KR20210072034A - 변형된 수용체를 포함하는 혈소판을 제조하는 방법 및 이의 용도 - Google Patents

변형된 수용체를 포함하는 혈소판을 제조하는 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본원에서는 변형된 수용체, 치료제, 펩타이드 및/또는 생활성 분자를 포함하는 혈소판을 생산하는 방법이 개시된다. 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 세포를 사용하여 예를 들어, 리소좀 저장 질환, 당뇨병 및 암을 치료하고, 관리하고, 예방하고, 진단할 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 세포는 특정 약물에 결합시 및/또는 조직 특이적 펩타이드에 결합시 효소, 생분자 또는 치료제의 방출을 촉발하기 위해 혈소판을 활성화시킬 수 있는 수용체를 포함하도록 가공될 수 있다.

Description

변형된 수용체를 포함하는 혈소판을 제조하는 방법 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 5일자로 출원된 미국 가출원 제62/741,971호의 우선권을 주장한다. 보다 초기에 출원된 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열목록의 첨부
본 출원은 본 출원시 동시에 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 상기 서열목록의 파일명은 21101_0377P1_Sequence_Listing이고 그 크기는 427 바이트이고, 2019년 9월 26일자로 작성되었고, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
리소좀 저장 질환 (LSD)은 리소좀 기능의 여러 측면에서의 결함, 가장 통상적으로 거대분자의 분해에 관여하는 효소인 리소좀 하이드롤라제에서의 돌연변이에 의해 유발된다1. 이들 돌연변이는 세포 거대분자의 분해에 관여하는 결함 효소를 유도한다. 세포 대사 동안에 생성된 거대분자는 배출 또는 재사용을 위해 분해되어야 하고; 그렇지 않으면 이 대사 폐기물은 세포의 저장 능력을 압도하여, 세포의 뒤틀림, 불활성화 및 파괴를 유도한다. 세포 파괴가 보다 퍼짐에 따라, 조직 및 궁극적인 장기 부전이 발생한다. 연구는 환부 세포가 이웃 세포에 의해 분비되는 외인성 효소를 수용할 수 있고, 심지어 잔여 효소 활성의 작은 증가도 리소좀 기능 복구에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. 이러한 실현은 하이드롤라제의 재조합 생성 및 소실된 효소를 생성하는 능력을 갖는 세포 집단을 포함하는 골수 이식체 뿐만 아니라 혈액으로의 주입을 포함하는 현재의 LSD에 대한 치료를 유도하였다. 그러나, 단백질 불안정성은 치료학적 용량에서 주요 표적 기관에 도달하는 것을 방지하고 골수 이식 (이식 대 숙주)과 연관된 위험으로 임상 효능을 방해한다6-10.
발명의 개요
본원에서는 다음을 포함하는 핵산 작제물이 개시된다: 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 제1 유전적 회로.
본원에서는 핵산 작제물을 포함하는 거핵세포가 개시되고, 여기서, 상기 핵산 작제물은 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 제1 유전적 회로를 포함한다.
본원에서는 변형된 수용체를 포함하는 가공된 거핵세포가 개시된다.
본원에서는 이들 환자 (예를 들어, LSD를 갖는 환자)의 개선된 수명을 유도할 수 있는 이들 조직의 건강 및 기능을 증진시키기 위해 제어 방출을 사용하여 생활성 생분자를 조직으로 방출시키는 능력을 갖는 혈소판을 가공하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 또한, 제어 방출을 사용하여 생활성 분자를 관련 조직으로 방출시키는 능력을 갖는 혈소판의 가공이 개시된다. 또한, 제어 방출을 사용하여 생활성 분자를 관련 조직으로 방출시키는 능력을 갖는, 가공된 혈소판을 제조하는 방법이 개시된다. 또한, 특정 약물에 결합 및/또는 조직-특이적 펩타이드에 결합 시 생분자의 방출을 촉발시키기 위해 혈소판을 활성화시킬 수 있는 수용체를 포함하는, 제어 방출을 사용하여 생활성 생분자를 관련 조직으로 방출시키는 능력을 갖는 혈소판의 가공이 개시된다.
본원에서는 적혈구 세포 또는 혈소판을 생산하는 방법이 개시되고, 상기 방법은: a) 유전학적으로 가공된 피더 세포를 제공하는 단계로서, 상기 피더 세포는 하나 이상의 유전적 회로를 포함하고, 상기 하나 이상의 유전적 회로는 관심 대상의 하나 이상의 유전자; 및 하나 이상의 프로모터를 포함하는, 단계; b) 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포를 제공하는 단계로서, 상기 영양공급된 세포는 하나 이상의 유전적 회로를 포함하고, 상기 하나 이상의 유전적 회로는 관심 대상의 하나 이상의 유전자, 및 하나 이상의 프로모터를 포함하고, 상기 관심 대상의 하나 이상의 유전자는 a)에서의 관심 대상의 하나 이상의 유전자와는 상이한, 단계; 및 c) 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포는 적혈구 세포 또는 혈소판으로 분화하도록 하는 조건하에 배지에서 a)에서의 유전학적으로 가공된 피더 세포를 b)에서의 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포와 배양하는 단계로서; 하나 이상의 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포는 적혈구 세포 또는 혈소판으로 분화하는 단계를 포함한다. 그러한 방법은 또한 영양공급된 세포로부터 분화한 적혈구 세포 및 혈소판이 특정 약물로의 결합시 및/또는 조직-특이적 펩타이드에 결합시 효소의 방출을 촉발시키기 위해 혈소판을 활성화시킬 수 있는 수용체를 포함하도록 상기 영양공급된 세포를 가공하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서는 치료제를 포함하는 혈소판 또는 적혈구 세포를 생산하는 방법이 개시되고, 상기 방법은: a) 유전학적으로 가공된 피더 세포를 제공하는 단계로서, 상기 피더 세포는 하나 이상의 유전적 회로를 포함하고, 상기 하나 이상의 유전적 회로는 관심 대상의 하나 이상의 유전자; 및 하나 이상의 프로모터를 포함하는, 단계; b) 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포를 제공하는 단계로서, 상기 영양공급된 세포는 하나 이상의 유전적 회로를 포함하고, 상기 하나 이상의 유전적 회로는 관심 대상의 하나 이상의 유전자, 및 하나 이상의 프로모터를 포함하고, 상기 관심 대상의 하나 이상의 유전자는 a)에서의 관심 대상의 하나 이상의 유전자와는 상이한, 단계; 및 c) 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포는 혈소판 및/또는 적혈구 세포 전구 줄기 세포 (progenitor stem cell)로 분화하도록 하는 조건하에 배지에서 a)에서의 유전학적으로 가공된 피더 세포를 b)에서의 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포와 배양하는 단계; 및 d) 가공된 수용체 및/또는 치료제를 포함하는 혈소판 또는 적혈구 세포를 생산하는 단계를 포함한다. 그러한 방법은 또한 특정 약물로의 결합시 및/또는 조직 특이적 펩타이드에 결합시 생분자의 방출을 촉발시키기 위해 혈소판을 활성화시킬 수 있는 수용체를 포함하도록 혈소판을 가공하는 단계를 포함할 수 있다.
도 1a 내지 1e는 질환 치료를 위한 전달 시스템으로서 가공된 혈소판을 나타낸다. 도 1a는 리소좀 저장 질환 (LSD)에서 세포 뒤틀림, 불활성화 및 파괴를 나타낸다. 도 1b는 거핵세포가 이들의 세포질 연장으로부터 혈소판을 형성하고 이들 형성된 혈소판이 생활성 단백질로 충전됨을 나타낸다. 도 1c는 리소좀 효소가 충전된 가공된 혈소판을 나타낸다. 도 1d는 비-가공된 혈소판이 트롬빈 및 다른 소분자에 의해 활성화됨을 나타낸다. 도 1e는 혈소판에서 디자이너 약물에 의해서만 전적으로 활성화된 디자이너 수용체의 가공 (DREADD)이 수용체가 약제학적 불활성 소분자에 결합하고 내인성 분자에는 더 이상 결합하지 않도록 함을 나타낸다.
도 2는 HSC 분화의 개요를 나타낸다. HSC는 보다 특화된 혈액 세포가 되는 다양한 전구 세포 (precursor cell)로 분화할 잠재력을 갖는 다능 줄기 세포이다.
도 3a 내지 3d는 HSC 성장 및 잠재력을 평가하는 방법을 나타낸다. 도 3a는 (i) 마우스 골수로부터 단리된 세포, (ii) 특정 일 동안 덱스터 (Dexter) 배양물 중에서 성장한 세포, (iii) 메토컬트 (MethoCult)로 전달된 세포, 및 (iv) 시간 경과 시 계수되는 계통-유래된 콜로니의 수를 나타낸다. 도 3b는 마우스 골수로부터 단리된 세포가 (i) 7일 동안 메토컬트 (MethoCult)에서 성장하고 (ii) CD41 및 CD45로 표지되어 이들의 분화를 평가함을 나타낸다. CD41은 혈소판 (P4 게이트에서 세포, 분홍색)을 표지시키고, CD45는 혈액 계통의 모든 핵화된 세포 (P3 게이트에서 세포, 청색)를 표지시킨다. 둘 다로 표지된 세포 (P2 게이트에서 세포, 녹색)는 MK 및 전구 세포이다. 도 3c는 골수로부터 LSK+ 세포 (HSC)를 분류하고 8일 동안 OD9 기질 세포 상에서 성장시킴을 나타낸다. 도 3d는 ES 세포가 9일 동안 OP9 기질 세포 상에서 성장하고, LSK+ 세포가 유동 세포측정에 의해 검출됨을 나타낸다 (P3 게이트에서 세포, 청색).
도 4a 내지 4d는 Rosa26 유전자좌에서 랜딩 패드를 나타낸다. 도 4a는 3x attP 부위가 CRISPR 기술을 사용하여 마우스 ES 세포에서 Rosa26 대립유전자로 삽입됨을 나타낸다. 도 4b는 PhiC31 인테그라제를 사용하여, 유전적 회로가 안정한 통합을 위해 Rosa26 대립유전자를 표적화할 수 있음을 나타낸다. 도 4c는 통합을 확인하기 위한 PCR 스크리닝 결과를 나타낸다. 도 4d는 스크리닝 프라이머를 사용한 마우스로부터의 cDNA의 PCR 결과를 나타낸다. 레인 1: 2-로그 래더, 레인 2: 어떠한 통합도 갖지 않는 야생형, 레인 3: 랜딩 패드의 삽입.
본원의 개시내용은 하기의 발명의 상세한 설명, 도면 및 본원에 포함된 실시예를 참조로 보다 용이하게 이해될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물을 개시하고 기술하기 전에, 이들은 물론 다양할 수 있으므로, 달리 특정되지 않는 한 특정 합성 방법 또는 달리 특정되지 않는 한 특정 시약으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야만 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 양상을 기재하기 위한 것이며 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 또한 이해해야 한다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법과 재료들을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있으나, 예시적 방법과 재료들을 이제 기술된다.
더욱이, 달리 명백하게 진술되지 않는 한, 본원에 제시된 임의의 방법이 그 단계들이 특정 순서로 수행될 것을 요구하는 것으로 해석되도록 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 방법 청구항이 실제로 이의 단계에 의해 이어지는 순서를 언급하지 않거나 단계가 특정 순서로 제한되어야 한다는 청구항 또는 기재 사항에 구체적으로 기재되지 않은 경우, 어떠한 방식으로든지 순서가 어떠한 면에서든 유추될 의도는 없다. 이는 단계 또는 작동 흐름 (operational flow)의 배열과 관련된 논리 문제, 문법적 구성 또는 구두점에서 파생된 일반 의미, 사양에 설명된 측면의 수 또는 유형을 포함하여 해석에 대한 임의의 가능한 비표현적 기반을 유지한다.
본원에 언급된 모든 공보는 공보가 인용하는 방법 및/또는 재료를 개시하고 기재하기 위해 참조로 본원에 포함된다. 본원에 논의된 공보는 본원의 출원일 전 이들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서 그 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 공보보다 앞서지 않는다는 것을 허용하는 것으로 이해되어서는 안된다. 또한, 본원에 제공된 공개 날짜는 실제 공개 날짜와 상이할 수 있으므로 독립적인 확인이 필요할 수 있다.
정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같은, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 언급하지 않는 한, 복수에 대한 언급을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 특정 목록의 임의의 하나의 구성원을 의미하고, 또한 상기 목록의 구성원의 임의의 조합을 포함한다.
범위는 본원에서 "약" 또는 "대략적으로" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 또는 "대략적으로" 또 다른 특정 값까지로서 표현될 수 있다. 그러한 범위가 표현되는 경우, 추가의 양상은 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 "약" 또는 "대략적으로"라는 선행을 사용하여 근사치로 표현될 때, 특정 값이 추가 측면을 형성하는 것으로 이해될 것이다. 추가로 범위 각각의 평가변수는 다른 평가변수와 상대적으로 및 다른 평가변수와는 무관하게 둘 다 유의적인 것으로 이해될 것이다. 또한 본원에 개시된 다수의 값이 있고 각각의 값은 또한 본원에서 값 자체에 추가로 특정 값에 대해 "약"으로서 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시된 경우, "약 10"이 또한 개시된다. 또한 2개의 특정 유닛 사이의 각각의 유닛이 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 개시된 경우, 11, 12, 13, 및 14가 또한 개시된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "임의의" 또는 "임의로"는 후속적으로 기재된 이벤트 또는 상황이 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수 있고 기재가 상기 이벤트 또는 상황이 일어나는 경우 그리고 그것이 일어나지 않는 경우를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은 대상체로부터의 조직 또는 기관; 세포 (대상체 내에서, 대상체로부터 직접 취득된 세포 또는 배양물 중에 유지되거나 배양된 세포주로부터의 세포); 세포 용해물 (또는 용해물 분획) 또는 세포 추출물; 또는 본원에 기재된 바와 같이 검정되는 세포 또는 세포 물질 (예를 들어, 폴리펩타이드 또는 핵산)로부터 유래된 하나 이상의 분자를 함유한 용액을 의미한다. 샘플은 또한 세포 또는 세포 성분을 함유하는 임의의 체액 또는 분비물 (예를 들어, 혈액, 소변, 대변, 타액, 눈물, 담즙액이지만 이에 제한되지 않음)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 투여 표적, 예를 들어, 인간을 지칭한다. 따라서, 개시된 방법의 대상체는 척추동물, 예를 들어, 포유류, 어류, 조류, 파충류 또는 양서류일 수 있다. 용어 "대상체"는 또한 애완 동물 (예를 들어, 고양이, 개 등), 가축 (예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 및 실험실 동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 래트, 기니아 피그, 과실 파리 등)을 포함한다. 하나의 양상에서, 대상체는 포유류이다. 또 다른 양상에서, 대상체는 인간이다. 용어는 특정 연령 또는 성별을 지칭하지 않는다. 따라서, 남성 또는 여성이든 상관없이 태아 뿐만 아니라 성인, 어린이, 청소년 및 신생아 대상체가 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "환자"는 질환 또는 장애에 걸린 대상체를 지칭한다. 용어 "환자"는 인간 및 수의학 대상체를 포함한다. 개시된 방법의 일부 양상에서, "환자"는 예를 들어, 투여 단계 전과 같이 암에 대한 치료를 필요로 하는 것으로 진단되었다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는"은 "로 이루어진" 및 "본질적으로이루어진"을 포함할 수 있다.
용어 "벡터" 또는 "작제물"은 벡터 서열이 연결된 또 다른 핵산을 세포로 수송할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 용어 "발현 벡터"는 세포에 의한 발현을 위해 적합한 (예를 들어, 전사 제어 요소에 연결된) 형태로 유전자 작제물을 함유하는 임의의 벡터 (예를 들어, 플라스미드, 코스미드 또는 파아지 염색체)를 포함한다. "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 통상적으로 사용되는 형태의 벡터임으로 상호교환적으로 사용된다. 더욱이, 본 발명은 등가의 기능을 제공하는 다른 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "발현 벡터"는 본원에서 이들이 작동적으로 연결된 유전자들의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 지칭한다. 재조합 DNA 기술에서 활용되는 통상의 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태로 있다. 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 산의 발현에 적합한 형태로 본원에 개시된 바와 같은 핵산을 포함할 수 있다. 다른 말로, 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 조절 요소 또는 프로모터를 포함할 수 있고, 이들은 발현될 핵산 서열에 작동적으로 연결될 발현을 위해 사용되는 숙주 세포를 기반으로 선택될 수 있다.
용어 "관심 대상의 서열" 또는 "관심 대상의 유전자"는 부분적으로 또는 전체적으로 이종성, 즉, 이것이 도입될 세포에 대해 외래 핵산 서열 (예를 들어, 치료 유전자)을 의미할 수 있다.
용어 "관심 대상의 서열" 또는 "관심 대상의 유전자"는 또한 부분적으로 또는 전체적으로 이것이 도입되는 세포의 내인성 유전자와 상동성이지만 게놈을 변경하기 위한 방식으로 세포의 게놈으로 삽입되도록 디자인된 (예를 들어, 이것은 천연 유전자와는 상이한 위치에 삽입되거나 이의 삽입은 "녹아웃"을 유도한다) 핵산 서열을 의미할 수 있다. 예를 들어, 관심 대상의 서열은 cDNA, DNA, 또는 mRNA일 수 있다.
용어 "관심 대상의 서열" 또는 "관심 대상의 유전자"는 또한 이것이 도입되는 세포의 내인성 유전자와 부분적으로 또는 전체적으로 상보성인 핵산 서열을 의미할 수 있다.
"관심 대상의 서열" 또는 "관심 대상의 유전자"는 또한 선택된 핵산의 최적의 발현을 위해 필요할 수 있는, 하나 이상의 전사 조절 서열 및 임의의 다른 핵산, 예를 들어, 인트론을 포함할 수 있다. "관심 대상의 단백질"은 관심 대상의 서열 또는 관심 대상의 유전자로부터 발현되는, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열 (예를 들어, 치료 단백질)을 의미한다.
용어 "에 작동적으로 연결된"은 핵산과 또 다른 핵산 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 프로모터, 인핸서, 전사 및 해독 종료 부위, 및 다른 신호 서열은 다른 서열에 작동적으로 연결된 핵산 서열의 예이다. 예를 들어, 전사 제어 요소로의 DNA의 작동적 연결은 그러한 DNA의 전사가 DNA를 특이적으로 인지하고, 이에 결합하고 이를 전사하는 RNA 폴리머라제에 의해 프로모터로부터 개시되도록 하는 DNA와 프로모터 간의 물리적 및 기능적 관계를 지칭한다.
"억제한다", "억제하는" 및 "억제"는 활성, 반응, 병태, 질환 또는 다른 생물학적 파라미터를 감소시키거나 저하시킴을 의미한다. 이것은 활성, 반응, 병태 또는 질환의 완전한 소멸을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 이것은 또한 예를 들어, 고유 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 병태 또는 질환에서 10% 억제 또는 감소를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 양상에서, 억제 또는 감소는 고유 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, 또는 이들 사이의 임의의 양의 감소일 수 있다. 일부 양상에서, 억제 또는 감소는 고유 또는 대조군 수준과 비교하여 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 또는 90 내지 100%이다. 일부 양상에서, 억제 또는 감소는 고유 또는 대조군 수준과 비교하여 0 내지 25, 25 내지 50, 50 내지 75, 또는 75 내지 100%이다.
본원에 사용된 바와 같은 "조절한다", "조절하는" 및 "조절"은 활성 또는 기능 또는 수에서의 변화를 의미한다. 변화는 활성, 기능 또는 수의 증가 또는 감소, 증진 또는 억제일 수 있다.
용어 "변경한다" 또는 "조절한다"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있고, 예를 들어, 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은 본원에 기재된 바와 같은 방법을 적용한 후 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준이 상기 방법을 적용하기 전 세포에서 이의 발현과는 상이함을 의미한다.
"촉진시킨다", "촉진" 및 "촉진시키는"은 활성, 반응, 병태, 질환, 또는 기타 생물학적 파라미터에서의 증가를 지칭한다. 이것은 활성, 반응, 병태 또는 질환의 개시를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 이것은 또한 예를 들어, 고유 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 병태 또는 질환에서의 10% 증가를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 양상에서, 증가 또는 촉진은 고유 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 이상, 또는 이들 사이의 임의의 양의 촉진일 수 있다. 일부 양상에서, 증가 또는 촉진은 고유 또는 대조군 수준과 비교하여 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 또는 90 내지 100%이다. 일부 양상에서, 증가 또는 촉진은 고유 또는 대조군 수준과 비교하여 0 내지 25, 25 내지 50, 50 내지 75, 또는 75 내지 100% 이상, 예를 들어, 200, 300, 500, 또는 1000% 초과이다. 일부 양상에서, 증가 또는 촉진은 고유 또는 대조군 수준과 비교하여 100퍼센트 초과, 예를 들어, 고유 또는 대조군 수준과 비교하여 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500% 이상일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "CRISPR 시스템" 및 "CRISPR-Cas 시스템"은 Cas 유전자를 암호화하는 서열, 가이드 서열 (또한, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 "스페이서"로서 지칭되는; 예를 들어, 가이드 RNA 또는 gRNA), 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함하는, CRISPR-연관된 ("Cas") 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 지시하는데 관여하는 전사체 및 다른 요소들을 지칭한다. 일부 양상에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들은 I형, II형, 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래한다. 일부 양상에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터 유래한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 (내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 프로토 스페이서로도 지칭됨)의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는 요소들을 특징으로 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "질환" 또는 "장애" 또는 "병태"는 상호교환적으로 사용되어 신체 또는 일부 기관 상태의 임의의 변화, 기능의 수행능을 중단시키거나 교란시키고, 영향받은 사람 또는 사람과 접촉한 자들에게 불괘감, 기능부전, 고통 또는 심지어 사망과 같은 증상을 유발하는 것을 지칭한다. 질환 또는 장애 또는 병태는 또한 디스템퍼, 병 (ailing), 질병 (ailment), 병폐 (malady), 장애, 병 (sickness), 질환 (illness), 통증 (complaint), 또는 정동 (affection)과 관련될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터", "프로모터 요소" 또는 "프로모터 서열"은 등가물이고 본원에 사용된 바와 같이, 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 경우 mRNA로의 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열의 전사를 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 프로모터는 전형적으로 필수적인 것은 아니지만 mRNA로의 이의 전사를 제어하는 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열의 5' (즉, 상류)에 위치하고 (예를 들어, 구조적 유전자의 전사 개시 부위에 인접한), RNA 폴리머라제에 의한 특이적 결합 부위 및 전사 개시를 위한 다른 전사 인자를 제공한다.
적합한 프로모터는 발현이 일어나야만 하는 숙주 세포의 유전자로부터 유래하거나 상기 숙주 세포에 대한 병원체로부터 유래할 수 있다 (예를 들어, 조직 프로모터 또는 바이러스와 같은 병원체). 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사율은 유도제에 응답하여 증가한다. 대조적으로, 전사율은 프로모터가 항시성 프로모터인 경우 유도제에 의해 조절되지 않는다. 또한, 프로모터는 특정 조직 유형(들), 예를 들어, 잎, 뿌리 또는 분열조직에서 연관된 암호화 영역을 전사하는데 활성이도록 조직-특이적 또는 조직 바람직한 방식으로 조절될 수 있다. 이것이 프로모터에 적용됨에 따른 용어 "조직 특이적"은 상이한 유형의 조직에서 관심 대상의 동일한 뉴클레오타이드 서열 또는 유전자의 발현의 상대적 부재하에 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열 또는 유전자를 특정 유형의 조직으로 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다.
이전의 발명은 이해를 명확하게 할 목적으로 설명 및 예시를 위해 일부 상세하게 기재되었지만, 특정 변화 및 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에서 수행될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 출원들은 본 발명이 속한 당업자들의 기술 수준을 나타낸다. 모든 공보 및 특허 출원은 본원에서 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지적되는 경우와 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
혈소판은 신체 전반에 걸쳐 순환하는 무핵 혈액 세포이고 항상성, 상처 치유, 혈관형성, 염증 및 응고 형성에서 중요한 역할을 수행한다. 혈소판은 거핵세포 (MK), 이들의 전구체 세포의 세포질로부터 형성되는 대량의 단백질을 저장하는 분비 과립으로 채워진다. 혈소판이 활성화된 경우, 생활성 단백질 (예를 들어, 생분자)은 무수히 많은 생리학적 과정에 관여하는 이들의 과립으로부터 방출된다. 혈소판의 선천적 저장, 트래픽킹 및 방출능을 이용함에 의해, 이들은 질환 또는 장애에 대한, 예를 들어, 대사 장애에 대한 생분자의 개발을 위해 전달 비히클이 되도록 가공될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 일부 양상에서, 혈액 혈소판은 예를 들어, 리소좀 저장 질환 (LSD)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 장애를 갖는 환자에 대한 치료학적 치료로서 작용하는 적당한 대사 기능을 위해 요구되는 효소의 분비를 제어하기 위해 가공될 수 있다.
리소좀 저장 질환은 리소좀 기능의 여러 측면에서의 결함, 가장 통상적으로 거대분자의 분해에 관여하는 효소인 리소좀 하이드롤라제에서의 돌연변이에 의해 유발된다. 이들 돌연변이는 세포 거대분자의 분해에 관여하는 결함 효소를 유도한다. 세포 대사 동안에 생성된 거대분자는 배출 또는 재사용을 위해 분해되어야 하고; 그렇지 않으면 이러한 대사 폐기물은 세포의 저장 능력을 압도하여, 세포의 뒤틀림, 불활성화 및 파괴를 유도한다. 세포 파괴가 보다 퍼지게 됨에 따라, 조직 기능 부전 및 궁극적으로 장기 부전이 발생한다. 연구는 환부 세포가 이웃 세포에 의해 분비되는 외인성 효소를 취득할 수 있고, 심지어 잔여 효소 활성의 작은 증가가 리소좀 기능 복구에 상당한 영향을 가질 수 있음을 보여주었다. 이러한 실현은 현재의 LSD에 대한 치료를 유도하였고, 이는 하이드롤라제의 재조합 생성 및 소실된 효소를 생성하는 능력을 갖는 세포 집단을 포함하는 골수 이식체 뿐만 아니라 혈액으로의 주입을 포함한다. 그러나, 단백질 불안정성은 이들이 치료학적 용량에서 주요 표적 기관에 도달하는 것을 방지하고 골수 이식 (이식 대 숙주)과 연관된 위험으로 임상 효능을 방해한다. 본원에 개시된 바와 같이, 유전적 도구 및 회로는 예를 들어, 리소좀 효소를 혈소판으로 패키징하기 위해 사용될 수 있는 특정 작업을 수행하기 위해 세포를 구축하고 재-가공하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본원에서는 특정 약물로의 결합 및/또는 조직 특이적 펩타이드로의 결합시 효소 (또는 생분자 또는 치료제)의 방출을 촉발하기 위해 혈소판을 활성화시킬 수 있는 수용체를 디자인하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 이와 같이, 혈소판은 전신 전달 장치 또는 표적화된 조직/기관 특이적 전달 장치로서 가공될 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 치료요법은 환자 치료에 대한 유연성, 정확성 및 개인화를 제공할 수 있다. 본원에 개시된 방법은 유전적 도구를 포함하였고 본원에 기재된 디자인 원리는 기존의 치료요법을 보완하기 위한 것 뿐만 아니라 단독으로 효율적이고 효과적인 치료를 위한 임의의 다른 질환/장애와 조합될 수 있는 일반적 플랫폼으로서 작용할 수 있다.
또한 본원에서는 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위한 전달 시스템으로서 혈소판을 사용하는 방법이 개시된다. 또한, 본원에서는 대사 질환, 예를 들어, 리소좀 저장 질환 (LSD)에 대한 혈소판-기반 치료학적 세포 치료를 사용하는 방법이 개시된다. 본원에 언급된 바와 같이, LSD는 리소좀 효소 결핍의 결과로서 신체의 세포에서 다양한 독성 물질의 비정상적 축적을 특징으로 하는 유전적 대사 질환이다1-3. 이들 오작동 효소는 약 50개 상이한 유전학적 질환 그룹을 나타내고, 개별적으로 희귀하지만, 이들의 조합된 유병률은 모든 출생 8,000명 당 1명인 것으로 평가된다. LSD는 골격, 뇌, 피부, 심장 및 중추신경계를 포함하는 신체의 상이한 부분에 영향을 미친다. LSD를 갖는 환자는 제한된 수명을 갖는다. 이들 대사 질환에 대해 중요한 충족되지 않는 임상적 필요성은 리소좀 효소의 지연 전달을 위해서 그리고 치료학적 수준의 이들 효소가 요구되는 기관으로 전달되도록 하기 위해 효과적인 방법이다.
추가로, 본원에서는 질환 또는 장애 (예를 들어, LSD)를 치료하기 위해 전달 시스템으로서 기증하는 혈소판을 생성하기 위해 가공된 줄기 세포를 사용하는 방법이 개시된다. 혈소판은 거핵세포 (MK), 이들의 전구체 세포의 세포질로부터 형성되는 대량의 단백질의 저장하는 분비 과립으로 채워진다4,5. 혈소판은 MK의 연장으로부터 만들어진 세포질 공포 (bleb)이기 때문에, 이들은 MK 세포질에 존재하는 단백질로 채워지고 핵을 함유하지 않는다. 따라서, 전구 줄기 세포에 행해지는 유전학적 가공이 더 이상 혈소판에 존재하지 않아 개시된 방법이 대사 장애를 치료하기 위한 실제 치료학적 옵션이 되도록 할 것이다.
본원에서는 개선된 혈소판 분화 및 시험관내 단리를 위한 유전학적 상호작용 세포 배양 시스템에 사용될 수 있는 줄기 세포 운명의 결정을 탐지하기 위해 생성된 유전자 회로가 개시된다. 본원에서는 이들이 언제 그리고 어디서 이들의 치료학적 페이로드 (payload)를 방출하는지의 제어를 유지할 수 있는 전달 시스템으로서 기능하도록 혈소판을 재프로그래밍하기 위해 이들 기술을 개발하고, 개량하고 통합하는 방법이 개시된다. 일부 양상에서, 페이로드는 치료제일 수 있다. 일부 양상에서, 페이로드는 하나 이상의 내인성 생분자일 수 있다.
골수에서, 혈소판은 조혈 줄기 세포 (HSC)의 특화된 혈액 및 면역 세포로의 분화인 조혈 과정으로부터 유래한다 (도 2)11. 혈소판은 신체 전반에 걸쳐 다수로 순환하고 평균 수명은 9 내지 10일이며 이러한 대형 세포 집단의 공급원은 MK로부터 기원한다. 일반적으로 혈소판은 휴지기, 비활성 상태이며 활성화되기 전에 촉발제 (trigger)가 필요하다. 활성화 시, 혈소판은 이들의 세포내 과립으로부터 300개 초과의 활성 생분자를 분비한다. 따라서, 혈소판은 다양한 페이로드의 생체내 전달을 위해 이들이 매력적인 후보가 되도록 하는 많은 특징을 소유한다: 1) 이들은 신체내 광범위 순환 범위를 갖고, 2) 이들은 무핵 세포이고, 3) 이들은 생물적합성이고, 4) 인간에서 이들의 평균 수명은 약 10일이고, 5) 활성화 후, 이들의 단백질 과립은 분비 소포로 작용하여 성분들을 세포외 유체로 방출시킨다.
본원에서는 질환 치료를 위한 전달 시스템으로서 혈소판을 사용하는 방법이 개시된다. 또한, 본원에서는 예를 들어, 리소좀 저장 질환을 포함하는, 혈소판-기반 치료학적 세포 치료가 개시된다. LSD는 리소좀 효소 결핍의 결과로서 신체의 세포에서 다양한 독성 물질의 비정상적 축적을 특징으로 하는 유전적 대사 질환이다1-3 (도 1a). 이들 오작동 효소는 약 50개 상이한 유전학적 질환 그룹을 나타내고, 개별적으로 희귀하지만, 이들의 조합된 유병률은 모든 출생 8,000명 당 1명인 것으로 평가된다. LSD는 골격, 뇌, 피부, 심장 및 중추신경계를 포함하는 신체의 상이한 부분에 영향을 미친다. LSD를 갖는 환자는 제한된 수명을 갖는다.
LSD 치료를 위한 현재 표준 치료법은 효소 대체 치료요법 (ERT)이다7. 이러한 치료를 위해 효소는 재조합적으로 제조되고 이들의 투여는 일반적으로 최대 3시간 소요할 수 있는 매주 주입을 통해 일어나지만 보다 빈번한 투여가 일부 ERT에 대해 나타났다7. 그러나, 많은 이들 치료요법의 효능은 외인성으로 주사된 효소의 신속한 분해, 및 치료학적 용량에서 주요 표적 기관에 도달하여 질환을 치료하는 이들의 무능력으로 인해 제한된다. 따라서, 활성 효소를 혈류로 직접 주사하는 한계를 해결하는 치료요법의 개발을 위한 실질적으로 충족되지 않은 임상적 필요성이 존재한다.
본원에서는 혈소판이 언제 그리고 어디서 이들의 치료학적 페이로드를 방출하는지를 제어함에 따라서 혈소판의 공간적 및 일시적 활성을 재프로그래밍하는 혈소판에 대한 유전적 도구를 개발하기 위해 사용되는 컴퓨터 모델링 및 컴퓨터 시뮬레이션 뿐만 아니라 혈소판을 생성하도록 줄기 세포 분화를 지시하기 위해 사용될 수 있는 유전자 네트워크의 개발이 개시된다. 일부 양상에서, 혈소판은 생활성 단백질과 함께 로딩될 수 있다. 일부 양상에서, 혈소판은 내인성 생활성 단백질을 포함한다. 초기 실험은 마우스 모델을 사용하였지만, 본원에 기재된 방법을 사용하여 인간을 포함하는 임의의 포유동물 시스템에 사용될 수 있는 전달 시스템으로서 혈소판을 재프로그래밍할 수 있다. 마우스 및 인간 혈소판 생물학의 기전의 일부는 상이하지만, 마우스 세포에서 이러한 기술의 확립은 인간 세포 (예를 들어, iPS 세포)로의 이들 기술의 적용이 일부 조정과 함께 이들 차이를 해소할 수 있도록 할 것이다.
합성 생물학은 연구 도구로서 사용될 수 있다. 신흥 합성 생물학 분야는 유전학적 조절 시스템의 흥미로운 도구 상자를 제조하였고, 이러한 도구를 기초 연구 및 치료 응용에 적용할 목적으로 포유류 세포에서 제어 및 특정 기능을 실행하는 새로운 유전적 회로를 구축하는데 사용할 수 있다. 세포 신호전달 네트워크의 복잡성은 보다 단순한 부분 또는 모듈의 서브세트로 구성된 유전학적 네트워크를 고려함으로써 단순화될 수 있다. 이러한 단순화는 합성 생물학의 기초이고, 여기서, 가공 패러다임은 이상적이고 시스템적 방식으로 세포 기능을 이해하거나 제어하기 위해 예측 가능하고 강력한 시스템을 생성하도록 적용된다15,16. 궁극적으로 이러한 접근법은 세포 재프로그래밍을 예측 가능한 방식으로 수행하도록 한다17,18. 이러한 목적을 위해, 유전적 회로는 메모리19, 및 암 세포 동정21과 같은 고등급의 세포 기능에 대한 수학적 계산 범위20의 Boolean 논리 기능을 세포가 수행할 수 있도록 하는 DNA 및 RNA로 구축되어 T 세포 집단22을 제어하고 마이크로환경에 대해 보고한다23. 이들 기능의 바탕이 되는 가공된 유전자 회로는 유전학적 스위치, 발진기, 디지털 논리 게이트 및 세포 계수기를 포함하고 역학적 및 예측 가능한 방식으로 유전자 발현을 조절하도록 디자인되었다24-26. 본원에 기재된 바와 같이, 합성 생물학 도구를 사용하여 시험관내 세팅에서 증진된 혈소판 생성을 위해 HSC 증식 및 MK로의 분화를 조절하는 내적이고 외적인 기전을 모방하고 조절하기 위해 사용될 수 있다.
조성물
유전적 회로. 본원에서는 유전적 회로가 개시된다. 본원에서는 하나 이상의 유전적 회로를 포함하는 핵산 작제물이 개시된다. 본원에 개시된 유전적 회로의 임의의 조합은 단일 핵산 작제물에 존재할 수 있다. 본원에 개시된 임의의 유전적 회로는 "제1 유전적 회로", "제2 유전적 회로", 또는 "제3 유전적 회로"로서 기재될 수 있다.
일부 양상에서, 유전적 회로는 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 유전적 회로는 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열; 및 관심 대상의 유전자에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 유전적 회로는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 유전적 회로는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자; 및 관심 대상의 유전자를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 유전적 회로는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 유전적 회로는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자 및 관심 대상의 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 유전적 회로는 관심 대상의 유전자를 포함할 수 있다.
본원에서는 다음을 포함하는 핵산 작제물이 개시된다: 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 제1 유전적 회로. 일부 양상에서, 조직-특이적 프로모터는 거핵세포-특이적 프로모터일 수 있다. 일부 양상에서, 거핵세포-특이적 프로모터는 거핵세포가 성숙해짐에 따라 (즉, 활성화 되어짐에 따라) 거핵세포의 특정 발육 단계에 특이적인 프로모터일 수 있다. 일부 양상에서, 거핵세포-특이적 프로모터는 인간 거핵세포 프로모터일 수 있다. 일부 양상에서, 거핵세포-특이적 프로모터는 CXCL4, GPIIb, 또는 PTPRC일 수 있다. CXCL4 유전자 (혈소판 인자 4 (PF4)로도 공지된 케모킨 (C-X-C 모티프) 리간드 4)는 혈소판 응집 동안에 활성화된 혈소판의 알파 과립으로부터 방출된 소형 사이토카인이다. CXCL4는 헤파린-유사 분자의 효과를 완화시킴으로써 혈액 응고를 촉진시킨다. GPIIb (CD41로도 공지된, GPIIb/IIa 복합체의 당단백질 IIb)는 피브리노겐 및 폰 빌레브란트 인자에 대한 수용체로서 작용하는 혈소판의 표면 상에 발견된 인테그린 복합체의 일부이다. GPIIb는 혈소판 활성화를 보조하고 정상 혈소판 응집 및 내피 접착을 위해 중요하다. PTPRC (CD45 또는 백혈구 공통 항원으로도 공지된 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 C형)는 다양한 세포 기능에 관여하는 I형 막관통 단백질이다. 일부 양상에서, 프로모터는 조절 가능할 수 있다. 일부 양상에서, 프로모터는 항시성으로 활성일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 조절 요소, 프로모터, 프로모터 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및 발현을 제어할 수 있는 다른 요소들 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 전사 종결 신호)을 지칭한다. 프로모터는 항시성 발현을 지시할 수 있다. 프로모터는 또한 세포-사이클 의존성 또는 발육 단계-의존성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 일시적-의존성 방식으로 발현을 지시할 수 있다. 프로모터의 예는 WPRE, CMV 인핸서 및 SV40 인핸서를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특이적 유전자 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 그러한 프로모터는 세포 특이적 발현 또는 특이적 경로에 속박된 발현을 가능하게 한다. 포유동물 세포에서 활성인 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 프로모터는 Tet-온 및 Tet-오프 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유도성 프로모터이다. 그러한 유도성 프로모터는 목적하는 발현의 타이밍을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 테트라사이클린 유도성 시스템 (tet); 열 쇼크 프로모터 및 IPTG 활성화된 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양상에서, 프로모터는 양방향성이다.
프로모터 및/또는 인핸서는 이들의 기능을 촉발하는 광 또는 특이적 화학적 이벤트에 의해 특이적으로 활성화될 수 있다. 시스템은 테트라사이클린 및 덱사메타손과 같은 시약에 의해 조절될 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 바와 같은 유전적 회로는 프로모터, 예를 들어, 인핸서, 5' 비해독된 영역 (5'UTR), 3' 비해독된 영역 (3'UTR), 및 리프레서 서열; 항시성 프로모터, 유도성 프로모터; 조직 특이적 프로모터, 세포-특이적 프로모터 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 조직-특이적 프로모터의 예는 알부민, 림프구 특이적 프로모터, T-세포 프로모터, 신경필라멘트 프로모터, 췌장 특이적 프로모터, 우유 유청 (milk whey) 프로모터; 혹스 (hox) 프로모터, a-페토단백질 프로모터, 인간 LIMK2 유전자 프로모터, FAB 프로모터, 인슐린 유전자 프로모터, 트랜스피레틴, 알파.1-안티트립신, 플라스미노겐 활성화인자 억제제 1형 (PAI-1), 아포지질단백질 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 유전자, GFAP 프로모터, OPSIN 프로모터, NSE, Her2, erb2, 및 이들의 단편 및 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 프로모터의 예는 테트라사이클린, 메탈로티오닌, 엑디손 (ecdysone), 포유류 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 레이트 (late) 프로모터; 및 마우스 포유류 종양 바이러스 긴 말단 반복체 (MMTV-LTR)) 및 다른 스테로이드-반응성 프로모터, 라파마이신 반응성 프로모터 및 이들의 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서는 "변형된 수용체" 또는 "DREADD"로서 본원에서 지칭되는 인공 또는 외인성 효능제에 의해서만 활성화되도록 변형될 수 있는 수용체가 개시된다. 이러한 방식으로 변형된 수용체는 전적으로 디자이너 약물 (DREADD)에 의해 활성화된 디자이너 수용체로 불리우는 기술을 사용하는 당업자에게 공지되어 있다. 가공된 거핵세포 및/또는 가공된 혈소판을 제조하기 위해 거핵세포 및/또는 혈소판을 가공하기 위한 DREADD 기술의 조합은 본원에 개시되어 있다. 수용체는 내인성 리간드에는 민감하지 않지만 정상적으로 효과가 없는 물질에는 민감성이도록 돌연변이되어 변형될 수 있다. 당업자는 공지된 방법을 사용하여 그러한 변형된 수용체를 제공하거나 디자인할 수 있고, 본원 개시내용의 관점에서 이들을 본원에 개시된 조성물 및 방법에 적용할 수 있다. 용어 "변형된 수용체" 및 "DREADD"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 변형된 수용체 (예를 들어, GPCR, PAR)는 변형된 수용체의 선택된 천연 (예를 들어, 내인성) 리간드에 대해 감소된 결합 친화성 (야생형 수용체 (예를 들어, GPCR, PAR)에 의해 선택된 리간드의 결합에 상대적으로)을 가질 수 있지만 외인성, 전형적 합성, 리간드 (예를 들어, 펩타이드 또는 소분자)에 대해 정상적, 거의 정상적 또는 바람직하게 증진된 결합 친화성을 가질 수 있다. 따라서, 변형된 수용체-발현 세포의 변형된 수용체-매개된 활성화는 천연 리간드의 존재하에 생체내 유의적인 정도로 일어나지 않지만 외인성으로 도입된 리간드 (예를 들어, 효능제)로의 노출시 유의적으로 반응한다. 예를 들어, 변형된 수용체는 천연 리간드와 비교하여 외인성 리간드에 의해 우수하게 활성화될 수 있다 (예를 들어, 유사한 농도에서 선택된 천연 또는 내인성 리간드에 결합함에 의한 것 보다 리간드의 결합에 의해 보다 크게 유의적 정도로 활성화될 수 있다).
고유 GPCR의 "천연 리간드" 및 "천연적으로 존재하는 리간드" 및 "내인성 리간드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되어 포유동물 숙주에 내인성인 생분자를 의미할 수 있고, 여기서, 상기 생분자는 고유 GPCR에 결합하여 G 단백질-커플링된 세포성 반응을 유발한다. 하나의 예는 트롬빈이다.
"합성 소분자", "합성 소분자 리간드", "합성 리간드", "합성 효능제", "외인성 효능제", "외인성 리간드" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 G 단백질-커플링된 수용체 또는 변형된 G 단백질-커플링된 수용체 또는 변형된 PAR (즉, DREADD)의 막관통 도메인내 결합하고 수용체의 활성화 및 목적하는 계열의 G 단백질의 동시 활성화를 촉진시킬 수 있는 천연 또는 화학적 수단에 의해 전적으로 제조된 임의의 화합물을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "결합하는"은 용어 "수용체-리간드 결합" 또는 "리간드 결합하는"과 상호교환적으로 사용되어 수용체 (예를 들어, G 단백질-커플링된 수용체 또는 변형된 수용체)와 리간드 (예를 들어, 천연 리간드 (예를 들어, 펩타이드 리간드) 또는 합성 리간드 (예를 들어, 합성 소분자 리간드)) 간의 물리적 상호작용을 의미할 수 있다. 리간드 결합은 당업계에 공지된 다양한 방법 (예를 들어, 방사능활성 표지된 리간드와 연관된 검출)에 의해 측정될 수 있다.
일부 양상에서, 변형된 수용체는 변형된 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 GPCR은 Gq, Gi, Gs 또는 G12/G13 수용체일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "G 단백질-커플링된 수용체"는 이의 천연 리간드의 결합 및 수용체의 활성화 시 세포성 반응을 유도하는 G 단백질-매개된 신호(들)를 전달하는 수용체를 지칭한다. G 단백질-커플링된 수용체는 진화적으로 관련된 단백질의 대형 계열을 형성한다. G-단백질-커플링된 수용체 계열의 구성원인 단백질은 일반적으로 7개의 추정 막관통 도메인으로 구성된다. G 단백질 커플링된 수용체는 또한 "7개 막관통 분절 (7TM) 수용체"로서 그리고 "7개 나선 수용체"로서 당업계에 공지되어 있다. GPCR은 세포 외부의 분자를 검출하고 내부 신호 형질도입 경로 및 궁극적으로 세포 반응을 활성화시킨다. GPCR은 이종삼량체 구아민 뉴클레오타이드-결합 단백질 (G-단백질)의 복합체와 상호작용하고 따라서, 이온 채널을 포함하는 광범위한 세포내 신호전달 경로를 조절할 수 있다. 예를 들어, 리간드가 GPCR에 결합하는 경우, 이것은 GPCR에서 형태적 변화를 유발하고 이는 이것이 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자 (GEF)로서 작용하도록 한다. 이어서, GPCR은 G 단백질에 결합된 GDP를 GTP로 교환함으로써 연관된 G 단백질을 활성화시킬 수 있다. 이어서, 결합된 GTP와 함께 G 단백질의 α 서브유닛은 β 및 γ 서브유닛에서 분리되어 α 서브유닛 유형 (Gαs, Gαi/o, Gαq/11, Gα12/13)에 직접적으로 의존하여 세포내 신호전달 단백질 또는 표적 기능성 단백질에 추가로 영향을 미치도록 할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "G 단백질-커플링된 세포성 반응" 또는 "GPCR 세포성 반응"은 GPCR에 의한 리간드 결합시 일어나는 세포 반응 또는 신호전달 경로를 의미한다. 본원의 개시내용과 관련된 그러한 GPCR 세포성 반응은 하나 이상의 혈소판의 활성화를 촉발시켜 이어서 하나 이상의 생분자 및/또는 치료제의 방출을 유도하는 것들이다. 이것이 억제성 반응 또는 자극성 반응인지의 반응의 유형은 방출되는 생분자(들) 및/또는 치료제, 및 활성화된 GPCR의 유형에 의존할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호전달"은 리간드 결합의 결과로서 (예를 들어, 변형된 수용체에 합성 또는 외인성 리간드 결합의 결과로서) 생화학적 또는 생리학적 반응의 생성을 의미할 수 있다.
용어 "수용체 활성화", "DREADD 활성화", "변형된 수용체 활성화", "GPCR 활성화" 및 "PAR 활성화"는 본원에 상호교환적으로 사용되어 G 단백질-매개된 신호전달과 연관된 G 단백질-매개된 신호전달 및 생리학적 또는 생화학적 반응을 유발하는 방식으로 리간드 (예를 들어, 천연 또는 합성 리간드)의 수용체로의 결합을 의미할 수 있다. 활성화는 G 단백질-관련된 신호와 연관된 생물학적 신호를 측정함으로써 측정될 수 있다.
"표적화된 세포 활성화" 및 "표적 세포 활성화"는 본원에서 상호교환적으로 사용되어 표적 세포 (예를 들어, 가공된 혈소판)에서 특이적 G 단백질-매개된 생리학적 반응의 DREADD-매개된 활성화 또는 수용체-매개된 활성화를 의미할 수 있고, 여기서, DREADD-매개된 활성화 또는 수용체-매개된 활성화는 DREADD 또는 변형된 수용체로의 내인성 리간드 분자의 결합에 의해 일어난다. 본원에 사용된 바와 같이, 세포성 활성화는 하나 이상의 생분자 및/또는 치료제의 방출을 유도하고 이어서 억제성 반응 또는 자극성 반응을 유발할 수 있음을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 진핵 세포 (예를 들어, 혈소판)의 G 단백질-매개된 세포성 반응에 영향을 미칠수 있거나 이를 유발할 수 있다. 혈소판은 변형된 GPCR을 암호화할 수 있는 서열을 포함하는 유전적 회로를 사용하여 가공된 세포이다.
일부 양상에서, 변형된 수용체는 변형된 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 PAR은 PAR1, PAR2, PAR3 또는 PAR4일 수 있다. PAR은 이들의 세포외 도메인의 일부의 절단에 의해 활성화되는 관련된 G 단백질-커플링된 수용체의 하위계열이다. PARS는 혈소판에서 고도로 발현된다. PAR 계열의 대부분은 세포성 작용을 유발하기 위해 G-단백질 i (cAMP 억제), 12/13 (Rho 및 Ras 활성화) 및 q (칼슘 신호전달)의 작용을 통해 작용한다.
본원에서는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자들을 포함하는 유전적 회로가 개시된다. 또한 본원에서는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자 및 프로모터를 포함하는 유전적 회로가 개시된다. 추가로 본원에서는 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 제1 유전적 회로를 포함하고; 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자를 포함하는 제2 유전적 회로를 추가로 포함하는 핵산 작제물이 기재된다. 일부 양상에서, 제1 유전적 회로의 조직-특이적 프로모터는 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 제2 유전적 회로는 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 제2 유전적 회로는 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터는 하나 초과의 거핵세포 분화 유전자에 작동적으로 연결되어 있다. 일부 양상에서, 제2 유전적 회로의 프로모터는 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 제2 유전적 회로의 프로모터는 항시성으로 활성일 수 있다. 일부 양상에서, 제1 유전적 회로의 조직-특이적 프로모터는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자에 작동적으로 연결될 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자들은 HoxB4, GATA-1, c-MYC, BMI1, BCL-XL, PLK-1 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자들은 HoxB4 또는 GATA-1 또는 조혈 줄기 세포의 거핵세포로의 분화를 지시할 수 있는 임의의 다른 분화 유전자일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자는 HoxB4 및 GATA-1일 수 있다. 일부 양상에서, GATA-1은 옥신 (auxin) 단백질 분해 태그를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자들은 c-MYC, BMI1, BCL-XL일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자들은 PLK-1 및/또는 만능 줄기 세포의 거핵세포로의 분화를 지시할 수 있는 임의의 다른 분화 유전자일 수 있다. 분화 유전자(들)는 덜 특수화된 세포가 보다 특수화된 세포 유형이 되는 공정을 촉진시키는 유전자일 수 있다. 유전자 발현은 세포 분화를 조절할 수 있다. 유전자 또는 가동되거나 (발현된) 중단된 (억제된) 유전자들의 조합이 세포성 형태 및 기능을 지시할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 제1의 유전적 회로는 관심 대상의 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 제2의 유전적 회로는 관심 대상의 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 관심 대상의 유전자는 치료제일 수 있다. 치료제는 효소, 호르몬, 폴리펩타이드, 항체, 약물, 화학치료제, 독소 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
본원에서는 관심 대상의 유전자를 포함하는 유전적 회로가 개시된다. 또한, 본원에서는 제3 유전적 회로가 개시되고, 제3 유전적 회로는 관심 대상의 유전자를 포함한다. 추가로 본원에서는 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 제1 유전적 회로; 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자를 추가로 포함하는 제2 유전적 회로를 포함하고; 관심 대상의 유전자를 포함하는 제3 유전적 회로를 추가로 포함하는 핵산 작제물이 기재된다. 일부 양상에서, 제2 유전적 회로는 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터는 하나 초과의 거핵세포 분화 유전자에 작동적으로 연결되어 있다. 일부 양상에서, 제3 유전적 회로는 관심 대상의 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 양상에서 제3 유전적 회로의 프로모터는 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 관심 대상의 유전자는 치료제일 수 있다. 치료제는 효소, 호르몬, 폴리펩타이드, 항체, 약물, 화학치료제, 독소 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 임의의 유전적 회로는 하나 이상의 재조합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 재조합 부위는 loxP, attP, Bxb1 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 양상에서, attP, loxP, 또는 Bxb1 부위는 Rosa26 유전자좌에 삽입될 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 임의의 유전적 회로는 하나 이상의 리프레서 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리프레서 단백질은 LacI, TetR, QS 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리프레서 단백질은 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 임의의 유전적 회로에서 임의의 프로모터는 하나 이상의 오퍼레이터 부위를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 임의의 유전적 회로에서, 본원에 기재된 하나 이상의 유전자들은 조절 가능하거나, 항시성으로 활성이거나 이들의 조합일 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 임의의 유전적 회로는 하나 이상의 리컴비나제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리컴비나제는 Cre, phiC31 인테그라제 또는 Bxb1일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리컴비나제는 조절될 수 있다.
만능 줄기 세포. 본원에서는 만능 줄기 세포가 개시된다. 본원에서는 본원에 개시된 임의의 핵산 작제물을 포함하는 만능 줄기 세포가 기재된다. 본원에서는 본원에 개시된 임의의 유전적 회로를 포함하는 만능 줄기 세포가 기재된다. 일부 양상에서, 만능 줄기 세포는 조혈 전구 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)일 수 있다. 일부 양상에서, 만능 줄기 세포는 제대혈 또는 골수로부터 유래한다. 일부 양상에서, iPSC는 혈액 세포로부터 유래할 수 있다. 일부 양상에서, 만능 줄기 세포는 인간 만능 줄기 세포일 수 있다.
거핵세포. 본원에서는 거핵세포가 기재된다. 본원에서는 임의의 발육 단계에서 거핵세포가 기재된다. 본원에서는 본원에 기재된 임의의 핵산 작제물을 포함하는 거핵세포가 개시된다. 본원에서는 본원에 기재된 임의의 유전학적 작제물을 포함하는 거핵세포가 개시된다. 본원에서 핵산 작제물을 포함하는 거핵세포가 개시되고, 여기서, 상기 핵산 작제물은 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 제1 유전적 회로를 포함한다. 일부 양상에서, 조직-특이적 프로모터는 거핵세포-특이적 프로모터일 수 있다. 일부 양상에서, 거핵세포-특이적 프로모터는 CXCL4, GPIIb, 또는 PTPRC일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 수용체는 변형된 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 또는 변형된 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 GPCR은 Gq, Gi, Gs 또는 G12/G13 GPCR일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 PAR은 PAR1, PAR2, PAR3 또는 PAR4일 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 거핵세포는 제2 유전적 회로를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 제2 유전적 회로는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자들은 HoxB4, GATA1, c-MYC, BMI1, BCL-XL, PLK-1 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자들은 HoxB4 또는 GATA1 또는 조혈 줄기 세포의 거핵세포로의 분화를 지시할 수 있는 임의의 다른 분화 유전자일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자는 HoxB4 및 GATA1일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자들은 c-MYC, BMI1, BCL-XL일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자들은 PLK-1 및/또는 조혈 줄기 세포의 거핵세포로의 분화를 지시할 수 있는 임의의 다른 분화 유전자일 수 있다. 일부 양상에서, 제1 유전적 회로 및/또는 제2 유전적 회로를 포함하는 거핵세포는 추가의 유전적 회로를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 추가의 유전적 회로는 관심 대상의 유전자를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 추가의 유전적 회로는 제2 또는 제3 유전적 회로일 수 있다. 일부 양상에서, 관심 대상의 유전자는 치료제일 수 있다. 치료제는 효소, 호르몬, 폴리펩타이드, 항체, 약물, 화학치료제, 독소 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
또한 본원에서는 변형된 수용체를 포함하는 가공된 거핵세포가 개시된다. 일부 양상에서, 변형된 수용체는 변형된 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 또는 변형된 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 GPCR은 Gq, Gi, Gs 또는 G12/G13 GPCR일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 PAR은 PAR1, PAR2, PAR3 또는 PAR4일 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 임의의 가공된 거핵세포는 추가로 치료제를 포함할 수 있다.
혈소판. 본원에서는 혈소판이 개시된다. 본원에서는 가공된 혈소판이 개시다. 본원에서는 변형된 수용체를 포함하는 가공된 혈소판이 개시된다. 일부 양상에서, 변형된 수용체는 변형된 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 또는 변형된 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 GPCR은 Gq, Gi, Gs 또는 G12/G13 GPCR일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 PAR은 PAR1, PAR2, PAR3 또는 PAR4일 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 임의의 가공된 혈소판은 추가로 치료제를 포함할 수 있다.
혈소판 또는 혈소판 집단을 생산하는 방법
본원에서는 혈소판 또는 혈소판 집단을 생산하는 방법이 개시된다. 본원에서는 변형된 수용체를 포함하는 혈소판 또는 혈소판 집단을 생산하는 방법이 개시된다. 일부 양상에서, 상기 방법은: a) 본원에 개시된 임의의 핵산 작제물을 포함하는 만능 줄기 세포를 제공하는 단계; b) 상기 만능 줄기 세포의 거핵세포로의 확장을 가능하게 하는 조건하에 배지에서 상기 만능 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 c) 상기 거핵세포를 혈소판으로 분화시키는 단계를 포함할 수 있고; 여기서, 상기 혈소판 또는 혈소판 집단은 변형된 수용체를 포함한다. 일부 양상에서, 만능 줄기 세포는 조혈 전구 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)일 수 있다. 일부 양상에서, 만능 줄기 세포는 제대혈 또는 골수로부터 유래할 수 있다. 일부 양상에서, iPSC는 혈액 세포로부터 유래할 수 있다. 일부 양상에서, 만능 줄기 세포는 인간 만능 줄기 세포일 수 있다. 일부 양상에서, 배지는 하나 이상의 조절제를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 배지 조절제를 사용하여 줄기 세포의 특정 세포 유형으로의 분화를 지시할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 배지 조절제는 만능 줄기 세포의 거핵세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 배지 조절제는 거핵세포의 혈소판으로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 배지 조절제는 만능 줄기 세포의 혈소판으로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 배지 조절제는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 테트라사이클린, 독사사이클린, 퀴닌산 또는 옥신일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 수용체는 변형된 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 또는 변형된 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 GPCR은 Gq, Gi, Gs 또는 G12/G13 GPCR일 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 PAR은 PAR1, PAR2, PAR3 또는 PAR4일 수 있다. 본원에 개시된 임의의 방법에서, 혈소판 또는 혈소판 집단은 추가로 치료제를 포함한다. 일부 양상에서, 만능 줄기 세포는 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 유전적 회로를 포함하는 핵산 작제물을 포함할 수 있거나; 상기 만능 줄기 세포는 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 제1 유전적 회로; 및 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자를 포함하는 제2 유전적 회로를 포함하는 핵산 작제물을 포함하고; 여기서, 상기 제1 유전적 회로 또는 제2 유전적 회로는 관심 대상의 유전자를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 혈소판 또는 혈소판 집단을 단리하거나 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본원에서는 적혈구 세포 및 혈소판을 생산하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 a) 유전학적으로 가공된 피더 세포를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 피더 세포는 하나 이상의 유전학적 재료를 포함할 수 있다. 하나 이상의 유전적 회로는 관심 대상의 하나 이상의 유전자; 및 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 방법은 b) 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 영양공급된 세포는 하나 이상의 유전적 회로를 포함할 수 있다. 하나 이상의 유전적 회로는 관심 대상의 하나 이상의 유전자; 및 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 관심 대상의 하나 이상의 유전자는 a)에서 관심 대상의 하나 이상의 유전자와는 상이할 수 있다. 상기 방법은 c) b)에서 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포와 함께 a)에서 유전학적으로 가공된 피더 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 배양 단계는 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포가 적혈구 세포 또는 혈소판으로 분화하도록 하는 조건하에 배지에서 수행할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이 하나 이상의 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포는 적혈구 세포 또는 혈소판으로 분화할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 방법 단계 a)에서 하나 이상의 유전적 회로는 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 유전적 회로는 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포에서 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 유전적 회로는 유전학적으로 가공된 피더 세포에서 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자에 의해 조절될 수 있다.
일부 양상에서, 단계 a)에서 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 단계 a)에서 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 리컴비나제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리컴비나제는 예를 들어, Cre 또는 phiC31 인테그라제 또는 Bxb1 인테그라제일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리컴비나제는 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 본원에서 및 단계 a)에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 재조합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 재조합 부위는 loxP, attP 또는 Bxb1일 수 있다. 일부 양상에서, attP 부위는 Rosa26 유전자좌에 및/또는 염색체 11에 삽입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 조절 요소, 프로모터, 프로모터 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및 발현을 제어할 수 있는 다른 요소들 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 전사 종결 신호)을 지칭한다. 프로모터는 항시성 발현을 지시할 수 있다. 프로모터는 또한 세포-사이클 의존성 또는 발육 단계-의존성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 일시적-의존성 방식으로 발현을 지시할 수 있다. 프로모터의 예는 WPRE, CMV 인핸서 및 SV40 인핸서를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특이적 유전자 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 그러한 프로모터는 세포 특이적 발현 또는 특이적 경로에 속박된 발현을 가능하게 한다. 포유동물 세포에서 활성인 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 프로모터는 Tet-온 및 Tet-오프 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유도성 프로모터이다. 그러한 유도성 프로모터는 목적하는 발현의 타이밍을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 테트라사이클린 유도성 시스템 (tet); 열 쇼크 프로모터 및 IPTG 활성화된 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양상에서, 프로모터는 양방향성이다.
프로모터 및/또는 인핸서는 이들의 기능을 촉발하는 광 또는 특이적 화학적 이벤트에 의해 특이적으로 활성화될 수 있다. 시스템은 테트라사이클린 및 덱사메타손과 같은 시약에 의해 조절될 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 바와 같은 유전적 회로는 프로모터, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 인핸서, 5' 비해독된 영역 (5'UTR), 3' 비해독된 영역(3'UTR), 및 리프레서 서열; 항시성 프로모터, 유도성 프로모터; 조직 특이적 프로모터, 세포-특이적 프로모터 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 조직-특이적 프로모터의 예는 알부민, 림프구 특이적 프로모터, T-세포 프로모터, 신경필라멘트 프로모터, 췌장 특이적 프로모터, 우유 유청 프로모터; 혹스 (hox) 프로모터, a-페토단백질 프로모터, 인간 LIMK2 유전자 프로모터, FAB 프로모터, 인슐린 유전자 프로모터, 트랜스피레틴, 알파.1-안티트립신, 플라스미노겐 활성화인자 억제제 1형 (PAI-1), 아포지질단백질 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 유전자, GFAP 프로모터, OPSIN 프로모터, NSE, Her2, erb2, 및 이들의 단편 및 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 프로모터의 예는 테트라사이클린, 메탈로티오닌, 엑디손 (ecdysone), 포유류 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 레이트 (late) 프로모터; 및 마우스 포유류 종양 바이러스 긴 말단 반복체 (MMTV-LTR)) 및 다른 스테로이드-반응성 프로모터, 라파마이신 반응성 프로모터 및 이들의 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 및 단계 a)에서 개시된 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 리프레서 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리프레서 단백질은 LacI, TetR 및/또는 QS일 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 하나 이상의 리프레서 단백질은 조절될 수 있다.
배지는 하나 이상의 조절제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 조절제는 본원에 개시된 바와 같은 a) 또는 b)의 유전적 회로를 조절할 수 있다 (예를 들어, 억제하거나 활성화시킬 수 있다). 일부 양상에서, 본원에서 및 단계 a)에서 개시된 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 배지 조절제에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 배지 조절제는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 테트라사이클린, 독사사이클린, 퀴닌산 또는 옥신일 수 있다.
본원에 개시된 방법은 또한 조절될 수 없는, 단계 a)에서 하나 이상의 유전적 회로를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 본원에서 및 단계 a)에서 개시된 바와 같은 유전적 회로의 하나 이상의 프로모터는 항시성으로 발현될 수 있다. 일부 양상에서, 본원에서 및 단계 a)에서 개시된 유전적 회로의 하나 이상의 프로모터는 CMV, RSV 및/또는 U6, 베타 액틴, 및/또는 연장 인자 프로모터일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 프로모터는 하나 이상의 오퍼레이트 부위 (예를 들어, tet)를 포함할 수 있다. 그러한 오퍼레이터 부위는 하나 이상의 리프레서 단백질이 결합하게 할 수 있다.
본원에 개시된 방법은 또한 단계 a)에서 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자들은 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴 및/또는 IL1-α일 수 있다. 일부 양상에서, 본원에서 및 단계 a)에서 개시된 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자는 항시성으로 발현될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 유전학적으로 가공된 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 유전학적으로 가공된 피더 세포는 배아 줄기 세포 또는 마우스 배아 줄기 세포로부터 유래할 수 있다. 일부 양상에서, 유전학적으로 가공된 피더 세포는 골아세포일 수 있다. 일부 양상에서, 골아세포는 OP-9 기질 세포일 수 있다. 일부 양상에서, 골아세포는 제대혈 또는 골수로부터 기원할 수 있다. 일부 양상에서, 유전학적으로 가공된 피더 세포는 불멸화된 세포주로부터 유래할 수 있다. 일부 양상에서, 유전학적으로 가공된 피더 세포는 미분화된 조혈 줄기 세포 (HSC) 성장을 지지할 수 있다. 일부 양상에서, 유전학적으로 가공된 피더 세포는 유전학적으로 가공될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 비-유전학적으로 가공된 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 상기 피더 세포는 배아 줄기 세포 또는 마우스 배아 줄기 세포로부터 유래할 수 있다. 일부 양상에서, 피더 세포는 골아세포일 수 있다. 일부 양상에서, 골아세포는 OP-9 기질 세포일 수 있다. 일부 양상에서, 골아세포는 제대혈 또는 골수로부터 기원할 수 있다. 일부 양상에서, 피더 세포는 불멸화된 세포주로부터 유래할 수 있다. 일부 양상에서, 피더 세포는 미분화된 조혈 줄기 세포 (HSC) 성장을 지지할 수 있다.
본원에 개시된 방법은 다양한 세포를 사용할 수 있다. 세포의 예는 줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 방법은 조절될 수 있는 본원에서 및 b)에서 개시된 바와 같은 하나 이상의 유전적 회로를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, b)에서 하나 이상의 유전적 회로는 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포에서 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, b)에서 하나 이상의 유전적 회로는 유전학적으로 가공된 피더 세포에서 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, b)에서 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 리컴비나제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리컴비나제는 Cre 또는 phiC31 인테그라제 또는 Bxb1 인테그라제일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리컴비나제는 조절될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 하나 이상의 재조합 부위를 추가로 포함하는, 본원에서 및 단계 b)에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 유전적 회로를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 재조합 부위는 loxP, attP 또는 Bxb1일 수 있다. 일부 양상에서, attP, loxP, 또는 Bxb1 부위는 Rosa26 유전자좌에 삽입될 수 있다. 일부 양상에서, 본원에서 및 단계 b)에서 개시된 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 본원에서 및 단계 b)에서 개시된 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 리프레서 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리프레서 단백질은 LacI, TetR 또는 QS일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리프레서 단백질은 조절될 수 있다.
일부 양상에서, 본원에서 및 단계 b)에서 개시된 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 배지 조절제에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 조절제는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 테트라사이클린, 독사사이클린, 퀴닌산 또는 옥신일 수 있다. 그러한 배지 조절제 또는 제제는 당업계에 널리 공지되어 있다.
본원에 개시된 방법은 조절될 수 없는 본원에서 및 단계 b)에서 기재된 하나 이상의 유전적 회로를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 본원에서 및 단계 b)에서 개시된 바와 같은 유전적 회로의 하나 이상의 프로모터는 항시성으로 활성일 수 있다. 일부 양상에서, 단계 b)에서 유전적 회로의 하나 이상의 프로모터는 CMV, RSV, U6, 베타 액틴, 및/또는 연장 인자 프로모터일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 프로모터 (예를 들어, CMV, RSV 및/또는 U6)는 하나 이상의 오퍼레이터 부위를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 오퍼레이터 부위는 리프레서 단백질이 결합하도록 할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에서 및 단계 b)에서 개시된 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자는 HoxB4 및/또는 GATA-1일 수 있다. 일부 양상에서, 본원에서 및 단계 b)에서 개시된 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자는 항시성으로 발현될 수 있다. 일부 양상에서, GATA-1은 옥신 단백질 분해 태그를 포함한다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포는 조혈 전구 줄기 세포일 수 있다. 일부 양상에서, 조혈 줄기 세포는 제대혈, 골수, iPS 세포 또는 ES 세포로부터 유래할 수 있다. 일부 양상에서, 유전학적으로 가공된 영양공급된 세포는 혈소판 및 적혈구 세포의 전구 세포를 생성할 수 있다. 일부 양상에서, 전구 세포는 혈소판 및 적혈구 세포를 생성할 수 있다. 일부 양상에서, 전구 세포는 본원에 개시된 하나 이상의 유전적 회로를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 전구 세포는 관심 대상의 임의의 하나 이상의 유전자의 발현을 조절할 수 있는 본원에 개시된 하나 이상의 유전적 회로를 포함한다. 일부 양상에서, 관심 대상의 하나 이상의 유전자는 HoxB4 및/또는 GATA-1일 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 유전적 회로는 하나 이상의 리프레서 단백질 (예를 들어, LacI, TetR 또는 QS)을 포함할 수 있고 하나 이상의 의학적 조절제 (예를 들어, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 테트라사이클린, 독사사이클린, 퀴닌산 또는 옥신)에 의해 제어될 수 있다.
관심 대상의 유전자는 임의의 유전자일 수 있다. 이것은 내인성일 수 있거나 도입될 수 있다. 용어 "표적", "표적 유전자" 및 "표적 뉴클레오타이드 서열"은 상호교환적으로 사용될 수 있고 관심 대상의 유전자를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자는 공지된 기능을 갖는 유전자이거나 이의 기능이 공지되어 있지 않지만 이의 총 또는 부분 뉴클레오타이드 서열이 공지된 유전자이다. 대안적으로, 표적 유전자 및 이의 뉴클레오타이드 서열의 기능은 둘 다 공지되어 있지 않다. 표적 유전자는 진핵 세포의 고유 유전자일 수 있거나 예를 들어, 유전학적 형질전환에 의해 진핵 세포에 이전에 도입되었거나 상기 진핵 세포의 모 세포에 도입된 이종성 유전자일 수 있다. 이종성 표적 유전자는 진핵 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있거나 염색체외 분자로서, 예를 들어, 자가 복제 염색체외 분자로서 진핵 세포에 존재한다. 표적 유전자는 복제, 전사, 해독 또는 표적 단백질의 발현에 중요한 다른 공정을 조절하는 폴리펩타이드를 암호화하는 영역 또는 폴리뉴클레오타이드 영역; 또는 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 표적 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 영역; 또는 5' 또는 3' UTR 또는 인트론과 같은 비-암호화 영역을 포함할 수 있다. 표적 유전자는 예를 들어, 관심 대상의 유전자의 전사에 의해 생성되는 mRNA 분자를 지칭할 수 있다.
본원에 개시된 유전적 회로의 디자인 또는 작제는 모듈 양상으로 수행할 수 있어 이종성 및 다른 재조합 유전자를 포함하는 임의의 유전자의 조절을 가능하게 한다. 일부 양상에서, 일부 또는 모듈은 유전학적 활성화제, 유전학적 리프레서, 리컴비나제, 게놈 편집 및 합성 전사 인자일 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 유전적 회로는 하나 이상의 모듈을 포함할 수 있다.
벡터는 원핵세포에 도입되고 증폭될 수 있고, 이어서 상기 증폭된 벡터는 진핵 세포에 도입될 수 있다. 벡터는 또한 원핵 세포에서 도입되어 증폭될 수 있고 진핵 세포 (예를 들어, 바이러스 벡터 패키징 시스템의 일부로서 플라스미드를 증폭시키는)에 도입될 수 있는 벡터를 생성하기 위해 중간체 벡터로서 작용할 수 있다. 원핵 세포를 사용하여 벡터의 카피물을 증폭시키고 하나 이상의 핵산을 발현시켜 숙주 세포 또는 숙주 유기체로의 전달을 위한 하나 이상의 단백질의 공급원을 제공할 수 있다. 원핵 세포에서 단백질의 발현은 흔히 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 항시성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 갖는 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli)에서 수행된다. 벡터는 또한 효모 발현 벡터 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae))일 수 있다.
일부 양상에서, 벡터는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 하나 이상의 서열의 발현을 구동시킬 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8 및 pMT2PC를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 포유동물 세포에서, 조절 요소들은 벡터의 발현을 제어한다. 프로모터의 예는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 시미안 바이러스 40으로부터 유래된 것들, 및 본원에 개시되고 당업계에 공지된 기타의 것들이다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 방법은 단계 a) 또는 b)에서 관심 대상의 하나 이상의 유전자의 발현을 가능하게 하는 단계 c)에서의 조건을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 골아세포는 미토마이신-C와 접촉하거나 이에 노출되거나 이로 처리될 수 있다. 골아세포는 줄기 세포가 첨가되기 전에 세척될 수 있다. 골아세포는 미토마이신-C를 제거하기 위해 세척될 수 있다. 일반적으로, 골아세포는 따라서 당업자에게 공지된 표준 프로토콜에 따라 제조될 수 있다. 골아세포는 예를 들어, 피더 세포 상부 상에 추가의 세포를 성장시키기 전 또는 직전에 미토마이신-C로 처리될 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 배지는 하나 이상의 성분 또는 조절제 (예를 들어, 배지 조절제)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 성분 또는 조절제는 혈소판 및/또는 적혈구 전구 줄기 세포의 형성을 유도할 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 하나 이상의 성분 또는 조절제는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 테트라사이클린, 독사사이클린, 퀴닌산 또는 옥신일 수 있다. 일부 양상에서, 전구 줄기 세포는 혈소판 및/또는 적혈구 전구 세포를 생성할 수 있다. 일부 양상에서, 전구 줄기 세포는 하나 이상의 자가-동정 세포 표면 마커를 발현할 수 있다. 일부 양상에서, 전구 줄기 세포는 GATA-1 및/또는 HoxB4를 발현할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 세포 표면 마커의 발현은 본원에 기재된 유전적 회로에 의해 생성될 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 세포 표면 마커는 자가-동정할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 세포 표면 마커는 CD13, CD34, CD41a, 및 CD43일 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 혈소판 및/또는 적혈구 세포는 하나 이상의 세포 표면 마커를 발현할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 세포 표면 마커는 CD41a 및 CD42b일 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 방법은 혈소판 또는 적혈구를 단리하거나 정제하는 단계 d)를 추가로 포함할 수 있다.
치료 방법
본원에서는 인간 환자를 치료하는 방법이 개시된다. 일부 양상에서, 상기 방법은: a) 본원에 기재된 하나 이상의 혈소판 또는 혈소판 집단을 인간 대상체에게 투여하는 단계; 및 b) 외인성 효능제를 상기 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 외인성 효능제의 존재는 변형된 수용체를 활성화시킨다. 일부 양상에서, 변형된 수용체의 활성화는 본원에 개시된 임의의 혈소판으로부터 치료제 또는 본원에 개시된 임의의 혈소판으로부터 하나 이상의 내인성 분자의 방출을 유도할 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 임의의 혈소판 또는 혈소판 집단은 정맥내 주사 또는 수혈을 통해 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 하나 이상의 혈소판 또는 혈소판 집단은 정맥내 주사 또는 수혈을 통해 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 외인성 리간드 또는 효능제는 두개내, 척추강내, 근육내 또는 정맥내 주사 또는 경구를 통해 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 외인성 리간드 또는 효능제는 가공된 혈소판상에 존재하는 변형된 수용체에 선택적이거나 특이적일 수 있다. 일부 양상에서, 인간 환자는 투여 단계 전에 치료를 필요로 하는 것으로 동정되었다. 일부 양상에서, 인간 환자는 질환 또는 장애를 가질 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 임의의 혈소판은 치료학적 반응을 유발하기에 충분한 양으로 대상체 또는 환자에게 수혈을 통해 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 혈소판 농도는 적어도 1,000 μl, 5,000 μl, 또는 10,000 μl일 수 있거나 1,000 μl 내지 5,000 μl, 5,000 μl 내지 10,000 μl 내 또는 이들 사이의 임의의 양일 수 있다.
"투여 용법" 또는 "지지 용법"은 특정 비율로 결정된 방식 (예를 들어, 연속적 또는 간헐적)에 따라 투여되는 혈소판 또는 다른 세포의 양 및 유형을 포함하는 혈소판 투여 스케줄을 지칭할 수 있고, 여기서, 방식 또는 비율은 시간에 따라 다양할 수 있다. "최적화된 투여 용법" 또는 "최적화된 지지 용법"은 의도된 수용자의 분자 성질에 따라 혈소판을 선택함으로써 최적화된 투여 또는 지지 용법을 지칭한다.
또한, 치료제 또는 하나 이상의 내인성 생분자를 하나 이상의 세포에게 전달하는 방법이 개시된다. 일부 양상에서, 상기 방법은 하나 이상의 세포를 본원에 개시된 하나 이상의 혈소판과 접촉시킴을 포함한다. 일부 양상에서, 상기 접촉 단계는 외인성 효능제의 존재하에 수행될 수 있다. 일부 양상에서, 외인성 효능제의 존재는 변형된 수용체를 활성화시켜 치료제 또는 하나 이상의 내인성 생분자를 하나 이상의 세포에 방출시킬 수 있다. 일부 양상에서, 접촉 단계는 두개내, 척추강내, 근육내 또는 정맥내 주사를 통한 생체내 단계일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 혈소판 또는 혈소판 집단은 정맥내 주사 또는 수혈을 통해 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 혈소판 또는 혈소판 집단은 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 외인성 효능제는 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 외인성 효능제는 접촉 단계 전, 접촉 단계 동안에 또는 접촉 단계 후 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 외인성 효능제는 두개내, 척추강내, 근육내 또는 정맥내 주사를 통해 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 외인성 리간드 또는 효능제는 가공된 혈소판상에 존재하는 변형된 수용체에 선택적이거나 특이적일 수 있다. 일부 양상에서, 인간 환자는 투여 단계 전에 치료를 필요로 하는 것으로 동정되었다. 일부 양상에서, 인간 환자는 질환 또는 장애를 가질 수 있다.
질환 및 장애. 일부 양상에서, 질환은 리소좀 저장 질환일 수 있다. 일부 양상에서, 질환은 암일 수 있다. 일부 양상에서, 질환은 당뇨병일 수 있다.
일부 양상에서, 질환은 자가면역 질환 또는 장애일 수 있다. 일부 양상에서, 자가면역 질환 또는 장애는 기관에 영향을 미칠 수 있다. 일부 양상에서, 환부 기관은 심장, 신장, 간, 폐 또는 피부일 수 있다. 일부 양상에서, 자가면역 질환 또는 장애는 분비선에 영향을 미칠 수 있다. 일부 양상에서, 분비선은 부신, 다선 (multi-glandular), 췌장, 갑상선, 하나 이상의 생식 기관 또는 침샘일 수 있다. 일부 양상에서, 자가면역 질환 또는 장애는 소화계에 영향을 미칠 수 있다. 일부 양상에서, 자가면역 질환 또는 장애는 혈액, 연결 조직, 전신 및/또는 다중-기관, 신경계, 눈, 귀 또는 혈관계에 영향을 미칠 수 있다. 일부 양상에서, 자가면역 질환 또는 장애는 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 대장염 및 코흔 질환), I형 진성 당뇨병, 길리안-바레 증후군 (Guillian-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초 다발신경병증, 건선, 그레이브씨 질환, 하시모토 갑상선염, 중증근무력증, 다발성 경화증, 애디슨 질환, 쇼그렌 증후군, 악성 빈혈, 셀리악 질환 및 혈관염일 수 있다.
일부 양상에서, 질환은 암일 수 있다. 일부 양상에서, 암은 1차 또는 2차 종양일 수 있다. 일부 양상에서, 암은 전이될 수 있다. 일부 양상에서, 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 암은 임의의 암일 수 있다. 일부 양상에서, 암은 항문암, 방광암, 뇌암, 골암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 내분비암, 식도암, 눈암, 담낭암, 두경부암, 신장암, 백혈병, 간암, 림프종, 흑색종, 구강암 또는 구강인두암, 골육종, 부갑상선암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체 암, 전립선암, 피부암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 음부암, 난소암, 폐암 또는 위암일 수 있다.
효능제 및 투여. 본원에서는 외인성 효능제의 존재에 의해 활성화될 수 있는 변형된 수용체가 개시되어 있다. 외인성 효능제 (또는 리간드, 또는 소분자, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어)는 경구로 또는 비경구로 (예를 들어, 전신 투여) 전달될 수 있는 것이다. 리간드는 이것이 일반적으로 하나 이상의 생분자 또는 치료제의 방출을 위해 치료되거나 표적화될 신체 또는 영역으로부터 부재라는 점에서 또는 이것이 변형된 수용체 활성화시키지 않는 충분히 낮은 기저 농도로 존재한다는 점에서 외인성이다. 일부 양상에서, 리간드는 합성, 즉, 천연적으로 존재하지 않는 것일 수 있다. 일부 양상에서, 리간드는 DREADD 활성화 또는 변형된 수용체 활성화 이외의 다른 최소의 활성 또는 생물학적 활성을 갖지 않는 것이다.
DREADD 또는 변형된 수용체의 막관통 도메인 내에 결합할 수 있고 G 단백질의 목적하는 계열의 DREADD-매개된 활성화 또는 변형된 수용체-매개된 활성화를 촉진시키는 임의의 소분자, 일반적으로 합성 소분자는 본원에 기재된 혈소판의 표적화된 활성화 방법에 사용하기 위해 적합하다. 전형적으로 2000 내지 6000 Da의 분자량을 갖는 G-단백질-커플링된 수용체의 천연 펩타이드 리간드와 대조적으로, 일부 양상에서, G-단백질-커플링된 수용체의 소분자 리간드는 일반적으로 100 내지 1000 Da의 분자량을 가질 것이다.
본원에 개시된 방법에 유용한 합성 소분자는 천연 (예를 들어, 재조합 세포주로부터 단리된) 또는 화학적 수단 (예를 들어, 유기 또는 무기 화학적 공정을 사용하여)에 의해 생성된 합성 소분자를 포함한다.
고유 GPCR에 결합하고 이를 활성화시키는 여러 합성 소분자는 당업계에 공지되어 있고 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있다. 본원에 개시된 방법에 사용하기 위해 적합한 추가의 합성 소분자는 고유 GPCRS 또는 DREADD에 결합하는 것에 대해 후보 화합물을 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 예를 들어, 변형된 수용체 또는 DREADD를 발현하는 세포주 (또는 이들로 형질감염된)를 사용하고 이를 변형된 수용체 또는 DREADD 결합에 대해 시험될 다양한 농도의 화합물에 노출시킴으로써 동정될 수 있다. 변형된 수용체 또는 DREADD 결합은 시험 화합물에 대한 노출로 검출될 수 있지만 변형된 수용체 또는 DREADD에 결합하지 않고/않거나 세포 활성화를 유도하지 않는 대조군 화합물의 존재하에서는 검출될 수 없다.
일부 양상에서, 리간드는 클로자핀의 대사물인 클로자핀-N-옥사이드 (CNO)일수 있다. 일부 양상에서, 리간드는 hM3Dq에 결합하는 퍼라핀일 수 있다. hM3Dq 및 hM4Di의 결합 부위는 고도로 유사하기 때문에, 이것은 또한 hM4Di에 결합하는 것으로 예상될 수 있다.
효능제 및 용량. 질환 또는 장애를 치료하는 것과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료"는 일반적으로 인간 대상체 또는 환자의 치료 및 치료요법에 관한 것일 수 있고, 여기서, 일부 목적하는 치료학적 효과, 예를 들어, 질환 또는 장애의 진행 억제가 성취되고, 진행률의 감소, 진행률의 중단, 질환 또는 장애의 퇴행, 질환 또는 장애의 개선 및 질환 또는 장애의 치유를 포함할 수 있다. 예방학적 대책으로서 치료 (즉, 예방 (prophylaxis), 예방 (prevention))가 또한 포함된다.
일부 양상에서, 외인성 리간드는 치료학적 유효량으로 전달될 수 있다. 일부 양상에서, 혈소판, 가공된 혈소판 또는 혈소판 집단은 치료학적 유효량으로 전달될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 유효량"은 목적하는 치료 용법에 따라 투여되는 경우 일부 목적하는 치료학적 효과를 생성하기 위해 효과적이거나, 합리적 이득/위험 비율에 상응하는 변형된 수용체 또는 외인성 리간드의 양을 지칭한다.
유사하게, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방학적 유효량"은 목적하는 치료 용법에 따라 투여되는 경우, 일부 목적하는 예방학적 효과를 생성하기 위해 효과적이고 합리적 이득/위험 비율에 상응하는 변형된 수용체 또는 외인성 리간드의 양을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "예방"은 특정 병태, 질환 또는 장애를 지연, 완화 또는 회피하는데 도움을 줌으로써 건강을 보존할 목적과 함께 증상적 병태, 질환 또는 병태를 발견하기 전에 미리 투여되는 대책을 지칭한다.
이것은 외인성 리간드가 단독으로 사용 (예를 들어, 투여)될 수 있지만, 흔히 이것을 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 조성물 또는 제형으로서 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 양상에서, CNO는 비경구 투여를 통해 투여될 수 있다. 일부 양상에서, CNO는 경구 투여를 통해 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 투여되는 CNO의 용량은 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg일 수 있다. 일부 양상에서, 투여되는 CNO의 용량은 1 mg/kg 내지 5 mg/kg일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는"은 화합물, 성분, 재료, 조성물, 투여 형태 등에 관한 것이고, 이는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 대상체 (예를 들어, 인간)의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합한 완전한 의학적 판단 범위 내에 있고 합리적 이득/위험 비율에 상응한다. 각각의 담체, 희석제, 부형제 등은 또한 제형의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 "허용되는"이어야 한다.
일부 양상에서, 조성물은 유일한 활성 성분으로서, 본원에 기재된 바와 같은 리간드 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 약제학적 조성물 (예를 들어, 제형, 제제, 약물)일 수 있다.
일부 양상에서, 개시된 방법 또는 조성물은 증상적 또는 질환 변형이든 상관 없이 다른 치료요법과 조합될 수 있다.
용어 "치료"는 조합 치료 및 치료요법을 포함하고, 여기서, 2개 이상의 치료 또는 치료요법은 예를 들어, 순차적으로 또는 동시에 조합된다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 사용한 치료와 하나 이상의 다른 (예를 들어, 1, 2, 3, 4) 제제 또는 치료요법을 조합하는 것이 유리할 수 있다. 동시-치료제의 적당한 예는 본원의 개시내용에 기반이 되는 당업계의 기술자에게 공지되어 있다. 전형적으로 동시-치료제는 당업계에서 임의의 공지된 것일 수 있고, 이것은 본원에 기재된 질환 또는 장애를 치료하는데 있어서 치료학적 효과를 치료될 개체의 진단을 위해 대상체에게 주어질 수 있는 것으로 사료된다. 특정 조합은 당업자에게 공지된 통상의 일반적인 지식 및 투여 용법을 사용하여 투여량을 선택하는 담당의의 판단에 있다.
제제 (예를 들어, 변형된 수용체 및 외인성 리간드, 및 하나 이상의 다른 제제를 포함하는 가공된 혈소판)는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있고 개별적으로 다양한 용량의 스케줄 및 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 순차적으로 투여되는 경우, 제제는 밀접하게 격리된 간격 (예를 들어, 5 내지 10분의 기간) 또는 보다 긴 간격 (예를 들어, 1, 2, 3, 4시간 이상의 이격 또는 요구되는 경우 보다 긴 기간 이격)으로 투여될 수 있고, 정확한 투여 용법은 치료제(들)의 성질에 상응한다.
본원에서는 환자를 치료하는 방법이 개시된다. 일부 양상에서, 환자는 혈소판 수혈을 필요로 할 수 있다. 일부 양상에서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 시험관내 생성되고 임의로 단리된 혈소판을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 시험관내 생성되고 임의로 단리된 혈소판은 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
본원에서는 치료제, 펩타이드, 효소 또는 생활성 분자 (생분자)를 포함하는 혈소판을 생성하는 방법이 개시된다. 일부 양상에서, 상기 방법은 신체에서 방출될 혈청 내 치료 단백질을 함유하는 혈소판을 생성하기 위해 본원에 개시된 임의의 방법을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 외인성 및/또는 고유한 조절을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 상기 방법은 또한 예를 들어, 특정 약물과의 결합 및/또는 조직 특이적 펩타이드와의 결합 시 효소의 방출을 촉발시키기 위해 혈소판을 활성화시킬 수 있는 수용체를 포함하도록 혈소판을 가공시키는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서는 치료제, 펩타이드, 효소 또는 생활성 분자 (생분자)를 포함하는 혈소판을 생성하는 방법이 개시된다. 일부 양상에서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다: a) 유전학적으로 가공된 골아세포를 제공하는 단계; b) 유전학적으로 가공된 조혈 줄기 세포 (HSC)를 제공하는 단계로서, 상기 HSC가 하나 이상의 유전적 회로를 포함하고; 상기 하나 이상의 유전적 회로가 관심 대상의 하나 이상의 유전자를 포함하고, 관심 대상의 하나 이상의 유전자가 a)에서의 관심 대상의 하나 이상의 유전자; 및 하나 이상의 프로모터와는 상이한, 단계; c) a)에서의 유전학적으로 가공된 골아세포를 유전학적으로 가공된 HSC가 혈소판 줄기 세포로 분화하도록 하는 조건하에 배지 중에서 b)에서의 유전학적으로 가공된 HSC와 배양하는 단계; 및 d) 치료제, 펩타이드, 효소 또는 생활성 분자를 포함하는 혈소판을 생성하는 단계. 일부 양상에서, 생성되는 혈소판은 가공된 수용체 또는 변형된 수용체를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 유전학적으로 가공된 HSC는 만능 줄기 세포 또는 이들의 전구 줄기 세포 중 하나로부터 기원할 수 있다. 전구 줄기 세포는 치료제, 펩타이드, 효소 또는 생활성 분자를 생성할 수 있다. 전구 줄기 세포는 고유적으로 또는 외인성으로 조절되어 치료제, 펩타이드, 효소 또는 생활성 분자를 생성하거나 분비할 수 있다. 상기 방법은 또한 특정 약물로의 결합시 및/또는 조직 특이적 펩타이드에 결합시 효소의 방출을 촉발시키기 위해 혈소판을 활성화시킬 수 있는 수용체를 포함하도록 혈소판을 가공하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료제"는 화학적 화합물, 단백질, 펩타이드, 소분자, 항체, 유전자, 효소 또는 세포를 지칭한다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료 단백질 또는 제제는 혈소판으로 최종 분화 전에 혈소판 전구 줄기 세포에서 유전적 회로로부터 전사될 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료 단백질 또는 제제는 거핵세포에서 유전적 회로로부터 전사될 수 있다. 이들 치료 단백질 또는 제제는 전구 세포의 세포질에 존재할 수 있고 따라서 최종 분화된 혈소판의 일부일 수 있다. 치료 단백질 또는 제제의 생성은 항시적 발현 프로모터로부터 및/또는 유도성 유전적 회로와 함께 전사될 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 방법은 e) 전구 줄기 세포의 혈소판으로의 분화를 촉진시키는 조건하에 배지에서 단계 c)에서 생성된 전구 줄기 세포를 재배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 개시된 방법은 f) 혈소판을 수거하거나 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 방법을 수행하여 치료학적 세포를 생성할 수 있다. 치료학적 세포는 하나 이상의 치료제, 펩타이드, 효소, 유전자 또는 생활성 분자를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 치료제는 소분자, 유전자, 펩타이드, 효소, 백신 또는 항미생물제일 수 있다.
일부 양상에서, a)에서 하나 이상의 유전적 회로는 조절될 수 있다. 일부 양상에서, a)에서 하나 이상의 유전적 회로는 유전학적으로 가공된 HSC에서 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 단계 a)에서 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, a) 및 b)에서 유전적 회로의 하나 이상의 프로모터는 CMV, RSV 및/또는 U6일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 프로모터 (예를 들어, CMV, RSV 및/또는 U6)는 하나 이상의 오퍼레이터 부위 (예를 들어, tet)를 포함할 수 있다.
일부 양상에서, a)에서 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 리컴비나제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리컴비나제는 Cre, phiC31 인테그라제 및/또는 Bxb1일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리컴비나제는 조절될 수 있다. 일부 양상에서, a)에서 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 리컴비나제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 재조합 부위는 loxP 또는 attP일 수 있다. 일부 양상에서, attP 또는 임의의 다른 리컴비나제 인지 부위는 Rosa26 및/또는 염색체 11 유전자좌에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, attP 및 임의의 다른 인테그라제 인지 부위는 치료제에 대한 삽입 부위로서 작용할 수 있다.
일부 양상에서, a)에서 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 리프레서 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리프레서 단백질은 LacI, TetR 및/또는 QS일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리프레서 단백질은 조절될 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 배지는 하나 이상의 성분 또는 조절제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, a) 및 b)에서 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 배지 조절제 또는 성분에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 배지 조절제 또는 성분은 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 테트라사이클린, 독사사이클린, 퀴닌산 또는 옥신일 수 있다.
일부 양상에서, a)에서 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자는 트롬보포이에틴일 수 있다. 일부 양상에서, 트롬보포이에틴은 항시성으로 발현될 수 있다.
일부 양상에서, b)에서 하나 이상의 유전적 회로는 조절될 수 있다. 일부 양상에서, b)에서 하나 이상의 유전적 회로는 유전학적으로 가공된 HSC에서 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, b)에서 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 일부 양상에서, b)에서 유전적 회로의 하나 이상의 프로모터는 CMV, RSV 및/또는 U6일 수 있다.
일부 양상에서, b)에서 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 리컴비나제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리컴비나제는 phiC31 인테그라제 또는 Cre 또는 Bxb1 인테그라제일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리컴비나제는 조절될 수 있다. 일부 양상에서, b)에서 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 재조합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 재조합 부위는 loxP, attP 또는 Bxb1일 수 있다. 일부 양상에서, attP, loxP, 또는 Bxb1 부위는 Rosa26 유전자좌에 삽입될 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 재조합 부위는 치료제에 대한 삽입 부위로서 작용할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 게놈 내 리컴비나제 부위, 예를 들어, attP는 본원에 개시된 임의의 유전적 회로를 '도킹 부위'를 통해 게놈에 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 상기 도킹 부위는 유전자 발현을 성취하는데 강력한 것으로 공지되고 후성적 사일런싱에 내성일 수 있는, 본원에 개시된 유전적 회로의 게놈으로의 표적화되고 강력한 삽입을 가능하게 한다.
치료제의 위치는 게놈에 있을 수 있다.
일부 양상에서, b)에서 하나 이상의 유전적 회로는 하나 이상의 리프레서 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리프레서 단백질은 LacI, TetR 및/또는 QS일 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 리프레서 단백질은 조절될 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 개시된 배지는 하나 이상의 배지 조절제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 배지 조절제는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 테트라사이클린, 독사사이클린, 퀴닌산 또는 옥신일 수 있다.
일부 양상에서, b)에서 유전적 회로의 관심 대상의 하나 이상의 유전자는 GATA-1일 수 있다. 일부 양상에서, GATA-1은 항시성으로 발현될 수 있다.
일부 양상에서, 단계 c)에서 혈소판 전구 줄기 세포는 하나 이상의 세포 표면 마커를 발현할 수 있다. 일부 양상에서, 단계 c)에서 혈소판 전구 줄기 세포는 GATA-1을 발현할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 표면 마커는 CD13, CD34, CD41a, 및 CD43일 수 있다. 일부 양상에서, 혈소판 또는 적혈구 세포는 하나 이상의 세포 표면 마커를 발현할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 세포 표면 마커는 CD41a 및 CD42b일 수 있다.
본원에서는 치료제를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 치료학적 유효량의 치료학적 혈소판을 대상체 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 투여 단계 전에 치료를 필요로 하는 환자를 동정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 환자에게 치료학적 유효량의 단리된 혈소판을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양상에서 혈소판은 치료제를 포함한다. 단리된 혈소판 및 적혈구 세포는 DNA를 함유하지 않는다. 이들 세포는 이들이 본원에 개시된 방법을 통해 발현하도록 가공된 단백질 및 펩타이드를 발현한다. 이들 세포는 무핵화된다.
치료학적 투여는 예방학적 적용을 포함한다. 유전학적 시험 및 다른 예후적 방법을 기준으로, 이들의 환자와 논의하는 담당의는 예방학적 투여를 선택할 수 있고, 여기서, 상기 환자는 하나의 유형의 병태 장애 또는 질환에 대해 임상적으로 결정된 성향 또는 증가된 민감성 (일부 경우에 크게 증가된 민감성)을 갖는다.
본원에 기재된 치료제를 포함하는 혈소판 적혈구 세포 뿐만 아니라 혈소판은 임상적 질환 발병을 지연시키거나, 감소시키거나 바람직하게 예방하는데 충분한 양으로 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 따라서, 일부 양상에서, 환자는 인간 환자이다. 치료학적 적용에서, 조성물은 병태, 장애 또는 질환을 이미 갖거나 이들로 진단된 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에게 징후 또는 증상을 적어도 부분적으로 개선시키거나 병태, 이의 합병증 및 결과물의 증상의 진행을 억제 (및 바람직하게는 정지)시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 성취하기에 적당한 양은 "치료학적 유효량"으로서 정의된다. 본원에 기재된 치료제를 포함하는 혈소판 뿐만 아니라 혈소판의 치료학적 유효량은 치유를 성취할 수 있는 양이지만 그 결과는 성취될 수 있는 여러 가지 중 하나일 뿐이다. 하나 이상의 증상은 덜 중증일 수 있다. 회수는 치료받은 개체에서 가속화될 수 있다.
본원에 기재된 혈소판 내 존재하고 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 적용된 본원에 기재된 바와 같은 방법에 사용되는 하나 이상의 치료제의 치료학적 유효량은 연령, 체중 및 다른 일반 병태 (상기 언급된 바와 같이)에서 개별적 차이를 고려하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본원에 기재된 치료제를 포함하는 혈소판을 포함하는 혈소판은 임의의 다양한 투여 경로에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다.
치료제를 포함하는 혈소판을 포함하는 혈소판은 비경구 투여를 위해 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위해 제조된 혈소판은 정맥내 (또는 동맥내), 근육내, 피하 및 복막내 투여를 위해 제조된 것들을 포함한다.
실시예
실시예 1: 증진된 분화를 위해 고유 신호를 조절하기 위해 만능 줄기 세포를 가공한다
마우스 HSC가 유전자 도구를 사용하기 위해 적당한 세포 공급원을 제공하는지를 결정하기 위해, 도구 및 방법은 혈소판 부하하기 위해 개발되었고, 전체 골수는 마우스로부터 제거하였고 장기 잠재력에 대해 시험하였다 (도 3a). 다른 보고와 일치하게, 계통-위임 HSC 전구체의 수는 시간 경과에 따라 유의적으로 감소한다27-32 (도 3b). 이어서, 골수로부터 단리된 HSC가 시험관내 혈소판으로 분화될 수 있는지를 결정하기 위해, 다능 HSC (LSK+ 세포)는 마우스 골수로부터 단리하였고 이들을 표준 분화 조건을 사용하여 분화시켰다33-35 (도 3c). 이들 연구로부터, HSC가 배양물 중에 그러한 짧은 수명을 갖기 때문에, 이들 목적을 위한 이들의 직접적인 조작이 실현되지 않는 것으로 결론지워졌다. 이어서, 배아 줄기 세포 (ES)의 시험관내 다능 HSC로의 분화 효능이 시험되었고 다능 HSC (LSK+) 세포가 배양 9일 이내에 수득될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (도 3d). 따라서, 마우스 배아 줄기 (ES)는 이들 세포가 신속하게 증식하고, 이들이 이들의 만능 세포 집단을 지속적으로 갱신하고, 이들이 배양물 중에 유지하기 용이하기 때문에 유전학적으로 조작될 것이다. 이들 유전학적으로 조작된 ES 세포는 HSC로 분화될 것이다. 이러한 ES 세포 접근법의 또 다른 이점은 가공된 세포가 노화에 신속하게 도달하거나 자발적으로 분화하고 따라서 보다 짧은 기능성 수명을 갖는 1차 HSC와 같은 또 다른 세포주 보다 신속하게 확장될 수 있고 보다 길게 유지될 수 있다는 것이다. 이를 성취하기 위해, 유전적 회로를 위한 '랜딩 패드' 또는 '도킹 부위'를 삽입하기 위해 CRISPR 기술을 사용하는 모듈 기술을 수행하였다. 통상적인 기술은 유전적 회로의 게놈으로의 무작위 삽입을 포함하고 회로가 안정하게 통합된 안정한 클론을 선택하고 상기 특정 삽입 부위에서 회로의 기능을 시험한다. 이들 단계는 단조롭고 시간 소모적일 수 있다. 추가로, 시험 단계는 각각의 클론이 상이하고 위치에 영향을 미쳐 (예를 들어, 국소 인핸서, 리프레서 또는 후성적 변형으로 인해) 회로의 탈조절 또는 잘못된 조절을 유도할 수 있기 때문에 중요하다. 이들 한계를 우회하기 위해, 마우스 배아 줄기 (ES) 세포는 Rosa26 유전자좌에서 '도킹 부위'로 가공하여 유전적 회로의 표적화되고 강력한 삽입을 가능하게 하였다. Rosa26 유전자좌는 마우스 모델에서 강력한 유전자 발현을 성취하기 위해 광범위하게 사용되고 후성적 사일런싱에 내성이다36. CRISPR/Cas9 기술을 사용하여, 3개의 attP 부위는 Rosa26 유전자좌에 부가하였고 (도 4), 이는 이들 부위에서 단일방향 재조합으로 phiC31 인테그라제를 사용하여 상기 위치에서 유전적 회로를 특이적으로 삽입하도록 한다 (도 4b)37. 이것은 임의의 유전자 네트워크를 마우스 ES 세포의 게놈으로 삽입하기 위한 강력한 기술이 되도록 한다. 추가로, ES 세포는 전능이기 때문에, 이들 유전학적으로 변형된 세포는 관심 대상의 질환 또는 조직을 기준으로 일정 범위의 상이한 기능성 세포 유형으로 분화될 수 있다. 혈소판 생성 및 MK에서 리소좀 효소의 생성할 목적을 위해, 유전학적으로 변경된 ES 세포는 HSC로 분화될 것이고 리소좀 효소의 발현은 분화 전반에 걸쳐 상이한 단계에 제어될 것이다. 추가로, 이러한 기술의 개발은 사용될 세포 유형의 임의의 유전학적 배경을 가능하게 하고 사용되는 다양한 마우스 모델과의 면역 적합성을 보장한다. 최종적으로, CRISPR 기술의 사용은 유사한 도킹 부위가 인간 세포주에 구축되도록 할 것이다.
실시예 2: 생분자를 분비하는 혈소판을 생성하기 위해 거핵세포를 유전학적으로 가공한다
혈소판은 천연 및 합성 페이로드의 생체내 전달을 위해 이들이 매력적인 후보가 되도록 하는 많은 특징을 소유한다: 1) 이들은 신체내 광범위 순환 범위를 갖고, 2) 이들은 무핵 세포이고, 3) 이들은 생물적합성이고, 4) 인간에서 이들의 평균 수명은 ~10일이고, 5) 활성화 후, 이들의 단백질 과립은 분비 소포로 작용하여 성분들을 세포외 유체로 방출시킨다. 본원에 개시된 바와 같은 합성 생물학을 사용함에 의해, MK는 혈소판 분비를 위해 표적화될 단백질 카고의 치료학적 수준을 발현하도록 프로그래밍될 수 있다. 개념 증명으로서, 증진된 녹색 형광성 단백질 (EGFP), 분비된 알칼린 포스파타제 (SEAP), 및 루시퍼라제는 초기에 MK에서 발현되어 치료학적 페이로드를 위한 전달 비히클로서 혈소판을 사용하는 효능을 결정할 것이다. 리포터 분자의 이러한 제품군은 이들이 카고 부하 및 전달 공정의 상이한 양상을 검정하기 위해 사용될 수 있기 때문에 선택되었다. EGFP는 가용성 유전자전이 카고가 분비 과립으로 패키징 되는지를 결정하기 위해 사용될 것이고, SEAP는 시험관내 성장한 세포 배지로 카고 방출 정도를 검정하기 위해 사용될 것이고, 루시퍼라제는 가공 혈소판이 이들 연구가 생체내 모델로 이동될 때 사용될 내인성 혈소판과 유사하게 손상 부위에 집적되는지를 결정하기 위해 사용될 것이다.
실험 및 방법. 치료학적 생분자를 위한 전달 비히클로서 혈소판을 사용하기 위한 개념 증명으로서 항시적으로 발현하는 리포터 유전자는 ES 세포의 attP 부위에 삽입될 것이다 (도 4). 이들 세포는 OP9 기질 지지 세포 상에 플레이팅되고 MK로 분화될 것이다. 대안적으로, 인간 iPS 세포가 사용될 수 있고 따라서 이들 세포는 임의의 지지 세포 상에 플레이팅될 필요가 없을 것이다. ES 세포에서 attP 랜딩 패드가 사용될 것이고 이는 가공되어 항시성으로 발현하는 리포터 유전자를 삽입하고, 이들 세포를 MK 및 혈소판으로 분화하고, 이어서 리포터 발현에 대해 이들 세포를 검정하여 이들 재조합적으로 제조된 단백질의 위치 및 기능을 결정하고 이들이 혈소판 기능이 어떻게 영향을 미치는지를 결정한다.
MK 및 혈소판에서 GFP 발현: 많은 잠재적 바이오-치료학적 분자와 같이, GFP는 세포질 전반에 걸쳐 확산하는 작은 가용성 단백질이다. MK는 FACS 분석을 위해 수거하여 MK 분화 및 GFP 발현 수준을 확인할 것이다. 전체 집단에서 GFP 발현 MK의 퍼센트가 또한 평가될 것이다. MK에서 GFP 발현 수준을 결정한 후, GFP를 발현하는 MK는 혈소판으로 분화될 것이다. FAC 분석은 혈소판 분화를 확인하고 이들 세포에서 GFP 발현을 정량화하기 위해 수행될 것이다. 혈소판에서 GFP의 서브-세포 분포를 확립하기 위해, 정제된 세포는 GFP에 대한 항체를 사용하여 면역표지시킬 것이다.
MK 및 혈소판에서 SEAP 발현: HSC를 OP9 기질 세포 층 상에 MK로 분화시킨 후, 이들 세포를 수거할 것이고 SEAP 분비는 확립된 ELISA 프로토콜을 사용하여 배지에서 정량할 것이다38. MK로부터의 SEAP 분비를 결정한 후, SEAP를 발현하는 MK는 혈소판으로 분화시킬 것이고 혈소판이 시험관내 생분자를 분비할 수 있는지를 결정할 것이다. 이를 성취하기 위해, 가공된 혈소판은 다중 시점 (10일 동안 1일 3회)에서 배양 배지에서 SEAP의 수준을 시험함으로써 비가공된 혈소판과 함께 특징 분석될 것이다.
MK 및 혈소판에서 루시퍼라제의 발현: 가공된 혈소판이 손상에 응답할 수 있는지를 결정하기 위해, 루시퍼라제는 MK 세포 및 혈소판에서 발현될 것이고 이는 생존 동물 이미지화를 가능하게 할 것이다. 이들 실험은 루시퍼라제를 발현할 수 있는 혈소판을 가공하기 위한 개념 증명으로서 사용할 것이다. HSC를 MK로 분화시킨 후, 루시퍼라제 활성은 생발광할 수 있는 플레이트 판독기를 사용하여 정량할 것이다.
혈소판 특징 분석. 혈소판 세포 분화는 유동 세포측정을 사용하여 표면 마커에 의해 동정될 수 있다. 탈과립화 및 응집 평가는 공지된 활성화인자 폰 빌레브란트 인자 (vWF)39, 피브리노겐40, 콜라겐41,42, 및 트롬빈과 관련하여 수행될 것이다43. 혈소판 탈과립화는 세로토닌 및 혈소판 유래된 인자 4 (PDF-4)에 특이적인 ELISA에 의해 결정될 것이다44. 대조군으로서, 마우스로부터 새롭게 단리된 혈소판은 비교를 위해 사용될 것이다. 공지된 활성화인자의 존재하에 응집하는 혈소판 능력은 응집측정기를 사용하여 결정될 것이다. 추가로, 혈소판 상에 PAR 수용체를 효소적으로 절단함으로써 작용하는 트롬빈에 의한 혈소판 탈과립화는 세로토닌 및 혈소판 유래된 인자43 4 (PDF-4)에 특이적인 ELISA에 의해 결정될 것이다44.
GFP가 혈소판에서 발현되지 않는 경우에, 세포막과 연관되는 것으로 나타난 미리스톨-태그된 GFP가 사용될 것이다45. 이 경우에, GFP는 MK 막과 연관될 것이고 혈소판 막의 일부가 될 가능성이 있다. 현미경 및 유동 세포측정을 수행하여 GFP 발현을 정량할 것이다. SEAP 또는 루시퍼라제가 혈소판의 일부가 아닌 경우에, 리포터 유전자는 거핵세포 단백질의 표적화 및/또는 저장에 직접적으로 관여하는 것으로 입증된 아미노산 서열 LKNG (서열번호 1)로 태그될 수 있다46. 이를 성취하기 위해, LKNG (서열번호 1)는 MK에서 과립 패키징을 위해 표적화될 5' 또는 3' UTR 중 어느 하나에서 리포터 분자에 융합될 수 있다.
실시예 3: 신규한 혈소판 수용체를 가공하기 위해 지시된 진화 접근법을 개발하고 입증한다
혈소판은 활성화되어 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 신호전달을 통해 이들의 생활성 분자를 분비할 수 있다47. GPCR은 다양한 정상 및 병리학적 질환에 관여하기 때문에 많은 치료학적 표적이된 대형 계열의 다목적 막 단백질이다. 생체내 GPCR 신호전달의 정확한 시공간 제어를 수득하기 위해, 디자이너 약물에 의해 배타적으로 활성화된 디자이너 수용체 (DREADD)는 포유동물 뇌에서 거동인자 및 생리학적 공정을 선택적으로, 신속하게, 가역적으로 및 용량-의존적으로 제어하기 위해 가공되었다48. 이들 가공된 수용체는 어떠한 내인성 리간드, 상기 리간드의 부재하에 어떠한 기본 활성도 갖지 않도록 디자인되었고, 또 다른 약리학적 불활성 화합물은 약리학적 불활성 및 대사적으로 안정한 소분자의 나노몰 농도에 의해 GPCR을 배타적으로 및 강력하게 활성화시킨다49. 혈소판은 이들의 활성화 수단 중 하나로서 GPCR을 사용하기 때문에, 이들 세포의 활성화를 시공간적으로 제어하기 위한 전략으로서 혈소판 상의 DREADD를 가공할 수 있다.
실험 및 방법. DREADD는 Gq, Gi, 및 Gs G-단백질 커플링된 신호전달 경로를 통한 뉴런 신호전달의 비-침습성 제어가 가능하도록 이전에 가공되었다. 합성 리간드에 의해 활성화되고 어떠한 생물학적 활성도 갖지 않는 수용체를 가공하기 위해, 혈소판을 활성화하는데 관여하는 GPCR은 내인성 기질/리간드 인지 보다 합성을 선호하도록 변형시킬 것이다. 그러한 변형된 GPCR의 전면에 프로테아제 활성화된 수용체 (PAR)가 있고 이는 Gq, G12/G13 및 일부 경우에 G 단백질의 Gi 계열에 커플링된다. PAR은 혈소판의 가장 효과적인 활성화인자인 트롬빈에 의해 활성화된다47. 4개의 PAR 중에 PAR1 및 PAR4는 인간 혈소판 상에 존재하는 반면 마우스 혈소판은 PAR3 및 PAR4를 발현한다47. 이러한 이유 때문에, 지시된 분자 진화 접근법을 취하여 약리학적 불활성 화합물 클로자핀-N-옥사이드 (CNO)에 의해 활성화되지만 이의 고유 리간드 트롬빈에 의해 활성화되지 않는 PAR 계열의 생성을 촉진시킬 것이다. 이들 연구를 위해, CNO는 오늘날 가장 광범위하게 사용되는 DREADD가 이들의 리간드로서 CNO를 사용할 것이기 때문에 합성 리간드로서 사용되고 연구는 이것이 선천적 수용체에 대한 친화성이 결여된 약리학적 불활성 분자이고 나노몰 농도에서 GPCR 신호전달의 시공간적 제어를 활성화시킴을 보여주었다48,49.
지시된 분자 진화는 연속 라운드의 무작위 돌연변이, 스크리닝 및 이어서 선택에 의해 특정 성질을 단백질에 부여하기 위한 기술이다. 목적하는 기준을 충족하도록 단백질의 성공적 진화는 스크리닝될 생물학적 다양성 및 크기, 스크리닝 검정의 질 및 주형으로부터 목적하는 결과로의 기능적 점프의 크기를 포함하는 실험 디자인의 여러 양상에 의존한다. Gq 신호전달 경로에 주로 관여하는 PAR 수용체의 경우에, 본래의 DREADD 표적화된 수용체가 또한 Gq 신호전달 경로를 통해 신호를 전달하기 때문에, 수개 내지 적당한 기능적 단계를 수행하여 CNO에 대한 이들 수용체를 진화시켜 신호전달을 활성화시킬 것으로 예측된다. 디자이너 약물에 추가로, 그 조직에 결합시 혈소판을 활성화시킴에 따라서 생물학적 페이로드를 방출하는 다른 약물 또는 조직 특이적 펩타이드에 응답하도록 수용체를 진화시킬 수도 있다.
DREADD를 생성하기 위한 실험 과정은 매우 간단한 것으로 보고되었다50. 간략하게, 선택된 수용체는 무작위로 돌연변이되어 많은 상이한 돌연변이체의 라이브러리를 생성시키고, CNO와 새로운 돌연변이체 수용체의 상호작용을 시험하고, CNO에 결합할 수 있는 돌연변이체를 선택하고, 보다 많은 라운드의 무작위 돌연변이를 진행하여 CNO와 심지어 보다 양호한 상호작용을 갖는 돌연변이를 선택하고, 최상의 돌연변이체 후보물을 선택하여 포유동물 세포에서 발현되도록 하고 이어서 결합 검정을 수행한다50.
효모에서 GPCR 발현을 수득할 수 없는 경우, 높은 카피수를 갖는 발현 플라스미드가 선택될 것이다. GPCR을 과발현하는 고카피수의 플라스미드로의 개시는 효모에 독성이 있을 수 있고 세포 중에서 카피수에 보다 큰 변화를 유도할 것이고, 콜로니별로 GPCR의 상이한 발현 수준이 상이하고 실험 재현성을 감소시킨다. 마지막으로, 지시된 돌연변이유발 접근법을 최대화하기 위해 다중 효모 균주를 사용할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Deans, Tara <120> Methods of Making Platelets Comprising Modified Receptors and Uses Thereof <130> 21101.0377P1 <150> US 62/741,971 <151> 2018-10-05 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Leu Lys Asn Gly 1

Claims (71)

  1. 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 제1 유전적 회로를 포함하는 핵산 작제물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조직-특이적 프로모터는 거핵세포-특이적 프로모터인, 핵산 작제물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 거핵세포-특이적 프로모터는 CXCL4, GPIIb, 또는 PTPRC인, 핵산 작제물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 프로모터는 조절 가능한, 핵산 작제물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 프로모터는 항시성으로 활성인, 핵산 작제물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 수용체는 변형된 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 또는 변형된 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)인, 핵산 작제물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 변형된 GPCR은 Gq, Gi, Gs 또는 G12/G13 GPCR인, 핵산 작제물.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 변형된 PAR은 PAR1, PAR2, PAR3 또는 PAR4인, 핵산 작제물.
  9. 청구항 1에 있어서, 제2 유전적 회로를 추가로 포함하고, 상기 제2 유전적 회로는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자를 포함하는, 핵산 작제물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자는 HoxB4, GATA1, c-MYC, BMI1, BCL-XL, PLK-1 또는 이들의 조합인, 핵산 작제물.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 제1 유전적 회로의 조직-특이적 프로모터는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자에 작동적으로 연결되는, 핵산 작제물.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 제2 유전적 회로는 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자에 작동적으로 연결되는, 핵산 작제물.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 프로모터는 조절 가능한, 핵산 작제물.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 프로모터는 조절 가능한, 핵산 작제물.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 프로모터는 항시성으로 활성인, 핵산 작제물.
  16. 청구항 1 또는 9에 있어서, 상기 제1 유전적 회로 또는 상기 제2 유전적 회로는 관심 대상의 유전자를 추가로 포함하는, 핵산 작제물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 관심 대상의 유전자는 치료제인, 핵산 작제물.
  18. 청구항 9에 있어서, 제3 유전적 회로를 추가로 포함하고, 상기 제3 유전적 회로는 관심 대상의 유전자를 포함하는, 핵산 작제물.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 관심 대상의 유전자는 치료제인, 핵산 작제물.
  20. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항의 핵산 작제물을 포함하는 만능 줄기 세포.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 만능 줄기 세포는 조혈 전구 줄기 세포 (hematopoietic progenitor stem cell), 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)인, 만능 줄기 세포.
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 만능 줄기 세포는 제대혈 또는 골수로부터 유래하는, 만능 줄기 세포.
  23. 청구항 20에 있어서, 상기 iPSC는 혈액 세포로부터 유래하는, 만능 줄기 세포.
  24. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항의 핵산 작제물을 포함하는 거핵세포.
  25. 핵산 작제물을 포함하는 거핵세포로서, 상기 핵산 작제물은 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 제1 유전적 회로를 포함하는, 거핵세포.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 조직-특이적 프로모터는 거핵세포-특이적 프로모터인, 핵산 작제물.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 거핵세포-특이적 프로모터는 CXCL4, GPIIb, 또는 PTPRC인, 핵산 작제물.
  28. 청구항 25에 있어서, 상기 변형된 수용체는 변형된 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 또는 변형된 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)인, 거핵세포.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 변형된 GPCR은 Gq, Gi, Gs 또는 G12/G13 GPCR인, 거핵세포.
  30. 청구항 28에 있어서, 상기 변형된 PAR은 PAR1, PAR2, PAR3 또는 PAR4인, 거핵세포.
  31. 청구항 25에 있어서, 제2 유전적 회로를 추가로 포함하고, 상기 제2 유전적 회로는 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자를 포함하는, 거핵세포.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자는 HoxB4 및/또는 GATA1; c-MYC, BMI1, 및 BCL-XL; PLK-1; 또는 이들의 조합인, 거핵세포.
  33. 청구항 25 또는 31에 있어서, 추가의 유전적 회로를 추가로 포함하고, 상기 추가의 유전적 회로는 관심 대상의 유전자를 포함하는, 거핵세포.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 관심 대상의 유전자는 치료제인, 거핵세포.
  35. 변형된 수용체를 포함하는 가공된 거핵세포.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 변형된 수용체는 변형된 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 또는 변형된 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)인, 가공된 거핵세포.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 변형된 GPCR은 Gq, Gi, Gs 또는 G12/G13 GPCR인, 가공된 거핵세포.
  38. 청구항 36에 있어서, 상기 변형된 PAR은 PAR1, PAR2, PAR3 또는 PAR4인, 가공된 거핵세포.
  39. 청구항 35 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 치료제를 추가로 포함하는, 가공된 거핵세포.
  40. 변형된 수용체를 포함하는 가공된 혈소판.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 변형된 수용체는 변형된 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 또는 변형된 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)인, 가공된 혈소판.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 변형된 GPCR은 Gq, Gi, Gs 또는 G12/G13 GPCR인, 가공된 혈소판.
  43. 청구항 41에 있어서, 상기 변형된 PAR은 PAR1, PAR2, PAR3 또는 PAR4인, 가공된 혈소판.
  44. 청구항 40 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 치료제를 추가로 포함하는, 가공된 혈소판.
  45. 혈소판 또는 혈소판 집단을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항의 핵산 작제물을 포함하는 만능 줄기 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 만능 줄기 세포의 거핵세포로의 확장을 가능하게 하는 조건하에 배지에서 상기 만능 줄기 세포를 배양하는 단계; 및
    c) 상기 거핵세포를 혈소판으로 분화시키는 단계를 포함하고;
    상기 혈소판 또는 혈소판 집단이 상기 변형된 수용체를 포함하는, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 만능 줄기 세포는 조혈 전구 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)인, 방법.
  47. 청구항 45에 있어서, 상기 만능 줄기 세포는 제대혈 또는 골수로부터 유래하는, 방법.
  48. 청구항 46에 있어서, 상기 iPSC는 혈액 세포로부터 유래하는, 방법.
  49. 청구항 45에 있어서, 상기 배지는 하나 이상의 조절제를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 하나 이상의 배지 조절제는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 테트라사이클린, 독사사이클린, 퀴닌산 또는 옥신인, 방법.
  51. 청구항 45에 있어서, 상기 변형된 수용체는 변형된 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 또는 변형된 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)인, 방법.
  52. 청구항 52에 있어서, 상기 변형된 GPCR은 Gq, Gi, Gs 또는 G12/G13 GPCR인, 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, 상기 변형된 PAR은 PAR1, PAR2, PAR3 또는 PAR4인, 방법.
  54. 청구항 45에 있어서, 상기 만능 줄기 세포는 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 유전적 회로를 포함하는 핵산 작제물을 포함하거나; 상기 만능 줄기 세포는 변형된 수용체를 암호화할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 제1 유전적 회로; 및 하나 이상의 거핵세포 분화 유전자를 포함하는 제2 유전적 회로를 포함하는 핵산 작제물을 포함하고; 여기서, 상기 제1 유전적 회로 또는 상기 제2 유전적 회로는 관심 대상의 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 혈소판 또는 혈소판 집단은 치료제를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 청구항 45에 있어서, 상기 혈소판 또는 혈소판 집단을 단리하거나 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  57. 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은: a) 청구항 40 내지 55 중 어느 한 항의 하나 이상의 혈소판을 인간 대상체에게 투여하는 단계; 및 b) 외인성 효능제를 상기 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 외인성 효능제의 존재가 변형된 수용체를 활성화시키는, 방법.
  58. 청구항 56에 있어서, 상기 인간 환자는 투여 단계 전에 치료를 필요로 하는 것으로 동정된, 방법.
  59. 청구항 56에 있어서, 상기 인간 환자는 질환을 갖는, 방법.
  60. 청구항 58에 있어서, 상기 질환은 암인, 방법.
  61. 청구항 58에 있어서, 상기 질환은 당뇨병인, 방법.
  62. 청구항 59에 있어서, 상기 암은 전이된, 방법.
  63. 청구항 58에 있어서, 상기 질환은 리소좀 저장 질환인, 방법.
  64. 청구항 56에 있어서, 상기 변형된 수용체의 활성화는 청구항 44, 청구항 45항 또는 청구항 54의 혈소판으로부터 치료제 또는 하나 이상의 내인성 생분자의 방출을 유도하는, 방법.
  65. 청구항 56에 있어서, 상기 하나 이상의 혈소판 또는 혈소판 집단은 정맥내 주사 또는 수혈을 통해 투여되는, 방법.
  66. 청구항 56에 있어서, 상기 외인성 효능제는 두개내, 척추내, 근육내 또는 정맥내 주사 또는 경구를 통해 투여되는, 방법.
  67. 치료제 또는 하나 이상의 내인성 생분자를 하나 이상의 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 방법은: 상기 하나 이상의 세포를 청구항 40 내지 55 중 어느 한 항의 하나 이상의 혈소판과 접촉시키는 단계를 포함하고; 상기 접촉 단계는 외인성 효능제의 존재하에 수행되고, 상기 외인성 효능제의 존재는 변형된 수용체를 활성화시켜 상기 치료제 또는 상기 하나 이상의 내인성 생분자를 상기 하나 이상의 세포로 방출시키는, 방법.
  68. 청구항 66에 있어서, 상기 접촉 단계는 생체내 두개내, 척추내, 근육내 또는 정맥내 주사를 통해 수행되는, 방법.
  69. 청구항 66에 있어서, 상기 하나 이상의 혈소판 또는 혈소판 집단은 정맥내 주사 또는 수혈을 통해 투여되는, 방법.
  70. 청구항 66에 있어서, 상기 외인성 효능제는 접촉 단계 전, 접촉 단계 동안에 또는 접촉 단계 후 투여되는, 방법.
  71. 청구항 68에 있어서, 상기 외인성 효능제는 두개내, 척추내, 근육내 또는 정맥내 주사 또는 경구를 통해 투여되는, 방법.
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