 항체의 항종양 활성(실험: Bispec.Her2_PZ_KPL-4_002). KPL-4 이종이식 종양을 갖는 SCID 베이지색 마우스는 5 주 동안 지시된 투여량으로 주 1회 복강내로 치료되었다. 인간 IgE를 표적화하는 졸레어 인간화된 IgG1 항체가 대조군으로서 사용되었다. 종점(59일)에서의 중간값에 기초한 통계적 분석 결과, 졸레어에 비하여 이중특이성 HER2 항체는 종양 성장을 120.8%(s.); 크로스맙_003(서열 번호 119, 120, 121, 122, 당조작되지 않음)은 120.6%(s.); TvAb12(서열 번호 123 및 124)는 70.1%(s.); TvAb20(서열 번호 131 및 132)은 83.4%(s.) 억제하였다. OmniE(서열 번호 145, 146)는 종양 성장에 유의적인 영향을 미치지 않았다. 종양 성장 곡선은 평균 +/- SEM으로 도시된다(각각의 그룹에서 n = 9).
도 17: KPL-4 유방암 이종이식에서 항-Her2_005 크로스맙 항체(서열 번호 119, 120, 121, 122, 당조작되지 않음)의 항종양 활성(실험: Bispec.Her2_PZ_KPL-4_003). KPL-4 이종이식 종양을 갖는 SCID 베이지색 마우스는 5 주 동안 1 내지 20 mg/kg 범위의 크로스맙의 증가되는 투여량으로 주 1회 복강내로 치료되었다. 인간 IgE를 표적화하는 졸레어 인간화된 IgG1 항체가 대조군으로서 사용되었다. 종점(70일)에서의 중간값에 기초한 통계적 분석 결과, 졸레어에 비하여 이중특이성 HER2 항체는 종양 성장을 121.8%(s.) 억제하였고; Her2 크로스맙_005는 종양 성장을 1 mg/kg의 투여량에서 25.1%(n.s.); 5 mg/kg의 투여량에서 112.3%(s.); 10 mg/kg의 투여량에서 109.5%(s.) 및 20 mg/kg의 투여량에서 121.8%(s.) 억제하였다. 종양 성장 곡선은 평균 +/- SEM으로 도시된다(각각의 그룹에서 n = 10).
도 18: KPL-4 유방암 이종이식에서의 상이한 항-Her2 항체의 항종양 활성(실험: Bispec.Her2_PZ_KPL-4_009). KPL-4 이종이식 종양을 갖는 SCID 베이지색 마우스는 4 주 동안 상이한 화합물로 주 1회 복강내로 치료되었다. 인간 IgE를 표적화하는 졸레어 인간화된 IgG1 항체가 대조군으로서 사용되었다. 종점(70일)에서의 중간값에 기초한 통계적 분석 결과, 졸레어에 비하여 이중특이성 HER2 항체(각각 5 mg/kg으로 투약됨)는 종양 성장을 83.2%(s.) 억제하였고, 각각 10 mg/kg의 투여량으로 제공된 경우 둘 다 109.5%(s.) 억제하였다. 2가지 상이한 투여량(5 mg/kg 및 10 mg/kg)으로 제공된 TvAb16(서열 번호 127 및 128)은 유의적인 항-종양 효과를 갖지 않았다. TvAb20(서열 번호 131 및 132)은 5 mg/kg의 투여량에서 종양 성장을 75.3%(s.), 10 mg/kg의 투여량에서 59.8%(n.s.) 억제하였다. 종양 성장 곡선은 평균 +/- SEM으로 도시된다(각각의 그룹에서 n = 10).
도 19: 초기 페르투추맙/트라스투추맙 하이브리드 경쇄의 SPR 분석. 트라스투추맙 LCDR3 영역의 아미노산 잔기를 함유하는 초기 페르투추맙 하이브리드 LC에 의한 페르투추맙, 트라스투추맙, 및 서열 조합물의 SPR-기초된 동력학적 분석. 평탄한 선은 데이터의 1:1 상호작용 모델로의 전체적 정합을 나타낸다. 페르투추맙Tras.L3: 서열 번호 26, 페르투추맙Tras.Y91H: 서열 번호 28.
도 20: 새롭게 식별된 경쇄 페르투추맙(Tras.L3)(QM), 서열 번호 54와 조합된 페르투추맙 및 트라스투추맙 HC의 SPR 분석. 상이한 농도에서의 두 항체의 Her2에 대한 결합이 제시된다. 평탄한 선은 데이터의 1:1 상호작용 모델로의 전체적 정합을 나타낸다.
도 21: 파아지 디스플레이(phage display)에 의해 식별된 친화도-성숙된 페르투추맙 클론의 특징화. 식별된 친화도-성숙된 클론의 SPR 분석. 상이한 농도에서의 세균성 Fab의 Her2에 대한 결합이 제시된다. 평탄한 선은 데이터의 1:1 상호작용 모델로의 전체적 정합을 나타낸다. B2: 서열 번호 66, D1: 서열 번호 62, E1: 서열 번호 68, C8: 서열 번호 72, G2: 서열 번호 70, A1: 서열 번호 74.
도 22: 공통의 경쇄를 갖는 이중특이성 HER2 항체에 대한 개략도.
도 23: 공통의 경쇄를 갖는 이중특이성 HER2 항체의 정제 및 분석적 특징화. 정제 방법은 크기 배제 크로마토그래피[수퍼덱스 200, 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)]가 수반되는 친화도 단계(단백질 A)를 포함하였다. 최종 생성물은 분석용 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 칼럼)에 의해 분석되고 특징화되었다. (A): D1유래(서열 번호 64) 포함, (B): G2(서열 번호 70) 포함, (C): E1(서열 번호 68) 포함.
도 24: Her2 넉-아웃(knock-out) 변이체의 SPR 분석. 넉-아웃 변이체 둘 다에 결합하는 트라스투추맙 및 페르투추맙의 센서그램(sensogram)이 제시된다. 평탄한 선은 데이터의 1:1 상호작용 모델로의 전체적 정합을 나타낸다.
도 25: 공통의 경쇄 클론 변이체를 갖는 이중특이성 HER2 항체의 KPL-4 세포에 대한 결합. 지시된 항체의 농도를 증가시키면서 KPL-4 세포가 염색되었다. 항체는 FITC 표지된 항-인간 2차 항체로 검출되고, 형광도는 유세포 분석기로 결정되었다. "헤르셉타르그(Herceptarg) CLC D1-유래": 서열 번호 64, 54, 92, "헤르셉타르그 CLC G2/2": 서열 번호 70, 54, 92, "헤르셉타르그 CLC E1/1": 서열 번호 68, 54, 92; "GA 604": 서열 번호 109, 110, 111, 112.
도 26: 공통의 경쇄 클론 변이체를 갖는 이중특이성 HER2 항체에 의한 BT474, N87, 및 SkBr3 세포의 증식 저해. BT474(A), N87(B), 및 SkBr3(C) 세포는 3개의 상이한 헤르셉타르그 변이체로 처리된다. 대조군으로서 트라스투추맙, 페르투추맙 및 이들 둘의 조합이 포함되었다. 5일 후, 증식 저해는 셀타이터 글로(CellTiter Glo)에 의해 결정되었다. "헤르셉타르그 CLC D1-유래": 서열 번호 64, 54, 92, "헤르셉타르그 CLC G2/2": 서열 번호 70, 54, 92, "헤르셉타르그 CLC E1/1": 서열 번호 68, 54, 92; "GA 604": 서열 번호 109, 110, 111, 112.
도 27: 공통의 경쇄 변이체를 갖는 이중특이성 HER2 항체에 의한 KPL-4 세포 및 MDA-MB 231의 사멸. (A) PBMC(E:T 25:1)에 의한 KPL-4 세포의 항체 의존성 사멸은 4 시간 이후 LDH 방출을 측정함으로써 결정되었다. (B) PBMC(E:T 5:1)에 의한 MDA-MB 231 세포의 항체 의존성 사멸은 24 시간 이후 LDH 방출을 측정함으로써 결정되었다. "헤르셉타르그 CLC D1-유래": 서열 번호 64, 54, 92, "헤르셉타르그 CLC G2/2": 서열 번호 70, 54, 92, "헤르셉타르그 CLC E1/1": 서열 번호 68, 54, 92; "GA 604": 서열 번호 109, 110, 111, 112.
도 28: 공통의 경쇄 변이체를 갖는 이중특이성 HER2 항체에 의한 BT474 세포의 증식 저해. BT474 세포는 상이한 헤르셉타르그 변이체에 의해 처리되었다. 대조군으로서 트라스투추맙, 페르투추맙 및 이들 둘의 조합이 포함되었다. 6일 후, 증식 저해는 셀타이터 글로에 의해 결정되었다. "헤르셉타르그 CLC D1-유래 wt": 서열 번호 64, 54, 92, 헤르셉타르그 CLC D1-유래 G2": 서열 번호 64, 54, 92(당조작된 변이체) "헤르셉타르그 크로스맙": 서열 번호 109, 110, 111, 112.
도 29: BT-474 세포 상의 Her2 항체의 Clq 결합. BT474 세포는 3종의 헤르셉타르그 변이체와 함께 항온처리되었다. 대조군으로서 트라스투추맙, 페르투추맙 및 이들 둘의 조합이 포함되었다. "헤르셉타르그 CLC D1-유래 wt": 서열 번호 64, 54, 92, 헤르셉타르그 CLC D1-유래 G2": 서열 번호 64, 54, 92(당조작된 변이체) "헤르셉타르그 크로스맙": 서열 번호 109, 110, 111, 112.
도 30: BT-474 세포 상에서의 CDC 활성화(LDH 방출). BT474 세포는 3종의 헤르셉타르그 변이체와 함께 항온처리되었다. 대조군으로서 트라스투추맙, 페르투추맙 및 이들 둘의 조합이 포함되었다. "헤르셉타르그 CLC D1-유래 wt": 서열 번호 64, 54, 92, "헤르셉타르그 CLC D1-유래 G2": 서열 번호 64, 54, 92(당조작된 변이체), "헤르셉타르그 크로스맙": 서열 번호 109, 110, 111, 112.
도 31: BT-474 세포(ACEA)의 CDC 매개된 사멸. BT474 세포는 3종의 헤르셉타르그 변이체와 함께 항온처리되었다. 대조군으로서 트라스투추맙, 페르투추맙 및 이들 둘의 조합이 포함되었다. "헤르셉타르그 CLC D1-유래 wt": 서열 번호 64, 54, 92, 헤르셉타르그 CLC D1-유래 G2": 서열 번호 64, 54, 92(당조작된 변이체) "헤르셉타르그 크로스맙": 서열 번호 109, 110, 111, 112.
도 32: 이중특이성 항체의 생체내 활성. 상이한 Her2 이중특이성 분자(10 mg/kg)로 치료한 후의 마우스 이종이식 모델에서의 종양 부피는 트라스투추맙, 페르투추맙 및 이들 둘의 조합에 의한 치료와 비교되었다. "헤르셉타르그": 서열 번호 64, 54, 92. "대조군": 졸레어, 비 Her2 결합 항체.
I. 정의
개시내용 전체를 통해, 용어 "ErbB2", "ErbB2 수용체", "c-Erb-B2", 및 "HER2"는 상호교환적으로 사용되고, 달리 지시되지 않는 한, 고유의 서열 ErbB2 인간 폴리펩타이드, 또는 이의 작용성 유도체를 지칭한다. "ber2", "erbB2" 및 "c-erb-B2"는 상응하는 인간 유전자를 지칭한다.
본원에서 목적을 위해 "억셉터 인간 골격구조"는 하기 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 골격구조 또는 인간 컨센서스 골격구조로부터 유래된 경쇄 가변성 도메인(VL) 골격구조 또는 중쇄 가변성 도메인(VH) 골격구조의 아미노산 서열을 포함하는 골격구조이다. 인간 면역글로불린 골격구조 또는 인간 컨센서스 골격구조"로부터 유래된" 억셉터 인간 골격구조는 이의 동일한 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 이는 아미노산 서열 변화를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 몇몇 실시태양에서, VL 억셉터 인간 골격구조는 서열에 있어서 VL 인간 면역글로불린 골격구조 서열 또는 인간 컨센서스 골격구조 서열에서와 동일하다.
"친화도"는 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 부위 및 그의 결합 파트너(예를 들어 항원) 사이의 비-공유적 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용될 경우, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어 항체 및 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 표시될 수 있다. 친화도는, 본원에 기재된 방법들을 비롯하여, 당분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화도를 측정하기 위한 특정한 예증적 및 예시적 실시태양은 아래에 기재된다.
"친화도 성숙된" 항체는 하나 이상의 초가변성 영역(HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖고, 이러한 변경으로 인하여 변경되지 않는 모 항체에 비하여 항원에 대한 항체의 친화도가 개선되는 항체를 지칭한다.
용어 "이중특이성 HER2 항체" 및 "HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체"는 상호교환적으로 사용되고, 항체가 HER2를 발현하는 세포를 표적화하는데 있어서 진단 제제 및/또는 치료 제제로서 유용하기에 충분한 친화도로 각각 세포외 도메인 II 및 IV 둘 다에서 HER2에 결합할 수 있는 이중특이성 항체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 세포외 도메인 II 및 IV 둘 다에서 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체가 비연관된 비-HER2 단백질에 결합하는 정도는, 예를 들어, 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay), 표면 플라스몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)에 기초된 검정[예를 들어 비아코어(Biacore)] 또는 유세포 분석기(FACS)에 의해 측정될 경우, 항체의 HER2에 대한 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시태양에서, HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고 다양한 항체 구조물, 예컨대 제한되지 않지만 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 항체 단편을, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 내포한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는, 제한되지 않지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabody), 크로스(cross)-Fab 단편; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자(예를 들어 scFv), 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함된다. scFv 항체는, 예를 들어 휴스턴(Houston, J.S.)의 문헌[Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96]에 기재되어 있다. 또한, 항체 단편은 VH 도메인의 특징, 즉 작용성 항원 결합 부위로 VL 도메인과 함께 조립될 수 있는 특징, 또는 VL 도메인의 특징, 즉 VH 도메인과 함께 조립될 수 있는 특징을 가짐으로써 전장 항체의 항원 결합 특성을 제공하는 단일 쇄 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에 사용될 경우, "Fab 단편"은 경쇄(CL)의 VL 도메인 및 불변성 도메인을 포함하는 경쇄 단편, 및 중쇄의 VH 도메인 및 제1 불변성 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 하나의 실시태양에서 본 발명의 이중특이성 항체는 적어도 하나의 Fab 단편을 포함하고, 여기서 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역 또는 불변성 영역은 교환된다. 가변성 영역 또는 불변성 영역의 교환에 기인하여, 상기 Fab 단편은 또한 "크로스-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "크로스오버(crossover) Fab 단편"으로서 지칭된다. 크로스오버 Fab 분자의 2개의 상이한 쇄 조성이 가능하고 본 발명의 이중특이성 항체에 포함된다. 한편, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역은 교환되는바, 크로스오버 Fab 분자는 경쇄 가변성 영역(VL) 및 중쇄 불변성 영역(CH1)으로 구성된 펩타이드 쇄, 및 중쇄 가변성 영역(VH) 및 경쇄 불변성 영역(CL)으로 구성된 펩타이드 쇄를 포함한다. 이러한 크로스오버 Fab 분자는 크로스Fab( VLVH )로 지칭된다. 다른 한편으로는, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변성 영역은 교환되고, 크로스오버 Fab 분자는 중쇄 가변성 영역(VH) 및 경쇄 불변성 영역(CL)으로 구성된 펩타이드 쇄, 및 경쇄 가변성 영역(VL) 및 중쇄 불변성 영역(CH1)으로 구성된 펩타이드 쇄를 포함한다. 이러한 크로스오버 Fab 분자는 크로스Fab(CLCH1)로 지칭된다.
"단일 쇄 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변성 도메인(VH), 항체 불변성 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변성 도메인(VL), 항체 경쇄 불변성 도메인(CL) 및 연결기로 구성된 폴리펩타이드이고, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 결합기는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서중 하나를 갖는다: a) VH-CH1-연결기-VL-CL, b) VL-CL-연결기-VH-CHl, c) VH-CL-연결기-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-연결기-VH-CL; 여기서 상기 연결기는 적어도 30개의 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50개의 아미노산의 폴리펩타이드이다. 상기 단일 쇄 Fab 단편 a) VH-CHl-연결기-VL-CL, b) VL-CL-연결기-VH-CH1, c) VH-CL-연결기-VL-CH1 및 d) VL-CH1-연결기-VH-CL는 CL 도메인 및 CH1 도메인 사이의 천연 디설파이드 결합을 통해 안정화된다. 또한, 이들 단일 쇄 Fab 분자는 시스테인 잔기의 삽입을 통한 쇄간 디설파이드 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수 있다[예를 들어 카밧 번호매김(Kabat numbering)에 따라 가변성 중쇄의 44 위치 및 가변성 경쇄의 100 위치]. 용어 "N-말단"은 N-말단의 마지막 아미노산을 표시한다. 용어 "C-말단"은 C-말단의 마지막 아미노산을 표시한다. "축합된" 또는 "연결된"은 성분들(예를 들어 Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)이 펩타이드 결합에 의해 직접적으로, 또는 하나 이상의 펩타이드 연결기를 경유하여 결합됨을 의미한다.
용어 "연결기"는 본원에서 사용될 경우 펩타이드 연결기를 지칭하고 바람직하게는 적어도 5개 아미노산의 길이, 바람직하게는 5 내지 100개, 더욱 바람직하게는 10 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드이다. 하나의 실시태양에서 상기 펩타이드 연결기는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm이고, 이때 G = 글리신, S = 세린, (x = 3, n = 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n = 2, 3, 4 또는 5 및 m = 0, 1, 2 또는 3)이고, 바람직하게는 x = 4 및 n = 2 또는 3이며, 더욱 바람직하게는 x = 4, n = 2이다. 하나의 실시태양에서 상기 펩타이드 연결기는 (G4S)2이다.
용어 "면역글로불린 분자"는 천연 발생 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, IgG 부류의 면역글로불린은 디설파이드-결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 소위 중쇄 불변성 영역으로 칭해지는 3종의 불변성 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)이 수반되는, 소위 가변성 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변성 도메인으로 칭해지는 하나의 가변성 영역(VH)을 갖는다. 유사하게, N-으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 소위 경쇄 불변성 영역으로 칭해지는 하나의 불변성 경쇄(CL) 도메인이 수반되는, 소위 가변성 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변성 도메인으로 칭해지는 하나의 가변성 영역(VL)을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)으로 칭해지는 5가지 유형중 하나로 할당될 수 있고, 이들중 몇몇은 추가로 하위유형, 예를 들어 γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA1)로 분류된다. 면역글로불린의 경쇄는 그의 불변성 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 칭해지는 2가지 유형중 하나로 할당될 수 있다. 면역글로불린은 면역글로불린 힌지(hinge) 영역을 경유해 연결된, 2개의 Fab 분자 및 1개의 Fc 도메인으로 본질적으로 구성된다.
기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 기준 항체의 그의 항원으로의 결합을 경쟁 검정에서 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 역으로, 기준 항체는 항체의 그의 항원으로의 결합을 경쟁 검정에서 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 상보적인 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 일부를 지칭한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 에피토프로 칭해지는 항원의 특정한 부분에만 결합할 수 있다. 항원 결합 도메인은, 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변성 도메인(또한 항체 가변성 영역으로 칭해짐)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변성 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변성 영역(VH)을 포함한다.
용어 "키메라성" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원 또는 종으로부터 유래되는 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 근원 또는 종으로부터 유래되는, 대체적으로 재조합 DNA 기법에 의해 제조되는 항체를 지칭한다. 토끼 가변성 영역 및 인간 불변성 영역을 포함하는 키메라성 항체가 바람직하다. 본 발명에 의해 내포되는 "키메라성 항체"의 다른 바람직한 형태는 불변성 영역이, 특히 Clq 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관하여, 본 발명에 따른 특성을 생성하는 고유의 항체의 영역으로부터 개질되거나 변화된 항체이다. 이러한 키메라성 항체는 또한 "종류-변환된(class-switched) 항체"로도 지칭된다. 키메라성 항체는 면역글로불린 가변성 영역을 인코딩하는 DNA 분절 및 면역글로불린 불변성 영역을 인코딩하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메라성 항체를 생산하는 방법으로는 종래의 재조합 DNA가 포함되고 유전자 형질감염 기법이 또한 당분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어 모리슨(Morrison, S.L.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; 미국 특허 제5,202,238호 및 제5,204,244호를 참조한다.
용어 "세포독성제"는 본원에 사용될 경우 세포 기능을 저해 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 일으키는 물질을 지칭한다. 세포독성제로는, 제한되지 않지만, 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드(빈스크린, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입 제제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대 핵용해(nucleolytic) 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소, 또는 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소(이의 단편 및/또한 변형물 포함); 및 이후 기재되는 다양한 항종양제 또는 항암제가 포함된다.
"효과기 기능"은 항체 이소타입에 따라 상이한, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예로는: Clq 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 항체-의존성 세포성 식세포작용(ADCP), 사이토킨 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 착체-매개된 항원 섭취; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
본원에서 사용될 경우, 용어 "조작, 조작된, 조작하는"은 펩타이드 주쇄의 임의의 처리, 또는 천연 발생 또는 재조합 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 번역후 개질을 포함하는 것으로 고려된다. 조작은 아미노산 서열의 개질, 글리코실화 패턴의 개질, 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 개질, 뿐만 아니라 이들 접근법의 조합을 포함한다.
용어 "아미노산 돌연변이"는 본원에서 사용될 경우 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 개질을 내포함을 의미한다. 치환, 결실, 삽입 및 개질의 임의의 조합이 이루어져 최종 구성물에 도달될 수 있되, 최종 구성물은 원하는 특징, 예를 들어, Fc 수용체로의 감소된 결합, 또는 또 다른 펩타이드와의 증가된 회합을 소유한다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시 말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들어 Fc 영역의 결합 특징을 변경할 목적으로, 비-보존성 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체함이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 20개의 표준 아미노산(예를 들어 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-하이드록시라이신)의 비-천연 발생 아미노산에 의한 대체 또는 천연 발생 아미노산 유도체에 의한 대체를 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당분야에 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 유전적 방법은 부위-지정된 돌연변이생성, PCR, 유전자 합성 등을 포함한다. 유전자 조작 이외의 방법, 예컨대 화학적 개질에 의한 아미노산의 측쇄 기를 변경시키는 방법이 또한 유용할 수 있는 것으로 간주된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 지시하기 위해 다양한 지정이 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들면, Fc 도메인의 329 위치에서 프롤린의 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G, 또는 Pro329Gly로서 지시될 수 있다.
제제, 예를 들어, 약학 제형의 "효과량"은 원하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하기 위해 필요한 시간의 기간 동안 및 투여량에서의 효과적인 양을 지칭한다.
용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 본원에서 불변성 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 이 용어는 고유의 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 다를 수 있지만, 인간 IgG 중쇄의 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단으로 연장되는 것으로 대체적으로 정의된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정화되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변성 영역중 아미노산 잔기의 번호매김은 카밧(Kabat, E.A.) 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재된 바와 같이, EU 색인으로도 지칭되는 EU 번호매김 체제에 따른다. Fc 도메인의 "서브유닛"은, 본원에서 사용될 경우 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩타이드중 하나, 즉 안정한 자가-회합이 가능한 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변성 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들면, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변성 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진시키는 개질"은 동종이량체를 형성하기 위해 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩타이드와 동일한 폴리펩타이드의 회합을 감소시키거나 방지하는 Fc 도메인 서브유닛의 펩타이드 주쇄의 조작 또는 번역후 개질이다. 회합을 촉진시키는 개질은 본원에서 사용될 경우 특히 회합이 요망되는 2개의 Fc 도메인 서브유닛 각각(즉 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛)에 이루어지는 별도의 개질을 포함하고, 여기서 개질은 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 회합을 촉진시키기 위해 서로 상보성이다. 예를 들면, 회합을 촉진시키는 개질은 Fc 도메인 서브유닛중 하나 또는 둘 다의 구조 또는 전하를 바꾸어 이들의 회합을 각각 입체적으로 또는 정전기적으로 바람직하게 만들 수 있다. 이와 같이, (이종)이량체는 제1 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩타이드 및 제2 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩타이드 사이에서 발생되고, 이는 각각의 서브유닛(예를 들어 항원 결합 부위)에 축합되는 추가의 성분이 동일하지 않다는 면에서 동일하지 않을 수 있다. 몇몇 실시태양에서 회합을 촉진시키는 개질은 Fc 도메인에서의 아미노산 돌연별히, 특히 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 회합을 촉진시키는 개질은 별도의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을, Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에 포함한다.
"골격구조" 또는 "FR"은 초가변성 영역(HVR) 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기를 지칭한다. 가변성 도메인의 FR은 일반적으로 다음의 4가지 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전체 항체"는 본원에서 상호교환적으로 고유의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양액"은 상호교환적으로 사용되고, 이러한 세포의 자손체를 비롯하여 외래성 핵산이 도입되어진 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하고, 이는 계대배양의 수와 무관하게 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유도된 자손체를 포함한다. 자손체는 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 고유적으로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택될 때 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손체가 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 인간 항체 레퍼토리(repertoiry) 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 인간 이외의 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 항체이다. 인간 항체에 대한 이러한 정의는 인간 이외의 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특히 배제한다. 본 발명에 따른 키메라성 및 인간화된 항체에 대해 또한 언급될 경우, 용어 "인간 항체"는 본원에서 사용될 경우, 특히 Clq 결합 및/또는 FcR 결합과 관련하여, 예를 들어 Fc 부분의 "종류-변환" 즉 변화 또는 돌연변이(예를 들어 IgG1 내지 IgG4 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해, 본 발명에 따른 특성을 생성하기 위해 불변성 영역에서 개질되는 이러한 항체를 또한 포함한다.
용어 "재조합 인간 항체"는 본원에서 사용될 경우 NS0 또는 CHO 세포 같은 숙주 세포로부터 또는 인간 면역글로불린 유전자를 위해 유전자 이식된 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 인간 항체를 포함하고자 한다. 이러한 재조합 인간 항체는 가변성 영역 및 불변성 영역을 재배열된 형태로 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체를 생체내에서 체세포 초돌연변이시켰다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 그에 연관되기는 하지만, 생체내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
"인간 컨센서스 골격구조"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격구조 서열의 선택시 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격구조이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변성 도메인 서열의 하위군으로부터이다. 일반적으로, 서열의 하위군은 카밧 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 하나의 실시태양에서, VL의 경우, 하위군은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 하위군 카파 I이다. 하나의 실시태양에서, VH의 경우, 하위군은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화된" 항체는 인간 이외의 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라성 항체를 지칭한다. 특정 실시태양에서, 인간화된 항체는 적어도 하나의, 전형적으로 2개의 가변성 도메인의 실질적으로 모두를 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예를 들어, CDR)은 인간 이외의 항체의 HVR에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변성 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화된 형태", 예를 들어, 인간 이외의 항체는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 본 발명에 의해 내포되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는, 특히 Clq 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여, 불변성 영역이 고유의 항체의 불변성 영역으로부터 추가적으로 개질 또는 변화되어 본 발명에 따른 특성을 생성하는 항체이다.
용어 "초가변성 영역" 또는 "HVR"은, 서열에서 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프(loop)("초가변성 루프")를 형성하는 항체 가변성 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 고유의 4개-쇄 항체는 6개의 HVR을 포함한다; VH에 3개(H1, H2, H3), VL에 3개(L1, L2, L3). HVR은 일반적으로 초가변성 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 가장 높은 서열 가변성이고/이거나 항원 인식에 연관된다. 예시적인 초가변성 루프는 아미노산 잔기 26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2), 91 내지 96(L3), 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2), 및 96 내지 101(H3)에서 초래된다[코티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)의 문헌 "J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)"]. 예시적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24 내지 34, L2의 50 내지 56, L3의 89 내지 97, H1의 31 내지 35B, H2의 50 내지 65, 및 H3의 95 내지 102에서 초래된다[카밧 등의 문헌 "Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)"]. 초가변성 영역(HVR)은 또한 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되고, 이들 용어는 본원에서 항원 결합 영역을 형성하는 가변성 영역의 부위와 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 이러한 특정한 영역은 카밧 등의 문헌[U.S. Dept. of Health 및 Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 코티아 등의 문헌[J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에 의해 기재되고, 여기서 정의는 서로에 대해 비교될 경우 아미노산 잔기의 중첩부 또는 하위집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하는 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 바와 같이 용어의 범주내에 속하는 것으로 의도된다. 상기 인용된 참고문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 내포하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 아래의 표 A에 제시된다. 특정한 CDR을 내포하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당분야의 숙련가라면 어느 잔기가 항체의 가변성 영역 아미노산 서열이 제공된 특정한 CDR을 포함하는지 일상적으로 결정할 수 있다.
[표 A]
CDR 정의1
Figure pct00001
카밧 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변성 영역 서열에 대한 번호매김 시스템을 정의하였다. 숙련가라면, 서열 자체를 넘어서는 실험적 데이터에 대한 신뢰없이, "카밧 번호매김"의 이러한 시스템을 임의의 가변성 영역 서열에 정확히 할당할 수 있다. 본원에서 사용될 경우, "카밧 번호매김"은 카밧 등의 문헌[U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 제시된 번호매김 시스템을 지칭한다. 달리 구체화되지 않는다면, 항체 가변성 영역에서 특정 아미노산 잔기 위치의 번호매김에 대한 기준은 카밧 번호매김 시스템에 따른다.
VH에서의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변성 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR(specificity determining residue)"을 포함한다. SDR은 CDR의 영역내에 포함되고, 약자화된-CDR, 또는 a-CDR로 불린다. 예시적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31 내지 34, L2의 50 내지 55, L3의 89 내지 96, H1의 31 내지 35B, H2의 50 내지 58, 및 H3의 95 내지 102에서 초래된다[알마그로(Almagro) 및 프란손(Fransson)의 문헌 "Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)" 참조]. 달리 지시되지 않는 한, 가변성 도메인중 HVR 잔기 및 기타 잔기(예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 상기 카밧 등의 문헌에 따라 번호매김된다.
"면역컨주게이트(immunoconjugate)"는 하나 이상의 이종성 분자(들), 제한되지 않지만, 예로서 세포독성제에 컨주게이트되는 항체이다.
"개체" 또는 "피험체"는 포유동물이다. 포유동물로는, 제한되지 않지만, 가축 동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 인간 이외의 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)가 포함된다. 특정 실시태양에서, 개체 또는 피험체는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분들로부터 분리된 것이다. 몇몇 실시태양에서, 항체는, 예를 들면, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF: isoelectric focusing), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정될 경우 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법을 검토하기 위해, 예를 들어, 플래트만(Flatman) 등의 문헌[J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은, 대개는 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 그의 천연 염색체 부위로부터 상이한 염색체 부위에 또는 염색체 밖에 존재한다.
"HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 예컨대 단일 벡터 또는 별도의 벡터내의 이러한 핵산 분자(들), 및 숙주 세포에서 하나 이상의 부위에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)를 지칭한다.
용어 "단일클론성 항체"는 본원에 사용될 경우 실질적으로 동종성인 항체들의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 모집단을 구성하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하지만, 예를 들어, 천연 발생 돌연변이를 포함하거나 단일클론성 항체 제제의 생산 동안 야기된 가능한 변이 항체는 제외하고, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정자(에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 다중클론성 항체 제제와 대조적으로, 단일클론성 항체 제제의 각각의 단일클론성 항체는 항원 상의 단일한 결정자에 대해 유도된다. 이와 같이, 한정어 "단일클론성"은, 항체의 실질적으로 동종성인 모집단으로부터 수득된 항체의 특성을 지시하고, 이는 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론성 항체는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있고, 제한되지 않지만, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-표시 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 포함하는 형질감염 동물을 이용하는 방법이 포함되고, 이러한 방법 및 단일클론성 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법은 본원에 기재되어 있다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종성 부위(예를 들어 세포독성 부위) 또는 방사능표지에 컨주게이션되지 않는 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 약학 제형에 존재할 수 있다.
"고유의 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 고유의 IgG 항체는 디설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 3개의 불변성 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)이 수반되는, 가변성 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변성 도메인으로도 지칭되는 하나의 가변성 영역(VH)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 하나의 불변성 경쇄(CL) 도메인이 수반되는, 가변성 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변성 도메인으로도 지칭되는 하나의 가변성 영역(VL)을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변성 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2가지 유형중 하나로 할당된다.
용어 "패키지 삽입물"은, 지시사항, 용법, 투여량, 투여법, 조합 치료법, 사용금지사유에 관한 정보, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고문 등을 포함하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 관례상 포함되는 설명서를 지칭한다.
"비-실질적 교차-반응성"은, 분자(예를 들어, 항체)가 분자의 실제 표적 항원과 상이한 항원(예를 들어 표적 항원과 매우 관련된 항원)을, 특히 표적 항원에 비하여, 인식하거나 이에 특이적으로 결합하지 않음을 의미한다. 예를 들면, 항체는 실제 표적 항원과 상이한 항원에 약 10% 미만 내지 약 5% 미만으로 결합하거나, 또는 실제 표적 항원과 상이한 상기 항원에 약 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만, 바람직하게는 약 2%, 1%, 또는 0.5% 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.2% 또는 0.1% 미만으로 구성된 양으로 결합할 수 있다.
기준 폴리펩타이드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요할 경우, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 기준 폴리펩타이드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열중의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당분야의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당분야의 숙련가라면, 비교되는 서열의 전장에 대하여 최대 정렬을 달성하기 위해 요구되는 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성% 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 제조되고, 원시 코드(source code)는 사용자 기록문서와 함께 워싱턴 디.씨. 20559 소재의 미국 저작권 사무소(Copyright Office)에 보관되어 있고, 여기서 이는 미국 저작권 등록 번호 제TXU510087호하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수가능하거나, 또는 원시 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은, 디지털 UNIX V4.0D를 비롯하여, UNIX 작동 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 달라지지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B로의, B와의, 또는 B에 대한 소정의 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성%(이는 다르게는 소정의 아미노산 서열 B로의, B와의 또는 B에 대한 특정한 아미노산 서열 동일성%을 갖거나 포함한 소정의 아미노산 서열 A로서도 표현됨)은 다음과 같이 계산된다:
X/Y 분율×100
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일 부합성으로서 획득된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성%은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성%과 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 특히 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성% 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 문단에서 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은 이에 포함된 활성 구성성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여되는 피험체에 허용되지 않도록 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용가능함 담체"는 피험체에 무독성인 활성 구성성분 이외의 약학 제형중의 구성성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능함 담체로는, 제한되지 않지만, 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제가 포함된다.
본원에서 사용될 경우, 용어 "치료"(및 이의 문법적인 변형어, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료될 개체의 자연적 과정을 변경시키는 시도에 있어서의 임상적 개입을 지칭하고, 임상적 병리 과정 동안 또는 예방을 위해 수행될 수 있다. 요망되는 치료 효과로는, 제한되지 않지만, 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증후의 경감, 질병의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 방지, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 억제, 및 경감 또는 개선된 예후가 포함된다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체는 질병의 전개를 지연시키거나 질병의 진행을 둔화시키기 위해 사용된다.
용어 암은 본원에서 사용될 경우, 하기 암 중 임의의 것의 불응성 형태 또는 하기 암 중 하나 이상의 조합을 비롯하여, 림프종, 림프성 백혈병, 폐암, 비-소세포 폐암(NSCL), 기관지 폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부의 암, 위암, 위장관암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신세포암, 신우암, 중피종, 간암, 담관암, 중추신경계(CNS)의 종양, 척추 종양, 뇌간 교세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평세포암종, 뇌하수체 선종 및 에윙스(Ewings) 육종과 같은 증식성 질환을 지칭한다.
용어 "가변성 영역" 또는 "가변성 도메인"은 항원으로의 항체의 결합에 관여되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유의 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변성 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격구조 영역(FR) 및 3개의 초가변성 영역(HVR)을 포함한다[예를 들어, 킨드트(Kindt) 등의 문헌 "Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)" 참조]. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 포르토라노(Portolano) 등의 문헌[J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; 클락슨(Clackson) 등의 문헌[Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "항체의 항원-결합 부위"는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 항원-결합 부위는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격구조" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의되는 바와 같은 초가변성 영역 잔기 이외의 가변성 도메인 영역이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N-말단으로부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 기여하고 항체 특성을 정의하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 카밧 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)]의 표준 정의 및/또는 "초가변성 루프"로부터의 이들 잔기에 따라 결정된다.
항체 특이성은 항원의 특정한 에피토프에 대한 항체의 선택적 인식을 지칭한다. 천연 항체는, 예를 들면, 단일특이성이다. 용어 "단일특이성" 항체는 본원에서 사용될 경우 각각 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 표시한다.
본 발명에 따른 "이중특이성 항체"는 2개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 본 발명의 항체는 HER2의 2개의 상이한 에피토프, 즉 HER2의 세포외 도메인 II 및 IV에 대해 특이적이다. 용어 "이중특이성" 항체는 본원에서 사용될 경우 각각 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 적어도 2개의 결합 부위를 갖는 항체를 표시한다.
이중특이성 항체는 또한 HER2를 발현하는 세포에 세포독성제를 편재화시키기 위해 사용될 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
용어 "(원자)가"는 본 출원에서 사용될 경우 항체 분자에서 결합 부위의 특정화된 수의 존재를 표시한다. 그러하게, 용어 "2가", "4가", 및 "6가"는 각각 항체 분자에서 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 및 6개의 결합 부위를 표시한다. 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 적어도 "2가"이고, "3가" 또는 "다가"(예를 들어 "4가" 또는 "6가")일 수 있다.
본 발명의 항체는 2개 이상의 결합 부위를 갖고 이중특이성이다. 즉, 항체는 2개 보다 많은 결합 부위가 존재하는 경우(즉 항체가 3가 또는 다가인 경우) 조차도 이중특이성일 수 있다. 본 발명의 이중특이성 항체는, 예를 들면, 다가 단일 쇄 항체, 디아바디(diabody) 및 트리아바디(triabody), 뿐만 아니라 추가의 항원-결합 부위(예를 들어, 단일 쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab, 또는 (Fab)2)가 하나 이상의 펩타이드-연결기를 경유하여 연결된 전장 항체의 불변성 도메인 구조를 갖는 항체를 포함한다. 항체는 단일 종으로부터의 전장일 수 있거나, 키메라화되거나 인간화될 수 있다.
용어 "벡터"는, 본원에서 사용될 경우, 이것이 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가-복제 핵산 구조물, 뿐만 아니라 이것이 도입되는 숙주 세포의 게놈내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 "발현 벡터"로서 본원에 지칭된다.
용어 "아미노산"은 본 출원에서 사용될 경우 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y), 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 발생 카복시 α-아미노산의 기를 표시한다.
본원에서 사용될 경우, "세포", "세포주", 및 "세포 배양액"은 상호교환적으로 사용되고 모든 이러한 표시는 자손체를 포함한다. 이와 같이, "형질감염체" 및 "형질감염된 세포"는 주요 대상 세포, 및 형질전환의 수와 무관하게 이로부터 유래되는 배양물을 포함한다. 또한 모든 자손체는 고의적 또는 우연적 돌연변이에 기인하여 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 알아야 한다. 고유적으로 형질전환된 세포에서 스크리닝될 경우 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변형 자손체가 포함된다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체) 및 그의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 별도로 지시되지 않는 한, 본원에서 사용될 경우, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 비롯하여, 당분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적이고 예시적인 실시양태들이 아래에 기재되어 있다.
본원에서 사용될 경우 용어 "결합" 또는 "특이적으로 결합"은 시험관내 검정, 바람직하게는 플라스몬 공명 검정(비아코어, 지이-헬쓰케어, 스웨덴 업살라 소재)에서 항원의 에피토프로의 항체의 결합을 지칭한다. 결합 친화도는 용어 ka(항체/항원 착체로부터의 항체의 회합에 대한 반응 속도 상수), kD(해리 상수) 및 KD(kD/ka)에 의해 정의된다. 결합 또는 특이적인 결합은 10-8 몰/ℓ 이하, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 몰/ℓ의 결합 친화도(KD)를 의미한다.
항체의 사멸 수용체로의 결합은 비아코어 검정(지이-헬쓰케어, 스웨덴 업살라 소재)에 의해 조사될 수 있다. 결합 친화도는 용어 ka(항체/항원 착체로부터의 항체의 회합에 대한 반응 속도 상수), kD(해리 상수) 및 KD(kD/ka)에 의해 정의된다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 결정자를 포함한다. 특정 실시태양에서, 에피토프 결정자는 분자, 예컨대 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설포닐의 화학적 활성 표면 무리를 포함하고, 특정 실시태양에서, 특이적인 3차원 구조적 특징, 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다.
본원에서 사용될 경우, 특히 "당-"이라는 접두어를 갖는 용어 "조작자, 조작된, 조작", 뿐만 아니라 용어 "글리코실화 조작"은 천연 발생 또는 재조합 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 글리코실화 패턴의 임의의 처리를 포함하는 것으로 고려된다. 글리코실화 조작은 세포의 글리코실화 기작의 대사적 조작을 포함하고, 예컨대 세포에서 발현된 당단백질의 변형된 글리코실화를 달성하기 위한 올리고당 합성 경로의 유전자적 처리이다. 더욱이, 글리코실화 조작은 글리코실화에 미치는 돌연변이 및 세포 환경의 영향을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 글리코실화 조작은 글리코실전달효소 활성의 변경이다. 특정한 실시태양에서, 조작은 변경된 글루코스아미닐전달효소 활성 및/또는 푸코실전달효소 활성을 초래한다.
II. 조성물 및 방법
하나의 양태에서, 본 발명은 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체에 기초한다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 암의 치료 또는 진단에 유용하다.
A. 공통의 경쇄를 갖는, HER2에 특이적으로 결합하는 예시적 이중특이성 항체
본 발명의 하나의 양태에서, HER2의 세포외 도메인 II에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부위 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부위를 포함하는, HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 양쪽 결합 부위가 종양 세포 증식의 저해에 있어서 모 단일특이성 항체의 효능을 보유하고 HER2의 세포외 도메인 II에 대해 증가된 친화도를 갖는 공통의 경쇄를 보유하는 1가의 이중특이성 항체를 생성하였다. 모 항체 둘 다의 결합 특성을 보유하는 공통의 경쇄를 갖는 이중특이성 분자의 생성은, 하이브리드 경쇄의 공통의 CDR이 HER2의 세포외 도메인 II 및 IV 둘다에 대하여 결합 특이성을 보유해야 하므로 간단하지 않다. 이러한 소위 '공통의 경쇄' 원칙의 사용, 즉 하나의 경쇄를 공유하지만 여전히 별도의 특이성을 갖는 2개의 결합기를 조합함은 경쇄 짝짓기 오류를 방지하고, 이러한 특정한 경우에 모 항체의 에피토프 특이성을 보유한다. 결과로서, 생산 동안 부산물이 더 적고, 높은 수율로 HER2 이중특이성 항원 결합 분자의 균일한 제조를 용이하게 한다. 페르투추맙의 중쇄는 추가로 최적화되어 HER2의 세포외 도메인 II에 대한 친화도에 있어서 더 강력한 분자를 생성하였다. 또한, 트라스투추맙 중쇄는 특정 돌연변이를 CDR에 도입함으로써 안정화되었다. 생성 분자는 모 페르투추맙 및 트라스투추맙 단일특이성 항체에 비해 더 우수하다. 1가의 공통의 경쇄 형식인 이중특이성 HER2 항체는 페르투추맙 에피토프에 대해 증가된 친화도를 갖고, 세포 증식에 있어서 모 항체의 조합물과 비교하여 탁월한 저해 효과를 나타낸다.
하나의 실시태양에서, HER2의 세포외 도메인 II에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 분자 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 분자를 포함하고, 여기서 제1 Fab 분자의 가변성 경쇄의 서열이 제2 Fab 분자의 가변성 경쇄의 서열과 동일한(즉 제1 및 제2 Fab 분자가 공통의 경쇄를 포함하는) 이중특이성 항체가 제공된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은
(a) 서열 번호 55의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 77의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 56의 중쇄 CDR3을 포함하는 제1 중쇄;
(a) 서열 번호 20의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 29의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 30의 중쇄 CDR3을 포함하는 제2 중쇄; 및
(a) 서열 번호 89의 경쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 90의 경쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는 제1 및 제2 경쇄를 포함하는, HER2의 세포외 도메인 II 및 IV에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은
(a) 서열 번호 14의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 60의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 16의 중쇄 CDR3을 포함하는 제1 중쇄;
(a) 서열 번호 20의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 29의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 30의 중쇄 CDR3을 포함하는 제2 중쇄; 및
(a) 서열 번호 89의 경쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 90의 경쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는 제1 및 제2 경쇄를 포함하는, HER2의 세포외 도메인 II 및 IV에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은
(a) 서열 번호 58의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 15의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 59의 중쇄 CDR3을 포함하는 제1 중쇄;
(a) 서열 번호 20의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 29의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 30의 중쇄 CDR3을 포함하는 제2 중쇄; 및
(a) 서열 번호 89의 경쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 90의 경쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는 제1 및 제2 경쇄를 포함하는, HER2의 세포외 도메인 II 및 IV에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양의 제2 중쇄는 CDR에 더 높은 화학 안정성을 부여하는 적어도 하나의 개질을 아미노산 서열중에 함유하여, 스트레스 조건하에서 HER2로의 결합이 보유된다. 본원에서 유용한 개질은 예를 들어 D98E, D98N, D98T, G99A 또는 G99S이다. 놀랍게도 본 발명자들은 CDR의 몇몇 개질이 분자의 안정성을 개선시킬 뿐만 아니라, HER2로의 결합 친화도를 개선시켰음을 발견하였다.
그러므로 하나의 실시태양에서, 본 발명은
(a) 서열 번호 55의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 77의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 56의 중쇄 CDR3을 포함하는 제1 중쇄;
(a) 서열 번호 20의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 29의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 79의 중쇄 CDR3을 포함하는 제2 중쇄; 및
(a) 서열 번호 89의 경쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 90의 경쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는 제1 및 제2 경쇄를 포함하는, HER2의 세포외 도메인 II 및 IV에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은
(a) 서열 번호 14의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 60의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 16의 중쇄 CDR3을 포함하는 제1 중쇄;
(a) 서열 번호 20의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 29의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 79의 중쇄 CDR3을 포함하는 제2 중쇄; 및
(a) 서열 번호 89의 경쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 90의 경쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는 제1 및 제2 경쇄를 포함하는, HER2의 세포외 도메인 II 및 IV에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은
(a) 서열 번호 58의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 15의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 59의 중쇄 CDR3을 포함하는 제1 중쇄;
(a) 서열 번호 20의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 29의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 79의 중쇄 CDR3을 포함하는 제2 중쇄; 및
(a) 서열 번호 89의 경쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 90의 경쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는 제1 및 제2 경쇄를 포함하는, HER2의 세포외 도메인 II 및 IV에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 이중특이성 항체는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 가변성 경쇄(즉 공통의 경쇄), 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제1 중쇄, 및 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제2 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 이중특이성 항체는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 가변성 경쇄(즉 공통의 경쇄), 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제1 중쇄, 및 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제2 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 이중특이성 항체는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 가변성 경쇄(즉 공통의 경쇄), 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제1 중쇄, 및 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제2 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양의 제2 중쇄는 CDR에 대한 안정성 및 표적, 예를 들어 D98E, D98N, D98T, G99A 또는 G99S에 대한 결합을 부여하는 적어도 하나의 개질을 아미노산 서열에 함유한다.
그러므로 하나의 실시태양에서, 이중특이성 항체는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 가변성 경쇄(즉 공통의 경쇄), 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제1 중쇄, 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제2 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 이중특이성 항체는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 가변성 경쇄(즉 공통의 경쇄), 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제1 중쇄, 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제2 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 이중특이성 항체는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 가변성 경쇄(즉 공통의 경쇄), 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제1 중쇄, 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제2 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 서열 번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 불변성 영역을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 불변성 영역을 포함한다.
또 다른 실시태양에서 본 발명의 이중특이성 항체는 서열 번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 불변성 영역을 포함한다.
또 다른 실시태양에서 본 발명의 이중특이성 항체는 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄 불변성 영역을 포함한다.
하나의 실시태양에서 서열 번호 54, 113, 64, 114, 82, 116, 92 및 115를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
하나의 실시태양에서 서열 번호 54, 113, 64, 114, 82, 116, 96 및 115를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양의 이중특이성 항체는 하기 섹션 F에서 개략화된 바와 같이 당조작된다. 하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양의 이중특이성 항체는 하기 섹션 D에서 개략화된 바와 같이 이종이량체화를 촉진시키는 Fc 도메인 개질을 포함한다.
B. 크로스오버 Fab 단편을 포함하는 예시적인 HER2 이중특이성 항체
본 발명의 하나의 실시태양에서, HER2의 세포외 도메인 II에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부위 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부위를 포함하는, HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 본 발명의 발명자들은 제2 1가 이중특이성 항체 형식을 생성하였고, 여기서 결합 부위중 하나는 크로스오버 Fab 단편이다. 본 발명의 하나의 양태에서 IgG 분자의 Fab 단편중 하나가 크로스오버 Fab 단편에 의해 대체되는 1가 이중특이성 항체가 제공된다. 크로스오버 Fab 단편은 Fab 단편이고, 여기서 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역 또는 불변성 영역은 교환된다. 크로스오버 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체 형식은, 예를 들면, 국제 특허출원 공개공보 제WO2009/080252호, 제WO2009/080253호, 제WO2009/080251호, 제WO2009/080254호, 제WO2010/136172호, 제WO2010/145792호 및 제WO2013/026831호에 기재되어 있다. 고유의 트라스투추맙 서열은 안정성 및 친화도를 개선시키기 위해 가변성 중쇄 및 가변성 경쇄 둘 다의 CDR내로 개질을 도입함으로써 최적화되었고, 생성된 서열은 골격구조-그라프팅되어 이중특이성 분자에서 경쇄의 짝짓기 오류를 방지하고, 이중특이성 항체는 당조작되어, 높은 수율 및 부산물의 낮은 백분율로 생산될 수 있는 HER2를 표적화하는 매우 강력한 이중특이성 항체를 생성한다. 또한 이는 개개의 모 항체의 조합과 비교하여 더 탁월한 종양 세포 증식의 저해를 보여준다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은
(a) 서열 번호 14의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 15의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 16의 중쇄 CDR3;
(d) 서열 번호 11의 경쇄 CDR1;
(e) 서열 번호 12의 경쇄 CDR2;
(f) 서열 번호 13의 경쇄 CDR3을 포함하는, HER2의 세포외 도메인 II에 대해 특이적인 제1 항원 결합 부위; 및
(a) 서열 번호 20의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 108의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 79의 중쇄 CDR3;
(d) 서열 번호 107의 경쇄 CDR1;
(e) 서열 번호 18의 경쇄 CDR2;
(f) 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는, HER2의 세포외 도메인 IV에 대해 특이적인 제2 항원 결합 부위를 포함하는, HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 이중특이성 항체는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 경쇄를 포함하는 HER2의 세포외 도메인 II에 대해 특이적인 제1 항원 결합 부위; 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 HER2의 세포외 도메인 IV에 대해 특이적인 제2 항원 결합 부위를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은
(a) 서열 번호 14의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 15의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 16의 중쇄 CDR3;
(d) 서열 번호 11의 경쇄 CDR1;
(e) 서열 번호 12의 경쇄 CDR2;
(f) 서열 번호 13의 경쇄 CDR3을 포함하는, HER2의 세포외 도메인 II에 대해 특이적인 제1 항원 결합 부위; 및
(a) 서열 번호 20의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 29의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 79의 중쇄 CDR3;
(d) 서열 번호 104의 경쇄 CDR1;
(e) 서열 번호 18의 경쇄 CDR2;
(f) 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는, HER2의 세포외 도메인 IV에 대해 특이적인 제2 항원 결합 부위를 포함하는, HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 이중특이성 항체는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 경쇄를 포함하는 HER2의 세포외 도메인 II에 대해 특이적인 제1 항원 결합 부위; 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및 서열 번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 HER2의 세포외 도메인 IV에 대해 특이적인 제2 항원 결합 부위를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은
(a) 서열 번호 14의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 15의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 16의 중쇄 CDR3;
(d) 서열 번호 11의 경쇄 CDR1;
(e) 서열 번호 12의 경쇄 CDR2;
(f) 서열 번호 13의 경쇄 CDR3을 포함하는, HER2의 세포외 도메인 II에 대해 특이적인 제1 항원 결합 부위; 및
(a) 서열 번호 20의 중쇄 CDR1;
(b) 서열 번호 29의 중쇄 CDR2;
(c) 서열 번호 79, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 87 및 서열 번호 88로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3;
(d) 서열 번호 104, 서열 번호 103 및 서열 번호 158로 구성된 군에서 선택된 경쇄 CDR1;
(e) 서열 번호 18의 경쇄 CDR2;
(f) 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는, HER2의 세포외 도메인 IV에 대해 특이적인 제2 항원 결합 부위를 포함하는, HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 서열 번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 불변성 영역을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 C-말단 라이신이 제거된 서열 번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 불변성 영역을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 불변성 영역을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 C-말단 라이신이 제거된 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 불변성 영역을 포함한다.
또 다른 실시태양에서 본 발명의 이중특이성 항체는 서열 번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 불변성 영역을 포함한다.
또 다른 실시태양에서 본 발명의 이중특이성 항체는 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄 불변성 영역을 포함한다.
하나의 실시태양에서 서열 번호 109, 110, 111 및 112를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인, HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편, 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편을 포함한다(여기서 적어도 하나의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역 또는 불변성 영역은 교환됨).
상기 이중특이성 항체가 HER2의 세포외 도메인 II에 대한 하나의 결합 부위 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 대한 하나의 결합 부위에 의해 2가이므로, 이러한 형식은 또한 "1+1" 형식으로서 지칭된다. 그러므로 본 섹션에 기재된 이중특이성 항체는 HER2의 세포외 도메인 II에 대해 1가이고 HER2의 세포외 도메인 IV에 대해 1가이다. 1+1 형식을 갖는 이중특이성 항체의 예시적인 구조는 도 10에 도시된다. 가변성 영역 또는 불변성 영역의 교환에 기인하여, 상기 Fab 단편은 또한 "크로스-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "크로스오버 Fab 단편"로서 지칭된다. 1+1 형식의 IgG 분자는 또한 크로스맙 형식으로서 지칭된다[섀퍼(Schaefer) 등의 문헌 "Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: 11187-92" 참조].
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인, HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편(여기서 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역 또는 불변성 영역은 교환됨), 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인, HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편, 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편(여기서 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역 또는 불변성 영역은 교환됨)을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인, HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편, 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편(여기서 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역은 교환됨)을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인, HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편, 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편(여기서 중쇄 및 경쇄의 불변성 영역은 교환됨)을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 상기 이중특이성 항체는 2개의 Fab 단편이 N-말단에 축합되는 Fc 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역 또는 불변성 영역은 교환된다. 하나의 실시태양에서 2개의 Fab 단편은 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인의 N-말단에 축합된다. 하나의 실시태양에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 하나의 실시태양에서 HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편, HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 부분이다. 특정한 실시태양에서 면역글로불린 분자는 IgG 부류 면역글로불린이다. 더 더욱 특정한 실시태양에서 면역글로불린은 IgG1 하위부류 면역글로불린이다. 또 다른 실시태양에서 면역글로불린은 IgG4 하위부류 면역글로불린이다. 추가의 특정한 실시태양에서 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 실시태양에서 면역글로불린은 키메라성 면역글로불린 또는 인간화된 면역글로불린이다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 하나의 결합 부위 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 하나의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함하고, 여기서 IgG 분자의 하나의 아암(arm)(Fab 단편)의 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역 또는 불변성 영역은 교환된다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 하나의 결합 부위 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 하나의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함하고, 여기서 IgG 분자의 하나의 아암(Fab 단편)의 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역은 교환된다. 이러한 항체 형식은 또한 크로스맙(VHVL)로서 지칭된다.
하나의 실시태양에서 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 결합 부위를 포함하는 IgG 분자의 하나의 아암(Fab 단편)의 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역은 교환된다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 하나의 결합 부위 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 하나의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함하고, 여기서 IgG 분자의 하나의 아암(Fab 단편)의 중쇄 및 경쇄의 불변성 영역은 교환된다. 이러한 항체 형식은 또한 크로스맙(CH1CL)로서 지칭된다.
하나의 실시태양에서 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 결합 부위를 포함하는 IgG 분자의 하나의 아암(Fab 단편)의 중쇄 및 경쇄의 불변성 영역은 교환된다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 하나의 결합 부위 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 하나의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함하고, 여기서 IgG 분자의 하나의 아암(Fab 단편)의 완전한 VH-CH1 및 VL-CL 도메인은 교환된다. 이는 적어도 하나의 Fab 단편이 Fc 도메인의 N-말단에 경쇄를 경유하여 축합됨을 의미한다(VLCL). 하나의 실시태양에서 나머지 Fab 단편은 Fc 도메인의 N-말단에 중쇄를 경유하여 축합됨을 의미한다(VHCH1). 이러한 항체 형식은 또한 크로스맙Fab로서 지칭된다. 하나의 실시태양에서 Fab 단편은 둘 다 Fc 도메인의 N-말단에 면역글로불린 힌지 영역을 통해 축합된다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양의 이중특이성 항체는 하기 섹션 F에 개략화된 바와 같이 당조작된다. 하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양의 이중특이성 항체는 하기 섹션 C에서 개략화된 바와 같이 이종이량체화를 촉진시키는 Fc 도메인 개질을 포함한다.
C. 이종이량체화를 촉진시키는 Fc 도메인 개질
본 발명의 이중특이성 HER2 항체는 Fc 도메인의 2개의 서브유닛중 하나 또는 나머지에 축합되는 상이한 항원 결합 부위를 포함하고, 이에 따라 Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 전형적으로 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 쇄로 구성된다. 이들 폴리펩타이드의 재조합 공동-발현 및 후속적인 이량체화는 2개의 폴리펩타이드의 몇몇 가능한 조합을 유도한다. 재조합 생산시 본 발명의 이중특이성 항체의 수율 및 순도를 개선시키기 위해서, 원하는 폴리펩타이드의 회합을 촉진시키는 개질을 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인내로 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정한 실시태양에서 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진시키는 개질을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 서브유닛 사이의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 존재한다. 이와 같이, 하나의 실시태양에서 상기 개질은 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 존재한다.
특정 실시태양에서 상기 개질은 소위 "노브-인투-홀(knob-into-hole)" 개질로서, Fc 도메인의 2개의 서브유닛중 하나에 "노브" 개질을 포함하고 Fc 도메인의 2개의 서브유닛중 나머지 하나에 "홀" 개질을 포함한다. 노브-인투-홀 기술은 예를 들어 미국 특허 제5,731,168호; 미국 특허 제7,695,936호; 리지웨이(Ridgway) 등의 문헌[Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 카터(Carter)의 문헌[J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 이 방법은 제1 폴리펩타이드의 계면에 돌출부("노브")를, 제2 폴리펩타이드의 계면에 상응하는 강(cavity)("홀")을 도입함을 포함하여, 돌출부가 강내에 위치됨으로써 이종이량체 형성을 촉진시키고 동종이량체 형성을 방해하도록 할 수 있다. 돌출부는 제1 폴리펩타이드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들어 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 돌출부와 동일하거나 또는 유사한 크기의 보상적 강은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄(예를 들어 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩타이드의 계면에 생성된다.
따라서, 특정한 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 강에 위치가능한 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내에 돌출부를 생성하고, Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치될 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내에 강을 생성한다. 돌출부 및 강은 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을, 예를 들어 부위-특이적 돌연변이생성, 또는 펩타이드 합성에 의해 변경시킴으로써 만들어질 수 있다.
특정 실시태양에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 위치 366의 트레오닌 잔기는 트립토판 잔기로 대체되고(T366W), Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 티로신 잔기는 위치 407에서 발린 잔기로 대체된다(Y407V). 하나의 실시태양에서, Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가적으로 트레오닌 잔기는 위치 366에서 세린 잔기로 대체되고(T366S) 류신 잔기는 위치 368에서 알라닌 잔기로 대체된다(L368A).
역시 추가의 실시태양에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 추가적으로 세린 잔기는 위치 354에서 시스테인 잔기로 대체되고(S354C), 및 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가적으로 티로신 잔기는 위치 349에서 시스테인 잔기로 대체된다(Y349C). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입으로 인해 Fc 도메인의 2개의 서브유닛의 사이에 디설파이드 가교가 형성되고, 추가로 이량체를 안정화시킨다[카터(Carter)의 문헌 "J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)"].
대안의 실시태양에서 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진시키는 개질은, 예를 들어 PCT 공보 제WO 2009/089004호에 기재된 바와 같이 정전기적 조정 효과를 매개하는 개질을 포함한다. 일반적으로, 이러한 방법은 동종이량체 형성이 정전기적으로 바람직하지 않지만 이종이량체화가 정전기적으로 바람직하도록 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 계면에서 하전된 아미노산 잔기에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체함을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 제1 항원 결합 부위 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함하고, 여기서 제1 중쇄의 Fc 부분은 제1 이량체화 모듈을 포함하고, 제2 중쇄의 Fc 부분은 제2 이량체화 모듈을 포함하여 IgG 분자의 2개의 중쇄의 이종이량체화를 허용한다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 노브-인투-홀 전략에 따라 제1 이량체화 모듈은 노브를 포함하고, 제2 이량체화 모듈은 홀을 포함한다[카터(Carter P.), 리지웨이(Ridgway J.B.B.), 프레스타(Presta L.G.)의 문헌 "Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996 , pp. 73-73(1)" 참조].
D. 핵산 서열, 벡터 및 방법
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 제공한다. 본 발명의 이중특이성 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전체 이중특이성 항원 결합 분자를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로서, 또는 공동-발현되는 다수(예를 들어, 둘 이상)의 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공동-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드는, 예를 들어, 디설파이드 결합 또는 작용성 이중특이성 항체를 형성하기 위한 다른 수단을 통해 회합될 수 있다. 예를 들면, Fab 단편의 경쇄 부분은 Fab 단편의 중쇄 부분, Fc 도메인 서브유닛 및 임의적으로 또 다른 Fab 단편(의 일부)을 포함하는 이중특이성 항체의 부분으로부터 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 공동-발현되는 경우, 중쇄 폴리펩타이드는 경쇄 폴리펩타이드와 회합되어 Fab 단편을 형성할 것이다. 또 다른 예에서, 2개의 Fc 도메인 서브유닛중 하나 및 임의적으로 하나 이상의 Fab 단편(의 일부)을 포함하는 본원에 제공된 이중특이성 항체의 부분은 2개의 Fc 도메인 서브유닛중 나머지 및 임의적으로 Fab 단편(의 일부)을 포함하는 본원에 제공된 이중특이성 항체의 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 공동-발현될 경우, Fc 도메인 서브유닛은 회합되어 Fc 도메인을 형성할 것이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 항체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 63, 67 및 69로 제시된 바와 같은 제1 가변성 중쇄 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 항체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 91 및 133으로 제시된 바와 같은 제2 가변성 중쇄 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 항체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 53으로 제시된 바와 같은 가변성 경쇄 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 항체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 83, 85, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 63, 67, 69, 53, 21 및 23으로 제시된 바와 같은 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 항체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 63, 67 및 69에서의 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 제1 가변성 중쇄 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 항체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 91 및 133에서의 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 제2 가변성 중쇄 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 항체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 53에서의 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 가변성 경쇄 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다.
추가의 목적에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 항체가 생산되도록 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 제조 방법이 제공된다.
E. Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 개질
하나의 양태에서 상기 임의의 실시태양에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 부분이 개질된 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함한다. 개질된 Fc 부분은 야생형 Fc 부분에 비하여 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는다.
본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한쌍의 폴리펩타이드 쇄로 구성된다. 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이고, 이의 각각의 서브유닛은 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변성 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 서로 안정하게 회합할 수 있다.
본 발명에 따른 하나의 실시태양에서 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정한 실시태양에서 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또 다른 실시태양에서 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 더욱 구체적인 실시태양에서, Fc 도메인은 위치 S228(카밧 번호매김)에서의 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 더욱 구체적인 실시태양에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L235E 및 S228P 및 P329G를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 이러한 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 아암 교환을 감소시킨다[스투벤라우흐(Stubenrauch) 등의 문헌 "Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)" 참조]. 추가의 특정한 실시태양에서 Fc 도메인은 인간이다.
Fc 도메인은 본 발명의 이중특이성 항체에 우호적인 약동력학적 특성, 예컨대 표적 조직에서의 양호한 축적 및 우호적인 조직-혈액 분포 비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 부여한다. 그러나 이는 동시에 본 발명의 이중특이성 항체를 바람직한 항원-함유 세포에 표적화하기 보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 원치않게 표적화할 수 있다. 따라서, 특정한 실시태양에서 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은, 고유의 IgG1 Fc 도메인에 비하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 이러한 실시태양에서 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)은, 고유의 IgG1 Fc 도메인(또는 고유의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)에 비하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도, 및/또는 고유의 IgG1 Fc 도메인(또는 고유의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)에 비하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 실시태양에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)은 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정한 실시태양에서 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 실시태양에서 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 실시태양에서 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 실시태양에서 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체이고, 더욱 특히 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa이며, 가장 특히 인간 FcγRIIIa이다. 하나의 실시태양에서 Fc 수용체는 저해성 Fc 수용체이다. 특정 실시태양에서 Fc 수용체는 저해성 인간 Fcγ 수용체, 더욱 특히 인간 FcgRIIB이다. 하나의 실시태양에서 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP, 및 사이토킨 분비중 하나 이상이다. 특정한 실시태양에서 효과기 기능은 ADCC이다. 하나의 실시태양에서 Fc 도메인은, 고유의 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 신생 Fc 수용체(FcRn)에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화도를 나타낸다. FcRn으로의 실질적으로 유사한 결합은, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)이 FcRn에 대한 고유의 IgG1 Fc 도메인(또는 고유의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)의 결합 친화도를 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 더욱 특히 약 90% 초과하여 나타낼 경우 달성된다.
특정 실시태양에서 Fc 도메인은, 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해 감소된 Fc 수용체에 대한 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 특정한 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에 존재한다. 하나의 실시태양에서 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시킨다. 하나의 실시태양에서 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 적어도 2-배, 적어도 5-배, 또는 적어도 10-배 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시키는 아미노산 돌연변이가 하나 보다 많이 존재하는 실시태양에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 적어도 10-배, 적어도 20-배, 또는 심지어 적어도 50-배 감소시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서 조작된 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체는, 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체와 비교하여, 20% 미만, 특히 10% 미만, 더욱 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 특정한 실시태양에서 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 몇몇 실시태양에서 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 실시태양에서 Fc 수용체는 저해성 Fc 수용체이다. 특정 실시태양에서 Fc 수용체는 저해성 인간 Fcγ 수용체이고, 더욱 특히 인간 FcgRIIB이다. 몇몇 실시태양에서 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 실시태양에서 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체이고, 더욱 특히 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa이며, 가장 특히 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게는, 이들 수용체 각각에 대한 결합이 감소된다. 몇몇 실시태양에서 보체 성분에 대한 결합 친화도, 특히 Clq에 대한 결합 친화도가 또한 감소된다. 하나의 실시태양에서 신생 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도의 보존은, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)이 Fc 도메인의 조작되지 않은 형태(또는 Fc 도메인의 조작되지 않은 형태를 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)의 약 70%를 초과하여 FcRn에 대한 결합 친화도를 나타낼 경우 달성된다. Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체는, 이러한 친화도를 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과하여 나타낸다. 특정 실시태양에서 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은, 조작되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 감소된 효과기 기능을 갖도로 조작된다. 감소된 효과기 기능으로는, 제한되지 않지만, 다음중 하나 이상이 포함될 수 있다: 감소된 보체 의존성 세포독성(CDC), 감소된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP), 감소된 사이토킨 분비, 항원 제시 세포에 의한 감소된 면역 착체-매개된 항원 섭취, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵세포에 대한 감소된 결합, 다형핵백혈구 세포에 대한 감소된 결합, 세포자멸을 유도하는 직접 신호발송의 감소, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T 세포 프라이밍(priming). 하나의 실시태양에서 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP, 및 감소된 사이토킨 분비중 하나 이상이다. 특정한 실시태양에서 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 하나의 실시태양에서 감소된 ADCC는 조작되지 않은 Fc 도메인(또는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
하나의 실시태양에서 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 하나의 실시태양에서 Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 구체적인 실시태양에서 Fc 도메인은 L234, L235 및 P329의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시태양에서 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함한다. 하나의 이러한 실시태양에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 실시태양에서 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 구체적인 실시태양에서 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G이고, 특히 P329G이다. 하나의 실시태양에서 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함하고 추가로 E233, L234, L235, N297 및 P331로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 구체적인 실시태양에서 추가로 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정한 실시태양에서 Fc 도메인은 P329, L234 및 L235에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특정한 실시태양에서, Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 하나의 이러한 실시태양에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은, PCT 특허 출원 제PCT/EP2012/055393호(본원에 참고로 그의 전체가 인용됨)에 기재된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 없앤다. 제PCT/EP2012/055393호는 또한 이러한 돌연변이체 Fc 도메인의 제조 방법, 및 그의 특성, 예컨대 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능을 결정하기 위한 방법을 기재한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 몇몇 실시태양에서 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이고, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 실시태양에서 IgG4 Fc 도메인은 위치 S228에서 아미노산 치환을 포함하고, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함한다. Fc 수용체에 대한 결합 친화도 및/또는 그의 효과기 기능을 추가로 감소시키기 위해, 하나의 실시태양에서 IgG4 Fc 도메인은 위치 L235에서 아미노산 치환을 포함하고, 특히 아미노산 치환 L235E를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함하고, 특히 아미노산 치환 P329G를 포함한다. 특정한 실시태양에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환을 포함하고, 특히 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함한다. 이러한 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이들의 Fcγ 수용체 결합 특성은 PCT 특허 출원 제PCT/EP2012/055393호(본원에 참고로 그의 전체가 인용됨)에 기재되어 있다.
특정한 실시태양에서, 고유의 IgG1 Fc 도메인에 비하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은, 아미노산 치환 L234A, L235A 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
특정 실시태양에서 Fc 도메인의 N-글리코실화가 제거되었다. 하나의 이러한 실시태양에서 Fc 도메인은 위치 N297에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 특히 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파르트산(N297D)으로 대체하는 아미노산 치환을 포함한다.
상기 본원에서 및 PCT 특허 출원 제PCT/EP2012/055393호에 기재된 Fc 도메인에 더하여, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329중 하나 이상의 치환을 갖는 도메인을 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327중 2개 이상의 위치에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함하고, 예컨대 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체가 포함된다(미국 특허 제7,332,581호).
돌연변이체 Fc 도메인은 당분야에 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 개질에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 인코딩 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이 생성, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면 서열결정(sequencing)에 의해 확인될 수 있다.
Fc 수용체로의 결합은 예를 들어 ELISA에 의해, 또는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 표준 기기, 예컨대 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)를 사용하여 쉽게 결정될 수 있고, Fc 수용체는 예컨대 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 적합한 이러한 결합 검정은 본원에 기재되어 있다. 다르게는, Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 활성화하는 세포의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도는 특정한 Fc 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주, 예컨대 FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 사용하여 평가될 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체의 효과기 기능은, 당분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 검정은 본원에 기재되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 다른 예는 미국 특허 제5,500,362호; 헬스트롬(Hellstrom) 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)] 및 헬스트롬 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; 미국 특허 제5,821,337호; 브루그게만(Bruggemann) 등의 문헌[J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기재되어 있다. 다르게는, 비-방사성 검정 방법이 사용될 수 있다[예를 들면, 유세포 분석을 위한 ACTI(등록상표) 비-방사성 세포독성 검정(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 검정(프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨 소재)]. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 킬러(NK) 세포가 포함된다. 다르게는, 또는 추가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예를 들어, 동물 모델, 예컨대 클리네스(Clynes) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 보체 성분, 구체적으로 Clq로의 Fc 도메인의 결합이 또한 감소될 수 있다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작되는 몇몇 실시태양에서, 이러한 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. Clq 결합 검정은 본 발명의 이중특이성 항체가 Clq에 결합할 수 있고 이에 따라 CDC 활성을 갖는지의 여부를 결정하기 위해 실행될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2006/029879호 및 제WO 2005/100402호에서의 Clq 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다[예를 들면, 가자노-산토로(Gazzano-Santoro) 등의 문헌 "J. Immunol. Methods 202:163 (1996)"; 크래그(Cragg, M.S.) 등의 문헌 "Blood 101:1045-1052 (2003)"; 및 크래그 및 글레니(M.J. Glennie) 등의 문헌 "Blood 103:2738-2743 (2004)" 참조].
하기 섹션은 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 개질을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체의 바람직한 실시태양을 설명한다.
F. 항체 변이체
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 이중특이성 항체의 아미노산 서열 변이체가 상기 기재된 것들에 추가로 고려된다. 예를 들면, 이중특이성 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 요망될 수 있다. 이중특이성 항체의 아미노산 서열 변이체는 이중특이성 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열내로 적절한 개질을 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 개질로는, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 서열 내로의 삽입 및/또는 서열내 잔기의 치환이 포함된다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 최종 구축물에 도달되도록 이루어질 수 있되, 최종 구축물은 원하는 특징, 예를 들어 항원-결합 특징을 소유해야 한다.
1. 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이생성을 위해 흥미로운 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"이라는 표제하에 표 B에 제시된다. 보다 실질적인 변화는 "예시적인 치환"이라는 표제하에 표 B에 제공되고, 아미노산 측쇄 부류에 대해서는 하기 추가로 기재된 바와 같다. 아미노산 치환은 흥미로운 항체에 도입되고 생성물은 원하는 활성, 예를 들어, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝된다.
[표 B]
Figure pct00002
Figure pct00003
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환함을 수반할 것이다.
치환적 변이체의 한가지 유형은 모 항체(예를 들어 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변성 영역 잔기를 치환함을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는, 모 항체에 비하여 특정 생물학적 특성(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 있어서 개질(예를 들어 개선)될 수 있고/있거나, 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환적 변이체는 친화도 성숙된 항체이고, 이는 편리하게, 예를 들어, 파아지 디스플레이(phage display)에 기초한 친화도 성숙 기법, 예컨대 본원에 기재된 기법에 의해 생성될 수 있다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이되고 변이 항체는 파아지 상에 디스플레이되고 특정 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경(예를 들어, 치환)은 HVR에서 이루어져서, 예를 들어, 항체 친화도를 개선시킬 수 있다. 이러한 변경은 HVR "돌연변이다발점(hotspot)", 즉 체세포 돌연변이 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기[예를 들어, 초우드허리(Chowdhury)의 문헌 "Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)" 참조], 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어지고, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 돌연변이는, 예를 들어, 후겐붐(Hoogenboom) 등의 문헌[Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 돌연변이의 몇몇 실시태양에서, 돌연변이를 위해 채택된 변형가능한 유전자내로 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오류-발생 PCR, 쇄 셔플링(shuffling), 또는 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이생성)에 의해 다양성이 도입된다. 이어서 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서 라이브러리는 스크리닝되어 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-유도된 접근법을 포함하고, 여기서 수 개의 HVR 잔기(예를 들어, 한 시점에 4 내지 6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여된 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 또는 모델링(modeling)을 사용하여 특이적으로 식별될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3은 특히 종종 표적화된다.
특정 실시태양에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 초래될 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에 만들어진다. 이러한 변경은 HVR "돌연변이다발점" 또는 SDR의 바깥쪽일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시태양에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다.
돌연변이생성을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하는 유용한 방법은 커닝햄(Cunningham) 및 웰스(Wells)의 문헌[Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이생성"으로 지칭된다. 이러한 방법에서, 표적 잔기의 하나의 잔기 또는 기(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)는, 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는지의 여부를 결정하기 위해 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 식별되거나 대체된다. 초기 치환에 대한 작용적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 다르게는, 또는 추가적으로, 항원-항체 착체의 결정 구조는 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 식별한다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃한 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 포함하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실 말단 축합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변형으로는 효소(예를 들어 ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드로의 항체의 N- 또는 C-말단의 축합이 포함된다.
2. 글리코실화 변이체
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 이중특이성 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항체로의 글리코실화 부위의 첨가 또는 이의 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다.
이중특이성 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유의 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297로의 N-결합에 의해 일반적으로 결합된 분지화된 2촉각 올리고당을 전형적으로 포함한다. 예를 들어, 롸이트(Wright) 등의 문헌[TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc: N-acetyl glucosamine), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 2촉각 올리고당 구조의 "줄기"에 있는 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체중 올리고당의 개질은 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어진다.
한 실시태양에서, Fc 영역에 결합되는(직접적으로 또는 간접적으로) 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 이중특이성 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 이러한 항체중 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%이다. 푸코스의 양은 예를 들면 국제 특허출원 공개공보 제WO 2008/077546호에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정되는 경우, Asn 297에 결합된 모든 당구조물(예를 들어, 착체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대한, Asn297에서의 당류 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 297 위치(Fc 영역 잔기의 Eu 번호매김)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체에서의 작은 서열 변형에 기인하여 297 위치의 약 ± 3의 아미노산 상류 또는 하류, 즉 294 내지 300 위치에 위치될 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 제2003/0157108호[프레스타(Presta, L)]; 및 제2004/0093621호[교와 학코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)]를 참조한다. "푸코스제거된" 또는 "푸코스-부족" 항체 변이체에 관한 문헌의 예로는: US 제2003/0157108호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2000/61739호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2001/29246호; US 제2003/0115614호; US 제2002/0164328호; US 제2004/0093621호; US 제2004/0132140호; US 제2004/0110704호; US 제2004/0110282호; US 제2004/0109865호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/085119호; 제WO 2003/084570호; 제WO 2005/035586호; 제WO 2005/035778호; 제WO 2005/053742호; 제WO 2002/031140호; 오카자키(Okazaki) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 야만-오누키(Yamane-Ohnuki) 등의 문헌[Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]이 포함된다. 푸코스제거된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포[리프카(Ripka) 등의 문헌 "Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)"; 미국 특허 출원 제2003/0157108A1호(프레스타); 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/056312A1호[아담스(Adams) 등; 특히 실시예 11], 및 넉아웃(knockout) 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포[예를 들어, 야만 오누키 등의 문헌 "Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)"; 칸다(Kanda, Y.) 등의 문헌 "Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)"; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/085107호 참조]가 포함된다.
2등분된 올리고당을 갖는 이중특이성 항체 변이체가 추가로 제공되고, 예를 들어, 여기서 이중특이성 항체의 Fc 영역에 결합된 2촉각 올리고당은 GlcNAc에 의해 2등분된다. 이러한 이중특이성 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/011878호[진-마이레트(Jean-Mairet) 등]; 미국 특허 제6,602,684호(우마나 등); 및 US 제2005/0123546호(우마나 등)에 기재되어 있다. Fc 영역에 결합된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 CDC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 1997/30087호[파텔(Patel) 등]; 국제 특허출원 공개공보 제WO 1998/58964호[라주(Raju, S.)]; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 1999/22764호(라주)에 기재되어 있다.
3. 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시태양에서, 이중특이성 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 이중특이성 항체, 예를 들어, "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 치환된 잔기는 이중특이성 항체의 허용가능한 부위에서 초래된다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 항체의 허용가능한 부위에 위치되고, 다른 부위, 예컨대 약물 부위 또는 연결기-약물 부위에 항체를 컨주게이션하여 면역컨주게이트를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 하기 잔기들중 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 번호매김); 중쇄의 A118(EU 번호매김); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 번호매김). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
G. 재조합 방법 및 조성물
본 발명의 이중특이성 항체는, 예를 들면, 고체-상태 펩타이드 합성[예를 들어 메리필드(Merrifield) 고체 상 합성] 또는 재조합 생산에 의해 수득될 수 있다. 재조합 생산을 위해, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은, 이중특이성 항체(단편)를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 단리되고, 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내로 삽입된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 종래의 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하나의 실시태양에서 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당분야의 숙련가에게 잘 공지된 방법이 사용되어 적절한 전사/번역 제어 신호에 따라 이중특이성 항체(단편)의 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전적 재조합이 포함된다. 예를 들면, 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌[MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)]; 및 어수벨(Ausubel) 등의 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)]에 기재된 기법을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있거나, 또는 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터로는 발현 카세트(cassette)를 포함하고, 이 안으로 이중특이성 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(단편)(즉, 코딩 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소와 작동가능하게 회합하여 클로닝된다. 본원에 사용될 경우, "코딩 영역"은 아미노산 내로 번역되는 코돈으로 구성되는 핵산의 일부분이다. "정지 코돈(stop codon)"(TAG, TGA, 또는 TAA)이 아미노산으로 번역되지 않을 지라도, 이는 존재한다면 코딩 영역의 일부로 고려되지만, 임의의 플랭크(flanking) 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜(ribosome) 결합 부위, 전사 종결자, 인트론(intron), 5' 및 3' 비번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 둘 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예를 들어 단일 벡터 상에서, 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예를 들어 별도의 (상이한) 벡터 상에서 존재할 수 있다. 더욱이, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 포함하거나, 또는 2개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있고, 예를 들어 본 발명의 벡터는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있고, 이는 단백질분해적 분할을 통해 최종 단백질로 번역후에 또는 번역과 동시에 분리된다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 본 발명의 이중특이성 항체(단편)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체에 축합되거나 축합되지 않은 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역으로는, 제한없이, 특수화된 요소 또는 모티프(motif), 예컨대 분비 신호 펩타이드 또는 이종성 작용성 도메인이 포함된다. 작동가능한 회합은, 유전자 생성물의 발현이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어하에 놓이도록 하는 방식으로 유전자 생성물, 예를 들어 폴리펩타이드를 위한 코딩 영역이 하나 이상의 조절 서열과 회합될 때 존재한다. 2개의 DNA 단편(예컨대 폴리펩타이드 코딩 영역 및 이와 회합된 프로모터)은, 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 생성물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 초래하는 경우, 및 2개의 DNA 단편 사이의 연결기의 성질이 유전자 생성물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력에 간섭하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력에 간섭하지 않을 경우 "작동적으로 회합"된다. 이와 같이, 프로모터 영역은, 프로모터가 핵산의 전사에 영향을 줄 수 있다면, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산과 작동적으로 회합될 것이다. 프로모터는 단지 예정된 세포에서 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 제어 요소, 예를 들면 인헨서(enhancer), 오퍼레이터(operator), 리프레서(repressor), 및 전사 종결 신호는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 회합되어 세포-특이적 전사를 지시한다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역이 본원에 개시된다. 다양한 전사 제어 영역은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이들로는, 제한없이, 척추동물 세포에서 작용하는 전사 제어 영역, 예컨대, 제한되지 않지만, 사이토메갈로바이러스(cytomegaloviruse)(예를 들어 급초기 프로모터, 인트론-A와 함께), 시미안(simian) 바이러스 40(예를 들어 초기 프로모터), 및 레트로바이러스(retroviruse)[예컨대, 예를 들어 라우스(Rous) 육종 바이러스]로부터의 프로모터 및 인헨서 분절이 포함된다. 다른 전사 제어 영역으로는 척추동물 유전자로부터 유래된 영역, 예컨대 액틴(actin), 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 a-글로빈, 뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 추가의 적합한 전사 제어 영역으로는 조직-특이적 프로모터 및 인헨서, 뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들어 프로모터 유도성 테트라사이클린)가 포함된다. 유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당분야의 숙련가에게 공지된다. 이들로는, 제한되지 않지만, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소(특히 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES, 또는 CITE 서열로서 지칭됨)가 포함된다. 발현 카세트는 또한 다른 특징부, 예컨대 복제의 기원, 및/또는 염색체 통합 요소, 예컨대 레트로바이러스성 긴 말단 반복부(LTR: retroviral long terminal repeat), 또는 아데노-회합된 바이러스성(AAV: adeno-associated viral) 역전된 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat)를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드의 분비를 유도하는 분비 또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 추가의 코딩 영역과 회합될 수 있다. 예를 들면, 이중특이성 항체의 분비가 요망된다면, 신호 서열을 인코딩하는 DNA는 본 발명의 이중특이성 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산의 상류에 위치될 수 있다. 신호 가설에 따라서, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 신호 펩타이드 또는 분비 리더(leader) 서열을 갖는데, 이는 거친 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 쇄의 배출이 개시된다면 성숙한 단백질로부터 분할된다. 당분야의 숙련가라면 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드가 일반적으로 폴리펩타이드의 N-말단에 축합되는 신호 펩타이드를 갖고, 이는 번역된 폴리펩타이드로부터 분할되어 폴리펩타이드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생성함을 인식한다. 특정 실시태양에서, 고유의 신호 펩타이드, 예를 들어 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드가 사용되거나, 또는 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 서열의 작용성 유도체가 이와 작동적으로 회합된다. 다르게는, 이종성 포유동물 신호 펩타이드, 또는 이의 작용성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA: tissue plasminogen activator) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제(glucuronidase)의 리더 서열로 치환될 수 있다.
이후의 정제를 촉진하거나(예를 들어 히스티딘 태그) 또는 이중특이성 항체 표지화를 보조하기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 인코딩하는 DNA는 이중특이성 항체 (단편) 인코딩 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 실시태양에서 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 각각 폴리뉴클레오티드 및 벡터에 관하여 본원에 기재된 임의의 특징들을 단일하게 또는 조합하여 혼입할 수 있다. 하나의 이러한 실시태양에서, 숙주 세포는 본 발명의 이중특이성 항체(의 일부)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들어 이로 형질전환되거나 형질감염된다). 본원에 사용될 경우, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 이중특이성 항체 또는 이의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. 이중특이성 항체를 복제하거나 이의 발현을 지지하기에 적합한 숙주 세포는 당분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 세포는 특정한 발현 벡터에 의해 적절히 형질감염 또는 형질전환될 수 있고, 세포를 함유한 다량의 벡터는 임상적 적용을 위해 충분량의 이중특이성 항체를 수득하도록 대규모 발효기를 접종하기 위해 성장될 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵 미생물, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등이 포함된다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 특히 글리코실화가 필요하지 않을 경우 박테리아에서 생산될 수 있다. 발현 후, 폴리펩타이드는 가용성 분별물에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다. 원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 사상균 또는 효모는 폴리펩타이드-인코딩 벡터를 위해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주(예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"된 곰팡이 및 효모 균주를 포함)여서, 부분적 또는 전체적 인간 글리코실화 패턴으로 폴리펩타이드의 생산을 초래한다. 게른그로스(Gerngross)의 문헌[Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)], 및 리(Li) 등의 문헌[Nat Biotech 24, 210-215 (2006)]을 참조한다. (글리코실화된) 폴리펩타이드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스성 균주가 식별되었다. 식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 이용될 수도 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호[유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES: 등록상표) 기술을 기재함]를 참조한다. 척추동물 세포는 숙주로서 사용될 수도 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주[예를 들어, 그라함(Graham) 등의 문헌 "J. Gen Virol. 36:59 (1977)"에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포]; 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포[예를 들어, 매터(Mather)의 문헌 "Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)"에 기재된 바와 같은 TM4 세포]; 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 뇌 암종 세포(HELA); 개과 동물 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562); TRI 세포[예를 들어, 매터 등의 문헌 "Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)"에 기재된 바와 같음]; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 dhfr-CHO 세포[우를라우브(Urlaub) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)"]; 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NSO, P3X63 및 Sp2/0이 포함된다. 단백질 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주를 고찰하기 위해, 예를 들어, 야자키(Yazaki) 및 우(Wu)의 문헌[Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 숙주 세포로는 배양된 세포, 예를 들어, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포 및 식물 세포, 뿐만 아니라 몇개만 예를 들자면, 유전자도입 동물, 유전자도입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포가 포함된다. 하나의 실시태양에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 이들 시스템에서 외래 유전자를 발현시키는 표준 기술이 당분야에 공지되어 있다. 항원 결합 도메인, 예컨대 항체의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 세포는, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄 둘 다를 갖는 항체이도록 항체 쇄의 나머지를 또한 발현하기 위해 조작될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체의 제조 방법이 제공되고, 여기서 방법은 본원에 제공된 바와 같이 이중특이성 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 이중특이성 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 이중특이성 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
이중특이성 항체의 성분은 서로 유전자적으로 축합된다. 이중특이성 항체는 이의 성분들이 직접적으로 서로, 또는 간접적으로 연결기 서열을 통해 축합되도록 고안될 수 있다. 연결기의 조성 및 길이는 당분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있고, 효능에 대해 시험될 수 있다. 이중특이성 항체의 상이한 성분들 사이의 연결기 서열의 예는 본원에 제공된 서열에서 발견된다. 원한다면 축합물의 개별적 성분들을 분리하기 위해 분할 부위를 혼입하도록 추가적인 서열이 또한 포함될 수 있고, 예를 들면 엔도펩티다아제(endopeptidase) 인식 서열이다.
특정 실시태양에서 이중특이성 항체의 부분을 형성하는 Fab 단편은 항원성 결정자에 결합할 수 있는 항체 가변성 영역을 적어도 하나 포함한다. 가변성 영역은 천연 발생 또는 비천연 발생 항체 및 이의 단편의 일부를 형성하거나 이로부터 유래될 수 있다. 다중클론성 항체 및 단일클론성 항체의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있다[예를 들어 할로우(Harlow) 및 래인(Lane)의 문헌 "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988"을 참조한다]. 비천연 발생 항체는 고체 상-펩타이드 합성을 사용하여 구축될 수 있거나, 재조합적으로 생산될 수 있거나(예를 들어 미국 특허 제4,186,567호에 기재된 바와 같음) 또는 예를 들면 가변성 중쇄 및 가변성 경쇄를 포함하는 조합적 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다[예를 들어 맥카퍼티(McCafferty)에게 허여된 미국 특허 제5,969,108호].
항체의 임의의 동물 종, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변성 영역이 본 발명의 이중특이성 항체에 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 비제한적 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변성 영역은 뮤린(murine), 영장류, 또는 인간 기원의 것일 수 있다. 이중특이성 항체가 인간 사용을 위해 의도된다면, 항체의 키메라성 형태가 사용될 수 있는데, 여기서 항체의 불변성 영역은 인간으로부터이다. 항체의 인간화된 형태 또는 완전한 인간 형태는 또한 당분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다[예를 들어 윈터(Winter)에게 허여된 미국 특허 제5,565,332호 참조]. 인간화는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있고, 제한되지 않지만 (a) 인간 이외의(예를 들어, 공여자 항체) CDR을 인간(예를 들어, 수여자 항체) 골격구조, 및 중요 골격구조 잔기(예를 들어 양호한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 보유하기 위에 중요한 잔기)를 보유하거나 하지 않는 불변성 영역 상으로 그라프팅하는 방법, (b) 단지 인간 이외의 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)을 인간 골격구조 및 불변성 영역 상으로 그라프팅하는 방법, 또는 (c) 전체 인간 이외의 가변성 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 이들을 인간-유사 구간으로 "클로킹(cloaking)"하는 방법이 포함된다. 인간화된 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 알마그로(Almagro) 및 프란손(Fransson)의 문헌[Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 검토되어 있고, 추가로, 예를 들어, 리에흐만(Riechmann) 등의 문헌[Nature 332:323-329 (1988)]; 퀸(Queen) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; 존스(Jones) 등의 문헌[Nature 321, 522-525 (1986)]; 모리슨(Morrison) 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)]; 모리슨 및 오이(Oi) 등의 문헌[Adv Immunol 44, 65-92 (1988)]; 베르회옌(Verhoeyen) 등의 문헌[Science 239, 1534-1536 (1988)]; 패들란(Padlan)의 문헌[Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)]; 카쉬미르(Kashmiri) 등의 문헌[Methods 36:25-34 (2005)(SDR (a-CDR) 그라프팅에 대해 기재)]; 패들란(Padlan)의 문헌[Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)("재보수(resurfacing)"에 대해 기재)]; 달라쿠아(Dall'Acqua) 등의 문헌[Methods 36 43-60 (2005)("FR 셔플링(shuffling)"에 대해 기재)]; 및 오스본(Osbourn) 등의 문헌[Methods 36:61-68 (2005)] 및 클림카(Klimka) 등의 문헌[Br. J. Cancer 83:252-260 (2000)(FR 셔플링에 대한 "안내된 선택" 접근에 대해 기재)]에 기재되어 있다. 인간 항체 및 인간 가변성 영역은 당분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 반 디지크(van Dijk) 및 반 데 윈켈(van de Winkel)의 문헌[Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)] 및 론베르그(Lonberg)의 문헌[Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 기재되어 있다. 인간 가변성 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단일클론성 항체의 일부를 형성하거나 이로부터 유래될 수 있다[예를 들어 문헌 "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)" 참조]. 인간 항체 및 인간 가변성 영역은 온전한 인간 항체 또는 인간 가변성 영역을 갖는 온전한 항체를 항원 챌린지(challenge)에 반응하여 생산하도록 개질된 유전자도입 동물에게 면역원을 투여함으로써 또한 제조될 수 있다[예를 들어 론베르그(Lonberg)의 문헌 "Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)" 참조]. 인간 항체 및 인간 가변성 영역은 또한 인간-유래된 파아지(phage) 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변성 영역 서열을 단리함으로써 생성될 수도 있다[예를 들어, 후겐붐(Hoogenboom) 등의 문헌 "Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)"; 및 맥카퍼티(McCafferty) 등의 문헌 "Nature 348, 552-554"; 클락슨(Clackson) 등의 문헌 "Nature 352, 624-628 (1991)" 참조]. 파아지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 표시한다.
특정 실시태양에서, 본 발명에 유용한 Fab 단편은, 예를 들면, 미국 특허출원 공개공보 제2004/0132066호(이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용됨)에 개시된 방법에 따라 증진된 결합 친화도를 갖도록 조작된다. 특이적 항원 결정자에 결합하는 본 발명의 이중특이성 항체의 능력은 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA) 또는 당분야의 숙련가에게 친숙한 다른 기법, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기법(비아코어 T100 시스템 상에서 분석됨)[릴제블래드 등의 문헌 "Glyco J 17, 323-329 (2000)"], 및 전통적 결합 검정[힐레이의 문헌 "Endocr Res 28, 217-229 (2002)"]을 통해 측정될 수 있다. 경쟁 검정은 특정한 항원에 결합하는 기준 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변성 도메인을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 이러한 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어 선형 또는 입체배좌 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑(mapping)하기 위한 상세한 예시적 방법은 모리스(Morris)의 문헌[Methods in Molecular Biology vol. 66 (1996) (Humana Press, Totowa, NJ)]의 "에피토프 매핑 프로토콜(Epitope Mapping Protocols)"에 제공되어 있다. 예시적인 경쟁 검정에서, 고정화된 항원은 항원에 결합하는 제1의 표지화된 항체 및 항원에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험된 제2 표지화되지 않은 항체를 포함하는 용액내에서 항온처리된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서 고정화된 항원은 제1의 표지화된 항체를 포함하지만 제2의 표지화되지 않은 항체를 포함하지 않는 용액내에서 항온처리된다. 항원으로 제1 항체가 결합할 수 있는 조건하에 항온처리한 후, 과량의 결합되지 않은 항체가 제거되고, 고정화된 항원과 회합된 표지의 양이 측정된다. 고정화된 항원과 회합된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 이는 제2 항체가 항원에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁함을 지시한다. 할로우(Harlow) 및 래인(Lane)의 문헌[(1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 이중특이성 항체는 당분야에 공지된 기법, 예컨대 고 성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정한 단백질을 정제하기 위해 사용되는 실제 조건은 인자들, 예컨대 순 전하, 소수성, 친수성 등에 좌우될 것이고, 당분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 항체의 친화도 크로마토그래피 정제를 위해, 이중특이성 항체에 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 이중특이성 항체의 친화도 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G와의 매트릭스가 사용될 수 있다. 순차적 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피가 사용되어 본질적으로 실시예에 기재된 바와 같은 이중특이성 항체를 단리할 수 있다. 이중특이성 항체의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등과 같은 다양한 임의의 공지된 분석적 방법에 의해 결정될 수 있다.
H. 검정
본원에서 제공된 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 당분야에 공지된 다양한 검정에 의해 이들의 물리적/화학적 및/또는 생물학적 활성에 대해 식별되거나, 스크리닝되거나, 특징화된다
1. 친화도 검정
HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체의 친화도는 표준 기기장치, 예컨대 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 제시된 방법에 따라 결정될 수 있다. 다르게는, 본원에 제공된 이중특이성 항체의 HER2로의 결합은 특정한 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여, 예를 들면 유세포 분석기(FACS)에 의해 평가될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예증적 및 예시적 실시태양은 하기 및 아래의 실시예에 기재되어 있다.
하나의 실시태양에 따라서, KD는 표면 플라스몬 공명에 의해 비아코어(등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어)를 사용하여 25℃에서 측정된다. Fc-부분 및 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해, His-태깅된(tagged) 재조합 Fc-수용체는 CM5 칩 상에 고정화된 항-펜타 His 항체[퀴아겐(Qiagen)]에 의해 포획되고, 이중특이성 구축물은 분석물로서 사용된다. 간단히, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)은 공급업체의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)에 의해 활성화된다. 항 펜타-His 항체는 10 mM 아세트산 나트륨(pH 5.0)에 의해 40 ㎍/㎖로 희석된 후 5 ㎕/분의 유속으로 주입되어 커플링된 단백질의 대략 6500 응답 유닛(RU: response unit)을 달성한다. 리간드의 주입 이후, 1 M 에탄올아민이 주입되어 미반응 기를 차단한다. 후속적으로 Fc-수용체는 4 또는 10 nM에서 60초 동안 포획된다. 동력학적 측정을 위해, 이중특이성 구축물의 4배의 연속 희석물(500 nM 내지 4000 nM의 범위)이 HBS-EP(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4)에 25℃에서 30 ㎕/분의 유속으로 120초 동안 주입된다.
표적 항원에 대한 친화도를 결정하기 위해, 이중특이성 구축물은 항 펜타-His 항체에 대해 기재된 바와 같은 활성화된 CM5-센서 칩 표면 상에 고정화된 항 인간 Fab 특이적 항체(지이 헬쓰케어)에 의해 포획된다. 커플링된 단백질의 최종 양은 대략 12000 RU이다. 이중특이성 구축물은 300 nM에서 90초 동안 포획된다. 표적 항원은 180초 동안 250 내지 1000 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 유속으로 유세포를 통해 통과된다. 해리는 180초 동안 모니터링된다.
벌크 굴절률 차이는 기준 유세포 상에서 수득된 응답을 차감함으로써 보정된다. 정지 상태 응답이 사용되어 랑뮤(Langmuir) 결합 등온선의 비선형 곡선 정합에 의해 해리 상수 KD를 유도하였다. 회합 속도(k회합) 및 해리 속도(k해리)는, 단순 1 대 1 랑뮤 결합 모델[비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1]을 사용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 정합시킴으로써 계산된다. 평형 해리 상수(KD)는 k해리/k회합 비로 계산된다. 예를 들어, 첸(Chen) 등의 문헌[J Mol Biol 293, 865-881 (1999)]을 참조한다.
2. 결합 검정 및 기타 검정
하나의 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 그의 항원 결합 활성에 대하여, 예를 들어, 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯(Western blot) 등에 의해 시험된다.
또 다른 양태에서, 경쟁 검정은 HER2로의 결합을 위해 특이적 항-HER2와 경쟁하는 항체를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 이러한 경쟁 항체는 특이적 항-HER2에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체배좌 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑(mapping)하기 위한 상세한 예시적 방법이 모리스(Morris)의 문헌[(1996) Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]의 "에피토프 매핑 프로토콜"에 기재되어 있다. 추가의 방법은 실시예 섹션에 기재되어 있다.
3. 활성 검정
하나의 양태에서, 생물학적 활성을 갖는 HER2에 결합하는 이중특이성 항체를 식별하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성으로는, 예를 들어, DNA 단편화, 세포자멸의 유도 및 표적화된 세포의 용해가 포함된다. 생체내 및/또는 시험관내 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다. 하나의 실시태양에서 상기 활성은 보체-의존성 세포독성(CDC)의 유도이다. 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 페르투추맙 또는 트라스투추맙 단독에 비해 더 높은 정도로 CDC를 유도한다. 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 CDC를 페르투추맙 또는 트라스투추맙 단독에 비해 적어도 약 10 배 더 높은 정도로, 약 20 배 더 높은 정도로 또는 약 30 배 더 높은 정도로 유도한다. 또 다른 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 CDC를 페르투추맙 또는 트라스투추맙의 조합에 비해 더 높은 정도로 유도한다. 또 다른 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 CDC를 페르투추맙 또는 트라스투추맙의 조합물에 비해 약 30%, 40%, 50% 또는 60%, 또는 적어도 30% 내지 70%, 또는 적어도 40% 내지 60% 더 높은 정도로 유도한다. 보체-의존성 세포독성(CDC) 검정은 열-처리되지 않은 혈청 또는 상업적으로 입수가능한 보체 분별물에 의해 수행될 수 있다[예를 들어 라자르(Lazar, G. A.) 등의 문헌 "증진된 효과기 기능을 갖는 조작된 항체 Fc 변이체(Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function). Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 4005-4010 (2006)" 참조]. 표적 세포 사멸은 몇몇 세포 생존능력 시약, 예컨대 알라마블루(Alamar Blue)[라자르 등의 문헌 "증진된 효과기 기능을 갖는 조작된 항체 Fc 변이체. Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 4005-4010 (2006)", 이두소기에(Idusogie, E. E.) 등의 문헌 "보체를 보충하기 위해 증가된 활성을 갖는 조작된 항체(Engineered antibody with increased activity to recruit complement). J. Immunol. 166, 2571-2575 (2001)"], 셀타이터-글로[예를 들어 자오(Zhao, X.) 등의 문헌 "급성 골수성 백혈병에서 항체-매개된 면역요법을 위한 C-유형 렉틴-유사 분자-1의 표적화(Targeting C-type lectin-like molecular-1 for antibody-mediated immunotherapy in acute myeloid leukemia). Haematologica 95, 71-78 (2009)" 참조], LDH 방출[예를 들어 코니쉬(Konishi, E.), 키타이(Kitai, Y.) 및 콘도(Kondo, T.)의 문헌 "낮은 수준의 항체를 측정하기 위한 보체-의존성 세포독성의 이용: 일본 뇌염 바이러스의 모델에서 비구조적 단백질 1에 대한 적용(Utilization of complement-dependent cytotoxcicity to measure low levels of antibodies: application to nonstructural protein 1 in a model of Japanese encephalitis virus). Clin. Vaccine Immunol. 15, 88-94 (2008)" 및 본원에 개시된 실시예 참조] 또는 칼세인-AM 방출에 의해 평가될 수 있다. 몇몇 실시태양에서 상기 정도의 CDC 유도는 세포 항원에 결합되는 본 발명의 항체에 대한 보체 단백질 Clq의 결합을 측정하는 LDH 방출 검정 또는 보체 검정에 의해 결정된다. 이어서 이중특이성 항체의 CDC 유도는 페르투추맙 또는 트라스투추맙 단독, 또는 페르투추맙 및 트라스투추맙의 조합물의 CDC 유도와 비교되고, CDC 유도를 위한 모든 값은 동일한 검정에서 검정되고, 동일한 세포주 및 동일한 개개 항체 농도를 갖는다. 미량적량판에서 수행된다면, 이중특이성 항체 및 대조군(페르투추맙 또는 트라스투추맙 단독, 또는 페르투추맙 및 트라스투추맙의 조합물)의 CDC를 유도하는 능력은 바람직하게는 동일한 검정을 사용하여 동일한 미량적량판에서 측정된다. 예시적인 검정은, 예를 들어 실시예 18 또는 19에 개시되어 있다. 하나의 실시태양에서 CDC의 상기 유도는 암 세포, 예를 들어 유방암 세포 상에서 결정된다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다. 세포 용해(예를 들어 LDH 방출의 측정에 의해) 또는 세포자멸(예를 들어 터넬(TUNEL) 검정 사용)을 검출하기 위한 검정은 당분야에 잘 공지되어 있다. ADCC 또는 CDC를 측정하기 위한 검정 또한 국제 특허 출원 공개공보 제WO 2004/065540호(실시예 1 참조)(이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용됨)에 기재되어 있다
I. 약학 제형
본원에 기재된 바와 같은 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체의 약학 제형은 원하는 순도를 갖는 이러한 이중특이성 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써[레밍턴(Remington)의 문헌 "Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)"], 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 제한되지 않지만, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐 피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 일당류, 이당류, 및 기타 탄화수소, 예로서 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다. 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 본원에서 추가로 간질성(interstitial) 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제(hyaluronidase) 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20[하이레넥스(HYLENEX: 등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International Inc.)]을 포함한다. 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법(rhuPH20 포함)은 미국 특허 공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2006/044908호에 기재된 제형을 포함하고, 후자의 제형으로는 히스티딘-아세테이트 완충액이 포함된다.
제형은 본원에서 또한 치료될 특정 증상에 필수적인 하나 보다 많은 활성 구성성분들, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 구성성분을 포함할 수 있다. 이러한 활성 구성성분들은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합물에 적절히 존재한다.
활성 구성성분들은, 예를 들면, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼(microemulsion), 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼(macroemulsion)에 트래핑될 수 있다. 이러한 기법들은 레밍턴의 문헌[Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지효성(sustained-release) 제제가 제조될 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예로는 항체를 포함한 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이러한 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
J. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 HER2에 결합하는 임의의 이중특이성 항체는 치료 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 암을 치료하는데에 사용하기 위한 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 특정 실시태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓는 환자를 치료하는 방법에 사용하기 위한, HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다. 하나의 이러한 실시태양에서, 이 방법은 개체에게 효과량의 적어도 하나의 추가의 치료제, 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시태양에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서의 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체의 용도를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 약제는 암의 치료를 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 약제는 암을 앓는 개체에게 효과량의 약제를 투여함을 포함하는 암 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 실시태양에서, 이 방법은 개체에게 효과량의 적어도 하나의 추가의 치료제, 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시태양에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 이 방법은 암을 앓는 개체에게 효과량의 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 이러한 실시태양에서, 이 방법은 개체에게 효과량의 적어도 하나의 추가의 치료제, 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시태양에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 예를 들어 상기 임의의 치료 방법에서 사용하기 위한, 본원에 제공된 HER2에 특이적으로 결합하는 임의의 이중특이성 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된 HER2에 특이적으로 결합하는 임의의 이중특이성 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된 HER2에 특이적으로 결합하는 임의의 이중특이성 항체 및 적어도 하나의 추가의 치료제, 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 치료제를 포함한다.
본 발명의 이중특이성 항체는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 예컨대 비경구적, 폐내, 및 비강내, 바람직하다면 국소적 치료를 위해 병변내 투여가 포함된다. 비경구적 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은, 부분적으로는 투여가 단기인지 장기인지에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 주사에 의해, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 수행될 수 있다. 제한되지 않지만 다양한 시점에 걸친 다중 투여 또는 단일 투여, 거환 투여, 및 맥동 주입 등을 비롯한 다양한 투약 계획이 본원에서 고려된다.
본 발명의 이중특이성 항체는 양호한 의료행위와 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려되는 인자로는 치료될 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 증상, 질환의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 의료진에게 공지된 다른 인자들이 포함된다. 이중특이성 항체는, 필수적이지는 않지만, 해당 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 임의적으로 제형화된다. 이러한 다른 제제의 효과적인 양은 제형에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료의 유형 및 상기 언급된 다른 인자들에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량으로 및 동일한 투여 경로에 의해, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1% 내지 99%의 양으로, 또는 실험적/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 이중특이성 항체의 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 위중성 및 과정, 이중특이성 항체가 예방을 목적으로 투여되는지 치료를 목적으로 투여되는지의 여부, 이전 치료법, 환자의 임상적 병력 및 이중특이성 항체에 대한 응답, 및 참여 의사의 견해에 좌우될 것이다. 이중특이성 항체는 적합하게는 환자에게 1회 또는 일련의 치료로 투여된다. 질환의 유형 및 위중성에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 이중특이성 항체는, 예를 들면 하나 이상의 별도의 투여에 의해서인지 연속적인 주입에 의해서인지와 무관하게, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자들에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 증상에 따라서, 치료는 질환 증후의 원하는 억제가 초래될 때까지 유지될 것이다. 이중특이성 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위내일 수 있다. 이와 같이, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주마다 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들어 환자가 항체를 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량으로 수여받도록). 초기에 더 높은 적재 용량이 투여된 후 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 샙생이 유용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 종래의 기법 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법이 본 발명의 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체 대신 또는 이에 더하여 본 발명의 면역컨주게이트를 사용하여 수행될 수 있음을 알아야 한다.
K. 제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 기재된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 포함하는 제품이 제공된다. 제품은 용기, 및 용기의 위에 또는 용기와 연결된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 그 자체의, 또는 증상을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면 용기는 피하내 주사 바늘에 의해 침투가능한 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물중 적어도 하나의 활성화제는 본 발명의 이중특이성 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은, 조성물이 선택된 증상을 치료하기 위해 사용됨을 지시한다. 게다가, 제품은 (a) 조성물이 포함된 제1 용기(여기서 조성물은 본 발명의 이중특이성 항체를 포함함); 및 (b) 조성물이 포함된 제2 용기(여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 달리는 치료제를 포함함)를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시태양에서 제품은 조성물이 특정 증상을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 다르게는, 또는 추가적으로, 제품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 주사용 정균수(BWFI: bacteriostatic water for injection), 포스페이트-완충된 염수, 링거의 용액 및 덱스트로즈 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용액을 추가로 포함할 수 있다. 추가로 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘, 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품이 본 발명의 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체 대신에 또는 이에 더하여 본 발명의 면역컨주게이트를 포함할 수 있음을 알아야 한다.
L. 면역컨주게이트
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 저해제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 컨주게이션된 본원의 HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 포함하는 면역컨주게이트를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 항체-약물 컨주게이트(ADC: antibody-drug conjugate)이고, 여기서 항체는 하나 이상의 약물, 예컨대 제한되지 않지만 메이탄시노이드(maytansinoid)(미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 제EP 0 425 235 B1호 참조); 아우리스타틴(auristatin), 예컨대 모노메틸아우리스타틴(monomethylauristatin) 약물 부위 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호, 및 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴(dolastatin); 칼리헤아미신(calicheamicin) 또는 이들의 유도체[미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 및 제5,877,296호; 힌만(Hinman) 등의 문헌 "Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)"; 및 로데(Lode) 등의 문헌 "Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)" 참조]; 안트라사이클린(anthracycline), 예컨대 다우노마이신(daunomycin) 또는 독소루비신(doxorubicin)[크라츠(Kratz) 등의 문헌 "Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)"; 제프레이(Jeffrey) 등의 문헌 "Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)"; 토르고브(Torgov) 등의 문헌 "Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)"; 나기(Nagy) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)"; 두보우치크(Dubowchik) 등의 문헌 "Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)"; 킹(King) 등의 문헌 "J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)"; 및 미국 특허 제6,630,579호]; 메토트렉세이트(methotrexate); 빈데신(vindesine); 탁산(taxane), 예컨대 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 라로탁셀(larotaxel), 테세탁셀(tesetaxel), 및 오르타탁셀(ortataxel); 트리코테센(trichothecene); 및 CC1065에 컨주게이션된다.
또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편, 예컨대 제한되지 않지만, 디프테리아(diphtheria) A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신(exotoxin) A 쇄[슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터], 리신(ricin) A 쇄, 아브린(abrin) A 쇄, 모데신(modeccin) A 쇄, 알파-사르신(sarcin), 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 저해제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파노오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin), 및 트리코테세네스(tricothecenes)에 컨주게이션된 본원에 상기 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 방사성 원자에 컨주게이션되어 방사성컨주게이트를 형성하는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성컨주게이트의 생산에 이용가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 방사성컨주게이트가 검출을 위해 사용될 경우, 이는 신티그래프(scintigraphic) 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명(NMR: nuclear magnetic resonance) 영상화(또한 자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 컨주게이트는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예컨대 디메틸 아디피미데이트 HC1), 활성 에스테르(예컨대 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물(예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 비테타(Vitetta) 등의 문헌[Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지화된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체로의 방사성뉴클레오티드의 컨주게이션을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. 국제 특허출원 공개공보 제W094/11026호를 참조한다. 연결기는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시키는 "분할가능한 연결기"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정성 연결기, 펩티다아제-민감성 연결기, 광불안정성 연결기, 디메틸 연결기 또는 디설파이드-함유 연결기[차리(Chari) 등의 문헌 "Cancer Res. 52:127-131 (1992)"; 미국 특허 제5,208,020호]가 사용될 수 있다.
면역컨주게이트 또는 ADC는 본원에서, 제한되지 않지만, 상업적으로 입수가능한 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)[예를 들어, 미국 일리노이주 락포드 소재의 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.)로부터]를 비롯한 가교-결합제에 의해 제조된 이러한 컨주게이트를 명백히 고려한다.
III. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 기재사항이 제시되지만, 다양한 다른 실시태양이 실행될 수 있음을 알아야 한다.
앞서 발명이 이해를 명확히 할 목적으로 예증 및 예시로서 상세히 기재되었지만, 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전체가 참고로 분명히 혼입된다.
실시예 1: 재료 및 방법
달리 지시되지 않는 한 하기 일반적 방법이 적용되었다:
재조합 DNA 기법
샘브룩(Sambrook, J.) 등의 문헌[Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같이 DNA를 조작하기 위해 표준 방법을 사용하였다. 분자 생물 시약을 제조업체의 지시에 따라 사용하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 처리
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적 정보가 카밧(Kabat, E.A.) 등의 문헌[(1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242]에 제공된다. 항체 쇄의 아미노산은 EU 번호매김에 따라 번호매겨진다[에델만(Edelman, G.M.) 등의 문헌 "PNAS 63 (1969) 78-85"; 카밧 등의 문헌 "(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242"].
GCG[제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신 매디슨 소재]의 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 인포맥스(Infomax)의 벡터 NTI 어드밴스 스위트(Vector NTI Advance suite) 버전 8.0을 서열 생성, 매핑, 분석, 주석달기 및 예증을 위해 사용하였다.
DNA 서열분석
세퀴서브(SequiServe)(독일 바터스테텐 소재) 및 진아트 아게(Geneart AG)(독일 레겐스부르그 소재)에서 수행되는 이중 가닥 서열분석에 의해 DNA 서열을 결정하였다.
실시예 2: 2+2 IgG-scFv 형식의 트라스투추맙 및 페르투추맙 이중특이성 항체의 생성
유전자 합성
원하는 유전자 분절을 진아트 아게(독일 레겐스부르그 소재)에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 생성물로부터 자동화된 유전자 합성에 의해 제조하였다. 단일 제한 엔도누클레아제(endonuclease) 분할 부위에 의해 플랭크된 유전자 분절을 pGA18(ampR) 플라스미드내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고 농도를 UV 분광법으로 결정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
발현 플라스미드의 구축
발현 플라스미드를 인코딩하는 모든 중쇄 및 경쇄를 구축하기 위해 하기 발현 벡터를 사용하였다. 벡터는 하기 요소로 구성된다:
- 선택 마커로서의 하이그로마이신 내성 유전자,
- 엡스타인-바르 바이러스(EBV: Epstein-Barr virus)의 복제 기원, oriP,
- 에스케리키아 콜라이에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제의 기원
- 에스케리키아 콜라이에서 암피실린(ampicillin) 내성을 부여하는 베타-락타마아제(beta-lactamase) 유전자,
- 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)로부터의 급초기 인헨서 및 프로모터
- 인간 1-면역글로불린 아데닐산 중합반응("폴리 A") 신호 서열
중쇄 또는 경쇄를 포함하는 면역글로불린 유전자를 유전자 합성에 의해 제조하고, 상기 기재된 바와 같이 pGA18(ampR) 플라스미드 내로 클로닝하였다. 특유의 제한 부위를 사용하여 지향적 클로닝에 의해 가변성 중쇄 구축물을 구축하였다. 가변성 경쇄 구축물을 VL 및 CL이 포함된 유전자 합성으로서 정렬하고 특유의 제한 부위를 사용하여 지향적 클로닝에 의해 구축하였다. 최종 발현 벡터를 에스케리키아 콜라이 세포로 형질전환시키고, 발현 플라스미드 DNA를 단리하고[미니프렙(Miniprep)], 제한 효소 분석 및 DNA 서열분석을 수행하였다. 정확한 클론을 150 ㎖의 LB-Amp 배지에서 성장시키고, 다시 플라스미드 DNA를 단리하고[맥시프렙(Maxiprep)] 서열 무결성을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
HEK293 세포에서의 면역글로불린 변이체의 일과성 발현
인간 배아 신장 293-F 세포의 일과성 형질감염에 의해 프리스타일(FreeStyle: 상표명) 293 발현 시스템을 제조업체[인비트로겐(Invitrogen), 미국]의 지시에 따라 사용하여 재조합 면역글로불린 변이체를 발현시켰다. 작은 규모의 시험 발현을 위해, 30 ㎖의 0.5×106 HEK293F 세포/㎖를 형질감염 1일 전에 접종하였다. 다음 날, 플라스미드 DNA(배양액 부피 1 ㎖ 당 1 ㎍ DNA)를 1.2 ㎖의 옵티-멤(Opti-MEM: 등록상표) I 환원 혈청 배지(Reduced Serum Medium)(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)와 혼합한 후, 40 ㎕의 293펙틴(293Fectin: 상표명) 형질감염 시약(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 실온에서 항온처리하고 세포에 적가하였다. 형질감염 1일 후 각각의 플라스크에 300 ㎕의 L-글루타민[200 mM, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 독일 스타인하임 소재] 및 L-아스파라긴, 아미노산, 미량 원소, 암모늄-Fe(III) 시트레이트, 에탄올아민, 미량 원소, D-글루코스, 프리스타일 배지(RPMI 부재)가 함유된 600 ㎕의 피드(feed)7을 공급하였다. 형질감염 3일 후 배지중의 세포 농도, 생존능력 및 글루코스 농도를 자동화된 세포 생존능력 분석기[비-셀(Vi-CELL: 상표명) XR, 베크만 쿨터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 풀러톤 소재] 및 글루코스 계량기[아큐-첵(Accu-CHEK: 등록상표) 센서 컴포트(Sensor comfort), 로슈 디애그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일 만하임 소재]에 의해 결정하였다. 또한 각각의 플라스크에 300 ㎕의 L-글루타민, 300 ㎕의 비필수 아미노산 용액[팬(PAN: 상표명), 바이오텍(Biotech), 독일 아이덴바흐 소재], 300 ㎕ 피루브산 나트륨[100 mM, 깁코(Gibco), 인비트로겐], 1.2 ㎖의 피드7 및 5 g/ℓ의 글루코스(D-(+)-글루코스 용액 45%, 시그마)를 공급하였다. 최종적으로, 형질감염 6일 후 항체를 3500 rpm으로 X3R 멀티퓨즈(Multifuge)[헤라에우스(Heraeus), 영국 버킹엄셔 소재]에서 15분 동안 주변 온도에서 원심분리에 의해 수거하고, 상청액을 스테리플립(Steriflip) 필터 유닛[0.22 mm 밀리포어 익스프레스 플러스 페스(Millipore Express PLUS PES) 막, 밀리포어, 매사추세츠주 베드포드 소재]을 통해 멸균 여과하고, 추가로 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 5 ℓ까지의 큰 규모의 형질감염을 선형으로 환산하였다.
이중특이성 항체 및 대조 항체의 정제
단백질 A-세파로스(Protein A-Sepharose: 상표명)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)를 사용하는 친화도 크로마토그래피 및 수퍼덱스200 크기 배제 크로마토그래피에 의해 이중특이성 항체를 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간단히, 멸균 여과된 세포 배양 상청액을 PBS 완충액(10 mM Na2HP04, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)으로 평형화된 하이트랩 단백질 A(HiTrap ProteinA) HP(5 ㎖) 칼럼 상에 적용하였다. 결합되지 않은 단백질을 평형 완충액으로 세척하였다. 항체 및 항체 변이체를 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 2.8)으로 용출하고, 단백질 포함 분별물을 0.1 ㎖의 1 M 트리스(Tris)(pH 8.5)로 중화시켰다. 용출된 단백질 분별물을 모으고, 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심분리 필터 장치(MWCO: 30K, 밀리포어)에 의해 3 ㎖의 부피로 농축시키고, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0)로 평형화된 수퍼덱스200 하이로드(HiLoad) 120 ㎖ 16/60 겔 여과 칼럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 상에 적재하였다. 5% 미만의 고분자량 응집물을 갖는 정제된 이중특이성 항체 및 대조 항체가 함유된 분별물을 모으고 1.0 mg/㎖ 분취량으로서 -80℃에서 저장하였다.
단백질 정량화
예비-충전된 포로스(Poros: 등록상표) A 단백질 A 칼럼[어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재]이 구비된 자동화된 얼티메이트(Ultimate) 3000 시스템[디오넥스(Dionex), 독일 이드스타인 소재]을 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 단백질을 정량화하였다. 모든 샘플을 완충액 A(0.2 M Na2HP04·[2H20], pH 7.4)에 적재하고 완충액 B(0.1 M 시트르산, 0.2 M NaCl, pH 2.5)으로 용출하였다. 단백질 농도를 결정하기 위해, 1.62의 흡광 계수를 모든 샘플에 대해 사용하였다.
정제된 단백질의 분석
아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 결정하였다. 이중특이성 항체 및 대조 항체의 순도 및 분자량을 SDS-PAGE에 의해 환원제(5 mM 1,4-디티오트레이톨)의 존재 및 부재하에 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하여 분석하였다. 누파게(NuPAGE: 등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐, 미국 소재)을 제조업체의 지시에 따라 사용하였다(4 내지 20% 트리스-글리신 겔). 이중특이성 항체 및 대조 항체 샘플의 응집물 함량을 200 mM KH2P04, 250 mM KCl(pH 7.0) 이동 완충액 중에서 25℃에서 수퍼덱스 200 분석용 크기-배제 칼럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)을 사용하여 고-성능 SEC에 의해 분석하였다. 25 ㎍의 단백질을 칼럼 상에서 0.5 ㎖/분의 유속으로 주입하고 50분에 걸쳐 등용매 용출하였다. N-글리칸을 펩타이드-N-글리코시다아제 F[로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals)]로 효소적으로 처리하여 제거한 후, 환원된 이중특이성 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 주쇄의 무결성을 나노일렉트로(NanoElectro) 분무 Q-TOF 질량 분석법에 의해 입증하였다.
분석용 HPLC
TSK-GEL G3000SW 겔 여과 칼럼[7.5 mm ID×30 cm, 토소하스 코포레이션(TosoHaas Corp.), 미국 펜실바니아주 몽고메리빌 소재]을 갖는 아질런트(Agilent) HPLC 1100[아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재]을 사용하여 항체를 분석하였다. 18 ㎕의 용출된 단백질을 완충액 A(300 mM NaCl중 0.05 M K2HPO4/KH2PO4, pH 7.5) 중에서 칼럼 상에 적재하고 크기에 기초하여 분리하였다.
환원 및 비-환원 SDS-PAGE
7 ㎕의 용출된 단백질을 2×샘플 완충액(누파게(등록상표) LDS 샘플 완충액, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)과 혼합하고 또 다른 7 ㎕를 10% 환원제(누파게(등록상표) 샘플 환원제, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)가 함유된 2×샘플 완충액과 혼합하였다. 샘플을 70℃로 10분 동안 가열하고 블록성형된(pre-cast) 누파게(등록상표) 4-12% 비스트리스 겔(BisTris Gel)(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 상으로 적재하였다. 겔을 45분 동안 200V 및 125 mA에서 운행시켰다. 이후 겔을 밀리포어 워터로 3회 세척하고 심플리블루(SimplyBlue: 상표명) 세이프스테인(SafeStain)(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)으로 염색하였다. 겔을 밀리포어 워터에서 하룻밤 탈색시켰다. 도 1 a) 내지 d)는 2+2 IgG-scFv 형식의 트라스투추맙 및 페르투추맙 이중특이성 항체의 상이한 변이체를 개략적으로 도시한다. 모든 이중특이성 항체는 각각의 항원 결합 부위에 대해 2가이고 ErbB2/HER2 수용체에서 2개의 상이한 파라토프(paratope)에 결합한다(항원 1 = 트라스투추맙 특이성; 항원 2 = 페르투추맙 특이성). 본원에 기재된 2+2 IgG-scFv 형식의 모든 이중특이성 항체는 비-골격구조 그라프팅되고, 비-CDR 최적화되며, 당조작되지 않고 Fc 부분에 돌연변이를 전혀 함유하지 않는다.
도 2 내지 4는 2+2 IgG-scFv 형식의 트라스투추맙 및 페르투추맙 이중특이성 항체의 변이체에 대한 예시적인 크기-배제 정제 그래프, SDS-PAGE 분석 및 분석용 HPLC를 보여준다. TvAB17, TvAB13 및 변이체 헤르셉틴-scFv_A 내지 E에 대한 데이터는 제시되지 않고; 2+2 IgG-scFv 형식의 트라스투추맙 및 페르투추맙 이중특이성 항체의 모든 변이체를 동일한 품질로 생산하였다.
[표 1a]
2+2 IgG-scFv 형식의 트라스투추맙 및 페르투추맙 이중특이성 항체의 서열
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
[표 1b]
응집 수준을 감소시키기 위해 scFv 부분에서의 디설파이드 결합을 안정화시킨 TvAB12_2431_트라스투추맙HCscFv옴니타르그(Omnitarg)(HC_LC)의 변이체
Figure pct00007
실시예 3: 2+2 IgG-scFv 형식의 트라스투추맙 및 페르투추맙 이중특이성 항체에 의한 증식 저해 검정
세포주
MDA-MB 175 VII 세포를 10% 태내 소 혈청 및 2 ㎖의 L-글루타민이 보충된 DMEM/F12 배지(깁코)에 유지시켰다. 세포주의 증식은 표준 세포 배양 프로토콜을 따랐다.
증식을 저해하는 이중특이성 항체의 능력을 세포주 MDA-MB-175 VII에서 평가하였다. MDA-MB-175 VII를 10% 태내 소 혈청 및 2 ㎖의 L-글루타민이 보충된 DMEM/F12 배지(깁코)에 배양하였다. 대수 증식기의 세포를 떼어내고, 계수하고, 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 100 ㎕의 배지에 2×10e4 세포를 접종하였다. 세포를 항온처리기에서 하룻밤 유지시키고, 다음 날 배지에 희석된 개개의 항체 100 ㎕를 세포에 일련의 희석 형태로 첨가하였다. 6일의 총 항온처리 시간 이후, 세포 성장을 알라마블루(인비트로겐) 검정에서 평가하였다. 제조업체의 권고에 따라 검정을 수행하였다.
[표 2]
증식 검정에서 선택된 이중특이성 항체의 효능
Figure pct00008
실시예 4: 헤르셉타르그 안정화
중쇄의 위치 98에서의 아스파테이트 이성화 부위 및 경쇄의 위치 30에서의 아스파라긴 탈아미드화 부위는 트라스투추맙의 안정성 돌연변이다발점이다. 이들 2개의 위치는 항체의 항원 결합 능력의 안정성 및 무결성에 영향을 준다. 석신산 나트륨 또는 히스티딘 완충액을 사용하여 동결건조된 제형을 도입함으로써 이러한 문제점을 해결하였다. 안정성 및 저장 반감기를 증가시키기 위해 본 발명자들은 더 높은 고유 안정성을 가져야 하는 아미노산 또는 아미노산 연장부에 의해 불안정성의 공지된 근원을 대체하고자 하였다. 본 발명자들은 이를 위해 중쇄에서 Asp98의 Glu에 의한 대체 및 경쇄에서 Asn30의 Ser에 의한 대체, 또한 경쇄에서 Thr31의 Val에 의한 대체를 시험하였다. 이들 돌연변이를 D98E, N30S, 및 T31V로 약칭하였다. T31V는 N30의 탈아미드화에 직접적으로 영향을 주지 않지만, 아스파라긴의 C-말단부 상에 인접한 잔기가 폴리펩타이드 쇄의 안정성 특성에 영향을 주는 것으로 추정되었다.
항체 샘플을 1, 2, 또는 3 개월의 기간에 걸쳐 40℃하에 다음의 3가지 완충액중 하나에서 항온처리하였다: 40 mM 히스티딘, 150 mM NaCl(pH 5.0), 40 mM 히스티딘, 150 mM NaCl(pH 6.0), 또는 40 mM 히스티딘, 150 mM NaCl(pH 7.4). 이러한 기간 동안 단백질 농도는 항상 1 mg/㎖였다. 지시된 시점 이후, 샘플을 채취하고 액체 질소에서 충격 동결시키고(shock frozen), 이어서 추가로 분석할 때까지 -80℃에서 유지시켰다. 이러한 분석을 프로테온(ProteOn) XPR36 기기[바이오래드(BioRad)] 상에서 실행하였다. 각각 대략 700 RU의 Her2를 아민 커플링에 의해 GLM 칩의 2개 채널 상에 고정화시켰다(수직 배향).
트라스투추맙 변이체를 100 ㎕/분으로 수평 배향으로 주입함으로써 6개의 상이한 분석물 농도(100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 nM)에서 2중으로 측정하였다. 회합 속도를 180초 동안 기록하였고, 해리 속도를 600초 동안 기록하였다. 1O mM 글리신(pH 1.5) 및 50 mM NaOH의 2가지 펄스에 의해 60초 동안 150 ㎕/분으로 재생을 수행하였다(수평 배향). 총 4가지 상이한 트라스투추맙 변이체를 측정하였다. 제1 실험(표 3 및 4)에서, 단지 개질되지 않은 트라스투추맙 및 변이체 602(중쇄의 D98E 및 경쇄의 T31V)를 시험하였다. 제2 실험에서 개질되지 않은 트라스투추맙, 변이체 602(중쇄의 D98E 및 경쇄의 T31V) 및 변이체 VH:D98E/VL:N30S VH:D98E/VL: N30T를 시험하였다(표 5, 6, 7).
결과:
모든 변이체는 재조합 Her2 항원에 대하여 모 트라스투추맙 분자와 동일한 친화도를 나타낸다. 40℃에서 pH 5 또는 pH 6에 노출 후, 트라스투추맙은 친화도를 약 5배로 손실하였는데, 이는 주로 해리 속도를 증가시키고 회합 속도를 변화시키지 않고 유지시킴으로써 이루어졌다. 변이체 602는 pH 스트레스 이전 및 이후에 거의 구별되지 않은 친화도를 나타내었다. 변이체 N30S는 모 트라스투추맙에 비해 초기보다 더 높은 친화도를 가졌고, 이는 스트레스 조건 동안 거의 일정하게 유지되었다. N30S, N30T, 또는 T31V(VL)를 갖는 변이체 D98E(VH)를 추가의 실험에서 사용하였다. 결과는 도 5 및 6 및 하기 표에 제시된다.
[표 3]
40 mM 히스티딘, 150 mM NaCl(pH 5.0) 완충액에서 40℃하에 1, 2 또는 3 개월 동안 샘플을 항온처리한 후 SPR 방법(프로테온 인스트루멘트)에 의해 결정된 트라스투추맙 변이체의 동력학적 친화도 매개변수
Figure pct00009
각각의 측정을 2중으로 실행하였고, 실험값 둘 다 제시된다. 재합성된 트라스투추맙(wt)을 시험하였고 각각 중쇄 및 경쇄에서 D98E T31V 변이체(클론 602로 지칭됨)와 비교하였다.
[표 4]
표 3과 유사한 트라스투추맙 변이체의 동력학적 친화도 매개변수
Figure pct00010
여기서 샘플을 40 mM 히스티딘, 150 mM NaCl(pH 6.0) 완충액에서 40℃하에 이전과 동일한 시간 간격으로 샘플을 항온처리하였다.
[표 5]
표 3과 유사한 트라스투추맙 변이체의 동력학적 친화도 매개변수
Figure pct00011
여기서 샘플을 40 mM 히스티딘, 150 mM NaCl(pH 5.0) 완충액에서 40℃하에 이전과 동일한 시간 간격으로 샘플을 항온처리하였다. 포함된 샘플은 재합성된 트라스투추맙(wt), 각각 중쇄 및 경쇄에서의 D98E T31V 변이체(클론 602로 지칭됨. 이는 HEK 대신 CHO에서 생산됨)이다. 또한 경쇄 변이체 N30S, 및 N30T(둘 다 D98E 중쇄 변이체를 가짐)이다.
* 느린 해리 속도에 기인하여, 해리 속도 및 해리 상수는 높은 불확실성을 갖는다.
[표 6]
표 3과 유사한 트라스투추맙 변이체의 동력학적 친화도 매개변수
Figure pct00012
여기서 샘플을 40 mM 히스티딘, 150 mM NaCl(pH 6.0) 완충액에서 40℃하에 이전과 동일한 시간 간격으로 샘플을 항온처리하였다. 포함된 샘플은 재합성된 트라스투추맙(wt), 각각 중쇄 및 경쇄에서의 D98E T31V 변이체(클론 602로 지칭됨. 이는 HEK 대신 CHO에서 생산됨)이다. 또한 경쇄 변이체 N30S, 및 N30T(둘 다 D98E 중쇄 변이체를 가짐)이다.
* 느린 해리 속도에 기인하여, 해리 속도 및 해리 상수는 높은 불확실성을 갖는다.
[표 7]
표 3과 유사한 트라스투추맙 변이체의 동력학적 친화도 매개변수
Figure pct00013
여기서 샘플을 40 mM 히스티딘, 150 mM NaCl(pH 7.4) 완충액에서 40℃하에 이전과 동일한 시간 간격으로 샘플을 항온처리하였다. 포함된 샘플은 재합성된 트라스투추맙(wt), 각각 중쇄 및 경쇄에서의 D98E T31V 변이체(클론 602로 지칭됨. 이는 HEK 대신 CHO에서 생산됨)이다. 또한 경쇄 변이체 N30S, 및 N30T(둘 다 D98E 중쇄 변이체를 가짐)이다.
* 느린 해리 속도에 기인하여, 해리 속도 및 해리 상수는 높은 불확실성을 갖는다.
실시예 5: 스트레스 이후 트라스투추맙 및 트라스투추맙 안정화 변이체의 KPL-4 세포로의 결합
결합
KPL-4 세포를 수거하고 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 0.2 미오(Mio) 세포를 96 웰 환저 플레이트로 접종하였다. 플레이트를 400 g에서 3분 동안 원심분리시켜 세포를 펠릿화하였다. 상청액을 제거하고 세포를 40 ㎕의 희석된 항체에 재현탁시켰다. 플레이트를 30분 동안 4℃에서 항온처리하여 항체의 결합을 허용하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해, 세포를 다시 원심분리하고 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 항체를 검출하기 위해 세포를 12 ㎕의 희석된 2차 염소 항-인간 Fc 특이적 FITC-표지된 2차 항체[잭슨 이뮤노리써치(Jackson ImmunoResearch) # 109-096-098]에 재현탁시키고 30분 동안 4℃에서 다시 항온처리하였다. 이후 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 200 ㎕의 FACS 완충액에 재현탁시키고, 형광도를 BD 칸토(Canto)II로 측정하였다.
ADCC
표적 세포를 수거하고, 세척하고, 칼세인(인비트로겐)으로 염색하고, AIM V(등록상표) 배지[라이프 테크놀로지스(Life Technologies)]에 재현탁시키고, 3×104 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 개개의 항체 희석물을 세포에 3중으로 첨가하고, 10분 동안 항온처리한 후, 효과기 세포(말초 혈액 단핵 효과기 세포[PBMC: peripheral blood mononuclear effector])를 첨가하였다. 이어서 효과기(E) 및 표적(T) 세포를 지시된 시간 동안 37℃에서 지시된 E:T 비율로 항온처리하였다(모든 샘플에 대해 3중으로). 항온처리 후, 세포를 PBS로 1회 세척한 다음 보레이트 완충액으로 용해시켰다. 칼세인 보유를 왈락 빅터(Wallac Victor)3 1420 멀티라벨 계수기(Multilabel Counter)에서 측정하였다. ADCC를 하기 수학식 1에 의해 계산하였다:
[수학식 1]
ADCC 백분율 = [(샘플 방출-자발적 방출)/(최대 방출-자발적 방출)]×100
항체 없이 효과기 세포와 함께 항온처리된 표적 세포에 상응하는 자발적 방출은 0% 세포독성으로서 정의되었고, 최대 방출[1% 트리톤(Triton) X-100으로 용해된 표적 세포]은 100% 세포독성으로서 정의되었다. 각각의 3회 실험에 대한 ADCC의 평균 백분율 및 표준 편차를 계산하였다.
결과는 도 7 내지 9에 제시된다.
실시예 6: 헤르셉타르그 크로스맙의 생성 및 더 적은 짝짓기 오류를 달성하기 위한 신규한 LC06 기제 골격구조 상에서의 골격구조 그라프팅
유전자 합성
원하는 유전자 분절을 진아트 아게(독일 레겐스부르그 소재)에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 생성물로부터 자동화된 유전자 합성에 의해 제조하였다. scFv 항체 단편의 C-말단 결합을 갖는 중쇄 또는 경쇄, "S354C 및 T366W 돌연변이를 전달하는 "노브-인투-홀" 항체 중쇄, 및 개질되지 않은 VH 도메인, 교차된 C 카파 도메인 또는 scFab 항체 단편과 함께 CH3 도메인에 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 전달하는 "노브-인투-홀" 중쇄, 뿐만 아니라 개질되지 않은 항체 경쇄 또는 CH1 도메인 교환된 경쇄를 인코딩하는 유전자 분절을 단일 제한 엔도누클레아제 분할 부위(BamHI-XbaI, BamHI-XmnI 또는 BamHI-KpnI)에 의해 플랭크시키고, pGA18(ampR) 플라스미드내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고, 농도를 UV 분광법에 의해 결정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 모든 구축물을 리더 펩타이드(MGWSCIILFLVATATGVHS)(이는 진핵 세포에서 분비를 위한 단백질을 표적화함)를 코딩하는 5'-단부 DNA 서열을 갖도록 고안하였다.
발현 플라스미드의 구축
발현 플라스미드를 인코딩하는 모든 "노브-인투-홀" 중쇄 뿐만 아니라 항체 경쇄의 구축을 위해 사용되는 발현 벡터는 하기 구성요소를 포함한다:
- 선택 마커로서의 하이그로마이신 내성 유전자,
- 엡스타인-바르 바이러스(EBV)의 복사 기원, oriP ,
- 에스케리키아 콜라이에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원
- 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자,
- 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)로부터의 인간 급초기 인헨서 및 프로모터,
- 인간 1-면역글로불린 아데닐산 중합반응("폴리 A") 신호 서열, 및
- 특유의 BamHI 및 XbaI 제한 부위.
scFv 항체 단편의 C-말단 결합을 갖는 중쇄 또는 경쇄, 개질되지 않은 VH 도메인, 교차된 C 카파 도메인 또는 scFab 단편을 갖는 "노브-인투-홀" 중쇄 뿐만 아니라, 개질되지 않은 경쇄 또는 CH1 도메인 교환된 경쇄를 포함하는 면역글로불린 유전자를 유전자 합성에 의해 제조하고 pGA18(ampR) 플라스미드내로 기재된 바와 같이 클로닝하였다. 합성된 DNA 분절 및 발현 벡터를 전달하는 pG18(ampR) 플라스미드를 BamHI 및 XbaI, BamHI 및 XmnI 또는 BamHI 및 KpnI 제한 효소(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스)로 분해하고 아가로스 겔 전기영동시켰다. 이어서 DNA 분절을 인코딩하는 scFv 항체 단편의 C-말단 결합을 갖는 정제된 중쇄 또는 경쇄, 개질되지 않은 또는 VH 도메인을 갖는 "노브-인투-홀" 중쇄 및 개질되지 않은 또는 도메인 교환된 경쇄를 단리된 발현 벡터 BamHI/XbaI, BamHI/XmnI 또는 BamHI/KpnI 단편에 결찰시켜 최종 발현 벡터를 생성하였다. 최종 발현 벡터를 에스케리키아 콜라이 세포내로 형질전환시키고, 발현 플라스미드 DNA를 단리하고(미니프렙), 제한 효소 분석 및 DNA 서열분석하였다. 정확한 클론을 150 ㎖의 LB-Amp 배지에서 성장시키고, 다시 플라스미드 DNA를 단리하고(맥시프렙) 서열 무결성을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
HEK293 세포에서 이중특이성 항체의 일과성 발현
프리스타일(상표명) 293 발현 시스템을 제조업체의 지시(인비트로겐, USA 소재)에 따라 사용하여 인간 배아 신장 293-F 세포의 일과성 형질감염에 의해 재조합 이중특이성 항체를 발현시켰다. 간단히 현탁액 프리스타일(상표명) 293-F 세포를 프리스타일(상표명) 293 발현 배지중에 37℃/8% C02 하에 배양하고 형질감염 1일 전에 세포를 신선한 배지에서 1×lO6의 생존가능한 세포/㎖의 밀도로 접종하였다. 형질감염을 위해, DNA를 10 ㎖의 둘베코(Dulbecco)의 PBS(PAA, 오스트리아) 중에서 162.5 ㎕의 293-프리(상표명) 형질감염 시약[메르크(Merck), USA 소재] 및 scFab 인코딩 DNA의 N-말단 결합을 갖는 125 ㎍의 중쇄를 1:1의 플라스미드 비로 사용하여 DNA를 제조하였고, 여기서 250 ㎖의 최종 형질감염 부피중 1:1:1 몰 비로 "노브-인투-홀" 중쇄 1 및 2 및 경쇄 플라스미드 DNA를 갖는다. 크로스맙의 형질감염을 위해, 1:1:1:1, 1:1:1:2, 1:1:1:4, 1:1:1:8의 "노브-인투-홀" 중쇄 1:개질되지 않은 경쇄:C 카파 도메인 교환된 "노브-인투-홀" 중쇄 2:CH1 도메인 교환된 경쇄의 플라스미드 비가 제조되었다. CH1-VL 경쇄 플라스미드 비를 l×, 2×, 4× 및 8×의 몰비로 사용하여, CE-SDS 및 Q-TOF 분광법의 조합에 의한 쇄 짝짓기의 최적화를 평가하였다. 형질감염 7일 후 항체 함유 세포 배양 상청액을 14000 g에서 30분 동안 원심분리에 의해 수거하고, 멸균 필터(0.22 ㎛)를 통해 여과하였다. 상청액을 정제할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 생성된 항체의 서열은 아래의 표 8에 제시된다.
이중특이성 <Her2GlyMab> 항체의 당조작된 유도체의 제조
인산 칼슘-형질감염 접근법을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 공동-형질감염시킴으로써 이중특이성 <Her2GlyMab> 항체의 당조작된 유도체를 생산하였다. 대수 증식하는 HEK293-EBNA 세포를 인산 칼슘 방법에 의해 형질감염시켰다. 당조작된 항체를 생산하기 위해, 각각 축합 GnTIII 폴리펩타이드 발현을 위한 플라스미드 및 만노시다아제 II 발현을 위한 제2 플라스미드에 의해 세포를 공동-형질감염시켰다. 이중특이성 항체의 플라스미드를 상기 재료 및 방법 섹션에서와 같이 첨가하였다. 10% FCS가 보충된 DMEM 배양 배지를 사용하여 T 플라스크에서 접착성 단층 배양액으로서 세포를 성장시켰고, 이들이 50 내지 80% 융합되었을 때 형질감염시켰다. T75 플라스크의 형질감염을 위해, 7.5(내지 8) 밀리온의 세포를 형질감염 24 시간 전에 FCS(10% V/최종 V에서)가 보충된 약 14 ㎖의 DMEM 배양 배지에 접종하고(결국 250 ㎍/㎖의 네오마이신), 세포를 37℃에서 5% C02의 분위기를 갖는 항온처리기에 하룻밤 놓아 두었다. 형질감염되는 각각의 T75 플라스크를 위해, 47 ㎍의 총 플라스미드 벡터 DNA, 235 ㎕의 1 M CaCl2 용액을 혼합하고 469 ㎕의 최종 부피가 되도록 물을 첨가함으로써 DNA, CaCl2 및 물의 용액을 제조하였다. 이 용액에, 469 ㎕의 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HP04 용액(pH 7.05)을 첨가하고, 10초 동안 즉시 혼합하고, 실온에서 20초 동안 정치시켰다. 현탁액을 2% FCS가 보충된 약 12 ㎖의 DMEM으로 희석하고, 기존의 배지 대신 T75에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% C02에서 약 17 내지 20 시간 동안 항온처리한 다음, 배지를 약 12 ㎖의 DMEM(10% FCS)로 대체하였다. 조건화된 배양 배지를 형질감염 5 내지 7일 후 수거하고 5분 동안 210 내지 300*g에서 원심분리하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과하고(또는 다르게는 5분 동안 1200 rpm에서 원심분리한 후, 10분 동안 4000 rpm에서 제2 원심분리하고), 4℃에서 유지시켰다.
당조작된 항체를 정제하고, 당조작되지 않은 항체에 대해 상기 기재된 바와 같이 제형화하였다. 항체의 Fc 영역에 결합된 올리고당을 아래에 기재된 바와 같이 분석하여 푸코스의 양을 결정하였다.
골격구조 그라프팅
근거: 트라스투추맙 및 페르투추맙의 유사한 골격구조는 경쇄의 짝짓기 오류를 허용한다: 트라스투추맙 및 페르투추맙 둘 다는 VHIII VLkI 골격구조를 갖고 이에 따라 양쪽 중쇄에 대한 경쇄 계면 친화도는 동일하다.
크로스맙 헤르셉타르그 이중특이성 항체에서 경쇄의 짝짓기 오류를 피하기 위해, "크로스맙XPer Her2GlyMab"의 트라스투추맙 골격구조를 비-관련 항체 LC06의 골격구조와 교환시켰다. 트라스투추맙은 생식계열 hVH3_66 및 hVK1D_39에 관련된 반면, 항체 LC06은 각각 생식계열 hVbase_VH1_1 생식계열 및 hVL_3에 상응한다. 페르투추맙은 hVH3_23 및 hVK1D_13에 관련되고, 트라스투추맙과 비교하여 매우 유사한 골격구조 시스템을 보여준다.
LC06의 생식계열 억셉터 골격구조는 트라스투추맙 카파 경쇄와 비교하여 트라스투추맙 골격구조, 특히, LC06 람다 경쇄와 상이하다. 트라스투추맙의 항체 Fab 결정 구조는 적층되고, 골격구조의 화합성을 구조적으로 평가하였다. 트라스투추맙 경쇄의 CDRI, II 및 III을 LC06의 새로운 람다 골격구조 상으로 그라프팅하였다. 포함된 돌연변이는 D98E 및 N30S였고, N30S는 N30S 개질을 갖는 Her2 세포외 도메인에 대한 친화도의 증가로 인해 T31V에 우호적으로 사용되었다. CDR 그라프팅에 의해 초래되는 Kd의 임의의 감소는 N30S 돌연변이의 사용으로 보상될 수 있는 것으로 사료되었다. 억셉터 골격구조에 일부 수용 공간이 이들의 생물학적 활성 입체배좌로 CDR을 취하기 위해 필요하고; 예를 들면 경쇄의 카밧 위치 71에서 A(LC06 람다)를 F(트라스투추맙 카파)로 복귀 돌연변이시켰다. 페르투추맙의 기원적 VHIII - VLkI(카파 I 계열) 골격구조를 유지시켰다. 생성된 이중특이성 항체는 "크로스맙-CDRG Her2GlyMab"으로 표시되고, 아래의 표 8에 제시된 서열을 갖는다.
[표 8]
헤르셉타르그 크로스맙 이중특이성 항체의 서열
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
이중특이성 항체의 정제
맙셀렉트슈어-세파로즈(MabSelectSure-Sepharose: 상표명)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 및 수퍼덱스 200 크기 배제(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피를 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 이중특이성 항체를 정제하였다. 간단히, 멸균 여과된 세포 배양 상청액을 PBS 완충액(10 mM Na2HP04, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)으로 평형화된 맙셀렉트슈어 수지 상에서 포획하고, 평형 완충액으로 세척하고, 25 mM 시트르산 나트륨으로 pH 3.0에서 용출하였다. 용출된 단백질 분별물을 모으고, 2 M 트리스(pH 9.0)로 중화시키고, 추가로 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0)로 평형화된 수퍼덱스 200 26/60 GL(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 칼럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 분별물을 CE-SDS[캘리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Science), USA 소재]로 분석하고, 분별물이 함유된 이중특이성 항체를 모으고, -80℃에서 저장하였다.
정제된 단백질의 분석
아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 광학 밀도(OD)를 280 nm에서 측정함으로써 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 결정하였다. 미소유체 랩칩(Labchip) 기술(캘리퍼 라이프 사이언스, USA 소재)을 사용하여 CE-SDS에 의해 이중특이성 항체 및 대조 항체의 순도, 항체 무결성 및 분자량을 분석하였다. CE-SDS 분석을 위해 HT 단백질 발현 시약 키트를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 5 ㎕의 단백질 용액을 제조하고, 랩칩 GXII 시스템 상에서 HT 단백질 발현 칩을 사용하여 분석하였다. 랩칩 GX 소프트웨어 버전 3.0.618.0을 사용하여 데이터를 분석하였다. 200 mM KH2P04, 250 mM KCl(pH 7.0) 이동 완충액 중에서 25℃ 하에 수퍼덱스 200 분석용 크기-배제 칼럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)을 사용하여 고성능 SEC에 의해 이중특이성 항체 및 대조 항체 샘플의 응집물 함량을 분석하였다. 25 ㎍의 단백질을 0.5 ㎖/분의 유속으로 칼럼 상에 주입하고, 50분에 걸쳐 등용매 용출하였다.
질량 분석법
펩타이드-N-글리코시다아제 F(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스)에 의한 효소적 처리에 의해 N-글리칸을 제거한 후 환원된 이중특이성 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 주쇄의 무결성을 나노일렉트로 스프레이(NanoElectro spray) Q-TOF 질량 분석법에 의해 입증하였다. 중쇄 및 경쇄 짝짓기 오류의 양을 또한 정량화하였다.
표면 플라스몬 공명
기기: 비아코어(BIAacore) T100(지이 헬쓰케어)
소프트웨어: 비아코어 T100 컨트롤, 버전 2.02/2.03
비아코어 T100 평가, 버전 2.02/2.03
비아코어 B3000(비아코어)
소프트웨어: 비아코어 B3000 컨트롤, 버전 4.1.2
비아 평가, 버전 4.1.1
검정형식 칩: CM5-칩
<Her2GlyMab>-분자의 동력학적 상수 및 생성된 친화도를 "트라스투추맙"- 및 "페르투추맙"-작용성 둘 다에 대해 각각 측정하였다. 아민 커플링된 모 MAb "트라스투추맙"(FC1/2) 또는 "페르투추맙"(FC3/4)과 Her2의 예비-착화를 통해 이들 두 작용성을 구별하였다. 모 MAb 및 Her2의 착체 형성은 Her2 ECD의 주입 이후 보상되었다.
예비-착화된 모 MAb "트라스투추맙"/Her2의 결과로서, 모든 "트라스투추맙"-결합 부위는 포화되지만, 모든 "페르투추맙"-결합 부위는 이용가능하고 그 반대이다. 최종적으로 분석되는 "<Her2GlyMab>"-분자의 결합을 각각의 주기에 의해 농도를 증가시키면서 주입을 통해 측정하였다. 관찰된 회합 및 해리를 랑뮤 1:1 결합 모델에 의해 계산하였다. 측정 동안 Her2의 해리를 최소화하기 위해, 동력학적 상수를 T = 25℃에서 측정하였다.
포획 분자의 아민 커플링
제조업체의 지시에 따른 유동 세포 1 내지 4 상의 표준 아민 커플링: CM5 칩, T = 25℃, 이동 완충액: HBS-N 완충액, 800 RU를 목표로 하는 EDC/NHS의 혼합물에 의한 활성화; 모 Ab "트라스투추맙" 또는 "페르투추맙"을 커플링 완충액 아세트산 나트륨(pH 4.5, c = 2 내지 3 ㎍/㎖)에 희석시키고; 최종적으로 남은 활성화된 카복실 기를 1 M 에탄올아민의 주입에 의해 차단하였다.
유동 세포 1 및 3(아민 커플링된 모 mAb "트라스투추맙" 또는 "페르투추맙"을 가짐) 상의 칩 표면을 가능한 완충액-효과 또는 비-특이적 결합의 보정을 위해 기준 대조 표면으로서 사용하였다.
25℃에서 <Her2GlyMab> 분자의 동력학적 특징
이동 완충액: PBS
모든 샘플을 이동 완충액 + 1 mg/㎖의 BSA로 희석하였다.
유동 세포 2 및 4 상에서의 HER2 ECD의 포획: c = 100 nM, 유속 5 ㎕/분, 시간 120초.
분석물 샘플: 고전적인 일련의 농도의 <Her2GlyMab>-분자를 5가지 농도(c = 300, 100, 33.33, 11.11 및 3.7 nM)에서 분석하고 50 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 각각의 농도에 대해 1회 2중물로서; 회합 시간: 180초, 해리 시간: 900초.
아민 커플링된 Mab "트라스투추맙"을 위한 10 mM 글라이신(pH 2.5) 및 아민 커플링된 Mab "페르투추맙"을 위한 25 mM NaOH를 사용하여 각각의 주기 이후 최종 재생을 수행하였다: 접촉 시간 각각 60초, 유속 30 ㎕/분.
동력학적 매개변수를 2중 기준(대조 기준: Mab 트라스투추맙 및 페르투추맙 각각에 대한 분석물의 결합; 유동 세포: 1 각각 3회)을 사용하여 계산하였다(블랭크로서 농도 "0"을 사용함). 모델 '랑뮤 결합 1:1, RI (굴절률) = 0'에 의해 계산을 수행하였다.
결과: 이중특이성, 2가 <Her2GlyMab> 항체 분자의 발현 및 정제
상기 재료 및 방법에 기재된 절차에 따라서, 이중특이성, 2가 <Her2GlyMab> 항체 분자 OAscFab1, OAscFab2, OAscFabPer1, OAscFabPer2, 크로스맙-XPer, 크로스맙-XTra 및 크로스맙-CDRG를 발현시키고 정제하였다. 각각의 분자에서, 그 부분의 VH 및 VL은 가변성 경쇄에서의 돌연변이 T31V 또는 N30T 및 중쇄에서의 돌연변이 D98E를 갖는 최적화된 트라스투추맙 서열 및 페르투추맙 모 서열에 각각 기초한다. 항체의 개략적 구조는 도 10에 제시된다. 서열은 상기 표 8에 제시된다.
<Her2GlyMab> 항체 분자 OAscFab1 Her2 GlyMab, OAscFab2 Her2 GlyMab, OAscFabPer1 Her2 GlyMab, OAscFabPer2 Her2 GlyMab(모두 당조작됨, 노브-인투-홀, 트라스투추맙 scFab는 D98E 및 T31V 돌연변이를 함유함), 크로스맙-XPer Her2 GlyMab, 크로스맙-XTra Her2 GlyMab(둘 다 당조작됨, 노브-인투-홀, 트라스투추맙 cross-Fab는 D98E 및 T31V 돌연변이를 함유함), 및 크로스맙-CDRG Her2 GlyMab(당조작됨, 노브-인투-홀, CDR 그라프팅됨, 트라스투추맙 cross-Fab는 D98E 및 N30S 돌연변이를 함유함)의 발현을 웨스턴 블로팅 및 HP-SEC에 의해 확인하였다(도 11). OAscFab1, OAscFab2, OAscFabPer1, OAscFabPer2, 크로스맙-XPer, 크로스맙 XTra 및 크로스맙-CDRG의 정제는 표 9에 제시된 수율을 유도하였다. 모든 OAscFab 구축물은 정제 후 90% 미만의 단량체를 나타내었고, 이들 분자의 감소된 순도는 발현시 플라스미드 비의 최적화에 의해 증가될 수 없었다(데이터는 제시되지 않음). 그러나, 발현시 플라스미드 쇄 비율의 최적화는 하기 기재된 바와 같이 크로스맙 항체의 정제 후 존재하는 단량체 분별물을 증가시키는 것으로 입증되었다.
[표 9]
Her2GlyMab 정제 - 단백질 A 및 HP-SEC를 사용하는 SEC 정제 후의 응집 백분율 및 당조작된 구축물의 UV 분광법 A280에 의해 계산된 개별 단백질 수율에 대한 분석
Figure pct00021
실시예 7: 발현에 사용된 최적 플라스미드 비에서의 이중특이성 2가 <Her2GlyMab> 항체 분자의 발현 및 정제
크로스맙-XTra
상기 재료 및 방법에 기재된 절차에 따라서, 이중특이성, 2가 <Her2GlyMab> 항체 분자 크로스맙-XTra를 1:1:1:1, 1:1:1:2, 1:1:1:4 및 1:1:1:8의 플라스미드 몰비로 발현시키고 정제하였다. 크로스맙-XTra의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 세포 배양 상청액의 단백질 A 정제 이후, 구축물은 1:1:1:1 동몰 플라스미드 비에서 Q-TOF MS에 의해 검출될 경우 대략 148 kDa의 예상 분자량을 갖는 이중특이성 항체 대략 73%; 페르투추맙 및 X트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이룬 2 x 페르투추맙 경쇄를 함유하는 항체 11%; 중쇄 홀-홀 회합의 형성에 의한 온전한 X트라스투추맙 항체(X트라스투추맙으로부터 기원된 중쇄 및 경쇄 둘 다) 9%; 단지 페르투추맙 경쇄와 홀-홀 회합된 X트라스투추맙 중쇄 4%; 및 1 x X트라스투추맙 경쇄 및 1 x 페르투추맙 경쇄와 홀-홀 회합된 X트라스투추맙 중쇄 3%를 나타내었다.
1:1:1:2 플라스미드 비(여기서 교차된 트라스투추맙 경쇄(XHerLC)의 몰 비는 2-배로 표시됨)는 다음을 나타내었다: Q-TOF MS에 의해 검출될 경우 대략 148 kDa의 예상 분자량을 갖는 이중특이성 항체 대략 81%; 페르투추맙 및 X트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이룬 2 x 페르투추맙 경쇄를 함유하는 항체 1%; 중쇄 홀-홀 회합의 형성에 의한 온전한 X트라스투추맙 항체(X트라스투추맙으로부터 기원된 중쇄 및 경쇄 둘 다) 16%; 단지 페르투추맙 경쇄와 홀-홀 회합된 X트라스투추맙 중쇄는 검출되지 않음; 및 1 x X트라스투추맙 경쇄 및 1 x 페르투추맙 경쇄와 홀-홀 회합된 X트라스투추맙 중쇄 1%.
1:1:1:4 플라스미드 비(여기서 교차된 트라스투추맙 경쇄의 몰 비는 4-배로 표시됨)는 다음을 나타내었다: Q-TOF MS에 의해 검출될 경우 대략 148 kDa의 예상 분자량을 갖는 이중특이성 항체 대략 64%; 페르투추맙 및 X트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이룬 2 x 페르투추맙 경쇄는 검출되지 않았으나, 페르투추맙 및 X트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이룬 2 x X트라스투추맙 경쇄 12%가 상기 비율에서 처음으로 검출됨; 중쇄 홀-홀 회합의 형성에 의한 온전한 X트라스투추맙 항체(X트라스투추맙으로부터 기원된 중쇄 및 경쇄 둘 다) 24%; 단지 페르투추맙 경쇄와 홀-홀 회합된 X트라스투추맙 중쇄는 검출되지 않음; 및 1 x X트라스투추맙 경쇄 및 1 x 페르투추맙 경쇄와 홀-홀 회합된 X트라스투추맙 중쇄는 검출되지 않음.
1:1:1:8 플라스미드 비(여기서 교차된 트라스투추맙 경쇄의 몰 비는 8-배로 표시됨)는 다음을 나타내었다: Q-TOF MS에 의해 검출될 경우 대략 148 kDa의 예상 분자량을 갖는 이중특이성 항체 대략 45%; 페르투추맙 및 X트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이룬 2 x 페르투추맙 경쇄는 검출되지 않았으나, 페르투추맙 및 X트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이룬 2 x X트라스투추맙 경쇄 28%가 상기 비율에서 처음으로 검출됨; 중쇄 홀-홀 회합의 형성에 의한 온전한 X트라스투추맙 항체(X트라스투추맙으로부터 기원된 중쇄 및 경쇄 둘 다) 27%; 단지 페르투추맙 경쇄와 홀-홀 회합된 X트라스투추맙 중쇄는 검출되지 않음; 및 1 x X트라스투추맙 경쇄 및 1 x 페르투추맙 경쇄와 홀-홀 회합된 X트라스투추맙 중쇄는 검출되지 않음.
[표 10]
크로스맙-XTra Her2GlyMab - 교차된 트라스투추맙 경쇄(XHerLC)의 최적 플라스미드 적정을 포함하는 Her2GlyMab 항체 구축물의 부산물 프로파일에 대한 Q-TOF 분석 및 정량화(N.D. - 검출되지 않음)
Figure pct00022
크로스맙-XPer
세포 배양 상청액의 단백질 A 정제 이후, 구축물은 1:1:1:1 동몰 플라스미드 비에서 Q-TOF MS에 의해 검출될 경우 대략 148 kDa의 예상 분자량을 갖는 이중특이성 항체 대략 85%; X페르투추맙 및 트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이룬 2 x X페르투추맙 경쇄를 함유하는 항체 2%; 중쇄 홀-홀 회합의 형성에 의한 온전한 트라스투추맙 항체(트라스투추맙으로부터 기원된 중쇄 및 경쇄 둘 다) 1%; 및 X페르투추맙 및 트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이루는 2 x 트라스투추맙 경쇄 12%를 나타내었다. 추가의 종은 검출되지 않았다.
1:1:1:2 플라스미드 비(여기서 교차된 페르투추맙 경쇄(XPerLC)의 몰 비는 2-배로 표시됨)는 다음을 나타내었다: Q-TOF MS에 의해 검출될 경우 대략 148 kDa의 예상 분자량을 갖는 이중특이성 항체 대략 89%; X페르투추맙 및 트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이룬 2 x X페르투추맙 경쇄를 함유하는 항체 7%; 중쇄 홀-홀 회합의 형성에 의한 온전한 트라스투추맙 항체(트라스투추맙으로부터 기원된 중쇄 및 경쇄 둘 다)는 검출되지 않음; 및 X페르투추맙 및 트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이루는 2 x 트라스투추맙 경쇄 4%.
1:1:1:4 플라스미드 비(여기서 교차된 페르투추맙 경쇄(XPerLC)의 몰 비는 4-배로 표시됨)는 다음을 나타내었다: Q-TOF MS에 의해 검출될 경우 대략 148 kDa의 예상 분자량을 갖는 이중특이성 항체 대략 74%; X페르투추맙 및 트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이룬 2 x X페르투추맙 경쇄를 함유하는 항체 25%; 중쇄 홀-홀 회합의 형성에 의한 온전한 트라스투추맙 항체(트라스투추맙으로부터 기원된 중쇄 및 경쇄 둘 다)는 검출되지 않음; 및 X페르투추맙 및 트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이루는 2 x 트라스투추맙 경쇄 1%.
1:1:1:8 플라스미드 비(여기서 교차된 페르투추맙 경쇄(XPerLC)의 몰 비는 8-배로 표시됨)는 다음을 나타내었다: Q-TOF MS에 의해 검출될 경우 대략 148 kDa의 예상 분자량을 갖는 이중특이성 항체 대략 52%; X페르투추맙 및 트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이룬 2 x X페르투추맙 경쇄를 함유하는 항체 48%; 중쇄 홀-홀 회합의 형성에 의한 온전한 트라스투추맙 항체(트라스투추맙으로부터 기원된 중쇄 및 경쇄 둘 다)는 검출되지 않음; 및 X페르투추맙 및 트라스투추맙 중쇄와 쌍을 이루는 2 x 트라스투추맙 경쇄는 검출되지 않음.
크로스맙-CDRG
세포 배양 상청액의 단백질 A 정제 이후, 구축물은 1:1:1:1 동몰 플라스미드 비에서 Q-TOF MS에 의해 검출될 경우 대략 148 kDa의 예상 분자량을 갖는 이중특이성 항체 대략 95%; 및 X페르투추맙 및 트라스투추맙(HerCDRG) 중쇄와 쌍을 이룬 2 x X페르투추맙 경쇄를 함유하는 항체 5%를 나타내었다. 추가의 종은 검출되지 않았고, 플라스미드 비에 대한 추가의 최적화를 수행하지 않았다. 부산물 프로파일을 비교하기 위해 항체 크로스맙-XHer 및 크로스맙-CDRG 상에서 수행된 MS 스펙트럼은 도 12에서 볼 수 있다.
[표 11]
크로스맙-XPer Her2GlyMab - 교차된 트라스투추맙 경쇄(XPerLC)의 최적화 플라스미드 적정을 비교하는 Her2GlyMab 항체 구축물의 부산물 프로파일에 대한 Q-TOF 분석 및 정량화(N.D. - 검출되지 않음).
Figure pct00023
[표 12]
크로스맙-CDRG Her2GlyMab - 짝짓기 오류된 항체 중쇄 및 경쇄의 존재를 검출하는 Her2GlyMab 항체 구축물의 부산물 프로파일에 대한 Q-TOF 분석 및 정량화(N.D. - 검출되지 않음)
Figure pct00024
실시예 8: 양쪽 항원에 대한 이중특이성 항체의 동시적 결합
이중특이성 항체의 결합을 상기 기재된 바와 같이 비아코어를 통해 분석하였다. 별도의 검정 형식에서 샘플(크로스맙XPer 뿐만 아니라 OAscFab1 및 OAscFab2에 대해)은 트라스투추맙 뿐만 아니라 페르투추맙 특이성에 대해 작용성인 것으로 입증되었다. 크로스맙XPer는 양성 대조군과 동일한 크기 순서로 동력학적 상수 및 이에 따른 친화도를 나타내었다. 트라스투추맙 매개된 결합에 대한 약간 감소된 ka-속도 상수를 제외하고, OAscFab1 및 OAscFab2는 양성 대조군, 즉 모 Mab과 동일한 크기 순서로 동력학적 상수 및 이에 따른 친화도를 나타내었다.
CM5-칩 상의 리간드 밀도에 의존적인 양성 대조군의 부분적 2가 결합은 상기 실시예에 묘사된 2가지 실험에서 해리 속도 상수의 변화를 초래할 수 있다.
[표 13]
Her2GlyMab 친화도의 SPR 분석 - CM5-칩을 갖는 비아코어TlOO을 25℃에서 사용하여 항체의 회합 및 해리 속도를 측정함
Figure pct00025
실시예 9: 1+1 헤르셉타르그 크로스맙 및 당조작된 헤르셉타르그 크로스맙의 시험관내 평가
증식 저해 검정
HER2 크로스맙(크로스맙-XTra Her2GlyMab, 서열 번호 119, 120, 121, 122), 트라스투추맙, 페르투추맙 또는 트라스투추맙/페르투추맙의 조합물의 존재하에 5일 동안 항온처리한 후 (A) BT474 및 (B) N87 세포의 대사적 활성 및 증식에 대한 측정을 위해 알라마블루(등록상표)(인비트로겐)를 사용하였다. 염료의 생물환원은 산화된 형태(블루)의 양을 감소시키고, 동시에 형광성 중간체(레드)를 증가시킨다.
표적 세포를 수거하고, 세척하고, RPMI 1640(깁코) + 10% FCS + 1% 글루타맥스(상표명)(깁코)에 재현탁시키고 1×104 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 세포를 3 시간 동안 세포 항온처리기에서 항온처리한 후 각각의 항체 희석물을 첨가하였다. 플레이트를 부드럽게 진탕시키고 5일 동안 세포 항온처리기에서 항온처리하였다.
25 ㎕/웰의 알라마블루를 플레이트에 첨가하고 7 시간 동안 항온처리기에서 항온처리하였다. 흡광도를 584 nm 및 612 nm에서 왈락 빅터3 1420 멀티라벨 계수기로 모니터링하였다. 증식 저해의 백분율을 계산하기 위해, 처리되지 않은 대조 샘플을 검정에 포함시키고 100% 증식으로 정의하였다. 각각의 3회의 실험에 대한 증식 저해의 평균 백분율을 계산하였다. 결과는 도 13에 제시된다.
ADCC 검정
HER2 크로스맙(크로스맙-XTra Her2GlyMab, 서열 번호 119, 120, 121, 122), 트라스투추맙, 페르투추맙 또는 트라스투추맙/페르투추맙의 조합물에 의해 매개된 ADCC를 KPL-4(A), T47D(B) 및 Calu-3(C) 세포 상에서 평가하였다.
표적 세포를 수거하고, 세척하고, AIM V(등록상표) 배지(라이프 테크놀로지스)에 재현탁시키고, 3×104 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 개별 항체 희석물을 3중으로 세포에 첨가하고 10분 동안 항온처리한 후 효과기 세포(말초 혈액 단핵 효과기 세포[PBMC])를 첨가하였다. 이어서 효과기(E) 및 표적(T) 세포를 4 시간 동안 37℃에서 25:1의 E:T 비율로 항온처리하였다(모든 샘플에 대해 3중으로). 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출을 LDH 세포독성 검출 키트[로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)]에 의해 측정하였다. ADCC를 하기 수학식에 의해 계산하였다:
수학식 1
ADCC 백분율 = [(샘플 방출-자발적 방출)/(최대 방출-자발적 방출)]×100
항체 없이 효과기 세포와 함께 항온처리된 표적 세포에 상응하는 자발적 방출은 0% 세포독성으로서 정의되었고, 최대 방출(1% 트리톤 X-100으로 용해된 표적 세포)은 100% 세포독성으로서 정의되었다. 각각의 3회 실험에 대한 ADCC의 평균 백분율 및 표준 편차를 계산하였다. 결과는 도 14에 제시된다.
실시예 10: HER2 크로스맙의 생체내 특징: Calu3 폐암 및 KPL4 유방암 이종이식편에서 종양 성장에 미치는 이중특이성 항체 표적화 HER2의 영향
시험관내 배양된 세포 - Calu3
상기 인간 폐 선암종 암 세포주를 폐암을 앓는 인간 백인 남성으로부터 확립하였다. 세포를 츄가이 파마슈티칼스 캄파니 리미티드(Chugai Pharmaceuticals Co., Ltd.)로부터 수득하고 작업용 세포 은행을 위해 내부적으로 계대배양하였다. 종양 세포를 37℃에서 수-포화된 분위기 중에서 5% C02하에 10% 태내 소 혈청 글루타민[팬 바이오텍(PAN Biotech), 독일 소재]이 보충된 RPMI 배지(팬 바이오텍, 독일 소재)에서 일상적으로 배양하였다. 계대배양을 주당 2회 스플리팅(splitting)하면서 트립신/EDTA 1x(팬)에 의해 수행하였다. 세포 계대배양 P6을 생체내 연구에 사용하였다.
시험관내 배양된 세포 - KPL-4
이러한 인간 유방암 세포주를 염증성 피부 전이를 앓는 유방암 환자의 악성 흉수로부터 확립하였다. 구레바야시(J. Kurebayashi) 교수[가와사키 메디칼 스쿨(Kawasaki Medical School), 일본 구라시키 소재]가 세포를 제공하였다. 37℃에서 수-포화된 분위기 중에서 5% C02하에 10% 태내 소 혈청(팬 바이오텍, 독일 소재) 및 2 mM L-글루타민(팬 바이오텍, 독일 소재)이 보충된 DMEM 배지(팬 바이오텍, 독일 소재)에서 종양 세포를 일상적으로 배양하였다. 계대배양을 주당 2회 스플리팅하면서 트립신/EDTA 1x(팬)에 의해 수행하였다. 세포 계대배양 P6을 생체내 연구에 사용하였다.
동물
암컷 SCID 베이지(C.B.-17) 마우스(10 내지 12 주령; 체중 18 내지 20 g[찰스 리버(CHarles River), 독일 슐츠펠트 소재]) 또는 암컷 BALB/C nu/nu 마우스(8 내지 10 주령; 체중 >20 g[봄홀트가르트(Bomholtgard), 덴마크 소재])를 특정-병원체-부재 조건하에 국제 지침서[GV-솔라스(GV-Solas); 페라사(Felasa); 티에르쉬쥐(TierschG)]에 따라 매일 12 시간씩의 명암 주기로 유지시켰다. 도착 후 동물을 1 주일 동안 동물 시설의 격리실에 가두어 새로운 환경 및 관찰에 익숙해지도록 하였다. 연속적인 건강 모니터링을 규칙적인 근거하에 실행하였다. 다이어트 식품[올트로민(Alltromin)] 및 물(산성화됨, pH 2.5 내지 3)을 자유롭게 제공하였다. 실험 연구를 검토하고, 지방 정부에 의해 승인받았다; 등록 번호: 55.2-1-54-2531.2-3-08 Scid-베이지 정위(orthotop) 설치류 유방암 모델 및 211-2531.2-16/00. 1.2.2 피하 종양 모델.
종양 세포 주사
주사일에, 종양 세포를 배양 플라스크[그라이너 트리플라스크(Greiner Triflask)]로부터 수거하고(트립신-EDTA), 50 ㎖의 배양 배지로 옮기고, 1회 세척하고, PBS에 재현탁시켰다. PBS에 의한 추가의 세척 단계 및 여과[세포 스트레이너(strainer); 팔콘(Falcon) φ 100 ㎛) 후, 최종 세포 역가를 1.5×108/㎖로 조정하였다. 종양 세포 현탁액을 주의깊게 전달 피펫으로 혼합하여 세포 응집을 방지하였다. 폐쇄된 순환 시스템에서 예비항온처리 챔버(chamber)[플렉시글라스(plexiglas)], 개별 마우스 코-마스크(실리콘) 및 비-가연성 또는 폭발성 마취 화합물 이소플루란(Isoflurane)[파마시아-업존(Pharmacia-Upjohn), 독일 소재]에 의해 소동물용 스테펜스(Stephens) 흡인 유닛을 사용하여 마취를 수행하였다. 주사 2일 전, SCID 베이지색 마우스의 외피를 면도하였다. Calu3 세포의 피하 주사를 위해, 마취된 동물의 피부를 해부 겸자로 주의깊게 들어 올리고, 100 ㎕의 세포 현탁액(= 5.0 x 10e6 세포)을 동물의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 세포 현탁액을 1.0 ㎖의 투베르쿨린(tuberculin) 주사기[브라운(Braun), 멜선겐 소재]내로 넓은 주사 바늘(0.45×25 mm)에 의해 충전시켰다. KPL-4 세포(3 x 10e6 세포)를 각각의 마취된 마우스의 오른쪽 서혜부 끝에서 두번째 유선 지방체 내로 20 ㎕의 부피로 정위치로 주사하였다. 정위치 이식을 위해, 하밀톤(Hamilton) 마이크로리터 주사기 및 30Gx1/2" 바늘을 사용하여 유두 아래 피부를 통해 세포 현탁액을 주사하였다.
모니터링
부작용의 임상적 증후의 검출을 위해 동물을 매일 조절하였다. 실험 전체를 통해 모니터링하기 위해, 동물의 체중을 주 2회 기록하고 종양 부피를 주 2회 캘리퍼(caliper)로 측정하였다. 종양 부피를 NCI 프로토콜에 따라 계산하였다(종양 중량 = 1/2ab2, 여기서 "a" 및 "b"는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경임). 종료 기준은 임계 종양 질량(1.7 g까지 또는 φ > 1.5 cm), 기선으로부터 20%를 초과하는 체중 감소, 종양 궤양 또는 동물의 불량한 일반적 증상이었다. 동물에 대한 연구 배제 기준은 상응하는 "티에르베르수취산자이게(Tierversuchsanzeige)"에 기재되고 승인되었다.
동물의 치료
KPL-4의 경우 평균 80 ㎣, Calu3의 경우 평균 100 ㎣으로 마우스를 종양 부피에 대해 무작위화하였다. 마우스를 주 1회 1O ㎖/kg의 부피로 복강내 치료하였다. 복합 치료를 위해 트라스투추맙을 먼저 제공하고 페르투추맙을 24 시간 후 제공하였다. 결과는 표 14 내지 17 및 도 15 내지 18에 제시된다.
[표 14]
BispecHer2_Pz_Calu3_001(도 15)
Figure pct00026
크로스맙_003 non-ge: 당조작되지 않은 크로스맙-XTra Her2GlyMab(서열 번호 119, 120, 121, 122), 음성 대조군: 항-IgE 항체[오말리추맙(Omalizumab)], 헤르셉타르그 2+2 OmniE: 중쇄의 c-말단 상으로 첨가된 트라스투추맙 scFV를 갖는 페르투추맙 항체. 트라스투추맙 scFv는 TvAb12, TvAb20 및 VH 105-VL 43(서열 번호 145, 146) 사이에 안정화 디설파이드 결합을 함유한다: scFv 2+2 HER2 이중특이성 항체, 실시예 2 참조.
[표 15]
BispecHer2_PZ_KPL-4_002(도 16)
Figure pct00027
크로스맙_003 non-ge: 당조작되지 않은 크로스맙-XTra Her2GlyMab(서열 번호 119, 120, 121, 122), 음성 대조군: 항-IgE 항체(오말리추맙), 헤르셉타르그 2+2 OmniE: 중쇄의 c-말단 상으로 첨가된 트라스투추맙 scFV를 갖는 페르투추맙 항체. 트라스투추맙 scFv는 TvAb12, TvAb20 및 VH 105-VL 43(서열 번호 145, 146) 사이에 안정화 디설파이드 결합을 함유한다: scFv 2+2 HER2 이중특이성 항체, 실시예 2 참조.
[표 16]
BispecHer2 _ PZ _ KPL -4_003(도 17)
Figure pct00028
크로스맙_005 당조작되지 않은 크로스맙-XTra Her2GlyMab(서열 번호 119, 120, 121, 122), 음성 대조군: 항-IgE 항체(오말리추맙).
[표 17]
탐구성_ PZ _ KPL -4_009(도 18)
Figure pct00029
음성 대조군: 항-IgE 항체(오말리추맙), TvAb16 및 TvAb20: scFv 2+2 HER2 이중특이성 항체, 실시예 2 참조.
실시예 11: 트라스투추맙 및 페르투추맙을 위한 공통의 경쇄의 생성
유전자 합성
필요할 경우 원하는 유전자 분절을 적절한 주형을 사용하는 PCR에 의해 생성하거나, 진아트 아게(독일 레겐스부르그 소재)에서 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 생성물로부터 자동화된 유전자 합성에 의해 합성하였다. 정확한 유전자 서열이 입수가능하지 않은 경우, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 가장 가까운 동족체로부터의 서열에 기초하여 고안하고, 유전자를 RT-PCR에 의해 적절한 조직으로부터 기원하는 RNA로부터 단리하였다. 단일 제한 엔도누클레아제 분할 부위가 플랭크된 유전자 분절을 표준 클로닝/서열분석 벡터내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고 농도를 UV 분광법으로 결정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 개개의 발현 벡터내로 서브클로닝을 허용하기에 적합한 제한 부위를 갖도록 유전자 분절을 고안하였다. 진핵 세포에서 분비를 위한 단백질을 표적화하는 리더 펩타이드를 코딩하는 5'-단부 DNA 서열을 갖도록 모든 구축물을 고안하였다. 서열 번호 155, 156, 및 157은 예시적인 리더 펩타이드를 제공한다.
항원 발현 벡터의 클로닝
성숙된 티로신 키나아제-유형 세포 표면 수용체 HER2[Her2, 유니프로트(Uniprot): P04626]의 아미노산 1 내지 629를 인코딩하는 DNA 단편을 프레임(frame) 내에서 N-말단 리더 서열이 함유된 포유동물 수여 벡터내로 클로닝하였다. 또한, 구축물은 C-말단 avi-태그를 함유하여, 고정화된-금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)에 의한 정제를 위해 사용되는 His-태그 및 Bir A 비오틴 리가아제(ligase)에 의해 공동-발현 동안 특이적 비오티닐화를 허용하였다(서열 번호 1 및 2).
항원 발현은 일반적으로 MPSV 프로모터에 의해 구동되고 전사는 CDS의 다운스트림에 위치된 합성 폴리A 신호 서열에 의해 종결된다. 발현 카세트에 더하여, 각각의 벡터는 EBV-EBNA 발현 세포주에서 자율적 복제를 위해 EBV oriP 서열을 함유한다.
항원 및 항체의 생산 및 정제
항원 및 항체 둘다는 HEK 293 세포내로 일과성으로 형질감염되고, EBV-유래된 단백질 EBNA를 안정하게 발현하였다. 비오틴 리가아제 Bir A를 인코딩하는 동시적으로 공동-감염된 플라스미드는 avi 태그-특이적 비오티닐화를 생체내에서 허용하였다. 이어서 단백질 A 칼럼을 사용하고, 이후 겔 여과하여 단백질을 정제하였다.
트라스투추맙/페르투추맙 공통 경쇄의 고안
트라스투추맙 및 페르투추맙을 위한 공통의 경쇄(CLC)를 생성하기 위해, 개별 경쇄(LC)를 분석하고 비교하였다. 서열 분석 결과, 가변성 도메인은 둘 다는 동일한 생식계열 서열로부터 기원함을 알 수 있었다. 일반적인 트라스투추맙 LCDR3 및 특정한 경우의 잔기 H91이 Her2 상의 트라스투추맙-특이적 에피토프와 특이적으로 상호작용하므로, 트라스투추맙/페르투추맙 CLC를 생성하기 위한 첫번째 시도는 다음과 같이 실행되었다: 트라스투추맙의 완전한 LCDR3 영역 또는 단지 잔기 H91이 페르투추맙 LC에서의 상응하는 위치를 대체하였다. 결과로서, 페르투추맙-유래된 LCDR1 및 2를 인코딩하지만 트라스투추맙-유래된 LCDR3 아미노산 잔기를 함유하는 하이브리드 LC 구축물이 생성되었다. "페르투추맙(Tras.L3) LC"(서열 번호 25로서 열거된 가변성 도메인의 DNA 서열) 또는 "페르투추맙(Tras.Y91H) LC"(서열 번호 27)로 지칭되는 생성된 CLC를 트라스투추맙 또는 페르투추맙 HC와 공동-발현시켰다. 생성된 4가지 항체[서열 번호 22 및 26으로서 열거된 가변성 도메인의 단백질 서열, "페르투추맙 HC" x "페르투추맙(Tras.L3) LC"; 서열 번호 92 및 26, "트라스투추맙 HC" x "페르투추맙(Tras.L3) LC"; 서열 번호 22 및 28, "페르투추맙 HC" x "페르투추맙(Trast.Y91H) LC"; 서열 번호 92 및 28, "트라스투추맙 HC" x "페르투추맙(Tras.Y91H) LC"]를 포유동물-유래된 세포 배양 상청액으로부터 정제하고 Her2로의 결합을 측정하고 개개의 모 항체(서열 번호 22 및 24, "페르투추맙 HC" x "페르투추맙 LC"; 서열 번호 92 및 82, "트라스투추맙 HC" x "트라스투추맙 LC")와 SPR에 의해 비교하였다.
바이오래드의 프로테온 XPR36 바이오센서를 사용하는 SPR에 의한 친화도-결정
신규 항체 쇄 조합물의 친화도(KD)를 표면 플라스몬 공명에 의해 프로테온 XPR36 기기(바이오래드)를 사용하여 25℃에서 측정하였다. 제1 단계에서, hu IgG(Fc-특이성)를 인식하는 6500 RU의 항-인간 IgG(시그마 I2136, 다중클론성 염소 항체)를 GLM 칩의 모든 6개 채널 상에 아민 커플링에 의해 고정화시켰다(Na아세테이트 pH 4, 30 ㎕/분, 300초)(수직 배향).
각각의 항체를 PBST(10 mM 포스페이트, 150 mM 염화 나트륨 pH 7.4, 0.005% 트윈 20)에 의해 2 ㎍/㎖로 희석시키고, 이어서 60초 동안 30 ㎕/분으로 주사하여 수직 배향으로 약 400 응답 유닛(RU)의 고정화 수준을 달성하였다. Her2의 주입: 원-샷(one-shot) 동력학적 측정을 위해, 주입 방향을 수평 배향으로 변화시키고, 정제된 Her2의 일련의 3배 희석물(300 내지 3.7 nM의 다양한 농도 범위)를 100 ㎕/분에서 별도의 채널 1 내지 5를 따라 동시에 주입하였고, 회합 속도는 180초, 해리 속도는 600초였다. 완충액(PBST)을 6번째 채널을 따라 주입하여 참고용 "인-라인(in-line)" 블랭크를 제공하였다. 1O mM 글리신(pH 1.5) 및 50 mM NaOH의 2개의 펄스에 의해 30초 동안 100 ㎕/분에서 재생을 수행하였다(수평 배향). 프로테온 매니저 v3.1 소프트웨어에서 단순 1-대-1 랑뮤 결합 모델을 사용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 정합시킴으로써 회합 속도 상수(k회합) 및 해리 속도 상수(k해리)를 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)를 k해리/k회합 비로서 계산하였다.
예상된 바와 같이, 두 대조 항체 트라스투추맙 및 페르투추맙은 낮은 나노몰 또는 서브나노몰 범위로 이들의 공지된 친화도를 갖고 Her2를 인식하였다. 그러나, 새롭게 고안된 "페르투추맙(Tras.Y91H) LC"와 조합된 페르투추맙 HC의 친화도는 약간 감소된 반면, 트라스투추맙 HC와 조합된 동일한 경쇄는 어떠한 검출가능한 결합을 생성하지 않았다. 이는 페르투추맙 LC에서의 단일 트라스투추맙-유래된 점 돌연변이(Y91H)가 이러한 쇄 조합에서 Her2로의 결합을 번역하기에 충분하지 않음을 지시한다. 이는 트라스투추맙 HC와 조합될 경우 약한 결합을 생성하지만, 페르투추맙 HC와 공동-발현될 경우 결합이 감소되지만 분명히 가시성인 제2 CLC 변이체 "페르투추맙 LC(Trast. L3)"과 대조적이다. 동력학적 및 열역학적 측정에 대한 요약이 도 19 및 표 18에 제공된다. 이러한 발견에 기초하여, CLC "페르투추맙 LC(Trast. L3)"을, 트라스투추맙 HC와 조합되어 Her2 결합을 복원하면서도 페르투추맙 HC와 공동-발현될 경우 친화도에 가능한 작게 영향을 미치기 위해 추가로 개질하였다.
[표 18]
트라스투추맙, 페르투추맙, 및 이의 하이브리드 분자의 동력학적 및 열역학적 매개변수
Figure pct00030
실시예 12: 공통의 경쇄의 친화도-개선
페르투추맙(Tras.L3) LC로의 추가의 트라스투추맙-특이적 LCDR 잔기의 도입 및 특징화
이전 SPR 측정의 결과에 기초하여, 페르투추맙 HC와 조합된 고안된 CLC "페르투추맙(Trast. L3) LC"의 결합은, 결합을 감소시켰지만 여전히 검출가능한 결합이었다. 대조적으로, CLC와 트라스투추맙 HC의 공동-발현은 마이크로몰 범위의 매우 약한 친화도를 초래하였고, 모 트라스투추맙 항체에 비해 상당히 감소되었다.
CLC를 생성하고 트라스투추맙 HC와 함께 결합을 개선시키기 위해, 트라스투추맙에 특이적인 골격구조 3 영역에서 뿐만 아니라, LCDR1, 2, 및 3의 추가의 트라스투추맙-특이적 아미노산을 앞서 고안된 "페르투추맙(Trast.L3) LC"의 서열(서열 번호 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 및 51로서 열거된 가변성 도메인의 DNA 서열)내로 개별적으로 도입하였다. 생성된 구축물(서열 번호 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 및 52로서 열거된 가변성 도메인의 단백질 서열)을 트라스투추맙 HC(서열 번호 92) 또는 페르투추맙 HC(서열 번호 22)와 공동-발현시키고, 포유동물-유래된 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. Her2에 대한 결합을 측정하고 개개의 모 항체와 비교하였다.
SPR에 의한 "페르투추맙(Trast.L3) LC" 변이체의 친화도-결정
신규 항체 쇄 조합물의 친화도(KD)를 표면 플라스몬 공명에 의해 프로테온 XPR36 기기(바이오래드)를 사용하여 측정하고 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다. 동력학적 및 열역학적 측정에 대한 요약이 표 19에 제공된다. 흥미롭게도, "페르투추맙(Tras.L3) LC" 변이체에서 추가의 단일 돌연변이중 어느 것도 페르투추맙과 조합될 경우 친화도에 크게 영향을 주지 않았고, 친화도는 "페르투추맙 HC" x "페르투추맙(Tras.L3) LC"에 필적할만하였다. 그러나, "페르투추맙(Tras.L3) LC" 변이체와 트라스투추맙 HC의 조합은 유의적인 차이를 초래하였다. LCDR3 영역(P94Y 및 T96Y)에서의 페르투추맙 서열에 대한 복귀 돌연변이(서열 번호 50 및 52로서 열거된 가변성 도메인의 단백질 서열)는 Her2에 대한 결합을 완전히 없앴고, 페르투추맙-특이적 돌연변이(서열 번호 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 및 48)의 도입은 초기 조합물 "트라스투추맙 HC" x "페르투추맙(Tras.L3) LC"와 비교하여 동일하거나 개선된 친화도를 생성하였다. 특히, 돌연변이 I31T, G32A, Y53F, 및 G66R은 결합에 있어서 가장 유의적인 개선을 유도하였다.
가장 유의적인 트라스투추맙-특이적 잔기의 "페르투추맙(Tras.L3) LC"로의 동시적 도입
상기 기재된 결합 측정에 기초하여, 4개의 가장 관련된 트라스투추맙-특이적 돌연변이의 "페르투추맙(Tras.L3) LC"로의 도입을 조합하였다. 개별 돌연변이를 함유하는 가변성 도메인의 단백질 서열은 서열 번호 36, 40, 42, 및 48로서 열거된다. "4중 돌연변이" 함유 쇄를 "페르투추맙(Tras.L3)(QM) LC"(서열 번호 54)로 지칭하였다.
SPR에 의한 "페르투추맙(Trast.L3)(QM) LC"의 친화도-결정
신규 "페르투추맙(Tras.L3)(QM) LC"를 특징짓고 페르투추맙 HC 또는 트라스투추맙 HC와 조합될 경우의 결합 친화도를 결정하기 위해, 추가의 SPR 실험을 수행하였다. 신규 항체 쇄 조합물의 친화도(KD)를 프로테온 XPR36 기기(바이오래드)에 의해 측정하고 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다. 동력학적 및 열역학적 측정에 대한 요약이 도 20 및 표 20에 제공된다. 이전에 도입되고 특징지워진 개별 돌연변이와 유사하게, 페르투추맙 HC 및 "페르투추맙(Tras.L3)(QM) LC"를 포함하는 항체의 친화도는 초기 쇄 조합물 "페르투추맙 HC" x "페르투추맙(Tras.L3) LC"와 비교하여 유의적으로 감소하지 않았다. 두 쇄 조합물의 경우, 친화도는 26 내지 34 nM의 범위내였다. 흥미롭게도, "트라스투추맙 HC"와 "페르투추맙(Tras.L3)(QM) LC"의 조합은 Her2에 대한 친화도를 매우 강하게 개선시켰다. 더욱이, 200 pM의 그의 친화도는 모 항체 트라스투추맙의 측정된 친화도(2.2 nM)에 비해 더욱 양호하다. "페르투추맙(Tras.L3)(QM) LC"와 트라스투추맙 HC의 조합이 Her2에 대한 결합을 완전히 복원시키고(또는 초과시키고) 페르투추맙 HC와의 조합이 Her2에 대한 결합을 감소시키지만 없애지는 않는다는 점을 고려하여, "페르투추맙(Tras.L3)(QM) LC"를 Her2 특이성 둘 다에 대한 CLC로서 사용하고 페르투추맙-특이적 에피토프로의 결합을 페르투추맙 HC의 친화도-돌연변이에 의해 복원시키는 것이 명백하였다.
[표 19]
추가의 CLC 하이브리드 분자의 조합시 트라스투추맙 또는 페르투추맙 HC를 포함하는 항체의 동력학적 및 열역학적 매개변수
Figure pct00031
[표 20]
트라스투추맙 또는 페르투추맙 HC 및 최종 CLC를 포함하는 항체의 동력학적 및 열역학적 매개변수
Figure pct00032
실시예 13: 페르투추맙 중쇄의 친화도 돌연변이
페르투추맙-기제 H1/H3 및 H2 친화도 돌연변이 라이브러리의 생성
표준 프로토콜[실라씨(Silacci) 등의 문헌(2005)]을 사용하여 파아지 디스플레이에 의해 친화도-성숙된 페르투추맙-유래된 중쇄의 생성을 실행하였다.
"페르투추맙(Tras.L3)(QM) LC"와 함께 발현될 경우 개선된 친화도를 갖는 페르투추맙-유래된 HC를 생성하기 위해, CDR1 및 3에서 또는 CDR2에서 무작위화된 성숙 라이브러리를 생성하였다. 페르투추맙 HC(서열 번호 22) 및 "페르투추맙(Tras.L3)(QM) LC"(서열 번호 54)의 서열을 파아지미드내로 클로닝하고, 무작위화를 위한 주형으로서 사용하였다. CDR1 및 3에서 무작위화된 페르투추맙 HC 친화도 성숙 라이브러리의 생성을 위해, 3개의 단편을 "중첩 연장에 의한 스플라이싱"(SOE: splicing by overlapping extension) PCR에 의해 조립하고 파아지 벡터내로 클로닝하였다. 하기 프라이머 조합물을 사용하여 라이브러리 단편: 단편 1(LMB3(서열 번호 147) 및 AM_omni_H1_TN-ba(서열 번호 148), 단편 2(RJH108(omni_3'H1_fo)(서열 번호 149) 및 RJH109(omni_5'H3_re)(서열 번호 150), 및 단편 3(AM_omni_H3_TN_fo(서열 번호 151) 및 RJH99(서열 번호 152)를 생성하였다. 충분한 양의 전장 무작위화된 단편의 조립 후, 이를 동일하게 처리된 억셉터 파아지미드 벡터와 함께 MunI/NheI에 의해 분해시켰다. 6 ug의 Fab 라이브러리 삽입물을 24 ug의 파아지미드 벡터와 결찰시켰다. 정제된 결찰물을 60회의 형질전환을 위해 사용하여 6×10 exp9 형질전환체를 생성하였다. 페르투추맙 친화도 돌연변이 라이브러리를 표시하는 파아지미드 입자를 구하고 PEG/NaCl 정제에 의해 정제하여 선택을 위해 사용하였다.
CDR2-무작위화된 페르투추맙 HC 친화도 돌연변이 라이브러리의 생성을 유사하게 실행하였지만, 단지 2개 단편만을 생성하고, 조립하고, 이전과 동일한 제한 효소를 사용하여 파아지미드 내로 클로닝하였다. 다음의 프라이머 조합물을 사용하여 라이브러리 단편을 생성하였다: 단편 1(LMB3(서열 번호 147) 및 RJH110(omni_5'H2_ba)(서열 번호 153) 및 단편 2(AM_omni_h2_TN_fo(서열 번호 154) 및 RJH99(서열 번호 152). 정제된 결찰물을 60회의 형질전환을 위해 사용하여 4×10 exp9 형질전환물을 생성하였다. 페르투추맙 친화도 돌연변이 라이브러리를 표시하는 파아지미드 입자를 구하고 PEG/NaCl 정제에 의해 정제하여 선택을 위해 사용하였다.
[표 21a]
CDR1 및 3-무작위화된 페르투추맙 친화도-돌연변이 라이브러리의 생성을 위한 프라이머 조합
Figure pct00033
[표 21b]
CDR1 및 3-무작위화된 페르투추맙 친화도-돌연변이 라이브러리의 생성을 위한 프라이머 서열
Figure pct00034
[표 22a]
CDR2-무작위화된 페르투추맙 친화도-돌연변이 라이브러리의 생성을 위한 프라이머 조합
Figure pct00035
[표 22b]
CDR2-무작위화된 페르투추맙 친화도-돌연변이 라이브러리의 생성을 위한 프라이머 서열
Figure pct00036
친화도 성숙된 페르투추맙 HC-유래된 클론의 선택
인간 Her2의 세포외 도메인(ECD)에 대한 선택을 HEK293-발현된 단백질을 사용하여 실행하였다. N-말단 avi-태그를 경유하여 비오틴 리가아제 Bir A의 공동-발현에 의해 항원을 효소적으로 비오티닐화시켰다. 하기 패턴에 따라 용액에서 패닝 라운드(panning round)를 수행하였다: 1. 0.5 시간 동안 1 ㎖의 총 부피에서 10 nM 비오티닐화된 Her2 ECD에 대한 약 1012 파아지미드 입자의 결합, 2. 10분 동안 5.4×107 스트렙타비딘-코팅된 자기 비이드의 첨가에 의한 비오티닐화된 Her2 ECD 및 특이적으로 결합된 파아지 입자의 포획, 3.5×1 ㎖의 PBS/트윈20 및 5×1 ㎖의 PBS에 의한 비이드의 세척, 4. 10분 동안 1 ㎖의 1OO mM TEA의 첨가에 의한 파아지 입자의 용출 및 500 ㎕의 1 M 트리스/HCl(pH 7.4)의 첨가에 의한 중화, 5. 대수 증식기의 에스케리키아 콜라이 TG1 박테리아의 재-감염, 및 6. 헬퍼파아지(helperphage) VCSM13에 의한 감염 및 후속적인 선택 라운드에서 사용되는 파아지미드 입자의 후속적인 PEG/NaCl 침전. 감소되는(20×lO-9 M에서 1×1O-9 M로) 항원 농도를 사용하는 3회 라운드에 걸쳐 선택을 실행하였다. 라운드 2 및 3에서, 항원:파아지 착체의 포획을 스트렙타비딘 비이드 대신 뉴트라비딘(neutravidin) 플레이트에 의해 수행하였다. 또한, 뉴트라비딘 플레이트를 3 시간 동안 2 ℓ의 PBS에서 세척하였다. 특이적 결합기를 다음과 같이 ELISA에 의해 확인하였다: 웰당 100 ㎕의 30 nM 비오티닐화된 Her2 ECD를 뉴트라비딘 플레이트 상에 코팅하였다. Fab-함유 박테리아 상청액을 첨가하고, 결합 Fab를 이들의 Flag-태그를 경유하여 항-Flag/HRP 2차 항체를 사용하여 검출하였다. ELISA-양성 클론을 96-웰 형식에서 가용성 Fab 단편으로서 박테리아에 의해 발현시켰고, SPR-분석에 의해 프로테온 XPR36을 사용하여 상청액을 동력학적 스크리닝 실험하였다.
SPR에 의한 친화도-성숙된 페르투추맙 HC 변이체의 친화도 결정
신규 페르투추맙 HC 변이체의 친화도(KD)를 표면 플라스몬 공명에 의해 측정하였다. 제1 단계에서, 7000 RU의 다중클론성 항-인간 Fab 항체를 GLM 칩의 모든 6개 채널 상에 아민 커플링에 의해 고정화시켰다(Na아세테이트 pH 4.5, 30 ㎕/분, 300초)(수직 배향).
각각 항체-함유 박테리아 상청액을 여과하고 PBS로 3배 희석한 다음, 180초 동안 30 ㎕/분으로 주입하여 수직 배향으로 100 내지 400 응답 유닛(RU)의 고정화 수준을 달성하였다. Her2의 주입: 원-샷 동력학적 측정을 위해, 주입 방향을 수평 배향으로 변화시키고, 정제된 Her2의 일련의 2배 희석물(100 내지 6.25 nM의 다양한 농도 범위)를 100 ㎕/분에서 별도의 채널 1 내지 5를 따라 동시에 주입하였고, 회합 속도는 180초, 해리 속도는 1000초였다. 완충액(PBST)을 6번째 채널을 따라 주입하여 참고용 "인-라인" 블랭크를 제공하였다. 1O mM 글리신(pH 1.5) 및 50 mM NaOH의 2개의 펄스에 의해 30초 동안 100 ㎕/분에서 재생을 수행하였다(수평 배향). 프로테온 매니저 v3.1 소프트웨어에서 단순 1-대-1 랑뮤 결합 모델을 사용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 정합시킴으로써 회합 속도 상수(k회합) 및 해리 속도 상수(k해리)를 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)를 k해리/k회합 비로서 계산하였다. 가장 높은 친화도 상수를 갖는 Fab를 발현하는 클론을 식별하고 상응하는 파아지미드의 중쇄를 서열분석하였다. 가장 관련된 페르투추맙 HC 변이체(서열 번호 62, 66, 68, 70, 72, 및 74로서 열거된 가변성 도메인의 단백질 서열)의 열역학적 측정이 표 23 및 도 21에 요약되어 있다.
[표 23]
공통의 경쇄(CLC)와 조합된, 선택된 친화도 성숙된 페르투추맙 클론 변이체의 친화도
Figure pct00037
실시예 14: 트라스투추맙/페르투추맙 이중특이성 항체의 특징화
CLC를 갖는 트라스투추맙/페르투추맙 이중특이성 항-Her 항체의 생성
하기 단계에서, 친화도-성숙된 페르투추맙 HC 뿐만 아니라 트라스투추맙 HC를 "페르투추맙(Tras.L3)(QM) LC"로 지칭되는 CLC와 조합하여 이중특이성 항체 형식으로 발현시켰다. CLC를 갖는 이러한 이중특이성 항체의 생성을 위해, 2가지 상이한 HC의 이종이량체를 노브-인투-홀 기술의 적용에 의해 달성하였다. 페르투추맙 친화도-성숙된 클론 E1 및 G2의 가변성 도메인(서열 번호 68 및 70으로서 열거된 가변성 도메인의 단백질 서열) 뿐만 아니라 클론 "D1-유래된"(D1-유래) 서열(서열 번호 64)을 도메인 CH3에서 "홀" 돌연변이가 함유된 인간 IgG1 HC 내로 클로닝하였다. CLC를 갖는 이중특이성 항체에 대한 개략적 개요가 도 22에 제시된다. 친화도-성숙 클론 "D1-유래"는 클론 D1(서열 번호 62)의 CDR1 및 3 돌연변이를 다른 선택된 클론에서 발견되는 추가의 CDR2 돌연변이와 조합한다. 트라스투추맙 HC(서열 번호 92)의 가변성 도메인을 도메인 CH3에서 "노브" 돌연변이가 함유된 인간 IgG1 HC 내로 클로닝하였다. "헤르셉타르그" 구축물로서 지칭되는 생성된 구축물을 공동-발현시키고, 포유동물-유래된 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 모든 3가지 이중특이성 항체에 대한 분석적 데이터의 요약이 도 23 및 표 24에 제시된다.
[표 24]
공통의 경쇄를 갖는 HER2 항체의 생산
Figure pct00038
Her2 넉-아웃 항원 변이체의 생성
Her2 상의 양쪽 에피토프 각각에 대한 헤르셉타르그 이중특이성 항체의 결합을 분석하고 특징짓기 위해서, Her2 넉-아웃 변이체를 고안하였다. 이들 변이체에서, 두개의 특이적 에피토프중 하나를 개개의 항체 쇄와 상호작용하는 아미노산의 돌연변이에 의해 결실시켰다.
발현 및 정제를 위하여, 개개의 DNA 단편을 프레임내에서 가용성- 및 정제 태그로서 작용하는 C-말단 인간 IgG1 Fc 코딩 단편 및 N-말단 리더 서열에 축합시켰다. Fc 단편의 C-말단 단부에 있는 avi-태그는 생체내 비오티닐화를 허용하였다. 항원을 단량체 형태로 발현하기 위해, 이들 Fc 쇄는 "노브" 돌연변이[서열 번호 5 및 6, Her2 ECD-Fc(노브); 서열 번호 7 및 8, Her2 ECD(페르투추맙 KO)-Fc(노브); 서열 번호 9 및 10, Her2 ECD(트라스투추맙 KO)- Fc(노브)]를 함유하였고, "Fc-홀" 대응물(서열 번호 3 및 4)과 공동-발현되었다.
SPR에 의한 헤르셉타르그 이중특이성 항체의 친화도-결정
her2에서 각각의 이들 에피토프에 대한 신규 이중특이성 항체의 친화도(KD)를 SPR에 의해 프로테온 XPR36 기기(바이오래드)를 사용하여 25℃에서 측정하였다. 제1 단계에서, 인간 IgG(Fc-특이성)를 인식하는 11000 RU의 다중클론성 염소 항-인간 IgG(시그마 I2136)를 GLM 칩의 모든 6개 채널 상에 아민 커플링에 의해 고정화시켰다(Na아세테이트 pH 4, 30 ㎕/분, 300초)(수직 배향).
각각의 항체를 PBST(10 mM 포스페이트, 150 mM 염화 나트륨 pH 7.4, 0.005% 트윈 20)에 의해 2 ㎍/㎖로 희석시키고, 이어서 60초 동안 30 ㎕/분으로 주사하여 수직 배향으로 약 400 응답 유닛(RU)의 고정화 수준을 달성하였다. Her2의 주입:원-샷 동력학적 측정을 위해, 주입 방향을 수평 배향으로 변화시키고, 정제된 1가 Her2-Fc 단백질 구축물의 일련의 2배 희석물(100 내지 6.25 nM의 다양한 농도 범위)을 100 ㎕/분에서 별도의 채널 1 내지 5를 따라 동시에 주입하였고, 회합 속도는 180초, 해리 속도는 600초였다. 완충액(PBST)을 6번째 채널을 따라 주입하여 참고용 "인-라인" 블랭크를 제공하였다. 10 mM 글리신(pH 1.5) 및 50 mM NaOH의 2개의 펄스에 의해 30초 동안 100 ㎕/분에서 재생을 수행하였다(수평 배향). 프로테온 매니저 v3.1 소프트웨어에서 단순 1-대-1 랑뮤 결합 모델을 사용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 정합시킴으로써 회합 속도 상수(k회합) 및 해리 속도 상수(k해리)를 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)를 k해리/k회합 비로서 계산하였다.
트라스투추맙, 페르투추맙 뿐만 아니라, 친화도-성숙된 페르투추맙 HC, 트라스투추맙 HC, 및 CLC "페르투추맙(Trast.L3)(QM)"을 포함하는 3가지 이중특이성 헤르셉타르그 구축물을 비롯한 모든 항체를 Her2 넉-아웃 변이체 둘다에 대한 결합에 대해 시험하였다. 예상된 바와 같이, 트라스투추맙 및 페르투추맙은 둘 다 예상된 친화도를 갖고 이들 개개의 Her2 에피토프에 결합하였다. 상응하는 넉-아웃 변이체에 대한 결합은 무효화되었다(도 24). 이들 결과는, Her2 넉-아웃 에피토프 변이체의 사용이 이중특이성 항체의 결합을 분해하고 양쪽 특이성에 대한 개별적 친화도를 분석할 수 있도록 허용함을 입증한다. 각각의 헤르셉타르그 클론 변이체의 개별 KD의 측정은, 0.6 내지 1.8 nM의 예상된 범위의 트라스투추맙 에피토프에 대한 일정한 결합 친화도를 보여주었다. 대조적으로, 페르투추맙 에피토프에 대한 결합은 친화도-성숙된 페르투추맙 HC에 의존한다. 3가지 헤르셉타르그 클론 변이체 중에서, 클론 "D1-유래"는 가장 높은 친화도(0.16 nM)를 갖는 것으로 밝혀졌다. 열역학적 데이터에 대한 요약이 표 25에 제시된다. 요약하면, 이러한 실험으로부터 본 발명자들이 CLC를 갖고 에피토프 트라스투추맙 및 페르투추맙에 특이적인 이중특이성 항체를 생성할 수 있었음이 확인된다.
KPL-4 세포에 대한 헤르셉타르그 클론 변이체의 결합 분석
KPL-4 세포를 수거하고 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 0.2 미오 세포를 96 웰 환저 플레이트 내로 접종하였다. 플레이트를 400 g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. 상청액을 제거하고 세포를 40 ㎕의 희석된 항체에 재현탁시켰다. 플레이트를 30분 동안 4℃에서 항온처리하여 항체의 결합을 허용하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세포를 다시 원심분리하고 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 항체를 검출하기 위해, 세포를 12 ㎕의 희석된 2차 염소 항-인간 Fc 특이적 FITC-표지된 2차 항체(잭슨 이뮤노리써치 #109-096-098)에 재현탁시키고 다시 30분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 이후 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 200 ㎕의 FACS 완충액에 재현탁시키고, 형광도를 BD 칸토II에 의해 측정하였다. 결과는 도 25에 제시된다.
[표 25]
CLC와 조합된, 선택된 이중특이성 항체 친화도 성숙된 페르투추맙 클론 변이체의 친화도
Figure pct00039
[표 26]
다양한 세포 유형의 증식 저해(신뢰 구간을 갖는 IC50 값)
Figure pct00040
헤르셉타르그 결합 변이체에 의해 매개된 증식 저해
표적 세포를 수거하고, 세척하고, RPMI 1640(깁코) + 10% FCS + 1% 글루타맥스(상표명)(깁코)에 재현탁시키고 5×103 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 세포를 4 시간 동안 세포 항온처리기에서 항온처리한 후 개개의 항체 희석물을 첨가하였다. 플레이트를 부드럽게 진탕시키고 5일 동안 세포 항온처리기에서 항온처리하였다. 플레이트를 실온으로 평형화시키고 100 ㎕/웰의 신선하게 제조된 셀타이터 글로(프로메가) 기질을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광을 왈락 빅터3 1420 멀티라벨 계수기에서 측정하였다. 결과는 표 26 및 도 26에 제시된다.
헤르셉타르그 클론-매개된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)
표적 세포를 수거하고, 세척하고, AIM V(등록상표) 배지(라이프 테크놀로지스)에 재현탁시키고, 3×104 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 개개의 항체 희석물을 세포에 3중으로 첨가하고, 10분 동안 항온처리한 후, 효과기 세포(말초 혈액 단핵 효과기 세포[PBMC])를 첨가하였다. 이어서 효과기(E) 및 표적(T) 세포를 지시된 시간 동안 37℃에서 지시된 E:T 비율로 항온처리하였다(모든 샘플에 대해 3중으로). 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출을 LDH 세포독성 검출 키트(로슈 어플라이드 사이언스)를 사용하여 측정하였다. ADCC를 하기 수학식 1에 의해 계산하였다:
수학식 1
ADCC 백분율 = [(샘플 방출-자발적 방출)/(최대 방출-자발적 방출)]×100
항체 없이 효과기 세포와 함께 항온처리된 표적 세포에 상응하는 자발적 방출은 0% 세포독성으로서 정의되었고, 최대 방출(1% 트리톤 X-100으로 용해된 표적 세포)은 100% 세포독성으로서 정의되었다. 각각의 3회 실험에 대한 ADCC의 평균 백분율 및 표준 편차를 계산하였다. 결과는 도 27에 제시된다.
[표 27]
리더 펩타이드
Figure pct00041
실시예 15: 증식 검정
1×lO4 BT-474 세포/웰을 96-웰 평저 플레이트 중의 RPMI/10% FCS에 배양하였다. 24 시간 후, 성장 배지를 제거하고 지시된 항체의 적정된 양을 100 ㎕의 최종 부피로 첨가하였다(배양 배지에서 미리 혼합됨).
배양액중 생존가능한 세포의 수를 결정하기 위해, 대사적으로 활성인 세포의 지시자로서 존재하는 ATP 수준을 정량화함으로써 셀타이터-글로 발광 세포 생존능력 검정을 수행하였다. 이와 같이, 배양 6일 후 100 ㎕의 셀타이터-글로 반응 믹스(프로메가, 카탈로그 번호 #G7571)를 세포에 첨가하고 2분 동안 흔들어준 후, 75 ㎕의 용해물을 별도의 96-웰 평저 적정 플레이트[코스타(Costar), 카탈로그 번호 #3917]로 옮겼다. 추가의 혼합 후, 제조업체의 지시에 따라 테칸 인피니트(Tecan Infinite) 판독기를 사용하여 발광을 평가하였다.
결과는 표 28 및 도 28에 제시된다.
증식 검정에서, 이중특이성 Her2 항체는 페르투추맙 또는 트라스투추맙 단독 또는 이들의 조합에 비해 더욱 강력하게 BT-474 세포의 증식을 저해하였음이 제시되었다. 다음의 이중특이성 Her2 항체를 시험하였다: "헤르셉타르그 CLC D1-유래 wt": 서열 번호 64, 54, 92, "헤르셉타르그 CLC D1-유래 G2": 서열 번호 64, 54, 92(당조작된 변이체) "헤르셉타르그 크로스맙": 서열 번호 109, 110, 111, 112.
[표 28]
IC50 BT474 증식 검정
Figure pct00042
실시예 16: Clq FACS 결합 검정
3×105 BT-474 세포를 10 ㎍/㎖의 지시된 항체와 함께 얼음 상에서 항온처리하였다. 다음의 이중특이성 Her2 항체를 시험하였다: 헤르셉타르그 CLC D1-유래 wt": 서열 번호 64, 54, 92, 헤르셉타르그 CLC D1-유래 G2": 서열 번호 64, 54, 92(당조작된 변이체) "헤르셉타르그 크로스맙": 서열 번호 109, 110, 111, 112.
30분 후, 10 ㎍/㎖의 Clq(시그마, C1740)를 첨가하고 추가적으로 20분 동안 항온처리하였다. 세척 후, 세포를 상업용 PE-표지된 항-Clq 항체[세다레인(Cedarlane), CL7611PE-SP)]로 대비염색하였다. 추가의 항온처리(30분, 얼음) 후, 세포를 2회 세척하고 FACS 칸토 II 상에서 분석하였다.
결과는 도 29 및 표 29에 제시된다. 이러한 Clq 검정은 BT-474 세포 상에서 상이한 Her 항체에 대한 재조합 보체 인자 Clq의 결합을 나타낸다. 가장 높은 Clq 결합은 트라스투추맙 및 페르투추맙의 조합물로 처리한 경우, 이어서 2개의 CLC 이중특이성 Her2 항체로 처리한 경우 초래되는 것으로 제시되었다. 크로스맙에 의한 처리는 단지 약간 상승된 Clq 결합을 초래하였다.
[표 29]
Clq 결합 검정
Figure pct00043
실시예 17: 새끼 토끼 보체(BRC)에 의한 LDH 검정
CHO-K1 Nxrel9 세포(IL15R 형질감염된 CHO-K1)를 10,000 세포/웰로 96-웰 평저 세포 배양 플레이트 상에 접종하고(NUNC, 100 ㎕/웰) 하룻밤 배양하였다. IL15-Fc 축합 폴리펩타이드를 첨가하고(5-배 최종 농도에서 25 ㎕/웰) 1 시간 동안 항온처리하였다. 이후, 새끼 토끼 보체(세다레인, 카탈로그 번호 CL3441)의 1개 바이알을 1 ㎖의 아쿠아 비데스트(Aqua bidest)로 재구성하였다. 보체 용액을 배지로 희석하고 25 ㎕를 웰에 첨가하였다. 4 시간 후, 플레이트를 200 g에서 원심분리하고, 100 ㎕/웰을 또 다른 96-웰 평저 플레이트로 옮겼다. 이후, 100 ㎕의 LDH 반응 믹스[세포독성 컴출 키트, 로슈 디애그노스틱 게엠베하(Roche Diagnostic GmbH), 독일 만하임 소재]를 첨가하였다. 37℃에서 20분의 항온처리 시간 후, 광학 밀도(OD)를 492/690에서 테칸 선라이즈(Tecan Sunrise) 판독기 상에서 측정하였다.
[표 30]
BRC에 의한 LDH 검정
Figure pct00044
BRC는 낮은 배경 독성을 갖고 용량 의존적 보체 독성을 나타내는 것으로 볼 수 있다.
실시예 18: BT-474 세포 상에서의 CDC(보체 의존성 세포독성) 활성화(LDH 방출)
1×104 세포/웰을 150 ㎕에서 10 ㎍/㎖의 지시된 항체와 30분 동안 37℃하에 항온처리하였다. 다음의 이중특이성 Her2 항체를 시험하였다: 헤르셉타르그 CLC D1-유래 wt": 서열 번호 64, 54, 92, 헤르셉타르그 CLC D1-유래 G2": 서열 번호 64, 54, 92(당조작된 변이체) "헤르셉타르그 크로스맙": 서열 번호 109, 110, 111, 112.
이어서 50 ㎕의 새끼 토끼 보체(세다레인, 카탈로그 번호 CL3441, 배치 번호 6312)를 첨가하고 추가의 2 시간 동안 항온처리하였다. 이어서, s/n을 전달하고 50 ㎕의 LDH 반응 믹스(로슈)와 혼합하고, 15분의 추가의 항온처리 후, 490/620 nm에서의 소멸(Ex.)을 테칸 선라이즈 판독기 상에서 분석하였다. BT-474 세포에 대한 특정 항체 의존성 독성(n = 4의 평균 +/- SD)을 다음과 같이 계산하였다:
(Ex.샘플-Ex.자발적 용해/Ex.최대 용해-자발적 용해)×100
결과는 도 30에 도시된다.
이러한 CDC 검정은 새끼 토끼 보체의 존재하에 상이한 항-Her2 항체(형식, 조합)의 처리시 사멸중인/사멸된 세포에 대한 마커로서의 LDH의 방출을 보여준다. 여기서, 트라스투추맙 및 페르투추맙의 조합물은 CDC의 유의적인 유도를 초래하였지만, 모 항체는 단독으로 그렇지 않았다. 놀랍게도, CLC 헤르셉타르그 변이체는 둘 다 탁월한 CDC 효과를 유발하였지만, 헤르셉타르그 크로스맙 처리는 모 항체의 조합물에 비해 덜 효과적인 CDC 반응을 초래하였다.
실시예 19: BT-474 세포(ACEA)의 CDC(보체 의존성 세포독성)-매개된 사멸
1×104 세포/웰을 96-웰 E-플레이트[ACEA 바이오사이언시즈 인코포레이티드(ACEA Biosciences Inc.)] 상에 접종하고 하룻밤 엑스셀리겐스(Xcelligence) 장치에서 성장시켰다. 성장 배지를 제거하고 세포를 무혈청 AIM-V 배지(깁코)로 1회 세척하였다. 50 ㎕/웰의 AIM-V 배지 및 AIM-V중 50 ㎕의 항체(3-배 최종 농도)를 첨가하고 20분 동안 항온처리하였다. 50 ㎕의 새끼 토끼 보체(세다레인)를 첨가하고 셀인덱스(CellIndex)(CI; 세포의 생존능력에 대한 표시로서)를 5분 마다 측정하였다(곡선 참조). 다음의 이중특이성 Her2 항체를 시험하였다: 헤르셉타르그 CLC D1-유래 wt": 서열 번호 64, 54, 92, 헤르셉타르그 CLC D1-유래 G2": 서열 번호 64, 54, 92(당조작된 변이체) "헤르셉타르그 크로스맙": 서열 번호 109, 110, 111, 112.
특이적 CDC를 하기 수학식 2에 따라 계산하였고, 여기서 CI는 정규화된 세포 지수이다:
[수학식 2]
% CDC = [(CI 보체 대조군 - CI 샘플)/CI 보체 대조군]×100
2개의 대표적 시점에서(반응 개시 후 1 시간 및 2 시간째), 특이적 용해(= CDC-유도된 세포 사멸)를 계산하고 다이어그램으로 제시하였다(n = 4의 평균 +/- SEM).
결과는 도 31 및 표 31에 제시된다. 이러한 CDC 검정은 새끼 토끼 보체의 존재하에 상이한 항-Her2 항체(형식, 조합)로의 처리시 사멸중인/사멸된 세포에 대한 마커로서 세포 지수에서의 변화를 보여주고, 여기서, 트라스투추맙 및 페르투추맙의 조합물은 CDC의 유의적인 유도를 초래하였지만, 모 항체는 단독으로 그렇지 않았다. 놀랍게도, CLC 헤르셉타르그 변이체는 둘 다 탁월한 CDC 효과를 유발하였지만, 헤르셉타르그 크로스맙 처리는 모 항체의 조합물에 비해 덜 효과적인 CDC 반응을 초래하였다.
헤르셉타르그 CLC D1-유래의 우수성에 대한 한가지 가능한 이유는 페르투추맙 에피토프에 대한 상당히 더 높은 친화도 뿐만 아니라, 트라스투추맙 에피토프에 대한 약간 더 높은 친화도일 수 있다(또한 표 25 참조).
[표 31]
BT-474 세포(ACEA)의 CDC(보체 의존성 세포독성)-매개된 사멸
Figure pct00045
실시예 20: 마우스 이종이식 연구
세포주 KPL4
이러한 인간 유방암 세포주는 염증성 피부 전이를 앓는 유방암 환자의 악성 흉수로부터 확립되었다. 구레바야시 교수(가와사키 메디칼 스쿨, 일본 구라시키 소재)가 세포를 제공하였다. 37℃에서 수-포화된 분위기 중에서 5% C02하에 10% 태내 소 혈청(팬 바이오텍, 독일 소재) 및 2 mM L-글루타민(팬 바이오텍, 독일 소재)이 보충된 DMEM 배지(팬 바이오텍, 독일 소재)에서 종양 세포를 일상적으로 배양하였다. 계대배양을 주당 2회 스플리팅하면서 트립신/EDTA 1x(팬)에 의해 수행하였다. 세포 계대배양 P6을 생체내 연구에 사용하였다.
마우스
암컷 SCID 베이지(C.B.-17) 마우스[10 내지 12 주령; 체중 18 내지 20 g(찰스 리버, 독일 슐츠펠트 소재); 체중 >20 g]를 특정-병원체-부재 조건하에 국제 지침서(GV-솔라스; 페라사; 티에르쉬쥐)에 따라 매일 12 시간씩의 명암 주기로 유지시켰다. 도착 후 동물을 1 주일 동안 동물 시설의 격리실에 가두어 새로운 환경 및 관찰에 익숙해지도록 하였다. 연속적인 건강 모니터링을 규칙적인 근거하에 실행하였다. 다이어트 식품(올트로민) 및 물을 자유롭게 제공하였다. 실험 연구를 검토하고, 지방 정부에 의해 승인받았다
종양 세포 주입
주입 일에, 종양 세포를 배양 플라스크(그라이너 트리플라스크)로부터 수거하고(트립신-EDTA), 50 ㎖의 배양 배지로 옮기고, 1회 세척하고, PBS에 재현탁시켰다. PBS에 의한 추가의 세척 단계 및 여과(세포 스트레이너; 팔콘 φ 100 ㎛) 후, 최종 세포 역가를 1.5×10e8/㎖로 조정하였다. 종양 세포 현탁액을 주의깊게 전달 피펫으로 혼합하여 세포 응집을 방지하였다. 폐쇄된 순환 시스템에서 예비항온처리 챔버(플렉시글라스), 개별 마우스 코-마스크(실리콘) 및 비-가연성 또는 폭발성 마취 화합물 이소플루란(파마시아-업존, 독일 소재)에 의해 소동물용 스테펜스 흡인 유닛을 사용하여 마취를 수행하였다. 주사 2일 전, SCID 베이지색 마우스의 외피를 면도하고 KPL-4 세포(3 x 10e6 세포)를 각각의 마취된 마우스의 오른쪽 서혜부 끝에서 두번째 유선 지방체 내로 20 ㎕의 부피로 정위치로 주사하였다(하밀톤 마이크로리터 주사기 및 30Gx1/2" 바늘 사용). 세포 현탁액을 유두 아래 피부를 통해 주사하였다.
모니터링
부작용의 임상적 증후에 대한 검출을 위해 동물을 매일 조절하였다. 실험 전체를 통해 모니터링하기 위해, 동물의 체중을 주 2회 기록하고 종양 부피를 주 2회 캘리퍼로 측정하였다. 종양 부피를 NCI 프로토콜에 따라 계산하였다(종양 중량 = 1/2ab2, 여기서 "a" 및 "b"는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경임). 종료 기준은 임계 종양 질량(1.7 g까지 또는 φ > 1.5 cm), 기선으로부터 20%를 초과하는 체중 감소, 종양 궤양 또는 동물의 불량한 일반적 증상이었다. 동물에 대한 연구 배제 기준은 상응하는 "티에르베르수취산자이게"에 기재되고 승인되었다.
치료
마우스를 평균 80 ㎣의 종양 부피에 대해 무작위화하고, 후속적으로 주 1회 1O ㎖/kg의 부피로 복강내 치료하였다. 복합 치료를 위해 헤르셉틴을 먼저 제공하고 페르제타를 24 시간 후 제공하였다.
다음의 이중특이성 Her2 항체를 시험하였다: 헤르셉타르그 CLC-D1-유래: 서열 번호 64, 54, 92. 결과는 도 32에 제시된다.
Figure pct00046
[표 32]
페르투추맙 및 트라스투추맙의 모 서열
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
[표 33]
공통의 경쇄를 갖는 항체의 서열
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
[표 34]
항원
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
[표 35]
공통의 경쇄 항체 "D1-유래"의 전장 항체 서열
Figure pct00069
Figure pct00070
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> BISPECIFIC HER2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> 31865 WO <140> PCT/EP2014/078375 <141> 2014-12-18 <150> EP 13198819.8 <151> 2013-12-20 <160> 164 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1995 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> HER2 ECD DNA <400> 1 acccaagtgt gcaccggcac agacatgaag ctgcggctcc ctgccagtcc cgagacccac 60 ctggacatgc tccgccacct ctaccagggc tgccaggtgg tgcagggaaa cctggaactc 120 acctacctgc ccaccaatgc cagcctgtcc ttcctgcagg atatccagga ggtgcagggc 180 tacgtgctca tcgctcacaa ccaagtgagg caggtcccac tgcagaggct gcggattgtg 240 cgaggcaccc agctctttga ggacaactat gccctggccg tgctagacaa tggagacccg 300 ctgaacaata ccacccctgt cacaggggcc tccccaggag gcctgcggga gctgcagctt 360 cgaagcctca cagagatctt gaaaggaggg gtcttgatcc agcggaaccc ccagctctgc 420 taccaggaca cgattttgtg gaaggacatc ttccacaaga acaaccagct ggctctcaca 480 ctgatagaca ccaaccgctc tcgggcctgc cacccctgtt ctccgatgtg taagggctcc 540 cgctgctggg gagagagttc tgaggattgt cagagcctga cgcgcactgt ctgtgccggt 600 ggctgtgccc gctgcaaggg gccactgccc actgactgct gccatgagca gtgtgctgcc 660 ggctgcacgg gccccaagca ctctgactgc ctggcctgcc tccacttcaa ccacagtggc 720 atctgtgagc tgcactgccc agccctggtc acctacaaca cagacacgtt tgagtccatg 780 cccaatcccg agggccggta tacattcggc gccagctgtg tgactgcctg tccctacaac 840 tacctttcta cggacgtggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctgcacaa ccaagaggtg 900 acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc ccgagtgtgc 960 tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc caatatccag 1020 gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga gagctttgat 1080 ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt gtttgagact 1140 ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct gcctgacctc 1200 agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg cgcctactcg 1260 ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag ggaactgggc 1320 agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac ggtgccctgg 1380 gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg gccagaggac 1440 gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca ctgctggggt 1500 ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga gtgcgtggag 1560 gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca ctgtttgccg 1620 tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggact ggaggctgac 1680 cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg ctgccccagc 1740 ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga ggagggcgca 1800 tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga caagggctgc 1860 cccgccgagc agagagccag ccctctgacg gtcgacgaac agttatattt tcagggcggc 1920 tcaggcctga acgacatctt cgaggcccag aagatcgagt ggcacgaggc tcgagctcac 1980 caccatcacc atcac 1995 <210> 2 <211> 684 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HER2 ECD <400> 2 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu 20 25 30 Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln 35 40 45 Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr 50 55 60 Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr 65 70 75 80 Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu 85 90 95 Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala 100 105 110 Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly 115 120 125 Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu 130 135 140 Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr 145 150 155 160 Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu 165 170 175 Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys 180 185 190 Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp 195 200 205 Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys 210 215 220 Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly 225 230 235 240 Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn 245 250 255 His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn 260 265 270 Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe 275 280 285 Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp 290 295 300 Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr 305 310 315 320 Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala 325 330 335 Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala 340 345 350 Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe 355 360 365 Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser 370 375 380 Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu 385 390 395 400 Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu 405 410 415 Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile 420 425 430 Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser 435 440 445 Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu 450 455 460 Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp 465 470 475 480 Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg 485 490 495 Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys 500 505 510 Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys 515 520 525 Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu 530 535 540 Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys 545 550 555 560 His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Leu 565 570 575 Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe 580 585 590 Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met 595 600 605 Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro 610 615 620 Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro 625 630 635 640 Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe 645 650 655 Gln Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 660 665 670 Trp His Glu Ala Arg Ala His His His His His His 675 680 <210> 3 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Fc(hole)DNA <400> 3 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa a 681 <210> 4 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fc(hole) <400> 4 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 5 <211> 2670 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Her2 ECD-Fc(knob)DNA <400> 5 acccaagtgt gcaccggcac agacatgaag ctgcggctcc ctgccagtcc cgagacccac 60 ctggacatgc tccgccacct ctaccagggc tgccaggtgg tgcagggaaa cctggaactc 120 acctacctgc ccaccaatgc cagcctgtcc ttcctgcagg atatccagga ggtgcagggc 180 tacgtgctca tcgctcacaa ccaagtgagg caggtcccac tgcagaggct gcggattgtg 240 cgaggcaccc agctctttga ggacaactat gccctggccg tgctagacaa tggagacccg 300 ctgaacaata ccacccctgt cacaggggcc tccccaggag gcctgcggga gctgcagctt 360 cgaagcctca cagagatctt gaaaggaggg gtcttgatcc agcggaaccc ccagctctgc 420 taccaggaca cgattttgtg gaaggacatc ttccacaaga acaaccagct ggctctcaca 480 ctgatagaca ccaaccgctc tcgggcctgc cacccctgtt ctccgatgtg taagggctcc 540 cgctgctggg gagagagttc tgaggattgt cagagcctga cgcgcactgt ctgtgccggt 600 ggctgtgccc gctgcaaggg gccactgccc actgactgct gccatgagca gtgtgctgcc 660 ggctgcacgg gccccaagca ctctgactgc ctggcctgcc tccacttcaa ccacagtggc 720 atctgtgagc tgcactgccc agccctggtc acctacaaca cagacacgtt tgagtccatg 780 cccaatcccg agggccggta tacattcggc gccagctgtg tgactgcctg tccctacaac 840 tacctttcta cggacgtggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctgcacaa ccaagaggtg 900 acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc ccgagtgtgc 960 tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc caatatccag 1020 gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga gagctttgat 1080 ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt gtttgagact 1140 ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct gcctgacctc 1200 agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg cgcctactcg 1260 ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag ggaactgggc 1320 agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac ggtgccctgg 1380 gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg gccagaggac 1440 gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca ctgctggggt 1500 ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga gtgcgtggag 1560 gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca ctgtttgccg 1620 tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggact ggaggctgac 1680 cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg ctgccccagc 1740 ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga ggagggcgca 1800 tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga caagggctgc 1860 cccgccgagc agagagccag ccctctgacg gtcgacggtg gtagtccgac acctccgaca 1920 cccgggggtg gttctgcaga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 1980 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 2040 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 2100 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 2160 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 2220 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 2280 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatgc 2340 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc 2400 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 2460 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 2520 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2580 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ccggaggcct gaacgacatc 2640 ttcgaggccc agaagattga atggcacgag 2670 <210> 6 <211> 890 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Her2 ECD-Fc(knob) <400> 6 Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln 20 25 30 Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser 35 40 45 Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile 50 55 60 Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val 65 70 75 80 Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp 85 90 95 Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro 100 105 110 Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys 115 120 125 Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr 130 135 140 Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr 145 150 155 160 Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met 165 170 175 Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser 180 185 190 Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro 195 200 205 Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly 210 215 220 Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly 225 230 235 240 Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr 245 250 255 Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser 260 265 270 Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser 275 280 285 Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp 290 295 300 Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys 305 310 315 320 Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser 325 330 335 Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu 340 345 350 Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala 355 360 365 Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile 370 375 380 Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu 385 390 395 400 Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn 405 410 415 Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly 420 425 430 Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His 435 440 445 Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe 450 455 460 Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp 465 470 475 480 Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly 485 490 495 His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe 500 505 510 Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu 515 520 525 Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu 530 535 540 Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Leu Glu Ala Asp 545 550 555 560 Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala 565 570 575 Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp 580 585 590 Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys 595 600 605 Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln 610 615 620 Arg Ala Ser Pro Leu Thr Val Asp Gly Gly Ser Pro Thr Pro Pro Thr 625 630 635 640 Pro Gly Gly Gly Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 645 650 655 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 660 665 670 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 675 680 685 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 690 695 700 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 705 710 715 720 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 725 730 735 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 740 745 750 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 755 760 765 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu 770 775 780 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 785 790 795 800 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 805 810 815 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 820 825 830 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 835 840 845 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 850 855 860 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile 865 870 875 880 Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 885 890 <210> 7 <211> 2670 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Her2 ECD(pertuzumab KO)-Fc(knob)DNA <400> 7 acccaagtgt gcaccggcac agacatgaag ctgcggctcc ctgccagtcc cgagacccac 60 ctggacatgc tccgccacct ctaccagggc tgccaggtgg tgcagggaaa cctggaactc 120 acctacctgc ccaccaatgc cagcctgtcc ttcctgcagg atatccagga ggtgcagggc 180 tacgtgctca tcgctcacaa ccaagtgagg caggtcccac tgcagaggct gcggattgtg 240 cgaggcaccc agctctttga ggacaactat gccctggccg tgctagacaa tggagacccg 300 ctgaacaata ccacccctgt cacaggggcc tccccaggag gcctgcggga gctgcagctt 360 cgaagcctca cagagatctt gaaaggaggg gtcttgatcc agcggaaccc ccagctctgc 420 taccaggaca cgattttgtg gaaggacatc ttccacaaga acaaccagct ggctctcaca 480 ctgatagaca ccaaccgctc tcgggcctgc cacccctgtt ctccgatgtg taagggctcc 540 cgctgctggg gagagagttc tgaggattgt cagagcctga cgcgcactgt ctgtgccggt 600 ggctgtgccc gctgcaaggg gccactgccc actgactgct gccatgagca gtgtgctgcc 660 ggctgcacgg gccccaagca ctctgactgc ctggcctgcc tccacttcaa ccacagtggc 720 atctgtgagc tgcactgccc agccctggtc acctacaaca cagacacgcg ggagtccatg 780 cccaatcccg agggccggta tagattcggc gccagctgtg tgactgcctg tccctacaac 840 tacctttcta cggaccgggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctggccaa ccaagaggtg 900 acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc ccgagtgtgc 960 tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc caatatccag 1020 gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga gagctttgat 1080 ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt gtttgagact 1140 ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct gcctgacctc 1200 agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg cgcctactcg 1260 ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag ggaactgggc 1320 agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac ggtgccctgg 1380 gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg gccagaggac 1440 gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca ctgctggggt 1500 ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga gtgcgtggag 1560 gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca ctgtttgccg 1620 tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggact ggaggctgac 1680 cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg ctgccccagc 1740 ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga ggagggcgca 1800 tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga caagggctgc 1860 cccgccgagc agagagccag ccctctgacg gtcgacggtg gtagtccgac acctccgaca 1920 cccgggggtg gttctgcaga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 1980 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 2040 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 2100 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 2160 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 2220 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 2280 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatgc 2340 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc 2400 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 2460 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 2520 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2580 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ccggaggcct gaacgacatc 2640 ttcgaggccc agaagattga atggcacgag 2670 <210> 8 <211> 890 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Her2 ECD(pertuzumab KO)-Fc(knob) <400> 8 Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln 20 25 30 Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser 35 40 45 Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile 50 55 60 Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val 65 70 75 80 Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp 85 90 95 Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro 100 105 110 Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys 115 120 125 Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr 130 135 140 Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr 145 150 155 160 Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met 165 170 175 Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser 180 185 190 Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro 195 200 205 Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly 210 215 220 Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly 225 230 235 240 Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr 245 250 255 Arg Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Arg Phe Gly Ala Ser 260 265 270 Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Arg Gly Ser 275 280 285 Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu Ala Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp 290 295 300 Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys 305 310 315 320 Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser 325 330 335 Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu 340 345 350 Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala 355 360 365 Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile 370 375 380 Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu 385 390 395 400 Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn 405 410 415 Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly 420 425 430 Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His 435 440 445 Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe 450 455 460 Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp 465 470 475 480 Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly 485 490 495 His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe 500 505 510 Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu 515 520 525 Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu 530 535 540 Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Leu Glu Ala Asp 545 550 555 560 Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala 565 570 575 Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp 580 585 590 Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys 595 600 605 Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln 610 615 620 Arg Ala Ser Pro Leu Thr Val Asp Gly Gly Ser Pro Thr Pro Pro Thr 625 630 635 640 Pro Gly Gly Gly Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 645 650 655 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 660 665 670 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 675 680 685 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 690 695 700 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 705 710 715 720 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 725 730 735 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 740 745 750 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 755 760 765 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu 770 775 780 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 785 790 795 800 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 805 810 815 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 820 825 830 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 835 840 845 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 850 855 860 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile 865 870 875 880 Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 885 890 <210> 9 <211> 2667 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Her2 ECD(trastuzumab KO)-Fc(knob)DNA <400> 9 acccaagtgt gcaccggcac agacatgaag ctgcggctcc ctgccagtcc cgagacccac 60 ctggacatgc tccgccacct ctaccagggc tgccaggtgg tgcagggaaa cctggaactc 120 acctacctgc ccaccaatgc cagcctgtcc ttcctgcagg atatccagga ggtgcagggc 180 tacgtgctca tcgctcacaa ccaagtgagg caggtcccac tgcagaggct gcggattgtg 240 cgaggcaccc agctctttga ggacaactat gccctggccg tgctagacaa tggagacccg 300 ctgaacaata ccacccctgt cacaggggcc tccccaggag gcctgcggga gctgcagctt 360 cgaagcctca cagagatctt gaaaggaggg gtcttgatcc agcggaaccc ccagctctgc 420 taccaggaca cgattttgtg gaaggacatc ttccacaaga acaaccagct ggctctcaca 480 ctgatagaca ccaaccgctc tcgggcctgc cacccctgtt ctccgatgtg taagggctcc 540 cgctgctggg gagagagttc tgaggattgt cagagcctga cgcgcactgt ctgtgccggt 600 ggctgtgccc gctgcaaggg gccactgccc actgactgct gccatgagca gtgtgctgcc 660 ggctgcacgg gccccaagca ctctgactgc ctggcctgcc tccacttcaa ccacagtggc 720 atctgtgagc tgcactgccc agccctggtc acctacaaca cagacacgtt tgagtccatg 780 cccaatcccg agggccggta tacattcggc gccagctgtg tgactgcctg tccctacaac 840 tacctttcta cggacgtggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctgcacaa ccaagaggtg 900 acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc ccgagtgtgc 960 tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc caatatccag 1020 gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga gagctttgat 1080 ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt gtttgagact 1140 ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct gcctgacctc 1200 agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg cgcctactcg 1260 ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag ggaactgggc 1320 agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac ggtgccctgg 1380 gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg gccagaggac 1440 gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca ctgctggggt 1500 ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga gtgcgtggag 1560 gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca ctgtttgccg 1620 tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggact ggaggctcgg 1680 cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac agacggtgcg tggcccgctg ccccagcggt 1740 gtgaaacctg acctctccta catgcccatc tggaagtttc cagatgagga gggcgcatgc 1800 cagccttgcc ccatcaactg cacccactcc tgtgtggacc tggatgacaa gggctgcccc 1860 gccgagcaga gagccagccc tctgacggtc gacggtggta gtccgacacc tccgacaccc 1920 gggggtggtt ctgcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 1980 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 2040 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 2100 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 2160 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 2220 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 2280 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg 2340 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 2400 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 2460 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 2520 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 2580 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatccg gaggcctgaa cgacatcttc 2640 gaggcccaga agattgaatg gcacgag 2667 <210> 10 <211> 889 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Her2 ECD(trastuzumab KO)-Fc(knob) <400> 10 Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln 20 25 30 Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser 35 40 45 Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile 50 55 60 Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val 65 70 75 80 Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp 85 90 95 Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro 100 105 110 Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys 115 120 125 Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr 130 135 140 Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr 145 150 155 160 Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met 165 170 175 Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser 180 185 190 Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro 195 200 205 Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly 210 215 220 Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly 225 230 235 240 Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr 245 250 255 Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser 260 265 270 Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser 275 280 285 Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp 290 295 300 Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys 305 310 315 320 Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser 325 330 335 Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu 340 345 350 Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala 355 360 365 Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile 370 375 380 Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu 385 390 395 400 Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn 405 410 415 Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly 420 425 430 Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His 435 440 445 Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe 450 455 460 Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp 465 470 475 480 Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly 485 490 495 His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe 500 505 510 Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu 515 520 525 Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu 530 535 540 Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Leu Glu Ala Arg 545 550 555 560 Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Arg Arg Cys Val Ala Arg 565 570 575 Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys 580 585 590 Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr 595 600 605 His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg 610 615 620 Ala Ser Pro Leu Thr Val Asp Gly Gly Ser Pro Thr Pro Pro Thr Pro 625 630 635 640 Gly Gly Gly Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 645 650 655 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 660 665 670 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 675 680 685 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 690 695 700 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 705 710 715 720 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 725 730 735 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 740 745 750 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 755 760 765 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 770 775 780 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 785 790 795 800 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 805 810 815 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 820 825 830 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 835 840 845 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 850 855 860 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe 865 870 875 880 Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 885 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt VL CDR1 <400> 11 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt VL CDR2 <400> 12 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt VL CDR3 <400> 13 Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt VH CDR1 <400> 14 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp 1 5 10 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt VH CDR2 <400> 15 Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt VH CDR3 <400> 16 Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab wt VL CDR1 <400> 17 Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab wt VL CDR2 <400> 18 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab wt VL CDR3 <400> 19 Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab wt VH CDR1 <400> 20 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 21 <211> 558 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt VH (10289)DNA <400> 21 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcacc gactacacca tggactgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtggccgac gtgaacccca acagcggcgg cagcatctac 180 aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg agcgtggaca gaagcaagaa caccctgtac 240 ctccagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggaacctg 300 ggccccagct tctacttcga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcgct 360 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagc 558 <210> 22 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt VH (10289) <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt VL(10290)DNA <400> 23 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacacagg cgtgcccagc 180 cggttcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacatct acccctacac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt VL(10290) <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Trast. L3)(10403)DNA <400> 25 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Trast. L3)(10403) <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Trast. H91)(10404)DNA <400> 27 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacacagg cgtgcccagc 180 cggttcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacatct acccctacac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Trast. H91)(10404) <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab wt VH CDR2 <400> 29 Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab wt VH CDR3 <400> 30 Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Tras.L3) K24R(10949)DNA <400> 31 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgcc gggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 32 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Tras.L3) K24R(10949) <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 33 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL(Tras.L3) S30N (10950)DNA <400> 33 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgaac atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL(Tras.L3) S30N (10950) <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Tras.L3) I31T (10951)DNA <400> 35 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc accggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Tras.L3) I31T (10951) <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Tras.L3) I31V (10952)DNA <400> 37 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc gtcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 38 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Tras.L3) I31V <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Val Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Tras.L3) G32A(10953)DNA <400> 39 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcgccgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL (Tras.L3) G32A(10953) <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 41 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL(Tras.L3) Y53F(10954)DNA <400> 41 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc ggtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab VL(Tras.L3) Y53F(10954) <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 43 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) R54L(10955)DNA <400> 43 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc tgtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) R54L(10955) <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 45 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) T56S(10956)DNA <400> 45 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacagcgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) T56S(10956) <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) G66R(10957)DNA <400> 47 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagccgctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) G66R(10957) <400> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 49 <211> 320 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) T94Y(10958)DNA <400> 49 acatccagat gacccagagc cccagcagcc tgagcgccag cgtgggcgac agagtgacca 60 tcacatgcaa ggccagccag gacgtgtcca tcggcgtggc ctggtatcag cagaagcccg 120 gcaaggcccc caagctgctg atctacagcg ccagctaccg gtacaccggc gtgcccagca 180 gattcagcgg cagcggctcc ggcaccgact tcaccctgac catcagcagc ctgcagcccg 240 aggacttcgc cacctactac tgccagcagc actacaccta cccccccacc ttcggccagg 300 gcaccaaggt ggaaatcaag 320 <210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) T94Y(10958) <400> 50 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 51 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) P96Y(10959)DNA <400> 51 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccctacac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) P96Y(10959) <400> 52 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 53 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) (QM) (11055)DNA <400> 53 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc acagccgtgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc ggtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac atttggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) (QM) (11055) <400> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone D1-derived VH CDR1 <400> 55 Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Thr Met Asp 1 5 10 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone D1- derived VH CDR3 <400> 56 Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone B2- VH CDR3 <400> 57 Asn Leu Gly Pro Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone E1- VH CDR1 <400> 58 Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Thr Met Asp 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone E1- VH CDR3 <400> 59 Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone G2- VH CDR2 <400> 60 Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Tyr Ile Val Asn Arg Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 61 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone D1 DNA <400> 61 gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60 agctgtgcag caagcggttt tacctttaac gattatacca tggattgggt tcgtcaggca 120 ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga atagcggtgg tagcatttat 180 aaccagcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240 ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaacctg 300 ggtccgttct tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357 <210> 62 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone D1 <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone D1-derived DNA <400> 63 gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60 agctgtgcag caagcggttt tacctttaac gattatacca tggattgggt tcgtcaggca 120 ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga atagcggtgg tagcattgtt 180 aaccgtcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240 ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaacctg 300 ggtccgttct tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357 <210> 64 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone D1-derived <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone B2 DNA <400> 65 gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60 agctgtgcag caagcggttt tacctttaac gattatacca tggattggtt tcgtcaggca 120 ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga atagcggtgg tagcatttat 180 aaccagcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240 ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaatctg 300 ggtccgaact tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357 <210> 66 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone B2 <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 67 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone E1 DNA <400> 67 gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60 agctgtgcag caagcggttt tacctttgca gattatacca tggattgggt tcgtcaggca 120 ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga atagcggtgg tagcatttat 180 aaccagcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240 ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaatctg 300 ggtccgtggt tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357 <210> 68 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone E1 <400> 68 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone G2 DNA <400> 69 gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60 agctgtgcag caagcggttt tacctttacc gattacacaa tggattgggt tcgtcaggca 120 ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga actctggtgg ttacattgtt 180 aaccgtcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240 ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaatctg 300 ggtccgagct tctattttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357 <210> 70 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone G2 <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Tyr Ile Val Asn Arg Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone C8 DNA <400> 71 gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60 agctgtgcag caagcggttt tacctttacc gattacacaa tggattgggt tcgtcaggca 120 ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga actctggtgg ttctattatg 180 aaccgtcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240 ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaatctg 300 ggtccgagct tctattttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357 <210> 72 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone C8 <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Met Asn Arg Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone A1 DNA <400> 73 gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60 agctgtgcag caagcggttt tacctttacc gattacacaa tggattgggt tcgtcaggca 120 ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga actctggtgg ttctattgtt 180 aaccagcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240 ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaatctg 300 ggtccgtggt tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357 <210> 74 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone A1 <400> 74 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone C8- VH CDR2 <400> 75 Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Met Asn Arg Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone A1- VH CDR2 <400> 76 Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Gln Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab aff.mat. clone D1-derived VH CDR2 <400> 77 Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (D98N)(6636)CDR3 <400> 78 Trp Gly Gly Asn Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (D98E)(6637)CDR3 <400> 79 Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (D98T)(6638)CDR3 <400> 80 Trp Gly Gly Thr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 81 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VL(4245)DNA <400> 81 gacatccaga tgacccagag cccaagctct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgca gagccagcca ggacgtgaac acagccgtgg cctggtatca gcagaagcca 120 ggcaaggccc caaagctgct gatctacagc gccagcttcc tgtacagcgg cgtgccaagc 180 agattcagcg gcagcagaag cggcacagac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagcca 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccaccaac cttcggacag 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 82 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VL(4245) <400> 82 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 83 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VL T31A (6641)DNA <400> 83 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggacgtgaac gccgctgtag cgtggtacca gcagaaacca 120 ggtaaggcac cgaagctatt aatttatagt gcgagcttcc tgtacagtgg ggtcccgtcg 180 cgttttagcg gctctcgatc cggcacggat tttaccctga ccattagcag cctgcagcct 240 gaagactttg cgacatatta ttgccaacag cactacacaa ctcctcccac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa a 321 <210> 84 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VL T31A (6641) <400> 84 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Ala Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 85 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VL T31V (6642)DNA <400> 85 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggacgtgaac gtggctgtag cgtggtacca gcagaaacca 120 ggtaaggcac cgaagctatt aatttatagt gcgagcttcc tgtacagtgg ggtcccgtcg 180 cgttttagcg gctctcgatc cggcacggat tttaccctga ccattagcag cctgcagcct 240 gaagactttg cgacatatta ttgccaacag cactacacaa ctcctcccac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa ag 322 <210> 86 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VL T31V (6642) <400> 86 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (G99A)(6639)CDR3 <400> 87 Trp Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (G99S)(6640)CDR3 <400> 88 Trp Gly Gly Asp Ser Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) (QM)-CDR1 <400> 89 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab (Tras.L3) (QM)-CDR2 <400> 90 Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr 1 5 <210> 91 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (11345)DNA <400> 91 gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300 ggagacgggt tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 <210> 92 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (11345) <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 93 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (D98N)(6636)DNA <400> 93 gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300 ggaaacgggt tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 <210> 94 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (D98N)(6636) <400> 94 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asn Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 95 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (D98E)(6637)DNA <400> 95 gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300 ggagaggggt tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 <210> 96 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (D98E)(6637) <400> 96 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 97 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (D98T)(6638)DNA <400> 97 gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300 ggaaccgggt tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 <210> 98 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (D98T)(6638) <400> 98 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Thr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 99 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (G99A)(6639)DNA <400> 99 gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300 ggagacgcct tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 <210> 100 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (G99A)(6639) <400> 100 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 101 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (G99S)(6640)DNA <400> 101 gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300 ggagacagct tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 <210> 102 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (G99S)(6640) <400> 102 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Ser Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 103 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VL T31A (6641)CDR1 <400> 103 Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Ala Ala Val Ala 1 5 10 <210> 104 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VL T31V (6642)CDR1 <400> 104 Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala Val Ala 1 5 10 <210> 105 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab CDRG VH (D98ECDRG) <400> 105 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 106 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab CDRG VL (N30TCDRG) <400> 106 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg 100 105 <210> 107 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab CDRG VL CDR1 <400> 107 Gly Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 108 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab CDRG VH CDR2 <400> 108 Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 109 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> XPertuzumab heavy chain (VHCL) <400> 109 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 130 135 140 Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 145 150 155 160 Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 165 170 175 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 180 185 190 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 195 200 205 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 210 215 220 Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 110 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab light chain (VLCH1) <400> 110 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr 100 105 110 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 130 135 140 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 145 150 155 160 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 180 185 190 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 195 200 205 Pro Lys Ser Cys 210 <210> 111 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab CDRG heavy chain (VHCH1) <400> 111 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 112 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab CDRG light chain (VLCL) <400> 112 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 113 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt CL <400> 113 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 114 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab wt CH1 <400> 114 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 115 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab CH1 <400> 115 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 100 105 <210> 116 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab CL <400> 116 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 117 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VH (D98E) <400> 117 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 118 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab VL (T31V) <400> 118 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 119 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab heavy chain <400> 119 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 130 135 140 Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 145 150 155 160 Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 165 170 175 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 180 185 190 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 195 200 205 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 210 215 220 Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 120 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab light chain <400> 120 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 121 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> XTrastuzumab heavy chain <400> 121 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 122 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> XTrastuzumab light chain <400> 122 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr 100 105 110 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 130 135 140 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 145 150 155 160 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 180 185 190 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 195 200 205 Pro Lys Ser Cys 210 <210> 123 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain (kappa) [Trastuzumab 1016] <400> 123 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 124 <211> 711 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain [Trastuzumab + scFv Omnitarg RB40] <400> 124 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 465 470 475 480 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 485 490 495 Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp 500 505 510 Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg 515 520 525 Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu 530 535 540 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 545 550 555 560 Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 565 570 575 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 580 585 590 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 595 600 605 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 610 615 620 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr 625 630 635 640 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 645 650 655 Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 660 665 670 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 675 680 685 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Cys 690 695 700 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 705 710 <210> 125 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain [scFv Trastuzumab + Omnitarg RB34] <400> 125 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr 165 170 175 Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp 210 215 220 Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 260 265 270 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile 275 280 285 Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 290 295 300 Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 305 310 315 320 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 325 330 335 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro 340 345 350 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 355 360 365 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 370 375 380 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 385 390 395 400 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 405 410 415 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 420 425 430 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 435 440 445 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 450 455 460 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 465 470 <210> 126 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain (Omnitarg RB33) <400> 126 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 127 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain [Trastuzumab + scFvOmnitarg RB35] <400> 127 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 225 230 235 240 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln 245 250 255 Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 260 265 270 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro 275 280 285 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 290 295 300 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 305 310 315 320 Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 325 330 335 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 340 345 350 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 355 360 365 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr 370 375 380 Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 385 390 395 400 Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 405 410 415 Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 420 425 430 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 435 440 445 Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 450 455 460 Leu Val Thr Val Ser Ser 465 470 <210> 128 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain [Trastuzumab 1036] <400> 128 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 129 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain (kappa) [Trastuzumab 1016] <400> 129 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 130 <211> 711 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain [Trastuzumab + scFvOmnitarg RB43] <400> 130 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 465 470 475 480 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile 485 490 495 Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 500 505 510 Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 515 520 525 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 530 535 540 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro 545 550 555 560 Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 565 570 575 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 580 585 590 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 595 600 605 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 610 615 620 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 625 630 635 640 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 645 650 655 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 660 665 670 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 675 680 685 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 690 695 700 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 <210> 131 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain [Trastuzumab + scFv Omnitarg RB61] <400> 131 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 225 230 235 240 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 245 250 255 Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln 260 265 270 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg 275 280 285 Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 290 295 300 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 305 310 315 320 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr 325 330 335 Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 340 345 350 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 355 360 365 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 370 375 380 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln 385 390 395 400 Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser 405 410 415 Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser 420 425 430 Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 435 440 445 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser 450 455 460 Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 465 470 475 480 <210> 132 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain [Trastuzumab 1036] <400> 132 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 133 <211> 696 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> scFab Trastuzumab heavy chain 1 <400> 133 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 245 250 255 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 260 265 270 Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 275 280 285 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr 290 295 300 Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr 305 310 315 320 Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 325 330 335 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala 340 345 350 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 355 360 365 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 370 375 380 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 385 390 395 400 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 405 410 415 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 420 425 430 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 435 440 445 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 450 455 460 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 465 470 475 480 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 485 490 495 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 500 505 510 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 515 520 525 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 530 535 540 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 545 550 555 560 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 565 570 575 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 580 585 590 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 595 600 605 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 610 615 620 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 625 630 635 640 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 645 650 655 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 660 665 670 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 675 680 685 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 690 695 <210> 134 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab heavy chain 2 <400> 134 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 355 360 365 Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 135 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab light chain 1 <400> 135 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 136 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab heavy chain 1 <400> 136 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 355 360 365 Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 137 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab light chain 1 <400> 137 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 138 <211> 696 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> scFab Trastuzumab heavy chain 2 <400> 138 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 465 470 475 480 Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 485 490 495 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn 500 505 510 Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 515 520 525 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 530 535 540 Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 545 550 555 560 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr 565 570 575 Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 580 585 590 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 595 600 605 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 610 615 620 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 625 630 635 640 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 645 650 655 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 660 665 670 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 675 680 685 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 690 695 <210> 139 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> scFab Pertuzumab heavy chain 1 <400> 139 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 355 360 365 Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 465 470 475 480 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 485 490 495 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile 500 505 510 Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 515 520 525 Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 530 535 540 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 545 550 555 560 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro 565 570 575 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 580 585 590 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 595 600 605 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 610 615 620 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 625 630 635 640 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 645 650 655 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 660 665 670 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 675 680 685 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 690 695 <210> 140 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab heavy chain 2 <400> 140 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 141 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab light chain 2 <400> 141 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu 210 <210> 142 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab heavy chain 1 <400> 142 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 143 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab light chain 1 <400> 143 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 144 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> scFab Pertuzumab heavy chain 2 <400> 144 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 355 360 365 Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 465 470 475 480 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 485 490 495 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile 500 505 510 Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 515 520 525 Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 530 535 540 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 545 550 555 560 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro 565 570 575 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 580 585 590 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 595 600 605 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 610 615 620 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 625 630 635 640 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 645 650 655 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 660 665 670 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 675 680 685 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 690 695 <210> 145 <211> 701 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain with scFv Trastuzumab stabilized with disulphide bonding <400> 145 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 450 455 460 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 465 470 475 480 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val 485 490 495 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro 500 505 510 Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 515 520 525 Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 530 535 540 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly 545 550 555 560 Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Cys Gly Thr Leu Val Thr 565 570 575 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 580 585 590 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 595 600 605 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn 610 615 620 Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Cys Pro Lys Leu 625 630 635 640 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 645 650 655 Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 660 665 670 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr 675 680 685 Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 690 695 700 <210> 146 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pertuzumab light chain <400> 146 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 147 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> LMB3 <400> 147 caggaaacag ctatgaccat gattac 26 <210> 148 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AM_omni_H1_TN-ba <400> 148 ccggtgcctg acgaacccaa tccataaagg taaaaccgct tgctgcacag ctc 53 <210> 149 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> RJH108 (omni_3H1_fo) <400> 149 atggattggg ttcgtcaggc accgggtaaa gg 32 <210> 150 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> RJH109 (omni_5H3_re) <400> 150 attacgtgca caataataca ctgcggtatc ctc 33 <210> 151 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AM_omni_H3_TN_fo <400> 151 taccgcagtg tattattgtg cacgtttctt tgattattgg ggtcagggca ccctggttac 60 <210> 152 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> RJH99 <400> 152 ggctgagact cctcaagaga aggattag 28 <210> 153 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> RJH110(omni_5H2_ba) <400> 153 attaacatct gcaacccatt ccagaccttt ac 32 <210> 154 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AM_omni_h2_TN_fo <400> 154 ggtctggaat gggttgcaga tgttaatggt attaaccgtt ttaaaggtcg ttttaccctg 60 ag 62 <210> 155 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Leader peptide <400> 155 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 156 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Leader peptide <400> 156 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys 20 <210> 157 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Leader peptide <400> 157 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 158 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab VL N30S CDR1 <400> 158 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 159 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab VHCH1- Fc KNOB <400> 159 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 160 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab VHCH1- Fc KNOB DNA <400> 160 gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300 ggagacgggt tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350 <210> 161 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Common light chain VLCL <400> 161 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 162 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Common light chain VLCL - DNA <400> 162 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc acagccgtgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc ggtacaccgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac atttggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 163 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pertuzumab VHCH1 Fc hole <400> 163 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 355 360 365 Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 164 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pertuzumab VHCH1 Fc hole DNA <400> 164 gaagttcagc tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60 agctgtgcag caagcggttt tacctttaac gattatacca tggattgggt tcgtcaggca 120 ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga atagcggtgg tagcattgtt 180 aaccgtcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240 ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaacctg 300 ggtccgttct tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagcgct 360 agcaccaagg gcccaagcgt gttccctctg gcccccagca gcaagagcac aagcggcgga 420 acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agcccgtgac agtgtcctgg 480 aacagcggag ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 540 ctgtacagcc tgagcagcgt ggtcacagtg cctagcagca gcctgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660 agctgcgaca agacccacac ctgtccccct tgtcctgccc ctgagctgct gggcggaccc 720 agcgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa 780 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca caatgccaag accaagcccc gggaggaaca gtacaacagc 900 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaggccctg cctgccccca tcgagaaaac catcagcaag 1020 gccaagggcc agcccagaga accccaggtg tgcaccctgc cccccagcag agatgagctg 1080 accaagaacc aggtgtccct gagctgtgcc gtcaagggct tctaccccag cgatatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 1200 gacagcgacg gcagcttctt cctggtgtcc aaactgaccg tggacaagag ccggtggcag 1260 cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320 aagtccctga gcctgagccc cggcaag 1347

Claims (22)

  1. HER2의 세포외 도메인 II에 특이적인 제1 항원 결합 부위 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 포함하고, HER2의 세포외 도메인 II 및 IV 둘다에 대해 1가인, HER2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    페르투추맙(Pertuzumab) 또는 트라스투추맙(Trastuzumab)의 조합물에 비해 더 높은 정도로 보체-의존성 세포독성을 유도하는 이중특이성 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    이중특이성 항체의 보체 의존성 세포독성이 락테이트 탈수소효소(LDH) 검정 또는 보체 검정에 의해 결정되고, 동일한 검정에 의해 결정시 페르투추맙 및 트라스투추맙의 조합물의 보체 의존성 세포독성에 비교되는 이중특이성 항체.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    보체 의존성 세포독성이 암 세포, 바람직하게는 유방암 세포 상에서 시험관내 결정되는 이중특이성 항체.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    HER2의 세포외 도메인 II에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 분자 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 분자를 포함하고, 여기서 제1 Fab 분자의 가변성 경쇄의 서열이 제2 Fab 분자의 가변성 경쇄의 서열과 동일한 이중특이성 항체.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) 서열 번호 55, 서열 번호 58 및 서열 번호 14로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR1,
    서열 번호 77, 서열 번호 15 및 서열 번호 60으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 56 또는 서열 번호 59 및 서열 번호 16으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3을 포함하는 제1 중쇄;
    (b) 서열 번호 20의 중쇄 CDR1,
    서열 번호 29의 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 30 및 서열 번호 79로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3을 포함하는 제2 중쇄; 및
    (c) 제1 및 제2 경쇄를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 경쇄의 가변성 경쇄가 서열 번호 89, 서열 번호 90 및 서열 번호 19의 CDR을 포함하는 이중특이성 항체.
  7. 제5항에 있어서,
    서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 가변성 경쇄, 서열 번호 64, 서열 번호 70 및 서열 번호 68로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제1 중쇄, 및 서열 번호 92 및 서열 번호 117로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 이중특이성 항체.
  8. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    HER2의 세포외 도메인 II에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 분자 및 HER2의 세포외 도메인 IV에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 분자를 포함하고, 여기서 하나 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역 또는 불변성 영역이 교환되는 이중특이성 항체.
  9. 제8항에 있어서,
    제1 Fab 분자가 서열 번호 14의 중쇄 CDR1, 서열 번호 15의 중쇄 CDR2 및 서열 번호 16의 중쇄 CDR3; 및 서열 번호 11의 경쇄 CDR1, 서열 번호 12의 경쇄 CDR2 및 서열 번호 13의 경쇄 CDR3을 포함하고, 제2 Fab 분자가 서열 번호 20의 중쇄 CDR1, 서열 번호 108의 중쇄 CDR2 및 서열 번호 79의 중쇄 CDR3; 및 서열 번호 107의 경쇄 CDR1, 서열 번호 18의 경쇄 CDR2 및 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는 이중특이성 항체.
  10. 제8항에 있어서,
    제1 Fab 분자가 서열 번호 14의 중쇄 CDR1, 서열 번호 15의 중쇄 CDR2 및 서열 번호 16의 중쇄 CDR3; 및 서열 번호 11의 경쇄 CDR1, 서열 번호 12의 경쇄 CDR2 및 서열 번호 13의 경쇄 CDR3을 포함하고, 제2 Fab 분자가 서열 번호 20의 중쇄 CDR1, 서열 번호 29의 중쇄 CDR2 및 서열 번호 79, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 87 및 서열 번호 88로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3; 및 서열 번호 104, 서열 번호 103 및 서열 번호 158로 구성된 군에서 선택된 경쇄 CDR1, 서열 번호 18의 경쇄 CDR2 및 서열 번호 19의 경쇄 CDR3을 포함하는 이중특이성 항체.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    제1 Fab 분자가 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변성 경쇄를 포함하고, 제2 Fab 분자가 서열 번호 105의 아미노산 서열 및 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 이중특이성 항체.
  12. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항의 이중특이성 항체를 포함하는 약학 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    암을 치료하기 위한 이중특이성 항체.
  14. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 이중특이성 항체.
  15. 약제를 제조하는데 있어서의 제1항 내지 제11항중 어느 한 항의 이중특이성 항체의 용도.
  16. 제15항에 있어서,
    약제가 암을 치료하기 위한 용도.
  17. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항의 이중특이성 항체의 중쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열.
  18. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항의 이중특이성 항체의 경쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열.
  19. 제17항 및/또는 제18항의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  20. 제19항에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  21. 항체를 생산하도록 제20항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
  22. 특히 앞의 예를 참고하여, 본원에 기재된 바와 같은 발명.
KR1020167016099A 2013-12-20 2014-12-18 이중특이성 her2 항체 및 사용 방법 KR20160099087A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13198819 2013-12-20
EP13198819.8 2013-12-20
PCT/EP2014/078375 WO2015091738A1 (en) 2013-12-20 2014-12-18 Bispecific her2 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160099087A true KR20160099087A (ko) 2016-08-19

Family

ID=49876448

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167016099A KR20160099087A (ko) 2013-12-20 2014-12-18 이중특이성 her2 항체 및 사용 방법

Country Status (11)

Country Link
US (2) US10584178B2 (ko)
EP (2) EP3083696B1 (ko)
JP (2) JP6510532B2 (ko)
KR (1) KR20160099087A (ko)
CN (2) CN105829347B (ko)
BR (1) BR112016010706A2 (ko)
CA (1) CA2925677A1 (ko)
HK (1) HK1223115A1 (ko)
MX (1) MX2016008098A (ko)
RU (1) RU2016129517A (ko)
WO (1) WO2015091738A1 (ko)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
LT2708559T (lt) 2008-04-11 2018-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigeną surišanti molekulė, galinti pakartotinai prisijungti prie dviejų ar daugiau antigeno molekulių
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
KR101638224B1 (ko) 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
EP3733714A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-04 Universität Zürich Her2-binding tetrameric polypeptides
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
JP6422956B2 (ja) * 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
RU2737882C2 (ru) 2013-11-27 2020-12-04 Займворкс Инк. Биспецифические антигенсвязывающие конструкции против her2
CA2925677A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific her2 antibodies and methods of use
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
EP3699198A1 (en) 2014-11-17 2020-08-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
CN110658340B (zh) 2015-01-08 2023-10-31 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物
US10556952B2 (en) 2015-03-30 2020-02-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to Fc gamma receptors
EP3294772A4 (en) * 2015-05-13 2019-05-01 Zymeworks Inc. BINDING CONSTRUCTS TO HER2 TARGETING ANTIGEN
KR20180012859A (ko) * 2015-06-17 2018-02-06 제넨테크, 인크. 항-her2 항체 및 이용 방법
ES2901133T3 (es) * 2015-09-23 2022-03-21 Regeneron Pharma Anticuerpos biespecíficos anti-CD3 optimizados y usos de los mismos
CN106554419A (zh) * 2015-09-28 2017-04-05 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 重组抗her2双特异性抗体、其制备方法和应用
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US10377833B2 (en) 2016-07-22 2019-08-13 Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd. Bispecific anti-HER2 antibody
CN107446045A (zh) * 2016-07-22 2017-12-08 北京天广实生物技术股份有限公司 一种抗her2的抗体、其药物组合物及用途
WO2018114728A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with a bispecific anti-ang2/vegf antibody and a bispecific anti-her2 antibody
JP7191833B2 (ja) * 2017-01-30 2022-12-19 中外製薬株式会社 抗スクレロスチン抗体およびその使用
CN108395480A (zh) * 2017-02-08 2018-08-14 广州百尼夫生物科技有限公司 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carher2-nkt细胞及其制备方法和应用
AU2018219887B2 (en) 2017-02-08 2024-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
EP4273258A3 (en) 2017-02-20 2024-01-17 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
CN110520442A (zh) * 2017-03-17 2019-11-29 本康生物制药（深圳）有限公司 多特异性抗体、抗体偶联物和相关的药物组合物及应用
WO2018191188A1 (en) * 2017-04-09 2018-10-18 Xiao Shouhua Biparatopic and multiparatopic antibodies with common light chain and method of use
CN117946278A (zh) * 2017-06-25 2024-04-30 西雅图免疫公司 多特异性抗体及其制备和使用方法
CN111356477B (zh) 2017-08-01 2024-08-30 Ab工作室有限公司 双特异性抗体及其用途
SG11202001930QA (en) * 2017-09-07 2020-04-29 Dragonfly Therapeutics Inc Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
AR115360A1 (es) 2018-02-08 2021-01-13 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno y métodos de uso
AU2019218136A1 (en) 2018-02-08 2020-08-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the NKG2D receptor
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
MX2020009469A (es) 2018-03-13 2021-01-29 Zymeworks Inc Conjugados de anticuerpo y farmaco anti-her2 biparatopicos y metodos de uso.
PE20210652A1 (es) * 2018-04-13 2021-03-26 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno dirigidas a her2 que comprenden 4-1bbl
CA3110513A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/c20 bispecific antibodies
AU2019358419A1 (en) * 2018-10-08 2021-04-15 Universität Zürich HER2-binding tetrameric polypeptides
EP3988574A4 (en) * 2019-02-03 2022-10-12 Shanghai Bao Pharmaceuticals Co., Ltd. AGAINST HER2 BI-SPECIFIC ANTIBODIES AND THEIR USE
CN113677403A (zh) 2019-04-12 2021-11-19 豪夫迈·罗氏有限公司 包含脂质运载蛋白突变蛋白的双特异性抗原结合分子
BR112022016232A2 (pt) * 2020-02-19 2022-11-16 Denali Therapeutics Inc Proteínas biespecíficas anti-her2 manipuladas
IL295312A (en) * 2020-02-28 2022-10-01 Regeneron Pharma Bispecific antigen binding molecules that bind her2 and methods of using them
US20230151116A1 (en) * 2020-03-27 2023-05-18 Jiangsu Alphamab Biopharmaceuticals Co., Ltd. Efficacious dose for her2 bispecific antibody
WO2021220215A1 (en) * 2020-05-01 2021-11-04 Novartis Ag Engineered immunoglobulins
IL297880A (en) 2020-06-23 2023-01-01 Hoffmann La Roche Agonistic cd28 antigen-binding molecules targeting her2
CN114057882B (zh) * 2020-07-31 2023-01-06 山东博安生物技术股份有限公司 多价多特异性抗体
US20230405141A1 (en) * 2020-08-13 2023-12-21 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Antibody drug conjugate
WO2022104186A1 (en) * 2020-11-16 2022-05-19 Tavotek Biotherapeutics (Hong Kong) Limited A shielded and homing bispecific antibody that simultaneously inhibits angiogenic pathway targets and her2 family proteins and uses thereof
CN114539413A (zh) * 2020-11-25 2022-05-27 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合her2的多价双特异性抗体、其制备方法和用途
JP2024509891A (ja) * 2021-03-08 2024-03-05 ジーンクアンタム ヘルスケア （スーチョウ） シーオー．， エルティーディー． 抗ｈｅｒ２抗体－免疫アゴニストコンジュゲート及びその使用
WO2023280092A1 (zh) * 2021-07-05 2023-01-12 江苏康宁杰瑞生物制药有限公司 抗体药物偶联物及其应用
CN113817065B (zh) * 2021-09-06 2023-04-18 深圳市乐土生物医药有限公司 一种抗her2的多肽及其用途
TW202340240A (zh) * 2021-11-17 2023-10-16 大陸商江蘇先聲藥業有限公司 多特異性抗體及其藥物用途
WO2024028731A1 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Transferrin receptor binding proteins for treating brain tumors
WO2024028732A1 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Cd98 binding constructs for treating brain tumors
WO2024061224A1 (zh) * 2022-09-20 2024-03-28 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗her2抗体及其用途
WO2024104933A1 (en) * 2022-11-15 2024-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules
CN116514998B (zh) * 2023-05-12 2023-09-15 再少年(北京)生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US6733752B1 (en) 1994-03-30 2004-05-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Prevention of tumors with monoclonal antibodies against neu
IL132560A0 (en) * 1997-05-02 2001-03-19 Genentech Inc A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US20040110226A1 (en) * 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
US7332585B2 (en) * 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
AU2003224916B2 (en) 2002-04-10 2009-01-08 Genentech, Inc. Anti-HER2 antibody variants
US7709610B2 (en) * 2003-05-08 2010-05-04 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
US20060003412A1 (en) * 2003-12-08 2006-01-05 Xencor, Inc. Protein engineering with analogous contact environments
KR20120068807A (ko) 2004-07-22 2012-06-27 제넨테크, 인크. Ｈｅｒ２ 항체 조성물
GB0624500D0 (en) * 2006-12-07 2007-01-17 Istituto Superiore Di Sanito A novel passive vaccine for candida infections
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
CA2761233A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US20110082052A1 (en) * 2009-08-11 2011-04-07 Academia Sinica Phage displaying system expressing single chain antibody
WO2011035456A1 (zh) 2009-09-25 2011-03-31 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 通过计算机辅助设计来获得高亲和力的蛋白质的方法
RU2580038C2 (ru) * 2009-12-04 2016-04-10 Дженентек, Инк. Мультиспецифические антитела, аналоги антител, композиции и способы
PT2330131E (pt) * 2009-12-07 2015-01-14 Fundació Privada Institució Catalana De Recerca I Estudis Avancats Anticorpos contra a variante truncada de her-2 ctf-611
ES2594893T3 (es) * 2009-12-16 2016-12-23 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anticuerpos anti HER2 y sus usos
TW201138821A (en) * 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
JP6082344B2 (ja) * 2010-05-27 2017-02-15 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２エピトープに対するモノクローナル抗体
US10208129B2 (en) * 2010-12-06 2019-02-19 National Research Council Of Canada Antibodies selective for cells presenting ErbB2 at high density
WO2012085113A1 (en) * 2010-12-23 2012-06-28 Roche Diagnostics Gmbh Binding agent
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
CA2832389A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
CA2832387A1 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecifc antibodies against her2
EP2748202B1 (en) 2011-08-23 2018-07-04 Roche Glycart AG Bispecific antigen binding molecules
EP2906596B1 (en) * 2012-10-12 2023-12-27 Arizona Board of Regents on behalf of Arizona State University Antibody based reagents that specifically recognize toxic oligomeric forms of tau
DK3736292T3 (da) 2013-12-17 2024-07-22 Genentech Inc Anti-CD3-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse
CA2925677A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific her2 antibodies and methods of use
US9629801B2 (en) * 2014-01-10 2017-04-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Blood-brain barrier targeting antibodies
CA2874083C (en) * 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
CN110658340B (zh) * 2015-01-08 2023-10-31 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物

Also Published As

Publication number Publication date
EP3083696B1 (en) 2018-02-14
CN112062853A (zh) 2020-12-11
CN105829347B (zh) 2020-09-08
US10584178B2 (en) 2020-03-10
US20170029529A1 (en) 2017-02-02
JP6510532B2 (ja) 2019-05-08
CA2925677A1 (en) 2015-06-25
US11787873B2 (en) 2023-10-17
JP2017501706A (ja) 2017-01-19
JP2019141066A (ja) 2019-08-29
HK1223115A1 (zh) 2017-07-21
JP7077263B2 (ja) 2022-05-30
CN105829347A (zh) 2016-08-03
BR112016010706A2 (pt) 2017-12-05
EP3327038B1 (en) 2020-09-23
EP3327038A2 (en) 2018-05-30
WO2015091738A1 (en) 2015-06-25
EP3083696A1 (en) 2016-10-26
RU2016129517A (ru) 2018-01-25
EP3327038A3 (en) 2018-06-13
CN112062853B (zh) 2024-01-09
MX2016008098A (es) 2017-01-11
US20200291131A1 (en) 2020-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112062853B (zh) 双特异性her2抗体及使用方法
CN107531788B (zh) 对her2和血脑屏障受体特异性的三特异性抗体及使用方法
JP6998869B2 (ja) 多重特異性抗体のスクリーニング方法
KR20240024318A (ko) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 CD3 ABD 엽산 수용체 1(FolR1) 및 PD-1 축 결합 길항물질의 조합 요법
JP2021510521A (ja) Ｐｄ−１に対する単一ドメイン抗体及びその変異体
JP7248761B2 (ja) 抗ｂｒｄｕ抗体および使用方法
KR20230017841A (ko) Cd3 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 및 이의 용도
CA3164283A1 (en) Anti-tigit antibodies, multispecific antibodies comprising the same and methods of using the same
KR20230137393A (ko) Psma 결합 단백질 및 이의 용도
WO2017004149A1 (en) Multi-specific binding proteins
US11396549B2 (en) Anti-colony stimulating factor 1 receptor (CSF1R) antibodies and methods of use thereof for treating cancer
KR20230163485A (ko) 면역 이펙터 세포 재유도를 위한 물질 및 방법
US11820816B2 (en) Anti-VEGF antibodies and methods of use
CN107002114A (zh) 用于确定cdc引发抗体的测定试验和方法
CN115135675A (zh) 融合蛋白及其用途
WO2024140996A2 (en) Anti-pdl1/vegf antibodies and methods of use
KR20240004694A (ko) 항체

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid