JP2022512622A - 改変受容体を含む血小板の作製方法及びその使用法 - Google Patents

Abstract

改変受容体、治療薬、ペプチド、及び／または生物活性分子を含む血小板を産生する方法が本明細書で開示される。本明細書に開示の方法で産生される細胞は、例えば、リソソーム蓄積症、糖尿病、及びがんを処置、管理、予防、及び診断するために使用することができる。本明細書に開示の方法により産生される細胞は、特定の薬物への結合時及び／または組織特異的ペプチドへの結合時に、酵素、生体分子、または治療薬の放出を誘発するように血小板を活性化することが可能な受容体を含むように操作することができる。【選択図】図１

Description

発明の詳細な説明

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月５日に出願された米国仮出願第６２／７４１，９７１号の出願日の利益を主張する。この先に出願された出願の内容は、本明細書により全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の組み込み
本出願は、２０１９年９月２６日に作成されたサイズが４２７バイトであるファイル名２１１０１＿０３７７Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇを含有する出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを経由してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含有し、これは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソーム機能の複数の態様の欠陥、最も一般には、高分子の分解に関与する酵素であるリソソーム加水分解酵素の変異、により引き起こされる¹。これらの変異は、細胞高分子の分解に関与する欠陥のある酵素をもたらす。細胞代謝中に生成された高分子は、排泄または再利用のいずれのために分解されなければならず；そうでなければ、この代謝廃棄物が、細胞の貯蔵能力を圧倒し、細胞の変形、不活化、及び破壊がもたらされる。細胞破壊がより広範囲になるにつれて、組織及び最終的な臓器不全が生じる。実験は、疾患細胞が隣接細胞により分泌される外因性酵素を取り込むことが可能であること、及び残留酵素活性の小さな増加が、リソソーム機能を回復に重大な影響を与え得ることを示している。この認識により、不足する酵素を産生する能力を有する細胞集団を含む骨髄移植に加えて、加水分解酵素の組み換え産生及びそれらの血液への注入を含むＬＳＤの現在の処置がもたらされている。しかし、タンパク質の不安定性は、治療用量での主要な標的器官に到達することを妨げ、骨髄移植と関連するリスク（移植片対宿主）は、臨床有効性を抑える^6~10。

改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む第１の遺伝子回路を含む核酸構築物が本明細書に開示される。

核酸構築物を含む巨核球が本明細書に開示され、核酸構築物が、改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む第１の遺伝子回路を含む。

改変受容体を含む操作巨核球が本明細書に開示される。

これらの患者（例えば、ＬＳＤ患者）の平均余命の改善につながり得るこれらの組織の健康及び機能を増強するために制御放出を使用して、組織に生物活性生体分子を放出する能力を有する血小板を操作するための組成物及び方法が本明細書に記載される。制御放出を使用して関連組織に生物活性分子を放出する能力を有する血小板の操作も開示される。制御放出機序を使用して、関連組織に生物活性分子を放出する能力を有する操作血小板を作製する方法も開示される。また、特定の薬物への結合時及び／または組織特異的ペプチドへの結合時に、血小板を活性化して生体分子の放出を誘発することが可能な受容体を含む制御放出を使用して、関連組織に生体活性生体分子を放出する能力を有する血小板を操作することも開示される。

赤血球または血小板を産生する方法が本明細書に開示され、方法は、ａ）遺伝子操作フィーダー細胞（フィーダー細胞が、１つ以上の遺伝子回路を含み、１つ以上の遺伝子回路が、１つ以上の目的の遺伝子を含む）；及び１つ以上のプロモーターを提供すること；ｂ）遺伝子操作フェド細胞（フェド細胞が、１つ以上の遺伝子回路を含み、１つ以上の遺伝子回路が、１つ以上の目的の遺伝子を含み、１つ以上の目的の遺伝子が、ａ）の１つ以上の目的の遺伝子とは異なる）；及び１つ以上のプロモーターを提供すること；ならびに、ｃ）遺伝子操作フェド細胞を、赤血球または血小板に分化させる条件下での培地中で、ｂ）の遺伝子操作フェド細胞と共に、ａ）の遺伝子操作フィーダー細胞を培養すること（遺伝子操作フェド細胞のうちの１つ以上が赤血球または血小板に分化する）を含む。そのような方法はまた、フェド細胞から分化する赤血球及び血小板が、特定の薬物への結合時及び／または組織特異的ペプチドへの結合時に、酵素の放出を誘発するように血小板を活性化することが可能な受容体を含むようにフェド細胞を操作することを含み得る。

治療薬を含む血小板または赤血球を産生する方法が本明細書に開示され、方法は、ａ）遺伝子操作フィーダー細胞（フィーダー細胞が、１つ以上の遺伝子回路を含み、１つ以上の遺伝子回路が、１つ以上の目的の遺伝子を含む）；及び１つ以上のプロモーターを提供すること；ｂ）遺伝子操作フェド細胞（フェド細胞が、１つ以上の遺伝子回路を含み、１つ以上の遺伝子回路が、１つ以上の目的の遺伝子を含み、１つ以上の目的の遺伝子が、ａ）の１つ以上の目的の遺伝子とは異なる）；及び１つ以上のプロモーターを提供すること；ｃ）遺伝子操作フェド細胞を血小板及び／または赤血球前駆幹細胞に分化させる条件下の培地中で、ｂ）の遺伝子操作フェド細胞と共に、ａ）の遺伝子操作フィーダー細胞を培養すること；ならびに、ｄ）操作受容体及び／または治療薬を含む血小板または赤血球を産生すること、を含む。そのような方法はまた、特定の薬物への結合時及び／または組織特異的ペプチドへの結合時に、生体分子の放出を誘発するように血小板を活性化することが可能な受容体を含むように血小板を操作することを含み得る。

図１Ａ～図１Ｅは、疾患処置のための送達システムとしての操作血小板を示す。図１Ａは、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）における細胞の変形、不活化及び破壊を示す。図１Ｂは、巨核球が細胞質伸長から血小板を形成すること、及びこれらの形成された血小板が生物活性タンパク質で満たされていることを示す。図１Ｃは、リソソーム酵素で満たされた操作血小板を示す。図１Ｄは、未操作血小板がトロンビン及び他の小分子により活性化されることを示す。図１Ｅは、血小板でデザイナー薬（ＤＲＥＡＤＤ）により排他的に活性化されるデザイナー受容体を操作することで、受容体が薬学的に不活性な小分子に結合し、内因性分子には結合しないことを示す。 ＨＳＣ分化の概要を示す。ＨＳＣは、多能性幹細胞であり、より特殊な血球になる種々の前駆細胞に分化する可能性がある。 図３Ａ～図３Ｄは、ＨＳＣの成長及び可能性の評価方法を示す。図３Ａは、（ｉ）マウス骨髄から単離された細胞、（ｉｉ）指定日数間Ｄｅｘｔｅｒ培養で成長させた、（ｉｉｉ）ＭｅｔｈｏＣｕｌｔに移された細胞、及び（ｉｖ）経時的に計数された系統特異的コロニーの数、を示す。図３Ｂは、マウス骨髄から単離された細胞を、（ｉ）ＭｅｔｈｏＣｕｌｔで７日間成長させ、（ｉｉ）分化を評価するためにＣＤ４１及びＣＤ４５で標識したことを示す。ＣＤ４１は、血小板（Ｐ４ゲートの細胞、ピンク）を標識し、ＣＤ４５は、血液系統の全ての有核細胞（Ｐ３ゲートの細胞、青）を標識する。両方で標識された細胞（Ｐ２ゲートの細胞、緑色）は、ＭＫ及び前駆細胞である。図３Ｃは、骨髄由来のＬＳＫ＋細胞（ＨＳＣ）を選別し、ＯＰ９間質細胞上で８日間成長させた。図３Ｄは、ＥＳ細胞をＯＰ９間質細胞上で９日間成長させ、ＬＳＫ＋細胞をフローサイトメトリーで検出したことを示す（Ｐ３ゲートの細胞、青）。 図４Ａ～図４Ｄは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座のランディングパッドを示す。図４Ａは、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用してマウスＥＳ細胞のＲｏｓａ２６対立遺伝子に挿入された３ｘ ａｔｔＰ部位を示す。図４Ｂは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼを使用して、遺伝子回路が安定した統合のためにＲｏｓａ２６対立遺伝子を標的にし得る。図４Ｃは、統合を確認するためのＰＣＲスクリーンの結果を示す。図４Ｄは、スクリーニングプライマーを使用したマウス由来のｃＤＮＡのＰＣＲ結果を示す。レーン１：２ログラダー、レーン２：統合されていない野生型、ランド３：ランディングパッドの挿入。

本開示は、本発明の以下の詳細な説明、本明細書に含まれる図及び実施例を参照することにより、より容易に理解することができる。

本方法及び組成物が開示及び説明される前に、それらは、別途明記のない限り、特定の合成方法に、または別途明記のない限り、特定の試薬に限定されず、それ故、当然、変動し得ると理解すべきである。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の態様を説明する目的のものであり、限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、ここでは、例示的方法及び材料が記載される。

さらに、別途明記のない限り、本明細書に記載の任意の方法は、ステップが特定の順序で実施されることを要求すると解釈されることが決して意図されるものではないと理解すべきである。従って、方法クレームが、ステップが従うべき順序を実際に列挙しない場合、またはステップが特定の順序に限定されるものであることが別途特許請求の範囲もしくは明細書に具体的に記載されない場合、いかなる点においても、順序が推定されることが決して意図されるものではない。これは、ステップまたは操作フローの配置に関する論理の問題、文法的な構成または句読点から派生した明白な意味、及び明細書に記載される態様の数またはタイプを含む解釈のために可能な任意の非明示の原則にあてはまる。

本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されることに関連する方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明により、そのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、本明細書で提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる可能性があり、これは、独立して確認を必要とする可能性がある。

定義
明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。

本明細書で使用される「または」という語は、特定のリストのいずれか１つのメンバーを意味し、また、そのリストのメンバーの任意の組み合わせを含む。

範囲は、本明細書では、「約」または「ほぼ」ある特定の値から、及び／または「約」もしくは「ほぼ」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表現される場合、さらなる態様は、１つの特定値から及び／または他の特定値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」または「ほぼ」を使用することにより、特定値がさらなる態様を形成すると理解されるであろう。範囲のそれぞれの端点は、他の端点に関連して、及び他の端点とは独立して、重要であることがさらに理解されるであろう。本明細書に開示の多くの値があること、及び各値が、値自体に加えて、「約」その特定の値として本明細書に開示されることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。２つの特定の単位間の各単位も開示されることもまた理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。

本明細書で使用される場合、「任意」または「任意に」という用語は、続いて記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいこと、ならびに、記載が該事象または状況が起こる場合及び起こらない場合を含むことを意味する。

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、対象の組織または器官、細胞（対象内、対象から直接採取された、または培養液中に維持されたもしくは培養細胞株由来の細胞のいずれか）；細胞溶解物（もしくは溶解物画分）または細胞抽出物；または細胞もしくは細胞材料（例えば、ポリペプチドもしくは核酸）に由来する１つ以上の分子を含む溶液を意味し、これは、本明細書に記載のようにアッセイされる。試料はまた、細胞または細胞構成要素を含有する任意の体液または排泄物（例えば、限定されないが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁）であってよい。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒト、を指す。従って、開示された方法の主題は、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類などの脊椎動物であり得る。「対象」という用語はまた、家庭動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ミバエなど）を含む。一態様では、対象は、哺乳動物である。別の態様では、対象は、ヒトである。用語は、特定の年齢または性別を表さない。従って、男性または女性に関わらず、成人、小児、青年、及び新生児対象、ならびに胎児が、網羅されることが意図される。

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、疾患または障害に罹患している対象を指す。「患者」という用語は、ヒト及び獣医学的対象を含む。開示の方法の一部の態様では、「患者」は、例えば、投与ステップの前に、がんの処置の必要性があると診断されている。

本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「からなる」及び「から本質的になる」という態様を含み得る。

「ベクター」または「構築物」という用語は、ベクター配列が連結されている別の核酸を細胞に輸送することが可能な核酸配列を指す。「発現ベクター」という用語は、細胞による発現に適する形態の（例えば、転写調節エレメントに連結されている）遺伝子構築物を含有する任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、またはファージ染色体）を含む。プラスミドが一般に使用されるベクター形態であるので、「プラスミド」及び「ベクター」は、互換的に使用される。さらに、本発明は、同等の機能を果たす他のベクターを含むことが意図される。

「発現ベクター」という用語は、本明細書では、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことが可能なベクターを指す。組み換えＤＮＡ手法で有用な一般的な発現ベクターは多くの場合、プラスミドの形態をとる。組み換え発現ベクターは、宿主細胞における酸の発現に適する形態で本明細書に開示の核酸を含み得る。換言すれば、組み換え発現ベクターは、１つ以上の制御エレメントまたはプロモーターを含み得、これは、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている発現に使用される宿主細胞に基づいて選択することができる。

「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語は、それが導入される細胞に対して部分的または完全に異種、すなわち、外来である核酸配列（例えば、治療遺伝子）を意味し得る。

「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語はまた、それが導入される細胞の内因性遺伝子に部分的または完全に相同であるが、ゲノムを変化させるような方法で、細胞のゲノムに挿入されるように設計される（例えば、それが、天然遺伝子とは異なる位置に挿入されるか、またはその挿入が「ノックアウト」をもたらす）核酸配列を意味し得る。例えば、目的の配列は、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡであり得る。

「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語はまた、それが導入される細胞の内因性遺伝子に部分的または完全に相補的である核酸配列を意味し得る。

「目的の配列」または「目的の遺伝子」はまた、選択された核酸の最適な発現に必要であり得る１つ以上の転写制御配列及びイントロンなどの他の任意の核酸を含み得る。「目的のタンパク質」は、目的の配列または目的の遺伝子から発現するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、治療用タンパク質）を意味する。

「作動可能に連結されている」という用語は、核酸と別の核酸配列との機能的関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結されている核酸配列の例である。例えば、転写調節エレメントへのＤＮＡの作動的連結は、そのようなＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始されるような、ＤＮＡ及びプロモーター間の物理的及び機能的関係を指す。

「抑制する」、「抑制すること」、及び「抑制」は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターを低下または減少させることを意味する。これは、活性、応答、状態、または疾患の完全な除去を含み得るが、これらに限定されない。これはまた、例えば、天然または対照レベルと比較して、活性、応答、状態、または疾患の１０％の抑制または低減を含んでもよい。従って、一部の態様では、抑制または低減は、天然または対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の低減であり得る。一部の態様では、抑制または低減は、天然または対照レベルと比較して、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、または９０～１００％である。一部の態様では、抑制または低減は、天然または対照レベルと比較して、０～２５、２５～５０、５０～７５、または７５～１００％である。

本明細書で使用される「調節する」、「調節すること」、及び「調節」は、活性または機能または数の変化を意味する。変化は、活性、機能、または数の増加または減少、増強または抑制であってよい。

「変更する」または「調節する」という用語は、例えば、細胞内のヌクレオチド配列の発現に関して、本明細書では互換的に使用することができ、本明細書に記載の方法を適用した後の細胞内のヌクレオチド配列の発現レベルが、方法を適用する前の細胞での発現とは異なることを意味する。

「促進する」、「促進」、及び「促進すること」は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターの増加を指す。これは、活性、反応、状態、または疾患の開始を含み得るが、これらに限定されない。これは、例えば、天然または対照レベルと比較して、活性、応答、状態、または疾患の１０％の増加も含んでもよい。従って、一部の態様では、増加または促進は、天然または対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、もしくはそれ以上、またはその間の任意の量の促進であり得る。一部の態様では、増加または促進は、天然または対照レベルと比較して、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、または９０～１００％である。一部の態様では、増加または促進は、天然または対照レベルと比較して、０～２５、２５～５０、５０～７５、もしくは７５～１００％、またはそれ以上、例えば、２００、３００、５００、もしくは１０００％多い。一部の態様では、増加または促進は、天然または対照レベルと比較して、比較して１００％を超える、例えば、天然または対照レベルと比較して、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００％またはそれ以上であり得る。

本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲシステム」及び「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」は、Ｃａｓ遺伝子、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈で「スペーサー」とも呼ばれる；例えば、ガイドＲＮＡもしくはｇＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の他の配列及び転写物をコードする配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現またはその活性を導くことに関与する転写物及び他のエレメントを指す。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムのうちの１つ以上のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓなどの内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメント（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈ではプロトスペーサーとも呼ばれる）を特徴とする。

本明細書で使用される場合、「疾患」または「障害」または「状態」という用語は、体もしくは器官の一部の状態の任意の変化、機能の実施を中断もしくは妨害すること、及び／または罹患した者もしくは人と接触した者に不快感、機能不全、苦痛、さらには死などの症状を引き起こすこと、に関して互換的に使用される。疾患または障害または状態はまた、ジステンパー、不調、慢性病、病気、障害、病気、疾病、不健康、または影響に関する可能性がある。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」、「プロモーターエレメント」、または「プロモーター配列」という用語は、同義語であり、本明細書で使用される場合、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている場合、ｍＲＮＡへの目的のヌクレオチド配列の転写を調節すること可能であるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは通常、必ずしもではないが、目的のヌクレオチド配列（これのｍＲＮＡへの転写をプロモーターが調節する）の５’（すなわち、上流）に位置し（例えば、構造遺伝子の転写開始部位に近位し）、転写開始のためのＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。

好適なプロモーターは、発現が生じるべき宿主細胞の遺伝子から、またはこの宿主細胞の病原体（例えば、組織プロモーターまたはウイルスのような病原体）から誘導することができる。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘導剤に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写速度は、誘導剤により制御されない。また、プロモーターは、葉、根または分裂組織などの特定の組織型（複数可）の関連するコード領域を転写する際にのみ活性であるように、組織特異的または組織に好ましい方法で制御されてもよい。プロモーターに適用する「組織特異的」という用語は、異なる型の組織に、同じ目的のヌクレオチド配列または遺伝子の発現が比較的存在しない場合に、特定型の組織に目的のヌクレオチド配列または遺伝子の選択的発現を導くことが可能であるプロモーターを指す。

上述の発明が、理解を明確にするために実例または例示として、少し詳しく説明されているが、特定の変更及び修正は、添付の特許請求の範囲内で実施されてもよい。

本明細書に記載される全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する当業者らのレベルを示す。全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

血小板は、体全体に循環して、ホメオスタシス、創傷治癒、血管新生、炎症、及び血栓形成に重要な役割を果たす無核血液細胞である。血小板は、前駆細胞である巨核球（ＭＫ）の細胞質から形成される大量のタンパク質を貯蔵する分泌顆粒で満たされる。血小板が活性化された場合、生体活性タンパク質（例えば、生体分子）が、無数の生理学的プロセスに関与する顆粒から放出される。血小板先先天性貯蔵、輸送、及び放出容量を利用することにより、それらは、疾患または障害、例えば、代謝障害用の生体分子の開発のための送達ビヒクルであるように設計することができる。本明細書に開示される場合、一部の態様では、血小板は、例えば、限定されないが、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を含む種々の障害を有する患者のための治療的処置として役立つ適切な代謝機能に必要な酵素の分泌を調節するように設計することができる。

リソソーム蓄積症は、リソソーム機能の複数の態様の欠陥、最も一般には、高分子の分解に関与する酵素であるリソソーム加水分解酵素の変異により引き起こされる。これらの変異は、細胞高分子の分解に関与する欠陥のある酵素をもたらす。細胞代謝中に生成された高分子は、排泄または再利用のいずれのために分解されなければならず；そうでなければ、この代謝廃棄物が、細胞の貯蔵能力を圧倒し、細胞の変形、不活化、及び破壊がもたらされる。細胞破壊がより広範囲になるにつれて、組織及び最終的な臓器不全が生じる。実験は、疾患細胞が隣接細胞により分泌される外因性酵素を取り込むことが可能であること、及び残留酵素活性の小さな増加が、リソソーム機能を回復に重大な影響を与え得ることを示している。この認識により、不足する酵素を産生する能力を有する細胞集団を含む骨髄移植に加えて、加水分解酵素の組み換え産生及びそれらの血液への注入を含むＬＳＤの現在の処置がもたらされている。しかし、タンパク質の不安定性が、主要な標的器官に治療用量で到達することを妨げ、骨髄移植と関連するリスク（移植片対宿主）が、臨床有効性を抑える。本明細書に開示されるように、遺伝子ツール及び回路は、細胞を構築及び再設計して、例えば、リソソーム酵素を血小板にパッケージングするために使用することができる特定のタスクを実施するために、使用することができる。

また、特定の薬物への結合時及び／または組織特異的ペプチドへの結合時に、酵素（または生体分子または治療薬）の放出を誘発するように血小板を活性化することが可能な受容体を設計することを含む方法が本明細書に開示される。従って、血小板は、全身送達デバイスまたは標的とされる組織／器官特異的送達デバイスのいずれかとして操作することができる。本明細書に開示の方法及び療法は、患者の処置に、柔軟性、精度、及び個人化を提供し得る。本明細書に記載の遺伝的ツール及び設計原理が含まれる本明細書に開示の方法は、効率的及び効果的な単独処置用の、ならびに、既存療法を補完する他の任意の疾患／障害と組み合わせることができる一般的なプラットフォームとして機能し得る。

疾患、障害、または状態を処置する送達システムとして血小板を使用する方法も本明細書に開示される。また、代謝性疾患、例えば、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に血小板系治療用細胞処置を使用する方法が本明細書に開示される。本明細書言及されるように、ＬＳＤは、リソソーム酵素の欠乏の結果としての、体の細胞内の種々の毒性物質の異常な蓄積を特徴とする遺伝性代謝性疾患である^1~3。これらの機能不全を起こす酵素は、約５０の異なる遺伝性疾患の群を表し、個々にまれではあるが、それらを合わせた有病率は、出生８，０００人毎に１人と推定される。ＬＳＤは、骨格、脳、皮膚、心臓、及び中枢神経系を含む体の様々な部分に影響を与える。ＬＳＤ患者は、平均余命が限られる。これらの代謝性疾患の満たされていない重要な臨床的ニーズは、リソソーム酵素の持続的送達及び必要な器官に送達されるべきこれらの酵素の治療レベルのための効果的な方法である。

さらに、疾患または障害（例えば、ＬＳＤ）を処置するための送達システムとして機能する血小板を作製する操作幹細胞を使用する方法が本明細書で開示される。血小板は、前駆細胞である巨核球（ＭＫ）の細胞質から形成される大量のタンパク質を貯蔵する分泌顆粒で満たされる^4、5。血小板がＭＫの伸長から作製された細胞質ブレブであるので、ＭＫの細胞質に存在するタンパク質で満たされており、核を含有しない。それ故、前駆幹細胞に対して行われる遺伝子操作は、血小板にもはや存在しないであろう。このことにより、開示の方法が、代謝障害の処置のための実用的な治療オプションになる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血小板の分化及び単離を改善するための遺伝的に相互作用する細胞培養システムで使用することができる幹細胞の運命決定を精査するために作成されている遺伝子回路が本明細書に開示される。治療的ペイロードを放出する場合の調節を維持し得る送達システムとして機能するように血小板をリプログラムするこれらの技術を開発、改善、及び統合する方法が本明細書に開示される。一部の態様では、ペイロードは、治療薬であり得る。一部の態様では、ペイロードは、１つ以上の内因性生体分子であり得る。

骨髄では、血小板は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の特化された血液細胞及び免疫細胞への分化である造血のプロセスから誘導される（図２）¹¹。血小板は、９～１０日の平均寿命と体全体に多数に循環し、この大規模な細胞集団の供給源は、ＭＫ由来である。一般に、血小板は、休止の不活性状態であり、活性化される前に誘発を必要とする。活性化時に、血小板は、細胞内顆粒から３００を超える活性生体分子を分泌する。従って、血小板は、様々なペイロードのｉｎ ｖｉｖｏ送達の魅力的な候補となる多くの特徴を有する：１）体内の循環範囲が広い、２）無核細胞である、３）生体適合性がある、４）ヒトにおける血小板の平均寿命が約１０日である、５）活性化後、血小板のタンパク質顆粒が、分泌小胞として機能して細胞外液に構成要素を放出する。

疾患処置のための送達システムとして血小板を使用する方法が本明細書に開示される。また、例えば、リソソーム蓄積症を含む代謝性疾患に対する血小板系治療用細胞処置が本明細書に開示される。ＬＳＤは、リソソーム酵素の欠乏の結果としての、体の細胞内の種々の毒性物質の異常な蓄積を特徴とする遺伝性代謝性疾患である^1~3（図１Ａ）。これらの機能不全を起こす酵素は、約５０の異なる遺伝性疾患の群を表し、個々にまれではあるが、それらを合わせた有病率は、出生８，０００人毎に１人と推定される。ＬＳＤは、骨格、脳、皮膚、心臓、及び中枢神経系を含む体の様々な部分に影響を与える。ＬＳＤ患者は、平均余命が限られる。

ＬＳＤを処置するための現在の標準治療は、酵素補充療法（ＥＲＴ）である⁷。この処置では、酵素は、組み換えにより作製され、それらの投与は通常、最大３時間かかる可能性のある毎週の注入により行われる。但し、一部のＥＲＴのより頻繁な投与がみられている⁷。しかし、外部から注入された酵素の急速な分解、及び疾患を修正する治療的用量で主要な標的器官に到達できないことに起因して、これらの治療の有効性は乏しい。それ故、血流に直接活性酵素を注入する限界に対処する療法の開発に対する満たされていない実質的な臨床的ニーズが存在する。

血小板を産生する幹細胞分化を導くために使用することができる遺伝子ネットワークの開発、ならびに、血小板が治療的ペイロードを放出する時及び場所を調節し、それにより、血小板の空間的及び時間的活性をリプログラミングする遺伝子ツールを開発するために使用された計算モデリング及びコンピューターシミュレーションが本明細書に記載される。一部の態様では、血小板は、生物活性タンパク質を搭載することができる。一部の態様では、血小板は、内因性生物活性タンパク質を含む。最初の実験がマウスモデルを使用したが、本明細書に記載の方法は、ヒトを含む任意の哺乳動物系で使用することができる送達系として血小板をリプログラムするために使用することができる。マウス及びヒト血小板の生物学の機序の一部が異なるが、マウス細胞でこの技術を確立すると、これらの違いを説明する一部の調整と共に、これらの技術をヒト細胞（ｉＰＳ細胞など）に適用することが可能になるであろう。

合成生物学は、研究ツールとして使用することができる。合成生物学の新しい分野は、遺伝子制御システムの刺激的なツールボックスを生じており、基礎研究にツールを適用するために、及び治療用途のために哺乳動物細胞内で制御及び特定の機能を実行する新たな遺伝子回路を構築するために使用することができる。細胞シグナル伝達ネットワークの複雑さは、より単純な部分またはモジュールのサブセットからなる遺伝子ネットワークを考慮することにより簡略化することができる。この単純化は、合成生物学の基礎であり、操作パラダイムが、細胞機能を理解または調節するための予測可能で強力なシステムを生成するための合理的及び体系的な方法で適用される^15、16。最終的に、このアプローチは、予測可能な方法で実施するように細胞をリプログラミングする必要がある^17、18。この目的に向けて、遺伝子回路は、細胞が、記憶¹⁹及び数学的計算法²⁰から、がん細胞同定²¹、Ｔ細胞集団²²の調節、及び微小環境に関する報告²³のような高次細胞機能に及ぶＢｏｏｌｅａｎ論理機能を実施すること可能にするＤＮＡ及びＲＮＡから構築されている。これらの機能の根底にある遺伝子操作回路は、遺伝的スイッチ、発振器、デジタル論理ゲート、及び細胞カウンターを含み、動的及び予測可能な方法で遺伝子発現を制御するように設計されている^24~26。本明細書に記載されるように、合成生物学ツールは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ設定で血小板産生を増強するために、ＨＳＣ増殖及びＭＫへの分化を制御する内因性及び外因性機序を模倣及び制御するために使用することができる。

組成物
遺伝子回路。遺伝子回路が本明細書に開示される。１つ以上の遺伝子回路を含む核酸構築物が本明細書に開示される。本明細書に開示の遺伝子回路の任意の組み合わせは、単一の核酸構築物に存在し得る。本明細書に開示の遺伝子回路のいずれも、「第１の遺伝子回路」、「第２の遺伝子回路」、または「第３の遺伝子回路」として説明することができる。

一部の態様では、遺伝子回路は、改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含み得る。一部の態様では、遺伝子回路は、改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーター；及び目的の遺伝子を含み得る。

一部の態様では、遺伝子回路は、１つ以上の巨核球分化遺伝子を含み得る。一部の態様では、遺伝子回路は、１つ以上の巨核球分化遺伝子、及び目的の遺伝子を含み得る。一部の態様では、遺伝子回路は、もう１つの巨核球分化遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターを含み得る。一部の態様では、遺伝子回路は、もう１つの巨核球分化遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター、及び目的の遺伝子を含み得る。

一部の態様では、遺伝子回路は、目的の遺伝子を含み得る。

改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む第１の遺伝子回路を含む核酸構築物が本明細書に開示される。一部の態様では、組織特異的プロモーターは、巨核球特異的プロモーターであり得る。一部の態様では、巨核球特異的プロモーターは、巨核球が成熟する（すなわち、活性化する）につれて、巨核球の特定の発達段階に特異的であるプロモーターであり得る。一部の態様では、巨核球特異的プロモーターは、ヒト巨核球プロモーターであり得る。一部の態様では、巨核球特異的プロモーターは、ＣＸＣＬ４、ＧＰＩＩｂ、またはＰＴＰＲＣであり得る。血小板第４因子（ＰＦ４）としても既知のＣＸＣＬ４遺伝子（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド４は、血小板凝集中に活性化血小板のアルファ顆粒から放出される小さなサイトカインである。ＣＸＣＬ４は、ヘパリン様分子の効果を緩和することにより血液凝固を促進する。ＧＰＩＩｂ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩａ複合体の糖タンパク質ＩＩｂ、ＣＤ４１としても既知）は、フィブリノーゲン及びｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子として機能する血小板の表面にみられるインテグリン複合体の一部である。ＧＰＩＩｂは、血小板の活性化に役立ち、正常な血小板凝集及び内皮接着に重要である。ＰＴＰＲＣ（プロテインチロシンホスファターゼ、ＣＤ４５としても既知の受容体タイプＣ、または白血球共通抗原）は、様々な細胞機能に関与するＩ型膜貫通型タンパク質である。一部の態様では、プロモーターは、制御可能であり得る。一部の態様では、プロモーターは、構成的に活性であり得る。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、制御エレメント、プロモーター、プロモーターエンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び発現を調節することが可能な他のエレメント（例えば、限定されないが、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列を含む転写終結シグナル）を指す。プロモーターは、構成的発現を導き得る。プロモーターはまた、限定されないが、細胞周期依存性または発生段階依存性を含む時間依存的方法で発現を導き得る。プロモーターの例としては、ＷＰＲＥ、ＣＭＶエンハンサー、及びＳＶ４０エンハンサーが挙げられる。特定の遺伝子特異的プロモーターを使用することができる。そのようなプロモーターは、細胞特異的発現または特定の経路に結びついた発現を可能にする。哺乳動物細胞で活性のある任意のプロモーターを使用することができる。一部の態様では、プロモーターは、限定されないが、Ｔｅｔ－ｏｎ及びＴｅｔ－ｏｆｆシステムを含む誘導性プロモーターである。そのような誘導性プロモーターは、所望の発現のタイミングを調節するために使用することができる。一部の態様では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン誘導性システム（ｔｅｔ）、熱ショックプロモーター、及びＩＰＴＧ活性化プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、プロモーターは、双方向性である。

プロモーター及び／またはエンハンサーは、それらの機能を誘発する光または特定の化学的事象のいずれかにより特異的に活性化することができる。システムは、テトラサイクリン及びデキサメタゾンなどの試薬で制御することができる。

一部の態様では、本明細書に開示の遺伝子回路は、例えば、限定されないが、エンハンサー、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、及びリプレッサー配列；構成的プロモーター、誘導性プロモーター；組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、またはそれらの多様体を含むプロモーターを含み得る。組織特異的プロモーターの例としては、アルブミン、リンパ球特異的プロモーター、Ｔ細胞プロモーター、ニューロフィラメントプロモーター、膵臓特異的プロモーター、ミルクホエイプロモーター、ｈｏｘプロモーター、ａ－フェトタンパク質プロモーター、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子プロモーター、ＦＡＢプロモーター、インスリン遺伝子プロモーター、トランスフィレチン、アルファ．１－アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１型（ＰＡＩ－１）、アポリポタンパク質ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、ＧＦＡＰプロモーター、ＯＰＳＩＮプロモーター、ＮＳＥ、Ｈｅｒ２、ｅｒｂ２、及びそれらのフラグメント、ならびにその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。他のプロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；及びマウス乳癌ウイルスの長い末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））ならびに他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーター、ならびにそれらの多様体が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書では「改変受容体」または「ＤＲＥＡＤＤ」と呼ばれる、人工または外因性アゴニストでのみ活性化されるように改変することができる受容体が本明細書に開示される。デザイナー薬物で排他的に活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）と呼ばれる技術を使用して、このように改変された受容体が当業者に既知である。操作巨核球及び／または操作血小板を調製するために、ＤＲＥＡＤＤ技術を組み合わせて巨核球及び／または血小板を操作することが本明細書に記載される。受容体は、内因性リガンドに対して感受性がないようにするが、通常は、効果がない物質に対して感受性があるように変異させることができる。当業者は、既知の方法を使用して、そのような改変受容体を提供または設計し、本開示を考慮して、それらを本明細書に開示の組成物及び方法に適用し得る。「改変受容体」及び「ＤＲＥＡＤＤ」という用語は、互換的に使用することができる。改変受容体（例えば、ＧＰＣＲ、ＰＡＲ）は、（野生型受容体（例えば、ＧＰＣＲ、ＰＡＲ）による選択されたリガンドの結合と比較して）改変受容体の選択された天然（例えば、内因性）リガンドに対する結合親和性の減少を有し得るが、通常は、合成の、外因性リガンド（例えば、ペプチドまたは小分子）に対して正常の、ほぼ正常の、または、好ましくは、増強された結合親和性を有する。従って、改変受容体発現細胞の改変受容体媒介性活性は、天然のリガンドの存在下、ｉｎ ｖｉｖｏで有意な程度には生じないが、外部から導入されたリガンド（例えば、アゴニスト）に曝露時に、有意に応答する。例えば、改変受容体は、天然リガンドと比較して外因性リガンドで上方に活性化することができる（例えば、同様の濃度で選択された天然リガンドまたは内因性リガンドに結合することよりも、リガンドの結合より有意な程度に活性化することができる）。

哺乳動物宿主に対して内因性である生体分子を意味する、天然ＧＰＣＲの「天然リガンド」及び「天然に存在するリガンド」及び「内因性リガンド」は、本明細書において互換的に使用することができ、生体分子は、天然ＧＰＣＲに結合して、Ｇタンパク質共役細胞の応答を誘発する。例は、トロンビンである。

Ｇタンパク質共役受容体または改変Ｇタンパク質共役受容体または改変ＰＡＲ（すなわち、ＤＲＥＡＤＤ）の膜貫通型ドメイン内に結合して、受容体の活性化及びＧタンパク質の所望のファミリーの付随する活性化を促進し得る天然の手段または化学的手段により外部で作製される任意の化合物を意味する「合成小分子」、「合成小分子リガンド」、「合成リガンド」、「合成アゴニスト」、「外因性アゴニスト」、「外因性リガンド」などは、本明細書では、互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、受容体（例えば、Ｇタンパク質共役受容体または改変受容体）及びリガンド（例えば、天然リガンド（例えば、ペプチドリガンド）または合成リガンド（例えば、合成小分子リガンド））間の物理的相互作用を意味する「結合」という用語は、「受容体－リガンド結合」または「リガンド結合」という用語と互換的に使用することができる。リガンド結合は、当該技術分野で既知の様々な方法（例えば、放射性標識リガンドとの会合の検出）により測定することができる。

一部の態様では、改変受容体は、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であり得る。一部の態様では、改変ＧＰＣＲは、Ｇｑ、Ｇｉ、Ｇｓ、またはＧ₁₂／Ｇ₁₃受容体であり得る。

本明細書で使用される「Ｇタンパク質共役受容体」は、天然リガンドの結合及び受容体の活性化時に、細胞応答をもたらすＧタンパク質媒介性シグナル（複数可）を変換する受容体を指す。Ｇタンパク質共役受容体は、進化的に関連するタンパク質の大きなファミリーを形成する。Ｇタンパク質共役受容体ファミリーのメンバーであるタンパク質は一般に、７つの推定上の膜貫通型ドメインからなる。Ｇタンパク質共役受容体は、当該技術分野では、「７回膜貫通型セグメント（７ＴＭ）受容体」及び「ヘプタヘリカル受容体」としても既知であった。ＧＰＣＲは、細胞外の分子を検出し、内部シグナル伝達経路、最終的には、細胞応答を活性化する。ＧＰＣＲは、ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）との複合体と相互作用し、それにより、イオンチャネルを含む多種多様の細胞内シグナル伝達経路を制御する。例えば、リガンドは、ＧＰＣＲに結合する場合、ＧＰＣＲの立体構造変化を引き起こし、これにより、リガンドがグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）として作用することが可能になる。次に、ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質に結合しているＧＤＰをＧＴＰと交換することにより、関連するＧタンパク質を活性化し得る。次に、Ｇタンパク質のαサブユニットは、結合しているＧＴＰと共に、さらにαサブユニットのタイプ（Ｇαｓ、Ｇαｉ／ｏ、Ｇαｑ／１１、Ｇα１２／１３）に直接応じて、細胞内シグナル伝達タンパク質または標的機能タンパク質に影響を与えるために、β及びγサブユニットから解離し得る。本明細書で使用される場合、「Ｇタンパク質共役細胞応答」または「ＧＰＣＲ細胞応答」は、ＧＰＣＲによるリガンド結合時に生じる細胞応答またはシグナル伝達経路を意味する。本開示に関連するそのようなＧＰＣＲ細胞応答は、１つ以上の血小板の活性化を誘発し、次に、１つ以上の生体分子及び／または治療薬の放出を誘導するものである。それが抑制性応答であるか、興奮性応答であるかに関わらず、反応のタイプは、放出される生体分子（複数可）及び／または治療薬、ならびに活性化されたＧＰＣＲのタイプに依存するであろう。

本明細書で使用される「シグナル伝達」という用語は、リガンド結合の結果としての（例えば、改変受容体への合成または外因性リガンド結合の結果としての）生化学的または生理学的応答の生成を意味し得る。

Ｇタンパク質媒介性シグナル伝達、及びＧタンパク質媒介性シグナル伝達と関連する生理学的または生化学的応答を誘発する方法で、リガンド（例えば、天然または合成リガンド）が受容体に結合することを意味する「受容体活性化」、「ＤＲＥＡＤＤ活性化」、「改変受容体活性化」、「ＧＰＣＲ活性化」、及び「ＰＡＲ活性化」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。活性化は、Ｇタンパク質関連シグナルと関連する生物学的シグナルを測定することにより測定することができる。

標的細胞（例えば、操作血小板）における特定のＧタンパク質媒介性生理学的応答のＤＲＥＡＤＤ媒介性活性化または受容体媒介性活性化を意味する「標的とされる細胞活性化」及び「標的細胞の活性化」は、本明細書では、互換的に使用することができ、ＤＲＥＡＤＤ媒介性活性化または受容体媒介性活性化は、内因性リガンド分子がＤＲＥＡＤＤまたは改変受容体に結合することにより生じる。本明細書で使用される場合、細胞活性化は、１つ以上の生体分子及び／または治療薬の放出を誘導することを含み得、それにより、これが、抑制性応答または興奮性応答を誘発し得る。

本明細書に記載の組成物及び方法は、真核細胞（例えば、血小板）のＧタンパク質媒介性細胞応答に影響を与えるか、または誘発し得る。血小板は、改変ＧＰＣＲをコードすることが可能な配列を含む遺伝子回路を使用して操作されている細胞である。

一部の態様では、改変受容体は、改変プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）であり得る。一部の態様では、改変ＰＡＲは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４であり得る。ＰＡＲは、細胞外ドメインの一部の切断により活性化される関連Ｇタンパク質共役受容体のサブファミリーである。ＰＡＲＳは、血小板で高度に発現する。ほとんどのＰＡＲファミリーは、Ｇタンパク質ｉ（ｃＡＭＰ抑制性）、１２／１３（Ｒｈｏ及びＲａｓ活性化）、ならびにｑ（カルシウムシグナル伝達）の作用を介して作用して、細胞作用を引き起こす。

１つ以上の巨核球分化遺伝子を含む遺伝子回路が本明細書に開示される。１つ以上の巨核球分化遺伝子及びプロモーターを含む遺伝子回路も本明細書に開示される。さらに、改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む第１の遺伝子回路を含み；さらに第２の遺伝子回路（第２の遺伝子回路は、１つ以上の巨核球分化遺伝子を含む）を含む核酸構築物が本明細書で開示される。一部の態様では、第１の遺伝子回路の組織特異的プロモーターは、制御可能であり得る。一部の態様では、第２の遺伝子回路は、プロモーターを含み得る。一部の態様では、第２の遺伝子回路は、プロモーターを含み、プロモーターは、もう１つの巨核球分化遺伝子に作動可能に連結されている。一部の態様では、第２の遺伝子回路のプロモーターは、制御可能であり得る。一部の態様では、第２の遺伝子回路のプロモーターは、構成的に活性であり得る。一部の態様では、第１の遺伝子回路の組織特異的プロモーターは、１つ以上の巨核球分化遺伝子に作動可能に連結することができる。一部の態様では、１つ以上の巨核球分化遺伝子は、ＨｏｘＢ４、ＧＡＴＡ－１、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＢＣＬ－ＸＬ、ＰＬＫ－１、またはそれらの組み合わせであり得る。一部の態様では、１つ以上の巨核球分化遺伝子は、ＨｏｘＢ４またはＧＡＴＡ－１、または造血幹細胞の巨核球への分化を導き得る他の任意の分化遺伝子であり得る。一部の態様では、１つ以上の巨核球分化遺伝子は、ＨｏｘＢ４及びＧＡＴＡ－１であり得る。一部の態様では、ＧＡＴＡ－１は、オーキシンタンパク質分解タグを含み得る。一部の態様では、１つ以上の巨核球分化遺伝子は、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＢＣＬ－ＸＬであり得る。一部の態様では、１つ以上の巨核球分化遺伝子は、ＰＬＫ－１及び／または多能性幹細胞の巨核球への分化を導き得る他の任意の分化遺伝子であり得る。分化遺伝子（複数可）は、特化されていない細胞が、より特化された細胞型になるプロセスを促進する遺伝子であり得る。遺伝子発現は、細胞分化を制御し得る。オン（発現）またはオフ（抑制）された遺伝子または遺伝子の組み合わせは、細胞の形態及び機能を指示し得る。

一部の態様では、本明細書に開示の第１の遺伝子回路はさらに、目的の遺伝子を含み得る。一部の態様では、本明細書に開示の第２の遺伝子回路はさらに、目的の遺伝子を含み得る。一部の態様では、目的の遺伝子は、治療薬であり得る。治療薬は、酵素、ホルモン、ポリペプチド、抗体、薬物、化学療法薬、毒素、またはオリゴヌクレオチドであり得る。

目的の遺伝子を含む遺伝子回路が本明細書に開示される。また、第３の遺伝子回路が本明細書に開示され、第３の遺伝子回路が目的の遺伝子を含む。さらに、改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む第１の遺伝子回路を含み；さらに、第２の遺伝子回路（第２の遺伝子回路が１つ以上の巨核球分化遺伝子を含む）を含み；さらに、第３の遺伝子回路（第３の遺伝子回路が目的の遺伝子を含む）を含む核酸構築物が本明細書で開示される。一部の態様では、第２の遺伝子回路は、プロモーターを含み、プロモーターは、もう１つの巨核球分化遺伝子に作動可能に連結されている。一部の態様では、第３の遺伝子回路は、目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターを含む。一部の態様では、第３の遺伝子回路のプロモーターは、制御可能であり得る。一部の態様では、目的の遺伝子は、治療薬であり得る。治療薬は、酵素、ホルモン、ポリペプチド、抗体、薬物、化学療法薬、毒素、またはオリゴヌクレオチドであり得る。

一部の態様では、本明細書に記載の遺伝子回路のいずれかはさらに、１つ以上の組み換え部位を含み得る。一部の態様では、１つ以上の組み換え部位は、ｌｏｘＰ、ａｔｔＰ、Ｂｘｂ１、またはそれらの組み合わせであり得る。一部の態様では、ａｔｔＰ、ｌｏｘＰ、またはＢｘｂ１部位は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座に挿入することができる。一部の態様では、本明細書に記載の遺伝子回路のいずれかはさらに、１つ以上のリプレッサータンパク質を含み得る。一部の態様では、１つ以上のリプレッサータンパク質は、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、ＱＳ、またはそれらの組み合わせであり得る。一部の態様では、１つ以上のリプレッサータンパク質は、制御可能であり得る。一部の態様では、本明細書に記載の遺伝子回路のいずれかにおけるプロモーターのいずれかは、１つ以上のオペレーター部位を含み得る。一部の態様では、本明細書に開示の遺伝子回路のいずれにおいても、本明細書に記載の遺伝子の１つ以上は、制御可能、構成的活性、またはそれらの組み合わせであり得る。一部の態様では、本明細書に開示の遺伝子回路のいずれかはさらに、１つ以上のリコンビナーゼを含み得る。一部の態様では、１つ以上のリコンビナーゼは、Ｃｒｅ、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ、またはＢｘｂ１であり得る。一部の態様では、１つ以上のリコンビナーゼは、制御可能であり得る。

多能性幹細胞。多能性幹細胞が本明細書に開示される。本明細書に開示の核酸構築物のいずれかを含む多能性幹細胞が本明細書に開示される。本明細書に開示の遺伝子回路のいずれかを含む多能性幹細胞が本明細書に開示される。一部の態様では、多能性幹細胞は、造血前駆幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。一部の態様では、多能性幹細胞は、臍帯血または骨髄に由来する。一部の態様では、ｉＰＳＣは、血球に由来し得る。一部の態様では、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり得る。

巨核球。巨核球が本明細書に開示される。任意の発達段階における巨核球が本明細書に開示される。本明細書に記載の核酸構築物のいずれかを含む巨核球が本明細書に開示される。本明細書に記載の遺伝子構築物のいずれかを含む巨核球が本明細書に開示される。核酸構築物を含む巨核球が本明細書に開示され、核酸構築物が、改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む第１の遺伝子回路を含む。一部の態様では、組織特異的プロモーターは、巨核球特異的プロモーターであり得る。一部の態様では、巨核球特異的プロモーターは、ＣＸＣＬ４、ＧＰＩＩｂ、またはＰＴＰＲＣであり得る。一部の態様では、改変受容体は、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）または改変プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）であり得る。一部の態様では、改変ＧＰＣＲは、Ｇｑ、Ｇｉ、Ｇｓ、またはＧ₁₂／Ｇ₁₃ ＧＰＣＲであり得る。一部の態様では、改変ＰＡＲは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４であり得る。一部の態様では、本明細書に開示の巨核球はさらに、第２の遺伝子回路を含み得る。一部の態様では、第２の遺伝子回路は、１つ以上の巨核球分化遺伝子を含み得る。一部の態様では、１つ以上の巨核球分化遺伝子は、ＨｏｘＢ４、ＧＡＴＡ１、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＢＣＬ－ＸＬ、ＰＬＫ－１、またはそれらの組み合わせであり得る。一部の態様では、１つ以上の巨核球分化遺伝子は、ＨｏｘＢ４もしくはＧＡＴＡ１、または造血幹細胞の巨核球への分化を指示し得る任意の他の分化遺伝子であり得る。一部の態様では、１つ以上の巨核球分化遺伝子は、ＨｏｘＢ４及びＧＡＴＡ１であり得る。一部の態様では、１つ以上の巨核球分化遺伝子は、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＢＣＬ－ＸＬであり得る。一部の態様では、１つ以上の巨核球分化遺伝子は、ＰＬＫ－１及び／または造血幹細胞の巨核球への分化を指示し得る他の任意の分化遺伝子であり得る。一部の態様では、第１の遺伝子回路及び／または第２の遺伝子回路を含む巨核球は、追加の遺伝子回路を含み得る。一部の態様では、追加の遺伝子回路は、目的の遺伝子を含み得る。一部の態様では、追加の遺伝子回路は、第２または第３の遺伝子回路であり得る。一部の態様では、目的の遺伝子は、治療薬であり得る。治療薬は、酵素、ホルモン、ポリペプチド、抗体、薬物、化学療法薬、毒素、またはオリゴヌクレオチドであり得る。

改変受容体を含む操作巨核球もまた、本明細書で開示される。一部の態様では、改変受容体は、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）または改変プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）であり得る。一部の態様では、改変ＧＰＣＲは、Ｇｑ、Ｇｉ、Ｇｓ、またはＧ₁₂／Ｇ₁₃ ＧＰＣＲであり得る。一部の態様では、改変ＰＡＲは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４であり得る。一部の態様では、本明細書に開示の操作巨核球のいずれかはさらに、治療薬を含み得る。

血小板。血小板が本明細書に開示される。操作血小板が本明細書に開示される。改変受容体を含む操作血小板が本明細書に開示される。一部の態様では、改変受容体は、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）または改変プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）であり得る。一部の態様では、改変ＧＰＣＲは、Ｇｑ、Ｇｉ、Ｇｓ、またはＧ₁₂／Ｇ₁₃ ＧＰＣＲであり得る。一部の態様では、改変ＰＡＲは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４であり得る。一部の態様では、本明細書に開示の操作血小板のいずれかはさらに、治療薬を含み得る。

血小板または血小板集団を産生する方法
血小板または血小板集団を産生する方法が本明細書に開示される。改変受容体を含む血小板または血小板集団を産生する方法が本明細書に開示される。一部の態様では、方法は、ａ）本明細書に開示の核酸構築物のいずれかを含む多能性幹細胞を提供すること；ｂ）巨核球に多能性幹細胞を膨張させる条件下、培地中で多能性幹細胞を培養すること；及び、ｃ）巨核球の血小板への分化（血小板または血小板集団が改変受容体を含む）を含み得る。一部の態様では、多能性幹細胞は、造血前駆幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。一部の態様では、多能性幹細胞は、臍帯血または骨髄に由来し得る。一部の態様では、ｉＰＳＣは、血球に由来し得る。一部の態様では、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり得る。一部の態様では、培地は、１つ以上のモジュレーターを含み得る。一部の態様では、培地モジュレーターは、幹細胞の特定の細胞型への分化を導くために使用することができる。一部の態様では、１つ以上の培地モジュレーターは、多能性幹細胞の巨核球への分化を促進し得る。一部の態様では、１つ以上の培地モジュレーターは、巨核球の血小板への分化を促進し得る。一部の態様では、１つ以上の培地モジュレーターは、多能性幹細胞の血小板への分化を促進し得る。一部の態様では、１つ以上の培地モジュレーターは、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキササイクリン、キナ酸、またはオーキシンであり得る。一部の態様では、改変受容体は、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）または改変プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）であり得る。一部の態様では、改変ＧＰＣＲは、Ｇｑ、Ｇｉ、Ｇｓ、またはＧ₁₂／Ｇ₁₃ ＧＰＣＲであり得る。一部の態様では、改変ＰＡＲは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４であり得る。本明細書に開示の方法のいずれにおいても、血小板または血小板集団はさらに、治療薬を含む。一部の態様では、多能性幹細胞は、改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む遺伝子回路を含む核酸構築物を含み得るか、または、多能性幹細胞は、改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む第１の遺伝子回路；及び第２の遺伝子回路（第２の遺伝子回路が１つ以上の巨核球分化遺伝子を含み、第１の遺伝子回路または第２の遺伝子回路がさらに、目的の遺伝子を含む）を含む核酸構築物を含む。一部の態様では、方法はさらに、血小板または血小板集団を単離または精製することを含み得る。

赤血球及び血小板を産生する方法もまた、本明細書で開示される。方法は、以下を含み得る。方法は、ステップａ）：遺伝子操作フィーダー細胞を提供すること、を含み得る。フィーダー細胞は、１つ以上の遺伝子回路を含み得る。１つ以上の遺伝子回路は、１つ以上の目的の遺伝子、及び１つ以上のプロモーターを含み得る。方法は、ステップｂ）：遺伝子操作フェド細胞を提供すること、を含み得る。フェド細胞は、１つ以上の遺伝子回路を含み得る。１つ以上の遺伝子回路は、１つ以上の目的の遺伝子、及び１つ以上のプロモーターを含み得る。１つ以上の目的の遺伝子は、ａ）の１つ以上の目的の遺伝子とは異なり得る。方法はさらに、ステップｃ）：ａ）の遺伝子操作フィーダー細胞を、ｂ）の遺伝子操作フェド細胞と共に培養すること、を含み得る。培養ステップは、遺伝子操作フェド細胞を赤血球または血小板に分化させる条件下、培地中で行い得る。本明細書に開示されるような遺伝子操作フェド細胞のうちの１つ以上は、赤血球または血小板に分化し得る。

一部の態様では、本明細書に開示の方法のステップａ）の１つ以上の遺伝子回路は、制御可能であり得る。一部の態様では、１つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作フェド細胞における遺伝子回路の１つ以上の目的の遺伝子により制御することができる。一部の態様では、本明細書に開示の１つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作フィーダー細胞における遺伝子回路の１つ以上の目的の遺伝子で制御することができる。

一部の態様では、本明細書に開示及びステップａ）の１つ以上の遺伝子回路は、１つ以上のプロモーターで制御することができる。一部の態様では、ステップａ）の１つ以上の遺伝子回路はさらに、１つ以上のリコンビナーゼを含み得る。一部の態様では、１つ以上のリコンビナーゼは、例えば、ＣｒｅもしくはｐｈｉＣ３１インテグラーゼまたはＢｘｂ１インテグラーゼであり得る。一部の態様では、１つ以上のリコンビナーゼは、制御可能であり得る。一部の態様では、本明細書に開示のａ）の１つ以上の遺伝子回路はさらに、１つ以上の組み換え部位を含み得る。一部の態様では、１つ以上の組み換え部位は、ｌｏｘＰ、ａｔｔＰ、またはＢｘｂ１であり得る。一部の態様では、ａｔｔＰ部位は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座及び／または第１１染色体に挿入することができる。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、制御エレメント、プロモーター、プロモーターエンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び発現を調節することが可能な他のエレメント（例えば、限定されないが、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列を含む転写終結シグナル）を指す。プロモーターは、構成的発現を導き得る。プロモーターはまた、限定されないが、細胞周期依存性または発生段階依存性を含む時間依存的方法で発現を導き得る。プロモーターの例としては、ＷＰＲＥ、ＣＭＶエンハンサー、及びＳＶ４０エンハンサーが挙げられる。特定の遺伝子特異的プロモーターを使用することができる。そのようなプロモーターは、細胞特異的発現または特定の経路に結びついた発現を可能にする。哺乳動物細胞で活性のある任意のプロモーターを使用することができる。一部の態様では、プロモーターは、限定されないが、Ｔｅｔ－ｏｎ及びＴｅｔ－ｏｆｆシステムを含む誘導性プロモーターである。そのような誘導性プロモーターは、所望の発現のタイミングを調節するために使用することができる。一部の態様では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン誘導性システム（ｔｅｔ）、熱ショックプロモーター、及びＩＰＴＧ活性化プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、プロモーターは、双方向性である。

プロモーター及び／またはエンハンサーは、それらの機能を誘発する光または特定の化学的事象のいずれかにより特異的に活性化することができる。システムは、テトラサイクリン及びデキサメタゾンなどの試薬で制御することができる。

一部の態様では、本明細書に開示の遺伝子回路は、例えば、限定されないが、エンハンサー、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、及びリプレッサー配列；構成的プロモーター、誘導性プロモーター；組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、またはそれらの多様体を含むプロモーターを含み得る。組織特異的プロモーターの例としては、アルブミン、リンパ球特異的プロモーター、Ｔ細胞プロモーター、ニューロフィラメントプロモーター、膵臓特異的プロモーター、ミルクホエイプロモーター、ｈｏｘプロモーター、ａ－フェトタンパク質プロモーター、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子プロモーター、ＦＡＢプロモーター、インスリン遺伝子プロモーター、トランスフィレチン、アルファ．１－アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１型（ＰＡＩ－１）、アポリポタンパク質ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、ＧＦＡＰプロモーター、ＯＰＳＩＮプロモーター、ＮＳＥ、Ｈｅｒ２、ｅｒｂ２、及びそれらのフラグメント、ならびにその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。他のプロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；及びマウス乳癌ウイルスの長い末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））ならびに他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーター、ならびにそれらの多様体が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に開示及びステップａ）の１つ以上の遺伝子回路はさらに、１つ以上のリプレッサータンパク質を含み得る。一部の態様では、１つ以上のリプレッサータンパク質は、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、及び／またはＱＳであり得る。一部の態様では、本明細書に開示の１つ以上のリプレッサータンパク質は、制御可能であり得る。

培地はさらに、１つ以上のモジュレーターを含み得る。一部の態様では、１つ以上のモジュレーターは、本明細書に開示のａ）またはｂ）の遺伝子回路を調節（例えば、抑制または活性化）し得る。一部の態様では、本明細書に開示及びステップａ）の１つ以上の遺伝子回路は、１つ以上の培地モジュレーターで制御することができる。一部の態様では、１つ以上の培地モジュレーターは、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキササイクリン、キナ酸、またはオーキシンであり得る。

本明細書に開示の方法はまた、制御不可能であるステップａ）の１つ以上の遺伝子回路を含み得る。一部の態様では、本明細書に開示及びステップａ）の遺伝子回路の１つ以上のプロモーターを構成的に発現させることができる。一部の態様では、本明細書に開示及びステップａ）の遺伝子回路の１つ以上のプロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶ、及び／またはＵ６、ベータアクチン、及び／または伸長因子プロモーターであり得る。一部の態様では、１つ以上のプロモーターは、１つ以上のオペレーター部位（例えば、ｔｅｔ）を含み得る。そのようなオペレーター部位は、１つ以上のリプレッサータンパク質が結合することを可能にし得る。

本明細書に開示の方法はまた、ステップａ）の遺伝子回路の１つ以上の目的の遺伝子を含み得る。一部の態様では、本明細書に開示の遺伝子回路の１つ以上の目的の遺伝子は、エリスロポエチン、トロンボポエチン、及び／またはＩＬ１－αであり得る。一部の態様では、本明細書に開示及びステップａ）の遺伝子回路の１つ以上の目的の遺伝子を構成的に発現させることができる。

本明細書に開示の方法は、遺伝子操作フィーダー細胞を含み得る。一部の態様では、遺伝子操作フィーダー細胞は、胚性幹細胞またはマウス胚性幹細胞に由来し得る。一部の態様では、遺伝子操作フィーダー細胞は、骨芽細胞であり得る。一部の態様では、骨芽細胞は、ＯＰ－９間質細胞であり得る。一部の態様では、骨芽細胞は、臍帯血または骨髄に由来し得る。一部の態様では、遺伝子操作フィーダー細胞は、不死化細胞株に由来し得る。一部の態様では、遺伝子操作フィーダー細胞は、未分化の造血幹細胞（ＨＳＣ）の成長をサポートし得る。一部の態様では、遺伝子操作フィーダー細胞は、遺伝子操作されることが可能である。

本明細書に開示の方法は、非遺伝子操作フィーダー細胞を含み得る。一部の態様では、フィーダー細胞は、胚性幹細胞またはマウス胚性幹細胞に由来し得る。一部の態様では、フィーダー細胞は、骨芽細胞であり得る。一部の態様では、骨芽細胞は、ＯＰ－９間質細胞であり得る。一部の態様では、骨芽細胞は、臍帯血または骨髄に由来し得る。一部の態様では、フィーダー細胞は、不死化細胞株に由来し得る。一部の態様では、フィーダー細胞は、未分化の造血幹細胞（ＨＳＣ）の成長をサポートし得る。

本明細書に開示の方法は、様々な細胞を使用することができる。細胞の例としては、胚性幹細胞などの幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に開示の方法は、制御可能であり得る本明細書に記載のｂ）の１つ以上の遺伝子回路を含み得る。一部の態様では、ｂ）の１つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作フェド細胞において、遺伝子回路の１つ以上の目的遺伝子で制御することができる。一部の態様では、ｂ）の１つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作フィーダー細胞において、遺伝子回路の１つ以上の目的遺伝子で制御することができる。一部の態様では、ｂ）の１つ以上の遺伝子回路はさらに、１つ以上のリコンビナーゼを含み得る。一部の態様では、１つ以上のリコンビナーゼは、ＣｒｅまたはｐｈｉＣ３１インテグラーゼまたはＢｘｂ１インテグラーゼであり得る。一部の態様では、１つ以上のリコンビナーゼは、制御可能であり得る。

本明細書に開示の方法は、さらに１つ以上の組み換え部位を含む、本明細書に記載及びステップｂ）の１つ以上の遺伝子回路を含み得る。一部の態様では、１つ以上の組み換え部位は、ｌｏｘＰ、ａｔｔＰ、またはＢｘｂ１であり得る。一部の態様では、ａｔｔＰ、ｌｏｘＰ、またはＢｘｂ１部位は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座に挿入することができる。一部の態様では、１つ以上の遺伝子回路は、本明細書に開示及びステップｂ）の１つ以上のプロモーターで制御することができる。一部の態様では、本明細書に開示及びステップｂ）の１つ以上の遺伝子回路はさらに、１つ以上のリプレッサータンパク質を含み得る。一部の態様では、１つ以上のリプレッサータンパク質は、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、またはＱＳであり得る。一部の態様では、１つ以上のリプレッサータンパク質は、制御可能であり得る。

一部の態様では、本明細書に開示及びステップｂ）の１つ以上の遺伝子回路は、１つ以上の培地モジュレーターで制御することができる。一部の態様では、１つ以上のモジュレーターは、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキササイクリン、キナ酸、またはオーキシンであり得る。そのような培地モジュレーターまたは薬剤は、当該技術分野で周知である。

本明細書に開示の方法は、制御不可能であり得る本明細書に記載及びステップｂ）の１つ以上の遺伝子回路を含み得る。一部の態様では、本明細書に開示及びステップｂ）の遺伝子回路の１つ以上のプロモーターは、構成的活性であり得る。一部の態様では、ステップｂ）の遺伝子回路の１つ以上のプロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶ Ｕ６、ベータアクチン、及び／または伸長因子プロモーターであり得る。一部の態様では、１つ以上のプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、及び／またはＵ６）は、１つ以上のオペレーター部位を含み得る。一部の態様では、オペレーター部位は、リプレッサータンパク質を結合させ得る。

一部の態様では、本明細書に開示及びステップｂ）の遺伝子回路の１つ以上の目的の遺伝子は、ＨｏｘＢ４及び／またはＧＡＴＡ－１であり得る。一部の態様では、本明細書に開示及びステップｂ）の遺伝子回路の１つ以上の目的の遺伝子は、構成的に発現させることができる。一部の態様では、ＧＡＴＡ－１は、オーキシンタンパク質分解タグを含む。

一部の態様では、本明細書に記載の遺伝子操作フェド細胞は、造血前駆幹細胞であり得る。一部の態様では、造血幹細胞は、臍帯血、骨髄、ｉＰＳ細胞、またはＥＳ細胞に由来し得る。一部の態様では、遺伝子操作フェド細胞は、血小板及び赤血球の前駆細胞を産生することが可能であり得る。一部の態様では、前駆細胞は、血小板及び赤血球を産生することが可能であり得る。一部の態様では、前駆細胞は、本明細書に開示の遺伝子回路のうちの１つ以上を含み得る。一部の態様では、前駆細胞は、１つ以上の目的の遺伝子のいずれかの発現を制御し得る本明細書に開示の遺伝子回路のうちの１つ以上を含む。一部の態様では、１つ以上の目的の遺伝子は、ＨｏｘＢ４及び／またはＧＡＴＡ－１であり得る。一部の態様では、本明細書に記載の遺伝子回路はまた、１つ以上のリプレッサータンパク質（例えば、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、またはＱＳ）を含み得、１つ以上の培地モジュレーター（例えば、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキササイクリン、キナ酸、またはオーキシン）で調節することができる。

目的の遺伝子は、任意の遺伝子であり得る。それは、内因性であるか、または導入することができる。「標的」、「標的遺伝子」、及び「標的ヌクレオチド配列」という用語は、互換的に使用することができ、目的の遺伝子を指す。例えば、標的遺伝子は、既知の遺伝子であるか、または機能が不明であるが、全体のもしくは部分的なヌクレオチド配列が既知である遺伝子である。あるいは、標的遺伝子及びそのヌクレオチド配列の機能は両方とも、不明である。標的遺伝子は、真核細胞の天然遺伝子であり得るか、または、例えば、遺伝的形質転換により、真核細胞もしくは該真核細胞の親細胞に以前に導入されている異種遺伝子であり得る。異種標的遺伝子は、真核細胞のゲノムに安定して組み込むことができるか、または染色体外分子、例えば、自律的に複製する染色体外分子として、真核細胞に存在する。標的遺伝子は、複製、転写、翻訳、または標的タンパク質の発現に重要な他のプロセスを制御するポリペプチドまたはポリヌクレオチド領域をコードする領域を含むポリヌクレオチド；あるいは、標的ポリペプチドをコードする領域及び標的ポリペプチドの発現を制御する領域；あるいは５’もしくは３’ＵＴＲまたはイントロンなどの非コード領域を含むポリヌクレオチド、を含み得る。標的遺伝子は、例えば、目的の遺伝子の転写により生成されるｍＲＮＡ分子を指し得る。

本明細書に開示の遺伝子回路の設計または構築は、異種及び他の組み換え遺伝子を含む任意の遺伝子の制御を可能にするモジュール方式で実施することができる。一部の態様では、部分またはモジュールは、遺伝子アクチベーター、遺伝子リプレッサー、リコンビナーゼ、ゲノム編集、及び合成転写因子であり得る。一部の態様では、本明細書に記載の遺伝子回路は、１つ以上のモジュールを含み得る。

ベクターは、原核生物に導入することができ、増幅され、次に、増幅されたベクターは、真核細胞に導入することができる。ベクターはまた、原核生物に導入して、増幅し、真核細胞に導入することができるベクター（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅する）を産生する中間ベクターとして機能し得る。原核生物は、ベクターのコピーを増幅し、宿主細胞または宿主生物への送達のための１つ以上のタンパク質の供給源を提供するために、１つ以上の核酸を発現させるために使用することができる。原核生物におけるタンパク質の発現は多くの場合、注入または非注入タンパク質のいずれかの発現を導く構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで実施される。ベクターはまた、酵母発現ベクター（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得る。

一部の態様では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞における１つ以上の配列の発現を引き起こすことが可能である。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８及びｐＭＴ２ＰＣが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物細胞では、制御エレメントが、ベクターの発現を調節する。プロモーターの例は、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、ならびに本明細書に開示及び当該技術分野で既知の他のものから誘導される。

一部の態様では、本明細書の開示の方法は、ステップａ）またはｂ）の１つ以上の目的の遺伝子の発現を可能にするステップｃ）の条件を含み得る。一部の態様では、骨芽細胞は、マイトマイシン－Ｃに接触、曝露、または処置することができる。骨芽細胞は、幹細胞を加える前に、洗浄することができる。骨芽細胞は、マイトマイシン－Ｃを除去するために、洗浄することができる。一般に、骨芽細胞は、当業者に既知の標準的なプロトコールに従って調製することができる。例えば、骨芽細胞は、フィーダー細胞の上に追加の細胞を成長させる前または直前に、マイトマイシン－Ｃで処置することができる。

一部の態様では、本明細書に開示の方法において使用することができる培地は、１つ以上の構成要素またはモジュレーター（例えば、培地モジュレーター）を含み得る。１つ以上の構成要素またはモジュレーターは、血小板及び／または赤血球前駆幹細胞の形成をもたらし得る。一部の態様では、本明細書に記載の１つ以上の構成要素またはモジュレーターは、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキササイクリン、キナ酸、またはオーキシンであり得る。一部の態様では、前駆幹細胞は、血小板及び／または赤血球前駆細胞を産生することができる。一部の態様では、前駆幹細胞は、１つ以上の自己同定細胞表面マーカーを発現し得る。一部の態様では、前駆幹細胞は、ＧＡＴＡ－１及び／またはＨｏｘＢ４を発現し得る。一部の態様では、１つ以上の細胞表面マーカーの発現は、本明細書に開示の遺伝子回路で生じさせ得る。一部の態様では、１つ以上の細胞表面マーカーは、自己識別的であり得る。一部の態様では、１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ４１ａ、及びＣＤ４３であり得る。

一部の態様では、本明細書に記載の方法で産生される血小板及び／または赤血球は、１つ以上の細胞表面マーカーを発現し得る。一部の態様では、１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４１ａ及びＣＤ４２ｂであり得る。

一部の態様では、本明細書に開示の方法はさらに、ステップｄ）：血小板または赤血球を単離または精製することを含み得る。

処置方法
ヒト患者を処置する方法が本明細書で開示される。一部の態様では、方法は、ａ）本明細書に記載の血小板または血小板集団のうちの１つ以上をヒト患者に投与すること；及び、ｂ）ヒト患者に外因性アゴニストを投与すること、を含み得、外因性アゴニストの存在は、改変受容体を活性化する。一部の態様では、改変受容体の活性化は、本明細書に開示の血小板のいずれかからの治療薬の放出、または本明細書に開示の血小板のいずれかからの１つ以上の内因性分子の放出を誘導し得る。一部の態様では、本明細書に開示の血小板または血小板集団のいずれかは、静脈内注射または輸注を介して投与することができる。一部の態様では、本明細書に開示の１つ以上の血小板または血小板集団は、静脈内注射または輸注を介して投与することができる。一部の態様では、外因性リガンドまたはアゴニストは、頭蓋内、脊髄内、筋肉内、もしくは静脈内注射を介して、または経口で投与することができる。一部の態様では、外因性リガンドまたはアゴニストは、操作血小板上に存在する改変受容体について選択的またはこれに特異的であり得る。一部の態様では、ヒト患者は、投与ステップの前に処置を必要とすると確認されている。一部の態様では、ヒト患者は、疾患または障害を有し得る。

一部の態様では、本明細書に記載の血小板のいずれかは、任意の量で対象または患者に輸注を介して投与することができ、量は、治療応答を誘発するのに十分である。一部の態様では、血小板濃度は、少なくとも１，０００μｌ、５，０００μｌ、もしくは１０，０００μｌ、または１，０００μｌ～５，０００μｌ、５，０００μｌ～１０，０００μｌの範囲内、またはその間の任意の量であり得る。

「投与レジメン」または「サポートレジメン」は、特定の速度で決定されたモード（例えば、連続的または断続的）に従って投与される血小板または他の細胞の量及び種類を含む血小板投与のスケジュールを指し得、モードまたは速度は経時的に変動してもよい。「最適化投与レジメン」または「最適化サポートレジメン」は、意図されたレシピエントの分子属性に従って血小板を選択することにより最適化される投与またはサポートレジメンを指す。

１つ以上の細胞に治療薬または１つ以上の内因性生体分子を送達する方法も開示される。一部の態様では、方法は、１つ以上の細胞を本明細書に開示の血小板のうちの１つ以上と接触させることを含む。一部の態様では、接触ステップは、外因性アゴニストの存在下で行うことができる。一部の態様では、外因性アゴニストの存在は、改変受容体を活性化し、それにより、１つ以上の細胞に治療薬または１つ以上の内因性生体分子を放出し得る。一部の態様では、接触ステップは、頭蓋内、脊髄内、筋肉内、または静脈内注射を介するｉｎ ｖｉｖｏのものであり得る。一部の態様では、１つ以上の血小板または血小板集団は、静脈内注射または輸注を介して投与することができる。一部の態様では、１つ以上の血小板または血小板集団は、それを必要とする対象または患者に投与することができる。一部の態様では、外因性アゴニストは、それを必要とする対象または患者に投与することができる。一部の態様では、外因性アゴニストは、接触ステップの前、その間、またはその後に投与することができる。一部の態様では、外因性アゴニストは、頭蓋内、脊髄内、筋肉内、または静脈内注射を介して、または経口で投与することができる。一部の態様では、外因性リガンドまたはアゴニストは、操作血小板上に存在する改変受容体について選択的またはこれに特異的であり得る。一部の態様では、ヒト患者は、投与ステップの前に処置を必要とすると確認されている。一部の態様では、ヒト患者は、疾患または障害を有し得る。

疾患及び障害。一部の態様では、疾患は、リソソーム蓄積症であり得る。一部の態様では、疾患は、がんであり得る。一部の態様では、疾患は、糖尿病であり得る。

一部の態様では、疾患は、自己免疫疾患または障害であり得る。一部の態様では、自己免疫疾患または障害は、臓器に影響を及ぼし得る。一部の態様では、罹患した器官は、心臓、腎臓、肝臓、肺、または皮膚であり得る。一部の態様では、自己免疫疾患または障害は、腺に影響を及ぼし得る。一部の態様では、腺は、副腎、多腺、膵臓、甲状腺、１つ以上の生殖器官、または唾液腺であり得る。一部の態様では、自己免疫疾患または障害は、消化器系に影響を及ぼし得る。一部の態様では、自己免疫疾患または障害は、結合組織である血液に影響を及ぼし、全身的、及び／または多臓器、筋肉、神経系、目、耳、もしくは血管系であり得る。一部の態様では、自己免疫疾患または障害は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、Ｉ型真性糖尿病、Ｇｕｉｌｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、乾癬、Ｇｒａｖｅ病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、Ａｄｄｉｓｏｎ病、Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群、悪性貧血、セリアック病、及び血管炎であり得る。

一部の態様では、疾患は、がんであり得る。一部の態様では、がんは、原発性または続発性腫瘍であり得る。一部の態様では、がんは、転移している。一部の態様では、がんは、固形がんまたは血液がんであり得る。がんは、いかなるがんでもあり得る。一部の態様では、がんは、肛門癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、内分泌癌、食道癌、眼癌、胆嚢癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝癌、リンパ腫、メラノーマ、口腔癌または口腔咽頭癌、骨肉腫、副甲状腺癌、膵癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、外陰癌、卵巣癌、肺癌、または胃癌であり得る。

アゴニスト及び投与。外因性アゴニストの存在により活性化することができる改変受容体が本明細書で開示される。外因性アゴニスト（またはリガンド、または小分子、用語は本明細書では互換的に使用される）は、経口的または非経口的に送達する（例えば、全身投与する）ことができるものである。リガンドが、一般に、処置されるべき、または１つ以上の生体分子または治療薬の放出のために標的とされるべき体もしくは領域にはないか、あるいは、リガンドが改変受容体を活性化しない十分に低い基礎濃度で存在するという点で、リガンドは外因性である。一部の態様では、リガンドは、合成のものであり、すなわち、天然に存在しないものであり得る。一部の態様では、リガンドは、ＤＲＥＡＤＤ活性化または改変受容体活性化以外に、最小限の生物学的活性を有するか、または生物学的活性が全くないものである。

任意の小分子、一般に、ＤＲＥＡＤＤまたは改変受容体の膜貫通型ドメイン内に結合し且つＧタンパク質の所望のファミリーのＤＲＥＡＤＤ媒介性活性化または改変受容体媒介性活性化を促進し得る合成小分子は、本明細書に記載の血小板の標的とされる活性化の方法での使用に適する。通常は、２０００～６０００Ｄａの分子量を有するＧタンパク質共役受容体の天然ペプチドリガンドとは対照的に、一部の態様では、Ｇタンパク質共役受容体の小分子リガンドは一般に、１００～１０００Ｄａの分子量を有する。

本明細書に開示の方法に有用な合成小分子は、天然（例えば、組み換え細胞株から単離される）または化学的手段（例えば、有機もしくは無機化学プロセスを使用する）のいずれかにより生成される合成小分子を含む。

天然ＧＰＣＲを結合及び活性化するいくつかの合成小分子は、当該技術分野で既知であり、本明細書に開示の方法に有用であり得る。本明細書に開示の方法での使用に適する追加の合成小分子は、天然ＧＰＣＲＳまたはＤＲＥＡＤＤへの結合について候補化合物をスクリーニングすることにより同定することができる。例えば、改変受容体またはＤＲＥＡＤＤを発現（またはトランスフェクト）し且つ改変受容体またはＤＲＥＡＤＤ結合について試験されるべき化合物の様々な濃度に曝露する細胞株を使用することによる。改変受容体またはＤＲＥＡＤＤ結合は、試験化合物への曝露で検出することができるが、改変受容体もしくはＤＲＥＡＤＤに結合しない、及び／または細胞活性化を誘発しない対照化合物の存在下では検出できない。

一部の態様では、リガンドは、クロザピンの代謝産物であるクロザピン－Ｎ－オキシド（ＣＮＯ）であり得る。一部の態様では、リガンドは、ｈＭ３Ｄｑに結合するペルラピンであり得る。ｈＭ３Ｄｑ及びｈＭ４Ｄｉの結合部位が非常に類似しているので、同様に、ｈＭ４Ｄｉに結合すると予想することができる。

アゴニスト及び投薬量。疾患または障害の処置との関連で、本明細書で使用される「処置」という用語は、一般に、一部の所望の治療効果が達成されるヒト対象または患者の処置及び治療、例えば、疾患または障害の進行の抑制、に関連し得、進化の速度の低減、進行の速度の停止、疾患または障害の退行、疾患または障害の改善、及び疾患または障害の治癒を含み得る。予防手段としての処置（すなわち、予防処置、防止手段）も含まれる。

一部の態様では、外因性リガンドは、治療的有効量で送達することができる。一部の態様では、血小板、操作血小板、または血小板集団は、治療的有効量で送達することができる。

本明細書で使用される「治療的有効量」という用語は、所望の処置レジメンに従って投与される場合、合理的な利益／リスク比に見合った、一部の所望の治療効果を生成するのに有効である改変受容体または外因性リガンドの量を指す。

同様に、本明細書で使用される「予防的有効量」という用語は、所望の処置レジメンに従って投与される場合、合理的な利益／リスク比に見合った、一部の所望の予防効果を生成するのに有効である改変受容体または外因性リガンドの量を指す。本明細書で使用される「予防」は、その特定の状態、疾患、または障害を遅延させるか、軽減するか、または回避するのを助けることにより健康を維持するために、症候性の状態、疾患、または障害の検出より前に投与される手段を指す。

外因性リガンドが単独で使用（例えば、投与）することは可能であり得るが、多くの場合、例えば、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、組成物または製剤として提示することが好ましい。

一部の態様では、ＣＮＯは、非経口投与を介して投与することができる。一部の態様では、ＣＮＯは、経口投与を介して投与することができる。一部の態様では、投与されるＣＮＯの投薬量は、０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり得る。一部の態様では、投与されるＣＮＯの投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇであり得る。

本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症がなく、合理的な利益／リスク比に見合った、健全な医学的判断の範囲内で、対象（例えば、ヒト）の組織と接触した使用に適する化合物、成分、材料、組成物、剤形などに関する。各担体、希釈剤、賦形剤などもまた、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容可能」でなければならない。

一部の態様では、組成物は、単独の活性成分として、本明細書に記載のリガンド、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれらからなる医薬組成物（例えば、製剤、調製物、薬品）であり得る。

一部の態様では、開示された方法または組成物は、症候性修飾性であるか、疾患修飾性であるかに関わらず、他の療法と組み合わせることができる。

「処置」という用語は、２つ以上の処置または治療が、例えば、連続的または同時に組み合わされる、組み合わせ処置及び治療を含む。例えば、本明細書に記載の化合物を用いる処置を、１つ以上（例えば、１、２、３、４つ）の他の薬剤または療法と組み合わせることが有益であり得る。本明細書の開示に基づく同時療法の適切な例は、当業者らに既知である。通常は、同時療法は、処置される個体の診断に従い、本明細書に記載の疾患または障害の処置の際に治療効果を与え得ると考えられる当該技術分野で既知のいずれかのものであり得る。特定の組み合わせは、医師の判断であり、医師は、熟練した施術者に既知の一般的な共通の知見及び投与レジメンを使用して投薬量も選択するであろう。

薬剤（例えば、改変受容体及び外因性リガンドを含む操作血小板、ならびに１つ以上の他の薬剤）が、同時または連続的に投与されてもよく、個別の様々な投与スケジュールで及び異なる経路を介して、投与されてもよい。例えば、連続的に投与される場合、薬剤は、密集した間隔（例えば、５～１０分にわたって）またはより長い間隔（例えば、１、２、３、４時間以上の間隔、または必要な場合、さらに長い間隔）で投与することができ、正確な投薬レジメンは、治療薬（複数可）の特性に見合っている。

患者を処置する方法が本明細書に開示される。一部の態様では、患者は、血小板の輸注を必要とするものであり得る。一部の態様では、方法は、治療的有効量のｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され、任意に単離された血小板を投与することを含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され、任意に単離された血小板は、本明細書に開示の方法のいずれかにより産生させることができる。

治療薬、ペプチド、酵素、または生物活性分子（生体分子）を含む血小板を産生する方法が本明細書で開示される。一部の態様では、方法は、体内で放出されるべき、内側に治療用タンパク質を含む血小板を産生する本明細書に開示の方法のいずれかを含み得る。一部の態様では、方法は、本明細書に記載の外因性及び／または内因性制御を含み得る。一部の態様では、方法はまた、特定の薬物への結合時及び／または組織特異的ペプチドへの結合時に、例えば、酵素の放出を誘発するように血小板を活性化することが可能な受容体を含むように血小板を操作することを含み得る。

治療薬、ペプチド、酵素、または生物活性分子（生体分子）を含む血小板を産生する方法が本明細書で開示される。一部の態様では、方法は、ａ）遺伝子操作骨芽細胞を提供するステップ；ｂ）遺伝子操作造血幹細胞（ＨＳＣ）（ＨＳＣが、１つ以上の遺伝子回路を含み、１つ以上の遺伝子回路が、１つ以上の目的の遺伝子を含み、１つ以上の目的の遺伝子が、ａ）の１つ以上の目的の遺伝子とは異なる）及び１つ以上のプロモーターを提供するステップ；ｃ）遺伝子操作ＨＳＣを血小板幹細胞に分化させる条件下、培地中で、ａ）の遺伝子操作骨芽細胞を、ｂ）の遺伝子操作ＨＳＣと共に培養するステップ；ならびに、ｄ）治療薬、ペプチド、酵素、または生物活性分子を含む血小板を産生するステップ；を含み得る。一部の態様では、産生される血小板は、操作受容体または改変受容体を含み得る。一部の態様では、遺伝子操作ＨＳＣは、多能性幹細胞またはそれらの前駆幹細胞の１つに由来し得る。前駆幹細胞は、治療薬、ペプチド、酵素、または生物活性分子を産生することが可能である。前駆幹細胞は、治療薬、ペプチド、酵素、または生物活性分子を産生または分泌するために、内因的または外因的に制御することができる。方法はまた、特定の薬物への結合時及び／または組織特異的ペプチドへの結合時に、酵素の放出を誘発するように血小板を活性化することが可能な受容体を含むように血小板を操作することを含み得る。

本明細書で使用される場合、「治療薬」という用語は、化合物、タンパク質、ペプチド、小分子、抗体、遺伝子、酵素、または細胞を指す。

一部の態様では、本明細書に開示の治療用タンパク質または薬剤は、血小板への最終分化の前に、血小板前駆幹細胞の遺伝子回路から転写することができる。一部の態様では、本明細書に開示の治療用タンパク質または薬剤は、巨核球の遺伝子回路から転写することができる。これらの治療用タンパク質または薬剤は、前駆細胞の細胞質に存在し、それ故、最終的に分化した血小板の一部であり得る。治療用タンパク質または薬剤の産生は、構成的に発現するプロモーターから、及び／または誘導性遺伝子回路で、転写することができる。

一部の態様では、本明細書に開示の方法はさらに、ｅ）前駆幹細胞の血小板への分化を促進する条件下で、ステップｃ）で産生された前駆幹細胞を、培地中で再培養するステップ、を含み得る。一部の態様では、本明細書に開示の方法はさらに、ｆ）血小板を収集または単離するステップ、を含み得る。

一部の態様では、本明細書に開示の方法は、治療用細胞を産生するために実施することができる。治療用細胞は、１つ以上の治療薬、ペプチド、酵素、遺伝子、または生物活性分子を含み得る。一部の態様では、治療薬は、小分子、遺伝子、ペプチド、酵素、ワクチン、または抗菌薬であり得る。

一部の態様では、ａ）の１つ以上の遺伝子回路は、制御可能である。一部の態様では、ａ）の１つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作ＨＳＣの遺伝子回路の１つ以上の目的の遺伝子により制御することができる。一部の態様では、１つ以上の遺伝子回路は、１つ以上のプロモーターで制御することができる。一部の態様では、ａ）及びｂ）の遺伝子回路の１つ以上のプロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶ、及び／またはＵ６であり得る。一部の態様では、１つ以上のプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、及び／またはＵ６）は、オペレーター部位（例えば、ｔｅｔ）を含み得る。

一部の態様では、ａ）の１つ以上の遺伝子回路はさらに、１つ以上のリコンビナーゼを含み得る。一部の態様では、１つ以上のリコンビナーゼは、Ｃｒｅ、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ、及び／またはＢｘｂ１であり得る。一部の態様では、１つ以上のリコンビナーゼは、制御可能であり得る。一部の態様では、ａ）の１つ以上の遺伝子回路はさらに、１つ以上の組み換え部位を含み得る。一部の態様では、１つ以上の組み換え部位は、ｌｏｘＰまたはａｔｔＰであり得る。一部の態様では、ａｔｔＰまたは他の任意のリコンビナーゼ認識部位は、Ｒｏｓａ２６及び／または第１１染色体遺伝子座に挿入することができる。一部の態様では、ａｔｔＰ及び他のインテグラーゼ認識部位は、治療薬の挿入部位として機能することができる。

一部の態様では、ａ）の１つ以上の遺伝子回路はさらに、１つ以上のリプレッサータンパク質を含み得る。一部の態様では、１つ以上のリプレッサータンパク質は、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、及び／またはＱＳであり得る。一部の態様では、１つ以上のリプレッサータンパク質は、制御可能であり得る。

一部の態様では、本明細書に開示の培地はさらに、１つ以上の構成要素またはモジュレーターを含み得る。一部の態様では、ａ）及びｂ）の１つ以上の遺伝子回路は、１つ以上の培地モジュレーターまたは構成要素により制御することができる。一部の態様では、１つ以上の培地モジュレーターまたは構成要素は、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキササイクリン、キナ酸、またはオーキシンであり得る。

一部の態様では、ａ）の遺伝子回路の１つ以上の目的の遺伝子は、トロンボポエチンであり得る。一部の態様では、トロンボポエチンは、構成的に発現させることができる。

一部の態様では、ｂ）の１つ以上の遺伝子回路は、制御可能であり得る。一部の態様では、ｂ）の１つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作ＨＳＣの遺伝子回路の１つ以上の目的の遺伝子により制御することができる。一部の態様では、ｂ）の１つ以上の遺伝子回路は、１つ以上のプロモーターで制御することができる。一部の態様では、ｂ）の遺伝子回路の１つ以上のプロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶ、及び／またはＵ６であり得る。

一部の態様では、ｂ）の１つ以上の遺伝子回路はさらに、１つ以上のリコンビナーゼを含み得る。一部の態様では、１つ以上のリコンビナーゼは、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼまたはＣｒｅもしくはＢｘｂ１インテグラーゼであり得る。一部の態様では、１つ以上のリコンビナーゼは、制御可能であり得る。一部の態様では、ｂ）の１つ以上の遺伝子回路はさらに、１つ以上の組み換え部位を含み得る。一部の態様では、１つ以上の組み換え部位は、ｌｏｘＰ、ａｔｔＰ、またはＢｘｂ１であり得る。一部の態様では、ａｔｔＰ、ｌｏｘＰ、またはＢｘｂ１部位は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座に挿入することができる。一部の態様では、１つ以上の組み換え部位は、治療薬の挿入部位として機能し得る。

本明細書に記載されるように、ゲノム内のリコンビナーゼ部位、例えば、ａｔｔＰは、『ドッキング部位』を介してゲノムに本明細書に開示の遺伝子回路のいずれかを挿入するために使用することができる。このドッキング部位は、ゲノム発現の達成において強力であることが既知のゲノムに、本明細書に開示の遺伝子回路の標的とされる及び強力な挿入を可能にし、後成的サイレンシングに対して耐性を示し得る。

治療薬の位置は、ゲノム内にあり得る。

一部の態様では、ｂ）の１つ以上の遺伝子回路はさらに、１つ以上のリプレッサータンパク質を含み得る。一部の態様では、１つ以上のリプレッサータンパク質は、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、及び／またはＱＳであり得る。一部の態様では、１つ以上のリプレッサータンパク質は、制御可能であり得る。

一部の態様では、本明細書に開示の培地はさらに、１つ以上の培地モジュレーターを含み得る。一部の態様では、１つ以上の培地モジュレーターは、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキササイクリン、キナ酸、またはオーキシンであり得る。

一部の態様では、ｂ）の遺伝子回路の１つ以上の目的の遺伝子は、ＧＡＴＡ－１であり得る。一部の態様では、ＧＡＴＡ－１を構成的に発現させることができる。

一部の態様では、ステップｃ）の血小板前駆幹細胞は、１つ以上の細胞表面マーカーを発現し得る。一部の態様では、ステップｃ）の血小板前駆幹細胞は、ＧＡＴＡ－１を発現し得る。一部の態様では、１つ以上の表面マーカーは、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ４１ａ、及びＣＤ４３であり得る。一部の態様では、血小板または赤血球は、１つ以上の細胞表面マーカーを発現し得る。一部の態様では、１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４１ａ及びＣＤ４２ｂであり得る。

治療薬を必要とする患者を処置する方法が本明細書で開示される。方法は、対象または患者に治療的有効量の治療用血小板を投与することを含み得る。方法は、投与ステップの前に処置を必要とする患者を同定することを含み得る。方法は、患者に治療的有効量の単離血小板を投与することを含み得る。一部の態様では、血小板は、治療薬を含む。単離血小板及び赤血球に、ＤＮＡを含有しない。これらの細胞は、タンパク質及びペプチドを発現する。本明細書に開示の方法を介して、これらの細胞をタンパク質及びペプチド発現するように操作した。これらの細胞は、無核である。

治療的投与は、予防的用途を包含する。遺伝子試験及び他の予後法に基づいて、医師は、患者と相談して、患者が一種の状態、障害、または疾患に対する素因の臨床的な決定または感受性の増加（一部の場合では、感受性の大幅な増加）を有する場合、予防的投与を選択し得る。

血小板ならびに本明細書に記載の治療薬を含む血小板及び赤血球は、対象（例えば、ヒト患者）に、臨床疾患の発症を遅延、低減、または、好ましくは予防するのに十分な量で投与することができる。従って、一部の態様では、患者は、ヒト患者である。治療的用途では、組成物は、状態、障害、または疾患を既に有するか、またはそれと診断された対象（例えば、ヒト患者）に、徴候もしくは症状を少なくとも部分的に改善するか、または状態の症状、その合併症、及び影響の進行を抑制（好ましくは、阻止）するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療的有効量」として定義される。治療的有効量の血小板及び本明細書に記載の治療薬を含む血小板は、治癒を達成する量であり得るが、その結果は、達成することができるいくつかの結果のうちの１つにすぎない。症状の１つ以上は、重症ではない可能性がある。処置されている個体の回復を促進することができる。

哺乳動物（例えば、ヒト）に適用される、本明細書に記載の血小板内に存在し且つ本明細書に開示の方法で使用される治療薬のうちの１つ以上の治療的有効量は、（上記の）年齢、体重、及び他の一般的な状態の個体差を考慮して、当業者が決定することができる。

本明細書に記載の治療薬を含む血小板を含む血小板は、様々な投与経路のいずれかによる投与のために製剤化することができる。

治療薬を含む血小板を含む血小板は、非経口投与用に調製することができる。非経口投与用に調製された血小板は、静脈内（または動脈内）、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与用に調製されたものを含む。

実施例１：分化を促進するための内因性キューを制御するように多能性幹細胞を操作する
マウスＨＳＣが、遺伝的なツールを使用するための適切な細胞供給源を提供するかどうかを判定するために、ツール及び方法を開発して血症板を搭載し、全骨髄をマウスから取り出し、長期電位について試験した（図３Ａ）。他の報告と一致して、系統特異的ＨＳＣ前駆細胞の数は、経時的に大幅に低下する^27~32（図３Ｂ）。次に、骨髄由来の単離ＨＳＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで血小板に分化することができるかどうかを判定するために、多能性ＨＳＣ（ＬＳＫ＋細胞）をマウス骨髄から単離し、標準的な分化条件を使用して分化させた^33~35（図３Ｃ）。これらの実験から、ＨＳＣは培養寿命が非常に短いので、これらの目的のために、それらを直接遺伝子操作することは現実的ではないと結論付けた。次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚性幹細胞（ＥＳ）の多能性ＨＳＣへの分化の有効性を試験し、多能性ＨＳＣ（ＬＳＫ＋）細胞が培養の９日以内に得ることができることが判明した（図３Ｄ）。それ故、マウス胚性幹（ＥＳ）は、これらの細胞が急速に増殖するので、遺伝子操作されることになり、それらは、多能性細胞集団を一貫して更新し、培養液中に維持するのは容易である。これらの遺伝子操作ＥＳ細胞は、ＨＳＣに分化するであろう。このＥＳ細胞アプローチの別の利点は、操作細胞が、急速に膨張し、急速に老化に到達するか、または自然に分化し、それにより、より短い機能的寿命を有する、初代ＨＳＣなどの代替の細胞株より長く維持することができるという点である。これを達成するために、ＣＲＩＳＰＲ技術を利用して遺伝子回路の『ランディングパッド』または『ドッキング部位』を挿入するモジュラー技術を実行した。従来手法は、ゲノムへの遺伝子回路のランダム挿入、回路が安定して組み込まれる安定なクローンの選択、及び特定の挿入部位での回路の機能の試験を含む。これらのステップは、面倒で時間のかかるものであり得る。さらに、各クローンが異なることがあり、位置の影響（例えば、局所的エンハンサー、リプレッサー、または後成的改変による）が回路の脱制御または誤制御をもたらし得るので、試験段階は重要である。これらの制限を迂回するために、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞は、遺伝子回路の標的とされる及び強力な挿入を可能にするように、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の『ドッキング部位』で操作されている。Ｒｏｓａ２６遺伝子座は、マウスモデルで強力な遺伝子発現を達成するために広く使用され、エピジェネティックなサイレンシングに耐性がある³⁶。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、３つのａｔｔＰ部位がＲｏｓａ２６遺伝子座に追加されており（図４）、これにより、これらの部位における一方向組み換えで、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼを使用してこの場所に特異的に遺伝子回路を挿入することが可能になる（図４Ｂ）³⁷。これにより、マウスＥＳ細胞のゲノムに任意の遺伝子ネットワークを挿入するための強力な方法論が可能になる。さらに、ＥＳ細胞が全能性であるので、これらの遺伝子改変細胞は、目的の疾患または組織に基づいて、様々な機能細胞型に分化させることができる。血小板産生及びＭＫにおけるリソソーム酵素の産生のために、遺伝的改変ＥＳ細胞は、ＨＳＣに分化することになり、リソソーム酵素の発現は、分化を通して様々な段階で調節されるであろう。さらに、この技術を開発すると、使用されるべき細胞型のいずれかの遺伝的背景が可能になり、使用される種々のマウスモデルとの免疫適合性が確保される。最終的に、ＣＲＩＳＰＲ技術の使用により、類似のドッキング部位でヒト細胞株に構築されることが可能になるであろう。

実施例２：生体分子を分泌する血小板を生成するように巨核球を遺伝子操作する
血小板は、天然及び合成のペイロードのｉｎ ｖｉｖｏ送達の魅力的な候補となる多くの特徴を有する：１）体内の循環範囲が広い、２）有核細胞である、３）生体適合性がある、４）ヒトにおける平均寿命が約１０日である、５）活性化後、それらのタンパク質顆粒は分泌小胞として機能し、細胞外液に構成要素を放出する。本明細書に開示の合成生物学を使用することにより、ＭＫは、血小板分泌の標的とされるべき治療レベルのタンパク質カーゴを発現するようにプログラムすることができる。概念実証として、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、及びルシフェラーゼは、治療用ペイロードの送達ビヒクルとして血小板を使用することの有効性を判定するために、最初にＭＫに発現させるであろう。カーゴ搭載及び送達プロセスの様々な態様を分析するために使用することができるので、この一連のレポーター分子は選択されている。ＥＧＦＰは、可溶性トランスジェニックカーゴが分泌顆粒にパッケージングされるかどうかを判定するために使用されることになり、ＳＥＡＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長した細胞の培地へのカーゴ放出の程度をアッセイするために使用されることになり、ルシフェラーゼは、これらの実験がｉｎ ｖｉｖｏモデルに移行した時に使用されるために、操作血小板が、内因性血症板に類似する損傷の部位に濃縮されるかどうかを判定するために使用されることになる。

実験及び方法論。治療用生体分子の送達ビヒクルとして血小板を使用するという概念実証として、構成的に発現するレポーター遺伝子は、ＥＳ細胞のａｔｔＰ部位に挿入されるであろう（図４）。これらの細胞は、ＯＰ９間質サポート細胞上にプレーティングされ、ＭＫに分化させるであろう。あるいは、ヒトｉＰＳ細胞を使用することができ、それにより、これらの細胞は、任意のサポート細胞上にプレーティングされる必要がないであろう。構成的に発現するレポーター遺伝子を挿入し、これらの細胞をＭＫ及び血小板に分化させ、次に、レポーター発現についてこれらの細胞をアッセイして、これらの組み換えにより作製されたタンパク質の位置及び機能、ならびにそれらが血症板機能にどのように影響するかを判定するように操作させたＥＳ細胞内のａｔｔＰランディングパッドが使用されるであろう。

ＭＫ及び血小板でＧＦＰを発現させる：多くの潜在的な生物療法分子と同様に、ＧＦＰは、細胞質全体に拡散する小さな可溶性タンパク質である。ＭＫは、ＭＫの分化及びＧＦＰの発現レベルを確認するために、ＦＡＣＳ分析用に収集されるであろう。全集団におけるＧＦＰ発現ＭＫの割合も評価されるであろう。ＭＫでのＧＦＰ発現レベルを決定した後、ＧＦＰを発現するＭＫは、血小板に分化するであろう。ＦＡＣＳ分析は、血小板分化を確認するために、及びこれらの細胞におけるＧＦＰ発現を定量化するために行われるであろう。血小板におけるＧＦＰの細胞内分布を確立するために、精製細胞は、ＧＦＰに対する抗体を使用して免疫標識されるであろう。

ＭＫ及び血小板でＳＥＡＰを発現させる：ＯＰ９間質細胞の層でＨＳＣをＭＫに分化させた後、これらの細胞が回収され、ＳＥＡＰ分泌が、確立されたＥＬＩＳＡプロトコールを使用して培地中で定量されるであろう³⁸。ＭＫＳからのＳＥＡＰ分泌を決定した後、ＳＥＡＰを発現するＭＫは、血小板に分化し、血小板がｉｎ ｖｉｔｒｏで生体分子を分泌することが可能であるかどうかが判定されるであろう。これを達成するために、操作血小板は、複数の時点（１日３回、１０日間）にわたって培地中のＳＥＡＰのレベルを試験することにより、未操作血小板を特徴とするであろう。

ＭＫ及び血小板でルシフェラーゼを発現する：操作血小板が損傷に応答することが可能であるかどうかを判定するために、ルシフェラーゼは、ＭＫ細胞及び血小板で発現され、これにより、生きた動物のイメージングが可能になるであろう。これらの実験は、ルシフェラーゼを発現することが可能な血小板を操作するための概念実証として役立つであろう。ＨＳＣをＭＫに分化させた後、生物発光が可能なプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性を定量するであろう。

血小板の特性評価。血小板細胞の分化は、フローサイトメトリーを使用した表面マーカーで同定することができる。脱顆粒及び凝集の評価は、既知のアクチベーターであるｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）³⁹、フィブリノーゲン⁴⁰、コラーゲン^41、42、及びトロンビン⁴³に関して行われるであろう。血小板の脱顆粒は、セロトニン及び血小板由来因子４（ＰＤＦ－４）に特異的なＥＬＩＳＡで決定されるであろう⁴⁴。対照として、マウス由来の新たに単離された血小板は、比較のために使用されるであろう。既知のアクチベーターの存在下で凝集する血小板の能力は、血小板凝集計を使用して決定されるであろう。さらに、血小板上のＰＡＲ受容体を酵素的に切断することにより作用するトロンビンによる血小板脱顆粒⁴³は、セロトニン及び血小板由来因子４（ＰＤＦ－４）に特異的なＥＬＩＳＡで決定されるであろう⁴⁴。

ＧＦＰが血小板で発現されない場合は、細胞膜⁴⁵と会合することが示されているミリストルタグ化ＧＦＰが使用されるであろう。この場合、ＧＦＰは、ＭＫ膜と会合することになり、血小板膜の一部になる可能性がある。顕微鏡検査及びフローサイトメトリーは、ＧＦＰ発現を観察及び定量するために行われるだろう。ＳＥＡＰまたはルシフェラーゼが血小板の一部ではない場合、レポーター遺伝子は、アミノ酸配列ＬＫＮＧ（配列番号１）でタグ化することができ、これは、巨核球タンパク質⁴⁶の標的化及び／または貯蔵に直接関与することが実証されている。これを達成するために、ＬＫＮＧ（配列番号１）は、ＭＫの顆粒パッケージングのために標的とされるべき５’または３’ＵＴＲのいずれかでレポーター分子に融合させることができる。

実施例３：新規血小板受容体を操作するための指向性進化アプローチを開発及び検証する
血小板は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）シグナル伝達⁴⁷を介して生物活性分子を分泌するように活性化されるようになり得る。ＧＰＣＲは、広範な正常及び病理学的疾患に関与するので、多くの治療標的の焦点となっている多機能膜タンパク質の大きなファミリーである。ｉｎ ｖｉｖｏでのＧＰＣＲシグナル伝達の正確な時空間調節を得るために、デザイナー薬物（ＤＲＥＡＤＤ）により排他的に活性化されるデザイナー受容体は、哺乳動物の脳において行動及び生理学的プロセスを選択的に、迅速に、可逆的に、及び用量依存的に調節するように操作されている⁴⁸。これらの操作受容体は、内因性リガンドを有し、リガンドの不存在下でのバックグラウンド活性を全く有さないように設計されており、別途、薬理学的に不活性な化合物は、ナノモル濃度の薬理学的に不活性で代謝的に安定な小分子で、ＧＰＣＲを排他的に及び強力に活性化する⁴⁹。血小板が活性化の手段の１つとしてＧＰＣＲを使用するので、これらの細胞の活性化を空間的及び時間的に調節するための方策として、血小板上のＤＲＥＡＤＤを操作することが可能である。

実験及び方法論。ＤＲＥＡＤＤは以前に、Ｇ_q、Ｇ_i、及びＧ_sのＧタンパク質共役シグナル伝達経路によりニューロンシグナル伝達の非侵襲的調節を可能にするように操作されている。合成リガンドにより活性化され、生物学的活性を全く有さない受容体を操作するために、血小板の活性化に関与するＧＰＣＲは、内因性基質／リガンド認識よりも合成基質／リガンド認識を好むように改変されるであろう。そのような改変ＧＰＣＲの最前線には、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）があり、これは、Ｇ_q、Ｇ₁₂／Ｇ₁₃、一部の場合では、Ｇタンパク質のＧ_iファミリーに結合する。ＰＡＲは、血小板の最も効果的なアクチベーターであるトロンビンにより活性化される⁴⁷。４つのＰＡＲのうち、ＰＡＲ１及びＰＡＲ４は、ヒト血小板に存在し、マウス血小板は、ＰＡＲ３及びＰＡＲ４を発現する⁴⁷。このために、薬理学的に不活性な化合物であるクロザピン－Ｎ－オキシド（ＣＮＯ）により活性化されるが、その天然リガンドトロンビンにより活性化されないＰＡＲのファミリーの作成を容易にする指向性分子進化アプローチが採用されるであろう。今日最も広く使用されるＤＲＥＡＤＤが、リガンドとしてＣＮＯを使用するので、これらの実験では、ＣＮＯが、合成リガンドとして使用されるであろう。実験は、それが先天性受容体に対する親和性を欠く薬理学的に不活性な分子であり、ナノモル濃度でＧＰＣＲシグナル伝達の空間的及び時間的調節を活性化することを示している^48、49。

指向性分子進化は、ランダムな変異、スクリーニング、その後の選択の連続ラウンドによりタンパク質に特定の特性を与えるための手法である。効率よく所望の基準を満たすようにタンパク質を進化させることは、生物多様性及びスクリーニングされるべきライブラリのサイズ、スクリーニングアッセイの品質、ならびにテンプレートから所望の結果への機能的ジャンプのサイズを含む実験的な設計のいくつかの態様に依存する。主にＧ_qシグナル伝達経路に関与するＰＡＲ受容体の場合、元のＤＲＥＡＤＤに標的とされる受容体もまたＧ_qシグナル伝達経路を介してシグナル伝達するので、シグナル伝達を活性化させるように、ＣＮＯに対するこれらの受容体を進化させる少数から中程度の機能的ステップが実施されることが予想される。デザイナードラッグに加えて、他の薬剤、または血小板を活性化し、それにより、その組織への結合時に生物学的ペイロードを放出する組織特異的ペプチドに応答するように受容体を進化させることも可能である。

ＤＲＥＡＤＤを作成するための実験手順は、かなり簡単であると報告される⁵⁰。要するに、選択すべき受容体は、多くの異なる変異体のライブラリを作成し、ＣＮＯの新しい変異体受容体との相互作用を試験し、ＣＮＯに結合することが可能な変異体を選択し、ＣＮＯとさらによく相互作用している変異体について選択するより多くのラウンドのランダム変異を経験し、哺乳動物細胞で発現させるべき最適な変異体候補を選択し、それにより結合アッセイ⁵⁰を実施するために、ランダムに変異させる。

それは、酵母におけるＧＰＣＲ発現を取得することが可能でない場合、高コピー数の発現プラスミドが選択されるであろう。ＧＰＣＲを過剰発現する高コピー数のプラスミドで開始すると、酵母に対する毒性であり得、コロニー毎にＧＰＣＲの異なる発現レベル及び実験の再現性の減少をもたらす、細胞間のコピー数の大きな変動をもたらすであろう。最後に、複数の酵母菌株は、指向性変異誘発アプローチを最大化するために、使用されるであろう。

Claims (71)

1. 改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む第１の遺伝子回路を含む、核酸構築物。
2. 前記組織特異的プロモーターが、巨核球特異的プロモーターである、請求項１に記載の核酸構築物。
3. 前記巨核球特異的プロモーターが、ＣＸＣＬ４、ＧＰＩＩｂ、またはＰＴＰＲＣである、請求項２に記載の核酸構築物。
4. 前記プロモーターが、制御可能である、請求項１に記載の核酸構築物。
5. 前記プロモーターが、構成的に活性である、請求項１に記載の核酸構築物。
6. 前記改変受容体が、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）または改変プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）である、請求項１に記載の核酸構築物。
7. 前記改変ＧＰＣＲが、Ｇｑ、Ｇｉ、Ｇｓ、またはＧ₁₂／Ｇ₁₃ ＧＰＣＲである、請求項６に記載の核酸構築物。
8. 前記改変ＰＡＲが、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４である、請求項６に記載の核酸構築物。
9. さらに第２の遺伝子回路を含み、前記第２の遺伝子回路が１つ以上の巨核球分化遺伝子を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
10. 前記１つ以上の巨核球分化遺伝子が、ＨｏｘＢ４、ＧＡＴＡ１、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＢＣＬ－ＸＬ、ＰＬＫ－１、またはそれらの組み合わせである、請求項９に記載の核酸構築物。
11. 前記第１の遺伝子回路の前記組織特異的プロモーターが、前記１つ以上の巨核球分化遺伝子に作動可能に連結されている、請求項９に記載の核酸構築物。
12. 前記第２の遺伝子回路が、プロモーターを含み、前記プロモーターが、前記もう１つの巨核球分化遺伝子に作動可能に連結されている、請求項９に記載の核酸構築物。
13. 前記プロモーターが、制御可能である、請求項１１に記載の核酸構築物。
14. 前記プロモーターが、制御可能である、請求項１２に記載の核酸構築物
15. 前記プロモーターが、構成的に活性である、請求項１２に記載の核酸構築物。
16. 前記第１の遺伝子回路または前記第２の遺伝子回路がさらに、目的の遺伝子を含む、請求項１または９に記載の核酸構築物。
17. 前記目的の遺伝子が、治療薬である、請求項１６に記載の核酸構築物。
18. さらに、第３の遺伝子回路を含み、前記第３の遺伝子回路が目的の遺伝子を含む、請求項９に記載の核酸構築物。
19. 前記目的の遺伝子が、治療薬である、請求項１８に記載の核酸構築物。
20. 請求項１～１９に記載の核酸構築物のいずれかを含む、多能性幹細胞。
21. 前記多能性幹細胞が、造血前駆幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２０に記載の多能性幹細胞。
22. 前記多能性幹細胞が、臍帯血または骨髄に由来する、請求項２０に記載の多能性幹細胞。
23. 前記ｉＰＳＣが、血液細胞に由来する、請求項２０に記載の多能性幹細胞。
24. 請求項１～１９に記載の核酸構築物のいずれかを含む、巨核球。
25. 巨核球であって、核酸構築物を含み、前記核酸構築物が、改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む第１の遺伝子回路を含む、前記巨核球。
26. 前記組織特異的プロモーターが、巨核球特異的プロモーターである、請求項２５に記載の核酸構築物。
27. 前記巨核球特異的プロモーターが、ＣＸＣＬ４、ＧＰＩＩｂ、またはＰＴＰＲＣである、請求項２６に記載の核酸構築物。
28. 前記改変受容体が、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）または改変プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）である、請求項２５に記載の巨核球。
29. 前記改変ＧＰＣＲが、Ｇｑ、Ｇｉ、Ｇｓ、またはＧ₁₂／Ｇ₁₃ ＧＰＣＲである、請求項２８に記載の巨核球。
30. 前記改変ＰＡＲが、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４である、請求項２８に記載の巨核球。
31. さらに、第２の遺伝子回路を含み、前記第２の遺伝子回路が、１つ以上の巨核球分化遺伝子を含む、請求項２５に記載の巨核球。
32. 前記１つ以上の巨核球分化遺伝子が、ＨｏｘＢ４及び／またはＧＡＴＡ１；ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ－ＸＬ；ＰＬＫ－１；またはそれらの組み合わせである、請求項３１に記載の巨核球。
33. さらに、追加の遺伝子回路を含み、前記追加の遺伝子回路が、目的の遺伝子を含む、請求項２５または３１の巨核球。
34. 前記目的の遺伝子が、治療薬である、請求項３３に記載の巨核球。
35. 改変受容体を含む、改変巨核球。
36. 改変受容体が、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）または改変プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）である、請求項３５に記載の操作巨核球。
37. 前記改変ＧＰＣＲが、Ｇｑ、Ｇｉ、Ｇｓ、またはＧ₁₂／Ｇ₁₃ ＧＰＣＲである、請求項３６に記載の操作巨核球。
38. 前記改変ＰＡＲが、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４である、請求項３６に記載の操作巨核球。
39. さらに、治療薬を含む、請求項３５～３８のいずれかに記載の操作巨核球。
40. 改変受容体を含む、操作血小板。
41. 改変受容体が、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）または改変プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）である、請求項４０に記載の操作血小板。
42. 前記改変ＧＰＣＲが、Ｇｑ、Ｇｉ、Ｇｓ、またはＧ₁₂／Ｇ₁₃ ＧＰＣＲである、請求項４１に記載の操作血小板。
43. 前記改変ＰＡＲが、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４である、請求項４１に記載の操作血小板。
44. さらに、治療薬を含む、請求項４０～４３のいずれかに記載の操作血小板。
45. 改変受容体を含む血小板または血小板集団を生成する方法であって、前記方法が、
    ａ）請求項１～１９に記載の核酸構築物のいずれかを含む多能性幹細胞を提供すること；
    ｂ）前記多能性幹細胞の巨核球への膨張を可能にする条件の下、培地中で、前記多能性幹細胞を培養すること、及び
    ｃ）前記巨核球を血小板に分化させること；を含み、
    前記血小板または前記血小板集団が、前記改変受容体を含む、前記方法。
46. 前記多能性幹細胞が、造血前駆幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項４５に記載の方法。
47. 前記多能性幹細胞が、臍帯血または骨髄に由来する、請求項４５に記載の方法。
48. 前記ｉＰＳＣが、血液細胞に由来する、請求項４６に記載の方法。
49. 前記培地がさらに、１つ以上のモジュレーターを含む、請求項４５に記載の方法。
50. 前記１つ以上の培地モジュレーターが、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキササイクリン、キナ酸、またはオーキシンである、請求項４９に記載の方法。
51. 前記改変受容体が、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）または改変プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）である、請求項４５に記載の方法。
52. 前記改変ＧＰＣＲが、Ｇｑ、Ｇｉ、Ｇｓ、またはＧ₁₂／Ｇ₁₃ ＧＰＣＲである、請求項５２に記載の方法。
53. 前記改変ＰＡＲが、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４である、請求項５２に記載の方法。
54. 前記多能性幹細胞が、改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む遺伝子回路を含む核酸構築物を含み得るか、または、前記多能性幹細胞が、改変受容体をコードすることが可能な配列に作動可能に連結されている組織特異的プロモーターを含む第１の遺伝子回路；及び第２の遺伝子回路を含み、前記第２の遺伝子回路が１つ以上の巨核球分化遺伝子を含み、前記第１の遺伝子回路または前記第２の遺伝子回路がさらに、目的の遺伝子を含む、核酸構築物を含む、請求項４５に記載の方法。
55. 前記血小板または前記血小板集団がさらに、治療薬を含む、請求項５４に記載の方法。
56. さらに、前記血小板または血小板集団を単離または精製することを含む、請求項４５に記載の方法。
57. ヒト患者を処置する方法であって、前記方法が、ａ）前記ヒト患者に請求項４０～５５のいずれかに記載の血小板のうちの１つ以上を投与すること；及び、ｂ）前記ヒト患者に外因性アゴニストを投与すること、を含み、前記外因性アゴニストの存在が前記改変受容体を活性化する、前記方法。
58. 前記ヒト患者が、前記投与ステップ前に処置を必要としていると同定されている、請求項５６に記載の方法。
59. 前記ヒト患者が、疾患を有する、請求項５６に記載の方法。
60. 前記疾患が、がんである、請求項５８に記載の方法。
61. 前記疾患が、糖尿病である、請求項５８に記載の方法。
62. 前記がんが、転移している、請求項５９に記載の方法。
63. 前記疾患が、リソソーム蓄積症である、請求項５８に記載の方法。
64. 前記改変受容体の前記活性化が、請求項４４、４５、もしくは５４に記載の血小板、または１つ以上の内因性生体分子由来の治療薬の前記放出を誘導する、請求項５６に記載の方法。
65. 前記１つ以上の血小板または前記血小板集団が、静脈内注射または輸注を介して投与される、請求項５６に記載の方法。
66. 前記外因性アゴニストは、頭蓋内、脊髄内、筋肉内、または静脈内注射を介して、または経口で投与される、請求項５６に記載の方法。
67. １つ以上の細胞に、治療薬または１つ以上の内因性生体分子を送達する方法であって、前記方法が、前記１つ以上の細胞を請求項４０～５５に記載の血小板のうちの１つ以上と接触さことを含み、前記接触ステップが、前記外因性アゴニストの存在下で行われ、前記外因性アゴニストの存在が、前記改変受容体を活性化し、それにより、前記１つ以上の細胞に前記治療薬または前記１つ以上の内因性生体分子を放出する、前記方法。
68. 前記接触ステップが、頭蓋内、脊髄内、筋肉内、または静脈内注射を介するｉｎ ｖｉｖｏのものである、請求項６６に記載の方法。
69. 前記１つ以上の血小板または前記血小板集団が、静脈内注射または輸注を介して投与される、請求項６６に記載の方法。
70. 前記外因性アゴニストが、前記接触ステップの前、その間、またはその後に投与される、請求項６６に記載の方法。
71. 前記外因性アゴニストは、頭蓋内、脊髄内、筋肉内、または静脈内注射を介して、または経口で投与される、請求項６８に記載の方法。

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