KR20150069017A

KR20150069017A - 혈소판 표적화 치료

Info

Publication number: KR20150069017A
Application number: KR1020157012821A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 에이. 윌콕스; 산드라 엘. 하베릭터
Original assignee: 플레이틀렛 타게티드 테라퓨틱스, 엘엘씨
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2013-10-24
Publication date: 2015-06-22
Also published as: US10294291B2; US20150344541A1; BR112015009229A2; EP2912186B1; US20190270791A1; JP2016501515A; HK1211986A1; EP3859004A1; IL238417A0; WO2014066663A1; EP2912186A4; CA2888982C; DK2912186T3; US9982034B2; IL238417B; ES2854754T3; EP2912186A1; JP2018161152A; JP6975105B2; PL2912186T3

Abstract

본 개시는 혈소판에 대해 외인성 유전자의 발현을 표적화하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 혈소판에 대한 외인성 제제(예로, 응고 인자)의 발현 표적화에 의한 혈우병 및 다른 질환 및 병태의 치료에 관한 것이다.

Description

혈소판 표적화 치료{PLATELET TARGETED TREATMENT}

본 출원은 2012. 10. 24.에 출원된 미국 가출원 번호 61/717,951을 우선권으로 청구하며, 이는 본원에 그 전문이 참조로 도입된다.

발명의 분야

혈우병은 환자의 혈액이 정상적으로 응고하지 않아서 종종 사망으로 이어지는 중증 내출혈을 유도하는 일반적인 출혈 장애이다(약 1:10,000 남성에서 일어남). 혈우병은 보통 출생 시 시작되어 개인의 일생에 걸쳐 재발생하는 중증의 제어되지 않는 출혈 사례를 나타내는 환자에서 유전된다. 혈액이 응고하는 것을 돕기 위해 혈소판과 함께 작용하는 몇몇 유형의 응고 인자가 존재하지만, 혈우병이 있는 사람들은 보통 정상적인 지혈을 방지하는 응고 인자 VIII(혈우병 A) 또는 인자 IX(혈우병 B)를 인코딩하는 단백질에 정량적인 또는 정성적인 결함을 갖는다.

조혈 줄기 세포는 골수에서 분화하여 혈소판으로 알려진 수천 개의 작은 단편으로 성숙하고 나뉘는 거핵구를 형성하며, 이는 정상 상태에서는 약 10일 동안 혈류에서 조용히 순환하고(다른 혈액 세포 또는 혈관 벽과 상호작용하지 않고) 그 주요 업무는 부상을 복구하기 위해 활성화되어, 형태를 변경하고, 손상된 혈관에 부착하는 것이다. 혈관이 부상을 입은 경우, 응고 인자는 혈소판이 함께 부착하여 절단부를 막고 혈관 파단부를 닫아 출혈을 멈추도록 돕는다.

혈우병 A가 있는 사람들은 응고 인자 VIII이 없거나 수준이 낮다. 혈우병이 있는 사람들 10명 중 9명이 A형이다. 혈우병 B가 있는 사람들은 응고 인자 IX가 없거나 수준이 낮다. 두 응고 인자 모두 정상적으로는 간에서 합성되지만, 다른 세포 유형이 재조합 FVIII 및 FIX 단백질의 완전한 기능적 형태를 합성하도록 유도될 수 있다는 보고들이 존재한다.

혈우병은 얼마나 많은 정상적인 기능적 응고 인자가 혈액에 존재하는지에 따라 경증, 중등, 또는 중증일 수 있다. 혈우병 A가 있는 사람들 10명 중 7명은 중증 형태의 장애를 갖는다.

보통 인자 VIII 및 IX가 X 염색체에 존재하므로 혈우병은 남성에서 일어난다(영향을 받은 아버지와 질환 보인자인 어머니로부터 각각 결함이 있는 X 염색체를 유전받은 여성과 같이 드문 예외도 있음). 전 세계에 걸쳐 매년 10,000명 중 약 1명의 개인이 혈우병을 가지고 태어난다.

혈우병에 대한 주요 치료는 단백질 대체 치료법이다. 응고 인자 VIII(혈우병 A를 위해) 또는 응고 인자 IX(혈우병 B를 위해)의 농축물이 공여자 혈액 풀 또는 FVIII 또는 FIX를 인코딩하는 정상 유전자로 형질전환된 조직 배양 세포주로부터 제조된 재조합 단백질로부터 단리될 수 있고, 심각한 출혈 사례의 개시 시 느리게 적가되거나 정맥 내로 주사된다. 이들 주입은 부재하거나 수준이 낮은 응고 인자의 대체를 돕는다.

대체 치료법의 합병증에는 궁극적으로 약 30% 환자에서 응고 인자의 불활성화 또는 파괴 및 제어되지 않는 출혈로 이어지는 환자의 면역계에 대해 외래인 정상적인 치료 단백질에 대한 항체 반응의 발생(저해제 형성으로 알려져 있음)으로 인해, 인간 응고 인자로부터의 바이러스 감염 발생(특히 제3 세계 국가의 감염된 혈액 공여자로부터 HIV 또는 간염으로 오염된 혈액에서 유래됨), 치료 지연으로 야기되는 신체의 관절, 근육 또는 다른 부분에 대한 중증 혈관 부상 및 손상을 진정시키기 위해 빈번한 재투여를 필요로 하는 매우 짧은 반감기(수일)를 갖는 대체 단백질의 매우 고가의 비용이 포함된다.

따라서, 이러한 합병증을 극복하는 혈우병에 대한 새로운 치료가 필요하다.

발명의 요약

본 개시는 혈소판에 대해 외인성 유전자의 발현을 표적화하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 혈소판에 대한 외인성 제제(예로, 응고 인자)의 발현 표적화에 의한 혈우병 및 다른 질환 및 상태의 치료에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시는 골수 거핵구 내에서의 외인성 유전자의 발현 표적화가 인간 혈소판 내에서 재조합 치료 단백질의 발현 및/또는 저장으로 이어지는 조혈 줄기 세포 유전자 치료법을 위한 조성물 및 임상적으로 관련된 방법에 관한 것이다.

예를 들어 일부 구현예에서, 본 발명은 a) 인테그린 αIIb 유전자(ITGA2B) 프로모터의 단편을 포함하는 발현 카세트; 및 발현 카세트에 작동 가능하게 연결된 관심 외인성 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 예를 들어, 서열 목록 번호 21, 22, 또는 23, 또는 서열 목록 번호 21, 22, 23, 또는 25보다 더 크거나 더 작은 서열(예로, 서열 목록 번호 21, 22, 23, 및 25보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 또는 초과의 뉴클레오티드가 더 크거나 더 작음)로부터 선택된 핵산 서열 또는 이들의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 표적화 인자(예로, D2 도메인에 작동 가능하게 연결된 인간 폰 빌레브란트 인자 프로펩티드(VWFpp)의 단편)(예로, 서열 목록 번호 24에 기재된 바와 같거나 서열 목록 번호 24보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 또는 초과의 뉴클레오티드가 더 크거나 더 작은 서열 또는 서열 목록 번호 24의 단편)를 추가로 포함한다. 본 발명은 특정한 외인성 유전자로 제한되지 않는다. 예에는 비제한적으로 인간 FVIII 또는 FIX 유전자가 포함된다. 일부 구현예에서, 벡터는 자가 불활성화 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터(예로, 렌티바이러스 벡터)이다.

추가 구현예는 본원에 기재된 발현 벡터를 포함하는 조혈 줄기 세포(예로, 생체외 줄기 세포)를 제공한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 동물(예로, 인간)에서 질환 및 상태(예로, 혈우병)를 치료하기 위한 이러한 줄기 세포의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 유전자(예로, 인자 VIII 유전자)가 개질된 줄기 세포에서 발현되는 조건 하에 개질된 줄기 세포를 생성하기 위해 조혈 줄기 세포를 본원에 기재된 바와 같은 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 동물(예로, 인간) 내로 상기 개질된 줄기 세포의 전달 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 혈우병으로 진단받았고, 전달은 동물에서 과도한 출혈을 치료하거나 예방한다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 생체외에서 일어난다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 동물로부터 가동화된다(예로 시토카인의 투여, 말초 혈액 내로의 가동화, 성분 채집 수집물과의 접촉, 면역 자기 비드 단리에 의해). 일부 구현예에서, 동물은 혈소판에서 상기 인자 VIII을 발현한다. 일부 구현예에서, 방법은 반복된다(예로, 정기적인 간격으로 또는 필요 시).

추가 구현예가 본원에 기재된다.

도면의 설명

도 1은 혈소판-표적화된 렌티바이러스 벡터 설계를 나타낸다. (A) ITGA2B 유전자 프로모터 단편은 루시퍼라아제에서 거핵구-특이적 발현을 유도한다. (B) -889ITGA2B-BDDFVIII-WPTS 렌티바이러스 벡터 도표. (C) -673ITGA2B-VWFSPD2-BDDFVIII-WPTS 렌티바이러스 벡터 도표.

도 2는 BDDFVIII의 개 혈소판 α-과립 내로의 합성 및 수송을 나타낸다. (A) 혈소판 내에서 BDDFVIII 및 Fg의 공동-편재를 나타내는 동일초점 현미경. (B) 전자 현미경에서 인간 BDDFVIII은 α-과립에 직접 편재된 것으로 확인되었다.

도 3은 혈소판 FVIII의 정량적 분석을 나타낸다.

도 4는 FVIII:C를 분비하도록 유도된 활성화된 혈소판을 나타낸다.

도 5는 개 게놈 내에서 렌티바이러스 벡터의 검출 및 위치 확인을 위한 PCR 분석을 나타낸다. (A) 백혈구 게놈 DNA 내에서 BDDFVIII-렌티바이러스 벡터의 장기 검출. (B) 개 게놈 내에서 렌티바이러스 벡터의 위치를 확인하기 위한 선형 증폭-매개(LAM)-PCR.

도 6은 혈소판 BDDFVIII을 이용한 개 혈우병 A 표현형의 교정을 나타낸다.

도 7은 ITGA2B 유전자 프로모터 및 VWFspD2의 구조 영역을 나타낸다. 화살표는 혈소판 표적화된 치료 이전 및 이후의 심각한 출혈 사례를 나타낸다. 개 I42 및 M64는 지혈의 완전 교정을 나타낸다.

도 8은 본 개시의 구현예의 예시적인 렌티바이러스 유전자 치료법 벡터를 나타낸다.

도 9는 도 8의 벡터의 서열(서열 목록 번호 25)을 나타낸다.

도 10은 재조합 렌티바이러스 유전자 전달 구축물에서 이용된 인테그린 αIIb 프로모터 단편에 대한 도표 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. (A) 거핵구-특이적 루시퍼라아제 리포터 연구를 위해 이용된 인간 αIIb-유전자 프로모터 NcoI의 -SalI BglII -1218 내지 +30에 대한 뉴클레오티드 서열(서열 목록 번호 21). (B) 거핵구-특이적 루시퍼라아제 리포터 연구를 위해 이용된 인간 αIIb-유전자 프로모터 NcoI의 -SalI BglII -889 내지 +30에 대한 뉴클레오티드 서열(서열 목록 번호 22). (C) 거핵구-특이적 루시퍼라아제 리포터 연구를 위해 이용된 인간 αIIb-유전자 프로모터 NcoI의 -SalI BglII -673 내지 +30에 대한 뉴클레오티드 서열(서열 목록 번호 23). 번호 지정은 Prandini 외(Biochem Biophys Res Commun 156(1) 595-601, 1988)에 기반한다.

정의

본 발명의 이해를 돕기 위해, 여러 용어 및 어구를 아래에 정의한다:

본원에서 이용되는 용어 "유전자 전달 시스템"은 핵산 서열을 포함하는 조성물을 세포 또는 조직으로 전달하는 임의 수단을 나타낸다. 예를 들어, 유전자 전달 시스템에는 비제한적으로 벡터(예로, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 인간 인공 염색체, 및 다른 핵산-기반 전달 시스템), 네이키드 핵산의 마이크로주입, 중합체-기반 전달 시스템(예로, 리포좀-기반 및 금속 입자-기반 시스템), 바이오리스틱 주입 등이 포함된다. 본원에서 이용되는 용어 "바이러스 유전자 전달 시스템"은 원하는 세포 또는 조직으로 표본 전달을 촉진하기 위해 바이러스 요소(예로, 온전한 바이러스, 개질된 바이러스 및 바이러스 성분, 예컨대 핵산 또는 단백질)를 포함하는 유전자 전달 시스템을 나타낸다. 본원에서 이용되는 용어 "아데노바이러스 유전자 전달 시스템"은 아데노바이러스과에 속하는 온전한 또는 변형된 바이러스를 포함하는 유전자 전달 시스템을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "핵산 분자"는 비제한적으로 DNA 또는 RNA를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 핵산을 나타낸다. 이 용어는 비제한적으로 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실-메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸-아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도-우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠어신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡신, 슈도우라실, 쿠어신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 쿠어신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하는 DNA 또는 RNA의 임의의 공지된 염기 유사체가 포함되는 서열을 포괄한다.

용어 "유전자"는 폴리펩티드, 전구체, 또는 RNA(예로, rRNA, tRNA)의 생산을 위해 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산(예로, DNA) 서열을 나타낸다. 폴리펩티드는 전장 또는 단편의 원하는 활성 또는 기능적 특성(예로, 효소 활성, 리간드 결합, 신호 전달, 면역원성 등)이 보유되는 한, 전장 코딩 서열에 의해 또는 코딩 서열의 임의 부분에 의해 인코딩될 수 있다. 이 용어는 또한 구조 유전자의 코딩 영역 및 유전자가 전장 mRNA의 길이에 대응하도록 어느 한 말단에서 약 1kb 이상의 거리에 대한 5' 및 3' 말단 모두에서 코딩 영역에 인접하여 위치하는 서열을 포괄한다. 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열은 5' 미번역 서열로 불린다. 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA에 존재하는 서열은 3' 미번역 서열로 불린다. 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태를 모두 포괄한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론" 또는 "개입 영역" 또는 "개입 서열"로 명명된 비코딩 서열로 단속되는 코딩 영역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA(hnRNA)로 전사되는 유전자 절편이다; 인트론은 인핸서와 같은 조절 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 핵 또는 일차 전사체로부터 제거되거나 "스플라이스 아웃(spliced out)"된다; 따라서 인트론은 메신저 RNA(mRNA) 전사체에는 존재하지 않는다. mRNA는 번역 동안 신생 폴리펩티드에서 아미노산 서열 또는 순서를 특정하기 위해 기능한다.

본원에서 이용되는 용어 "이종성 유전자"는 그 천연 환경에 있지 않는 유전자를 나타낸다. 예를 들어, 이종성 유전자에는 다른 종으로 도입된 한 종으로부터의 유전자가 포함된다. 이종성 유전자에는 또한 일부 방식으로 변형된(예로, 돌연변이된, 다중 사본으로 부가된, 비천연 조절 서열에 연결된, 등) 개체에 대해 천연인 유전자가 포함된다. 이종성 유전자는 이종성 유전자 서열이 전형적으로 염색체에서 유전자 서열과 자연적으로 연관된 것으로 확인되지 않는 DNA 서열에 연결되거나 자연에서 확인되지 않는 염색체 부분에 연관된다(예로, 유전자가 보통 발현되지 않는 유전자위에서 유전자가 발현된다)는 점에서 내인성 유전자와 구별된다.

본원에서 이용되는 "프로모터/인핸서"는 프로모터 및 인핸서 기능(즉, 프로모터 요소 및 인핸서 요소에 의해 제공되는 기능, 이들 기능의 논의에 대해서는 상기를 참고하라)을 모두 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA 절편을 표시한다. 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복은 프로모터 및 인핸서 기능을 모두 함유한다. 인핸서/프로모터는 "내인성" 또는 "외인성" 또는 "이종성"일 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈에서 주어진 유전자에 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터는 해당 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 유도되도록 유전적 조작(즉, 클로닝 및 재조합과 같은 분자 생물학적 기법)에 의해 유전자에 병치되는 것이다. 조절 요소는 조직 특이적이거나 세포 특이적일 수 있다. 용어 "조직 특이적"은 조절 요소에 적용되는 경우, 상이한 유형의 조직(예로, 간)에서 동일한 관심 뉴클레오티드 서열(들) 발현의 상대적 부재 하에 특정 유형의 조직(예로, 유선)에 대해 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 유도할 수 있는 조절 요소를 나타낸다. 조절 요소의 조직 특이성은, 예를 들어 리포터 유전자를 프로모터 서열(조직-특이적이 아님) 및 조절 요소에 작동 가능하게 연결하여 리포터 구축물을 생성하고, 리포터 구축물이 생성되는 유전자삽입 동물의 모든 조직 내로 통합되도록 리포터 구축물을 동물의 게놈 내로 도입하고, 유전자삽입 동물의 상이한 조직에서 리포터 유전자의 발현을 검출(예로, 리포터 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA, 단백질, 또는 단백질의 활성을 검출)하여 평가될 수 있다. 다른 조직에서의 리포터 유전자의 발현 수준에 비해 하나 이상의 조직에서 리포터 유전자의 더 큰 발현 수준의 검출은 조절 요소가 더 큰 수준의 발현이 검출되는 조직에 대해 "특이적"이라는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에서 이용되는 용어 "조직-특이적"(예로, 간-특이적)은 발현의 절대적 특이성을 필요로 하지 않는 상대적인 용어이다. 다시 말하면, 용어 "조직-특이적"은 하나의 조직이 매우 높은 발현 수준을 갖고 다른 조직에서 발현이 없는 것을 필요로 하지 않는다. 다른 조직에 비해 한 조직에서의 발현이 더 크면 충분하다. 대조적으로, "엄격한" 또는 "절대적인" 조직-특이적 발현은 다른 조직에서는 검출 가능한 발현이 없이 단일 조직 유형(예로, 간)에서의 발현을 시사함을 의미한다.

본원에서 이용되는 용어 "부분" 또는 "단편"이 뉴클레오티드 서열에 대해 언급되는 경우("주어진 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 단편"에서와 같이), 이는 그 서열의 단편을 나타낸다. 단편은 4 뉴클레오티드 내지 전체 뉴클레오티드-1 뉴클레오티드의 크기 범위일 수 있다(10 뉴클레오티드, 20, 30, 40, 50, 100, 200 등). 일부 구현예에서, 단편은 서열 또는 이들의 서브세트보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 또는 200 뉴클레오티드 더 작은(예로, 31, 32, 33, 34, 35, 35, 36, 37, 38, 39 뉴클레오티드가 더 짧은 등) 뉴클레오티드 서열(예로, 프로모터)을 포함한다.

본원에서 이용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 짧은 길이의 단일쇄 폴리뉴클레오티드 사슬을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 200 잔기 길이 미만(예로, 15 내지 100)이지만, 본원에서 이용되는 용어는 또한 더 긴 폴리뉴클레오티드 사슬도 포괄하려는 것이다. 올리고뉴클레오티드는 종종 이들의 길이로 언급된다. 예를 들어 24 잔기 올리고뉴클레오티드는 "24-머(mer)"로 불린다. 올리고뉴클레오티드는 자가 혼성화에 의해 또는 다른 폴리뉴클레오티드에 대한 혼성화에 의해 이차 및 삼차 구조를 형성할 수 있다. 이러한 구조에는 비제한적으로 이중체, 헤어핀, 십자형, 굽은 형 및 삼중체가 포함될 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "상보적인" 또는 "상보성"은 염기쌍 형성 규칙에 의해 관련된 폴리뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드 서열)에 대한 언급에서 이용된다. 예를 들어, 서열 "5'-A-G-T-3'"은 서열 "3'-T-C-A-5'"에 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있고, 여기서 단지 일부 핵산의 염기가 염기쌍 형성 규칙에 따라 매치된다. 또는 핵산 간에는 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 존재할 수 있다. 핵산 가닥 간 상보성 정도는 핵산 가닥 간의 혼성화 효율 및 강도에 대해 유의미한 효과를 갖는다. 이는 핵산 간 결합에 의존하는 검출 방법뿐만 아니라 증폭 반응에서 특히 중요하다.

용어 "상동성"은 상보성 정도를 나타낸다. 부분 상동성 또는 완전 상동성(즉, 동일성)이 존재할 수 있다. 부분 상보적인 서열은 완전하게 상보적인 핵산 분자가 표적 핵산에 혼성화하는 것을 적어도 부분적으로 저해하는 핵산 분자이며 "실질적으로 상동성"이다. 표적 서열에 대해 완전히 상보적인 서열의 혼성화 저해는 낮은 엄격성 조건 하에 혼성화 분석(서던 또는 노던 블롯, 용액 혼성화 등)을 이용하여 조사될 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 탐침은 낮은 엄격성 조건 하에 표적에 대해 완전히 상동성인 핵산 분자의 결합(즉, 혼성화)에 대해 경쟁하고 이를 저해할 것이다. 이는 낮은 엄격성 조건이 비특이적 결합을 허용하는 정도라는 것이 아니다; 낮은 엄격성 조건은 다른 것에 대한 두 서열의 결합이 특이적인(즉 선택적인) 상호작용인 것을 요구한다. 비특이적 결합의 부재는 실질적으로 비상보적인(예로, 약 30% 미만의 동일성인) 제2 표적의 이용에 의해 평가될 수 있다; 비특이적 결합의 부재 시, 탐침은 제2의 비상보적인 표적에 혼성화하지 않을 것이다.

cDNA 또는 게놈 클론과 같은 이중쇄 핵산 서열에 대한 언급에서 이용되는 경우, 용어 "실질적으로 상동성인"은 상술된 바와 같은 낮은 엄격성 조건 하에 이중쇄 핵산 서열의 하나 또는 두 가닥에 혼성화할 수 있는 임의의 탐침을 나타낸다.

유전자는 일차적 RNA 전사체의 차별적 스플라이싱에 의해 생성되는 다중 RNA 종을 생산할 수 있다. 동일한 유전자의 스플라이스 변이체인 cDNA는 서열 동일성 또는 완전 상동성 영역(두 cDNA 상에서 동일한 엑손 또는 동일한 엑손 부분의 존재 표시) 및 완전 비동일성 영역(예를 들어, cDNA 2는 엑손 "B"를 대신 함유하는 cDNA 1 상의 엑손 "A"의 존재 표시)을 함유할 것이다. 두 cDNA가 서열 동일성 영역을 함유하므로, 이들은 전체 유전자 또는 두 cDNA 상에서 발견되는 서열을 함유하는 유전자 부분에서 유래되는 탐침에 모두 혼성화할 것이다; 따라서 두 스플라이스 변이체는 이러한 탐침에 대해 그리고 서로에 대해 실질적으로 상동성이다.

단일쇄 핵산 서열에 대한 언급에서 이용되는 경우, 용어 "실질적으로 상동성인"은 상술된 바와 같은 낮은 엄격성 조건 하에 단일쇄 핵산 서열이 혼성화할 수 있는(즉, 그 상보체인) 임의의 탐침을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "혼성화"는 상보적인 핵산의 쌍 형성을 언급하는데 이용된다. 혼성화 및 혼성화 강도(즉, 핵산 간 연합 강도)는 핵산 간 상보성 정도, 관련된 조건의 엄격성, 형성된 하이브리드의 T_m, 및 핵산 내의 G:C 비와 같은 요인에 의해 영향을 받는다. 그 구조 내에 상보적인 핵산의 쌍 형성을 함유하는 단일 분자는 "자가 혼성화된" 것으로 불린다.

"단리된 올리고뉴클레오티드" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"에서와 같이 핵산에 대한 언급에서 이용되는 경우 용어 "단리된"은 그 천연원에서 일반적으로 연관되는 적어도 하나의 성분 또는 오염물로부터 분리되고 확인되는 핵산 서열을 나타낸다. 단리된 핵산은 자연에서 발견되는 것과 상이한 형태 또는 설정에서 존재하는 것과 같다. 대조적으로, 단리되지 않은 핵산, 예컨대 DNA 및 RNA와 같은 핵산은 자연에서 존재하는 상태로 발견된다. 예를 들어, 주어진 DNA 서열(예로, 유전자)은 주변 유전자에 인접하여 숙주 세포 염색체 상에서 발견된다; RNA 서열, 예컨대 특정 단백질을 인코딩하는 특정 mRNA 서열은 여러 단백질을 인코딩하는 수 많은 다른 mRNA와의 혼합물로 세포에서 발견된다. 그러나 주어진 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산에는, 예로서 핵산이 천연 세포에서와 상이한 염색체 위치에 있거나 다르게는 자연에서 발견되는 것과 상이한 핵산 서열이 접해 있는 주어진 단백질을 일반적으로 발현하는 세포 내의 핵산이 포함된다. 단리된 핵산, 올리고뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드는 단일쇄 또는 이중쇄 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 단백질을 발현하기 위해 이용되어야 하는 경우, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 최소한 센스 또는 코딩 가닥을 함유할 것이지만(즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 단일쇄일 수 있음), 센스 및 안티센스 가닥 모두를 함유할 수도 있다(즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 이중쇄일 수 있음).

본원에서 이용되는 용어 "정제된" 또는 "정제하기 위한"은 표본으로부터 성분(예로, 오염물)의 제거를 나타낸다. 예를 들어, 항체는 오염시키는 비-면역글로불린 단백질의 제거에 의해 정제된다; 이들은 또한 표적 분자에 결합하지 않는 면역글로불린의 제거에 의해 정제된다. 비-면역글로불린 단백질의 제거 및/또는 표적 분자에 결합하지 않는 면역글로불린의 제거는 표본에서 표적-반응성 면역글로불린의 백분율을 증가시킨다. 다른 예에서, 재조합 폴리펩티드는 박테리아 숙주 세포에서 발현되며, 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 정제된다; 이에 따라 재조합 폴리펩티드의 백분율이 표본에서 증가된다.

본원에서 이용되는 용어 "표본"은 가장 광의의 개념으로 이용된다. 하나의 개념에서, 이는 생물학적 및 환경적 표본뿐만 아니라 임의의 원천에서 수득된 시편 또는 배양물을 포함하려는 것이다. 생물학적 표본은 동물(인간 포함)로부터 수득될 수 있고, 유체, 고체, 조직 및 기체를 포괄한다. 생물학적 표본에는 혈액 산물, 예컨대 혈장, 혈청 등이 포함된다. 환경적 표본에는 환경적 재료, 예컨대 표면 물질, 토양, 물 및 산업 표본이 포함된다. 그러나 이러한 예는 본 발명에 적용 가능한 표본 유형을 제한하는 것으로 간주되지 않는다.

본원에서 이용되는 용어 "대상체"는 본 발명의 방법에 의해 처리될 개체를 나타낸다. 이러한 개체에는 바람직하게는 비제한적으로 포유류(예로, 쥐과, 유인원, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)가 포함되며, 가장 바람직하게는 인간이 포함된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "대상체"는 일반적으로 박테리아 감염을 특징으로 하는 상태에 대해 치료를 받을 것이거나 치료(예로, 본 발명의 화합물 및 선택적으로 하나 이상의 다른 제제의 투여)를 받은 개인을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 개시는 혈소판에 대해 외인성 유전자의 발현을 표적화하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 혈소판에 대한 외인성 제제(예로, 응고 인자)의 발현 표적화에 의한 혈우병 및 다른 질환 및 상태의 치료에 관한 것이다.

본 발명의 구현예는 세포-특이적 프로모터를 이용하여 특정 세포 유형에 대해 이종성 유전자의 발현을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 이종성 또는 외인성 유전자의 발현은 다시 전구 세포(예로, 혈소판)에서 관심 유전자를 발현하는 줄기 세포(예로, 암 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포)에 대해 표적화된다. 조성물 및 방법은 다양한 질환(예로, 혈소판 매개 질환, 예컨대 혈우병)의 치료에서의 용도를 구한다. 본 발명이 혈우병 또는 혈소판 장애의 치료로 제한되지 않지만, 본 발명의 특정 구현예는 외인성 또는 이종성 응고 인자를 이용한 혈우병 치료에 기반하여 예시된다.

일부 구현예에서, 본 개시는 혈소판 계통에서만 단백질 발현을 유도하기 위해 혈소판 특이적 유전자 프로모터의 단편을 이용하는 조혈 줄기 세포 유전자 치료법 그리고 일부 상황에서는 부상 부위에서 활성화된 혈소판으로부터 외인성 제제의 조절된 방출을 유도하기 위해 혈소판 α-과립에 특이적으로 재조합 단백질을 수송하기 위해 치료 분자에 대한 신호 펩티드의 융합의 채용에 의한 혈소판이 관여되는 다른 질환(정맥 및 동맥의 혈전증, 면역 반응, 및 암) 및 병태뿐만 아니라 혈우병 및 드문 그리고 일반적인 유전 출혈 장애의 치료에 관한 것이다. 요약하면, 상기 전략은 혈소판에 대해 외인성 제제(예로, 유전된 혈소판 결함을 교정함으로써 지혈을 복원하기 위한 정상적인 대체 단백질, 혈우병에 대한 응고 인자, 심부 정맥 혈전증 및 동맥 폐색에 대한 항-혈전 제제 및 고형암을 수축시키고 암에서의 혈관신생을 예방하기 위한 항-종양 제제)의 발현을 표적화하는 상처 보수를 구현하기 위해 혈소판이 치료 제제를 전달하기 위한 전달체로 이용될 수 있도록 한다.

혈소판 기능의 다양한 측면(활성화, 부착, 응집, 신호 전달, 과립 저장)에 영향을 미치는 몇몇 잘 분석된 유전되는 유전적 결함이 존재하며, 이는 보통 임상적으로는 스스로 출혈을 제어하는데 있어 실패로 발현된다(Leslie, M. Science 328, 562-564(2010)). 본 발명의 구현예는 인간 내에서 혈우병 A의 교정을 위해 혈소판 내에서 응고 FVIII의 합성을 유도하는 정상적인 인테그린 유전자 프로모터를 인코딩하는 유전자가 형질도입된 조혈 줄기 세포의 자가 이식물을 제공한다. 거핵구 내에서 생물학적으로 정상인 분자의 새로운 합성은 이전에 혈소판이 상처 보수에 참여할 수 있도록 전체 단백질의 수송을 허용하였다. 이는 개 글란츠만 혈소판기능저하증(GT)에 의해 영향을 받은 인테그린 αIIb가 결핍된 개에 있어서 개선된 혈소판 기능 및 감소된 출혈 시간과 혈액 손실을 위해 혈소판 상에서 인테그린 αIIbβ3 수용체 복합체의 새로운 합성을 일으키기 위한 인테그린 αIIb의 발현을 유도하는 인테그린 αIIb 유전자 프로모터의 조혈 줄기 세포 유전자 전달을 이용한 최근의 성공에 의해 뒷받침된다(Fang, J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 9583-9588(2011)).

인테그린 β3를 인코딩하는 종양레트로바이러스 벡터를 이용한 G-CSF 가동화된 말초 혈액 줄기 세포(G-PBC)의 형질도입은 인간 GT 환자에서 유래된 거핵구 상에서 생활성 인테그린 αIIbβ3 복합체의 새로운 합성을 일으켰다(Wilcox, D. A et al., Blood. 95: 3645-52, 2000; Leslie, M. Science 328, 562-564(2010)). 또한 혈소판 기능은 β3을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 골수 이식에 의해 GT에 대한 쥐과 모델에서 교정될 수 있었으며(Fang, J. et al., Blood 106, 2671-2679(2005)) 혈소판 상에서 αIIbβ3을 생성하기 위한 인테그린 αIIb의 조혈 줄기 세포 유전자 전달의 이용은 개 글란츠만 혈소판기능저하증(GT)을 교정할 수 있는 것으로 나타났다(Fang, J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 9583-9588(2011)).

본 발명의 구현예의 개발 과정 동안 수행된 실험은 G-PBC 내로의 유전자 전달로부터 종양레트로바이러스가 형질도입된 인간 거핵구 및 혈소판이 인간 응고 인자 VIII를 합성하고 저장하며, 혈소판 활성화의 생리적 작용제로 시험관내 활성화되는 경우 FVIII를 방출할 수 있음을 나타낸다는 것을 보였다(Wilcox, D.A., et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis. 1: 2477-89, 2003). 또한 지혈은 인간 FVIII의 발현을 유도하는 인테그린 αIIb 유전자 프로모터의 -889 단편의 전사 제어 하에 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 골수 이식에 의해 혈우병 A에 대한 쥐과 모델 내에서(FVIII에 대한 저해 항체의 존재 하에서도) 개선될 수 있으며(Shi, Q. and Wilcox, D.A., et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 5: 352-361, 2007 및 Shi, Q., et al., Blood 112: 2713-21, 2008) 및 인간 FVIII에 융합된 VWFSPD2를 갖는 및 갖지 않는 인테그린 αIIb 유전자 프로모터 단편의 조혈 줄기 세포 렌티바이러스 매개 유전자 전달을 위한 G-CSF 가동화된 PBC의 이용은 혈소판 및 혈소판 α 과립 내에서 완전히 기능적인 FVIII의 발현을 유도하였고, 이는 혈소판 기능을 교정하고 지혈 개선 및 임의의 심각한 출혈 사례의 감소 및/또는 부재로 이어진 것으로 나타났다; 따라서 동물은 이식 후 적어도 2.5년 동안 혈우병 A에 대한 대동물 "개" 모델 내에서 FVIII 단백질 대체 치료법의 주입을 필요로 하지 않았을 뿐만 아니라 개 혈소판 내에 저장된 재조합 인간 FVIII에 대해 저해 항체가 생성되지 않았다

따라서 일부 구현예에서, 본 발명은 줄기 세포(예로, 조혈 줄기 세포)를 표적화하기 위해 유전자 치료법을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 다양한 질환 및 상태(예로, 혈소판 매개 장애)의 치료에서의 용도를 구한다.

본 발명의 일부 구현예는 혈우병 및 다른 혈소판 질환의 치료로 예시되지만, 본 발명이 혈우병 치료로 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 조성물 및 방법은 생체내 또는 생체외 유전자 치료법을 포함한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 조혈 줄기 세포는 혈소판에 대해 특이적으로 외인성 유전자(예로, 혈소판 기능에 관련된 응고 인자, 혈소판 단백질, 혈전성 장애에 대한 항-혈전성 제제 및 종양성 장애에 대한 항-신생혈관 및 항-종양 제제)의 발현을 표적화하는 벡터를 이용하여 생체외 가동화 및 표적화된 후 개질된 조혈 줄기 세포가 재도입된다.

I. 벡터

본 발명은 특정한 표적화 벡터 또는 발현 카세트로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 세포(예로, 혈소판) 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 관심 외인성 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 유전자 발현 표적화 또는 신호 분자뿐만 아니라 발현 인핸서를 추가로 포함한다. 도 7, 8, 및 10은 본 발명의 구현예에서 유용한 예시적인 발현 카세트 및 벡터를 나타낸다. 예시적인 벡터 성분이 아래에 기재된다.

A. 프로모터

일부 구현예에서, 벡터는 특정 세포 유형에 대해 유전자 발현을 유도하는 프로모터를 포함한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 프로모터는 혈소판 특이적 프로모터이다. 본 발명은 특정한 혈소판 특이적 프로모터로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 절단된 인테그린 αIIb 유전자(ITGA2B) 프로모터가 이용된다. 예시적인 프로모터에는 비제한적으로 거핵구 내에서 고수준의 유전자 전사를 위한 "ETS" 및 "GATA" 요소 그리고 다른 조혈 세포 계통 내에서 유전자 전사를 저해하는 억제인자 영역을 인코딩하는 -1218, -889 및 -673 ITGA2B 프로모터가 포함된다(서열 목록 번호 21, 22, 23; 및 25; 도 8 및 10).

ITGA2B 유전자 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 Dr. Gerard Marguerie가 주도한 프랑스 그룹에 의해 1988년에 최초로 분석되었다(Prandini MH, Denarier E, Frachet P, Uzan G, Marguerie G. Isolation of the human platelet glycoprotein IIb gene and characterization of the 5' flanking region. Biochem Biophys Res Commun 1988, 156(1): 595-601). 도 7은 ITGA2B 프로모터의 구조 영역을 나타낸다. 일부 구현예에서, 프로모터의 단편(예로, 1218, -889 및 -673)이 이용된다. 일부 구현예에서, -673은 혈소판-특이적 삽입유전자 발현을 유도하기 위한 필수 조절 요소를 모두 함유한다. 1993년에, 연구자들은 유전자 프로모터 연구를 수행하여, 전사 인자 GATA-1이 거핵구에서 고수준의 유전자 발현을 위해 중요하며, 적어도 3개, 아마도 제4 영역이 ITGA2B에서 확인된 GATA-1 결합 부위로 작용함을 발견하였다(Martin F, Prandini MH, Thevenon D, Marguerie G, Uzan G. The transcription factor GATA-1 regulates the promoter activity of the platelet glycoprotein IIb gene. J Biol Chem 1993, 268(29): 21606-21612). 다음으로, 고수준의 삽입유전자 발현을 일으키기 위해 함께 작용하는 것으로 여겨지는, ITGA2B에 결합하는 다른 전사 인자 Ets에 대해 3개의 공통 서열이 존재함을 발견하였다(Lemarchandel V, Ghysdael J, Mignotte V, Rahuel C, Romeo PH. GATA and Ets cis-acting sequences mediate megakaryocyte-specific expression. Mol Cell Biol 1993, 13(1): 668-676). 쥐과 ITGA2B 프로모터가 클로닝되었고, 인간 ITGA2B 프로모터와, 특히 전사 인자 공통 결합 서열이 확인된 영역에서 매우 높은 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 것이 확인되었다(Denarier E, Martin F, Martineau S, Marguerie G. PCR cloning and sequence of the murine GPIIb gene promoter. Biochem Biophys Res Commun 1993, 195(3): 1360-1364). 추가적인 유전자 프로모터 분석은 -139부터 -63까지의 ITGA2B 영역이 유전자 프로모터가 다른 조혈 계통 내에서 삽입유전자 전사 유도를 예방하기 위해 보존되어야 함을 나타내었고, 따라서 이 영역이 억제인자로 표지된다(Prandini MH, Martin F, Thevenon D, Uzan G. The tissue-specific transcriptional regulation of the megakaryocytic glycoprotein IIb gene is controlled by interactions between a repressor and positive cis-acting elements. Blood 1996, 88(6): 2062-2070). 마지막으로, 프로모터가 최적의 혈소판 특이적 유전자 전사를 위해 필수적인 삼차원 구조를 형성하는 경우, 다른 요소와 함께 Ets와 기능하는데 중요한 것으로 여겨지는 Sp1에 대한 결합 부위가 ITGA2B에서 확인되었다(Block KL, Shou Y, Poncz M. An Ets/Sp1 interaction in the 5'-flanking region of the megakaryocyte- specific alpha IIb gene appears to stabilize Sp1 binding and is essential for expression of this TATA-less gene. Blood 1996, 88(6): 2071-2080).

본 발명은 서열 목록 번호 21-23)에 기재된 ITGA2B 프로모터로 제한되지 않는다. 본 발명의 구현예는 본원에 기재된 단편, 부분, 및 단편의 조합을 고려한다. 일부 구현예에서, 단편은 전장 ITGA2B 프로모터보다 짧으며(예로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200 또는 그 초과의 뉴클레오티드가 더 짧으며) 원하는 활성(예로, 원하는 효과, 예로 질환 또는 상태의 징후 또는 증상 감소를 야기하기 위해 세포-특이적 발현을 유도하는 능력)을 유지한다.

일부 구현예에서, 프로모터는 서열 목록 번호 21, 22, 및 23, 또는 서열 목록 번호 21, 22, 및 23보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 또는 그 초과의 뉴클레오티드가 더 크거나 더 작은 서열에 기재된 ITGA2B 단편을 포함한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 서열 목록 번호 21보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200 또는 그 초과의 뉴클레오티드가 더 작은 단편이 이용된다. 일부 구현예에서, 서열 목록 번호 23보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 또는 그 초과의 뉴클레오티드가 더 큰 단편이 이용된다.

일부 구현예에서, 프로모터 활성을 보유하는 서열 목록 번호 21, 22, 또는 23의 불연속적 단편이 이용된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 서열 목록 번호 21, 22 또는 23의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 뉴클레오티드가 이용된다.

일부 구현예에서, 프로모터 단편은 프로모터 활성에 유용한 하나 이상의 요소를 포함한다. 예에는 비제한적으로 GATA 요소(예로, GATA54 또는 GATA454), sP1 요소, Ets35 요소 등이 포함된다(예로, Block et al., Blood 1994 84: 3385-3393; Prandini et al., Blood 1996 88: 2062-2070; Block et al., Blood 1996 88: 2071-2080; 및 Doubeikovski et al., J. Biol. Chem. 272: 24300-24307, 1997 참고; 그 각각은 전문이 본원에 참조로 도입된다).

일부 구현예에서, 프로모터의 5' 말단은 발현 벡터의 클로닝 및 구축을 보조하기 위해 제한 엔도뉴클레아제 부위를 부가하기 위해 개질된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 5' 말단의 1, 2, 3, 또는 4 뉴클레오티드가 제한 엔도뉴클레아제 부위를 부가하기 위해 야생형 서열 또는 본원에 개시된 단편으로부터 개질된다.

일부 구현예에서, 단편은 서열 목록 번호 21, 22, 또는 23에서 발견되는 프로모터 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.

B. 이종성 유전자

본 발명은 특정한 외인성 유전자로 제한되지 않는다. 혈우병을 치료하는 구현예에서, 외인성 유전자는 일반적으로 응고 인자(예로, 인자 VIII 및/또는 인자 IX)이다. 인간 인자 VIII은 접근 번호 NM_000132.3을 가지며 인간 인자 IX는 접근 번호 NM_000133.3을 갖는다.

다른 외인성 유전자가 다른 혈소판 관련 상태의 치료에서 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈소판 관련 장애와 다른 질환의 치료에 유용한 외인성 유전자가 이용된다(예로, 암 치료에서 항-종양 제제, 즉 고형 종양을 수축시키기 위한 "IL-24" 및 심부 정맥 혈전증의 경우와 같이 혈액 응괴 부위에서 방출될 항-혈전성 제제의 방출을 표적화하기 위해 혈소판을 이용함으로써).

C. 표적화 인자 및 인핸서

일부 구현예에서, 발현 카세트는 혈소판의 특정한 서브-구조로의 발현을 표적화하는 표적화 인자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 VWF뿐만 아니라 세포 과립 구획, 구체적으로 둘 다 세포 활성화 시 분비될 수 있는 천연 저장 서브구조인 내피 세포의 "바이벨-펠라데 소체" 및 혈소판 α-과립에 단백질을 저장하는 능력이 입증된 펩티드에 융합된 재조합 단백질을 수송할 수 있는 것으로 확인된 신호 서열 펩티드의 최소 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 발현 구축물은 {Rosenberg JB et al, Intracellular Trafficking of FVIII to von Willebrand Factor storage Granules, J. Clin. Invest. 101, 613-624(1998); Haberichter SL, Jacobi P, Montgomery RR. Critical independent regions in the VWF propeptide and mature VWF that enable normal VWF storage. Blood 2003, 101(4): 1384-1391 및 Haberichter et al, The Von Willlebrand Factor Propeptide(VWFpp) Traffics an Unrelated Protein to Storage, Arterioscler Thromb Vas Biol. 22, 921 926(2002)}에 나타낸 바와 같이 α-과립 구획 내로 직접 분자 수송을 촉진하기 위해 폰 빌레브란트 인자 프로펩티드 신호 펩티드 및 D2 도메인(SPD2)을 인코딩하는 핵산을 포함한다.

ITGA2B 유전자 프로모터의 673bp 단편 및 VWF/SPD2 유전자를 포함하는 발현 카세트의 예를 도 7에 나타낸다(서열 목록 번호 24). 그 원하는 활성을 보유하는 이들 서열의 변이체가 구체적으로 본 발명의 구현예의 조성물 및 방법에서의 이용을 위해 고려된다.

일부 구현예에서, 구축물은 프로모터/신호전달 카세트 및 관심 외인성 유전자 간에 발현 인핸서(예로, 마멋 간염 바이러스(WHP) 전사 후 조절 요소(WPRE))를 포함한다. 상기 요소는 그 구조가 세포 내에서 전사체의 분해를 저해하고, 이에 따라 WPRE의 부재 시의 유전자 전달 벡터에 비해 더 많은 치료 단백질이 합성될 수 있도록 하므로, 몇몇 유전자 전달 전략에 의해 이용되었다.

D. 벡터 골격

본 발명은 특정한 발현 벡터로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 벡터는 자가 불활성화된다. 일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터(예로, 렌티바이러스 벡터)이다. 표 2는 예시적인 적합한 벡터의 요약을 제공한다.

바이러스	장점	단점
아데노바이러스	높은 역가 높은 유전자 발현 비분열 세포를 감염시킬 수 있음 매우 큰 카세트(40kb)를 수용함	면역원성임 게놈 내로 통합되지 않음
아데노-연관 바이러스	비분열 세포를 감염시킬 수 있음 인간에서 상대적으로 안전함	작은 카세트(4kb)를 수용함 조혈 세포에서 낮은 형질도입 효율
알파바이러스(신드비스)	비분열 세포를 감염시킬 수 있음 높은 역가 높은 형질도입 효율 높은 유전자 발현	세포에 독성이 있음 게놈 내로 통합되지 않음
렌티바이러스	게놈 내로 안정적으로 도입됨 비분열 세포를 감염시킬 수 있음	분야에서 신규함 인간에서의 안전성이 불확실함
레트로바이러스	게놈 내로 안정적으로 도입됨 인간에서 상대적으로 안전함 높은 역가 큰 카세트(8kb)를 수용함	분열 세포만 감염시킴

레트로바이러스(레트로바이러스과)는 3개 군으로 구분된다: 스푸마바이러스(예로, 인간 거품형성 바이러스); 렌티바이러스(예로, 인간 면역결핍 바이러스 및 양 비스나 바이러스) 및 종양바이러스(예로, MLV, 라우스 육종 바이러스).

레트로바이러스는 동물 세포를 감염시키는 외피보유(예로, 숙주 세포-유래 지질 이중층 막으로 둘러싸임) 단일쇄 RNA 바이러스이다. 레트로바이러스는 세포를 감염시키는 경우, 그 RNA 게놈이 이중쇄 선형 DNA 형태로 전환된다(예로, 역전사된다). 이어서 바이러스의 DNA 형태가 프로바이러스로서 숙주 세포 게놈 내로 통합된다. 프로바이러스는 추가적인 바이러스 게놈 및 바이러스 mRNA의 생산을 위한 주형으로 작용한다. 게놈 RNA의 2개 사본을 함유하는 성숙한 바이러스 입자가 감염된 세포 표면에서 나오기 시작한다. 바이러스 입자는 바이러스 캡시드(바이러스 gag 유전자 산물을 함유함) 내부에 게놈 RNA, 역전사효소 및 다른 pol 유전자 산물을 포함하며, 이는 바이러스 외피 당단백질(막-연관 단백질로도 불림)을 함유하는 숙주 세포에서 유래된 지질 이중층 막에 의해 둘러싸인다.

여러 레트로바이러스의 게놈 구조는 레트로바이러스 게놈이 레트로바이러스 벡터를 생산하도록 적응할 수 있게 한다. 관심 유전자를 수반하는 재조합 레트로바이러스 벡터의 생산은 전형적으로 두 단계로 달성된다. 첫 번째로, 관심 유전자가 관심 유전자의 효율적인 발현을 위해 필요한 서열(바이러스 긴 말단 반복[LTR] 또는 내부 프로모터/인핸서 및 관련 스플라이싱 신호에 의해 제공될 수 있는 프로모터 및/또는 인핸서 요소 포함), 바이러스 RNA의 감염성 바이러스 입자로의 효율적인 패키지화를 위해 필요한 서열(예로, 패키지화 신호[Psi], tRNA 프라이머 결합 부위[-PBS], 역전사를 위해 필요한 3' 조절 서열[+PBS] 및 바이러스 LTR)을 함유하는 레트로바이러스 벡터 내로 삽입된다. LTR은 바이러스 게놈 RNA의 연합, 역전사효소 및 통합효소 기능을 위해 필요한 서열, 및 바이러스 입자에 패키지화될 게놈 RNA의 발현을 유도하는데 관여되는 서열을 함유한다. 안전성의 이유로, 여러 재조합 레트로바이러스 벡터에는 바이러스 복제를 위해 필수적인 유전자의 기능적 사본이 없다(이들 필수 유전자는 결실되거나 불능화됨); 생성 바이러스는 복제 결핍인 것으로 불린다.

두 번째로, 재조합 벡터의 구축에 이어, 벡터 DNA가 패키지화 세포주 내로 도입된다. 패키지화 세포주는 바이러스 게놈 RNA의 원하는 숙주 범위를 갖는 바이러스 입자로의 패키지화를 위해 트랜스로 필요한 바이러스 단백질(예로, 바이러스-인코딩된 gag, pol 및 env 단백질)을 제공한다. 숙주 범위는 부분적으로 바이러스 입자 표면 상에서 발현되는 외피 유전자 산물의 유형에 의해 제어된다. 패키지화 세포주는 동종숙주역, 양생 또는 이종숙주역 외피 유전자 산물을 발현할 수 있다. 대안적으로, 패키지화 세포주에는 바이러스 외피(env) 단백질을 인코딩하는 서열이 없을 수 있다. 이 경우, 패키지화 세포주는 바이러스 게놈을 막-연관 단백질(예로, env 단백질)이 없는 입자 내로 패키지화할 것이다. 바이러스의 세포 내 진입을 허용할 막 연관 단백질을 함유하는 바이러스 입자를 생산하기 위해, 레트로바이러스 서열을 함유하는 패키지화 세포주는 막-연관 단백질(예로 물집입안염 바이러스[VSV]의 G 단백질)을 인코딩하는 서열로 전달감염된다. 이어서 전달감염된 패키지화 세포가 전달감염된 패키지화 세포주에 의해 발현되는 막-연관 단백질을 함유하는 바이러스 입자를 생산할 것이다; 다른 바이러스의 외피 단백질에 의해 캡시드화된 하나의 바이러스에서 유래된 바이러스 게놈 RNA를 함유하는 이들 바이러스 입자는 가유형 바이러스 입자로 불린다.

재조합 레트로바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터는 다른 기법, 예컨대 칼슘 포스페이트-DNA 공침전 또는 DEAE-덱스트란-매개된 전달감염, 전기천공 또는 핵산의 마이크로주입에 비해 유전자를 세포 내로 전달하는 보다 효율적인 수단을 제공한다. 바이러스 전달 효율은 부분적으로 핵산의 전달이 수용체-매개 절차라는(즉, 바이러스가 감염될 세포의 표면 상에서 특정한 수용체 단백질에 결합한다는) 점에 기인하는 것으로 여겨진다. 또한, 일단 세포 내로 바이러스에 의해 전달된 핵산은 바이러스에 의해 전달되지 않은 핵산의 통합과는 대조적으로 제어되는 방식으로 통합된다; 다른 수단, 예컨대 칼슘 포스페이트-DNA 공침전에 의해 전달되는 핵산은 재배열 및 분해의 대상이 된다.

일반적으로 이용되는 재조합 레트로바이러스 벡터는 양생 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스(MoMLV)에서 유래된다(Miller and Baltimore, Mol. Cell. Biol., 6:2895 [1986]). MoMLV 시스템은 몇몇 장점을 갖는다: 1) 상기 특정한 레트로바이러스는 여러 상이한 세포 유형을 감염시킬 수 있고, 2) 구축된 패키지화 세포주가 재조합 MoMLV 바이러스 입자의 생산을 위해 이용 가능하며, 3) 전달된 유전자는 표적 세포 염색체 내로 영구 통합된다. 구축된 MoMLV 벡터 시스템은 레트로바이러스 서열의 작은 부분(바이러스 긴 말단 반복 또는 "LTR" 및 패키지화 또는 "psi" 신호)을 함유하는 DNA 벡터 및 패키지화 세포주를 포함한다. 전달될 유전자는 DNA 벡터 내로 삽입된다. DNA 벡터 상에 존재하는 바이러스 서열은 벡터 RNA의 바이러스 입자 내로의 삽입 또는 패키지화를 위해 그리고 삽입된 유전자의 발현을 위해 필요한 신호를 제공한다. 패키지화 세포주는 입자 조립을 위해 필요한 바이러스 단백질을 제공한다(Markowitz et al., J. Virol., 62:1120 [1988]).

이러한 장점에도 불구하고, MoMLV에 기반한 기존 레트로바이러스 벡터는 몇몇 내재적인 문제에 의해 제한을 받는다: 1) 이들은 비분열 세포를 감염시키지 않으며(Miller et al., Mol. Cell. Biol., 10:4239 [1992]), 2) 낮은 역가의 재조합 바이러스를 생산하고(Miller and Rosman, BioTechn., 7: 980 [1989]; 및 Miller, Nature 357: 455 [1992]), 3) 특정 세포 유형(예로, 인간 림프구)을 낮은 효율로 감염시킨다(Adams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8981 [1992]). MoMLV-기반 벡터에 연관된 낮은 역가는 적어도 부분적으로는 바이러스-인코딩된 외피 단백질의 불안정성에 기인하였다. 물리적 수단(예로, 초원심분리 및 초여과)에 의한 레트로바이러스 스톡의 농축은 감염성 바이러스의 상당한 손실로 이어진다.

다른 일반적으로 이용되는 레트로벡터는 비제한적으로 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)를 포함하는 렌티바이러스로부터 유래된다. 렌티바이러스 벡터는 비복제 세포를 감염시킬 수 있는 장점을 갖는다.

레트로 벡터에 의한 특정 세포 유형의 낮은 역가 및 비효율적인 감염은 막 연관 단백질로 VSV의 G 단백질을 함유하는 가유형 레트로바이러스 벡터의 이용에 의해 극복되었다. 세포 내로의 진입을 획득하기 위해 특정한 세포 표면 단백질 수용체에 결합하는 레트로바이러스 외피 단백질과는 달리, VSV G 단백질은 원형질막의 인지질 성분과 상호작용한다(Mastromarino et al., J. Gen. Virol., 68:2359 [1977]). 세포 내로의 VSV의 진입은 특정한 단백질 수용체의 존재에 의존하지 않으므로, VSV는 매우 광범위한 숙주 범위를 갖는다. VSV G 단백질을 보유하는 가유형 레트로바이러스 벡터는 VSV의 변형된 숙주 범위 특징을 갖는다(즉, 이들은 거의 모든 종의 척추동물, 무척추동물 및 곤충 세포를 감염시킬 수 있다). 중요하게는, VSV G-가유형 레트로바이러스 벡터는 큰 감염성 손실 없이도 초원심분리에 의해 2000배 이상 농축될 수 있다(Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8033 [1993]).

VSV G 단백질은 또한 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 기반한 가유형 레트로바이러스 벡터에 이용되었다(Naldini et al., Science 272:263 [1996]). 따라서 VSV G 단백질이 다양한 가유형 레트로바이러스 벡터를 생성하기 위해 이용될 수 있고, MoMLV 기반 벡터로 제한되지 않는다.

본 발명은 바이러스 G 단백질이 바이러스 입자 내에서 이종성 막-연관 단백질로 채용되는 경우, VSV G 단백질의 이용으로 제한되지 않는다. 랩도바이러스과의 다른 구성원에서 유래된 다른 G 단백질을 인코딩하는 서열이 이용될 수 있다; 여러 랩도바이러스 G 단백질을 인코딩하는 서열은 GenBank 데이터베이스에서 이용 가능하다.

대부분의 레트로바이러스는 수신체 세포가 감염 시 순환 중인(즉, 분열 중인) 경우에만 수신체 세포의 게놈 내로 바이러스의 이중쇄 선형 형태(프로바이러스)를 전달하거나 통합될 수 있다. 분열 중인 세포만을 또는 이를 더 효율적으로 감염시키는 것으로 나타난 레트로바이러스에는 MLV, 비장 괴사 바이러스, 라우스 육종 바이러스 인간 면역결핍 바이러스, 및 다른 렌티바이러스 벡터가 포함된다.

MLV 바이러스 DNA의 통합은 유사분열을 통한 숙주 세포의 진행에 의존하는 것으로 나타났으며, 유사분열에 대한 의존성은 바이러스 통합 복합체가 핵 내로의 진입을 획득하기 위해 핵 외피를 순서대로 분해시켜야 하는 요건을 반영하는 것으로 추정되었다(Roe et al., EMBO J., 12:2099 [1993]). 그러나 중기에서 정지된 세포에서는 통합이 일어나지 않으므로, 핵 외피의 분해만으로는 바이러스 통합을 허용하기에 충분치 않을 수 있다; 게놈 DNA의 응축 상태와 같은 추가적인 요건이 존재할 수 있다(Roe et al., 상기).

본 발명은 레트로바이러스 벡터로 제한되지 않는다. 다수의 적합한 벡터가 당분야 숙련가에게 공지되어 있고, 시판된다. 이러한 벡터에는 비제한적으로 하기 벡터가 포함된다: 1) 박테리아 -- pQE70, pQE60, pQE 9(Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene); ptrc99a, pKK223 3, pKK233 3, pDR540, pRIT5(Pharmacia); 및 2) 진핵생물 -- pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXT1, pSG(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(Pharmacia). 숙주 내에서 복제 가능하고 생활성인 한 임의의 다른 플라스미드 또는 벡터가 이용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 포유류 발현 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트와 더불어, 복제 기원, 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수신체 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 인접 비전사 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, SV40 스플라이스에서 유래된 DNA 서열, 및 폴리아데닐화 부위가 비전사 유전 요소를 제공하기 위해 이용될 수 있다.

II. 치료 방법

일부 구현예에서, 본 발명은 줄기 세포(예로, 조혈 줄기 세포 또는 암 줄기 세포)의 유전적 조작을 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 혈소판 기능에 관련된 다양한 장애(예로, 혈우병 및 아래 표 3에 기재된 장애)의 치료에서의 용도를 구한다.

보통 연장된 출혈 사례로 이어지는 혈소판 막, 세포질 및 과립 단백질의 분자 유전학적 결함을 특징으로 하는 몇몇 출혈 장애가 있다. 각 장애가 드물고, 아마도 1,000,000명 중 1명에서 일어나지만(예로 글란츠만 혈소판기능저하증), 종합적으로 보면 유전적 혈소판 결함은 전 세계적으로 20,000명 중 1명에서 일어난다{Wilcox, D.A. White II, G.C, Gene therapy for platelet disorders: studies with glanzmann's thrombasthenia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 1: 2300-2311,(2003) 및 Wilcox, D. A., White II, G.C: Gene therapy for platelet disorders. In: Platelets. Second Edition, A.D. Michelson(ed.), Academic Press, San Diego, Chapter 71: 1313-1325, (2007) 및 Third Edition, Chapter 64: In Press(2012)}. 유전적 혈소판 결함에 부가하여, 혈소판 표면, 세포질 또는 과립에 대한 치료 제제의 표적화를 목적으로 하는 조혈 줄기 세포 유전자 치료법이 지혈, 혈전증, 면역 반응 및 암의 다른 장애를 교정하기 위한 전략으로서의 용도를 구한다.

유전적 장애	결함	손상된 기능
G-단백질 장애	G_αq, G_αj1	활성화
ADP 수용체 결함	P2Y₁₂	활성화
버나드-슐리어 증후군	당단백질 Ib-IX	접착
콜라겐 수용체 결핍	당단백질 Ia-IIa	접착
글란츠만 혈소판기능저하증	당단백질 IIb-IIIa	응집
회색 혈소판 증후군	NBEAL2	α-과립 형성/저장
퀘백 혈소판 장애	유로키나아제 플라스미노겐 활성화제	α-과립 저장
스코트 증후군	포스파티딜세린 전위	응고
메이-헤글린 이상 훼흐트너 증후군 세바스티안 혈소판 증후군 엡스타인 증후군	MYH9	세포골격/혈소판 형성
위스코트-알드리치 증후군	WAS 단백질	세포골격
세디아크-히가시 증후군	CHS 단백질	치밀소체 형성/저장
헤르만스키-푸디아크 증후군	HPS1, HPS3-7, AP-3	치밀소체 형성/저장
트롬복산 결핍증	트롬복산 A₂	신호 전달

일부 구현예에서, 치료 방법은 생체외 방법이며, 여기서는 자가 조혈 줄기 세포가 치료를 필요로 하는 동물(예로, 인간)로부터 수확되고, 본원에 기재된 벡터 중 하나를 이용해서 개질되고, 원래 공여체에 재도입된다. 이러한 자가 방법은 공여체 응고 인자의 주입으로 일어날 수 있는 거부 반응 또는 자가면역의 위험을 감소시키고, 생체외 형질도입을 통해 조혈 줄기 세포로 유전자 형질도입을 제한할 수 있도록 한다.

조혈 줄기 세포의 생체외 개질에 대한 예시적인 방법은 {Aiuti et al., Science 341:865(2013; 본원에 그 전문이 참조로 도입됨)}에 기재된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 방법에는 말초 혈액 줄기 세포를 말초 혈액 내로 가동화하기 위해 시토카인을 투여하는 단계; 성분채집 및 CD34+ 세포에 대한 자기 비드 선택을 수행하는 단계; 예로 불설판 및/또는 플루다라빈과 같은 다른 제제를 이용한 사전 컨디셔닝 단계; 및 환자 내로 재도입하기 전에 줄기 세포를 개질하기 위해 바이러스(예로, 렌티바이러스) 유전자 전달 벡터를 이용하는 단계가 포함된다.

일부 구현예에서, 조혈 줄기 세포는 시토카인 또는 다른 가동화 제제의 투여를 이용해서 가동화되지만(예로, Fu et al., Blood Rev. 2000 Dec;14(4):205-18 및 미국 특허 7417026 참고, 그 각각은 가동화 프로토콜의 논의를 위해 그 전문이 본원에 참조로 도입됨), 다른 적합한 프로토콜이 이용될 수도 있다.

예를 들어 일부 구현예에서, 가동화 시토카인에는 비제한적으로 인터류킨-3(IL-3), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF) (Amgen의 FDA 승인 약물 Neupogen으로도 알려져 있음), 줄기 세포 인자(SCF), 과립구 대식구 집락 자극 인자(GM-CSF), 및 IL-3, GM-CSF, SCF, 및 GM-CSF 중 하나 이상의 순차적인 또는 동시 투여가 포함된다.

가동화 제제에 대해 적합한 투여량 범위가 변하지만, 일반적으로 화합물은 약 0.1㎍/kg-5mg/체중kg 범위로 투여된다; 바람직하게는 범위는 약 1㎍/kg-300㎍/체중kg; 보다 바람직하게는 약 10㎍/kg-100㎍/체중kg이다. 따라서 전형적인 70-kg 인간 대상체에 있어서, 투여량 범위는 약 0.7㎍-350mg; 바람직하게는 약 700㎍-21mg; 가장 바람직하게는 약 700㎍-7mg이다. 화합물이 경구 또는 경피 투여되는 경우, 예를 들어 i.v. 투여에 비해 투여량이 더 높을 수 있다. 화합물은 단회 볼루스 용량, 경시적인 용량, i.v. 또는 경피 투여, 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다.

투여될 활성 화합물의 양은 당분야 숙련가의 판단에 따라 변할 수 있다. 수신체에 투여될 활성 화합물의 양은 줄기 세포 가동화를 위해 상술된 범위 내이다. 그러나, 이러한 양의 투여는 줄기 세포 증강 치료법 분야의 의사가 설정한 기준에 따라 변할 것이다.

가동화 후, CD34+ 말초 혈액 줄기 세포(PBC)는 최근에 FDA에 의해 임상적 이용에 대해 승인받은 Miltenyi automacs 시스템(대동물용, 개, 25-45kg) 및 Miltenyi Clinimacs 시스템(인간용)을 이용하여 면역자기 비드에 의해 저분자량 단핵구로부터 단리된다. CD34+PBC는 본원에 기재된 벡터를 이용해서 유전적으로 개질되고 자가 줄기 세포 이식물에 의해 필요한 대상체 내로 재도입된다. 일부 구현예에서, 출혈 증례에 대한 장기 보호를 제공하기 위해 단회 치료가 이용된다. 혈우병을 치료하는 일부 구현예에서, 치료는 출혈 증례를 예방하기 위해 정기적인 기준으로(예로, 매주, 매달, 매년, 2, 3, 4, 5년 또는 그 초과마다 등) 수행된다. 일부 구현예에서, 치료는 비정상적인 출혈 증례가 발생하는 경우에만(예로, 사고 후, 수술 이전 또는 이후 등) 투여된다. 일부 구현예에서, 유지 치료법은 비정상적인 출혈 증례가 발생하는 경우 추가 치료법과 조합 투여된다.

실험

하기 실시예는 본 발명의 특정한 바람직한 구현예 및 측면을 설명하고 추가 예시하기 위해 제공되며 이들의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

실시예 1

재료 및 방법

세포주.

형질전환된 인간 세포주를 American Type Culture Collection(Rockville, MD)에서 입수하고, 전-거핵구(HEL 거핵구 형질전환 세포주)(Bray, P. F. et al. J Clin Invest 80, 1812-1817.(1987); Greenberg, S. M., et al., T-세포 림프종(KT1)(Okamoto, T., et al. J Biol Chem 261, 4615-4619(1986)), B-세포 림프종(Raji)(Choi, J. H. et al. International immunopharmacology 8, 852-858, 2008.01.037(2008)), 적백혈병(K562)(Gauwerky, C. & Golde, D. W. Blood 56, 886-891(1980)) 및 상피(HeLa)(Goldstein, M. N., et al., Annals of the New York Academy of Sciences 89, 474-483(1960)) 세포주에 대해 기재된 조건 하에 증식시켰다.

루시퍼라아제 리포터 유전자 프로모터 벡터.

ITGA2B 유전자 프로모터 구축물: 게놈 DNA를 인간 전-거핵구 세포주, Dami,49로부터 단리하고 인간 ITGA2B 유전자 프로모터 단편을 ITGA2B의 센스 프라이머 "-1218"(5'-

-3')"-1198"(서열 목록 번호 1)(진한 글씨체) 또는 ITGA2B의 "-889"(5'-

-3')"-872"(서열 목록 번호 2)(진한 글씨체) 또는 ITGA2B의 "-673"(5'-

-3')"-654"(서열 목록 번호 3)(진한 글씨체) 및 루시퍼라아제 pGL3-BASIC의 뉴클레오티드 +99 내지 +86 및 ITGA2B 유전자 프로모터의 뉴클레오티드 +30 내지 +15(진한 글씨체)를 인코딩하는 안티센스 프라이머(5'-

-3')(서열 목록 번호 4)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 구축물의 정확한 동일성은 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인하였다.

pCMVLuc: pRc/CMV(Invitrogen)의 사이토메갈로바이러스 조직 비-특이적 유전자 프로모터의 BglII 및 HindIII 제한효소 소화물(878bp)을 pGL3-Basic 루시퍼라아제 벡터(Promega, Madison, WI) 내로 결찰시킨다. 상기 구축물이 모든 세포 유형 내에서 고수준의 유전자 발현을 위한 양성 대조군으로 작용하였다; 따라서, 각각의 세포주에 대해 100% 루시퍼라아제 활성의 임의 수준을 할당하였다(도 1).

pGL3-BasicLuc: 루시퍼라아제 유전자 전사를 유도하기 위한 유전자 프로모터가 없으므로 0% 루시퍼라아제 활성에 대한 음성 대조군 구축물(도 1)(Promega).

pCMVnlac: 세포주에 pITGA2BLuc+ 구축물 중 하나 그리고 삽입유전자 발현을 정규화하기 위해 β-갈락토시다아제 마커 유전자를 인코딩하는 pCMVnlac을 공-전달감염시켰다(Wilcox et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96(17): 9654-9659.

루시퍼라아제 유전자 프로모터 리포터 분석.

세포주(2x10⁷)를 (20)㎍)의 ITGA2B 유전자 프로모터 구축물(-1218, -889, -673)(도 1a) 또는 초파리 루시퍼라아제를 인코딩하는 양성(CMV) 또는 음성(Basic) 대조군 및 β-갈락토시다아제를 인코딩하는 pCMVnlac(20㎍)으로 공-전달감염시켰다.49 간략하게, 공-전달감염 48시간 후, 세포를 세척하고, 수확하고, 용해액을 제조하고, 루시퍼라아제 분석 시스템(Promega)을 이용해서 -80℃로 냉동하였다. 루시퍼라아제 활성을 Turner Designs 모델 20 발광측정기로 측정하였다. β-갈락토시다아제 활성의 검출을 수행하여 β-갈락토시다아제에 대한 기질, 클로로페놀 레드 β-D-갈락토프라노시드(CPRG)를 이용한 비색 변화를 측정하는 민감한 ELISA 효소 분석으로 각각의 세포주에 대해 일시적인 삽입유전자 발현을 정규화하였다(Eustice DC, et al., Biotechniques 1991, 11(6): 739-740, 742-733). 각각의 세포주로부터 전달감염 효율을 확인하기 위해 각각의 구축물에 대한 루시퍼라아제/CPRG Vmax값의 상대 광 단위(RLU)의 평균 값을 비교하여 루시퍼라아제 활성 백분율을 결정하였다. pCMVLuc에 대한 RLU에 100% 임의 값을 할당하였고, 모든 다른 결과는 도 1a에 나타낸 값에 기반하여 각각의 벡터로부터 계산하였다.

인간 BDDFVIII에 대한 ITGA2B 프로모터 유도 렌티바이러스 벡터.

ITGA2B-(M)WPTS 유전자 전달 벡터는 HIV 유형-1 렌티바이러스 벡터(D.Trono, University of Geneva, Switzerland)로부터 유래된다.51 p-889ITGA2B-BDDFVIII-WPTS 렌티바이러스 벡터(도 1b)는 인간 ITGA2B 프로모터의 -889 내지 +30 뉴클레오티드 단편 및 인간 BDDFVIII 분자를 인코딩한다.16 p-673ITGA2B-VWFSPD2-BDDFVIII-WPTS 렌티바이러스 벡터(도 1c)는 혈소판 α-과립으로 인간 BDDFVIII를 수송하기 위해 SPD2 펩티드를 이용하는 하이브리드 분자의 거핵구-특이적 전사를 허용하기 위해 뉴클레오티드 -673 내지 +30의 인간 ITGA2B 유전자 프로모터 단편에 이어 D2 도메인에 연결된 540 아미노산 VWF 신호 펩티드(SP;66bp)를 인코딩하는 인간 폰 빌레브란트 인자 프로펩티드(VWFpp의 단편(1,199bp) 및 인간 BDDFVIII를 인코딩하는 cDNA를 인코딩한다.22 SP를 인코딩하는 cDNA를 전방 프라이머(P)1(5'

3')(서열 목록 번호 5), 및 후방 P2(5'

3')(서열 목록 번호 6)를 이용하여 PCR로 증폭하고, 전방 P3(5'

3')(서열 목록 번호 7) 및 후방 P4(5'

3')(서열 목록 번호 8)를 이용한 PCR로 증폭된 D2에 결찰시켰다. 네스티드 PCR로 ITGA2B 프로모터 및 VWFSPD2를 P5(5'

3')(서열 목록 번호 9) 및 P4와 연결하였다. p-889ITGA2-BDDFVIII-WPTS는 VWFD2에 직접 결찰된 cDNA를 합성하기 위해 전방 P7(5'

3')(서열 목록 번호 10) 및 후방 P8(5'

3')(서열 목록 번호 11)을 이용하여 BDDFVIII 단편을 인코딩하는 cDNA의 PCR을 위한 주형으로 작용하였다. 모든 PCR 산물을 3'BDDFVIII(MluI 및 SpeI)로 5'hBDDFVIII(BsmBI 및 MluI)에 결찰되는 고유한 제한효소 부위 -673ITGA2B-SPD2(ClaI 및 BsmBI)를 이용해서 pCR-Blunt II-TOPO(Life Technologies, Grand Island, NY) 내로 클로닝하였다. 모든 단편을 pWPTS 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하고, 정확한 동일성을 뉴클레오티드 서열 분석으로 확인하였다. 재조합 바이러스 입자를 3 플라스미드의 일시적 공-전달감염으로 생성한 뒤 상청액을 수집하고, 원심분리에 의해 500배 농축하고, 이용 시까지 -80℃에 보관하였다(Fang J, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2011, 108(23): 9583-9588). 바이러스 입자 역가를 RT-PCR로 결정하였다(Lizee G, et al., Hum Gene Ther 2003, 14(6): 497-507). 마커 구조 분석을 이용하여 스톡에 복제 적격 바이러스 입자가 없음을 확인하였다(Wilcox et al., Blood 2000, 95(12): 3645-3652).

개(Dogs).

둘 다 실험실 동물 관리의 인가를 위한 미국 연합의 인가 설비인 노스캐롤라이나 기관 동물 관리 및 이용 위원회 및 위스코신 의대에서 혈우병 A를 갖는 FVIII-결핍 개를 이용한 시토카인 가동화 CD34+G-PBC 유전자 전달 및 자가 이식물 연구(University of North Carolina, Chapel Hill, NC)(Lozier JN, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2002, 99(20): 12991-12996)를 수행하고 승인을 받았다.

개 CD34+ G-PBC 단리, 형질도입, 이식.

19마리 성체(1.25, 4.25, 및 6.5연령) FVIII-결핍 수컷 개에 매일 개 재조합 과립구 집락 자극 인자(crG-CSF;10㎍/kg/d) 및 줄기 세포 인자(crSCF; 5㎍/kg/d)(Amgen, Thousand Oaks, CA)를 주사하였다. COBE Spectra 혈구 분리기를 이용해서 3일째 날에 G-PBC 수집을 수행하였다. 단핵구 G-PBC를 Fico-Paque Plus(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 이용해서 단리하였다. CD34+ G-PBC를 Automacs 자기 세포 분리기(Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA) 상에서 바이오틴-콘주게이트된-1H6 Ab(1mg/ml)(Richard Nash, Fred Hutchinson Research Institute, Seattle, WA) 및 항-바이오틴 면역-자기 비드(1:5 희석액)로 선택하였다. CD34+ G-PBC에 -889ITGA2B-BDDFVIII-WPTS 또는 -673ITGA2B-VWFSPD2-BDDFVIII-WPTS 렌티바이러스 벡터를 형질도입하였다. 간략하게, 4x106 세포/웰을 20㎍/cm2 레트로넥틴(Takara Shuzo, Otsu, Shiga, Japan)이 코팅된 6-웰 플레이트(Falcon-Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 접종하고, 10%FCS, rhIL-3, rcaIL-6, rcaSCF, rhTPO 및 rhflk2/flt3 리간드를 함유하는 X-Vivo 10 중에 1.0x10⁴ ITGA2B-FVIII 렌티바이러스 입자/세포와 함께 인큐베이션하였다. 약 3x106 FVIII-형질도입된 CD34+G-PBC/kg 및 2x108 CD34(-)G-PBC를 비-골수절제 용량의 5-10mg/kg Busulfex®로 사전 컨디셔닝된 각각의 자가 이식물 수신체의 요골측 피부 정맥 내로 주입하였다. 10mg/kg/d 시클로스포린(Gengraf®, Abbott Laboratories, North Chicago, IL) 및 8mg/kg/d MMF(표 1)로 이식 후

90일 동안 일시적인 면역 억제를 투여하였다(Fang et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2011, 108(23): 9583-9588).

혈액 수집.

혈액을 7.5% EDTA 항응고제(Fang et al., 상기)를 함유하는 혈관튜브(vacutube) 내로 사전 선택된 시간에 수집하였다. 혈액 세포를 Vet ABC 혈액 분석기(scil animal care company, Gurnee, IL) 상에서 계수하였다. 혈소판을 Fico/Lite™(Atlanta Biologicals, Norcross, GA)로 단리하고, PBS로 세척하고, 면역형광 유세포 측정 또는 FVIII:C 활성 분석을 위해 직접 이용하였다. 백혈구를 제조업체의 사양에 따라 Ficoll-Paque Plus®(GE Healthcare)로 단리하였다.

항체.

개 CD34에 대한 쥐과 모노클로날 1°Ab "1H6"(1mg/ml)을 Fred Hutchinson 암 연구 센터(Seattle, WA)에서 얻었다.27 개 피브리노겐을 인식하는 양 항-토끼 피브리노겐 폴리클로날 1°Ab(5㎍/ml)를 (Enzyme Research)에서 구입하였다. 모노클로날 1°Ab(5-10㎍/ml), MBC 103.3 및 301.3(R.R.Montgomery, BloodCenter of WI, Milwaukee, WI)은 인간 BDDFVIII 상의 에피토프를 인식한다.53 이용된 2°Ab는 당나귀 항-양 IgG(H+L) 단편에 콘주게이트된 Alexa Fluor® 488 F(ab')2(1:1,000 희석액) 및 염소 항-마우스 IgG(H+L)의 Alexa Fluor® 568 F(ab')2 단편(1:500 희석액)이었고, Life Technologies(Grand Island, NY)에서 얻었다.

면역형광 동일초점 현미경.

개 혈소판을 3.7%(vol/vol) 완충 포르말린으로 고정하고, 0.5% Triton X-100(20mmol/L Hepes, 300mmol/L 수크로오스, 50mmol/L NaCl, 및 3mmol/L MgCl2, pH7.0 중) 중에 투과화하고, HBSS 중 2.5% 일반 염소 혈청으로 차단하였다. 혈소판을 개 피브리노겐에 대한 양 폴리클로날 1°Ab 및 인간 FVIII에 대한 모노클로날 1°Ab(MBC 103.3 & 301.3)(5ug/ml)와 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.53 당나귀 항-양 IgG(H+L)의 Alexa Fluor® 488-콘주게이트된 F(ab')2 단편을 피브리노겐을 검출하기 위한 2°Ab(1:1,000 희석액)로 이용하였고, 염소 항-마우스 IgG(H+L) 콘주게이트된 2°Ab의 Alexa Fluor® 568-콘주게이트된 F(ab')2 단편(1:500 희석액)을 25℃에서 30분 동안 FVIII의 존재를 검출하기 위해 이용하였다. 혈소판을 Vectashield(Vector Labs, Burlingame, CA)로 실장하였다. 면역형광을 Zeiss LSM 510 Multiphoton 동일초점 현미경(Carl Zeiss, Inc. Oberkochen, Germany)으로 검출하였다(Wilcox DA, et al., Journal of thrombosis and haemostasis : JTH 2003, 1(11): 2300-2311). FVIII-결핍 개에서 단리된 혈소판을 음성 대조군으로 이용하였다. 비특이적 이소형 대조군 Ab가 음성 대조군으로 작용하였다. 혈소판을 각 필드에 대해 찍은 Z 섹션으로 이미지화하고, 전체 Z 시리즈(12-25개 이미지)를 적층된 투영으로 조합하였다. 투영을 동일초점 보조 소프트웨어 프로그램(Bio-Rad)을 이용해서 병합하였다. 컴퓨터 할당된 색상은 비트맵 오버랩의 강도에 기반하였고, Alexa488-형광단을 녹색 픽셀로 나타내고, Alexa568-형광단을 적색 픽셀로 나타내고, 두 형광단-콘주게이트된 항체의 공동 편재를 황색 픽셀로 나타내었다.

면역형광 유세포 측정.

개 혈소판을 혈액에서 단리하고, BDDFVIII의 세포내 검출을 위해 Cytofix™ 및 PERM/WASH™ 시약(BD Biosciences)으로 처리하였다. 혈소판을 4℃에서 30분 동안 인간 FVIII(5ug/ml)에 대한 모노클로날 1°Ab(MBC 103.3 & 301.3)와 인큐베이션한 뒤 4℃에서 30분 동안 염소 항-마우스 IgG(H+L)가 콘주게이트된 2°Ab의 Alexa Fluor® 568-콘주게이트된 F(ab')2 단편(1:500 희석액)과 인큐베이션하였다. FVIII-결핍 개에서 단리된 혈소판을 음성 대조군으로 이용하였다. 비특이적 이소형 대조군 Ab가 음성 대조군으로 작용하였다. 세포를 수집하고, Accuri 분석 소프트웨어를 이용해서 Accuri® C6 유세포 측정기(Accuri Cytometers, Inc., Ann Arbor MI) 상에서 분석하였다.

면역 금(Immunogold) 표지.

혈소판을 1.25% 글루타르알데히드(Fluka AG, Buchs, Switzerland) 중에 고정하고, 2.3M 수크로오스(Fluka)를 주입하고, Reichert KF 80 냉동 시스템(Leica, Vienna, Austria)으로 냉동하였다.

80nm 섹션을 FC 4E 크리오키트 부착물이 장착된 Ultracut E 울트라마이크로툼으로 제조하고 콜로디온-코팅된 니켈 그리드 상에 놓았다. 그리드를 1% BSA를 포함하는 PBS 상에서 10분 동안 인큐베이션한 뒤 25℃에서 1시간 동안 FVIII에 대한 1°Ab(301.3)의 (10㎍/ml) 액적 상에 놓았다. 섹션을 10nm 금 입자(AuroProbe EM G10의 1/100 희석액) 상에 흡착된 염소 항-마우스 2°Ab와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군에는 동일한 농도로 동일한 종의 비관련 IgG의 이용이 포함되었다.

전자 현미경.

그리드를 우라닐 아세테이트 및 오스뮴으로 염색한 뒤 80KV에서 Jeol JEM-1010 투과 전자 현미경(Jeol, Croissy-sur-seine, France)으로 관찰 전에 메틸셀룰로오스에 임베딩하였다.

혈소판의 작용제 유도 활성화.

혈소판을 순환 말초 혈액으로부터 단리하고, 세척하고, 혈소판 활성화의 생리적 작용제로 활성화하였다. 활성화를 유도하기 위해, 혈소판을 전술된 바와 같이(Fang et al., 상기) 37℃에서 30분 동안 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 각각 25μM의 아데노신 디포스페이트(ADP)(Sigma), 에피네프린(Bio/Data Corporation, Horsham, PA) 및 개 트롬빈 수용체 활성화 펩티드: PAR1(SFFLKN-NH2), PAR3(TRFGAP-NH2) 및 PAR4(SFPGQP-NH2)를 함유하는 Tyrode 완충액 중에 재현탁하였다(2.5 x 106/ml). 별도의 분취물을 음성 대조군으로 작용제를 포함하지 않는 Tyrode 완충액 중에 인큐베이션하였다. 혈소판을 원심분리에 의해 펠렛화하고, 작용제 처리 및 음성 대조군 표본으로부터 상청액을 흡입하여 제거하였다. 혈소판 펠렛을 coatest 분석을 이용하여 FVIII:C 활성에 대해 평가 시까지 -80℃로 즉시 냉동하였다.

혈액 게놈 DNA 중 렌티바이러스 벡터의 PCR 검출.

DNA를 Ficoll-Paque™ Plus(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)로 정제된 개 백혈구로부터 QIAamp® DNA 혈액 Mini 키트(Qiagen,, Maryland, USA)로 단리하였다. p-889ITGA2-BDDFVIII-WPTS가 양성 대조군으로 작용하였다. PTC200 기기(MJ Research, Watertown, MA) 상에서 Taq 폴리머라아제(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 전방 프라이머 P1(5'-

-3') 및 후방 프라이머 P2(5'-

-3')(서열 목록 번호 12)를 이용해서 PCR 분석을 수행하여 WPRE를 인코딩하는 318 뉴클레오티드의 일차 산물을 합성하였다(도 1b, c). 이차 PCR 반응을 WPRE의 302bp 산물을 인코딩하는 네스티드 전방 프라이머 P3(5'-

-3')(서열 목록 번호 13) 및 후방 프라이머 P4(5'-

-3')(서열 목록 번호 14)로 수행하였다(도 5a).

렌티바이러스 형질도입 효율을 검출하기 위한 RT-qPCR.

렌티바이러스 유전자 마킹 백분율을 BIO-RAD CFX96 실시간 시스템을 이용해서 RT-qPCR로 측정하였다.52 간략하게, 12.5ul의 TaqMan Universal PCR 마스터 혼합물(Life technologies), 900nM 농도의 각각의 프라이머, 및 200nM 탐침을 20㎕의 수중에 조합하였다. 이어서 5㎕의 개 게놈 DNA를 첨가하고, 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 이어서 95℃에서 15초 및 60℃에서의 1분 40사이클의 PCR을 이용하였다. 각각의 RT-qPCR에 있어서, 음성 대조군으로 주형이 없는 대조군이 포함되었다. 각각의 표본을 Primer Express 소프트웨어(version 1.0; Applied Biosystems)를 이용하여 유전자 복제수에 대해 3회 분석하고, 삽입유전자 복제수/게놈에 대한 평균 값을 렌티바이러스 벡터에 대해 양성인 말초 혈액 세포의 백분율(형질도입 효율로도 알려져 있음)로 변환하여 표 1의 8열에 보고하였다. 이용된 렌티바이러스 LTR 프라이머 및 탐침은 다음과 같았다: 전방: 5'-

-3'(서열 목록 번호 15); 후방: 5'-

-3'(서열 목록 번호 16); 탐침: 6FAM-

-MGBNFQ(서열 목록 번호 17). 개 ITGB3 유전자를 유전자 복제수에 대한 내인성 대조군으로 이용하였다: 전방: 5'-

'(서열 목록 번호 18); 후방: 5'-

-3'(서열 목록 번호 19); 탐침: 6FAM-

-MGBNFG(서열 목록 번호 20). 복제수는 TaqMan 원칙에 기반하였다. 관련된 서열(렌티바이러스 벡터 LTR 및 개 ITGB3)을 함유하는 기지의 농도의 플라스미드 구축물의 10배 연속 희석액을 이용하여 표본 정량을 위한 표준 곡선을 생성하였다.

선형 증폭-매개(LAM)-PCR.

말초 혈액 백혈구에서 단리된 게놈 DNA 내에서 렌티바이러스 벡터 삽입 부위의 위치를 확인하기 위해 LAM-PCR을 수행하였다. 간략하게, 통합된 프로바이러스 LTR 및 숙주 게놈 간 접합부를 벡터-특이적 5'-바이오티닐화된 프라이머[5'-/바이오틴/-

-3'(서열 목록 번호 26)]를 이용해서 2회의 선형 PCR[95℃에서 5분; (95℃에서 1분, 60℃에서 45초, 72℃에서 90초) x 50; 72℃에서 10분]로 선택하고, 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드[Dynal M-280]를 이용해서 정제하였다. 산물을 Klenow 폴리머라아제 및 무작위 헥사뉴클레오티드 프라이머를 이용해서 이중쇄화하고, 2시간 동안 65℃에서 Tsp509I로 소화시켰다. 지향성 이중쇄 링커 올리고를 비-LTR 말단 상에 결찰시키고 생성 산물을 LTR-특이적 전방 프라이머[F1: 5'-/바이오틴/-

-3'(서열 목록 번호 27); F2: 5'-

-3'(서열 목록 번호 28)] 및 링커 카세트 특이적 후방 프라이머[R1: 5'-

-3'(서열 목록 번호 29); R2: 5'-

-3'(서열 목록 번호 30)]를 이용해서 네스티드 PCR[95℃에서 5분; (95℃에서 1분, 60℃에서 45초, 72℃에서 90초) x 35; 72℃에서 10분]로 증폭시켰다. 네스티드 PCR 라운드 사이에, 산물을 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 이용해서 정제하였다. 산물을 2% TAE 아가로오스 겔 상에서 가시화하였다. 서열분석을 위해, 산물을 겔 정제하고 pCR2.1-TOPO 내로 클로닝하고, E. coli Top10 내로 형질전환하고, LB-Amp-Xgal 플레이트 상에서 선택하고, M13F/R을 이용한 콜로니 PCR로 증폭시켰다.

통합 부위의 기능적 평가.

프로바이러스 LTR 서열을 함유하는 것으로 확인된 LAM-PCR로부터의 서열 산물을 기지의 게놈 반복 및 프로바이러스 특성에 대해 마스킹하였다. 생성 서열을 UCSC의 Blat(BLAST-유사 정렬 도구) 서버를 이용해서 개 게놈(CanFam 2.0, 2005. 5. 어셈블리)에 정렬시켰다. 95% 유사성으로 게놈 내 고유한 위치에 대한 서열 맵핑을 선택하고, 통합 부위를 프로바이러스 LTR 서열의 측면에 접한 게놈 정렬에서의 염기로 결정하였다. 각각의 부위에 있어서, 가장 가까운 RefSeq 유전자를 결정하고, 인간 암 오르소로그 목록과 비교하였다.

생물학적 활성 인간 FVIII(FVIII:C)의 검출.

1x10⁸ 혈소판/ml의 용해액을 Chromogenix Coatest® SP4 FVIII 키트(DiaPharma, Franklin, OH)를 이용해서 FVIII:C에 대해 평가하였다.12 상청액 표본 2개씩을 96웰 마이크로타이터 플레이트(25㎕/웰)의 미코팅된 웰에 넣고, 분석 성분(인지질, 인자 IXa, 인자 X, 및 칼슘 클로라이드)을 첨가하고, 37oC에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 발색 인자 Xa 기질 S-675를 첨가하고, 플레이트를 37℃에 사전 설정된 Wallac Victor2 마이크로플레이트 판독기로 옮겼다. S-2675의 인자 Xa-의존적 변환은 각 웰 내 FVIII:C의 양에 직접 관련된다. 405nm에서 Vmax를 이용하여 혈소판 용해 완충액 중에 희석된 기지량의 재조합 인간 FVIII(Kogenate; Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Berkeley, CA)를 도시하여 표준 곡선을 구축하였다. 각 반응의 Vmax를 역학 소프트웨어 프로그램 SOFTmax, v.2.34(Molecular Devices)를 이용해서 FVIII:C 활성 단위로 변환하였다. FVIII 활성을 405nm에서의 종말점 판독에 의해 측정하고, 490nm에서의 배경 판독을 405nm에서 감산하였다. 표 1 및 도 6에 기록된 측정 값을 이용해서 평균 FVIII:C U/ml/1x10⁸ 혈소판 x 92ml 혈액/kg x 개 체중(kg) x (2x10⁸ 혈소판)/1ml 혈액)를 곱하여 총 최대 FVIII:C/개를 계산하였다.

전혈 응고 시간(WBCT) 분석.

WBCT는 28℃에서 2 실리콘화 유리관(Becton-Dickinson, Rutherford, NJ)을 이용한 Lee-White 응고 시간의 변형이다(Nichols TC, et al., J Thromb Haemost 2012, 10(3): 474-476). 1ml의 전혈을 인취하고, 0.5ml의 혈액을 각 관 내로 분배하였다. 타이머를 시작하였다. 1분 뒤, 1개 튜브를 30초마다 기울이고, 다른 것은 움직이지 않고 놔두었다. 기울인 관에서 응고가 형성되는 경우, 두 번째 관을 응고가 형성될 때까지 30초마다 기울였다. 두 번째 관에서 완전 겔화된 응괴의 형성에 걸리는 시간을 WBCT로 기록하였다. 혈액을 정상 지혈되는 것(WBCT 7.5-12.5분), 그리고 동물이 적어도 1개월 동안 혈장으로 치료받지 않은 경우, G-PBC 이식 이전 및 이후 3마리의 실험 개(F20, I42, M64)로부터 수집하였다.

인간 FVIII에 대한 면역 반응을 검출하기 위한 저해제 분석.

개 혈액 혈장(F20, I42 및 M64)을 전술된 바와 같이 응고 인자 VIII 또는 IX에 대해 저해 항체를 검출하는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 혼합 분석으로 저해제에 대해 스크리닝하였다(Langdell RD, et al., J Lab Clin Med 1953, 41(4): 637-647; Sahud MA. Semin Thromb Hemost 2000, 26(2): 195-203; Matrai J, et al., Hepatology 2011, 53(5): 1696-1707). 간략하게, 평가 혈장을 37℃에서 2시간 동안 정상 혈장과 1:1 혼합물 중에 인큐베이션한 뒤, 인큐베이션한 혼합물을 표준 aPTT 시약을 이용해서 분석한다. 비교를 위해 인간 FVIII와 교차 반응하고 이를 저해하는 기지의 Bethesda 저해제(BIU) 역가를 갖는 혈우병 A 개로부터의 혈장(양성 대조군) 및 저해제가 없는 개로부터의 혈장(음성 대조군)을 동시에 분석하였다.

결과

혈소판-표적화된 렌티바이러스 벡터 설계 및 전략

루시퍼라아제 리포터 분석은 전장 인간 ITGA2B 유전자 프로모터의 단편이 필적하는 혈소판-특이적 유전자 전사를 허용함을 드러내었다(도 1a). 3 상이한 ITGA2B 프로모터 단편(-1218, -889 및 -673)은 전-거핵구 세포주 내에서 유사한 수준의 루시퍼라아제 활성을 유도하였다. 대조적으로, ITGA2B 프로모터가 유도한 루시퍼라아제 활성은 다른 혈액 세포 계통 및 상피 세포주에서는 검출되지 않고 유지되었다. 각각의 ITGA2B 프로모터는 고수준의 거핵구 유전자 전사를 허용하는 Ets 및 GATA 인자 그리고 다른 계통 내에서의 발현을 저해하는 억제인자 영역을 인코딩한다(Prandini MH, et al., Blood 1996, 88(6): 2062-2070).20 그 결과, 두 렌티바이러스 유전자 전달 벡터를 인간 유전자 치료법을 위한 전략을 개발하기 위해 혈우병 A 개에서 혈소판-유래 BDDFVIII의 지혈 기능을 개선하는 능력 및 최적의 조혈 줄기 세포 형질도입 효율에 대해 평가하였다. 2마리 개는 BDDFVIII의 거핵구-특이적 전사를 유도할 수 있는 것으로 나타난 인간 ITGA2B 프로모터의 -889 뉴클레오티드에서 시작하는 단편을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 G-PBC를 주입받았다(도 1b).21 정상 상태 하에서는 FVIII가 혈소판에 없지만, 상기 접근은 조직 배양된 인간 CD34+G-PBC에서 유래된 혈소판 자손 및 혈우병 A 마우스 내로 이식된 렌티바이러스 벡터-형질도입된 골수에서 생활성 BDDFVIII를 저장하기 위해 성공적인 것으로 입증되었다,12(Shi et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 2007, 5(2): 352-361). 1마리 개는 α-과립 구획 내로 BDDFVIII의 수송을 촉진하기 위해 D2 도메인(SPD2) 및 폰 빌레브란트 인자(VWF) 프로펩티드 신호 펩티드에 융합된 BDDFVIII의 하이브리드 분자의 거핵구-특이적 발현을 유도하기 위해 설계된 ITGA2B 프로모터의 가장 짧은 단편(-673)을 인코딩하는 신규한 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 G-PBC를 주입받았다(도 1c)(Haberichter SL, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002, 22(6): 921-926; Haberichter SL, et al., Blood 2003, 101(4): 1384-1391). VWF는 인간 및 개 혈장에서 FVIII의 담체 단백질로 작용하는(Kaufman RJ, et al. Molecular & Cellular Biology 1989, 9(3): 1233-1242) 인간 혈소판에서의 정상적인 α-과립 구성성분이다(그러나 개 혈소판에는 없음)(Nichols TC, et al., Blood 1993, 81(10): 2644-2651).

조혈 줄기 세포 유전자 치료법을 위한 전략

임상적으로 관련된 프로토콜을 설계하기 위해, 개 조혈 줄기 세포를 개 시토카인(cG-CSF & cSCF)으로 골수로부터 말초 혈액 내로 가동화하고, GT 개를 이용한 이전 연구와 동일하게 유해 사례 없이 G-PBC 성분채집을 수행하였다(Fang et al., 상기). 단핵 림프구를 성분채집 산물로부터 Ficoll-Paque Plus를 이용해서 단리한 뒤 개 CD34 항원 양성(CD34+) 세포를 면역자기 선택에 의해 정제하였다(McSweeney PA, et al., Blood 1998, 91(6): 1977-1986). 표 1은 형질도입된 세포에 대한 생체외 또는 생체내 선택을 이용하지 않고 각각의 표적 세포에 약 1x10⁴ 총 바이러스 입자/CD34+G-PBC가 형질도입된 약 3x10⁶ FVIII-형질도입된 CD34+G-PBC/체중kg이 수혈된 3마리의 혈우병 A 개의 자가 이식물에 대한 상태를 요약한다(칼럼 4, 5). 비-골수절제 이식-전 컨디셔닝 요법을 채택하여 주입될 새로 이식된 세포를 위해 골수 내에 오목부를 생성하였다(표 1, 칼럼 2). 컨디셔닝 요법의 강도는 용량이 기관에 독성이 되는 수준에 의해 결정된다. 정상 개 모델로 수행된 초기 연구는 안정한 동종이계 혼합 공여체/숙주 조혈 키메라증이 이식-전 컨디셔닝을 위해 준치사 용량의 부설판(조혈 줄기 세포에 우선적으로 독성인 약물)의 투여에 의해 안전하게 구축될 수 있음을 나타내었다. 최근 보고도 개 백혈구 접착 결핍을 교정하기 위한 조혈 줄기 세포 유전자 전달에 있어서 10mg/kg의 부설판(Bauer TR, Jr., et al., Nat Med 2008, 14(1): 93-97), 이어서 주조직 적합 복합체 동일 골수 이식 후 미코페놀레이트 모페틸(MMF) 및 시클로스포린(CSP)을 이용한 일시적 면역억제의 성공적인 이용을 나타내었다(Enssle J, et al., Hum Gene Ther 2010, 21(4): 397-403). 그러나, 이러한 수준의 이식-전 컨디셔닝 요법은 현재 연구에 이식된 첫 번째 개(F20)가 G-PBC 이식 후 3개월 동안 개 혈장 산물 및 재조합 cFVIII의 형태로 개 (c)FVIII의 매일 보충을 필요로 하므로, 혈우병 A를 갖는 동물을 위해 부적합한 것으로 입증되었다. 엡실론-아미노카프로산(EACA)도 인간 BDDFVIII가 혈소판에서 상당한 수준에 도달할 때까지 G-PBC 이식 후 주입되었다. EACA는 플라스민-플라스미노겐 시스템의 효과적인 합성 저해제이며, 여러 원인, 및 혈우병에서의 치과 수술로부터의 지주막하 출혈, 비뇨생식기 출혈을 제어한다(Griffin JD, et al., Semin Thromb Hemost 1978, 5(1): 27-40). 비교를 위해, cFVIII 보충을 이용한 치료가 필요한 심각한 출혈 증례의 수를 각각의 개에 대해 G-PBC 이식 1년 전 및 2.5년 후에 기록하였다(표 1, 칼럼 10, 11)(Niemeyer GP, et al., Experimental Hematology 2003, 31(12): 1357-1362). F20에서의 빈번한 출혈 사례의 관찰 결과, 저용량 부설판으로 구성된 더 경도의 컨디셔닝 요법을 다음 두 이식 수신체에게 제공하였다(I42, 5mg/kg; M64, 7mg/kg). 결론적으로, 모든 3마리 개가 일시적인 면역 억제를 수여받았고(Fang et al., 상기) 쉽게 검출 가능한 인간 BDDFVIII 수준이 혈소판 및 혈액배양(hemocult) 평가에서 관찰되어 GI 출혈의 부재를 시사할 때까지 표준 이식 요법으로 G-PBC 이식 후 3개월 동안 cFVIII 및 EACA의 매일 보충을 수여받았다(Fang et al., 상기). 궁극적으로, I42 및 M64는 이식 후 2.5년 동안 중증 출혈 증례가 없었으므로 추가 FVIII 보충을 필요로 하지 않음이 관찰되었다(표 1, 칼럼 11).

혈소판 FVIII의 생물학적 연구

BDDFVIII가 G-PBC 이식 후 합성되고 혈소판에 저장되는지를 결정하기 위해 면역-동일초점 현미경을 수행하였다. 모든 세 마리 개(F20, I42, M64)의 분석 결과를 나타내는, 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 G-PBC의 자가 이식물을 수여받은 한 마리 개(I42)로부터 단리된 혈소판의 현미경 분석 결과의 이미지를 도 2a에 나타낸다. 혈소판 α-과립의 특이적 마커, 피브리노겐(Fg)에 대해 반점식 염색 패턴이 존재한다(좌측 패널). 인간 BDDFVIII도 혈소판 내에서 반점식 패턴으로 검출되었다(중앙 패널). 좌측(Fg) 및 중앙 패널(BDDFVIII)이 중첩되는 경우 황색 염색의 출현으로 명백한 바와 같이 BDDFVIII 염색이 빈번하게 Fg 내에 공동 편재되어, 두 단백질이 함께 혈소판 α-과립 내에 저장될 수 있음을 시사하는 것을 주지하라(우측 패널)(Wilcox et al., J Thromb Haemost 2003, 1(12): 2477-2489).

외인성 BDDFVIII가 혈소판 α-과립에 특이적으로 수송되고 있는지를 결정하기 위해 면역-전자 현미경을 수행하였다. 면역 금 분석을 FVIII에 대한 1°Ab 및 10nm 금 입자 상에 흡착된 2°Ab로 혈소판의 초박편 섹션 상에서 수행하였다(도 2b). α-과립은 FVIII 이식물 수신체뿐만 아니라 FVIII-결핍 개의 혈소판 내에서 정상 크기 및 형태로 나타났다. BDDFVIII은 FVIII-결핍 음성 대조군의 혈소판 α-과립에 존재하지 않는다(좌측 패널). 대조적으로, 모든 3마리 개(F20, I42, M64)로부터 단리된 혈소판의 α-과립 및 세포질 내에서 BDDFVIII이 검출되었다. 이 결과는 폰 빌레브란트 질환을 갖는 VWF(-/-) 유전자삽입 마우스의 혈소판 내 BDDFVIII의 전위 발현에 대해 보고된 관찰과 일치한다(Yarovoi H, et al., Blood 2005, 105(12): 4674-4676). M64로부터의 -673ITGA2B-VWFSPD2-BDDFVIII 형질도입된 혈소판이 α-과립 내에 가장 고수준의 BDDFVIII을 저장하였다(우측 패널). 또한, BDDFVIII은 혈소판 세포질에서 막 시스템 내에서는 거의 검출되지 않아서, VWFSPD2가 실제로 BDDFVIII을 직접 α-과립 구획 내로 수송하기 위해 증가된 효율을 가짐을 시사하였다.

혈소판의 면역형광 유세포 측정 분석은 M64 혈소판이 FVIII-결핍 음성 대조군 혈소판에 비해 I42 및 F20이 뒤따르며 FVIII의 검출을 위한 가장 높은 평균 형광 강도를 나타내었으므로, M64가 혈소판 별로 가장 고수준의 FVIII를 저장함을 확인시켰다(도 3). 이들 결과는 VWFSPD2 표적화 구축물이 혈소판 내에서 BDDFVIII를 저장하기 위한 장점을 부여한다는 것을 시사한다. 이어서 가장 작은 -673ITGA2B 유전자 프로모터의 이용은 렌티바이러스 벡터가 가장 큰 치료 삽입물(이 경우에는 VWFSPD2-BDDFVIII)을 수용할 수 있도록 한다; 따라서 -1218 또는 -889 ITGA2B 프로모터에 비해 유전자 전달을 위해 더 유용할 수 있다.

활성화된 혈소판이 조직 배양에서 활성화된 인간 거핵구에 대해 이전에 나타낸 바와 같이 BDDFVIII의 생물학적 활성 형태(FVIII:C)를 분비할 수 있는지를 결정하기 위해, Chromogenix Coatest® SP4 FVIII 분석을 수행하였다(Wilcox et al., Thromb Haemost 2003, 1(12): 2477-2489).12 도 4에서, FVIII-결핍 개의 혈소판 용해액은 BDDFVIII:C 배경 활성 수준이 미처리(흑색, -작용제) 및 활성화된 혈소판(흰색, +작용제)에 대해 실제로 변하지 않음을 나타낸다. 대조적으로, FVIII:C 활성은 F20, I42 및 M64의 휴지 상태의 미처리 혈소판의 용해액에서 쉽게 검출되었다. 또한, BDDFVIII:C 수준은 모든 세 실험 개에서 혈소판 활성화의 생리적 작용제 혼합물: ADP, 에피네프린, 및 개 PAR 1, 3, 4에 의해 자극된 혈소판 용해액에서 감소되었다. 요약하면, BDDFVIII-형질도입된 G-PBC를 수여받은 개는 혈소판 활성화 후에만 FVIII:C 활성의 감지 가능한 감소를 나타내어, 실험 동물로부터의 혈소판이 혈관계 내에서 FVIII를 분비하도록 유도될 수 있음을 시사한다.

렌티바이러스 벡터의 게놈 분석

렌티바이러스 벡터 WPRE 요소를 이식 후 적어도 2.5년 동안 F20, I42, 및 M64에서 수집된 백혈구에서 단리된 게놈 DNA의 PCR로 검출하였다(도 5a). 말초 혈액 백혈구에서 단리된 게놈 DNA의 실시간 정량적 PCR(RT-qPCR) 분석은 각각의 렌티바이러스 벡터에 대한 형질도입 효율이 1%(F20), 4%(I42) 및 2%(M64)임을 드러내었다(표 1, 칼럼 8). 삽입 종양유전자의 출현 부재 시 게놈 분석에 의한 렌티바이러스 벡터의 검출은 정상 형태 및 순환 조혈 세포의 수를 나타내는 말초 혈액 계수 및 말초 혈액 도말의 빈번한 평가를 이용하여 모든 개의 전반적으로 우수한 건강과 일치한다. 실험 개의 게놈 내에서 렌티바이러스 벡터의 통합 패턴을 결정하기 위해 선형 증폭-매개(LAM)-PCR도 수행하였다. 도 5b는 이식된 개(F20, I42 및 M64)의 게놈 DNA에 다중 밴드가 존재하는 것으로 나타나는 반면, FVIII 결핍 대조군의 게놈 내에는 렌티바이러스 벡터가 존재하지 않았음을 나타낸다. 고유한 삽입 부위가 F20에 대해 염색체 4에서 그리고 M64에 대해 염색체 35에서 특이적으로 검출되었다. 이 결과는 삽입 부위가 현재 개 게놈 맵의 정확한 영역에 배치될 수 없지만(Sutter NB, Ostrander EA. Dog star rising: the canine genetic system. Nat Rev Genet 2004, 5(12): 900-910), 렌티바이러스 벡터의 삽입이 I42 게놈 DNA 내에서 검출될 수 있었음을 나타낸다. 요약하면, 이 결과는 상기 연구가 종결되었을 때(

이식 후 2.5년) 삽입 돌연변이화가 일어나지 않았음을 시사한다. 이는 발견된 렌티바이러스 벡터가 보통 동물 및 인간에서 게놈의 양성 영역 내로 삽입된다는 다른 보고와 일치한다(Biffi A, et al., Blood 2011, 117(20): 5332-5339).

혈우병 A에 대한 혈소판-표적화된 유전자 치료법의 유효성

인간 조혈 세포는 조직 배양된 인간 거핵구 내에서(Shi Q, et al., Molecular Genetics and Metabolism 2003, 79(1): 25-33.), BDDFVIII-형질도입된 인간 G-PBC가 이종 이식된 마우스에서 단리된 말초 혈액 혈소판에서,12 그리고 BDDFVIII-형질도입된 골수 이식물을 수여받은 혈우병 A에 대한 쥐과 모델에서(Shi Q, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2007, 5(2): 352-361) 인간 BDDFVIII의 기능적 형태(FVIII:C)의 합성을 위한 일차 조직원으로 작용할 수 있음이 전에 관찰되었다. 현재의 연구(도 6)는 FVIII:C 활성(

5-15mU/ml/108 혈소판)이 각각의 개에서 자가 G-PBC 이식 후 적어도 2.5년 동안 색소 분석에 의해 검출될 수 있고, 가장 높은 수준은 이식 후 약 1년째에 나타나며, 전형적으로

5-10mU/ml/10⁸ 혈소판으로 감소됨을 나타낸다(F20, I42, M6). FVIII-결핍 개의 표본이 각 시점에 대한 음성 대조군으로 작용하였다(흑색 라인).

임의의 주어진 시점에 각 동물 내에 존재하는 총 FVIII:C 활성 수준을 결정하기 위해, 개에서

2x10⁸ 혈소판/1.0ml 혈액이 존재하고

92ml 혈액/kg이 존재함이 주지된다. 도 6에 나타낸 데이터 지점에 대해 계산된 각 개의 체중 및 형질도입 효율 그리고 평균 FVIII:C 수준에 대해 표 1에 보고된 값을 이용하여, 모든 순환 혈소판 내에 약 0.230U(F20), 1.325U(I42) 및 0.676U(M64) FVIII:C/개가 저장된 것으로 산정된다. 이들 값을 예상에 투입하여, 용어 1U FVIII:C/ml은 일반(20kg) 개로부터의 기준 혈장 중 100% FVIII 활성을 정의한다; 따라서 일반(20kg) 동물은 임의의 주어진 시점에 그 혈장 부피 중에 총

800U의 FVIII를 갖는다. 도 6의 결과는 G-PBC의 1년 전에 각 동물에서 cFVIII 보충을 포함하는 수혈을 필요로 하는 여러 중증 출혈 증례가 일어났었음을 나타낸다. 유전자 치료법 프로토콜로 인한 출혈을 예방하기 위해, 각각의 개가 G-PBC 이식 프로토콜 1일부터 시작하여 매일 cFVIII 보충을 수여받았음을 주지하라. 혈액이 이들의 대변에 없을 때까지 EACA도 이식된 개에 투여되었고, 이는

5mU/ml/10⁸ 혈소판에 도달하는 혈소판 FVIII:C 수준과 현저하게 일치하였다. F20(상부 패널)은 ≤5mU/ml/10⁸ 혈소판의 최저 전반적 혈소판 FVIII:C 수준을 나타내었고, 이식 후 2.5년의 실험적 추적을 통해 일반 개 혈장 또는 cFVIII의 수혈 형태의 추가적인 보충 투여를 필요로 하는 중증의 간헐적 출혈 증례를 또한 경험하였다. 상기 결과는 출혈 표현형의 적절한 교정을 달성하기 위해 5mU/ml/108 혈소판 FVIII:C가 개 혈우병 A에서 극복되어야 하는 삽입유전자 발현의 역치 수준으로 나타남을 시사한다. 이식 개 I42(중앙 패널)는 약 9mU/ml/10⁸ 혈소판의 최고 항정 상태 FVIII:C를 유지하였고, 이식 후 적어도 2.5년 동안 cFVIII 보충의 투여를 필요로 하는 중증 출혈을 겪지 않아 궁극적으로 혈우병 A 표현형의 교정을 나타내었다. M64(하부 패널)는 8mU/ml/10⁸ 혈소판의 평균 FVIII:C 활성 수준을 수득한 하이브리드 SPD2FVIII 분자의 합성으로 다른 이식 개에서보다 일찍 5mU FVIII:C/ml/10⁸ 혈소판에 도달하였다. 상기 결과는 VWFSPD2 수송 펩티드와 커플링된 -889ITGA2B 유전자 프로모터 또는 -673ITGA2B 유전자 프로모터의 이용이 혈소판에 대해 BDDFVIII를 표적화하기 위해 효과적으로 이용되어 개 혈우병 A 표현형의 교정으로 이어질 수 있음을 나타낸다.

전혈이 시험관에서 응고하기 위해 필요한 시간이 전통적 버전의 Lee-White 전혈 응고 시간(WBCT) 분석을 이용하여 각 개에 대해 측정되었다(Nichols TC, et al., J Thromb Haemost 2012, 10(3): 474-476). 정상 지혈 개는 평균 WBCT 10.5분±SD 1.4분을 갖는다. FVIII-결핍 개에 대한 베이스라인 WBCT는 G-PBC 이식 전에는 44.5(F20), 40.5(I42) 및 >60(M64)분이었다. G-PBC 이식 후, 평균 WBCT는 39.5(F20, n=5), 38.4(I42, n=5) 및 41.9(M64, n=4)분으로 감소되었다. 상기 결과는 WBCT의 매우 약한 감소를 나타내며, 이는 FVIII-결핍 개에 대한 WBCT의 정상 변동 내인 것으로 잘 간주될 수 있다. 흥미롭게도, 상기 결과는 실험 개의 혈장 내에서 FVIII:C(이는 WBCT의 성공을 위한 필수 성분임)의 검출 불능을 뒷받침한다. 따라서 상기 결과는 도 4 및 도 6에 나타낸 바와 같이 혈소판-유래된 FVIII가 FVIII-결핍 개 내에서 지혈을 개선하기 위해 혈관 부상 부위에서 생리적 혈소판 작용제로의 자극 후 활성화된 혈소판에서 분비되어야 하므로(혈장 FVIII와는 달리), 생체외 WBCT의 측정은 생체내 지혈을 개선하기 위한 혈소판 FVIII에 대한 유효성을 예측하기 위해 적합한 분석이 아님을 시사한다.

G-PBC 이식물 수신체가 새로 발현된 인간 BDDFVIII에 대해 체액성 항체 반응을 개발하였는지를 결정하기 위해, (F20, I42 및 M64)의 개 혈액 혈장을 응고 인자 VIII 또는 IX에 대한 저해 항체를 검출하는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 혼합 분석을 이용하여 저해제에 대해 스크리닝하였다. 비교 분석을 위해 인간 FVIII와 교차 반응하고 이를 저해하는 기지의 Bethesda 저해제(BIU) 역가를 갖는 혈우병 A 개의 혈장을 양성 대조군으로 이용하였고, 저해제가 없는 개의 혈장을 음성 대조군으로 동시에 분석하였다. 결과는 F20, I42, 및 M64가 저해제를 개발하지 않았음을 시사한다(표 1: 칼럼 12). 상기 결과는 혈장 중 FVIII:C 존재의 검출 불능과 일치한다. 상기 결과는 혈우병 A 마우스의 인간 혈소판 BDDFVIII에 대한 저해 항체 개발 실패 및 렌티바이러스 벡터-형질도입된 쥐과 골수의 이식 후 혈장 중 FVIII:C의 검출 불능과 동일하다(Shi Q, et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 2007, 5(2): 352-361). 이는 또한 FVIII에 대한 기존 항체를 이용한 인간에 대한 치료로서 혈소판에 대한 BDDFVIII의 삽입유전자 합성의 표적화를 뒷받침한다(Shi Q, et al., J Clin Invest 2006, 116(7): 1974-1982; Kuether et al., J Thromb Haemost 2012).

ITGA2B-BDDFVIII 형질도입된 CD34+ G-PBC의 FVIII-결핍 개 내로의 자가 이식을 위한 조건

개	Tx 전 컨디셔닝 부설판(mg/kg)	렌티바이러스 벡터	총 바이러스 입자(x10^4)/세포	주입된 Tx CD34(+) PBC/kg	주입된 Tx CD34(-) PBC/kg	체중(kg)	Tx 후 형질도입 효율(%)^*	Tx 후 면역 억제 일수	Tx 전 심각한 출혈/yr	Tx 후 심각한 출혈/yr	Tx 후 저해제 검출	Tx 연령	추적 년수
♂F20	10	-889 ITGA2B-BDDFVIII	0.8	4.0x10^6	2.0x10^8	25.20	1.00	MMF31/CSP70	5.00	7.00	0/2	6.5	2.6
♂I42	5	-889 ITGA2B-BDDFVIII	1.3	1.25x10^6	2.0x10^8	20.00	4.00	MMF45/CSP91	5.00	0.00	0/2	4.25	2.75
♂M64	7	-673 ITGA2B-VWFSPD2-BDDFVIII	0.7	4.58x10^6	2.6x10^8	22.90	2.00	MMF91/CSP91	3.00	0.00	0/2	1.25	2.75

^* RT-PCR에 의해 렌티바이러스 벡터에 대해 양성인 말초 혈액 세포의 백분율(%)

^* 미코페놀레이트 모페틸이 MMF임.

^* 시클로스포린이 CSP임.

상기 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허, 특허 출원 및 접근 번호는 본원에 이들의 전문이 참조로 도입된다. 본 발명이 특정한 구현예에 대해 기재되었으나, 청구되는 발명이 이러한 특정 구현예에 부당하게 제한되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 본 발명의 기재된 조성물 및 방법의 다양한 개질 및 변형은 당업자에게 자명할 것이며, 하기 청구범위의 범위 내이다.

Claims

a) 인테그린 αIIb 유전자(ITGA2B) 프로모터의 단편을 포함하는 발현 카세트; 및 상기 발현 카세트에 작동 가능하게 연결된 관심 외인성 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 세포의 특정 위치로 상기 관심 유전자의 발현을 표적화하는 표적화 인자를 추가로 포함하는, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 표적화 인자는 혈소판을 생산하는 특정 조혈 세포 계통 내에서 상기 관심 유전자의 발현을 표적화하는, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 표적화 인자는 D2 도메인에 작동 가능하게 연결된 인간 폰 빌레브란트(Von Willebrand) 인자 프로펩티드(VWFpp)의 단편인, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열 목록 번호 24의 서열을 포함하는 핵산 서열을 갖는, 조성물.
제5항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열 목록 번호 24의 핵산 서열을 갖는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열 목록 번호 21, 22, 23, 및 25로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 핵산 서열을 갖는, 조성물.
제7항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열 목록 번호 21, 22, 23, 및 25로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는, 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 유전자는 인간 FVIII 유전자인, 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 자가-불활성화 벡터인, 조성물.
제10항에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 조성물.
제11항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 조혈 줄기 세포.
제13항에 있어서, 상기 줄기 세포는 생체외에 있는, 줄기 세포.
동물에서 혈우병을 치료하기 위한, 제13항 또는 제14항의 줄기 세포의 용도.
제15항에 있어서, 상기 동물은 인간인, 용도.
상기 인자 VIII 유전자가 개질된 줄기 세포에서 발현되는 조건 하에 조혈 줄기 세포를 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시켜 상기 개질된 줄기 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 상기 개질된 줄기 세포를 동물 내로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 동물은 혈우병으로 진단받은, 방법.
제18항에 있어서, 상기 전달 단계는 상기 동물에서 과도한 출혈을 치료하거나 예방하는, 방법.
제17항에 있어서, 상기 동물은 인간인, 방법.
제17항에 있어서, 상기 접촉 단계는 생체외에서 발생하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 줄기 세포는 상기 동물로부터 가동화되는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 가동화 단계는 상기 동물에 대한 시토카인 투여 단계를 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 동물은 혈소판에서 상기 인자 VIII을 발현하는, 방법.
제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 반복되는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 방법은 정기적 간격으로 반복되는, 방법.