KR20170094787A - Cdc 유발 항체를 측정하기 위한 검정 및 방법 - Google Patents

Cdc 유발 항체를 측정하기 위한 검정 및 방법 Download PDF

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Abstract

본원에서는, i) 인간 기원의 제 1 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 위치, 및 ii) 인간 기원의 제 2 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 위치를 포함하는 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 방법을 보고하고 있으며, 상기 방법은 제 1 항원 및 제 2 항원을 발현하는 세포를 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계; 토끼 보체를 혼합물에 첨가하는 단계; 및 세포 용해를 측정하고, 그로써 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 단계를 포함한다.

Description

CDC 유발 항체를 측정하기 위한 검정 및 방법 {ASSAY AND METHOD FOR DETERMINING CDC ELICITING ANTIBODIES}
본 발명은 효과기 기능 유발 항체 및 항체 조합의 검출/선택을 위한 검정 및 방법의 분야에 있다.
면역글로불린은 특정 Fc 수용체, 예컨대 FcRn 뿐 아니라 Clq 에 대한 2 개 결합 위치를 각각의 중쇄 Fc-부위에 하나씩 함유한다.
보체 활성화를 위해서 하나 초과의 면역글로불린 분자는 Clq 에 대한 단량체성 IgG 의 친화성이 꽤 약한 것으로서 요구된다 (약 10-4 M 친화성) (예를 들어 Sledge et al., J. Biol. Chem. 248 (1973) 2818-2813, Hughes-Jones et al., Mol. Immunol. 16 (1979) 697-701 참조). 다가 C1q 의 결합은 면역글로불린 분자의 항원-기반 결합, 및 그에 따라 보체 활성화에 의해 증가할 수 있다 (약 10-8 M 친화성) (예를 들어 Burton et al., Mol. Immunol. 22 (1990) 161-206 참조).
Clq 의 3 차원 구조는 항체 결합 부위를 포함하는 6 개의 구형 헤드를 포함하는 튤립 다발과 유사하다 (예를 들어 Perkins et al., Biochem. J. 228 (1985) 13-26, Poon et al., J. Mol. Biol. 168 (1983) 563-577, Reid et al., Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 1-12, 및 Weiss et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 573-581 참조).
US 5,851,528 은 보체 활성화를 저해하는 방법을 보고하고 있다. CD55 및 CD59 에 대한 재조합 항체 및 이의 용도는 US 8,034,902 에 보고되어 있다. US 2012/0226020 에서는 보체 활성화를 조절하는 하이브리드 및 키메라 폴리펩티드가 보고되어 있다. 신규한 조절제 및 사용 방법은 US 2013/0302355 에 보고되어 있다. US 2010/0255011 에서는 표적 세포에서의 보체 조절 단백질 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법이 보고되어 있다.
WO 2008/007648 에서는 항체를 분류하는 것이, 세포 표면 항원을 인지할 수 있는 항체와 동일 종의 세포를 접촉시키고, 각 세포를 분석하고, 수득한 데이터를 비교하고, 유사성에 따라 개별 항체를 분류하는 것을 포함한다는 것이 보고되어 있다. 표적 세포에서의 보체 조절 단백질 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법이 WO 2010/120541 에 보고되어 있다.
Mekhaiel, D.N.A., et al. 은 개질된 효과기 기능을 갖는 중합체성 인간 Fc-융합 단백질을 보고하고 있다 (Nature Sci. Rep. 1 (2011) 1-11). 변형된 효과기 기능을 갖는 폴리펩티드 변이체가 WO 00/42072 에 보고되어 있다. US 2008/0089892 에서는 Fc 부위 변이체가 보고되어 있다. 변형된 항체 Fc 부위 및 이의 용도가 WO 2006/105062 에 보고되어 있다.
신생아 토끼 보체를 사용하여, 항체의 도움으로 상이한 복합적 면역 세포 집단으로부터 림프구를 고갈시킴으로써 이식을 촉진시켰다 (예를 들어 Herve, P., et al., Transplant. 39 (1985) 138-143 참조).
새끼 토끼 보체는 쥐과 기원의 항체를 사용하여 신장 세포 암종 (RCC) 에서 보체 의존적 세포독성 (CDC) 을 유발하는데 성공적이지 않았다 (예를 들어 Vessella, R.L., et al., Canc. Res. 45 (1985) 6131-6139 참조).
토끼 혈청은 단일 및 쌍형 쥐과 IgG2a 항체 결합 p97 (= 멜라노트랜스페린) 을 사용하여 CDC 에 의해 인간 SK-Mel28 흑색종 세포 (비-상피 = 비-암종) 를 사멸시킬 수 있었다 (예를 들어 Hellstroem, I., et al., Int. J. Canc. 31 (1983) 553-555 참조).
멤브레인-결합 보체 조절 단백질 (mCRP) 은 단핵구 및 호중구와 비교하여 림프구에서 낮은 발현 수준을 갖는다 (예를 들어 Nuutila, J., et al., Hum. Immunol. 74 (2013) 522-530 참조).
면역 회피 메커니즘으로서 mCRP 의 상향 조절은 예를 들어 림프종 또는 흑색종에서보다 대부분의 암 세포에서 더 표명된다 (예를 들어 Fishelson, Z., et al., Mol. Immunol. 40 (2003) 109-123 참조).
항체를 사용하여, CDC 가 mCRP 의 CDC-저해성 영향 없이 공통유전자 혈청 (예를 들어 인간 암종 세포 및 인간 항체와 함께 정상 인간 혈청 (NHS)) 을 갖는 환경에 있는지 (예를 들어 Dechant et al., 2008, Cancer Research 참조) 또는 mCRP CD46, CD55 및 CD59 의 siRNA-의존적 하향 조절에 의해 극복되어야만 하는 강력한 mCRP 의존적 CDC-저해 효과를 나타내는 공통유전자 혈청 (예를 들어 인간 암종 세포 및 인간 항체와 함께 정상 인간 혈청 (NHS)) 을 갖는 환경에 있는지 (예를 들어 Mamidi, S., et al., Mol. Onc.7 (2013) 580-594 참조) 를 나타내었다.
Konishi, e., et al. 은 낮은 수준의 항체 측정을 위한 보체-의존적 세포독성의 이용: 일본 뇌염 바이러스의 모델에서의 비구조적 단백질 1 에 대한 응용 (Clin. Vac. Immunol. 15 (2008) 88-94) 을 보고하였다. Klitgaard, J., et al. 은 2 개 항-cos 단일클론 항체의 조합이 만성 림프성 백혈병 세포의 보체-의존적 세포독성을 상승작용적으로 유도한다는 것을 보고하였다 (Brit. J. Hematol. 163 (2013) 182-193). Hellstrom, I., et al. 은 흑색종-항원 p97 의 2 개 결정자에 대한 단일클론 항체가 보체-의존적 세포독성에서 상승작용적으로 작용한다는 것을 보고하였다 (J. Immunol. 127 (1981) 157-160). Maddipatla, S., et al. 은 Trail-R1 및 CD20 을 표적화하는 단일클론 항체의 조합에 의한 B-세포 림프종에 대항하는 항종양 활성 증가를 보고하였다 (Clin. Cancer Res. 13 (2007) 4556-4564). Huang, J., et al. 은 인간 DAF, CD59 및 MCP 의 발현에 의한 인간 보체-매개 용해로부터의 이종발생 세포 보호에 대하여 보고하였다 (FEMS Immunol. Med. Microbiol. 31 (2001) 203-209). Qu, Z., et al. 은 B-세포 림프종에 대항하여 시험관내 및 생체내 활성인 CD20 및 CD22 에 대한 재조합 이중특이적 단일클론 항체 (bsMab) 에 대하여 보고하였다 (Blood 108 (2006) 713a-714a).
발명의 개요
본원은 암종-세포 표면 항원 결합 항체의 암종 세포에 관한 CDC 능력 분석을 위한 개선된 검정을 보고하고 있다. 이러한 검정은 예를 들어 지루하고, 복잡하며 불안정한 접근방식, 예컨대 mCRP 의 siRNA 하향 조절을 요구하지 않는다. 이러한 접근방식은 체내에서의 CDC 압력을 회피하는 면역 회피 메커니즘으로서 암종 세포에서의 mCRP 상향 조절에 대응한다. 현 검정은 mCRP 의 효과로 인해 다른 환경에서 CDC 를 유발할 수 없는 암종-세포 표면 항원 결합 항체의 CDC 를 측정하는 수단을 제공한다.
인간 또는 인간화 항체 및 인간 암종 세포와 함께 토끼 보체와 같은 비-공통유전자 혈청이 인간 세포, 특히 인간 암종 세포에서 보체 의존적 세포독성 (CDC) 을 매우 강건한 방식으로 유발하는데 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 암종 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 인간 또는 인간화 항체의 CDC 능력 측정을 위해 BRC 를 사용함으로써:
- 암종 세포에서의 상향 조절된 인간 mCRP 는 다른 검정 구성에서 관찰된 인간 또는 인간화 항체의 CDC-유발 효과를 파기하지 않고,
- 일부 경우에 정상 인간 혈청 (NHS) 이 인간 또는 인간화 항체 및 인간 종양 세포로만 CDC 를 유발할 수 있다는 비신뢰성이, mCRP 가 siRNA 에 의해 하향 조절되는 경우, 극복될 수 있고,
- 상이한 항체, 항체 포맷 또는 항체 접합체의 CDC 능력의 고처리량 스크리닝이 이제 가능하다.
본원에서 보고하는 바와 같은 방법은 암 세포, 예컨대 상피 기원의 림프종 세포 또는 암종 세포 뿐 아니라 자가면역 반응을 유발하는 세포와 함께 사용될 수 있다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 i) 인간 기원의 제 1 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 위치, 및 ii) 인간 기원의 제 2 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 위치를 포함하는 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 제 1 항원 및 제 2 항원을 발현하는 세포를 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계,
b) 토끼 보체를 a) 의 혼합물에 첨가하는 단계, 및
c) 세포 용해를 측정하고, 그로써 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 i) 인간 기원의 제 1 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 위치, 및 ii) 인간 기원의 제 2 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 위치를 포함하는, CDC-활성을 갖는 조성물을 선택하는 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 제 1 항원 및 제 2 항원을 발현하는 세포를 개별적으로 둘 이상의 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계,
b) 토끼 보체를 a) 의 혼합물에 첨가하는 단계,
c) 세포 용해를 측정하고, 그로써 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 단계, 및
d) 단계 c) 의 결과를 기반으로 하여 CDC-활성을 갖는 조성물을 선택하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 i) 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 제 1 결합 위치, ii) 임의로는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 위치를 포함하는 항체의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 적어도 제 1 항원 및 임의로는 제 2 항원을 발현하는 세포를 항체와 함께 인큐베이션하는 단계,
b) 토끼 보체를 a) 의 혼합물에 첨가하는 단계, 및
c) 세포 용해를 측정하고, 그로써 항체의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 i) 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 제 1 결합 위치, ii) 임의로는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 위치를 포함하는 항체의 보체 의존적 세포독성의 종 특이적 mCRP-유도 저해를 극복하는 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 적어도 제 1 항원 및 임의로는 제 2 항원을 발현하는 세포를 항체와 함께 인큐베이션하는 단계,
b) 토끼 보체를 a) 의 혼합물에 첨가하는 단계, 및
c) 세포 용해를 측정하고, 그로써 항체의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 단계.
한 구현예에서 항체는 항체 포맷이다.
한 구현예에서 둘 이상의 조성물은 제 1 및/또는 제 2 에피토프 또는 항원이 상이하다.
모든 양태의 한 구현예에서 조성물은 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 인간 또는 인간화 항체 및 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 인간 또는 인간화 항체를 포함한다.
모든 양태의 한 구현예에서 조성물은 제 1 항원 상의 제 1 에피토프 및 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간 또는 인간화 이중특이적 항체를 포함한다.
모든 양태의 한 구현예에서 제 1 항원 및 제 2 항원은 동일한 항원이며 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프는 상이하다. 한 구현예에서 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프는 비-중복 (non-overlapping) 에피토프이다.
모든 양태의 한 구현예에서 세포 용해는 보체 첨가 0.5 내지 3 시간 후에 측정된다.
모든 양태의 한 구현예에서 세포는 암 세포이다. 한 구현예에서 암 세포는 암종 세포이다. 한 바람직한 구현예에서 암 세포는 상피 기원의 암종 세포이다.
모든 양태의 한 구현예에서 세포는 인간 세포이다. 한 구현예에서 인간 세포는 인간 암 세포이다. 한 구현예에서 인간 세포는 인간 B-세포 림프종 세포이다. 한 구현예에서 인간 암 세포는 인간 암종 세포이다. 한 바람직한 구현예에서 인간 암 세포는 상피 기원의 인간 암종 세포이다.
모든 양태의 한 구현예에서 방법은 무-혈청 방법이다.
모든 양태의 한 바람직한 구현예에서 토끼 보체는 새끼 토끼 보체이다.
한 구현예에서 제 1 결합 위치 대 제 2 결합 위치의 비는 10:1 내지 1:10 이다. 한 바람직한 구현예에서 비는 0.5:1 내지 1:0.5 이다.
도 1: A: LDH 배출에 의해 측정되고 % CDC 로서 나타낸 BT-474 세포에서의 특이적 CDC; 흑색 원형: 트라스투주맙; 흑색 사각형: 페르투주맙; 윗 방향 삼각형: 트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합; 아랫 방향 삼각형 = 이중특이적 항-HER2 항체, 공통 (common) 경쇄; 다이아몬드형 = 이중특이적 항-HER2 항체, 공통 경쇄, 당 조작됨; 고리 원형 = 이중특이적 항-HER2 항체, CrossMab 포맷. B: BT-474 세포 (상부 그래프) 및 SK-Br3 세포 (하부 그래프) 에서의 특이적 CDC; 1 = 트라스투주맙; 2 = 페르투주맙; 3 = 트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합; 4 = 인간 IgG1, 카파 경쇄 대조군; 좌측 막대: 새끼 토끼 보체가 존재하는 특이적 CDC; 우측 막대: 새끼 토끼 보체가 부재하는 특이적 CDC; % CDC 및 특이적 CDC 는 특이적 세포독성 [%] 을 의미함.
도 2: 세포 지수 (ACEA) 의 시간 경과; 1 = 트라스투주맙; 2 = 페르투주맙; 3 = 배지 단독; 4 = 보체 대조군; 5 = 트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합; 6 = 이중특이적 항-HER2 항체, 공통 경쇄; 7 = 이중특이적 항-HER2 항체, 공통 경쇄, 당 조작됨; 8 = 이중특이적 항-HER2 항체, CrossMab 포맷.
도 3: 세포 지수 (ACEA) 의 시간 경과; 1 = 배지 단독; 2 = 보체 대조군; 3 = 항-CD55 항체, 인간 혈청 풀 (pool), 트라스투주맙, 페르투주맙 사용; 4 = 항-CD59 항체, 인간 혈청 풀, 트라스투주맙, 페르투주맙 사용; 5 = 항-CD55 항체, 항-CD59 항체, 인간 혈청 풀, 트라스투주맙 및 페르투주맙 사용; 6 = 트라스투주맙, 페르투주맙 및 새끼 토끼 보체.
도 4: CD46, CD55, CD59 녹다운 (삼중-KO) SK-OV-3 세포를 사용하는 CDC 검정의 결과. 세포를 10 ㎍/mL 항체 각각, 새끼 토끼 보체 및 정상 인간 혈청과 함께 각각 인큐베이션하였다.
I. 정의
용어 "Clq 결합" 은 그의 항원에 결합한 항체에 대한 Clq 의 결합을 나타낸다. 그의 항원에 대한 항체의 결합은 본원에서 보고된 바와 같은 방법 및 검정 내에서 생체내 및 시험관내 제한되지 않는다.
한 구현예에서 Clq 결합은 i) 멀티-웰 플레이트 (예를 들어 96-웰 ELISA 플레이트) 를 밤새 4℃ 에서 0.007 내지 25.0 mg/mL 범위의 농도에서 PBS 중 항체로 코팅하고, ii) 플레이트를 세척하고, iii) 남아 있는 반응성 표면 잔류물을 0.5 x PBS/0.025% Tween 20/0.1% 젤라틴으로 블로킹하고, iv) 1 시간 동안 37℃ 에서 a) 3% 풀링된 인간 혈청, b) 토끼 항-인간 Clq 및 c) HRP 에 접합된 돼지 항-토끼 IgG 항체와 함께 멀티-웰 플레이트를 인큐베이션하고 (중간 세척 포함), v) 약 30 분 동안 1 mg/mL 2,2'-아지노-비스 3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산과 함께 인큐베이션하고, vi) 100 μL 2% 옥살산을 첨가하고, vii) 마이크로플레이트 판독기에서 405 nm 에서 흡광도를 측정하는 것을 포함하는 방법에서 측정된다.
본원에서 항체의 C1q 결합은 높은 결합활성 결합을 초래하는 다가 상호작용이다.
용어 "보체 활성화" 는 고전적인 보체 경로의 개시를 나타낸다. 이러한 개시는 항체-항원 복합체에 대한 보체 성분 Clq 의 결합으로 인한 것이다. Clq 는 고전적 보체 캐스케이드에서의 제 1 단백질이다. 이는 보체 성분 C3 을 C3b 및 C3a 로 절단시키는 활성 C3 전환효소의 형성을 초래하는 일련의 반응에 관련된다. C3b 는 멤브레인 C5 에 결합하여, 보체 활성화의 지연 이벤트를 촉발하는 (C5b, C6, C7, C8 및 C9 의 멤브레인 공격 복합체 (MAC) 로의 어셈블리) 소위 C5b 를 초래한다. 마지막으로, 보체 캐스케이드는 세포 용해를 일으키는 세포벽 내 기공 형성을 초래한다 (aka 보체 의존적 세포독성, CDC).
용어 "보체-의존적 세포독성 (CDC)" 은 항체가 세포 상 위치한 그의 항원에 결합시 상기 개략적으로 나타낸 메커니즘에 따라 세포 용해를 초래하는 항체-매개 보체 활성화 과정을 나타낸다. CDC 는 특이적 CDC 검정을 사용하여 시험관내 측정될 수 있다. 당해 기술 분야에서 정상 인간 혈청이 보체 공급원으로서 사용된다.
용어 "보체-의존적 세포성 세포독성 (CDCC)" 는 보체 3 (C3) 절단 생성물 (표적 세포 상에 위치하며 항체-매개 보체 활성화로 인해 생성됨) 을 인지하는 보체 수용체를 발현하는 세포에 의해 매개되는 세포 사멸 과정을 나타낸다.
"친화성" 은 분자 (예를 들어, 항체) 의 단일 결합 위치와 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합계의 강도를 나타낸다. 다르게 나타내지 않는 한, 본원에서 사용하는 바와 같이, "결합 친화성" 은 결합 쌍의 일원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화성을 나타낸다. 분자 X 의 그의 파트너 Y 에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (kd) 에 의해 표시될 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것들을 포함하는, 당업계에 공지된 통상적 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화성을 측정하기 위한 특정한 설명적이고 예시적인 구현예를 하기에 기재한다.
본원에서의 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구조, 예컨대 비제한적으로, 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내고 CDC 를 유발할 수 있는 것이면, 항체 단편을 포함한다.
"효과기 기능" 은 항체 부류에 따라 가변적인 항체의 Fc-부위에 기인하는 그러한 생물학적 활성을 나타낸다. 항체 효과기 기능의 예는: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체) 의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서의 용어 "Fc-부위" 는 불변부의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 자생 (native) 서열 Fc-부위 및 변이체 Fc-부위를 포함한다. 한 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-부위는 Cys226, 또는 Pro230 으로부터, 중쇄의 카르복실-말단으로 확장된다. 그러나, Fc-부위의 C-말단 리신 (Lys447) 은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 명시하지 않는 한, Fc-부위 또는 불변부에서의 아미노산 잔기의 번호화는 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242] 에서 기재한 바와 같이, EU 지수로도 지칭하는 EU 번호화 시스템에 따른 것이다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물" 은 상호교환가능하게 사용되며, 외인성 핵산이 도입되는 세포 (이러한 세포의 자손 포함) 를 나타낸다. 숙주 세포는, 1 차 형질전환된 세포 및 계대 횟수에 관계 없이 그로부터 유래한 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 를 포함한다. 자손은 핵산 내용물에 있어서 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 나타낸다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 이 비-인간 항체의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 이 인간 항체의 것에 상응하는, 하나 이상, 및 통상 2 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 인간화된 항체는 임의로는 인간 항체에서 유래한 항체 불변부의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화 형태", 예를 들어, 비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 나타낸다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "과가변부" 또는 "HVR" 은, 서열에 있어서 과가변성이며 ("상보적 결정 부위" 또는 "CDR") 구조적으로 규정된 루프 ("과가변 루프") 를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉부") 를 함유하는 항체 가변 도메인의 각 부위를 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6 개의 HVR 을 포함한다; VH 에서 3 개 (H1, H2, H3), 그리고 VL 에서 3 개 (L1, L2, L3).
본원에서의 HVR 은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) 에서 발생하는 과가변 루프 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 에서 발생하는 CDR (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) 및 93-101 (H3) 에서 발생하는 항원 접촉부 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) 및 94-102 (H3) 를 포함하는, (a), (b) 및/또는 (c) 의 조합.
다르게 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 상기 Kabat et al. 에 따라 번호매겨진다.
"단리된" 항체는 이의 자연적 환경 성분으로부터 분리되는 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 측정되는 바와 같이 95% 또는 99% 초과 순도로 정제된다. 항체 순도 평가를 위한 방법의 검토를 위해서는, 예를 들어 [Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87] 을 참조한다.
"단리된" 핵산은 이의 자연적 환경 성분으로부터 분리되는 핵산 분자를 나타낸다. 단리된 핵산은, 보통 핵산 분자를 함유하지만 핵산 분자가 이의 자연적 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 있거나 염색체외 존재하는, 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "단일클론 항체" 는 실질적으로 동질한 항체 집단에서 수득한 항체를 나타내는데, 즉, 가능한 변이체 항체 (예를 들어 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 단일클론 항체 제조물의 생성 동안 발생함, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함) 를 제외하고, 그 집단을 포함하는 개별 항체가 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 통상 상이한 결정자 (에피토프) 에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제조물과 반대로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단일클론" 은 실질적으로 동질한 항체 집단에서 수득되는 것으로서의 항체 특질을 나타내며, 임의 특정 방법에 의한 항체 생성을 필요로 하는 것으로 해석되지 않을 것이다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자자리 (loci) 의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 비제한적으로 포함하는 다양한 기법에 의해 생성될 수 있으며, 이러한 방법 및 단일클론 항체 생성을 위한 기타 예시적 방법이 본원에 기재되어 있다.
쥐과 단일클론 항체 4D5 는 생리학적 수준의 HER2 를 발현하는 세포에 대해 효과를 갖지 않으면서, HER2 과발현 암세포에서 HER2 를 특이적으로 표적화한다. 인간화 (4D5) 단일클론 항체 (hu4D5) 는, 1998 년 후반에 FDA 판매 승인을 획득한 약물 Herceptin® (트라스투주맙, rhuMab HER2, US 5,821,337) 으로서 상업적으로 공지되어 있다.
페르투주맙 (PERJETATM, rhuMab 2C4, US 7,862,817) 은 HER2 수용체가 세포 표면 상에서 다른 HER 수용체 (EGFR/HER1, HER3 및 HER4) 와 페어링 (이량체화) 되는 것 (종양 성장 및 생존에 있어서 그 역할을 하는 것으로 여겨지는 과정) 을 방지하는 것으로 특히 설계되는 인간화 단일클론 항체이다. PERJETA 는 HER2-양성 전이성 또는 국부 재발 절제불가 유방암을 갖는 성인 환자에서 Herceptin (트라스투주맙) 및 도세탁셀과 함께 승인되었으며 2013 년 9 월에 선행항암 (neoadjuvant) 유방암 치료용으로 FDA 승인을 획득하였다.
페르투주맙은 HER2 의 도메인 II (이량체화에 필수적임) 에 결합하는 한편, 트라스투주맙은 HER2 의 세포외 도메인 IV 에 결합한다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "암" 은 증식성 질환, 예컨대 림프종, 림프성 백혈병, 폐암, 비소세포 폐 (NSCL) 암, 폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위장암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음주 암종, 호지킨 병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 고환암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추 신경계 (CNS) 의 신생물, 척추 축 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 뇌질피복 세포증, 수모세포종, 수막종, 편평상피 세포 암종, 뇌하수체 선종 및 에윙 육종, 예컨대 상기 임의 암의 불응성 형태, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 나타낸다. 한 구현예에서 암은 암종이다.
본원에서 사용되는 경우, 용어 "항원-결합 위치" 는 항원-결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 항체의 항원-결합 부분은 "상보성 결정 부위" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 부위는 본원에서 정의된 바와 같은 과가변 부위 잔기 외의 가변 도메인 부위이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N- 에서 C-말단으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 은 대부분 항원 결합에 기여하며 항체의 특성을 정의하는 부위이다. CDR 및 FR 부위는 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 표준 정의에 따라 결정되고, 및/또는 이들 잔기는 "과가변 루프" 로부터의 것이다.
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적 인지를 나타낸다. 천연 항체는, 예를 들어 단일특이적이다. 본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "단일특이적" 항체는 그의 각각이 동일 항원의 동일 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 위치를 갖는 항체를 나타낸다.
"이중특이적 항체" 는 2 개의 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 항체이다. 본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "이중특이적" 항체는 그의 각각이 상이한 에피토프에 결합하는 2 개 이상의 결합 위치를 갖는 항체를 나타낸다.
본 출원 내에서 사용하는 바와 같은 용어 "~가" 는 항체 분자 중 명시된 수의 결합 위치의 존재를 나타낸다. 그로서, 용어 "이가", "사가" 및 "육가" 는 항체 분자 중 각각 2 개 결합 위치, 4 개 결합 위치 및 6 개 결합 위치의 존재를 나타낸다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 "이가" 이며 "삼가" 또는 "다가" (예를 들어 "사가" 또는 "육가") 일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는" 은 시험관내 검정, 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 검정 (SPR, BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 에서 항원 에피토프에 대한 항체 결합을 나타낸다. 결합 친화성은 용어 ka (항체/항원 복합체로부터의 항체의 결합에 대한 속도 상수), kd (해리 상수) 및 KD (kd/ka) 에 의해 정의된다. '결합하는' 또는 '특이적으로 결합하는' 은 10-7 mol/L 이하의 결합 친화성 (KD) 을 의미한다.
용어 "에피토프" 는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정자를 포함한다. 특정 구현예에서, 에피토프 결정자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 분족 (grouping) 을 포함하고, 특정 구현예에서는 특정한 3 차원 특징, 및 또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체가 결합하는 항원의 부위이다.
II. 본원에 보고된 바와 같은 방법
암종은 생체내 CDC 압력을 회피하는 면역 회피 메커니즘으로서 mCRP (특히 CD55 및 CD59) 를 종종 상향 조절하는 세포이며 상피 기원의 것이다. 일부 경우 암종-세포 표면 항원 결합 항체는 mCRP 의 영향/존재로 인해 CDC 를 유발할 수 없다. 과거에 이는 지루하고, 복잡하며 불안정한 접근방식, 예를 들어 mCRP 의 siRNA 하향 조절을 사용하여 암종 세포에서 다루어져왔다. 본원에서는, 즉 다른 것들 중에서도 암종-세포 표면 항원 결합 항체의 CDC 능력의 분석을 위한 보다 강건하고 고처리량의 양립가능한 검정이 보고되고 개선된다.
한편으로는 하나 이상의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며 다른 한편으로는 인간 기원의 Fc-부위 폴리펩티드, 예를 들어 둘 이상의 인간 또는 인간화 항체 또는 인간 또는 인간화 이중특이적 항체의 조합을 포함하는 분자를 포함하는 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하기 위해서는, 비-공통유전자 보체, 즉 토끼 보체, 예를 들어 새끼 토끼 보체가 사용되어야 한다는 것이 발견되었다. 예기치 않게, 공통유전자 보체의 사용은 기능적 방법을 초래하지 않았다. 마찬가지로, 기니피그 보체 (특이적인 비-공통유전자 보체) 의 사용은 또한 기능적 검정을 초래하지 않았다.
본원에서는, 항체 조합 또는 이중특이적 항체의 CDC-활성을 측정하는 방법이 보고된다. 상기 방법은 인간 혈청 및 인간 암 세포로의 인큐베이션이 믿을만한 결과를 제공하지 않는 경우에 특히 유용하다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 i) 인간 기원의 제 1 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 위치, 및 ii) 인간 기원의 제 2 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 위치를 포함하는 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 제 1 항원 및 제 2 항원을 발현하는 세포를 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계,
b) 토끼 보체를 a) 의 혼합물에 첨가하는 단계, 및
c) 세포 용해를 측정하고, 그로써 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 i) 인간 기원의 제 1 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 위치, 및 ii) 인간 기원의 제 2 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 위치를 포함하는, CDC-활성을 갖는 조성물을 선택하는 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 제 1 항원 및 제 2 항원을 발현하는 세포를 개별적으로 둘 이상의 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계,
b) 토끼 보체를 a) 의 혼합물에 첨가하는 단계,
c) 세포 용해를 측정하고, 그로써 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 단계, 및
d) 단계 c) 의 결과를 기반으로 CDC-활성을 갖는 조성물을 선택하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 i) 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 제 1 결합 위치, ii) 임의로는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 위치를 포함하는 항체의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 적어도 제 1 항원 및 임의로는 제 2 항원을 발현하는 세포를 항체와 함께 인큐베이션하는 단계,
b) 토끼 보체를 a) 의 혼합물에 첨가하는 단계,
c) 세포 용해를 측정하고, 그로써 항체의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 단계.
단일특이적 항체가 본원에서 보고하는 바와 같은 검정에서 작동하지 않는다는 것이 발견되었다.
놀랍게도, 인간 암 세포, 인간 또는 인간화 항체 및 토끼 기원의 비-공통유전자 보체의 조합이 기능적 검정을 초래한다는 것이 발견되었다.
한 구현예에서 세포는 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프를 발현한다.
한 구현예에서 제 1 항원 및 제 2 항원은 세포 표면 항원이다.
세포 표면 항원을 발현하는 세포는 임의의 세포일 수 있다. 한 구현예에서 세포는 암 세포이다. 한 구현예에서 암 세포는 암종 세포이다.
보체 의존적 세포독성은 보체 첨가 1 또는 2 시간 후에 측정되어야 한다. 따라서, 한 구현예에서 세포 용해는 보체, 즉 새끼 토끼 보체 첨가 0.5 시간 내지 3 시간 후에 측정된다. 한 구현예에서 세포 용해는 보체 첨가 1 시간 내지 2 시간 후에 측정된다.
세포 용해는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 LDH 배출 또는 세포 생존력 측정으로 측정될 수 있다. 따라서, 한 구현예에서 세포 용해는 LDH 배출 또는 세포 생존력을 측정함으로써 측정된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 방법은 혈청의 존재를 필요로 하지 않는다. 따라서, 한 구현예에서 방법은 무혈청 방법이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 방법은 결합을 위해 서로 교차-경쟁하지 않지만 조합으로 (단독 아님) CDC 를 유발하는 항체 조합의 선택에 사용될 수 있다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 방법이며,
여기서 조성물은
i) 인간 기원의 제 1 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 위치, 및
ii) 인간 기원의 제 2 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 1 항원 또는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 위치를 포함하고,
여기서 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 제 1 항원 또는 제 1 항원 및 제 2 항원을 발현하는 인간 세포를 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계,
b) 토끼 보체를 a) 의 혼합물에 첨가하는 단계, 및
c) 세포 용해를 측정하고, 그로써 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 이중특이적 항체 또는 2 개 단일특이적 항체의 조합의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 방법이며,
여기서
i) 제 1 단일특이적 항체는 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하고, 제 2 단일특이적 항체는 제 1 항원 또는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하거나,
ii) 이중특이적 항체는 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 위치, 및 제 1 항원 또는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 위치를 포함하고,
여기서 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 제 1 항원 또는 제 1 항원 및 제 2 항원을 발현하는 상피 기원의 인간 암종 세포를 이중특이적 항체 또는 2 개 단일특이적 항체의 조합과 함께 인큐베이션하는 단계,
b) 토끼 보체를 a) 의 혼합물에 첨가하는 단계, 및
c) 세포 용해를 측정하고, 그로써 이중특이적 항체 또는 2 개 단일특이적 항체의 조합의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 단계.
인간화 항체
통상, 치료제로서 사용되는 것으로 의도되는 비-인간 항체는, 모체 비-인간 항체의 특이성을 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로 인간화 항체는, HVR, 예를 들어 CDR (또는 이의 일부) 이 비-인간 항체로부터 유래하고, FR (또는 이의 일부) 이 인간 항체 서열에서 유래하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로는 또한 적어도 일부 또는 전체 길이 인간 불변부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화 항체에서의 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예를 들어 HVR 잔기가 유래하는 항체) 로부터의 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성이 회복 또는 개선된다.
인간화 항체 및 이를 생성 방법은 예를 들어 [Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633] 에서 검토되며, 예를 들어 Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321 및 US 7,087,409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34 (특이성 결정 부위 (SDR) 그래프팅을 기재함); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 ("리서페이싱 (resurfacing)" 을 기재함); Dall'Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60 ("FR 셔플링 (shuffling) 을 기재함"); Osbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68; 및 Klimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (FR 셔플링에 대한 "안내된 선택" 접근방식을 기재함) 에서 추가 기재된다.
인간화에 사용할 수 있는 인간 골격부는 비제한적으로 하기를 포함한다: "최적합" 방법을 사용하여 선택되는 골격부 (예를 들어, Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변부의 특정 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열에서 유래하는 골격부 (예를 들어, Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 골격부 또는 인간 생식세포 골격부 (예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 참조); 및 스크리닝 FR 라이브러리에서 유래하는 골격부 (예를 들어, Baca, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684; 및 Rosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618) 참조).
다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법에 사용되는 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 위치/항원/에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 동일한 항원의 2 개 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전체 길이 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 생성시키기 위한 기법은 비제한적으로, 상이한 특이성을 갖는 2 개 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합체 동시발현 (Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659 참조), 및 "놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, US 5,731,168 참조) 를 포함한다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체성 분자를 생성하기 위한 정전기 스티어링 효과 조작 (WO 2009/089004 참조); 둘 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, US 4,676,980 및 Brennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83 참조); 이중특이적 항체 생성을 위한 류신 지퍼 사용 (예를 들어, Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 참조); 이중특이적 항체 단편 생성을 위한 "디아바디" 기법 사용 (예를 들어, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참조); 단일-사슬 Fv (sFv) 이량체 사용 (예를 들어 Gruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374 참조); 및 예를 들어 Tutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69 에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체 제조에 의해 생성될 수 있다.
3 개 이상의 기능적 항원 결합 위치를 갖는 조작된 항체, 예컨대 "문어 (Octopus) 항체" 가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어 US 2006/0025576 참조).
항체는 또한 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF" 를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
본원에서의 항체 또는 단편은 또한 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2010/145793 에 기재된 다중특이적 항체를 포함한다.
재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들어 US 4,816,567 에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조될 수 있다. 발현을 위해서는 항체의 개별 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산이 요구된다. 이러한 핵산은 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄). 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들어, 하기로 형질전환된다): (1) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터. 한 구현예에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어 중국 햄스퍼 난소 (CHO) 세포 또는 림프 세포이다 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포). 한 구현예에서, 상기 제공되는 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의로는 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항체 제조 방법이 제공된다.
항체의 재조합체 생성을 위해, 예를 들어 상기 기재하는 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산(들) 은 단리되며 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 이러한 핵산은 종래의 절차 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용) 를 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해, 예를 들어 US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523 를 참조하고; 또한 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 (대장균에서의 항체 단편 발현을 기재함) 를 참조한다. 발현 후, 항체는 가용성 분획물 중 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 추가 정제될 수 있다.
원핵세포에 추가로, 진핵세포 미생물 예컨대 사상균 또는 효모는 그의 글리코실화 경로가 "인간화" 되어 부분적 또는 전체 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 초래하는 진균 및 효모를 비롯하여, 항체-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다 (Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 참조).
글리코실화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 에서 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인되어 있다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다 (예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서의 항체 생성을 위한 PLANTIBODIESTM 기법을 기재함) 참조).
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 조정되는 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포의 기타 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7); 인간 배아 신장 주 (예를 들어, Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에서 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 햄스터 새끼 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어, Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에서 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유류 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예컨대 DHFR- CHO 세포 (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 을 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주 검토를 위해서는, 예를 들어, [Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), 255-268] 을 참조한다.
약학 제형
항체의 약학 제형은, 원하는 정도의 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)), 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 이용한 농도 및 투약량에서 수용자에게 일반적으로 비독성이며, 비제한적으로 하기를 포함한다: 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 산화방지제 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물 예컨대 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 간질성 (interstitial) 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX® Baxter International, Inc.) 을 추가로 포함한다. 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법 (rhuPH20 포함) 이 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP 는 콘드로이티나아제와 같은 하나 이상의 추가적 글리코사미노글리카나아제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형이 US 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 US 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
제형은 또한 특정 징후가 치료되는데 필요한 바에 따라 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션 (coacervation) 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중 포획될 수 있다. 이러한 기법은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)] 에 개시되어 있다.
서방출 제제가 제조될 수 있다. 서방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 (매트릭스는 성형 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태임) 를 포함한다.
생체내 투여에 사용할 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 성취될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
임의의 조성물, 즉 본원에서 제공된 방법으로 선택된 항체 조합 또는 다중특이적 항체가 치료 방법에서 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로서 사용하기 위한, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에서 사용하기 위한, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 유효량의 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물을 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 개인을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물을 제공한다. 이러한 한 구현예에서, 방법은 유효량의 하나 이상의 추가적 치료제를 개인에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 임의의 구현예에 따른 "개인" 은 바람직하게는 인간이다.
추가 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에서의, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물의 용도를 제공한다. 추가 구현예에서, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물은, 유효량의 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물을 질환을 갖는 개인에게 투여하는 것을 포함하는 질환 치료 방법에서 사용된다. 이러한 한 구현예에서, 방법은 유효량의 하나 이상의 추가적 치료제를 개인에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 임의의 구현예에 따른 "개인" 은 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 방법은 유효량의 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물을 이러한 질환을 갖는 개인에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 구현예에서, 방법은 유효량의 하나 이상의 추가적 치료제를 개인에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 임의의 구현예에 따른 "개인" 은 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 예를 들어 상기 임의의 치료 방법에서 사용하기 위한, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물을 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 구현예에서, 약학 제형은 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 임의의 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약학 제형은 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 임의의 조성물 및 하나 이상의 추가적 치료제를 포함한다.
본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물은 치료요법에서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물은 하나 이상의 추가적 치료제와 동시-투여될 수 있다.
상기 나타낸 이러한 조합 치료요법은 병용 투여 (둘 이상의 치료제가 동일 또는 개별 제형에 포함됨), 및 개별 투여 (이 경우, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물의 투여가 추가적 치료제(들) 의 투여 이전, 동시 및/또는 이후에 발생할 수 있음) 를 포함한다. 한 구현예에서, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물의 투여 및 추가적 치료제의 투여는 서로 약 1 개월 내, 또는 약 1, 2 또는 3 주 내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 일 내 발생한다.
본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물 (및 임의의 추가적 치료제) 은 임의의 적합한 수단, 예컨대 비경구, 폐내 및 비강내, 및 국부 치료에 대해 필요시, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 부분적으로, 투여가 단기간 또는 장기간인지 여부에 따라 정맥내 또는 피하 주사에 의한 것일 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 투입을 비제한적으로 포함하는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물은 진료 표준 (good medical practice) 과 일치하는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서의 고려를 위한 인자는 치료하는 특정 장애, 치료하는 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제 전달 위치, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의사에게 공지된 기타 인자를 포함한다. 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물은, 그럴 필요는 없으나, 의문의 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 임의로 제형화된다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형에 존재하는 성분의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 토의한 기타 인자에 따라 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투약량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투약량의 약 1 내지 99% 로, 또는 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투약량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물의 적절한 투약량 (단독으로 또는 하나 이상의 기타 추가적 치료제와 조합으로 사용시) 은 치료하는 질환의 유형, 조성물의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 조성물이 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지에 따라, 이전 치료요법, 환자의 임상 이력 및 조성물에 대한 반응, 및 참여 의사의 재량에 따라 좌우될 것이다. 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 선택된 조성물은 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어 0.5 mg/kg - 10 mg/kg) 의 조성물이, 예를 들어 하나 이상의 개별 투여 또는 연속 투입인지에 따라, 환자에 대한 투여용 초기 후보 투약량일 수 있다. 한 전형적인 1 일 투약량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 치료는 일반적으로 계속될 것이다. 조성물의 한 예시적 투약량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3 주마다 (예를 들어 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어 약 6 용량의 항체를 받도록) 투여될 수 있다. 초기의 높은 로딩 용량 이후, 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약량 계획이 유용할 수 있다. 이러한 치료요법의 과정은 종래의 기법 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 기재를 고려하여, 다양한 기타 구현예가 실행될 수 있다는 것이 이해된다.
재료 및 방법
재조합 DNA 기법
[Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에서 기재된 바와 같이, DNA 를 조작하는데 표준 방법을 사용하였다. 분자 생물학적 시약을 제조사 지시사항에 따라 사용하였다.
유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
Geneart GmbH (Regensburg, Germany) 에서 화학적 합성에 의해 원하는 유전자 부분을 제조하였다. 합성한 유전자 단편을 증식/증폭을 위해 대장균 플라스미드 내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 대안적으로, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 어닐링하거나 PCR 을 통해 짧은 합성 DNA 단편을 어셈블리하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드를 metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany) 에 의해 제조하였다.
시약
모든 시판 화학 물질, 항체 및 키트를, 다르게 언급하지 않는 한 제조사의 프로토콜에 따라 제공된 바와 같이 사용하였다.
항체
트라스투주맙
경쇄:
Figure pct00001
중쇄:
Figure pct00002
페르투주맙
경쇄:
Figure pct00003
중쇄:
Figure pct00004
Figure pct00005
이중특이적 항-HER2 항체, 공통 경쇄
공통 경쇄:
Figure pct00006
중쇄 1 (놉, 트라스투주맙):
Figure pct00007
중쇄 2 (홀, 페르투주맙):
Figure pct00008
Figure pct00009
이중특이적 항-HER2 항체, CrossMab 포맷:
중쇄 1:
Figure pct00010
중쇄 2:
Figure pct00011
경쇄 1:
Figure pct00012
경쇄 2:
Figure pct00013
Figure pct00014
발현
a) 발현 플라스미드의 구축
모든 중쇄 및 경쇄 인코딩 발현 플라스미드의 구축에 하기 발현 벡터를 사용하였다. 벡터는 하기 요소로 구성된다:
- 선택 마커로서 히그로마이신 저항성 유전자,
- 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 의 복제 기원, oriP,
- 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원,
- 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자,
- 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 로부터의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 면역글로불린 폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열.
중쇄 또는 경쇄를 포함하는 면역글로불린 유전자를 유전자 합성에 의해 제조하고 상기 기재한 바와 같이 pGA18 (ampR) 플라스미드 내로 클로닝하였다. 가변 중쇄 구축물을 고유한 제한 위치를 사용하여 지향성 클로닝 (directional cloning) 에 의해 구축하였다. 가변 경쇄 구축물을 VL 및 CL 을 포함하는 것으로 유전자 합성으로서 주문하고, 고유한 제한 위치를 사용하여 지향성 클로닝에 의해 구축하였다. 최종 발현 벡터를 대장균 세포 내로 형질전환시키고, 발현 플라스미드 DNA 를 단리하고 (Miniprep) 제한 효소 분석 및 DNA 서열분석 처리하였다. 올바른 클론을 150 ml LB-Amp 배지에서 성장시키고, 플라스미드 DNA 를 다시 단리하고 (Maxiprep) DNA 서열분석에 의해 서열 무결성을 확인하였다.
b) HEK293 세포에서의 면역글로불린 변이체의 일시적 발현
재조합 면역글로불린을, FreeStyleTM 293 Expression System 을 제조사 지시사항 (Invitrogen, USA) 에 따라 사용하여, 인간 배아 신장 293-F 세포의 일시적 트랜스펙션에 의해 발현시켰다. 소규모 시험 발현을 위해 30 mL 의 0.5 x 106 HEK293F 세포/mL 을 트랜스펙션 1 일 전에 시딩하였다. 다음 날, 플라스미드 DNA (1 mL 배양 배지 당 1 ㎍ DNA) 를 1.2 mL Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 와 혼합한 후, 40 μL 의 293FectinTM 트랜스펙션 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 을 첨가하였다. 혼합물을 15 분 동안 실온에서 인큐베이션하고 세포에 적가하였다. 트랜스펙션 1 일 후 각 플라스크에 300 μL L-글루타민 (200 mM, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) 및 600 μL 의 공급물 (아미노산, 당, 미량 원소, RPMI 없는 FreeStyle 배지 함유) 을 공급하였다. 트랜스펙션 3 일 후 세포 농도, 생존력 및 배지 중 글루코오스 농도를 자동화 세포 생존력 분석기 (Vi-CELLTM XR, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) 및 글루코오스 계량기 (Accu-CHEK® Sensor comfort, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 를 사용하여 측정하였다. 추가로 각각의 플라스크에 300 μL 의 L-글루타민, 300 μL 비-필수 아미노산 용액 (PANTM Biotech, Aidenbach, Germany), 300 μL 나트륨 피루베이트 (100 mM, Gibco, Invitrogen), 1.2 ml 공급물을 공급하고 5 g/L 글루코오스 (D-(+)-글루코오스 용액 45%, Sigma) 을 첨가하였다. 마지막으로, 트랜스펙션 6 일 후 항체를 X3R Multifuge (Heraeus, Buckinghamshire, England) 에서 주변 온도에서 15 분 동안 3500 rpm 에서 원심분리에 의해 수확하고, 상청액을 Steriflip 필터 유닛 (0.22 ㎛ Millipore Express PLUS PES 멤브레인, Millipore, Bedford, MA) 을 통해 멸균 여과하고, 추가 사용할 때까지 -20℃ 에서 보관하였다. 5 L 이하의 대규모 트랜스펙션을 선형으로 조정하였다.
c) 정제
이중특이적 항체를, Protein A-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden) 및 Superdex200 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다. 간단하게, 멸균 여과된 세포 배양물 상청액을, PBS 완충제 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 로 평형화된 HiTrap Protein A HP (5 mL) 컬럼에 적용하였다. 미결합 단백질을 평형 완충제로 세척해내었다. 항체 및 항체 변이체를 0.1 M 시트레이트 완충제 (pH 2.8) 로 용리하고, 단백질 함유 분획물을 0.1 mL 1 M Tris (pH 8.5) 로 중화시켰다. 용리된 단백질 분획물을 풀링하고, Amicon Ultra 원심분리 필터 장치 (MWCO: 30 K, Millipore) 를 사용하여 3 mL 의 부피로 농축하고, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl (pH 6.0) 로 평형화된 Superdex200 HiLoad 120 mL 16/60 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 에 로딩하였다. 정제된 이중특이적 항체 및 대조군 항체를 함유하는 분획물 (5% 미만의 고분자량 응집물을 가짐) 을 풀링하고, 1.0 mg/mL 분취액으로서 -80℃ 에서 보관하였다.
d) 단백질 정량
단백질을, 사전-패킹된 Poros® A Protein A 컬럼 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 을 갖는 자동화 Ultimate 3000 system (Dionex, Idstein, Germany) 을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정량하였다. 모든 샘플을 완충제 A (0.2 M Na2HPO4·[2 H2O], pH 7.4) 중 로딩하고 완충제 B (0.1 M 시트르산, 0.2 M NaCl, pH 2.5) 중 용리하였다. 단백질 농도를 측정하기 위해, 1.62 의 흡광 계수를 모든 샘플에 사용하였다.
e) 정제된 단백질의 분석
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를, 아미노산 서열을 기반으로 계산한 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm 에서의 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 결정하였다. 이중특이적 항체 및 대조군 항체의 순도 및 분자량을, 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue) 로 염색하여 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. NuPAGE® Pre-Cast gel system (Invitrogen, USA) 을 제조사 지시사항에 따라 사용하였다 (4-20% 트리스-글리신 겔). 이중특이적 항체 및 대조군 항체 샘플의 응집물 함량을, 25℃ 에서 200 mM KH2PO4, 250 mM KCl, pH 7.0 런닝 완충제 중 Superdex 200 분석적 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 사용하여 고성능 SEC 에 의해 분석하였다. 25 ㎍ 단백질을 0.5 mL/분의 유량으로 컬럼에 주입하고, 50 분에 걸쳐 등용매 용리하였다. 환원된 이중특이적 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 백본의 무결성을, Peptide-N-Glycosidase F (Roche Molecular Biochemicals) 로의 효소 처리에 의해 N-글리칸 제거 후 NanoElectrospray Q-TOF 질량 분석법에 의해 확인하였다.
f) 분석 HPLC
TSK-GEL G3000SW 겔 여과 컬럼 (7.5 mm ID x 30 cm, Tosohaas Corp., Montgomeryville, PA, USA) 을 갖는 Agilent HPLC 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) 를 사용하여 항체를 분석하였다. 18 μL 의 용리된 단백질을 완충제 A (300 mM NaCl, pH 7.5 중 0.05 M K2HPO4/KH2PO4) 중 컬럼에 로딩하고, 크기를 기반으로 분리하였다.
실시예 1
상이한 보체 공급원을 사용하는 검정
기니피그 보체 ( GPC ) 로의 Alamar Blue 검정
CHO-K1 Nxre19 세포 (IL15R 트랜스펙션된 CHO-K1) 를 GlutaMax 가 보충된 DMEM/F12 배지 (Gibco, 카탈로그 번호 31331-028) 중 96-웰 편평 바닥 세포 배양 플레이트 (NUNC, 100 μL/웰) 에 20,000 개 세포/웰로 시딩하였다. 25 μL 의 IL15-Fc 융합 폴리펩티드 (6-배 종료-농도) 를 첨가하고 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 25 μL 의 기니피그 보체 (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 S1639) 를 첨가하고 3.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 50 μL 의 Alamar Blue (Promega) 를 첨가하고 밤새 37℃/5% CO2 에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 550 nm (여기) 및 595 nm (방사) 의 파장에서 측정하였다.
Figure pct00015
데이터로부터, 기니피그 보체가 Fc-부위의 부재 하에서도 모든 희석에서 독성이 있다는 것을 관찰할 수 있다.
인간 보체 (HUC) 로의 LDH 검정
CHO-K1 Nxre19 세포 (IL15R 트랜스펙션된 CHO-K1) 를 96-웰 편평 바닥 세포 배양 플레이트 (NUNC, 100 μL/웰) 에 10,000 개 세포/웰로 시딩하고, GlutaMax 가 보충된 DMEM/F12 배지 (Gibco, 카탈로그 번호 31331-028) 에서 밤새 배양하였다. IL15-Fc 융합 폴리펩티드를 첨가하고 (5-배 종료-농도에서 25 μL/웰) 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 성장 배지를 제거하고 세포를 무혈청 배지로 1 회 세척하였다. 이후 190 μL/웰 무혈청 배지 및 10 μL 의 인간 보체 (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 S1764, c = 1 mg/mL) 를 첨가하였다. 4 시간 후 플레이트를 200 g 에서 원심분리하고 100 μL/웰을 또 다른 96-웰 편평 바닥 플레이트에 옮겼다. 이후 100 μL 의 LDH 반응 믹스 (mix) (세포독성 검출 키트, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 를 첨가하였다. 37℃ 에서 20 분 인큐베이션한 후 광학 밀도 (OD) 를 Tecan Sunrise 판독기 상에서 492/690 nm 에서 측정하였다.
Figure pct00016
데이터로부터, 인간 보체가 용량 의존적 보체 의존적 독성을 발휘하지 않는다는 것을 관찰할 수 있다.
새끼 토끼 보체 (BRC) 로의 LDH 검정
CHO-K1 Nxre19 세포 (IL15R 트랜스펙션된 CHO-K1) 를 96-웰 편평 바닥 세포 배양 플레이트 (NUNC, 100 μL/웰) 에 10,000 개 세포/웰로 시딩하고 GlutaMax 가 보충된 DMEM/F12 배지 (Gibco, 카탈로그 번호 31331-028) 에서 밤새 배양하였다. IL15-Fc 융합 폴리펩티드를 첨가하고 (5-배 종료-농도에서 25 μL/웰) 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 새끼 토끼 보체 1 개 바이알 (Cedarlane, 카탈로그 번호 CL3441) 을 1 mL 의 Aqua bidest 로 재구성하였다. 보체 용액을 배지로 희석하고 웰에 25 μL 첨가하였다. 4 시간 후 플레이트를 200 g 에서 원심분리하고 100 μL/웰을 또 다른 96-웰 편평 바닥 플레이트에 옮겼다. 이후 100 μL 의 LDH 반응 믹스 (세포독성 검출 키트, Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany) 를 첨가하였다. 37℃ 에서 20 분 인큐베이션한 후, 광학 밀도 (OD) 를 Tecan Sunrise 판독기 상에서 492/690 nm 에서 측정하였다.
Figure pct00017
BRC 가 낮은 배경 독성을 가지며 용량 의존적 보체 독성을 나타낸다는 것을 관찰할 수 있다.
실시예 2
BT-474 세포 상의 항-HER2 항체의 C1q 결합
약 3x105 개 BT-474 세포를 10% FCS 가 보충된 RPMI 1640 에서 얼음 상 10 ㎍/mL 의 표시한 항체와 함께 인큐베이션하였다. 얼음 상 30 분 인큐베이션한 후 10 ㎍/mL C1q (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 C1740) 를 첨가하였다. 이후 인큐베이션을 얼음 상에서 추가로 20 분 동안 지속하였다. 세척한 후, 세포를 200 μL 배지에 재현탁하고 PE-표지 항-C1q 항체 (Cedarlane, 카탈로그 번호 CL7611PE-SP) 로 대비염색하였다. 얼음 상에서 30 분 인큐베이션한 후, 세포를 2 회 세척하고 FACS Canto II 상에서 분석하였다.
Figure pct00018
이러한 C1q 검정은 재조합 보체 인자 C1q 가 BT-474 세포 상의 상이한 항체에 결합하는 것을 설명한다.
실시예 3
BT-474 세포 상의 항-HER2 항체의 증식 저해
10000 개 (1x104) BT-474 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 10% FCS 가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 24 시간 후 성장 배지를 제거하고 적정된 양의 표시한 항체를 100 μL 의 최종 부피로 첨가하였다 (배양 배지 중 사전혼합됨; 200 nM, 66.7 nM, 22.2 nM, 7.4 nM, 2.5 nM, 0.8 nM, 0.3 nM, 0.1 nM). 배양물 중 생존가능 세포를 측정하기 위해, CellTiterGlo 발광 세포 생존력 검정을 제조사 지시사항에 따라 수행하였다 (대사적으로 활성인 세포의 표시자로서 ATP 수준을 정량). 따라서, 6 일 배양한 후 100 μL CellTiterGlo Reaction Mix (Promega, 카탈로그 번호 G7571) 를 세포에 첨가하고, 진탕하면서 2 분 동안 인큐베이션하였다. 이후 75 μL 의 용해물을 개별 96-웰 편평 바닥 플레이트 (Costar, 카탈로그 번호 3917) 에 옮겼다. 추가적 혼합 후에, Tecan Infinite 판독기를 사용하여 제조사 지시사항에 따라 발광을 평가하고, 각각의 IC50 값을 계산하였다.
Figure pct00019
증식 검정에서, 항체가 BT-474 의 증식을 저해하였다는 것이 나타났다.
실시예 4
BT-474 세포, SK-Br3 세포 및 SK-OV-3 세포 상의 항-HER2 항체에 의한 CDC 활성화
10000 개 세포/웰 (BT-474, SK-Br3 또는 SK-OV-3 세포) 를 96-웰 플레이트에 시딩하고 20 시간 동안 37℃/5% CO2 에서 인큐베이션하였다. 이후 배지를 제거하고, 세포를 100 μL AIM-V 배지 (Gibco, 카탈로그 번호 0870112 DK) 로 1 회 세척하였다. 50 μL AIM-V 배지를 각 웰에 두었다. 이후 50 μL 항체 용액 (3-배 종료-농도) 을 첨가하고 30 분 동안 37℃/5% CO2 에서 인큐베이션하였다. AIM-V 배지 중 1:10 희석한 50 μL 의 새끼 토끼 보체 (Cedarlane, 카탈로그 번호 CL3441, 배치 번호 6312) 를 첨가하고 인큐베이션을 2 시간 동안 지속하였다. 이후, 50 μL 의 상청액을 옮기고 50 μL LDH Reaction Mix (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 와 혼합하였다. 37℃ 에서 15 분 추가 인큐베이션한 후, 흡광 (Ex.) 을 Tecan Sunrise 판독기 상에서 490/620 nm 에서 측정하였다. 특이적 항체 의존적 독성 (평균 +/- SD (n=4)) 을 하기와 같이 계산하였다: 항체 의존적 독성 % = (Ex. 샘플 - Ex. 자연적 용해 / Ex. 최대 용해-자연적 용해) x 100. 결과를 도 1 에 나타낸다.
BT474, SkBr3 및 SK-OV-3 세포를 트라스투주맙, 페르투주맙 또는 이의 조합 (총 항체 농도 10 μg/mL 또는 1 μg/mL) 과 함께 인큐베이션한 후, 새끼 토끼 보체와 함께 2 시간 인큐베이션하였다. 카파 경쇄를 갖는 인간 IgG1 을 동형 대조군으로서 사용하였다. 세포 용해의 판독 (LDH 배출) 을 LDH 세포독성 키트 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 카탈로그 번호 11644793001) 를 사용하여 Tecan sunrise 판독기 상에서 수행하였다. 특이적 용해도는 3% Triton-X 처리 세포에 관한 신호로서 제공된다 (최대 용해). 실험을 오반복하여 수행하였다.
Figure pct00020
이러한 CDC 검정은 새끼 토끼 보체의 존재 하 상이한 항체로의 처리시 (포맷, 조합) 사멸하는/사멸한 세포에 대한 마커로서 LDH 의 배출을 보여준다.
실시예 5
CDC 에 대한 항체 비 측정
웰 당 10000 개 SK-OV-3 세포를 AIM-V 배지 (Gibco, 카탈로그 번호 0870112-DK) 중 웰 당 100 μL 로 96-웰 편평 바닥 플레이트 (Thermo Scientific, Nunclon Delta Surface) 에 시딩하고, 20 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후, 0.1, 0.5, 1, 5 또는 10 ㎍/mL 의 최종 농도에서 트라스투주맙 및 페르투주맙을 함유하는 50 μL 의 항체-저장액을 첨가하였다. 인간 IgG1, 카파 경쇄 (Sigma, 카탈로그 번호 I5154-1MG) 를 대조군으로서 사용하였다. 최종 농도 1% 에서의 Triton-X (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 카탈로그 번호 11332481001) 를 최대 용해 측정을 위해 첨가하였다. 30 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션한 후, 50 μL 새끼 토끼 보체-저장액 (Cedarlane, 카탈로그 번호 CL3441) 을 1/30 의 최종 희석으로 첨가하였다. 이후 플레이트를 2 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다 (최종 부피/웰 = 150 μL). 세포 용해량을 세포독성 검출 키트 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 카탈로그 번호 11644793001) 를 사용하여 LDH 활성을 통해 측정하였다. 흡광도를 Tecan Sunrise 판독기 상에서 490 nm 및 620 nm 에서 측정하였다.
양성 대조군으로서 하기 샘플을 사용하였다:
배지 대조군: AIM-V 배지로의 SK-OV-3 세포
자연적 용해: 활성 BRC 로의 SK-OV-3 세포
최대 용해: 1 % Triton-X 로의 SK-OV-3 세포
동형 대조군: 10 ㎍/mL 인간 IgG, 카파 및 BRC 로의 SK-OV-3 세포
음성 대조군: 10 ㎍/mL 항체/조성물 및 열 불활성화된 BRC 로의 SK-OV-3 세포
검정 대조군: 10 ㎍/mL 트라스투주맙 및 페르투주맙 및 활성 BRC 로의 SK-OV-3 세포.
0.5:1 내지 1:1 의 트라스투주맙/페르투주맙 비 뿐 아니라 0.5:1 내지 1:1 의 페르투주맙/트라스투주맙 비에서 최적 세포 사멸이 관찰되었다. 심지어 1:10 비도 CDC 에 극적으로 영향을 주지 않았으므로, 전반적으로 검정은 항체 비의 변화에 대해 매우 강건한 것으로 여겨졌다.
실시예 6
항-HER2 항체에 의한 BT-474 세포의 CDC-매개 사멸
10000 개 BT-474 세포/웰을 96-웰 E-플레이트 (ACEA Biosciences Inc.) 에 시딩하고, AIM-V 배지 중 Xcelligence 장치에서 밤새 성장시켰다. 성장 배지를 제거하고 세포를 무혈청 AIM-V 배지 (Gibco) 로 1 회 세척하였다. 웰 당 50 μL AIM-V 배지 및 AIM-V 중 50 μL 항체 (3-배 종료 농도) 를 첨가하고 20 분 동안 인큐베이션하였다. 이후 50 μL 새끼 토끼 보체 (Cedarlane) 를 첨가하고 세포 지수 (CI; 세포 생존력에 대한 대표물) 를 5 분 마다 측정하였다. 특이적 CDC 를 하기 식에 따라 계산하였으며, 반면 CI 는 정규화된 세포 지수이다:
Figure pct00021
2 개 대표적 시점 (반응 시작 1 시간 및 2 시간 후) 에서, 특이적 용해도 (즉 CDC-유도된 세포 사멸) 를 계산하고 도 2 및 하기 표에 나타내었다 (평균+/- SEM (n=4)).
Figure pct00022
이러한 CDC 검정은 새끼 토끼 보체의 존재 하 상이한 항체로의 처리시 (포맷, 조합) 사멸하는/사멸한 세포에 대한 마커로서 세포 지수의 변화를 보여준다.
실시예 7 (비교예)
인간 기원의 보체를 기반으로 한 CDC 검정을 확립하기 위한 시도.
SkBr3 세포를 트라스투주맙, 페르투주맙, 또는 트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합 (10 μg/mL 총 항체 농도) 으로 감작시킨 후, 2 시간 동안 새끼 토끼 보체 (BCR, 실시예 4 에서 기재한 바와 같음) 또는 3 명의 건강한 공여자의 정상 인간 혈청 (NHS) (1:50 희석물, NHS 1, NHS 2, NHS 3) 과 함께 인큐베이션하였다. 카파 경쇄를 갖는 인간 IgG1 을 동형 대조군으로서 사용하였다.
세포 용해의 판독 (LDH 배출) 을 LDH 세포독성 키트 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 카탈로그 번호 11644793001) 를 사용하여 Tecan sunrise 판독기 상에서 수행하였다. 평균 용해 (%) 는 3% Triton-X 처리 세포에 관한 신호이다 (최대 용해). 실험을 삼반복하여 수행하였다.
Figure pct00023
실시예 8 (비교예)
CD55, CD59 및 CD46 의 siRNA 매개 녹다운
세포주 생성
CD46, CD55 및 CD59 녹다운을 위해, SK-OV-3 세포를 상응하는 siRNA (Biospring; CD46 카탈로그 번호 203525-A, CD55 카탈로그 번호 203526-A, CD59 카탈로그 번호 203527-A), 하나의 대조군 siRNA (Biospring, 카탈로그 번호 203524-A) 및 트랜스펙션 시약 LipofectAmine (Invitrogen, 카탈로그 번호 13778-100) 으로 처리하였다. 사용한 양은 제조사의 프로토콜에 따른 것이었다. 3 일 배양한 후, 세포 표면 상의 CD46, CD55 및 CD59 의 양을 FACS-항체의 마스터 믹스 및 50 μL 로의 1-2 x105 개 세포를 갖는 세포 현탁액을 사용하여 FACS-분석에 의해 측정하였다. 항체-마스터 믹스는 1 μL 의 각 항-CD-55-APC 항체 (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 555696) 및 항-CD59-PE 항체 (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 555764) 및 10 μL 의 항-CD46-FITC 항체 (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 555949), 10% 마우스 혈청 (Southern Biotech, 카탈로그 번호 0050-01) 및 FACS-완충제 (20 μL BSA 이 보충된 5 mL DPBS) 를 함유하였다. FACS 항체를 적정하여, 이용할 적절한 농도를 결정하였다. 동형 대조군에 대하여, 20 μL IgG2a,k-FITC (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 556652), IgG2a,k-APC (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 552893), IgG2a,k-PE (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 551438) 각각을 10% 마우스 혈청 및 FACS-완충제와 함께 사용하였다. 세포를 상기 언급한 FACS-항체와 함께 30 분 동안 4℃ 및 20 rpm 에서 인큐베이션하고, 600 μL 빙냉 DPBS 완충제로 세척하고, 200 μL Cytofix (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 554655) 에 재현탁하였다. FACS 분석을 FACS Canto II 상에서 수행하였다.
Figure pct00024
CD 55 에 대해 상당한 녹아웃을 달성하였다 (약 80% 녹아웃). CD 59 의 발현은 약 45% 하향 조절되었다. CD46 은 발현 수준에서 변화를 나타내지 않는다.
녹아웃 후 CDC
CD46, CD55 및 CD59 녹다운을 위해, SK-OV-3 세포를 상응하는 siRNA (Biospring; CD46 카탈로그 번호 203525-A, CD55 카탈로그 번호 203526-A, CD59 카탈로그 번호 203527-A) 및 트랜스펙션 시약 LipofectAmine (Invitrogen, 카탈로그 번호 13778-100) 으로 처리하였다. 사용량은 제조사 프로토콜에 따른 것이었다. 3 일 배양한 후, 세포 표면 상의 CD46, CD55 및 CD59 의 양을 FACS-분석에 의해 측정하였다 (상기 참조). 제 4 일에 CDC-검정을 야생형 (= 처리된 비-siRNA) SK-OV-3, SK-OV-3-삼중 세포 (모든 3 개 siRNA 로 트랜스펙션됨) 및 SK-OV-3-대조군.siRNA (비특이적 대조군 siRNA 로 트랜스펙션됨) 로 수행하였다. CDC-검정을 위해서, 웰 당 10,000 개 세포를 AIM-V 배지 (Gibco, 카탈로그 번호 0870112-DK) 를 웰 당 100 μL 함유하는 96-웰 편평 바닥 플레이트 (Thermo Scientific, Nunclon Delta Surface) 에 시딩하고, 20 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 에서 인큐베이션하였다. 이후 트라스투주맙, 페르투주맙, 인간 IgG1, 카파 (Sigma, 카탈로그 번호 I5154) 및 이중특이적 항-HER2 항체 (공통 경쇄) 를 10 ㎍/mL 의 최종 농도에서 시험하였다. 최종 농도 1% 에서의 Triton-X (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 카탈로그 번호 11332481001) 를 최대 용해 측정에 사용하였다. 모든 샘플을 30 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 이후, 새끼 토끼 보체 (BRC) (Cedarlane, 카탈로그 번호 CL3441) 및 정상 인간 혈청 (NHS) 을 1/30 의 최종 희석으로 첨가하고, 플레이트를 2 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다 (최종 부피/웰 = 150 μL). 세포 용해량을 세포독성 검출 키트 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 카탈로그 번호 11644793001) 를 사용하여 LDH 활성을 통해 측정하였다. 흡광도를 Tecan Sunrise 판독기를 사용하여 490 nm 및 620 nm 에서 측정하였다.
양성 대조군으로서 하기 샘플을 사용하였다:
배지 대조군: AIM-V 배지로의 SK-OV-3 세포
자연적 용해: 활성 BRC 로의 SK-OV-3 세포
최대 용해: 1% Triton-X 로의 SK-OV-3 세포
동형 대조군: 10 ㎍/mL 인간 IgG, 카파 및 BRC 로의 SK-OV-3 세포
음성 대조군: 10 ㎍/mL 항체/조성물 및 열 불활성화된 BRC 로의 SK-OV-3 세포
검정 대조군: 10 ㎍/mL 트라스투주맙 및 페르투주맙 및 활성 BRC 로의 SK-OV-3 세포.
결과를 도 4 에 나타낸다.
보체 공급원으로서 NHS 의 존재 하에 CD55 및 CD59 의 녹다운은 CDC 를 발휘시키기 위해 전적으로 요구된다. 지루한 siRNA 녹다운 절차는 BRC 를 사용하여 극복될 수 있다. 검정은 암종 세포 상의 mCRP 의 존재에 의해 영향이 없음을 나타내었다. 이는 상이한 항체 포맷의 고처리량 스크리닝 (상이한 항체 조합에 대한 스크리닝 외) 에 대해 본원에 보고된 바와 같은 검정을 사용하기 위한 전제조건이거나, 다른 CDC 검정에 대한 양성 대조군으로서 분명하다.
양성 대조군은 CDC 검정이 작동하였다는 것을 보여주었다. OD 490/620 nm 의 비교 및 SK-OV-3, SK-OV-3-삼중-KO 및 SK-OV-3-대조군.siRNA 의 특이적 세포독성 (%) 은 대조군 siRNA 가 세포독성을 유도하지 않는다는 것을 보여주었다.
실시예 9 (비교예)
막 결합 보체 조절 단백질 (mCRP) 의 조작에 의한 CDC 검정을 확립하기 위한 시도
특히 NHS 에 대항하는 (BRC 와 반대로) 표적 세포에 의해 제한 인자가 검정에 영향을 주는지 여부를 설명하기 위해, CDC 과정의 상이한 단계를 저해하는 단백질의 군인 mCRP 의 발현을 감소시키는 것이 시도되었다.
항-CD55 및 항-CD59 중화 항체
트라스투주맙 및/또는 페르투주맙으로 처리한 후, 단일 및 조합 인큐베이션에서 표적 CD55 및 CD59 에 대항하여 유도된 중화 항체 (총 중화 항체 농도 10 μg/mL) 를 사용하여, mCRP 저해를 수행하였다 (Zhao, W.P., et al., Onc. Rep. 21 (2009) 1405-1411 참조).
하기를 조정하여, 검정을 실시예 6 에서와 같이 수행하였다: SK-OV-3 세포를 CD55, CD59 또는 둘 모두에 대항하는 중화 항체 (neu mAb) (총 neu mAb 농도 10 μg/mL) 와 함께 인큐베이션한 후, 트라스투주맙 및/또는 페르투주맙 (또는 동형 대조군) 과 함께 인큐베이션하고 혈청 (1:30 희석) 을 첨가하였다. 관찰한 것을 도 3 에 나타낸다.
동일한 결과를 갖는 풀링된 인간 혈청으로 실험을 반복하였다.
두 실험 모두에서 BRC 는 CDC 에 대해 약 50% 를 초래한 반면, 인간 혈청으로는 CDC 에 대해 15% 미만이 관찰될 수 있었다.
CD46, CD55 및 CD59 의 siRNA-매개 녹다운
mCRP 발현 감소를, 세포질 내에서 각각의 mRNA 분자 분해를 초래시킬 세포 내로 mCRP-mRNA 특이적 소규모 간섭 RNA (siRNA) 분자를 트랜스펙션시킴으로써 RNA 간섭 기법 (RNAi) 에 의해 수행하였다. 표적 세포를 siRNA 트랜스펙션 48 시간 후 mCRP 의 표면 발현에 대한 FACS 분석 처리하여, 유전자 녹다운의 효율을 측정하였다 (예를 들어 Mamidi, S., et al., Mol. Onc.7 (2013) 580-594 참조).
BT474, SkBr3 및 SK-OV-3 세포를, 제조사 지시사항 (Biospring) 에 따라 리포펙션 (Dharmafect 1) 을 사용하여, CD46 (SEQ ID NO: 12 및 13), CD55 (SEQ ID NO: 14 및 15), CD59 (SEQ ID NO: 16 및 17) 또는 스크램블 siRNA (SEQ ID NO: 18 및 19) (통상 25 nM) 로 트랜스펙션하였다.
트랜스펙션 48 시간 후, 2 x 105 세포를 CD46, CD55 및 CD59 에 대항하는 표지된 항체 (각각 5 ㎍/mL; CD46-FITC 카탈로그 번호 555949, CD55-APC 카탈로그 번호 555696, CD59-PE 카탈로그 번호 555764; BD Pharmingen) 를 사용하여 염색하고, 대조군을 포함하는 표시된 수용체의 표면 발현을 분석하였다. FACS 에 의해 측정된 바와 같은 CD46 발현에서의 상대적 감소를 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00025
삼중 siRNA 트랜스펙션된 세포의 FACS 에 의해 측정된 바와 같은 CD46, CD55 및 CD59 발현에서의 상대적 감소를 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00026
(*) SK-OV-3 세포는 siRNA 트랜스펙션에 대해 매우 민감하다. 모방 트랜스펙션 및 트랜스펙션된 스크램블 RNA 는 CD46 발현을 27% 까지, CD59 발현을 610% 까지 증가시켰다.
SkBr3 세포의 LDH 검정을 새끼 토끼 보체 또는 풀링된 정상 인간 혈청을 사용하여 (언급된 siRNA 또는 대조군의 존재 또는 부재 하), 실시예 4 에서 기재한 바와 같이 트랜스펙션 96 시간 후 수행하였다. 하기 표에서, 새끼 토끼 보체를 갖는 CD46, CD55 및 CD59 에 대한 siRNA 로 트랜스펙션된 SkBr3 세포 (삼중 트랜스펙션된 세포) 의 특이적 용해도의 평균 백분율을 나타낸다 (n=3 의 +/- SD).
Figure pct00027
하기 표에서, 풀링된 인간 혈청을 사용한 CD46, CD55 및 CD59 에 대한 siRNA 로 트랜스펙션된 SkBr3 세포 (삼중 트랜스펙션된 세포) 의 특이적 용해도의 평균 백분율을 나타낸다 (n=3 의 +/- SD).
Figure pct00028
전술한 발명이 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예시에 의해 일부 상세히 기재되어 있으나, 상세한 설명 및 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학적 문헌의 개시물은 그 전체가 본원에 참조로 명백히 포함된다.
<110> F. 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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 10 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CrossMab LC1 <400> 10 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 11 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CrossMab LC2 <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr 100 105 110 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 130 135 140 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 145 150 155 160 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 180 185 190 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 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Claims (12)

  1. 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 방법으로서,
    조성물은
    i) 인간 기원의 제 1 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 위치, 및
    ii) 인간 기원의 제 2 Fc-부위 폴리펩티드에 접합되는 제 1 항원 또는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 위치
    를 포함하고,
    방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    a) 제 1 항원 또는 제 1 항원 및 제 2 항원을 발현하는 인간 세포를 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계,
    b) 토끼 보체를 a) 의 혼합물에 첨가하는 단계, 및
    c) 세포 용해를 측정하고, 그로써 조성물의 보체 의존적 세포독성을 측정하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 조성물이 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 인간 또는 인간화 항체, 및 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 인간 또는 인간화 항체를 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 조성물이 제 1 항원 상의 제 1 에피토프 및 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간 또는 인간화 이중특이적 항체를 포함하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 제 1 항원 상의 제 1 에피토프 및 제 1 항원 상의 제 2 에피토프에 결합하며 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프가 상이한 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프가 비-중복 (non-overlapping) 에피토프인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 용해가 보체 첨가 0.5 내지 3 시간 후 측정되는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 세포가 인간 암 세포 또는 자가면역 반응을 유발하는 인간 세포인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 인간 암 세포가 상피 기원의 인간 암종 세포인 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 인간 암 세포가 인간 B-세포 림프종 세포인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 방법인 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 토끼 보체가 새끼 토끼 보체인 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 결합 위치 대 제 2 결합 위치의 비가 0.5:1 내지 1:0.5 인 방법.
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