JP2020519230A - がんの治療のための、補体不活性化に耐性のエンベロープウイルス - Google Patents

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Abstract

組換え融合タンパク質が開示される。融合タンパク質は、（ａ）ＣＤ５５ペプチド配列、（ｂ）ＣＤ５５配列のＣ末端側にリンカー配列、（ｃ）リンカー配列のＣ末端側に膜貫通ドメイン、及び（ｄ）膜貫通ドメインのＣ末端側に細胞内ドメインを含む。融合タンパク質は、ＧＰＩアンカーを含有しない。融合タンパク質は、Ｎ末端分泌シグナルペプチドを伴って発現されてよく、かかるシグナルペプチドは切断されて、細胞株又はエンベロープウイルスの表面で成熟タンパク質をもたらす。融合タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスは、補体不活性化に耐性であり、がんを治療するために使用することができる。

Description

配列表の参照
Ａｎｎｅｘ Ｃ／ＳＴ．２５テキストファイルの形式で電子出願された配列表及び関連ファイル参照２１００３−ＰＣＴは、本開示の一部である。
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に感染しそれを破壊することによるがんの治療剤として試験されている。これらの腫瘍溶解性ウイルスとして、ニューカッスル病ウイルス、アデノウイルス、シンドビスウイルス、ワクチニアウイルス、ヘルペスウイルスなどが挙げられる。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ、Newcastle Disease Virus）は、大部分の腫瘍細胞でインターフェロン経路が欠損しているという要因によると推定される、腫瘍細胞において優先的に複製し溶解するという固有の特性により、がん患者において腫瘍を収縮する大きな可能性を示した（Pecora, A.L., Rizvi, N., Cohen, G.I., Meropol, N.J., Sterman, D., Marshall, J.L., Goldberg, S., Gross, P., O’Neil, J.D., Groene, W.S., Roberts, M.S., Rabin, H., Bamat, M.K., and R.M. Lorence. 2002. Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J. Clin. Oncol. 20:2251、Laurie, S.A., Bell, J.C., Atkins, H.L., Roach, J., Bamat, M.K., O’Neil, J.D., Roberts, M.S., Groene, W.S., and R.M. Lorence. 2006. A phase 1 clinical study of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, using two-step desensitization. Clin. Cancer Res. 12:2555、Lorence, R.M., Roberts, M.S., O’Neil, J.D., Groene, W.S., Miller, J.A., Mueller, S.N., and M.K. Bamat. 2007. Phase 1 clinical experience using intravenous administration of PV701, an oncolytic Newcastle disease virus. 7:157）。予備的な有望な臨床結果にもかかわらず、がん治療剤としてのＮＤＶは、ウイルスが患者の体内に侵入すると、必然的に大部分のＮＤＶ粒子が患者の自然免疫系、補体副経路によって破壊されるという欠点がある。
補体系は、自然及び適応免疫系の一部である（Volanakis, J.E., 1998. Chapter 2. In The Human Complement System in Health and Disease. Edited by J. E. Volanakis, and M.M. Frank. Marcel Dekker, Inc., New York pp 9-32によって概説されている）。補体は、微生物の殺滅並びに免疫複合体の輸送及びクリアランスにおいて重要な役割を果たしている。補体系の活性化産生物の多くは、炎症誘発又は免疫調節機能にも関連している。補体系は、３種の酵素活性化カスケード：古典的経路、レクチン経路及び副経路に体系化される血漿及び膜関連タンパク質からなる。３種すべての経路は、終末補体複合体／膜侵襲複合体（ＴＣＣ／ＭＡＣ、terminal complement complex/membrane attack complex）及び一連の生物学的に活性な産物の形成をもたらすことができる。
ヒト細胞及び器官は、相同性補体媒介溶解からそれらを保護する膜結合補体調節タンパク質のファミリーを有する。これらの補体調節タンパク質として、ＣＤ５５（崩壊促進因子、ＤＡＦ、decay-accelerating factor）、ＣＤ４６（膜補因子タンパク質、ＭＣＰ、membrane cofactor protein）、ＣＤ３５（補体受容体１、ＣＲ１、complement receptor 1）及びＣＤ５９（反応性溶解の膜阻害剤）が挙げられる（Carroll, M. C., E. M. Alicot, P. J. Katzman, L. B. Klickstein, J. A. Smith, and D. T. Fearon. 1988. Organization of the genes encoding complement receptors type 1 and 2, decay-accelerating factor, and C4-binding protein in the RCA locus on human chromosome 1. J. Exp. Med. 167:1271、Rey-Campos, J., P. Rubinstein, and S. Rodriguez de Cordoba. 1988. A physical map of the human regulator of complement activation gene cluster linking the complement genes CR1, CR2, DAF, and C4BP. J. Exp. Med. 167:664、Lublin, D. M., and J. P. Atkinson. 1989. Decay-accelerating factor: biochemistry, molecular biology, and function. Annu. Rev. Immunol. 7:35. 5. Nakano, Y., K. Sumida, N. Kikuta, N. H. Miura, T. Tobe, and M. Tomita. 1992. Complete determination of disulfide bonds localized within the short consensus repeat units of decay accelerating factor (CD55 antigen). Biochim. Biophys. Acta 1116:235、Morgan, B. P., and S. Meri. 1994. Membrane proteins that protect against complement lysis. Springer Semin. Immunopathol. 15:369、Kim D.D., and W.C. Song. 2006. Membrane complement regulatory proteins. Clin. Immunol. 118:127）。
ＣＤ５５は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ、glycosylphosphatidylinositol）アンカータンパク質であり、そのＣ末端の糖脂質成分（ＧＰＩアンカー）を通じて細胞原形質膜に付着する。ＣＤ５５などのＧＰＩアンカータンパク質は、取り込まれ、分解又は切断され、細胞原形質膜から放出される場合がある（Censullo, P., and M.A. Davitz. 1994a. How GPI-anchored proteins turnover: or where do they go after arrival at the plasma membrane. Semin Immunol. 6:81、Censullo, P., and M.A. Davitz. 1994b. The fate of GPI-anchored molecules. Braz J. Med. Biol. Res. 27:289、Turner A.J. 1994. PIG-tailed membrane proteins. Essays Biochem. 28:113）。例えばＣＤ５５を含むＧＰＩアンカータンパク質は、ＧＰＩ特異的ホスホリパーゼＣ及びＤの作用によって細胞表面から放出される場合がある（Turner A.J. 1994. PIG-tailed membrane proteins. Essays Biochem. 28:113）。これらの酵素活性は、ＧＰＩアンカータンパク質の異化反応を調節し、これらのタンパク質の細胞表面発現を制御している可能性がある（Censullo, P., and M.A. Davitz.1994b. The fate of GPI-anchored molecules. Braz J. Med. Biol. Res. 27:289）。
Pecora, A.L., Rizvi, N., Cohen, G.I., Meropol, N.J., Sterman, D., Marshall, J.L., Goldberg, S., Gross, P., O’Neil, J.D., Groene, W.S., Roberts, M.S., Rabin, H., Bamat, M.K., and R.M. Lorence. 2002. Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J. Clin. Oncol. 20:2251 Laurie, S.A., Bell, J.C., Atkins, H.L., Roach, J., Bamat, M.K., O’Neil, J.D., Roberts, M.S., Groene, W.S., and R.M. Lorence. 2006. A phase 1 clinical study of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, using two-step desensitization. Clin. Cancer Res. 12:2555 Lorence, R.M., Roberts, M.S., O’Neil, J.D., Groene, W.S., Miller, J.A., Mueller, S.N., and M.K. Bamat. 2007. Phase 1 clinical experience using intravenous administration of PV701, an oncolytic Newcastle disease virus. 7:157 Volanakis, J.E., 1998. Chapter 2. In The Human Complement System in Health and Disease. Edited by J. E. Volanakis, and M.M. Frank. Marcel Dekker, Inc., New York pp 9-32 Carroll, M. C., E. M. Alicot, P. J. Katzman, L. B. Klickstein, J. A. Smith, and D. T. Fearon. 1988. Organization of the genes encoding complement receptors type 1 and 2, decay-accelerating factor, and C4-binding protein in the RCA locus on human chromosome 1. J. Exp. Med. 167:1271 Rey-Campos, J., P. Rubinstein, and S. Rodriguez de Cordoba. 1988. A physical map of the human regulator of complement activation gene cluster linking the complement genes CR1, CR2, DAF, and C4BP. J. Exp. Med. 167:664 Lublin, D. M., and J. P. Atkinson. 1989. Decay-accelerating factor: biochemistry, molecular biology, and function. Annu. Rev. Immunol. 7:35. 5. Nakano, Y., K. Sumida, N. Kikuta, N. H. Miura, T. Tobe, and M. Tomita. 1992. Complete determination of disulfide bonds localized within the short consensus repeat units of decay accelerating factor (CD55 antigen). Biochim. Biophys. Acta 1116:235 Morgan, B. P., and S. Meri. 1994. Membrane proteins that protect against complement lysis. Springer Semin. Immunopathol. 15:369 Kim D.D., and W.C. Song. 2006. Membrane complement regulatory proteins. Clin. Immunol. 118:127 Censullo, P., and M.A. Davitz. 1994a. How GPI-anchored proteins turnover: or where do they go after arrival at the plasma membrane. Semin Immunol. 6:81 Censullo, P., and M.A. Davitz. 1994b. The fate of GPI-anchored molecules. Braz J. Med. Biol. Res. 27:289 Turner A.J. 1994. PIG-tailed membrane proteins. Essays Biochem. 28:113
本発明は、（ａ）ＣＤ５５ペプチド配列、（ｂ）前記ＣＤ５５配列のＣ末端側にリンカー配列、（ｃ）前記リンカー配列のＣ末端側に膜貫通ドメイン、及び（ｄ）前記膜貫通ドメインのＣ末端側に細胞内ドメインを含む組換え融合タンパク質であって、ＧＰＩアンカーを含有しない融合タンパク質を提供する。本発明は、前記タンパク質をコードする核酸及び発現ベクター、前記タンパク質を発現する細胞、前記タンパク質をウイルス膜上に組み込んでいるエンベロープウイルス、前記タンパク質を組み込んでいる本発明のウイルスを含む医薬組成物、並びに治療方法及びウイルスの使用も提供する。
本発明は、融合タンパク質を発現しないウイルスと比較して回収率が高いことによって証明されるとおり、本発明による融合タンパク質を発現するウイルスが正常ヒト血清による不活性化に耐性であったという発見に一部基づいている。ウイルス膜上の組換え融合タンパク質の形態で補体阻害剤を組み込んでいる本発明の改変された細胞によって産生された腫瘍溶解性エンベロープウイルスは、ウイルス膜上の補体阻害剤を欠いている対応するウイルスと比較して、良好ながん治療剤であり、腫瘍に入る前のヒト血清循環におけるその生存能力によってがん患者に良好な臨床転帰を提供する。利益は、以下の３つからなる：１）腫瘍溶解性ウイルスをバイオリアクターでの細胞培養系において産生することができる；２）ニワトリ卵において産生される親腫瘍溶解性ウイルスと比較して、同じ治療有効性を達成するために必要なウイルス性粒子が少ない；３）より少ないウイルス性粒子のがん患者への注入により、サイトカインストームなどの多量のウイルス粒子に伴う副作用又は不純物に関連する影響を低減できる。
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の防御における補体調節タンパク質ＣＤ５５の効果を研究した他の人々は（Biswas, M., Johnson, J.B., Kumar, S.R.P. Parks, G.D., and E. Subbiah. 2012. Incorporation of host complement regulatory proteins into Newcastle disease virus enhances complement evasion. J. Virol. 86:12708、Rangaswamy, U.S., Cotter, C.R., Chang, X., Jin, H., and Z. Chen. 2016. CD55 is a key complement regulatory protein that counteracts complement-mediated inactivation of Newcastle disease virus. J. Gen. Virol. 97:1765）、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを含む天然の未改変ＣＤ５５を使用した。対照的に本発明の融合タンパク質は、ＧＰＩアンカーを除く。理論に束縛されることなく、ＧＰＩアンカーの除去が細胞表面でのＣＤ５５の異化動態を変化させたと考えられる。本発明の融合タンパク質は、Biswas及びRangaswamyによって利用されたものよりさらにストリンジェントな不活性化条件に抵抗することができた。不活性化アッセイにおいてBiswasは５〜１０％正常ヒト血清を使用し、Rangaswamyは０．３〜５％正常ヒト血清を使用した。下記の実施例は、組換え融合タンパク質を組み込んだＮＤＶで不活性化アッセイを実施するために４０％正常ヒト血清を使用した。
分泌シグナルペプチド、ＣＤ５５の４個のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ、short consensus repeat）、可動性リンカー、ＣＤ８膜貫通ドメイン、及びトランケートしたＣＤ８細胞内ドメインからなる組換え補体阻害性融合タンパク質に続いてＩＲＥＳ−ｎｅｏ選択可能マーカー及び合成ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡ）をコードする哺乳動物細胞発現コンストラクトマップ配列を示す図である。 改変されたＤＦ１細胞膜又は改変ＮＤＶ膜の成熟補体阻害性融合タンパク質の向きを例示する図である。 組換え補体阻害性融合タンパク質の細胞表面発現を示すグラフである。ＣＤ５５特異的抗体による融合タンパク質発現についてのフローサイトメトリー分析。左側のヒストグラムは、陰性対照としての未処置ＤＦ１細胞を示している。右側のヒストグラムは、配列番号２を安定に発現するＤＦ１細胞（細胞クローン番号８）を示している。 腫瘍細胞株において補体阻害性融合タンパク質を組み込まれた改変されたＤＦ１細胞（クローン番号８）によって産生されたＮＤＶの細胞毒性アッセイを示すグラフである。 分泌シグナルペプチド、ＣＤ５５の４個のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）、可動性リンカー、ＣＤ８膜貫通ドメイン、及びトランケートしたＣＤ８細胞内ドメインからなる組換え補体阻害性融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。二重下線は、分泌シグナルペプチドを示す。標準書体は、ＣＤ５５のＳＣＲを示す。下線は、（Ｇ４Ｓ１）３リンカーを示す。太字は、ＣＤ８膜貫通ドメインを示す。斜字体は、トランケートしたＣＤ８細胞内ドメインを示す。
本発明の融合タンパク質によれば、配列（ａ）には、任意のＣＤ５５ペプチド配列を利用することができる。一実施形態では、ＣＤ５５ペプチド配列はヒトＣＤ５５ペプチド配列である。ＣＤ５５ペプチド配列は、ＣＤ５５の４個のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）を含むことが好ましい。配列（ｂ）には、任意の可動性リンカー、例えば当技術分野において周知の従来法の可動性リンカーを利用することができる。一実施形態では、Ｇ４Ｓ１リンカー、好ましくは（Ｇ４Ｓ１）３リンカーが利用される。配列（ｃ）には、任意の膜貫通ドメイン、例えば当技術分野において周知の従来の膜貫通ドメインを利用することができる。一実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインである。配列（ｄ）には、任意の細胞内ドメイン、例えば従来の細胞内ドメインを利用することができる。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン、好ましくはトランケートしたＣＤ８膜貫通ドメインである。
本発明の融合タンパク質は、配列（ａ）のＮ末端側に分泌シグナルペプチドをさらに含んでよい。本発明の好ましいプロセスによれば、融合タンパク質は、最初にシグナルペプチドと共に発現される。シグナルペプチドは、新たに合成された融合タンパク質を小胞体（ＥＲ）に誘導し、そこでシグナルペプチダーゼによってシグナルペプチドが切断される。配列番号２は、Ｎ末端シグナルペプチドを有する本発明の例示的融合タンパク質である。配列番号３は、Ｎ末端シグナルペプチドを有さない本発明の例示的融合タンパク質である。
本発明の融合タンパク質によれば、Ｎ末端シグナルペプチドと配列（ａ）の間、配列（ａ）と配列（ｂ）の間、配列（ｂ）と配列（ｃ）の間、配列（ｃ）と配列（ｄ）の間、これらの任意の２個の間、これら任意の３個の間又は４個すべての間に１又は２以上のアミノ酸のスペーサーがあってよい。本発明の一実施形態では、Ｎ末端（teminal）シグナルペプチドと配列（ａ）の間にスペーサーはないか、又は言い換えると、Ｎ末端シグナルペプチドは、単一のペプチド結合によって配列（ａ）と共有結合している。別の実施形態では、Ｎ末端シグナルペプチドと配列（ａ）の間にスペーサーがある。
本発明の一実施形態では、配列（ａ）と配列（ｂ）の間にスペーサーはないか、又は言い換えると配列（ａ）は単一のペプチド結合によって配列（ｂ）と共有結合している。別の実施形態では、配列（ａ）と配列（ｂ）の間にスペーサーがある。本発明の一実施形態では、配列（ｂ）と配列（ｃ）の間にスペーサーはないか、又は言い換えると配列（ｂ）は単一のペプチド結合によって配列（ｃ）と共有結合している。別の実施形態では、配列（ｂ）と配列（ｃ）の間にスペーサーがある。本発明の一実施形態では、配列（ｃ）と配列（ｄ）の間にスペーサーはないか、又は言い換えると配列（ｃ）は単一のペプチド結合によって配列（ｄ）と共有結合している。別の実施形態では、配列（ｃ）と配列（ｄ）の間にスペーサーがある。原則として、スペーサーのサイズに制限はない。
ＣＤ５５は、４個の細胞外ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｐｒｏ（ＳＴＰ、Ser/Thr/Pro）リッチ領域及びＧＰＩアンカードメインを含有する。本発明の融合タンパク質によれば、ＧＰＩアンカードメインは除かれている。ＳＴＰリッチ領域は、存在しても存在しなくてもよい。本発明の融合タンパク質コード配列の一実施形態は、第３のペプチド配列コード配列のＣ末端側にポリアデニル化シグナルをさらに含む。ポリアデニル化シグナル（Ｐｏｌｙ Ａ）は、任意のＰｏｌｙ Ａであってよい。
本発明は、上記のタンパク質をコードする核酸を提供する。一実施形態では、核酸はＤＮＡである。シグナルペプチドをコードする配列と配列（ａ）の間、配列（ａ）と配列（ｂ）の間、配列（ｂ）と配列（ｃ）の間、配列（ｃ）と配列（ｄ）の間、又は他所のいずれかに１又は２以上のイントロンを含有してよい。本発明の一実施形態では、核酸は、配列番号２又は配列番号３の配列を有するタンパク質をコードする。配列番号１は、配列番号２の配列を有するタンパク質をコードする核酸の一例である。同一のアミノ酸についての異なる核酸コドントリプレットコード、遺伝暗号の縮重として周知である関係のために、配列番号２の配列を有するタンパク質をコードする多数の他の核酸配列は容易に想定でき、本発明に含まれる。
本発明の実施形態は、制御配列、例えばプロモーターに作動可能に連結された上記の核酸を含む発現ベクターである。融合タンパク質を駆動するプロモーターは、任意のプロモーターであってよく、ＣＭＶプロモーターに限定されない。プロモーターと融合タンパク質コード配列の間にイントロンがある場合、任意の適切な従来のイントロンを利用することができる。例えばβグロビンイントロンは適切である。
本発明は、本発明の融合タンパク質をその細胞表面に安定に発現する細胞株を提供する。本発明によれば、タンパク質発現のための任意の従来の細胞株を使用することができる。一実施形態では、細胞株は哺乳動物細胞株である。別の実施形態では、細胞株は、非哺乳動物細胞株、例えばＤＦ−１ニワトリ胚線維芽細胞株である。
本発明は、上記の融合タンパク質をウイルス膜上に組み込んでいるエンベロープウイルスを提供する。本発明によれば、任意のエンベロープウイルスを利用することができる。一実施形態では、ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルス、例えばニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）などのパラミクソウイルスである。実施例では、組換え融合タンパク質の形態にある補体阻害剤が、ＮＤＶ粒子エンベロープに組み込まれた。本発明の組換え融合タンパク質は、ＮＤＶ以外の腫瘍溶解性ウイルスのために使用して、宿主補体不活性化にさらに耐性である腫瘍溶解性ウイルス性粒子の生成をもたらすこともできる。融合タンパク質の形態の新規の組換え補体阻害剤を使用して、HeLa細胞などの任意の他の哺乳動物細胞を改変することにより、腫瘍溶解性ウイルスを産生することもできる。腫瘍溶解性ウイルスは、その内容が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０００／０６２７３５号パンフレットに記載されている。その結果が下に示される実験において利用されたＮＤＶは、国際公開第ＷＯ２０００／０６２７３５号パンフレットに記載されたＰＰＭＫ１０７であった。
ウイルスは、ウイルス及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に組み込むことができる。本発明は、哺乳動物対象において新生物状態（neoplastic condition）を治療するための方法であって、対象に、新生物状態を治療するのに有効な量の上記のウイルスを投与することを含む方法を提供する。がん治療のために、ウイルスは、患者に任意の従来法の経路を介して、例えば１回又は２回以上の腫瘍内又は静脈内注射によって投与することができる。腫瘍内投与の場合、用量範囲は腫瘍あたり１×１０７〜５×１０１２ｐｆｕであってもよい。静脈内投与の場合、用量範囲は１×１０７〜１×１０１３ｐｆｕ／ｍ２であってもよい（「Ｐｆｕ」は、「プラーク形成単位」（plaque forming unit）の略称である）。
本発明による腫瘍溶解性ウイルスを、ＧＭＣＳＦなどの他の分子を組み込むように改変して、腫瘍溶解性ウイルスの有効性を増強することもできる。さらに、腫瘍溶解性ウイルスは、抗ＰＤ１又は抗ＰＤＬ１分子などのチェックポイント阻害剤との併用がん療法の一部とすることもできる。さらに腫瘍溶解性ウイルスは、他の化学療法薬との併用がん療法の一部とすることもできる。化学療法薬は、これだけに限らないがカンプトテシン化合物、例えばイリノテカン又はトポテカンであってもよい。
本明細書において述べるすべての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許及び特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれると示されたのと同様に、本明細書にその全体が参照により組み込まれる。前述の刊行物、特許及び特許出願のいずれかを含んで公表された任意の追加的情報は、同様に参照により組み込まれる。例えば一部の学術論文は、典型的にはオンラインで入手可能である追加的情報を含んで公表される。
本発明は、本明細書に記載の本発明を例示するが限定しない次の実施例を参照することによってさらに理解される。
［実施例］
分泌シグナルペプチドの下流にＣＤ５５の４個のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）に続いて可動性リンカー（３×Ｇ４Ｓ１）並びにＣＤ８膜貫通及びトランケートしたＣＤ８細胞内ドメインを含む組換えＣＤ５５の改変体を作製した（図１）。コード配列を、ＣＭＶプロモーター、組換えタンパク質発現を駆動する合成イントロンを有する哺乳動物発現コンストラクトにクローニングした。発現カセットは、ＩＲＥＳの下流に薬物選択可能マーカー、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼも含有した。遺伝子発現カセットは、合成ポリアデニル化シグナルで終わった。配列番号１は、哺乳動物細胞発現コンストラクトのヌクレオチド配列である。配列番号２は、発現されるタンパク質のアミノ酸配列を表す。ニワトリ胚線維芽細胞ＤＦ１細胞表面で発現される又はウイルス膜に組み込まれる場合、ＣＤ５５ ＳＣＲが細胞又はウイルス膜の外側にあり、細胞又はウイルス膜に隣接する可動性リンカーがＣＤ５５のＳＣＲにその生物学的機能を発揮するような最大の可動性を提供する、すなわち補体経路の中心的調節因子であるＣ３転換酵素を無効にするような立体配置／方向を有する成熟組換え融合タンパク質（配列番号３）をもたらすように、シグナルペプチドは切断される。可動性リンカーには、ＣＤ８膜貫通ドメイン及びトランケートしたＣＤ８細胞内ドメインが続く。
哺乳動物発現コンストラクトをニワトリ胚線維芽細胞ＤＦ１細胞にＰＥＩ ２５Ｋ（ポリエチレンイミン、直鎖２５ｋＤａ、Polysciences社、カタログ番号23966）媒介トランスフェクションを介してトランスフェクトした。トランスフェクション７２時間後、トランスフェクトした細胞を、配列番号２を恒常的に発現する安定細胞株を作製するために３００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Geneticin（登録商標）、アミノグリコシド抗菌薬）において選択した。安定細胞株は、成熟ヒトＣＤ５５に特異的であるモノクローナル抗体（R&D Systems社、カタログ番号MAB20091）によって検出されるとおり、配列番号３をその細胞表面に恒常的に発現した。図３に示すとおり組換え融合タンパク質は、フローサイトメトリーによって分析されたとおり（図３、右側のヒストグラム）組換え融合タンパク質をコードするコンストラクトを安定にトランスフェクトされたＤＦ１細胞上に発現された。未処置ＤＦ１細胞を陰性対照とした（図３、左側のヒストグラム）。
細胞表面に配列番号３を発現する安定細胞株を、胚形成ニワトリ卵から産生された野生型ＮＤＶに感染させた。次いでウイルスの力価をヒト腫瘍細胞株ＨＴ１０８０上で決定した。等量のウイルス（ＰＦＵによって測定）を４０％正常ヒト血清（ＮＨＳ、normal human serum）及び４０％熱不活性化正常ヒト血清（ｉＮＨＳ、inactivated normal human serum）をそれぞれ用いたインキュベーションに供した。ヒト血清を用いたインキュベーション後に生存していたウイルスを、次にプラークアッセイによってＨＴ１０８０細胞上でスコア化した。ＮＨＳ対ｉＮＨＳを用いたインキュベーション後に回収されたウイルスの割合を算出した。表１に示すとおり、胚形成ニワトリ卵において産生されたウイルスについての回収率は０．５％であり、ニワトリ卵によって産生されたＮＤＶ粒子の大部分がヒト補体副経路によって不活性化される可能性が高いことを示唆していた。同様に親ニワトリ胚線維芽細胞ＤＦ１細胞によって産生されたウイルスについての回収率も０．５％であった。驚くべきことに、細胞表面に配列番号３を安定に発現するバルク非クローン性ＤＦ１細胞から産生されたウイルスについての回収率は５．８％であり、野生型ウイルスより１０倍を超えて高かった。配列番号３を発現するＤＦ１細胞の合計１１個のクローン性集団を検討した場合、５個のクローンがバルク非クローン性細胞株より低い回収率を記録し、６個のクローンが高い回収率を記録して回収率は０．８〜２０％の範囲であった（表１）。クローン番号８によって生成されたウイルスは、胚形成ニワトリ卵又は親ＤＦ１細胞のいずれかによって産生されたウイルスより２０倍高い１０％の回収率を有した。クローン番号４０によって生成されたウイルスは、胚形成ニワトリ卵又は親ＤＦ１細胞のいずれかによって産生されたウイルスより４０倍高い２０％の回収率を有した。これらのデータは、正常ヒト血清中に存在する補体活性が、胚形成ニワトリ卵又は親ニワトリ胚線維芽細胞ＤＦ１細胞によって産生されたＮＤＶ粒子を急速に破壊したことを強く示唆している。しかし、細胞表面に組換え補体阻害剤を安定に発現するＤＦ−１細胞によって産生された新規ＮＤＶ粒子は、同一の実験条件下で４０％正常ヒト血清を用いたインキュベーション後にニワトリ卵又は親ＤＦ１細胞のいずれかによって産生されたウイルスと比較して、最大４０倍という顕著に高い回収率を示した。
細胞表面に補体阻害性融合タンパク質を安定に発現するＤＦ１細胞（クローン番号８）から産生されたＮＤＶの広域スペクトル腫瘍溶解性活性をCellTiter96（登録商標）AQueous One Solutionを使用して評価した。この溶液は、代謝的に活性な細胞が試薬中のＭＴＳテトラゾリウム（すなわち、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）を可溶性発色ホルマザンに生体還元（bio-reduce）できる、ＭＴＴ（すなわち、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイと同様に機能する。簡潔には、３種の異なる腫瘍細胞株であるＨＴ１０８０（線維肉腫）、ＰＡＮＣ−１（膵臓上皮癌）及びＯＶ−ＣＡＲ３（卵巣腺癌）を（where grown）別々の９６ウェルプレートで増殖させた。翌日、ＮＤＶウイルスの系列希釈物をそれぞれのウェルに加え、プレートを６日間、５％ＣＯ２を含む３７℃インキュベーターでインキュベートした。６日目に、各プレートのすべてのウェルの吸光度を４９０ｎｍで分光光度計を使用して測定した。ＩＣ５０を各細胞株について４パラメーターロジスティック非線形回帰分析を使用して算出した。これは、ＨＴ１０８０、ＯＶ−ＣＡＲ−３及びＰＡＮＣ−１細胞株についてそれぞれ２５５、１２０及び４７ｐｆｕ／ウェルの最終ＩＣ５０値をもたらした（図４）。これらの結果は、その細胞表面に組換え補体阻害剤を安定に発現したＤＦ−１細胞によって産生されたＮＤＶ粒子が用量依存的様式で種々の腫瘍細胞株を溶解する能力を保持していることを示している。
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Claims (34)

  1. （ａ）ＣＤ５５ペプチド配列、（ｂ）前記ＣＤ５５配列のＣ末端側にリンカー配列、（ｃ）前記リンカー配列のＣ末端側に膜貫通ドメイン、及び（ｄ）前記膜貫通ドメインのＣ末端側に細胞内ドメインを含む融合タンパク質であって、ＧＰＩアンカーを含有しない、前記融合タンパク質。
  2. ＣＤ５５ペプチド配列がヒトＣＤ５５ペプチド配列である、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 配列（ａ）がＣＤ５５の４個のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  4. リンカーが（Ｇ４Ｓ１）３リンカーである、請求項１に記載のタンパク質。
  5. 膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインである、請求項１に記載のタンパク質。
  6. 細胞内ドメインが、トランケートしたＣＤ８細胞内ドメインである、請求項１に記載のタンパク質。
  7. ペプチド配列（ａ）が、単一のペプチド結合によってペプチド配列（ｂ）と共有結合している、請求項１に記載のタンパク質。
  8. ペプチド配列（ａ）が、スペーサーによってペプチド配列（ｂ）と共有結合している、請求項１に記載のタンパク質。
  9. ペプチド配列（ｂ）が、単一のペプチド結合によってペプチド配列（ｃ）と共有結合している、請求項１に記載のタンパク質。
  10. ペプチド配列（ｂ）が、スペーサーによってペプチド配列（ｃ）と共有結合している、請求項１に記載のタンパク質。
  11. ペプチド配列（ｃ）が、単一のペプチド結合によってペプチド配列（ｄ）と共有結合している、請求項１に記載のタンパク質。
  12. ペプチド配列（ｃ）が、スペーサーによってペプチド配列（ｄ）と共有結合している、請求項１に記載のタンパク質。
  13. 融合タンパク質が、配列（ａ）のＮ末端側に分泌シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載のタンパク質。
  14. 分泌シグナルペプチドがＣＤ５５の分泌シグナルペプチドである、請求項１３に記載のタンパク質。
  15. Ｎ末端分泌シグナルペプチドが、単一のペプチドによって配列（ａ）と共有結合している、請求項１３に記載のタンパク質。
  16. Ｎ末端分泌シグナルペプチドが、スペーサーによって配列（ａ）と共有結合している、請求項１３に記載のタンパク質。
  17. 配列番号２の配列を有する、請求項１に記載のタンパク質。
  18. 配列番号３の配列を有する、請求項１に記載のタンパク質。
  19. 請求項１〜１８のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
  20. ＤＮＡである、請求項１９に記載の核酸。
  21. １又は２以上のイントロンをさらに含む、請求項２０に記載の核酸。
  22. 配列番号２の配列を有するタンパク質をコードする、請求項１９に記載の核酸。
  23. 配列番号１の配列を有する、請求項２２に記載の核酸。
  24. 制御配列に作動可能に連結された、請求項１９〜２３のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクター。
  25. 請求項１〜１８のいずれかに記載のタンパク質を細胞表面に安定に発現する細胞株。
  26. 哺乳動物細胞株である、請求項２５に記載の細胞株。
  27. ＤＦ−１ニワトリ胚線維芽細胞株である、請求項２５に記載の細胞株。
  28. 請求項１〜１８のいずれかに記載のタンパク質をウイルス膜上に組み込んでいるエンベロープウイルス。
  29. 腫瘍溶解性ウイルスである、請求項２８に記載のウイルス。
  30. 腫瘍溶解性ウイルスがニューカッスル病ウイルスである、請求項２９に記載のウイルス。
  31. 請求項２９又は３０に記載のウイルスと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  32. 哺乳動物対象において新生物状態を治療するための方法であって、前記状態を治療するのに有効な量の、請求項２８に記載のウイルスを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
  33. ウイルスが腫瘍内投与される、請求項３２に記載の方法。
  34. ウイルスが静脈内投与される、請求項３２に記載の方法。
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