JP5050198B2 - ヒト補体制御因子発現遺伝子およびその利用 - Google Patents
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Description
本発明はヒト補体制御因子発現遺伝子、即ちブタ内在性レトロウイルスをドナー（ブタ）からレシピエント（ヒト）に感染させないように改変されたヒト補体制御因子の発現遺伝子とその利用に関する。
腎臓や肝臓、あるいは心臓移植などの臓器移植は今や定着した医療となっている。しかし、近年各国とも深刻なドナー不足が問題となっている。ドナー不足を解決する手段の一つとして、異種移植が挙げられる。異種移植のドナーとしては、臓器の大きさ、生産性などからブタが異種移植のドナーの最有力候補と考えられている。しかし、ブタからヒトへの異種移植には、種の相違による免疫関連分子（補体と補体制御因子など）の不一致やGalactose α1-3 Galactose (Galα1-3Gal)をはじめとする異種糖鎖抗原などによる拒絶反応の問題がある。ブタの臓器をヒトに移植した場合、数分から数時間で急性拒絶反応がおこる。この急性拒絶反応は、抗体の抑制または補体の抑制、あるいはその両方の抑制によって回避され得る。抗体の抑制方法としては、各種薬剤を使う方法、脾臓摘出などをおこなう方法、抗体などの拒絶要因を吸着する方法などが知られている。また、ブタ血管内皮細胞に存在するがヒトには存在しない糖鎖（Galα1-3Gal）が抗原となることがわかっていることから、この糖鎖をもたないトランスジェニックブタをつくる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。補体の抑制方法に関しては、各種薬剤を使う方法、ｓＣＲ１などの補体制御蛋白の投与や、遺伝子工学的に例えばヒト補体制御因子（Decay Accelerating Factor；以下、ＤＡＦ（ＣＤ５５）と略記する。）のような、ヒトの補体制御蛋白をブタの血管内皮細胞などで発現するようなトランスジェニックブタを作る方法などが知られている（例えば、特許文献２参照。）。
また異種移植における大きな問題は、例えばブタレトロウイルス（以下、ＰＥＲＶという。）のような病原体が移植を通してレシピエント（ヒト）に感染する危険性を否定できないことである。外来性の病原体はブタなどのドナーとなる動物をＳＰＦ（Specific Pathogen-Free；特定病原体不在）化することなどによって排除できるが、ＰＥＲＶなどはブタゲノム中に存在するので、その排除は困難である。ＰＥＲＶはブタに疾病を生じないとされている。現在のところ、生存ブタ由来組織を用いて治療されたレシピエント（ヒト）がＰＥＲＶに感染したという報告はみられない（例えば、非特許文献１参照。）。しかし、ヒト培養細胞株にＰＥＲＶがin vitroで感染したという報告（非特許文献２参照）があることから、ブタ臓器をヒトに移植した場合に、ＰＥＲＶがヒトにin vivo感染し疾病を起こす危険性があり、またヒトの体内で増殖したウイルスが突然変異を起こして新しいウイルスになる危険性もある。
特開平２００２−２９１３７２号公報
特開平１１−２３９４３０号公報
サイエンス（Science）、１９９９年、第２８５巻、ｐ．１２３６
ネイチャー・メディシン（Nature Medicine）、１９９７年、第３巻（３）、ｐ．２８２−２８６
異種移植の臨床応用に向け、ＤＡＦを発現するブタ血管内皮細胞などのブタ由来細胞や形質転換ブタが作出されている。ＤＡＦを発現するブタ由来細胞や形質転換ブタから分離した臓器など（以下、ＤＡＦ発現細胞等と略記する。）がレシピエント（ヒト）に移植された場合、該ＤＡＦ発現細胞等はレシピエント（ヒト）の血清に対し抵抗性を有するので、レシピエント（ヒト）が移植された細胞や臓器に対し拒絶反応をおこすのを抑制できる。しかし、ＤＡＦ発現細胞等のゲノムに存在するＰＥＲＶもヒト血清に対して抵抗性を有する可能性がある。このため、ＤＡＦ発現細胞等を移植されるレシピエント（ヒト）は、ＰＥＲＶに感染する危険性が大きいと考えられている。
異種移植に伴うＰＥＲＶによる感染症を回避する方法としては、レシピエント（ヒト）を処置する方法とドナーを処置する方法がある。これらのうち、レシピエント（ヒト）を処置する方法としては逆転写酵素阻害剤やプロテアーゼ阻害剤の投与などが考えられ、一方ドナー動物（例えば、ブタ）を処置する方法としては、交配によるＰＥＲＶ遺伝子を有さないブタ系統の育種、ブタＰＥＲＶ遺伝子のノックアウト、アンチセンスやリボザイムの適用も考えられるが現在迄のところ成功例は得られていない（ゼノトランスプランテーション（Xenotransplantation）、２００２年、第９巻、ｐ．２４２）。また、ｓｉＲＮＡ法が試みられているが完全ではない（ジャーナル・オブ・バイオロジー（J.Biol．）、２００５年、第１３７巻、ｐ．５０３）
そこで、本発明は、移植細胞、移植組織または移植臓器はＤＡＦなどの補体制御因子を発現してヒト血清に対し抵抗性を有するが、該移植細胞、移植組織または移植臓器が産生するＰＥＲＶはヒト血清に対し抵抗性を有さないＤＡＦなどの補体制御因子発現遺伝子を創製することを目的とする。さらに、本発明は、前記遺伝子で形質転換したＤＡＦなどの補体制御因子発現ブタ細胞またはＤＡＦなどの補体制御因子発現ブタを創製することを目的とする。
異種移植に伴うＰＥＲＶによる感染症を回避する方法としては、レシピエント（ヒト）を処置する方法とドナーを処置する方法がある。これらのうち、レシピエント（ヒト）を処置する方法としては逆転写酵素阻害剤やプロテアーゼ阻害剤の投与などが考えられ、一方ドナー動物（例えば、ブタ）を処置する方法としては、交配によるＰＥＲＶ遺伝子を有さないブタ系統の育種、ブタＰＥＲＶ遺伝子のノックアウト、アンチセンスやリボザイムの適用も考えられるが現在迄のところ成功例は得られていない（ゼノトランスプランテーション（Xenotransplantation）、２００２年、第９巻、ｐ．２４２）。また、ｓｉＲＮＡ法が試みられているが完全ではない（ジャーナル・オブ・バイオロジー（J.Biol．）、２００５年、第１３７巻、ｐ．５０３）
そこで、本発明は、移植細胞、移植組織または移植臓器はＤＡＦなどの補体制御因子を発現してヒト血清に対し抵抗性を有するが、該移植細胞、移植組織または移植臓器が産生するＰＥＲＶはヒト血清に対し抵抗性を有さないＤＡＦなどの補体制御因子発現遺伝子を創製することを目的とする。さらに、本発明は、前記遺伝子で形質転換したＤＡＦなどの補体制御因子発現ブタ細胞またはＤＡＦなどの補体制御因子発現ブタを創製することを目的とする。
本発明者は上記課題を解決するため、鋭意研究を行った。レトロウイルスなどのウイルスの多くは細胞の膜上に存在する脂肪酸ラフト（raft）を利用して出芽し産生される。そこで脂肪酸ラフトに対する親和性を変化させた改変型ＤＡＦの遺伝子を種々構築し、ブタ血管内皮細胞に導入し、該細胞を形質転換させた。その結果、動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質とＤＡＦまたはその部分蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子を導入したブタ血管内皮細胞は、ヒト血清に対し抵抗性を有するが、該細胞が産生するＰＥＲＶはヒト血清に対して抵抗性を増強しないことを見出した。本発明者はさらに研究を進め、本発明を完成するにいたった。
すなわち、本発明は、
［１］ 動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質と補体制御因子またはその部分蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子、
［２］ 膜貫通ドメイン蛋白質が、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの膜貫通領域であり、該膜貫通領域のアミノ酸配列の少なくとも1個のアミノ酸が連続する少なくとも３個のアラニンで置換されているか、膜貫通領域のアミノ酸配列中に連続する少なくとも３個のアラニンが挿入されていることを特徴とする前記［１］に記載の遺伝子、
［３］ 膜貫通ドメイン蛋白質が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする前記［２］に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号３、４、５または６で表されるアミノ酸配列と同一；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一、
［４］ 補体制御因子が、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、ＭＣＰ（ＣＤ４６）、ＣＤ５９、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ファクターＨ，ファクターＩ、Ｃ４ｂｐ，Ｃ１−１ＮＨ、ＣｒｒｙおよびＨＳＶ−ｇＣｌから選択される少なくとも１の因子であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の遺伝子、
［５］ 補体制御因子が、ＤＡＦ（ＣＤ５５）であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の遺伝子、
［６］ 部分蛋白質がＤＡＦ（ＣＤ５５）の機能ドメインＳＣＲ２およびＳＣＲ３を有することを特徴とする前記５に記載の遺伝子、
［７］ 部分蛋白質が、さらにＤＡＦ（ＣＤ５５）の機能ドメインＳＣＲ４を有することを特徴とする前記［６］に記載の遺伝子、
［８］ 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる前記［１］に記載の遺伝子：
（ａ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ補体制御因子と実質的に同質の活性を有し、動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通部を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［９］ 前記［１］〜［８］のいずれかの遺伝子で形質転換された補体制御因子発現ブタ細胞、および
［１０］ 前記［１］〜［８］のいずれかの遺伝子で形質転換された補体制御因子発現ブタ、
に関する。
［１］ 動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質と補体制御因子またはその部分蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子、
［２］ 膜貫通ドメイン蛋白質が、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの膜貫通領域であり、該膜貫通領域のアミノ酸配列の少なくとも1個のアミノ酸が連続する少なくとも３個のアラニンで置換されているか、膜貫通領域のアミノ酸配列中に連続する少なくとも３個のアラニンが挿入されていることを特徴とする前記［１］に記載の遺伝子、
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（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一、
［４］ 補体制御因子が、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、ＭＣＰ（ＣＤ４６）、ＣＤ５９、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ファクターＨ，ファクターＩ、Ｃ４ｂｐ，Ｃ１−１ＮＨ、ＣｒｒｙおよびＨＳＶ−ｇＣｌから選択される少なくとも１の因子であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の遺伝子、
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［７］ 部分蛋白質が、さらにＤＡＦ（ＣＤ５５）の機能ドメインＳＣＲ４を有することを特徴とする前記［６］に記載の遺伝子、
［８］ 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる前記［１］に記載の遺伝子：
（ａ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ補体制御因子と実質的に同質の活性を有し、動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通部を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［９］ 前記［１］〜［８］のいずれかの遺伝子で形質転換された補体制御因子発現ブタ細胞、および
［１０］ 前記［１］〜［８］のいずれかの遺伝子で形質転換された補体制御因子発現ブタ、
に関する。
本発明に係る融合蛋白質としては、（１）動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質と、ＤＡＦ（ＣＤ５５）との融合蛋白質、（２）動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質と、ＤＡＦ（ＣＤ５５）の部分蛋白質との融合蛋白質が挙げられる。
融合蛋白質としては、例えば図１で表される蛋白質が好ましく挙げられる。図１で表される蛋白質としては、具体的には、例えば配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質などが挙げられる。
融合蛋白質としては、例えば図１で表される蛋白質が好ましく挙げられる。図１で表される蛋白質としては、具体的には、例えば配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質などが挙げられる。
補体制御因子は、細胞性補体制御因子であっても、血清中の補体制御因子であってもよく、またウイルス関連補体制御因子であってもよい。細胞性補体制御因子としては、例えば、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、ＭＣＰ（Membran-Cofactor-Protein：ＣＤ４６）、ＣＤ５９またはＣＲ１（Ｃ３ｂレセプター：ＣＤ３５）などのヒト補体制御因子が挙げられる。これらはヒトの補体制御因子に限定されない。例えばマウス特有の補体制御因子Ｃｒｒｙ（Complement receptor 1-related gene/protein y）などであってもよく、上記ヒト補体制御因子と類似するヒト以外の種の補体制御因子であってもよい。血清中の補体制御因子としては、例えばＦａｃｔｏｒＨ、ＦａｃｔｏｒＩ、Ｃ４ｂｐまたはＣ１−１ＮＨ（C1 Inhibitor）などが挙げられる。ウイルス関連補体制御因子としては、例えばＨＳＶ−ｇＣｌ(Herpes Simplex Virus type 1 glycoproteins gCl )などが挙げられる。これらのなかでもＤＡＦ（ＣＤ５５）、ＭＣＰ（ＣＤ４６）がより好ましく、ＤＡＦ（ＣＤ５５）がとりわけ好ましい。
ＤＡＦ（ＣＤ５５；以下、単にＤＡＦと略記する。）は、ヒト赤血球から分離された分子量約６５〜７５ｋＤａの膜蛋白質で、４個のＳＣＲ（short consensus repeat；ＳＣＲ１、ＳＣＲ２、ＳＣＲ３、ＳＣＲ４）機能ドメイン、Ｏ−結合型糖類の付加部位（O-glycosylation site）を有するセリン（Ｓ）とスレオニン（Ｔ）に富むＳＴドメイン、およびＧＰＩ（glycosylphosphatidylinositol）−アンカーを含む。
ＤＡＦは、ＣＤ５５抗原ともいい、Ｃ４ｂＣ２ａ、Ｃ３ｂＢｂなどの２分子集合体のＣ３コンベルターゼを可逆的に解離してＣ３コンベルターゼの形成を阻害して補体の活性化を抑制できる。このため、例えばヒトに移植されたブタ臓器のブタ血管内皮細胞はヒトに存在する自然抗体に認識され、次いでその自然抗体がブタの血管内皮細胞に結合すると、ヒト補体が活性化され、最終的にブタ内皮細胞は拒絶反応により溶解または壊死する。しかし、ＤＡＦを発現するブタ臓器が移植された場合、ＤＡＦはヒト補体の働きを特異的に抑制できるので、ヒトにおいてブタ臓器の拒絶反応を抑制できる。
ＤＡＦは、ＣＤ５５抗原ともいい、Ｃ４ｂＣ２ａ、Ｃ３ｂＢｂなどの２分子集合体のＣ３コンベルターゼを可逆的に解離してＣ３コンベルターゼの形成を阻害して補体の活性化を抑制できる。このため、例えばヒトに移植されたブタ臓器のブタ血管内皮細胞はヒトに存在する自然抗体に認識され、次いでその自然抗体がブタの血管内皮細胞に結合すると、ヒト補体が活性化され、最終的にブタ内皮細胞は拒絶反応により溶解または壊死する。しかし、ＤＡＦを発現するブタ臓器が移植された場合、ＤＡＦはヒト補体の働きを特異的に抑制できるので、ヒトにおいてブタ臓器の拒絶反応を抑制できる。
ＤＡＦには、ＤＡＦと実質的に同じ作用を有する限り、ＤＡＦのアミノ酸配列中の１若しくは複数個（例えば、約２〜２０個、好ましくは約２〜１０個；以下同様である。）のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよく、また糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法などの周知の技術的手段により、または天然に生じうる程度の数（１〜複数個）が、欠失、置換若しくは付加などされていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加したＤＡＦとしては、例えば天然のＤＡＦに付加している糖鎖を酵素などで処理し糖鎖を欠損させたＤＡＦ、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたものなどが挙げられる。
さらに、ＤＡＦのアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつＤＡＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質も本発明に係るＤＡＦに含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
さらに、ＤＡＦのアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつＤＡＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質も本発明に係るＤＡＦに含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
ＤＡＦの具体例としては、例えばGeneBank/EMBL/DDBJなどでアクセッション番号（Accession No.）が付けられ登録されているＤＡＦが挙げられ、例えばアクセッション番号ＮＭ＿０００５７４などが挙げられるが、これに限定されない。
ＤＡＦと実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、例えばＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）などによる相同性検索などにより、ＤＡＦのアミノ酸配列と相同性が高いアミノ酸配列を有する蛋白質であって、かつＤＡＦ活性を有する蛋白質などが挙げられる。例えばアクセッション番号ＮＭ＿０００５７４で登録されているアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、アクセッション番号ＮＭ＿０００５７４で登録されているアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であって、ＤＡＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質、例えばアクセッション番号ＮＭ＿０００５７４で登録されているアミノ酸配列から、１〜複数個のアミノ酸残基を挿入または欠失させたアミノ酸配列、１〜複数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列または１〜複数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列などを含む蛋白質であって、ＤＡＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質が挙げられる。
ＤＡＦの部分蛋白質は、ＤＡＦを構成するアミノ酸配列の部分配列を有する蛋白質であり、ＤＡＦと実質的に同質の活性を有すればよい。ＤＡＦの部分蛋白質としては、ＳＣＲ機能ドメインを有することが好ましい。ＤＡＦの部分蛋白質を構成するＳＣＲ機能ドメインは、例えば機能ドメインＳＣＲ１の除去はＤＡＦ機能に影響を与えないこと、ＳＣＲ２とＳＣＲ３の両機能ドメインの欠如、および機能ドメインＳＣＲ４、特にＳＣＲ４のアミノ酸配列のうち、Ｎ末側のアミノ酸配列の欠如はＤＡＦ機能を無くすことが報告されているので（Ｊ． Immunology, Vol149, 2906-2913(1992)）、少なくとも機能ドメインＳＣＲ２およびＳＣＲ３を有することが好ましく、さらに、機能ドメインＳＣＲ４を有することが好ましい。前記機能ドメインＳＣＲ４は該ＳＣＲ機能ドメインのアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から約１９０〜２２６位までのアミノ酸配列を含んでいればよい。さらにＤＡＦの部分蛋白質は、ＳＣＲ機能ドメインのＣ末側にセリンおよびトレオニンに富むＳＴドメインを有することが好ましい。また、該部分蛋白質は、機能ドメインＳＣＲ２のＮ末側にＤＡＦのシグナルペプチドを有することが好ましい。
「脂肪酸ラフト」は、動物細胞膜に存在して例えばスフィンゴ脂質やコレステロールに富む膜ドメインで、その機能としては、例えば細胞のシグナル伝達や膜輸送などが挙げられる。またウイルスは、脂肪酸ラフトを利用して増殖し得る。このため、ＤＡＦは、脂肪酸ラフトと親和性を有さない膜貫通ドメイン蛋白質を有するＤＡＦか、脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質を有するＤＡＦが好ましい。そして、このようなＤＡＦをドナーとなる異種動物に発現させることが好ましい。
異種動物としては、レシピエントとなる動物（例えばヒトなど）と異なる種に属する動物が挙げられ、レシピエントがヒトの場合、哺乳動物が好ましい。哺乳動物は、特に制限されないが、臓器の大きさ、生産性などからブタがとりわけ好ましい。
本発明において、「親和性」としては、膜貫通ドメイン蛋白質が脂肪酸ラフトと容易に結合（例えば、イオン結合、水素結合、共有結合など）する性質や傾向が挙げられ、「親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質」としては、脂肪酸ラフトと全く結合しない膜貫通ドメイン蛋白質、脂肪酸ラフトと容易に結合しない膜貫通ドメイン蛋白質、または脂肪酸ラフトと結合しても容易にはずれる膜貫通ドメイン蛋白質などが挙げられる。「膜貫通ドメイン蛋白質」としては、細胞膜を貫通または通過する機能を有する蛋白質が挙げられ、このような機能を有する蛋白質であれば特に制限されない。前記細胞膜としては、本発明の遺伝子で形質転換されるドナーの細胞の細胞膜、例えばブタ血管内皮細胞の細胞膜などが挙げられる。「脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質」としては、例えばヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの膜貫通ドメイン蛋白質であり、該膜貫通ドメイン蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも1個のアミノ酸が連続する少なくとも３個のアラニンで置換されているか、膜貫通ドメイン蛋白質のアミノ酸配列中に連続する少なくとも３個のアラニンが挿入されているアミノ酸配列を有する蛋白質などが挙げられる。またトランスフェリンレセプターの膜貫通ドメイン蛋白質のアミノ酸配列なども挙げられる。
ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの膜貫通ドメイン蛋白質としては、例えばinfluenza A virus(A/Udorn/72 (H3N2))のヘマグルチニンやinfluenza A virus(A/ Beijing/353/89 (H3N2))のヘマグルチニン(ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＡＡＢ５８２９７)のアミノ酸配列のうち第５３０番目〜第５６０番目のアミノ酸配列（WILWISFAISCFL LCVVLLGFIMWACQKGNI；配列番号１）、influenza A virus(A/Udorn/302/1972 (H3N2))のヘマグルチニン(ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＡＡＡ４３０９９)やinfluenza A virus (A/Hong Kong/46/71 (H3N2))のヘマグルチニン(ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＡＢＢ８２２２７)のアミノ酸配列のうち第５３０番目〜第５５７番目のアミノ酸配列（WILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQR；配列番号２）などが好ましく挙げられる。
膜貫通ドメイン蛋白質において、連続する少なくとも３個のアラニンの置換または挿入の位置は特に限定されないが、前記膜貫通ドメイン蛋白質のアミノ酸配列のＮ末端から約１０番目のアミノ酸までの位置が好ましい。脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質の具体例としては、例えば表１で表されるアミノ酸配列などが好ましく挙げられる。アミノ酸配列における各残基のアミノ酸の名称は1文字略記法に従った（以下、同様。）。
動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質は、ＤＡＦまたはその部分蛋白質のＣ末側に融合されることが好ましい。
膜貫通ドメイン蛋白質と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質は、膜貫通ドメイン蛋白質と実質的に同じ作用を有する限り、膜貫通ドメイン蛋白質のアミノ酸配列中の１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。膜貫通ドメイン蛋白質と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、例えばＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）などによる相同性検索などにより、膜貫通ドメイン蛋白質のアミノ酸配列と相同性が高いアミノ酸配列を有する蛋白質であって、かつ膜貫通機能を有する蛋白質などが挙げられる。例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であって、膜貫通機能を有する蛋白質が挙げられる。
前記融合蛋白質をコードする遺伝子としては、ＤＡＦをコードするＤＮＡまたはＤＡＦと実質的に同質の活性を有しＤＡＦの部分蛋白質をコードするＤＮＡと、動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質を発現し得るＤＮＡが挙げられる。融合蛋白質をコードする遺伝子としては、例えば図１で示される融合蛋白質をコードする遺伝子などが挙げられる。図１で示される融合蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡとしては、例えば配列番号７で表されるＤＮＡなどが好ましく挙げられる。図１で示されるＳＰ（シグナルペプチド）をコードするｃＤＮＡとしては、例えば配列番号７の第１３位〜１１４位で表される塩基配列（配列番号９）が挙げられる。図１で示されるＳＣＲ２、ＳＣＲ３およびＳＣＲ４の機能ドメインをコードするｃＤＮＡとしては、例えば配列番号７の第１１５位〜６８１位で表される塩基配列（配列番号１０）が挙げられる。図１で示されるＳ／Ｔ（ＳＴドメイン蛋白質）をコードするｃＤＮＡとしては、例えば配列番号７の第６８２位〜８８８位で表される塩基配列（配列番号１１）が挙げられる。図１で示されるＴＭ（脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質）をコードするｃＤＮＡとしては、例えば配列番号７の第８８９位〜９７５位で表される塩基配列が挙げられる。
融合蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡは、融合蛋白質をコードする遺伝子の開始コドンの上流にコザック配列（Ｋｏｚａｋ配列；５’−ＧＣＣＡＣＣ）を有することが好ましい。コザック配列を有することにより、真核生物で融合蛋白質をコードするｍＲＮＡが効率よく翻訳され得る。また、融合蛋白質をコードする遺伝子の開始コドン（または前記コザック配列）の上流および停止コドンの下流には、制限酵素認識配列を有することが好ましい。制限酵素としては、特に制限はないが、例えばＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩまたはＸｈｏＩなどが好ましく挙げられる。
また、融合蛋白質をコードする遺伝子と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＡＦと実質的に同質の活性を有し、動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通部を有する蛋白質をコードするＤＮＡも本発明に係る遺伝子として好ましい。前記遺伝子と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば上記遺伝子の部分配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡが挙げられる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
前記遺伝子と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、例えばＤＤＢＪなどによる相同性検索などにより、前記遺伝子と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡであって、かつＤＡＦ活性を有し、動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通部を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning，A laboratory Manual， Third Edition（J．Sambrook et al．，Cold Spring Harbor Lab．Press，2001：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
さらに、本発明に使用されるＤＮＡは上記に限定されず、発現する蛋白質がＤＡＦと実質的に同じ活性を有し、動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通部を有する蛋白質をコードするＤＮＡである限り、前記融合蛋白質をコードする遺伝子として使用できる。
ＤＡＦをコードするＤＮＡまたは膜貫通ドメイン蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば通常のハイブリダイゼーション法やＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法などにより容易に得ることができ、該ＤＮＡの取得は具体的には例えば前記モレキュラー・クローニング第３版などの基本書などを参考にして行うことができる。
なお、本発明で用いられるＤＡＦまたは膜貫通ドメイン蛋白質をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞もしくは組織由来のｃＤＮＡライブラリーまたは合成ＤＮＡなどが好ましく挙げられる。前記ライブラリーを調製するゲノムＤＮＡ断片がクローニングされるベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、コスミドまたはファージミドなどが挙げられる。
また、本発明に係るＤＮＡには、逆転写酵素によりＤＡＦまたは膜貫通ドメイン蛋白質を発現することができるものであれば、ＤＡＦまたは膜貫通ドメイン蛋白質をコードするＲＮＡも含まれる。該ＲＮＡとしては、例えば細胞または組織よりｍＲＮＡ画分を公知の手段により調製して、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅したＲＮＡなどが挙げられる。
また、本発明に係るＤＮＡには、逆転写酵素によりＤＡＦまたは膜貫通ドメイン蛋白質を発現することができるものであれば、ＤＡＦまたは膜貫通ドメイン蛋白質をコードするＲＮＡも含まれる。該ＲＮＡとしては、例えば細胞または組織よりｍＲＮＡ画分を公知の手段により調製して、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅したＲＮＡなどが挙げられる。
本発明のＤＡＦ発現ドナー（例えば、ブタ）細胞は、上記融合蛋白質をコードする遺伝子を用いてドナー細胞を形質転換し、それらの遺伝子を過剰発現させることによって調製することができる。ドナー細胞としては、ヒトに異種移植可能な全てのドナーの臓器や組織の細胞が挙げられ、好ましい細胞としては、例えば、血管内皮細胞、膵島細胞、胎児膵島様細胞、膵内分泌細胞、膵臓幹細胞、肝細胞、脳細胞または骨髄細胞などが挙げられる。ドナー細胞を形質転換するために導入方法や導入条件などは公知の至適条件を選択することができる。ドナー細胞を形質転換するための導入方法や導入条件などは公知の至適条件を選択することができる。
また、上記融合蛋白質をコードする遺伝子を例えばブタの受精卵の前核にマイクロインジェクション法などの慣用の方法で導入してＤＡＦ発現ブタ（形質転換ブタ）を作製できる。これらの形質転換ブタ細胞または形質転換ブタを作製する方法としては、例えば、特開平１１−２３９４３０号公報、特開２００２−２９１３７２号公報、特開２００４−３５７５１４号公報などに記載の公知の至適条件を適宜選択することができる。このように形質転換したドナーの臓器は、レシピエント（ヒト）の移植用臓器として使用し得る。移植用臓器としては、ヒトに異種移植可能な全てのドナーの臓器や組織が挙げられ、好ましい臓器としては、例えば、血管、肝臓、腎臓、膵臓、肺、腸、心臓、皮膚、半月版または腱などが挙げられる。
また、上記融合蛋白質をコードする遺伝子を例えばブタの受精卵の前核にマイクロインジェクション法などの慣用の方法で導入してＤＡＦ発現ブタ（形質転換ブタ）を作製できる。これらの形質転換ブタ細胞または形質転換ブタを作製する方法としては、例えば、特開平１１−２３９４３０号公報、特開２００２−２９１３７２号公報、特開２００４−３５７５１４号公報などに記載の公知の至適条件を適宜選択することができる。このように形質転換したドナーの臓器は、レシピエント（ヒト）の移植用臓器として使用し得る。移植用臓器としては、ヒトに異種移植可能な全てのドナーの臓器や組織が挙げられ、好ましい臓器としては、例えば、血管、肝臓、腎臓、膵臓、肺、腸、心臓、皮膚、半月版または腱などが挙げられる。
本発明に係る動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質とＤＡＦまたはその部分蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡは、該遺伝子を導入されたドナー細胞またはドナーにおいてＤＡＦを発現し得る。また該遺伝子を発現したドナー細胞またはドナーから摘出した臓器は、レシピエント（ヒト）において、拒絶反応を回避できるので、異種移植用の細胞または臓器となり得る。さらに、該遺伝子を発現したドナー細胞またはドナーから摘出した臓器がＰＥＲＶを産生したとしても、レシピエント（ヒト）の血清に対して抵抗性を有さないか、抵抗性を有しても抵抗性が非常に低いため、該遺伝子を発現したドナー細胞またはドナーから摘出した臓器を移植されるレシピエント（ヒト）へのＰＥＲＶ感染の可能性を排除または抑制できる。
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において各略号の意味は、次のとおりである。
ＰＩ：フォスファチジルイノシトール
ＴＭ：膜貫通ドメイン
ＨＬＡ：ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen）
ＨＡ：ヘマグルチニン
ＣＹＴ：細胞質部分
ＬＤＨ：乳酸脱水素酵素（Lactate Dehydrogenase）
LacZ：大腸菌βガラクトシダーゼ
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
Ｄ−ＰＢＳ：ダルベッコリン酸バッファー
ＮＨＳ：Normal Human Serum
Ｄ−ＭＥＭ：Dulbecco's Modified Eagle Medium
ＦＣＳ：ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）
また、実施例における％は特に明記しない場合は質量％を示す。
ＰＩ：フォスファチジルイノシトール
ＴＭ：膜貫通ドメイン
ＨＬＡ：ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen）
ＨＡ：ヘマグルチニン
ＣＹＴ：細胞質部分
ＬＤＨ：乳酸脱水素酵素（Lactate Dehydrogenase）
LacZ：大腸菌βガラクトシダーゼ
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
Ｄ−ＰＢＳ：ダルベッコリン酸バッファー
ＮＨＳ：Normal Human Serum
Ｄ−ＭＥＭ：Dulbecco's Modified Eagle Medium
ＦＣＳ：ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）
また、実施例における％は特に明記しない場合は質量％を示す。
１．遺伝子発現細胞の調製
（１）ｃＤＮＡの構築
ＤＡＦの部分蛋白質と膜貫通ドメイン蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子を発現するブタ血管内皮細胞の調製
シグナルペプチド（配列番号９）、ＳＣＲ２〜４（配列番号１０）機能ドメインおよびＳＴドメイン（配列番号１１）からなるＤＡＦの部分蛋白質（以下、Delta-SCR1-DAFと略記する。）のＣ末端に以下（ａ）〜（ｄ）の蛋白質：
（ａ）GTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT；配列番号１２（以下、PI-anchorと略記する。）
（ｂ）KQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD；配列番号１３（以下、TM(HLA-G1)と略記する。
（ｃ）WILAAAFAISCFLLCVVLLGFIMWACQR；配列番号３（以下、TM (HA-AAA)と略記する。）
（ｄ）DVVWVIAVIVIAIVVGVAVICVVPYRS；配列番号１４（以下、TM（MCP-delta-CYT）と略記する。）
を融合した蛋白質（図２）をコードする遺伝子を含むｃＤＮＡ:
（i）Delta-SCR1-DAF(PI-anchor)（配列番号１５）；
（ii）Delta-SCR1-DAF(TM(HLA-G1))（配列番号１６）；
（iii）Delta-SCR1-DAF(TM(HA-AAA))（配列番号７）；
（iv）Delta-SCR1-DAF(TM（MCP-delta-CYT）)（配列番号１７）；
を調製した。
PI-anchorは、ホスファチジルイノシトールアンカー膜蛋白質であり、膜の脂質と結合する。TM(HLA-G1)は、ＨＬＡ由来の膜貫通ドメイン蛋白質である。TM（MCP-delta-CYT）は、ＭＣＰの細胞質部分（ＣＹＴ）を欠如させた膜貫通ドメイン蛋白質である。
上記（i）乃至（iv）のｃＤＮＡは、前記各遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）の上流にコザック配列を、さらにその上流に制限酵素（ＥｃｏＲＩ）の認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）を付加し、ＤＡＦの部分蛋白質の停止コドン（ＴＡＧまたはＴＧＡ）の下流に制限酵素（ＫｐｎＩ）の認識配列（ＧＡＧＧＴＡＣＣ）あるいは制限酵素（ＸｈｏＩ）の認識配列（ＣＴＣＧＡＧ）を付加した。
調製した各ｃＤＮＡは、製品プロトコルに従い発現Vector: pCX（ネオマイシン耐性遺伝子が組みこまれている；ジーン（Gene）、1991年、第108巻、ｐ．193-199）に組み込み上記各ｃＤＮＡ挿入プラスミドをそれぞれ調製した。
（１）ｃＤＮＡの構築
ＤＡＦの部分蛋白質と膜貫通ドメイン蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子を発現するブタ血管内皮細胞の調製
シグナルペプチド（配列番号９）、ＳＣＲ２〜４（配列番号１０）機能ドメインおよびＳＴドメイン（配列番号１１）からなるＤＡＦの部分蛋白質（以下、Delta-SCR1-DAFと略記する。）のＣ末端に以下（ａ）〜（ｄ）の蛋白質：
（ａ）GTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT；配列番号１２（以下、PI-anchorと略記する。）
（ｂ）KQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD；配列番号１３（以下、TM(HLA-G1)と略記する。
（ｃ）WILAAAFAISCFLLCVVLLGFIMWACQR；配列番号３（以下、TM (HA-AAA)と略記する。）
（ｄ）DVVWVIAVIVIAIVVGVAVICVVPYRS；配列番号１４（以下、TM（MCP-delta-CYT）と略記する。）
を融合した蛋白質（図２）をコードする遺伝子を含むｃＤＮＡ:
（i）Delta-SCR1-DAF(PI-anchor)（配列番号１５）；
（ii）Delta-SCR1-DAF(TM(HLA-G1))（配列番号１６）；
（iii）Delta-SCR1-DAF(TM(HA-AAA))（配列番号７）；
（iv）Delta-SCR1-DAF(TM（MCP-delta-CYT）)（配列番号１７）；
を調製した。
PI-anchorは、ホスファチジルイノシトールアンカー膜蛋白質であり、膜の脂質と結合する。TM(HLA-G1)は、ＨＬＡ由来の膜貫通ドメイン蛋白質である。TM（MCP-delta-CYT）は、ＭＣＰの細胞質部分（ＣＹＴ）を欠如させた膜貫通ドメイン蛋白質である。
上記（i）乃至（iv）のｃＤＮＡは、前記各遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）の上流にコザック配列を、さらにその上流に制限酵素（ＥｃｏＲＩ）の認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）を付加し、ＤＡＦの部分蛋白質の停止コドン（ＴＡＧまたはＴＧＡ）の下流に制限酵素（ＫｐｎＩ）の認識配列（ＧＡＧＧＴＡＣＣ）あるいは制限酵素（ＸｈｏＩ）の認識配列（ＣＴＣＧＡＧ）を付加した。
調製した各ｃＤＮＡは、製品プロトコルに従い発現Vector: pCX（ネオマイシン耐性遺伝子が組みこまれている；ジーン（Gene）、1991年、第108巻、ｐ．193-199）に組み込み上記各ｃＤＮＡ挿入プラスミドをそれぞれ調製した。
（２）LacZ遺伝子が導入されたブタ血管内皮細胞への誘導蛋白質をコードするｃＤＮＡの導入
まず、LacZ遺伝子導入ブタ血管内皮細胞（ＢＢＲＣ、２００３年、第３１０巻、ｐ．３２７）５×１０5個を直径１０ｃｍの培養皿に蒔き、一晩培養した。
次いで、上記（１）で調製された各プラスミド４μｇとＤ−ＭＥＭ（ＦＣＳ−）３７５μＬとPLUS Reagent １０μＬとのｃＤＮＡ混合溶液と、リポフェクトアミン１５μＬとＤ−ＭＥＭ（ＦＣＳ−）３７５μＬとを混合したリポフェクトアミン溶液とをクリーンベンチの中でピペッティングより混合した。この混合液を１５〜３０分間、室温で放置し、形質転換用ｃＤＮＡ溶液とした。次に、一晩培養したLacZ遺伝子導入ブタ血管内皮細胞の入った培養皿をＤ−ＭＥＭ（ＦＣＳ−）で３回洗浄した。洗浄後のLacZ遺伝子導入ブタ血管内皮細胞の入った培養皿にＯｐｔｉ−ＭＥＭＲＩまたはＤ−ＭＥＭ（ＦＣＳ−）を５ｍＬ入れ、さらに上記の形質転換用ｃＤＮＡ溶液を、ピペットを用いて添加した。３７℃で、５％ＣＯ２存在下、５時間培養した。次いで培養した培養皿の培養液を除去し、培養皿に１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭを入れ、３７℃で、５％ＣＯ２存在下に培養した。翌日培養した細胞を２〜３枚の培養皿に分割し、さらに培養した。分割後４８時間経ってから、ゲネチシンを１０〜１３μｇ／１０ｃｍ培養皿となるよう添加した選択培地に交換した。細胞の状態を見ながらネオマイシン耐性細胞の選択の期間を決めた。凡そ、４〜６日で細胞がほとんど死んだところで選択をやめ、完全培地に戻した。
選択の済んだブタ血管内皮細胞に抗体（１Ｃ６；和光純薬工業株式会社製）を反応させ、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting；フローサイトメトリー）でその発現量を判定した。なお、コントロールとして、無処置のブタ内皮細胞（野生型細胞）と、ブタ血管内皮細胞に空プラスミド（Ｍｏｃｋ）をトランスフェクションした細胞（Ｍｏｃｋ細胞）を用いた。
ＦＡＣＳの結果を図３に示す。
まず、LacZ遺伝子導入ブタ血管内皮細胞（ＢＢＲＣ、２００３年、第３１０巻、ｐ．３２７）５×１０5個を直径１０ｃｍの培養皿に蒔き、一晩培養した。
次いで、上記（１）で調製された各プラスミド４μｇとＤ−ＭＥＭ（ＦＣＳ−）３７５μＬとPLUS Reagent １０μＬとのｃＤＮＡ混合溶液と、リポフェクトアミン１５μＬとＤ−ＭＥＭ（ＦＣＳ−）３７５μＬとを混合したリポフェクトアミン溶液とをクリーンベンチの中でピペッティングより混合した。この混合液を１５〜３０分間、室温で放置し、形質転換用ｃＤＮＡ溶液とした。次に、一晩培養したLacZ遺伝子導入ブタ血管内皮細胞の入った培養皿をＤ−ＭＥＭ（ＦＣＳ−）で３回洗浄した。洗浄後のLacZ遺伝子導入ブタ血管内皮細胞の入った培養皿にＯｐｔｉ−ＭＥＭＲＩまたはＤ−ＭＥＭ（ＦＣＳ−）を５ｍＬ入れ、さらに上記の形質転換用ｃＤＮＡ溶液を、ピペットを用いて添加した。３７℃で、５％ＣＯ２存在下、５時間培養した。次いで培養した培養皿の培養液を除去し、培養皿に１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭを入れ、３７℃で、５％ＣＯ２存在下に培養した。翌日培養した細胞を２〜３枚の培養皿に分割し、さらに培養した。分割後４８時間経ってから、ゲネチシンを１０〜１３μｇ／１０ｃｍ培養皿となるよう添加した選択培地に交換した。細胞の状態を見ながらネオマイシン耐性細胞の選択の期間を決めた。凡そ、４〜６日で細胞がほとんど死んだところで選択をやめ、完全培地に戻した。
選択の済んだブタ血管内皮細胞に抗体（１Ｃ６；和光純薬工業株式会社製）を反応させ、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting；フローサイトメトリー）でその発現量を判定した。なお、コントロールとして、無処置のブタ内皮細胞（野生型細胞）と、ブタ血管内皮細胞に空プラスミド（Ｍｏｃｋ）をトランスフェクションした細胞（Ｍｏｃｋ細胞）を用いた。
ＦＡＣＳの結果を図３に示す。
２．ＬＤＨアッセイ
上記1．（３）で調製したDelta-SCR1-DAF(PI-anchor)、Delta-SCR1-DAF(TM(HLA-G1))、Delta-SCR1-DAF(TM(HA-AAA))、またはDelta-SCR1-DAF(TM（MCP-delta-CYT）)遺伝子を含むｃＤＮＡ挿入プラスミドが導入されたLacZ遺伝子導入ブタ血管内皮細胞１〜２×１０4個を、９６穴のマイクロカルチャープレートに分注し、１５時間培養した細胞を使用した。前記培養した細胞の生存を確認し、細胞をＤ−ＰＢＳまたはＰＢＳで洗浄後、１０％または２０％のＮＨＳを５０μＬ加えた。ＮＨＳを添加した細胞を、３７℃で２時間培養した。その後、１０００ｒｐｍで１分間、遠心分離した。
遠心分離後の上清をＬＤＨアッセイに付した。ＬＤＨアッセイは、微量毒性試験用試薬ＭＴＸ−ＬＤＨキット（極東製薬工業株式会社製）を用い、製品プロトコルに従い測定した。すなわち、培養液をあらかじめ１５μＬ分注した９６穴のマイクロカルチャープレートに、前記遠心分離したＮＨＳ添加細胞培養液の上清を１０μＬ添加し、基質発色試薬２５μＬを添加した。Tuple mixerで1分間振とう後、３７℃で、１０〜１５分間反応させた。反応停止液５０μＬを添加した後、Tuple mixerで1分間振とうした。振とう後すぐに、波長５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。超音波で細胞を破壊して測定したときの吸光度から算出されるＬＤＨ量を細胞障害性１００％（細胞死１００％）とした。
上記1．（３）で調製したDelta-SCR1-DAF(PI-anchor)、Delta-SCR1-DAF(TM(HLA-G1))、Delta-SCR1-DAF(TM(HA-AAA))、またはDelta-SCR1-DAF(TM（MCP-delta-CYT）)遺伝子を含むｃＤＮＡ挿入プラスミドが導入されたLacZ遺伝子導入ブタ血管内皮細胞１〜２×１０4個を、９６穴のマイクロカルチャープレートに分注し、１５時間培養した細胞を使用した。前記培養した細胞の生存を確認し、細胞をＤ−ＰＢＳまたはＰＢＳで洗浄後、１０％または２０％のＮＨＳを５０μＬ加えた。ＮＨＳを添加した細胞を、３７℃で２時間培養した。その後、１０００ｒｐｍで１分間、遠心分離した。
遠心分離後の上清をＬＤＨアッセイに付した。ＬＤＨアッセイは、微量毒性試験用試薬ＭＴＸ−ＬＤＨキット（極東製薬工業株式会社製）を用い、製品プロトコルに従い測定した。すなわち、培養液をあらかじめ１５μＬ分注した９６穴のマイクロカルチャープレートに、前記遠心分離したＮＨＳ添加細胞培養液の上清を１０μＬ添加し、基質発色試薬２５μＬを添加した。Tuple mixerで1分間振とう後、３７℃で、１０〜１５分間反応させた。反応停止液５０μＬを添加した後、Tuple mixerで1分間振とうした。振とう後すぐに、波長５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。超音波で細胞を破壊して測定したときの吸光度から算出されるＬＤＨ量を細胞障害性１００％（細胞死１００％）とした。
ＬＤＨアッセイの結果を表２に示した
ブタ血管内皮細胞にヒト血清をかけ、抗体・補体の反応により障害を受けたブタ血管内皮細胞から放出されるＬＤＨの量で細胞障害性が判定できる。Delta-SCR1-DAF(PI-anchor)およびDelta-SCR1-DAF(TM(HA-AAA))遺伝子を導入したブタ血管内皮細胞では細胞障害性が非常に低いことが判明した。
すなわち、本結果は、ドナーとしてＤＡＦ遺伝子を導入したブタ血管内皮細胞をレシピエント（ヒト）に移植すると、その発現量と一定の相関をもってレシピエント（ヒト）において抗体・補体による拒絶反応を起こし難いことを示している。
すなわち、本結果は、ドナーとしてＤＡＦ遺伝子を導入したブタ血管内皮細胞をレシピエント（ヒト）に移植すると、その発現量と一定の相関をもってレシピエント（ヒト）において抗体・補体による拒絶反応を起こし難いことを示している。
３．LacZアッセイ
ほぼコンフルエントの状態の上記1．（３）で調製したDelta-SCR1-DAF(PI-anchor)、Delta-SCR1-DAF(TM(HLA-G1))、Delta-SCR1-DAF(TM(HA-AAA))、またはDelta-SCR1-DAF(TM（MCP-delta-CYT）)遺伝子を含むｃＤＮＡ挿入プラスミドが導入されたLacZ遺伝子導入ブタ血管内皮細胞の上清を捨て、培養液を交換し、２４時間培養した。２４時間培養後、それら細胞の培養上清を０．８μｍフィルターに通し、上清をフィルター滅菌した。８ｍｇ／ｍＬとなるようＰＢＳまたはストック培養液に溶解したPolybrane溶液を、前記フィルター滅菌済みの各上清にPolybrane８μｇ／ｍＬの濃度となるように各々添加し、Polybrane溶液添加フィルター滅菌済み溶液をそれぞれ調製した。
ヒト胎児腎細胞（２９３細胞）を、２４穴のマイクロカルチャープレートに、２×１０5個/well(５００μＬ/well)の濃度で播いた。３７℃にて一晩培養後、２９３細胞の上清を吸い取って、上記Polybrane溶液添加フィルター滅菌済み溶液を５００μＬ加え、４〜８時間培養した。次いでPolybrane溶液添加フィルター滅菌済み上清を吸い取って新鮮培養液を７５０μＬ加え、３７℃で２日間培養した。２日間培養後、培養液に２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳを培養液と等量加えた。１５分間室温で静置後、培養液を吸い取り、細胞をＰＢＳで一度洗った。X-gal溶液を１３０μＬ加えて１〜２時間培養した。顕微鏡下でtiterを数えた。
なお、コントロールとして、無処置のブタ内皮細胞（野生型細胞）と、ブタ血管内皮細胞に空プラスミド（Ｍｏｃｋ）をトランスフェクションした細胞（Ｍｏｃｋ細胞）を用いた。
ほぼコンフルエントの状態の上記1．（３）で調製したDelta-SCR1-DAF(PI-anchor)、Delta-SCR1-DAF(TM(HLA-G1))、Delta-SCR1-DAF(TM(HA-AAA))、またはDelta-SCR1-DAF(TM（MCP-delta-CYT）)遺伝子を含むｃＤＮＡ挿入プラスミドが導入されたLacZ遺伝子導入ブタ血管内皮細胞の上清を捨て、培養液を交換し、２４時間培養した。２４時間培養後、それら細胞の培養上清を０．８μｍフィルターに通し、上清をフィルター滅菌した。８ｍｇ／ｍＬとなるようＰＢＳまたはストック培養液に溶解したPolybrane溶液を、前記フィルター滅菌済みの各上清にPolybrane８μｇ／ｍＬの濃度となるように各々添加し、Polybrane溶液添加フィルター滅菌済み溶液をそれぞれ調製した。
ヒト胎児腎細胞（２９３細胞）を、２４穴のマイクロカルチャープレートに、２×１０5個/well(５００μＬ/well)の濃度で播いた。３７℃にて一晩培養後、２９３細胞の上清を吸い取って、上記Polybrane溶液添加フィルター滅菌済み溶液を５００μＬ加え、４〜８時間培養した。次いでPolybrane溶液添加フィルター滅菌済み上清を吸い取って新鮮培養液を７５０μＬ加え、３７℃で２日間培養した。２日間培養後、培養液に２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳを培養液と等量加えた。１５分間室温で静置後、培養液を吸い取り、細胞をＰＢＳで一度洗った。X-gal溶液を１３０μＬ加えて１〜２時間培養した。顕微鏡下でtiterを数えた。
なお、コントロールとして、無処置のブタ内皮細胞（野生型細胞）と、ブタ血管内皮細胞に空プラスミド（Ｍｏｃｋ）をトランスフェクションした細胞（Ｍｏｃｋ細胞）を用いた。
結果を表３に示した。
ブタ血管内皮細胞からは、レトロウイルスが培養液中に放出される。この培養液を２９３細胞に作用させ、一定時間後にレトロウイルスに感染した２９３細胞の数をX-gal染色で確認したものである。Delta-SCR1-DAF(PI-anchor)遺伝子を導入したブタ血管内皮細胞から放出されるＰＥＲＶの場合、ヒト血清と反応させた後も反応前の５１．７％のヒト２９３細胞への感染率を保っており、ＰＥＲＶの膜上にＤＡＦが有効に発現し補体の攻撃を抑制していることが考えられる。一方、Delta-SCR1-DAF(TM(HA-AAA))遺伝子を導入したブタ血管内皮細胞からでるＰＥＲＶでは、ヒト血清との反応で反応前の２０．６％まで感染率が低下しており、ＰＥＲＶ膜上にうまくＤＡＦが発現していないことが考えられる。
すなわち、Delta-SCR1-DAF(TM(HA-AAA))遺伝子を導入したブタ血管内皮細胞をドナーとしてレシピエント（ヒト）に移植すると、レシピエント（ヒト）において抗体・補体による拒絶反応を起こし難く、かつＰＥＲＶ感染の可能性も非常に低いことを示している。
すなわち、Delta-SCR1-DAF(TM(HA-AAA))遺伝子を導入したブタ血管内皮細胞をドナーとしてレシピエント（ヒト）に移植すると、レシピエント（ヒト）において抗体・補体による拒絶反応を起こし難く、かつＰＥＲＶ感染の可能性も非常に低いことを示している。
本発明に係る遺伝子は異種移植用の異種動物細胞または異種臓器の製造に有用である。
Claims (9)
- レシピエントへのブタレトロウイルス感染率が低減された異種移植用補体制御因子発現ブタ細胞製造のための遺伝子であって、
動物細胞膜上に存在する脂肪酸ラフトと親和性を有さないか脂肪酸ラフトとの親和性が抑制された膜貫通ドメイン蛋白質と補体制御因子またはその部分蛋白質との融合蛋白質をコードし、膜貫通ドメイン蛋白質がヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの膜貫通領域であり、該膜貫通領域のアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が連続する少なくとも３個のアラニンで置換されているか、膜貫通領域のアミノ酸配列中に連続する少なくとも３個のアラニンが挿入されており、配列番号３、４、５または６で表されるアミノ酸配列からなるものであることを特徴とする遺伝子。 - 補体制御因子が、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、ＭＣＰ（ＣＤ４６）、ＣＤ５９、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ファクターＨ，ファクターＩ、Ｃ４ｂｐ，Ｃ１−１ＮＨ、ＣｒｒｙおよびＨＳＶ−ｇＣｌから選択される少なくとも１の因子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
- 補体制御因子が、ＤＡＦ（ＣＤ５５）であることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子。
- 部分蛋白質がＤＡＦ（ＣＤ５５）の機能ドメインＳＣＲ２およびＳＣＲ３を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子。
- 部分蛋白質が、さらにＤＡＦ（ＣＤ５５）の機能ドメインＳＣＲ４を有することを特徴とする請求項４に記載の遺伝子。
- 配列番号７で表される塩基配列のＤＮＡからなる請求項１に記載の遺伝子：
- 請求項１〜６のいずれかの遺伝子で形質転換された補体制御因子発現ブタ細胞。
- 請求項１〜６のいずれかの遺伝子で形質転換された補体制御因子発現ブタ。
- レシピエントへのブタレトロウイルス感染率が低減された異種移植用補体制御因子発現ブタ細胞の製造方法であって、請求項１〜６のいずれかの遺伝子でブタ細胞を形質転換する工程を含むことを特徴とする製造方法。
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