JPH10313865A

JPH10313865A - ヒト補体制御因子が呈示されたベクター

Info

Publication number: JPH10313865A
Application number: JP9125965A
Authority: JP
Inventors: Katsuhisa Ito; 克久伊藤; Tsuneaki Sakata; 恒昭坂田; Mamoru Hasegawa; 護長谷川
Original assignee: Deinabetsuku Kenkyusho Kk
Current assignee: Deinabetsuku Kenkyusho Kk
Priority date: 1997-05-15
Filing date: 1997-05-15
Publication date: 1998-12-02

Abstract

(57)【要約】【課題】局所的なヒト補体の機能の抑制が可能であ
り、従来の確立したベクター生産系に適用でき、かつ、
直接「in vivo」で頻回投与可能なウイルスベクターを
提供することを課題とする。【解決手段】ヒト補体の機能を制御する因子を発現す
るマウスのベクター産生細胞を調製し、該細胞を用いて
レトロウイルスベクターを産生させることにより、表面
にヒト補体の機能を制御する因子を提示したウイルスベ
クターを構築することに成功した。さらに、本発明者ら
は、構築したウイルスベクターが実際にヒト補体の存在
下においても安定であることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト補体に抵抗性
を有するウイルスベクター、および該ベクターの製造方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】レトロウイルスベクターは、現在、遺伝
子治療の分野で最も多く用いられているベクターであ
る。しかし、従来のレトロウイルスベクターは霊長類の
体内で速やかに不活化されることが報告されている（Hu
m Gene Ther 1:15 (1990)）。このため、レトロウイル
スベクターを用いた遺伝子治療のほとんどは、生体外に
標的細胞を取り出し、遺伝子導入を行うという「ex viv
o」法により行われている（蛋白核酸酵素 40:2491
(1995)）。しかし、より簡便に遺伝子治療を行うに
は、直接生体内にベクターを注入し、生体内で遺伝子導
入を行う「in vivo」法が理想である。このためには、
生体内で不活化されないレトロウイルスベクターの開発
が必要である。

【０００３】従来のレトロウイルスベクターが霊長類の
体内で速やかに不活化されることには、補体系が関与し
ていることが報告されている（Hum Gene Ther 1:15 (19
90)）。すなわち、レトロウイルスベクターが補体系の
活性化を引き起し、遺伝子導入能を消失させると考えら
れている。

【０００４】これまでレトロウイルスによる補体系の活
性化はウイルスエンベロープタンパク質(p15E)が補体系
タンパク質のC1qに結合することにより引き起こされる
と考えられていた（J. Exp. Med. 144:970 (1976)）。
しかし、近年になってヒトならびに旧世界ザル以外の動
物種に広く分布するα(1,3)ガラクトシル抗原が補体系
の活性化の主たる要因であることが報告された。即ち、
従来、既存のレトロウイルスベクター作製のためのパッ
ケージング細胞としてマウス由来の細胞が用いられてい
たため、この細胞でパッケージングされたレトロウイル
スベクターの表面にはα(1,3)ガラクトシル基が存在
し、その一方α(1,3)ガラクトシル基に対する自然抗体
がヒト（ならびに旧世界ザル）に存在していたため、従
来のレトロウイルスベクターをヒトに適用した場合にヒ
ト補体系の活性化が引き起されたのである（J ExpMed 1
82: 1345 (1995)）。

【０００５】そこで、レトロウイルスベクターのヒト補
体系による不活化を防ぐ方法の開発が行われ、この結果
これまでに三つの方法が報告された。

【０００６】第一に、可溶型補体阻害分子を投与する方
法である（PCT/US95/08924）。しかし、この方法では補
体阻害活性はベクター上に留まらず、全身で補体系の活
性化が抑制されることが問題になると考えられる。

【０００７】第二に、パッケージング細胞として、マウ
ス由来細胞にかえて、ヒト由来の細胞を用いる方法であ
る（J Virol 68: 8001 (1994), J Virol 69: 7430 (199
5),PCT/US95/10496）。しかし、この方法では、新たに
作製したパッケージング細胞の安全性とベクター生産能
を再評価する必要がある。

【０００８】第三に、マウス由来のパッケージング細胞
により付加されるα(1,3)ガラクトシル基抗原の発現を
抑える方法である。例えば、パッケージング細胞にH-ト
ランスフェラーゼ（H-transferase）を導入することに
よってα(1,3)ガラクトシル基抗原の発現を抑え、これ
によりヒト補体に抵抗性を有するベクターが作製された
旨報告されている（J Exp Med 182: 1345 (1995),PCT/U
S95/08920）。しかし、この方法には、ベクターの頻回
投与によりベクターに対して新たな抗体が生じた場合
に、該抗体による補体系を介したベクターの不活化を避
けることはできないという問題点がある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、局
所的なヒト補体の機能の抑制が可能であり、従来の確立
したベクター生産系に適用でき、かつ、直接「in viv
o」で頻回投与可能なウイルスベクターを提供すること
を課題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を行った結果、ベクター上にヒト補体の機能を制御する
因子が呈示されたウイルスベクターを構築することによ
り、上記課題を解決しうると考えた。即ち、このような
特徴を有するウイルスベクターであれば、局所的にヒト
補体の機能を抑制することが可能であり、また新たに生
じた抗体による不活性化という問題もなく、さらに、安
全性とベクター生産能が保証されているマウスのパッケ
ージング細胞に適用可能であると考えた。そこで、この
ような特性を有するウイルスベクターの構築を試みた。

【００１１】この結果、本発明者らは、レトロウイルス
が宿主由来の細胞膜タンパク質（例えば、補体制御因
子、主要組織適合抗原、接着因子など）を取り込むこと
に鑑み（Virology 205:82 (1994)）、ヒト補体の機能を
制御する因子を発現するマウスのベクター産生細胞を調
製し、該細胞をパッケージング細胞として用いてレトロ
ウイルスベクターを産生させることにより、ベクター上
にヒト補体の機能を制御する因子を提示したウイルスベ
クターを構築することに成功した。さらに、本発明者ら
は、構築したウイルスベクターが実際にヒト補体の存在
下においても安定であることを見出した。

【００１２】即ち、本発明は、ベクター上にヒト補体の
機能を制御する因子を呈示したウイルスベクターに関
し、具体的には、（１）ベクター上にヒト補体の機能
を抑制する因子が呈示されたウイルスベクター、（２）
ヒト補体の機能を抑制する因子が膜結合型である、
（１）記載のウイルスベクター、（３）ヒト補体の機
能を抑制する因子が、DAF（CD55）、MCP（CD46）、CR1
（CD35）、CD59からなる群から選択される、（２）記載
のウイルスベクター、（４）レトロウイルス由来であ
る、（１）記載のウイルスベクター、（５）少なくと
も感染性を有するウイルス粒子の構成に必要なタンパク
質と、膜結合型のヒト補体の機能を抑制する因子とを発
現する細胞、（６）ウイルス粒子がレトロウイルス由
来のものである、（５）記載の細胞、（７）少なくと
も膜結合型のヒト補体の機能を抑制する因子を発現す
る、感染したウイルスベクターを増殖させるための非ヒ
ト細胞、（８）膜結合型のヒト補体の機能を抑制する
因子が、DAF（CD55）、MCP（CD46）、CR1（CD35）、CD5
9からなる群から選択される、（５）〜（７）いずれか
に記載の細胞、（９）（５）記載の細胞にウイルスベ
クターDNAを導入して、該細胞を培養し、生成するウイ
ルスベクターを回収する工程を含むことを特徴とする、
（１）記載のウイルスベクターの製造方法、（１０）
（７）記載の細胞に、ウイルスベクターDNAを導入し
て、該細胞を培養し、生成するウイルスベクターを回収
する工程を含むことを特徴とする、（１）記載のウイル
スベクターの製造方法、（１１）ウイルスベクターの表
面に膜結合型のヒト補体の機能を抑制する因子を捕捉さ
せる工程を含むことを特徴とする、（１）記載のウイル
スベクターの製造方法、（１２）膜結合型のヒト補体の
機能を抑制する因子の細胞外領域と、該膜結合型のヒト
補体の機能を抑制する因子以外の膜タンパク質の膜貫通
に関与する領域とを含む、融合タンパク質、（１３）膜
結合型のヒト補体の機能を抑制する因子の細胞外領域が
DAF由来である、（１２）記載の融合タンパク質、（１
４）膜貫通に関与する領域がGPI−アンカーまたはVSV−
G膜貫通領域である、（１２）記載の融合タンパク質、
（１５）（１２）〜（１４）のいずれかに記載の融合タ
ンパク質をコードするDNA、（１６）（１５）記載のDNA
を含むベクター、（１７）（１６）記載のDNAを発現可
能に保持する形質転換体、に関する。

【００１３】なお、本発明において「ウイルスベクタ
ー」とは、ウイルスエンベロープタンパク質を少なくと
も構成成分として含むベクターを指す。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明は、ベクター上にヒト補体
の機能を抑制する因子が呈示されたウイルスベクターに
関する。

【００１５】本発明においてヒト補体の機能を抑制する
因子を呈示させるウイルスベクターとしては、ベクター
の不活性化にヒト補体系が関与している（または、関与
している可能性がある）ウイルスベクターであれば特に
制限はないが、特に、現在臨床で最も多く用いられベク
ターの生産系が確立されている点で、レトロウイルスベ
クターが好ましい。

【００１６】ヒト補体の機能を抑制する因子としては、
ベクター生産細胞内で発現させた場合に細胞膜に結合ま
たは組み込まれるものであれば特に制限はなく、膜貫通
領域を有するタンパク質、GPIアンカー型タンパク質な
どを用いることが可能である。例えば、DAF（CD55）
（Current Topics in Microbiology and Immunology Vo
l.178. p8 (1992)）、MCP（CD46）（Current Topics in
Microbiology and Immunology Vol.178. p45 (199
2)）、CR1（CD35）（Current Topics in Microbiology
and Immunology Vol.178. p31 (1992)）、CD59（Curren
t Topics in Microbiology and Immunology. Vol.178.
p61 (1992)）などを用いることが可能である。

【００１７】また、ヒト補体の機能を抑制する因子とし
ては、人工的に調製される融合タンパク質、例えば、ヒ
ト補体の機能を抑制する因子の機能に関与する領域（例
えば、膜結合型のヒト補体の機能を抑制する因子の細胞
外領域または可溶型のヒト補体の機能を抑制する因子の
機能に関与する領域など）と、膜タンパク質の膜貫通に
関与する領域とを含む、融合タンパク質などを用いるこ
とも可能である。

【００１８】膜結合型のヒト補体の機能を抑制する因子
の細胞外領域としては、例えば、DAF、MCP、CR1、CD59
などの細胞外領域を用いることが可能である。

【００１９】また、膜タンパク質の膜貫通に関与する領
域としては、通常は、膜タンパク質の膜貫通領域が用い
られ、例えば、VSV-Gの膜貫通領域、レトロウイルスの
膜貫通領域などが挙げられる。また、膜タンパク質がGP
I-アンカー型タンパク質である場合には、GPI-アンカー
付加シグナル領域を用いることも可能であり、例えば、
DAFのGPI-アンカー付加シグナル領域を用いることが可
能である。

【００２０】なお、融合タンパク質は、ヒト補体の機能
を抑制する因子の機能に関与する領域に相当するDNA断
片をフレームを合わせてライゲーションし、これを適当
な発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入して発現さ
せ、精製することにより調製することが可能である。宿
主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、動物細胞など
を用いることが可能である。ベクターとしては、宿主細
胞が大腸菌であれば、例えば、「pQE30」、「pQE32」
（キアゲン社製）、「pET3a」、「pET3b」（ノバゲン社
製、宝酒造）、「pGEX-5X-1」、「pGEX-5X-2」（ファル
マシア社製）、「pUC118」（宝酒造）など、宿主細胞が
酵母であれば、例えば、「pRS303」、「pRS304」（R.S.
Sikorski and P.Hieter (1989) Genetics 122:19-2
7）、「pRS423」、「pRS424」（T.W.Christianson,R.S.
Sikorski,M.Dante,J.H.Shero, and Hieter (1992) Gene
110:119-122）など、宿主細胞が動物細胞であれば、例
えば、「pNEO」（P.Southern, and P.Berg(1982)J.Mol.
Appl.Genet.1:327）、「pCAGGS」（H.Niwa,K.Yamamura,
and J.Miyazaki.Gene 108,193-200 (1991)）、「pRc/C
MV」（インビトロゲン社製）などを用いることが可能で
ある。宿主細胞へのベクターの導入は、リン酸カルシウ
ム法やリポフェクション法などの常法により行うことが
可能である（実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック
羊土社 (1996)）。形質転換体からの融合タンパク質
の精製は、融合タンパク質が細胞膜上に発現している場
合には、細胞をNP-40などの界面活性剤により可溶化
し、種々のカラムクトマトグラフィーや電気泳動などの
常法（新生化学実験講座１タンパク質I 分離・精製
・性質(東京化学同人)）により精製することが可能であ
る。また、形質転換体内で可溶性タンパク質として存在
すれば、超音波破砕などにより細胞を破砕した後、上記
と同様の方法により精製することが可能である。また、
不溶性タンパク質として存在していれば、例えば、グア
ニジン塩酸等の変性剤を用いて可溶化した後、透析によ
り徐々に塩濃度を下げ、可溶化されているタンパク質に
ついて上記と同様の方法を用いて精製することが可能で
ある。

【００２１】また、本発明は、上記ウイルスベクターを
増殖させるための細胞（パッケージング細胞）に関す
る。該細胞は、少なくとも上記の膜結合型のヒト補体の
機能を抑制する因子を発現する。好ましくは、少なくと
も感染性を有するウイルス粒子の構成に必要なタンパク
質と、上記の膜結合型のヒト補体の機能を抑制する因子
とを発現する細胞である。この細胞には、膜結合型のヒ
ト補体の機能を抑制する因子をコードするDNAが染色体
内に発現可能に組み込まれているもの、該DNAが染色体
外で発現可能に保持されているものなどが含まれるが、
該DNAが形質転換体内で発現可能である限り、DNAの存在
形態に特に制限はない。感染性を有するウイルス粒子の
構成に必要なタンパク質をコードするDNAについても同
様に、その存在形態に特に制限はない本発明のパッケー
ジング細胞の調製法としては特に制限はないが、例え
ば、感染性を有するウイルス粒子の構成に必要なタンパ
ク質を発現する細胞に、上記の膜結合型のヒト補体の機
能を抑制する因子をコードするDNAを発現可能に導入す
ることにより調製することが可能である。

【００２２】感染性を有するウイルス粒子の構成に必要
なタンパク質を発現する細胞としては、ヒトへの指向性
を有するものであれば特に制限はない。この細胞は、ウ
イルス粒子の構成に必要なタンパク質に対する遺伝子を
細胞に導入するなどの方法で調製することが可能である
が、「PA317」（実験医学 Vol.12,No.15 p28 (199
4)）、「GP+envAm12」（実験医学 Vol.12,No.15 p28 (1
994)）などの既存のパッケージング細胞を用いることが
可能である。ウイルス粒子の構成に必要なタンパク質と
しては、ウイルスがレトロウイルスであれば、「ga
g」、「pol」、「env」が挙げられる。なお、ベクター
としてレトロウイルスベクターを用いた場合には、パッ
ケージング細胞には、後述のウイルスベクターDNAに欠
損させた遺伝子（「gag」、「pol」、「env」をコード
する遺伝子のうち欠損させた遺伝子）を発現させる。

【００２３】膜結合型のヒト補体の機能を抑制する因子
をコードするDNAは、適当なベクターに組み込んで細胞
に導入することが好ましい。ベクターとしては、真核生
物細胞用の発現ベクターであれば特に制限はないが、例
えば、pCAGGS（Gene 108：193(1991)）などのベクター
を好適に用いることが可能である。

【００２４】また、本発明は、本発明のウイルスベクタ
ーの製造方法に関する。本発明のウイルスベクターは、
本発明のパッケージング細胞に、必要に応じて所望の外
来遺伝子を挿入できるウイルスベクターDNAを導入し、
得られた細胞から放出されたウイルス粒子を回収するこ
とにより製造することが可能である。用いられるウイル
スベクターDNAとしては、レトロウイルスベクターであ
れば、パッケージングシグナル、プライマー結合部位、
LTRなどウイルスゲノムとして必要なシスエレメントが
含まれていれば特に制限はなく、例えば、LRNL（Virolo
gy 171:331 (1989)）、MFG(PNAS 86:3539 (1993)）など
を用いることが可能である（実験医学 Vol.12,No.15 p2
8 (1994)）。パッケージング細胞へのウイルスベクター
DNAの導入は、リン酸カルシウム法やリポフェクション
法などの方法で行うことが可能である。また、放出され
たウイルスベクターは、培養上清から回収することが可
能である。

【００２５】なお、本発明のウイルスベクターは、ウイ
ルスベクターの表面に膜結合型のヒト補体の機能を抑制
する因子を捕捉させることにより、製造することも可能
である。ヒト補体の機能を抑制する因子の捕捉は、例え
ば、GPIアンカー型因子であれば、ヒト補体の機能を抑
制するGPIアンカー型因子を精製し、ウイルスベクター
とインキュベートすることにより行うことが可能である
（J.Exp.Med 160:1558(1984)）。また、ヒト補体の機能
を抑制する領域を、例えば、架橋剤やビオチン-アビジ
ンの系などを用いて物理化学的に結合させて製造するこ
とも可能である。さらに、ヒト補体の機能を抑制する領
域をウイルスベクターのエンベロープタンパク質と遺伝
子工学的に融合させて製造することも可能である。

【００２６】得られた本発明のウイルスベクターは、例
えば、遺伝子病に対する治療用遺伝子などを挿入して、
遺伝子治療などに利用することが可能であると考えられ
る。

【００２７】以下、本発明を実施例により具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではな
い。

【００２８】

【実施例】

[実施例１] ヒト血清によるベクターの不活化異種指向性のベクターを生産するためのマウス細胞由来
のパッケージング細胞「PA317」（Mol.Cel.Biol., 6:28
95 (1986))に、選択マーカー遺伝子としてネオマイシン
遺伝子を持つLRNLベクター(Virology 171: 331 (1989))
に外来遺伝子としてβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を持た
したものを導入し、マーカー遺伝子としてネオマイシン
耐性遺伝子とβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）遺伝子を
持つレトロウイルスベクターを生産するPA317/β-gal細
胞を作製した。

【００２９】PA317/β-gal細胞の培養上清をヒト血清と
37℃, 30分間反応し、反応後、残存するベクターの力価
をNIH/3T3細胞を標的細胞として用いて、この細胞にマ
ーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子とβ-ガラクト
シダーゼ遺伝子）を伝達する活性で測定した。

【００３０】具体的には、ヒト血清と反応後のベクター
を含む培養上清に終濃度8μg/mlになるようにポリブレ
ンを添加し、さらに新鮮な培地（DMEM/10%牛胎児血清）
を加え容量を1mlにした。これを、前日にコンフルエン
トの1/10で6cmシャーレに継代したNIH/3T3細胞に添加
し、5%炭酸ガス培養器内で37℃, 5時間培養した。培養
後、新鮮な培地3mlを加え、一晩培養した。翌日、新鮮
な培地に交換しさらに一晩培養した。

【００３１】培養後、EDTA-トリプシンで細胞を剥が
し、1/10は10cmシャーレ中の新鮮な培地へ移し、500μg
/mlのG418存在下で3日毎に培地を交換して10日間培養を
行い、生じたG418耐性コロニーをクリスタルバイオレッ
ト染色にて計測した（Currentprotocols in molecular
biology : John Wiley & Sons, Inc.）（図１Ａ）。

【００３２】残り9/10は遠心により細胞を回収し、2% T
riton X-100を含む緩衝液で細胞を溶解し、遠心して上
清を回収した。この上清中のβ-ガラクトシダーゼ活性
を4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトピラノシド
を基質として測定した（図１Ｂ）。

【００３３】この結果、56℃, 30分間熱処理をし補体系
を不活化した非働化血清と較べて、補体系の生きている
血清を用いた場合では、大幅なベクター力価の低下が認
められた。また、上記二つのベクターの力価測定系には
良い相関が認められた。

【００３４】[実施例２] 可溶型ヒト補体制御因子によ
るベクターの不活化の抑制補体系の活性化機構は前半部分と後半部分に分かれる。
前半の活性化段階は抗体依存性の古典的経路、即ち、免
疫複合体上で補体成分C1、C4、C2、C3が順に反応する系
と、抗体非依存性の第二経路、即ち、菌体成分上でC3、
B因子、D因子が活性化する経路とがある。後半の経路は
共通で進行し、C5、C6、C7、C8、C9が連鎖的に膜に結合
する反応が進行する。この結果、脂質二重層に親水性の
チャンネルを形成し溶菌などが起こる。本発明者らは、
ベクターの不活化に補体系が関与していることを明らか
にし、また、補体系のどの段階が関与しているか明らか
にするために、ヒト補体系の制御因子として、C3段階で
補体系の活性化を抑制する可溶型「complement recepto
r type I」（sCR1）およびC9段階で補体系の活性化を抑
制する可溶型CD59（sCD59）を様々な量組み合わせてベ
クターとヒト血清との反応液中に添加し、その影響を検
討した（図２）。

【００３５】この結果、sCR1はベクターの不活化を完全
に抑制し、この効果は用量依存的であった（図２Ｂ）。
一方、sCD59は用量依存的にベクターの不活化を抑制し
たが、抑制効果は部分的であった（図２Ａ）。

【００３６】この結果から、ヒト血清によるベクターの
不活化にはヒト補体系が関与していることが明らかにな
り、また、特にC3段階で補体系の活性化を抑制すること
により、ベクターは不活化から免れることが明らかにな
った。

【００３７】[実施例３] DAF発現ベクターの構築実施例２の結果から、C3段階でヒト補体系の活性化を抑
制することにより、ベクターの不活化が完全に阻害され
ることから、ベクター生産細胞（PA317/β-gal）に導入
するヒト補体制御因子としてはC3段階で補体系を抑制す
る崩壊促進因子（Decay Accelerating Factor(DAF)）を
用いた。

【００３８】DAFはグリコシルホスファチジルイノシト
ール(GPI)-アンカー型タンパクとして細胞膜上に発現す
る(Biochemistry 25: 6740 (1986))。GPI-アンカー型タ
ンパクがレトロウイルス上にのることはThy-1等で報告
されている(J Gen Virol 64:1241 (1983))が、効率よく
ベクター上にのるかどうかは不明である。そこで、DAF
を通常の膜貫通領域を持った膜タンパク質として発現さ
せるためにDAF-TMの構築も行った。

【００３９】DAFは膜貫通領域を持った膜タンパクとし
て発現しても活性を保っていることは報告されている(J
Exp Med 174: 37 (1991))。そこで、DAFの細胞外領域
（配列番号：１に記載のDAF遺伝子の塩基番号の1番目〜
1067番目に相当する）と、水疱性口内炎ウイルス(VSV)
の糖タンパク質G(VSV-G)の膜貫通領域と細胞内領域(JVi
rol 66: 1579 (1992))（配列番号：２に記載のVSV-G遺
伝子の塩基番号の1389番目〜1536番目に相当する）を融
合させた遺伝子を構築した。

【００４０】発現ベクター「pCAGGS」（Gene 108:193
(1991)）に導入されたDAF(pCAGGS-DAF)遺伝子をBbsIで
切断し、平滑末端化しDAFのGPI-アンカー付加シグナル
部分を除いた。一方、pHCMV-Gベクター（米国特許第551
2421号明細書）に挿入されたVSV-G(pCMV-G)からKpnI-Ec
oRIフラグメントを調製し、さらにAluIとNdeIで切断す
ることにより、VSV-Gの膜貫通領域と細胞内領域を持っ
たAluI-EcoRIフラグメントを調製した。このフラグメン
トを平滑末端化し、先のBbsI切断pCAGGS-DAFとライゲー
ションすることにより、DAF-TM発現ベクターの「pCAGGS
-DAF-TM」を作製した（図３）。これらのベクターをリ
ン酸カルシウム法により、ベクター生産細胞のPA317/β
-gal細胞に導入した。

【００４１】マウス細胞由来のPA317/β-gal細胞はヒト
血清中のヒト補体系に感受性を示し、補体系により溶解
する。一方、ヒト補体制御因子の導入されたPA317/β-g
al細胞はヒト補体系に対して抵抗性を示すことが期待さ
れる。そこで、DAFおよびDAF-TM遺伝子を導入された細
胞を50%ヒト血清を含む培地中で培養することにより、
遺伝子導入細胞の濃縮を行った。さらに、遺伝子導入細
胞の純化は抗DAFモノクローナル抗体（D17, 生化学工業
社製）を用いてセルソーター（EPICS ELITE ESP, コー
ルター社製）により行った。DAF-TM遺伝子導入細胞につ
いては、セルソーターにより高発現細胞集団（DAF-TM
(H)細胞）と低発現細胞集団（DAF-TM(L)細胞)）に分画
した。

【００４２】[実施例４] ベクター生産細胞上でのDAF
の発現 PA317/β-gal細胞上でのDAFの発現と機能を解析した。D
AFタンパクの発現は抗DAFモノクローナル抗体を用いて
セルソーターにより解析した。遺伝子導入細胞をEDTA-
トリプシンにより剥がした。この操作により抗DAFモノ
クローナル抗体の認識するエピトープは消失しないこと
は確認した。これらの細胞を抗DAFモノクローナル抗体1
0μg/mlと氷中で30分間反応し、洗浄後、FITC標識抗マ
ウス抗体（BIOSOURCE international社製）と氷中で30
分間反応し、洗浄後セルソーターによる解析を行った。

【００４３】この結果、DAFおよびDAF-TM(H)細胞につい
て、DAFタンパク質の発現は80%以上の細胞に認められ
た。一方、DAF-TM(L)細胞については、約50%の細胞にDA
Fタンパクの発現が認められた。DAFタンパク発現細胞に
ついて、発現強度はDAF-TM(H)細胞、DAF-TM(L)細胞、DA
F細胞の順であった（図４Ａ）。

【００４４】次ぎに、これら細胞膜上に発現したDAFが
機能を有しているかを細胞がヒト補体に対する抵抗性を
示すかどうかで検討した。

【００４５】96ウェルプレート中でコンフルエントの細
胞に各濃度のヒト血清を添加し37°C, 30分間反応し
た。反応後、遠心により上清を回収し、ヒト補体により
溶解した細胞より遊離する乳酸デヒドロゲナーゼ（Lact
ate dehydrogenase）活性を測定して細胞溶解率を算定
した。

【００４６】この結果、DAFおよびDAF-TM遺伝子導入細
胞は何れもヒト補体に対する抵抗性の上昇が認められ
た。この抵抗性の獲得は細胞上でのDAFタンパクの発現
と相関していた（図４Ｂ）。このことは細胞上のDAFタ
ンパクが機能を有していることを示唆している。

【００４７】[実施例５] DAF発現生産細胞の生産する
ベクターの力価 DAFおよびDAF-TM遺伝子導入細胞のベクター生産能なら
びに生産するベクターのヒト補体抵抗性について検討し
た。

【００４８】まず、PA317/β-gal細胞、DAF細胞、DAF-T
M(L)細胞ならびにDAF-TM(H)細胞の培養上清を用いて、
実施例１の方法により、上清中のベクターの力価を測定
し、ベクター生産能の比較を行った。この結果、DAF細
胞のベクター生産能はPA317/β-gal細胞と比較して約1/
10であったが、DAF-TM(L)細胞ならびにDAF-TM(H)細胞の
ベクター生産能はPA317/β-gal細胞と差がなかった。

【００４９】そこで、DAF-TM(L)細胞ならびにDAF-TM(H)
細胞の生産するベクターについてヒト補体抵抗性の検討
を行った。方法は実施例１に準じ、ベクターと反応させ
る血清濃度は30%で行った。

【００５０】この結果、DAF-TM(L)細胞ならびにDAF-TM
(H)細胞の生産するベクターは何れもヒト補体に対する
抵抗性の上昇が認められた（図５）。また、DAF-TM(H)
細胞の生産するベクターはDAF-TM(L)細胞の生産するベ
クターと比較してヒト補体に対する抵抗性の上昇は大き
く、このことは細胞上でのDAF発現量が補体抵抗性の上
昇と相関している可能性を示唆しているか、または、DA
F-TM(L)細胞の約50%はDAFタンパクを発現していないこ
とに起因する可能性が考えられる。

【００５１】[実施例６] ヒト補体抵抗性実施例５で見られた、ヒト補体に対する抵抗性の上昇が
DAFによるものかどうか、中和活性を有する抗DAFモノク
ローナル抗体を用いて検討した。

【００５２】DAF-TM(H)細胞の生産するベクターをヒト
血清と反応させる際に、中和活性を有する抗DAFモノク
ローナル抗体（和光純薬工業社製）を終濃度25μg/mlで
添加し、残存するベクターの力価を実施例１の方法で測
定した（図６）。

【００５３】この結果、PA317/β-gal細胞の生産するベ
クターと比較して、DAF-TM(H)細胞の生産するベクター
のヒト補体抵抗性の上昇分は、中和活性を有する抗DAF
モノクローナル抗体により完全に抑制された。したがっ
て、DAF-TM(H)細胞の生産するベクターが獲得した補体
抵抗性はDAFに由来することが確認された。

【００５４】[実施例７] 補体抵抗性の上昇に対するDA
Fの関与実施例６において、DAF-TMの生産するベクターのヒト補
体抵抗性はDAFが関与していることが明らかになった
が、このDAFの関与について、ベクター上のDAFではな
く、培地中に放出されたDAFが関与している可能性も考
えられるため、この点について検討した。すなわち、ヒ
ト補体抵抗性ベクターを生産するDAF-TM細胞の培養上清
を用い、羊感作赤血球のヒト補体による溶血系に添加
し、溶血阻害活性が存在するかどうか検討した。

【００５５】96穴丸底プレートに感作羊赤血球（石津製
薬社製）5×10⁸/mlにヒト血清を終濃度1%に添加し容量
をゼラチン-ベロナール緩衝液(GVB²⁺)で20μlにし、さ
らに、DAF-TM細胞の培養上清20μlまたは対照として培
地ならびにPA317/β-gal細胞の培養上清20μlを加え、4
0μlの反応系で37℃, 30分間反応した。反応後、100μl
のEDTA-GVBを添加し遠心後、上清の405nmでの吸光度を
測定し赤血球の容血率を算出し、容血阻害率を求めた。

【００５６】この結果、DAF-TM細胞の培養上清中には対
照と比較して有意な補体制御活性の上昇は認められなか
った（図７）。また、この系において、実施例２で用い
たsCR1を添加すると2.4μg/mlの濃度でも完全に溶血を
阻害した。

【００５７】一方、実施例２の結果から、sCR1を用いた
ベクターの不活化阻害には少なくともsCR1は数百mg/ml
の濃度が必要であることから、DAF-TM細胞の培養上清中
にはベクターの不活化阻害に必要な量の可溶型補体制御
因子は存在しないことが示唆された。

【００５８】また、細胞上のDAFは自己細胞上での補体
の活性化は抑制するが、他細胞上での補体活性化はほと
んど抑制しないことが報告されており（J Exp Med 155
8: 160 (1984)）、このことは、ベクター上に存在するD
AFがベクターにヒト補体抵抗性を付与していることを裏
付けるものである。

【００５９】[実施例８] ベクター上のDAFの存在実施例７の結果から、DAF-TM細胞の産生するベクターは
ベクター上に存在するDAFによりヒト補体抵抗性を獲得
したことが示されたが、ベクター上にDAFが存在するこ
とを直接確認するために、抗DAF抗体を用いた免疫沈降
反応によりベクター活性が吸収されるか否かを検討し
た。

【００６０】DAF-TM細胞をクローニングして得られたヒ
ト補体抵抗性の上昇したベクターを産生する細胞（DT5
2,DT56）の培養上清ならびに対照としてPA317/β-gal細
胞の培養上清を用いて以下の実験を行った。0.45μmの
フィルターを通した各ベクター生産細胞の培養上清100
μlに抗DAFモノクローナル抗体（和光純薬工業社製なら
びに生化学工業社製、各0.5mg/ml）2μlまたは対照とし
て1mg/mlのマウスIgGを添加し、0℃で4時間反応させ
た。反応後、キャリアーとして5mg/mlのマウスIgGを5μ
l加え、さらに、1mg/mlの抗マウスIgG抗体（BIOSOURCE
international社製）を50μl添加した。この混合物を37
℃で1時間反応後、さらに0℃で一晩反応した。反応後、
遠心し沈降物を除去後、上清100μlを用いて実施例１の
方法に準じ、残存するベクターの力価を測定した。

【００６１】この結果、ヒト補体抵抗性を示したベクタ
ー（DT52,DT56）において、抗DAF抗体を用いた免疫沈降
反応により約30%のベクター活性の低下が認められた
（図８）。これにより、少なくとも機能有るベクター粒
子の一部にはDAFが存在することが示された。

【００６２】

【発明の効果】本発明により、ヒト補体の機能を抑制す
る因子をエンベロープ上に呈示するウイルスベクターが
提供された。本発明のウイルスベクターは、ヒト体内で
安定であり、従来の確立したベクター生産系に適用で
き、かつ、直接「in vivo」で頻回投与可能であるとい
う特性を有するため、特に遺伝子治療の分野においての
利用が期待される。

【００６３】

【配列表】

配列番号 : 1 配列の長さ : 1146 配列の型 : 核酸鎖の数 : 二本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : cDNA to mRNA 配列の特徴特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 1 .. 1143 特徴を決定した方法 : S 配列 ATG ACC GTC GCG CGG CCG AGC GTG CCC GCG GCG CTG CCC CTC CTC GGG 48 Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly 1 5 10 15 GAG CTG CCC CGG CTG CTG CTG CTG GTG CTG TTG TGC CTG CCG GCC GTG 96 Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val 20 25 30 TGG GGT GAC TGT GGC CTT CCC CCA GAT GTA CCT AAT GCC CAG CCA GCT 144 Trp Gly Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala 35 40 45 TTG GAA GGC CGT ACA AGT TTT CCC GAG GAT ACT GTA ATA ACG TAC AAA 192 Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys 50 55 60 TGT GAA GAA AGC TTT GTG AAA ATT CCT GGC GAG AAG GAC TCA GTG ATC 240 Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile 65 70 75 80 TGC CTT AAG GGC AGT CAA TGG TCA GAT ATT GAA GAG TTC TGC AAT CGT 288 Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg 85 90 95 AGC TGC GAG GTG CCA ACA AGG CTA AAT TCT GCA TCC CTC AAA CAG CCT 336 Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro 100 105 110 TAT ATC ACT CAG AAT TAT TTT CCA GTC GGT ACT GTT GTG GAA TAT GAG 384 Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu 115 120 125 TGC CGT CCA GGT TAC AGA AGA GAA CCT TCT CTA TCA CCA AAA CTA ACT 432 Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr 130 135 140 TGC CTT CAG AAT TTA AAA TGG TCC ACA GCA GTC GAA TTT TGT AAA AAG 480 Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys 145 150 155 160 AAA TCA TGC CCT AAT CCG GGA GAA ATA CGA AAT GGT CAG ATT GAT GTA 528 Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val 165 170 175 CCA GGT GGC ATA TTA TTT GGT GCA ACC ATC TCC TTC TCA TGT AAC ACA 576 Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr 180 185 190 GGG TAC AAA TTA TTT GGC TCG ACT TCT AGT TTT TGT CTT ATT TCA GGC 624 Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly 195 200 205 AGC TCT GTC CAG TGG AGT GAC CCG TTG CCA GAG TGC AGA GAA ATT TAT 672 Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr 210 215 220 TGT CCA GCA CCA CCA CAA ATT GAC AAT GGA ATA ATT CAA GGG GAA CGT 720 Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg 225 230 235 240 GAC CAT TAT GGA TAT AGA CAG TCT GTA ACG TAT GCA TGT AAT AAA GGA 768 Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly 245 250 255 TTC ACC ATG ATT GGA GAG CAC TCT ATT TAT TGT ACT GTG AAT AAT GAT 816 Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp 260 265 270 GAA GGA GAG TGG AGT GGC CCA CCA CCT GAA TGC AGA GGA AAA TCT CTA 864 Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu 275 280 285 ACT TCC AAG GTC CCA CCA ACA GTT CAG AAA CCT ACC ACA GTA AAT GTT 912 Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Asn Val 290 295 300 CCA ACT ACA GAA GTC TCA CCA ACT TCT CAG AAA ACC ACC ACA AAA ACC 960 Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr 305 310 315 320 ACC ACA CCA AAT GCT CAA GCA ACA CGG AGT ACA CCT GTT TCC AGG ACA 1008 Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr 325 330 335 ACC AAG CAT TTT CAT GAA ACA ACC CCA AAT AAA GGA AGT GGA ACC ACT 1056 Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr 340 345 350 TCA GGT ACT ACC CGT CTT CTA TCT GGG CAC ACG TGT TTC ACG TTG ACA 1104 Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr 355 360 365 GGT TTG CTT GGG ACG CTA GTA ACC ATG GGC TTG CTG ACT TAG 1146 Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr 370 375 380 配列番号 : 2 配列の長さ : 1536 配列の型 : 核酸鎖の数 : 二本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : cDNA to mRNA 配列の特徴特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 1 .. 1533 特徴を決定した方法 : S 配列 ATG AAG TGC CTT TTG TAC TTA GCC TTT TTA TTC ATT GGG GTG AAT TGC 48 Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys 1 5 10 15 AAG TTC ACC ATA GTT TTT CCA CAC AAC CAA AAA GGA AAC TGG AAA AAT 96 Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn 20 25 30 GTT CCT TCT AAT TAC CAT TAT TGC CCG TCA AGC TCA GAT TTA AAT TGG 144 Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser Ser Asp Leu Asn Trp 35 40 45 CAT AAT GAC TTA ATA GGC ACA GCC ATA CAA GTC AAA ATG CCC AAG AGT 192 His Asn Asp Leu Ile Gly Thr Ala Ile Gln Val Lys Met Pro Lys Ser 50 55 60 CAC AAG GCT ATT CAA GCA GAC GGT TGG ATG TGT CAT GCT TCC AAA TGG 240 His Lys Ala Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp 65 70 75 80 GTC ACT ACT TGT GAT TTC CGC TGG TAT GGA CCG AAG TAT ATA ACA CAG 288 Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr Gln 85 90 95 TCC ATC CGA TCC TTC ACT CCA TCT GTA GAA CAA TGC AAG GAA AGC ATT 336 Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile 100 105 110 GAA CAA ACG AAA CAA GGA ACT TGG CTG AAT CCA GGC TTC CCT CCT CAA 384 Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln 115 120 125 AGT TGT GGA TAT GCA ACT GTG ACG GAT GCC GAA GCA GTG ATT GTC CAG 432 Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln 130 135 140 GTG ACT CCT CAC CAT GTG CTG GTT GAT GAA TAC ACA GGA GAA TGG GTT 480 Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val 145 150 155 160 GAT TCA CAG TTC ATC AAC GGA AAA TGC AGC AAT TAC ATA TGC CCC ACT 528 Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr 165 170 175 GTC CAT AAC TCT ACA ACC TGG CAT TCT GAC TAT AAG GTC AAA GGG CTA 576 Val His Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu 180 185 190 TGT GAT TCT AAC CTC ATT TCC ATG GAC ATC ACC TTC TTC TCA GAG GAC 624 Cys Asp Ser Asn Leu Ile Ser Met Asp Ile Thr Phe Phe Ser Glu Asp 195 200 205 GGA GAG CTA TCA TCC CTG GGA AAG GAG GGC ACA GGG TTC AGA AGT AAC 672 Gly Glu Leu Ser Ser Leu Gly Lys Glu Gly Thr Gly Phe Arg Ser Asn 210 215 220 TAC TTT GCT TAT GAA ACT GGA GGC AAG GCC TGC AAA ATG CAA TAC TGC 720 Tyr Phe Ala Tyr Glu Thr Gly Gly Lys Ala Cys Lys Met Gln Tyr Cys 225 230 235 240 AAG CAT TGG GGA GTC AGA CTC CCA TCA GGT GTC TGG TTC GAG ATG GCT 768 Lys His Trp Gly Val Arg Leu Pro Ser Gly Val Trp Phe Glu Met Ala 245 250 255 GAT AAG GAT CTC TTT GCT GCA GCC AGA TTC CCT GAA TGC CCA GAA GGG 816 Asp Lys Asp Leu Phe Ala Ala Ala Arg Phe Pro Glu Cys Pro Glu Gly 260 265 270 TCA AGT ATC TCT GCT CCA TCT CAG ACC TCA GTG GAT GTA AGT CTA ATT 864 Ser Ser Ile Ser Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Asp Val Ser Leu Ile 275 280 285 CAG GAC GTT GAG AGG ATC TTG GAT TAT TCC CTC TGC CAA GAA ACC TGG 912 Gln Asp Val Glu Arg Ile Leu Asp Tyr Ser Leu Cys Gln Glu Thr Trp 290 295 300 AGC AAA ATC AGA GCG GGT CTT CCA ATC TCT CCA GTG GAT CTC AGC TAT 960 Ser Lys Ile Arg Ala Gly Leu Pro Ile Ser Pro Val Asp Leu Ser Tyr 305 310 315 320 CTT GCT CCT AAA AAC CCA GGA ACC GGT CCT GCT TTC ACC ATA ATC AAT 1008 Leu Ala Pro Lys Asn Pro Gly Thr Gly Pro Ala Phe Thr Ile Ile Asn 325 330 335 GGT ACC CTA AAA TAC TTT GAG ACC AGA TAC ATC AGA GTC GAT ATT GCT 1056 Gly Thr Leu Lys Tyr Phe Glu Thr Arg Tyr Ile Arg Val Asp Ile Ala 340 345 350 GCT CCA ATC CTC TCA AGA ATG GTC GGA ATG ATC AGT GGA ACT ACC ACA 1104 Ala Pro Ile Leu Ser Arg Met Val Gly Met Ile Ser Gly Thr Thr Thr 355 360 365 GAA AGG GAA CTG TGG GAT GAC TGG GCA CCA TAT GAA GAC GTG GAA ATT 1152 Glu Arg Glu Leu Trp Asp Asp Trp Ala Pro Tyr Glu Asp Val Glu Ile 370 375 380 GGA CCC AAT GGA GTT CTG AGG ACC AGT TCA GGA TAT AAG TTT CCT TTA 1200 Gly Pro Asn Gly Val Leu Arg Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Phe Pro Leu 385 390 395 400 TAC ATG ATT GGA CAT GGT ATG TTG GAC TCC GAT CTT CAT CTT AGC TCA 1248 Tyr Met Ile Gly His Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser Ser 405 410 415 AAG GCT CAG GTG TTC GAA CAT CCT CAC ATT CAA GAC GCT GCT TCG CAA 1296 Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala Ala Ser Gln 420 425 430 CTT CCT GAT GAT GAG AGT TTA TTT TTT GGT GAT ACT GGG CTA TCC AAA 1344 Leu Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys 435 440 445 AAT CCA ATC GAG CTT GTA GAA GGT TGG TTC AGT AGT TGG AAA AGC TCT 1392 Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser 450 455 460 ATT GCC TCT TTT TTC TTT ATC ATA GGG TTA ATC ATT GGA CTA TTC TTG 1440 Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu 465 470 475 480 GTT CTC CGA GTT GGT ATC CAT CTT TGC ATT AAA TTA AAG CAC ACC AAG 1488 Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys 485 490 495 AAA AGA CAG ATT TAT ACA GAC ATA GAG ATG AAC CGA CTT GGA AAG 1533 Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys 500 505 510 TAA 1536

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト血清によるレトロウイルスベクターの不活
性化能を検出した結果を示す図である。対照として、非
働化ヒト血清を用いた。なお、図１Ａはβ-ガラクトシ
ダーゼ活性により検出したものであり、図１Ｂは薬剤
（G418）耐性コロニー数で検出したものである。また、
図の横軸のＡ，Ｂ，Ｃは異なる３人の被験者を示す。

【図２】可溶型ヒト補体制御因子によるベクターの不活
化の抑制活性を検出した結果を示す図である。図２Ａは
sCR1濃度を固定して、様々な濃度のsCD59で検出したも
のであり、図２ＢはsCD59濃度を固定して、様々な濃度
のsCR1で検出したものである。

【図３】プラスミドベクター「pCAGGS-DAF-TM」の構築
を示す図である。

【図４】図４Ａはベクター生産細胞上でのDAFの発現を
セルソーターで検出したものである。図４Ｂはベクター
生産細胞上のDAFが機能していることをヒト補体に対す
る抵抗性で示したものである。

【図５】DAF-TM(L)細胞およびDAF-TM(H)細胞の生産する
ベクターのヒト補体に対する抵抗性をベクター残存率で
検出した結果を示す図である。対照として、PA317/β-g
al細胞の生産するベクターを用いた。

【図６】ヒト補体に対する抵抗性の上昇がDAFによるも
のかどうかを中和活性を有する抗DAFモノクローナル抗
体を用いて検出した結果を示す図である。

【図７】DAF-TM培養上清中に有意な可溶型DAFが存在し
ないことを示す図である。

【図８】ベクター上におけるDAFの存在を免疫沈降反応
により検出した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ベクター上にヒト補体の機能を抑制する
因子が呈示されたウイルスベクター。
【請求項２】ヒト補体の機能を抑制する因子が膜結合
型である、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項３】ヒト補体の機能を抑制する因子が、DAF
（CD55）、MCP（CD46）、CR1（CD35）、CD59からなる群
から選択される、請求項２記載のウイルスベクター。
【請求項４】レトロウイルス由来である、請求項１記
載のウイルスベクター。
【請求項５】少なくとも感染性を有するウイルス粒子
の構成に必要なタンパク質と、膜結合型のヒト補体の機
能を抑制する因子とを発現する細胞。
【請求項６】ウイルス粒子がレトロウイルス由来のも
のである、請求項５記載の細胞。
【請求項７】少なくとも膜結合型のヒト補体の機能を
抑制する因子を発現する、感染したウイルスベクターを
増殖させるための細胞。
【請求項８】膜結合型のヒト補体の機能を抑制する因
子が、DAF（CD55）、MCP（CD46）、CR1（CD35）、CD59
からなる群から選択される、請求項５〜７いずれかに記
載の細胞。
【請求項９】請求項５記載の細胞にウイルスベクター
DNAを導入して、該細胞を培養し、生成するウイルスベ
クターを回収する工程を含むことを特徴とする、請求項
１記載のウイルスベクターの製造方法。
【請求項１０】請求項７記載の細胞に、ウイルスベクタ
ーDNAを導入して、該細胞を培養し、生成するウイルス
ベクターを回収する工程を含むことを特徴とする、請求
項１記載のウイルスベクターの製造方法。
【請求項１１】ウイルスベクターの表面に膜結合型のヒ
ト補体の機能を抑制する因子を捕捉させる工程を含むこ
とを特徴とする、請求項１記載のウイルスベクターの製
造方法。
【請求項１２】膜結合型のヒト補体の機能を抑制する因
子の細胞外領域と、該膜結合型のヒト補体の機能を抑制
する因子以外の膜タンパク質の膜貫通に関与する領域と
を含む、融合タンパク質。
【請求項１３】膜結合型のヒト補体の機能を抑制する因
子の細胞外領域がＤＡＦ由来である、請求項１２記載の
融合タンパク質。
【請求項１４】膜貫通に関与する領域がGPI−アンカー
またはVSV−G膜貫通領域である、請求項１２記載の融合
タンパク質。
【請求項１５】請求項１２〜１４のいずれかに記載の融
合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１６】請求項１５記載のDNAを含むベクター。
【請求項１７】請求項１６記載のDNAを発現可能に保持
する形質転換体。