ES2854754T3 - Tratamiento dirigido a plaquetas - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un vector de expresión que comprende un casete de expresión que comprende un promotor, en el que el promotor es un fragmento del promotor del gen de la integrina αIIb (ITGA2B); y un gen exógeno de interés unido operativamente a dicho casete de expresión, en la que dicho vector de expresión comprende además un factor de direccionamiento que dirige la expresión de dicho gen de interés a una ubicación específica con una célula, en el que dicho factor de direccionamiento se dirige a la expresión de dicho gen de interés dentro de un linaje celular hematopoyético específico que produce plaquetas, en el que dicho factor de direccionamiento es un fragmento del propéptido del factor Von Willebrand humano (FvWpp) unido operativamente a un dominio D2, y en el que dicho casete de expresión tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22 y 23.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento dirigido a plaquetas

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a composiciones y procedimientos para dirigir la expresión de genes exógenos a plaquetas. En particular, la presente divulgación se refiere al tratamiento de la hemofilia y otras enfermedades y afecciones al dirigir la expresión de agentes exógenos (por ejemplo, factores de coagulación) a las plaquetas.

Antecedentes de la invención

La hemofilia es un trastorno hemorrágico común (que ocurre en aproximadamente 1:10.000 hombres) en el cual causa una hemorragia interna severa que a menudo conduce a la muerte porque la sangre del paciente no coagula normalmente. La hemofilia generalmente se hereda con pacientes que presentan episodios hemorrágicos graves incontrolables que comienzan en el nacimiento y vuelven a ocurrir a lo largo de la vida del individuo. Aunque hay varios tipos de factores de coagulación que trabajan junto con las plaquetas para ayudar a que la sangre se coagule, las personas con hemofilia generalmente tienen defectos cuantitativos o cualitativos en las proteínas que codifican el factor de coagulación VIII (hemofilia A) o el factor IX (hemofilia B) que impiden la hemostasia normal.

Las células madre hematopoyéticas se diferencian en la médula ósea para formar megacariocitos que maduran y se descomponen en varios miles de pequeños fragmentos conocidos como plaquetas, que en condiciones normales circulan silenciosamente (sin interactuar con las otras células sanguíneas o la pared del vaso) en el torrente sanguíneo durante aproximadamente 10 días con el trabajo principal para activarse, cambiar de forma y adherirse al vaso sanguíneo dañado para reparar la lesión. Cuando los vasos sanguíneos se lesionan, los factores de coagulación ayudan a que las plaquetas se unan para tapar los cortes y cerrar las roturas en los vasos para detener el sangrado.

Las personas con hemofilia A carecen o tienen niveles bajos de factor VIII de coagulación. Aproximadamente 9 de cada 10 personas que tienen hemofilia tienen el tipo A. Las personas con hemofilia B no tienen o tienen niveles bajos de factor de coagulación IX. Ambos factores de la coagulación se sintetizan normalmente en el hígado, aunque hay informes de que se puede inducir a otros tipos de células a sintetizar formas completamente funcionales de proteínas recombinantes FVIII y FIX.

La hemofilia puede ser leve, moderada o grave, dependiendo de la cantidad de factor de coagulación funcional normal presente en la sangre. Aproximadamente 7 de cada 10 personas que tienen hemofilia A tienen la forma grave del trastorno.

La hemofilia generalmente ocurre en hombres porque los Factores VIII y IX están ubicados en el cromosoma X (aunque con raras excepciones, las mujeres heredan un cromosoma X defectuoso de un padre afectado y de una madre que es portadora de la enfermedad). Aproximadamente 1 de cada 10.000 personas nace con hemofilia cada año en todo el mundo.

El tratamiento principal para la hemofilia es la terapia de reemplazo de proteínas. Los concentrados del factor de coagulación VIII (para hemofilia A) o factor de coagulación IX (para hemofilia B) pueden aislarse de grupos de sangre de un donante o proteína recombinante que se ha preparado a partir de estirpes celulares de cultivo de tejidos transformadas con genes normales que codifican FVIII o FIX que goteaban o se inyectaban lentamente en una vena al inicio de un episodio hemorrágico grave. Estas infusiones ayudan a reemplazar el factor de coagulación que falta o está bajo.

El documento US 2004/192599 A1 describe el uso del promotor del factor plaquetario 4 para impulsar la expresión del factor VIII con el dominio B eliminado (BDD-FVIII). D1 sugiere además que pueden usarse otros promotores específicos para impulsar la expresión a las plaquetas.

El documento US 2010/183556 A1 describe diferentes construcciones de deleción del factor von Willebrand (vWF) que pueden coexpresarse con el factor VIII. D2 describe un constructo vWF de longitud completa (ex52), un constructo donde los dominios A2, A3, D4, B1, B2, B3 y parcialmente los dominios C1 se han eliminado (ex28) y un constructo en el que además los dominios D3 y A1 también se han eliminado (ex23). D2 describe que la coexpresión de estas construcciones puede estabilizar el factor VIII.

Shi et al. (JOURNAL OF THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS, vol. 5, No. 2, 1 de febrero de 2007 (2007-02-01), páginas 352-361), describen el uso de una construcción lentiviral que contiene el promotor ITGA2B -889 para impulsar la expresión del factor VIII en modelos de ratones nulos para FVIII. No se pudo detectar FVIII en el plasma de los ratones tratados; sin embargo, esta construcción permitió restaurar el fenotipo hemorrágico (ver figura 5). Wilcox et al. (PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 96, No. 17, 17 de agosto de 1999 (1999-08-17), páginas 9654-9659), describen una prueba del concepto de que el promotor ITGA2B puede impulsar la expresión temprana y específica durante la megacariocitopoyesis. El promotor se utilizó para impulsar la beta-Gal o el aloantígeno 2 plaquetario (página 9654, segundo párrafo del último párrafo antes de materiales y procedimientos).

Denarier et al. (BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 195, No. 3.30 de septiembre de 1993 (1993-09-30), páginas 1360-1364) describe la clonación, secuenciación y análisis de la región promotora GPIIb de murino (ITGA2B) (primera página, último párrafo antes del material y procedimientos).

Las complicaciones de la terapia de reemplazo incluyen el desarrollo de una respuesta de anticuerpos a la proteína terapéutica normal que es extraña al sistema inmunitario del paciente (conocida como formación de inhibidores), que finalmente conduce a la inactivación o destrucción del factor de coagulación y la hemorragia incontrolada en aproximadamente el 30 % de los pacientes, desarrollando infecciones virales por factores de coagulación humanos (de sangre contaminada con VIH o hepatitis de donantes de sangre infectados, especialmente en países del tercer mundo), costes muy elevados de la proteína de reemplazo que tiene una vida media muy corta (días) que requiere administración frecuente para aliviar una lesión vascular grave y daño a las articulaciones, músculos u otras partes del cuerpo como resultado de retrasos en el tratamiento.

Por tanto, se necesitan nuevos tratamientos para la hemofilia que superen estas complicaciones.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una composición que comprende un vector de expresión que comprende un casete de expresión que comprende un promotor, en el que el promotor es un fragmento del promotor del gen de la integrina aIIb (ITGA2B); y un gen exógeno de interés unido operativamente a dicho casete de expresión, en el que dicho vector de expresión comprende además un factor de dirección que dirige la expresión de dicho gen de interés a una ubicación específica con una célula, en el que dicho factor de dirección se dirige a la expresión de dicho gen de interés dentro de un linaje celular hematopoyético específico que produce plaquetas, en el que dicho factor de direccionamiento es un fragmento del propéptido del factor Von Willebrand humano (FvWpp) unido operativamente a un dominio D2, y en el que dicho casete de expresión tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consta de la SEQ ⁱD NO: 22 y 23.

La invención se refiere además a una célula madre que comprende la composición de acuerdo con la invención, en la que la célula madre expresa el gen exógeno.

La invención se refiere además a una célula madre de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en hemofilia, defectos plaquetarios heredados, trastornos de trombosis, trastornos de la respuesta inmune y cáncer en un animal, dicho animal preferentemente un ser humano, y en el que la célula madre es una célula madre hematopoyética.

La invención se refiere además a un procedimiento ex vivo que comprende: poner en contacto ex vivo una célula madre con una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para generar una célula madre modificada en condiciones tales que dicho gen exógeno se exprese en dicha célula madre modificada, en la que dicho gen exógeno es FVIII y en la que la célula madre es una célula madre hematopoyética.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un diseño de vector lentivírico dirigido a plaquetas. (A) Los fragmentos del promotor del gen ITGA2B dirigen la expresión específica de megacariocitos en luciferasa. (B) Diagrama vectorial lentivírico -889ITGA2B-BDDFVIII-WPTS. (C) diagrama vectorial lentivírico -673ITGA2B-VWFSPD2-BDDFVIII-WPTS.

La Figura 2 muestra la síntesis y el tráfico de BDDFVIII en microscopía confocal de gránulos a de plaquetas caninas (A) que muestra la co-localización de BDDFVIII y Fg dentro de las plaquetas. (B) microscopía electrónica localiza BDDFVIII humano directamente en gránulos a.

La Figura 3 muestra el análisis cuantitativo de plaquetas FVIII.

La Figura 4 muestra plaquetas activadas inducidas para secretar FVIII:C.

La Figura 5 muestra el análisis de PCR para la detección y localización del vector lentivírico dentro del genoma canino. (A) detección a largo plazo del vector lentivírico BDDFVIII dentro del ADN genómico de leucocitos. (B) -PCR mediada por amplificación lineal (LAM) para localizar el vector lentivírico dentro del genoma canino.

La Figura 6 muestra la corrección del fenotipo canino de hemofilia A con plaquetas BDDFVIII.

La Figura 7 muestra las regiones estructurales del promotor del gen ITGA2B y FvWspD2. Las flechas muestran eventos hemorrágicos graves antes y después del tratamiento dirigido a plaquetas. Los perros 142 y M64 muestran una corrección completa de la hemostasia

La Figura 8 muestra un vector de terapia génica lentiviral ejemplar de realizaciones de la presente divulgación.

La Figura 9 muestra la secuencia (SEQ ID NO: 25) del vector de la Figura 8.

La Figura 10 muestra un diagrama y una secuencia de nucleótidos para los fragmentos del promotor de la integrina allb utilizados en las construcciones de transferencia de genes de lentivirus recombinantes. (A) Secuencia de nucleótidos para -Sal I Bgl II -1218 a 30 del promotor del gen allb humano Nco I usado para estudios de informadores de luciferasa específicos de megacariocitos (SEQ ID NO: 21). (B) Secuencia de nucleótidos para -Sal I Bgl II -889 a 30 del promotor del gen aIIb humano Nco I usado para estudios de indicadores de luciferasa específicos de megacariocitos (SEQ ID NO: 22). (C) Secuencia de nucleótidos para -Sal I Bgl II -673 a 30 del promotor del gen aIIb humano Nco I usado para estudios de indicadores de luciferasa específicos de megacariocitos (SEQ ID NO: 23). La numeración se basa en Prandini, et al (Biochem Biophys Res Commun 156 (1) 595-601, 1988).

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación, se definen varios términos y frases:

Como se usa en este documento, el término “sistema de transferencia de genes” se refiere a cualquier medio de administrar una composición que comprende una secuencia de ácido nucleico a una célula o tejido. Por ejemplo, los sistemas de transferencia de genes incluyen, entre otros, vectores (por ejemplo, retrovirales, adenovirales, virus adenoasociados, cromosomas artificiales humanos y otros sistemas de administración basados en ácidos nucleicos), microinyección de ácido nucleico desnudo, polímero sistemas de administración basados (por ejemplo, sistemas basados en liposomas y basados en partículas metálicas), inyección biolística y similares. Como se usa en este documento, el término “sistema de transferencia de genes virales” se refiere a sistemas de transferencia de genes que comprenden elementos virales (por ejemplo, virus intactos, virus modificados y componentes virales como ácidos nucleicos o proteínas) para facilitar la administración de la muestra a una célula o tejido deseado. Como se usa en este documento, el término “transferencia de genes del sistema de adenovirus” se refiere a sistemas de transferencia de genes que comprenden virus intactos o alterados que pertenecen a la familia Adenoviridae.

Como se usa en el presente documento, el término “molécula de ácido nucleico” se refiere a cualquier molécula que contiene ácido nucleico, que incluye, pero no se limita a, ADN o ARN. El término abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de ADN y ARN base conocidos que incluyen, pero no se limitan a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-metilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5'-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

El término “gen” se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que comprende secuencias codificantes necesarias para la producción de un polipéptido, precursor o ARN (por ejemplo, ARNr, ARNt). El polipéptido puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier parte de la secuencia codificante siempre que la actividad deseada o las propiedades funcionales (por ejemplo, Actividad enzimática, unión de ligando, transducción de señales, inmunogenicidad, etc.) de la longitud o el fragmento se retienen. El término también abarca la región codificante de un gen estructural y las secuencias ubicadas adyacentes a la región codificante en los extremos 5' y 3' para una distancia de aproximadamente 1 kb o más en cada extremo de manera que el gen corresponda a la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias ubicadas en 5' de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas. Las secuencias ubicadas 3' o cadena abajo de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias 3' no traducidas. El término “gen” abarca tanto el cDNA como las formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante interrumpida con secuencias no codificantes denominadas “intrones” o “regiones intermedias” o “secuencias intermedias”. Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en ARN nuclear (ARNhn); los intrones pueden contener elementos reguladores como potenciadores. Los intrones se eliminan o “empalman” de la transcripción nuclear o primaria; por lo tanto, los intrones están ausentes en la transcripción del ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.

Como se usa en este documento, el término “gen heterólogo” se refiere a un gen que no se encuentra en su entorno natural. Por ejemplo, un gen heterólogo incluye un gen de una especie introducido en otra especie. Un gen heterólogo también incluye un gen nativo de un organismo que ha sido alterado de alguna manera (por ejemplo, mutado, agregado en múltiples copias, ligado a secuencias reguladoras no nativas, etc.). Los genes heterólogos se distinguen de los genes endógenos en que las secuencias de genes heterólogos se unen típicamente a secuencias de ADN que no se encuentran asociadas de forma natural con las secuencias de genes en el cromosoma o están asociadas con porciones del cromosoma que no se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, Genes expresados en loci donde el gen no se expresa normalmente).

Promotor/potenciador, como se usa en este documento, denota un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar funciones tanto promotoras como potenciadoras (es decir, las funciones proporcionadas por un elemento promotor y un elemento potenciador, ver más arriba para una discusión de estas funciones). Por ejemplo, las repeticiones terminales largas de los retrovirus contienen tanto funciones promotoras como potenciadoras. El potenciador/promotor puede ser “endógeno” o “exógeno” o “heterólogo”. Un potenciador/promotor “endógeno” es uno que está naturalmente ligado con un gen dado en el genoma. Un potenciador/promotor “exógeno” o “heterólogo” es uno que se coloca en yuxtaposición a un gen por medio de manipulación genética (es decir, técnicas de biología molecular como clonación y recombinación) de manera que la transcripción de ese gen está dirigida por el potenciador/promotor enlazado. Los elementos reguladores pueden ser específicos de tejido o específicos de célula. El término “específico de tejido”, tal como se aplica a un elemento regulador, se refiere a un elemento regulador que es capaz de dirigir la expresión selectiva de una secuencia de nucleótidos de interés a un tipo específico de tejido (por ejemplo, glándula mamaria) en ausencia relativa de expresión de la misma secuencia de nucleótidos de interés en un tipo diferente de tejido (por ejemplo, hígado). La especificidad tisular de un elemento regulador puede evaluarse, por ejemplo, enlazando operativamente un gen indicador a una secuencia promotora (que no es específica de tejido) y al elemento regulador para generar una construcción indicadora, introduciendo la construcción indicadora en el genoma de un animal de manera que la construcción indicadora se integre en cada tejido del animal transgénico resultante y detecte la expresión del gen indicador (por ejemplo, detección de ARNm, proteína o la actividad de una proteína codificada por el gen indicador) en diferentes tejidos del animal transgénico. La detección de un mayor nivel de expresión del gen indicador en uno o más tejidos en relación con el nivel de expresión del gen indicador en otros tejidos muestra que el elemento regulador es “específico” para los tejidos en los que se detectan mayores niveles de expresión. Por tanto, el término “específico de tejido” (por ejemplo, específico de hígado) como se usa en este documento es un término relativo que no requiere una especificidad absoluta de expresión. En otras palabras, el término “específico de tejido” no requiere que un tejido tenga niveles de expresión extremadamente altos y que otro tejido no tenga expresión. Es suficiente que la expresión sea mayor en un tejido que en otro. Por el contrario, la expresión “estricta” o “absoluta” específica de tejido pretende indicar la expresión en un solo tipo de tejido (por ejemplo, hígado) sin expresión detectable en otros tejidos.

Como se usa en este documento, el término “porción” o “fragmento” cuando se hace referencia a una secuencia de nucleótidos (como en “una porción o fragmento de una secuencia de nucleótidos dada”) se refiere a fragmentos de esa secuencia. Los fragmentos pueden variar en tamaño desde cuatro nucleótidos hasta la secuencia de nucleótidos completa menos un nucleótido (10 nucleótidos, 20, 30, 40, 50, 100, 200, etc.). En algunas realizaciones, los fragmentos comprenden una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, Promotor) que son 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 100, 150 o 200 nucleótidos menos que la secuencia o subconjuntos de la misma (por ejemplo, 31, 32, 33, 34, 35, 35, 36, 37, 38, 39 nucleótidos más cortos y similares).

Como se usa en este documento, el término “oligonucleótido” se refiere a una longitud corta de cadena polinucleotídica monocatenaria. Los oligonucleótidos tienen típicamente menos de 200 residuos de longitud (por ejemplo, entre 15 y 100), sin embargo, como se usa en el presente documento, el término también pretende abarcar cadenas polinucleotídicas más largas. Los oligonucleótidos se denominan a menudo por su longitud. Por ejemplo, un oligonucleótido de 24 residuos se denomina “24-mer”. Los oligonucleótidos pueden formar estructuras secundarias y terciarias autohibridando o hibridando con otros polinucleótidos. Tales estructuras pueden incluir, pero no se limitan a, dúplex, horquillas, cruciformes, curvas y triplex.

Como se usa en este documento, los términos “complementario” o “complementariedad” se usan en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia “5-A-G-T-3”’, es complementaria a la secuencia “3-T-C-A-5'”. La complementariedad puede ser “parcial”, en la que sólo algunas de las bases de los ácidos nucleicos se emparejan de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. O puede haber complementariedad “completa” o “total” entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficacia y la fuerza de la hibridación entre las cadenas de ácidos nucleicos. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los procedimientos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.

El término “homología” se refiere a un grado de complementariedad. Puede haber homología parcial u homología completa (es decir, identidad). Una secuencia parcialmente complementaria es una molécula de ácido nucleico. que inhibe al menos parcialmente una molécula de ácido nucleico completamente complementaria de hibridar con un ácido nucleico diana es “sustancialmente homólogo”. La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente complementaria a la secuencia diana puede examinarse usando un ensayo de hibridación (transferencia Southern o Northern, hibridación en solución y similares) en condiciones de baja rigurosidad. Una secuencia o sonda sustancialmente homóloga competirá e inhibirá la unión (es decir, la hibridación) de una molécula de ácido nucleico completamente homóloga a una diana en condiciones de baja rigurosidad. Esto no quiere decir que las condiciones de baja rigurosidad sean tales que se permita la unión no específica; Las condiciones de baja rigurosidad requieren que la unión de dos secuencias entre sí sea una interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de unión no específica puede probarse mediante el uso de una segunda diana que sea sustancialmente no complementaria (por ejemplo, menos de aproximadamente 30 % de identidad); en ausencia de unión no específica, la sonda no hibridará con la segunda diana no complementaria.

Cuando se usa en referencia a una secuencia de ácido nucleico de cadena doble tal como un ADNc o clon genómico, el término “sustancialmente homólogo” se refiere a cualquier sonda que puede hibridar con una o ambas cadenas de la secuencia de ácido nucleico de cadena doble en condiciones de baja rigurosidad como se describió anteriormente.

Un gen puede producir múltiples especies de ARN que se generan por corte y empalme diferencial del transcrito de ARN primario. Los ADNc que son variantes de corte y empalme del mismo gen contendrán regiones de identidad de secuencia u homología completa (que representan la presencia del mismo exón o porción del mismo exón en ambos ADNc) y regiones de no identidad completa (por ejemplo, que representan la presencia del exón “A” en el cDNA 1 en el que el cDNA 2 contiene el exón “B” en su lugar). Debido a que los dos ADNc contienen regiones de identidad de secuencia, ambos hibridarán con una sonda derivada del gen completo o porciones del gen que contienen secuencias encontradas en ambos ADNc; por tanto, las dos variantes de empalme son sustancialmente homólogas a dicha sonda y entre sí.

Cuando se usa en referencia a una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla, el término “sustancialmente homólogo” se refiere a cualquier sonda que puede hibridar (es decir, es el complemento de) la secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla en condiciones de baja rigurosidad como se describió anteriormente.

Como se usa en este documento, el término “hibridación” se usa en referencia al emparejamiento de ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de la hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre los ácidos nucleicos) se ve afectada por factores como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, la rigurosidad de las condiciones involucradas, la Tm del híbrido formado y la relación G:C dentro de los ácidos nucleicos. Se dice que una sola molécula que contiene un emparejamiento de ácidos nucleicos complementarios dentro de su estructura es “autohibridada”.

El término “aislado” cuando se usa en relación con un ácido nucleico, como en “un oligonucleótido aislado” o “polinucleótido aislado” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos un componente o contaminante con el que normalmente se asocia en su fuente natural. El ácido nucleico aislado está presente en una forma o entorno que es diferente de aquel en el que se encuentra en la naturaleza. Por el contrario, los ácidos nucleicos no aislados como ácidos nucleicos como el ADN y el ARN se encuentran en el estado en que existen en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de ADN dada (por ejemplo, un gen) se encuentra en el cromosoma de la célula huésped en las proximidades de genes vecinos; las secuencias de ARN, como una secuencia de ARNm específica que codifica una proteína específica, se encuentran en la célula como una mezcla con muchos otros ARNm que codifican una multitud de proteínas. Sin embargo, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína determinada incluye, a modo de ejemplo, dicho ácido nucleico en células que normalmente expresan la proteína dada donde el ácido nucleico se encuentra en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales, o está flanqueado por una secuencia de ácido nucleico diferente de la que se encuentra en la naturaleza. El ácido nucleico, oligonucleótido o polinucleótido aislado puede estar presente en forma monocatenaria o bicatenaria. Cuando se va a utilizar un ácido nucleico, oligonucleótido o polinucleótido aislado para expresar una proteína, el oligonucleótido o polinucleótido contendrá como mínimo la cadena codificante o sentido (es decir, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser de cadena sencilla), pero puede contener ambos las cadenas codificantes y anticodificantes (es decir, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser de doble cadena).

Como se usa en este documento, el término “purificado” o “purificar” se refiere a la eliminación de componentes (por ejemplo, contaminantes) de una muestra. Por ejemplo, los anticuerpos se purifican mediante la eliminación de proteínas contaminantes que no son inmunoglobulinas; también se purifican mediante la eliminación de inmunoglobulina que no se une a la molécula diana. La eliminación de proteínas que no son inmunoglobulinas y/o la eliminación de inmunoglobulinas que no se unen a la molécula diana da como resultado un aumento en el porcentaje de inmunoglobulinas reactivas a la diana en la muestra. En otro ejemplo, los polipéptidos recombinantes se expresan en células huésped bacterianas y los polipéptidos se purifican mediante la eliminación de proteínas de la célula huésped; el porcentaje de polipéptidos recombinantes aumenta así en la muestra.

Como se usa en este documento, el término “muestra” se usa en su sentido más amplio. En cierto sentido, se pretende que incluya una muestra o cultivo obtenido de cualquier fuente, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas pueden obtenerse de animales (incluidos los seres humanos) y abarcan fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen productos sanguíneos, como plasma, suero y similares. Las muestras ambientales incluyen material ambiental como materia superficial, suelo, agua y muestras industriales. Sin embargo, tales ejemplos no deben interpretarse como limitantes de los tipos de muestras aplicables a la presente invención.

Como se usa en este documento, el término “sujeto” se refiere a organismos que se van a tratar mediante los procedimientos de la presente invención. Dichos organismos incluyen preferentemente, pero no se limitan a, mamíferos (por ejemplo, murinos, simios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos y similares), y lo más preferentemente incluye humanos. En el contexto de la invención, el término “sujeto” se refiere en general a un individuo que recibirá o que ha recibido tratamiento (por ejemplo, la administración de un compuesto de la presente invención y opcionalmente uno o más de otros agentes) para una afección caracterizada por infección bacteriana. Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se refiere a composiciones y procedimientos para dirigir la expresión de genes exógenos a plaquetas. En particular, la presente divulgación se refiere al tratamiento de la hemofilia y otras enfermedades y afecciones dirigiendo la expresión de agentes exógenos (por ejemplo, factores de coagulación) a las plaquetas. Las realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y procedimientos para dirigir la expresión de un gen heterólogo a un tipo de célula específico usando un promotor específico de célula. Por ejemplo, en algunos aspectos, la expresión de genes heterólogos o exógenos se dirige a una célula madre (por ejemplo, célula madre cancerosa o célula madre hematopoyética) que a su vez expresa el gen de interés en las células progenitoras (por ejemplo, plaquetas). Las composiciones y procedimientos encuentran uso en el tratamiento de una variedad de enfermedades (por ejemplo, enfermedades mediadas por plaquetas como la hemofilia). Ciertos aspectos de la presente divulgación se ilustran basándose en el tratamiento de la hemofilia con factores de coagulación exógenos o heterólogos, aunque la presente divulgación no se limita al tratamiento de la hemofilia o trastornos plaquetarios. En algunos aspectos, la presente divulgación se refiere al tratamiento de la hemofilia y trastornos hemorrágicos hereditarios raros y comunes, así como a otras enfermedades que implican plaquetas (por ejemplo, trombosis de venas y arterias, respuesta inmune y cáncer) y afecciones mediante el empleo de terapia génica de células madre hematopoyéticas utilizando un fragmento de un promotor génico específico de plaquetas para impulsar la expresión de proteínas solo en el linaje plaquetario y, en algunas circunstancias, la fusión de un péptido señal a la molécula terapéutica para transportar proteínas recombinantes específicamente a los gránulos a de plaquetas para inducir la liberación regulada. de los agentes exógenos de las plaquetas activadas en el sitio de la lesión. En resumen, este enfoque permite que las plaquetas se utilicen como vehículo para administrar agentes terapéuticos para permitir la reparación de heridas dirigidas a la expresión de agentes exógenos (por ejemplo, Proteínas de reemplazo normales para restaurar la hemostasia mediante la corrección de defectos plaquetarios heredados, factores de coagulación para la hemofilia, agentes antitrombóticos para trombosis venosa profunda y oclusión de arterias y agentes antineoplásicos para encoger tumores sólidos y prevenir la angiogénesis en el cáncer) a plaquetas.

Existen varios defectos genéticos heredados bien caracterizados que afectan varios aspectos de la función plaquetaria (activación, adhesión, agregación, transducción de señales, almacenamiento de gránulos), que generalmente se manifiestan clínicamente como una falla para controlar el sangrado (Leslie, M. Science 328, 562­ 564 (2010)). Las realizaciones de la presente invención proporcionan un trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas transducidas con genes que codifican el promotor del gen de la integrina normal que impulsa la síntesis del FVIII de coagulación dentro de las plaquetas para la corrección de la hemofilia A en humanos. La síntesis de novo de una molécula biológicamente normal dentro de los megacariocitos ha permitido previamente el tráfico de la proteína completa para permitir que las plaquetas participen en la reparación de heridas. Esto está respaldado por el éxito reciente del uso de la transferencia de genes de células madre hematopoyéticas del promotor del gen de la integrina aIIb que impulsa la expresión de la integrina aIIb para generar la síntesis denovo del complejo del receptor de la integrina aIIbp3 en las plaquetas para mejorar la función plaquetaria y reducir los tiempos de hemorragia y la pérdida de sangre en perros con deficiencia de integrina aIIb afectada con Trombastenia de Glanzmann (GT) canina (Fang, J. et al. Proc Natl Acad Sci USA 108, 9583-9588 (2011)).

La transducción de células madre de sangre periférica movilizadas por G-CSF (G-PBC) con un vector de oncoretrovirus que codifica la integrina p3 generó una síntesis de novo de complejos viables de integrina aIIbp3 en megacariocitos derivados de pacientes con GT humana (Wilcox, D. A et al., Blood 95: 3645 - 52, 2000; Leslie, M. Science 328, 562 - 564 (2010)). También se ha demostrado que la función plaquetaria podría corregirse dentro de un modelo murino para GT mediante el trasplante de médula ósea transducida con un vector lentivirus que codifica p3 (Fang, J. et al., Blood 106, 2671-2679 (2005)) y que el uso de la transferencia de genes de células madre hematopoyéticas de integrina aIIb para generar aIIbp3 en plaquetas puede corregir la Trombastenia de Glanzmann (GT) canina (Fang, J. et al. Proc Natl Acad Sci USA 108, 9583-9588 (2011)).

Los experimentos llevados a cabo durante el desarrollo de las realizaciones de la presente invención demuestran que la transferencia de genes a G-PBC muestra que los megacariocitos y plaquetas humanos transducidos por oncoretrovirus podrían sintetizar y almacenar el factor VIII de coagulación humano y liberar FVIII tras la activación in vitro con agonistas fisiológicos de activación plaquetaria (Wilcox, D.A., et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis. 1: 2477-89, 2003). También se ha demostrado que la hemostasia podría mejorarse dentro de un modelo murino para la hemofilia A (incluso en presencia de anticuerpos inhibidores del FVIII) mediante el trasplante de médula ósea transducida con un vector lentivirus bajo el control transcripcional del fragmento -889 del promotor del gen de integrina aIIb que impulsa la expresión del FVIII humano (Shi, Q. y Wilcox, D.A., et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 5: 352-361, 2007) y (Shi, Q., et al., Blood 112: 2713 -21, 2008) y que el uso de G-CSF movilizó PBC para lentivirus de células madre hematopoyéticas que median la transferencia génica del fragmento promotor del gen de la integrina aIIb con y sin FvWSPD2 fusionado al FVIII humano indujo la expresión de FVIII completamente funcional dentro de las plaquetas y los gránulos a de plaquetas que corrigió la función plaquetaria y resultó en una mejor hemostasia y la reducción y/o ausencia de eventos hemorrágicos graves; por lo tanto, los animales no requirieron una inyección con terapia de reemplazo de proteína de FVIII dentro de un modelo “canino” de animales grandes para la hemofilia A durante al menos 2,5 años después del trasplante, así como tampoco se generaron anticuerpos inhibidores para el FVIII humano recombinante almacenado en plaquetas caninas

De acuerdo con lo anterior, en algunos aspectos, la presente divulgación proporciona composiciones y procedimientos para terapias genéticas dirigidas a células madre (por ejemplo, células madre hematopoyéticas). Las composiciones y los procedimientos descritos en este documento encuentran uso en el tratamiento de una variedad de enfermedades y afecciones (por ejemplo, trastornos mediados por plaquetas).

Algunos aspectos de la presente divulgación se ilustran con el tratamiento de la hemofilia y otras enfermedades plaquetarias, aunque la presente invención no se limita al tratamiento de la hemofilia. Por ejemplo, en algunos aspectos, las células madre hematopoyéticas se movilizan y se dirigen ex vivo con vectores que se dirigen a la expresión de genes exógenos (por ejemplo, factores de coagulación, proteínas plaquetarias pertinentes para la función plaquetaria, agentes antitrombóticos para trastornos trombóticos y agentes antiangiogénicos y antineoplásicos para trastornos oncogénicos) específicamente a las plaquetas después de la reintroducción de las células madre hematopoyéticas modificadas.

I. Vectores

La presente divulgación no se limita a un casete de expresión o vector de direccionamiento particular. En algunos ápices, los casetes de expresión comprenden un gen exógeno de interés que puede operarse unido a un promotor específico de la célula (por ejemplo, plaquetas). En algunos aspectos, los casetes de expresión comprenden además moléculas de señalización o dirigidas a la expresión de genes, así como potenciadores de la expresión. Las Figuras 7, 8 y 10 muestran casetes de expresión y vectores ejemplares útiles en aspectos de la presente divulgación. Los componentes del vector ejemplares se describen a continuación.

A. Promotores

En algunos aspectos, los vectores comprenden promotores que dirigen la expresión génica a un tipo de célula particular. Por ejemplo, en algunos aspectos, los promotores son promotores específicos de plaquetas. La presente divulgación no se limita a un promotor específico de plaquetas particular. En algunos aspectos, se utilizan promotores del gen de la integrina allb truncada (ITGA2B). Los promotores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, promotores ITGA2B -1218, -889 y -673 que codifican elementos “ETS” y “GATA” para un alto nivel de transcripción génica dentro de megacariocitos y una región represora que inhibe la transcripción génica dentro de otro linaje de célula hematopoyética. (SEQ ID NO: 21, 22, 23; y 25; Figuras 8 y 10).

La secuencia de nucleótidos del promotor del gen ITGA2B se caracterizó por primera vez en 1988 por un grupo en Francia encabezado por el Dr. Gerard Marguerie (Prandini MH, Denarier E, Frachet P, Uzan G, Marguerie G. Aislamiento de la glicoproteína plaquetaria humana IIb gen y caracterización de la región flanqueante 5'. Biochem Biophys Res Commun 1988, 156 (1): 595-601). La figura 7 muestra regiones estructurales del promotor ITGA2B. En algunas realizaciones, se utiliza un fragmento (por ejemplo, 1218, -889 y -673) del promotor. En algunas realizaciones, el -673 contiene todos los elementos reguladores esenciales para impulsar la expresión del transgén específico de plaquetas. En 1993, los investigadores realizaron estudios de promotores de genes y encontraron que el factor de transcripción GATA-1 era importante para la expresión génica de alto nivel en megacariocitos con al menos tres y tal vez una cuarta región que sirve como sitio de unión de GATA-1 identificado en ITGA2B (Martin F, Prandini MH, Thevenon D, Marguerie G, Uzan G. El factor de transcripción GATA-1 regula la actividad promotora del gen de la glicoproteína plaquetaria IIb. J Biol Chem 1993, 268 (29): 21606-21612). A continuación, se descubrió que hay tres secuencias de consenso para otro factor de transcripción Ets que se une a ITGA2B que se considera que actúan juntos para producir un alto nivel de expresión transgénica (Lemarchandel V, Ghysdael J, Mignotte V, Rahuel C, Romeo PH. Las secuencias de acción cis de GATA y Ets median la expresión específica de megacariocitos. Mol Cell Biol 1993, 13 (1): 668-676). Se clonó el promotor ITGA2B murino y se encontró que tenía una homología de secuencia de nucleótidos muy alta con el promotor ITGA2B humano, especialmente en las regiones donde se identificaron las secuencias de unión por consenso de factores de transcripción (Denarier E, Martin F, Martineau S, Marguerie G. PCR cloning and sequence of the murine GPIIb gene promoter. Biochem Biophys Res Commun 1993, 195(3): 1360-1364). Un análisis adicional del promotor de genes mostró que una región de ITGA2B de -139 a -63 debe conservarse para evitar que el promotor del gen impulse la transcripción del transgén dentro de otros linajes hematopoyéticos, por lo que esta región se etiqueta como Represor (Prandini MH, Martin F, Thevenon D, Uzan G. The tissue-specific transcriptional regulation of the megakaryocytic glycoprotein IIb gene is controlled by interactions between a repressor and positive cis-acting elements. Blood 1996, 88(6): 2062-2070). Finalmente, se identificó un sitio de unión para Sp1 en ITGA2B que se cree importante para trabajar con Ets junto con los otros elementos cuando el promotor forma una estructura tridimensional que es esencial para la transcripción óptima de genes específicos de plaquetas (Block KL, Shou Y, Poncz M. An Ets/Sp1 interaction in the 5'-flanking region of the megakaryocyte- specific alpha IIb gene appears to stabilize Sp1 binding and is essential for expression of this TATA-less gene. Blood 1996, 88(6): 2071-2080).

La presente divulgación no se limita a los promotores ITGA2B descritos en las SEQ ID NO: 21-23). Los aspectos de la presente divulgación contemplan fragmentos, porciones y combinaciones de los fragmentos descritos en este documento. En algunos aspectos, los fragmentos son más cortos que el promotor ITGA2B de longitud completa (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200 o más nucleótidos más cortos) y mantienen la actividad deseada (por ejemplo, la capacidad de impulsar la expresión específica de células para provocar un efecto deseado, por ejemplo, reducción del signo o síntoma de una enfermedad o afección).

En algunos aspectos, los promotores comprenden los fragmentos ITGA2B descritos en las SEQ ID NO: 21, 22 y 23, o secuencias que son 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 o más nucleótidos más grandes o más pequeños que las SEQ ID NO: 21, 22 y 23. Por ejemplo, en algunos aspectos, se utilizan fragmentos que son 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200 o más nucleótidos más pequeños que la SEQ ID NO: 21. En algunas formas de realización de la invención, se utilizan fragmentos que son 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 o más nucleótidos mayores que la SEQ ID NO: 23.

En algunos aspectos de la divulgación, se utilizan fragmentos discontinuos de la SEQ ID NO: 21, 22 o 23 que retienen la actividad promotora. Por ejemplo, en algunos aspectos, se utilizan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 nucleótidos de las SEQ ID NO: 21, 22 o 23.

En algunas realizaciones, los fragmentos de promotor comprenden uno o más elementos útiles para la actividad del promotor. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, elementos GATA (por ejemplo, GATA54 o GATA454), elementos sP1, elementos Ets35 y similares (véase, por ejemplo, Block et al., Blood 199484: 3385-3393; Prandini et al., Blood 1996 88: 2062-2070; Block et al., Blood 1996 88: 2071-2080; y Doubeikovski et al., J. Biol. Chem. 272: 24300-24307, 1997).

En algunas realizaciones, los extremos 5' de los promotores se modifican para agregar sitios de endonucleasa de restricción para ayudar en la clonación y construcción de vectores de expresión. Por ejemplo, en algunas realizaciones, 1, 2, 3 o 4 nucleótidos en el extremo 5' se modifican a partir de la secuencia de tipo silvestre o los fragmentos descritos en este documento para añadir sitios de endonucleasa de restricción.

En algunas realizaciones de la invención, los fragmentos comprenden, consisten esencialmente en o consisten en la secuencia promotora encontrada en las SEQ ID NO: 22 o 23.

B. Genes heterólogos

La presente divulgación no se limita a un gen exógeno particular. En realizaciones de la invención que tratan la hemofilia, los genes exógenos son generalmente factores de coagulación (por ejemplo, Factor VIII y/o Factor IX). El factor VIII humano tiene el número de acceso NM_000132.3 y el factor humano IX tiene el número de acceso NM_000133.3.

Se pueden utilizar otros genes exógenos en el tratamiento de otras afecciones relacionadas con las plaquetas. En algunos aspectos de la divulgación, se utilizan genes exógenos útiles en el tratamiento de enfermedades distintas de los trastornos relacionados con las plaquetas (por ejemplo, en el tratamiento del cáncer mediante el uso de plaquetas para dirigir la liberación de agentes antineoplásicos “es decir, IL-24” para reducir el tamaño de los tumores y agentes antitrombóticos que se liberan en el lugar de los coágulos de sangre, como los casos de trombosis venosa profunda).

C. Factores de focalización y potenciadores

En algunos aspectos, los casetes de expresión comprenden además un factor de direccionamiento que dirige la expresión en una subestructura particular de una plaqueta. En algunos aspectos, los casetes de expresión comprenden además la secuencia mínima de aminoácidos de un péptido de secuencia señal que se ha encontrado que puede traficar no solo FvW sino también proteínas recombinantes fusionadas al péptido que tiene la capacidad probada de almacenar proteínas en compartimentos de gránulos celulares específicamente las células endoteliales de la subestructura de almacenamiento natural “cuerpos de Weibel-Palade” y los gránulos a de plaquetas, los cuales pueden secretarse ambos tras la activación celular. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la invención, las construcciones de expresión comprenden un ácido nucleico que codifica un péptido señal del propéptido del factor de Von Willebrand y un dominio D2 (SPD2) para promover el tráfico de moléculas directamente en el compartimento de gránulos a como se muestra en Rosenberg Jb et al., Intracellular Trafficking of FVIII to von Willebrand Factor storage Granules, J. Clin. Invertir. 101, 613 - 624 (1998); Haberichter SL, Jacobi P, Montgomery RR. Critical independent regions in the FvW propeptide and mature FvW that enable normal FvW storage.2003, 101 (4): 1384­ 1391 y Haberichter et al, The Von Willlebrand Factor Propeptide (FvWpp) Traffics an Unrelated Protein to Storage, Arterioscler Thromb Vas Biol. 22, 921926 (2002).

Un ejemplo de un casete de expresión que comprende un fragmento de 673 pb del promotor del gen ITGA2B y un gen FvW/SPD2 se muestra en la Figura 7 (SEQ ID NO: 24). Las variantes de estas secuencias que conservan su actividad deseada se contemplan específicamente para su uso en composiciones y procedimientos de realizaciones de la presente invención.

En algunas realizaciones, las construcciones comprenden un potenciador de la expresión (por ejemplo, Virus de la Hepatitis de la Marmota (WHP) Elemento Regulador Postranscripcional (WPRE)) entre el casete de señalización/promotor y el gen exógeno de interés. Este elemento ha sido utilizado por varias estrategias de transferencia génica porque su estructura inhibe la degradación del transcrito dentro de la célula y por lo tanto permite sintetizar más proteína terapéutica en comparación con un vector de transferencia génica en ausencia de WPRE.

D. Estructuras principales vectoriales

La presente invención no se limita a un vector de expresión particular. En algunas realizaciones, los vectores se auto inactivan. En algunas realizaciones, los vectores son vectores retrovíricos (por ejemplo, vectores lentivíricos). La Tabla 2 proporciona un resumen de ejemplos de vectores adecuados.

Tabla 2

Virus Ventajas Desventajas

Título alto Alta expresión génica Puede infectar

Adenovirus células que no se dividen Acepta casetes muy Inmunogénico No se integra en el genoma grandes (40 kb)

Adenovirus Puede infectar células que no se dividen Acepta casetes pequeños (4 kb) Baja asociado Relativamente seguro en humanos eficiencia de transducción en células hematopoyéticas

Puede infectar células que no se dividen. Alto

Alfavirus (Sindbis) título. Alta eficiencia de transducción. Alta Tóxico para las células No se integra en el expresión génica. genoma

Incorporado de forma estable al genoma Puede Nueva en el campo Seguridad incierta en infectar células que no se dividen humanos

Incorporado de manera estable en el genoma

Retrovirus Relativamente seguro en humanos Título alto Infecta solo las células en división Acepta casetes grandes (8 kb)

Los retrovirus (familia Retroviridae) se dividen en tres grupos: los espumavirus (por ejemplo, virus espumoso humano); los lentivirus (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana y virus visna de oveja) y los oncovirus (por ejemplo, MLV, virus del sarcoma de Rous).

Los retrovirus están envueltos (por ejemplo, rodeados por una membrana de bicapa lipídica derivada de la célula huésped) virus de ARN de cadena sencilla que infectan células animales. Cuando un retrovirus infecta una célula, su genoma de ARN se convierte en una forma de ADN lineal de cadena doble (por ejemplo, se transcribe de forma inversa). La forma de ADN del virus se integra luego en el genoma de la célula huésped como un provirus. El provirus sirve como molde para la producción de genomas virales y ARNm virales adicionales. Partículas virales maduras que contienen dos copias del brote de ARN genómico de la superficie de la célula infectada. La partícula vírica comprende el ARN genómico, la transcriptasa inversa y otros productos del gen pol dentro de la cápside vírica (que contiene los productos del gen gag vírico), que está rodeada por una membrana de bicapa lipídica derivada de la célula huésped que contiene las glicoproteínas de la envoltura vírica (también denominada como proteínas asociadas a la membrana).

La organización de los genomas de numerosos retrovirus ha permitido la adaptación del genoma retrovírico para producir vectores retrovíricos. La producción de un vector retrovírico recombinante que lleva un gen de interés se logra típicamente en dos etapas. Primero, el gen de interés se inserta en un vector retrovírico que contiene las secuencias necesarias para la expresión eficiente del gen de interés (incluidos los elementos promotores y/o potenciadores que pueden ser proporcionados por las repeticiones terminales largas [LTR] víricas o por un promotor/potenciador interno y señales de empalme relevantes), secuencias requeridas para el empaquetamiento eficiente del ARN viral en viriones infecciosos (por ejemplo, la señal de empaquetamiento [Psi], el sitio de unión del cebador de ARNt [-PBS], las secuencias reguladoras 3' requeridas para transcripción inversa [+PBS] y las LTR víricas). Los LTR contienen secuencias necesarias para la asociación de ARN genómico vírico, funciones de transcriptasa inversa e integrasa, y secuencias involucradas en la dirección de la expresión del ARN genómico que se empaquetará en partículas víricas. Por razones de seguridad, muchos vectores retrovíricos recombinantes carecen de copias funcionales de los genes que son esenciales para la replicación viral (estos genes esenciales se eliminan o desactivan); se dice que el virus resultante tiene defectos de replicación.

En segundo lugar, tras la construcción del vector recombinante, el ADN del vector se introduce en una estirpe celular de empaquetamiento. Las estirpes celulares de empaquetamiento proporcionan proteínas víricas requeridas en trans para el empaquetamiento del ARN genómico vírico en partículas víricas que tienen el rango de hospedadores deseado (por ejemplo, las proteínas gag, pol y env codificadas por virus). El rango de hospedadores está controlado, en parte, por el tipo de producto génico de la envoltura expresado en la superficie de la partícula vírica. Las estirpes celulares de empaquetamiento pueden expresar productos génicos de envoltura ecotróficos, anfotrópicos o xenotrópicos. Alternativamente, la estirpe celular de empaquetamiento puede carecer de secuencias que codifiquen una proteína de envoltura vírica (env). En este caso, la estirpe celular empaquetadora empaquetará el genoma viral en partículas que carecen de una proteína asociada a la membrana (por ejemplo, una proteína env). Para producir partículas víricas que contienen una proteína asociada a la membrana que permitirá la entrada del virus en una célula, la estirpe celular de empaquetamiento que contiene las secuencias retrovirales se transfecta con secuencias que codifican una proteína asociada a la membrana (por ejemplo, La proteína G del virus de la estomatitis vesicular [VSV]). La célula de empaquetamiento transfectada producirá entonces partículas víricas que contienen la proteína asociada a la membrana expresada por la estirpe celular de empaquetamiento transfectada; estas partículas víricas, que contienen ARN genómico vírico derivado de un virus encapsulado por las proteínas de la envoltura de otro virus, se dice que son partículas de virus pseudotipadas.

Los vectores virales, incluidos los vectores retrovíricos recombinantes, proporcionan un medio más eficaz de transferir genes a las células en comparación con otras técnicas como la coprecipitación de ADN-fosfato cálcico o la transfección, electroporación o microinyección de ácidos nucleicos mediada por DEAE-dextrano. Se considera que la eficacia de la transferencia viral se debe en parte al hecho de que la transferencia de ácido nucleico es un procedimiento mediado por receptores (es decir, el virus se une a una proteína receptora específica en la superficie de la célula a infectar). Además, el ácido nucleico transferido viralmente una vez dentro de una célula se integra de manera controlada en contraste con la integración de ácidos nucleicos que no son transferidos viralmente; Los ácidos nucleicos transferidos por otros medios, como la coprecipitación de ADN-fosfato de calcio, están sujetos a reordenamiento y degradación.

Los vectores retrovíricos recombinantes comúnmente usados se derivan del virus anfotrópico de leucemia murina de Moloney (MoMLV) (Miller y Baltimore, Mol. Cell. Biol., 6: 2895 [1986]). El sistema MoMLV tiene diversas ventajas: 1) este retrovirus específico puede infectar muchos tipos de células diferentes, 2) las estirpes celulares de empaquetamiento establecidas están disponibles para la producción de partículas víricas MoMLV recombinantes y 3) los genes transferidos se integran permanentemente en el cromosoma de la célula diana. Los sistemas de vectores MoMLV establecidos comprenden un vector de ADN que contiene una pequeña porción de la secuencia retroviral (la repetición terminal larga viral o “LTR” y la señal de empaquetamiento o “psi”) y una estirpe celular de empaquetamiento. El gen a transferir se inserta en el vector de ADN. Las secuencias víricas presentes en el vector de ADN proporcionan las señales necesarias para la inserción o empaquetamiento del ARN del vector en la partícula vírica y para la expresión del gen insertado. La estirpe celular de empaquetamiento proporciona las proteínas víricas necesarias para el ensamblaje de partículas (Markowitz et al., J. Virol., 62: 1120 [1988]).

A pesar de estas ventajas, los vectores retrovíricos existentes basados en MoMLV están limitados por varios problemas intrínsecos: 1) no infectan células que no se dividen (Miller et al., Mol. Cell. Biol., 10: 4239 [1992]), 2) producen títulos bajos del virus recombinante (Miller y Rosman, BioTechn., 7: 980 [1989]; y Miller, Nature 357: 455 [1992]) y 3) infectan ciertos tipos de células (por ejemplo, linfocitos humanos) con baja eficacia (Adams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8981 [1992]). Los títulos bajos asociados con los vectores basados en MoMLV se han atribuido, al menos en parte, a la inestabilidad de la proteína de la envoltura codificada por el virus. La concentración de reservas de retrovirus por medios físicos (por ejemplo, ultracentrifugación y ultrafiltración) conduce a una pérdida grave de virus infecciosos.

Otros retrovectores comúnmente usados se derivan de lentivirus que incluyen, pero no se limitan a, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) o virus de inmunodeficiencia felina (VIF). Los vectores lentivirus tienen la ventaja de poder infectar células que no se replican.

El título bajo y la infección ineficaz de ciertos tipos de células por retro vectores se han superado mediante el uso de vectores retrovíricos pseudotipados que contienen la proteína G del VSV como proteína asociada a la membrana. A diferencia de las proteínas de la envoltura retrovírica que se unen a un receptor de proteína de la superficie celular específica para entrar en una célula, la proteína G de VSV interactúa con un componente fosfolípido de la membrana plasmática (Mastromarino et al., J. Gen. Virol., 68: 2359 [ 1977]). Debido a que la entrada de VSV en una célula no depende de la presencia de receptores de proteínas específicos, VSV tiene un rango de huéspedes extremadamente amplio. Los vectores retrovíricos pseudotipados que portan la proteína G del VSV tienen un rango de huéspedes alterado característico del VSV (es decir, pueden infectar casi todas las especies de células de vertebrados, invertebrados e insectos). Es importante destacar que los vectores retrovíricos pseudotipados de VSV G se pueden concentrar 2000 veces o más por ultracentrifugación sin pérdida significativa de infectividad (Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8033 [1993]).

La proteína G de VSV también se ha utilizado para pseudotipar vectores retrovíricos basados en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Naldini et al., Science 272: 263 [1996]). Por tanto, la proteína G de VSV se puede utilizar para generar una variedad de vectores retrovíricos pseudotipados y no se limita a vectores basados en MoMLV.

La presente invención no se limita al uso de la proteína G de VSV cuando se emplea una proteína G viral como proteína asociada a la membrana heteróloga dentro de una partícula vírica. Pueden usarse secuencias que codifiquen otras proteínas G derivadas de otros miembros de la familia Rhabdoviridae; las secuencias que codifican numerosas proteínas G rabdovirales están disponibles en la base de datos GenBank.

La mayoría de los retrovirus pueden transferir o integrar una forma lineal bicatenaria del virus (el provirus) en el genoma de la célula receptora solo si la célula receptora está ciclando (es decir, dividiéndose) en el momento de la infección. Los retrovirus que se ha demostrado que infectan células en división exclusivamente, o de manera más eficiente, incluyen MLV, virus de necrosis del bazo, virus de inmunodeficiencia humana del virus del sarcoma de Rous y otros vectores lentivíricos.

Se ha demostrado que la integración del ADN del virus MLV depende de la progresión de la célula huésped a través de la mitosis y se ha postulado que la dependencia de la mitosis refleja un requisito de ruptura de la envoltura nuclear para que el complejo de integración vírica obtenga la entrada al núcleo (Roe et al., EMBO J., 12: 2099 [1993]). Sin embargo, como la integración no se produce en células detenidas en metafase, la ruptura de la envoltura nuclear por sí sola puede no ser suficiente para permitir la integración vírica; puede haber requisitos adicionales, como el estado de condensación del ADN genómico (Roe et al., supra).

La presente invención no se limita a vectores retrovíricos. Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, los siguientes vectores: 1) Bacteriano - pQE70, pQE60, pQE 9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223 3, pKK233 3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); y 2) Eucariotas - pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Puede usarse cualquier otro plásmido o vector siempre que sean replicables y viables en el hospedador. En algunas realizaciones de la presente invención, los vectores de expresión de mamíferos comprenden, junto con un casete de expresión como se describe en este documento, un origen de replicación, cualquier sitio de unión de ribosoma necesario, sitios de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de empalme, secuencias de terminación transcripcional y secuencias no transcritas. En otras realizaciones, las secuencias de ADN derivadas del corte y empalme de SV40 y los sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos.

II. Procedimientos terapéuticos

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona sistemas y procedimientos para la manipulación genética de células madre (por ejemplo, células madre hematopoyéticas o células madre cancerosas). En algunos aspectos, las composiciones y los procedimientos descritos en este documento encuentran uso en el tratamiento de una variedad de trastornos relacionados con la función plaquetaria (por ejemplo, hemofilia y los trastornos descritos en la Tabla 3 a continuación).

Ha habido varios trastornos hemorrágicos caracterizados por defectos genéticos moleculares de la membrana plaquetaria, proteínas citoplasmáticas y granulares que normalmente conducen a episodios hemorrágicos prolongados. Si bien cada trastorno es raro, puede ocurrir en 1:1.000.000 de personas (por ejemplo, trombastenia de Glanzmann), en conjunto, un defecto plaquetario hereditario ocurre en 1:20.000 personas en todo el mundo como se describe en Wilcox, D.A. White II, G.C, Gene therapy for platelet disorders: studies with glanzmann's thrombasthenia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 1:2300-2311, (2003) y Wilcox, D. A., White II, G.C: Gene therapy for platelet disorders. In: Platelets. Segunda edición, A.D. Michelson (ed.), Academic Press, San Diego, Capítulo 71:1313-1325, (2007) y Tercera edición, Capítulo 64: In Press (2012). Además de los defectos plaquetarios hereditarios, la terapia génica con células madre hematopoyéticas dirigida a agentes terapéuticos dirigidos a la superficie de las plaquetas, el citoplasma o los gránulos se utiliza como estrategia para corregir otros trastornos de la hemostasia, la trombosis, la respuesta inmunitaria y el cáncer.

Tabla 3

(Continuación)

En algunas realizaciones, los procedimientos terapéuticos son procedimientos en los que se recolectan células madre hematopoyéticas autólogas de un animal (por ejemplo, un ser humano) que necesita tratamiento, se modifican usando uno de los vectores descritos en este documento y se reintroducen en el donante original. Dichos procedimientos autólogos reducen el riesgo de respuestas autoinmunitarias o de rechazo que pueden ocurrir con la infusión de factores de coagulación del donante y permiten limitar la transducción de genes a células madre hematopoyéticas a través de la transducción.

Un procedimiento ejemplar para la modificación de células madre hematopoyéticas se describe en Aiuti et al. (Science 341: 865 (2013). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el procedimiento incluye los pasos de administrar citocinas para movilizar células madre de sangre periférica en la sangre periférica; realizar aféresis y selección de perlas magnéticas para células CD34+; preacondicionamiento usando, por ejemplo, bulsulfán y/u otros agentes como la fludarabina y el uso de un vector de transferencia de genes viral (por ejemplo, lentiviral) para modificar las células madre antes de que se reintroduzcan en el paciente.

En algunas realizaciones, las células madre hematopoyéticas se movilizan usando la administración de citocinas u otros agentes de movilización (véase, por ejemplo, Fu et al., Blood Rev. 2000 Dec; 14 (4): 205-18 y la patente de los Estados Unidos 7417026 para una discusión de los protocolos de movilización), aunque se pueden utilizar otros protocolos adecuados.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, las citocinas de movilización incluyen, pero no se limitan a, interleucina-3 (IL-3), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), también conocido como fármaco Neupogen aprobado por la FDA de Amgen, célula madre factor (SCF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), y secuencial o coadministración de uno o más de IL-3, GM-CSF, SCF y GM-CSF.

Los intervalos de dosificación adecuados para los agentes de movilización varían, pero en general, los compuestos se administran en el intervalo de aproximadamente 0,1 pg/kg-5 mg/kg de peso corporal; preferentemente, el intervalo es de aproximadamente 1 pg/kg-300 pg/kg de peso corporal; más preferentemente alrededor de 10 pg/kg-100 pg/kg de peso corporal. Para un sujeto humano típico de 70 kg, por tanto, el intervalo de dosificación es de aproximadamente 0,7 pg-350 mg; preferentemente alrededor de 700 pg-21 mg; lo más preferentemente alrededor de 700 pg-7 mg. Las dosis pueden ser mayores cuando los compuestos se administran por vía oral o transdérmica en comparación con, por ejemplo, administración i.v. Los compuestos se pueden administrar como una sola dosis en bolo, una dosis a lo largo del tiempo, como en administración i.v. o transdérmica, o en múltiples dosis.

La cantidad de compuesto activo a administrar puede variar según el criterio del experto en la materia. La cantidad de compuesto activo a administrar al receptor está dentro de los intervalos descritos anteriormente para la movilización de células madre. Sin embargo, la administración de tales cantidades variará de acuerdo con los estándares establecidos por los médicos en el campo de la terapia de mejora con células madre.

Después de la movilización, las células madre de sangre periférica (PBC) CD34+ se aíslan de las células mononucleares de bajo peso molecular ||||mediante perlas inmunomagnéticas utilizando el sistema de automacs de Miltenyi (para animales grandes, perros, 25-45 kg) y el sistema Clinimacs de Miltenyi (para humanos). aprobado recientemente para uso clínico por la FDA. Los CD34+PBC se modifican genéticamente usando los vectores descritos en este documento y se reintroducen en un sujeto que lo necesite mediante un trasplante autólogo de células madre. En algunas realizaciones, se utiliza un único tratamiento para proporcionar protección a largo plazo contra episodios de hemorragia. En algunas realizaciones que tratan la hemofilia, el tratamiento se realiza de forma regular (por ejemplo, semanal, mensual, anual, una vez cada 2, 3, 4, 5 o más años, y similares) para prevenir episodios de hemorragia. En algunas realizaciones, el tratamiento solo se administra cuando ocurren episodios de hemorragia anormal (por ejemplo, después de accidentes, antes o después de la cirugía, etc.). En algunas realizaciones, la terapia de mantenimiento se administra en combinación con terapia adicional cuando ocurren episodios de hemorragia anormal.

Experimental

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma. Ejemplo 1

Materiales y procedimientos

Estirpes celulares.

Se obtuvieron estirpes celulares humanas transformadas de American Type Culture Collection (Rockville, MD) y se propagaron en las condiciones descritas para promegacariocíticos (estirpe celular transformada Megacariocitos HEL) (Bray, P.F. et al. J Clin Invest 80, 1812-1817, (1987); Greenberg, S.M., et al., Linfoma de células T (KT1), (Okamoto, T., et al. J Biol Chem 261, 4615-4619 (1986)) B-cell lymphoma B (Raji), (Choi, JH et al. International immunopharmacology 8, 852-858, 2008.01.037 (2008)) Erythroleukemia (K562), (Gauwerky, C. & Golde, DW Blood 56, 886-891 (1980)) y Epithelial (HeLa) (Goldstein, MN, et al., Annals of the New York Academy of Sciences 89, 474­ 483 (1960)).

Vectores promotores del gen reportero de luciferasa.

Construcciones del Promotor del Gen ITGA2B: se aisló ADN genómico de la estirpe celular de pro-megacariocitos humanos, Dami, 49 y los fragmentos del promotor del gen ITGA2B humano se amplificaron mediante PCR utilizando el cebador codificante “-1218” (5'-TTACGCGTCGACAGATCTAAATGTGGCTGGTTACCCC-3') “-1198” (SEQ ID NO: 1) (negrita) de ITGA2B o “-889” (5'-TTACGCGTCGACAGATCTGTGCTCAATGCTGTGCC-3') “-872” (SEQ ID NO: 2) (negrita) de ITGA2B, o “-673” (5'-TTACGCGTCGACAGATCTCCTTGCCACCTAGACC-3') “-654” (SEQ ID NO: 3) (negrita) de ITGA2B y cebador anticodificante (5'-GGCGTCTTCCATGGTCCTTCTTCCACAACC-3') (SEQ ID NO: 4) codificando los nucleótidos 99 a 86 de luciferasa pGL3-BASIC y nucleótidos 30 a 15 (negrita) del promotor del gen ITGA2B. La identidad correcta de las construcciones se confirmó mediante análisis de secuencia de nucleótidos. PCMVLuc: una digestión de restricción BglII y HindIII del promotor génico no específico de tejido de citomegalovirus (878 pb) de pRc/CMV (Invitrogen) se liga al vector pGL3-Luciferasa básica (Promega, Madison, WI). Esta construcción sirvió como control positivo para la expresión génica de alto nivel dentro de todos los tipos de células; por tanto, se asignó un nivel arbitrario de 100 % de actividad luciferasa para cada estirpe celular (Fig. 1).

PGL3-BasicLuc: construcción de control negativo para 0 % de actividad luciferasa (Fig. 1) porque carece de un promotor génico para impulsar la transcripción del gen luciferasa (Promega).

PCMVnlac: las estirpes celulares se cotransfectaron con una de las construcciones pITGA2BLuc y pCMVnlac que codifica el gen marcador de la p-galactosidasa para normalizar la expresión del transgén (Wilcox et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96 (17): 9654-9659.

Ensayo informador del promotor del gen de luciferasa.

Las estirpes celulares (2x107) se cotransfectaron con (20) |jg) del constructo promotor del gen ITGA2B (-1218, -889, -673) (Fig. 1A) o el control positivo (CMV) o negativo (Basic) que codifican luciferasa de luciérnaga y pCMVnlac (20 |jg) que codifica p-galactosidasa.49 En resumen, cuarenta y ocho horas después de la cotransfección, las células se lavaron, recolectaron y los lisados se prepararon y congelaron a -80 °C usando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega). Se midió la actividad de luciferasa con un luminómetro modelo 20 de Turner Designs. La detección de la actividad de la p-galactosidasa se realizó para normalizar la expresión transgénica transitoria para cada estirpe celular con un ensayo enzimático ELISA sensible que midió el cambio colorimétrico con el sustrato para la pgalactosidasa, p-D-galactofranósido rojo clorofenol (CPRG) (Eustice DC, et al. al., Biotechniques 1991, 11 (6): 739740, 742-733). El porcentaje de actividad luciferasa se determinó comparando el valor medio de las Unidades Relativas de Luz (RLU) del valor de luciferasa/CPRG Vmáx para cada construcción para revelar la eficacia de transfección para cada estirpe celular. A la RLU para pCMVLuc se le asignó arbitrariamente un valor del 100 % y todos los demás resultados se calcularon para cada vector basándose en ese valor como se muestra en la figura 1A. Vector lentiviral impulsado por promotor ITGA2B para BDDFVIII humano.

Los vectores de transferencia genética ITGA2B -(M) WPTS se derivan de un vector lentivírico de tipo 1 del VIH (D. Trono, Universidad de Ginebra, Suiza). 51 El vector lentivírico p-889ITGA2B-BDDFVNI-WPTS (Fig. 1B) codifica un fragmento de nucleótidos de -889 a 30 del promotor ITGA2B humano y la molécula BDDFVIII humana. 16 El vector lentivírico p-673ITGA2B-FvWSPD2-BDDFvIlI-WPTS (Fig. 1C) codifica un fragmento del promotor del gen ITGA2B humano del nucleótido -673 al 30 seguido de un fragmento del propéptido del factor Von Willebrand humano (FvWpp que codifica el péptido señal FvW de 540 aminoácidos (SP; 66 pb) unido al dominio D2 (1,199 pb) y el ADNc que codifica el BDDFVIII humano para permitir la transcripción específica de megacariocitos de una molécula híbrida que usa el péptido SPD2 para transportar el BDDFVIII humano a los gránulos a de plaquetas. 22 Se amplificó ADNc que codifica SP mediante PCR con cebador directo (P) 1 (5'GTTAATCGATATCTCCTTGCCACCTAGA3') (SEQ ID NO: 5), y P2 (5'AATCTGGCAGGAATCATGGTCCTTCTTCCACAACCT3') inverso (SEQ ID NO: 6) y se ligó con D2 amplificado por PCR utilizando P3 (5'AGGTTGTGGAAGAAGGACCATGATTCCTGCCAGATTTGC3') (SEQ ID NO: 7) y P4 (5'CGTCTCGGCCCTTTTGCTGCCATGAGACAG3') inversa (SEQ ID NO: 8). Un promotor ITGA2B ligado a PCR anidado y FvWSPD2 con P5 (5'ATCGATATCTCCTTGCCACCT A3') (SEQ ID NO: 9) y P4. p-889ITGA2-BDDFVIII-WPTS sirvió como plantilla para la PCR de ADNc que codifica un fragmento de BDDFVIII usando P7 (5'CGTCTCAGGGCCACCAGAAGATACTACCT3') directo (SEQ ID NO: 10) y P8 (5'ACGCGTCTTCTCTACATACTAGTA3') inverso (SEQ ID NO: 11) para sintetizar el ADNc que se liga directamente a FvWD2. Todos los productos de PCR se clonaron en pCR-Blunt II-TOPO (Life Technologies, Grand Island, NY) usando sitios de restricción únicos -673ITGA2B-SPD2 (ClaI y BsmBI) ligados a 5'hBDDFVIII (BsmBl y MluI) con 3'BDDFVIII (MluI y Spel). Todos los fragmentos se clonaron en el vector lentivírico pWPTS y se confirmó la identidad correcta mediante análisis de secuencia de nucleótidos. Se generaron viriones recombinantes a partir de cotransfección transitoria de tres plásmidos seguida de recolección de sobrenadante, concentración de 500 veces por centrifugación y almacenamiento a -80 °C hasta su utilización (Fang J, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011, 108 (23): 9583-9588). El título de virión se determinó mediante RT-PCR (Lizee G, et al., Hum Gene Ther 2003, 14 (6): 497-507). Replication-competent virions were confirmed absent from stocks with marker rescue assays (Wilcox et al., Blood 2000, 95 (12): 3645-3652).

Perros

Se realizaron estudios de trasplante autólogo y transferencia de genes CD34+ G-PBC movilizados por citocinas utilizando perros deficientes en FVIII afectados con hemofilia A (Universidad de Carolina del Norte, Chape1Hill, NC) (Lozier JN, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99 (20): 12991-12996) y fueron aprobados por los Comités Institucionales de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Carolina del Norte y el Colegio Médico de Wisconsin, que son instalaciones acreditadas de la Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio.

Aislamiento, transducción, trasplante de CD34+ G-PBC canino.

Se inyectaron diariamente 19 perros machos adultos (1,25, 4,25 y 6,5 años) deficientes en FVIII con factor estimulante de colonias de granulocitos recombinantes caninos (crG-CSF; 10 pg/kg/d) y factor de células madre (crSCF; 5 pg/kg/d) (Amgen, Thousand Oaks, CA). La recolección de G-PBC se realizó al tercer día usando un Separador de Células Sanguíneas COBE Spectra. Se aislaron G-PBC mononucleares con Fico-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). CD34+ G-PBC se seleccionaron con biotina-conjugado-1H6 Ab (1 mg/ml) (Richard Nash, Fred Hutchinson Research Institute, Seattle, WA) y perlas inmunomagnéticas anti-biotina (dilución 1:5) en un separador magnético de células Automacs (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CALIFORNIA). Se transdujeron CD34+ G-PBC con el vector lentivírico -889ITGA2B-BDDFVIII-WPTS o -673ITGA2B-FvWSPD2-BDDFVIII-WPTS. Brevemente, se sembraron 4 x 106 células/pozo en una placa de 6 pozos (Falcon-Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) recubierta con 20 |jg/cm2 de RetroNectina (Takara Shuzo, Otsu, Shiga, Japón) y se incubaron con 1,0 x 104 lentiviriones ITGA2B-FVIII./celda en X-Vivo 10 que contiene ligando de Fc S, rhIL-3, rcaIL-6, rcaSCF, rhTPO y rhflk2/flt3 al10 %. Aproximadamente 3 x 106 CD34+ G-PBC transducido con FVIII/kg y 2 x 108 CD34 (-) G-PBC se infundieron en la vena cefálica de cada receptor de trasplante autólogo preacondicionado con una dosis no mieloablativa de 5-10 mg/kg de Busulfex®. La inmunosupresión transitoria administrada durante aproximadamente 90 días después del trasplante con 10 mg/kg/d de ciclosporina (Gengraf®, Abbott Laboratories, North Chicago, IL) y 8 mg/kg/d de MMF (Tabla 1) (Fang et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011, 108 (23): 9583-9588).

Recolección de sangre.

La sangre se recolectó en tiempos preseleccionados en un tubo de vapor que contenía anticoagulante EDTA al 7,5 % (Fang et al., Supra). Se contaron las células sanguíneas en un analizador de hematología Vet ABC (scil animal care company, Gurnee, IL). Las plaquetas se aislaron con Fico/Lite™ (Atlanta Biologicals, Norcross, GA), se lavaron con PBS y se usaron directamente para citometría de flujo inmunofluorescente o análisis de actividad de FVIII:C. Los leucocitos se aislaron con Ficoll-Paque Plus® (GE Healthcare) de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

Anticuerpos.

Un Ab monoclonal murino de 1 °a “1H6” CD34 canino (1 mg/ml) era del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson (Seattle, WA).27 Un Ab policlonal de fibrinógeno anticonejo de oveja de 1 ° (5 pg/ml) que reconoce el fibrinógeno canino se compró de (Enzyme Research). Abs monoclonal de 1 ° (5-10 pg/ml), MBC 103,3 y 301,3 (RRMontgomery, BloodCenter of WI, Milwaukee, WI), reconocen epítopos en BDDFVlII humano.53 Abs de 2 ° usados fueron Alexa Fluor® 488 F (ab') 2 conjugado a un fragmento de IgG anti-oveja de burro (H L) (dilución 1:1.000) y un fragmento Alexa Fluor® 568 F(ab')2 de IgG anti-ratón de cabra (H L) (1:500 dilución) eran de Life Technologies (Grand Island, NY).

Microscopía confocal inmunofluorescente.

Las plaquetas caninas se fijaron con formalina tamponada al 3,7 % (vol/vol), permeabilizada en Triton X-100 al 0,5 % (en Hepes 20 mmol/L, sacarosa 300 mmol/L, NaCl 50 mmol/L y NaCl 3 mmol/L). MgCl2, pH 7,0) y se bloqueó con suero de cabra normal al 2,5 % en HBSS. Las plaquetas se incubaron con un Ab policlonal de oveja de 1 ° para fibrinógeno canino y Ab monoclonal de 1 ° (MBC 103,3 y 301,3) para FVIII humano (5 ug/ml) durante la noche a 4 °C.53 El fragmento F(ab')2 de burro conjugado con Alexa Fluor® 488 IgG (H L) anti-oveja se utilizó como Ab de 2 ° (dilución 1:1,000) para detectar fibrinógeno y un fragmento F(ab')2 de cabra conjugado con Alexa Fluor® 568 de IgG (H L) anti-ratón utilizó Ab conjugado de 2 ° (dilución 1:500) para detectar la presencia de FVIII durante 30 min a 25 °C. Las plaquetas se montaron con Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA). La inmunofluorescencia se detectó con un microscopio confocal multifotón Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss, Inc. Oberkochen, Alemania) (Wilcox DA, et al., Journal of thrombosis and hemostasis: JTH 2003, 1 (11): 2300-2311). Las plaquetas aisladas de perros deficientes en FVIII se utilizaron como controles negativos. El Ab de control de isotipo inespecífico sirvió como controles negativos. Se obtuvieron imágenes de las plaquetas mediante secciones Z tomadas para cada campo y la serie Z completa (12-25 imágenes) se combinaron en una proyección apilada. Las proyecciones se fusionaron utilizando el programa de software Confocal Assistant (Bio-Rad). Los colores asignados por ordenador se basaron en las intensidades de las superposiciones de mapas de bits, con Alexa488-fluorocromo representado por píxeles verdes, Alexa568-fluorocromo representado por píxeles rojos y la co-localización de los dos anticuerpos conjugados con fluorocromo representados por píxeles amarillos.

Citometría de flujo inmunofluorescente.

Se aislaron plaquetas caninas de la sangre y se trataron con reactivos Cytofix™ y PERM/WASH™ (BD Biosciences) para la detección intracelular de BDDFVIII. Las plaquetas se incubaron con un Ab monoclonal de 1 ° (MBC 103,3 & 301,3) a FVIII humano (5 ug/ml) durante 30 minutos a 4 °C y luego se incubaron con un fragmento F(ab')2 de cabra conjugado con Alexa Fluor® 568 IgG (H L) anti-ratón conjugado con Ab de 2 ° (dilución 1:500) durante 30 minutos a 4 °C. Las plaquetas aisladas de perros deficientes en FVIII se utilizaron como controles negativos. El Ab de control de isotipo inespecífico sirvió como controles negativos. Las células se recogieron y analizaron en un citómetro de flujo Accuri® C6 (Accuri Cytometers, Inc., Ann Arbor MI) utilizando el software de análisis Accuri.

Etiquetado Inmunogold.

Las plaquetas se fijaron en glutaraldehído al 1,25 % (Fluka AG, Buchs, Suiza), se infundieron con sacarosa 2,3 M (Fluka) y se congelaron con un sistema de congelación Reichert KF 80 (Leica, Viena, Austria). Se prepararon secciones de “ 80 nm con el ultramicrótomo Ultracut E equipado con un accesorio cryokit FC 4E y se colocaron sobre rejillas de níquel revestidas con colodión. Las rejillas se incubaron durante 10 min en PBS con BSA al 1 % y luego se colocaron en gotas (10 pg/ml) de Ab de 1 ° a FVIII (301,3) durante 1 hora a 25 °C. Las secciones se incubaron durante 1 hora con un Ab de 2 ° de cabra anti-ratón adsorbido en partículas de oro de 10 nm (dilución 1/100 de AuroProbe EM G10). Los controles incluyeron el uso de una IgG independiente de la misma especie y en la misma concentración.

Microscopiía de electrones.

Las rejillas se tiñeron con acetato de uranilo y osmio y luego se incrustaron en metilcelulosa antes de la observación con un microscopio electrónico de transmisión Jeol j EM-1010 (Jeol, Croissy-sur-seine, Francia) a 80 KV.

Activación de plaquetas inducida por agonistas.

Se aislaron plaquetas de sangre periférica circulante, se lavaron y se activaron con agonistas fisiológicos de activación plaquetaria. Para inducir la activación, las plaquetas se resuspendieron en tampón de Tyrode (2,5 x 106/ml) que contenía CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, 25 pM cada uno de difosfato de adenosina (^a D^p ) (Sigma), epinefrina (Bio/Data Corporation, Horsham, PA) y péptidos activadores del receptor de trombina canina: PAR1 (SFFLKN-NH2), PAR3 (TRFGAP-NH2) y PAR4 (SFPGQP-NH2) durante 30 minutos a 37 °C como se describió previamente (Fang et al., Supra). Se incubaron alícuotas separadas en tampón de Tyrode sin agonista como control negativo. Las plaquetas se sedimentaron mediante centrifugación y el sobrenadante se aspiró y se desechó de las muestras tratadas con agonista y de control negativo. El sedimento de plaquetas se congeló inmediatamente a -80 °C hasta que se analizó la actividad de FVIII:C usando el ensayo coatest.

Detección por PCR del vector lentivírico en ADN genómico sanguíneo.

Se aisló ADN con un mini kit de sangre de ADN QIAamp® (Qiagen, Maryland, EE. UU.) A partir de leucocitos caninos purificados con Ficoll-Paque ™ Plus (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). p-889ITGA2-BDDFVIII-WPTS sirvió como control positivo. El análisis de PCR se realizó con polimerasa Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) en un instrumento PTC200 (MJ Research, Watertown, MA) con el cebador directo P1 (5'-ACGCTATGTGGATACGCTG-3') y el cebador inverso P2 (5-AACACCACGGAATTGTCAG-3') (SEQ ID NO: 12) para sintetizar un producto primario de 318 nucleótidos que codifica el WPRE (Figura 1B, C). Se realizó una reacción de PCR secundaria con el cebador directo anidado P3 (5-TGGATACGCTGCTTTAATGC-3') (SEQ ID NO: 13) y el cebador inverso P4 (5-AATTGTCAGTGCCCAACAG-3') (SEQ ID NO: 14) que codifica un producto de 302 bp de WPRE (Fig. 5A).

RT-qPCR para detectar la eficiencia de la transducción lentiviral.

Se midió el porcentaje de marcado de genes lentivirales mediante RT-qPCR usando el sistema BIO-RAD CFX96 Real-Time System.52 Brevemente, se midieron 12,5 ul de TaqMan Universal PCR Master Mix (tecnologías Life), una concentración de 900 nM de cada cebador y una sonda de 200 nM. combinado en 20 pl de agua. Luego se agregaron 5 ul de ADN genómico canino y se utilizó PCR 2 min a 50 °C, 10 min a 950 °C y luego 40 ciclos de 15 sa 950 °C y 1 min a 600 °C. Para cada RT-qPCR, un control sin plantilla se incluyó como control negativo. Cada muestra se analizó por triplicado para determinar el número de copias de genes utilizando el software Primer Express (versión 1.0; Applied Biosystems) y el valor medio para el número de copias de transgenes/genoma se convirtió en porcentaje de células sanguíneas periféricas positivas para vector lentivírico (también conocido como eficiencia de transducción) e indicado en la Tabla 1, Columna 8. Los cebadores y la sonda de LTR lentivíricos usados fueron: Fwd: 5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA-3' (SEQ ID NO: 15); Rev: 5'-TGACTAAAAGGGTCTGAGGGA-3' (SEQ ID NO: 16); sonda: 6FAM-TGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTG-MGBNFQ (SEQ ID NO: 17). El gen ITGB3 canino se utilizó como control endógeno para el número de copias del gen con Fwd: 5-ATGCATCCCACTTGCTGGTAT-3' (SEQ ID NO: 18); Rev: 5-TGCCCATCGTTAGGTTGG-3' (SEQ ID NO: 19); sonda: 6FAM-TGCCTGCCAGCCTTCCATCCAG-MGBNFG (SEQ ID NO: 20). El número de copias se basó en el principio TaqMan. Se utilizó una dilución en serie diez veces mayor de las construcciones de plásmido de concentración conocida que contenían secuencias relevantes (vector lentivírico LTR e ITGB3 canino) para crear curvas estándar para la cuantificación de muestras.

PCR mediada por amplificación lineal (LAM).

Se realizó LAM-PCR para localizar los sitios de inserción del vector lentivírico dentro del ADN genómico aislado de leucocitos de sangre periférica. Brevemente, la unión entre la LTR proviral integrada y el genoma del hospedador se seleccionó mediante 2 rondas de PCR lineal [95 °C durante 5 min; (95 °C durante 1 m, 60 °C durante 45 s, 72 °C durante 90 s) x 50; 72 °C durante 10 m] con un cebador biotinilado 5' específico de vector [5'-/biotina/-GAACCCACTGCTTAAGCCTCA-3' (SEQ ID NO: 26)] y se purificó usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina [Dynal M-280]. Los productos fueron de doble cadena usando polimerasa Klenow y cebadores de hexanucleótidos aleatorios y se digirieron con Tsp509I a 65 °C durante 2 h. Se ligaron oligonucleótidos enlazadores de cadena doble direccionales en el extremo no LTR y los productos resultantes se amplificaron mediante PCR anidada [95 °C durante 5 min; (95 °C durante 1 m, 60 °C durante 45 s, 72 °C durante 90 s) x 35; 72 °C durante 10 m] usando cebadores directos específicos de LTR [F1: 5'-/biotina/-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA-3' (SEQ ID NO: 27); F2: 5'-AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT-3' (SEQ ⁱD NO: 28)] y cebadores inversos específicos del casete enlazador [R1: 5-GACCCGGGAGATCTGAATTC-3' (SEQ ID NO: 29); R2: 5'-AGTGGCACAGCAGTTAGG-3' (SEQ ID NO: 30)]. Entre rondas de PCR anidada, los productos se purificaron usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Los productos se visualizaron en geles de agarosa TAE al 2 %. Para la secuenciación, los productos se purificaron en gel y se clonaron en pCR2.1-TOPO, se transformaron en E. coli Top10, se seleccionaron en placas LB-Amp-Xgal y se amplificaron mediante PCR de colonias usando M13F/R.

Evaluación funcional de sitios de integración.

Los productos de secuencia de LAM-PCR que se verificó que contenían la secuencia de LTR proviral se enmascaron para repeticiones genómicas conocidas y características provirales. La secuencia resultante se alineó con el genoma del perro (CanFam 2.0, ensamblaje de mayo de 2005) utilizando el servidor Blat (herramienta de alineación similar a BLAST) en UCSC. Se seleccionaron las secuencias que mapean en una ubicación única en el genoma con una similitud del 95 % y se determinaron los sitios de integración como la base en la alineación genómica que flanquea la secuencia de LTR proviral. Para cada sitio, se determinó el gen RefSeq más cercano y se comparó con una lista de ortólogos de cáncer humano.

Detección de FVIII humano biológicamente activo (FVIIkC).

Se analizaron los lisados de 1 x 108 plaquetas/ml para FVIII:C usando un kit Chromogenix Coatest® SP4 FVIII (DiaPharma, Franklin, OH).12 Se colocaron muestras duplicadas de sobrenadante en pozos sin revestir de una placa de microtitulación de 96 pozos (25 pl/pozo) y los componentes del ensayo (fosfolípido, factor IXa, factor X y cloruro de calcio) se agregaron y se incubaron durante 10 min a 37 °C. Se añadió el sustrato S-675 del factor Xa cromogénico y la placa se transfirió a un lector de microplacas Wallac Victor2 preestablecido a 37 °C. La conversión de S-2675 dependiente del factor Xa está directamente relacionada con la cantidad de FVIII:C en cada pozo. Se construyó una curva estándar trazando cantidades conocidas de FVIII humano recombinante (Kogenate; Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Berkeley, CA) diluido en tampón de lisado de plaquetas usando Vmáx a 405 nm. La Vmáx de cada reacción se convirtió en unidades de actividad de FVIII:C usando el programa de software cinético, SOFTmax, v.2.34 (Molecular Devices). La actividad del FVIII se midió mediante una lectura de punto final a 405 nm, una lectura de fondo a 490 nm se restó de 405 nm. El máximo total FVIII:C/perro se calculó multiplicando el medio FVIII:CU/ml/1 x 108 plaquetas x 92 ml de sangre/kg x peso del perro (kg) x (2 x 108 plaquetas)/1 ml de sangre) utilizando los valores medidos registrados en la Tabla 1 y figura 6.

Ensayo de tiempo de coagulación de sangre total (WBCT).

WBCT es una modificación del tiempo de coagulación de Lee-White usando dos tubos de vidrio siliconizados (Becton-Dickinson, Rutherford, NJ) a 28 °C (Nichols TC, et al., J Thromb Haemost 2012, 10 (3): 474-476). Se extrajo un ml de sangre completa y se distribuyeron 0,5 ml de sangre en cada tubo. Se puso en marcha un temporizador. Después de un minuto, se inclinó un tubo cada 30 segundos y el otro se dejó en reposo. Cuando se formó un coágulo en el tubo inclinado, el segundo tubo se inclinó luego cada 30 segundos hasta que se formó un coágulo. El tiempo para la formación de un coágulo completamente gelificado en el segundo tubo se registró como WBCT. Se recogió sangre de un perro hemostáticamente normal (WBCT 7,5-12,5 min) y de los tres perros experimentales (F20, I42, M64) antes y después del trasplante de G-PBC si los animales no habían sido tratados con plasma durante al menos un mes.

Ensayo de inhibidor para detectar la respuesta inmunitaria al FVIII humano.

Se examinó el plasma sanguíneo canino (F20, 142 y M64) en busca de inhibidores con un ensayo de mezcla de tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) que detecta anticuerpos inhibidores del factor de coagulación VIII o IX como se describió anteriormente (Langdell RD, et al., J Lab Clin Med 1953, 41 (4): 637-647; Sahud MA. Semin Thromb Hemost 2000, 26 (2): 195-203; Matrai J, et al., Hepatology 2011, 53 (5): 1696-1707). Brevemente, los plasmas de prueba se incuban en una mezcla 1:1 con plasma normal durante 2 ha 37 °C y luego la mezcla incubada se analiza usando reactivos de aPTT estándar. Plasma de perros con hemofilia A con títulos conocidos de inhibidor de Bethesda (BIU) que tiene reactividad cruzada e inhibe el FVIII humano (control positivo) y el plasma de perros sin inhibidores (control negativo) se analizaron simultáneamente para comparar.

Resultados

Diseño y estrategia de vectores lentivíricos dirigidos a plaquetas

Un ensayo de indicador de luciferasa reveló que los fragmentos del promotor del gen ITGA2B humano de longitud completa permitían una transcripción del gen específico de plaquetas comparable (Figura 1A). Tres fragmentos de promotor ITGA2B diferentes (-1218, -889 y -673) dirigieron niveles similares de actividad luciferasa dentro de una estirpe celular pro-megacariocítica. Por el contrario, la actividad luciferasa impulsada por el promotor ITGA2B permaneció indetectable en los otros linajes de células sanguíneas y una estirpe de células epiteliales. Cada promotor ITGA2B codifica factores Ets y GATA que permiten un alto nivel de transcripción de genes de megacariocitos y una región represora que inhibe la expresión dentro de otros linajes (Prandini MH, et al., Blood 1996, 88 (6): 2062-2070).20 Como resultado, se probaron dos vectores lentivíricos de transferencia génica para determinar la eficiencia óptima de transducción de células madre hematopoyéticas y la capacidad de mejorar la función hemostática con BDDFVIII derivado de plaquetas en perros con hemofilia A para desarrollar una estrategia para la terapia génica humana. Dos perros recibieron una infusión de G-PBC transducida con un vector lentivírico que codifica un fragmento que comienza en nucleótidos -889 del promotor ITGA2B humano que se muestra capaz de dirigir la transcripción específica de megacariocitos de BDDFVIII (Figura 1B).21 Aunque el FVIII está ausente en las plaquetas en condiciones normales, este enfoque resultó exitoso para almacenar BDDFVIII viable en la progenie plaquetaria derivada de CD34+ G-PBC humano cultivado en tejido,12 y médula ósea transducida por vector lentivírico trasplantada en ratones con hemofilia A (Shi et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 2007, 5 (2): 352-361). Un perro recibió una infusión de G-PBC transducida con un nuevo vector lentivírico que codifica el fragmento más corto del promotor ITGA2B (-673) diseñado para inducir la expresión específica de megacariocitos de una molécula híbrida de BDDFVIII fusionad con el péptido señal propéptido del factor von Willebrand (FvW) y dominio D2 (SPD2) para facilitar el tráfico de BDDFVIII en el compartimento de gránulos a (Figura 1C) (Haberichter SL, et al., Arterioscler Thromb Vase Biol 2002, 22 (6): 921-926; Haberichter SL, et al., Blood 2003, 101 (4): 1384­ 1391). El FvW es un constituyente de gránulos a normal en las plaquetas humanas (aunque ausente en las plaquetas caninas) (Nichols TC, et al., Blood 1993, 81 (10): 2644-2651) que sirve como proteína portadora del FVIII en plasma de humanos y caninos (Kaufman RJ, et al. Molecular & Cellular Biology 1989, 9 (3): 1233-1242).

Estrategia para la terapia génica con células madre hematopoyéticas

Para diseñar un protocolo clínicamente relevante, se movilizaron células madre hematopoyéticas caninas desde la médula ósea a la sangre periférica con citocinas caninas (cG-CSF & cSCF) y se realizó aféresis de G-PBC sin incidentes adversos idénticos a estudios previos usando perros GT (Fang et al., supra). Se aislaron linfocitos mononucleares con Ficoll-Paque Plus del producto de aféresis y luego se purificaron células caninas positivas al antígeno CD34 (CD34+) mediante selección inmunomagnética (McSweeney PA, et al., Blood 1998, 91 (6): 1977­ 1986). La Tabla 1 resume las condiciones para el trasplante autólogo de tres perros con hemofilia A transfundidos con aproximadamente 3 x 106 CD34+ G-PBC transducido con FVIII/kg de peso corporal donde cada célula diana fue transducida con aproximadamente 1 x 104 partículas víricas totales/CD34+ G-PBC sin el uso de selección ex vivo o in vivo para células transducidas (columnas 4, 5). Se empleó un régimen de acondicionamiento previo al trasplante no mieloablativo para crear un nicho en la médula ósea para que las células recién trasplantadas se injertaran (Tabla 1, Columna 2). La intensidad del régimen de acondicionamiento está determinada por el nivel al que la dosis se vuelve tóxica para los órganos. Estudios anteriores realizados con modelos caninos normales han demostrado que el quimerismo hematopoyético mixto donante/huésped alogénico estable se puede establecer de manera segura mediante la administración de una dosis subletal de busulfán (un fármaco preferentemente tóxico para las células madre hematopoyéticas) para el acondicionamiento previo al trasplante. Un informe reciente también demostró el uso exitoso de busulfán a 10 mg/kg para la transferencia de genes de células madre hematopoyéticas para corregir la deficiencia de adhesión de leucocitos caninos (Bauer TR, Jr., et al., Nat Med 2008, 14 (1): 93-97), seguida de inmunosupresión transitoria con micofenolato de mofetilo (MMF) y ciclosporina (CSP) después de un trasplante de médula ósea idéntica con complejo mayor de histocompatibilidad (Enssle J, et al., Hum Gene Ther 2010, 21 (4): 397­ 403). Sin embargo, este nivel de régimen de acondicionamiento previo al trasplante resultó inapropiado para animales con hemofilia A, ya que el primer perro (F20) trasplantado en el estudio actual requirió suplementos diarios con (c) FVIII canino en forma de productos de plasma canino y cFVIII recombinante para tres meses después del trasplante de G-PBC. También se infundió ácido épsilon-aminocaproico (EACA) después del trasplante de G-PBC hasta que el BDDFVIII humano alcanzó un nivel significativo en las plaquetas. EACA es un inhibidor sintético eficaz del sistema plasmina-plasminógeno y controla la hemorragia subaracnoidea, el sangrado genitourinario por muchas causas y la cirugía dental en hemofílicos (Griffin JD, et al., Semin Thromb Hemost 1978, 5 (1): 27-40). A modo de comparación, el número de episodios hemorrágicos graves que requirieron tratamiento con suplemento de cFVIII se registró 1 año antes y 2,5 años después del trasplante de G-PBC para cada perro (Tabla 1, Columnas 10, 11) (Niemeyer GP, et al., Experimental Hematology 2003, 31 (12): 1357-1362). Como resultado de la observación de episodios hemorrágicos frecuentes con F20, se administró un régimen de acondicionamiento más suave que consistía en una dosis más baja de busulfán a los dos siguientes receptores de trasplante (142,5 mg/kg; M64,7 mg/kg). En conclusión, los tres perros recibieron inmunosupresión transitoria (Fang et al., Supra) y suplementos diarios de cFVIII y EACA durante tres meses después del trasplante de G-PBC como régimen de trasplante estándar hasta que se observaron niveles de BDDFVIII humano fácilmente detectables en pruebas de plaquetas y hemocultivo indicaron la ausencia de hemorragia GI (Fang et al., supra). En última instancia, se observó que 142 y M64 no requirieron más suplementos de FVIII ya que no se produjeron episodios hemorrágicos graves durante 2,5 años después del trasplante (Tabla 1, Columna 11).

Estudios biológicos de plaquetas FVIII

Se realizó microscopía inmunofocal para determinar si BDDFVIII se estaba sintetizando y almacenando en plaquetas después del trasplante de G-PBC. En la Figura 2A se muestran imágenes de los resultados del análisis microscópico de plaquetas aisladas de un perro (142) que recibió un trasplante autólogo de G-PBC transducida con vector lentivírico, que representa el resultado del análisis de los tres perros (F20, 142, M64). Había un patrón de tinción punteada para un marcador específico de gránulos a de plaquetas, fibrinógeno (Fg) (panel izquierdo). También se detectó BDDFVIII humano en un patrón punteado dentro de las plaquetas (panel medio). Tenga en cuenta que la tinción de BDDFVIII se co-localizó con frecuencia dentro de Fg como es evidente por la aparición de una tinción amarilla cuando el panel izquierdo (Fg) y el medio (BDDFVIII) se superpusieron, lo que indica que ambas proteínas podrían almacenarse juntas dentro de los gránulos a de plaquetas (panel derecho) (Wilcox et al., J Thromb Haemost2003, 1 (12): 2477-2489).

Se realizó microscopía inmunoelectrónica para determinar si el BDDFVIII exógeno se transportaba específicamente a los gránulos a de plaquetas. El análisis de inmunogold se realizó en secciones ultrafinas de plaquetas con un Ab de 1 ° a FVIII y un Ab de 2 ° adsorbido en partículas de oro de 10 nm (Figura 2B). El gránulo a parecía normal en tamaño y forma dentro de las plaquetas de perros con deficiencia de FVIII, así como de receptores de trasplantes de FVIII. BDDFVIII está ausente en los gránulos a de plaquetas de un control negativo deficiente en FVIII (panel izquierdo). Por el contrario, se detectó BDDFVIII dentro de los gránulos a y el citoplasma de plaquetas aisladas de los tres perros (F20, 142, M64). Este resultado es consistente con las observaciones reportadas para la expresión ectópica de BDDFVIII dentro de las plaquetas de ratones transgénicos FvW (-/-) afectados con la enfermedad de von Willibrand (Yarovoi H, et al., Blood 2005, 105 (12): 4674-4676). Plaquetas transducidas -673ITGA2B -FvWSPD2-BDDFVIII de M64 almacenaron el mayor nivel de BDDFVIII dentro del gránulo a (panel derecho). Además, el BDDFVIII se detectó raramente dentro de los sistemas de membranas en el citoplasma plaquetario, lo que indica que el FvWSPD2 de hecho tenía una mayor eficiencia para transportar BDDFVIII directamente al compartimento de gránulos a.

El análisis de citometría de flujo inmunofluorescente de plaquetas confirmó que M64 almacenaba el mayor nivel de FVIII por plaqueta porque las plaquetas M64 mostraban la intensidad fluorescente media más alta para la detección de FVIII seguida de 142 y F20 en comparación con las plaquetas de control negativo deficientes en FVIII (figura 3). Estos resultados indican que la construcción de dirección FvWSPD2 imparte una ventaja para almacenar BDDFVIII dentro de las plaquetas. Posteriormente, el uso del promotor del gen -673ITGA2B más pequeño permite que el vector lentivírico acomode el inserto terapéutico más grande (en este caso, el FvWSPD2-BDDFVIII); y, por lo tanto, puede ser más útil para la transferencia de genes que los promotores -1218 o -889 ITGA2B.

Se realizó un ensayo Chromogenix Coatest® SP4 FVIII para determinar si las plaquetas activadas podían secretar una forma biológicamente activa de BDDFVIII (FVIII:C) como se mostró anteriormente para megacariocitos humanos activados en cultivo de tejidos (Wilcox et al., Thromb Haemost 2003, 1 (12): 2477-2489.12 En la Figura 4, los lisados de plaquetas de un perro deficiente en FVIII muestran que el nivel de actividad de fondo de BDDFVIII:C prácticamente no cambia para las plaquetas no tratadas (Negro, - Agonista) y activadas (Blanco, Agonista). En contraste, la actividad de FVIII:C se detectó fácilmente en el lisado de plaquetas inactivas no tratadas de F20, 142 y M64. Además, los niveles de BDDFVIII:C disminuyeron en lisados de plaquetas estimuladas por una mezcla de agonistas fisiológicos de activación plaquetaria: ADP, epinefrina y ^pA^r 1,3,4 canino en los tres perros experimentales. En resumen, los perros que recibieron G-PBC transducida con BDDFVIII muestran una disminución apreciable en la actividad de FVIII:C solo después de la activación plaquetaria, lo que indica que las plaquetas de animales de experimentación se pueden inducir a que secreten FVIII dentro de la vasculatura.

Análisis genómico del vector lentivírico

El elemento WPRE del vector lentivírico se detectó mediante PCR de ADN genómico aislado de leucocitos recogidos de F20, 142 y M64 durante al menos 2,5 años después del trasplante (Fig. 5A). El análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) de ADN genómico aislado de leucocitos de sangre periférica reveló que la eficiencia de transducción para cada vector lentivírico fue del 1 % (F20), 4 % (142) y 2 % (M64) (Tabla 1, Columna 8). La detección del vector lentivírico mediante análisis genómico en ausencia de la aparición de oncogénesis insercional es consistente con la buena salud general de todos los perros con una evaluación frecuente de los recuentos sanguíneos periféricos y frotis de sangre periférica que documentan la morfología normal y el número de células hematopoyéticas circulantes. También se realizó PCR-Mediada por Amplificación Lineal (lAm ) para determinar el patrón de integración del vector lentivírico dentro del genoma de los perros experimentales. La Figura 5B muestra que el vector lentivírico no estaba presente dentro del genoma de un control deficiente en FVIII, mientras que parecen estar presentes múltiples bandas en el ADN genómico de perros trasplantados (F20, 142 y M64). Se detectó un sitio de inserción distinto específicamente en el cromosoma 4 para F20 y el cromosoma 35 para M64. Los resultados demuestran que la inserción del vector lentivírico podría detectarse dentro de 142 ^a Dⁿ genómico, aunque un sitio de inserción no pudo localizarse en una región precisa del mapa del genoma canino actual (Sutter NB, Ostrander EA. Dog star rising: the canine Nat Rev Genet 2004, 5 (12): 900-910). En resumen, los resultados indican que la mutagénesis insercional no se había producido cuando se concluyó este estudio (aproximadamente 2,5 años después del trasplante). Esto es consistente con otro informe que encontró que los vectores lentivíricos generalmente se insertan en áreas benignas del genoma en animales y humanos (Biffi A, et al., Blood 2011, 117 (20): 5332-5339).

Eficacia de la terapia génica dirigida a plaquetas para la hemofilia A

Se observó anteriormente que las células hematopoyéticas humanas podrían servir como una fuente de tejido primario para la síntesis de una forma funcional de BDDFVIII humano (FVIII:C) dentro de megacariocitos humanos cultivados en tejido (Shi Q, et al., Molecular Genetics y Metabolism 2003, 79 (1): 25-33.), en plaquetas de sangre periférica aisladas de ratones xenotrasplantados con G-PBC humana transducida con BDDFVIII, 12 y en un modelo murino para hemofilia A que recibió un trasplante de transducido con BDDFVIII médula ósea (Shi Q, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2007, 5 (2): 352-361). El estudio actual (Figura 6) muestra que la actividad de FVIII:C (“ 5-15 mU/ml/108 plaquetas) se puede detectar mediante análisis cromogénico durante al menos 2,5 años después del trasplante autólogo de G-PBC en cada perro con los niveles más altos que aparecen aproximadamente un año después del trasplante y típicamente se estabiliza a “ 5-10 mU/ml/108 plaquetas (F20, 142, M6). Las muestras de perros deficientes en FVIII sirvieron como controles negativos para cada punto de tiempo (línea negra).

Para determinar el nivel total de actividad de FVIII:C presente en cada animal en un momento dado, se observa que hay “ 2 x 108 plaquetas/1,0 ml de sangre y “ 92 ml de sangre/kg en perros. Usando los valores registrados en la Tabla 1 para el peso y la eficiencia de transducción y el nivel medio de FVIII:C de cada perro calculado a partir de los puntos de datos que se muestran en la Figura 6, se estima que hay aproximadamente 0,230 U (F20), 1,325 U (142) y 0,676 U (M64) FVIII:C/perro almacenado dentro de todas las plaquetas circulantes. Para poner estos valores en perspectiva, el término 1 U FVIII:C/ml define la actividad del FVIII al 100 % en el plasma de referencia de un perro normal (20 kg); por lo tanto, un animal normal (20 kg) tiene aproximadamente 800 unidades totales de FVIII en su volumen de plasma en un momento dado. Los resultados de la Figura 6 muestran que se produjeron múltiples episodios de hemorragia grave en cada animal un año antes de la G-PBC que requirió una transfusión con suplementos de cFVIII. Tenga en cuenta que, para prevenir el sangrado debido al protocolo de terapia génica, cada perro recibió suplementos diarios de cFVIII a partir del primer día del protocolo de trasplante de G-PBC. También se administró EACA a los perros trasplantados hasta que no hubo sangre en sus heces, lo que coincidió notablemente con niveles de plaquetas de FVIII:C que alcanzaron “ 5 mU/ml/108 plaquetas. F20 (panel superior) mostró los niveles de plaquetas FVIII:C más bajos de < 5 mU/ml/108 plaquetas y también experimentó episodios de hemorragia intermitente graves durante el seguimiento experimental de 2,5 años después del trasplante que requirió la administración de suplementos adicionales en forma de transfusiones de plasma canino normal o cFVIII. Este resultado indica que 5 mU/ml/108 plaquetas de FVIII:C parece ser un nivel umbral de expresión transgénica que debe superarse en la hemofilia A canina para lograr la corrección adecuada del fenotipo hemorrágico. El perro de trasplante 142 (panel medio) mantuvo el estado estable más alto de FVIII:C de aproximadamente 9 mU/ml/108 plaquetas y no experimentó hemorragia grave que requiriera la administración de suplementos de cFVIII, lo que finalmente demostró la corrección del fenotipo de hemofilia A durante al menos 2,5 años después del trasplante. M64 (panel inferior) alcanzó 5 mU de FVIII:C/ml/108 plaquetas antes que los otros perros trasplantados con la síntesis de una molécula híbrida SPD2FVIII que obtuvo un nivel de actividad de FVIII:C medio de 8 mU/ml/108 plaquetas. Este resultado demuestra que el uso del promotor del gen -889ITGA2B o del promotor del gen -673ITGA2B acoplado con el péptido de tráfico FvWSPD2 puede usarse eficazmente para dirigir BDDFVIII a plaquetas, lo que conduce a la corrección del fenotipo de hemofilia A canina.

Se midió el tiempo necesario para que la sangre entera se coagule en un tubo de ensayo para cada perro utilizando la versión tradicional del ensayo Lee-White del tiempo de coagulación de la sangre entera (WBCT) (Nichols TC, et al., J Thromb Haemost 2012, 10 (3): 474-476). Los perros hemostáticamente normales tienen un WBCT medio de 10.5 minutos ± DE 1,4 minutos. El WBCT basal para los perros con deficiencia de FVIII fue 44,5 (F20), 40,5 (142) y > 60 (M64) minutos antes del trasplante de G-PBC. Después del trasplante de G-PBC, el WBCT promedio disminuyó a 39.5 (F20, n = 5), 38,4 (I42, n = 5) y 41,9 (M64, n = 4) minutos. Este resultado muestra una disminución muy modesta en WBCT, que podría considerarse dentro de la variación normal de WBCT para perros con deficiencia de FVIII. Curiosamente, este resultado apoya la incapacidad para detectar FVIII:C en el plasma de los perros experimentales (que es un componente esencial para el éxito del WBCT). Por lo tanto, este resultado indica que la medición de WBCT ex vivo no es un ensayo adecuado para predecir la eficacia del FVIII plaquetario para mejorar la hemostasia in vivo porque (a diferencia del FVIII plasmático) los resultados indican que el FVIII derivado de plaquetas debe secretarse a partir de plaquetas activadas después de estimulación con agonistas plaquetarios fisiológicos en el sitio de la lesión vascular para mejorar la hemostasia en perros con deficiencia de FVIII como se muestra en la Figura 4 y la Figura 6.

Para determinar si los receptores de trasplante de G-PBC desarrollaron una respuesta de anticuerpos humorales al BDDFVIII humano recién expresado, se examinó el plasma sanguíneo canino de (F20, 142 y M64) en busca de inhibidores con un ensayo de mezcla de tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) que detecta anticuerpos inhibidores del factor de coagulación VIII o IX. El plasma de perros con hemofilia A con títulos conocidos de inhibidor de Bethesda (BIU) que reaccionan de forma cruzada e inhiben el FVIII humano se utilizó como control positivo y el plasma de perros sin inhibidores se analizó simultáneamente como control negativo para el análisis comparativo. Los resultados indican que F20, 142 y M64 no desarrollaron inhibidores (Tabla 1: Columna 12). Este resultado es consistente con nuestra incapacidad para detectar la presencia de FVIII:C en el plasma. Este resultado es idéntico a la falla de los ratones con hemofilia A para desarrollar anticuerpos inhibidores de la plaqueta humana BDDFVIII y nuestra incapacidad para detectar FVIII:C en el plasma después del trasplante de médula ósea murina transducida con vector lentivírico (Shi Q, et al., Revista de trombosis y hemostasia 2007, 5 (2): 352-361). Esto apoya además la orientación de la síntesis transgénica de BDDFVIII a plaquetas como tratamiento para humanos con anticuerpos preexistentes contra FVIII (Shi Q, et al., J Clin Invest 2006, 116 (7): 1974-1982; Kuether et al., J Thromb Haemost 2012).

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un vector de expresión que comprende

un casete de expresión que comprende un promotor, en el que el promotor es un fragmento del promotor del gen de la integrina aIIb (ITGA2B); y un gen exógeno de interés unido operativamente a dicho casete de expresión, en la que dicho vector de expresión comprende además un factor de direccionamiento que dirige la expresión de dicho gen de interés a una ubicación específica con una célula,

en el que dicho factor de direccionamiento se dirige a la expresión de dicho gen de interés dentro de un linaje celular hematopoyético específico que produce plaquetas,

en el que dicho factor de direccionamiento es un fragmento del propéptido del factor Von Willebrand humano (FvWpp) unido operativamente a un dominio D2, y

en el que dicho casete de expresión tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22 y 23.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho casete de expresión tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 24, preferentemente, en la que dicho casete de expresión tiene una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 24.

3. Composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que dicho gen exógeno se selecciona del grupo que consiste en un gen que codifica un factor de coagulación, una proteína plaquetaria pertinente a la función plaquetaria, un agente antitrombótico para trastornos trombóticos y un antiangiogénico. para los trastornos oncogénicos y un agente antineoplásico para los trastornos oncogénicos.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que dicho gen exógeno se selecciona del grupo que consiste en FVIII humano y FIX humano.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho vector es un vector autoinactivante, preferentemente en el que dicho vector es un vector retrovírico, más preferentemente en el que dicho vector retrovírico es un vector lentivírico.

6. Célula madre que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la célula madre expresa el gen exógeno.

7. Célula madre de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en hemofilia, defectos plaquetarios heredados, trastornos de trombosis, trastornos de la respuesta inmunitaria y cáncer en un animal, siendo dicho animal preferentemente un ser humano, y en donde la célula madre es una célula madre hematopoyética.

8. Célula madre para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el uso comprende transferir dicha célula madre a un animal.

9. Célula madre para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, siendo dicho animal un ser humano.

10. Célula madre para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, expresando dicho animal dicho producto génico exógeno en plaquetas, en el que dicho gen exógeno es FVIII.

11. Procedimiento ex vivo que comprende:

Poner en contacto ex vivo una célula madre con una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para generar una célula madre modificada en condiciones tales que dicho gen exógeno se exprese en dicha célula madre modificada, en el que dicho gen exógeno es FVIII y en el que la célula madre es una célula madre hematopoyética.