JP6014020B2 - 組み換えベクターを用いたがんの治療 - Google Patents
組み換えベクターを用いたがんの治療 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6014020B2 JP6014020B2 JP2013502771A JP2013502771A JP6014020B2 JP 6014020 B2 JP6014020 B2 JP 6014020B2 JP 2013502771 A JP2013502771 A JP 2013502771A JP 2013502771 A JP2013502771 A JP 2013502771A JP 6014020 B2 JP6014020 B2 JP 6014020B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- retroviral
- vector
- cells
- cancer
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/2292—Thymosin; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Description
Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli ら、(1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomellら、(1989) J. Clin. Chem 35: 1826; Landegren ら、(1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu and Wallace (1989) Gene 4:560; Barringerら、(1990) Gene 89:117; およびSooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564に見られる。in vitro で増幅された核酸をクローニングするための改善法はWallaceら、U.S. Pat. No. 5,426,039に述べられている。大きい核酸を増幅するための改善法は、Chengら(1994) Nature 369: 684-685およびそこに引用されている参考文献に要約されており、そこでは40kbに及ぶPCR増幅産物が生成されている。実質的にいかなるRNAも、逆転写酵素とポリメラーゼを用いて、制限酵素による消化、PCRによる延長および配列決定に適した二本鎖DNAに変換できることが当業者には理解されるだろう。たとえば、Ausubel, SambrookおよびBerger(全て上掲)参照。
ある実施形態では、ウイルスベクターは増殖中の哺乳類細胞にのみ感染する複製コンピテントレトロウイルスベクターであってもよい。ある実施形態では、複製コンピテントレトロウイルスベクターは例えばシトシンデアミナーゼなどをコードする異種のポリヌクレオチドの5'側に配列内リボソーム進入部位(IRES)を含む。ある実施形態では、ポリヌクレオチドはレトロウイルスベクターのENVポリヌクレオチドの3'側に位置する。ある実施形態ではウイルスベクターは標的細胞に対して複数回感染することができる(1個の二倍体細胞に対して5もしくはそれ以上)レトロウイルスベクターである。
本発明の様々な態様を以下に示す。
1.細胞増殖性の病気もしくは疾患を有する対象の治療において使用するための、チモシン−1−アルファポリペプチドと複製レトロウイルスベクターとを含む治療用の組み合わせであって、
該複製コンピテントレトロウイルスベクターが、
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、その3'末端の長い末端反復配列(LTR)、その5'末端にある、哺乳類細胞での発現に適したプロモーター配列、gag核酸領域、pol核酸領域およびenv核酸領域を含む前記レトロウイルスポリヌクレオチド;
異種のポリヌクレオチドと機能可能に連結された配列内リボソーム進入部位(IRES)を含み、3'LTRの5'側およびレトロウイルスのエンベロープをコードするenv核酸領域の3'側に位置するカセット;ならびに
逆転写、パッケージングおよび標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列
を含む、前記組み合わせ。
2.異種のポリヌクレオチドが、毒性のないプロドラッグを毒性のある薬剤に変換するポリペプチドを発現する自殺遺伝子を含む上記1記載の組み合わせ。
3.標的細胞ががん細胞である上記1記載の組み合わせ。
4.標的細胞が細胞増殖性疾患を有する上記1記載の組み合わせ。
5.細胞増殖性疾患が、肺がん、結腸−直腸がん、乳がん、前立腺がん、尿路がん、子宮がん、脳のがん、頭および首のがん、すい臓がん、黒色腫、胃がんおよび卵巣がん、関節リウマチもしくは他の自己免疫疾患からなる群から選択される上記4記載の組み合わせ。
6.レトロウイルスベクターがチモシン−アルファ−1ポリペプチドに先立って投与される上記1記載の組み合わせ。
7.レトロウイルスポリヌクレオチド配列が、マウス白血病ウイルス(MLV)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)、ヒヒ内在性レトロウイルス(BEV)、ブタ内在性ウイルス(PERV)、ネコ由来のレトロウイルスRD114、リスザルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス-関連ウイルス(XMRV)、トリ細胞内皮症ウイルス(REV)、またはテナガザル白血病ウイルス(GALV)に由来する上記1記載の組み合わせ。
8.レトロウイルスのエンベロープが広宿主性のMLVエンベロープである上記1記載の組み合わせ。
9.レトロウイルスがガンマレトロウイルスである上記1記載の組み合わせ。
10.チモシン−アルファ−1ポリペプチドが配列番号73と少なくとも85%の同一性を有し、チモシン−アルファ−1活性を有している上記1記載の組み合わせ。
11.異種のポリヌクレオチドがシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている上記1記載の組み合わせ。
12.異種のポリヌクレオチドが自殺遺伝子および免疫増強遺伝子で構成されるグループから選択される上記1記載の組み合わせ。
13.レトロウイルスがさらにmiRNAを含む上記1記載の組み合わせ。
14.複製コンピテントレトロウイルスが、
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドの3'末端に長い末端反復配列(LTR)、レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端にプロモーター配列(該プロモーターは哺乳類細胞での発現に適している)、gag核酸領域、pol核酸領域およびenv核酸領域を含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
シトシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドと機能可能に連結された配列内リボソーム進入部位(IRES)を含むカセット(該カセットは3'LTRの5'側およびレトロウイルスのエンベロープをコードするenv核酸領域の3'側に位置する);および
逆転写、パッケージングおよび標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列を含む上記1記載の組み合わせ。
15.チモシン−1−アルファおよびレトロウイルスベクターが同時に送達されるように配合される上記1記載の組み合わせ。
16.細胞増殖性疾患を有する被験者を治療する方法であって、
複製コンピテントレトロウイルスの投与の前、投与中もしくは投与後にチモシン−アルファ−1ポリペプチドを被験者に投与することを含んでおり、該コンピテントウイルスが
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に長い末端反復配列(LTR)、レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端にプロモーター配列(該プロモーターは哺乳類細胞での発現に適している)、gag核酸領域、pol核酸領域およびenv 核酸領域を含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
異種のポリヌクレオチドと機能可能に連結された配列内リボソーム進入部位(IRES)を含むカセット(該カセットは3'LTRの5'側およびレトロウイルスのエンベロープをコードするenv核酸領域の3'側に位置する);および
逆転写、パッケージングおよび標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列を含む、前記方法。
17.レトロウイルスポリヌクレオチド配列が、マウス白血病ウイルス(MLV)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)、ヒヒ内在性レトロウイルス(BEV)、ブタ内在性ウイルス(PERV)、ネコ由来のレトロウイルスRD114、リスザルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス-関連ウイルス(XMRV)、トリ細胞内皮症ウイルス(REV)、またはテナガザル白血病ウイルス(GALV)に由来する上記16記載の方法。
18.レトロウイルスのエンベロープが広宿主性のMLVエンベロープである上記16記載の方法。
19.レトロウイルスがガンマレトロウイルスである上記16記載の方法。
20.標的細胞が腫瘍性の細胞である上記16記載の方法。
21.細胞増殖性疾患が、肺がん、結腸―直腸がん、乳がん、前立腺がん、尿路がん、子宮がん、脳のがん、頭および首のがん、すい臓がん、黒色腫、胃がんおよび卵巣がん、関節リウマチもしくは他の自己免疫疾患からなる群から選択される上記16記載の方法。
22.チモシン−アルファ−1ポリペプチドが配列番号73と少なくとも85%の同一性を有し、チモシン−アルファ−1活性を有している上記16記載の方法。
23.異種のポリヌクレオチドがシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている上記16記載の方法。
24.異種のポリヌクレオチドが 自殺遺伝子および免疫増強遺伝子で構成されるグループから選択される上記16記載の方法。
25.レトロウイルスがさらにmiRNAを含む上記16記載の方法。
26.複製コンピテントレトロウイルスが、
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に長い末端反復配列(LTR)、レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端にプロモーター配列(該プロモーターは哺乳類細胞での発現に適している)、gag核酸領域、pol核酸領域およびenv核酸領域を含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
シトシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドと機能可能に連結された配列内リボソーム進入部位(IRES)を含むカセット(該カセットは3'LTRの5'側およびレトロウイルスのエンベロープをコードするenv核酸領域の3'側に位置する);および
逆転写、パッケージングおよび標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列を含む上記16記載の方法。
pACE-GFPemdプラスミドの以前の骨格(US6899871, Wangら、Hum Gene Ther 14:117 2003)を図3Eに示したように3つの方法で改変した。改変はPCRを用いてオリゴヌクレオチド指定突然変異により行った(Loggら、J. Mol Biol 369: 1214, 2007; “Molecular Biology and Biotechnology” Eds. J M. Walker, R.Rapley, Royal Society of Chemistry, London UK, 2000もまた参照)。以下の改変を行った。1) 広宿主性のenv遺伝子の3'末端p15領域の核酸配列はもともと狭宿主性のエンベロープに由来していたが、この配列を4070A広宿主性のエンベロープの対応する配列によって置換した;コードされているエンベロープのアミノ酸は二つの構築物で同一である。2) IRES配列3'末端をPstI1部位の挿入によって目的の導入遺伝子の挿入が容易となるように改変し、IRES遺伝子導入部位の両端の小さな不完全反復を除いた。3) 3'LTRの下流の残余のウイルス配列を除いた。結果としてできたプラスミドpACE-emdGFP(aka pACE-GFP、pACE-eGFPおよびT5.0006)を、シトシンデアミナーゼおよび変異体をコードするベクターのための基礎として用いた。コード配列カセットの挿入には、初め二つの方法を用いた。最初の方法では5'TTATAAT3'(配列番号74)配列を、二番目の方法では5'TTATAA3'(配列番号75)配列を、ATG開始コドンのすぐ上流に作成した。ベクターおよび合成のシトシンデアミナーゼ遺伝子を単にPstI1およびNot1酵素で切断した後再連結するという点で二番目の方法の方が単純である。シトシンデアミナーゼを挿入したベクターは、CDopt(CD1)およびCDopt+3pt (CD2)(図2参照)のコード配列ならびに実施例3で説明するように293T細胞の一過性トランスフェクションによって作られた感染性ウイルスの調製物を用いて両方の方法で作った。その後U87細胞を培養中に0.1のMOIで感染させ、細胞が100%感染するまで増殖させた。100%感染した細胞の細胞抽出物のシトシンデアミナーゼ活性を実施例6で述べるようにして測定したところ、酵素の比活性はどちらの上流配列を用いた構築物であっても同等であると認められ、これらの構築物はその他の点では同一であった。したがって、図2の表で、pACE-eGFP(T5.0006)とpACE-yCD(T5.0007)は一番目の上流配列を有しており、一方で他のさらに試験を行った他の全ての構築物は二番目の配列を有している。その後、異なる挿入遺伝子を有するベクターはPStI1およびNotIの直接の切断によって通常通り構築された。
二組の変更がなされた:(1)酵母シトシンデアミナーゼタンパク質の熱安定性を向上させるための三つのアミノ酸(A23L、I140LおよびV108I)を変える三つの位置での変異および(2)アミノ酸配列のさらなる変更を伴わずに、ヒト細胞でのタンパク質の翻訳効率を改善するためのヒトコドン利用配列を増すための、追加の遺伝子配列の変更。
ConradらおよびPCT WO 99/60008のヒトコドンに最適化したシトシンデアミナーゼを比較したところ、両方において合計91の最適化されたコドンが示され、36のコドンは同一であり、47のコドンは3番目の塩基対が置換を起こしており(全て同じアミノ酸をコードしている)、9つのコドンは異なっていた(しかしながらいずれも同じアミノ酸をコードしていた)。異なっていた9つのコドンとして以下のものがある:
AGC(Ser)からTCC(Ser)
CGT(Arg)からAGG(Arg)
CCA(Pro)からCCT(Pro)
全てが等価なGC含量を有し、同じアミノ酸をコードしている。上述の天然の酵母遺伝子配列は個々にコドン最適化され以下のCD遺伝子(CD1)を与え、複製コンピテントレトロウイルス(RCR)をコードしているpAC3プラスミドベクターにIRESと共に挿入された場合にT5.0001と呼ぶ。
シトシンデアミナーゼの安定性を高めるためにさらなる改変がなされた。野生型の酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子に遺伝子的強化を施し、三つのアミノ酸(A23L、I140LおよびV108I)を変更する三つの位置で変異を起こさせて、酵母シトシンデアミナーゼタンパク質の熱安定性を向上させた。
部位特異的変異誘発プライマー:
センスプライマー:5'-tcgaggatatcggcgagtgaaacccgttattctttttggc-3'(配列番号45)、
アンチセンスプライマー:5'-gccaaaaagaataacgggtttcactcgccgatatcctcga-3'(配列番号46)、
センスプライマー: 5'tcggcgagtgatccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgccaacccgttatt-3'(配列番号47)、
アンチセンスプライマー:
5'-aataacgggttggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggatcactcgccga-3'(配列番号48)。
UPRTポリペプチドに連結されて最適化されたCD-UPRTを形成する上述したCDポリペプチドを含んだ融合構築物もまた開発された。CDとUPRTの間の終止-開始を除くために以下のプライマーが用いられた。
CDポリペプチドとUPRTポリペプチドの間およびフレーム内にリンカー(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4(配列番号56)ドメインをクローニングすることにより、最適化されたCD-リンカー-UPRT配列を形成するように融合構築物はまた開発された。リンカーを挿入するために以下の配列が用いられた。
OPRTポリペプチドと連結させCD-最適化-OPRTase(ヒト化CD+3pt変異+OPRTaseヒト機能性ドメイン)を形成した上述のCDポリペプチドを含んだ融合構築物もまた開発された。
CDポリペプチドとOPRTポリペプチドの間およびフレーム内にリンカー(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4(配列番号56)ドメインをクローニングすることにより、最適化されたCD-リンカー-OPRT配列を形成するように融合構築物はまた開発された。
ベクターは多くの方法により作成することができるが、最初のステップは感染性の粒子の生産を可能とするためにDNAベクターを細胞に導入することであり、感染性の粒子はその後細胞の上清から回収することができる。ひとたび感染性の粒子が生産されれば、他の生産方法が当業者によって実施可能である。ベクター粒子は293T細胞の一過性のトランスフェクションによって生産された(Pearら、Proc Natl Acad Sci U S A. 90:8392-8396 1993)。
機能的なベクター濃度もしくは力価は、定量的PCR(qPCR)に基づく方法を用いて決定される。この方法では、形質導入可能な宿主株化細胞(例えばPC-3ヒト前立腺癌細胞、ATCC Cat# CRL-1435)に標準的な量のベクターを感染させ、形質導入の後に宿主細胞の中に存在するプロウイルスが生じた量を測る事によりベクターの力価が決定される。細胞とベクターを標準的な培養条件(37℃、5%CO2)で24時間インキュベートして完全な感染を可能とした後、ベクターの複製を止めるために抗レトロウイルスAZTを添加する。次に細胞は培養シャーレから回収され、ゲノムDNA(gDNA)がInvitrogen Purelink gDNA精製キットを用いて精製され、RNase/DNaseを含まない無菌水を用いて精製カラムから溶出される。A260/A280の吸光度比はサンプルの濃度と相対的な純度を決定するために分光光度計により測定される。gDNA濃度は、追加のRNase/DNaseを含まない無菌水により所与の全てのgDNA調製サンプルのセットの最も低い濃度に対して標準化され、それにより解析した全てのサンプルに対してqPCRに入力されるDNAは一定となる。ゲノムDNAの純度はさらにそれぞれのサンプルの一定分量をエチジウムブロマイド染色した0.8%アガロースゲルで電気泳動することにより評価される。サンプルが1.8-2.0のA260/A280吸光度範囲を越え、かつgDNAの単一のバンドを示せば、ベクターのプロウイルスのコピー数のqPCR解析のためのサンプルの準備ができている。プロウイルス(宿主gDNAに組み込まれたベクターDNAおよび逆転写されたベクターDNA)のLTR領域を識別するプライマーを用いてqPCRを行って、既知の数の細胞に形質導入するのに既知の量のベクターが使用されたときに起こった形質導入現象の合計回数を推定する。107から10コピーまで連続希釈し、サンプルと同一のqPCR条件下で測定した既知のコピー数の標的担持プラスミドを利用した標準曲線から、反応あたりの形質導入現象の数を計算する。各qPCRにおいて使用されたゲノム当量(先に決定された濃度から)、および反応あたりに起こった形質導入現象の数から、形質導入時に存在した総細胞数に基づいて起こった形質導入の総数が決定される。この値は最初の形質
導入の間に、細胞を含む培地中に希釈された後のベクターの力価である。補正された力価を計算するには、希釈は培養液の容量と力価の容量をかけ、力価の容量で割ることにより補正した。これらの実験は複製中の培養液で行われ、平均力価およびその標準偏差と変動係数を決定するためにそれぞれの条件で三回の測定によるqPCRにより解析される。
有効であるためには、ベクター構築物およびそれらに由来する感染性の粒子は、(1)一過性のトランスフェクションによって良好な力価のウイルスを生じること(実施例3と4を参照)、(2)複数の継代中安定であること、(3)5-FCの存在下で効率的に細胞を死滅させること、および(4)標的細胞の感染の際に酵素活性を発現することが必要である。実施例3はベクターから有用な力価が得られうる事を示している。
安定性を実証するために以下の実験がなされた。およそ106の未処理のU-87細胞に最初ウイルスベクターを0.01のMOIで感染させ、単一の感染サイクルが完了するように完全に感染するまで培養した。その後上清を非感染細胞に再度移し、サイクルを繰り返した。本実験においては、12回のサイクルの試験が二度行われた(図5はそれぞれ二度の試験のうちの一つを示しており;二度の試験の他方は同様の結果であった)。yCD2もしくは他の導入遺伝子配列の遺伝的安定性は、導入遺伝子の挿入部位の隣接部のMLV特異的なプライマーを用いて、感染細胞の組み込まれたプロウイルスのPCR増幅により評価される。全長の増幅産物より短いいずれのバンドの出現も、ベクターの不安定性の指標となる。図5は、本発明のベクター(T5.0007-改変ベクターと異種のポリペプチドCDを含む)がpACE-CDよりも多くの継代に対して安定性を維持することを実証する。さらにT5.0004とT5.0005がpACE-CDと同程度安定であるように見える一方、T5.0003はいくらか不安定である。pACE-CDはマウスのがん研究において用いられており、マウスモデルにおいて良好な抗腫瘍効果を示す。しかしながら、特に多くの回数の5-FC処置が必要とされる場合には、ウイルスゲノムが安定であるほど、動物およびヒトの治療においてより強力に長く続くだろう。継代の後期において小さなバンドの存在が抑制される事によって示されるように(図5)、T5.0001とT5.0002は両方顕著にT5.0007より安定であり、これはタンパク質をコードしている配列のサイレントな変更や点突然変異にいたる小さな変更が、より安定的なベクターゲノムをもたらすとともに、予期できない優れた性質をもたらしうることを示している。
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)は増殖アッセイにおいて生存細胞の数を決定するための比色法である。我々はこのアッセイを5-フルオロシトシン(5-FC)およびフルオロウラシル(5-FU)への様々な株化細胞の用量反応を決定するのと同様に、細胞増殖動態を決定するために利用した。
U87細胞は0.1の感染効率(MOI)で形質導入され、ウイルスを伝播させるために5日間培養し、形質導入5日後の細胞を回収した。800xg、5分間の遠心分離により細胞を集めた。細胞のペレットから上清を吸引除去し、5mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、800xg、5分間遠心分離した。得られた細胞ペレットは1.5mLのPBS中に取り上げ、ピペットチップを通過させることによって再懸濁させ、-20℃の冷凍庫に配置した。細胞は凍結/融解法により溶解させた。再懸濁した細胞が室温で解凍され、ピペットチップを通過させ、プロテアーゼインヒビター混合物と混ぜて-20℃で再凍結した。酵素アッセイの前に、サンプルは再び室温で解凍し、ピペットチップを通過させた。その後、懸濁液はテーブルトップ遠心機で14000rpm、5分間遠心分離した。上清はデカントでペレットから新しいエッペンドルフチューブに移し、氷上に配置した。
本発明のベクターは293T細胞への一過性のトランスフェクションにより作られ(実施例3)、続いて細胞上清の回収、ろ過、ベンゾナーゼ処置、透析ろ過/濃縮および透析を行った。さらに当業者に知られるカラムクロマトグラフィーのステップが含まれていてもよい(例えばUS5792643; T. Rodriguez ら、J Gene Med 9:233 2007; WO2010148203を参照)。ベクターはまた恒常的に感染させた株化細胞から産生され、上述のような手順で処理されてもよい(例えばWO2010148203を参照)。臨床の材料は無菌性、マイコプラズマやエンドトキシン、加えて製品特有の効力、強さや純度テストなどの標準的な試験に基づいて用いられる。力価は、標的細胞に組み込まれたウイルスベクターDNAのPCRによる定量によって形質導入単位(TU)として決定した(実施例4)。最終産物は109TU/mlまでの力価を有することを目標としており、無菌で注入可能な等張のトリス緩衝ショ糖溶液中に配合された。
形質導入は安定なヒト前立腺がんに由来するPC-3株化細胞を用いて12ウェルプレートでなされる。各試験サンプルのために、三つのウェルにおいてPC-3細胞に形質導入するのに、力価測定していない3つの希釈度のベクター調製物を用いた。ウイルスの複製は形質導入の24時間後にアジドチミジン(AZT)を用いて停止させた。細胞は回収およびゲノムDNAの精製の前にさらに24-64時間維持された。
Qiagen DNeasy DNA Minikitsを、形質導入し回収した細胞からゲノムDNAを調製するために製造者のプロトコルに従って用いた。DNA濃度および純度はA260およびA260/A280比を決定するためのUV/vis分光光度法を用いて直接吸光度を測定することにより評価した。
BioRad CFX96 real-time PCR装置もしくは同等のものを定量PCRを行うために用いた。各試験サンプルに存在するプロベクターのコピー数は、特異的なDNAオリゴヌクレオチドプライマーおよび、CMV/Psiプラスミドプロモーターに対する、組み込まれたもしくはプロレトロウイルスのU3/Psiパッケージングを増幅するために設計されたTaqMan probeを併せて用いることにより測定した。ベクターの力価はコピー数の標準曲線に対して表される。ベクターのコピー数の標準曲線を作成するために、PC-3細胞のゲノムDNAにプロレトロウイルスのU3/Psi配列を有する独特なプラスミドが追加された。ベクター試験サンプルの力価は、希釈液あたりの反応数を用いて、複数の希釈液で形質導入されたゲノムの数を計算することにより求めた。
形質導入はマルチウェルプレート上でU87細胞に対して行われた。それぞれの形質導入において、適した三つの希釈液が用いられ、それぞれ三回行われた。細胞は形質導入の0、1、3および5日後に回収された。
細胞を溶解し、BSAを標準として用いたBCAタンパク質アッセイにより全タンパク質濃度を決定した。yCD2酵素アッセイのために、37℃、1-2時間の条件で5-FUの生成の割合が直線を保たれるように、適切な量の細胞溶解物を5-FCを含む緩衝液に加えた。反応溶液の最終的な容量は100μLである。2時間後、酵素反応をトリクロロ酢酸の添加によって終了させ、短くボルテックスして次のHPLC解析のために準備した。非形質導入細胞からの細胞溶解物はネガティブコントロールとして用いた一方で、100%感染細胞からのサンプルを用いた同様のアッセイはポジティブコントロールとして用いた。
反応を終了させた混合物は12,000rpm、5分間、室温で微量遠心機により遠心分離した。その後上清はデカントでペレットから除き、pHが約4.0のリン酸緩衝液を含む水性の移動相で事前に平衡化した逆相HPLCカラムに注入する前に、さらに微粒子を除くために0.2μフィルターを通過させた。クロマトグラムは基質の消費および産物の生成の両方を観察するため260nmおよび280nmで調査した。基質または産物の濃度は、GraphPadの描図と解析能を用いて、既知濃度の基質又は産物から計算して事前に作った標準曲線と比較することにより決定した。1-2時間で作られた5-FUの量は活性のCD単位(CD活性の1単位は1分当たりに5-FUを1nmol生成するものとして定義する)を決定するために用いられ、この値をアッセイで用いたタンパク質量(細胞溶解物に由来する)で割ることにより比活性を計算した。
一本鎖抗体は好ましい効果を有する既知の完全な抗体の配列に由来する。そのような配列は利用可能である(例えばWO2006048749, US2006165706, US7034121, Genbank Accession Numbers DJ437648, CS441506, CS441500, CS441494, CS441488、その開示内容を参照し本明細書に組み込む)。そのような通常の抗体遺伝子配列は、当業者に知られている一般に用いられる方法で一本鎖抗体(scFv)配列に変換される(例えばGilliland ら、“Rapid and reliable cloning of antibody variable regions and generation of recombinant single chain antibody fragments.” Tissue Antigens 47, 1-20, 1996を参照)。CTLA-4に対するファージの一本鎖抗体もまたファージscFvライブラリーを直接スクリーニングすることにより利用可能であり(Pistilloら、Tissue Antigens 55:229 2000)、本発明の複製レトロウイルスベクターに挿入するために直接用いることができる。配列の由来がどのようなものであるかに関わらず、scFvは一般的に約700-900bpの長さであり商業的な売主(BioBasic)によって、先に述べたように5'末端にPsiI部位および3'末端にNotIに適合する部位をともなって合成される。この配列はその後yCD2配列の除去後にPsiI-NotI部位でpAC3-yCD2由来の複製レトロウイルス骨格に挿入される。ベクターは説明したとおりに作製および力価測定され、上述のとおり必要であればさらに精製された。ヒトおよびマウスのCTLA4は配列がよく類似しており、本発明の複製レトロウイルスは最初、当業者においてよく知られるCT26/BALB/cモデルやS91マウス黒色腫モデルのような適した同系の免疫適格性のマウスモデル(例えば Hodge ら J.Immunol. 174:5994 2005を参照)において試験された。結果は一またはそれ以上の: がん成長の調節;毒性の欠如;抗腫瘍反応の発生;全身免疫の指標となる離れた病変の縮小によって測定された。投与量はマウスに対して103から107TUの範囲に及ぶ。患者においてベクターはがんへの病巣内注射によって、もしくはその後ウイルスをがんへと運ぶ血液循環内投与によって投与された。投与量は105から1011TUの範囲に及ぶ。
目的
本試験の目的は、表面抗原152(CD152)とも呼ばれる細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4)に対する一本鎖抗体を有する新規のMLVを基礎とする複製コンピテントレトロウイルスベクター(pAC3-αCD152)の、皮下の黒色腫(クラウドマンS91)を有するDBA/2マウスに腫瘍内(IT)注入を介して送達されたときの、黒色腫の増殖に対する効果を評価することである。
メスのDBA/2もしくはBALB/cマウス(〜8週齢)をJackson Laboratories (Bar Harbor, ME)より購入した。マウスは試験を始める前に、到着後7日間順応させた。
クラウドマンS91細胞(ATCC, Manassas VA)はDBA/2マウスに由来する自然に生じた黒色腫である。10%のウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、およびGlutamax(Hyclone, Logan UT、およびInvitrogen, San Diego CA)を含むダルベッコ変法イーグル培地により細胞を培養した。細胞は移植のためPBS (Hyclone, Logan UT)に再懸濁した。S91細胞(100μL中に1E6)はDBA/2マウスの腹部右側に注入された。
ベクター
ベクター調製物は一過性のトランスフェクションにより(もしくはHT1080細胞中の産生株化細胞から)およそ7E6TU/mlの力価で作成された。最初の試験ではベクターはさらなる精製や濃縮は行っていない。次に続く完全な用量反応曲線を決定する試験のために、高い力価の精製されたサンプルを、およそ108/mlの力価となるように調製した。ベクターは腫瘍内(IT)に50-100μLの容量および静脈内(IV)に100μLの容量で投与され、全体の投与量/マウスはおよそ7E5〜7E6〜7E7TU/マウスとした。αCD152を発現するベクターはToca αCD152とした。
5つのグループのメスのDBA/2(55頭のマウス、9-10週齢)にS91黒色腫細胞を皮下移植し(0日目)次に、投与(S91がんの増殖の速度;およそ50-100mm3になる程度にあわせて4-7日目)した;ビヒクルとともに(グループ1)、コントロールベクター[AC3-GFP(V)]とともに(グループ2)、Toca αCD152ベクターの腫瘍内(IT)注入(グループ3)、もしくはToca αCD152 ベクターの静脈内注入(グループ4)とともに。グループ5のマウスはがんの移植をせずToca αCD152のみを静脈内注入した。
がんの増殖解析は大きさが2000mm3になっとき、もしくは60日後のうち、どちらかが最初に訪れたときに行われた。各グループの10頭のマウスについて、時間経過ごとににがんのサイズをプロットした。統計上の有意性は分散分析(ANOVA)を用いて決定した。P値<0.05が全ての解析において統計的に有意であると考えられ、解析はPrism 5 statistical software(GraphPad Software)または同等のものを用いて行われた。治療中のαCD152発現の何らかの有害な現象を評価するために生涯にわたる観察もまた行われた。
複製MLVの腫瘍内(IT)注入によるαCD152の送達は、コントロールと比較して統計的に有意な増殖遅延を示した。複製MLVの静脈内注入によるαCD152の送達は、コントロールと比較して統計的に有意な増殖遅延を示し、DBA/2-クラウドマンS91マウス黒色腫モデルの黒色腫の負担を抑制した。それ以上の動物実験は以下により詳細に述べるとおりに行われた。
ヌードマウス宿主中でのRCRベクターによるシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子治療の治療効果だけでなく、RCRベクターの伝播および体内分布を試験するために、U87ヒト神経膠腫株化細胞を用いた頭蓋内異種移植モデルが確立された。
RCRベクターによるシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子治療の治療効果およびその免疫学的影響だけでなく、RCRベクターの伝播と体内分布を試験するために、同系のBALB/cマウスにおいてCT26結腸直腸がん株化細胞を用いた頭蓋内異種移植モデルが確立された。
ヒトpri-miRNA-128-1の異種のポリヌクレオチド配列を有する組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの構築
miR-128-1を発現する複製コンピテントレトロウイルスベクターpAC3-miR-128-1は一つの実施形態で述べたpAC3-yCD2の骨格に由来している。pAC3-miR-128-1ベクターのpAC3骨格は、IRES-yCD2ポリヌクレオチド配列を除くために、MluIおよびNotIを用いてpAC3-yCD2プラスミドのDNAのエンドヌクレアーゼ消化により単離された。pri-miR-128-1のポリヌクレオチドDNA配列はpEP-mir-128-1発現ベクター(Cell BioLabs Inc.)(配列番号31)のプロダクトシートから得られた。pri-miR-128-1のDNA配列は、二本鎖DNA断片の5'末端にMluI制限酵素部位、および3'末端にNotI制限酵素部位を有するように合成され、次にMluIおよびNotIで消化した上述のpAC3-yCD2プラスミドDNAの対応する部位に挿入された。結果としてできた構築物であるpAC3-miR-128-1は3つの遺伝子:gag、pol、およびenvをコードし、そしてpri-miR-128-1非コード配列を有する。
miR-128を有する組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの形質導入細胞からのmiR-128の発現を確かめるために、感染度が最大に達する感染から9日後の細胞を、成熟miRNAの発現の検出を目的とした全RNAの抽出のために膨張させ回収した。Taqman microRNAアッセイの結果は、pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2、およびpAC3-H1-shRNAmiR128で形質転換させたHT1080およびU87-MG細胞の両方において、それぞれ形質転換していない細胞と比較して、成熟miR-128が過剰に発現したことを示した。両方の株化細胞において、pAC3-miR-128-1およびpAC3-H1-shRNAmiR128ベクターで形質転換させた細胞は、pAC3-miR-128-2ベクターで形質転換した細胞よりも高いレベルの成熟miR-128を発現した。
構築
複製コンピテントレトロウイルスベクターpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128は一つの実施形態で述べたpAC3-yCD2の骨格に由来している。NotIを用いてpAC3-yCD2プラスミドのDNAをエンドヌクレアーゼ消化することにより、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128ベクターのpAC3-yCD2骨格は単離された。ヒトH1プロモーターのポリヌクレオチドDNA配列はpSilencer 3.1 H1 hygro発現ベクター(Ambion)の製品情報から得、そして短いヘアピン構造を有するpre-miR-128-1のポリヌクレオチドDNA配列はthe http:(//)www.mirbase.org/から得た。ヒトH1プロモーターと連結させたpre-miR128-1のDNA配列(配列番号34)は、二本鎖DNA断片の両端にNotI制限酵素部位を有するよう合成され、次にNotIで消化した上述のpAC3-yCD2プラスミドDNAの対応する部位に挿入された。結果としてできた構築物であるpAC3-H1-shRNAmiR128は4つの遺伝子:gag、pol、envおよびyCD2をコードし、そして短いヘアピン構造を有するpre-miR-128-1非コード配列を有する。
pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの形質導入細胞からのmiR-128の発現を確かめるために、感染度が最大に達する感染から9日後の細胞を、成熟miRNAの発現の検出を目的とした全RNAの抽出のために膨張させ回収した。Taqman microRNAアッセイの結果は、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128を形質転換させたHT1080およびU87-MG細胞の両方において、形質転換していない細胞と比較して、成熟miR-128が過剰に発現したことを示す。
Bmi-1の発現は神経膠芽腫を含むヒトの様々ながんにおいて上方制御されることが観察されており、miR-128の標的であることが示されている。miR-128の標的の関与を確かめるために、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128形質導入細胞からのBmi-1の発現をqRT-PCRにより検出した。結果はpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128を形質導入したU-87-MG細胞が形質導入していない細胞よりも低い量のBmi-1を発現する一方で、HT1080細胞では形質導入細胞と形質導入していない細胞の間に有意な差が観察されなかったことを示している。このデータはmiR-128が中枢神経系において重要な機能的役割を果たしているという考えを支持する。
pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの形質導入細胞からのyCD2の発現を確かめるために、感染度が最大に達する感染から9日後の細胞をyCD2発現の検出を目的とした全タンパク抽出のために膨張させ回収した。免疫ブロットの結果は、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128を形質導入させたHT1080およびU87-MG細胞の両方において、pAC3-yCD2形質導入細胞と比較して正常なyCD2の発現がみられたことを示している。
目的
本試験の目的は、miR128配列を担持する新規のMLVベースの複製コンピテントレトロウイルスベクター(AC3-miR128-1(V);AC3-miR128-2(V);AC3-miR128-3(V))が生存へ与える影響を評価することであり、その評価はヒト神経膠腫異種移植片を有するヌードマウスへ頭蓋内(IC)注入を介して、Toca 511が三段階の投与量で送達されたときに行う。
メスの胸腺欠損のnude-Foxn1^nu(ヌード)マウス(〜8週齢)はHarlan(Indianapolis IN)から購入した。マウスは到着後7日間順応させた。3.5mmの突起を有するキャップを装着し、右線条体に移植された3.0mmの突起を有する留置ガイドカニューレをマウスに外科的に配置した。突起の定位座標はAP=+0.5 mm、ML=-1.8mmである(十字縫合から)。
U-87MG細胞(ATCC, Manassas VA)は44歳のコーカサス人女性の悪性の神経膠腫に由来する。10%のウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、およびGlutamax(Hyclone, Logan UT, and Invitrogen, San Diego CA)を含むダルベッコ変法イーグル培地により細胞を培養した。細胞は移植のためPBS(Hyclone, Logan UT)に再懸濁した。U-87MG細胞(1μL中に1E5)はガイドカニューレを通して挿入された3.5mmの突起を有する注入カニューレを通して、1分間につき0.2μLずつ頭蓋内(IC)注入された(5分間に続いてさらに5分間)。
メスの胸腺欠損のnude-Foxn1^nu マウス(65頭のマウス、9-10週齢)の6つのグループにU-87がん細胞を頭蓋内(IC)移植し(0日目)その後ICに(U-87細胞の成長速度にあわせて4-7日目)、ビヒクル(グループ1)、コントロールベクター(AC3-GFP(V)、グループ2)、またはAC3-miR128-1(V); AC3-miR128-2(V); AC3-miR128-3(V)(グループ3-5)を頭蓋内(IC)投与した。グループ6のマウスはがんもしくはベクターを移植しなかった。
60日目までの生存解析はグループ1-6からの各10頭のマウスにおいて行われ、カプランマイヤープロットとしてプロットされた。生存曲線はログランク検定(log-rank test)により比較した。P値<0.05が全ての解析において統計的に有意であると考えられ、解析はPrism 5 統計ソフトウェア(GraphPad Software)または同等のものを用いて行われた。
チモシンアルファ1を用いた実験がTu2449/B6C3F1神経膠腫マウスモデルへのToca 511処置と併せて行われた(U.Pohle ら、Int J Oncol.15:829-834 (1999); HM. Smilowitz ら、J. Neurosurg 106:652-659 2007)。最初の頭蓋内の細胞接種が104細胞であり、5-FCの投与が一日につき二回(BID)腹腔内で500mg/kgで行われ、薬剤のない日が10日間に続いて5-FCの4日間の投与があることを除いて、BALB/c-CT26モデルにおいてそれらと同様の方法で実験を行った(実施例10)。ベクターおよび5-FCの投与に加えて、幾つかのグループにはチモシンアルファ1(TA1)を投与した。チモシンアルファ1はSigma Aldrich cat#T3641から得て、滅菌水で400μg/mLの濃度でストック溶液を作った。TA1(200μg/kg、〜40μg/動物)は7日目から28日間、一日一回(SID)腹腔内(IC)に投与された。
Claims (12)
- 細胞増殖性の病気もしくは疾患の治療において使用するための、チモシンアルファ−1と複製コンピテントレトロウイルスベクターとを含む治療用の組み合わせ物であって、
該複製コンピテントレトロウイルスベクターが、
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、その3'末端の長い末端反復配列(LTR)、その5'末端にある、哺乳類細胞での発現に適したプロモーター配列、gag核酸領域、pol核酸領域およびenv核酸領域を含む前記レトロウイルスポリヌクレオチド;
異種のポリヌクレオチドと機能可能に連結された配列内リボソーム進入部位(IRES)を含み、3'LTRの5'側およびレトロウイルスのエンベロープをコードするenv核酸領域の3'側に位置するカセットであって、異種のポリヌクレオチドがシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているカセット;ならびに
逆転写、パッケージングおよび標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列
を含む、前記組み合わせ物。 - 細胞増殖性の病気もしくは疾患の治療において使用するための、複製コンピテントレトロウイルスベクターを含む組成物であって、該組成物がチモシンアルファ−1と併用され、
該複製コンピテントレトロウイルスベクターが、
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、その3'末端の長い末端反復配列(LTR)、その5'末端にある、哺乳類細胞での発現に適したプロモーター配列、gag核酸領域、pol核酸領域およびenv核酸領域を含む前記レトロウイルスポリヌクレオチド;
異種のポリヌクレオチドと機能可能に連結された配列内リボソーム進入部位(IRES)を含み、3'LTRの5'側およびレトロウイルスのエンベロープをコードするenv核酸領域の3'側に位置するカセットであって、異種のポリヌクレオチドがシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているカセット;ならびに
逆転写、パッケージングおよび標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列
を含む、前記組成物。 - 細胞増殖性の病気もしくは疾患の治療において使用するための、チモシンアルファ−1を含む組成物であって、該組成物が複製コンピテントレトロウイルスベクターと併用され、
該複製コンピテントレトロウイルスベクターが、
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、その3'末端の長い末端反復配列(LTR)、その5'末端にある、哺乳類細胞での発現に適したプロモーター配列、gag核酸領域、pol核酸領域およびenv核酸領域を含む前記レトロウイルスポリヌクレオチド;
異種のポリヌクレオチドと機能可能に連結された配列内リボソーム進入部位(IRES)を含み、3'LTRの5'側およびレトロウイルスのエンベロープをコードするenv核酸領域の3'側に位置するカセットであって、異種のポリヌクレオチドがシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているカセット;ならびに
逆転写、パッケージングおよび標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列
を含む、前記組成物。 - 標的細胞ががん細胞である請求項1記載の組み合わせ物または請求項2もしくは3に記載の組成物。
- 標的細胞が細胞増殖性疾患を有する請求項1記載の組み合わせ物または請求項2もしくは3に記載の組成物。
- 細胞増殖性疾患が、肺がん、結腸−直腸がん、乳がん、前立腺がん、尿路がん、子宮がん、脳のがん、頭および首のがん、すい臓がん、黒色腫、胃がんおよび卵巣がん、関節リウマチもしくは他の自己免疫疾患からなる群から選択される請求項5記載の組み合わせ物または組成物。
- レトロウイルスベクターがチモシンアルファ−1に先立って投与される請求項1記載の組み合わせ物または請求項2もしくは3に記載の組成物。
- レトロウイルスポリヌクレオチド配列が、マウス白血病ウイルス(MLV)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)、ヒヒ内在性レトロウイルス(BEV)、ブタ内在性ウイルス(PERV)、ネコ由来のレトロウイルスRD114、リスザルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス-関連ウイルス(XMRV)、トリ細胞内皮症ウイルス(REV)、またはテナガザル白血病ウイルス(GALV)に由来する請求項1記載の組み合わせ物または請求項2もしくは3に記載の組成物。
- レトロウイルスのエンベロープが広宿主性のMLVエンベロープである請求項1記載の組み合わせ物または請求項2もしくは3に記載の組成物。
- レトロウイルスがガンマレトロウイルスである請求項1記載の組み合わせ物または請求項2もしくは3に記載の組成物。
- レトロウイルスがさらにmiRNAを含む請求項1記載の組み合わせ物または請求項2もしくは3に記載の組成物。
- チモシンアルファ−1およびレトロウイルスベクターの組み合わせが同時送達のために配合される請求項1記載の組み合わせ物または請求項2もしくは3に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US31872810P | 2010-03-29 | 2010-03-29 | |
US61/318,728 | 2010-03-29 | ||
PCT/US2011/030402 WO2011126864A2 (en) | 2010-03-29 | 2011-03-29 | Cancer treatment with recombinant vector |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016035272A Division JP2016153403A (ja) | 2010-03-29 | 2016-02-26 | 組み換えベクターを用いたがんの治療 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013523754A JP2013523754A (ja) | 2013-06-17 |
JP6014020B2 true JP6014020B2 (ja) | 2016-10-25 |
Family
ID=44763495
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013502771A Expired - Fee Related JP6014020B2 (ja) | 2010-03-29 | 2011-03-29 | 組み換えベクターを用いたがんの治療 |
JP2016035272A Pending JP2016153403A (ja) | 2010-03-29 | 2016-02-26 | 組み換えベクターを用いたがんの治療 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016035272A Pending JP2016153403A (ja) | 2010-03-29 | 2016-02-26 | 組み換えベクターを用いたがんの治療 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US8829173B2 (ja) |
EP (1) | EP2547353B1 (ja) |
JP (2) | JP6014020B2 (ja) |
WO (1) | WO2011126864A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016153403A (ja) * | 2010-03-29 | 2016-08-25 | トカジェン インコーポレーテッド | 組み換えベクターを用いたがんの治療 |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102076215A (zh) | 2008-06-30 | 2011-05-25 | 托卡根公司 | 5-氟胞嘧啶制剂及其用途 |
CN102227503B (zh) * | 2008-09-26 | 2015-10-21 | 托卡根公司 | 重组载体 |
CN107129971A (zh) | 2009-06-17 | 2017-09-05 | 托卡根公司 | 复制型逆转录病毒载体的生产细胞 |
WO2012058673A2 (en) | 2010-10-31 | 2012-05-03 | Tocagen Inc. | Enhanced cancer treatment and monitoring using recombinant vectors |
US11065311B2 (en) * | 2012-10-25 | 2021-07-20 | Denovo Biopharma Llc | Retroviral vector with mini-promoter cassette |
US9642921B2 (en) * | 2012-12-20 | 2017-05-09 | Tocagen Inc. | Cancer combination therapy and recombinant vectors |
US9783805B2 (en) * | 2013-02-28 | 2017-10-10 | City Of Hope | Replication capable rAAV vectors encoding inhibitory siRNA and methods of their use |
EP2971132B1 (en) * | 2013-03-15 | 2020-05-06 | Baylor Research Institute | Tissue and blood-based mirna biomarkers for the diagnosis, prognosis and metastasis-predictive potential in colorectal cancer |
CA2907184C (en) * | 2013-03-15 | 2022-12-06 | Sutter West Bay Hospitals | Falz for use as a target for therapies to treat cancer |
AU2014306093A1 (en) * | 2013-08-05 | 2016-03-17 | Tocagen Inc. | Recombinant vector with optimized A-bulge |
EP3122884B1 (en) | 2014-03-26 | 2019-12-25 | Tocagen Inc. | A retroviral vector having immune-stimulating activity |
IL297591A (en) | 2014-04-10 | 2022-12-01 | Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst | Drug-related transgene expression |
CN108174604B (zh) | 2015-08-07 | 2023-06-23 | 西雅图儿童医院(Dba西雅图儿童研究所) | 用于实体瘤靶向的双特异性car t细胞 |
WO2017040815A1 (en) * | 2015-09-04 | 2017-03-09 | Tocagen Inc. | Recombinant vectors comprising 2a peptide |
US11185555B2 (en) | 2016-04-11 | 2021-11-30 | Noah James Harrison | Method to kill pathogenic microbes in a patient |
CN110225977B (zh) | 2016-11-29 | 2023-05-05 | 阿迪雷尔有限公司 | 基因治疗载体系统和药物前体基因 |
AU2017375630B2 (en) | 2016-12-12 | 2023-12-21 | Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) | Chimeric transcription factor variants with augmented sensitivity to drug ligand induction of transgene expression in mammalian cells |
GB201710973D0 (en) | 2017-07-07 | 2017-08-23 | Avacta Life Sciences Ltd | Scaffold proteins |
US20210047425A1 (en) | 2019-08-12 | 2021-02-18 | Purinomia Biotech, Inc. | Methods and compositions for promoting and potentiating t-cell mediated immune responses through adcc targeting of cd39 expressing cells |
TW202128775A (zh) | 2019-10-16 | 2021-08-01 | 英商阿法克塔生命科學有限公司 | PD-L1抑制劑-TGFβ抑制劑雙特異性藥物部分 |
GB202101299D0 (en) | 2020-06-09 | 2021-03-17 | Avacta Life Sciences Ltd | Diagnostic polypetides and methods |
WO2022234003A1 (en) | 2021-05-07 | 2022-11-10 | Avacta Life Sciences Limited | Cd33 binding polypeptides with stefin a protein |
WO2023023278A2 (en) * | 2021-08-18 | 2023-02-23 | University Of Utah Research Foundation | Multigene constructs for treatment of age-related macular degeneration and other complement dysregulation-related conditions |
TW202332694A (zh) | 2021-10-07 | 2023-08-16 | 英商阿凡克塔生命科學公司 | 血清半衰期延長之pd-l1結合多肽 |
WO2023057567A1 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Avacta Life Sciences Limited | Pd-l1 binding affimers |
WO2024074709A1 (en) * | 2022-10-07 | 2024-04-11 | Universitat Pompeu Fabra | Methods and compositions for synthetic evolution |
CN116334010B (zh) * | 2023-05-30 | 2023-08-29 | 中义(北京)健康研究院 | 一种重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (54)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2604845A1 (de) | 1976-02-07 | 1977-08-18 | Knoll Ag | Neue piperazinderivate |
US4405712A (en) | 1981-07-01 | 1983-09-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | LTR-Vectors |
US4650764A (en) | 1983-04-12 | 1987-03-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Helper cell |
US5770428A (en) * | 1993-02-17 | 1998-06-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site |
EP0699240B1 (en) | 1993-04-06 | 1999-08-11 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Gibbon ape leukemia virus-based retroviral vectors |
US20030157070A1 (en) | 1994-12-30 | 2003-08-21 | Jolly Douglas J. | High efficiency ex vivo transduction of cells by high titer recombinant retroviral preparations |
US6117681A (en) | 1995-03-29 | 2000-09-12 | Bavarian Nordic Research Inst. A/S | Pseudotyped retroviral particles |
US20030026789A1 (en) | 1995-05-03 | 2003-02-06 | Richard J. Gregory | Gene therapy using replication competent targeted adenoviral vectors |
EP1025208A2 (en) | 1997-10-20 | 2000-08-09 | Universita' Degli Studi Di Padova | A packaging cell line producing siv-pseudotyped mlv |
FR2773561A1 (fr) | 1998-01-15 | 1999-07-16 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation d'une sequence riche en proline pour augmenter le caractere fusogenique d'enveloppes de retrovirus |
US6451304B1 (en) * | 1998-03-09 | 2002-09-17 | The Regents Of The University Of California | Method for retrovirus vector production by separated gag and pol expression |
JP2002512805A (ja) | 1998-04-29 | 2002-05-08 | オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション | アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターからのレトロウイルスプロデューサー細胞の構築 |
US7001733B1 (en) * | 1998-05-12 | 2006-02-21 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for screening for modulations of IgE synthesis, secretion and switch rearrangement |
WO1999060110A2 (en) | 1998-05-20 | 1999-11-25 | The University Of Tennessee Research Corporation | Stable envelope proteins for retroviral, viral and liposome vectors and use in gene and drug therapy |
US6264940B1 (en) | 1998-08-05 | 2001-07-24 | The Research Foundation Of State University Of New York | Recombinant poliovirus for the treatment of cancer |
CA2346931C (en) | 1998-10-01 | 2011-11-29 | University Of Southern California | Gene delivery system and methods of use |
US6899871B2 (en) * | 1998-10-01 | 2005-05-31 | University Of Southern California | Gene delivery system and methods of use |
US6576463B1 (en) | 1999-01-15 | 2003-06-10 | The Regents Of The University Of California | Hybrid vectors for gene therapy |
JP2002542834A (ja) * | 1999-04-29 | 2002-12-17 | アールフス・ユニバーシティー | レトロウイルスベクターでのires転写カセットからの異種遺伝子群の発現 |
WO2001004266A1 (en) | 1999-07-08 | 2001-01-18 | The Regents Of The Universty Of California | A lung cancer associated retrovirus, gene delivery vector and methods of use thereof |
WO2001040488A1 (en) | 1999-11-30 | 2001-06-07 | Novartis Ag | Increased transgene expression in retroviral vectors having scaffold attachment region |
US6692736B2 (en) | 2000-03-24 | 2004-02-17 | Cell Genesys, Inc. | Cell-specific adenovirus vectors comprising an internal ribosome entry site |
WO2002022663A2 (en) | 2000-09-18 | 2002-03-21 | Maxygen, Inc. | Stress resistant retroviruses |
GB0024550D0 (ja) * | 2000-10-06 | 2000-11-22 | Oxford Biomedica Ltd | |
US20030003565A1 (en) | 2000-11-27 | 2003-01-02 | Dubensky Thomas W. | Functional lentiviral vector from an MLV-based backbone |
WO2002061104A2 (en) | 2001-01-30 | 2002-08-08 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Hybrid adenoviral vector |
DE10111433A1 (de) | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Bundesrepublik Deutschland Let | Replikationskompetente molekulare Klone von porcinem endogenem Retrovirus der Klasse A und Klasse B,abgeleitet von Schweine- und humanen Zellen |
JP2002335965A (ja) | 2001-05-14 | 2002-11-26 | Japan Science & Technology Corp | 細胞特異的発現複製ベクター |
US7098248B2 (en) | 2001-07-09 | 2006-08-29 | Research Development Foundation | Beta-adrenergic blockade reversal of catabolism after severe burn |
DE10143237A1 (de) | 2001-09-04 | 2003-03-20 | Icon Genetics Ag | Herstellung künstlicher interner ribosomaler Eingangsstellenelemente (Ires-Elemente) |
JP4344858B2 (ja) | 2001-09-13 | 2009-10-14 | カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー | 細胞内で抗ウイルス性小rna分子を発現させる方法 |
MXPA04003864A (es) * | 2001-10-26 | 2004-08-11 | Immuno Rx Inc | Inmunoterapia para revertir la supresion inmune. |
FR2832424B1 (fr) | 2001-11-20 | 2004-09-24 | Genethon Iii | Plasmide chimere comprenant un genome retroviral replicatif et utilisations |
EP1470233A1 (en) | 2002-02-01 | 2004-10-27 | Transgene S.A. | Adenoviral vectors for modulating the cellular activities associated with pods |
US20040068762A1 (en) * | 2002-07-17 | 2004-04-08 | Attar Ricardo M. | Transgenic non-human mammals expressing a reporter nucleic acid under the regulation of androgen response elements |
WO2005047505A2 (en) * | 2003-08-07 | 2005-05-26 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods and products for expression of micro rnas |
WO2005086922A2 (en) | 2004-03-10 | 2005-09-22 | Board Of Regents, University Of Texas System | Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes |
US20080227736A1 (en) | 2004-06-03 | 2008-09-18 | Regents Of The University Of California, | Targeting Pseudotyped Retroviral Vectors |
US20070003522A1 (en) | 2004-07-08 | 2007-01-04 | Albritton Lorraine M | Methods and compositions for improved retroviral gene and drug delivery |
KR20070067702A (ko) | 2004-11-04 | 2007-06-28 | 화이자 프로덕츠 인크. | 유방암을 치료하기 위한 ctla-4 항체와 아로마타제억제제 병용 요법 |
AU2005309485A1 (en) * | 2004-11-24 | 2006-06-01 | Nanovector Limited | Viral vectors |
US7968698B2 (en) | 2005-05-25 | 2011-06-28 | The Regents Of The University Of California | Optimized core promoters and uses thereof |
CA2665080C (en) | 2005-10-01 | 2015-11-24 | Charles Stout | Regulatable fusion promoters |
US8034355B2 (en) * | 2005-10-07 | 2011-10-11 | Presidents And Fellows Of Harvard College | Attenuated nonsegmented negative-sense RNA viruses with reduced mRNA cap methyltransferase activity comprising mutations within conserved domain VI of the large polymerase |
EP1795596A1 (en) | 2005-12-08 | 2007-06-13 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Composition and methods for therapy and diagnosis of cancer |
WO2007095201A2 (en) | 2006-02-15 | 2007-08-23 | The Regents Of The University Of California | Pseudotyped retroviral vectors and methods of use thereof |
EP2004677A2 (en) | 2006-03-17 | 2008-12-24 | Aarhus Universitet | Chimeric viral envelopes |
CA2649063C (en) * | 2006-05-02 | 2014-11-25 | Luigina Romani | Use of thymosin .alpha.1, alone or in combination with ptx3 or ganciclovir, for the treatment of cytomegalovirus infection |
WO2008151633A2 (en) | 2007-06-15 | 2008-12-18 | Skau Aps | Vectors for vaccines against lentivirus infections |
CN102076215A (zh) | 2008-06-30 | 2011-05-25 | 托卡根公司 | 5-氟胞嘧啶制剂及其用途 |
US8829173B2 (en) * | 2008-09-26 | 2014-09-09 | Tocagen Inc. | Recombinant vectors |
CN102227503B (zh) | 2008-09-26 | 2015-10-21 | 托卡根公司 | 重组载体 |
CN107129971A (zh) | 2009-06-17 | 2017-09-05 | 托卡根公司 | 复制型逆转录病毒载体的生产细胞 |
BR112013003221A2 (pt) | 2010-08-13 | 2019-09-24 | Pioneer Hi Bred Int | polinucleotídeo quimérico, construto de ácido nucleico, célula, planta, explante vegetal, semente transgênica, polipeptídeo quimérico, método de direcionar um polipeptídeo de interesse a um cloroplasto, cassete de expressão, célula vegetal, polipeptídeo isolado |
-
2011
- 2011-03-26 US US13/072,704 patent/US8829173B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-03-29 JP JP2013502771A patent/JP6014020B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-03-29 US US13/638,490 patent/US20130130986A1/en not_active Abandoned
- 2011-03-29 WO PCT/US2011/030402 patent/WO2011126864A2/en active Application Filing
- 2011-03-29 EP EP11766479.7A patent/EP2547353B1/en not_active Not-in-force
-
2014
- 2014-09-04 US US14/477,741 patent/US9732326B2/en active Active
-
2016
- 2016-02-26 JP JP2016035272A patent/JP2016153403A/ja active Pending
-
2017
- 2017-08-08 US US15/672,029 patent/US10407666B2/en active Active
-
2019
- 2019-09-04 US US16/560,525 patent/US20200239858A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016153403A (ja) * | 2010-03-29 | 2016-08-25 | トカジェン インコーポレーテッド | 組み換えベクターを用いたがんの治療 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2547353A4 (en) | 2013-10-16 |
US20160053232A1 (en) | 2016-02-25 |
JP2016153403A (ja) | 2016-08-25 |
EP2547353A2 (en) | 2013-01-23 |
US20130130986A1 (en) | 2013-05-23 |
WO2011126864A3 (en) | 2012-04-19 |
US9732326B2 (en) | 2017-08-15 |
US20180087035A1 (en) | 2018-03-29 |
US8829173B2 (en) | 2014-09-09 |
US10407666B2 (en) | 2019-09-10 |
US20110287020A1 (en) | 2011-11-24 |
US20200239858A1 (en) | 2020-07-30 |
JP2013523754A (ja) | 2013-06-17 |
EP2547353B1 (en) | 2019-03-06 |
WO2011126864A2 (en) | 2011-10-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6014020B2 (ja) | 組み換えベクターを用いたがんの治療 | |
JP6523224B2 (ja) | 組換えベクター | |
US11279949B2 (en) | Recombinant vectors comprising 2A peptide | |
JP6609663B2 (ja) | 複製可能レトロウイルスベクターの産生細胞 | |
US20220195460A1 (en) | Retroviral vector having immune-stimulating activity | |
JP2016526920A (ja) | 最適化a−バルジを有する組換えベクター | |
US20160222412A1 (en) | Recombinant vector with stabilizing a-loop |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20130909 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130909 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140228 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150525 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20151027 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160226 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20160307 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160531 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160726 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160830 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160923 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6014020 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |