KR100969271B1

KR100969271B1 - 제8 혈액응고 인자와 폰 빌리 블란트 인자 변이체의 재조합 발현 벡터 시스템

Info

Publication number: KR100969271B1
Application number: KR1020100039200A
Authority: KR
Inventors: 최상윤; 박상원
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2010-07-09
Also published as: KR20100059766A

Abstract

본 발명은 제8혈액응고인자와 von Willebrand factor 변이체의 발현 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 그 엑손을 결실하여 사이즈를 크게 줄이고도 제8혈액응고인자의 안정화 및 활성화 효율을 현저히 높인 돌연변이 von Willebrand factor와 이를 혈우병 치료에 유용한 제8혈액응고인자와 동시에 발현시킬 수 있는 벡터 시스템에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 사이즈를 줄인 돌연변이 von Willebrand factor를 이용함으로써 바이러스 벡터에서 제8혈액응고인자와 함께 효율적으로 발현시키고 제8혈액응고인자의 활성을 현저히 높힐 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 바이러스 벡터는 혈우병 치료를 위한 유전자 요법에 효율적으로 이용할 수 있다.

Description

제8 혈액응고 인자와 폰 빌리 블란트 인자 변이체의 재조합 발현 벡터 시스템{Recombinant expression vector system for variants of coagulation factor VIII and von Willebrand factor}

본 발명은 제8혈액응고인자와 von Willebrand factor 변이체의 발현 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 그 엑손을 결실하여 사이즈를 크게 줄이고도 제8혈액응고인자의 안정화 및 활성화 효율을 현저히 높인 돌연변이 von Willebrand factor와 이를 혈우병 치료에 유용한 제8혈액응고인자와 동시에 발현시킬 수 있는 벡터 시스템에 관한 것이다.

혈우병 A는 X-chromosome 관련 선천성 혈액 응고 질환으로 제8혈액응고인자의 결핍으로 출혈시 혈액 응고의 장애를 일으키는 질환이다. 증상으로는 근육내나 뼈속 혹은 위장이나 요로등에 있어서 빈번한 출혈과 이와 관련하여 붓거나 통증이 발생한다. 현재 치료는 외부에서 응고인자를 보충함으로써 이뤄지고 있으나, 이는 평생에 걸쳐 투여해야함으로써 일상생활의 번거로움에 더불어 경제적인 면에서 많은 어려움이 따르게 된다. 또한 투여시의 2차적 감염에 유의해야하는 문제점을 안고 있다.

제8혈액응고인자는 X chromosome에 위치한 180Kb크기의 유전자로 A1-A2-B-A3-C1-C2의 여러 개 domain을 가진 당단백질이며, 이의 합성은 대부분 간에서 이루어진다. 현재까지 제8혈액응고인지를 전달하고자하는 연구는 많이 시도되어졌으나, 그 크기가 매우 커서 장애를 겪거나, 혹은 전달되어진 제8혈액응고인자 유전자의 발현이 되지 않거나, 분비가 되지 않아 많은 어려움이 따랐다. 제8혈액응고인자의 구조 중 B domain은 하나의 큰 exon으로 되어있으며, asparagin, serin 그리고 threonine residue에 매우 많이 glycosylated되어진 구조를 가진다. 최근 기능 연구에 의하면 이는 procoagulant 활성에 있어서 필수 domain이 아니며 따라서 이 부분의 제거는 제8혈액응고인자의 기능성 분자의 형성에 문제가 없음이 밝혀졌다. B-domain 제거된 제8혈액응고인자(BDD-FVIII)를 세포에 발현시켰을 때, 불안정한 제8혈액응고인자 mRNA 구조와 ER chaperones의 반응이 극복되어져, 많은 mRNA level의 확보가 가능하였다. BDD-FVIII중에서도 N-말단쪽으로 226개의아미노산을 남겨 N-linked glycosylaton의 consensus site를 6개 두었을 때, 제8혈액응고인자의 분비가 현저히 증가함이 증명되어졌다.

혈우병A를 유전자 치료적으로 접근할 때, 목표 세포는 골수세포이며, 골수세포중에서도 줄기세포나 선조세포가 가장 적합하다. 유전자 전달 매개체로 lentivirus-based vector를 사용하는데, 이러한 벡터는 세포에 감염시 유전자 물질을 감염된 세포의 염색체에 끼어들어가 발현되어지기 때문에 안정적이고 지속적인 발현을 가능하게 한다. 기존의 Moloney murine leukemia virus와 같은 다른 종류의 바이러스의 경우, 분화하는 세포에만 감염되기 때문에 줄기 세포나 선조 세포와 같은 세포를 목표로 하여 감염하는 데에는 문제가 있었다. 또한, adenovirus와 같은 경우는 많은 양의 단백질의 발현은 가능하나 세포의 분화에 따라 계속 희석되어지기 때문에 지속적인 발현이 불가능하였다.

따라서 제8혈액응고인자의 안전하고 지속적인 전달의 방법의 필요성이 강조되고 있으며, 이에 방법적 개발이 요구된다. Lentiviral vector는 분열하는 세포뿐만 아니라 분열하지 않는 거의 모든 세포의 감염이 가능하며, 감염후 세포의 염색체에 삽입됨으로써 오랜 시간동안 안정적인 발현이 가능하다. 따라서, 제8혈액응고인자를 lentivirus-based vector를 매개로 하여 개발하면 유전자 치료에 있어서 매우 유용하다.

신체내 출혈시 혈액 응고 작용에서 원활한 제8혈액응고인자의 활성을 위해 중요하게 작용하는 요소가 von Willebrand factor (vWF)이다. vWF는 혈액 당단백질로 제8혈액응고인자에 결합하여 제8혈액응고인자가 혈액내에서 분해되는 것을 막아주는 역할을 한다. 이 외에도 혈액내피세포에 상처가 있을 때 콜라젠에 결합하거나 혈소판에 결합하여 혈액 응고 작용에 큰 역할을 담당한다. 이러한 vWF는 D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2의 domain으로 이뤄져 있는데, 이 중 D'-D3 부분이 제8혈액응고인자에 결합한다. vWF는 250 kDa 크기의 단백질로 유전자의 크기는 약 9kb이다. 따라서, 제8혈액응고인자의 역할을 돕고자 vWF를 lentiviral vector내에 삽입하는 것은 불가능하다. 이에 vWF의 domain구조에서 제8혈액응고인자와의 역할에 필요한 최소 부분을 연구하여 유전자의 exon 32까지의 vWF가 가장 효율적으로 기능을 함을 밝혔으며, 이에 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여lentivirus-based vector에 제8혈액응고인자와 뒤이어 internal ribosomal entry site (IRES)와 von Willebrand factor를 넣어 제작하였다. 이의 벡터와 lentivirus의 생성에 필수적으로 필요한 단백질인 gag-pol, env, tat, rev를 각각 발현시켜 세포에 감염시 제8혈액응고인자와 von Willebrand factor를 각각 발현하는 viral vector의 발명을 완성하였으며, 이는 기존에 한번도 시도되어지지 않았으며, 추후 유전자 치료 및 혈우병 연구에 유용함에 가치가 매우 높게 평가된다.

따라서, 본 발명의 목적은 그 엑손을 결실하여 사이즈를 크게 줄이고도 제8혈액응고인자의 안정화 및 활성화 효율을 현저히 높인 돌연변이 von Willebrand factor를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 세포내에서 제8혈액응고인자와 von Willebrand factor를 각각 지속적으로 안정적으로 발현하는 벡터를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 궁극적인 목적은 이러한 인자들의 발현으로 인해 혈우병 A에 있어서 유전자 치료를 성공시키기 위함에 있으며, 제8혈액응고인자뿐만 아니라, 이의 기능에 있어서 필수적으로 필요한 von Willebrand factor를 함께 발현 시켰다는 점에서 기존의 다른 발명과는 구분된다.

본 발명의 상기 목적은 lentivirus-based vector를 이용하여 제8혈액응고인자와von Willebrand factor를 발현하는 VSV-G pseudotyped lentivirus를 생성한 뒤, 세포에 감염시킴으로써 여러 종류의 다양한 세포에서 제8혈액응고인자를 효과적으로 발현시키고 그 활성을 측정함에 있다. 이의 확인은 최종적으로 제8혈액응고인자가 활성화된 제9혈액응고인자와 더불어 제10혈액응고인자를 활성화시킨 정도를 정량화하여 측정함으로써 달성하였다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 폰 빌리 브란트 인자(von Willebrand factor)내의 엑손 24-46이 결실된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 (vWF23)를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 (vWF23) 유전자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 폰 빌리 브란트 인자(von Willebrand factor)내의 엑손 29-46이 결실된 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 (vWF28)를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 (vWF28) 유전자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 폰 빌리 브란트 인자(von Willebrand factor)내의 엑손 33-46이 결실된 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 (vWF32)를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 (vWF32) 유전자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자(vWF23, vWF28 또는 vWF32)를 코딩하는 유전자를 포함하는 동물세포 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 동물세포 발현벡터는 동물세포에서 상기 유전자를 전달하여 발현할 수 있는 어떤 비바이러스성 (플라스미드 또는 리포좀) 또는 바이러스성 벡터도 포함되지만, 바람직하게는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노부속바이러스와 같은 바이러스성 벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 도 12에서는 상기 vWF23, vWF28 또는 vWF32를 발현하는 렌티바이러스 벡터인 pvEx23, pvEx28 및 pvEx32를 개시하고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 동물세포 발현벡터는 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자(vWF23, vWF28 또는 vWF32)를 코딩하는 유전자외에 B 도메인이 결실된 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 이 경우 하나의 벡터에서 혈우병 치료의 유효성분을 2가지 성분을 한꺼번에 발현시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 B 도메인이 결실된 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)는 서열번호 8의 아미노선 서열을 갖는 것을 특징으로 하며, 그 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자(vWF23, vWF28 또는 vWF32)와 B 도메인이 결실된 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)를 동시에 발현할 수 있는 동물세포 발현 벡터는 어떤 비바이러스성 (플라스미드 또는 리포좀) 또는 바이러스성 벡터도 포함되지만, 바람직하게는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노부속바이러스와 같은 바이러스성 벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 도 13에서는 상기 2가지 유전자가 IRES (internal ribosome entry site)에 의해 연결된 바이시스트론 (bicistronic) 발현 시스템인 pvBDD.FVIII.ires.vWex32 렌티바이러스 벡터를 개시하고 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 또는 B 도메인이 결실된 인간 혈액응고 제 8인자를 발현할 수 있는렌티바이러스 벡터를 패키징 세포에 트랜스펙션시켜 패키징된 렌티바이러스 입자를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 패키징 세포는 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 패키징하여 렌티바이러스 입자를 만들 수 있는 293T 세포 및 HT1080 세포와 같은 어떤 패키징 세포도 가능하나, 바람직하게는 293T 세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 렌티바이러스 입자를 만들기 위해 패키징세포에 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 pGag-pol, pRev, pTat 및 pVSV-G 와 코트랜스펙션시킨 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 보다 안전한 바이러스의 생산을 위하여 split gene expression system을 이용하였다. 즉, 바이러스의 생산에 필수적으로 필요한 인자인 gag-pol, tat, rev, VSV-G만을 발현하되, 이들을 모두 다른 벡터에 운반하여 recombination의 확률을 낮추어 주었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 동물세포 발현 벡터 또는 그로부터 발현된 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 및 B 도메인이 결실된 인간 혈액응고 제 8인자를 유효성분으로 혈우병 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 렌티바이러스 입자를 유효성분으로 함유하는 혈우병 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명자들은 제8혈액응고인자와 돌연변이 von Willebrand factor를 lentiviral-based vector에 동시에 발현하는 시스템을 개발하였다. 구체적으로 본 발명은 제8혈액응고인자의 발현과 활성을 lentiviral-based system에서 확인하는 단계와 제8혈액응고인자의 활성을 위한 von Willebrand factor의 필수 domain을 규명하고 이들을 함께 발현시키는 단계로 구성된다.

본 발명의 제8혈액응고인자는 이의 domain중에서 B domain이 제거되어 제8혈액응고인자의 분비를 더 증가시킨 형태(BDD-FVIII)이다. 제8혈액응고인자의 구조 중 B domain은 하나의 큰 exon으로 되어있으며, asparagin, serin 그리고 threonine residue에 매우 많이 glycosylated되어진 구조를 가진다. 최근 기능 연구에 의하면 이는 procoagulant 활성에 있어서 필수 domain이 아니며 따라서 이 부분의 제거는 제8혈액응고인자의 기능성 분자의 형성에 문제가 없음이 밝혀졌다. B-domain 제거된 제8혈액응고인자(BDD-FVIII)를 세포에 발현시켰을 때, 불안정한 제8혈액응고인자 mRNA 구조와 ER chaperones의 반응이 극복되어져, 많은 mRNA level의 확보가 가능하였다.

BDD-FVIII중에서도 N-말단쪽으로 226개의 아미노산을 남겨 N-linked glycosylaton의 consensus site를 6개 두었을 때, 제8혈액응고인자의 분비가 현저히 증가함이 증명되어졌다.Lentiviral vector는 분열하는 세포뿐만 아니라 분열하지 않는 거의 모든 세포의 감염이 가능하며, 감염후 세포의 염색체에 삽입됨으로써 오랜 시간동안 안정적인 발현이 가능하다. 따라서, 제8혈액응고인자를 lentivirus-based vector를 매개로 하여 개발하면 유전자 치료에 있어서 매우 유용하다.

본 발명의 돌연변이 von Willebrand factor는 전체 엑손(exons)중 일부가 제거되어 D1-D2-D'-D3 domain까지만 (vWF23), D1-D2-D'-D3-A1 domain까지만 (vWF28), 또는 D1-D2-D'-D3-A1-A2 domain까지만 (vWF32)을 포함하는 형태이다. 이 domain은 제8혈액응고인자와의 결합부위, 제8혈액응고인자 및 혈소판의 GP1b와의 결합부위, 또는 제8혈액응고인자, 혈소판의 GP1b 및 콜라젠과의 결합부위를 가지고 있다.

본 발명에서 제8혈액응고인자의 활성을 극대화하기 위해서는 von Willebrand factor의 발현이 필요하다. 이는 생체내 thrombin등과 같은 제8혈액응고인자를 비활성화시키는 인자로부터 보호하며, 또한 제8혈액응고인자의 안정된 구조를 돕기 위함이다. 그러나, 제8혈액응고인자를full-lengh의 von Willebrand factor와 함께 외부에서 발현시켜주면 이들은 세포내에서 co-localize하여 오히려 von Willebrand factor가 제8혈액응고인자의 분비를 저해하는 결과를 초래한다. 따라서, 이들을 제8혈액응고인자의 기능은 최대화하며, 분비를 저해하지 않는 부분만을 남긴 형태의 돌연변이 von Willebrand factor가 바람직하다.

본 발명의 제8혈액응고인자 및 von Willebrand factor의 발현을 위한 운반체로 다른 mammalian expression vector를 사용하여도 되나, 줄기세포 및 혈구선조세포등과 같이 유전자 전달이 쉽지 않은 세포들을 위하여 lentiviral-based vector를 사용하는 것이 더 유리하다. 그러나, lentiviral-based vector의 경우 발현 유전자의 크기에 대한 제한이 있다. B-domain deleted된 제8혈액응고인자 (BDD.FVIII)의 크기가 4.4 kb이며, A2 domain까지의 von Willebrand factor의 크기가 5.6kb이다. 따라서, 바이러스 titer의 큰 손실없이도 이들 유전자를 발현시킬 수 있으며, 또한 바이러스의 titer를 높이기 위해서는 lentivirus의 envelope protein을 VSV-G로 pseudotyping하여 생산한 뒤, 바이러스를 농축시킬 수 있다.

본 발명의 동물세포 발현벡터는 동물세포내에서 외래 유전자의 전사를 유도할 수 있는 진핵 혹은 원핵 세포 유래의 프로모터를 포함할 수 있으며, 프로모터 부위는 또한 전사의 증가과 억제를 위한 조절 요소를 포함할 수 있다. 적합한 프로모터에는 사이토메갈로바이러스 급 초기 프로모터(pCMV), 마우스 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터(pRSV)와 SP6, T3 혹은 T7 프로모터가 포함된다. 프로모터의 상류에 있는 인핸서 혹은 코딩 부위의 하류에 있는 종결자 서열은 발현을 용이하게 하기 위하여 본 발명의 벡터에 선택적으로 포함될 수 있다. 또한 본 발명의 벡터는 세포가 효율적이고 효과적으로 벡터의 핵산에 의하여 발현된 단백질을 가공하기에 충분한 폴리아데닐레이트 서열, 국지화 서열 혹은 신호 서열과 같은 부가적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 폴리아데닐레이트 서열의 예는 SV40 초기 부위 폴리아데닐레이트 사이트(C.V. Hall et al., J. Molec. App. Genet. 2, 101(1983))와 SV40 후기 부위 폴리아데닐레이트 사이트(S. Carswell and J.C. Alwine, Mol. Cell Biol. 9, 4248(1989))이다. 그러한 부가적 서열은 벡터내로 삽입되어 전사가 요망되면 작동적으로 프로모터 서열과 연결되고, 혹은 부가적으로 해독과 프로세싱이 요망되면 개시 및 프로세싱 서열과 작동적으로 연결된다. 삽입 서열은 벡터의 어떠한 위치에도 놓여질 수 있다. "작동적으로 연결된다"는 용어는 유전자 서열과 프로모터 혹은 다른 조절 또는 프로세싱 서열 사이의 연결을 기술하는 데 사용된다. 그결과 유전자 서열의 전사는 프로모터 서열과 작동적으로 연결됨으로써 관련되고, 유전자 서열의 해독은 해독 조절 서열과 작동적으로 연결됨으로써 관련되고, 유전자 서열의 후-전사 프로세싱은 프로세싱 서열과 작동적으로 연결됨으로써 관련된다.

본 발명의 벡터의 구축을 위한 표준 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고 샘브룩의 논문(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.(Cold Spring Harbor, NY, 1989))에서 찾을 수 있다. 다양한 전략이 DNA의 절편을 연결하는 데 유용하고, 그것의 선택은 DNA 절편의 말단의 성질에 달려있고 숙련된 기술자에 의하여 쉽게 이루어진다.

본 발명에 사용가능한 렌티바이러스의 예는 HIV-1 및 HIV-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV 및 비스나(visna) 바이러스를 들 수 있다. 이중 HIV 및 SIV가 유전자 치료에 사용하기에 바람직하다. 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)은 레트로바이러스내의 소 계통군, 렌티바이러스에 속하며, 이들 계통군의 다른 멤버와 같이 HIV는 휴지기 세포를 감염시킬 수 있다. 이는 렌티바이러스를 유전자 치료를 위한 매력있는 벡터로 만든다.

HIV-1-유래 벡터들은 그들의 세포질 및 핵 침입 단백질들(cytoplasmic and nuclear entry proteins)로 분열중인 세포와 비-분열 세포를 감염시키는 능력으로 인해 유전자 전달체로서 가장 많이 사용되고 있다(Kohn, 2001). 이러한 능력은 종종 벡터들의 다양한 특성에 기인한 것으로 생각되는데, 이는 다양한 비리온 단백질들(multiple virion proteins)에서 핵 위치 시그널 및 역-전사된 게놈에서 삼중나선(triple-stranded) 'DNA flap'을 생성하는 중심 폴리퓨린 지역(central polypurine tract)을 포함한다(Zennou et al., 2000). 이러한 특성들의 결과로서, 생물공학적으로 조작된 HIV-1은 조혈모세포(hematopoietic progenitor cells)를 꽤 낮은 MOI에서 매우 효과적으로 감염시킬 수 있다(Park and Choi, 2004). 유전자 치료용 도구로서 렌티바이러스 벡터들의 사용과 관련하여 첫 번째 고려사항은 전이벡터(transfer vector)가 HIV-1로부터 유래된다는 것이다. 그러나 바이러스 복제에 필요한 모든 바이러스 구성성분들은 종래 연구에서 이용된 바이러스 벡터에서 제거되었으며(Hofmann et al., 1999), 전이벡터는 최종적으로 5% 미만의 HIV-1 게놈을 포함하였다(Kohn, 2001). 렌티바이러스 벡터를 사용하면서 생긴 다른 문제(barrier)는 전이된 유전자의 크기에 제한된다는 것이다. vWF는 대략 9Kb의 cDNA 크기를 가지는 52개의 엑손을 포함하는데, 이는 대개의 렌티바이러스 벡터의 크기 제한을 초과하는 것이다. 본 발명에서, 본 발명자들은 성공적으로 vWF cDNA를 렌티바이러스 벡터에 도입시켰다(도 1과 2). 렌티바이러스의 준비와 제조에서, 본 발명자들은 HIV-1의 env를 VSV-G 단백질로 치환하였다. VSV-G는 특이적 세포표면 수용체 단백질을 통한다기보다는 막 융합을 통하여 세포내로 바이러스 침입을 매개하는데, 이는 숙주범위(host range)를 현저히 넓히는 결과를 가져온다(Hofmann et al., 1999). 더욱 중요한 것은, VSV-G는 초원심분리시 구조적 안정성을 부여해서 감염성의 손실이 거의 없는 높은 역가(titers)로 바이러스의 농축을 가능하게 한다(Burns et al., 1993; Hofmann et al., 1999). VSV-G의 이러한 특성을 활용함으로써, 본 발명자들은 성공적으로 vEx52를 제조하고 농축하여, 렌티바이러스 상청액 용량의 1/100만으로 6배 이상 높은 형질도입 효율을 가져왔다(도 3). 이러한 결과는 FACS로 분석되었고 형광 하에서 명확하게 관찰되었다: 농축되지 않은 vEx52보다 농축된 vEx52로 형질도입한 세포에서 현저하게 많은 eGFP의 양이 관찰되었다(도 4). De Meyer 등에 의한 최근 연구는 렌티바이러스 벡터로 긴 vWF cDNA의 병합(incorporation), 및 폰 빌리 브란트 질환 유형 3(VWD 유형 3)으로 유전자 치료제를 개발하기 위하여 VWD 유형 3을 가진 개들로부터 얻은 혈액생성내피세포(blood-outgrowth endothelial cells, BOECs)의 형질도입을 포함하였다(De Meyer et al., 2006). 그러나 낮은 역가의 바이러스를 농축하는 것은 추가적인 시간소요와 어려운 공정을 필요로 하기 때문에, 혈우병 A의 치료에 있어서 실제적인 적용에 이상적임을 증명할 수 없다. 따라서 본 발명자들은 렌티바이러스 벡터에 삽입되는 vWF cDNA의 크기를 줄이기 위한 시도를 하였다. 본 발명자들은 vWF와 FVIII 사이의 상호작용을 위한 최소한의 부위만 남기고 vWF의 도메인들을 제거하였다. 성숙한 vWF는 D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2 도메인들로 구성된다. FVIII는 D'-D3 도메인과 결합하고, A1 도메인은 혈소판 당단백질 Ib, 헤파린 및 콜라겐과 결합한다. 이것은 혈소판의 응집을 용이하게 하여 혈관손상 부위에 부착을 도와준다. 상기 vWF 유전자는 염색체 12에 위치하고 178,000개 염기를 가지는 52개의 엑손을 포함한다. 본 발명자들은 pRex23와 pvEx23을 제조하기 하기 위하여 엑손 24-46을 제거하여, FVIII와 결합하는 부위만을 남겨두었다. FVIII는 vWF의 아미노 말단(amino terminus)에 위치된 272개의 아미노산 잔기들 내에서 vWF와 결합한다(Sadler, 1998). 또한 본 발명자들은 pRex28와 pvEx28를 제조하였는데, 이는 엑손 29-46이 제거된 것이어서, FVIII 결합 부위 이외에 혈소판 결합 부위를 남긴 것이다. vWF상의 혈소판 결합 부위는 A1 도메인 내 위치한다(Sadler, 1998). pvEx23, pvEx28 및 pvEx52는 렌티바이러스에 팩킹될 때, pvEx23과 pvEx28로부터 얻은 바이러스 제조물이 pvEx52로부터 얻은 것보다 현저히 더 많았다. 일반적으로, 농축되지 않은 vEx52의 바이러스 역가는 2× 10⁴ 내지 4× 10⁴ particles/ml(도 3 참조)인데 반해, vEx23와 vEx28의 역가는 1× 10⁵와 3× 10⁵ particles/ml 사이에 있었다(도 5). 도 3과 도 5에서, 3가지 바이러스들의 형질도입 효율은 그래프(histogram)로 비교할 수 있다. Jurkat 세포를 형질도입 시키기 위하여 vEx23, vEx28 및 vEx52 500 μl을 사용하였을 때, 35.02%, 26.30% 및 4.64%의 세포들이 각각 eGFP에 대하여 양성으로 나타났다. 따라서 본 발명자들은 FVIII와 상호작용에 거의 필요없는 vWF 내의 도메인들을 제거함으로써 바이러스 역가와 형질도입 효율을 개선할 수 있었으며, 따라서 팩킹 크기를 줄일 수 있었다. pRex23, pRex28 및 pRex52를 293T 세포로 트랜스펙션 하여 기능적인 FVIII를 상청액에서 측정하였을 때, pRex23와 pRex28는 전체-길이 vWF인 pRex52로 관찰된 것보다 더 낮은 FVIII 활성을 나타내었다. 그러나, 바이러스 시스템을 사용할 경우, vEx28로 형질도입된 세포로부터 얻은 상청액은 vEx52로부터 얻은 것보다 더 높은 분비된 BDD.FVIII 활성(secreted BDD.FVIII activity)을 나타냈다(도 6). 이것은 전체-길이 vWF의 큰 크기가 vWF의 팩킹 및 발현 효율을 제한하기 때문일 것이다. 그러나 본 발명자들은 FVIII의 발현이 vWF에 의해 변경되었는지, vEx28이 상청액에서 발현된 FVIII의 분비되는 수준을 증가시켰는지, 그리고 이러한 효과가 아마도 BDD.FVIII 구조의 보호 때문인지를 결정할 수 없었다. 이것은 vWF가 없을 경우 더 많은 FVIII 활성이 세포에서 검출되었다는 관찰결과와 일치된다(Kaufman et al., 1998). vWF가 FVIII를 안정화시킨다는 다른 지표는 FVIII가 vWF가 없을 경우에 빠르게 분해되었지만(Over et al., 1978), vWF가 있을 경우에는 FVIII가 더 느리게 제거되었다(Tuddenham et al., 1982)는 사실이다. vWF와 FVIII의 성질을 좀 더 들여다보면, 두 단백질들은 FVIII-결핍 세포들을 고치는 데 있어서 강력한 유전적 도구를 제공하기 위하여 설계된 것일지도 모른다.

본 발명의 약학적 조성물의 제형은 비경구(예를 들어, 피부내, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내), 경구 혹은 흡입 투여에 적합한 것을 포함한다. 다른 방법으로, 본 발명의 약학적 제형은 대상의 점막내 투여(예를 들어, 비강투여)에 적합할 수 있다. 제형은 일회용량 형태로 간단하게 제조될 수 있고 당업계에 알려진 어떠한 방법으로도 제조될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1회 투여당 약 10³- 10⁷바이러스 입자, 또는 0.001-100 ㎎/㎏ 의 단백질의 양으로 투여되는 것이 적합하다.

도 1은 본 발명의 일실시예로서 돌연변이 vWF 유전자를 포함하는 팩키징 구조체(packaging constructs)의 개략적인 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예로서 형질도입된 COS-1 세포로부터 vWF의 통합(integration) 및 전사를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시예로서 vWF-발현하는 HIV-1의 농축(concentration)을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일실시예로서 vWF를 발현하는 위형(pseudotyped) HIV-1에 의한 형질도입을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일실시예로서 vWF의 결실 구조체의 개략적인 도면이다.
도 6은 본 발명의 일실시예로서 분비된 기능적 FVIII의 활성을 검출한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일실시예로서 제8혈액응고인자의 발현을 확인하기 위해 eGFP의 발현 시험 결과 사진이다.
도 8은 본 발명의 일실시예로서 각 돌연변이 vWF에 의한 제8혈액응고인자의 활성을 Chromogenic Assay로 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일실시예로서 B-도메인이 결실된 제8혈액응고인자의 유전자를 포함한 Lentivirus 벡터의 제조과정을 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예로서 vWF (von Willebrand Factor)의 유전자를 포함한 Lentivirus 벡터의 제조과정을 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예로서 vWF variants를 포함하는 벡터인 pRex23, pRex28 및 pRex32의 제조과정을 도시한 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예로서 vWF variants의 유전자를 포함한 Lentivirus 벡터인 pvEx23, pvEx28 및 pvEx32의 제조과정을 도시한 것이다.
도 13은 본 발명의 일실시예로서 BDD.FVIII와 vWF variant의 유전자를 포함한 Lentivirus 벡터인 pvBDD.FVIII.vWEx32의 제조과정을 도시한 것이다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 벡터 제조

전장 FVIII cDNA (ATCC Accession No. 40086)를 링커를 이용하여 변형된 pREP7 vector (Invitrogen, USA)의 NotI 부위에 클로닝하여 플라스미드 pRF8를 얻은 후, B-도메인의 대부분을 제거하기 위하여 B-도메인의 상향 5'-영역을 프라이머쌍 5

-GAACCGAAGCTGGTACCT-3

및 5

-GACAGGAGGGGCATTAAATTGCTTTTGCCT-3

를 이용하고, 하향 3‘-영역을 프라이머쌍 5

-TTTAATGCCCCACCAGTCTTGAAACGCCAT-3

및 5

-ATGCTCGCCAATAAGGCATTCCA-3

을 이용하여 PCR 증폭하였고, 다음 이들 산물을 열-변성(denaturation)과 재결합(renaturation)을 거쳐 원하는 결실을 얻었다. 그 산물을 KpnI 및 BglI 로 분해하고 원 pRF8 플라스미드의 KpnI - BglI 내로 서브클로닝하여 pREP7 (Invitrogen, USA)의 RSV 3

LTR 제어하에 B-도메인 결실된(BDD) FVIII cDNA가 삽입된 pREP7-BDD.FVIII를 제조하였다 (참조: The Journal of Gene Medicine, Volume 6, Issue 7 , Pages 760 - 768). 본 발명자는 상기 논문의 저자인 Subrata Banerjee에게서 pREP7-BDD.FVII를 제공받아 사용하였다. 또한, 전장 vWF cDNA (ATCC #59126)를 상기와 마찬가지로 링커를 이용하여 pREP7 vector (Invitrogen, USA)의 NotI 부위에 클로닝하여 pRex52 플라스미드를 얻었다.

실험에 사용된 Lentivirus backbone (transfer vector)으로는 Journal of Virology, December 1999, p. 10020-10028, Vol. 73, No. 12의 저자인 Joseph Sodroski로 받은 HIV-1 vector인 pHIvec2.GFP를 사용하였다 (상기 논문 참조). 상기 pHIvec2.GFP는 v653 rtatpC 바이러스에서 env 및 vpu 서열을 제거하고 Rev-responsive element를 유지하고, eGFP gene (Clontech)을 IRFS 뒤에 삽입함으로써 제조되었다. 상기 pHIvec2.GFP의 벡터맵은 도 1에서 vWF 유전자가 제거된 형태와 동일하다.

B-도메인이 결실된 제8혈액응고인자의 유전자를 포함한 Lentivirus 벡터를 만들기 위하여, BDD.FVIII (B-Domain-Deleted Coagulation Factor VIII)의 cDNA를 상기 pREP7-BDD.FVIII에서 NotI을 이용하여 얻고, 이를 같은 효소를 이용하여 상기 lentivirus backbone에 넣어 주어 pvBDD.FVIII를 생성하였다. 그 제조과정을 도 9에 도시하였다. 구체적으로 pRep7-BDD.FVIII와 lentivirus backbone을 NotI으로 digest하고, pREP7-BDD.FVIII에서 나온 BDD.FVIII fragment를 lentivirus backbone의 NotI site로 ligate하였다.

vWF (von Willebrand Factor)의 유전자를 포함한 Lentivirus 벡터를 만들기 위하여, 상기 pRex52와 lentivirus backbone을 NotI으로 digest하고, pRex52에서 나온 vWF fragment를 lentivirus backbone의 NotI site로 ligate하여, pvEx52를 제조하였다. 그 제조과정을 도 10에 도시하였다. 도 10의 결과물인 pvEx52의 구체적인 맵은 도 1에 개시되어 있다. vWF 유전자는 긴 말단 반복부위(LTR) 사이에 위치하고 바이러스 벡터에서 IRES-eGFP에 융합되어 있다.

vWF variants는 상기 pRex52에서 PCR (polymerase chain reaction)을 이용하여 만들었다. 각 PCR은 각 dNTP 25 mM, 각 phosphorlyated primers 10 μM, 2 mM Mg²⁺, 그리고 DNA 주형으로 반응되었으며, PfuUltraTMII Fusion HS DNA Polymerase로 증폭시켰다. PCR의 전체 부피는50 ㎕로 다음과 같은 조건에서 행하였다. 95℃에서 5분, 95℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃ 에서 1 Kb당 30초의 반응을 18번 반복, 72℃에서 10분. vWF variants를 만들기 위한 forward primer의 서열은 5-CGT GATGAGACGCTCCAG-3이였으며, reverse primers의 서열은 pRex23은 5-TTTTCTGGTGTCAGCACACTG-3, pRex28은 5-AGGTGCAGGGGAGAGGGT-3, 그리고 pRex32는 5-AGAGCACAGTTTGTGGAG-3이였다. PCR을 수행한 뒤, 증폭된 산물은 PCR removal kit (Qiagen)을 이용하여 분리하였으며, ligase (Takara)를 이용하여 15℃에서 약 24시간동안 반응시켜서 pRex23, pRex28 및 pRex32를 제조하였다. 그 제조과정은 도 11에 도시하였다. Ligated mixture는 TOP10에 transformation시켰다.

vWF variants의 유전자를 포함한 Lentivirus 벡터를 만들기 위하여, 상기 pRex23, pRex28 또는 pRex32와 lentivirus backbone을 NotI으로 digest하고, pRex23, pRex28 또는 pRex32에서 나온 vWF fragment를 lentivirus backbone의 NotI site로 ligate하여, pvEx23, pvEx28 및 pvEx32를 제조하였다. 그 제조과정을 도 12에 도시하였다.

pvBDD.FVIII는 BDD.FVIII뒤로 ires-eGFP가 붙어있는 형태인데, 여기서 eGFP부분만을 PCR을 이용하여 제거한 다음, 이 자리에 pRex32의 vWF variant를 넣어주어 pvBDD.FVIII.vWEx32를 생성하였다. 그 제조과정을 도 13에 도시하였다. Transformation은 TOP10을 사용하였다. BDD.FVIII에 이어 vWF32를 함께 발현시키기 위하여 IRES (internal ribosomal entry site) 서열을 BDD.FVIII뒤어 삽입시키고 이 뒤로 vWF32를 넣어주었다. 이로써 하나의 promoter하에 두개의 단백질이 동시에 발현 가능하며, 뒤에서 발현하는 vWF32는 BDD.FVIII의 활성과 기능에 도움을 주는 역할을 한다.

실시예 2: 바이러스의 생성

Vesicular stomatitis G protein (VSV-G) pseudotyped HIV-1는 293T를 quinquepartite plasmid transient transfection의 방법(Park and Choi, 2004 Mol. Cells 17, 297-303 참조)으로 gag-pol, tat, rev, VSV-G 및 transfer vector로 transfection함으로서 만들었다. 293T를 transfection 24시간 전에 100 mm plates에 4.5×10⁶로 split한 다음, transfection 4시간전에 supernatant를 10% FCS, 25 mM HEPES를 포함하는 culture medium으로 바꾸어주었다. Transfection은 Gag and Pol을 가지는 packaging plasmid를 10 ㎍, VSV-G 플라스미드를 2 ㎍, Tat 플라스미드를 1 ㎍, Rev 플라스미드를 1 ㎍, 그리고 transfer vector를 10 ㎍넣어주었다. 이들 DNA를 62 ㎕의 2.5 M CaCl₂에 넣어주고 부피를 물로 500 ㎕로 맞춰준 다음, vortex하고 이 mixture에 500 ㎕의 2x HBS (281 mM NaCl, 100 mM hepes, 1.5 mM Na₂HPO₄ pH 7.12)를 넣어주고 30 분동안 실온에서 둔 다음, 293T 세포 위로 뿌려주었다. Transfection 16시간 뒤, supernatant는 10 mM HEPES buffer의 RPMI로 바꾸어주었고, 48시간 뒤 생성되어 supernatant로 나온 바이러스를 0.45 μm filter를 이용하여 harvest하였다.

실시예 3: 바이러스의 titration

NIH3T3 cells 3 x 10⁵ cells 개를 60 cm² dishes에 넣고, 20 시간뒤에 여러 부피의 바이러스를 세포에 넣어주었다. 이 때, 전체 부피는 culture media로 2 ml로 하였으며, polybrene을2 μg/ml의 농도로 넣어주었다. 6시간 뒤에 바이러스를 제거하고 2% FCS를 포함하는 DMEM으로 세포를 씻어 바이러스를 완전히 제거한 다음, 세포를 incubator안에 넣었다. 2일 경과후, 세포를 0.25% trypsin을 이용하여 떼어낸 후, 1x PBS로 씻어주고, 3.7% formaldehyde로 fix하여주었다. 감염된 세포에서 발광하는 eGFP⁺의 퍼센트를FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems)와 CellQuest program (Becton Dickinson)을 이용하여 읽은 다음 바이러스의 titier를 다음의 공식을 이용하여 계산하였다. (2 × 세포수 × eGFP⁺ 세포수의 퍼센트) ÷ 바이러스의 양.

실시예 4: 바이러스의 농축( Concentration )

생성된 바이러스를 polyallomer tube에 넣고 SW28 로터에서 50,000 x g에서 1.5시간동안 4℃에서 원심분리하였다. Pellet을 작은 부피의 medium으로 녹인 다음, parafilm으로 tube를 덮고 4℃에서 24시간동안 방치하였다. 오랫동안 보관하기 위해서는 농축된 바이러스를 -80℃에 넣어두었다. 도 3은 본 발명의 일실시예로서 vWF-발현하는 HIV-1의 농축(concentration)을 나타낸다. 농축되지 않은(중앙) 500 μl과 농축된(우측) 5 μl의 vWF-발현하는 렌티바이러스 상청액은 Jurkat 세포를 형질도입 하는데 사용되었다. 형질도입된 세포들에서 eGFP+ 세포의 분획은 유세포분석기(flow cytometry)에 의해 결정되었다.

실시예 5: 세포의 트랜스덕션( Transduction )

세포를 hemocytometer에서 센 다음, 24-well plate, 6-well plate에 원하는 수의 세포를 깔아주었다. 바이러스 상층액을 세포에 더해주고 원하는 MOI로 넣어주고 이때 전체 부피는 원하는 부피로 medium으로 조정하였고, 이 때 polybrene을 2 ㎍/ml의 농도로 넣어주었다. 감염은 6시간동안 37℃에서 5% CO₂의 존재하에서 실행하였다. 감염이후, 세포를 medium으로 씻어주었다. 도 5는 본 발명의 일실시예로서 vWF의 결실 구조체의 개략적인 도면이다. A. pRex52와 렌티바이러스 벡터로부터 각각, pRex23과 pvEx23은 엑손 24-46을 제거함으로서 구성되었으며, pRex28과 pvEx28은 엑손 29-46을 제거함으로서 제조되었다. B. vEx23과 vEx28은 각각 pvEx23과 pvEx28로부터 생산되었고, 바이러스 상청액 500 μl은 Jurkat 세포를 형질도입하는데 사용되었다. 형질도입된 세포의 비율은 FACS로 분석되었다.

실시예 6: DNA 와 RNA 분리

Genomic DNA를 500 ㎕ lysis buffer (0.1 M Tris HCl, pH 8.5, 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl, 그리고 100 ㎍/ml protease K)로 분리하였다. 이를 isopropanol로 침전 시킨 다음, 70% Ethanol로 씻어주었다. RNA는 Trizol (Invitrogen)로 얻었으며, cDNA는 ImPromII (Promega)를 이용하여 합성하였다. PCR은 1x reaction buffer, 25 mM 각 dNTP, 10 μM 각 프라이머, 2 mM Mg² ⁺, 그리고 DNA 주형으로 전체부피를 50 ㎕로 하여 Pfu (Solgent)로 증폭하였다. 도 2는 본 발명의 일실시예로서 형질도입된 COS-1 세포로부터 vWF의 통합(integration) 및 전사를 나타낸다. COS-1 세포는 vWF를 발현하는 렌티바이러스로 형질도입 되었다. A. 형질도입된 vWF 유전자의 도입은 형질도입된 COS-1 세포의 게놈 DNA에서 421-bp vWF와 227-bp LTR에 대한 PCR에 의해 검출되었다. B. cDNA는 형질도입된 세포로부터 제조되었으며 각각 421-, 227- 및 187-bp를 갖는 vWF, LTR, 및 GAPDH에 특이적인 프라이머 쌍으로 증폭되었다. vEx52: vEx52로 형질도입, eGFP: eGFP-발현하는 렌티바이러스로 형질도입.

실시예 7: 플라스미드 트랜스펙션( Transfection )

12-well pate기준으로 50 ㎕의 150 mM NaCl에 transfection하고자하는 DNA (pRex23, pRex28 및 pRex32)를 넣어주고, vortex를 한 다음, spin down하였다. 이 mixture에 DNA양의 3배 부피의 PEI를 넣어준 다음, vortex하고 다시 spin down하였다. 실온에서 10분간 방치한 다음, 이를 세포 위로 조심스럽게 떨어뜨려주었다.

실시예 8: 세포면역염색법( Immunocytochemistry )

Transduction된 세포를 6-well 조직배양플레이트에서 글리코겐-코팅된 커버슬립사아에 성장시켰다. 그 세포를 냉각된 100% 메탄올로 고정시키고, TBS [50mM Tris-HCl (pH7.4), 150 mM NaCl]로 세척하고, 신선한 TBS중 0.1% sodium borohydride에서 5분간 quenching하고, 5분간 TBS로 3회 세척하였다. 세포를 블로킹 버퍼 (10% 말혈청, 10% 소혈청알부민, 0.02% NaN₃ in 1x PBS)로 60분간 블로킹하고 TBS로 5분간 세척하였다. 1차 vWF 항체(Abcam)를 TBS중 1% BSA로 희석하고 4℃에서 세포와 함께 하룻밤 인큐베이팅했다. 세포를 TBS로 5분간 3회 세척한 후, 그들을 알루미늄 호일로 커버된실온에서 30분간 TBS중 1% BSA에서 2차 염소-항마우스 IgG TRITC 항체 (Santa Cruz)로 라벨링하였다. 다음 그들을 5분간 TBS로 3회 세척하고 ProLong antifade kit (Cell Signaling)을 사용하여 슬라이드에 마운트하였다.

도 4는 본 발명의 일실시예로서 vWF를 발현하는 위형(pseudotyped) HIV-1에 의한 형질도입을 나타낸다. A. 293T 세포는 vWF-IRES-eGFP가 포함된 전이벡터를 포함하는 바이러스 생산을 위한 바이러스 구성성분들을 포함하는 플라스미드와 함께 트랜스펙션 되었다. 전이벡터로부터 얻은 eGFP는 10× 배율에서 형광형미경으로 가시화되었다. B. Jurkat 세포는 광학현미경과 형광현미경으로 가시화되었다. C. Jurkat 세포는 농축되지 않은 vWF-발현하는 위형 HIV-1 500 μl으로 형질도입 되었으며, 현미경으로 가시화되었다. D. Jurkat 세포는 160배 농축된 vWF-발현하는 위형 HIV-1 5 μl으로 형질도입 되었으며, 흰색 및 형광으로 가시화하였다. E. COS-1 세포는 vWF-위형 HIV-1로 0.5 MOI에서 형질도입 되었다. eGFP는 형광현미경으로 가시화되었다(좌측). vWF는 항체 및 TRITC로 VWF를 염색하여 가시화하였다(중앙). 검출된 vWF는 COS-1세포에서가 아닌 전이된 유전자에서 유래한 것이다(우측).

제8혈액응고인자의 서열에서 B domain을 제외한 BDD.FVIII을 만들어 lentiviral vector에 삽입하였다. Lentivirus의 발현을 위해 gag, pol, VSV-G, tat, rev와 함께 BDD.FVIII를 293T cell에 발현시켜주어 BDD.FVIII을 발현하는 lenvirius를 생산하였다. 이를 이용하여 세포에 감염시켜주면 세포에 BDD.FVIII이 발현하게 되며, 이의 발현을 최종적으로 제8혈액응고인자의 활성 측정을 통하여 확인하였다. 바이러스의 생성과 감염 여부는 벡터내의 eGFP의 발현으로 간접적으로 확인하였다 (도 7). 도 7은 본 발명의 일실시예로서 제8혈액응고인자의 발현을 확인하기 위해 eGFP의 발현 시험 결과 사진이다 (도 4의 A에 해당). 바이러스의 생성과 감염을 eGFP의 발현으로 간접확인하였다.

실시예 9: Factor VIII 의 활성 측정 실험

Activated FVIII activity (FVIII:C)는 Coatest VIII:C/4 kit (DiaPharm)로 정량하였다. Phospholipids와 100 mg/l ciprofloxacin와 이의 5배 부피의 factor IXa와 factor X를 섞어준 다음, 이를 50 ㎕를 96-well microtiter plates에 넣어주었다. 여기에 cell culture supernatant를 25 ㎕ 넣고, 37C에서 5분동안 incubate하였다. 25 ㎕의 0.025 mol/L CaCl2를 더해준 다음 37C에서 10분간 incubate한 뒤, S-2765와 I-2581를 50 ㎕넣고 다시 37C에서 10분간 반응시켰다. 반응은 20% acetic acid로 정지시키고 제8인자의 활성을 405 nm에서 측정하였다. Standard curve는 알고 있는 농도의 recombinant human FVIII를 이용하여 만들어 정량하였다.

도 6은 본 발명의 일실시예로서 분비된 기능적 FVIII의 활성을 검출한 결과를 나타낸다. A. 293T 세포는 pREP7-BDD.FVIII로 pRex23, pRex28 또는 pRex52와 함께 트랜스펙션 되었다. 형질도입된 세포의 상청액은 수집되어 FVIII 활성에 대하여 정량분석 되었다. B. K562 세포는 1.5 MOI에서 HIV-1-BDD.FVIII로 vEx23, vEx28 또는 vEx52와 함께 형질도입 되었다. 형질도입된 세포의 상청액은 수집되어 FVIII 활성에 대하여 스크리닝 되었다. 데이터는 최소 3번의 독립된 실험의 평균± 표준오차(means± S.E.)로 표시된다. C. RT-PCR은 형질도입된 세포로부터 얻은 RNAs로 수행되었다. B-도메인-삭제된 FVIII는 1.1 Kb의 제조물을 보였다. vEx23: vEx23로 형질도입, vEx28: vEx28로 형질도입, vEx52: vEx52로 형질도입.

실시예 10 : PMA 처리 유무에 따른 Factor VIII 의 활성 측정 실험

von Willebrand factor의 domain을 exon 23, exon 28, exon 32되는 부분에서 C-말단쪽으로 제거하여 pRex23, pRex28, pRex32라 명하였고, full length의 vWF는 pRex52이다. 이를 BDD.FVIII를 운반하는 pREP7-BF와 함께 발현시켰을 때 밖으로 분비되어진 제8혈액응고인자의 활성이 가장 큰 von Willebrand factor vector를 찾은 결과 pREP7-BF가 pRex32와 함께 transfect되어졌을 때 였다. (도 8). 도 8은 본 발명의 일실시예로서 각 돌연변이 vWF에 의한 제8혈액응고인자의 활성을 Chromogenic Assay로 측정한 결과이다. HeLa cell에 pREP7, pREP7-BF와 pRex23, pREP7-BF와 pRex28, pREP7-BF와 pRex32, 그리고 pREP7-BF와 pRex52를 transfect한 뒤, supernatant로 분비되어진 FVIII의 functional activity를 측정하였다. 도 8a는 정상상태(상처없는 상태)에서 제8혈액응고인자의 활성을 측정한 것으로서 모두 basal level에 비해 활성이 증가되었으며 32가 가장 크게 나타났다. 도 8b는 상처가 난 상태를 인위적으로 만들기 위해 PMA(phorbol ester)를 처리한 것인데 모두 최소 3배이상 FVIII분비가 유도되고 basal level에 비하여 크게 차이를 나타냈다. 이는 평상시에는 별로 과잉발현 안되지만 (평상시엔 항체 형성 등등의 이유로 low level이 바람직), 상처가 난 상태에서 FVIII 분비가 크게 유도되는 결과는 실제 혈우병의 임상에 있어서 매우 중요한 의미를 가진다.

실험결과 1. 렌티바이러스 생성

pvEx52(LTRs)를 제조하기 위하여 HIV-1-유래 렌티바이러스의 2개의 긴 말단 반복부위(long terminal repeats, LTRs) 사이에 8.8 Kb의 폰 빌리 브란트 인자(von Willebrand factor) cDNA를 클로닝하였다(도 1). vWF cDNA는 NotI을 사용하여 vW-8(ATCC #59126)로부터 분리한 후 렌티바이러스 벡터에 클로닝 하였다. vWF 유전자를 IRES-eGFP와 융합시킴으로써, 바이러스 입자를 팩킹(packaging)하는데 필요한 또 다른 바이러스 유전자들과 함께 293T 세포로 트랜스펙션(transfection) 후 바이러스 생성의 간접적인 지표로서 형광단백질(enhanced green fluorescence protein, eGFP)의 사용을 가능하게 하였다(Parolin et al., 1996; Yee et al., 1994). 팩킹 벡터는 CMV 프로모터의 조절하에서 gag와 pol을 포함하여, HIV-1의 tat와 rev를 CMV 프로모터의 조절하에서 개별적으로 발현하였다. 본 발명자들은 HIV-1 env 대신에 수포성구내염 바이러스 G 단백질(vesicular stomatitis virus G protein, VSV-G)을 사용하였다(Hofmann et al., 1999).

실험결과 2. HIV -1 위형 VSV -G( VSV -G pseudotyped HIV -1)의 형질도입

COS-1 세포를 완전한 vWF를 가진 vEx52, 또는 eGFP를 발현하는 HIV-1-eGFP 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입시킨 COS-1로부터 게놈 DNA를 분리하고, 인간 vWF 유전자와 HIV-1 LTR에 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. vWF는 vEx52-형질도입된 세포에서만 증폭할 수 있었던 반면, LTR은 vEx52와 HIV-1-eGFP-형질도입된 세포 둘 다에서 증폭할 수 있었다(도 2의 A). 그리고 RNA를 형질도입된 세포로부터 준비하여, 그 cDNA를 합성하였고 vWF와 LTR에 대한 PCR을 수행하였다(도 2의 B). RT-PCR의 결과는 게놈 DNA의 PCR 증폭결과와 일치하였다. vWF는 vEx52-형질도입된 세포에서만 증폭되었고, LTR은 vEx52와 HIV-1-eGFP 형질도입된 세포 둘 다에서 검출되었다.

실험결과 3. 형질도입된 림프아세포로부터 vWF 의 발현과 vEx52 의 농축

Jurkat 세포를 2× 10⁵로 배양하고 농축되지 않은 vEx52 바이러스 500 μl로 형질도입 시켰다. FACS 분석은 5.55%의 세포들이 GFP 발현에 대하여 양성임을 보여준다(도 3). 바이러스 현탁액을 50,000× g에서 원심분리로 160배까지 농축한 후, 농축된 바이러스 5 μl를 동수의 Jurkat 세포에 형질도입 하는데 사용하여, 29.51% eGFP+의 수율을 얻었다(도 3). vEx52 바이러스를 농축함으로써, 역가를 2.8× 10⁴ particles/ml에서 2.3× 10⁷ particles/ml까지 증가시켰다. 벡터의 트랜스펙션은 렌티바이러스 생산을 유도하는데, 이는 gGFP의 발현에 의해 간접적으로 확인하였다(도 4의 A). 그리고 농축되지 않거나 농축된 vEx52 둘 다의 형질도입과 발현을 eGFP 발현으로부터 형광으로 가시화하였다(도 4의 B-D). vEx52로부터 vWF 발현을 증명하기 위하여, COS-1 세포를 MOI 0.5에서 vEx52로 형질도입하고 인간 vWF 항체로 표지한 다음, TRITC 염색을 수행하였다(도 4의 E). 그리고 형질도입된 구성물(constructs)이 연장된 기간동안 유지되는지를 확인하기 위하여, 1× 10⁵ Jurkat 세포를 MOI 0.5에서 형질도입 시켰다. 4일 후, FACS 분석에 의해 38.27%의 세포가 eGFP에 대하여 양성으로 나타났다. 형질도입 후 9, 15, 35, 50 및 90일째에 분석에서, 각각 33.01%, 11.99%, 11.32%, 6.13%, 및 5.56%의 세포들이 eGFP+ 였다(데이터 미도시).

실험결과 4. 도메인-제거된 vWF 의 구성

pRex23과 pRex28은 엑손 24-46 및 29-46을 제거함으로써 pREP7-vWF(Dr. Subrata Banerjee로부터 충분히 제공받음)으로부터 제조하였다. pvEx23과 pvEx28은 pvEx52로부터 동일한 방법으로 제조하였다(도 5의 A). 상기 서열들은 정방향 프라이머 5′-CGTGATGAGACGCTCCAG-3′와, pRex23와 pvEx23에 대한 Ex23PR의 역방향 프라이머 5′-TTTTCTGGTGTCAGCACACTG-3′ 및 pRex28와 pvEx28에 대한 Ex28PR의 역방향 프라이머 5′-CAGGTGCAGGGGAGAGG- 3′를 이용하여 PCR에 의해 제거되었다. 그 후, pvEx23와 pvEx28은 팩킹 벡터와 함께 HIV-1 위형 VSV-G를 제조하기 위해 사용되었고, Jurkat 세포에서 적정되었다. vEx23와 vEx28의 바이러스 상청액(supernatants) 500 μl를 각각 형질도입에 사용할 때 35.02%와 26.30%의 세포들이 eGFP에 양성으로 분석되었다(도 5의 B).

실험결과 5. 분비된 FVIII 의 기능적 활성

FVIII의 분비 시 도메인-제거된 vWF의 효과를 시험하기 위하여, 293T 세포를 하나의 pRex23, pRex28, 또는 pRex52와 함께 pREP7-BDD.FVIII로 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션 48시간 후, 상청액을 수집하고 발색법(chromogenic assays)으로 FVIII의 기능적 활성을 스크리닝 하였다. pRex23, pRex28 및 pRex52로 형질도입으로부터 각각 28.89± 18.86, 107.22± 30.64 및 199.44 ± 58.93의 FVIII 활성 수준을 얻었다(도 6). 따라서 분비된 FVIII의 기능적 활성은 vWF의 domain의 일부가 제거됨에 따라 감소하였다. 다음으로, 본 발명자들은 vWF 렌티바이러스의 구성요소로서 도메인-제거된 vWF가 형질도입될 때 그 효과를 평가하였다. K562 세포를 vEx23, vEx28 또는 vEx52와 함께 HIV-1을 발현하는 BDD-FVIII인 vBDD.FVIII로 MOI 1.5에서 형질도입 시켰다. 형질도입된 세포로부터 얻은 RNA로 수행한 RT-PCR로부터 형질도입된 FVIII의 발현이 확인되었다(도 6). 형질도입된 세포의 상청액에서 FVIII 활성은 vEx52-형질도입된 세포에 대하여 28.33± 5.50이고, vEx23-와 vEx28-형질도입된 세포에 대해서는 각각 33.89± 3.93과 53.33± 9.43였다(도 6). These data suggest that the deleted form of vWF, vEx28, is the most efficient at promoting secretion of FVIII via interaction of its minimal essential domains with FVIII. 이러한 데이터는, FVIII와 vWF의 최소 필수 도메인(minimal essential domains)의 상호작용을 통해서 FVIII의 분비를 유도하는데에는 vWF의 삭제된 형태인 vEx28이 가장 효과적임을 나타낸다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 사이즈를 줄인 돌연변이 von Willebrand factor를 이용함으로써 바이러스 벡터에서 제8혈액응고인자와 함께 효율적으로 발현시키고 제8혈액응고인자의 활성을 현저히 높힐 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 바이러스 벡터는 혈우병 치료를 위한 유전자 요법에 효율적으로 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 제8혈액응고인자 및 von Willebrand factor의 동시 발현은 혈우병A의 유전자 치료와 같은 임상적 응용에 있어서 매우 유용하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

폰 빌리 브란트 인자(von Willebrand factor)내의 엑손 29-46이 결실된 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 (vWF28).
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 (vWF28) 유전자.
제 2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 (vWF28) 유전자.
제 1항의 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 동물세포 발현 벡터.
제 4항에 있어서, 상기 동물세포 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 동물세포 발현 벡터.
제 4항에 있어서, B 도메인이 결실된 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현 벡터.
제 6항에 있어서, 상기 B 도메인이 결실된 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현 벡터.
제 6항에 있어서, 도 13의 개열지도를 갖는 pvBDD.FVIII.ires.vWex32 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 동물세포 발현 벡터.
제 5항 또는 제 8항의 렌티바이러스 벡터를 패키징 세포에 트랜스펙션시켜 패키징된 렌티바이러스 입자.
제 9항에 있어서, 상기 패키징 세포는 293T 세포인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 입자.
제 9항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 pGag-pol, pRev, pTat 및 pVSV-G 와 코트랜스펙션시킨 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 입자.
제 4항 또는 제 6항의 동물세포 발현 벡터 또는 그로부터 발현된 돌연변이 폰 빌리 브란트 인자 및 B 도메인이 결실된 인간 혈액응고 제 8인자를 유효성분으로 함유하는 혈우병 치료 및 예방용 약학적 조성물.
제 9항에 따른 렌티바이러스 입자를 유효성분으로 함유하는 혈우병 치료 및 예방용 약학적 조성물.