JP4915980B2 - 補体レセプター２標的化補体調節因子 - Google Patents

補体レセプター２標的化補体調節因子 Download PDF

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Description

この出願は、仮米国特許出願第６０／４２６，６７６号（２００２年１１月１５日出願）の優先権を主張するもので、該米国特許出願の全体を本明細書では援用する。
（Ｉ．発明の背景）
補体は一連の血液タンパク質のための総称であって、免疫系の主たるエフェクター機構である。補体活性化および標的構造に対する該補体の付着は、直接的に補体を媒介した細胞溶解の原因となったり、強力な炎症調節因子の生成または免疫エフェクター細胞の動員および活性化による組織破壊を間接的にもたらす。組織損傷の媒介となる補体活性化産物は、補体経路の様々な段階で生成される。宿主組織での不適当な補体活性化は、多くの自己免疫疾患および炎症性疾患の病態で重要な役割を果すとともに、生体非適合性（例えば、心肺蘇生後炎症および移植拒絶反応）に関連する多くの症状にも関与する。補体の阻害は、そのような免疫媒介性疾患および症状の処置に対して潜在的な治療法を表す。補体を全身的に阻害する補体阻害タンパク質は、種々の動物疾患モデル（および２、３の臨床試験で）で有効であることが示されている。しかし、補体活性化および疾患の部位を標的とする補体インヒビターによって、安全および有効性に関して有意かつ潜在的な利点が与えられる。
健康な個体では、細胞表面で発現された補体阻害タンパク質によって、宿主細胞膜への補体の付着が妨げられる。このような補体阻害タンパク質は、腫瘍細胞の表面でも発現（しばしば高レベルで発現）され、モノクローナル抗体媒介性免疫療法（腫瘍細胞を標的とし、補体を活性化させるモノクローナル抗体）に対する腫瘍の耐性に寄与する重要な因子であると考えられる。
補体系は、約３０のタンパク質の集まりから構成され、免疫系の主要なエフェクター機構の１つである。補体カスケードは、基本的に古典経路（通常、抗体依存性）または第二経路（通常、抗体非依存性）のいずれか一方を介して活性化される。いずれの経路を介した活性化であっても、Ｃ３転換酵素の生成をもたらす。この酵素は、上記カスケードの中心的な酵素複合体である。Ｃ３転換酵素は、血清Ｃ３を切断してＣ３ａとＣ３ｂとに分け、後者は活性部位に共有結合してＣ３転移酵素（増幅ループ）をさらに生成する。活性化産物であるＣ３ｂ（および古典経路を介してのみ生成されるＣ４ｂも同様）ならびにその分解産物は、重要なオプソニンであり、免疫結合体輸送および可溶化と同様に標的細胞の細胞媒介性溶解（食細胞とＮＫ細胞とによる）を促進させることに関与する。Ｃ３／Ｃ４活性化産物および免疫系の種々の細胞上にあるそのレセプターもまた、細胞性免疫反応の調節にとって重要である。Ｃ３転換酵素は、Ｃ５転換酵素（Ｃ５を切断してＣ５ａおよびＣ５ｂを産生する複合体）の形成に関与する。Ｃ５ａは強力な炎症誘発性および化学走性を有し、免疫エフェクター細胞を動員および活性化させることができる。Ｃ５ｂの形成によって最終的な補体経路が開始されることで、補体系蛋白Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、および（Ｃ９）ｎが順次組み合わさって膜侵襲複合体（ＭＡＣまたはＣ５ｂ−９）が形成される。標的細胞膜でのＭＡＣの形成は、直接的な細胞溶解を引き起こしうるが、細胞の活性化および種々の炎症調節因子の発現／放出も引き起こすことができる。
膜補体インヒビターは、大きく２つのクラス、すなわち補体活性化経路のインヒビター（Ｃ３転換酵素形成を阻害）と最終補体経路のインヒビター（ＭＡＣ形成を阻害）とに、分けられる。補体活性化の膜インヒビターとして、補体レセプター１（ＣＲ１）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、およびメンブラン・コファクター・プロテイン（ＭＣＰ）が挙げられる。これらはすべて、Ｃ３／４結合蛋白の共通な特徴であるショート・コンセンサス・リピート（ＳＣＲ）と呼ばれる約６０〜７０アミノ酸の繰り返し単位（数量不定）からなるタンパク質構造を有する。ヒト補体活性化インヒビターの齧歯類ホモログが同定されている。齧歯類タンパク質Ｃｒｒｙは、ＤＡＦおよびＭＣＰの両方に類似して機能する広く分布する補体活性化インヒビターである。齧歯類ではＤＡＦおよびＭＣＰも発現されるが、Ｃｒｒｙは齧歯類での補体活性化で最も重要な調節因子として機能することは明らかである。ヒトで見つかるＣｒｒｙのホモログは存在しないにもかかわらず、Ｃｒｒｙおよび動物モデルでのその用途に関する研究は、臨床的に関連する。
宿主細胞膜での最終補体経路およびＭＡＣ形成の制御は、ＣＤ５９の活性化を介して主として生ずる。グルコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって形質膜に結合し、広範囲に分布する２０ｋＤ糖タンパク質である。ＣＤ５９は、組み合わさっているＭＡＣのＣ８およびＣ９に結合して膜挿入を妨げる。
種々のタイプの補体阻害タンパク質が、生体非適合性に関連した炎症性疾患および症状の治療について、現在研究されている。治療上の性質が最もよく解明されたヒト補体インヒビターのうちの２つは、可溶型補体レセプター１（ｓＣＲ１）および抗Ｃ５モノクローナル抗体である。これらの全身的に活性のある阻害タンパク質は、疾患に関する種々の動物モデルで有効性があることが示されており、より最近では臨床試験で有効性が示されている（１−５、６：＃１０３７）。抗Ｃ５ｍＡｂは、Ｃ５ａおよびＭＡＣの生成を阻害し、一方ｓＣＲ１は補体活性化のインヒビターであるとともに、Ｃ３活性化産物の生成を阻害する。ヒト崩壊促進因子（ＤＡＦ）およびメンブラン・コファクター・プロテイン（ＭＣＰ）（補体活性化の膜インヒビター）の可溶形態もまた、炎症および生体適合性の動物モデルで保護的であると示されている（７−１１）。ＣＤ５９は、ＭＡＣの会合を阻む補体の膜インヒビターではあるが、補体オプソニンまたはＣ３およびＣ５ａの産生に影響を及ぼさない。ＣＤ５９の可溶型が生産されているが、インビトロ、特に血清中では機能活性が低く、ＣＤ５９の治療効力はほとんどないことを示している（１２−１５）。
補体インヒビターを補体活性化および疾患の部位に標的化させることは、該補体インヒビターの効力を改善する可能性がある。補体は宿主防御および免疫結合体代謝で重要な役割を果たすことから、標的化補体インヒビターも潜在的に重大な副作用、特に長期にわたる補体阻害を減らすこともできる。最近、シアリル・ルイスｘ（ｓＬｅｘ）によってデコレートされたｓＣＲＩの修飾型を調製し、この修飾型が、ＰおよびＥセクレチンを発現している血管内皮細胞に結合することが示されている。ｓＣＲ１ｓＬｅｘは、炎症疾患の齧歯類モデルでのｓＣＲ１よりも、より強力な療法であるように見える（１６，１７）。インビトロフィージビリテイー・スタデイでは、抗体−ＤＡＰ（１８）および抗体−ＣＤ５９（１９）融合タンパク質が非標的細胞よりも標的細胞のほうを補体から保護するために、よりいっそう効果的であることが示された。組換え型補体インヒビターの非特異的膜標的化もまた、インヒビターを膜挿入ペプチドと結合させることで達成された（２０、２１）。
Ｃ３活性化フラグメントは、補体活性化部位で見いだされる豊富な補体オプソニンであり、それらは種々のＣ３レセプターに対するリガンドとして用いられる。そのようなレセプターの１つは、膜貫通タンパク質である補体レセプター２（ＣＲ２）であり、該タンパク質は成熟Ｂ細胞および小胞樹状突起細胞で主に発現されることで、体液性免疫において重要な役割を果たす（２２、２３）。ＣＲ２は、Ｃ３結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、それらのタンパク質に特徴的な構造単位である１５〜１６個のショート・コンセンサス・リピート（ＳＣＲ）ドメインからなり、２つのＮ末端ＳＣＲにＣ３結合部位が含まれる（２４、２５）。ＣＲ２は補体インヒビターではなくＣ３ｂに結合しないことから、補体活性化インヒビター（ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＲ１、およびＣｒｒｙ）とは異なる。ＣＲ２の天然リガンドは、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、およびＣ３ｄであり、ＣＲ２の２つのＮ末端ＳＣＲドメインに結合するＣ３ｂの細胞結合破壊フラグメントである（２６、２７）。Ｃ３の切断によって、最初に活性化細胞表面上でのＣ３ｂの生成および付着が生ずる。Ｃ３ｂフラグメントは、補体カスケードを増幅させる酵素複合体の生成に関与している。細胞表面上、特に補体活性化の調節因子を含む宿主表面（すなわち、大部分の宿主組織）上に付着した場合、Ｃ３ｂが急激に不活性化ｉＣ３ｂに変化する。たとえ膜結合補体調節因子が存在しない場合でも、相当な量のｉＣ３ｂが形成される。血清プロテアーゼによってｉＣ３ｂが連続的に消化されて膜結合フラグメントＣ３ｄｇ、さらにＣ３ｄになるが、このプロセスは相対的に低速である（２８、２９）。したがって、ＣＲ２に対するＣ３リガンドはひとたび生成されるとその寿命は相対的に長く、補体活性化部位に高濃度で存在することになる。
（ＩＩ．発明の要旨）
この発明の目的にもとづいて、本明細書で具体化かつ一般的に説明されるように、この発明は、一態様では、ＣＲ２を標的とした補体活性調節因子に関する。
本発明のさらなる利点は、以下の説明に部分的に記載され、その説明から部分的に明らかであるか、もしくは本発明を実施することによって知ることができる。本発明の利点は、添付された特許請求の範囲に詳しく開示された構成要素および組み合わせによって、実現かつ達成される。前述の一般的説明と後述の詳細な説明との両方が典型的かつ説明的なだけであって、クレームされたように、本発明を限定するものではないことが、理解される。
（発明の詳細な説明）
本発明は、本発明の好ましい実施形態および好ましい実施形態に包括される実施例に関する以下の詳細な説明と、図面ならびに図面に関する先の説明および以下の説明とを参照することによってより容易に理解されうる。
本化合物、組成物、物質、装置、および／または方法を開示および説明するに当たって、特に明記しない限り、この発明が特定の合成方法、特定の組換え生物工学方法、または特定の試薬に限定されるものではなく、当然ながら多様でありうることが理解されたい。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で用いられたものであり、限定することを意図したものではないということも理解されたい。
Ａ．定義
明細書および付随する請求項の記載で用いられるように、単数形「１つの（ａ）または（ａｎ）」、および「該（ｔｈｅ）」は、文脈において明らかに他のことが述べられているのではないかぎり、複数形の指示対象を包括する。したがって、例えば、「（１つの）医薬担体（ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃａｒｒｉｅｒ）」に言及することによって、２つ以上のそのような担体等の混合物が含まれる。
範囲は、「およその（約）（ａｂｏｕｔ）」１つの特定の値からの範囲として、かつ／または「およその（ａｂｏｕｔ）」別の特定の値までの範囲として本明細書で表記されうる。そのような範囲が表記される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からの範囲および／または他の特定の値までの範囲を含む。同様に、値が先行詞「約（ａｂｏｕｔ）」を用いて近似値として表記される場合、特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されるであろう。さらに、複数の範囲の各々の終点が、それ以外の終点と関連して有意である場合とそれ以外の終点から独立して有意である場合とがあることが理解されるであろう。
この明細書内およびそれに続く請求項の記載内では、以下の意味を持つように定義される多数の用語について言及する
すなわち、「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、以降に記載される事象または情況が生じる場合と生じない場合とがあることを意味し、その記載が該事象または情況が生じた場合の例と生じない場合の例とを含むことを意味する。
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、ある状態の被験体に組成物を投与することを意味し、この際、該状態は、いずれの病態、自己免疫疾患、癌、または炎症状態でもありうる。被験体への組成物の投与の作用は、限定はされないが、状態の症状の低減、状態の重度の低減、または状態の完全な除去の作用を持つことができる。
本明細書では、「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」とは、活性を低減させることを意味する。阻害は、活性のわずかな低減から全ての活性の完全な除去までを意味することができることが理解される。「インヒビター（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、活性を低減させるいずれのものでもありうる。
本明細書では、「活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」または「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」とは、活性を増加させることを意味する。活性化は、既存の活性の増加と、新たな活性の誘導とを意味することができることが理解される。「活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）」とは、活性を増加させるいずれのものでもありうる。
Ｂ．補体阻害構築物および補体活性化構築物
ＣＲ２および補体活性調節因子を含む構築物を含む組成物を開示する。
ＣＲ２は、ショート・コンセンサス・リピート（ＳＣＲ）として知られる１５または１６の繰り返し単位からなる細胞外部分からなる。アミノ酸１〜２０は、リーダー・ペプチドを含み、アミノ酸２３〜８２は、ＳＣＲ１を含み、アミノ酸９１〜１４６は、ＳＣＲ２を含み、アミノ酸１５４〜２１０は、ＳＣＲ３を含み、アミノ酸２１５〜２７１は、ＳＣＲ４を含む。活性部位（Ｃ３ｄｇ連結部位）は、ＳＣＲ１〜２（最初の２個のＮ末端ＳＣＲ）に位置する。ＳＣＲ単位は、スペーサーとして働く可変長の短い配列によって隔てられている。活性部位を含有する任意の数のＳＣＲを用いることができることが理解される。一実施形態では、構築物は、４つのＮ末端ＳＣＲ単位を含有する。別の実施形態では、構築物は、最初の２個のＮ末端ＳＣＲを含む。別の実施形態では、構築物は、最初の３個のＮ末端ＳＣＲを含む。
開示するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、および組成物に対して、種および株変異が存在することが理解される。開示するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、および組成物に対する全ての種および株変異を明確に開示する。
構築物が融合タンパク質である組成物も開示される。
本明細書では、「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、作用自在に連結したペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含む２つ以上の構成要素を意味する。ＣＲ２は、アミノ酸連結配列によって補体インヒビターまたは活性化因子に連結することができる。リンカーの例は、当該技術分野で公知である。リンカーの例としては、限定はされないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（Ｇ４Ｓ）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４（Ｇ３Ｓ）、ＳｅｒＧｌｙ４、およびＳｅｒＧｌｙ４ＳｅｒＧｌｙ４が挙げられる。連結配列は、ヒト（またはマウス）タンパク質内のＳＣＲユニット間で見出される「天然の（ｎａｔｕｒａｌ）」連結配列、例えば、ヒトＣＲ２のＳＣＲ２とＳＣＲ３との間の連結配列であるＶＳＶＦＰＬＥからなることもできる。連結配列を用いずに融合タンパク質を構築することもできる。
融合タンパク質が補体を阻害する、本発明の組成物も開示する。
補体活性調節因子が補体インヒビターを含む、本発明の組成物も開示する。
例えば、補体インヒビターが崩壊促進因子（ＤＡＦ）（配列番号１（ヌクレオチド）および配列番号２（アミノ酸））である、本発明の組成物も開示する。例えば、ＤＡＦは、グリコホスファチジル・アンカーおよびセリン−スレオニン・リッチ領域を持たず、４つのＳＣＲドメインを含む可溶性ヒトＤＡＦでありうる。ＤＡＦは、４つのＳＣＲドメインおよびセリン−スレオニン・リッチ領域を含むがグリコホスファチジル・アンカーは持たない可溶性ヒトＤＡＦでもありうる。
ＤＡＦ細胞外領域は、Ｎ末端の４つのＳＣＲ単位と、それに続くセリン／スレオニン（Ｓ／Ｔ）リッチ領域とからなる。アミノ酸１〜３４は、リーダー・ペプチドを含み、アミノ酸３５〜９５は、ＳＣＲ１を含み、アミノ酸９７〜１５９は、ＳＣＲ２を含み、アミノ酸１６２〜２２１は、ＳＣＲ３を含み、アミノ酸２２４〜２８４はＳＣＲ４を含み、アミノ酸２８７〜３５６は、Ｓ／Ｔ領域を含む。本発明の一実施形態では、本発明の組成物は、４つのＳＣＲ単位全てを含む。本発明の別の実施形態では、組成物は、ＤＡＦのＳＣＲ２〜４を含む。
補体インヒビターがＣＤ５９と別の補体インヒビターとの間に融合タンパク質を含む、本発明の組成物を開示し、該別の補体インヒビターは、ＤＡＦ、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、およびＣＲ１からなる群から選択される。補体インヒビターが２つ以上の補体インヒビターの融合タンパク質である、本発明の組成物も開示する。
融合タンパク質がＣＲ２−ＤＡＦ（配列番号６）を含む、本発明の組成物も開示する。融合タンパク質が配列番号５を含むヌクレオチドにコードされる、本発明の組成物も開示する。
融合タンパク質がＤＡＦ−ＣＲ２（配列番号１０）を含む、本発明の組成物も開示する。融合タンパク質が配列番号９を含むヌクレオチドにコードされる、本発明の組成物も開示する。
補体インヒビターがヒトＣＤ５９（配列番号３（ヌクレオチド）および配列番号４（アミノ酸））である、本発明の組成物も開示する。ヒトＣＤ５９は、グリコホスファチジル・アンカーを持たずに成熟タンパク質を含む可溶性ヒトＣＤ５９でありうる。
融合タンパク質がＣＲ２−ヒトＣＤ５９（配列番号８）を含む、本発明の組成物も開示する。融合タンパク質が配列番号７を含むヌクレオチドにコードされる、本発明の組成物も開示する。
融合タンパク質がヒトＣＤ５９−ＣＲ２（配列番号１２）を含む、本発明の組成物も開示する。融合タンパク質が配列番号１０を含むヌクレオチドにコードされる、本発明の組成物も開示する。
補体インヒビターがＣ５に対する抗体である、本発明の組成物も開示する。融合タンパク質がＣＲ２−抗Ｃ５抗体を含む、本発明の組成物も開示する
補体インヒビターがＣＲ１（配列番号１３（ヌクレオチド）および配列番号１４（アミノ酸））である、本発明の組成物も開示する。ＣＲ１の細胞外領域は、３０のＳＣＲ単位を含むことができる。本発明の一実施形態では、組成物がＣＲ１の完全な細胞外領域を含むことができる。本発明の別の実施形態では、組成物は、ＣＲ１の１つの活性部位（複数の活性部位）を含む。ＣＲ１の活性部位は、リーダー・ペプチドを含むアミノ酸１〜４６、ＳＣＲ１〜４（Ｃ４ｂ結合部位、Ｃ３ｂに対してより低い親和性）を含むアミノ酸４７〜３００、ＳＣＲ８〜１１（Ｃ３ｂ結合部位、Ｃ４ｂに対してより低い親和性）を含むアミノ酸４９７〜７５０、ＳＣＲ１５〜１８（Ｃ３ｂ結合部位、Ｃ４ｂに対してより低い親和性）を含むアミノ酸９４７〜１２００、およびＣ１ｑ結合部位を含むアミノ酸１４００〜１８５１である。本発明のさらに別の実施形態では、本発明の組成物は、ＣＲ１の活性部位のいずれかの組み合わせ（またはいずれか１つ）あるいはＣＲ１活性部位の全てを含むことができる。
補体インヒビターがＣＲ１の活性部位を含む、本発明の組成物を開示するとともに、この際、１つの活性部位（複数の活性部位）がさらに、アミノ酸６〜４６を含むリーダー・ペプチド、ＳＣＲ１〜４（Ｃ４ｂ結合部位、Ｃ３ｂに対してより低い親和性）を含むアミノ酸４７〜３００、ＳＣＲ８〜１１（Ｃ３ｂ結合部位、Ｃ４ｂに対してより低い親和性）を含むアミノ酸４９７〜７５０、ＳＣＲ１５〜１８（Ｃ３ｂ結合部位、Ｃ４ｂに対してより低い親和性）を含むアミノ酸９４７〜１２００、およびＣ１ｑ結合部位を含むアミノ酸１４００〜１８５１を含む。本発明のさらに別の実施形態では、本発明の組成物は、ＣＲ１の活性部位のいずれかの組み合わせ（またはいずれか１つ）あるいはＣＲ１の活性部位の全てを含むことができる。
補体インヒビターがＭＣＰ（配列番号１５（ヌクレオチド）および配列番号１６（アミノ酸））である、本発明の組成物も開示する。細胞外領域は、４つのＳＣＲ単位と、それに続くｓｅｒ／ｔｈｒ領域とからなる。アミノ酸１〜３４は、リーダー・ペプチドを含み、アミノ酸３５〜９５は、ＳＣＲ１を含み、アミノ酸９６〜１５８は、ＳＣＲ２を含み、アミノ酸１５９〜２２４は、ＳＣＲ３を含み、アミノ酸２２５〜２８５は、ＳＣＲ４を含み、アミノ酸２８６〜３１４は、Ｓ／Ｔ領域を含む。
補体インヒビターがＣｒｒｙ（配列番号１７）である、本発明の組成物も開示する。Ｃｒｒｙは、膜貫通領域を持たずに５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む可溶性マウスＣｒｒｙでありうる。
補体インヒビターがマウスＣＤ５９である、本発明の組成物も開示する。マウスＣＤ５９は、グリコホスファチジル・アンカーを持たずに成熟タンパク質を含む可溶性マウスＣＤ５９でありうる。
融合タンパク質が補体を活性化する、本発明の組成物を開示する。
したがって、補体活性調節因子が補体活性化因子を含む、本発明の組成物を開示する。
補体活性化因子がヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号１８）である、本発明の組成物を開示する。
補体活性化因子がＣＲ２−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号２０）を含む、本発明の組成物も開示する。融合タンパク質が配列番号２１を含むヌクレオチドにコードされる、本発明の組成物も開示する。
融合タンパク質がヒトＩｇＭ（配列番号１９）である、本発明の組成物を開示する。
融合タンパク質がＣＲ２−ヒトＩｇＭ Ｆｃを含む、本発明の組成物も開示する。
補体活性化因子がマウスＩｇＧ３（配列番号２２）である、本発明の組成物を開示する。
融合タンパク質がＣＲ２−マウスＩｇＧ３ Ｆｃを含む、本発明の組成物も開示する。
融合タンパク質がＣＲ２−マウスＩｇＭ Ｆｃを含む、本発明の組成物も開示する。
補体活性化因子が、組成物のＦｃ部分を介して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）も増加することについても明確に考察する。ＡＤＣＣは、ナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞上のＦｃ領域およびＦｃ受容体の認識および接触を介したＮＫ細胞による標的細胞の破壊である。これは、ＩｇＧ１ ＦｃまたはＩｇＧ３ ＦｃのＦｃγＲＩＩＩ認識の形態でありうる。ＦｃとのＦｃ受容体の接触に続いて、ＮＫ細胞は、パーフォリンおよびグランザイムを用いることによって標的細胞を溶解する。この機構は、腫瘍増殖を制御する上で重要である。
ＣＲ２−Ｆｃ融合タンパク質が免疫原性ではない、本発明の組成物を開示する。免疫原性ではない（すなわち、免疫応答を誘出しない）組成物は、被験体自身の免疫応答によって攻撃および不活性化されにくいということが理解される。ＣＲ２−Ｆｃ免疫原性の消失が期待されることにより、抗体がヒト化されていたとしても抗ＣＭ抗体を上回る潜在的な利点となる。本発明の一実施形態では、ＣＲ２と融合したＦｃ領域は、ｍｕ尾部部分（ｍｕ−ｔａｉｌｐｉｅｃｅ）を含有するヒトまたはマウスＩｇＧアイソタイプ、ヒトまたはマウスＩｇＭ、あるいは任意のヒトまたはマウスＩｇＧアイソタイプに由来しうる。ｍｕ尾部部分は、ＩｇＭ由来の１８アミノ酸Ｃ末端領域であり、ＩｇＧ Ｆｃ配列のＣ末端に付加されると、補体を効率的に活性化するとともにＦｃ受容体に対する親和性が増強しているＩｇＧの重合形態（ＩｇＭに類似の）の生成を生じる。融合は、組成物のＦｃ部分のヒンジ領域で生じうる。
ｍｕ尾部部分を持つＩｇＭまたはＩｇＧ Ｆｃ領域のいずれかを含有するＣＲ２融合タンパク質は、ＣＲ２−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を上回る利点を持つことができる。ＩｇＭまたはＩｇＧ−ｍｕ Ｆｃ領域は、最大で６つのＦｃと１２のＣＲ２部位までを持つ重合融合体タンパク質を生じる。これらの構築物は、Ｃ３リガンドに対する活性の増強およびエフェクター機能（補体活性化およびＦｃ受容体結合）の増強ができる。
補体活性化因子がＣＶＦ（配列番号２３（ヌクレオチド）および配列番号２４（アミノ酸））である、本発明の組成物も開示する。
本発明の一実施形態では、ＣＶＦを可溶性ＣＲ２と連結することができる。ＣＶＦはＢ因子と結合し、ＣＶＦＢｂ（すなわち、補体阻害タンパク質によって不活性化されないＣ３／Ｃ５コンベルターゼ）を形成することによって補体の代替経路を活性化することが理解される。ＣＶＦＢｂの半減期は、生理学的代替経路コンベルターゼＣ３ｂＢｂの半減期が約１分であるのに対して、約７時間である。
本発明の一実施形態では、ＣＶＦを可溶性ＣＲ２に化学的に結合することができる。
構築物がベクターである、本発明の組成物を開示する。
本発明のベクターを含む細胞を開示する。構築物が免疫結合体である組成物も開示する。本明細書では、「免疫結合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」とは、化学的クロス・リンカーによって作用自在に連結したペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含む２つの以上構成要素を意味する。免疫結合体の構成要素の連結は、該構成要素の反応基上で生じうる。クロス・リンカー用いて標的とされうる反応基としては、１級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、糖質、およびカルボン酸が挙げられ、あるいは活性基をタンパク質に付加することができる。化学的リンカーの例は、当該技術分野で公知であり、限定はされないが、ＭＢＳ、スルホ−ＭＢＳ、ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、ＧＭＢＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、ＥＭＣＳ、スルホ−ＥＭＣＳ等のビスマレイミドヘキサン、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ＮＨＳ−エステル−マレイミド・クロスリンカー；ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＴＢＰ等のイミドエステル・クロスリンカー；ＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド］、［２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−４−Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキサミド、ＤＴＭＥ：ジチオ−ビス−マレイミドエタン、ＤＭＡ（ジメチルアジパミド・２ＨＣｌ）、ＤＭＰ（ジメチルピメリミデート・２ＨＣｌ）、ＤＭＳ（ジメチルスベリミデート・２ＨＣｌ）、ＤＴＢＰ（ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート・２ＨＣｌ）、ＭＢＳ、（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート）、ＧＭＢＳ（Ｎ−［・マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル）、ＥＭＣＳ（Ｎ−［・マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル）、およびスルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−［・マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）を挙げることができる。
Ｃ．組成物を用いる方法
各種の補体阻害タンパク質が、生体非適合性に関連する炎症疾患および症状の治療法として現在検討中である。治療的に特徴付けられたヒト補体インヒビターの最善２つは、補体レセプター１の可溶性形態（ｓＣＲ１）および抗Ｃ５モノクローナル抗体である。これらの全身的に活性のある阻害タンパク質は、種々の疾患動物モデルにおいて、より近年には臨床試験において効力を示した（１〜５、６：＃１０３７、インビボ効力および臨床結果の教示に関して、本明細書に援用する）。
被験体の補体によって影響を受けた状態を処置する方法を開示し、該方法は、本発明の組成物を該被験体に投与することを含む。被験体への組成物の投与は、限定はされないが、状態の症状の低減、状態の重度の低減、または状態の完全な除去の作用を持つことができる。
１．補体を阻害する組成物を用いる方法
被験体の補体によって影響を受けた状態を処置する方法を開示し、該方法は、本発明の組成物を該被験体に投与することを含み、この際、該組成物は補体活性を阻害する。被験体への組成物の投与の作用は、限定はされないが、状態の症状の低減、状態の重度の低減、または状態の完全な除去の作用を持つことができることが理解される。
補体媒介性障害を減少させる方法を開示し、該方法は、補体を阻害する本発明の組成物を被験体に投与することを含む。
処置される状態が炎症状態である、本発明の方法を開示する。炎症状態が、喘息、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、反応性関節炎、脊椎炎、全身脈管炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、実験アレルギー性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、対宿主性移植片病、クローン病を含む炎症性大腸疾患、潰瘍性大腸炎、乏血再潅流傷害、心筋梗塞、アルツハイマー病、移植拒絶反応（同種異系および異種）、熱傷、任意の免疫結合体誘導炎症、糸球体腎炎、重症筋無力症、脳ループス、ギヤン‐バレー症候群、脈管炎、全身性硬化症、過敏性、カテーテル反応、アテローム、不妊性、甲状腺炎、ＡＲＤＳ、ポスト・バイパス症候群、血液透析、若年性リウマトイド、ベーチェット症候群、溶血性貧血、ペンフィグス、水疱性類天疱瘡、脳卒中、アテローム性動脈硬化、および強皮症からなる群から選択されうる、本発明の方法も開示する。
状態がウイルス感染である、本発明の方法も開示する。ウイルス感染が、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、呼吸系発疹ウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウィルス、ラサ熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレイ・バレー熱ウイルス、西ナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、シンドビスウイルス、ハンタウイルスからなるウイルスの群から選択されうる、本発明の方法も開示する。
状態がウイルス・ベクターに対する炎症応答である、本発明の方法を開示する。ウイルス・ベクターは、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、修飾ワクシニアアンカラウイルス、およびサイトメガロウイルスからなるウイルスの群から選択されうる。他のウイルス・ベクターもワクチン送達のために用いられることが理解される。当該技術分野で公知のあらゆるウイルス・ベクターが明確に開示される。
カンジダ属がＣＲ２と類似の結合特性を持つＣＲ３様タンパク質を発現することは当該技術分野で理解されている。ＣＲ３様タンパク質は、病因に関与すると思われる。したがって、本発明の一実施形態は、真菌性感染症に罹患する被験体を処置することであり、本発明の組成物を被験体に投与することを含む処置は、真菌−「ＣＲ３」機能を遮断するとともに、補体を阻害する。
補体インヒビターがアポトーシスにもとづく療法（例えば、Ｆａｓリガンドを発現するアデノウイルスを用いる遺伝子療法）の結果を高める、本発明の方法を開示する。
正常の発生中に生じるアポトーシスは、非炎症性であり、免疫寛容の誘導に関与する。アポトーシス性細胞死は、それがどのよう活性化されるかによって、かつどの細胞型（例えば、Ｆａｓと連結する治療因子は炎症を誘導することができる）であるかによって炎症性でありうるが、壊死性細胞死は、放出された細胞内用物と、刺激された食細胞によって放出される炎症誘発性サイトカインとによって媒介される持続的かつ強力な炎症応答を生じる。アポトーシス細胞および小胞は、正常には、食細胞によって除去されるので、細胞溶解の炎症誘発性の結果を防ぐ。この文脈では、アポトーシス細胞およびアポトーシス小体は、直接、補体を固定することと、補体は、アポトーシス細胞のオプソニン作用および増強された食作用が原因で抗炎症応答を持続することができることとが示される。
炎症は、先天性および適応性の免疫応答に影響しうる免疫細胞の非特異的な動員に関与する。アポトーシスにもとづく腫瘍療法中に補体活性化を変調してアポトーシス細胞／小体の食作用性取り込みを阻害することは、腫瘍環境内の炎症性／先天性免疫応答を増強する。さらに、アポトーシス細胞は、免疫原性自己抗原のソースでありえ、除去されたアポトーシス小体は、自己免疫化を生じうる。増強された免疫刺激環境を作り出すことに加えて、腫瘍細胞を誘導してアポトーシスを受けさせる部位で補体を変調することは、さらに、宿主が正常には寛容する腫瘍に対して特異的な免疫を増大または誘発する。
本発明の開示する組成物は、ＣＲ２およびＣＲ３アンタゴニストとして作用する。ＣＲ２阻害を介して補体活性を阻害する方法を開示し、該方法は、本発明の組成物を被験体に投与することを含む。ＣＲ３の阻害を介して補体活性を阻害する方法も開示し、該方法は、本発明の組成物を被験体に投与することを含む。ＣＲ２アンタゴニストは、免疫応答を変調することができるので、ＣＲ３アンタゴニストは、ＣＲ３が内皮ＩＣＡＭ１に結合するインテグリンであることから第２の抗炎症作用機構を持つことができる。ＩＣＡＭ１は、炎症部位で発現し、白血球接着および血管外遊出に関与する。さらに、ＩＣＡＭ１発現は、補体活性化産物に上方制御される。
２．補体を活性化する組成物を用いる方法
被験体の補体によって影響を受けた状態を処置する方法を開示し、該方法は、本発明の組成物を被験体に投与することを含み、この際、該組成物は補体を活性化する。被験体への組成物の投与は、限定はされないが、状態の症状の低減、状態の重度の低減、または状態の完全な除去の作用を持つことができることが理解される。
補体媒介性障害を増強する方法を開示し、該方法は、補体を活性化する本発明の組成物を被験体に投与することを含む。状態が癌である、本発明の方法も開示する。癌は、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、白血病、菌状息肉腫、癌腫、中実組織の癌腫、有棘細胞癌、腺癌、肉腫、膠腫、芽腫、神経芽細胞腫、プラスマ細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、エイズ関連のリンパ腫または肉腫、転移性癌、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部の有棘細胞癌、神経芽細胞腫／膠芽腫、卵巣癌、皮膚癌、肝癌、黒色腫、口腔、咽喉、喉頭、および肺の有棘細胞癌、大腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌、乳癌、上皮癌、腎臓癌、尿生殖器の癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、造血癌、精巣癌、結腸直腸癌、前立腺癌、または膵癌からなる群から選択されうる。
本発明の一実施形態では、ＣＲ２は、抗腫瘍抗体を投与した結果として、または正常には効果のない体液性免疫応答の結果として腫瘍細胞に堆積した補体を標的とすることができる。
したがって、本補体活性化組成物を、抗腫瘍抗体と組み合わせて投与することができる。そのような抗腫瘍抗体の例は、周知であり、抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体Ｊ５９１、ＰＥＱ２２６．５、およびＰＭ２Ｐ０７９．１（Ｆｒａｃａｓｓｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｓｔａｔｅ ５３（１）：９−２３）；抗Ｈｅｒ２抗体ｈｕ４Ｄ５（Ｇｅｒｓｔｎｅｒ，Ｒ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２１（５）：８５１−６２）；抗腎細胞癌抗体として用いることができる抗ジシアロシルＧｂ５モノクローナル抗体５Ｆ３（Ｉｔｏ Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１８（６）：４７５−４８５）；抗ＭＡＧＥモノクローナル抗体５７Ｂ（Ａｎｔｏｎｅｓｃｕ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３３（２）：２２５−９）；抗癌モノクローナル抗体ＣＬＮ−Ｉｇ（Ｋｕｂｏ，Ｏ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ．６０（３）：４９７−５０３）；抗ダルトンのリンパ腫関連抗原（ＤＬＡＡ）モノクローナル抗体ＤＬＡＢ（Ｓｕｂｂｉａｈ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３９（１０）：９９３−７）が挙げられる。抗腫瘍抗体が腫瘍に存在する時間中に本組成物が腫瘍に存在するかぎり、抗腫瘍抗体の投与前、投与と同時に、または投与後に投与することができる。
開示される組成物を用いて処置することができる癌の代表的な非限定的な群は以下のものである。すなわち、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、多発性骨髄腫、ホジキン疾患、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸癌、頭頸部の有棘細胞癌、腎臓癌、肺小細胞癌および非小細胞肺癌等の肺癌、尿路上皮癌、腺癌、肉腫、膠腫、悪性膠腫、芽腫、神経芽細胞腫、プラスマ細胞腫、組織球腫瘍、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、エイズ関連のリンパ腫または肉腫、転移性癌、神経芽細胞腫／膠芽腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、肝癌、黒色腫、口腔、咽喉、喉頭、および肺の有棘細胞癌、大腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌、乳癌、上皮癌、腎臓癌、尿生殖器の癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血癌、精巣癌、結腸直腸癌、胃癌、前立腺癌、ヴァルデンストレーム疾患、または膵癌である。
本明細書で開示する補体活性化組成物を用いて、頸部および肛門の形態異常、他の形態異常、重度異形成、過形成、非典型的過形成、および新形成等の前癌状態を処置することもできる。状態が前癌状態である、本発明の方法を開示する。組成物は、前癌細胞の表面上で過剰発現する抗原を認識することが理解される。
本発明の補体活性化組成物を用いてウイルス感染症を処置する方法を開示する。ウイルス感染症は、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルス、水痘‐帯状疱疹ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス６、ヒト・ヘルペスウイルス７、ヒト・ヘルペスウイルス８、天然痘ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、はしかウイルス、ポリオーマウイルス、ヒト・パピローマウイルス、呼吸系発疹ウイルス、アデノウイルス、コクサッキー・ウイルス、デング熱ウイルス、耳下腺炎ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、黄熱病ウイルス，エボラウイルス、マールブルグウィルス、ラサ熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレイ・バレー熱ウイルス、西ナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、シンドビスウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型、ハンタウイルス、風疹ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型、およびヒト免疫ウイルス２型からなるウイルスの群から選択されうる。
本発明の補体活性化組成物を用いて細菌感染を処置する方法を開示する。細菌感染が、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌ＢＣＧ株、ＢＣＧ亜株、マイコバクテリウム・アビウム（鳥型結核菌）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・アフリカヌム、カンサス・マイコバクテリウム、マイコバクテリウム・マリナム、マイコバクテリウム・ウルセランス、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核菌、ノカルジア・アステロイデス、他のノルカジア種、レジュネラ・ニューモフィラ、他のレジオネラ種、チフス菌、他のサルモネラ種、シゲラ種、ペスト菌、パスツレラ・ヘモリチ、動物パスツレラ症病原菌（パスツレラ・ムルトシダ）、他のパスツレラ種、アクチノバシラス・プレロニューモニアエ、リステリア・モノサイトゲネ、リステリア・イバノビイ、ブルセラアボルツス、他のブルセラ種、コードリア・ルミナンチウム、クラミジア・ニューモニアエ、トラコーマクラミジア、オウム病クラミジア、コキシエラ・バーネッティ、他のリケチア種、エーリキア種、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、バシラス・アンスラシス、大腸菌、コレラ菌、カンピロバクター種、髄膜炎菌、ナイセリア淋菌、緑膿菌、他のシュードモナス種、インフルエンザ菌、軟性下疳菌、他のヘモフィルス種、破傷風菌、他のクロストリジウム種、エルシニア・エンテロリチカ、および他のエルシニア種からなる細菌の群から選択されうる、本発明の方法も開示する。
本発明の補体活性化組成物を用いて寄生虫感染を処置する方法を開示する。寄生虫感染が、トキソプラズマ、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア、四日熱マラリア原虫、他のプラスモディウム種、トリパノソーマ・ブルーセイ、クルーズトリパノソーマ、森林型熱帯リーシュマニア、他のリーシュマニア種、マンソン住血吸虫、他の住血吸虫種、および赤痢アメーバからなる群から選択されうる本発明の方法も開示する。
本発明の補体活性化組成物を用いて真菌性感染症を処置する方法を開示する。真菌性感染症が、鵞口瘡カンジダ、クリプトコックス‐ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラタム、アスペルギルス・フミガーツス、コクシジオイデス・イミティス、ブラジルパラコクシジオイデス、ブラストミセス・デルマチチジス、ニューモシスティス・カリニ、アオカビ、およびアルテルナリア・アルテルナータからなる群から選択されうる、本発明の方法も開示する。本発明の方法では、被験体は哺乳動物でありうる。例えば、哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類動物、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、またはウマでありうる。
３．研究ツールとして組成物を用いる方法
開示する組成物を研究ツールとして種々の方法で用いることができる。例えば、開示する組成物を用いて、補体活性化のインヒビターを研究することができる。
開示する組成物を、癌、ウイルス感染症、細菌感染、寄生虫感染、および真菌性感染症等の補体活性化に関連する疾患に対する診断ツールとして用いることができる。ＣＲ２融合タンパク質は、補体活性化部位を標的とし、標識したＣＲ２融合タンパク質は、補体活性化に関連する状態を診断することができる。例えば、腫瘍反応性抗体は、腫瘍細胞上の補体を活性化し、その後、ＣＲ２が該補体を標的とする。標識したＣＲ２−Ｆｃは、その後、抗体ターゲティングに続くシグナルを増幅することが可能である。
Ｄ．組成物
開示する組成物を調製するために用いられる構成要素と、本明細書に開示する方法に用いられる組成物自体とを開示する。これらの物質および他の物質を本明細書に開示する。これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等を開示する際、これらの化合物の様々な個々の、かつ集合的な組み合わせおよび入れ替えの各々に対して明確に言及してはいないが、各々が本明細書において明確に考慮および説明されることが理解される。例えば、特定のＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦについて説明する場合、ならびに／あるいはそれらの特定の組み合わせについて説明および議論される場合、ならびに／あるいはＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、および／またはそれらの組み合わせを含む多数の分子になされうる多数の修飾について議論される場合、そうでない場合が明確に示されていない限りＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、またはそれらの組み合わせおよび可能な修飾のあらゆる組み合わせおよび入れ替えが明確に考慮される。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスと、分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスと、組み合わせ分子Ａ−Ｄの例とが開示される場合、各々が個々に、かつ集合的に組み合わせを意味すると各々に対して個々に詳述されていないとしても、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ，Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆが開示されていると考えられる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示する。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループが開示されていると考えられる。この概念を、限定はされないが、開示する組成物を作製および使用する方法でのステップを含むこの出願の全ての態様に適用する。したがって、実行することができる種々の付加的なステップがある場合、これらの付加的なステップの各々を、開示する方法の任意の特定の実施形態および実施形態の組み合わせで実行することができることが理解される。
１．配列類似性
本明細書で論じられるように、用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」および「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」の使用は、類似性と同じものを意味することが理解される。したがって、例えば、用語「相同性」が２つの非天然の配列間で用いられる場合、これは、必ずしも、これらの２つの配列間に進化上の関連があることを示しているわけではなく、むしろ、それらの核酸配列間の類似性または関連性を見ている。２つの進化上で関連する分子間の相同性を決定する方法の多くは、日常的に、それらが進化上で関連しているか否かに関係なく配列類似性を測定する目的で任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に適用される。
一般に、本明細書に開示する遺伝子およびタンパク質の任意の既知の変異体および誘導体または生じる可能性があるものを定義する一方法は、特定の既知の配列に対する相同性の観点から変異体および誘導体を定義することを介するものであることが理解される。本明細書に開示する特定の配列のこの同一性は、本明細書の他の箇所でも論じられる。例えば、配列番号２５は、ＣＲ２の特定の配列を説明し、配列番号２６は、配列番号２５にコードされるタンパク質、すなわちＣＲ２タンパク質の特定の配列を説明する。これらの遺伝子および他の遺伝子ならびに本明細書に開示するタンパク質の変異体を明確に開示し、それらは、規定の配列に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセント相同性を持つ。当業者は、２つのタンパク質または遺伝子等の核酸の相同性をどうように決定するかを理解する。例えば、２つの配列を、相同性がその最高レベルになるようにアラインした後、相同性を算出することができる。
相同性を算出する別の方法を、公開されるアルゴリズムによって実行することができる。比較に対する配列の最適アラインメントを、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ （１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３ （１９７０）の相同性アラインメント・アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４ （１９８８）の類似性方法のための探索によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化インプリメンテーション（ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検定によっておこなうことができる。
例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（少なくとも核酸アラインメントに関連する物質に対して、本明細書に援用する）に開示されるアルゴリズムによって、同じ種類の相同性を核酸のために得ることができる。通常、上記方法のいずれも用いることができることと、特定の例では、これらの種々の方法の結果は異なりうることとが理解されるが、当業者は、同一性がこれらの方法の少なくとも１つを用いて見出される場合、配列が規定の同一性を持ち、本明細書に開示されることを理解する。
例えば、本明細書で用いるように、別の配列に対して特定のパーセント相同性を持つとして詳述される配列とは、上記の算出方法の任意の１つ以上によって算出されるような詳述した相同性を持つ配列を指す。例えば、第１の配列が、Ｚｕｋｅｒ算出方法を用いて第２の配列に対して８０パーセント相同性を持つと算出される場合、第１の配列が任意の他の算出方法で算出されると第２の方法に対して８０パーセント相同性を持たないとしても、本明細書で定義するように、第１の配列は、第２の配列に対して８０パーセント相同性を持つ。別の例としては、第１の配列が、Ｚｕｋｅｒ算出方法およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ算出方法両方を用いて第２の配列に対して８０パーセント相同性を持つと算出される場合、第１の配列がＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ算出方法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ算出方法、Ｊａｅｇｅｒ算出方法、または任意の他の算出方法で算出されると第２の方法に対して８０パーセント相同性を持たないとしても、本明細書で定義するように、第１の配列は、第２の配列に対して８０パーセント相同性を持つ。さらに別の例としては、第１の方法が、算出方法の各々を用いて第２の配列に対して８０パーセント相同性を持つと算出される（実際には、多くの場合、異なる算出方法で算出される相同性パーセント値は異なる結果になる）場合、本明細書で定義するように、第１の配列は、第２の配列に対して８０パーセント相同性を持つ。
２．核酸
ＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤＳ９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲ１、ＣＲ１−ＣＲ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−抗Ｃ５、ＣＲ２−ＩｇＧ１ Ｆｃ（ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ（マウス）、またはＣＲ２−ＣＶＦをコードする核酸と、種々の機能的核酸とを含む核酸ベースである、本明細書で開示する種々の分子がある。開示する核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換体で構成される。これらの分子および他の分子の非限定的な例を本明細書で論じる。例えば、ベクターが細胞で発現する際、発現したｍＲＮＡは、通常、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵで構成されることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外因性送達によって細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子は、細胞環境中でアンチセンス分子の分解を減少させるヌクレオチドアナログで構成されることが有利であることが理解される。
ａ）ヌクレオチドおよび関連分子
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分およびリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチド同士を、ヌクレオシド間リンケージを作り出すそれらのリン酸部分および糖部分を介して連結することができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、およびチミン−１−イル（Ｔ）でありうる。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、５価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシンモノリン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシンモノリン酸）である。
ヌクレオチドアナログは、塩基、糖、またはリン酸部分のいずれかに対するある種の修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分に対する修飾としては、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕの天然および合成の修飾と、異なるプリンまたはプリミジン塩基（例えば、ウラシル−５−イル（．ｐｓｉ．）、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、および２−アミノアデニン−９−イル）とが挙げられる。修飾された塩基としては、限定はされないが、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。付加的な塩基修飾は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３で見出される。特定のヌクレオチドアナログ、例えば５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む）、５−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を増加することができる。しばしば、塩基修飾は、例えば２’−Ｏ−メトキシエチル等の糖修飾と組み合わせて、増加された二重鎖安定性等の特有の特徴を達成することができる。様々な塩基修飾を詳述および説明する第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、および第５，６８１，９４１号等の多数の米国特許がある。これらの特許を本明細書に援用する。
ヌクレオチドアナログは、糖部分の修飾を含むこともできる。糖部分に対する修飾としては、リボースおよびデオキシリボースの天然の修飾と、合成の修飾とが挙げられる。糖修飾としては、限定はされないが、２’位置での以下の修飾が挙げられる。すなわち、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；あるいはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルであり、この際、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルでありうる。２’糖修飾としては、限定はされないが、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２も挙げられ、この際、ｎおよびｍは１〜１０である。
２’位置での他の修飾としては、限定はされないが、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール、またはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インタカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基および類似の特性を持つ他の置換基が挙げられる。類似の修飾を糖上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置または２’−５’連結オリゴヌクレオチド内、および５’末端ヌクレオチドの５’位置でおこなうことができる。修飾された糖としては、ＣＨ２およびＳ等の架橋環酸素での修飾を含むものも挙げられる。ヌクレオチド糖アナログは、ペントフラノシル糖の代わりのシクロブチル部分等の糖模倣体を持つことができる。第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号（これら特許の各々の全体を本明細書に援用する）等の、そのような修飾された糖構造の調製を教示する多数の米国特許がある。
ヌクレオチドアナログは、リン酸部分で修飾することもできる。修飾されたリン酸部分としては、限定はされないが、２つのヌクレオチド間のリンケージがホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデ−トおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデ−ト、チオホスホルアミデ−ト、チオアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェートを含有するように修飾されうるものが挙げられる。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸または修飾されたリン酸リンケージは、３’−５’リンケージまたは２’−５’リンケージを介するものでありえ、該リンケージは、３’−５’〜５’−３’または２’−５’〜５’−２’等の反転極性を含有することができることが理解される。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も包括される。修飾されたリン酸を含有するヌクレオチドの作製および使用方法を教示する多数の米国特許としては、限定はされないが、第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、および第５，６２５，０５０号（これらの特許の各々を本明細書に援用する）が挙げられる。
ヌクレオチドアナログは、単一の修飾を含むことのみを必要とするが、１つの部分内または異なる部分の間に複数の修飾を含むこともできることが理解される。
ヌクレオチド置換体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等の、ヌクレオチドと類似の機能特性を持つがリン酸部分を含有しない分子である。ヌクレオチド置換体は、ワトソン−クリックまたはフーグステン様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して互いに連結する分子である。ヌクレオチド置換体は、適当な標的核酸と相互作用する際、二重らせん型構造に同調することができる。
ヌクレオチド置換体は、リン酸部分および／または糖部分が置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド置換体は、標準的なリン原子を含有しない。リン酸に対する置換体は、例えば、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間リンケージ、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオオシド間リンケージ、あるいは１つ以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環ヌクレオシド間リンケージでありうる。これらは、モルホリノ・リンケージ（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン主鎖；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）およびチオホルムアセチル（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルカン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２成分部分を持つ他のものを持つものを含む。多数の米国特許は、これらの種類のリン酸置換の作製および使用方法を開示しており、限定はされないが、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第および５，６７７，４３９号（これらの特許の各々を本明細書に援用する）が挙げられる。
ヌクレオチド置換体中では、ヌクレオチドの糖およびリン酸部分両方が、例えば、アミド型リンケージ（アミノエチルグリシン）に置換されうる（ＰＮＡ）ことも理解される。米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号（これら特許の各々を本明細書に援用する）は、ＰＮＡ分子の作製および使用方法について教示する（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００も参照せよ）。
他の種類の分子（複合体）をヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結して、例えば、細胞内取り込みを増強することも可能である。複合体を、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に連結することができる。そのような複合体としては、限定はされないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．；ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、あるいはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、あるいはオクダデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７等の脂質分が挙げられる。多数の米国特許は、そのような複合体の調製について教示しており、限定はされないが米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１，号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号（これら特許の各々を本明細書に援用する）が挙げられる。
ワトソン−クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換体のワトソン−クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換体のワトソン−クリック面としては、プリン・ベースのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド置換体のＣ２、Ｎ１、およびＣ６位置と、ピリミジン・ベースのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド置換体のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位置が挙げられる。
フーグステン相互作用は、二重鎖ＤＮＡの主溝中にさらされるヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのフーグステン面で起こる相互作用である。フーグステン面としては、プリンヌクレオチドのＮ７位置とＣ６位置の反応基（ＮＨ２またはＯ）とが挙げられる。
ｂ）配列
例えば、本明細書に開示されるような配列または文献で入手できる配列を持つＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲ１、ＣＲ１−Ｒ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＩｇＧ１ Ｆｃ（ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ（マウス）、またはＣＲ２−ＣＶＦ遺伝子に関連する種々の配列がある。これらの配列および他の配列全体と、そこに含まれる個々の部分列とを本明細書に援用する。
１つの特定の配列は、開示する組成物および方法を例示する例として、本明細書で用いられる配列番号２５で詳述される。この配列に関連する記載は、特に明記されない限り、ＣＲ２、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲ１、ＣＲ１−ＣＲ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＩｇＧ１ Ｆｃ（ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ（マウス）、またはＣＲ２−ＣＶＦに関連する任意の配列に適用可能であることが理解される。当業者は、配列不一致よび差異を解消する方法と、他の関連配列（ＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲ１、ＣＲ１−ＣＲ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＩｇＧ１ Ｆｃ（ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ（マウス）、またはＣＲ２−ＣＶＦの配列）に、特定の配列に関連する組成物および方法を調整する方法とを理解する。プライマーおよび／またはプローブを、本明細書に開示される情報および当該技術分野で公知の情報を与えられている任意のＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲ１、ＣＲ１−ＣＲ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＩｇＧ１ Ｆｃ（ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ（マウス）、またはＣＲ２−ＣＶＦ配列に対して設計することができる。
３．細胞への組成物の送達
本融合タンパク質組成物、免疫結合体組成物、および核酸組成物を細胞にインビトロまたはインビボで送達するために用いることができる多数の組成物および方法がある。本発明の組成物を、薬学的に許容される担体中で被験体に好適に投与する。適当な担体およびそれらの配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆＰｈａｒｍａｃｙ （１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載される。通常、適当な量の薬学的に許容される塩を配合物中で用いて、配合物を等張にする。薬学的に許容される担体の例としては、限定はされないが、生理食塩水、水：油エマルジョン、油：水エマルジョン、水：油：水エマルジョン、ならびにリンガー溶液およびブドウ糖溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８であり、より好ましくは、約７〜約７．５である。さらに、担体は、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリクッス等の徐放性配合物を含み、このマトリックスは、成型物の形態、例えば、膜、リポソーム、または微小粒子である。特定の担体が、例えば、投与経路および投与される抗体の濃度に応じてより好ましいことが当業者には自明である。
本発明の組成物を、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によって、あるいは効果的な形態で血流に組成物の送達を確実にする注入等の他の方法によって被験体、患者、または細胞に投与することができる。局所的または静脈内注射が好ましい。
本発明の組成物を投与するための効果的な投与量およびスケジュールを経験的に決定することができ、そのような決定をなすことは当該技術分野の技術内である。当業者は、投与しなければならない本発明の組成物の投与量が、例えば、該組成物を受ける被験体、投与経路、用いられる特定の種類の組成物、および投与される他の薬物に応じて変わることを理解する。単独で用いられる本発明の組成物の通常の１日投与量は、上記の要因に応じて、１日に体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。
ａ）核酸にもとづく送達系
インビトロまたはインビボのどちらかで、核酸を細胞に送達するために用いることができる多数の組成物および方法がある。これらの方法および組成物は、おおまかに２つのクラスに分けることができる。すなわち、ウイルスにもとづく送達系および非ウイルスにもとづく送達系である。例えば、核酸を、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈降、プラスミド、ウイルス・ベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド等の多数の直接送達系を介して、あるいはカチオン・リポソーム等の細胞または担体中の遺伝物質の輸送を介して送達することができる。ウイルス・ベクター、化学的トランスフェクタントを含むトランスフェクションのための適当な手段またはＤＮＡの電気穿孔および直接拡散等の物理力学的方法については、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）に記載される。そのような方法は、当該技術分野で公知であり、本明細書に開示する組成物および方法とともに用いるために容易に適応できる。特定の場合では、該方法を改変して、巨大ＤＮＡ分子とともに特異的に機能する。さらに、これらの方法を用いて、担体のターゲティング特性を用いることによって特定の疾患および細胞集団を標的とすることができる。
輸送ベクターは、細胞中に遺伝子を送達するために用いられる任意のヌクレオチド構造物（例えば、プラスミド）、あるいは遺伝子を送達するための一般的戦略の部分、例えば、組換え型レトロウイルスまたはアデノウイルスの部分でありうる（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））
本明細書で用いられるように、プラスミドまたはウイルス・ベクターは、配列番号２５等の開示する核酸を分解せずに細胞中に輸送し、かつ該核酸が送達される細胞中で遺伝子の発現を生成するプロモーターを含む因子である。いくつかの実施形態では、ＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲ１、ＣＲ１−ＣＲ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＩｇＧ１ Ｆｃ（ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ（マウス）、またはＣＲ２−ＣＶＦは、ウイルスまたはレトロウイルスのどちらかに由来する。ウイルス・ベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、エイズウイルス、神経栄養性ウイルス、シンドビス、およびＨＩＶ主鎖を有する、これらのウイルスを含む他のＲＮＡウイルスである。ベクターとして適当に用いられるようにするこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルス・ファミリーも好ましい。レトロウイルスとしては、マウス・モロニ―白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）と、ベクターとしてＭＭＬＶの望ましい特性を発現するレトロウイルスとが挙げられる。レトロウイルス・ベクターは、他のウイルス・ベクターより大きな遺伝的ペイロード、すなわちトランスジーンまたはマーカー遺伝子を運搬することができ、この理由のために一般的に用いられる。しかし、レトロウイルスは、非増殖細胞中では有用ではない。アデノウイルス・ベクターは、比較的安定であり、扱いが容易であり、高力価を持ち、エアロゾル配合物中で送達することができ、さらに非増殖細胞をトランスフェクトすることができる。ポックスウイルス・ベクターは、大きく、遺伝子を導入するための複数の部位を持つ。ポックスウイルス・ベクターは、熱安定性であり、室温で保存できる。ウイルス抗原によって誘出される宿主生物の免疫応答を阻害するように操作されたウイルス・ベクターが好ましい実施形態である。この種類の好ましいベクターは、インターロイキン８または１０に対するコーディング領域を保持する。
ウイルス・ベクターは、細胞に遺伝子を導入する化学的または物理的方法より高い処理能力（遺伝子を導入する能力）を持つことができる。通常、ウイルス・ベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆方向末端リピート、ならびにウイルス・ゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含有する。ベクターとして操作される際、ウイルスは、通常、１つ以上の早期遺伝子が除去され、遺伝子または遺伝子／プロモーター・カセットが、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルス・ベクターに挿入される。この種類の構築物は、約８ｋｂまでの外来遺伝物質を輸送することができる。除去された早期遺伝子の必要な機能は、通常、輸送中に早期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作された細胞系によって供給される。
（１）レトロウイルス・ベクター
レトロウイルスは、任意の種類、サブファミリー、属、または親和性を含むレトロウイルス科のウイルス・ファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルス・ベクターは、概ね、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）（本明細書に援用する）に記載される。遺伝子療法のためにレトロウイルス・ベクターを用いる方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ出願ＷＯ ９０／０２８０６およびＷＯ ８９／０７１３６、ならびにＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２ （１９９３））（これらの教示を本明細書に援用する）に記載される。
レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴに詰め込まれたパッケージである。核酸カーゴは、それとともに、複製された娘分子がパッケージ外被内に効率的にパッケージングされることを確実にするパッケージング・シグナルを輸送する。パッケージ・シグナルに加えて、複製と複製されたウイルスのパッケージングとのためにシス中に必要とされる多くの分子がある。通常、レトロウイルス・ゲノムは、タンパク質外被の作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有する。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子は、外来遺伝子が標的細胞に輸送されると外来ＤＮＡによって通常置換される。レトロウイルス・ベクターは、通常、パッケージ外被への組み込みのためのパッケージング・シグナルと、ｇａｇ転写単位の開始を合図する配列と、逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するプライマー結合部位を含む逆転写に必要なエレメントと、ＤＮＡ合成中にＲＮＡ鎖の転換を導く末端リピート配列と、ＤＮＡ合成の第２の鎖の合成のためのプライミング部位として働くプリン・リッチ配列５’から３’方向ＬＴＲと、レトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入物が宿主ゲノムに挿入することを可能にするＬＴＲ末端近くの特異的配列とを含有する。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの外来配列がウイルス・ゲノムに挿入され、逆転写され、複製された上で新しいレトロウイルス粒子中にパッケージングされることを可能にする。この量の核酸は、各転写物の大きさに応じて１つ〜多数の遺伝子の送達に十分である。挿入配列中に他の遺伝子とともに陽性または陰性どちらかの選択可能なマーカーを含むことが好ましい。
大部分のレトロウイルス・ベクター中の複製機構およびパッケージング・タンパク質が除去されている（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）ので、ベクターは、通常、該ベクターをパッケージング細胞系に置くことによって生成される。パッケージング細胞系は、複製およびパッケージング可動部は含むが任意のパッケージング・シグナルを持たないレトロウイルスでトランスフェクトまたは形質転換された細胞系である。選択されたＤＮＡを輸送するベクターをこれらの細胞系にトランスフェクトすると、対象遺伝子を含有するベクターは、複製され、ヘルパー細胞によってシス性に（ｉｎ ｃｉｓ）に与えられる機構によって新しいレトロウイルス粒子中にパッケージングされる。この機構のためのゲノムはパッケージングされない。この理由は、該ゲノムは、必要なシグナルを持たないためである。
（２）アデノウイルス・ベクター
複製欠損アデノウイルスの構築について記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２１３−１２２０ （１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３ （１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２６７−２７４ （１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２２６−１２３９ （１９８７）；Ｚｈａｎｇ ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ” ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８−８７２ （１９９３））。これらのウイルスをベクターとして用いる利点は、該ウイルスは初期の感染細胞内で複製することができるが、新たな感染性ウイルス粒子を形成することができないので、他の細胞型に拡散することができる程度に制限されていることにある。組換え型アデノウイルスを用いると、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、および多数の他の組織部位への直接のインビボ送達後に高効率の遺伝子輸送を達成することが示されている（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６ （１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７ （１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２ （１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１５４−１５９ （１９９３）；Ｌａ Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０ （１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４ （１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６ （１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３ （１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３：１２０１−１２０７ （１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０ （１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６ （１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｂｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ５：１２８７−１２９１ （１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：５０１−５０７ （１９９３））。組換え型アデノウイルスは、特異的な細胞表面レセプターに結合し、その後に該ウイルスがレセプター媒介エンドサイトーシスによって野生型または複製欠損ウイルスと同様に内部移行することによって遺伝子形質導入を達成する（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ ａｎｄ Ｄａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０：４６２−４７７ （１９７０）；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２：３８６−３９６ （１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５５：４４２−４４９ （１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５ （１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３ （１９８４）；Ｖａｒｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：６０６１−６０７０ （１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７３：３０９−３１９ （１９９３））。
ウイルス・ベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスにもとづくものでありえ、これらのウイルス粒子は、ヒト２９３細胞系等の細胞系で生成される。別の好ましい実施形態では、Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子両方をアデノウイルス・ゲノムから除去する。
（３）アデノ随伴ウイルス・ベクター
ウイルス・ベクターの別の種類は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）にもとづく。この欠損パルボウイルスは、多くの細胞型に感染することができヒトに対して非病原性であることから好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは、染色体１９に安定に挿入されることが知られている。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。この種類のベクターの特に好ましい実施形態では、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡによって生産されているｐ４．１Ｃベクターであり、このベクターは、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子等のマーカー遺伝子を含有することができる。
別の種類のＡＡＶウイルスでは、該ＡＡＶは、異種遺伝子に作用自在に連結する細胞特異的発現を導くプロモーターを含有する少なくとも１つのカセットにフランキングする逆方向末端リピート（ＩＴＲ）の対を含有する。この文脈において、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスに対してネイティブではない任意のヌクレオチド配列または遺伝子を指す。
通常、ＡＡＶおよびＢ１９コーティング領域は、欠失されており、その結果安全な非細胞傷害性ベクターとなる。ＡＡＶ ＩＴＲまたはその改変物は、感染力および部位特異的組み込みを付与するが、細胞傷害性は付与せず、そのプロモーターは、細胞特異的発現を導く。ＡＡＶベクターに関連する物質に対して、米国特許第６，２６１，８３４号を本明細書に援用する。
したがって、本発明のベクターは、実質的に毒性なしで哺乳類染色体に組み込まれることができるＤＮＡ分子を与える。
ウイルスおよびレトロウイルス中に挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つプロモーターおよび／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは、概ね、転写開始部位に対して比較的固定された位置にある際に機能するＤＮＡの配列または配列群である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要となるコア・エレメントを含有し、上流エレメントと応答エレメントを含有することができる。
（４）大ペイロード・ウイルス・ベクター
大きなヒト・ヘルペスウイルスを用いる分子遺伝実験によって、大きな異種ＤＮＡフラグメントを、ヘルペスウイルスによる感染を許容する細胞中でクローニング、増殖、および樹立することができる手段が与えられた（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：３３−４１，１９９４；Ｃｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ５：６３３−６４４，１９９９）。これらの大きなＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびＥＶウイルス（ＥＢＶ））は、１５０ｋｂより大きいヒト異種ＤＮＡフラグメントを特異的な細胞に送達する潜在能力を持つ。ＥＢＶ組換え体は、感染Ｂ細胞中で、エピソームＤＮＡとしてＤＮＡの大きな断片を維持することができる。個々のクローンは、ゲノム挿入配列を３３０ｋｂまでは保持し、遺伝学的に安定であると思われる。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶによる感染中に構成性に発現する特異的なＥＢＶ核タンパク質ＥＢＮＡ１を必要とする。さらに、これらのベクターをトランスフェクションのために用いることができ、ここで、多量のタンパク質をインビトロで一時的に生成することができる。ヘルペスウイルス・アンプリコン系も、２２０ｋｂより大きいＤＮＡの断片をパッケージングするため、かつ細胞を感染させるために用いられており、エピソームとしてＤＮＡを安定に維持することができる。
他の有用な系としては、例えば、複製および宿主制限非複製ワクシニアウイルス・ベクターが挙げられる。
ｂ）非核酸にもとづく系
開示する組成物を、種々の方法で標的細胞に送達することができる。例えば、組成物を、電気穿孔、リポフェクション、またはリン酸カルシウム沈降を介して送達することができる。選択される送達機構は、部分的に、標的される細胞型と、送達が、例えば、インビボまたはインビトロで起こっているかとに依存する。
したがって、組成物は、開示するＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲ１、ＣＲ１−ＣＲ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＩｇＧ１ Ｆｃ（ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ（マウス）、またはＣＲ２−ＣＶＦ、あるいはベクターに加えて、例えば、リポソーム、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）、またはアニオン性リポソーム等の脂質を含むことができる。リポソームは、所望であれば、さらにタンパク質を含んで、特定の細胞を標的とすることを容易にすることができる。化合物およびカチオン性リポソームを含む組成物を、標的器官対して求心性の血液に投与することができ、あるいは気道に吸入して気道の細胞を標的とすることができる。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００ （１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７ （１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照せよ。さらに、化合物を、マクロファージ等の特定の細胞型を標的とすることができるマイクロカプセルの構成要素として投与することができる。あるいは、マイクロカプセルからの化合物の拡散または化合物の送達を特定の割合または投与量に対して設計する場合に、化合物をマイクロカプセルの構成要素として投与することができる。
被験体の細胞への外因性ＤＮＡの投与および取り込み（すなわち、遺伝子形質導入またはトランスフェクション）を含む上記の方法では、細胞への組成物の送達は、種々の機構を介するものでありうる。一例としては、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）等の市販のリポソーム製剤と、当該技術分野で標準的な手順に従って開発された他のリポソームとを用いてリポソームを介するものでありうる。さらに、この発明の核酸またはベクターを、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能な技術である電気穿孔と、ＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）とによってインビボで送達することができる。
物質は、溶液、懸濁液（例えば、微小粒子、リポソーム、または細胞中に組み込まれる）中に存在することができる。これらは、抗体、レセプター、またはレセプター・リガンドを介して、特定の細胞型を標的とすることができる。以下の参考文献は、この技術を用いて、腫瘍組織に特異的なタンパク質を標的とする例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。これらの技術を、他の特定の細胞型に用いることができる。「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」等の媒体および他の抗体複合リポソーム（大腸癌を標的とする脂質媒介薬剤を含む）、細胞特異的リガンドを介したＤＮＡのレセプター媒介ターゲティング、リンパ球指向性腫瘍ターゲティング、ならびにインビボでのマウス神経膠腫の高特異性治療的レトロウイルス・ターゲティングがある。以下の参考文献は、腫瘍組織に特異的なタンパク質を標的とするこの技術を用いる例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，）。一般に、レセプターは、構成性またはリガンド誘導性エンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン被覆ピット中のこれらのレセプター・クラスタは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に進入し、レセプターが分類される酸性化エンドソームを通過し、その後、細胞表面へ再循環されるか、細胞内に保存されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。内部移行経路は、栄養素取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子の除去、ウイルスおよび毒素の日和見性進入、リガンドの解離および分解、ならびにレセプター・レベルの調節等の種々の機能を果たす。多くのレセプターは、細胞型、レセプター濃度、リガンドの種類、リガンド結合価、およびリガンド濃度に応じて１つより多い細胞内経路に従う。レセプター媒介エンドサイトーシスの分子機構および細胞機構については概説されている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９−４０９ （１９９１））。
宿主ゲノムに組み込まれるべき細胞に送達される核酸は、通常、組み込み配列を含有する。これらの配列は、しばしば、特にウイルスにもとづく系が用いられる場合ウイルス関連配列である。これらのウイルス組み込み配列を、核酸に組み込むこともでき、該核酸を、リポソーム等の非核酸にもとづく送達系を用いて、該送達系に含まれる核酸が宿主ゲノムに組み込まれることができるように送達する。
宿主ゲノムへの組み込みのための他の一般的技術としては、例えば、宿主ゲノムを用いて相同組換えを促進するように設計された系が挙げられる。これらの系は、通常、宿主ゲノム内の標的配列に対して十分な相同性を持つ発現すべき核酸にフランキングする配列に依存し、ベクター核酸と標的核酸との組換えが起こり、送達された核酸が宿主ゲノムに組み込まれる。これらの系および相同組換えを促進するために必要な方法は当業者に既知である。
ｃ）インビボ／エキソビボ
上述のように、組成物を、医薬的許容される担体中で投与することができ、当該技術分野で公知の種々の機構（例えば、裸ＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介したＤＮＡの筋肉内注射、エンドサイトーシス等）によって被験体の細胞にインビボおよび／またはエキソビボで送達することができる。
細胞外（ｅｘ ｖｉｖｏ）方法を用いる場合、当該技術分野で公知の標準的プロトコールにしたがって、細胞または組織を除去して、体外で維持する。組成物を、例えば、リン酸カルシウム媒介遺伝子送達、電気穿孔、マイクロインジェクション、または蛋白リポソーム等の任意の遺伝子輸送機構を介して細胞中に導入することができる。形質移入された細胞を、その後、細胞または組織型に標準的な方法を介して、被験体中に注入（例えば、医薬的に許容される担体中で）またはホモトピカルに移植して戻す。被験体への種々の細胞の移植または注入に対する標準的な方法は既知である。
４．発現系
細胞に送達される核酸は、通常、発現制御系を含有する。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス中に挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つプロモーターおよび／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは、概ね、転写開始部位に対して比較的固定された位置にある際に機能するＤＮＡの配列または配列群である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要となるコア・エレメントを含有し、上流エレメントと応答エレメントを含有することができる。
ａ）ウイルス・プロモーターおよびエンハンサー
哺乳類宿主細胞中でベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターを、種々のソース、例えば、ポリオーマ、サル・ウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルス等のウイルスのゲノムから、あるいは異種哺乳類プロモーター、例えば、ベータ・アクチン・プロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３ （１９７８））。ヒト・サイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして簡便に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５−３６０ （１９８２））。当然、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書で有用である。
エンハンサーは、概ね、転写開始部位から一定でない距離だけ離れて機能するＤＮＡの配列を指し、転写部位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３ （１９８１））または３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８ （１９８３））でありうる。さらに、エンハンサーは、イントロン内にある（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：７２９ （１９８３））とともに、コーディング配列自体内にある（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３ （１９８４））。エンハンサーは、通常１０〜３００ｂｐ長であり、シス性で機能する。エンハンサーが機能して、すぐ近くのプロモーターから転写を増加させる。エンハンサーは、しばしば、転写の調節を媒介する応答エレメントも含有する。プロモーターも、転写の調節を媒介する応答エレメントを含有する。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳類遺伝子から既知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、−フェトプロテイン、およびインシュリン）一方で、通常、一般的な発現のために真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。好ましい例には、複製起点の後期側上のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス早期プロモーター・エンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマ・エンハンサー、およびアデノウイルス・エンハンサーがある。
プロモーターおよび／またはエンハンサーを、光か、それらの機能を誘発する特異的な化学的事象かによって特異的に活性化することができる。系を、テトラサイクリンおよびデキサメタゾン等の試薬によって調節することができる。これらは、ガンマ照射等の照射にさらすことによって、またはアルキル化化学療法薬剤によってウイルス・ベクター遺伝子発現を増強する方法でもある。
特定の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、構成性プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用して、転写すべき転写単位の領域の発現を最大にすることができる。特定の構築物では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、特定の時間に特定の細胞型で発現するのみであったとしても、全ての真核細胞型で活性である。この種類の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモータ（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（完全長プロモーター）、およびレトロウイルス・ベクターＬＴＦである。
全ての特異的な調節エレメントをクローニングして、メラノーマ細胞等の特定の細胞型中で選択的に発現する発現ベクターを構築することができることが示されている。グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞中で遺伝子を選択的に発現させるために用いられている。
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）中で用いられる発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を与えうる転写の終止に必要な配列を含有することができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域もまた転写終結部位を含み得る。転写単位は、ポリアデニル化領域も含有することが好ましい。この領域の１つの利点は、該領域が、転写された単位がプロセッシングされｍＲＮＡのように輸送される可能性を増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同なポリアデニル化シグナルをトランスジーン・構築物中で用いることが好ましい。特定の転写単位では、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０早期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００の塩基からなる。転写された単位は、他の標準的な配列を、単独で、または上記の配列と組み合わせて含有し、構築物由来の発現または構築物の安定性を向上することが好ましい。
ｂ）マーカー
ウイルス・ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物を用いて、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、さらに送達されたとしたら発現されたかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、１３−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質である。
いくつかの実施形態では、マーカーは、選択可能なマーカーでありうる。哺乳類細胞に適した選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸換言酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイドロマイシン、およびピューロマイシンである。そのような選択可能なマーカーの哺乳類細胞中への輸送が成功した際は、形質転換された哺乳類宿主細胞は、選択圧下に置かれる場合生存することができる。選択制度の広く用いられている異なるカテゴリーは２つある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝と、添加培地から独立して増殖する能力を持たない突然変異細胞系の使用とにもとづく。２つの例がある。すなわち、ＣＨＯ ＤＨＦＲ − 細胞およびマウスＬＴＫ − 細胞である。これらの細胞は、チミジンおよびヘポキサンチン等の栄養素の添加がないと増殖する能力を持たない。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を持たないので、該細胞は、欠けているヌクレオチドが添加培地中で与えられなければ生存することができない。培地に添加することの代替は、インタクトなＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を持たない細胞に導入し、その結果それらの増殖要件を変更することである。ＤＨＦＲまたはＴｋ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非添加培地中で生存することができない。
第２のカテゴリーは、任意の細胞型で用いられる選択スキームであり、突然変異細胞系の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、通常、薬剤を使用して、宿主細胞の増殖を阻止する。新規の遺伝子を持つそれらの細胞は、薬剤耐性を伝えるタンパク質を発現し、選択を乗り切る。そのような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７ （１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２ （１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を用いる。この３つの例は、真核細胞制御下で細菌遺伝子を用いて、適当な薬剤Ｇ４１８、あるいはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに耐性をそれぞれ伝える。他のものとしては、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューロマイシンが挙げられる。
５．ペプチド
（ａ）タンパク質変異体
本明細書に記載したように、既知および本発明で検討されるＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲｌ、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧｌ、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲ１、ＣＲ１−ＣＲ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＩｇＧ１ Ｆｃ （ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ （マウス）、およびＣＲ２−ＣＶＦタンパク質の変異体が数多く存在する。また、既知の機能的ＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲ１、ＣＲｌ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＩｇＧｌ Ｆｃ （ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ （マウス）、およびＣＲ２−ＣＶＦ 株変異体に対して、ＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧｌ、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲ１、ＣＲ１−ＣＲ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＩｇＧ１ Ｆｃ （ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ
（マウス）、およびＣＲ２−ＣＶＦタンパク質（これらは開示された方法および組成物でも機能的である）の変異体が存在する。タンパク質変異体および誘導体は、当業者に十分理解されており、アミノ酸配列順序の修飾を含むことができる。例えば、アミノ酸配列修飾は、概して３つのクラスの一つ以上にあてはまる。すなわち、置換、挿入、または欠失の変異体である。挿入は、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入と同様にアミノおよび／またはカルボキシ末端の融合を含む。挿入は、通常、アミノまたはカルボキシ末端の融合よりも少ない挿入（例えば、約１〜４残基）である。免疫原融合タンパク質誘導体（例えば、実施例に記載のもの）は、インビトロで架橋させることによって標的配列に免疫原性を与えるために十分に大きいポリペプチドを溶解させることによって、または融合をコードしているＤＮＡで形質転換される組換え型の細胞培養によって作られる。欠失は、タンパク質配列から１個以上のアミノ酸残基の除去によって特徴づけられる。概して、２〜６個の残基を超えることなく、タンパク質分子内の任意の部位が欠失される。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードしているＤＮＡで、ヌクレオチドの部位特異的突然変異誘起によって調製され、それによって変異体をコードするＤＮＡが生じ、その後、組換え型細胞の培養液中でＤＮＡが発現される。既知の配列を持つＤＮＡの所定の部位での置換突然変異を作るための技術は、周知であり、例えばＭ１３プライマー突然変異誘起およびＰＣＲ突然変異誘起がある。アミノ酸置換は、典型的に一つの残基であるが、一度に多数の異なる位置で起こることができる。すなわち、挿入は約１〜１０アミノ酸程度であり、欠失は約１〜３０残基の範囲である。欠失および挿入は、好ましくは隣接した対で起こる。すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入である。置換、欠失、挿入、またはそれらのいかなる組合せでも、それについて、最終的な構築物に到達するために組み合わせることができる。突然変異はリーディング・フレームからはずれた配列を配置してはならなくて、望ましくは、メッセンジャーＲＮＡの二次構造を生成することができる相補性領域を作らない。置換の変異体は少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がそのところに挿入される。そのような置換は、一般に以下の表１および２に従ってなされて、保存的置換と呼ばれる。
機能的または免疫学的同一性での実質的な変化は、表２に示すものよりも保守性が低い置換を選択することによって、すなわち、（ａ）置換領域でのポリペプチド主鎖の構造、例えばシートまたはらせん構造、（ｂ）標的部位での分子の疎水性もしくは帯電性、または（ｃ）側鎖の嵩、を保つ上での作用によりいっそう著しく異なる残基を選択することで、なされる。タンパク質の特性に最も大きい変化を与えることは、（ａ）親水性残基（例えばセリルまたはトレオニル）が疎水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニン）に対して、またはそれによって、置換されること、（ｂ）システインまたはプロリンが他の残基に対して（またはそれによって）置換されること、（ｃ）陽電気を帯びた側鎖（例えばリジル、アルギニルまたはヒスチジル）を持つ残基が、電気陰性の残基に対して（またはそれによって）（例えばグルタミルまたはアスパルチル）と置換されること、（ｄ）または、大きな側鎖（例えばフェニルアラニン）を持つ残基は、側鎖（例えばグリシン）を持っていないものに対して（またはによって）置換されることであり、この場合、（ｅ）硫酸化および／または糖鎖形成に対する部位数の増加による。
例えば、１つのアミノ酸残基が、生物学的におよび／または化学的に類似している別のアミノ酸残基によって置換されることは、保存的置換として当業者に知られている。例えば、保存的置換とは一方の疎水性残基が別のものと置換されること、あるいは一方の極性残基が別のものと置き換えられることである。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ等の組み合わせを含むことが可能である。各々明確に開示された配列のそのような保守的に置換される変異体は、本明細書中に提供されるモザイク・ポリペプチドに含まれる。
置換または欠失突然変異誘起は、Ｎ−糖鎖形成（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−糖鎖形成（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入するために用いることができる。システインまたは他の不安定な残基の欠失も、望ましい。潜在的なタンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換は、例えば、塩基性残基の１つを欠失することで、またはグルタミン残基またはヒスチジン残基で置換することで達成される。
特定の翻訳後の誘導体化は、発現されたポリペプチドの組換え型の宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、対応するグルタミル残基およびアスパリル残基の翻訳後、脱アミドされる。あるいは、これらの残基は弱酸性の状況の下で脱アミドされる。他の翻訳後修飾として、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化を含む、セリルまたはトレオニン残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のｏ− アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ７９−８６ ［１９８３］））、Ｎ末端アミンのアセチル化、場合によっては、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
本明細書中に開示されたタンパク質の変異体と誘導体とを定義する一つの方法が、特異的な既知の配列に対する相同／同一性に関して、変異体と誘導体を定義することを通してあると理解される。例えば、配列番号２６はＣＲ２の特定の配列を記述し、配列番号２はＤＡＦタンパク質の特定の配列を記述する。これらの変異体と本明細書中に開示される他のタンパク質とは、述べた配列に対して、少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％相同性を有する。当業者は、容易に、２つのタンパク質の相同を決定する方法を理解する。例えば、相同性がその最高のレベルにあるように、相同性は２つの配列を整列配置した後に算出すことができる。
相同を算出するもう一つの方法は、発表されたアルゴリズムによって実行されることができる。比較のための配列の最適配列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ （１９８１）による局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３ （１９７０）による相同性アライメント・アルゴリズムによって、、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４ （１９８８）による類似性探索方法によって、それらのアルゴリズムのコンピュータ化インプリメンテーション（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、あるいは目視検査によって、おこなうことができる。
同一タイプの相同性が、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されたアルゴリズムによって、核酸に関して得ることができる。これらの文献は、核酸アラインメントに関連した少なくとも１種類の材料に関して本明細書中で援用する。
保存的突然変異の説明と相同性の説明とを任意の組合せ（例えば変異体が保存的突然変異である特定の配列に少なくとも７０％の相同を持つ実施形態）で一緒に組み合わせることができると理解される。
この明細書が種々のタンパク質およびタンパク質配列を開示することから、これらのタンパク質配列をコードすることができる核酸もまた開示されると理解される。これは、特異的なタンパク質配列に関連した全ての縮退配列を含むもので、すなわち、全ての核酸と同様に１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を持っている全ての核酸、タンパク質配列の開示された誘導体または変異体をコードする縮退核酸を含む。このように、各々の特定の核酸配列が本明細書中に書かれる可能性はないが、開示されたタンパク質配列を通して、どの配列も実際に開示されて本明細書中に記載されると理解される。例えば、配列番号２６に記されたタンパク質配列をコードすることができる多くの核酸配列のうちの１つは、配列番号２５で述べられる。加えて、例えば、配列番号２６の開示された保守的誘導体は配列番号２９で示される。ここで、位置９のイソロイシン（Ｉ）はバリン（Ｖ）に変えられる。この突然変異に関しては、開示された配列のいずれかの特定の誘導体をコードする核酸配列の全ても開示されていると理解される。また、生物体内で、どの特定のＤＮＡ配列がタンパク質（開示されたタンパク質の特定の変異体が本明細書で開示される）をコードするかということをアミノ酸配列は示さないが、上記タンパク質が生ずるタンパク質をコードする既知の核酸配列もまた知られており、本明細書で開示および記述されていると理解される。
６．抗体
（ａ）抗体一般
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、本明細書では広い意味で使われ、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が含まれる。完全な免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語がさらに意味するものは、該免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、および免疫グロブリン分子またはそのフラグメントのヒトまたはヒト化バージョンである。抗体は、本明細書で説明するインビトロアッセイを用いて、または類似の方法によって、該抗体の所望の活性が試験され、その後、インビボで治療および／または予防的な活性が既知の臨床試験方法に基づいて試験される。
本明細書で用いられるように、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、限定されるものではないが、任意のクラスの免疫グロブリン全体（すなわち、完全抗体）を包含する。天然の抗体は、一般にヘテロ四量体のグリコプロテインであり、２つの等しい軽（Ｌ）鎖と２つの等しい重（Ｈ）鎖とから構成される。一般に、各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合されるが、ジスルフィド結合の数は、免疫グロブリン・イソタイプが異なる重鎖間で変わる。各々の重鎖および軽鎖もまた、規則的に離間した鎖間ジスフィルド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変領域（Ｖ（Ｈ））を有し、その後にいくつかの定常領域が続く。各軽鎖は、一端に可変領域（Ｖ（Ｌ））を有し、他端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は、重鎖の第一の定常領域と一列に並べられており、軽鎖可変領域は重鎖の可変領域と一列に並べられている。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変領域と重鎖可変領域とのあいだの接点を形成すると考えられている。脊椎動物のいずれかの種に由来する抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列にもとづいてカッパ（ｋ）およびラムダ（ｌ）と呼ばれる２つの明らかに異なったタイプのうちの１つに当てはまる。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンには５つの主要なクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）があり、さらにそれらのいくつかはサブクラス（イソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２）に分けることができる。相当するクラスがマウスにあることが当業者にも理解されよう。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。
「可変（ｖａｒｉａｂｌｅ）」という用語は、抗体間で配列が異なり、かつ各々の特定の抗体の特定抗原に対する結合および特異性に用いられる可変領域の一定の部分を表現するために、本明細書では用いられる。しかし、可変性は、抗体の可変領域全体にわたって、通常均一に行き渡っているものではない。一般に両領域とも軽鎖および重鎖の可変領域にある相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変領域のより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域の各々は、４つのＦＲ領域を含み、主にｂシート立体配置とり、３つのＣＤＲが接続しており、該配置はループ結合を形成し、また、いくつかの例では一部分、ｂシート構造が形成される。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接した状態に保たれており、他の鎖からＣＤＲによって、抗体の抗原結合部位の形成に関与する（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７））。定常領域は、抗原に対する抗体の結合に直接関与するのではなく、種々のエフェクター機能（例えば抗体依存型細胞毒性への抗体の関与）を示す。
本明細書で用いられるように、「抗体またはそのフラグメント」という用語は、キメラ抗体およびハイブリッド抗体、二重または多重の抗原もしくはエピトープ特異性を持つもの、ハイブリッド・フラグメントを含むフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、およびＦａｂなど）を包含する。したがって、特異的抗原に対する結合能を保持する抗体のフラグメントが提供される。例えば、補体結合活性を保つ抗体のフラグメントは、「抗体またはそのフラグメント」という表現の意味に含まれる。そのような抗体およびフラグメントの作製は、当業者に公知の技術によっておこなうことができ、またそのような抗体およびフラグメントを、抗体の産生と特性および活性についてのスクリーニングとに関する一般的方法（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照せよ）ならびに実施例で述べられる方法にもとづいて、特性および活性についてスクリーニングにすることができる。
「抗体またはそのフラグメント」の意味にさらに含まれるものは、抗体フラグメントおよび抗原結合蛋白（単一鎖抗体）の複合体であり、例えば米国特許第４，７０４，６９２号（この特許の開示内容を本明細書で援用）に記載されたものである。
本明細書で用いられるように、「抗体」という用語は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体のこともいう。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギ由来のもの）は、ヒトでは自然に抗原性を呈するので、ヒトに投与した場合に望ましくない免疫応答を生ずる可能性がある。したがって、本発明の方法でヒト抗体または非ヒト抗体を用いることは、ヒトに投与した抗体が望ましくない免疫応答を起こすという可能性の低減に役立つ。
任意に、ヒトへの投与を目的として抗体を他の種で産生し、そして「ヒト化」する。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖またはフラグメント（例えば、Ｆｃ、ｓｃＦｖ、ｓＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合配列）であり、これらは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト抗体として、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられ、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、およびキャパシティを持つマウス、ラット、またはウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって、置換される。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応非ヒト残基よって置換される。ヒト抗体は、レシピエント抗体または取り込まれたＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれにも見いだされない残基を含むこともできる。一般に、ヒト化抗体は、実質的に、少なくとも１つ、一般的に２つの可変ドメイン全てを有し、全てもしくは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつ全てもしくは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン・コンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適なかたちで、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部（通常はヒト免疫グロブリンのもの）を含むことができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７ （１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６ （１９９２））。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、周知である。一般に、ヒト抗体は、非ヒトである供給源由来の抗体に１つ以上のアミノ酸残基が組込まれる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基であると言われ、一般に「インポート」可変領域から取り出されている。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列に置き換えることで、Ｗｉｎｔｅｒとその共同研究者たちとによる方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６ （１９８８））の方法に従って基本的におこなうことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であって、実質的に決して、完全なヒト可変領域が非ヒト種由来の対応配列によって置換されているわけではない。実際には、非ヒト抗体は概してヒト抗体であり、いくつかのＣＤＲ残基と、おそらくいくつかのＦＲ残基とが、齧歯類抗体の相同部位に由来する残基によって、置換されている。
ヒト化抗体作製で使用されるヒト可変領域（重鎖および軽鎖の両方）の選択は、抗原性を減らす上で重要である。「最良適合」方法にもとづいて、齧歯類抗体可変ドメインの配列が、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングされる。次に、齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒト・フレームワーク（ＦＲ）として受容する（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６ （１９９３）およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１ （１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なる非ヒト抗体に用いることができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５ （１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３ （１９９３））。
さらに重要なことは、抗体が抗原に対する高い親和性と他の好ましい生物学的性質とを保ちながらヒト化されることである。この目的を達成するために、好ましい方法にもとづいて、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列と種々の概念上のヒト化産物とを分析するプロセスによって、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリン・モデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。コンピュータ・プログラムは利用可能であり、該プログラムによって選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元立体構造が例示かつ表示される。このような表示を調べることは、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の有望な役割の分析（すなわち、抗原を結合させる候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析）を可能とさせる。このように、ＦＲ残基は、標的抗原に対する親和性の増大等、所望の抗体特性が達成されるように、コンセンサス配列およびインポート配列から選択および組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は直接的かつ最も実質的に、抗原結合への影響に関与している（ＷＯ９４／０４６７９、１９９４年３月３日公表）。
抗体消化で産生されるＦａｂフラグメントもまた、軽鎖の定常領域と重鎖の第１の定常領域とを含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域の１つ以上のシステインを含む重鎖ドメインのカルボキシル基末端でいくつかの残基の付加が生ずることで、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域でジスフィルド架橋によって連結した２つのＦａｂ’フラグメントを含む二価のフラグメントである。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’に対してなされた本明細書での呼称である。抗体フラグメントは、本来はＦａｂ’フラグメントの対（該フラグメント間にヒンジとなるシステインを有する）として産生された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
単離された免疫原的に特異的な抗体パラトープまたは抗体フラグメントも提供される。抗体の特異的免疫原エピトープを、分子の化学的または機械的崩壊によって抗体全体から単離することができる。本明細書に教示する方法によって、このように得られる精製フラグメントを調べてその免疫原性および特異性を決定することができる。抗体の免疫反応パラトープは、任意に、直接合成される。免疫反応性フラグメントとは、抗体アミノ酸配列に由来する少なくとも２〜５つの連続的なアミノ酸のアミノ酸配列として、定義される。
本発明の抗体を含むタンパク質を生産する１つの方法は、２つ以上のペプチドまたはポリペプチドをタンパク質化学技術によって連結することである。例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボノイル）化学物質のいずれかを用いて、現在利用可能な実験装置を用いて、ペプチドまたはポリペプチドを化学合成することができる（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当業者は、本発明の抗体に対応するペプチドまたはポリペプチドを例えば一般的な化学反応によって合成することができることを、容易に理解することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成することはできるが、その合成樹脂から切り出すことはできない。一方、抗体の他のフラグメントを合成して樹脂から切り出すことができ、それよって他のフラグメント上に機能的にブロックされている末端基が露出される。ペプチド縮合反応によって、これら２つのフラグメントがカルボキシル末端およびアミノ末端で、それぞれペプチド結合を介して共有結合して、抗体またはそのフラグメントを形成することができる（Ｇｒａｎｔ ＧＡ （１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｅｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ Ｍ ａｎｄ Ｔｒｏｓｔ Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ．）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、先に述べたようにインビボでそれぞれ別々に合成される。ひとたび単離すると、これらの別々のペプチドまたはポリペプチドを連結して、類似のペプチド縮合反応を経て抗体またはそのフラグメントを形成することができる。
例えば、クローン化ペプチド・セグメントまたは合成ペプチド・セグメントの酵素連結反応によって、相対的に短いペプチド・フラグメントが結合してより大きなペプチド・フラグメント、ポリペプチド、またはタンパク質ドメイン全体生ずることが可能である（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１ （１９９１））。あるいは、合成ペプチド固有の化学的連結反応を用いることで、短いペプチド・フラグメントから大きなペプチドまたはポリペプチドを化学的に構成することができる。この方法は、二段階化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９ （１９９４））。第一段階は、保護されていない合成ペプチド−アルファ−チオエステルとアミノ末端Ｃｙｓ残基を含む保護されていない別のペプチド・セグメントとの官能基選択的反応であり、最初の共有結合生成物としてるチオエステル結合連結された中間体を生じる。反応条件を変えることなく、この中間体は自然発生的な素早い分子内反応を起こして連結部位に天然ペプチド結合を形成する。この天然化学的連結反応の方法をタンパク質の全合成に適用することは、ヒト・インターロイキン８（ＩＬ−８）の合成で例示されている（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５ （１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８ （１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：６６２３−３０ （１９９４））。
あるいは、保護されていないペプチド・セグメントを化学的に連結する。ここでは、化学的連結反応の結果としてペプチド・セグメント間に形成された結合が非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１ （１９９２））。この技術は、完全な生物学的活性を持つ比較的純度の高い大量のタンパクと同様に、タンパク質ドメインのアナログを合成するのに、用いられる（ｄｅＬｉｓｌｅ Ｍｉｌｔｏｎ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７ （１９９２））。
本発明もまた、生理活性を持つ抗体のフラグメントを提供する。本発明のポリペプチド・フラグメントは、アデノウイルスまたはバキュロウイルス発現系等、ポリペプチド・フラグメントを産生することが可能な発現系でポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることによって得られる組換えタンパク質である。例えば、抗体とＦｃレセプターとの相互作用に関連する生理作用を生ずることができる特異的ハイブリドーマから抗体の活性ドメインを決定することができる。例えば、アミノ酸は、抗体の活性にも結合特異性にも結合親和性にもいずれにも貢献しないと分かったアミノ酸残基は、それぞれの活性を損なうことなく欠失され得る。例えば、種々の実施形態で、アミノ末端またはカルボキシル末端のアミノ酸が天然もしくは修飾非免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子から連続的に取り除かれ、それぞれの活性が多くの利用可能なアッセイの１つによって分析される。別の例では、抗体のフラグメントは、修飾抗体を含むもので、少なくとも１つのアミノ酸が、特定の位置で、天然に生ずるアミノ酸と置換されており、アミノ末端またはカルボキシル末端のアミノ酸の一部分または抗体の中央領域の一部分さえも、修飾抗体の精製を促進することができるポリペプチド・フラグメントまたは他の部分、例えばビオチンと置換されている。
フラグメントは、他の配列に結合しているかどうかにかかわらず、非修飾抗体または抗体フラグメントと比較してフラグメントの活性が著しく変わったり、損なわれないという条件で、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の修飾を含む。これらの修飾によっていくつかの特性、例えば、ジスルフィド結合可能なアミノ酸の除去もしくは付加、寿命の増加、および分泌特性の変化という特性が付加される。いずれにせよ、フラグメントは生理活性特性（例えば、結合活性、および結合領域の結合の調節）をもたなければならない。抗体の機能領域または活性領域は、タンパク質の特定領域を変異させた後、発現および発現ポリペプチドの試験をおこなうことで、同定することができる。そのような方法は、当業者に容易に理解されるもので、抗原をコードする核酸の部位特異的突然変異を含むことができる （Ｚｏｌｌｅｒ ＭＪ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００ （１９８２）。
種々のイムノアッセイのフォーマットを用いて、特定のタンパク質、変異体、またはフラグメントに選択的に結合する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質、変異体、またはそのフラグメントに対して選択的な免疫反応性を示す抗体を選択するするために、日常的に用いられる。免疫アッセイ・フォーマットおよび条件の記述については、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照せよ。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０ （１９８０）のスキャチャード解析によって、決定することができる。
また、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントの容器と、Ｆｃレセプター分子に対する抗体またはそのフラグメントの結合を検出するための１種類以上の試薬とを含む抗体試薬キットを提供する。試薬として、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、または他のタグが挙げられる。試薬として、さらに二次もしくは三次抗体、または酵素反応のための試薬を挙げることができ、酵素反応によって視覚化可能な産物を精製する。
（ｂ）ヒト抗体
この発明のヒト抗体は、あらゆる技術を用いて生成可能である。ヒトモノクローナル抗体の生成技術の例としては、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５，１９９１）によって記述されたものが挙げられる。この発明のヒト抗体（およびこれらのフラグメント）は、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１，１９９１）を用いても生成可能である。
この発明のヒト抗体は遺伝形質転換動物から採取可能でもある。例えば、免疫化に反応して全範囲のヒト抗体を生成する能力を有する遺伝形質転換型の突然変異マウスが記述されてきた（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５ （１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８ （１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３ （１９９３）参照）。詳細には、キメラかつ生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子の同型接合欠失は、内因性抗体生成を完全に阻害することになり、上記生殖細胞系突然変異マウスへのヒト生殖細胞系抗体遺伝子アレイの首尾のよい移入は、抗原攻撃時にヒト抗体を生成することになる。所望の活性を有する抗体は、本明細書に記述されているように、Ｅｎｖ−ＣＤ４−コレセプター複合体を用いて選択される。
ｃ）抗体の投与 この発明の抗体は、好ましくは薬学的に受容可能な担体で被験者に投与される。適切な担体およびそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記述されている。典型的には、薬学的に受容可能な塩の適正量は、等張性処方を示す処方箋に使用される。薬学的に受容可能な担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記液のｐＨは、好ましくは約５〜約８までとされ、より好ましくは約７〜約７．５までとされる。他の担体としては、抗体を含む固形疎水性ポリマーからなる半浸透性マトリックス等の徐放性製剤が挙げられ、上記マトリックスは例えばフィルム、リポソームあるいは微小粒子のような、形作られた物品の形態とされる。より好ましくは、特定の担体が例えば投与される抗体の投与経路および濃度に依存してもよいことは、この技術分野における当業者にとって明白なはずである。
上記抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）、あるいは有効な形態で血流への上記抗体の送出を保証する注入等の他の方法によって被験者、患者、あるいは細胞に投与可能である。局所あるいは静脈内注射は好適である。
上記抗体を投与するための有効量およびスケジュールは、経験的に決定可能であり、このような決定はこの技術分野における当業者によって行われる。この技術分野における当業者は、投与されなければならない上記抗体の投与量が、例えば抗体を受け入れる被験者、投与経路、使用された特定タイプの抗体、および投与される他の薬剤に依存して異なることは理解されるはずである。抗体の適切な投与量を選択するガイダンスは、抗体の治療用途に関する文献、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２およびｐｐ．３０３−３５７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ
Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９７）ｐｐ．３６５−３８９．中に見出される。抗体単独で用いられる場合における抗体の典型的な１日の投与量は、上述した因子に依存して、体重に対して、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲とされてもよい。
ヒト免疫不全ウィルス感染の治療、阻害あるいは予防用の抗体投与に続けて、治療用の抗体の有効性が熟練開業医に周知な種々の方法で評価可能である。例えば、この技術分野における当業者の１人は、この発明の抗体がウィルス負荷を減らすか、あるいはウィルス負荷の更なる増加を防止することを観察することによって、被験者におけるヒト免疫不全ウィルス感染を治療あるいは阻害するのにこの発明の抗体が有効であると理解するはずである。ウィルス負荷は、この技術分野において公知である方法、例えば被験者あるいは患者からのサンプル（例えば血液、これに限定されないが）中に、ヒト免疫不全ウィルス核酸の存在を検出するポリメラーゼ連鎖反応検定法あるいはヒト免疫不全ウィルス蛋白質の存在を検出する抗体検定法を用いて、あるいは患者内の抗ヒト免疫不全ウィルス抗体の循環レベルを測定することによって測定可能である。また、抗体治療の有効性は、ヒト免疫不全ウィルスに感染した患者中のＣＤ４＋Ｔ細胞数を測定することによって確認可能である。ヒト免疫不全ウィルス陽性の被験者すなわち患者中のＣＤ４＋Ｔ細胞数の初期あるいはその後の減少を阻害するか、あるいはヒト免疫不全ウィルス陽性の被験者中のＣＤ４＋Ｔ細胞数を増加することになる抗体治療は、有効な抗体治療である。
ｄ）抗体送達のための核酸アプローチ
この発明の組成物も、患者あるいは被験者自身の細胞が核酸を取り上げかつコード化された組成物（例えば、ＣＲ２−ＤＡＦ，ＤＡＦ−ＣＲ２，ＣＲ２−ＣＤ５９，ＣＤ５９−ＣＲ２，ＣＲ２−ＣＲＩ，ＣＲＩ−ＣＲ２，ＣＲ２−ＭＣＰ，ＭＣＰ−ＣＲ２，ＣＲ２−Ｃｒｒｙ，Ｃｒｒｙ−ＣＲ２，ＣＲ２−ＩｇＧｌ Ｆｃ （ヒト），ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ，ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ （マウス），あるいはＣＲ２−ＣＶＦ）を生成および分泌するように、上記抗体あるいは抗体フラグメントをコード化する核酸調製物（例えばデオキシリボ核酸あるいはリボ核酸）として患者あるいは被験者に投与可能である。
ｅ）核酸の送達
被験者の細胞への外因性デオキシリボ核酸の投与および摂取（すなわち、遺伝子トランスダクションあるいはトランスフェクション）を含む上述の方法において、この発明の核酸はありのままのデオキシリボ核酸あるいはリボ核酸の形態をとることができるか、あるいは核酸は、核酸を上記細胞に送出するベクター内に配することができ、これにより、抗体コード化デオキシリボ核酸フラグメントは、この技術分野における当業者の１人によって十分に理解されるように、プロモータの転写調節下に置かれる。上記ベクターは、アデノウィルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ））等の市販の調製物とすることができる。核酸あるいはベクターの細胞への送達は、種々の機序を経由してなすことができる。一例として、送出は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ，ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ），ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）等の市販のリポソーム調製物、並びにこの技術分野における標準的な手順に従って開発された他のリポソームを使用して、リポソームを経由してなすことができる。さらに、この発明の核酸あるいはベクターは、電気穿孔法によって生体内に送出可能であり、その技術は、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）並びにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機械（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）によって入手可能である。
一例として、ベクター送出は、組換え型レトロウィルスゲノム（例えば、Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５，１９８６参照）を一括することができるレトロウィルスベクター系等のウィルス系を経由してなすことができる。上記組換え型レトロウィルスは、その後に感染に使用することができ、これにより感染細胞に、この発明の広く無力化する抗体（あるいはこれらの活性フラグメント）をコード化する核酸を送出することができる。変更した核酸を哺乳類の細胞に導入する厳格な方法は、勿論、レトロウィルスベクターの使用に限定されるものではない。他の技術は、アデノウィルスベクター（Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：９４１−９４８，１９９４）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８４：１４９２−１５００，１９９４）、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７，１９９６）偽性型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｒｎａｔｏｌ．２４：７３８−７４７，１９９６）の使用を含む手順を広く利用することができる。リポソーム送出およびレセプター媒介性機序および他のエンドシトーシス機序（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８７：４７２−４７８，１９９６参照）等の物理的なトランスダクション技術も使用可能である。この発明は、あらゆる、あるいは他の一般的な遺伝子転写方法と共に使用可能である。
一例として、仮にこの発明の補体調節構造をコード化する核酸がアデノウィルスベクターで被験者の細胞に送出される場合には、ヒトへのアデノウィルスの投与量が注射当たり約１０７〜１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲とすることができるが、注射当たり１０１２ｐｆｕ程度に高くすることができる（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：９８５−１００１，１９９７；Ａｌｖａｒｅｚ ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：５９７−６１３，１９９７）。被験者は、単回の注射を受けることができるか、あるいは仮に追加の注射が必要な場合には、それらの注射は不定期の期間において６ケ月間隔（あるいは、熟練開業医によって決定されるような他の適切な間隔）、および／または治療の有効性が確立されるまで反復可能である。
この発明の上記核酸あるいはベクターの非経口的投与は、仮にこれが使用される場合には、注射によって概ね特徴付けられる。注射は、溶液あるいは懸濁液のいずれかのような従来の形状、注射前に液状の懸濁液に適した固形、あるいは乳剤で調製可能である。近時の非経口的投与のために改良されたアプローチは、一定の投与が維持されるように緩放性あるいは徐放性系の使用を含むものである。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号参照されたい。この文献は本明細書で援用されるものである。適切な処方に関する追加的議論および治療化合物の種々の投与経路に関しては、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５を参照されたい。
７．薬理学的担体／薬理学的生成物の送達
上述したように、上記組成物も、薬学的に受容可能な担体で生体内に投与可能である。「薬学的に受容可能な」とは、生物学的でなく、あるいは他の容認できないものでもない材料、すなわち核酸あるいはベクターと共に被験者に投与できるが、あらゆる許容できない生物学的効果を生じることなく、あるいは有害な方法で、この材料が含まれる薬理学的組成物の他のいずれの成分とも相互作用することない材料を意味する。上記担体は、この技術分野における当業者の１人にとって周知であるように、あらゆる活性成分の分解を最小にしかつ上記被験者におけるあらゆる逆効果を最小にするために、自然に選択される。
上記組成物は、経口的に、非経口的（例えば、静脈内注射）に、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外的に、局所的あるいはこれと同様に、投与可能であるが、局所的鼻腔内投与または吸入薬による投与が典型的で好ましい。本明細書で使用されているように、「局所的鼻腔内投与」とは、１つまたは双方の鼻孔を経由する鼻および鼻通路への上記組成物の送達を意味しかつ噴霧機構あるいは点滴機構によって、あるいは核酸あるいはベクターのエアロゾールによって送出するステップで構成することができる。後者は、多くの動物が同時に治療される場合に有効である。吸入薬による上記組成物の投与は、鼻あるいは口腔を経由して、噴霧機構あるいは点滴機構による送達によって行うことができる。送出は、挿管法によって呼吸系（例えば肺）のあらゆる領域に対して直接行うこともできる。必要な上記組成物の精確な量は、被験者の種、年齢、体重、および全身状態、治療されるアレルギー性疾患の重篤度、使用される特定の核酸あるいはベクター、その投与モード、およびこれらと同様のものに依存して、被験者によって異なるはずである。したがって、各組成物の正確な量を規定することは可能ではない。しかしながら、適量は、本明細書に与えられた実験ルーチンのみを用いて、この技術分野における当業者の１人によって決定可能である。
上記組成物の非経口的投与は、仮にこれが使用される場合には、注射によって概ね特徴付けられる。注射は、溶液あるいは懸濁液のいずれかのような従来の形状、注射前に液状の懸濁液に適した固形、あるいは乳剤で調製可能である。近時の非経口的投与のために改良されたアプローチは、一定の投与が維持されるように緩放性あるいは徐放性系の使用を含むものである。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号参照されたい。この文献は本明細書で援用されるものである。
上記材料は、溶液、懸濁液（例えば、微小粒子、リポソーム、あるいは細胞に組み込まれる）中に含めることができる。これらの材料は、抗体、レセプター、あるいはレセプタリガンドを経由して特定細胞型を標的とすることができる。次の文献は、腫瘍組織に対して特異的な蛋白質を標的とする上記技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。ビヒクルは、例えば、「ステルス」、および他の抗体複合化リポソーム（結腸癌を標的とする脂質媒介剤を含む）、細胞特異性リガンドを経由したＤＮＡのレセプター媒介性標的化、リンパ球定向腫瘍標的化、およびマウス生体内グリオーマ細胞の高特異性治療用レトロウィルス性の標的化である。次の文献は、腫瘍組織に対して特異的な蛋白質を標的とする上記技術の使用例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、レセプターは、構成あるいは誘導リガンドのいずれかのエンドシトーシス経路に含まれている。これらのレセプターは、クラスリン被覆穴に集まり、クラスリン被覆ベシクルを経由して細胞に入り、上記レセプターが選別される酸性化エンドソームを通過し、その後に、細胞表面へ循環し、細胞内に蓄積されるか、あるいはリソソーム内で分解される。内在化経路は、栄養摂取、活性化蛋白質の除去、巨大分子の浄化、ウィルスおよび毒素の日和見的侵入、リガンドの解離および分解、およびレセプターレベルの調節等の種々の機能に役立つものである。多くのレセプターは、細胞型、レセプター濃度、リガンドタイプ、リガンド価、およびリガンド濃度に依存して、１以上の細胞内経路を伴うものである。レセプター媒介エンドシトーシスの分子および細胞の機構は調査されてきた（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９−４０９ （１９９１））。
ａ）薬学的に受容可能な担体
抗体を含む上記組成物は、薬学的に受容可能な担体と組み合わせて使用可能である。
薬理学的な担体は、この技術分野における当業者にとって公知である。これらの最も典型的な担体は、ヒトに対して薬剤を投与するための標準的な担体であり、この担体としては殺菌水、生理食塩水、および生理学的なｐＨを有する緩衝液等の溶液が挙げられる。上記組成物は筋肉内あるいは皮下的に投与可能である。他の化合物は、この技術分野における当業者によって使用された標準的な手順に従って投与されることになる。
上記薬理学的組成物としては、選択分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、界面活性剤、およびこれらと同様なものを挙げることができる。上記薬理学的組成物としては、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤、およびこれらと同様なもの等の１つまたはそれ以上の活性成分をも挙げることができる。
上記薬理学的組成物は、局所的あるいは全身的な治療が望ましいか否かによって、および治療されるべき領域によって多くの方法で投与可能である。投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻腔内を含む）、経口的、吸入薬によって、あるいは非経口的に、例えば静脈内滴注、皮下注射、腹腔内注射、あるいは筋肉内注射によって行うことが可能である。開示された抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、キャビティー内、あるいは経皮的に投与可能である。
非経口的投与用の調製物としては、殺菌液あるいは非水性溶液、懸濁液、および乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注入可能な有機エステル類である。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、乳剤あるいは懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝性溶媒を含むものである。非経口的な賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、あるいは固定油が挙げられる。静脈内賦形剤としては、流体、および栄養補充液、電解補充液（リンゲルデキストロース系の補充液等）、およびこれらと同様のものが挙げられる。保存剤および他の添加剤は、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス、およびこれらと同様のものなどを存在させることもできる。
局所的投与用の処方としては、軟膏、洗浄剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレイ、リキッド、およびパウダーが挙げられる。従来の薬理学的担体、水性、パウダーあるいは油系の増粘剤、およびこれらと同様のものは、必須あるいは好適であってもよい。
経口的投与用の組成物としては、パウダーあるいは顆粒、懸濁液あるいは、水性あるいは非水性溶媒、カプセル、サッシェ、あるいはタブレットが挙げられる。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散剤あるいは結合剤は好適に使用可能である。
いくつかの組成物は、薬学的に受容可能な酸あるいは塩基の追加塩として投与可能であり、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸のような無機酸、および蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸等の有機酸との反応によって形成され得るか、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基、およびモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミン類および置換エタノールアミン類等の有機塩基との反応によって形成可能である。
ｂ）治療用途
上記組成物の投与量の範囲は、症害の混乱をもたらす所望の効果を生じるのに十分な量とされる。投与量は、望ましくない交叉反応、アナフィラキシー反応、およびこれらと同様な反応等の有害な副作用を引き起こすような多量であるべきではない。一般に、投与量は、患者の年齢、症状、性別、および疾患の進行度で異なり、この技術分野における当業者の１人によって決定可能である。上記投与量は、逆の徴候を示す状況において個々の外科医によって調節可能である。投与量は変更可能であり、１日あるいは数日間にわたって、１日に１回あるいはそれ以上の回数で投与可能である。
８．コンピュータ読み取り可能媒体
開示された核酸とタンパク質とをアミノ酸のヌクレオチドからなる配列として表現できることが理解される。これらの配列を表示する種々の方法があり、例えばヌクレオチドのグアノシンは、Ｇまたはｇで表される。同様に、アミノ酸のバリンは、ＶａｌまたはＶで表される。当業者は、任意の核酸またはタンパク質配列を、種々の既知の方法でどのように表示および表現するかを理解する（各々が開示されて本明細書で検討される）。本明細書で具体的に考察することは、コンピュータ読み取り可能媒体上でのこれらの配列の表示であり、例えば該媒体として市販のフロッピー（登録商標）・ディスク、テープ、チップ、ハード・ドライブ、コンパクト・ディスク、およびビデオ・ディスク、さらに他のコンピュータ読み取り可能媒体が挙げられる。また、開示された配列のバイナリー・コードによる表示も開示される。当業者は、コンピュータ読み取り可能媒体を理解する。したがって、コンピュータ読み取り可能媒体上に、核酸またはタンパク質配列が記録、格納、または保存される。
本明細書中に述べられている配列および該配列に関する情報を含むコンピュータ読み取り可能媒体を開示する。本明細書中に述べられている配列および該配列に関する情報を含み、該配列は配列番号３７、３８、３９、４０、４１、および４２を含まないコンピュータ読み取り可能媒体を開示する。
９．開示された組成物によるスクリーニングによって同定された組成物
ａ）コンピュータ支援医薬設計
開示された組成物を任意の分子モデリング技術の標的として用いることで、その開示された化合物の構造の同定または該開示組成物と所望の方法で相互作用する潜在的もしくは実際の分子、例えば低分子の同定をおこなう。本明細書に開示された核酸、ペプチド、および関連分子を、任意の分子モデリング・プログラムまたはアプローチで標的として用いることができる。
モデリング技術で開示された組成物を使用する場合、特定かつ所望の性質（例えば阻害もしくは刺激または標的分子の機能）を持つ分子（例えば、高分子）が同定されると理解される。開示された組成物、例えばＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧｌ、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲＩ、ＣＲＩ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＩｇＧＩ Ｆｃ （ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ （マウス）、またはＣＲ２−ＣＶＦを使用する場合に同定および単離される分子も開示される。したがって、開示された組成物、例えばＣＲ２、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＣＰ、Ｃｒｒｙ、ＩｇＧｌ、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＣＶＦ、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＣＤ５９−ＣＲ２、ＣＲ２−ＣＲＩ、ＣＲＩ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＭＣＰ、ＭＣＰ−ＣＲ２、ＣＲ２−Ｃｒｒｙ、Ｃｒｒｙ−ＣＲ２、ＣＲ２−ＩｇＧＩ Ｆｃ （ヒト）、ＣＲ２−ＩｇＭ Ｆｃ、ＣＲ２−ＩｇＧ３ Ｆｃ （マウス）、またはＣＲ２−ＣＶＦを必要とする分子モデリング・アプローチを用いて生産される産物ももまた、検討されて本明細書で開示されている。
したがって、このように、選択分子に結合する分子を単離する１つの方法は、合理的な設計を通してである。このことは、構造的情報とコンピュータ・モデリングとを通して達成される。コンピュータ・モデリング技術は、選択された分子の三次元原子構造と、分子と相互に作用する新化合物の合理的な設計の視覚化とを、可能にする。三次元構築物は、一般に、選択された分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲイメージングから得られたデータに依存する。分子動力学は、力場データを必要とする。コンピュータ・グラフィックス・システムは、新規化合物がどのようにして標的分子と連結するかの予測を可能にし、化合物および標的分子の構造を実験的に操作することが、結合特異性を完全にすることを可能にする。小さな変化が一方または両方で生ずる場合に分子と化合物との相互作用がどのようなものであるかの予測は、分子力学ソフトウェアと計算処理上インテンシブなコンピュータとを必要とし、通常、分子設計プログラムとユーザとのあいだのユーザ・フレンドリーな、メニュー方式のインタフェースと連結されている。
分子モデリング・システムの実施例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学関数を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィック・モデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、互いの分子挙動の相互作用的な構造、修飾、視覚化、および分析を可能にする
いくつかの論文が特定のタンパク質と相互作用する薬剤のコンピュータ・モデリングを概説しており、該論文は、例えば、Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７，１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ，Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４−５７ （Ｊｕｎｅ １６，１９８８）；ＭｃＫｉｎａｌｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ，１９８９ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９，１１１−１２２；Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｐｐ．１８９−１９３ （Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９）；Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｄｅａｎ，１９８９ Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６，１２５−１４０ ａｎｄ １４１−１６２；さらに、核酸成分のためのモデル酵素に関して、Ａｓｋｅｗ，ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，１０８２−１０９０である。 化学物質をスクリーニングしたり、グラフィック表示するための他のコンピュータ・プログラムは、以下の会社から市販されている。すなわち、例えば、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ．，Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏである。これらは、主に特定のタンパク質に対して特異的な薬剤への適用のために設計されるにもかかわらず、一旦ＤＮＡまたはＲＮＡの特異的な領域が同定されると、特にその領域と相互作用する分子の設計に適応され得る。
結合を変えうる化合物の設計および生成に関して上記されているにもかかわらず、基質結合または酵素活性を変える化合物について、既知の化合物のライブラリーをスクリーニングすることができ、該化合物として、天然産物もしくは合成化学物質、および生物活性物質、例えばタンパク質が挙げられる。
１０．キット
本明細書に開示された方法を実施するために使用できる試薬に適用されるキットが、本明細書に開示される。このキットは、任意の試薬または本明細書に開示された試薬の組み合わせを含むものであり、開示された方法を実施する上で必要または有益であると理解される。例えば、キットは、上記方法のいくつかの実施形態で議論される増幅反応を実施するためのプライマー、同様に目的どおりにプライマーを使用するために必要とされる緩衝液および酵素とを包含することもあり得る。例えば、被験体のリスクを評価するキットが開示され、該リスクとして、癌、喘息、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、反応性関節炎、脊椎関節炎、全身脈管炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、実験アレルギー性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、対宿主性移植片病、クローン病を含む炎症性大腸疾患、潰瘍性大腸炎、乏血再潅流傷害、心筋梗塞、アルツハイマー病病、移植拒絶反応（同種および異種）、熱傷、免疫結合体によって誘発されるいっさいの炎症、糸球体腎炎、重症筋無力症、多発性硬化症、脳ループス、ギヤン‐バレー症候群、脈管炎、全身性硬化症、過敏症、カテーテル反応、アテローム、不妊性、甲状腺炎、ＡＲＤＳ、ポスト・バイパス症候群、血液透析、若年性リウマチ様、ベーチェット症候群、溶血性貧血、ペンフィグス、水疱性類天疱瘡、脳卒中、アテローム性動脈硬化、および強皮症が挙げられる。
１１．類似の機能を持つ組成物
本明細書中に開示される組成物は、特定の機能、例えば補体活性の修飾またはＣＲ２、ＣＲ３、もしくはＣ３ｂの結合を有する。開示された機能を実行する特定の構造的必要条件は、本明細書中に開示され、同じ機能を実行することができる種々の構造があると理解される。そのような機能は、開示された構造に関連し、これらの構造は最終的に同じ結果（例えば補体活性の刺激または阻害）を達成する。
Ｅ．組成物を作る方法
本明細書中に開示される組成物と、開示された方法を実行するのに必要な組成物とは、特に指定しない限り、その特定の試薬または化合物のために当業者に公知の任意の方法を用いて作ることができる。
構築物を含む組成物を作る方法が開示され、ここで、その構築物はＣＲ２および補体の調節因子を含む。また、組成物を作る方法が開示され、該組成物は本発明の組成物である。
１．ペプチド合成
開示されたタンパク質（例えば配列番号６）を生成する１つの方法は、タンパク質化学技術によって２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを連結させることである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔ−ブチロキシカアルボノイル）化学物質を使用して、現在利用可能な実験装置を使用して、化学的に合成される（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当業者は、例えば、開示されたタンパク質に対応しているペプチドまたはポリペプチドが標準の化学反応によって合成できると、直ちに理解することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成することはできるが、合成樹脂から切り出すことはできない。一方、ペプチドまたはタンパク質の他のフラグメントを合成することができ、続けて樹脂から切り出すことができ、それによって他のフラグメント上の機能的にブロックされる末端基が露出される。ペプチド縮合反応によって、それら２つのフラグメントをカルボキシル末端およびアミノ末端でペプチド結合を介して共有結合させることができ、抗体またはそのフラグメントが形成される（Ｇｒａｎｔ ＧＡ （１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｓ：Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ Ｍ
ａｎｄ Ｔｒｏｓｔ Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ （少なくともペプチド合成に関連した材料に関しては、本明細書で援用する）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書に記載されているようにインビボでそれぞれに合成される。ひとたび単離すると、これらの別々のペプチドまたはポリペプチドを連結して、類似のペプチド縮合反応を経てペプチドまたはそのフラグメントを形成することができる。
例えば、クローン化ペプチド・セグメントまたは合成ペプチド・セグメントの酵素連結反応によって、相対的に短いペプチド・フラグメントが結合してより大きなペプチド・フラグメント、ポリペプチド、またはタンパク質ドメイン全体生ずることが可能である（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１ （１９９１））。あるいは、合成ペプチド固有の化学的連結反応を用いることで、短いペプチド・フラグメントから大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構成することができる。この方法は、二段階化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９ （１９９４））。第一段階は、保護されていない合成ペプチド−チオエステルとアミノ末端Ｃｙｓ残基を含む保護されていない別のペプチド・セグメントとの官能基選択的反応であり、開始の共有結合生成物としてチオエステル連結された中間体を生じる。反応条件を変えることなく、この中間体は自然発生的な素早い分子内反応を起こして連結部位に天然ペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５ （１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８ （１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：６６２３−３０ （１９９４））。
あるいは、保護されていないペプチド・セグメントを化学的に連結する。ここでは、化学的連結反応の結果としてペプチド・セグメント間に形成された結合が非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１ （１９９２））。この技術は、完全な生物学的活性を持つ比較的純度の高い大量のタンパクと同様に、タンパク質ドメインのアナログを合成するのに、用いられる（ｄｅＬｉｓｌｅ Ｍｉｌｔｏｎ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７ （１９９２））。
２．組成物を作るためのプロセス
組成物に至る中間体を作るのと同様に、組成物を作る方法がを開示する。例えば、配列番号５の核酸を開示する。これらの組成物を作るために使用しうる種々の方法、例えば合成化学的方法および標準的な分子生物学的方法がある。これらの組成物および他の開示された組成物を作製する方法が具体的に開示されていると、理解される。
配列番号２５に記述した配列を含む核酸と、核酸の発現を制御する配列とを有効なかたち（ｉｎ ａｎ ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｗａｙ）で連結させることを含むプロセスによって生産される核酸分子を、開示する。
配列番号２５に記載の配列と８０％同一の配列を含む核酸と、該核酸の発現を制御する配列とを有効なかたちで連結することを含むプロセスによって生産される核酸も、開示する。
本明細書で開示された核酸分子のいずれかによって動物体内で細胞をトランスフェクションさせるプロセスによって生産される動物を開示する。本明細書で開示された核酸分子のいずれかによって動物体内で細胞をトランスフェクションさせるプロセスによって生産され、哺乳類である動物を開示する。本明細書で開示された核酸分子のいずれかによって動物体内で細胞をトランスフェクションさせるプロセスによって生産され、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、または霊長類である動物も開示する。
本明細書で開示される細胞のいずれかを動物に加えるプロセスによって生産される動物も開示する。
この出願の全体を通じて、種々の刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示内容は、本発明が関係する技術の状態をより完全に説明するために、参考のためこの明細書に援用する。開示される参考文献は、参照が根拠とするセンテンスで述べられている参照文献に含まれる材料として本明細書で個々に、かつ具体的に援用される。
種々の修正変更が本発明の範囲または精神から逸脱することなく本発明でなされることができることは、当業者にとって明らかである。本発明の別の実施形態は、本明細書中に開示される発明の詳細および実施によって当業者によって明らかである。本明細書および実施例は例示のみを考慮し、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲にあることが意図されている。
Ｆ．実施例
以下の実施例は、本明細書で請求される化合物、組成物、物品、装置、および／または装置が作製されそして評価される方法の完全な説明および記述を、当業者に提供する。実施例は、単に本発明を例示するためのもであって、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ博士が発明として考えるものの範囲に制限を加えるものではない。努力は、数（例えば、量、温度等）に関して精度を確実にするために、なされたが、いくつかの誤差および偏差が含められるはずである。別途示されない限り、部は重量部であり、温度は℃、または外界温度であり、さらに圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
１．実施例１ 補体レセプター２（ＣＲ２）が媒介する補体インヒビターの補体活性化部位に対するターゲティング
ａ）方法
（１）細胞株およびＤＮＡ
ＤＮＡ操作は全て、マウスＩｇＧ１ Ｆｃコード領域を欠失したｐ１１８−ｍＩｇＧ１（３０）由来の哺乳類発現ベクターＰＢＭ中で実施した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用してタンパク質を発現させ、１０％ ＦＣＳを追加したダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）で維持した。Ｇ４１８の存在下、安定して形質移入したＣＨＯ細胞クローンを培養し、組み換え型タンパク質発現のため、ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ）非存在下、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ中の懸濁液内で細胞を培養した。ＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ）、１０％ ＦＣＳ中でＵ９３７細胞を培養した。
（２）抗体、試薬および血清
ＣＨＯ細胞膜に対するウサギ抗血清、精製されたヒトＤＡＦおよびＣＤ５９を標準的な技術（３１）により調製した。マウス抗ＤＡＦ ｍＡｂ １Ｈ４（３２）、ラット抗ＣＤ５９ ｍＡｂ ＹＴＨ５３．１（３３）およびマウス抗ヒトＣＲ２ ｍＡｂ １７１（ＳＣＲ １−２に結合）（３４）につき述べている。抗ヒツジ赤血球ＩｇＭをＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．（フランダース（Ｆｌａｎｄｅｒｓ）、ＮＪ）から入手した。二次抗体は全てＳｉｇｍａ社（セントルイス、ＭＯ）から購入した。精製された組み換え型ｓＣＤ５９はＢ．Ｐ．モーガン博士（ウェールズ大学、カーディフ、ＵＫ）から寄贈を受けた。Ｃ６欠乏ヒト血清をＱｕｉｄｅｌ社（サンディエゴ、ＣＡ）から購入し、研究室の健康なボランティアの血液から正常なヒト血清（ＮＨＳ）を得た。
（３）発現プラスミドの作製およびタンパク質発現
調製した前記組み換え型融合タンパク質および可溶性補体インヒビターを図１に示す。ｃＤＮＡ構築物は、前記４つのＮ末端ＳＣＲユニット（成熟したタンパク質、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２００２３、の１番目〜２５０番目の残基）をコードしている前記ＣＲ２配列をＤＡＦまたはＣＤ５９の細胞外領域をコードしている配列と接合することにより調製された。前記補体インヒビター配列はコードされた成熟したＤＡＦタンパク質配列（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８１７４）の１番目〜２４９番目の残基および成熟したＣＤ５９タンパク質配列（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１３９８７）の１番目〜７７番目の残基を用いた。ＣＲ２を補体インヒビター配列に接合するため、ＣＲ２をＣ末端およびＮ末端それぞれに含む融合タンパク質について、ＳＳ（ＧＧＧＧＳ）３および（ＧＧＧＳ）２をコードしているリンカー配列を用いた。標準的なＰＣＲ法（３５）により遺伝子構築物を調製した。クローニング・ステップは全て前記ＰＢＭベクター中で実施した。前記ＰＢＭベクターはタンパク質発現（３０）にも利用される。発現のため、製造業者の指示に従って（ＧＩＢＣＯ）ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用い、ＣＨＯ細胞中にプラスミドを形質移入した。文献（３０）に述べられているように、希釈を制限することにより安定して形質移入したクローンを選択した。また、クローンのタンパク質発現をＥＬＩＳＡにより定量した。
（４）ＥＬＩＳＡおよびタンパク質アッセイ
標準的なＥＬＩＳＡ技術（３１）を用いて、組み換え型タンパク質を検出し、培養上清中の相対タンパク質濃度を測定した。どのタイプの組み換え型タンパク質をアッセイするかに応じて、前記キャプチャー抗体は抗ＤＡＦ ｍＡｂ １Ｈ４または抗ＣＤ５９ ｍＡｂ ＹＴＨ５３．１のどちらかとなる。一次検出抗体は抗ＤＡＦまたは抗ＣＤ５９ウサギ・ポリクローナル抗体のどちらかである。ＥＬＩＳＡの中には、抗ＣＲ２ ｍＡｂ Ａ−３も一次検出抗体として使うものがあり、感度は低いが似たような結果を得ることができる。前記組み換え型タンパク質のタンパク質濃度は、ＵＶ吸光度またはＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ
ＩＩＩ）により測定した。
（５）タンパク質精製
アフィニティー・クロマトグラフィーにより培養上清から組み換え型タンパク質を精製した。製造業者が述べている通りに、抗ＤＡＦ １Ｈ４ ｍＡｂまたは抗ＣＤ５９ ＹＴＨ５３．１ ｍＡｂのいずれかをＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化アフィニティー・カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー、ＵＳＡ）にカップリングしてアフィニティー・カラムを調製した。組み換え型タンパク質を含む培養上清をｐＨ ８．０に調節し、アフィニティー・カラムに０．５ｍｌ／分の流速で送液した。前記カラムを６〜８カラム量のＰＢＳにより洗浄し、組み換え型タンパク質を２〜３カラム量の０．１
Ｍグリシン、ｐＨ ２．４により溶出した。前記融合タンパク質を含む画分は、１ Ｍ トリス緩衝液、ｐＨ ８．０を含むチューブに収集し、ＰＢＳ透析した。
（６）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング
精製された組み換え型タンパク質は、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ １０％アクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ハーキュリーズ、ＣＡ）中で分離した。ゲルはクマーシーブルー染色した。ウェスタンブロッティングのため、標準的な手順に従った（３１）。ごく簡単に、分離タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に転移し、前記転移タンパク質を抗ＤＡＦ ｍＡｂ １Ｈ４または抗ＣＤ５９ ｍＡｂ ＹＴＨ５３．１のいずれかの方法により検出した。膜はＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により展開した。ＣＲ２−ＣＤ５９もまた、グリカナーゼ処理の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ＣＲ２−ＣＤ５９（２ ｍｇ）は、０．１％ ＳＤＳ、１０ ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび５ ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．５）、１５ ｍＭの中で、９５℃で３分加熱した。冷却後、ＣＲ２−ＣＤ５９は１％ ノニデットＰ４０および０．３ ｍＭ ＰＭＳＦの存在下、３ＵのＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ Ｎ−グリカナーゼ（ＥＣ ３．５．１．５２、Ｓｉｇｍａ）でインキュベーとした。
（７）フローサイトメトリー
組み換え型融合タンパク質のＣ３オプソニン化細胞への結合はフローサイトメトリーで測定した。ＣＨＯ細胞を、１０％ 抗ＣＨＯ 抗血清（３０分／４℃）中でインキュベートし、洗浄して１０％ Ｃ６欠乏ＮＨＳ（４５分／３７℃）中でインキュベートした。次に前記Ｃ３オプソニン化細胞を洗浄し、１μＭ 組み換え型タンパク質（６０分／４℃）でインキュベートした。洗浄後、抗ＤＡＦ ｍＡｂ １Ｈ４または抗ＣＤ５９ ｍＡｂ ＹＴＨ５３．１のいずれか１０ μｇ／ｍｌ（３０分／４℃）、続けてＦＩＴＣ−複合体 二次抗体（１：１００，３０分／４℃）で適切に細胞をインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中で２％ パラホルムアルデヒドにより固定してＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
Ｓｙｓｔｅｍｓ、サンホセ、ＣＡ）により解析した。インキュベーションおよび洗浄は全てＤＭＥＭ中で実施した。
（８）Ｃ３リガンドに結合するＣＲ２融合タンパク質の解析
ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００ 装置を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定により、前記ＣＲ２融合タンパク質とＣ３ｄｇ−ビオチンとの相互作用の動態解析を実行した。前記チップの１つのフローセル表面上に２μｌ／分で２０分、Ｃ３ｄｇ−ビオチン５０μｇ／ｍｌを注入することにより、文献（３６）で述べている通りに調製したヒトＣ３ｄｇ−ビオチンをＢＩＡｃｏｒｅストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップ表面に結合した。前記フロー緩衝液は０．５Ｘ ＰＢＳ ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０である。キャプチャーしたＣ３ｄｇからの前記ＳＰＲシグナルにより、２５０〜５００の範囲のＢＩＡｃｏｒｅ反応単位を生じた。コントロールのストレプトアビジンにコーティングされたフローセルはタンパク質がない状態で稼動させた。結合は、０．５Ｘ ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中の２５℃、流速２５μｌ／分におけるＣＲ２融合タンパク質濃度（１５．６−５００ ｎＭ）にわたる範囲により評価した。ｋｉｎｊｅｃｔコマンドを用いて、ＣＲ２融合タンパク質サンプルを ５０μｌ分割量注入した。前記融合タンパク質と前記リガンドとの関連を１２０秒モニターした。その後は、前記複合体は緩衝液だけでさらに１２０秒経つと分離することができる。５０ μｌ／分で２００ ｍＭ 炭酸ナトリウム（ｐＨ ９．５）の１０秒パルスにより、異なる融合タンパク質濃度での解析を行う間に前記結合表面を再構築した。ＣＲ２融合タンパク質断片のＣ３ｄで固定されたフローセルへの結合はコントロールのフローセル結合で補正した。 ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて結合データを１：１ラングミュア結合モデルに近似させ、小剰余値およびχ２値による最良適合により評価した。得た前記動的分離プロファイルは、前記ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１プログラムを用いてオン速度およびオフ速度（ｋａおよびｋｄ）ならびにアフィニティー係数（ＫＤ）の算出するのに利用した。実験と実験の合間に、５０μｌ／分で５０ ｍＭ 水酸化ナトリウム（ｐＨ ９．５）の６０秒パルスにより前記ストレプトアビジン表面を再構築し、上述の通りにＣ３ｄｇ−ビオチンを再び適用した。
（９）補体溶解アッセイ
６０％〜８０％集密したＣＨＯ細胞をヴェルセン（ＧＩＢＣＯ）で脱着し、２回洗浄して１０６／ｍｌ ＤＭＥＭに再懸濁した。細胞に１０％ ウサギ抗ＣＨＯ細胞膜抗血清を加え（３０分／４℃）、細胞を補体に感作させた。次に抗血清を除去し、ＤＭＥＭで希釈したＮＨＳ中に細胞を再懸濁した。最終的なアッセイ容量は５０または１００μｌのいずれかである。３７℃で４５分後、トリパンブルー・エクスクルージョン（生細胞および死細胞をどちらも数える）または５１Ｃｒリリースのいずれかにより細胞の生存を測定した（３７）。いずれのアッセイからも似た結果を得ている。組み換え型タンパク質の補体インヒビター活性をアッセイするため、ＣＨＯ細胞に添加する前に前記タンパク質をＤＭＥＭで希釈してＮＨＳに加えた。１０％ ＮＨＳの最終的な濃度として、無防備の抗体が感作したＣＨＯ細胞がおよそ９０％溶解する濃度を採用した。抗体に感作したヒツジ赤血球（ＥＡ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて、補体による溶血の阻害を測定した。最終的な容量が３００μｌのゼラチン・ベロナール緩衝液（ＧＶＢ＋＋）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で溶血アッセイを実施した。前記ゼラチン・ベロナール緩衝液は２．５ Ｘ １０７ ＥＡ、最終的な希釈倍率が１／３００となるようなＮＨＳおよび付加的な融合タンパク質濃度を含む。３７℃で６０分、反応混合物をインキュベートし、１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含む３００μｌ ＰＢＳを加えて反応を止めた。遠心分離により細胞を取り除き、４１３ｎｍで上清中のヘモグロビンについて分光光度的に定量することにより細胞溶解をアッセイした。
（１０）Ｕ９３７細胞の赤血球への接着
文献（３８）に述べられている通りに、Ｃ３オプソニン化赤血球へのＣＲ３依存性接着のアッセイを効果的に実施した。簡便に、ＧＶＢ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に３７℃で３０分、測定前凝集量に近いウサギ抗ＳＲＢＣ ＩｇＭでヒツジの新鮮な赤血球（ＳＲＢＣ）を感作した。２回洗浄した後、ＧＶＢ（１２０分／３７℃）で等容量の１：２希釈したＣ６欠乏ヒト血清でＩｇＭに感作したＳＲＢＣをインキュベートすることによりＣ３ｂオプソニン化ＳＲＢＣを調製した。細胞を２回洗浄し、ペレットをＧＶＢに再懸濁した。血清中ではＣ３ｂの半減期が短くなるため、この処理後に赤血球に結合するＣ３の大多数はｉＣ３ｂまたはＣ３ｄの分解産物（ＣＲ２リガンド）の形式である。Ｕ９３７細胞（２００μｌ中に４ Ｘ １０＾５細胞）を５０μｌのＣ３オプソニン化ＳＲＢＣ（２ Ｘ １０６ 細胞）に加え、前記混合物を遠心分離（４分／４０ ｘ ｇ）して室温で９０分静置した。次に細胞を位相差顕微鏡で検査し、赤血球に接着しているＵ９３７細胞数を測定した。少なくとも１サンプルあたり１００赤血球につきスコアリングし、赤血球に結合しているＵ９３７細胞数の平均を算出した。実施した各実験では、３重に測定した。実験の中には、収集前に５０ ｎｇ／ｍｌ ホルボール・ミリスチン酸酢酸塩（ＰＭＡ）存在下でＵ９３７細胞を３日間培養しており、処理の結果ＣＲ３を上方制御したものがいくつかある（３９、４０）。ＩｇＭでコーティングされたＳＲＢＣのみとインキュベートした細胞、またはＣ６欠乏ヒト血清と直接インキュベートしたＳＲＢＣをコントロールとして用いた。
（１１）体内分布研究
続けて注入した放射性標識タンパク質の組織分布を測定する標準的な手順（４１、４２）を実施した。簡便に、３４週齢のメスのＮＺＢ／ＮＺＷ Ｆ１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、バーハーバー、ＭＥ）尾静脈に１．７μｇの１２５Ｉ標識したＣＲ２−ＤＡＦ（４．２０ ｘ １０６ ｃｐｍ／ｍｇ）またはｓＤＡＦ（４．８４ ｘ １０６ ｃｐｍ／ｍｇ）を注入した。２４時間後、血液サンプルを採取し、主要な器官を除去してから細かく切って１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳで洗浄し、計量・カウントした。組織グラムあたりの注入量パーセンテージによりターゲティング特異性を評価した。製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の指示に従い、ヨードジェン法（ｉｏｄｏｇｅｎ）を用いてタンパク質をヨウ素化した。
（１２）免疫蛍光顕微鏡
ＣＲ２−ＤＡＦまたはｓＤＡＦ（２７０μｇ）を２４週齢ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの尾静脈に注入した。２４時間後、腎臓を除去してスナップ冷凍（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）した。冷凍腎臓から調製したクリオスタット切片（５ μｍ）をアセトンにより固定し、間接型免疫蛍光顕微鏡用に処理した。抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的ＦＩＴＣ−複合体二次抗体（Ｆ４１４３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、マウス抗ヒトＤＡＦ １Ａ１０および１Ｈ６ ｍＡｂの等モル混合物を一次検出抗体（最終濃度、１０μｇ／ｍｌ）として用いた。続けて、前記マウス腎臓に接着した免疫結合体により起こる可能性が最も高いバックグラウンド染色を削減するため、前記二次ＦＩＴＣ標識抗体を１：８００（推奨されている希釈の１０倍）に希釈することを除けば、標準的な手順（４９、抗体染色技術の教示するところを本明細書で援用）を実施した。デジタル画像を取り込み、同じ設定でＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにより最適化した。
ｂ）結果
（１）構築物設計、発現、および精製
組み換え型融合タンパク質は、４つのヒトＣＲ２ Ｎ末端ＳＣＲユニットを含み、Ｎ末端またはＣ末端の可溶性ヒトＣＤ５９またはＤＡＦ（図１に示す構築物）のいずれかに連結された。組み換え型タンパク質は、安定して移入したＣＨＯ細胞クローンの培養上清から１００〜２００μｇ／ｌの間の収量で精製された。精製された組み換え型タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより解析することにより、予想される分子量の範囲（図２）内のタンパク質が明らかとなり、ＣＲ２−ＣＤ５９を除いて、タンパク質は全て単一のバンドとして移動することがわかった。ＣＲ２−ＣＤ５９でバンドが２つ観察されるのは、グリコシル化の違いによる。なぜならば、ＣＲ２−ＣＤ５９はグリカナーゼ処理の後では単一のバンドとして移動するからである。
（２）融合タンパク質の補体オプソニン化細胞へのターゲティング
ＣＲ２に対するＣ３リガンドを、補体活性化抗体およびＣ６欠乏血清（ＭＡＣ形成および細胞溶解を防ぐため）でＣＨＯ細胞をインキュベートすることによりＣＨＯ細胞に沈着した。ＣＲ２を含む融合タンパク質は全て、ｓＣＤ５９またはｓＤＡＦは異なるが、Ｃ３でコーティングされたＣＨＯ細胞（図３）に結合する。
（３）融合タンパク質とＣ３ｄｇリガンドとの間の相互作用の動態解析
前記ＣＲ２リガンド Ｃ３ｄｇに対して異なる組み換え型融合タンパク質のアフィニティーを表面プラズモン共鳴測定により測定して比較した。キャプチャーしたＣ３ｄｇ−ビオチン（およそ２０００反応ユニット）を含むＢｉａｃｏｒｅストレプトアビジン・チップ上に種々の濃度の前記融合タンパク質を通して前記実験を行った。グローバル適合パラメータにより、前記データの動態解析は１：１（ラングミュア）結合相互作用モデルに対して最良適合を示した （図４）．Ｎ末端にＣＲ２をもつ融合タンパク質（ＣＲ２−ＤＡＦおよびＣＲ２−ＣＤ５９）はどちらも似たような速い会合および速い解離速度をもつ結合プロファイルを示した。対照的に、Ｃ末端へのＣＲ２の融合タンパク質の結合（ＤＡＦ−ＣＲ２およびＣＤ５９−ＣＲ２）は遅い会合および解離速度を示した（図４、表１）。しかしながら、前記Ｎ末端がＣＲ２の融合タンパク質は最も高いアフィニティーで結合している（表１）。ＣＤ５９融合タンパク質はＤＡＦ融合タンパク質よりも高いアフィニティーで結合する。可溶性のＤＡＦおよびｓＣＤ５９は固定化したＣ３ｄｇには結合しない。
（４）融合タンパク質の補体インヒビター活性
補体が媒介するＣＨＯ細胞および赤血球の両方の溶解に対するこれら補体インヒビターの効果を測定することにより、標的化および非標的化補体インヒビターの補体インヒビター活性を解析した。これら実験では、無防備な細胞が９０〜１００％溶解する濃度のヒト血清中で抗体感作細胞および組み換え型タンパク質をインキュベートした。どちらの細胞タイプでも、前記標的化補体インヒビターはその対応する非標的化タンパク質よりも、補体媒介性溶解を阻害することにおいて、有意により有効であった。標的ＤＡＦタンパク質は、標的化ＣＤ５９よりも有効なインヒビターであった（図５および図６）。ＤＡＦおよびＣＤ５９のいずれかのＮ末端と連結しているＣＲ２を含む融合タンパク質は、Ｃ末端ＣＲ２融合タンパク質より有効なインヒビターである。最も可能性を秘めた補体溶解インヒビターはＣＲ２−ＤＡＦである。ＣＲ２−ＤＡＦは、ＣＨＯ細胞溶解を５０％阻害するのに濃度１８ ｎＭを要する。対照的に、非標的化ｓＤＡＦはＣＨＯ細胞溶解を５０％阻害するのに濃度３７５ｎＭを要し、２０倍の開きがある（図５ａ）。ｓＣＤ５９は特に貧弱な補体インヒビターであり、テストした中で最高の濃度である５００ ｎＭでＣＨＯ細胞溶解からわずか２５％しか保護しなかった。しかしながらＣＲ２−ＣＤ５９は１０２ｎＭでＣＨＯ細胞溶解を５０％阻害し、非標的化ｓＤＡＦよりも有効であった（図６ａ）。表４は前記の異なる組み換え型補体インヒビターインヒビター活性の比較である。Ｎ末端ＣＲ２融合タンパク質の高い補体インヒビター活性はこれらタンパク質がＣ３ｄｇリガンドに対して示す高いアフィニティーと関連している（表３）。
補体が媒介するＣＨＯ細胞および赤血球の溶解を保護するための相対的な有効性は、前記補体インヒビターの間でいくらか異なる。これは特に前記ＤＡＦインヒビターであてはまる。標的化ＤＡＦの方がずっと有効ではあるが、ｓＤＡＦはＣＨＯ細胞よりも赤血球を保護するのにずっと有効である。また、でより有意に補体を阻害する。赤血球が補体溶解の標的細胞である場合は、ＣＲ２−ＤＡＦおよびＤＡＦ−ＣＲ２のインヒビター活性にほとんど違いはない。
（５）細胞接着に対するＣＲ２融合タンパク質の効果
補体レセプター３は、内皮接着および血管外遊出ならびに前記細胞溶解メカニズム（食作用および脱顆粒）の活性化に関与する白血球受容体である。ＣＲ２およびＣＲ３同じｉＣ３ｂ補体リガンドを共有しているため、ＣＲ２融合タンパク質はＣＲ３が媒介する細胞結合を阻害するかどうかを決定した。これら実験のため、ＣＲ３依存性メカニズムでｉＣ３ｂにコーティングされた赤血球に結合する特徴がよくわかっている前単球細胞株（ＣＲ２ − 、ＣＲ３＋）、Ｕ９３７を用いた（４０）。前記ＣＲ２融合タンパク質は全て、ｓＤＡＦまたはｓＣＤ５９を除き、Ｕ９３７細胞のＣ３オプソニン化ヒツジ赤血球への結合を有意（Ｐ＜０．０１）に阻害した。各ＣＲ２融合タンパク質は濃度５００ｎＭでＵ９３７結合を同程度阻害した（図７）。ＰＭＡで刺激したＵ９３７細胞を用いた、ＣＲ３の上方制御をもたらす処理をする実験でも似たようなデータが得られている。（３９、４０）。赤血球の補体オプソニン化では、補体を活性化するためにＩｇＭを用いた。なぜなら、ＩｇＧは前記赤血球に沈着する際にＵ９３７細胞上に発現されるＦｃγレセプターに会合するからである。Ｕ９３７細胞はまた、前記ｉＣ３ｂリガンドを共有する第３のレセプターである、ＣＲ４（ｐ１５０、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）を発現する。しかしながら、おそらくＣＲ４と細胞骨格との関連および膜上での不動性のため、Ｕ９３７細胞のＣ３オプソニン化赤血球への結合はＣＲ４非依存型である（４０）。
（６）ＣＲ２−ＤＡＦの腎炎マウス腎臓へのターゲティング
ＣＲ２融合タンパク質が補体活性化部位およびインビボ疾患部位を標的とするかどうかを測定するため、メスのＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウス中のＣＲ２−ＤＡＦおよびｓＤＡＦの体内分布研究を実施した。ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウスでは自然発症の自己免疫性疾患が発達している。この自己免疫性疾患はヒト全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）と似ており、自己抗体の産生および補体沈着関連の免疫結合体が媒介する重症の糸球体腎炎が２６〜２８週齢で発達する（４、５２）。３４週齢ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウスにおける［１２５Ｉ］ＣＲ２−ＤＡＦおよび［１２５Ｉ］ｓＤＡＦの体内分布は注入後２４時間および４８時間に測定した。尾静脈に［１２５Ｉ］ＣＲ２−ＤＡＦを注入して２４時間すると、検定した他の器官と比べ、有意に高い割合の放射能が腎臓に局在した（図２５ａ）。［１２５Ｉ］ＣＲ２−ＤＡＦを注入して４８時間後、２４時間後と同程度の放射能が腎臓にあるが、肝臓および脾臓の放射能が増加し、血液中の放射能は減少した（図２５ｂ）。肝臓および脾臓は免疫結合体クリアランス部位であり、［１２５Ｉ］ＣＲ２−ＤＡＦのターゲッティングがこれら器官では後になって増加したことが説明できる。［１２５Ｉ］ｓＤＡＦは腎臓またはその他器官で優先的な結合を示さなかった（図２５、ａおよびｂ）。８週齢の腎炎罹患前ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウスでは、［１２５Ｉ］ＣＲ２−ＤＡＦの腎臓へのターゲティングの証拠はなかった（図２５ｃ）。さらに興味深いことに、［１２５Ｉ］ｓＤＡＦは［１２５Ｉ］ＣＲ２−ＤＡＦよりも循環器からずっと早く除去されることから、前記ＣＲ２部分は前記融合タンパク質の循環半減期を延ばす機能があることを示している。しかしながら、より若いマウスの［１２５Ｉ］ＣＲ２−ＤＡＦ血液レベルは、２４時間ではより高齢のマウスで記録したレベルの約半分である。［１２５Ｉ］ＣＲ２−ＤＡＦの長い循環器における半減期は、部分的には循環免疫結合体への結合の結果と考えられる。
ＣＲ２−ＤＡＦの腎臓沈着補体へのターゲティングについてもまた、腎臓切片を直接検査することによりもう１つのＳＬＥマウスモデルを検査した。メスのＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウスと同様、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、糸球体の免疫沈着と関連して（５３、このマウスモデルを教示するため本明細書で引用）、２４週齢までに補体沈着とともに重症の増殖性糸球体腎炎が発達する。ＣＲ２−ＤＡＦおよびｓＤＡＦを２４週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウス尾静脈に注入し、ヒトＤＡＦ免疫反応性について蛍光顕微鏡により腎臓切片を２４時間後に解析した。ＣＲ２−ＤＡＦを注入したマウスの腎臓切片は、免疫結合体で観察されたパターンと同様に糸球体に優先的に局在する傾向とともに高レベルのＤＡＦ染色を示した。ｓＤＡＦを注入されたマウスの糸球体では、ＤＡＦ染色は全く明らかでなかった（図２６）。
ｃ）結論
この研究は、補体活性化部位に対して標的化されるタンパク質を含む可溶性ヒトＤＡＦおよびＣＤ５９の生成および特徴付けを説明する。標的化タンパク質は、補体を阻害することで、それらの非標的化相対物よりかなり強力だった。ＣＤ５９およびＤＡＦの標的化は、補体Ｃ３活性化産物と結合するヒトＣＲ２のフラグメントにインヒビターを連結させることによって達成された。ＣＲ２に対するＣ３リガンドは、比較的寿命が長く、しばしば多量に、補体活性化の部位に共有結合する。このように、補体阻害のＣＲ２によって媒介される標的化は、数多くの補体関連疾患または症状に対して治療上の利点がある。この仮説と整合して、ＣＲ２−ＤＡＦは腎炎ＮＺＢ／Ｗ・Ｆ１マウスの腎臓を標的とすることが示された。これらのマウスは、補体活性化および付着（２、４３）をもたらす腎臓での結果として生ずる免疫結合体の形成と付着によって自己抗体を産生する。ヒトＣＲ２は、類似の親和性（４４）でヒトおよびマウスＣ３リガンドに結合し、生体内分布の研究によってＣＲ２融合タンパク質がインビボで標的機能を保持することが確認される。本研究は、ヒト補体阻害のためにこのアプローチの実現可能性を確立する。標的化アプローチは、可溶性ＣＲ１等の補体活性化の他のインヒビターに対しても効果的であり、それは臨床試験で効果的であり、さらにインビトロ（９）でＤＡＦよりも強力な補体のインヒビターである。
異なるＣＲ２融合タンパク質のＣ３ｄｇに対する相対的親和性は、Ｃ３ｄｇに対するＣＲ２のＳＣＲ１−２およびＣＲ２のＳＣＲ１−１５の親和性を暗示する。Ｃ３ｄｇとのＣＲ２・ＳＣＲ１−２およびＣＲ２・ＳＣＲ １−１５ 相互作用についてのＫＤ値は類似しているが、ＣＲ２・ＳＣＲ１−２はより速く結合および解離した。このことは、全体的な親和性（３６）に対する付加的なＳＣＲドメインの貢献が示された。別のＳＣＲ含有タンパク質（Ｈ因子）の溶液構造の分析は、ＳＣＲドメインがそれ自身上で折り畳まって、ＳＣＲドメイン間の相互作用がＣ３リガンド結合特性（４５）を調節しうることが示された。ＳＣＲ領域間の立体配置的可変性は、異なる（天然の）リンカー長から生じると予想され、より長いリンカーはより大きな立体配置的柔軟性を提供する。この文脈において、ＣＲ２およびＤＡＦ のＳＣＲ領域は比較的長いｓｅｒ−ｇｌｙリンカーで連結し、このことは融合パートナーが互いに折り重なりあってＣＲ２結合親和性を調節することができるＳＣＲ−ＳＣＲ相互作用をもたらすことを可能とする。
標的として抗体感作ＣＨＯ細胞またはヒツジ赤血球を使用して、補体媒介性溶解分析をおこなった。補体媒介性溶解と異なる細胞を保護する点で、補体インヒビターのいくつかの相対的活性に、著しい差があった。ＤＡＦ、ＤＡＦ−ＣＲ２、およびＣＤ５９−ＣＲ２は、補体媒介性溶解からヒツジ赤血球を保護する点で、ＣＨＯ細胞よりかなり活性が高かった。赤血球とは異なり、有核細胞の補体媒介性溶解が、完全に膠質浸透性の調節解除に起因するというわけではなく、形質膜での複数のＭＡＣの付着が必要である（４６−４８）。可溶性（非標的化）補体インヒビターの阻害活性を調べている大部分の前の研究は、補体媒介性溶解の標的細胞として、赤血球を使用して実行された。しかし、ＣＨＯ細胞はインビトロ実験に対するより生理学的に関連した標的となる可能性がある。
補体媒介性障害の異なる機構は、異なる疾患状況に関係しており、異なる疾患は経路内の異なる点で作用する阻害戦略から恩恵を受けることができる。例えば、疾患に適用できるならば、経路における遅いステップで補体をブロックする特定の利点は宿主防御機能、および補体の免疫ホメオスタシス機構は完全なままであることである。このように、ＣＤ５９をベースとするインヒビターは、末期細胞溶解性経路が主に原因に関係する疾患で、補体活性化のインヒビターに勝る利点を提供する。可溶性ＣＤ５９はインビトロでのその非常に劣った活性により治療的な利点を持ちそうにないが、ＣＤ５９のＣＲ２によって媒介される標的化が有意にその補体阻害活性を増加させることが本明細書で示された。実際に、ＣＲ２−ＣＤ５９はｓＤＡＦより補体媒介性溶解を阻害する活性が高く、インビボでｓＤＡＦは治療効力を示した（８）。ＣＲ２−ＣＤ５９の齧歯類アナログは、疾患の病因における初期の補体活性化産物対ＭＡＣ形成の相対的な役割を分析するための有用な手段でもある。多くの症状での異なる補体活性化産物の組織損傷に対する相対的寄与は、あまり理解されておらず、議論の余地がある。
ＣＲ２融合タンパク質は、Ｃ３オプソニン化赤血球に対するＵ９３７細胞の結合を阻害した。ＣＲ２およびＣＲ３は両方ともｉＣ３ｂを結合し、このデータは、Ｃ３−オプソニン化赤血球に対するＵ９３７結合がＣＲ３依存型（４０）であることから、ＣＲ２−融合タンパク質がＣＲ３アンタゴニストとして作用することを示す。接着分子として、ＣＲ３は、細胞間接着分子‐１（ＩＣＡＭ−１）との高親和性相互作用を介して、炎症部位での内皮癒着と漏出性出血を媒介する。補体レセプターとして、ＣＲ３はｉＣ３ｂとの相互作用を経て貪食作用および脱顆粒を促進および強化する。ＩＣＡＭ−１およびｉＣ３ｂは、ＣＲ３（Ｒｏｓｓの総説を参照）上で、オーバーラップしている抗原決定基と結合する。したがって、ＣＲ３は、炎症部位で細胞媒介性組織障害を促進する点で重要な決定因子となりえる。また、ＣＲ３をブロックする抗体はいくつかの炎症状態で作用を示した（Ｒｏｓｓの総説を参照）。したがって、ＣＲ３結合に対するＣＲ２の拮抗作用は、補体阻害と相乗的に作用するＣＲ２補体インヒビター融合タンパク質の作用の第２の抗炎症機構を示す。
補正活性化部位および疾患部位に対する標的化補体インヒビターは、それらの効力をかなり強化することができる。実際、ＣＤ５９をベースとする治療から利益を受ける症状にとって、補体活性化部位に対するＣＤ５９の標的化は、必要条件である。他の標的化アプローチ（例えば抗体によって媒介される標的化）に対するＣＲ２媒介性標的化の利点は、ＣＲ２部分が任意のアクセス可能な補体活性化部位を標的化し、広範囲な治療用途を持つことである。ＣＲ２融合タンパク質は、ＣＲ３アンタゴニストとして作用することもでき、このことは第２の重要な治療的な利点を示すことができる。ヒトＣＲ２−補体インヒビター融合タンパク質は、抗体可変部を含む組換え型のインヒビターよりも免疫原である可能性も低い。低レベルの全身性阻害を有する、有効な局所濃度を与える補体活性化の標的化インヒビターの予測された能力もまた、特に長期にわたる全身性補体阻害（これはＣ５９をベースとするインヒビターにとってさほど重要な問題ではない）を伴って、宿主防御機構を危うくする可能性を減衰させる。ＣＲ２標的化インヒビターは、補体を活性化させる感染因子を標的とすることができる。
２．実施例２：標的化補体阻害および活性化
ａ）補体インヒビター（炎症／生体非適合性）
補体インヒビターは、多くの自己免疫疾患および炎症性疾患および生体非適合性に関係した症状の治療のために、かなり有望である。補体に対する安全かつ活性のある薬理学的インヒビターは、現在利用できない。研究は、主に宿主膜結合型補体−調節タンパク質に基づく可溶性インヒビターを開発することに集中した。可溶性ＣＲｌ、ＭＣＰ、ＤＡＦ、およびＣｒｒｙの組換え型の形状は膜連結領域の除去によって作られ、さらに全てのタンパク質は疾患の種々のモデルで、炎症および補体媒介性組織障害を減少させる点で活性があることが示された。補体タンパク質Ｃ５の機能をブロックする可溶性ＣＲ１抗体は、臨床試験中である。しかし、全身投与した可溶性補体インヒビターの臨床使用に関して、深刻な疑問が存在する。補体は、先天性および適応性免疫において、重要な役割を果たし、Ｃ３ｂの生成は、多くの病原細菌の白血球媒介クリアランスとオプソニン化とにとってクリティカルである。加えて、液相補体活性化産物Ｃ５ａは感染を制御する際に重要であることが示され、循環流動からの病原性物質のクリアランスにとってで重要である。補体の全身阻害は、したがって、感染を制御する能力に関して、宿主にとって深刻な結果をもたらす可能性がある。補体は、免疫結合体の活発な異化にとっても重要であり、このことは自己免疫および免疫性複合体病の処置にとって補体インヒビターの使用に特に重要な問題である。
補正活性化部位および疾患部位に対する補体インヒビターの標的化は、非常に低い活性血清中濃度を可能にすることができ、有意に全身補体阻害のレベルを低下させることができる。増加した効力は標的化補体インヒビターの重要な利点であり、標的化は循環流動での可溶性組換え補体インヒビターの短い半減期の問題に対処することもできる。
補体インヒビターの標的化に関する上記の考慮すべき問題に加えて、補体経路を選択的にブロックしている異なる部分は、有益な補体活性化産物の生成を可能にすることができるが、疾患原因に関係する補体活性化産物の生成を阻害する。例えば、補体活性化インヒビター（例えば、ＣＲ１、ＤＡＦ、およびＣｒｒｙ）は、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、およびＣ５ｂ−９生成を阻害する。Ｃ５に対する抗体は、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９生成を阻害する。一方では、ＣＤ５９をベースとするインヒビターはＣ３ｂおよびＣ５ａ生成に影響することなく、Ｃ５ｂ−９形成のみをブロックする（図８参照）。終端の補体経路およびＣ５ｂ−９生成は、炎症を促進する際に重要であることが示され、腎臓（例えば免疫結合体性糸球体腎炎）のいくつかの疾患の進行に特に関係する。このように、特定の疾患に対して、ＣＤ５９をベースとするインヒビターは、初期の補体活性化産物の生成を妨げることなく、疾患原因を阻害することができる。初期の補体活性化産物の生成は、宿主防御および免疫結合体クリアランスにとって重要である。しかし、可溶性ＣＤ５９は補体（活性化ＤＡＦ、ＣＲＩ、ＭＣＰ、またはＣｒｒｙのインヒビターとは異なる）の有効なインヒビターでなく、またいかなる臨床応用を持つこともなさそうである。しかし、細胞標的化ＣＤ５９は、実行可能な療法を示すことができる。ＣＤ５９の抗体媒介性標的化（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．ｌｎｖｅｓｔ．，１０３，５５−６１）を用いるデータおよびＣＤ５９のＣＲ２媒介性標的化によって本明細書に表されるデータは、細胞膜に対して標的化されたＣＤ５９が可溶性の非標的化ＣＤ５９よりも著しく活性が高い。
（ｂ）補体活性化因子（癌）
癌免疫療法薬剤としてモノクローナル抗体を活性化させる抗腫瘍補体の当初の予想は、実現されなかった。これの１つの理由は、腫瘍細胞（補体インヒビターは、腫瘍細胞上でしばしば上方制御される）の補体阻害タンパク質の発現である。このように、特定の抗体がヒトで腫瘍を標的として、腫瘍細胞表面上で補体を活性化させることが示されたにもかかわらず、腫瘍細胞は補体媒介性破壊を阻止する。抗体療法に耐性の腫瘍での補体インヒビターの重要な役割を示しているインビトロ実験から、多くの証拠が存在する。また、報告（Ｃａｒａｇｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６２，１１１０−１５；Ｃｈｅｎｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０，３０１３−１８；Ｂａｒａｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８２，５２２−８）によれば、生体内に腫瘍細胞の表面で発現される補体インヒビターには補体付着および腫瘍化に関して機能的な影響力があると確認された。腫瘍細胞の上で補体付着を強化することで、腫瘍細胞のより活性の高い免疫媒介クリアランスを可能とし、補体活性化抗腫瘍抗体を用いる良好な免疫療法の見通しが改善される。強化された補体活性化は、腫瘍細胞発現された補体阻害タンパク質を圧倒する。
ｃ）結果−１
（１）標的化補体インヒビター融合タンパク質
前述のようにインビトロでの補体阻害機能について評価され、かつ標的化に対して、発現、生成、および特徴付けされたヒト融合タンパク質の例として、ＣＲ２−ＤＡＦ、ＣＲ２−ＣＤ５９、ＤＡＦ−ＣＲ２、およびＣＤ５９−ＣＲ２が挙げられる。成熟ヒト融合タンパク質のヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を、図８−１１に示す。
（２）発現および精製
融合タンパク質をコードしている相補ＤＮＡプラスミド・構築物（コンストラクト）を、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、安定に発現しているクローンを単離した。最も高レベルで融合タンパク質を発現しているクローンを選択した。選択されたクローンをバイオリアクターで増殖させ、融合タンパク質を親和性クロマトグラフィーによって培養液上清から単離した。親和性カラムの調製は、セファロースに結合した抗ＤＡＦおよび抗ＣＤ５９抗体複合体を使用しておこなった。組換えタンパク質の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット（図２）によっておこなった。
（３）Ｃ３リガンドに対する融合タンパク質の結合
（ａ）フロー・サイトメトリー
フロー・サイトメトリー実験を前述のとおり実施した。フロー・サイトメトリー（図１２）によって分析されるように、ＣＲ２含有融合タンパク質の全てがＣ３被覆ＣＨＯ細胞と結合した。ｓＤＡＦおよびｓＣＤ５９は、 Ｃ３被覆ＣＨＯ細胞と結合しなかった。
（ｂ）ＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）実験を前述のとおり実施した。酵素結合免疫測定法実験では、ＣＲ２を含有する構築物を、精製されたＣ３ｄｇでおおわれているウェルに添加した。結合の検出は、抗補体インヒビター抗体と酵素に結合した二次抗体とによって、おこなった。構築物を含む全てのＣＲ２がＣ３ｄに結合したが、ＣＤ５９およびｓＤＡＦは結合しなかった。
（ｃ）表面プラズモン共鳴
ビオチン化Ｃ３ｄｇ（ＣＲ２リガンド）を、ストレプトアビジン被覆ＢＩＡコア・チップに結合させ、ＣＲ２含有融合タンパク質の結合反応速度を測定した（図１３−１６）。ｓＤＡＦおよびｓＣＤ５９は、捕捉Ｃ３ｄｇと結合しなかった。Ｎ末端にＣＲ２を持つ融合タンパク質は、最も高い親和性で結合した。ＣＤ５９含有融合タンパク質は、対応のＤＡＦ含有融合タンパク質よりも高い親和性で結合した。
（４）融合タンパク質の補体阻害機能
融合タンパク質および可溶性非標的化補体インヒビターの機能的活性を、補体媒介性細胞溶解に対するタンパク質の作用を測定することによって、分析した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（図１７および１８）およびヒツジ赤血球（Ｅ）（図１９および２０）を使用するアッセイを用いた。
標的化補体インヒビターは、可溶性非標的化補体インヒビターよりも補体媒介からのかなり大きい防御を提供した。Ｎ末端にＣＲ２を持つ融合タンパク質は、ＤＡＦ含有融合タンパク質およびＣＤ５９含有融合タンパク質の両方に対して最も有効であった。Ｎ末端ＣＲ２融合タンパク質も、ＢＩＡｃｏｒｅ実験（上記参照）でＣ末端ＣＲ２融合タンパク質よりも高い親和性で、Ｃ３ｄと結合した。ＣＲ２−ＤＡＦは、これらのアッセイで補体媒介性溶解からの防御を提供するという点で、ＣＲ２−ＣＤ５９よりもずっと有効であった。しかし、注目すべきことは、非標的ｓＣＤ５９は、高濃度であっても補体阻害活性が非常に弱かった（ｓＤＡＦとは異なる）。また、細胞表面に対するＣＤ５９の標的化は、ＣＤ５９機能の必要条件である。
ＣＨＯ細胞およびＥに対する標的化補体インヒビターと非標的化補体インヒビターとのあいだの相対的活性は、異なる。しかし、赤血球は、「１回のヒット」（すなわち、単一ＭＡＣの形成がＥ溶解をもたらす）によって溶解する。ところが、有核細胞（例えばＣＨＯ細胞）は、付加的な耐性機構（例えば、ＭＡＣのキャッピングおよび分断）を有し、溶解のために複数のＭＡＣの付着を必要とする。これらの違いは、溶解阻害データが異なることを説明可能であり、ＣＨＯ細胞はインビトロ実験でそれらに対するより生理学的に関連した標的を示す可能性がある。
ｄ）結果−２
（１）標的化補体活性融合／複合体化タンパク質
ヒトＣＲ２−ＩｇＧ１のＦｃを発現および精製し、該フラグメントがインビトロでＣ３オプソニン化細胞を適切に標的化することを示した。ヒトおよびマウスｓＣＲ２（ＣＶＦとの接合のため）とマウス融合タンパク質とをコードする配列を持つ発現プラスミドを調製した。成熟ヒト融合タンパク質のヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を図２１に示す。
（２）発現および精製
ＣＲ２の最初の４つのＳＣＲをコードするｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするゲノム配列に連結した。融合タンパク質をコードするプラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトさせ、安定に発現するクローンを単離した。融合タンパク質の発現が最も高レベルであるクローンを選択した。選択されたクローンをバイオリアクターで増殖させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって、培養液上清から融合タンパク質を単離した。組換えタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２２）およびウエスタン・ブロットによって分析した。タンパク質は、還元および非還元条件で期待される分子量で移動した（ＣＲ２−Ｆｃはジスルフィド結合ダイマー）。ＣＲ２−マウスＩｇＧ３をコードするマウス・プラスミド・構築物を構築した。
（３）Ｃ３リガンドに対する融合タンパク質の結合
（ａ）フロー・サイトメトリー
フロー・サイトメトリーで分析したように、Ｃ３被覆ＣＨＯ細胞に対してＣＲ２−Ｆｃが結合した（図２３）。
（ｂ）ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ実験では、精製Ｃ３ｄｇに被覆されたウエルに、ＣＲ２−Ｆｃを添加した。結合は、抗ヒトＦｃ抗体および酵素結合二次抗体とによって、検出した。ＣＲ２−ＦｃはＣ３ｄに結合した。
（ｃ）表面プラズモン共鳴
ビオチン化Ｃ３ｄｇ（ＣＲ２リガンド）をストレプトアビジン被覆ＢＩＡコア・チップに結合させ、ＣＲ２−Ｆｃの結合を示した（図２４）。
３．実施例３
（ａ）急性尿細管間質性損傷のラット・モデルの抗体標的化補体インヒビター：
よく特徴づけられたマウス抗ラット腎臓モノクローナル抗体のパネルが、使われた（４９、５０、これらの抗体および該抗体の配列に関するそれらの教示について本明細書に援用する）。合計５つの抗体からの可変部ＤＮＡを、標準のＰＣＲ技術によって単離した（３５、ＰＣＲに関する教示のために参照によって本明細書に援用）。全てがうまくクローン化され、いくつかが単一鎖抗体として発現された。全ての単一鎖抗体は、インビトロで上皮性ラット腎臓または内皮細胞系を認識した。ｍＡｂｓ（Ｋ９／９）のうちの１つは、上皮細胞表面で同定された糖タンパク質と結合して、インビトロで糸球体毛細血管壁および近位尿細管に対する特異性を持つ（４９）。この抗体は、急性尿細管間質性損傷のラット・モデルで、標的とされたＣｒｒｙおよびＣＤ５９によって媒介される補体阻害の検討のために、標的化ビヒクルとして選択された。Ｋ９／９ｍＡｂが前の検査（４９）において、糸球体障害を誘発することが示されたにもかかわらず、フロイント・アジュバントと共に投与される場合、抗体は病原性を示すだけであった。実際に、Ｋ９／９ｍＡｂ（アジュバントとともに）の病原性は、再現されなかった。
タンパク尿症と進行性腎臓障害とのあいだに関連があり、データがタンパク尿症自体が間質性線維症と炎症に帰着するという仮説を支持する。タンパク尿症が腎毒性損傷をもたらす機構は、知られていない。しかし、補体が重要な役割を演ずるという証拠があり、しかもＭＡＣは、タンパク尿症による尿細管間質性損傷の主要な媒体である。（尿細管間質性損傷の補体およびタンパク尿症の役割は、最近調べられている（５１、５２））。既になされたＫ９／９ｍＡｂ（（４９）より上にわかる）の特徴付けが示唆することは、タンパク尿症によって誘導されるラット・モデル尿細管間質性損傷において、ｍＡｂが標的化補体インヒビターの治療的使用に対する調査に対して適当に標的することである。特異的にＭＡＣ形成をブロックすることができるインヒビターの有効性は、臨床的に関連した状態のもとで、尿細管間質性損傷でＭＡＣの役割の評価を可能にする。
ラットＣｒｒｙまたはラットＣＤ５９に連結した単鎖のＫ９／９抗体をコードするプラスミド・構築物を調製した（図２７に示す）。可溶性ラットＣｒｒｙ（ｓＣｒｒｙ）と単鎖Ｋ９／９（標的化ビヒクルのみ）とを発現する構築物も調製した。全ての組換えタンパク質は、１５リットルのＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｋファーメターでのピチア発酵により、１５ｍｇ／リットル以上で培地に発現された。
組換えタンパク質を、上記したようにインビトロでの標的化および補体阻害活性についてラット上皮細胞系統を標的細胞として、特徴付けした。単鎖のＫ９／９、Ｋ９／９−Ｃｒｒｙ、およびＫ９／９−ＣＤ５９は、特にインビトロでラット上皮細胞に結合した。ｓＣｒｒｙおよびＫ９／９−Ｃｎｙは補体付着および溶解を阻害し、さらにＫ９／９−ＣＤ５９は補体媒介性溶解を阻害した。標的化補体インヒビター（ｓＣｒｒｙおよびＫ９／９）両方の単鎖抗体を、ラット・ピューロマイシン・アミノヌクレオシド（ＰＡＮ）ネフローゼ・モデル（５３、ｓＣｒｒｙおよびＫ９／９に関する教示のため本明細書に援用する）（非標的化ＣＤ５９がかなり劣った補体阻害活性（５４）のみを持つことから、ｓＣＤ５９は評価されなかった）で特徴づけした。最初に、Ｋ９／９融合タンパク質の腎臓標的化を確認するために、インビボの結合特異性を、上記したように、ヨウ素化タンパク質の生体内分布によって決定した（５４、４１）。単一鎖Ｋ９／９およびＫ９／９融合タンパク質（しかし、Ｃｒｒｙでない）は、特異的にラット腎臓を標的とし、投与後４８時間検出可能であった（図２８）。投与後２４時間での生体内分布は類似しており、２４時間で血中に残る放射標識がみとめられなかった。
治療上の研究において、４匹のラットからなる群に０日目にＰＡＮ（１５０ｍｇ／ｋｇ）投与し、ＰＢＳまたは補体インヒビター（４０ｍｇ／ｋｇ）を４、７、および１０日目に投与した。尿（代謝ケージ）および血液を回収し、動物を１１日目に犠牲にした。ＰＡＮ処理によって、クレアチン・クリアランス（図２９、左から２番目の棒）によって測定されたように、腎臓機能を著しく損ねた。しかし、ｓＣｒｒｙ治療を受けているラットの腎臓機能に顕著な改善はない。しかし、クレアチン・クリアランスは標的化されたＣｒｒｙまたはＣＤ５９の治療を受けているＰＡＮ処置されたラットで、かなり改良された（ｐ＜０．０１）。対照（非タンパク尿）ラットと標的化インヒビターのいずれかを投与されたＰＡＮ処理ラットとのあいだのクリアチン・クリアランスに関して著しい差は、みとめられなかった（図２９）。期待どおりに、補体インヒビターで処理を受けたかどうかにかかわりなく、ＰＡＮ誘導タンパク尿は全てのマウスで高レベルであった（表１）。ＰＡＮ処理を受けたラットおよび治療を受けていないラットから調製した腎臓切片は、刷子縁（図３０ｂ参照、また添付物において）の損失によって評価されるように、それは尿細管内腔の膨張ならびに尿細管変性および上皮細胞変性を示した。最小限の改善は、ｓＣｒｒｙ療法（図３０ｄ）で理解できた。対照的に、尿細管膨張と変性は、標的化されたＣｒｒｙおよびＣＤ５９（図３０ｃはＫ９／９−Ｃｒｒｙを示す、しかし、組織学的にはＫ９／９−ＣＤ５９と見分けがつかなかった）の投与を受けたＰＡＮ治療をうけているラットで、かなり阻害された。これらのデータは、このモデルでは補体阻害の効果を示し、標的対非標的補体阻害の著しい利点を示し、またタンパク尿によって誘発された尿細管間障害でのＭＡＣ媒介障害に対しての重要な役割を示す。ｓＣＤ５９は有効なインヒビターでなく、本研究は適切に標的化されたＣＤ５９がインビボでＭＡＣの特異的阻害を可能にすることを証明する。
別の実験では、ヨウ素標識組換えタンパク質の循環半減期を、記載されているようにして測定した（５４、４１、教示されている技術に関して本明細書では援用）。タンパク質の半減期（ｔ１／２）は、以下の通りである。すなわち、ｓＣｒｒｙ；１９分、Ｋ９／９−Ｃｒｒｙ；２３分、Ｋ９／９−ＣＤ５９、２９分、単一鎖Ｋ９／９；２１分であった。全身性補体阻害に対する組換えタンパク質の効果を決定するために、ラットに対して４０ｍｇ／ｋｇでタンパク質を注射し、１、３、５、および７ｘｔ１／２によって決められた時間で血液の回収をおこなう。血清での補体阻害活性は、溶血性活性（感作ヒツジ赤血球）で測定した。期待されるように、Ｋ９／９−ＣＤ５９は、血清（非標識アッセイ・システム）（図３１）で、最小の阻害活性を持った。ｓＣｒｒｙおよびＫ９／９−Ｃｒｒｙの注射後約３時間（７ｘ ｔｌ／２）まで、血清中に残っている最小の補体阻害活性があった。標的および非標的インヒビター（生体内分布データとともに）の短いｔ１／２と、ｓＣｒｒｙが保護的ではないという事実とが、腎臓結合補体インヒビターが補体を局所的および長時間にわたって、補体を阻害するという点で有効であることを示す。
これらのデータはインビボでの標的化補体インヒビターの使用を確立して、疾患のモデルで、非標的化された全身補体阻害に対する標的化全身補体阻害の重要な利点を示す。異なる標的化ビヒクルが本研究（抗体フラグメント）で使われるにもかかわらず、同じ原理は他の標的化ビヒクル（例えばＣＲ２）に対して適用される。
４．実施例４
本明細書中に教示に従って作られる本発明の構築物の例は、本明細書中に開示される。使用する用語は、以下のような意味を持つ。すなわち、ＳＣＲ＝ショート・コンセンサス・リピート、ＬＰ＝リーダー・ペプチドである。構築物は、全てＣＲ２−リンカー−補体調節因子または補体調節因子−リンカー−ＣＲ２の基本式を持つ。括弧内の表記は、組成物に関する特定のセクションで具体的に説明される。例えば、「（完全）」とは成熟タンパク質全体が構築物として利用されることで、一方「（ＳＣＲ２−４）」はＳＣＲ１が構築物の一部ではないことを示している。リンカーがキメラリンカー、天然のリンカーペプチド、またはアミノ酸連結配列（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）である。このリストが限定されるものではなく、本出願で開示された構築物のいくつかの例を提供するだけであると、理解される。
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＤＡＦ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ＭＣＰ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ＣＲＩ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ヒト ＩｇＧＩ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４−ＤＡＦ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ＭＣＰ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ＣＲ１
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ ―ヒト ＩｇＧＩ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （完全）−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＤＡＦ （ＳＣＲ ２−４）
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ＤＡＦ （ＳＣＲ ２−４）
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＣＲＩ （ＬＰ−ＳＣＲＩ−４−ＳＣＲ８−１１−ＳＣＲ１５−１８）
ＣＲ２ （完全）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−Ｃｒｒｙ （５ Ｎ末端 ＳＣＲ）

ＣＲ２ （完全）− ＶＳＶＦＰＬＥ−ＤＡＦ
ＣＲ２ （完全）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （完全）− ＶＳＶＦＰＬＥ−ＭＣＰ
ＣＲ２ （完全）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ＣＲ１
ＣＲ２ （完全）− ＶＳＶＦＰＬＥ−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （完全）− ＶＳＶＦＰＬＥ −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （完全）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ヒト ＩｇＧｌ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− ＶＳ ＶＦＰＬＥ −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− ＶＳＶＦＰＬＥ −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （完全）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ＤＡＦ
ＣＲ２ （完全）−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ヒト−ＣＤ５９
ＣＲ２ （完全）−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ＭＣＰ
ＣＲ２ （完全）−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル -ＣＲＩ
ＣＲ２ （完全）−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （完全）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル
−マウス−ＣＤ５９
ＣＲ２ （完全）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル
−ヒト ＩｇＧｌ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ネズミ ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル
−マウス ＩｇＭ ＰＣ
ＣＲ２ （完全）−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ＣＶＦ
ＣＲ２ （完全）− ビスマレイミドヘキサン−ＤＡＦ
ＣＲ２ （完全）− ビスマレイミドヘキサン −ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （完全）− ビスマレイミドヘキサン−ＭＣＰ
ＣＲ２ （完全）− ビスマレイミドヘキサン −ＣＲ１
ＣＲ２ （完全）− ビスマレイミドヘキサン−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （完全）− ビスマレイミドヘキサン −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （完全）−ビスマレイミドヘキサン −ヒト ＩｇＧｌ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− ビスマレイミドヘキサン ヒト １ｇＭ ＦＣ
ＣＲ２ （完全）− ビスマレイミドヘキサン −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （完全）− ビスマレイミドヘキサン −マウス ＩｇＭ Ｆｃ ＣＲ２ （完全）− ビスマレイミドヘキサン −ＣＶＦ


ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３−ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１ −２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −ＣＲＩ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −ヒト ＩｇＧｌ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ ３ Ｓｅｒ） ４ −ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４−ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ヒト ＩｇＧｌ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３−ＤＡＦ （ＳＣＲ ２−４）
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）−（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ ＤＡＦ （ＳＣＲ ２−４）
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＣＲＩ （ＬＰ−ＳＣＲ１−４−ＳＣＲ８−１１−ＳＣＲ１５−１８）
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−Ｃｒｒｙ （５ Ｎ末端 ＳＣＲ）
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ＶＳＶＦＰＬＥ−ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ＶＳＶＦＰＬＥ−ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ＶＳＶＦＰＬＥ−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ＶＳＶＦＰＬＥ −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ヒト ＩｇＧ１ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ＶＳＶＦＰＬＥ −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ＶＳＶＦＰＬＥ −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ＤＡＦ

ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ヒトＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル -ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲＩ−２）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −マウスＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１ −２）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１ −２）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル -ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）−ビスマレイミドヘキサン−ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）−ビスマレイミドヘキサン −ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ビスマレイミドヘキサン−ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１ −２）−ビスマレイミドヘキサン−ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）−ビスマレイミドヘキサン−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ビスマレイミドヘキサン −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）−ビスマレイミドヘキサン −ヒト ＩｇＧＩ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ビスマレイミドヘキサン −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）−ビスマレイミドヘキサン −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ビスマレイミドヘキサン −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−２）− ビスマレイミドヘキサン−ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３−ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −ＭＣＰ


ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −ヒト ＩｇＧ１ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４ −ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４ −ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４ −ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４ −ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲ１ −３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４ −Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４−マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４ −ヒト ＩｇＧｌ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１ −３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４ −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４ −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４ −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ＤＡＦ （ＳＣＲ ２−４）
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇ１ｙ３Ｓｅｒ）４ −ＤＡＦ （ＳＣＲ ２−４）
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＣＲ１ （ＬＰ−ＳＣＲ１−４−ＳＣＲ８−１１−ＳＣＲ１５−１８）
ＣＲ２ （ＳＣＲ １−３）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−Ｃｒｒｙ （５ Ｎ末端 ＳＣＲ）
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ＶＳＶＦＰＬＥ−ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ＶＳＶＦＰＬＥ−ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１ −３）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ＶＳＶＦＰＬＥ−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ＶＳＶＦＰＬＥ −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ヒト ＩｇＧ１ Ｆｃ

ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− Ｖ ＳＶＦＰＬＥ −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ＶＳＶＦＰＬＥ−マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ＶＳ ＶＦＰＬＥ −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ヒトＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）−ｍ− マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル -ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −マウスＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１ −３）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）−ｎｒ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ビスマレイミドヘキサン−ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ビスマレイミドヘキサン −ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲＩ−３）− ビスマレイミドヘキサン−ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ビスマレイミドヘキサン -ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ビスマレイミドヘキサン−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ビスマレイミドヘキサン −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）−ビスマレイミドヘキサン ヒト ＩｇＧ１ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ビスマレイミドヘキサン −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）−ビスマレイミドヘキサン−マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ

ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）− ビスマレイミドヘキサン−マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−３）−ビスマレイミドヘキサン −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲＩ−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ヒト ＩｇＧＩ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ヒト ＩｇＧ１ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ヒト １ｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ＤＡＦ （ＳＣＲ ２−４）
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４ ＤＡＦ （ＳＣＲ ２−４）
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −ＣＲ１ （ＬＰ−ＳＣＲＩ−４−ＳＣＲ８−１１−ＳＣＲ１５−１８）
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ −Ｃｒｒｙ （５ Ｎ末端 ＳＣＲ）
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ＶＳＶＦＰＬＥ−ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ヒト ＣＤ５９


ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ＶＳＶＦＰＬＥ−ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ＣＲ１
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ＶＳＶＦＰＬＥ−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ＶＳＶＦＰＬＥ −マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ヒト ＩｇＧ１ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ＶＳＶＦＰＬＥヒトＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ＶＳＶＦＰＬＥ −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ＶＳＶＦＰＬＥ−マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ＶＳＶＦＰＬＥ −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ヒトＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ＣＲＩ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −マウスＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル−ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドキシスクシニミド・エステル −ＣＶＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ビスマレイミドヘキサン−ＤＡＦ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）−ビスマレイミドヘキサン−ヒト ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ビスマレイミドヘキサン−ＭＣＰ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）−ビスマレイミドヘキサン−ＣＲ１


ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）−ビスマレイミドヘキサン−Ｃｒｒｙ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）−ビスマレイミドヘキサン−マウス ＣＤ５９
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）−ビスマレイミドヘキサン−ヒト ＩｇＧｌ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ビスマレイミドヘキサン −ヒト ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）−ビスマレイミドヘキサン−マウス ＩｇＧ３ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ビスマレイミドヘキサン −マウス ＩｇＭ Ｆｃ
ＣＲ２ （ＳＣＲ１−４）− ビスマレイミドヘキサン −ＣＶＦ
（Ｈ．配列）
１．ＤＡＦ
ヌクレオチド配列は、配列番号１に対応する。
アミノ酸配列は、配列番号２に対応する。
２．ＣＤ５９
ヌクレオチド配列は、配列番号３に対応する。
アミノ酸配列は、配列番号４に対応する。
３．ＣＲ２−ＤＡＦ
ヌクレオチド配列は、配列番号５に対応する。
アミノ酸配列は、配列番号６に対応する。
４．ＣＲ２−ヒトＣＤ５９
ヌクレオチド配列は、配列番号７に対応する。
アミノ酸配列は、配列番号８に対応する。
５．ＤＡＦ−ＣＲ２
ヌクレオチド配列は、配列番号９に対応する。
アミノ酸配列は、配列番号１０に対応する。
６．ヒトＣＤ５９−ＣＲ２
ヌクレオチド配列は、配列番号１１に対応する。
アミノ酸配列は、配列番号１２に対応する。
７．ＣＲ１
ヌクレオチド配列は、配列番号１３に対応する。
アミノ酸配列は、配列番号１４に対応する。
８．ＭＣＰ
ヌクレオチド配列は、配列番号１５に対応する。
アミノ酸配列は、配列番号１６に対応する。
９．マウスＣｒｒｙ
アミノ酸配列は、配列番号１７に対応する。
１０．ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ
アミノ酸配列は、配列番号１８に対応する。
１１．ヒトＩｇＭ Ｆｃ
アミノ酸配列は、配列番号１９に対応する。
１２．ＣＲ２−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ
ヌクレオチド配列は、配列番号２０に対応する。
アミノ酸配列は、配列番号２１に対応する。
１３．マウスＩｇＧ３ Ｆｃ
アミノ酸配列は、配列番号２２に対応する。
１４．コブラ毒因子
ヌクレオチド配列は、配列番号２３に対応する。
アミノ酸配列は、配列番号２４に対応する。
１５．ヒトＣＲ２
ヌクレオチド配列は、配列番号２５に対応する。
アミノ酸配列は、配列番号２６に対応する。
１６．マウスＣＲ２
ヌクレオチド配列は、配列番号２７に対応する
アミノ酸配列は、配列番号２８に対応する。
１７．ヒトＣＲ２
アミノ酸配列は、配列番号２９に対応する。
添付した図面は、この明細書に組み込まれ、かつ該明細書の一部を構成するものであり、本発明のいくつかの実施形態を図示し、説明とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。
図１は、ＣＲ２−補体インヒビター融合タンパク質の例の図を示す。 図２は、精製組換え融合タンパク質および可溶性補体インヒビターのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロット分析を示す。ゲル（１０％アクリルアミド）をクーマシーブルー染色した。一次抗体として補体インヒビターに対する抗体を用いて、ウエスタン・ブロットを展開させた。 図３は、Ｃ３オプソニン化ＣＨＯ細胞に対する組換え融合タンパク質の結合を示す。抗体感作ＣＨＯ細胞をＣ６欠乏培地で培養し、洗浄し、そして可溶性補体インヒビター（黒色トレース）またはＮ末端（明灰色トレース）もしくはＣ末端（暗灰色トレース）にＣＲ２を有する融合タンパク質２０μｇ／ｍｌで培養した。組換えタンパク質の細胞結合は、抗ＤＡＦまたは抗ＣＤ５９ｍＡｂを用いたフロー・サイトメトリーによって検出した。補体インヒビターのかわりにＰＢＳでＣＨＯ細胞を培養することで、ｓＤＡＦおよびｓＣＤ５９に類似の蛍光プロフィールが得られた。別々におこなった３回の実験の代表例。 図４は、ＣＲ２融合タンパク質とＣ３ｄとのあいだの相互作用の表面プラズモン共鳴による分析を示す。図＿［図番が欠落しているようである］に示すように、実線は異なる濃度のＣＲ２融合タンパク質を示す。破線は、１：１ラングミュア結合モデルに合った曲線を示す。 図５は、組換えｓＤＡＦおよびＤＡＦ融合タンパク質による補体媒介性溶解の阻害を示す。抗体感作ＣＨＯ細胞（パネルａ）またはヒツジ赤血球（パネルｂ）を組換えタンパク質と１０％ヒト血清（ＣＨＯ細胞）または０．３３％ヒト血清（赤血球）ともに培養した。これらの濃度は、非保護細胞を約９０％溶解させるものであった。溶解の測定は、３７℃で４５分間培養した後におこなった。熱不活化血清での細胞の培養によって測定したバックグラウンドの溶解は５％未満であり、それを差し引いた。平均値±標準偏差（ＳＤ）、ｎ＝４。 図６は、組換えｓＣＤ５９およびＣＤ５９融合タンパク質による補体媒介性溶解の阻害を示す。抗体感作ＣＨＯ細胞（パネルａ）またはヒツジ赤血球（パネルｂ）を組換えタンパク質と１０％ヒト血清（ＣＨＯ細胞）または０．３３％ヒト血清（赤血球）ともに培養した。これらの濃度は、非保護細胞を約９０％溶解させるものであった。溶解の測定は、３７℃で４５分間培養した後におこなった。熱不活化血清での細胞の培養によって測定したバックグラウンドの溶解は５％未満であり、それを差し引いた。平均値±標準偏差（ＳＤ）、ｎ＝４。 図７は、Ｕ９３７細胞付着に対する組換え融合タンパク質の作用を示す。ヒツジ赤血球をＩｇＭ抗体で感作し、Ｃ６欠乏血清で培養した。Ｃ３オプソニン化赤血球を、５００ｎＭ組換え融合タンパク質またはＰＢＳの存在下で、Ｕ９３７と同時培養した。培養後、一赤血球あたりの結合Ｕ９３７細胞数の平均値を顕微鏡で測定した。平均値±標準偏差（ＳＤ）、ｎ＝３。 図８は、成熟ヒトＣＲ２−ＤＡＦのヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列を示す。下線を引いたアミノ酸は、ＣＲ２とＤＡＦとのあいだの結合配列を表す。 図９は、成熟ヒトＣＲ２−ＣＤ５９のヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列を示す。下線を引いたアミノ酸は、ＣＲ２とＣＤ５９とのあいだの結合配列を表す。 図１０は、成熟ヒトＤＡＦ−ＣＲ２のヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列を示す。下線を引いたアミノ酸は、ＤＡＦとＣＲ２とのあいだの結合配列を表す。 図１１は、成熟ヒトＣＤ５９−ＣＲ２のヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列を示す。下線を引いたアミノ酸は、ＣＤ５９とＣＲ２とのあいだの結合配列を表す。 図１２は、Ｃ３被覆ＣＨＯ細胞に対するＣＲ２含有融合タンパク質の標的化を示す。Ｃ３リガンドは、１０％抗ＣＨＯ抗血清および１０％Ｃ６欠乏ヒト血清での細胞の培養によって、ＣＨＯ細胞上に生成される（膜攻撃複合体の形成および細胞溶解を防ぐために）。細胞を洗い、融合タンパク質とともに培養する（２０μｇ／ｍｌ、４℃、３０分）。結合の検出は、適当な補体インヒビター（ＤＡＦまたはＣＤ５９）に対する抗体を用いたフロー・サイトメトリー法でおこなった。黒線：対照（融合タンパク質なし）、淡灰色：Ｃ端末にＣＲ２、濃灰色：Ｎ末端にＣＲ２。 図１３は、表面プラズモン共鳴によるＣ３ｄｇに対するＣＲ２−ＤＡＦ結合の分析を示す。 図１４は、表面プラズモン共鳴によるＣ３ｄｇに対するＣＲ２−ＣＤ５９結合の分析を示す。 図１５は、表面プラズモン共鳴によるＣ３ｄｇに対するＤＡＦ−ＣＲ２結合の分析を示す。 図１６は、表面プラズモン共鳴によるＣ３ｄｇに対するＣＤ５９−ＣＲ２結合の分析を示す。 図１７は、補体の媒介によるＣＨＯ細胞の溶解に対する標的および非標的ＤＡＦの作用を示す。ＣＨＯ細胞を、抗ＣＨＯ抗血清（１０％濃度、４℃、３０分）により補体に対して感作させ、補体阻害タンパク質濃度を変えながら引き続いて１０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）により培養した（３７℃、６０分）。つぎに、細胞溶解は、トリパン・ブルー排除アッセイによっておこなった。平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す典型例である。異なる融合タンパク質試料を用いて３つの別々の実験をおこなった。 図１８は、補体の媒介によるＣＨＯ細胞の溶解に対する標的および非標的ＣＤ５９の作用を示す。分析は、図１７の説明に記載したようにおこなった。平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す典型例である。異なる融合タンパク質試料を用いて３つの別々の実験をおこなった。 図１９は、補体媒介性溶血に対する標的および非標的ＤＡＦの作用を示す。ヒツジ赤血球（Ｅ）は、抗ヒツジＥ抗体によって感作され、その後補体阻害タンパク質の濃度を変化させながらＮＨＳ（３７℃、６０分）の１／３００倍希釈により培養される。細胞溶解の判断は、放出されたヘモグロビン（吸光度４１２ｎｍ）を測定することでおこなった。平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す典型例である。融合タンパク質試料が異なる２つの別々の実験をおこなった。 図２０は、補体媒介性溶血に対する標的および非標的ＣＤ５９の作用を示す。分析は、図１９の説明に記載したようにおこなった。平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す典型例である。融合タンパク質試料が異なる２つの別々の実験をおこなった。 図２１は、成熟ヒトＣＲ２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃのヌクレオチドおよび予測アミノ酸を示す。下線が引かれたアミノ酸は、ＣＲ２領域とＦｅ領域とのあいだの連結配列を表す。発現プラスミドは、ゲノムＦｅ領域（ヒンジ−イントロン−ＣＨ２−イントロン−ＣＨ３）を含む。 図２２は、ＣＲ２−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。精製ＣＲ２−Ｆｃを非還元（レーン１）または還元（レーン２）状態で泳動させた。ゲルをクマシー・ブルー染色した（レーン３のマーカーの分子量（ＭＷ）について。図２を参照）。 図２３は、ＣＲ２−ＦｃがＣ３被覆ＣＨＯ細胞を標的化している図である。Ｃ３リガンドは、説明どおりに生成された（図１２の説明）。細胞を洗い、ＣＲ２−Ｆｃ（２０μｇ／ｍｌ、４℃、３０分）とともに培養した。結合は、ＦＩＴＣに接合したヒトＦｃに対する抗体を用いたフロー・サイトメトリー法によって検出される。上側の図面は、ＣＲ２−ＦｃをＣ３被覆ＣＨＯ細胞とともに培養した場合に得られた結果を示し、下側の図面はＣＲ２−Ｆｃを対照ＣＨＯ細胞とインキュベートした場合に得られた結果が示されている。 図２４は、チップに固相化されたＣ３ｄリガンドに対するＣＲ２−Ｆｃの結合を示す表面プラズモン共鳴センサーグラムを示す。 図２５は、週齢３４週のＮＺＢ／Ｗマウスでの１２５Ｉ−ＣＲ２−ＤＡＦおよび１２５Ｉ−ｓＤＡＦの生体分布を示す。放射性標識タンパク質を尾静脈に注射し、放射標識の生体内分布を２４時間後に測定した。各タンパク質をマウス２匹に注射した。 図２６は、週齢２４週のＭＲＬ／ｌｐｒマウスの糸球体に結合したＣＲ２−ＤＡＦの画像を示す。ＣＤ２−ＤＡＦ（ａ）およびｓＤＡＦ（ｂ）の糸球体結合を、各タンパク質の尾静脈注射後、２４時間目に分析した。図は、腎臓切片を免疫蛍光によって染色した際を示す。 図２７は、単一鎖抗体Ｃ５９−Ｃｒｒｙ構築物を示す。図は、構築物を示し、ｋ９／９ｍＡｂ由来の可変軽鎖（ＶＬ）と可変重鎖（ＶＨ）とを含む。構築物を、酵母発現ベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に調製した。 図２８は、ラットでの補体阻害性因子およびＫ９／９単一鎖Ａｂの生体内分布を示す。ヨウ素標識組換えタンパク質は、ＰＡＮ処置４日後に投与し、器官の放射活性を４８時間後に測定した。 図２９は、ＰＡＮによる処置を受け、指示された治療を受けたラットのクレアチニン・クリアランスを示す（ｎ＝４、±ＳＤ）。 図３０は、ＰＡＳ染色腎皮質を示す。図３０Ａは無ＰＡＮ対照、図３０ＢはＰＢＳ処置のＰＡＮ、図３０Ｃは標的Ｋ９／９Ｃｒｒｙ処置のＰＡＮ、および図３ＤはｓＣｒｒｙ処置のＰＡＮを示す。 図３１は、組換えタンパク質投与後の血清の補体阻害活性を示す。感作ヒツジ赤血球の溶解によって測定。阻害活性率は、対照ラット由来の血清に対する割合である

Claims (33)

  1. 構築物を含む、補体活性を阻害するための組成物であって、該構築物が：
    （ａ）ＣＲ２またはＣＲ２タンパク質の少なくとも最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含むフラグメント、および
    （ｂ）補体インヒビターまたはそのフラグメントであって、該補体インヒビターまたはそのフラグメントは、ＤＡＦのＳＣＲ１〜４、ＤＡＦのＳＣＲ２〜４、ＣＤ５９の細胞外領域、ＣｒｒｙのＳＣＲ１〜５、ＭＣＰのＳＣＲ１〜４、ＣＲ１のＳＣＲ１〜３０、ＣＲ１のリーダーペプチド、ＣＲ１のＳＣＲ１〜４、ＣＲ１のＳＣＲ８〜１１、ＣＲ１のＳＣＲ１５〜１８、ＣＲ１のＣ１ｑ結合部位、または抗Ｃ５抗体を含む、補体インヒビターまたはそのフラグメント
    を含む、組成物。
  2. 前記ＣＲ２またはそのフラグメントが、全長のＣＲ２タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＣＲ２またはそのフラグメントが、ＣＲ２タンパク質の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記構築物が融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記ＣＲ２またはそのフラグメントが、前記補体インヒビターまたはそのフラグメントのＮ末端に融合されている、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記ＣＲ２またはそのフラグメントが、前記補体インヒビターまたはそのフラグメントのＣ末端に融合されている、請求項４に記載の組成物。
  7. 前記構築物が免疫結合体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記補体インヒビターが崩壊促進因子（ＤＡＦ）の最初の４つのＳＣＲドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記構築物が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４および６〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 前記構築物が配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５および７のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントがＣＤ５９を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記構築物が配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４および６〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 前記構築物が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５および７のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントがマウスＣＤ５９またはヒトＣＤ５９を含む、請求項１１に記載の組成物。
  15. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントがＣＤ５９の細胞外領域を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントがＣｒｒｙを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 前記構築物が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントがＣｒｒｙの最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントが、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）の最初の４つのＮ末端ＳＣＲを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントが、補体レセプター１（ＣＲ１）の最初の３０のＳＣＲを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントが、補体レセプター１（ＣＲ１）のリーダーペプチドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントが、補体レセプター１（ＣＲ１）のＳＣＲ１〜４を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントが、補体レセプター１（ＣＲ１）のＳＣＲ８〜１１を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントが、補体レセプター１（ＣＲ１）のＳＣＲ１５〜１８を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントが、補体レセプター１（ＣＲ１）のＣ１ｑ結合部位を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントが、ＤＡＦを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントが、ＭＣＰを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記補体インヒビターまたはそのフラグメントが、ＣＲ１を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 被験体において補体によって影響を受ける状態を処置するための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 前記状態が炎症状態である、請求項２９に記載の組成物。
  31. 補体媒介性障害を減少させるための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
  32. 前記炎症状態が脳卒中である、請求項３０に記載の組成物。
  33. 前記炎症状態が虚血性再灌流傷害である、請求項３０に記載の組成物。
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