CN114127560A

CN114127560A - 增加细胞对补体介导裂解的敏感性的方法

Info

Publication number: CN114127560A
Application number: CN202080035345.4A
Authority: CN
Inventors: 乔·泰克特; 马特·泰克特
Original assignee: UAB Research Foundation
Current assignee: UAB Research Foundation
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2022-03-01
Also published as: CA3134654A1; WO2020191255A1; AU2020241879A1; JP7502805B2; JP2022525474A; KR20220004973A; EP3942298A1; US20210405065A1; EP3942298A4; BR112021018557A2

Abstract

本发明提供了一种提高补体依赖性细胞毒性分析灵敏度的方法，所述方法确定潜在移植受体患者是否表达会减少或阻止受体接受供体器官的供体器官反应性抗体。至少一种编码补体抑制剂的基因在来自候选移植器官的细胞中失活。这样的修饰细胞，由于不再产生至少一种补体抑制剂，当置于来自潜在移植受体的血清样本中时，不会降低血清补体的有效活性。较低水平的受体患者血清抗体在诱导供体细胞的可检测裂解方面变得有效。

Description

增加细胞对补体介导裂解的敏感性的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年3月21日提交的题为“METHOD FOR INCREASING CELLSUSCEPTIBILITY TO COMPLEMENT-MEDIATED LYSIS”的美国临时专利申请第62/821,641号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含创建于2020年3月18日的题为“2221042940_ST25”的以电子形式ASCII.txt文件提交的序列表。该序列表的全部内容以其整体并入本文。

背景技术

异种器官移植(移植来自不同物种的供体的器官、组织和细胞)可以有效地解决人类供体胰腺的短缺。异种移植的优势还在于：(i)在可预测的、非紧急基础上提供；(ii)在受控环境中生产；以及(iii)在移植前可进行特征分析和研究。

根据供体和受体物种之间的关系，异种移植可以描述为一致的或不一致的。一致物种是系统发育上密切相关的物种(例如，小鼠与大鼠)。不一致物种是非密切相关的物种(例如，猪与人)。由于猪与人在解剖学和生理学方面有许多相似特征，在大多数研究中，猪一直是异种移植领域的焦点。猪也具有相对短的妊娠期，可以在无病原体的环境中繁殖，而且可能不会出现与不常作为食物来源的动物(如灵长类动物)相关的伦理问题。在过去十年中，猪到灵长类动物异种移植领域的科学知识和专业技术迅速增长，导致拯救生命的猪异种移植物的灵长类动物受体的存活时间显著延长。(Cozzi等人，异种器官移植16：203-214.2009)。

异种移植排斥反应可分为三个阶段：超急性排斥反应、急性体液性异种移植排斥反应和T细胞介导的细胞排斥反应。超急性排斥反应(HAR)是一种非常快速的事件，其在移植物再灌注后数分钟至数小时内导致不可逆的移植物损伤和损失。它是由移植时受者体内存在的异种天然抗体触发的。人类具有天然存在的针对猪细胞上发现的1，3-半乳糖(Gal)表位的抗体。该抗体以高量产生，并且是HAR的主要介质。将猪细胞中的1，3-半乳糖(Gal)表位作为GT(半乳糖苷转移酶基因敲除(GTKO))进行遗传去除，导致GTKO猪不会发生HAR。

发明内容

本公开的一个方面涵盖一种检测患者体内移植供体器官反应性抗体方法的实施例，所述方法包括以下步骤：(a)通过对动物或人类器官的细胞群进行遗传修饰，减少至少一种补体抑制剂的表达；(b)将遗传修饰的细胞群与从期望接受移植供体器官的患者分离出的血清样本接触；以及(c)检测所述遗传修饰细胞群的裂解，其中，裂解指示期望接受所述移植供体器官的所述患者是否表达供体器官反应性抗体，其中，当与来自所述器官且未经遗传修饰的细胞群比较时，所述裂解可被检测或增加，以减少至少一种表达的补体抑制剂。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞群可以来自候选移植器官。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞群可以是供体淋巴细胞。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞群可以来自肾脏。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞群可以是肾内皮细胞。

在本公开的该方面的一些实施例中，该方法可以进一步包括：(i)从所述器官获得组织样本；以及(ii)产生遗传修饰的器官衍生细胞群，该器官衍生细胞群包括通过用至少一种编码向导RNA和CRISPR Cas9的表达载体转染所述细胞而产生的非活性补体抑制剂编码基因，其中，所述向导RNA对补体抑制剂具有特异性。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述非活性补体抑制剂编码基因可以选自由CD46、CD55和CD59组成的组。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述补体抑制剂可以是CD46。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述使非活性补体抑制剂编码基因失活的向导RNA，包括从SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQID NO：11组成的组中选择的核苷酸序列，以及从SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12组成的组中选择的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述补体抑制剂是CD46类，并且在生理条件下，与SEQ ID NO：19序列或其补体杂交并基于CRISPR Cas9失活的向导RNA具有SEQ ID NO：20核苷酸序列。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述表达载体是质粒PX330或PX458，并且当所述质粒转染到哺乳动物细胞中时，所述表达质粒表达Cas9。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述表达载体包括与从SEQ ID No：13至SEQID No：18组成的组中选择的核苷酸序列具有至少85％相似性的核苷酸序列。

本公开的另一方面涵盖一种患者体内移植供体器官反应性抗体的检测方法的实施例，所述方法包括以下步骤：(a)通过对候选动物或人类移植供体肾脏的肾内皮细胞群进行遗传修饰，减少所述细胞群的至少一种补体抑制剂的表达，其中，所述遗传修饰通过以下步骤进行：(i)从肾脏获得组织样本；以及(ii)产生包含非活性CD46补体抑制剂编码基因的遗传修饰的肾衍生细胞群，所述非活性CD46补体抑制剂编码基因是通过用至少一种编码向导RNA和CRISPR Cas9的表达载体转染所述肾内皮细胞而产生的，其中，所述向导RNA对所述补体抑制剂CD46具有特异性，并且包含从SEQ ID NO：l和SEQ ID NO：7组成的组中选择的核苷酸序列，和与从SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8组成的组中选择的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中，所述表达载体包含与选自SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16的核苷酸序列具有至少85％相似性的核苷酸序列；(b)将遗传修饰的肾内皮细胞群与从期望接受移植供体器官的患者分离出的血清样本接触；以及(c)检测所述遗传修饰的肾内皮细胞群的裂解，其中，裂解指示期望接受所述移植供体器官的患者是否表达供体器官反应性抗体，其中，当与来自所述器官并且未经遗传修饰的肾内皮细胞群比较时，所述裂解可被检测或增加，以减少至少一种表达的补体抑制剂。

本公开的另一个方面是一种经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述细胞来自供体组织，其中，所述细胞经遗传修饰具有减少的补体抑制剂表达或不具有补体抑制剂表达。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述补体抑制剂可以是CD46、CD55或CD59。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述补体抑制剂可以是CD46类、CD46、CD55或CD59。

在本公开的该方面的一些实施例中，补体抑制剂可以是CD46类，并且可以具有与氨基酸序列SEQ ID NO：23至少90％相似的氨基酸序列。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述补体抑制剂是CD46类，并且可由与SEQID NO：19的核苷酸序列具有至少90％相似性的核苷酸序列编码。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞是通过CRISPR Cas9删除编码所述补体抑制剂的所述细胞的基因组的全部或片段而进行遗传修饰。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞可以是培养的细胞群。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述供体组织可以从选自肾脏、肺、心脏、肌肉、皮肤组织或淋巴细胞的器官获得。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞是从候选供体器官获得的。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述候选器官选自肾脏、肺、心脏、肌肉、皮肤组织组成的组。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述候选器官是肾脏。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述经遗传修饰的哺乳动物细胞是肾内皮细胞或淋巴细胞。

附图说明

在查阅本公开的各种实施例的详细描述时，结合附图将更容易理解本公开的其他方面。

图1A至图1C说明了缺乏CD46的肾内皮细胞(REC)的产生过程。使用CRISPR/Cas9使首建对象肾内皮细胞缺乏GGTA1基因和I类SLA基因。因此，I类SLA蛋白和α半乳糖碳水化合物不在这些细胞的表面上表达。起始细胞的流式细胞术分析由虚线直方图表示。阴性对照细胞未染色(灰色直方图)，阳性对照REC具有完整I类SLA和GGTA1基因，用实线直方图显示。这些永生化REC用靶向CD46基因的CRISPR/Cas9处理。

图1A说明了使用单克隆抗体检测的I类蛋白(A栏)和用于检测αgal表位表达的IB4凝集素(B栏)。

图1B描述缺乏PCR产物(用“-”标记的泳道)，表明CD46基因已被破坏。细胞被分离出来，并使用逆转录酶PCR评估CD46基因的转录。具有完整CD46基因的亲本REC用作阳性对照，并且显示代表CD46基因产物的清晰条带(由“+”标记的泳道)。

图1C描述在亲本细胞(实线直方图)和CD46敲除(虚线直方图)中评估的细胞表面CD46表达。未染色的细胞用作阴性对照(灰色直方图)。

图2A说明CD46 KO REC对两种已知外抗原的表达。亲本REC已经用靶向B4GalNT2基因的CRISPR/Cas9处理。使用DBA凝集素对N-乙酰-半乳糖胺进行流式细胞测量，这是一种由B4GalNT2酶产生的异抗原。测试亲本(A栏)和CD46-KO(B栏)细胞。结果显示为虚线直方图。在图A和B中使用相同的阴性对照(灰色直方图-代表未染色的细胞)和具有完整B4GalNT2的阳性对照细胞(实线直方图)。

图2B描述了也使用Neu5Gc-特异性单克隆抗体评估的第二异种抗原Neu5Gc的表达水平。未染色的细胞用作阴性对照(灰色直方图)。亲本细胞对Neu5Gc的表达以实线直方图显示，而虚线直方图代表CD46-KO细胞。

图3说明了CD46(+)亲本REC与CD46(-)REC的补体依赖性细胞毒性分析。通过将两种类型的REC与从13种不同人身上收集的循环抗体一起孵育来进行基于流式细胞术的CDC测定。与除了幼兔补体之外还用人类抗体观察到的死亡百分比相比，通过减去单独用幼兔补体观察到的死亡百分比来计算死细胞。线条突出显示了在两种细胞系上对于每个人类抗体样本观察到的死亡水平。对所有13个样本进行两次实验。

图4A至图4D说明了细胞裂解活性与IgM和IgG结合水平的比较。测试图3中使用的细胞针对13种人类样本的IgM和IgG结合水平。CDC结果的三种模式用于对各种样本进行分类。图3中所示的数据的代表性示例是为了突出这些类别。

图4A描述了两个无论CD46存在与否都呈阳性(超过20％的死细胞)的CDC示例。

图4B描述了无论CD46存在与否，CDC均为阴性(死细胞少于20％)的两个示例。

图4C描述了当使用CD46(+)细胞时为阴性，但在CD46(-)细胞上变为阳性的CDC。

图4D描述CD46(-)细胞裂解比CD46(+)细胞裂解少的CDC。一式三份进行抗体与这些样本结合的流式细胞术分析，以检查与CD46(+)和CD46(-)REC结合的相关IgG和IgM。每个CDC图下方的条形图表示IgG和IgM的分析结果。

图5说明了核苷酸序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12。

图6说明了核苷酸序列SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：18。

图7说明了具有登录号为XM_003482667.3并且是编码猪CD46类补体抑制剂的mRNA核苷酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)。强调了gRNA位置。向导RNS序列(还显示了SEQID NO：20)。

图8说明了显示以下氨基酸序列之间的相似性的氨基酸序列比对：人类CD46(SEQID NO：21)；猪CD46(SEQ ID NO：22)和猪CD46类(SEQ ID NO：23)补体抑制剂。

具体实施方式

本公开不限于所描述的特定实施例，因此当然也可以变化。由于本公开的范围将仅由所附权利要求限制，因此本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且并不旨在是限制性的。

在提供数值范围的情况下，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的第十个单位)以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值都包括在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含在本公开内，但要服从所述范围中任何具体排除的界限。当所述范围包括一个或两个极限时，排除这些包括的界限中的任何一个或两个的范围也包括在公开的范围内。

除非另有说明，否则本公开的实施例将采用医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释。

下列示例旨在向本领域普通技术人员提供完整披露内容和说明，以明确如何运用方法和使用本文披露和要求保护的组合物和化合物。已努力确保关于数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应考虑到一些错误和偏差。除非另有说明，否则份数是指重量份，温度是指摄氏度(℃)，压力为大气压或约为大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。

在详细描述本公开的实施例之前，应当理解，除非另有说明，否则本公开不限于特定的材料、试剂、反应材料、制造工艺、尺寸、频率范围、应用等，因为这些是可以变化的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是限制性的。在本公开中还可能的是，可以以不同的顺序执行步骤，这在逻辑上是可能的。还可能的是，本公开的实施例可以应用于除了本文描述的示例之外的涉及测量的附加实施例，这些附加实施例不旨在是限制性的。此外，本公开的实施例可以与除了本文描述的示例之外的其他测量技术组合或集成，这并不是限制性的。

应当注意，如在说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个(a)”、“一个(a)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个支撑件”包括多个支撑件。在本说明书和随后的权利要求书中，将参照许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义，除非具有明显的相反意图。

本文中引用的每项申请和专利，以及每项申请和专利中引用的每份文件或参考文献(包括在每项授权专利的审查期间的“申请引用文件”)，以及对应于任何这些申请和专利和/或要求任何这些申请和专利的优先权的每项PCT和外国申请或专利，以及每项申请引用文件中引用或参考的每份文件，在此明确地通过引用并入本文。此外，在本文中、在权利要求书之前的参考文献列表中或在文本本身中引用的文献或参考文献；并且这些文献或参考文献(“本文引用的参考文献”)中的每一个，以及本文引用的参考文献中的每一个中引用的每篇文献或参考文献(包括任何制造商的用法说明、指导书等)在此明确地通过引用并入本文。

在描述各种实施例之前，除非另有说明，否则应当使用以下提供的定义。

定义

如本文所用的术语“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是指IgG和IgM抗体的效应子功能。当它们与靶细胞(例如细菌或病毒感染的细胞，或外来细胞如移植器官的细胞)上的表面抗原结合时，经典补体途径通过将蛋白C1q与这些抗体结合而触发，从而形成膜攻击复合物(MAC)和靶细胞裂解。补体系统被人类IgG1、IgG3和IgM抗体有效激活，被IgG2抗体微弱激活，不被IgG4抗体激活。

如本文所用的术语“CD46补体调节蛋白”(也称为CD46，分化簇46，膜辅因子蛋白)是指由CD46基因编码的蛋白质，并且CD46是抑制性补体受体。该基因与其他编码补体系统结构成分的基因在一个簇中。已经发现该基因至少有14个不同的转录变体，编码14种不同的异构体。由该基因编码的蛋白是I型膜蛋白，并且是补体系统的调节部分。编码的蛋白具有辅助因子活性，用于血清因子I使补体成分C3b和C4b失活(通过裂解)，从而保护宿主细胞免受补体的损害。

与CD46同源的一个有利的靶补体抑制剂是猪CD46类多肽，其具有根据SEQ ID NO：23的氨基酸序列，并且由与核苷酸序列SEQ ID NO：19具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码。

如本文所用的术语“补体衰变加速因子”(也称为CD55或DAF)是指由CD55基因编码的蛋白质。DAF调节细胞表面上的补体系统。它识别在C4(经典或凝集素途径)或C3(替代途径)激活过程中产生的C4b和C3b片段。DAF与经典途径和凝集素途径的细胞相关C4b的相互作用干扰C2转化为C2b，从而阻止C4b2b C3转化酶的形成，并且DAF与替代途径的C3b的相互作用干扰因子D将因子B转化为Bb，从而阻止替代途径的C3bBb C3转化酶的形成。因此，通过限制补体级联的扩增转化酶，DAF间接阻断膜攻击复合物的形成。该糖蛋白广泛分布于造血细胞和非造血细胞中。

术语“CD59糖蛋白”(也称为MAC-抑制蛋白(MAC-IP)、反应性裂解的膜抑制剂(MIRL)或保护素)是一种在人类中由CD59基因编码的蛋白质，它属于LY6/uPAR/α-神经毒素蛋白质家族，CD59通过糖磷脂酰肌醇(GPI)锚附着在宿主细胞上，当补体激活导致C5b678沉积在宿主细胞上时，CD59可以阻止C9聚合，并形成补体膜攻击复合物，它还可以向细胞发出信号，使其采用积极措施，例如CD59-CD9复合物的内吞作用。

术语“敲除”是指转基因非人类哺乳动物或细胞，其中给定基因已被改变、去除或破坏。

如本文所用的术语“非天然存在的”或“改造的”可互换，并且表示人工参与。当提及核酸分子或多肽时，所述术语意指核酸分子或多肽至少基本上不含至少一种其他成分，所述其他成分在自然界中与所述核酸分子或多肽天然缔合，例如在自然界中发现的。

如本文所用的术语“互补性”是指核酸与另一核酸序列通过传统的Watson-Crick或其他非传统类型形成氢键的能力。互补百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的毗连残基氢键。这里所述的“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域内，互补程度至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。

如本文所用的杂交的术语“严格条件”是指与靶序列具有互补性的核酸，主要与靶序列杂交，并且基本上不与非靶序列杂交的条件。严格的条件通常取决于序列，并且根据许多因素而变化。一般来说，序列越长，序列与其靶序列特异性杂交的温度越高。严格条件的非限制性示例在Tiissen(1993)，《生物化学和分子生物学实验室技术--与核酸探针杂交》第一部分第二章“杂交原理概述和核酸探针检测策略”中详细描述，Elsevier，N.Y。

如本文所用的术语“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应以形成复合物的反应，所述复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键而稳定。氢键可以通过沃森克里克碱基配对、胡斯坦结合或以任何其他序列特异性方式发生。该复合物可包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛的过程中的步骤，例如PCR的启动，或者多核苷酸被酶裂解的过程。能够与给定序列杂交的序列被称为给定序列的“互补序列”。

如本文所用的术语“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(例如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸来自基因组DNA，则表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。

如本文所用的术语“CRISPR系统”共同指参与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的转录物和其他元素，包括编码Cas基因的序列、引导序列(在内源CRISPR系统的背景下也称为“间隔物”)或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。在一些实施例中，CRISPR系统的一种或多种元素来自I型、II型或III型CRISPR系统。在一些实施例中，CRISPR系统的一种或多种元素来自包含内源CRISPR系统的特定生物体，例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。通常，CRISPR系统的特征在于促进CRISPR复合体在靶序列位点处形成的元素(在内源CRISPR系统的背景下也称为前间区序列)。

在形成CRISPR复合体的背景下，“靶序列”是指引导序列被设计为与其具有互补性的序列，其中靶序列和引导序列之间的杂交促进CRISPR复合体的形成。不一定需要完全互补性，条件是存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合体的形成。靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施例中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在一些实施例中，靶序列可以在真核细胞的细胞器内，例如线粒体或叶绿体。可用于重组到包含靶序列的靶向基因座中的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在本公开主题的方面，外源模板多核苷酸可以称为编辑模板。在本公开主题的一个方面，重组是同源重组。

在一些实施例中，载体包含一个或多个插入位点，如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施例中，一个或多个插入位点(例如大约或大于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个插入位点)位于一个或多个载体的一个或多个序列元素的上游和/或下游。当使用多个不同的引导序列时，单个表达构建体可用于将CRISPR活性靶向细胞内的多个不同的相应靶序列。例如，单个载体可以包含约或大于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个引导序列。在一些实施例中，可以提供大约或大于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个此类含有引导序列的载体，并可选地递送至细胞。

在一些实施例中，载体包含与编码CRISPR酶(例如Cas蛋白)的酶编码序列可操作地连接的调控元素。例如，化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白的氨基酸序列可以在Swissport数据库中找到，其登录号为Q99ZW2。在一些实施例中，未修饰的CRISPR酶具有DNA切割活性，例如Cas9。在一些实施例中，CRISPR酶是Cas9，并且可以是来自化脓性链球菌(S.pyogenes)或肺炎链球菌(S.pneumoniae)的Cas9。

在一些实施例中，CRISPR酶指导靶序列位置处的一条或两条链的切割，例如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内。在一些实施例中，CRISPR酶指导在距靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对内的一条或两条链的切割。在一些实施例中，载体编码相对于相应的野生型酶突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。

在一些实施例中，编码CRISPR酶的酶编码序列经密码子优化以在特定细胞(例如真核细胞)中表达。真核细胞可以是特定生物体的或者源自特定生物体的细胞，例如哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类动物。通常，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中较常用或最常用的密码子替换原生序列的至少一个密码子(例如大约或大于大约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子)，同时保持原生氨基酸序列，来修饰核酸序列以增强在感兴趣的宿主细胞中的表达的过程。各种物种表现出对特定氨基酸的某些密码子的特定偏好。密码子偏好(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率又被认为取决于被翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中选定的tRNA的主导地位通常反映了肽合成中最常使用的密码子。因此，可以基于密码子优化来定制基因，使其在特定的生物体内达到最佳的基因表达。密码子使用表是容易获得的，例如，在“密码子使用数据库(CodonUsage Database)”中，这些表可以以多种方式调整。也可利用计算机算法对特定的序列进行密码子优化，以便在特定的宿主细胞中表达。在一些实施例中，编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个或所有密码子)对应于特定氨基酸的最常用的密码子。

通常，引导序列是任何多核苷酸序列，其与靶多核苷酸序列具有足够互补性，以与靶序列杂交并指导CRISPR复合体与靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，引导序列与其相应的靶序列之间的互补程度为大约或大于大约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。可以使用用于比对序列的任何合适的算法来确定最佳比对，所述算法的非限制性示例包括史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)、尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)、基于伯罗斯-惠勒(Burrows-Wheeler)变换的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、ClustalX、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies)，ELAND(Illumina(公司)，位于加利福尼亚州圣地亚哥)、SOAP(可访问soap.genomics.org.cn获得)和Maq。在一些实施例中，引导序列的长度为大约或大于大约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个或更多个核苷酸。在一些实施例中，引导序列的长度小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个或更少的核苷酸。

引导序列指导CRISPR复合体与靶序列的序列特异性结合的能力可以通过任何合适的测定来评估。例如，可以将足以形成CRISPR复合体的CRISPR系统的成分(包括待测试的引导序列)提供给具有相应靶序列的宿主细胞，例如通过转染编码CRISPR序列成分的载体，然后评估靶序列内的优先切割，例如通过本文所述的Surveyor测定。类似地，可以通过提供靶序列、CRISPR复合体的成分(包括待测试的引导序列和不同于测试引导序列的对照引导序列)，并比较测试和对照引导序列反应之间靶序列处的结合或切割速率，在试管中评估靶多核苷酸序列的切割。其他测定是可能的，并且将被本领域技术人员想到。

尽管本申请描述了典型的非人动物(猪)，但是可以类似地对其他动物的细胞进行遗传修饰。如上所述，在对人类进行器官移植时，猪是可取的。如本文所用，术语“猪”是指本领域已知的任何猪，包括但不限于野生猪、家猪、迷你猪、Sus scrofa猪、Sus scrofadomesticus猪以及近交猪。猪器官、组织或细胞包括来自猪的器官、组织、失活动物组织和细胞。

如本文所用的术语“供体器官”是指用作异种移植物的来自动物的器官、组织和/或细胞。移植材料可用作需要器官移植的人类受试者的临时或永久器官替代物。可以使用任何猪器官，包括但不限于脑、心脏、肺、眼、胃、胰腺、肾、肝、肠、子宫、膀胱、皮肤、毛发、指甲、耳朵、腺体、鼻、口、唇、脾、牙龈、牙齿、舌、唾液腺、扁桃腺、咽、食道、大肠、肠肚、直肠、肛门、甲状腺、胸腺、骨骼、软骨、肌腱、韧带、肾上囊、骨骼肌、平滑肌、血管、血液、脊髓、气管、输尿管、尿道、下丘脑、垂体、幽门、肾上腺、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、精囊、阴茎、淋巴、淋巴结和淋巴管。

如本文所用的术语“合成的”和“改造的”可以互换使用，并且是指已经通过人工创造或修饰的非天然存在的材料(例如，在其基因组中具有一个或预定的改造的遗传修饰的经遗传修饰的动物或细胞)或使用这种材料衍生的非天然存在的材料(例如，从这种经遗传修饰的动物获得的组织或器官)。包含一种或多种合成或改造的核酸的细胞被认为是改造的或经遗传修饰的细胞。如本文所用术语“改造的组织”是指改造的/经遗传修饰的细胞的聚集体。

当基因产物的总表达降低时，产生大小改变的基因产物，或当基因产物表现出功能变化时，该基因产物的表达降低。因此，如果基因表达野生型量的产物，但产物的酶活性、大小、细胞定位模式、受体-配体结合或其他活性变化，则认为该基因产物的表达降低。可以通过本领域已知的任何方法分析表达，包括但不限于RT-PCR、Western印迹、Northern印迹、微阵列分析、免疫沉淀、放射学测定、多肽纯化、分光光度分析、丙烯酰胺凝胶的考马斯染色、ELISA、二维凝胶电泳、原位杂交、化学发光、银染色、酶测定、丽春红S染色、多重RT-PCR、免疫组织化学测定、放射免疫测定、比色分析、免疫放射测定、正电子发射断层扫描、荧光测定、透化细胞的荧光激活细胞分选仪染色、放射免疫吸附测定、实时PCR、杂交测定、夹心免疫测定、流式细胞术、SAGE、差异扩增或电子分析。例如，参见Ausubel等人编辑的《2002分子生物学实验室指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley-Interscience(出版)，New York(纽约)，纽约；Coligan等人，(2002)《蛋白科学实验室指南》(CurrentProtocols in Protein Science)，Wiley-Interscience(纽约)，纽约；其全部内容通过引用并入本文。

如本文所用的术语“抗体”是指一种免疫球蛋白，它能与另一分子的特定空间和极性组织特异性结合，并因此被定义为与另一分子的特定空间和极性组织互补。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体，并且可以通过本领域公知的技术制备，例如宿主的免疫和血清的收集(多克隆)，或通过制备连续杂交细胞系和收集分泌的蛋白质(单克隆)，或通过克隆和表达至少编码天然抗体特异性结合所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变形式。抗体可包括完整的免疫球蛋白或其片段，所述免疫球蛋白包括各种类别和同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM、IgY等。其片段可包括Fab、Fv和F(ab′)₂、Fab′、scFv等。此外，在适当的情况下，可以使用免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物和缀合物，只要保持对特定分子的结合亲和力即可。

如本文所用的术语“抗原”是指与布置在抗体阵列上的抗体结合，并在抗体上诱导至少一个共有构象表位的任何实体。抗原可以是蛋白质、肽、抗体、小分子、脂质、碳水化合物、核酸和过敏原。抗原可以是其纯形式，也可以是抗原与其他成分混合在一起的样本。

如本文所用的术语“编码序列”或“编码”所选多肽的序列是指当置于适当的调节序列(或“控制元素”)的控制下时，在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界由5′(氨基)末端的起始密码子和3′(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列，甚至是合成DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3′处。

如本文所用的术语“引物”是指与待扩增或复制的DNA区段互补的寡核苷酸。通常在PCR中使用引物。引物与模板DNA杂交(或“退火”)并被聚合酶用作复制/扩增过程的起始点。

如本文所用的术语“表达的”或“表达”是指从基因转录以产生与基因的两条核酸链之一的区域至少部分互补的RNA核酸分子。如本文所用的术语表达的或表达还指从所述RNA核酸分子翻译以产生蛋白质、氨基酸序列或其一部分。

如本文所用的术语表达载体是指可用于表达编码本文所用的蛋白质的DNA和用于产生蛋白质的核酸。表达载体不受限制，只要它在各种原核和/或真核宿主细胞中表达编码蛋白质的基因并产生该蛋白质即可。当酵母、动物细胞或昆虫细胞用作宿主时，表达载体优选至少包含启动子、起始密码子、编码蛋白质的DNA和终止密码子。它还可以包含编码信号肽的DNA、增强子序列、编码蛋白质的基因的5′-和3′-非翻译区、剪接点、聚腺苷酸化位点、选择性标记区和复制子。如果需要，表达载体还可以含有通常使用的用于基因扩增的基因(标志物)。

在细菌中表达蛋白质的启动子/操纵基因区包含启动子、操纵基因和Shine-Dalgarno(SD)序列(例如AAGG)。例如，当宿主是埃希氏菌属时，其优选包含Trp启动子、lac启动子、recA启动子、lambda.PL启动子、b1pp启动子、tac启动子等。当宿主是真核细胞如哺乳动物细胞时，其示例是SV40衍生的启动子、逆转录病毒启动子、热休克启动子等。当然，启动子不限于上述示例。此外，使用增强子对表达是有效的。优选的起始密码子是例如甲硫氨酸密码子(ATG)。常用的终止密码子(例如，TAG、TAA和TGA)被例示为终止密码子。通常，使用的天然或合成终止子用作终止子区域。也可以使用本领域通常使用的增强子序列、聚腺苷酸化位点和剪接连接，例如来自SV40的那些。通常使用的选择标记可以按照常规方法使用。其示例是抗生素的抗性基因，例如四环素、氨苄青霉素或卡那霉素。

本文使用的表达载体可以通过将至少上述启动子、起始密码子、编码蛋白质的DNA、终止密码子和终止子区连续和环状连接至合适的复制子来制备。如果需要，可以通过诸如用限制酶消化或用T4 DNA连接酶连接的方法使用合适的DNA片段(例如，连接子、限制性位点等)。可以通过将上述表达载体引入宿主细胞来制备转化体。

如本文所用的术语蛋白质或核酸等分子的“片段”是指氨基酸或核苷酸遗传序列的任何部分。

如本文所用的术语“基因”是指功能性蛋白质、多肽或肽编码核酸单元。

如本文所用的术语“同一性”是指两个或更多个多肽序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。在本领域中，“同一性”还指多肽之间的序列相关性程度，如通过此类序列的串之间的匹配所确定的。“同一性”和“相似性”可以通过已知方法容易地计算，包括但不限于《计算分子生物学》，Lesk，A.M.著，牛津大学出版社，NY，1988；《生物计算：信息学和基因组项目》，Smith，D.W.著，美国学术出版社，NY，1993；《序列数据的计算机分析》，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.著，胡玛纳出版社，NJ，1994；《分子生物学中的序列分析》，von Heinje，G.，美国学术出版社，1987；《序列分析引物》，Gribskov，M.和Devereux，J.著，M斯托克出版社，NY，1991；以及Carillo和Lipman(1988)SIAM J.应用数学，48：1073。

确定同一性的优选方法是为了给出测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法编纂在公众可获得的计算机程序中。两个序列之间的同一性百分比可以通过使用结合了Needelman&Wunsch((1970)J..Mol.Biol.，48：443-453)算法(例如NBLAST和XBLAST)的分析软件(即Genetics Computer Group，Madison，Wis.的序列分析软件包)来确定。默认参数用于确定本公开的多肽的身份。

举例来说，多肽序列可以与参照序列相同，即100％相同，或者与参照序列相比，它可以包括多达一定整数数量的氨基酸改变，使得同一性百分比小于100％。这样的改变选自：至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)或插入，其中所述改变可以发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何位置，单独散布在参照序列的氨基酸之间，或以一个或多个连续组散布在参照序列内。通过将参考多肽中的氨基酸总数乘以相应同一性百分比的数值百分比(除以100)，然后从参考多肽中的所述氨基酸总数中减去该乘积来确定给定同一性百分比的氨基酸改变的数量。

如本文所用的术语“核酸分子”是指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物及其衍生物、片段和同源物。核酸分子可以是单链或双链的，但有利地是双链DNA。“分离的”核酸分子是与存在于核酸的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。“核苷”是指与糖连接的碱基。碱基可以是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)(或其取代物肌苷(I))、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)(或其取代物尿嘧啶(U))。糖可以是核糖(RNA中天然核苷酸的糖)或2-脱氧核糖(DNA中天然核苷酸的糖)。“核苷酸”是指与单个磷酸基团连接的核苷。

如本文所用的术语“寡核苷酸”是指一系列连接的核苷酸残基，该寡核苷酸具有足够数量的核苷酸碱基以用于PCR反应。短寡核苷酸序列可以基于基因组或cDNA序列或者是根据其设计的，并且用于扩增、确认或揭示特定细胞或组织中相同、相似或互补DNA或RNA的存在。寡核苷酸可以化学合成，并且可以用作引物或探针。寡核苷酸意指用于促进靶核酸(包括探针和引物)的检测或鉴定的、长度超过3个碱基的任何核苷酸。

如本文所用的术语“转化体”是指引入表达载体的一个或多个受体细胞。正如本领域技术人员所理解的，该功能术语包括基因组序列、cDNA序列、探针、寡核苷酸或其片段(及其组合)，以及基因产物，包括可能已经由用户设计和/或改变的基因产物。纯化的基因、核酸、蛋白质等在被识别或从通常与其相关的至少一种污染核酸或蛋白质中分离时，用于指代这些实体。

术语“转染”是指将试剂引入细胞的过程。可以转染的试剂的列表很大，包括但不限于向导RNA、有义和/或反义序列、编码一种或多种基因并组织成表达质粒的DNA、蛋白质、蛋白质片段等。存在多种用于将试剂转染到细胞中的方法，包括但不限于电穿孔、基于磷酸钙的转染、基于DEAE-葡聚糖的转染、基于脂质的转染、基于分子缀合物的转染(例如，聚赖氨酸-DNA缀合物)、显微注射等。

讨论

抗肿瘤治疗性抗体的开发涉及其效应子功能的体外分析，包括触发CDC以杀死靶细胞的能力。经典方法是将抗体与靶细胞和补体来源(即血清)一起孵育。然后用几种方法确定细胞死亡：

CDC测定用于寻找器官或骨髓移植的合适供体，即具有组织相容性系统HLA的匹配表型的供体。在对患者和供体进行HLA分型以确定其HLA表型后，进行交叉配型测试，以排除患者产生供体特异性抗HLA抗体，这可能导致移植排斥。

CDC HLA分型(或血清学分型)使用来自表征的同种异体抗血清或单克隆抗体的一批抗HLA抗体。这些抗体可以与患者或供体的淋巴细胞和补体来源逐一进行孵育。通过死细胞或活细胞染色测量死细胞的量(从而得出阳性结果)。

因此，CDC测定通常涉及将患者的血清与供体的淋巴细胞一起温育，并在加入兔补体后进行第二次温育。出现死细胞(阳性表现)意味着供体不适合该特定患者。有一些修饰方法可以提高测试的敏感性，包括延长最小孵育时间、添加抗人球蛋白(AHG)、在添加补体之前去除未结合的抗体、分离T细胞和B细胞亚群。除了CDC交叉配型之外，还有可用的流式细胞术交叉配型，其更灵敏甚至可以检测补体非活化抗体。然而，仍然需要能够检测非常低水平的患者抗体，由于这些抗体能够溶解候选供体细胞，从而最终产生组织排斥。

本公开涵盖了一种提高补体依赖性细胞的细胞毒性分析的灵敏度的方法，该方法确定潜在移植受体患者是否表达将减少或阻止受体对供体器官的接受的供体器官反应性抗体。因此，使用基于CRISPR Cas9的程序，来自编码补体抑制剂的至少一种基因的表达可以在来自候选移植器官的细胞中失活。这样修饰过的细胞，由于不再产生至少一种补体抑制剂，当置于来自潜在移植受体的血清样本中时，不会降低血清补体的有效活性。因此，较低水平的受体患者血清抗体在诱导供体细胞裂解方面变得有效。虽然本公开的方法可以有效地应用于来自潜在供体器官的细胞，其中所述细胞可以是原代细胞、培养的细胞或由分离的供体器官细胞产生并通过本领域已知的技术永生化的永生化细胞系，但是在应用于细胞如供体淋巴细胞时，所述方法也是有用的。

因此，本公开的一个方面包括一种确定候选供体器官是否将是潜在受体患者的抗体排斥的受试者的方法。在一些实施例中，从候选器官中取出组织样本，并通过CRISPRCas9基因编辑系统，从细胞基因组中删除编码补体抑制剂的基因。合适的靶向补体抑制剂包括但不限于CD46类、CD46、CD55和CD59。根据预期，在该方法的一个实施例中，产生基因改造的细胞所需的必要时间不会对患者产生重大影响。

进一步预期的是，根据本公开的遗传修饰的细胞可以通过本领域技术人员熟知的方法永生化并培养或储存，用于测试来自多个患者的多个血清样本，从而避免每次测试遗传修饰供体来源的细胞的必要性，因此提供了更具成本效益和快速进行的方法。

本公开还提供了适用于使来自异种移植供体的多个器官的细胞对补体抑制剂的表达失活的向导RNA核苷酸序列。在一个示例中，并非旨在限制，从肾内皮细胞的基因组中消除表达补体抑制剂CD46的能力。

基因组编辑技术包括通过使用改造的II型CRISPR/Cas9系统进行高效基因组编辑。CRISPR构建体依靠Cas9蛋白的核酸酶活性加上合成的引导RNA(gRNA)，合成起来简单而快速，并且可以进行多重操作。然而，尽管它们的合成相对容易，但CRISPR在技术上有限制，这与它们进入可靶向的基因组空间有关，这是由Cas9本身的特性和其gRNA的合成决定的。

CRISPR系统的切割需要gRNA与20个核苷酸的DNA序列和必需的前间区序列邻近基序(PAM)的互补碱基配对，PAM是在靶位点的3′处发现的短核苷酸基序(Jinek等人，(2012)Science 337：816-821)。理论上，可以使用CRISPR技术靶向基因组中的任何独特的N₂₀-PAM序列。PAM序列的DNA结合特异性(其根据所采用的特定Cas9的来源物种而变化)提供了一个限制。目前，限制最少且最常用的Cas9蛋白来自化脓性链球菌(S.pyogenes)，其识别序列NGG，因此，可以靶向基因组中的任何独特的21-核苷酸序列后跟两个鸟苷核苷酸(N₂₀NGG)。由蛋白质成分施加的可用靶向空间的扩展限于发现和使用具有改变的PAM要求的新型Cas9蛋白，或待通过诱变或定向进化产生新型Cas9变体。

CRISPR系统的第二个技术约束起因于在5′鸟苷核苷酸处启动的gRNA表达。使用III型类别的RNA聚合酶III启动子已可用于gRNA表达，由于这些短的非编码转录物具有明确定义的末端，并且除了1+核苷酸，所有转录所必需的元素都包含在上游启动子区域中。然而，由于常用的U6启动子需要鸟苷核苷酸来启动转录，因此U6启动子的使用进一步将基因组靶向位点限制为GN₁₉NGG。

靶向补体抑制剂编码基因的gRNA的实施例，例如但不限于CD46类、CD46、CD55和CD59。在一些实施例中，所述组合物包含(a)非天然存在的核酸酶系统(例如，CRISPR)，包含一种或多种载体，所述载体包含：i)启动子(例如，双向H1启动子)，可操作地连接至至少一种编码核酸酶系统向导RNA(gRNA)的核苷酸序列的，其中所述gRNA与所述受试者的细胞中DNA分子的编码补体抑制剂的靶序列杂交，其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种基因产物；和ii)在细胞中可操作的调控元素，所述调控元素可操作地连接至编码基因组靶向核酸酶(例如，Cas9蛋白)的核苷酸序列，其中成分(i)和成分(ii)位于所述系统的相同或不同载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列并与所述靶序列杂交，所述核酸酶切割所述DNA分子以改变所述一种或多种基因产物的表达。

在一些实施例中，将系统打包到单个腺相关病毒(AAV)颗粒或质粒中。在一些实施例中，腺相关病毒(AAV)可包含51种人腺病毒血清型(例如，血清型2、5或35)中的任一种。在一些实施例中，所述系统使一种或多种基因产物失活。在一些实施例中，核酸酶系统切除至少一个基因突变。在一些实施例中，启动子包含：a)提供编码gRNA的至少一个核苷酸序列在一个方向上的转录的控制元素；和b)提供编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列在相反方向上的转录的控制元素。在一些实施例中，Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。在一些实施例中，启动子与至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种gRNA可操作地连接。

在一些实施例中，本公开的方法利用一种包含非天然存在的CRISPR系统的组合物，所述非天然存在的CRISPR系统包含一种或多种载体，所述载体包含：a)H1启动子，所述H1启动子可操作地连接至编码CRISPR系统向导RNA(gRNA)的至少一种核苷酸序列，其中所述gRNA与细胞中DNA分子的靶序列杂交，其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)在细胞中可操作的调控元素，所述调控元素与编码Cas9蛋白的核苷酸序列可操作地连接，其中成分(a)和(b)位于所述系统的相同或不同载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列并与所述靶序列杂交，并且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子以改变所述一种或多种基因产物的表达。

在一些实施例中，本公开的方法可利用一种包含非天然存在的CRISPR系统的组合物，所述非天然存在的CRISPR系统包含一种或多种载体，所述载体包含：a)H1启动子，所述H1启动子可操作地连接至编码CRISPR系统向导RNA(gRNA)的至少一种核苷酸序列，其中所述gRNA与真核细胞中的DNA分子的靶序列杂交，其中所述DNA分子编码在真核细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)在真核细胞中可操作的调控元素，所述调控元素与编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列可操作地连接，其中成分(a)和(b)位于所述系统的相同或不同载体上，由此所述gRNA靶向所述靶序列并与所述靶序列杂交，并且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子，并且由此改变所述一种或多种基因产物的表达。在一个方面，靶序列可以是以任何核苷酸开始的靶序列，例如N₂₀NGG。在一些实施例中，靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG。在一些实施例中，靶序列包含核苷酸序列GN₁₉NGG。在一些实施例中，靶序列包含核苷酸序列CN₁₉NGG。在一些实施例中，靶序列包含核苷酸序列TN₁₉NGG。在一些实施例中，靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG或GN₁₉NGG。在另一个方面，Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。在另一个方面，Cas9蛋白经密码子优化以在真核细胞中表达。在另一方面，真核细胞是哺乳动物或人类细胞。在又另一个方面，一种或多种基因产物的表达减少。

因此，本公开的一个方面涵盖一种患者体内移植供体器官反应性抗体的检测方法的实施例，所述方法包括以下步骤：(a)通过对动物或人类器官的细胞群进行遗传修饰，减少至少一种补体抑制剂的表达；(b)将遗传修饰的细胞群与从期望接受移植供体器官的患者分离出的血清样本接触；以及(c)检测所述遗传修饰的细胞群的裂解，其中，裂解指示期望接受所述移植供体器官的所述患者是否表达供体器官反应性抗体，其中，当与来自所述器官且未经遗传修饰的细胞群相比时，所述裂解可被检测或增加，以减少至少一种表达的补体抑制剂。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述使非活性补体抑制剂编码基因失活的向导RNA包括从SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：11组成的组中选择的核苷酸序列，以及与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12组成的组中选择的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述补体抑制剂可以是CD46类，用于CRISPRCas9诱导失活的向导RNA在生理条件下可与SEQ ID NO：19的序列或其补体杂交，并具有SEQID NO：20的核苷酸序列。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述表达载体可以是质粒PX330或PX458，并且当所述质粒转染到哺乳动物细胞中时，所述表达质粒表达Cas9。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述表达载体可以包括与从SEQ ID NO：13至SEQ ID No：18组成的组中选择的核苷酸序列具有至少85％相似性的核苷酸序列。

本公开的另一方面涵盖一种患者体内移植供体器官反应性抗体的检测方法的实施例，所述方法包括以下步骤：(a)通过对候选动物或人类移植供体肾脏的肾内皮细胞群进行遗传修饰，减少所述细胞群的至少一种补体抑制剂的表达，其中，所述遗传修饰通过以下步骤进行：(i)从肾脏或淋巴细胞获得组织样本；以及(ii)产生包含非活性CD46补体抑制剂编码基因的遗传修饰的肾衍生细胞群，所述非活性CD46补体抑制剂编码基因是通过用至少一种编码向导RNA和CRISPR Cas9的表达载体转染所述肾内皮细胞而产生的，其中，所述向导RNA对所述补体抑制剂CD46具有特异性，并且包含从SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7组成的组中选择的核苷酸序列和与从SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8组成的组中选择的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中，所述表达载体包含与选自SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16的核苷酸序列具有至少85％相似性的核苷酸序列；(b)将遗传修饰的肾内皮细胞群与从期望接受移植供体器官的患者分离出的血清样本接触；以及(c)检测所述遗传修饰的肾内皮细胞群的裂解，其中，裂解指示期望接受所述移植供体器官的患者是否表达供体器官反应性抗体，其中，当与来自所述器官并且未经遗传修饰的肾内皮细胞群相比时，所述裂解可被检测或增加，以减少至少一种表达的补体抑制剂。

本公开的另一个方面是一种经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述细胞来自供体组织，其中，所述细胞经遗传修饰以具有减少的补体抑制剂表达或不具有补体抑制剂表达。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述补体抑制剂可以是CD46类，其氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：23具有至少90％的相似性。

在本公开的该方面的一些实施例中，补体抑制剂可以是CD46类，其核苷酸序列编码与核苷酸序列SEQ ID NO：19具有至少90％的相似性。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞可以通过CRISPR Cas9删除编码所述补体抑制剂的所述细胞的基因组的全部或片段而进行遗传修饰。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述供体组织可以是从选自肾脏、肺、心脏、肌肉、皮肤组织或淋巴细胞的器官获得的。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞来源于候选供体器官。

在本公开的该方面的一些实施例中，所述候选器官选自肾脏、肺、心脏、肌肉和皮肤组织组成的组。在本公开的该方面的一些实施例中，所述候选器官是肾脏。

虽然结合实施例和相应的文本和附图描述了本公开的实施例，但并不意图将本公开限制于这些描述的实施例。相反，其目的是涵盖本公开的精神和范围内的所有替代方案、修改和等同物。

示例

示例1

亲本细胞系的培养：在37℃和5％CO₂下，在附着因子包被的板(Thermo Fisher，Waltham，MA)上，在补充有10％Cosmic小牛血清(HyClone，Logan，UT)、100ug/ml内皮细胞特异性生长因子(Coming，Bedford，MA)和1％青霉素/链霉素(HyClone，Logan，UT)的RosewellPark Memorial Institute(RPMI)培养基1640(gibco，Carlsbad，CA)中培养具有GGTA1/B4GalNT2/SLA1KO的永生化肾内皮细胞系。通过与DyLight 649 Griffonia simplicifolia凝集素I、同工凝集素B4(Vector Labs，Burlingame，CA)一起孵育确认细胞为半乳糖-α1，3-半乳糖阴性，并且通过与SLA I类(Invitrogen，Rockford，IL)一起孵育确认细胞为SLA I类阴性，并使用伯明翰阿拉巴马大学综合流式细胞术核心在BD FACS Aria II上进行分析。

示例2

gRNA表达载体的产生：质粒pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(Addgene质粒48138)用于克隆设计的退火寡核苷酸(表I)以使用CRISPR相关的Cas9核酸酶系统产生向导RNA。将1ug质粒pX458用BbsI(New England Biolabs，Ipswich，MA)在37℃下消化30分钟。使用Bio-RAD热循环仪(Applied Biosystems，Foster city，California)将每对磷酸化寡核苷酸退火，在37℃下开始30分钟，然后在95℃下进行5分钟的步骤，然后以5℃/min降至25℃。在室温下将消化的pX458与退火的寡核苷酸par连接10分钟。按照制造商的方案，使用连接反应转化TOP10感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用QIAprep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从每次处理的8个菌落中分离质粒。对DNA克隆进行测序(Heflin centerGenomics Core-DNA，UAB)。

示例3

靶细胞的转染和鉴定：根据制造商的用法说明，使用Neon转染系统(LifeTechnologies，Grand Island，NY，USA)通过电穿孔转染猪REC。Cas9表达质粒的浓度和细胞数保持恒定，在每次转染2μg/1×10⁶个细胞。Cas9表达载体的不同之处仅在于是否存在绿色荧光蛋白(GFP)。将细胞在不含抗生素的培养基中培养24小时。48小时后，在BD FACSAria II上分选用GFP表达载体转染的细胞。建立门以保留最亮的细胞；这被限制为小于总人口的5％。通过FACS Aria流式细胞仪将具有高水平GFP表达的细胞每孔分选一个细胞到96孔板中。细胞在培养物中保留14天直至分选后汇合。

示例4

基匈型分析：使用QIAmp.RTM DNA微型试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从猪细胞中分离基因组DNA。使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)按照制造商的方案分离RNA样本。通过NanoDrop分光光度计(ND-1000，Wilmington，DE)确认RNA质量和数量。使用OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)逆转录RNA样本。纯化PCR产物，并连接到pCR4-TOPO TA(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将转化的细菌铺板到含有50μg/ml卡那霉素的Luria-Bertani琼脂上用于克隆选择。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)分离质粒。通过Sanger方法进行核苷酸序列分析。

示例5

表型分析：通过测量猪CD46的表达来分析表型特异性突变效率。用抗CD46抗体(克隆6D8/8，FITC)(Lifespan Biosciences，Seattle，WA)染色细胞以检查基因表达功能。未标记的细胞用作阴性对照。在BD FACS Aria II上收集流式细胞术数据，用FlowJo版本10(Treestar Inc，Ashland，OR)进行分析。

示例6

序凋分析：使用Geneious 11.0.4分析核苷酸序列。重叠的正向和反向序列片段组装了每个等位基因的完整编码序列。为每个基因座创建多序列比对。通过使用NCBI参考序列：NM_213888.1确认序列。

示例7

补体介导的细胞毒性_：在96孔V形底测定板中，将来自13名肾移植等待列表患者的100μl连续稀释的热灭活的人血清与来自亲本猪CD46KO的REC的100μl等分试样混合。在37℃下用或不用IgM破坏剂二硫苏糖醇(DTT)(最终2.5mM)处理30分钟的人血清。每个孔中REC的最终浓度为1×10⁶/ml，血清浓度随稀释而变化(100％、50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％)。将测定板在4℃下温育30分钟。温育后，将板离心6分钟(400g)，倾析并用HBSS清洗；将该步骤重复两次。人血清的热灭活防止储存的血清中补体的可变存在影响结果。将低TOX-H兔补体(Cedarlane，Burlington，NC，USA)在HBSS中1∶15稀释，并向每个孔中加入140μ1，在37℃下温育30分钟。温育后，将板离心6分钟(400g)，倾析并用HBSS清洗；在室温下用碘化丙啶(PI)(2.5mg/ml，Sigma-Aldrich)标记REC 15分钟。使用BD Accuri C6流式细胞仪和软件(BD Biosciences，Ann Arbor，MI)收集数据。

示例8

抗体结合：将每组的2×10⁵个REC与来自13名肾移植等待列表患者的25％热灭活人血清在4℃下温育30分钟。然后将样本用Hank′s缓冲盐溶液(HBSS)清洗三次。用与AlexaFluor 488(Jackson Immuno Research Laboratories Inc.，West Grove，PA，USA)缀合的抗人二抗在4℃下单独检测人类IgG和IgM 30分钟。将PBMC在HBSS中清洗三次。使用AccuriC6流式细胞仪(Accuri，Ann Arbor，MI，USA)进行荧光检测。使用FlowJo版本10(TreestarInc.，Ashland，OR，USA)进行数据分析。

示例9

图7中描述登录号为XM_003482667.3的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)，并且其是编码猪CD46类补体抑制剂的mRNA核苷酸序列。有利的gRNA序列与SEQ ID NO：19的序列杂交，由SEQ ID NO：20给出(图7)。

示例10

图8中描述的是氨基酸序列比对，其显示以下氨基酸序列之间的相似性：人CD46(SEQ ID NO：21)；猪CD46(SEQ ID NO：22)和猪CD46类(SEQ ID NO：23)补体抑制剂。

序列表

<110> 阿拉巴马大学研究基金会

<120> 增加细胞对补体介导的裂解的敏感性的方法

<130> 222104-2940

<150> 62/821,641

<151> 2019-03-21

<160> 23

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪CD46gRNA-1引物

<400> 1

caccgctcat ggacccctat tgacg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪CD46gRNA-2引物

<400> 2

aaaccgtcaa taggggtcca tgagc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪CD55gRNA-1引物

<400> 3

caccggcgcc atgagtcccc tgccg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪CD55gRNA-2引物

<400> 4

aaaccggcag gggactcatg gcgcc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪CD59gRNA-1引物

<400> 5

caccgaatcc atagacggtc acgat 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪CD59gRNA-2引物

<400> 6

aaacatcgtg accgtctatg gattc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类CD46gRNA-1引物

<400> 7

caccggcgcc gcgcatggag cctcc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类CD46gRNA-2引物

<400> 8

aaacggaggc tccatgcgcg gcgcc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类CD55gRNA-1引物

<400> 9

caccgggcgc gccatgaccg tcgcg 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类CD55gRNA-2引物

<400> 10

aaaccgcgac ggtcatggcg cgccc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类CD59gRNA-1引物

<400> 11

caccgatcac aatgggaatc caagg 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类CD59gRNA-2引物

<400> 12

aaacccttgg attcccattg tgatc 25

<210> 13

<211> 634

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PX330中的猪CD46

<400> 13

ttggggttcg atttcttggc tttatatatc ttgtggaagg acgaaacacc gctcatggac 60

ccctattgac ggttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa 120

cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt tttgttttag agctagaaat agcaagttaa 180

aataaggcta gtccgttttt agcgcgtgcg ccaattctgc agacaaatgg ctctagaggt 240

acccgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 300

attgacgtca atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 360

acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 420

tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattgtgcc cagtacatga ccttatggga 480

ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag 540

ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt 600

atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggg 634

<210> 14

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PX458中的猪CD55

<400> 14

gcggattcga tttcttggct ttatatatct tgtggaagga cgaaacaccg gcgccatgag 60

tcccctgccg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120

ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata gcaagttaaa 180

ataaggctag tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc tctagaggta 240

cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 300

ttgacgtcaa tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattgtgccc agtacatgac cttatgggac 480

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt cgaggtgagc 540

cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta 600

tttatttttt aattattttg tgca 624

<210> 15

<211> 634

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PX330中的猪CD59

<400> 15

cggaatccgg atttcttggc tttaatatct tgtggaagga cgaaacaccg aatccataga 60

cggtcacgat gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120

ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata gcaagttaaa 180

ataaggctag tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc tctagaggta 240

cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 300

ttgacgtcaa tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattgtgccc agtacatgac cttatgggac 480

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt cgaggtgagc 540

cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta 600

tttatttttt aattattttg tgcagcgatg gggg 634

<210> 16

<211> 603

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PX468中的人类CD46

<400> 16

tcgggttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaagga cgaaacaccg gcgccgcgca 60

tggagcctcc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120

ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata gcaagttaaa 180

ataaggctag tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc tctagaggta 240

cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 300

ttgacgtcaa tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattgtgccc agtacatgac cttatgggac 480

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt cgaggtgagc 540

cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta 600

ttt 603

<210> 17

<211> 616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PX330中的人类CD55

<400> 17

acgtatcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaggac gaaacaccgg gcgcgccatg 60

accgtcgcgg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact 120

tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa 180

taaggctagt ccgtttttag cgcgtgcgcc aattctgcag acaaatggct ctagaggtac 240

ccgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 300

tgacgtcaat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 360

ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 420

acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attgtgccca gtacatgacc ttatgggact 480

ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc 540

ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat 600

ttatttttta attatt 616

<210> 18

<211> 619

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PX330中的人类CD59

<400> 18

tcggttgcga tttcttggct ttatatatct tgtggaagga cgaaacaccg atcacaatgg 60

gaatccaagg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120

ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata gcaagttaaa 180

ataaggctag tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc tctagaggta 240

cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 300

ttgacgtcaa tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattgtgccc agtacatgac cttatgggac 480

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt cgaggtgagc 540

cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta 600

tttatttttt aattatttt 619

<210> 19

<211> 2675

<212> DNA

<213> 野猪

<400> 19

ttgttgcgtc tggtaagcct accctaaaag ctgtctcatg ggttggcctc agatttcccg 60

ctgatttccc caaacatgac ggtggcttgc gcaccgcgca aggcacctcc cgagcgccca 120

gagaggcctc ctttttcctg gtgctgcgtg gggattcttt tgctggcttt agtgttcccg 180

ctacccttat tcgccttcgt tgtctgtcct gatccaccga aactgaagag tgcggtgctc 240

acgagtgtcc ttcaacaacg ttattatcct ggggacaaaa tagagtatcg gtgtcgccca 300

ggataccttc cagatccatt tgaaacccgg aaatcttcct gtgaggcaaa tggctcatgg 360

acccctattg acgaggcttg ttttcgaaaa tcatgtccga aaccaacaat agaacatggt 420

gaaatatatg cccctcaaag aaactttgag tttgaatcag aagttcacat ttcgtgtatt 480

gaaggttacc atttaaaagg gaaaggtatt ctaacttgtc aacttattgg acaggacgtg 540

ttttggagtg atagaatgcc acaatgtgaa agggtttact gtggacgacc tccacaaata 600

aaaaatggaa aacataccaa tagctacagg aatatatttg aatataatga attagtaact 660

tatacttgta atccttcaaa tggaccagat gaatattcac ttgttggaga aagcaaactt 720

ttttgttctg cacctggcaa atggagtagt gcccctcctc agtgtaaagt ggtcaaatgt 780

gaacgtccag aactcaaaca tggagtcata gtatcgggaa gtagagaaaa attttcctac 840

caagcagtgg tgatatttgg atgcctgcaa ggtttttacc ttaatggcag caacgtggtg 900

ttctgtagtg gtaataatac atgggagcct gagataccaa agtgtattaa aggttacagg 960

ccaacttatc caaccaagaa tccagttgac aaatatccag gctatcctaa tcccgatttt 1020

gaaataccat cacttgacga ctttgaggat ttagatgccg gaatcattgc tcttatggct 1080

cttactgcaa ttgttgctgt tgcagtagtt ttcacctgcc tatacagatg tcttcgcagt 1140

gagaaggagg tggtgaagga taagaaaggg gaggaggaag aggagcagaa ggaggagaag 1200

aaggagaaag aggaggaaac agagaaaaag gaggagaagg agaagaagaa agagaaggag 1260

aaggagaaga aagagaagaa gaaaaaaggg aaaaaagaag ctggtgctgt atccgctact 1320

caaatggaaa aaccaaccag tccatcagtg cagaagcact aatttttctt ccacaaaccc 1380

atatatcagt ttatcttttg attctgttaa tatgttaaga tctacagtaa attcatacag 1440

aaactatgga aaaccatatg taggttcctc aaaaaattaa aaatagagct actatatgat 1500

ccagcaattc cactgtaggt atatatccaa agaaaacaaa atcaccagtg gaagagataa 1560

cagcacccac tgtgtaatgc agcattgttt acagtaacca caatatggaa acagcctaag 1620

tgtccagtgt caaatgaatg ggtgaagaga atgtgaggta gatatataga tacacacaca 1680

cacacacaca cacacacaca cacctacacc tatatataca ttcataaata gatacagaca 1740

gtggaatacc attcaaccat taaaaagaaa gccctgccat atgtgacaat acttatgaaa 1800

cttgagcaca ttatggtaag taaataagtc gtacagaaag acacaaatac tctatgatct 1860

cacttatagg tagaatccaa aaatccacac acagaaaaag aaatcagatt tctggttgcc 1920

agaggcaggg gatgagggtg gtgtaagaaa tgggtgaaag gtgtcaaaag gtacaaagta 1980

gcaggtataa gataagtact aggatatcat gtacagcatg gtgactataa ttagtaatgc 2040

tgtgttgtat acagctggct ctgtatttga tggtccccca tccatatctg tggctatgga 2100

gagctggttg tgctttgcca caatatataa gagacttgag cattcaggat tttatttgta 2160

ggggaagagg atgggaatct ggaaccaatc cccctcatat atcaagggat gacagcttta 2220

caagttgtta gagggtaggt ctttgatgtt ctgatcacaa ggaagaataa aaaaaatttt 2280

gtaactatga gaggtgatgc atattaagaa tttattgtaa tcatttcata atatttacat 2340

tatcaagtca tgctgtatac cctcaactta aacagtttta cacaggttac ctccttttct 2400

tcttcacttt gtcacacgtt gcagagatgg caattttcac agtttatggc aaccctacac 2460

cagcaagttt attggtgcca ttttcgcaac aacatttact cattttgtgt ctctgtgtca 2520

cattttggta attcatgcag tatttaaatt ttttattatc atcattctgt ttgttatggt 2580

gatctctgtt caattatatt tcatgtcact gctgttattc actgaagatg caaatgatta 2640

ttagtacttt tagcaataaa ttatttttta attaa 2675

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪CD46 crispr靶点

<400> 20

gcatgggaag caggaacact a 21

<210> 21

<211> 392

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

Met Glu Pro Pro Gly Arg Arg Glu Cys Pro Phe Pro Ser Trp Arg Phe

1 5 10 15

Pro Gly Leu Leu Leu Ala Ala Met Val Leu Leu Leu Tyr Ser Phe Ser

20 25 30

Asp Ala Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly

35 40 45

Lys Pro Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys

50 55 60

Lys Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys

65 70 75 80

Asp Arg Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg

85 90 95

Glu Thr Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro

100 105 110

Ala Asn Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn

115 120 125

Glu Gly Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys

130 135 140

Gly Ser Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val

145 150 155 160

Leu Cys Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser

165 170 175

Glu Val Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp

180 185 190

Pro Ala Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile

195 200 205

Tyr Cys Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys

210 215 220

Val Val Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser

225 230 235 240

Gly Phe Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys

245 250 255

Asp Lys Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser

260 265 270

Asn Ser Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys Val Leu Pro

275 280 285

Pro Ser Ser Thr Lys Pro Pro Ala Leu Ser His Ser Val Ser Thr Ser

290 295 300

Ser Thr Thr Lys Ser Pro Ala Ser Ser Ala Ser Gly Pro Arg Pro Thr

305 310 315 320

Tyr Lys Pro Pro Val Ser Asn Tyr Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Glu Glu

325 330 335

Gly Ile Leu Asp Ser Leu Asp Val Trp Val Ile Ala Val Ile Val Ile

340 345 350

Ala Ile Val Val Gly Val Ala Val Ile Cys Val Val Pro Tyr Arg Tyr

355 360 365

Leu Gln Arg Arg Lys Lys Lys Gly Thr Tyr Leu Thr Asp Glu Thr His

370 375 380

Arg Glu Val Lys Phe Thr Ser Leu

385 390

<210> 22

<211> 378

<212> PRT

<213> 野猪

<400> 22

Met Met Ala Phe Cys Ala Leu Arg Lys Ala Leu Pro Cys Arg Pro Glu

1 5 10 15

Asn Pro Phe Ser Ser Arg Cys Phe Val Glu Ile Leu Trp Val Ser Leu

20 25 30

Ala Leu Val Phe Leu Leu Pro Met Pro Ser Asp Ala Cys Asp Glu Pro

35 40 45

Pro Lys Phe Glu Ser Met Arg Pro Gln Val Leu Asn Thr Thr Tyr Arg

50 55 60

Pro Gly Asp Arg Val Glu Tyr Glu Cys Arg Pro Gly Phe Gln Pro Met

65 70 75 80

Val Pro Ala Leu Pro Thr Ser Ser Val Cys Gln Asp Asp Asn Thr Trp

85 90 95

Ser Pro Leu Gln Glu Ala Cys Arg Arg Lys Ala Cys Ser Asn Leu Pro

100 105 110

Asp Pro Leu Asn Gly Gln Val Ser Tyr Pro Asn Gly Asp Thr Leu Phe

115 120 125

Gly Ser Lys Ala Gln Phe Thr Cys Asn Thr Gly Phe Tyr Ile Ile Gly

130 135 140

Ala Glu Thr Val Tyr Cys Gln Val Ser Gly Asn Val Met Ala Trp Ser

145 150 155 160

Glu Pro Ser Pro Leu Cys Glu Lys Ile Leu Cys Lys Pro Pro Gly Glu

165 170 175

Ile Pro Asn Gly Lys Tyr Thr Asn Ser His Lys Asp Val Phe Glu Tyr

180 185 190

Asn Glu Val Val Thr Tyr Ser Cys Leu Ser Ser Thr Gly Pro Asp Glu

195 200 205

Phe Ser Leu Val Gly Glu Ser Ser Leu Phe Cys Ile Gly Lys Asp Glu

210 215 220

Trp Ser Ser Asp Pro Pro Glu Cys Lys Val Val Lys Cys Pro Tyr Pro

225 230 235 240

Val Val Pro Asn Gly Glu Ile Val Ser Gly Phe Gly Ser Lys Phe Tyr

245 250 255

Tyr Lys Ala Glu Val Val Phe Lys Cys Asn Ala Gly Phe Thr Leu His

260 265 270

Gly Arg Asp Thr Ile Val Cys Gly Ala Asn Ser Thr Trp Glu Pro Glu

275 280 285

Met Pro Gln Cys Ile Lys Glu Ser Thr Pro Pro Asn Thr Gln Pro Pro

290 295 300

Thr Pro Ser Val Ser Asp Ser Lys Pro Thr Asp Pro Pro Ala Thr Pro

305 310 315 320

Gly Pro Ser His Pro Gly Pro Pro Ser Pro Ser Asp Ala Ser Pro Pro

325 330 335

Lys Asp Ala Glu Ser Leu Asp Gly Gly Ile Ile Ala Ala Ile Val Val

340 345 350

Gly Val Leu Ala Ala Ile Ala Val Ile Ala Gly Gly Val Tyr Phe Phe

355 360 365

His His Lys Tyr Asn Lys Lys Arg Ser Lys

370 375

<210> 23

<211> 427

<212> PRT

<213> 野猪

<400> 23

Met Thr Val Ala Cys Ala Pro Arg Lys Ala Pro Pro Glu Arg Pro Glu

1 5 10 15

Arg Pro Pro Phe Ser Trp Cys Cys Val Gly Ile Leu Leu Leu Ala Leu

20 25 30

Val Phe Pro Leu Pro Leu Phe Ala Phe Val Val Cys Pro Asp Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Lys Ser Ala Val Leu Thr Ser Val Leu Gln Gln Arg Tyr Tyr

50 55 60

Pro Gly Asp Lys Ile Glu Tyr Arg Cys Arg Pro Gly Tyr Leu Pro Asp

65 70 75 80

Pro Phe Glu Thr Arg Lys Ser Ser Cys Glu Ala Asn Gly Ser Trp Thr

85 90 95

Pro Ile Asp Glu Ala Cys Phe Arg Lys Ser Cys Pro Lys Pro Thr Ile

100 105 110

Glu His Gly Ile Tyr Ala Pro Gln Arg Asn Phe Glu Phe Glu Ser Glu

115 120 125

Val His Ile Ser Cys Ile Glu Gly Tyr His Leu Lys Gly Lys Gly Ile

130 135 140

Leu Thr Cys Gln Leu Ile Gly Gln Asp Val Phe Trp Ser Asp Arg Met

145 150 155 160

Pro Gln Cys Glu Arg Val Tyr Cys Gly Arg Pro Pro Gln Ile Lys Asn

165 170 175

Gly Lys His Thr Asn Ser Tyr Arg Asn Ile Phe Glu Tyr Asn Glu Leu

180 185 190

Val Thr Tyr Thr Cys Asn Pro Ser Asn Gly Pro Asp Glu Tyr Ser Leu

195 200 205

Val Gly Glu Ser Lys Leu Phe Cys Ser Ala Pro Gly Lys Trp Ser Ser

210 215 220

Ala Pro Pro Gln Cys Lys Val Val Lys Cys Glu Arg Pro Glu Leu Lys

225 230 235 240

His Gly Val Ile Val Ser Gly Ser Arg Glu Lys Phe Ser Tyr Gln Ala

245 250 255

Val Val Ile Phe Gly Cys Leu Gln Gly Phe Tyr Leu Asn Gly Ser Asn

260 265 270

Val Val Phe Cys Ser Gly Asn Asn Thr Trp Glu Pro Glu Ile Pro Lys

275 280 285

Cys Ile Lys Gly Tyr Arg Pro Thr Tyr Pro Thr Lys Asn Pro Val Asp

290 295 300

Lys Tyr Pro Gly Tyr Pro Asn Pro Asp Phe Glu Ile Pro Ser Leu Asp

305 310 315 320

Asp Phe Glu Asp Leu Asp Ala Gly Ile Ile Ala Leu Met Ala Leu Thr

325 330 335

Ala Ile Val Ala Val Ala Val Val Phe Thr Cys Leu Tyr Arg Cys Leu

340 345 350

Arg Ser Glu Lys Glu Val Val Lys Asp Lys Lys Gly Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gln Lys Glu Glu Lys Lys Glu Lys Glu Glu Glu Thr Glu Lys Lys

370 375 380

Glu Glu Lys Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Lys Glu Lys

385 390 395 400

Lys Lys Lys Gly Lys Lys Glu Ala Gly Ala Val Ser Ala Thr Gln Met

405 410 415

Glu Lys Pro Thr Ser Pro Ser Val Gln Lys His

420 425

Claims

1.一种患者体内移植供体器官反应性抗体的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(a)通过对动物或人类器官的细胞群进行遗传修饰，减少至少一种补体抑制剂的表达；

(b)将遗传修饰的细胞群与从期望接受移植供体器官的患者分离出的血清样本接触；以及

(c)检测所述遗传修饰的细胞群的裂解，其中，裂解指示期望接受所述移植供体器官的所述患者是否表达供体器官反应性抗体，其中，当与来自所述器官且未经遗传修饰的细胞群比较时，所述裂解可被检测或增加，以减少至少一种表达的补体抑制剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群来自候选移植器官。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群是供体淋巴细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群来自肾脏。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述细胞群是肾内皮细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)还包括：

(i)从所述器官获得组织样本；以及

(ii)产生遗传修饰的器官衍生细胞群，该器官衍生细胞群包括通过用至少一种编码向导RNA和CRISPR Cas9的表达载体转染所述细胞而产生的非活性补体抑制剂编码基因，其中，所述向导RNA对补体抑制剂具有特异性。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述非活性补体抑制剂编码基因选自CD46类、CD46、CD55和CD59。

8.如权利要求6所述的方法，其中，所述补体抑制剂是CD46类，其核苷酸序列编码与SEQID NO：19的核苷酸序列具有至少90％的相似性。

9.如权利要求6所述的方法，其中，所述补体抑制剂是CD46类，其氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：23具有至少90％的相似性。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述使非活性补体抑制剂编码基因失活的向导RNA包括从SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11组成的组中选择的核苷酸序列，以及从SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12组成的组中选择的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

11.如权利要求9所述的方法，其中，所述补体抑制剂是CD46类，并且在生理条件下，与SEQ ID NO：19序列或其补体杂交并基于CRISPR Cas9失活的向导RNA具有SEQ ID NO：20核苷酸序列。

12.如权利要求6所述的方法，其中，所述表达载体是质粒PX330或PX458，并且当所述质粒转染到哺乳动物细胞中时，所述表达质粒表达Cas9。

13.如权利要求6所述的方法，其中，所述表达载体包括与从SEQ ID NO：13至SEQ IDNO：18组成的组中选择的核苷酸序列具有至少85％相似性的核苷酸序列。

14.一种患者体内移植供体器官反应性抗体的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(a)通过对候选动物或人类移植供体肾脏的肾内皮细胞群进行遗传修饰，减少所述细胞群的至少一种补体抑制剂的表达，其中，所述遗传修饰通过以下步骤进行：

(i)从肾脏获得组织样本；以及

(ii)产生包含非活性CD46补体抑制剂编码基因的遗传修饰肾衍生细胞群，所述非活性CD46补体抑制剂编码基因是通过用至少一种编码向导RNA和CRISPR Cas9的表达载体转染所述肾内皮细胞而产生的，其中，所述向导RNA对所述补体抑制剂CD46具有特异性，并且包含从SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7组成的组中选择的核苷酸序列，和与从SEQ ID NO：2和SEQID NO：8组成的组中选择的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中，所述表达载体包含与选自SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16的核苷酸序列具有至少85％相似性的核苷酸序列；

(b)将遗传修饰的肾内皮细胞群与从期望接受移植供体器官的患者分离出的血清样本接触；以及

(c)检测所述遗传修饰的肾内皮细胞群的裂解，其中，裂解指示期望接受所述移植供体器官的患者是否表达供体器官反应性抗体，其中，当与来自所述器官并且未经遗传修饰的肾内皮细胞群比较时，所述裂解可被检测或增加，以减少至少一种表达的补体抑制剂。

15.一种经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述细胞来自供体组织，其中，所述细胞经遗传修饰以具有减少的补体抑制剂表达或不具有补体抑制剂表达。

16.如权利要求15所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述补体抑制剂是CD46类、CD46、CD55或CD59。

17.如权利要求15所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述补体抑制剂是CD46类并且具有与氨基酸序列SEQ ID NO：23至少90％相似的氨基酸序列。

18.如权利要求15所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述补体抑制剂是CD46类，并且由与SEQ ID NO：19的核苷酸序列具有至少90％相似性的核苷酸序列编码。

19.如权利要求15所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述补体抑制剂是CD46类，并且由具有SEQ ID NO：19的核苷酸序列的核苷酸序列编码。

20.如权利要求15所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述细胞是通过CRISPRCas9删除编码所述补体抑制剂的所述细胞的基因组的全部或片段而进行遗传修饰。

21.如权利要求15所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述细胞是培养的细胞群。

22.如权利要求15所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述供体组织是从选自肾脏、肺、心脏、肌肉和皮肤组织的器官获得的。

23.如权利要求15所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述细胞是从候选供体器官获得的。

24.如权利要求15所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述候选器官选自肾脏、肺、心脏、肌肉、皮肤组织或淋巴细胞组成的组。

25.如权利要求15所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述候选器官是肾脏。

26.如权利要求15所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述经遗传修饰的哺乳动物细胞是肾内皮细胞或淋巴细胞。