CN107002114A - 用于确定cdc引发抗体的测定试验和方法 - Google Patents
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Abstract
本文报道一种用于确定组合物的补体依赖性细胞毒性的方法，其中所述组合物包含：i)特异性结合第一抗原上的第一表位的第一结合位点，其与人源的第一Fc区多肽缀合，以及ii)特异性结合第一抗原上或第二抗原上的第二表位的第二结合位点，其与人源的第二Fc区多肽缀合，其中所述方法包括以下步骤：用组合物孵育表达第一抗原或第一抗原和第二抗原的人细胞；向混合物中加入兔补体；和测定细胞裂解，从而确定组合物的补体依赖性细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测/选择效应子功能引发抗体和抗体组合的测定试验和方法领域。
背景技术
免疫球蛋白含有用于结合某些Fc受体(如FcRn)以及Clq的两个结合位点，在重链Fc区域中各有一个。
对于补体活化，需要一个以上的免疫球蛋白分子，因为单体IgG对Clq的亲和力相当弱(亲和力约为10-4M)(参见例如Sledge等人，J.Biol.Chem.248(1973)2818-2813，Hughes-Jones等人，Mol.Immunol.16(1979)697-701)。多价C1q的结合可以通过免疫球蛋白分子的基于抗原的缔合而增加，从而增加补体活化(约10-8M的亲合力)(参见例如Burton等人，Mol.Immunol.22(1990)161-206)。
Clq的三维结构类似于包含六个球形头的一束郁金香，其中球形头包含抗体结合区(参见例如Perkins等人，Biochem.J.228(1985)13-26，Poon等人，J.Mol.Biol.168(1983)563-577，Reid等人，Biochem.Soc.Trans.11(1983)1-12和Weiss等人，J.Mol.Biol.189(1986)573-581)。
在US 5,851,528中报道了抑制补体活化的方法。US 8,034,902中报道了针对CD55和CD59的重组抗体及其用途。在US 2012/0226020中报道了调节补体活化的杂交和嵌合多肽。US 2013/0302355报道了新的调节剂和使用方法。在US 2010/0255011中报道了用于调节靶细胞上的补体调节蛋白的活性的组合物和方法。
在WO 2008/007648中报道了分类抗体，包括将能够识别细胞表面抗原的抗体与相同种类的细胞接触，分析每个细胞并比较获得的数据和根据相似性对各个抗体进行分类。在WO 2010/120541中报道了用于调节靶细胞上的补体调节蛋白的活性的组合物和方法。
Mekhaiel，D.N.A.等人报道了具有修饰的效应子功能的聚合人Fc-融合蛋白(Nature Sci.Rep.1(2011)1-11)。在WO 00/42072中报道了具有改变的效应子功能的多肽变体。在US 2008/0089892中报道了Fc区变体。在WO 2006/105062中报道了改变的抗体Fc区及其用途。
新生兔补体被用来借助抗体从不同的复合免疫细胞群体中消耗淋巴细胞以利于移植(参见例如Herve，P.等人，Transplant.39(1985)138-143)。
幼兔补体在使用鼠源抗体的肾细胞癌(RCC)中未成功引发补体依赖性细胞毒性(CDC)(参见例如Vessella，R.L.等人，Canc.Res.45(1985)6131-6139)。
使用结合p97(＝黑素运铁蛋白)的单个和配对的鼠IgG2a抗体，兔血清可以通过CDC杀死人SK-Mel28黑素瘤细胞(非上皮细胞＝非癌(non-carcinoma))(参见例如Hellstroem，I.等人，Int.J.Canc.31(1983)553-555)。
与单核细胞和嗜中性粒细胞相比，膜结合的补体调节蛋白(mCRPs)在淋巴细胞上具有较低的表达水平(参见例如，Nuutila，J.等人，Hum.Immunol.44(2013)522-530)。
作为免疫逃逸机制的mCRPs上调在大多数癌细胞上比例如在淋巴瘤或黑素瘤上更显著。(参见例如Fishelson，Z.等人，Mol.Immunol。40(2003)109-123)。
使用抗体在具有同基因(syngeneic)血清(例如正常人血清(NHS)连同人癌细胞和人抗体)的设定下显示CDC，而没有mCRPs的CDC抑制作用(参见例如Dechant等人，2008，Cancer Research)；或在同基因血清(例如正常人血清(NHS)以及人癌细胞和人抗体)下显示出强烈的mCRP依赖性CDC抑制作用，该抑制作用不得不通过mCRP CD46，CD55和CD59的siRNA依赖性下调来克服(参见例如Mamidi，S.等人，Mol.Onc.7(2013)580-594)。
Konishi,e.等人报道了利用补体依赖性细胞毒性来测量低水平的抗体：在日本脑炎病毒模型中应用于非结构蛋白1(Clin.Vac.Immunol.15(2008)88-94)。Klitgaard，J.等人报道了两种抗Cos单克隆抗体的组合协同诱导慢性淋巴细胞性白血病细胞的补体依赖性细胞毒性(Brit.J.Hematol.163(2013)182-193)。Hellstrom，I.等人报道了对黑素瘤抗原p97的两个决定簇的单克隆抗体在补体依赖性细胞毒性中起协同作用(J.Immunol.127(1981)157-160。Maddipatla，S.等人报道了通过靶向Trail-R1和CD20的单克隆抗体的组合对B细胞淋巴瘤增强的抗肿瘤活性(Clin.Cancer Res.13(2007)4556-4564)。Huang，J.等人报道了通过表达人DAF，CD59和MCP来保护异基因(xenogeneic)细胞免于人补体介导的裂解(FEMS Immunol.Med.Microbiol.31(2001)203-209。Qu，Z.等人报道了针对CD20和CD22的重组双特异性单克隆抗体(bsMab)在体外和体内具有对抗B细胞淋巴瘤的活性(Blood 108(2006)713a-714a))。
发明概要
本文报道，用于分析癌细胞表面抗原结合抗体就癌细胞的CDC能力的改进测定试验。该测定试验不需要例如繁琐、复杂和不稳定的方法，例如mCRPs的siRNA下调。这种方法抵消了癌细胞中的mCRPs上调(作为逃避体内CDC压力的免疫逃逸机制)。本测定试验提供了一种确定癌细胞表面抗原结合抗体的CDC的手段，其中所述抗体在其他环境中由于mCRP的作用而不能引起CDC。
已经发现，非同基因血清(non-syngeneic serum)，如兔补体组合人或人源化抗体和人癌细胞(carcinoma cell)，可用于以非常稳健的方式在人细胞，特别是人癌细胞中引发补体依赖性细胞毒性(CDC)。通过使用BRC来确定与癌细胞表面抗原特异性结合的人或人源化抗体的CDC能力，
-在癌细胞上上调的人mCRPs不消除人或人源化抗体的CDC引发作用(而这在其他测定试验设置中被观察到)，
-可以克服在某些情况下如果mCRPs被siRNA下调时正常人血清(NHS)只能用人或人源化抗体和人肿瘤细胞引发CDC的不可靠性，
-现可以高通量筛选不同抗体、抗体形式或抗体缀合物的CDC能力。
本文报道的方法可用于恶性瘤细胞(cancer cells)，例如淋巴瘤细胞、或上皮起源的癌细胞(carcinoma cells)、以及引起自身免疫应答的细胞。
本文所报道的一个方面是用于确定组合物的补体依赖性细胞毒性的方法，所述组合物包含：i)特异性结合第一抗原上第一表位的第一结合位点，所述第一结合位点缀合至人源的第一Fc区多肽；ii)特异性结合第二抗原上第二表位的第二结合位点，所述第二结合位点缀合至人源的第二Fc区多肽，其中所述方法包括以下步骤：
a)用所述组合物孵育表达第一抗原和第二抗原的细胞，
b)向a)的混合物中加入兔补体，和
c)确定细胞裂解，从而确定组合物的补体依赖性细胞毒性。
本文报道的一个方面是选择具有CDC活性的组合物的方法，所述组合物包含：i)特异性结合第一抗原上第一表位的第一结合位点，其与人源的第一Fc区多肽缀合，和ii)特异性结合第二抗原上的第二表位的第二结合位点，其与人源的第二Fc区多肽缀合，其中该方法包括以下步骤：
a)用两种或更多种组合物分别孵育表达第一抗原和第二抗原的细胞，
b)向a)的混合物中加入兔补体，
c)确定细胞裂解，从而确定组合物的补体依赖性细胞毒性，和
d)基于步骤c)的结果选择具有CDC活性的组合物。
本文报道的一个方面是确定抗体的补体依赖性细胞毒性的方法，所述抗体包含：i)至少第一结合位点，所述第一结合位点特异性结合第一抗原上的第一表位，ii)任选地特异性结合第二抗原上的第二表位的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：
a)将表达至少第一抗原和任选第二抗原的细胞与抗体一起孵育，
b)向a)的混合物中加入兔补体，和
c)确定细胞裂解，从而确定抗体的补体依赖性细胞毒性。
本文报道的一个方面是，克服物种特异性的mCRP诱导的对抗体的补体依赖性细胞毒性的抑制作用的方法，所述抗体包含：i)至少第一结合位点，其特异性结合第一抗原上的第一表位，ii)任选地特异性结合第二抗原上的第二表位的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：
a)将表达至少第一抗原和任选第二抗原的细胞与抗体一起孵育，
b)向a)的混合物中加入兔补体，和
c)确定细胞裂解，从而确定抗体的补体依赖性细胞毒性。
在一个实施方案中，抗体是抗体形式。
在一个实施方案中，所述两种或更多种组合物在第一和/或第二表位或抗原方面是不同的。
在所有方面的一个实施方案中，组合物包含特异性结合第一抗原上的第一表位的第一人或人源化抗体，以及特异性结合第二抗原上的第二表位的第二人或人源化抗体。
在所有方面的一个实施方案中，组合物包含人或人源化双特异性抗体，其特异性结合第一抗原上的第一表位和第二抗原上的第二表位。
在所有方面的一个实施方案中，第一抗原和第二抗原是相同的抗原，并且第一表位和第二表位是不同的。在一个实施方案中，第一表位和第二表位是非重叠表位。
在所有方面的一个实施方案中，在加入补体后0.5和3小时之间测定细胞裂解。
在所有方面的一个实施方案中，细胞是恶性瘤细胞。在一个实施方案中，恶性瘤细胞是癌细胞。在一个优选实施方案中，恶性瘤细胞是上皮来源的癌细胞。
在所有方面的一个实施方案中，细胞是人细胞。在一个实施方案中，人细胞是人恶性瘤细胞。在一个实施方案中，人细胞是人B细胞淋巴瘤细胞。在一个实施方案中，人恶性瘤细胞是人癌细胞。在一个优选的实施方案中，人恶性瘤细胞是上皮起源的人癌细胞。
在所有方面的一个实施方案中，方法是无血清方法。
在所有方面的一个优选实施方案中，兔补体是幼兔补体(Baby Rabbitcomplement)。
在一个实施方案中，第一结合位点与第二结合位点之比为10:1至1:10。在一个优选的实施方案中，该比值为0.5:1至1:0.5。
附图说明
图1：A：通过LDH释放测定的BT-474细胞上的比CDC，显示为％CDC；实心圆：曲妥珠单抗(trastuzumab)；实心方块：帕妥珠单抗(pertuzumab)；正三角形：曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合；倒三角形＝双特异性抗HER2抗体，共同轻链；菱形＝双特异性抗HER2抗体，共同轻链，糖工程化的；空心圆＝双特异性抗HER2抗体，CrossMab格式。
B：BT-474细胞(上图)和SK-Br3细胞(下图)上的比CDC；1＝曲妥珠单抗；2＝帕妥珠单抗；3＝曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合；4＝人IgG1，κ轻链对照；左柱：使用幼兔补体的比CDC；右柱：无幼兔补体的比CDC；％CDC和比CDC指比细胞毒性[％]。
图2：细胞指数的时程(ACEA)；1＝曲妥珠单抗；2＝帕妥珠单抗；3＝仅培养基；4＝补体对照；5＝曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合；6＝双特异性抗HER2抗体，共同轻链；7＝双特异性抗HER2抗体，共同轻链，糖工程化的；8＝双特异性抗HER2抗体，CrossMab格式。
图3：细胞指数(ACEA)的时程；1＝仅培养基；2＝补体对照；3＝使用抗CD55抗体，人血清合并物，曲妥珠单抗，帕妥珠单抗；4＝使用抗CD59抗体，人血清合并物，曲妥珠单抗，帕妥珠单抗；5＝使用抗CD55抗体，抗CD59抗体，人血清合并物，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；6＝曲妥珠单抗，帕妥珠单抗和幼兔补体。
图4：使用CD46，CD55，CD59敲低(三重KO)SK-OV-3细胞的CDC测定试验的结果。将细胞分别与抗体各10μg/mL、幼兔补体或正常人血清一起孵育。
具体实施方式的详细描述
I.定义
术语“Clq结合”表示Clq与结合其抗原的抗体的结合。在本文报道的方法和测定试验中，抗体与其抗原的结合可以在体内和体外，没有限制。
在一个实施方案中，Clq结合是通过包括以下步骤的方法测定的：i)在4℃，用PBS中的抗体以0.007至25.0mg/mL的浓度，包被多孔板(例如96孔ELISA板)过夜，ii)清洗板，iii)用0.5×PBS/0.025％吐温20/0.1％明胶封闭剩余的反应性表面残基，iv)在37℃下用a)3％合并的人血清、b)兔抗人Clq、和c)与HRP缀合的猪抗兔IgG抗体，孵育多孔板1小时，包括在期间的洗涤，v)用1mg/mL 2,2'-联氮双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸孵育约30分钟，vi)加入100μL 2％草酸，和vii)在微板读取器上测量405nm处的吸光度。
抗体的C1q结合在此表示导致高亲合力结合的多价相互作用。
术语“补体活化”是指，经典补体途径的起始。该起始由补体成分Clq与抗体-抗原复合物的结合引起。Clq是经典补体级联中的第一个蛋白质。它参与一系列反应，导致形成活性C3转化酶，活性C3转化酶将补体成分C3切割成C3b和C3a。C3b与膜C5结合，得到所谓的C5b，其触发补体活化的晚期事件(C5b，C6，C7，C8和C9组装成膜攻击复合物(MAC))。最后，补体级联导致细胞壁中孔的形成，引起细胞裂解(又称补体依赖性细胞毒性，CDC)。
术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”表示，在抗体与位于细胞上的抗原结合后，由抗体介导的补体活化过程，其中根据上述机制引起细胞裂解。可以使用比CDC测定试验来体外测定CDC。在本领域中，使用正常人血清作为补体来源。
术语“补体依赖性细胞毒性(CDCC)”表示，由表达补体受体的细胞介导的细胞杀伤过程，其中所述补体受体识别补体3(C3)切割产物(位于靶细胞上并产生自抗体介导的补体活化)。
“亲和力”(affinity)是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1的相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。以下描述用于测量结合亲和力的具体举例说明性和示例性实施方案。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示所需的抗原结合活性并可引发CDC即可。
“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体类别而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
本文中使用的术语“Fc区”用于定义，含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链C-端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可存在或不存在。除非另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，描述于Kabat，E.A等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication 91-3242。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代的转化细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代在核酸内容上可以与亲本细胞不完全相同，而可以含有突变。在本文中包括这样的突变体后代，该后代具有在原始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个，通常为两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的，而所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指经过人源化的抗体。
本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指，抗体可变结构域中在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)并形成结构上确定的环(“高变环“)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的每个区域。通常，抗体包含六个HVR；VH中的三个(H1，H2，H3)，VL中的三个(L1，L2，L3)。
本文中HVR包括
(a)在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)的高变环(Chothia，C.和Lesk，AM，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)的CDR(Kabat，EA等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版。Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication91-3242)；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)和93-101(H3)的抗原接触(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)，(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明，否则根据Kabat等人(上引文)，在本文中编号可变结构域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)。
“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或色谱法(例如离子交换或反相HPLC)测定，抗体被纯化至大于95％或99％纯度。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman，S等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有该核酸分子的细胞中，但存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，所述抗体群体包含的各单个抗体，除了通常以少量存在的可能变体抗体外，是相同的和/或结合相同的表位，其中所述变体抗体可以例如含有天然发生的突变或在单克隆抗体制剂生产过程中产生。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂中的所有单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆的”表示，抗体从基本上均质的抗体群体获得的特征，而不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示法和利用转基因动物的方法，所述转基因动物含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，用于制备单克隆抗体的这些方法和其它示例性方法在本文描述。
鼠单克隆抗体4D5特异性靶向过表达HER2的恶性瘤细胞中的HER2，而对表达生理水平HER2的细胞没有影响。人源化(4D5)单克隆抗体(hu4D5)在商业上被称为药物(曲妥珠单抗，rhuMab HER2，US 5,821,337)，其在1998年底获得FDA上市批准。
帕妥珠单抗(PERJETATM，rhuMab 2C4，US 7,862,817)是人源化单克隆抗体，其特别设计用于防止HER2受体与细胞表面上的其它HER受体(EGFR/HER1，HER3和HER4)配对(二聚化)，该配对过程被认为在肿瘤生长和存活中发挥作用。PERJETA被批准与赫赛汀(曲妥珠单抗)和多西紫杉醇联合用于成年HER2阳性转移性或局部复发性不可切除乳腺癌患者，并于2013年9月获得FDA批准用于新辅助乳腺癌治疗。
帕妥珠单抗结合HER2的结构域II(对于二聚化是必需的)，而曲妥单抗结合HER2的细胞外结构域IV。
本文所用的术语“恶性瘤”是指增生性疾病，例如淋巴瘤，淋巴细胞白血病，肺癌，非小细胞肺癌(NSCL)，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌症，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌症，胃部癌症，胃癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌症，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌症，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆道癌，中枢神经系统(CNS)肿瘤，脊柱肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，神经鞘瘤(schwanoma)，室管膜瘤(ependymona)，成神经管细胞瘤，脑膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括任何上述恶性瘤的难治性病变，或上述一种或多种恶性瘤的组合。在一个实施方案中，恶性瘤是癌(carcinoma)。
当本文中使用时，术语“抗原结合位点”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是除本文定义的高变区残基之外的那些可变区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N至C端包含结构域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区域，并定义抗体的性质。CDR和FR区根据Kabat等人的标准定义(Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991))来确定和/或是来自“高变环”的那些残基。
抗体特异性是指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。本文所用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，其中所述结合位点均与相同抗原的相同表位结合。
“双特异性抗体”是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。本文所用的术语“双特异性”抗体表示具有至少两个结合不同表位的结合位点的抗体。
在本申请中使用的术语“价”表示在抗体分子中存在特定数目的结合位点。因此，术语“二价”，“四价”和“六价”表示在抗体分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。根据本发明的双特异性抗体至少是“二价”，并且可以是“三价”或“多价”(例如“四价”或“六价”)。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”是指，在体外测定试验，优选在表面等离子体共振测定试验(SPR，BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，瑞典)中，抗体与抗原表位的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体结合速率常数)，kd(解离常数)和KD(kd/ka)定义。结合或特异性结合是指10-7mol/L或更小值的结合亲和力(KD)。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。
II.如本所报道的方法
癌是上皮起源的，并且这些细胞经常上调mCRPs(特别是CD55和CD59)作为逃避体内CDC压力的免疫逃逸机制。在某些情况下，由于mCRP的作用/存在，癌的细胞表面抗原结合抗体不能引起CDC。在过去，这在癌细胞中一直使用繁琐、复杂和不稳定的方法来解决，例如，mCRPs的siRNA下调。本文报道了改进的(即，尤其是更稳健和高通量相容的)测定试验，用于分析癌的细胞表面抗原结合抗体的CDC能力。
已经发现，为了确定如下组合物的补体依赖性细胞毒性，必须使用非同基因补体(即兔补体，例如幼兔补体)，其中所述组合物包含一方面特异性结合一种或多种细胞表面抗原且另一方面含有人源Fc区多肽的分子，例如两种或多种人或人源化抗体的组合、或人或人源化双特异性抗体。出乎意料地，使用同基因补体没有导致功能性方法。同样地，使用豚鼠补体(特定非同基因补体)也没有导致功能性测定试验。
本文报道了测定抗体组合或双特异性抗体的CDC活性的方法。在用人血清和人恶性瘤细胞孵育不能提供可靠结果的情况中，该方法是尤其有用的。
本文所报道的一个方面是用于测定组合物的补体依赖性细胞毒性的方法，所述组合物包含：i)特异性结合第一抗原上第一表位的第一结合位点，所述第一结合位点与人源的第一Fc区多肽缀合；ii)特异性结合第二抗原上第二表位的第二结合位点，所述第二结合位点与人源的第二Fc区多肽缀合，其中所述方法包括以下步骤：
a)用组合物孵育表达第一抗原和第二抗原的细胞，
b)向a)的混合物中加入兔补体，和
c)测定细胞裂解，从而确定组合物的补体依赖性细胞毒性。
本文报道的一个方面是选择具有CDC活性的组合物的方法，所述组合物包含：i)特异性结合第一抗原上第一表位的第一结合位点，其与人源的第一Fc区多肽缀合，和ii)特异性结合第二抗原上的第二表位的第二结合位点，其与人源的第二Fc区多肽缀合，其中该方法包括以下步骤：
a)用两种或更多种组合物分别孵育表达第一抗原和第二抗原的细胞，
b)向a)的混合物中加入兔补体，
c)确定细胞裂解，从而确定组合物的补体依赖性细胞毒性，和
d)基于步骤c)的结果选择具有CDC活性的组合物。
本文报道的一个方面是确定抗体的补体依赖性细胞毒性的方法，所述抗体包含：i)至少第一结合位点，所述第一结合位点特异性结合第一抗原上的第一表位，ii)任选地特异性结合第二抗原上的第二表位的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：
a)将表达至少第一抗原和任选第二抗原的细胞与抗体一起孵育，
b)向a)的混合物中加入兔补体，和
c)确定细胞裂解，从而确定抗体的补体依赖性细胞毒性。
已经发现，单特异性抗体在本文报道的测定试验中不起作用。
已经令人惊讶地发现，人恶性瘤细胞、人或人源化抗体和兔来源的非同基因补体的组合导致功能性测定试验。
在一个实施方案中，细胞表达第一表位和第二表位。
在一个实施方案中，第一抗原和第二抗原是细胞表面抗原。
表达细胞表面抗原的细胞可以是任何细胞。在一个实施方案中，细胞是恶性瘤细胞。在一个实施方案中，恶性瘤细胞是癌细胞。
补体依赖性细胞毒性应在加入补体后1或2小时测定。因此，在一个实施方案中，在加入补体(即幼兔补体)之后0.5小时至3小时之间测定细胞裂解。在一个实施方案中，在加入补体后1小时至2小时之间测定细胞裂解。
细胞裂解可以用任何合适的方法测定，例如LDH释放或细胞生存力测定。因此，在一个实施方案中，通过测定LDH释放或细胞生存力来测定细胞裂解。
本文报道的方法不需要血清的存在。因此，在一个实施方案中，该方法是无血清方法。
本文所报道的方法可用于选择彼此无交叉竞争结合但组合(而非单独)发挥CDC的抗体组合。
本文报道的一个方面是测定组合物的补体依赖性细胞毒性的方法，
其中所述组合物包含
i)特异性结合第一抗原上的第一表位的第一结合位点，其与人源的第一Fc区多肽缀合，以及
ii)特异性结合第一抗原上或第二抗原上的第二表位的第二结合位点，其与人源的第二Fc区多肽缀合，
其中所述方法包括以下步骤：
a)用组合物孵育表达第一抗原或第一抗原和第二抗原的人细胞，
b)向a)的混合物中加入兔补体，和
c)测定细胞裂解，从而确定组合物的补体依赖性细胞毒性。
本文报道的一个方面是测定两种单特异性抗体的组合或双特异性抗体的补体依赖性细胞毒性的方法
其中，
i)第一单特异性抗体特异性结合第一抗原上的第一表位，第二单特异性抗体特异性结合第一抗原上或第二抗原上的第二表位，或
ii)双特异性抗体包含特异性结合第一抗原上的第一表位的第一结合位点和特异性结合第一抗原上或第二抗原上的第二表位的第二结合位点，
其中所述方法包括以下步骤：
a)使用两种单特异性抗体的组合或双特异性抗体孵育表达第一抗原或第一抗原和第二抗原的上皮起源的人癌细胞，
b)向a)的混合物中加入兔补体，和
c)测定细胞裂解，从而确定两种单特异性抗体的组合或双特异性抗体的补体依赖性细胞毒性。
人源化抗体
通常，旨在用作治疗剂的非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR(例如CDR)(或其部分)衍生自非人抗体并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也可以包含至少一部分或全长的人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如HVR残基所源自的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于如Almagro，J.C和Fransson，J.，Front.BIOSCI.13(2008)1619-1633，也描述于例如Riechmann，I等人，Nature 332(1988)323-329；Queen，C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337，US 7,527,791，US 6,982,321和US 7,087,409；Kashmiri，S.V.等人，Methods 36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)接枝)；Padlan，E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑(resurfacing)”)；Dall'Acqua，W.F.等人，Methods36(2005)43-60(描述“FR改组”)；Osbourn，J.等人，Methods 36(2005)61-68；和Klimka，A.等人，Br.J.Cancer83(2000)252-260(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法筛选的框架区(参见例如Sims，M.J等人，J.Immunol.151(1993)2296-2308；衍生自特定轻链或重链可变区亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter，P等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro，J.C.和Fransson，J.Biol.Chem.J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和来自FR文库筛选的框架区(参见例如Baca，M.等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684；和Rosok，M.J.等人，J.Biol.Chem.271(1996922611-22618)。
多特异性抗体
在某些实施方案中，本文报道的方法中使用的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点/抗原/表位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合相同抗原的两个不同表位。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein，C.和Cuello，A.C.，Nature 305(1983)537-540，WO93/08829和Traunecker，A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)，和““杵臼结构”(knob-in-hole)工程化(参见例如US 5,731,168)。多特异性抗体也可以通过如下方式制备：工程化构建静电转向效应用于制备抗体Fc-异二聚体分子(参见WO 2009/089004)；交联两个或多个抗体或片段(参见例如US 4,676,980和Brennan，M.等人，Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体(参见例如Kostelny，S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双抗体”(diabody)技术制备双特异性抗体片段(参见例如Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber，M.等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，例如在Tutt，A.等人，J.Immunol.147(1991)60-69)中描述的。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程抗体(包括“章鱼抗体”)也包括在本文中(参见例如US 2006/0025576)。
抗体还包括“双作用Fab”或“DAF”(例如，参见US 2008/0069820)。
本文的抗体或片段还包括WO 2009/080251，WO 2009/080252，WO 2009/080253，WO2009/080254，WO 2010/112193，WO 2010/115589，WO 2010/136172，WO 2010/145792和WO2010/145793中描述的多特异性抗体。
重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物制备抗体，例如US 4,816,567中所述。对于表达，需要编码抗体的各多肽链的核酸。该核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供包含该核酸的一或多个载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供包含该核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经转化了)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核生物，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下，培养如上所提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
对于抗体的重组生产，可以分离编码抗体(例如如上所述)的核酸并将其插入一个或多个载体中以进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。可以使用常规方法(例如，使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离此核酸并测序。
用于克隆或表达抗体编码载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237，US 5,789,199和US 5,840,523；也参见Charlton，K.A.，：Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(编)，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，第245-254页，描述了大肠杆菌中抗体片段的表达)。表达后，可以从细菌细胞糊分离抗体(可溶性级分中)并可进一步纯化。
除了原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是用于抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体(参见Gerngross，TU，Nat.Biotech.222(2004)1409-1414；和Li，H.等，Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞也可以源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主(参见例如US 5,959,177，US 6,040,498，US 6,420,548，US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，经适应而可以在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系是可用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚胎肾细胞系(例如在Graham，F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠sertoli细胞(如在Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，例如在Mather，J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中描述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，例如Y0，NS0和Sp2/0。对于适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，BKC(编)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，255-268。
药物制剂
抗体的药物制剂可以通过将具有所需纯度的抗体与一种或多种任选的药学上可接受载体混合来制备(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)(1980))，可以是冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚(乙烯基吡咯烷酮)；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rhuPH20((Baxter International，Inc.)。在US 2005/0260186和US 2006/0104968中描述了某些示例性的sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂描述于US 6,267,958中。水性抗体制剂包括US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
制剂还可以含有对于所治疗的具体适应症是必要的、多于一种活性成分，优选具有互补活性、相互不会不利影响的那些活性成分。这些活性成分适于以对预期目的而言有效的量组合存在。
活性成分可以截留在(例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的)微囊中，例如羟甲基纤维素或明胶-微囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊，截留在胶体药物递送系统(例如脂质体，白蛋白微球，微乳液，纳米颗粒和纳米囊)中或粗乳液中。这些技术公开在Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品的形式，例如。薄膜或微囊。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以容易地实现，例如通过无菌过滤膜过滤。
治疗方法和组合物
用本文提供的方法选择的任何组合物，即抗体组合或多特异性抗体可用于治疗方法。
在一个方面，提供了用本文报道的方法选择的组合物用作药物。在某些实施方案中，提供了用本文报道的的方法选择的组合物用于治疗方法。在某些实施方案中，本发明提供了用本文报道的的方法选择的组合物用于个体治疗方法，其包括向所述个体施用有效量的通过本文报道的方法选择的组合物。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。根据上述任一项实施方案中的“个体”优选为人。
在另一方面，本发明提供了用本文报道的方法选择的组合物在制造或制备药物中的用途。在另一个实施方案中，用本文报道的方法选择的组合物用于治疗疾病的方法中，包括向患有该疾病的个体施用有效量的通过本文报道的方法选择的组合物。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
另一方面，本发明提供了治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括向具有此疾病的个体施用有效量的通过本文报道的方法选择的组合物。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供药物制剂，其包含用本文报道的方法选择的组合物，例如用于任何上述治疗方法。在一个实施方案中，药物制剂包含通过本文报道的方法选择的任何组合物和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含通过本文报道的方法选择的任何组合物和至少一种另外的治疗剂。
用本文报道的方法选择的组合物可以单独或与其它活性剂组合用于治疗中。例如，用本文报道的方法选择的组合物可以与至少一种另外的治疗剂共施用。
上述的组合疗法包括组合施用(其中两种或多种治疗剂被包括在相同或分开的制剂中)和分开施用，在这种情况下，用本文报道的方法选择的组合物的施用可以在该另外的治疗剂或药剂的施用之前、同时、和/或随后进行。在一个实施方案中，用本文报道的方法选择的组合物的施用和另外的治疗剂的施用彼此发生在约一个月内、或约一个、两个或三个星期内、或约一、二、三、四、五、或六天内。
用本文报道的方法选择的组合物(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外，肺内和鼻内，以及如果需要用于局部治疗，病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内或皮下施用。剂量给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短期的还是长期的。本文考虑各种施用剂量方案，包括但不限于，单次施用或在多个时间点上的多次施用，推注施用和脉冲输注。
用本文报道的方法选择的组合物将以符合良好医学实践的方式配制，定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的特定疾病，待治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床状况，病症的原因，药剂的递送部位，施用方法，施用方案，以及医师已知的其他因素。用本文报道的方法选择的组合物不需要，但是可以任选地，与目前用于预防或治疗所述病症的一种或多种药剂一起配制。所述其它药剂的有效量取决于制剂中存在的组分的量，病症或治疗的类型、以及上述讨论的其它因素。这些药剂通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1至99％使用，或可以以经验上/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，用本文报道的方法选择的组合物的合适剂量(当单独使用或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型、组合物的类型、疾病的严重性和过程，组合物是否用于预防或治疗目的，先前的治疗，患者的临床病史和对组合物的反应、以及主治医师的判断。适宜地，用本文报道的方法选择的组合物可以在一次或一系列治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的组合物可以是用于给予患者的初始候选剂量，例如，通过一个或多个分开的施用，或通过连续输注的方式。取决于上述因素，一个典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。对于经过几天或更长时间的反复施用，根据病情，治疗通常将持续到发生疾病症状的所需抑制。组合物的一个示例性剂量在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可向患者施用约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可以间歇施用，例如。每周或每三周(例如，使得患者接受约2至约20，或例如约6个剂量的抗体)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。然而，其他剂量方案可是有用的。通过常规技术和测定，可以容易地监测疗法的进展。
III.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，根据上面提供的一般描述，可以实践各种其它实施方案。
材料和方法
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如描述于Sambrook，J.等人，Molecular cloning：Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork，1989。分子生物试剂根据制造商的说明使用。
基因和寡核苷酸合成
所需的基因片段通过化学合成在Geneart GmbH(Regensburg，Germany)制备。将合成的基因片段克隆到用于繁殖/扩增的大肠杆菌质粒中。通过DNA测序验证亚克隆的基因片段的DNA序列。或者，通过退火化学合成的寡核苷酸或通过PCR，组装短的合成DNA片段。寡核苷酸由metabion GmbH(Planegg-Martinsried，Germany)制备。
试剂
如果没有另外说明，所有商业化学品、抗体和试剂盒均按照制造商的方案使用。
抗体
曲妥珠单抗
轻链：
重链：
帕妥珠单抗
轻链：
重链：
双特异性抗-HER2抗体，共同轻链：
共同轻链：
重链1(杵,曲妥珠单抗):
重链2(臼,帕妥珠单抗):
双特异性抗-HER2抗体，CrossMab形式：
重链1:
重链2:
轻链1:
轻链2:
表达
a)表达质粒的构建
以下表达载体用于构建所有重链和轻链编码表达质粒。载体由以下元件组成：
-潮霉素抗性基因作为选择标记，
-EB病毒(EBV)的复制起点oriP，
-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，
-人免疫球蛋白多聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列。
通过基因合成制备包含重链或轻链的免疫球蛋白基因，并克隆到如上所述pGA18(ampR)质粒中。使用独特限制性位点通过定向克隆，构建了可变重链构建体。可变轻链构建体以包含VL和CL的基因合成方式订购，并通过使用独特限制性位点通过定向克隆而构建。将最终的表达载体转化到大肠杆菌细胞中，分离表达质粒DNA(Miniprep)，并进行限制酶分析和DNA测序。将正确的克隆在150ml LB-Amp培养基中生长，再次分离质粒DNA(Maxiprep)，并通过DNA测序证实序列完整性。
b)HEK293细胞中免疫球蛋白变体的瞬时表达
根据制造商的说明书(Invitrogen，USA)，使用FreeStyleTM 293表达系统，通过瞬时转染人胚肾293-F细胞来表达重组免疫球蛋白。对于小规模试验表达，在转染前一天接种30mL的0.5×106HEK293F细胞/mL。第二天，将质粒DNA(每mL培养体积1μg DNA)与1.2mLI减少血清培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)混合，然后加入40μL293FectinTM转染试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。将混合物在室温下孵育15分钟，逐滴加入细胞。转染后一天，向每个烧瓶中加入300μL L-谷氨酰胺(200mM，Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)和600μL含有氨基酸、糖、微量元素、不含RPMI的FreeStyle培养基的进料。转染后三天，使用自动细胞生存力分析仪(Vi-CELL TM XR，Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)和葡萄糖计(Sensor comfort,Roche DiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany)测定细胞浓度、生存力和培养基中的葡萄糖浓度。此外，向每个烧瓶中加入300μL L-谷氨酰胺，300μL非必需氨基酸溶液(PANTM Biotech，Aidenbach，Germany)，300μL丙酮酸钠(100mM，Gibco，Invitrogen)，1.2ml进料和5g/L葡萄糖(D-(+)-葡萄糖溶液45％，Sigma)。最后，转染后6天，在X3R Multifuge(Heraeus，Buckinghamshire，England)中在环境温度下以3500rpm离心15分钟来收获抗体，将上清液通过Steriflip过滤器(0.22μm Millipore Express PLUS PES膜，Millipore，Bedford，MA)无菌过滤并储存在-20℃直到进一步使用。高达5L的大规模转染按线性比例扩大。
c)纯化
通过使用蛋白A-SepharoseTM(GE Healthcare，Sweden)的亲和层析和Superdex200大小排阻层析，从细胞培养物上清液中纯化双特异性抗体。简言之，将无菌过滤的细胞培养物上清液加于用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的HiTrap Protein A HP(5mL)柱上。用平衡缓冲液洗去未结合的蛋白质。用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH2.8)洗脱抗体和抗体变体，并将含蛋白质的级分用0.1mL 1M Tris，pH8.5中和。合并洗脱的蛋白质级分，用Amicon Ultra离心过滤装置(MWCO：30K，Millipore)浓缩至3mL的体积，并加至用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex200 HiLoad 120mL16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)。合并含有纯化的双特异性和对照抗体的级分(小于5％高分子量聚集体)，并在80℃下以1.0mg/mL等分试样储存。
d)蛋白定量
蛋白质使用自动化Ultimate 3000系统(Dionex，Idstein，Germany)与预装A蛋白A柱(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)通过亲和层析进行定量。所有样品在缓冲液A(0.2M Na2HPO4·[2H2O]，pH7.4)中上样，并在缓冲液B(0.1M柠檬酸，0.2M NaCl，pH2.5)中洗脱。为了确定蛋白质浓度，所有样品均使用1.62的消光系数。
e)纯化蛋白质的分析
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。通过在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)下进行SDS-PAGE并用考马斯亮蓝染色，分析双特异性和对照抗体的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen，USA)(4-20％Tris-甘氨酸凝胶)。使用Superdex 200分析性大小排阻柱(GE Healthcare，Sweden)在200mM KH2PO4，250mMKCl，pH 7.0运行缓冲液中在25℃，通过高效SEC分析双特异性和对照抗体样品的聚集物含量。将25μg蛋白质以0.5mL/min的流速注射到柱上，并在50分钟内等度洗脱。通过肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶处理去除N-聚糖后，通过NanoElectrospray Q-TOF质谱法验证还原的双特异性抗体轻链和重链的氨基酸主链的完整性。
f)分析型HPLC
使用TSK-GEL G3000SW凝胶过滤柱(7.5mm ID×30cm，Tosohaas Corp.，Montgomeryville，PA，USA)和Agilent HPLC 1100(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)分析抗体。将18μL洗脱的蛋白质在缓冲液A(0.05M K2HPO4/KH2PO4在300mM NaCl中，pH7.5)中加载到柱上，并基于大小进行分离。
实施例1
使用不同补体来源的测定试验
使用豚鼠补体(GPC)的Alamar Blue测定试验
将CHO-K1Nxre19细胞(IL15R转染的CHO-K1)以20,000细胞/孔接种在96孔平底细胞培养板(NUNC，100μL/孔)上，在补充有GlutaMax(Gibco，Cat.No 31331-028)的DMEM/F12培养基中。加入25微升IL15-Fc融合多肽(6倍终浓度)并孵育1小时。然后加入25μL豚鼠补体(Sigma Aldrich，目录号S1639)并孵育3.5小时。然后加入50μL Alamar Blue(Promega)，并在37℃/5％CO2下孵育过夜。在550nm(激发)和595nm(发射)的波长下测量板。
| 样品 | 信号[AU] | 变异系数 |
| 仅细胞 | 16290 | 240 |
| 2.5μg/mL IL15-Fc-融合物，没有GPC | 16408 | 161 |
| 仅补体，没有IL15-Fc-融合物 | 4893 | 207 |
| 2.5μg/ml IL15-Fc-融合物，有GPC | 4410 | 360 |
| 1.25μg/ml IL15-Fc-融合物，有GPC | 4104 | 163 |
| 0.625μg/ml IL15-Fc-融合物，有GPC | 4397 | 299 |
| 0.3125μg/ml IL15-Fc-融合物，有GPC | 4070 | 104 |
| 0.156μg/ml IL15-Fc-融合物，有GPC | 3944 | 198 |
| 0.078μg/ml IL15-Fc-融合物，有GPC | 3817 | 117 |
| 0.039μg/ml IL15-Fc-融合物，有GPC | 4047 | 29 |
| 0.020μg/ml IL15-Fc-融合物，有GPC | 4432 | 293 |
| 0.010μg/ml IL15-Fc-融合物，有GPC | 4381 | 293 |
| 0.005μg/ml IL15-Fc-融合物，有GPC | 4092 | 89 |
从数据可以看出，即使在不存在Fc区的情况下，豚鼠补体在所有稀释度下都是有毒的。
用人补体(HUC)的LDH测定试验
将CHO-K1Nxre19细胞(IL15R转染的CHO-K1)以10,000个细胞/孔接种在96孔平底细胞培养板(NUNC，100μL/孔)上，并在补充有GlutaMax(Gibco，目录号31331-028))的DMEM/F12培养基中培养过夜。加入IL15-Fc融合多肽(25μL/孔，5倍终浓度)，孵育1小时。除去生长培养基，用无血清培养基洗涤细胞一次。然后加入190μL/孔的无血清培养基和10μL人补体(Sigma Aldrich，目录号S1764，c＝1mg/mL)。4小时后，将板以200g离心，将100μL/孔转移至另一个96孔平底板。然后加入100μL的LDH反应混合物(Cytotoxicity Detection Kit，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)。在37℃孵育20分钟后，在Tecan Sunrise读数器上以492/690nm测量光密度(OD)。
从上述数据可以看出，人补体没有显示剂量依赖性的补体依赖性毒性。
用幼兔补体(BRC)的LDH测定试验
将CHO-K1Nxre19细胞(IL15R转染的CHO-K1)以10,000个细胞/孔接种在96孔平底细胞培养板(NUNC，100μL/孔)上，并在补充有GlutaMax(Gibco，目录号31331-028))的DMEM/F12培养基中培养过夜。加入IL15-Fc融合多肽(25μL/孔，5倍终浓度)，孵育1小时。此后，将1瓶幼兔补体(Cedarlane，目录编号CL3441)用1mL重蒸水重构。将补体溶液用培养基稀释，向孔中加入25μL。4小时后，将板以200g离心，将100μL/孔转移到另一个96孔平底板。然后加入100μL LDH反应混合物(Cytotoxicity Detection Kit，Roche Diagnostic GmbH，Mannheim，Germany)。在37℃孵育20分钟后，在Tecan Sunrise读数器上以492/690nm测量光密度(OD)。
可以看出，BRC具有低的背景毒性并且显示出剂量依赖的补体毒性。
实施例2
抗HER2抗体在BT-474细胞上的C1q结合
将约3×105个BT-474细胞在补充有10％FCS的RPMI 1640中于冰上与10μg/mL所示抗体一起孵育。在冰上孵育30分钟后，加入10μg/mL C1q(Sigma Aldrich，目录号C1740)。此后在冰上再继续孵育20分钟。洗涤后，将细胞重新悬浮于200μL培养基中，并用PE标记的抗C1q抗体(Cedarlane，目录号CL7611PE-SP)复染。在冰上孵育30分钟后，洗涤细胞两次并在FACS Canto II上分析。
| 抗体/抗体 | PE信号(geomean) |
| 曲妥珠单抗 | 282 |
| 帕妥珠单抗 | 344 |
| 曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合 | 2157 |
| 双特异性抗HER2抗体，共同轻链 | 1439 |
| 双特异性抗HER2抗体，共同轻链，糖工程化的 | 1036 |
| 双特异性抗HER2抗体，CrossMab格式 | 489 |
该C1q测定试验法说明重组补体因子C1q与BT-474细胞上不同抗体结合。
实施例3
抗HER2抗体在BT-474细胞上的增殖抑制作用
将10,000(1×104)个BT-474细胞/孔在补充有10％FCS的RPMI 1640培养基中在96孔平底板中培养。24小时后，除去生长培养基，并加入滴定量的所示抗体(在培养基中预混合；200nM，66.7nM，22.2nM，7.4nM，2.5nM，0.8nM，0.3nM，0.1nM)至终体积100μL。为了确定培养物中活细胞的数量，根据制造商的说明书进行CellTiterGlo发光细胞生存力测定试验(定量ATP水平作为代谢活性细胞的指标)。因此，培养6天后，将100μL CellTiterGlo反应混合物(Promega，Cat.No.G7571)加入到细胞中并振荡孵育2分钟。此后，将75μL裂解物转移到分开的96孔平底板(Costar，目录号3917)中。再次混合后，根据制造商的说明书使用TecanInfinite读数器评估发光，并计算相应的IC 50值。
| 抗体/抗体 | IC50[nM] |
| 曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合 | 6.20 |
| 双特异性抗HER2抗体，共同轻链 | 3.31 |
| 双特异性抗HER2抗体，共同轻链，糖工程化的 | 3.93 |
| 双特异性抗HER2抗体，CrossMab格式 | 4.75 |
在增殖测定试验中，显示抗体抑制了BT-474的增殖。
实施例4
在BT-474细胞，SK-Br3细胞和SK-OV-3细胞上由抗HER2抗体引起的CDC活化
将10,000个细胞/孔(BT-474，SK-Br3或SK-OV-3细胞)接种在96孔板中，并在37℃/5％CO2下孵育20小时。然后除去培养基，用100μL AIM-V培养基(Gibco，目录号0870112 DK)洗涤细胞一次。将50微升AIM-V培养基置于每个孔中。然后加入50μL抗体溶液(3倍终浓度)，在37℃/5％CO2孵育30分钟。加入在AIM-V培养基中1:10稀释的50微升幼兔补体(Cedarlane，目录号CL3441，批号6312)，继续孵育2小时。此后，转移50μL上清液并与50μLLDH反应混合物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)混合。进一步在37℃孵育15分钟后，在Tecan Sunrise读数器中测定在490/620nm的消光(Ex.)。按如下计算比抗体依赖性毒性(n＝4的平均值±SD)：％抗体依赖性毒性＝(Ex.样品-Ex.自发裂解/Ex.最大裂解-自发裂解)×100。结果如图1所示。
将BT474，SkBr3和SK-OV-3细胞与曲妥单抗、帕妥珠单抗或其组合(总抗体浓度为10μg/mL或1μg/mL)一起孵育，随后与幼兔补体孵育两小时。使用具有κ轻链的人IgG1作为同种型对照。使用LDH细胞毒性试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号11644793001)在Tecan sunrise读数器上执行细胞裂解(LDH释放)的读出。相对于3％Triton-X处理的细胞(最大裂解)的信号，给出比裂解。实验进行了五个重复。
该CDC测定试验显示，在存在幼兔补体的情况下用不同抗体(形式，组合)处理时LDH的释放，作为正在死亡的细胞/死细胞的标志。
实施例5
针对CDC确定抗体比率
每孔10,000个SK-OV-3细胞以100μL/孔接种到96孔平底板(Thermo Scientific，Nunclon Delta Surface)中AIM-V培养基(Gibco，Cat.No.0870112-DK)中，在37℃和5％CO2下孵育20小时。在孵育期后，加入50μL含有曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的抗体贮存液，最终浓度为0.1、0.5、1,5或10μg/mL。将人IgG1，κ轻链(Sigma，目录号.11515-1MG)用作对照。以终浓度1％加入Triton-X(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号11332481001)以确定最大裂解。在37℃下孵育30分钟后，加入50μL幼兔补体贮存液(Cedarlane，目录号CL3441)，最终稀释度为1/30。然后将板在37℃下孵育2小时(终体积/孔＝150μL)。通过使用细胞毒性检测试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号11644793001)，通过LDH活性，确定细胞裂解的量。用Tecan Sunrise读数器在490nm和620nm测定吸光度。
作为阳性对照，使用以下样品：
培养基对照：SK-OV-3细胞与AIM-V培养基
自发性裂解：SK-OV-3细胞与活性BRC
最大裂解：SK-OV-3细胞与1％Triton-X
同种型对照：SK-OV-3细胞与10μg/mL人IgG,κ和BRC
阴性对照：SK-OV-3细胞与10μg/mL抗体/组合物和热灭活的BRC
测定试验对照：SK-OV-3细胞与10μg/mL曲妥珠单抗和帕妥珠单抗和活性BRC。
在曲妥珠单抗/帕妥珠单抗比为0.5:1至1:1以及帕妥珠单抗/曲妥单抗比为0.5:1至1:1时，观察到最佳细胞杀伤。总体而言，对于抗体比率的变化，该测定试验看起来具有非常稳健的性能，因为即使1:10的比率也不会显著影响CDC。
实施例6
抗HER2抗体引起的CDC介导的BT-474细胞杀伤
将10,000个BT-474细胞/孔接种在96孔E板(ACEA Biosciences Inc.)上，并在AIM-V培养基中在Xcelligence装置中生长过夜。除去生长培养基，用无血清的AIM-V培养基(Gibco)洗涤细胞一次。加入每孔50微升AIM-V培养基和50μL在AIM-V中的抗体(3倍终浓度)并孵育20分钟。此后，加入50μL的幼兔补体(Cedarlane)，每5分钟测量一次细胞指数(CI；代表细胞生存力)。比CDC按照下列公式计算，而CI是归一化的细胞指数：
在两个代表性时间点(反应开始后1小时和2小时)，计算比裂解(即，CDC诱导的细胞死亡)，并在图2和下表中示出(n＝4的平均值±SEM)。
该CDC测定试验说明，在存在幼兔补体的情况下用不同抗体(形式，组合)处理时细胞指数的变化，作为染色/死细胞的标记物。
实施例7(比较实施例)
尝试建立基于人源补体的CDC测定试验
使用曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、或曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合(10μg/mL总抗体浓度)敏化SkBr3细胞，然后用幼兔补体(BCR，如实施例4所述)或用3个健康供体的正常人血清(NHS)(1:50稀释，NHS 1，NHS 2，NHS 3)孵育2小时。将具有κ轻链的人IgG1用作同种型对照。
使用LDH细胞毒性试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号11644793001)在Tecan sunrise读数器上读出细胞裂解(LDH释放)。平均裂解(％)是相对于3％Triton-X处理的细胞(最大裂解)的信号。实验重复三次进行。
实施例8(比较实施例)
siRNA介导的CD55，CD59和CD46敲低
细胞系产生
对于CD46、CD55和CD59敲低，用相应的siRNA(Biospring；CD46目录号203525-A，CD55目录号203526-A，CD59目录号203527-A)，一种对照siRNA(Biospring，目录号203524-A)和转染试剂LipofectAmine(Invitrogen，目录号13778-100)处理SK-OV-3细胞。使用量根据制造商的方案。培养3天后，使用50μL中具有1-2×105个细胞的细胞悬液和FACS抗体的母混合物，通过FACS-分析，确定细胞表面上的CD46，CD55和CD59的量。抗体-母混合物含有抗CD-55-APC抗体(BD Pharmingen，目录号555696)和抗CD59-PE抗体(BD Pharmingen，目录号555764)各1μL、以及10μL抗体-CD46-FITC抗体(BD Pharmingen，目录号555949)，10％小鼠血清(Southern Biotech，目录号0050-01)和FACS缓冲液(5mL DPBS，补充有20μL BSA)。滴定FACS抗体以确定待使用的合适浓度。对于同种型对照，使用IgG2a,k-FITC(BDPharmingen，目录号556652)，IgG2a,k-APC(BD Pharmingen，目录号552893)，IgG2a,k-PE(BD Pharmingen，目录号 551438)各20μL、以及10％小鼠血清和FACS缓冲液。将细胞与上述FACS抗体在4℃和20rpm下孵育30分钟，用600μL冰冷的DPBS缓冲液洗涤并重悬于200μLCytofix(BD Pharmingen，目录号554655)中。在FACS Canto II上进行FACS分析。
| 靶标 | 信号 | 野生型SK-OV-3细胞 | 敲低SK-OV-3细胞 |
| CD46 | FITC | 683 | 662 |
| CD55 | APC | 1447 | 275 |
| CD59 | PE | 1192 | 649 |
CD 55实现了显著的敲除(约80％敲除)。CD59的表达下调约45％。CD46没有显示出表达水平变化。
敲低后的CDC
对于CD46、CD55和CD59敲低，SK-OV-3细胞用相应的siRNA(Biospring；CD46目录号203525-A，CD55目录号203526-A，CD59目录号203527-A)和转染试剂LipofectAmine(Invitrogen，目录号13778-100)处理。使用量根据制造商的方案。培养3天后，通过FACS分析(参见上文)确定细胞表面上的CD46、CD55和CD59的量。在第四天，用野生型(＝非siRNA处理的)SK-OV-3，SK-OV-3-三重细胞(用所有三种siRNA转染)和SK-OV-3-Contrl.siRNA(用非特异性对照siRNA转染)进行CDC-测定试验。对于CDC-测定试验，每孔10,000个细胞接种到96孔平底板(Thermo Scientific，Nunclon Delta Surface)中，含有100μL/孔，于AIM-V培养基(Gibco，Cat.No.0870112-DK)中，并在37℃和5％CO2下孵育20小时。之后，以10μg/mL的终浓度，测试曲妥珠单抗，帕妥珠单抗，人IgG1,κ(Sigma，目录号15515)和双特异性抗HER2抗体(共同轻链)。以终浓度1％使用Triton-X(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号11332481001)，以确定最大裂解。将所有样品在37℃孵育30分钟。随后，以1/30的最终稀释度加入幼兔补体(BRC)(Cedarlane，目录号CL3441)和正常人血清(NHS)，并将平板在37℃下孵育2小时(终体积/孔＝150μL)。使用细胞毒性检测试剂盒(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号11644793001)，通过LDH活性。确定细胞裂解的量。使用Tecan Sunrise读数器在490nm和620nm处测定吸光度。
作为阳性对照，使用以下样品：
培养基对照：SK-OV-3细胞与AIM-V培养基
自发性裂解：SK-OV-3细胞与活性BRC
最大裂解：SK-OV-3细胞与1％Triton-X
同种型对照：SK-OV-3细胞与10μg/mL人IgG,κ和BRC
阴性对照：SK-OV-3细胞与10μg/mL抗体/组合物和热灭活的BRC
测定试验对照：SK-OV-3细胞与10μg/mL曲妥珠单抗和帕妥珠单抗及活性BRC。
结果如图4所示。
在存在NHS作为补体来源时，绝对需要CD55和CD59的敲低来发挥CDC。繁琐的siRNA敲除程序可以通过使用BRC来克服。该测定试验显示mCRP存在对癌细胞没有影响。这是将本文报道的测定试验用于高通量筛选不同的抗体形式(以及筛选不同抗体组合)或作为其他CDC测定试验的阳性对照的前提条件。
阳性对照显示，该CDC测定试验是可行的。对SK-OV-3、SK-OV-3-三重-KO和SK-OV-3-Contrl.siRNA的OD 490/620nm和比细胞毒性(％)的比较表明，对照siRNA不诱导细胞毒性。
实施例9(比较实施例)
尝试通过操纵膜结合的补体调节蛋白(mCRPs)建立CDC测定试验
为了阐明特异性针对NHS(相对于BRC)的靶细胞的限制因子是否影响测定试验，尝试降低mCRPs的表达，mCRPs是抑制CDC过程不同阶段的一组蛋白质。
抗CD55和抗CD59中和抗体
在使用曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗治疗后，使用针对靶标CD55和CD59的中和抗体，以单独和联合孵育的方式(总中和抗体浓度为10μg/mL)，进行mCRP抑制(参见Zhao，WP等人，Onc.Rep 21(2009)1405-1411)。
按照实施例6并进行下面的适应性调整，实施了测定试验：将SK-OV-3细胞与针对CD55、CD59或两者的中和抗体(neu mAb)(总neu mAb浓度为10μg/mL)一起孵育，随后与曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗(或同种型对照)孵育，并添加血清(1:30稀释)。观察结果如图3所示。
用合并的人血清重复实验，结果相同。
在两个实验中，BRC导致约50％的相对CDC，而使用人血清可以观察到小于15％的相对CDC。
siRNA介导的CD46、CD55和CD59敲低
通过将mCRP-mRNA特异性小干扰RNA(siRNA)分子转染到细胞中，通过RNA干扰技术(RNAi)降低mCRP表达，其中siRNA将导致细胞质中相应的mRNA分子的降解。siRNA转染后48小时，对靶细胞进行FACS分析来检测CmRPs的表面表达，以确定基因敲低的效率(参见例如Mamidi，S.等人，Mol.Onc.7(2013)580-594)。
根据制造商的方案(Biospring)，使用脂质转染(Dharmafect 1)，用CD46(SEQ IDNO：12和13)，CD55(SEQ ID NO：14和15)，CD59(SEQ ID NO：16和17)或加扰siRNA(scrambledsiRNA)(SEQ ID NO：18和19)(通常为25nM)，转染BT474、SkBr3和SK-OV-3细胞。
转染后48小时，用针对CD46、CD55和CD59的标记抗体(每个5μg/mL；CD46-FITC目录号555949，CD55-APC目录号555696，CD59-PE目录号555764；BD Pharmingen)，染色2×105细胞，并分析所示受体(包括对照)的表面表达。通过FACS测定的CD46表达的相对降低如下表所示。
通过三重siRNA转染细胞的FACS测定，CD46、CD55和CD59表达的相对降低如下表所示。
(*)SK-OV-3细胞对siRNA转染非常敏感。模拟转染和加扰RNA转染导致CD46表达增加高达27％，导致CD59表达增加高达610％。
如实施例4所述，使用幼兔补体或合并的正常人血清(在所述siRNA或对照的存在或不存在下)，转染后96小时进行SkBr3细胞的LDH测定试验。在下表中显示了用幼兔补体和转染了CD46、CD55和CD59的siRNA的SkBr3细胞(三重转染细胞)的平均比裂解百分比(n＝3的+/-SD)。
在下表中显示了，用合并的人血清，转染了CD46、CD55和CD59的siRNA的SkBr3细胞(三重转染细胞)的平均比裂解百分比。(+/-SD，n＝3)
虽然为了清楚理解的目的，通过举例说明和示例的方式对前述发明进行了详细描述，但是该描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用明确地并入本文。
Claims (12)
1.一种用于确定组合物的补体依赖性细胞毒性的方法，
其中所述组合物包含：
i)特异性结合第一抗原上的第一表位的第一结合位点，其与人源的第一Fc区多肽缀合，以及
ii)特异性结合第一抗原上或第二抗原上的第二表位的第二结合位点，其与人源的第二Fc区多肽缀合，
其中所述方法包括以下步骤：
a)用组合物孵育表达第一抗原或第一抗原和第二抗原的人细胞，
b)向a)的混合物中加入兔补体，和
c)测定细胞裂解，从而确定组合物的补体依赖性细胞毒性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含：特异性结合第一抗原上的第一表位的第一人或人源化抗体、以及特异性结合第二抗原上的第二表位的第二人或人源化抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含：与第一抗原上的第一表位和第二抗原上的第二表位特异性结合的人或人源化双特异性抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述组合物结合第一抗原上的第一表位以及第一抗原上的第二表位，并且第一表位和第二表位是不同的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一表位和所述第二表位是非重叠表位。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在加入补体后0.5至3小时之间测定细胞裂解。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述人细胞是人恶性瘤细胞或引起自身免疫应答的人细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述人恶性瘤细胞是上皮来源的人癌细胞。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述人恶性瘤细胞是人B细胞淋巴瘤细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法是无血清方法。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述兔补体是幼兔补体。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第一结合位点与所述第二结合位点的比率为0.5:1至1:0.5。
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- 2017-06-16 US US15/624,872 patent/US20180017572A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
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