ES2651521T3

ES2651521T3 - Inhibidores proteicos de las rutas del complemento y de VEGF y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2651521T3
Application number: ES12853600.0T
Authority: ES
Inventors: Jeng-Horng Her; Huang-Tsu Chen
Original assignee: Innovent Biologics Inc; AP Biosciences Inc
Current assignee: Innovent Biologics Inc; AP Biosciences Inc
Priority date: 2011-12-01
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2032-11-30
Also published as: EP2785744B1; EP2785744A1; AU2012318288A1; DK2785744T3; BR112014013205A2; CA2857168C; WO2013082563A8; US20180312819A1; EP2785744A4; US9988611B2; JP2015500811A; CN104159926A; JP6138815B2; US20150079084A1; CN104159926B; CA2857168A1; US11518984B2; CN110078831A; JP2017189167A; WO2013082563A1

Abstract

Una proteína de fusión que comprende: (a) un dominio inhibidor del complemento (CID), un dominio inhibidor de VEGF (VID) y un dominio prolongador de la semivida, o (b) desde el extremo N al extremo C, un dominio inhibidor de VEGF (VID), una región Fc de inmunoglobulina y un dominio inhibidor del complemento (CID), en la que, en cada caso, la proteína de fusión inhibe la activación del complemento y la actividad de VEGF.

Description

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DESCRIPCION

Inhibidores proteicos de las rutas del complemento y de VEGF y metodos de uso de los mismos Referenda a solicitudes de patente relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos n.° de serie 61/629.932, presentada el 1 de diciembre de 2011.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a protelnas de fusion biespeclficas que inhiben la activacion de la ruta del complemento y del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, vascular endothelial growth factor), a composiciones que comprenden estas protelnas de fusion as! como a metodos para producir y utilizar las mismas.

Antecedentes de la invencion

El sistema del complemento es un efector funcional del sistema inmunitario innato que consiste en diversas protelnas plasmaticas y en protelnas de la membrana celular. La activacion del complemento conduce a una serie de cascadas de activacion de proteasas que desencadenan la liberation de citocinas y la amplification de la cascada de activacion. El resultado final de la activacion del complemento es la activacion del complejo de ataque a membrana (MAC, membrane attack complex) causante de la muerte celular, inflamacion causada por las anafilatoxinas C3a y C5a y opsonization de patogenos. El MAC es esencial para eliminar patogenos invasores y celulas danadas, necroticas y apoptoticas.

El sistema del complemento debe conseguir un equilibrio delicado entre la defensa contra patogenos y el evitar un exceso de inflamacion (Ricklin, D., et al., (2007). Nature Biotechnology, 25(11): 1265 - 1275). Se ha demostrado que muchas enfermedades inflamatorias, autoinmunitarias, neurodegenerativas e infecciosas, estan asociadas a una actividad excesiva del complemento. Por ejemplo, la patogenesis debida a lesion por isquemia/reperfusion (I/R) ha indicado que la activacion del complemento conduce a dano inducido por inflamacion en diversas enfermedades, entre las cuales se incluye el infarto agudo de miocardio (AMI, acute myocardial infarction), accidente cerebrovascular, choque hemorragico y septicemico y complicaciones a consecuencia de cirugla de injerto de derivation aortocoronaria (CABG, coronary artery bypass grafting) (Markiewski, M.M., et al, (2007). Am. J. Pathol. 171: 715-727). Ademas, la activacion del complemento es un importante factor causante de diversas enfermedades autoinmunitarias, entre las que se incluyen lupus eritematoso sistemico, Manderson, A.P., et al, (2004). Annu. Rev. Immunol. 22: 431 - 456), artritis reumatoide (RA, Rheumatoid Arthritis), psoriasis y astma (Guo, R.F., et al, (2005). Annu. Rev. Immunol. 23: 821 - 852). La activacion del complemento tambien se ha correlacionado con la patologla de la enfermedad de Alzheimer (Bonifati, D.M., et al, (2007). Mol. Immunol. 44: 999 - 1010) y con otras enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson y la degeneration macular relacionada con la edad (AMD, age-related macular degeneration) (Gehrs, K.M., (2010). Arch. Ophthalmol., 128 (3): 249 - 258).

El sistema del complemento puede activarse a traves de tres rutas diferentes: la ruta clasica, la ruta alternativa y la ruta de la lectina. Las tres rutas atraviesan complejos de proteasa crlticos de C3-convertasa y C5-convertasa que escinden componentes del complemento C3 y C5, respectivamente. La ruta clasica se inicia a traves de la union de C1q a anticuerpos de IgM o IgG lo que conduce a la activacion del complejo C1 que escinde los componentes del complemento C2 y C4, produciendo C2a, C2b, C4a y C4b. Por tanto, C4b y C2b forman la ruta clasica de C3- convertasa, que promueve la escision de C3 en C3a y C3b. Despues, C3b forma la C5-convertasa uniendose a C4bC2b (la C3 convertasa). La ruta de la lectina es identica a la ruta clasica aguas abajo de la C3 convertasa, y se activa a traves de la union de lectina de union a manosa (MBL, mannose-binding lectin) con restos de manosa en la superficie del patogeno. Despues, las serina proteasas MASP-1 y MASP-2, asociadas a MBL, pueden escindir C4 y C2 para formar la misma C3-convertasa como en la ruta clasica. A diferencia de las rutas clasica y la de la lectina, que son respuestas inmunitarias especlficas que requieren antlgenos, la ruta alternativa es una respuesta inmunitaria inespeclfica que esta continuamente activa a un nivel bajo. La hidrolisis espontanea de C3 conduce a C3a y C3b. C3b puede unirse al Factor B y despues escindir el Factor B a Ba y Bb con la facilitation del factor D. El complejo C3bBb que puede estabilizarse a traves de la union del Factor P (Properdina) es la C3-convertasa de la ruta alternativa que escinde C3 a C3a y C3b. C3b puede unirse al complejo C3bBb para formar el complejo C3bBbC3b que es la C5-convertasa de la ruta alternativa. Las C5-convertasas de las tres rutas pueden escindir C5 a C5a y C5b. Despues, C5b aglutina y ensambla moleculas de C6, C7, C7, C8 y C9 multiples para ensamblar el MAC. Esto crea un orificio o poro en la membrana que puede destruir o danar al patogeno o a la celula. El sistema del complemento esta estrechamente regulado por dos mecanismos: actividad aceleradora de la descomposicion (DAA, decay accelerating activity) y actividad del cofactor (CA, cofactor activity). DAA se refiere a la capacidad de promover la disociacion de la C3-convertasa o de la C5-convertasa. CA se refiere a la capacidad de facilitar que el Factor I escinda C3b o C4b a fragmentos inactivos. Para una revision del sistema del complemento vease Wagner, E., et al., (2010), Nat. Rev. Drug Discov., 9(1): 43 - 56.

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El Receptor del Complemento Humano de tipo 1 (CR1) es el unico regulador del complemento que tiene DAA para las C3-convertasas y C5-convertasas de la ruta tanto clasica como alternativa y CA para C3b y C4b, y por lo tanto ha generado interes en aplicaciones terapeuticas (Krych-Goldberg, M., et al, (2001), Immunological Reviews, 180: 112 - 122). Se ha demostrado que un CR1 humano soluble (sCR1) de origen natural que carece del dominio transmembrana y del dominio intracelular, inhibe el sistema del complemento in vitro y en diversos estudios animales in vivo (Mollnes, T.E., et al, (2006), Molecular Immunology, 43: 107 - 121). El sCR1 tambien se ha ensayado en ensayos cllnicos en seres humanos para reducir el dano tisular en infarto de miocardio (Perry, G.J., et al, (1998), J. Am. Coll. Cardiol., 31: 41 1A), slndrome de dificultad respiratoria del adulto (Zimmerman, J.L., et al, (2000), Crit. Care. Med., 28(9): 3149 - 3154) y trasplante de pulmon (Zamora, M.R., et al, (1999), Chest, 116: 46s). Se ha descubierto que es seguro, no inmunogenico y eficaz en cuanto a inhibir las actividades del complemento in vivo. Sin embargo, la estructura molecular hace que el sCR1 sea diflcil de producir como un agente terapeutico. La mutagenesis por delecion ha identificado que los primeros 3 SCR (SCR1-3) son suficientes para traspasar la DAA a las C3-convertasas, pero no el CA a C3b y C4b ((Krych-Goldberg, M., (1999), J. Bio. Chem., 274(44): 31160 - 31168). Similar al CR1, las protelnas reguladoras del complemento DAF, MCP, Factor H y C4BP, contienen diversas SCR donde se han mapeado los sitios de union de C3b o C4b y los sitios activos para las inhibiciones del complemento (Makrides, S.C., (1998), Pharmacological Reviews, 50 (1): 59 - 87). Se han producido y se ha demostrado que las formas solubles de MCP, DAF y Protectina, son eficaces para inhibir el complemento in vitro y en diversos modelos animales (Wagner, E., et al., (2010), Nat. Rev. Drug Discov., 9(1): 43 - 56). Sin embargo, tienen fuerzas relativamente bajas y semividas cortas in vivo.

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una de las protelnas mas importantes que promueven la angiogenesis, que es un proceso estrechamente regulado de desarrollo de nuevos vasos sangulneos a partir de una red vascular preexistente (Ferrara, N., (2004), Endocrine Reviews, 25(4): 581 - 611). La angiogenesis es necesaria durante el desarrollo y procesos fisiologicos normales, tales como la cicatrizacion de heridas, y tambien esta implicada en diversas patogenias de enfermedades entre las que se incluyen AMD, RA, Retinopatla Diabetica, crecimiento tumoral y metastasis. Se ha demostrado que la inhibicion de la angiogenesis es eficaz en aplicaciones terapeuticas.

Tanto la ruta de VEG como la del complemento contribuyen a la formacion de enfermedades con etiologlas similares. Por lo tanto, hay una necesidad de desarrollar agentes terapeuticos que se dirijan tanto a la ruta de VEGF como a complemento. En el presente documento se proporcionan protelnas de fusion que inhiben la activacion tanto de la ruta del complemento como la de VEGF. Las protelnas de fusion de la presente invencion pueden utilizarse como agente terapeutico para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el complemento y con VEGF.

Breve resumen de la invencion

La invencion proporcionada en el presente documento describe, entre otras cosas, una protelna de fusion que comprende un dominio inhibidor del complemento (CID, complement inhibiting domain), un dominio inhibidor de VEGF (VID, VEGF inhibiting domain) y un dominio prolongador de la semivida, en donde la protelna de fusion inhibe la activacion del complemento y la actividad de VEGF, composiciones que comprenden protelnas de fusion, y metodos para preparar las protelnas de fusion. Tambien se desvelan metodos de uso de estas protelnas de fusion para la inhibicion de la activacion del complemento y de la ruta de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF).

Por consiguiente, en un aspecto, la invencion proporciona una protelna de fusion que comprende un dominio inhibidor del complemento (CID), un dominio inhibidor de VEGF (VID), y un dominio prolongador de la semivida, en donde la protelna de fusion inhibe la activacion del complemento y la ruta de senalizacion de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF). En una realizacion, el CID comprende al menos una repeticion de consenso corta (SCR, short consensus repeat) de una protelna reguladora del complemento humano seleccionada del grupo que consiste en CR1, Factor H, C4-BP, DAF y MCP. En una realizacion adicional, el CID comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16. En cualquieras de las realizaciones del presente documento, el VID comprende una parte del dominio extracelular de un receptor de VEGF humano. En una realizacion, el VID comprende un dominio 2 de tipo inmunoglobulina (Ig) del VEGFR-1 humano y dominio 3 de tipo Ig de VEGFR-2 humano. En una realizacion adicional, el VID comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 o 38, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 o 38. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el dominio prolongador de la semivida comprende una region Fc de inmunoglobulina. En una realizacion, la region Fc es una Fc humana de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En otra realizacion, la region Fc comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 39, 41 y 42, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 39, 41 y 42. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, la protelna de fusion comprende ademas un enlazador peptldico entre dominios. En una realizacion, el enlazador peptldico comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID

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NO: 8. En algunas realizaciones del presente documento, la protelna de fusion comprende dicho VID, CID y Fc desde el extremo N al extremo C en un orden seleccionado del grupo que consiste en: (1) VID, Fc, CID; (2) CID, Fc, VID; (3) CID, VID, Fc; (4) VID, CID, Fc; (5) Fc, VID, CID; y (6) Fc, CID, VID.

En otro aspecto, la invencion proporciona una protelna de fusion que comprende, desde el extremo N al extremo C, un dominio inhibidor de VEGF (VID), una region Fc de inmunoglobulina y un dominio inhibidor del complemento (CID), donde la protelna de fusion inhibe la activacion del complemento y la ruta de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF). En una realizacion, el CID comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16 y 13-16. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el VID comprende una parte del dominio extracelular de un receptor de VEGF humano. En una realizacion, el VID comprende un dominio 2 de tipo inmunoglobulina (Ig) de VEGFR-1 humano o un dominio 3 de tipo Ig de VEGFR-2 humano. En una realizacion adicional, el VID comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 o 38, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 o 38. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, la region Fc es una Fc humana de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realizacion, la region Fc comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 39, 41 y 42, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 39, 41 y 42. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, la protelna de fusion comprende ademas un enlazador peptldico entre dominios. En una realizacion, el enlazador peptldico esta entre la region Fc y el CID. En otra realizacion, el enlazador peptldico comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8. En una realizacion, la protelna de fusion comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40.

En otro aspecto, la invencion proporciona una protelna de fusion producida cultivando una celula hospedadora que comprende un acido nucleico que codifica cualquier protelna de fusion de acuerdo con las reivindicaciones en un estado que produzca la protelna de fusion, y la recuperando la protelna de fusion producida por la celula hospedadora. En una realizacion, la protelna de fusion comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40. En otra realizacion, la protelna de fusion comprende ademas un peptido senal en su extremo N que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 10 y 43. En otra realizacion, la protelna de fusion recuperada producida por la celula hospedadora puede comprender un peptido senal que esta parcialmente escindido en el extremo N. En una realizacion, la celula hospedadora es una celula de mamlfero. En una realizacion adicional, la celula de mamlfero es una celula CHO.

En otro aspecto, la invencion proporciona una protelna de fusion dimerica (por ejemplo, una protelna de fusion Fc dimerica) que comprende dos protelnas de fusion, en la que cada protelna de fusion comprende cualquier protelna de fusion descrita en las reivindicaciones. En una realizacion, la protelna de fusion dimerica comprende dos protelnas de fusion identicas. En otra realizacion, la protelna de fusion dimerica comprende dos protelnas de fusion diferentes. En otra realizacion, la protelna de fusion dimerica comprende al menos una protelna de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40.

En un aspecto, la invencion tambien proporciona composiciones que comprenden cualquier protelna de fusion de acuerdo con las reivindicaciones y un vehlculo farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, la protelna de fusion comprende la secuencia de aminoacidos selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40. En una realizacion, la protelna de fusion es una forma dimerica. En otra realizacion, la protelna de fusion dimerica comprende dos protelnas de fusion identicas. En otra realizacion adicional, la protelna de fusion dimerica comprende dos protelnas de fusion diferentes. En otra realizacion adicional, la protelna de fusion dimerica comprende al menos una protelna de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en sEq ID NO: 12, 33-37 y 40.

En otro aspecto, la invencion proporciona un acido nucleico que codifica cualquiera de las protelnas de fusion de acuerdo con las reivindicaciones. En una realizacion, el acido nucleico codifica una protelna de fusion que comprende un dominio inhibidor del complemento (CID), un dominio inhibidor de VEGF (VID), y un dominio prolongador de la semivida, en el que la protelna de fusion inhibe la activacion del complemento y la ruta de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF). En una realizacion, el acido nucleico codifica un CID que comprende al menos una repeticion de consenso corta (SCR) de una protelna reguladora del

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complemento humano seleccionada del grupo que consiste en CR1, Factor H, C4-BP, DAF y MCP. En una realizacion adicional, el acido nucleico codifica un CID que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el acido nucleico codifica un VID que comprende una parte del dominio extracelular de un receptor de VEGF humano. En una realizacion, el acido nucleico codifica un VID que comprende un dominio 2 de tipo inmunoglobulina (Ig) de VEGFR-1 un dominio 3 de tipo Ig de VEGFR-2 humano. En una realizacion adicional, el acido nucleico codifica un VID que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 o 38, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 o 38. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el acido nucleico codifica un dominio prolongador de la semivida que comprende una region Fc de inmunoglobulina. En una realizacion, el acido nucleico codifica una region Fc que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 39, 41 y 42, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 39, 41 y 42. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el acido nucleico codifica adicionalmente un enlazador peptldico que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el acido nucleico codifica una protelna de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 112, 33-37 y 40.

En otro aspecto, la invention proporciona un vector que comprende un acido nucleico que codifica cualquiera de las protelnas de fusion descritas de acuerdo con las reivindicaciones. En una realizacion, la protelna de fusion comprende un dominio inhibidor del complemento (CID), un dominio inhibidor de VEGF (VID) y un dominio prolongador de la semivida, donde la protelna de fusion inhibe la activation del complemento y la ruta de serialization de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad VEGF). En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el vector comprende cualquiera de los acidos nucleicos desvelados en el presente documento que codifican una protelna de fusion como se describe en el presente documento. En una realizacion, el vector comprende un acido nucleico que codifica una protelna de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40. En cualquiera de los aspectos, la invencion proporciona una celula hospedadora que comprende cualquiera de los acidos nucleicos desvelados en el presente documento, que codifican una protelna de fusion de acuerdo con las reivindicaciones. En una realizacion, la celula hospedadora comprende un acido nucleico que codifica una protelna de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40.

En otro aspecto adicional, la invencion proporciona un metodo de production de una protelna de fusion, que comprende cultivar una celula hospedadora que comprende un acido nucleico que codifica cualquiera de las protelnas de fusion de acuerdo con las reivindicaciones, en un estado que permita producir la protelna de fusion y la recuperation de la protelna de fusion producida por la celula hospedadora. En una realizacion, la protelna de fusion se recupera del medio de cultivo celular y se purifica. En una realizacion adicional, la celula hospedadora es una celula de mamlfero o una celula de levadura. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, la protelna de fusion recuperada es un dlmero. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, la protelna de fusion recuperada es una protelna de fusion parcialmente escindida como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, la invencion proporciona una protelna de fusion de acuerdo con las reivindicaciones para su uso en un metodo de tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad ocular o un cancer, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las protelnas de fusion desveladas en el presente documento. En una realizacion, la protelna de fusion comprende un dominio inhibidor del complemento (CID), un dominio inhibidor de VEGF (VID) y un dominio prolongador de la semivida, donde la protelna de fusion inhibe la activacion del complemento y la ruta de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibition de la actividad de VEGF). En una realizacion, la protelna de fusion comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1, 33-37 y 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40. En una realizacion, el sujeto tiene artritis reumatoide, psoriasis, degeneration macular, retinopatla diabetica, obstruction de la vena central de la retina o un trasplante de cornea. En una realizacion adicional, la degeneracion macular es degeneracion macular humeda relacionada con la edad o degeneracion macular seca relacionada con la edad. En una realizacion, el sujeto tiene cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, cancer de rinon, cancer gastrico, cancer de ovario o retinoblastoma. En otra realizacion, el metodo comprende ademas administrar un segundo agente terapeutico para tratar la enfermedad.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona un kit que comprende cualquiera de las protelnas de fusion de acuerdo con las reivindicaciones. En una realizacion, la protelna de fusion comprende un dominio inhibidor del

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complemento (CID), un dominio inhibidor de VEGF (VID), y un dominio prolongador de la semivida, donde la protelna fusion inhibe la activacion del complemento y la ruta de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF). En una realizacion, la protelna de fusion comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40. En una realizacion, el kit comprende adicionalmente un prospecto con instrucciones para el uso de la protelna de fusion para el tratamiento en un sujeto de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad ocular o un cancer.

Debe entenderse que, una, algunas o todas las propiedades de las diversas realizaciones de la invencion reivindicada, pueden combinarse para formar otras realizaciones de la presente invencion. Estos y otros aspectos de la invencion seran obvios para un experto en la materia.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 proporciona dibujos esquematicos de protelnas de fusion. A) Protelnas anti-complemento (ACP, anti-complement proteins), ACP-1 a ACP-10. CID-WT es CR1 SCR-3 de tipo silvestre (Wild Type) humano; CID- KN es CR1 SCR1-3_N29K/ D109N variante humana; CID-YD es la variante CR1 SCR1-3_S37Y/G79D humana; CID-KYDN es la variante CR1 SCR1-3_N29K/S37Y/G79D/D109N humana, CID-NT es CR1 SCR8-10 de tipo silvestre humano; y Fc es la region Fc de IgG1 humana. B) Protelnas biespeclficas anti-complemento/VEGF (ACVP, anti-complement/VEGF proteins), ACVP-1 a AcVP-6. CID es la variante CR1 SCR1- 3_N29K/S37Y/G79D/D109N humana; VID es la fusion del 2° dominio de tipo Ig de VEGFR1 y el 3er dominio de tipo Ig de VEGFR2; y Fc es la region Fc de IgG1 humana.

La Figura 2 muestra geles de SDS-PAGE de protelnas de fusion purificadas. A) Protelnas de fusion purificadas ACP-10 (carril 1), ACP-9 (carril 2), ACP-8 (carril 3), ACP-7 (carril 4) y ACP-6 (carril 5). B) Protelna de fusion ACVP-1 purificada en condiciones no reductoras (carril 1) y reductoras (carril 3); y protelna de fusion ACP-9 purificada en condiciones no reductoras (carril 2) y reductoras (carril 4).

La Figura 3 es una serie de graficos que demuestra la inhibicion de la ruta del complemento mediante protelnas de fusion ACP. A) Inhibicion de la ruta clasica del complemento en eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos con diversas concentraciones de protelnas de fusion ACP-6, ACP-7, ACP-9 y ACP-10. B) Inhibicion de la ruta alternativa del complemento en eritrocitos de conejo con diversas concentraciones de protelnas de fusion ACP-6, ACP-7, ACP-9 y ACP-10. El Log[nM] de fusion de Fc es la concentracion logarltmica de la protelna de fusion indicada (nM).

La Figura 4 es una serie de graficos que demuestra la union in vitro de un VEGF por protelnas de fusion, como se detecta mediante un ensayo ELISA. A) Union in vitro directa de VEGF movilizado por ACVP-1. B) Union in vitro de VEGF soluble por AcVp-1 . C) Union in vitro de VEGF por ACVP-1, VID o Avastin.

La Figura 5 es una serie de graficos que demuestra la inhibicion de la ruta del complemento por protelnas de fusion ACVP. A) Inhibicion de la ruta clasica del complemento en eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos, mediante diversas concentraciones de la protelna de fusion ACVP-1. B) Inhibicion de la ruta alternativa del complemento en eritrocitos de conejo, mediante diversas concentraciones de la protelna de fusion ACVP-1. El Log[nM] de fusion de Fc es la concentracion logarltmica de la protelna de fusion indicada (nM).

La Figura 6 es un grafico que demuestra la inhibicion de la proliferation de celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells) inducida por VEGF mediante las protelnas de fusion ACVP-1, VID o CID. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. **p<0,01 en comparacion con DMEM+ VEGF control.

La Figura 7 es una transferencia western que demuestra la inhibicion de la activacion de la ruta de VEGFR2 a traves de las protelnas de fusion ACVP-1, VID o CID.

La Figura 8 es una serie de fotograflas de ojos de un modelo de neovascularization coroidea, CNV (choroidal neovascularization) inducida por laser en monos. Veintiun dlas despues de suministrar fotocoagulacion con diodo laser de 532 nm alrededor de la macula, a los monos se les inyecto mediante por via intravltrea A) control vehlculo (PBS); B) ACVP-1; C) VID o D) CID, a las concentraciones indicadas y las fotograflas del ojo tratado se tomaron 14 dlas despues de recibir la dosis para medir la filtration macular.

Descripcion detallada

La presente invencion proporciona, entre otras cosas, protelnas de fusion, y composiciones de las mismas, de acuerdo con las reivindicaciones, que inhiben la ruta del complemento y la ruta del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Una protelna de fusion de la invencion, como se describe en el presente documento, comprende un dominio inhibidor del complemento (CID), un dominio inhibidor de VEGF (VID), y un dominio prolongador de la

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semivida, en donde la protelna de fusion inhibe la ruta de activacion del complemento y de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF). En el presente documento tambien se proporcionan metodos para la produccion de las protelnas de fusion y metodos de uso de las mismas en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, enfermedades relacionadas con el complemento, enfermedades inflamatorias, enfermedades oculares, y/o cancer.

I. Tecnicas generales

Las tecnicas y los procedimientos descritos, o a los que se hace referencia en el presente documento, son generalmente bien entendidos y normalmente empleados, utilizando metodologla convencional, por los expertos en la materia, tal como, por ejemplo, las metodologlas ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a edicion (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (r.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley y Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley y Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

II. Definiciones

Una molecula (por ejemplo, un acido nucleico o una protelna) o una celula “aislada”, es una que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural.

Como se usa en el presente documento, la expresion “sustancialmente puro(a)” se refiere a un material que tiene una pureza (es decir, que no tiene contaminantes) de al menos 50 %, mas preferentemente de al menos 90 %, mas preferentemente de al menos 95 %, mas preferentemente de al menos del 98 %, mas preferentemente de al menos 99 %.

Un “polipeptido de fusion” o una “protelna de fusion” (como se utiliza indistintamente en el presente documento) se refiere a un polipeptido que tiene o dos mas partes unidas entre si por enlaces covalentes, procediendo cada una de las partes de protelnas diferentes. Las dos o mas partes pueden unirse directamente mediante un solo enlace peptldico o mediante un enlazador peptldico que contiene uno o mas restos de aminoacidos. Generalmente, las dos partes y el enlazador estaran en fase de lectura entre si y se produciran utilizando tecnicas recombinantes.

La expresion “porcentaje ( %) de identidad de secuencia de aminoacidos o de nucleotidos” con respecto a una secuencia de polipeptidos o de acido nucleico de referencia, se define como el porcentaje de restos de aminoacidos o de nucleotidos en una secuencia candidata que son identicos a los restos de aminoacidos o de nucleotidos en la secuencia de polipeptidos o de acido nucleico de referencia, despues de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para obtener el porcentaje de identidad de secuencia maximo, y sin considerar ninguna de las sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos o de acido nucleico, el alineamiento puede realizarse de diversas maneras incluidas en la especialidad de la tecnica, por ejemplo, utilizando un programa informatico disponible al publico tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALiGn o Megalign (DNASTAR) o los descritos en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, (2009). Los expertos en la materia pueden determinar parametros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquiera de los algoritmos necesarios para obtener el alineamiento maximo en toda la longitud de las secuencias a comparar. Por ejemplo, el programa Megalign (DNASTAR) puede crear alineamientos entre dos o mas secuencias de acuerdo con diferentes metodos, por ejemplo, el metodo clustal. Vease, por ejemplo, Higgins, D. G. y P. M. Sharp. (1988). Gene. 73: 237-244. El algoritmo clustal agrupa secuencias en agrupaciones examinando las distancias entre todos los pares. Las agrupaciones se alinean por pares y despues en grupos. El porcentaje de similitud entre dos secuencias de aminoacidos, por ejemplo, la secuencia A y la secuencia B, se calcula dividiendo la longitud de la secuencia A, menos el numero de restos hueco en la secuencia A, menos el numero de restos hueco en la secuencia B, en la suma del resto que coincide entre la secuencia A y la secuencia B, multiplicado por cien. En la determinacion del porcentaje de similitud no se incluyen los huecos de baja similitud, o de cero similitud, entre las dos secuencias de aminoacidos. El porcentaje de identidad entre secuencias de acido nucleico puede tambien contarse o calcularse por otros metodos conocidos en la materia, por ejemplo, el metodo de Jotun Hein. Vease, por ejemplo, Hein, J. (1990)

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Methods Enzymol. 183: 626-645.

El termino “vector”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula de acido nucleico que tiene la capacidad de propagar otro acido nucleico con el cual esta unido. El termino incluye el vector como una estructura de acido nucleico autorreplicante, as! como el vector que se ha incorporado en el genoma de una celula hospedadora en el que se ha introducido. Determinados vectores tienen la capacidad de dirigir la expresion de acidos nucleicos con los que estan unidos operativamente. En el presente documento dichos vectores se denominan “vectores de expresion”.

Las expresiones “celula hospedadora”, “llnea de celula hospedadora” y “cultivo de celula hospedadora”, se usan indistintamente y se refieren a celulas en las que se ha introducido acido nucleico exogeno, incluyendo la descendencia de dichas celulas. Las celulas hospedadoras incluyen “transformantes” y “celulas transformadas”, que incluyen la celula primaria transformada y su descendencia, sin tener en cuenta el numero de pases. La descendencia no tiene por que ser completamente identica en cuanto al contenido de acido nucleico a la celula parental, sino que puede contener mutaciones. En el presente documento se incluye la descendencia mutante que tiene la misma funcion o actividad biologica que la detectada o seleccionada en la celula originalmente transformada.

Como se usa en el presente documento, “tratamiento” o “tratar” se refiere a una estrategia para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo preferentemente resultados cllnicos. Para los fines de la presente invencion, los resultados cllnicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitacion, uno o mas de los siguientes: disminucion de los slntomas resultantes de la enfermedad, aumento de la calidad de vida de las personas que padecen la enfermedad, disminucion de la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, retraso de la progresion de la enfermedad y/o prolongacion de la supervivencia de los individuos.

Como se usa en el presente documento, “retraso del desarrollo de la enfermedad” significa retrasar, detener, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (tal como cancer). Este retraso puede ser de diferentes periodos de tiempo, dependiendo del historial de la enfermedad y/o del individuo que vaya a tratarse. Como es obvio para un experto en la tecnica, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, incluir la prevencion, en el sentido de que el individuo no desarrolla la enfermedad.

Un “individuo” o “sujeto” es un mamlfero. Entre los mamlferos se incluyen, pero sin limitacion, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, primates humanos y no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En algunas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.

La expresion “formulacion farmaceutica” se refiere a una preparacion que esta en una forma tal que permite que la actividad biologica de un principio activo contenido en la misma, sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente toxicos para un sujeto al cual se le administra la formulacion.

Un “vehlculo farmaceuticamente aceptable” se refiere a un principio en una formulacion farmaceutica, que no es un principio activo, que no es toxico para el sujeto. Un vehlculo farmaceuticamente aceptable incluye, pero sin limitacion, un tampon, un excipiente, un estabilizador o un conservante.

Una “cantidad o dosificacion eficaz” de un agente, por ejemplo, de una formulacion farmaceutica, se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapeutico o profilactico deseado. Una dosificacion eficaz puede administrarse en una o mas administraciones. Para los fines de la presente invencion, una dosificacion eficaz de un farmaco, un compuesto o una composicion farmaceutica, es una cantidad suficiente para conseguir un tratamiento profilactico o terapeutico de una manera directa o indirecta. Como se entiende en el contexto cllnico, una dosificacion eficaz de un farmaco, un compuesto o una composicion farmaceutica, puede realizarse, o no, junto con otro farmaco, compuesto o composicion farmaceutica. Por tanto, se puede considerar una “cantidad o dosificacion eficaz” en el contexto de la administration de uno o mas agentes terapeuticos, y se puede considerar que un solo agente se suministra en una cantidad eficaz si, junto con uno o mas agentes distintos, se puede tener u obtener un resultado deseable.

Como se usa en el presente documento, “junto con” se refiere a la administracion de una modalidad de tratamiento ademas de otra modalidad de tratamiento. Como tal, “junto con” se refiere a la administracion de una modalidad de tratamiento antes, durante o despues de la administracion de la otra modalidad de tratamiento al individuo.

La expresion “prospecto” se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de los productos terapeuticos, que contiene information acerca de las indicaciones, uso, dosificacion, administracion, terapia de combination, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapeuticos.

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “uno(a)”, “el” y “la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Por ejemplo, una referencia a una “protelna de fusion” o a un “polipeptido de fusion”, es una referencia a de una a muchas protelnas o

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polipeptidos de fusion, tal como cantidades molares, e incluye equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia, y asi sucesivamente.

En el presente documento la referencia a “aproximadamente” un valor o parametro incluye (y describe) realizaciones que estan dirigidas a ese valor o parametro por si mismo. Por ejemplo, una descripcion con referencia a “aproximadamente X” incluye la descripcion de “X”.

Se entiende que las realizaciones, aspectos y variaciones de la invencion descrita en este documento, incluyen “que consiste” y/o “que consiste esencialmente en realizaciones, aspectos y variaciones”.

III. Protefnas de fusion

De acuerdo con las reivindicaciones, la presente invencion proporciona proteinas de fusion que inhiben la ruta de activacion del complemento y de senalizacion de VEGF. En algunas realizaciones, la ruta del complemento que esta inhibida por las proteinas de fusion, puede ser la ruta clasica del complemento, la ruta alternativa del complemento y/o la ruta de la lectina. En algunas realizaciones, la ruta de VEGF que esta inhibida por las proteinas de fusion esta mediada por receptores de VEGF, por ejemplo, VEGFR-1, VEGFR-2 VEGFR-3. En algunas realizaciones, la ruta de VEGF que esta inhibida por las proteinas de fusion esta mediada por VEGF-A VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y P1GF. En algunas realizaciones, las proteinas de fusion descritas en el presente documento inhiben la ruta de activacion del complemento y de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF). Las proteinas de fusion descritas en el presente documento comprenden un dominio inhibidor del complemento (CID), un dominio inhibidor de VEGF (VID) y un dominio prolongador de la semivida.

Dominio inhibidor del complemento (CID)

La presente invencion proporciona dominios inhibidores del complemento (CID) que son componentes de polipeptidos de fusion de acuerdo con las reivindicaciones. El CID puede comprender un fragmento polipeptidico de una proteina reguladora del complemento implicada en la ruta del complemento, que incluye miembros de las proteinas reguladoras de la activacion del complemento (RCA, regulator of complement activation) y proteinas de control del complemento (CCP, complement control proteins). En algunas realizaciones, un CID comprende un fragmento de una proteina reguladora del complemento que incluye, pero sin limitacion, el receptor 1 del complemento (CR1), el Factor H, el factor acelerador de la descomposicion (DAF, Decay-accelerating factor), proteina cofactor de membrana (MCP, membrane cofactor protein) y proteina de union a C4b (C4BP, C4b-binding protein). En cualquiera de las realizaciones del presente documento, la proteina reguladora del complemento es de un mamifero, tal como de un ser humano, un babuino, un chimpance, un raton o una rata. En algunas realizaciones, la proteina reguladora de complemento es una proteina humana. Las proteinas reguladoras del complemento se unen a componentes de la ruta del complemento, entre los que se incluyen, pero sin limitacion, C3b, C4b, iC3b, C3dg, C1q y MBP. En algunas realizaciones, el fragmento de la proteina reguladora del complemento se une a un componente del complemento (tal como C3b, C4b, iC3b, C3dg, C1q y MBP) e inhibe la activacion de la ruta del complemento (tal como la ruta clasica, la ruta alternativa y/o la ruta de la lectina). En la tecnica se conocen metodos de ensayo de proteinas que inhiben cualquiera de las rutas del complemento e incluyen los metodos descritos en los ejemplos (tales como los Ejemplos 2, 3 y 6). Vease, por ejemplo, Scesney S.M., et al, (1996). Eur. J. Immunol, 26: 1729-1735. En algunas realizaciones, el CID comprende al menos una SCR (repetition consenso corta) de una proteina reguladora del complemento seleccionada del grupo que consiste en CR1, Factor H, DAF, MCP y C4BP.

El CID puede comprender una parte de una proteina reguladora del complemento que se une a un componente del complemento e inhibe la activacion del complemento. Por ejemplo, el CR1 humano (alotipo A) es una glucoproteina grande (~200 kD) que consiste en un dominio extracelular que comprende 30 repeticiones de repeticiones consenso cortas (SCR) homologas, variando cada una de ellas de 60 a 70 aminoacidos, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmatico. Las 28 primeras SCR se organizan en 4 repeticiones homologas largas (LHR, long homologous repeat) (LHR-A, -B, -C y -D) de cada una de las 7 SCR. Las 3 primeras SCR (SCR1-3) de la primera LHR (LHR-A) se une a C4b con afinidad intermedia y a C3b con afinidad baja. Las 3 primeras SCR (SCR8-10) de la segunda LhR (LHR-B) y las 3 primeras SCR (SCR15-17) de la tercera LhR (LHR-C) son casi identicas. Ambas se unen a C3b con afinidad alta y a C4b con afinidad intermedia. La LHR-A tiene actividad aceleradora de la descomposicion (DAA) alta para las C3-convertasas tanto de la ruta clasica como de la alternativa, pero una actividad de cofactor (CA) baja, mientras que la LHR-B y la LHR-C tienen una CA alta, pero una DAA baja para las C3-convertasas. Tanto la LHR-A como la LHR-B, con un espaciador apropiado, se requieren para la DAA para las C5-convertasas. En el presente documento se proporcionan CID que comprenden al menos una SCR de una proteina reguladora del complemento. En algunas realizaciones un CID comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ,26, 27, 28, 29 pero no mas de 30 SCR de una proteina reguladora del complemento. En algunos aspectos, un CID comprende una cualquiera de, de 1 a 30, de 1 a 29, de 1 a 28, de 1 a 27, de 1 a 26, de 1 a 25, de 1 a 24, de 1 a 23, de 1 a 22, de 1 a 21, de 1 a 20, de 1 a 19, de 1 a 18, de 1 a 17, de 1 a 16, de 1 a 15, de 1 a 14, de 1 a 13, de 1 a 12, de 1 a 11, de 1 a 10, de 1 a 9, de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3 o de 1 a 2 SCR de una proteina reguladora del complemento. En algunas realizaciones, un CID comprende una o mas SCR de una proteina reguladora del complemento seleccionada del grupo que consiste, pero sin limitacion, en CR1, Factor H, DAF, MCP y C4BP. En algunas realizaciones, un CID

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comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez SCR de CR1, Factor H, DAF, MCP o C4BP. Tambien se contempla un CID comprende al menos una SCR de dos o mas protelnas reguladoras del complemento. En algunas realizaciones, un CID comprende al menos una SCR de dos o mas protelnas reguladoras del complemento seleccionadas del grupo que consiste en CR1, Factor H, DAF, MCP y C4BP.

En el presente documento se proporcionan CID que comprenden al menos una SCR de cualquiera de las protelnas reguladoras del complemento presentadas en este documento. A menos que se mencione expllcitamente en este documento, las SCR se numeran secuencialmente desde el extremo N al extremo C de la protelna reguladora del complemento. Por ejemplo, el receptor 1 del complemento, CR1, humano contiene 30 SCR que se numeran de 1 a 30, estando la SCR1 en el extremo N de la protelna CR1 humano y la SCR30 en el extremo C de la protelna CR1 humano. En algunas realizaciones, el CID comprende SCR1-10 de CR1, tal como la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6. En otras realizaciones, el CID comprende SCR1-3 de CR1, tal como la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones adicionales, el CID comprende SCR8-10 de CR1, tal como la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el CID comprende SCR2-4 de DAF, tal como la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 13. En otras realizaciones, el CID comprende SCR2-4 de MCP, tal como la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14. En otras realizaciones adicionales, el CID comprende SCR1-4 del Factor H. En algunos aspectos, el CID comprende SCR1-4 del Factor H, tal como la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 15. En otras realizaciones mas, el CID comprende SCR1-3 de C4BPA, tal como la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16. En cualquiera de los aspectos del presente documento, un CID puede comprender una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16. La SCR1-4 del Factor H es un CID que se dirige especlficamente a la ruta alternativa pero no a la ruta clasica. Dado que para la eliminacion de patogenos dependiente de anticuerpos se requiere la ruta clasica del complemento, las aplicaciones terapeuticas de una protelna de fusion que contenga un CID que comprenda SCR1-4 del Factor H que inhiba unicamente la ruta alternativa, podrla ser una protelna de fusion preferida para limitar el posible efecto secundario de infecciones graves.

Los CID descritos en la presente invencion podrlan ser cualquiera de los inhibidores peptldicos u oligonucleotldicos contra el Factor B o Factor D o Factor P o C3 o C5. Los CID tambien podrlan ser fragmentos de anticuerpos de longitud completa, o regiones variables (VH o VK) de anticuerpo, o los anticuerpos scFv procedentes de anticuerpos contra Factor B o Factor D o Factor P o C3 o C5.

En algunas realizaciones, se contemplan variantes de secuencias de aminoacidos de los CID proporcionados en este documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas de un CID. Las variantes de secuencias de aminoacidos de un CID pueden prepararse introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleotidos que codifica el CID, o por slntesis peptldica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoacidos del CID. Cualquier combinacion de delecion, insercion y sustitucion puede realizarse para llegar a la construccion final, siempre que la construccion final posea las caracterlsticas deseadas, por ejemplo, union a un componente del complemento e inhibicion de la activacion de la ruta del complemento. En el presente documento se proporcionan variantes de un CID que es un componente de cualquiera de las protelnas de fusion desveladas en este documento. En algunas realizaciones, un CID comprende una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, de al menos 90 %, de al menos 91 %, de al menos 92 %, de al menos 93 %, de al menos 94 %, de al menos 95 %, de al menos 96 %, de al menos 97 %, de al menos 98 % o de al menos 99 %, con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16.

En algunos aspectos, la variante del CID comprende una o mas sustituciones en restos de aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en N29, S37, G79 y D109, siendo la posicion del resto de aminoacido relativa a la SEQ ID NO: 1. En una realizacion particular, la variante del CID comprende sustituciones en restos de aminoacidos N29 y D109, siendo la posicion del resto de aminoacido relativa a la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion particular, la variante del CID comprende sustituciones en los restos de aminoacidos S37 y G79, siendo la posicion del resto de aminoacido relativa a la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion particular adicional, la variante del CID comprende sustituciones en restos de aminoacidos N29, S37, G79 y D109, siendo la posicion del resto de aminoacido relativa a la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la variante del CID comprende sustituciones en los restos de aminoacidos N29K, S37Y, G79D y D109N, siendo la posicion del resto de aminoacido relativa a la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, como se muestra en la Tabla 1, la variante del CID comprende sustituciones de cualquiera de las posiciones de aminoacidos con respecto a la SEQ ID NO: 1.

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Tabla 1. Sustituciones de aminoacidos del CID Sustituciones de aminoacidos (A)

CID: A29 A37 A79 A109

CID-TS: N S G D

CID-KN: K S G N

CID-YD: N Y D D

CID-KYDN: K Y D N

Dominio inhibidor de VEGF (VID)

La presente invencion proporciona dominios inhibidores de VEGF (VID) que son componentes de protelnas de fusion de acuerdo con las reivindicaciones. La familia del gen de VEGF humano contiene cinco miembros: VEGF-A VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y factor de crecimiento placentario (P1GF). Ademas, se generan isoformas multiples de VEGF-A, VEGF-B y P1GF a traves de corte y empalme alternativo de ARN (Sullivan L.A., et al, (2010), MAbs, 2(2): 165 - 75). Todos los miembros de la familia de VEGF estimulan respuestas celulares uniendose a receptores de VEGF (VEGFR) en la superficie celular. Por ejemplo, se ha observado que VEGF-A estimula la mitogenesis de celulas endoteliales, promueve la supervivencia y proliferacion celular, induce la migracion celular y aumenta la permeabilidad microvascular. Los receptores de VEGFR son tirosina quinasa receptoras que tienen regiones extracelulares que consisten en 7 dominios de tipo inmunoglobulina (Ig). VEGFR-1 (Flt-1) se une a VEGF-A, a VEGF-B y a P1GF, y puede funcionar como un receptor senuelo para los VEGF o un regulador de VEGFR-2. VEGFR-2 (KDR/Flk-1) se une a todas las isoformas de VEGF y es el mediador predominante de la senalizacion de la angiogenesis inducida por VEGF). VEGFR-3 (Flt-4) se une a VEGF-C y a VEGF-D, pero no a VEGF-A, y funciona como un mediador de la linfangiogenesis.

En cualquiera de los aspectos de la invencion desvelada en el presente documento, un VID comprende un fragmento polipeptldico de un VEGFR que incluye, pero sin limitacion, VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3. En algunas realizaciones, un VID comprende una parte del dominio extracelular de un VEGFR que incluye, pero sin limitacion, VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3, En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el VEGFR es de un mamlfero, tal como de un ser humano, babuino, chimpance, raton o rata. En cualquiera de los aspectos del presente documento, una parte del dominio extracelular es un dominio de tipo inmunoglobulina (Ig). Por ejemplo, el VEGFR-1 humano contiene siete dominios de tipo Ig que se enumeran como 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, estando el dominio 1 de tipo Ig en el extremo N del dominio extracelular y el dominio 7 de tipo Ig en el extremo C del dominio extracelular. A menos que se mencione expllcitamente en el presente documento, los dominios de tipo Ig se enumeran secuencialmente desde el extremo N al extremo C de la protelna VEGFR. En algunas realizaciones, un VID comprende al menos un dominio de tipo Ig de uno o mas VEGFR seleccionados del grupo que consiste en VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3. En algunos aspectos, un VID comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, pero no mas de 7 dominios de tipo Ig de un VEGFR. En un aspecto adicional, un VID comprende de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3 o de 1 a 2 dominios de tipo Ig de un VEGFR.

En el presente documento se contempla un VID que comprende al menos un dominio de tipo Ig de dos o mas VEGFR. En algunas realizaciones, un VID comprende al menos un dominio de tipo Ig de dos o mas VGFR seleccionados del grupo que consiste en VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3. En algunos aspectos, un VID comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 pero no mas de 21 dominios de tipo Ig de al menos dos o mas VEGFR. En un aspecto adicional, un VID comprende de 1 a 21, de 1 a 20, de 1 a de 19, de 1 a de 18, de 1 a de 17, de 1 a 16, de 1 a 15, de 1 a 14, de 1 a 13, de 1 a 12, de 1 a 11, de 1 a 10, de 1 a 9, de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3 o de 1 a 2 dominios de tipo Ig de al menos dos o mas VEGFR. En el presente documento tambien se contemplan VID que comprenden cualquier combinacion de los siete dominios de tipo Ig de cada VEGFR. Por ejemplo, un VID puede comprender el dominio 2 de tipo Ig de VEGFR-1 (por ejemplo, VEGFR-1 humano) y el dominio 3 de tipo Ig de VEGFR-2 (por ejemplo, VEGFR-2 humano). En otro ejemplo, un VID puede comprender los dominios 1-3 de tipo Ig de VEGFR-1 (por ejemplo, VEGFR-1 humano), los dominios 2-3 de tipo Ig de VEGFR-1 (por ejemplo, VEGFR-1 humano), los dominios 1-3 de tipo Ig de VEGFR-2 (por ejemplo, VEGFR-2 humano), el dominio de tipo Ig2 de VEGFR-1 (por ejemplo, VEGFR-1 humano) y los dominios 3-4 de tipo Ig de VEGFR-2 (por ejemplo, VEgFr-2 humano), o el dominio 2 de tipo Ig de VEGFR-1 (por ejemplo, VEGFR-1 humano) y el dominio 3 de tipo Ig de VEGFR-3 (por ejemplo, VEGFR-3 humano). Para una descripcion mas detallada de estos dominios de tipo Ig y otros dominios de tipo Ig que pueden utilizarse como parte de un VID, vease la Patente de Estados Unidos N.° 7.531.173, Yu, D., et al., (2012). Mol. Ther. 20(3): 938-947, y Holash, J. et al., (2002). PNAS. 99(17): 11393-11398. En algunos aspectos, un VID comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11. En algunos aspectos, un VID comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, un VID se une a un factor de crecimiento endotelial vascular seleccionado del grupo que consiste en VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y P1GF. Como se proporciona en el presente documento, un polipeptido o que se une a un factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y P1GF) o que se une a un VEGFR (por ejemplo, VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3) para inhibir la activacion de una ruta de VEGF es un VID. Por ejemplo, un VID puede comprender un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, Fab', Fab-SH, Fv, scFv o F(ab')2), un peptido natural, o un peptido sintetico que se une a un factor de crecimiento

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endotelial vascular (por ejemplo, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y P1GF) y bloquea su interaccion con VEGFR. En algunos aspectos, un VID es un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, Fab', Fab-SH, Fv, scFv o F(ab')2), un peptido natural, o un peptido sintetico que se une a VEGFR (por ejemplo, VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3) y bloquea su interaccion con VEGF. En algunos aspectos, el VID esta acetilado. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el VID es de un mamlfero, tal como de un ser humano, un babuino, un chimpance, un raton o una rata.

Los VID de la presente invencion pueden ser cualquier dominio extracelular de los VEGFR, formas negativas dominantes de miembros de la familia de VEGF, anticuerpos contra miembros de la familia de VEGF, anticuerpos contra los VEGFR, inhibidores peptldicos contra miembros de la familia de VEGF o contra los VEGFR, inhibidores oligonucleotldicos contra miembros de la familia de VEGF o contra los VEGFR.

En algunas realizaciones, se contemplan variantes de secuencias de aminoacidos de cualquiera de los VID proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del VID. Las variantes de secuencias de aminoacidos de un VID pueden prepararse introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleotidos que codifica al VID, o por slntesis peptldica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoacidos del VID. Cualquiera combinacion de delecion, insertion y sustitucion puede realizarse para llegar a la construction final, siempre que la construction final posea las caracterlsticas deseadas, por ejemplo, union a VEGF e inhibition de la activation de la ruta de VEGF. En el presente documento se proporcionan variantes de VID que pueden ser un componente de cualquier polipeptido de fusion desvelado en el presente documento. En algunas realizaciones, un VID comprende una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, de al menos 90 %, de al

menos 91 %, de al menos 92 %, de al menos 93 %, de al menos 94 %, de al menos 95 %, de al menos 96 %, de al

menos 97 %, de al menos 98 % o de al menos 99 % con una secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de tipo Ig de VEGFR-1 (por ejemplo, VEGFR-1 humano). En algunas realizaciones, un VID comprende una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, de al menos 90 %, de al menos 91 %, de al

menos 92 %, de al menos 93 %, de al menos 94 %, de al menos 95 %, de al menos 96 %, de al menos 97 %, de al

menos 98 % o de al menos 99 % con la secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de tipo Ig de VEGFR-2 (por ejemplo, VEGFR-2 humano). En algunas realizaciones, un VID comprende una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, de al menos 90 %, de al menos 91 %, de al menos 92 %, de al menos 93 %, de al menos 94 %, de al menos 95 %, de al menos 96 %, de al menos 97 %, de al menos 98 % o de al menos 99 % con la secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de los dominios 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de tipo Ig de VEGFR-3. En algunas realizaciones, un VID comprende una secuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, de al menos 90 %, de al menos 91 %, de al menos 92 %, de al menos 93 %, de al menos 94 %, de al menos 95 %, de al menos 96 %, de al menos 97 %, de al menos 98 % o de al menos 99 % con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y 38.

Dominio prolongador de la semivida

La presente invencion proporciona un dominio prolongador de la semivida que puede ser un componente de cualquier protelna de fusion desvelada en el presente documento. Por ejemplo, las regiones Fc de una inmunoglobulina pueden incorporarse en un polipeptido de fusion para aumentar la semivida in vivo. Un dominio prolongador de la semivida puede comprender una region Fc de cualquier isotipo, subclase o alotipo de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el dominio prolongador de la semivida es una region Fc de un isotipo de inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgM e IgE. En algunas realizaciones, el dominio prolongador de la semivida comprende una region Fc de inmunoglobulina. En algunos aspectos, la region Fc es una Fc humana de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunos aspectos, la region Fc es una Fc humana de IgA1 o IgA2. En algunos aspectos, la region Fc es una Fc humana de IgD. En algunos aspectos, la region Fc es una Fc humana de IgE. En algunos aspectos, la region Fc es una Fc humana de IgM. En algunos aspectos, la region Fc esta glucosilada. En algunas realizaciones, la region Fc comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 39, 41 y 42. En cualquiera de los aspectos proporcionados en el presente documento, el dominio prolongador de la semivida puede ser un polipeptido o fragmento del mismo seleccionado del grupo que consiste, pero sin limitation, en un anticuerpo, albumina o inhibidor de proteasa (por ejemplo, alfa 1- antitripsina). En cualquiera de los aspectos proporcionados en el presente documento, el dominio prolongador de la semivida puede ser una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste, pero sin limitacion, en una secuencia de aminoacidos rica en glicina, una secuencia PESTAG o una secuencia PAS. El dominio prolongador de la semivida puede ser cualquier secuencia polipeptldica o de aminoacidos conocida en la tecnica que aumente la semivida de un polipeptido in vivo. Vease Kontermann, R. (Ed.) (2011). Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate their Plasma Half-lives. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el dominio prolongador de la semivida es de un mamlfero, tal como de un ser humano, un babuino, un chimpance, un raton o una rata.

En algunas realizaciones, se contemplan variantes de secuencias de aminoacidos de los dominios prolongadores de

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la semivida proporcionados en el presente documento se contemplan. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar las propiedades biologicas del dominio prolongador de la semivida. Las variantes de secuencias de aminoacidos de un dominio prolongador de la semivida pueden prepararse introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleotidos que codifica el dominio prolongador de la semivida, o por slntesis peptldica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoacidos del dominio prolongador de la semivida. Cualquier combinacion de delecion, insercion y sustitucion puede realizarse para llegar a la construccion final, siempre que la construction final posea las caracterlsticas deseadas, por ejemplo, prolongar la semivida de la protelna de fusion. En el presente documento se proporcionan variantes de un dominio prolongador de la semivida que pueden ser un componente de cualquier polipeptido de fusion desvelado en el presente documento. En algunas realizaciones, la variante del dominio prolongador de la semivida es una variante de la region Fc. En la tecnica se conocen variantes de la region Fc, por ejemplo, Publication de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2010/02493852 y Publication de Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 2006/01341105. En algunas realizaciones, en la region Fc de un polipeptido de fusion proporcionado en el presente documento pueden introducirse una o mas modificaciones de aminoacidos, generando de este modo una variante de la region Fc. La variante de la region Fc puede comprender una secuencia de la region Fc humana (por ejemplo, una region Fc humana de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que comprende una modification de aminoacidos (por ejemplo, una sustitucion) en una o mas posiciones de aminoacidos. En algunas realizaciones, la region Fc comprende una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, de al menos 90 %, de al

menos 97 %, de al menos 98 % o de al menos 99 % con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que

consiste en SEQ ID NO: 7, 39, 41 y 42. En algunas realizaciones, la variante de la region Fc esta glucosilada.

Enlazador peptfdico de fusion

La presente divulgation proporciona un enlazador que puede ser un componente de cualquier protelna de fusion desvelada en el presente documento. Por ejemplo, pueden utilizarse peptidos flexibles cortos entre los dominios (por ejemplo, CID, VID y dominio prolongador de la semivida) del polipeptido fusionado para garantizar un correcto plegamiento de cada dominio y minimizar el impedimento esterico. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador peptldico. En algunas realizaciones, el enlazador es un peptido que comprende aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en glicina, alanina y serina. En algunas realizaciones, el enlazador comprende de 2 a 100 aminoacidos. En otras realizaciones, el enlazador comprende 100 o menos aminoacidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende 20 o menos aminoacidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende 15 o menos aminoacidos. En algunas realizaciones, el enlazador peptldico comprende 10 o menos aminoacidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende 6 o menos aminoacidos. En algunos aspectos, el enlazador

comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,

32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,

63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,

94, 95, 96, 97, 98, 99, pero no mas de 100 aminoacidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el enlazador se utiliza entre el CID y el dominio prolongador de la semivida. En algunas realizaciones, el enlazador se utiliza entre el VID y el dominio prolongador de la semivida. En otras realizaciones, el enlazador se utiliza entre el VID y el CID. En otras realizaciones mas, el enlazador se utiliza entre el VID y el dominio prolongador de la semivida y entre el CID y el dominio prolongador de la semivida. En otras realizaciones, el enlazador se utiliza entre el VID y el CID y entre el CID y el dominio prolongador de la semivida. En algunas realizaciones, el enlazador se utiliza entre el CID y el VID y entre el VID y el dominio prolongador de la semivida. En algunas realizaciones, un polipeptido de fusion comprende al menos un enlazador pero no mas de cuatro enlazadores. Por ejemplo, un polipeptido de fusion puede comprender un CID, un VID, una region Fc (Fc) y al menos un enlazador desde el extremo N al extremo C en un orden seleccionado del grupo que consiste en (1) VID, Fc, enlazador, CID; (2) CID, enlazador, Fc, enlazador, VID; (3) CID, enlazador, VID, Fc; (4) VID, enlazador, CID, enlazador, Fc; (5) Fc, enlazador, VID, enlazador, CID; y (6) Fc, enlazador, CID, enlazador, VID. En algunas realizaciones, el polipeptido de fusion comprende un CID, un VID, un Fc y un enlazador desde el extremo N al extremo C en el siguiente orden VID, Fc, enlazador, CID.

Protefnas de fusion

Como se desvela en el presente documento, las protelnas de fusion son polipeptidos que tienen especificidades de union por dos companeros de union diana diferentes. En algunas realizaciones, los polipeptidos de fusion son polipeptidos humanos. En algunas realizaciones, los polipeptidos de fusion comprenden una primera especificidad de union con un componente de la ruta del complemento (por ejemplo, C3b, C4b, iC3b, C3dg, C1q o MBP) y una segunda especificidad de union con un VEGF (por ejemplo, VEgF-A VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o P1GF). En algunas realizaciones, el polipeptido de fusion comprende una primera especificidad de union con un componente de la ruta del complemento de mamlferos (por ejemplo, de ser humano) y una segunda especificidad de union con un VEGF de mamlfero (por ejemplo, de ser humano). En algunas realizaciones, los polipeptidos de fusion se unen al mismo componente de la ruta del complemento como cualquiera de las protelnas reguladoras del complemento descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, los polipeptidos de fusion se unen al mismo componente de la ruta del complemento como uno cualquiera de CR1, Factor H, DAF, MCP o C4BP. En algunas

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realizaciones, los polipeptidos de fusion comprenden al menos un CID de cualquiera de los CID descritos en el presente documento. En algunos aspectos, un polipeptido de fusion comprende un CID que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16. En algunas realizaciones, los polipeptidos de fusion se unen al mismo componente de la ruta de VEGF como cualquiera de los VEGFR descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los polipeptidos de fusion se unen al mismo componente de la ruta de VEGF como uno cualquiera de VEGFR-1, VEGFR-2 o VEGFR-3. En algunas realizaciones, los polipeptidos de fusion comprenden al menos un VID de cualquiera de los VID descritos en el presente documento. En algunos aspectos, un polipeptido de fusion comprende un VID que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11. En otros aspectos, un polipeptido de fusion comprende un VID que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 38. Cualquiera de los polipeptidos de fusion desvelados en el presente documento que comprenden un CID y un VID pueden comprender adicionalmente un dominio prolongador de la semivida. En algunas realizaciones, el dominio prolongador de la semivida es una region Fc. En algunas realizaciones, la region Fc comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 39, 41 y 42. En algunas realizaciones, el polipeptido de fusion que comprende un CID, un VID y un dominio prolongador de la semivida que inhibe la ruta de activacion del complemento y de senalizacion de VEGf (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF). Cualquiera de los polipeptidos de fusion desvelados en el presente documento que comprenden un CID, un VID y un dominio prolongador de la semivida puede comprender adicionalmente un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el CID comprende al menos una SCR corta de una protelna reguladora del complemento (por ejemplo, de ser humano) de mamlfero. En realizaciones adicionales, el VID comprende una parte del dominio extracelular de un VEGFR de mamlfero (por ejemplo, de ser humano). En algunas realizaciones, el polipeptido de fusion comprende un CID que comprende al menos una SCR corta de una protelna reguladora del complemento humano y un VID que comprende una parte del dominio extracelular de un VEGFR humano. La invencion proporciona un polipeptido de fusion que comprende:

a) un CID que comprende la secuencia de aminoacidos de

QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRC RRKS CRNPPDP VN GM VH VIKDIQF G S QIKY S CTKG YRLIG S S S ATCIIS GNT VIWDNET PICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSN DDQYGIWSGPAPQCI (SEQ ID NO:4);

b) un VID que comprende la secuencia de aminoacidos de

GRPF VEMY SEIPEIIHMTEGREL VIPCRVT SPNIT VTLKKFPLDTLIPDGKRIIWD SRKG FIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVL NCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSD QGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO:l 1);

y

c) un dominio prolongador de la semivida que comprende la secuencia de aminoacidos de

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K (SEQ ID NO:39).

La invencion proporciona un polipeptido de fusion que comprende:

a) un CID que comprende la secuencia de aminoacidos de

imagen1

RRKS CRNPPDP VN GM YH YIKDIQF G S QIKY S CTKG YRLIG S S S ATCIIS GNT VIWDNET PICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSYYTYRCNPGSGGRKVFELYGEPSIYCTSN DDQVGIWSGPAPQCI (SEQ ID NO:4);

b) un VID que comprende la secuencia de aminoacidos de

DT GRPFVEMY SEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNIT VTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSR KGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKL VLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTR

SDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO:38); y

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY

VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

K (SEQ ID NO:39).

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En el presente documento se proporcionan polipeptidos de fusion que comprenden un CID, un VID y un dominio prolongador de la semivida en cualquier orden. Por ejemplo, un polipeptido de fusion puede comprender un CID, un VID y una region Fc (Fc) desde el extremo N al extremo C en un orden seleccionado del grupo que consiste en (1) VID, Fc, CID; (2) CID, Fc, VID; (3) CID, VID, Fc; (4) VID, CID, Fc; (5) Fc, VID, CID; y (6) Fc, CID, VID. En algunas 15 realizaciones, el polipeptido de fusion comprende un CID, un VID y una region Fc desde el extremo N al extremo C en el siguiente orden VID, Fc, CID. En algunas realizaciones, el polipeptido de fusion comprende la secuencia de aminoacidos de:

GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKG

FIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVL

NCT ARTELNV GIDFNWE YPS SKHQHKKL VNRDLKT Q SGSEMKKFLSTLTIDG VTRSD

QGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL

MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT

VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS

LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPI

GTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQ

FGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRE NFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI (SEQ IB-

NO:12^-(SEQ ID NO:44).

En otras realizaciones, el polipeptido de fusion comprende la secuencia de aminoacidos de:

QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRC RRKSCRNPPDP VNGMVHVIKDIQF GSQIKY SCTKGYRLIGS S S ATCIISGNT VIWDNET PICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSN DDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGF YP SDIAVEWESN GQPENNYKTTPP YLD SDGSFFL Y SKLT VDKSRWQQGNVF SC S VMHEALHNH YT QK SL SL SP GKGGGGGGGRPF VEM Y SEIPEIIHMTEGREL VIPCRVT S PNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLT HRQTNTIID V VL SP SHGIEL S V GEKLVLNCT ARTELN V GIDFNWE YP S SKHQHKKL VN RDLKT Q SGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGL YTC AAS SGLMTKKNSTF VRVHEK (SEQ ID NO:33).

5 En otras realizaciones adicionales, el polipeptido de fusion comprende la secuencia de aminoacidos de:

QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRC RRK S CRNPPDP VN GM VH VIKDIQF GS QIK Y SC TKGYRLIGS S SAT CIISGNT VIWDNET PICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHY GS VVTYRCNPGSGGRKVFEL VGEPSIY CT SN DDQ V GIW SGPAPQCIGGGGGGGRPF VEM Y SEIPEIIHMTEGREL VIPCRVT SPNIT VTL KKFPLDTLIPDGKRUWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNT IID VVL SP SHGIEL SVGEKLVLN C T ARTELN V GIDFNWE YP S SKHQHKKL VNRDLKT Q SGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGL YTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQ YNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:34).

En otras realizaciones adicionales, el polipeptido de fusion comprende la secuencia de aminoacidos de:

GRPF YEMY SEIPEIIHMTEGREL VIPCRVT SPNIT VTLKKFPLDTLIPDGKRIIWD SRKG

FIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVL

NCT ARTELNV GIDFNWE YPS SKHQHKKL VNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDG VTRSD

QGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPI

GTYFKYECRPGYYGRPFSIICFKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQ

FGSQIKYSCTKGYRFIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGFPPTITNGDFISTNRE

NFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFEFVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGD

KTHTCPPCPAPEFFGGPSVFFFPPKPKDTFMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV

DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVFTVFHQDWFNGKEYKCKVSNKAFPAPIEK

TISKAKGQPREPQVYTFPPSREEMTKNQVSFTCFVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY

KTTPPVFDSDGSFFFYSKFTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAFHNHYTQKSFSFSPG

(SEQ ID NO:35).

En otras realizaciones, el polipeptido de fusion comprende la secuencia de aminoacidos de: DKTHTCPPCPAPEFFGGPSVFFFPPKPKDTFMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVFTVFHQDWFNGKEYKCKVSNKAFPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTFPPSREEMTKNQVSFTCFVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVFDSDGSFFFYSKFTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAFHNHYTQKSFSFSPG GGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGREFVIPCRVTSPNITVTFKKFPFDTFIPDGKRII WDSRKGFIISNATYKEIGFFTCEATVNGHFYKTNYFTHRQTNTIIDVVFSPSHGIEFSV GEKFVFNCTARTEFNVGIDFNWEYPSSKHQHKKFVNRDFKTQSGSEMKKFFSTFTID GVTRSDQGFYTCAASSGFMTKKNSTFVRVHEKGGGGGGQCNAPEWFPFARPTNFT DEFEFPIGTYFKYECRPGYYGRPFSIICFKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMV HVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRFIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGFPPTITNGD FISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFEFVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI 5 (SEQ ID NO:36).

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY

VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

GGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWT

GAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNT

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VIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGE

PSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVT

SPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL

THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLV

NRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK

(SEQ ID NO:37).

DTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSR

KGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKL

VLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTR

SDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD

TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV

LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ

VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEF

PIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDI

QFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNR

ENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI (SEQ

ID NO:40).

Tambien se contemplan protelnas de fusion que comprenden al menos dos o mas CID, dos o mas VID, y/o dos o mas dominios prolongadores de la semivida. Por ejemplo, una protelna de fusion puede comprender dos CID, un VID y una region Fc desde el extremo N al extremo C en un orden de VID, Fc, CID, CID o en cualquier otra combinacion de los mismos. En una realization, la protelna de fusion puede comprender un CID, dos VID, y una region Fc del extremo N al extremo C en el siguiente orden VID, VID, Fc, CID o cualquier otra de sus combinaciones. En otra realizacion, la protelna de fusion puede comprender un CID, un VID y dos regiones Fc desde el extremo N al extremo C en el siguiente orden VID, Fc, CID, Fc o cualquier otra de sus combinaciones. En otra realizacion adicional, la protelna de fusion puede comprender al menos dos CID, al menos dos VID y al menos dos regiones Fc desde el extremo N al extremo C en el siguiente orden VID, Fc, VID, Fc, CID, CID o en cualquier otra de sus combinaciones. En el presente documento, cualquier combinacion de al menos un VID, al menos un CID, y al menos un dominio prolongador de la semivida se proporciona como si cada combinacion se hubiera definido expresamente en el presente documento.

Las protelnas de fusion descritas en la presente invention pueden comprender formas qulmicamente modificadas de los CID. Por ejemplo, los CID pueden estar PEGilados o conjugados con pollmeros para aumentar la semivida in vivo; o los CID pueden estar qulmicamente entrelazados con anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, regiones Fc, HSA, u otras protelnas humanas para aumentar la semivida in vivo; o los CID pueden formularse en cualquier formato de liberation sostenida, prolongada, para prolongar las actividades anti-complemento in vivo.

Las protelnas de fusion descritas en la presente invencion pueden comprender formas qulmicamente modificadas de los VID. Por ejemplo, los VID pueden estar PEGilados o conjugados con pollmeros para aumentar la semivida in vivo; o los VID pueden estar qulmicamente entrelazados con anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, regiones Fc, HSA, u otras protelnas humanas para aumentar la semivida in vivo; o los VID pueden formularse en cualquier formato de liberacion sostenida, prolongada, para prolongar las actividades anti-complemento in vivo.

Las protelnas de fusion descritas en la presente invencion pueden comprender formas qulmicamente modificadas de

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los CID y VID. Por ejemplo, los CID y los VID pueden estar PEGilados o conjugados con pollmeros para aumentar la semivida in vivo; o los CID y los VID pueden estar qulmicamente entrelazados con anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, regiones Fc, HSA, u otras protelnas humanas para aumentar la semivida in vivo; o los CID y los VID pueden formularse en un formato de liberacion sostenida, prolongada, para prolongar las actividades anti- complemento in vivo.

En algunas realizaciones, se contemplan variantes de secuencias de aminoacidos de las protelnas de fusion proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del CID, VID y/o del dominio prolongador de la semivida. Las variantes de secuencias de aminoacidos del polipeptido de fusion pueden prepararse introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleotidos que codifica el CID, el VID o el dominio prolongador de la semivida, o por slntesis peptldica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de restos en las secuencias de aminoacidos del CID, VID y/o dominio prolongador de la semivida. Cualquier combinacion de delecion, insercion y sustitucion puede prepararse para llegar a la construccion final, siempre que la construction final posea las caracterlsticas deseadas (por ejemplo, union a un componente del complemento, union a un VEGF, inhibition de la activation de la ruta del complemento, inhibicion de la activation de la ruta de VEGF, y/o prolongation de la semivida). En algunas realizaciones, el polipeptido de fusion comprende una identidad de secuencia de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, de al menos 90 %, de al menos

91 %, de al menos 92 %, de al menos 93 %, de al menos 94 %, de al menos 95 %, de al menos 96 %, de al menos

97 %, de al menos 98 %, de al menos 99 % con la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de fusion que comprende cualquiera del CID, VID y Fc como se desvela en el presente documento desde el extremo N al extremo C en un orden seleccionado del grupo que consiste en (1) VID, Fc, CID; (2) CID, Fc, VID; (3) CID, VID, Fc; (4) VID, CID, Fc; (5) Fc, VID, CID; y (6) Fc, CID, VID. En algunas realizaciones, la variante del polipeptido de fusion comprende una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, de al menos 90 %, de al menos 91 %, de al menos 92 %, de al menos 93 %, de

al menos 94 %, de al menos 95 %, de al menos 96 %, de al menos 97 %, de al menos 98 %, de al menos 99 % con

la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40.

Las sustituciones de restos de aminoacidos desveladas en el presente documento tambien incluyen sustituciones conservativas. Las sustituciones conservativas se muestran a continuation en la Tabla 2 con el encabezamiento de “sustituciones preferidas”. Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biologica, entonces pueden introducirse cambios mas sustanciales, denominados “sustituciones a modo de ejemplo” en la Tabla 2, o como se describe adicionalmente mas adelante en referencia a clases de aminoacidos, y los productos pueden identificarse. En cualquiera de los polipeptidos de fusion, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.), proporcionados en el presente documento, pueden introducirse las sustituciones de aminoacidos descritas en la Tabla 2.

Tabla 2. Posibles sustituciones de aminoacidos

Resto: Sustituciones Sustituciones

Original: A modo de ejemplo Preferidas

Ala (A): Val; Leu; Ile Val

Arg (R): Lys; Gln; Asn Lys

Asn (N): Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln

Asp(D): Glu; Asn Glu

Cys (C): Ser; Ala Ser

Gln (Q): Asn; Glu Asn

Glu (E): Asp; Gln Asp

Gly (G): Ala Ala

His (H): Asn; Gln; Lys; Arg Arg

Ile (I): Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu

Leu (L): Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile

Lys (K): Arg; Gln; Asn Arg

Met (M): Leu; Phe; Ile Leu

Phe (F): Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr

Pro (P): Ala Ala

Ser (S): Thr Thr

Thr (T): Val; Ser Ser

Trp (W): Tyr; Phe Tyr

Tyr (Y): Trp; Phe; Thr; Ser Phe

Val (V): Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

Las modificaciones sustanciales en las propiedades biologicas de las protelnas o polipeptidos se realizan seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptldico en la zona de la sustitucion, por ejemplo, como una conformation en lamina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los aminoacidos

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pueden agruparse de acuerdo con sus propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrofobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrofilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) acidos: Asp, Glu;

(4) basicos: His, Lys, Arg;

(5) restos que influyen en la orientacion de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromaticos: Trp, Tyr, Phe;

(7) hidrofobos grandes: Norleucina, Met, Val, Leu, Ile.

Las sustituciones no conservativas conllevan el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un metodo util para la identificacion de determinados restos o regiones de la protelna de fusion que son localizaciones preferidas para la mutagenesis se denomina “mutagenesis por barrido de alanina” como describen Cunningham y Wells en Science, 244: 1081-1085 (1989). En este caso, se identifica un resto o un grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplaza por un aminoacido neutro o con carga negativa (mas preferentemente alanina o polialanina) para influir en la interaccion de los aminoacidos con el companero de union a la diana. Aquellas localizaciones de aminoacidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan despues introduciendo otras variantes o variantes adicionales en, o por, los sitios de sustitucion. Por tanto, aunque el sitio para la introduccion de una variacion de secuencia de aminoacidos esta predeterminado, la naturaleza de la mutacion como tal no esta predeterminada. Por ejemplo, para analizar el comportamiento de una mutacion en sitio determinado, se realiza mutagenesis al azar o por barrido de alanina en el codon o region diana y las variantes del polipeptido de fusion expresadas se exploran con respecto a la actividad deseada.

Cualquier resto de cistelna que no este implicado en el mantenimiento de la correcta conformacion de los polipeptidos de fusion, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de semivida, etc.) tambien puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molecula e impedir que se produzca un entrecruzamiento aberrante. A la inversa, pueden anadirse uno o mas enlaces de cistelna a los polipeptidos de fusion, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de semivida, etc.), para mejorar su estabilidad.

En realizaciones adicionales, los peptidos o polipeptidos de la invencion pueden comprender uno o mas aminoacidos de origen no natural o modificado. Un “resto de aminoacido de origen no natural” se refiere a un resto, distinto de los restos de aminoacidos de origen natural indicados anteriormente, que tienen la capacidad de unirse por enlace covalente con uno o mas restos de aminoacidos adyacentes en una cadena polipeptldica. Los aminoacidos no naturales incluyen, pero sin limitacion, homolisina, homoarginina, homoserina, acido azetidin carboxllico, acido 2-aminoadlpico, acido 3-aminoadlpico, beta-alanina, acido aminopropionico, acido 2-aminobutlrico, acido 4-aminobutlrico, acido 6-aminocaproico, acido 2-aminoheptanoico, acido 2-aminoisobutlrico, acido 3- aminoisbutlrico, acido 2-aminopimelico, butilglicina terciaria, acido 2,4-diaminoisobutlrico, desmosina, acido 2,2'- diaminopimelico, acido 2,3-diaminopropionico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo- hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N- metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, citrulina, pentilglicina, acido pipecolico y tioprolina. Los aminoacidos modificados incluyen aminoacidos naturales y no naturales que estan qulmicamente bloqueados, reversible o irreversiblemente, o modificados en su grupo N amino terminal o en sus grupos de cadena lateral, tales como, por ejemplo, D y L aminoacidos N-metilados, grupos funcionales de cadena lateral que estan qulmicamente modificados con otro grupo funcional. Por ejemplo, los aminoacidos modificados incluyen sulfoxido de metionina; metionina sulfona, acido aspartico (beta-metil ester), un aminoacido modificado de acido aspartico; N-etilglicina, un aminoacido modificado de glicina; o alanina carboxamida y un aminoacido de alanina modificado. En la tecnica se conocen aminoacidos adicionales no naturales y modificados, y metodos de incorporacion de los mismos en protelnas y peptidos (vease, por ejemplo, Sandberg et al., (1998) J. Med. Chem. 41: 2481-91; Xie y Schultz (2005) Curr. Opin. Chem. Biol. 9: 548-554; Hodgson y Sanderson (2004) Chem. Soc. Rev. 33: 422-430.

Las inserciones en las secuencias de aminoacidos incluyen fusiones amino (“N”) y/o carboxilo (“C”) terminales, cuya longitud varla desde un resto a polipeptidos que contienen cien restos, o mas, as! como inserciones intrasecuencia de un solo resto de aminoacido, o de multiples restos de aminoacidos. Como ejemplos de inserciones terminales se incluyen un polipeptido de fusion con un resto de metionilo en el extremo N o el polipeptido de fusion fusionado a un polipeptido citotoxico. Otras variantes de insercion de la molecula polipeptldica de fusion incluyen la fusion, en el extremo N o C del polipeptido de fusion, con una enzima o un polipeptido que aumente la semivida en suero del polipeptido de fusion (por ejemplo, un dominio prolongador de la semivida).

La presente divulgacion proporciona un peptido senal que puede ser un componente de cualquiera de los polipeptidos de fusion proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, un polipeptido de fusion que comprende un CID, un VID y un dominio prolongador de la semivida puede comprender adicionalmente un polipeptido heterologo, preferentemente una secuencia senal u otro polipeptido que tenga un sitio de escision

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especlfico en el extremo N de la protelna madura o del polipeptido maduro. La secuencia senal heterologa seleccionada es preferentemente una que sea reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa senal) por celulas hospedadoras eucariotas. Para las celulas hospedadoras procariotas que no reconocen ni procesan secuencias senal nativas de mamlfero, la secuencia senal eucariota (es decir, de mamlfero) se reemplaza por una secuencia senal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en secuencias llder de genes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o enterotoxina II termoestable. Para la secrecion en levaduras, la secuencia senal nativa puede sustituirse, por ejemplo, por la secuencia llder de invertasa de levadura, la secuencia llder del factor (incluyendo las secuencias llder del factor de Saccharomyces y Kluyveromyces) o cualquier secuencia llder de fosfatasa acida, la secuencia llder de la glucoamilasa de C. albicans, o la senal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresion de celulas de mamlfero, se dispone de secuencias senal de mamlferos, as! como de secuencias llder secretoras de virus, por ejemplo, la senal Gd del virus del herpes simple. En algunas realizaciones, un polipeptido de fusion que comprende un VID, un CID y un dominio prolongador de la semivida, comprende adicionalmente un peptido senal que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 10 y 43. Un peptido senal puede estar completamente escindido del polipeptido de fusion a medida que se produce a partir de celulas hospedadoras o puede estar parcialmente escindido. Una poblacion mixta de polipeptidos de fusion puede producirse a partir de una celula hospedadora, donde los polipeptidos de fusion comprenden una secuencia senal completamente escindida (por ejemplo, una secuencia no senal), una secuencia senal parcialmente escindida (por ejemplo, parte de la secuencia senal) y/o una secuencia senal no escindida (por ejemplo, una secuencia senal completa). Por ejemplo, cualquier polipeptido de fusion desvelado en el presente documento, que comprende adicionalmente en su extremo N un peptido senal que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 10 y 43, puede estar parcialmente escindido en el extremo N. En una realizacion, un polipeptido de fusion que comprende adicionalmente un peptido senal en el extremo N puede escindirse en el extremo N por uno cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 restos de aminoacidos. En otra realizacion, un polipeptido de fusion que comprende adicionalmente un peptido senal en el extremo N, puede escindirse en el extremo N para producir un polipeptido de fusion que comprenda uno cualquiera de 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoacidos del peptido senal. En algunas realizaciones, un polipeptido de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, comprende adicionalmente un peptido senal que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9. En otras realizaciones, un polipeptido de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, comprende adicionalmente un peptido senal que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 o 43.

La presente invencion proporciona una protelna de fusion dimerica que comprende dos protelnas de fusion, comprendiendo cada protelna de fusion cualquier protelna de fusion desvelada en el presente documento. En una realizacion, la protelna de fusion dimerica comprende dos protelnas de fusion identicas. En otra realizacion, la protelna de fusion dimerica comprende dos protelnas de fusion diferentes. La protelna de fusion dimerica comprende al menos una protelna de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40. En otra realizacion, una protelna de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40 puede tener 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoacidos eliminados del extremo N o del extremo C. En una realizacion, la protelna de fusion se recupera de una celula hospedadora que comprende un acido nucleico que codifica dicha protelna de fusion como un dlmero de fusion de protelna.

IV. Acidos nucleicos, vectores y celulas hospedadoras

Acidos nucleicos

En el presente documento se proporcionan acidos nucleicos aislados que codifican cualquiera de los CID descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el CID comprende una secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17-22 y 29-32. La presente divulgacion proporciona adicionalmente una molecula de acido nucleico aislada, donde la molecula de acido nucleico codifica un CID que comprende una secuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, de al menos 90 %, de al menos 91 %, de al menos 92 %, de al menos 93 %, de al menos 94 %, de al menos 95 %, de al menos 96 %, de al menos 97 %, de al menos 98 %, de al menos 99 % o de 100 %, con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16. En el presente documento tambien se proporcionan acidos nucleicos aislados que codifican cualquiera de los VID descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el VID comprende una secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 27. Adicionalmente, en el presente documento se proporciona una molecula de acido nucleico aislada, donde la molecula de acido nucleico codifica un VID que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, a de al menos 90 %, de al menos 91 %, de al menos 92 %, de al menos 93 %, de al menos 94 %, de al menos 95 %, de al menos 96 %, de al menos 97 %, de al menos 98 %, de al menos 99 %, o de 100 %, con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11 y 38. En el presente documento tambien se proporcionan acidos nucleicos aislados que codifican cualquiera de los dominios prolongadores de la semivida

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descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el dominio prolongador de la semivida es una region Fc. En algunas realizaciones, en la region Fc comprende una secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 23. Adicionalmente, en el presente documento se proporciona una molecula de acido nucleico aislada, donde la molecula de acido nucleico codifica un dominio prolongador de la semivida que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, de al menos 90 %, de al menos 91 %, de al menos

92 %, de al menos 93 %, de al menos 94 %, de al menos 95 %, de al menos 96 %, de al menos 97 %, de al menos

98 %, de al menos 99 % o de 100 %, con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 39, 41 y 42. En el presente documento se proporcionan acidos nucleicos aislados que codifican cualquiera de los polipeptidos de fusion descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el polipeptido de fusion comprende una secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 28. En el presente documento tambien se proporciona una molecula de acido nucleico aislada, donde la molecula de acido nucleico codifica un polipeptido de fusion que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 %, de al menos 86 %, de al menos 87 %, de al menos 88 %, de al menos 89 %, de al menos 90 %, de al menos 91 %, de al menos 92 %, de al menos 93 %, de al menos 94 %, de al menos 95 %, de al

menos 96 %, de al menos 97 %, de al menos 98 %, de al menos 99 % o de 100 %, con la secuencia de aminoacidos

seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40.

Las secuencias de polinucleotidos que codifican cualquiera de los polipeptidos descritos en el presente documento (por ejemplo, CID, VID, dominios prolongadores de la semivida, enlazadores, polipeptidos de fusion, etc.) pueden obtenerse utilizando tecnicas sinteticas y/o recombinantes convencionales. Las secuencias de polinucleotidos deseadas pueden aislarse y secuenciarse de celulas de origen apropiado. Las celulas origen para anticuerpos, peptidos y/o polipeptidos incluirlan celulas productoras de anticuerpos, peptidos y/o polipeptidos, tales como celulas de hibridoma. Como alternativa, los polinucleotidos pueden sintetizarse utilizando un sintetizador de nucleotidos o tecnicas de PCR.

Vectores

Una vez obtenidas, las secuencias que codifican el peptido, y/o polipeptido, se insertan en un vector recombinante que puede replicarse y que puede expresar polipeptidos heterologos en una celula hospedadora. Muchos de los vectores disponibles y conocidos en la tecnica pueden utilizarse para la finalidad de la presente invention. La selection de un vector apropiado dependera principalmente del tamano de los acidos nucleicos que vayan a insertarse en el vector y de la celula hospedadora particular que vaya a transformarse con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su funcion (amplification o expresion del polinucleotido heterologo, o ambas cosas) y su compatibilidad con la celula hospedadora particular en la que reside. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero sin limitation: un origen de replication (en particular cuando el vector se inserta en una celula procariota), un gen marcador de seleccion, un promotor, un sitio de union a ribosoma (RBS, ribosome binding site), una secuencia senal, el inserto de acido nucleico heterologo y una secuencia de termination de la transcription. En algunas realizaciones, el vector es un vector de expresion. En algunas realizaciones, el vector comprende un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de un CID. En algunos aspectos, el vector comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un CID que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16. En algunas realizaciones, el vector comprende un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de un VID. En algunos aspectos, el vector comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un VID que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11 y 38. En algunas realizaciones, el vector comprende un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de un dominio prolongador de la semivida. En algunos aspectos, el dominio prolongador de la semivida es una region Fc. En la tecnica se conocen bien secuencias adecuadas de la region Fc. Por ejemplo, diversos vectores de expresion que codifican una o mas regiones Fc se encuentran disponibles en la coleccion americana de cultivos tipo (American Type Culture Collection (Rockville, MD)). En algunos aspectos, el vector comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una region Fc que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 39, 41 y 42. En algunas realizaciones, el vector comprende un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de un polipeptido de fusion. En algunos aspectos, el vector comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido de fusion que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 3337 y 40.

En algunas realizaciones, el vector comprende un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de un polipeptido de fusion que adicionalmente comprende un acido nucleico que codifica un peptido senal. El acido nucleico que codifica el peptido senal esta ligado en fase de lectura desde el acido nucleico que codifica el polipeptido de fusion. En algunos aspectos, el vector que comprende un acido nucleico que codifica un polipeptido de fusion comprende adicionalmente un acido nucleico que codifica un peptido senal que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 10 y 43. En algunos aspectos, el vector comprende un acido nucleico que codifica un polipeptido de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40 y un acido nucleico que codifica una secuencia senal que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 43. En algunos aspectos, el vector comprende un acido nucleico que codifica un polipeptido de fusion que comprende la secuencia

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de aminoacidos de SEQ ID NO: 12 y un acido nucleico que codifica una secuencia senal que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ iD NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 43. En otros aspectos, el vector comprende un acido nucleico que codifica un polipeptido de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 40 y un acido nucleico que codifica una secuencia senal que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 43. En una celula hospedadora pueden utilizarse vectores muy conocidos en la tecnica, as! como los vectores desvelados en el presente documento (por ejemplo, PCI-neo), para la replicacion y expresion de los polinucleotidos que codifican cualquiera de los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) desvelados en el presente documento

(1) Componente de secuencia senal

En algunas realizaciones, cada cistron dentro de un vector recombinante, comprende un componente de la secuencia senal de secrecion que dirige la translocacion de los polipeptidos expresados a traves de una membrana. En general, la secuencia senal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN del polipeptido diana que se inserta en el vector. La secuencia senal seleccionada para la finalidad de la invencion debe ser una que sea reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa senal) por la celula hospedadora. Para las celulas hospedadoras procariotas que no reconocen ni procesan las secuencias senal nativas para los polipeptidos heterologos, la secuencia senal se sustituye por una secuencia senal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en secuencias llder de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II termoestable (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En algunas realizaciones, la secuencia senal esta codificada por un acido nucleico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 25 y 26.

(2) Origen de replicacion

Los vectores tanto de expresion como de clonacion contienen una secuencia de acido nucleico que permiten que el vector se replique en una o mas celulas hospedadoras seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonacion esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosomico del hospedador, e incluye orlgenes de replicacion o secuencias que se replican de un modo autonomo. Dichas secuencias son muy conocidas para varias bacterias, levaduras y virus. El origen de replicacion del plasmido pBR322 es adecuado para la mayorla de las bacterias Gram negativas, el origen del plasmido 2 p es adecuado para levaduras y diversos orlgenes de virus (SV40, polioma, adenovirus, virus de la estomatitis vesicular (“VSV") o virus del papiloma bovino (“BPV") son utiles para los vectores de clonacion en celulas de mamlfero. Generalmente, el componente origen de replicacion no es necesariamente para vectores de expresion en mamlferos (el origen de SV40 puede usarse normalmente solo porque contiene el promotor temprano).

(3) Componente de gen de selection

Los vectores de expresion y clonacion tambien pueden contener un gen de seleccion, conocido como marcador de seleccion, que tiene la capacidad de proporcionar seleccion fenotlpica en las celulas transformadas. Los genes de seleccion tlpicos codifican protelnas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina; (b) complementan deficiencias auxotroficas o (c) proporcionan nutrientes cllnicos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli. Un ejemplo de un esquema de seleccion utiliza un farmaco que detiene el crecimiento de una celula hospedadora. Aquellas celulas que se transforman satisfactoriamente con un gen heterologo producen una protelna que confiere resistencia a farmacos y por lo tanto sobreviven al regimen de seleccion. Los ejemplos de dichas estrategias de seleccion dominantes utilizan los farmacos neomicina, acido micofenolico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores de seleccion adecuados para celulas de mamlfero son los que permiten la identification de celulas competentes para captar el polipeptido de fusion - o el fragmento polipeptldico de fusion- que codifica los acidos nucleicos, tales como dihidrofolato reductasa (“DHFR"), glutamina sintetasa (GS), timidina quinasa, metaloprotelna I y II, preferentemente genes de metalotionelna de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa y similares. Por ejemplo, las celulas transformadas con el gen de seleccion de DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contenga metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Un ejemplo de cepa de celula hospedadora para su uso con DHFR de tipo silvestre es la llnea celular de ovario de hamster chino (“CHO", Chinese Hamster Ovary) que carece de actividad DHFR (por ejemplo, ATCC CRL- 9096). Como alternativa, las celulas transformadas con el gen de GS (glutamina sintetasa) se identifican cultivando los transformantes en un medio de cultivo que contenga L-metionina sulfoximina (Msx), un inhibidor de GS. En estas condiciones, el gen de GS se amplifica junto con cualquier otro acido nucleico cotransformado. El sistema de seleccion/amplificacion de GS puede utilizarse en combination con el sistema de seleccion/amplificacion de DHFR descrito anteriormente.

Para otro ejemplo, E. coli se transforma normalmente utilizando pBR322, un plasmido procedente de la especie E. coli. El vector pBR322 contiene genes que codifican resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y por tanto proporciona un medio facil para la identificacion de celulas transformadas. pBR322, sus derivados, u otros plasmidos microbianos o bacteriofagos tambien pueden contener, o modificarse para que contengan, promotores que puede utilizar el organismo microbiano para la expresion de protelnas endogenas.

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Un gen de seleccion adecuado para su uso en levaduras es el gen trpl presente en el plasmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de seleccion para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en un medio que contenga triptofano (por ejemplo, ATCC n.° 44076 o PEP4-1). Jones, Genetics, 85: 12 (1977). Por tanto, la presencia de la lesion trpl en el genoma de la celula hospedadora de levadura proporciona un entorno eficaz para detectar la transformacion a traves del crecimiento en ausencia de triptofano. De manera similar, las cepas de levadura con deficit de Leu2 (por ejemplo, ATCC 20.622 o 38.626) pueden complementarse por plasmidos conocidos portadores del gen Leu2. Adicionalmente, para la transformacion de levaduras del genero Kluyveromyces pueden utilizarse vectores procedentes del plasmido circular pKD1 de 1,6 pm. Como alternativa, en Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990), se publico un sistema de expresion para la produccion a gran escala de quimosina de ternera recombinante para K. lactis. Tambien se han descrito, Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968 - 975 (1991), vectores de expresion de copias multiples estables para la secrecion de albumina madura de suero humano recombinante por cepas industriales de Kluyveromyces.

Adicionalmente, como vectores transformantes junto con estos hospedadores, pueden utilizarse vectores de fagos que contienen secuencias de replicon y de control que sean compatibles con los microorganismos hospedadores. Por ejemplo, en la creacion de un vector recombinante que pueda utilizarse para transformar celulas hospedadoras susceptibles, tales como E. coli LE392, puede utilizarse un bacteriofago, tal como AGEM.TM.-11,

(4) Componente promotor

Los vectores de expresion y clonacion normalmente contienen un promotor que reconoce el organismo hospedador y que esta unido operativamente al acido nucleico que codifica los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongado de la semivida, etc.). Los promotores adecuados para su uso con hospedadores procariotas incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de lactamasa y lactosa, el promotor de fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptofano y promotores hlbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, tambien son adecuados otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores de bacterias o fagos conocidos).

En la presente invencion pueden utilizarse promotores constitutivos o inducibles segun las necesidades de una situacion particular, que pueden determinar un experto en la tecnica. Se conocen bien diversos promotores reconocidos por diversas posibles celulas hospedadoras. El promotor seleccionado puede unirse operativamente a un ADN cistronico que codifique un polipeptido descrito en el presente documento, eliminando el promotor del ADN origen mediante digestion con enzimas de restriccion e insertando la secuencia promotora aislada en el vector de eleccion. Para la amplification y/o expresion directa de los genes diana puede utilizarse tanto la secuencia promotora nativa como muchos promotores heterologos. Sin embargo, se prefiere utilizar promotores heterologos, ya que, en general, permiten obtener una mayor transcription y mayores producciones del gen diana expresado, en comparacion con el promotor polipeptldico diana nativo.

Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Practicamente, todos los genes eucariotas tienen una region rica en AT, localizada aproximadamente de 25 a 30 bases aguas arriba del sitio donde se inicia la transcripcion. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases aguas arriba desde el inicio de la transcripcion de muchos genes es la region CNCAAT, en la que N puede ser cualquier nucleotido. En el extremo 3' de la mayorla de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la senal para la adicion de la cola poliA en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias pueden insertarse en vectores de expresion eucariotas.

Como ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con hospedadores de levadura se incluyen las secuencias promotoras para la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucollticas, tales como enolasa, gliceraldehldo-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6- fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Los promotores inducibles en levaduras tienen la ventaja adicional de permitir la transcripcion controlada por condiciones de crecimiento. Como ejemplos de promotores inducibles se incluyen las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa acida, las enzimas degradativas asociadas al metabolismo del nitrogeno, la metalotionelna, la gliceraldehldo-3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilization de maltosa y galactosa. Adicionalmente, en el documento EP 73.657, se describen vectores y promotores adecuados para su uso en la expresion en levaduras. Ventajosamente, tambien se utilizan potenciadores de levaduras con promotores de levaduras.

La transcripcion de acidos nucleicos que codifican polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) a partir de vectores en celulas hospedadoras de mamlfero puede controlarse, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como poliomavirus, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), papilomavirus bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y, mas preferentemente, virus del simio 40 (SV40), por promotores de mamlfero heterologos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y mediante promotores de genes

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de choque termico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la celula hospedadora deseada.

Los promotores temprano y tardio del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restriccion de SV40 que tambien contiene el origen de replicacion del virus SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restriccion HindIII E. En la Patente de Estados Unidos n.° 4.419.446 se desvela un sistema para expresar ADN en hospedadores de mamifero que utiliza el papilomavirus bovino como un vector. Una modificacion de este sistema se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 4.601.978. Vease tambien Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982), con respecto a metodos para la expresion de ADNc de interferon humano en celulas de raton bajo el control de un promotor de timidina quinasa procedente del virus del herpes simple. Como alternativa, como promotor, puede utilizarse el Virus del Sarcoma de Rous con repeticion terminal larga.

(5) Componente de elemento potenciador

La transcripcion de un ADN que codifica los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) por eucariotas superiores a menudo se aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamifero (globina, elastasa, albumina, a-fetoproteina e insulina). Sin embargo, normalmente, un experto habitual en la tecnica utilizara un potenciador de un virus eucariota. Como ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardio del origen de replicacion (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardio del origen de replicacion y potenciadores de adenovirus. Vease tambien Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) acerca de elementos de potenciacion para la activacion de promotores eucariotas. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posicion 5' o 3' con respecto a las secuencias codificantes de la proteina de fusion, o al fragmento de la proteina de fusion, pero preferentemente se localiza en el lado 5' del promotor.

(6) Componente de terminacion de la transcripcion

Los vectores de expresion utilizados en celulas hospedadoras eucariotas (celulas de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, ser humano o nucleadas de otros organismos multicelulares) tambien contendran secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion y para la estabilizacion del ARNm. Dichas secuencias se encuentran disponibles normalmente desde las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de los ADN o ADNc eucariotas o de virus. Estas regiones contienen segmentos nucleotidicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica anticuerpos o fragmentos de los mismos. Un componente de terminacion de la transcripcion util es la region de poliadenilacion de la hormona del crecimiento bovino. Vease el documento WO94/11026 y el vector de expresion desvelado en su interior.

Celulas hospedadoras

Como celulas hospedadoras adecuadas para la clonacion o expresion del ADN que codifica los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) en los vectores descritos en el presente documento, se incluyen las celulas procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados para esta finalidad incluyen eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, asi como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrita en DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un hospedador de clonacion de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque tambien son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

Los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) pueden producirse en bacterias, en particular, cuando no se requiere glucosilacion, tal como cuando los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) se conjugan con un agente citotoxico (por ejemplo, una toxina). La produccion en E. coli es mas rapida y mas rentable. Para la expresion de polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) en bacterias, veanse, por ejemplo, los documentos U.S. 5.648.237 (Carter et. al.), U.S. 5.789.199 (Joly et al.) y U.S. 5.840.523 (Simmons et al.) que describen la region de inicio de la traduccion (TIR, translation initiation region) y secuencias senal para optimizar la expresion y secrecion. Despues de la expresion, los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) se aislan del concentrado celular de E. coli en una fraccion soluble y pueden purificarse a traves de, por ejemplo, una columna de proteina A o G dependiendo de la parte de union del polipeptido de fusion, tal como el isotipo de la region Fc. La purificacion final puede realizarse a traves del mismo proceso utilizado para purificar polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) expresados, por ejemplo, en celulas CHO.

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Ademas de los microbios procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son tambien hospedadoras de expresion o de clonacion adecuados para los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) que codifican vectores. Saccharomyces cerevisiae, o levadura comun de panadero, es la especie mas normalmente utilizada entre los microorganismos hospedadores eucariotas inferiores. Sin embargo, habitualmente tambien pueden utilizarse y son utiles en el presente documento, diversos otros generos, especies y cepas, tales como Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces spp., tales como K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospedadores de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Para una revision del analisis del uso de las levaduras y hongos filamentosos para la produccion de protelnas terapeuticas, vease, por ejemplo, Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004).

Pueden seleccionarse determinadas cepas y hongos de levaduras en los que las rutas de glucosilacion se han “humanizado”, dando como resultado la produccion de polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) con un patron de glucosilacion parcial o completamente humano. Vease, por ejemplo, Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006) (que describen la humanizacion de la ruta de glucosilacion en Pichia pastoris); y Gerngross et al., citados anteriormente.

Las celulas hospedadoras adecuadas para la expresion de polipeptidos de fusion glucosilados o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) proceden de organismos multicelulares. Como ejemplos de celulas de invertebrados se incluyen celulas vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y celulas hospedadoras de insectos permisivas correspondientes de hospedadores tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori (polilla). Diversas cepas de virus para la transfeccion se encuentran disponibles al publico, por ejemplo, la variante L-1 del NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 del NPV de Bombyx mori. Dichos virus pueden utilizarse como los virus del presente documento de acuerdo con la presente divulgacion, particularmente para la transfeccion de celulas de Spodoptera frugiperda.

Como hospedadores tambien pueden utilizarse cultivos de celulas vegetales de algodon, malz, patata, semilla de soja, petunia, tomate y tabaco.

Sin embargo, las celulas de vertebrados han suscitado un gran interes y su propagacion en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Son ejemplos utiles de llneas de celulas hospedadoras de mamlfero la llnea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la llnea de rinon embrionario humano (celulas 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspension, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); celulas de rinon de crla de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); celulas de rinon de mono (CV1 AtCC CCL 70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC cRl-1587); celulas de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de rinon de rata bufalo (BRL 3A, AtCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de hlgado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (MMT 060562, ATCC CCL51); celulas TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y una llnea de hepatoma humano (Hep G2). Otras llneas de celulas hospedadoras de mamlfero incluyen celulas de ovario de hamster chino (CHO), incluyendo celulas CHO DHFR- (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); y llneas de celulas de mieloma tales como NS0 y Sp2/0. Para una revision de determinadas llneas de celulas hospedadoras de mamlfero adecuadas para la produccion de polipeptidos, vease, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pags. 255-268.

Puede seleccionarse ejemplos de celulas de mamlfero capaces de expresar cualquiera de las protelnas desveladas en el presente documento del grupo que consiste en una celula de hamster, una celula de raton, una celula de rata, una celula de conejo, una celula de gato, una celula de perro, una celula de bovino, una celula de cabra, una celula de porcino, una celula de equino, una celula de oveja, una celula de mono, una celula de chimpance y una celula de ser humano. En otra realizacion, la celula animal es una celula neuronal (tal como, pero sin limitacion, una celula del sistema nervioso periferico o una celula del sistema nervioso central), una celula de musculo (tal como una celula de musculo cardiaco, esqueletico o liso), un gameto (tal como un espermatozoide o un oocito), una celula cancerosa, una celula inmunitaria (tal como, pero sin limitacion, un macrofago, un linfocito T o un linfocito B), una celula madre (tal como, pero sin limitacion, una celula madre embrionaria, o una celula madre adulta) o una celula endocrina (tal como, pero sin limitacion, una celula tiroidea, una celula hipotalamica, una celula de la pituitaria, una celula adrenal, una celula de testlculo, una celula de ovario, una celula pancreatica (tal como una celula p), una celula de estomago o una celula intestinal). En algunas realizaciones, la celula es una celula humana en un cultivo celular. En algunas realizaciones, la celula es una celula no humana en un cultivo celular. En algunas realizaciones, la celula es una celula cancerosa.

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Las celulas hospedadoras se transforman o transfectan con los vectores de expresion o clonacion anteriormente descritos para la produccion de los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) y se cultivan en medios con nutrientes convencionales modificados segun sea apropiado para promotores de induccion, seleccion de transformantes o amplification de los genes que codifican las secuencias deseadas.

Transfection se refiere a la captation de un vector de expresion por una celula hospedadora tanto si cualquiera de las secuencias codificantes se expresan de hecho como si no. El experto habitual en la materia conoce numerosos metodos de transfeccion, por ejemplo, precipitation con CaPO4 y electroporation. En general, una transfeccion satisfactoria se reconoce cuando dentro de la celula hospedadora se produce cualquier indication de la operation de este vector.

Transformation significa la introduction de ADN en el hospedador procariota de tal manera que el ADN puede replicarse, bien como un elemento extracromosomico o mediante un integrante cromosomico. Dependiendo de la celula hospedadora utilizada, la transformacion se realiza utilizando tecnicas convencionales apropiadas para dichas celulas. El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio se utiliza generalmente para celulas bacterianas que contienen barreras sustanciales en las paredes celulares. Otro metodo para la transformacion emplea polietilenglicol/DMSO. Otra tecnica que puede utilizarse es la electroporacion.

V. Metodos de produccion de polipeptidos de fusion y fragmentos de los mismos

En el presente documento se proporcionan metodos para la produccion de polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) de la invention como se desvela en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo para la produccion de cualquier polipeptido de fusion como se desvela en el presente documento, comprende cultivar una celula hospedadora que comprende el acido nucleico que codifica cualquiera de los polipeptidos de fusion desvelados en el presente documento en un estado que produce el polipeptido de fusion y la recuperation del polipeptido de fusion producido por la celula hospedadora. En algunos aspectos, un metodo para la produccion de un polipeptido de fusion comprende cultivar la celula hospedadora que comprende el acido nucleico que codifica el polipeptido de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40 en un estado que produzca el polipeptido de fusion y recuperar el polipeptido de fusion producido por la celula hospedadora.

(1) Cultivo de las celulas hospedadoras

Las celulas procariotas utilizadas para producir los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) de la invencion, se cultivan en medios conocidos en la tecnica y adecuados para el cultivo de las celulas hospedadoras seleccionadas. Como ejemplos de medios adecuados se incluyen el caldo de luria (LB, luria broth) ademas de complementos nutrientes necesarios. En realizaciones preferidas, los medios tambien contienen un agente de seleccion, escogido basandose en la construction del vector de expresion, para permitir el crecimiento selectivo de las celulas procariotas que contienen el vector de expresion. Por ejemplo, para el crecimiento de celulas que expresen el gen de resistencia a ampicilina se anade penicilina al medio. Cualquiera de los complementos necesarios, ademas de fuentes de carbono, nitrogeno y fosfato inorganico, tambien pueden incluirse a concentraciones apropiadas introducidas solas o como una mezcla con otro complemento o medio, tal como una fuente de nitrogeno compleja. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o mas agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutation, cistelna, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol. Las celulas hospedadoras procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el crecimiento de E. coli, por ejemplo, la temperatura preferida varla de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 39 °C, mas preferentemente de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 37 °C, incluso mas preferentemente a aproximadamente 30 °C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varla de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo hospedador. Para E. coli, el pH es preferentemente de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, y mas preferentemente de aproximadamente 7,0. Si se utiliza un promotor inducible en el vector de expresion, la protelna de expresion se induce en condiciones adecuadas para la activation del promotor. Por ejemplo, si se utiliza un promotor PhoA para el control de la transcription, las celulas hospedadoras transformadas pueden cultivarse en un medio limitante de fosfato para la induccion. Pueden utilizarse diversos otros inductores, de acuerdo con la construccion de vector empleada, como se sabe en la tecnica.

Las celulas hospedadoras utilizadas para producir los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) descritas en el presente documento, pueden cultivarse en diversos medios. Los medios disponibles en el comercio tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mlnimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para el cultivo de las celulas hospedadoras. Ademas, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980), en las patentes de Estados Unidos N.° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; en publicaciones WIPO N° WO 90/03430; WO 87/00195; o en la Patente de Estados Unidos Re. 30.985, pueden utilizarse como medios de cultivo para las celulas hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede complementarse si fuera necesario con hormonas y/u otros factores de

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crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidermico), sales (tales como cloruro de sodio, de calcio, de magnesio y de fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleotidos (tales como adenosina y timidina), antibioticos (tal como el farmaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorganicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o cualquier fuente de energla equivalente. Tambien puede incluirse cualquier otro complemento necesario a concentraciones apropiadas que serlan conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son las previamente utilizadas con la celula hospedadora seleccionada para la expresion, y sera obvio para el experto habitual en la materia.

(2) Purificacion de polipeptidos de fusion y fragmentos de los mismos

Cuando se utilizan tecnicas recombinantes, los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) descritos en el presente documento, pueden producirse intracelularmente, en el espacio periplasmatico, o secretarse directamente al medio. Si los polipeptidos se producen intracelularmente, como una primera etapa, la recuperacion de la protelna implica normalmente alterar el microorganismo, generalmente por medios tales como choque osmotico, tratamiento con ultrasonido o lisis. Una vez alteradas las celulas, los desechos de partlculas de celulas hospedadoras o de fragmentos lisados se retiran, por ejemplo, por centrifugacion o ultracentrifugacion. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para el aislamiento de polipeptidos que se secretan al espacio periplasmatico de E. coli. En resumen, el concentrado celular se descongela en presencia de fosfato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los desechos celulares pueden retirarse por centrifugacion. Cuando los polipeptidos se secretan al medio, generalmente los sobrenadantes de dichos sistemas de expresion se filtran primero y se concentran utilizando un filtro de concentration de protelnas disponible en el comercio, por ejemplo, una unidad de ultrafiltracion Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa, tal como PMSF, puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse antibioticos para impedir el crecimiento de contaminantes ocasionales.

Las composiciones de polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) preparadas a partir de dichas celulas, pueden purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografla de hidroxiapatita, electroforesis en gel, dialisis, y cromatografla de afinidad, siendo la cromatografla de afinidad la tecnica de purificacion preferida. En algunas realizaciones, se utiliza protelna A o protelna G como un ligando de afinidad para su uso en cromatografla de afinidad. La idoneidad de la protelna A como un ligando de afinidad, depende de la especie y del isotipo de cualquier region Fc de inmunoglobulina que este presente en los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983). En una realization preferida, la protelna A se utiliza como un ligando de afinidad para aislar y purificar polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se utiliza la protelna G como un ligando de afinidad para el aislamiento y purificacion de polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) como se describe en el presente documento. La matriz a la cual esta unido el ligando de afinidad es mas frecuentemente agarosa, pero se dispone tambien de otras matrices. Las matrices mecanicamente estables, tales como vidrio de poro controlado o poli(estireno-divinil)benceno, permiten caudales mas rapidos y tiempos de procesamiento mas cortos de los que pueden conseguirse con la agarosa. Otras tecnicas para la purificacion de protelnas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio ionico, precipitation con etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografla en sllice, heparina, SEPHAROSE™, o resinas de intercambio anionico o cationico (tales como una columna de acido poliaspartico), as! como cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitacion con sulfato de amonio, tambien se encuentran disponibles dependiendo de los polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) que vayan a recuperarse. En algunas realizaciones, la protelna de fusion recuperada es sustancialmente pura. En una realizacion adicional, la protelna de fusion recuperada tiene una pureza de al menos cualquiera de 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

Despues de realizar cualquiera de una etapa o mas de purificacion preliminar, la mezcla que comprende el polipeptido de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) de interes, y contaminantes, puede someterse a cromatografla de interaction hidrofoba a pH bajo, utilizando un tampon de elucion a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, preferentemente realizarse a concentraciones salinas bajas (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25 M de sal).

En general, en la tecnica hay establecidas varias metodologlas para la preparation de polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) para su uso en investigation, ensayo, y aplicaciones cllnicas, coherentes con las metodologlas descritas anteriormente y/o segun considere apropiado el experto en la materia para polipeptidos de fusion o fragmentos de los mismos (por ejemplo, CID, VID, dominio prolongador de la semivida, etc.) particulares, de interes.

(3) Actividades biologicas de los polipeptidos de fusion y fragmentos de los mismos

Los polipeptidos pueden purificarse e identificarse utilizando metodos habitualmente conocidos, tales como

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fraccionamiento en columnas de intercambio ionico o de inmunoafinidad; precipitacion con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia en silice o en una resina de intercambio cationico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS- PAGE; precipitacion con sulfato de amonio; filtracion en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; resinas de afinidad hidrofoba; afinidad por ligando utilizando un companero de union adecuado inmovilizado en una matriz, ensayo ELISA, BIACore, transferencia de Western, secuenciacion de aminoacidos y de acido nucleico, y actividad biologica.

Las actividades biologicas de las proteinas de fusion desveladas en el presente documento pueden caracterizarse o evaluarse, incluyendo, pero sin limitacion, la afinidad por un companero de union a diana (por ejemplo, VEGF o proteina del complemento), union competitiva (por ejemplo, bloqueando el companero de union a diana para la proteina reguladora de complemento VEGF), actividad inhibidora (por ejemplo, inhibicion de la activacion del complemento o activacion de VEGF), semivida o la proteina de fusion, inhibicion de la proliferacion celular, inhibicion del crecimiento tumoral e inhibicion de la angiogenesis (por ejemplo, neovascularizacion coroidea). En algunas realizaciones, las actividad biologica de las proteinas de fusion desveladas en el presente documento puede evaluarse in vivo e in vitro. En cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento, el ensayo se realiza a la temperatura de 4 °C, 20-28 °C (por ejemplo, 25 °C) o 37 °C.

La afinidad por un companero de union, tal como una proteina del complemento (por ejemplo, C3b, C4b, iC3b, C3dg, C1q o MBP), de las proteinas de fusion desveladas en el presente documento, puede evaluarse. En la tecnica se conocen muchos metodos para evaluar la afinidad de union y pueden utilizarse para identificar las afinidades de union de las proteinas de fusion por un companero de union. Las afinidades de union pueden expresarse como valores de constante de disociacion (Kd) o como valores de concentration que causa el 50% del efecto maximo (CE50). En la materia se conocen bien tecnicas para determinar las afinidades de union (por ejemplo, valores de Kd), tales como Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) y BIAcore. Vease, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Publications, NY (1988); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, (2009); Altschuh et al., Biochem., 31: 6298 (1992); y el metodo BIAcore desvelado en Pharmacia Biosensor. Por ejemplo, las afinidades de union de las proteinas de fusion por un companero de union pueden determinarse utilizando ELISA. En algunas realizaciones, la union de proteinas de fusion con C3b o C4b se ensaya utilizando ELISA. En este ensayo a modo de ejemplo, los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos se revisten con 100 ng/pocillo de C3b o C4b. Aproximadamente 0 - 1 pM de proteina de fusion purificada se anade a cada pocillo y se incuba durante 1 hora antes de lavar para retirar el C3b o C4b no unido. Posteriormente, a cada pocillo se anade una dilution de 1:5000 de un anti-Fc conjugado con HRP (por ejemplo, Sigma Catalogo N.° A0170- 1ML) y se incuba durante 1 hora. Despues de la incubation, los pocillos se lavan antes de la adicion de un reactivo de detention para Sustrato TMB (por ejemplo, Sigma Catalogo N.° S5814-100ML). La absorbancia de la muestra se mide a una DO de 450 nm y se analiza mediante un ajuste de curva sigmoidea, utilizando un programa informatico (por ejemplo, Prism4) para obtener un valor de Kd y/o un valor de CE50 para la union de la proteina de fusion con C3b o C4b. En un ejemplo adicional, la union de las proteinas de fusion con un VEGF (por ejemplo, VEGF-A, VEGF- B, VEGF-C, VEGF-D o P1GF) se ensaya utilizando ELISA. En un ensayo a modo de ejemplo, una placa ELISA de 96 pocillos se reviste con 100 ng de VEGF-A (por ejemplo, R&D Systems) y a cada pocillo se le anade aproximadamente 0 - 10 nM de proteina de fusion purificada, antes de la incubacion durante 1 hora. Despues de lavar, a cada pocillo se le anade una dilucion de 1:5000 de un anti-Fc conjugado con HRP para una incubacion de 1 hora antes de lavar y anadir a cada pocillo un reactivo de detencion para sustrato TMB. La absorbancia de la muestra se mide a una DO de 450 nm y se analiza mediante un ajuste de curva sigmoidea utilizando un programa informatico para obtener un valor de Kd y/o un valor de CE50 para la union de la proteina de fusion con un VEGF-A. En un ejemplo de ensayo adicional, la union de las proteinas de fusion con un VEGF soluble se ensaya mediante ELISA utilizando el Kit de ELISA Quantikine para VeGf Humano (R&D Systems Catalogo N.° DVE00).

La actividad inhibidora de una ruta del complemento (por ejemplo, la ruta clasica, la ruta alternativa y/o la ruta de la lectina) de las proteinas de fusion desveladas en el presente documento puede evaluarse. En la tecnica se conocen muchos metodos para evaluar la actividad inhibidora y pueden utilizarse para identificar la actividad inhibidora de una proteina de fusion. Las afinidades de union pueden expresarse como valores de concentracion que causa el 50% del efecto maximo (CE50). Por ejemplo, la actividad inhibidora de la ruta de clasica del complemento o de la ruta de la lectina mediante una proteina de fusion, puede determinarse utilizando un ensayo de complemento hemolitico total (CH50). En este ensayo a modo de ejemplo, primero se determina una dilucion de suero humano normal que produce la lisis del 90 % de 1 x 107 eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpo/ml despues de 1 hora de incubacion a 37 °C. El ensayo puede realizarse en un tampon que contenga CaCl2 0,15 mM y MgCh 0,5 mM. La inhibicion de la ruta clasica del complemento se activa mezclando la dilucion de suero humano normal que puede producir la lisis del 90 % de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpo con 0 - 500 mM de una proteina de fusion durante 1 hora a 37 °C. La hemolisis de los eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpo se ensaya despues de 1 hora de incubacion midiendo la absorbancia a una DO de 541 nm antes del analisis mediante ajuste de curva sigmoidea, utilizando un programa informatico (por ejemplo, Prism4) para obtener un valor de CE50 para la actividad inhibidora de la ruta clasica del complemento o de la ruta de la lectina mediante la proteina de fusion. En un ensayo a modo de ejemplo adicional, la actividad inhibidora de la ruta alternativa del complemento mediante una proteina de fusion se determina a traves de la inclusion de acido tetraacetico de etilenglicol (EGTA) para la quelacion de iones calcio en el tampon utilizado en el ensayo CH50. En algunas realizaciones, la actividad inhibidora de una ruta del complemento por una proteina de fusion es la inhibicion de la actividad aceleradora de la

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descomposicion (DAA) para la C3-convertasa alternativa. En otra realization, la actividad inhibidora de una ruta de complemento por una protelna de fusion es la inhibition de la actividad aceleradora de la descomposicion (DAA) para la C3-convertasa alternativa. La inhibicion de DAA por una protelna de fusion puede determinarse por metodos conocidos en la materia as! como por cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento (por ejemplo, Ejemplo 7). Para un ejemplo de ensayo CH50 vease Costabile, M., (2010). J. Vis. Exp. 29(37): 1923.

En cualquiera de las realizaciones del presente documento, una protelna de fusion tiene una CE50 de < 1 uM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menor, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo de 10-9 M a 10-13 M) para la inhibicion de una actividad (por ejemplo, inhibicion de la actividad del complemento y/o actividad de VEGF). En cualquiera de las realizaciones del presente documento, una protelna de fusion tiene una Kd por un companero de union (por ejemplo, protelna de complemento y/o VEGF) menor que aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1,0 mM, 50 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 400 nM, 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM,95 nM, 90 nM, 85 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 65 nM, 60 nM, 55 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12,5 pM, 6,25 pM, 5 pM, 4 pM o 3pM, inclusive, incluyendo cualquiera de los valores entre estos numeros. En algunas realizaciones, las variantes de los polipeptidos de fusion descritas en el presente documento, se unen a un companero de union con una mayor afinidad en comparacion con la union de un polipeptido de fusion de tipo silvestre descrito en el presente documento. En algunos aspectos, la variante del polipeptido de fusion se une a un companero de union con una afinidad de al menos cualquiera de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000, inclusive, incluyendo cualquier valor entre estos numeros, veces mayor en comparacion con la union del companero de union mediante un polipeptido de fusion que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 33-37 y 40.

En algunas realizaciones, las protelnas de fusion desveladas en el presente documento pueden evaluarse con respecto a actividades anti-proliferativas tales como reduction de la proliferation celular o crecimiento tumoral. En la tecnica se conocen muchos metodos para evaluar las propiedades anti-proliferativas de una protelna de fusion. En un ensayo a modo de ejemplo, pueden utilizarse celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) para demostrar la inhibicion de la proliferacion celular dependiente de VEGF. En este ensayo, las celulas HUVEC se mantienen en Medio de Crecimiento Celular Endotelial (por ejemplo, Lonza, Inc.) con FBS al 2 %. A los pocillos de una placa de microtitulacion de fondo plano de 96 pocillos recubierta con colageno se anaden aproximadamente 50 pl de 1 nM de VEGF-A y diversas concentraciones de la protelna de fusion. A cada pocillo se anaden aproximadamente 50 pl de celulas HUVEC a 1 x 105 celulas/ml en Medio-199 (por ejemplo, Hyclone, Inc.) y se incuba durante 72 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Despues de la incubation, la proliferacion celular se ensaya anadiendo 10 pl de CCK-8 (por ejemplo, Dojindo, Inc.) a cada pocillo y despues midiendo la absorbancia a una DO de 450/650 nm para determinar la inhibicion de la proliferacion celular por la protelna de fusion. En un ensayo a modo de ejemplo in vivo, la inhibicion de crecimiento tumoral se ensaya en ratones con xenoinjerto portadores de tumores procedentes de un determinado tipo de cancer (por ejemplo, carcinoma hepatocelular, cancer colorrectal, etc.). En este ensayo, diversas concentraciones de la protelna de fusion se administran a los ratones a un regimen de dosificacion particular y el crecimiento tumoral se mide al menos dos veces durante un periodo de tiempo para determinar la inhibicion del crecimiento tumoral mediante la protelna de fusion. En algunas realizaciones, las propiedades anti-angiogenicas de una protelna de fusion se miden utilizando tecnicas muy conocidas en la materia. En un ensayo a modo de ejemplo, se utiliza un modelo animal de degeneration macular humeda relacionada con la edad para ensayar la inhibicion de la neovascularization en el ojo por la protelna de fusion. En este ensayo, se suministra fotocoagulacion con diodo laser a la retina del animal (por ejemplo, raton, mono, etc.) para obtener neovascularizacion coroidea (CNV) y se administra la protelna de fusion. Las lesiones de CNV en los ojos de los animales (por ejemplo, ratones, ratas y monos), utilizando tecnicas conocidas en la materia y desveladas en el presente documento (por ejemplo, Ejemplo 11 y 12), se miden para determinar si se reducen con la administration de la protelna de fusion. Vease, Liu, J., et al., (2011). J. Biol. Chem. 286(23): 20991-21001; Nork, T.M., (2011). Arch. Ophthalmol. 129(8): 1042-1052; and Lichtlen, P. (2010). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 15(9): 4738-4745.

VI. Metodos de tratamiento utilizando polipeptidos de fusion y fragmentos de los mismos

La invention proporciona protelnas de fusion de acuerdo con las reivindicaciones para su uso en metodos para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad relacionada con el complemento, una enfermedad ocular y cancer. En algunas realizaciones, el metodo es de tratamiento de un sujeto con una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad relacionada con el complemento, una enfermedad ocular y/o cancer, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquier protelna de fusion descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, el metodo comprende adicionalmente administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapeutico adicional, por ejemplo, como se describe mas adelante. En algunas realizaciones, la invencion proporciona una protelna de fusion para su uso en la inhibicion de la union de una protelna del complemento con una protelna reguladora del complemento. En algunas realizaciones, la divulgation proporciona una protelna de fusion para su uso en la inhibicion de la union de una protelna del complemento con una protelna reguladora del complemento en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la protelna de fusion para inhibir la union de una

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protelna del complemento con una protelna reguladora del complemento. En algunas realizaciones, la invencion proporciona una protelna de fusion para su uso en la inhibicion de la union de un VEGF con un VEGFR. En algunas realizaciones, la divulgacion proporciona una protelna de fusion para su uso en la inhibicion de la union de un VEGF con un VEGFR en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la protelna de fusion para inhibir la union de un VEGF con un VEGFR. En algunas realizaciones, la divulgacion proporciona una protelna de fusion para su uso en la inhibicion de la ruta de activacion del complemento y de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la protelna de fusion para inhibir la ruta de activacion del complemento y de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF). Un “sujeto” de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es preferentemente un ser humano.

Una enfermedad inflamatoria que puede tratarse o prevenirse con las protelnas de fusion descritas en el presente documento incluye, pero sin limitacion, degeneracion macular (por ejemplo, degeneracion macular relacionada con la edad), infarto agudo de miocardio (AMI), aterosclerosis, glomerulonefritis, asma y esclerosis multiple. Una enfermedad autoinmunitaria que puede tratarse o prevenirse con las protelnas de fusion descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, enfermedad de Alzheimer, uveitis autoinmunitaria, lupus eritematoso sistemico (SLE), nefritis lupica, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, sindrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS), esclerosis multiple, diabetes mellitus, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriasica, trastornos inflamatorios del SNC, miastenia grave, glomerulonefritis y trombocitopenia autoinmunitaria. Una enfermedad relacionada con el complemento que puede tratarse o prevenirse con las proteinas de fusion descritas en el presente documento incluye, pero sin limitacion, aneurisma, sindrome uremico hemolitico atipico, purpura trombocitopenica trombotica, purpura trombocitopenica idiopatica, AMD, perdida espontanea fetal, perdida recurrente fetal, lesion cerebral traumatica, psoriasis, anemia hemolitica autoinmunitaria, angioedema hereditario, ictus, choque hemorragico, choque septico, complicacion por cirugia, tal como cirugia de injerto de derivacion aortocoronaria (CABG), complicaciones pulmonares, tales como enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), lesion por isquemia-reperfusion, rechazo de trasplante de organo y disfuncion multiorganica. En algunas realizaciones, el cancer que puede tratarse o prevenirse con las proteinas de fusion descritas en el presente documento incluye cancer colorrectal, cancer pulmonar no microcitico, linfoma, leucemia, adenocarcinoma, glioblastoma, cancer de rinon, cancer gastrico, cancer de prostata, retinoblastoma, cancer de ovario, cancer endometrial y cancer de mama. En una realizacion adicional, cualquiera de los canceres desvelados en el presente documento que pueden tratarse o prevenirse con las proteinas de fusion descritas en el presente documento es metastasico. Una enfermedad ocular que puede tratarse o prevenirse con las proteinas de fusion descritas en el presente documento, incluye, pero sin limitacion, degeneracion macular humeda relacionada con la edad, degeneracion macular seca relacionada con la edad, retinopatia diabetica, edema retinal diabetico, edema macular diabetico, fibroplasia retrolental, obstruccion de la vena central de la retina, obstruccion de la vena de la retina, retinopatia isquemica, retinopatia hipertensiva, uveitis (por ejemplo, anterior, intermedia, posterior o panuveltis), enfermedad de Behcet, distrofia cristalina de Biett, blefaritis, glaucoma (por ejemplo, glaucoma de angulo abierto), glaucoma neovascular, neovascularizacion de la cornea, neovascularizacion coroidea (CNV, choroidal neovascularization), neovascularizacion subretiniana, inflamacion de la cornea, y complicaciones de trasplante de cornea.

Las protelnas de fusion y composiciones descritas en el presente documento son particularmente utiles para el tratamiento de la degeneracion macular tal como AMD. La AMD es la causa principal de la ceguera y de las disfuncion visual entre las personas mayores (>50 anos) en los Estados Unidos y en otros palses desarrollados (Bird, A.C., (2010). J. Clin. Invest., 120(9): 3033 - 3041). La AMD se clasifica generalmente en dos tipos, una forma humeda y una forma seca, constituyendo la forma seca hasta el 80-90 % de todos los casos de AMD. La AMD seca (no exudativa) es una forma de AMD en la que restos celulares, denominados drusas, se acumulan entre la retina y la coroides. La AMD seca tiene tres fases, temprana, intermedia y avanzada, y se caracteriza por la presencia de drusas maculares. En la AMD seca avanzada, se produce atrofia geografica central dando como resultado la perdida de vision en el centro del ojo. La forma AMD humeda (exudativa o neovascular) es la forma mas grave en la cual vasos sangulneos anomalos (neovascularizacion coroidea, CNV) crecen desde la coroides a traves de la membrana de Bruch detras de la macula, dando como resultado una rapida perdida de vision. En los ultimos anos, cada vez hay mas pruebas que indican que la activacion del complemento desempena una funcion principal en la patogenesis de la AMD Issa, P.C., et al, (2011), Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 249: 163 - 174). Por ejemplo, en las drusas se han detectado altos niveles de protelnas del complemento. Ademas, estudios geneticos han confirmado asociacion de riesgo de AMD y polimorfismo en genes de protelnas del complemento incluyendo Factor H (CFH), CFHR1, CFHR3, C2, C3, Factor B, Factor I. En particular, el alelo CFH Y402h se correlaciona enormemente con riesgo de AMD. Finalmente, en el plasma de pacientes con AMD tambien se han encontrado niveles aumentados de productos de activacion del complemento. La AMD puede detectarse en sujetos con una prueba de agudeza visual, un examen de ojo dilatado, una prueba de la rejilla de Amsler, un angiograma con fluoresceina, o mediante un ensayo genetico para biomarcadores asociados a AMD. Esta generalmente aceptado que la AMD seca puede progresar a AMD humeda. La presente divulgacion proporciona metodos de tratamiento de AMD (tales como formas humeda o seca de AMD) administrando una cantidad eficaz de una composicion que comprende una proteina de fusion como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la divulgacion proporciona metodos de tratamiento o prevencion de uno o mas aspectos o sintomas de AMD, incluyendo, pero sin limitacion, la

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formacion de drusas oculares, la inflamacion en el ojo o tejido ocular, la perdida de celulas fotorreceptoras, la perdida de vision (incluyendo, por ejemplo, agudeza visual y campo visual), neovascularizacion, hemorragia subretiniana, desprendimiento de retina, filtracion de vasos sangulneos y cualquier otro aspecto relacionados con AMD.

En un aspecto adicional, la divulgacion proporciona el uso de una protelna de fusion en la fabricacion o preparacion de un medicamento. En algunas realizaciones, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad relacionada con el complemento, una enfermedad ocular, y un cancer. En algunas realizaciones, la divulgacion proporciona una protelna de fusion para la fabricacion de un medicamento para su uso en la inhibicion de la union de una protelna del complemento con una protelna reguladora del complemento. En algunas realizaciones, la divulgacion proporciona una protelna de fusion para la fabricacion de un medicamento para su uso en la inhibicion de la union de un VEGF con un VEGFR. En algunas realizaciones, la divulgacion proporciona una protelna de fusion para la fabricacion de un medicamento para su uso en la inhibicion de la ruta de activacion del complemento y de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF) en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la protelna de fusion para inhibir la activacion del complemento y la ruta de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF). Un “sujeto” de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es preferentemente un ser humano. En algunas realizaciones, el medicamento se utiliza para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, incluyendo, pero sin limitacion, degeneracion macular (por ejemplo, degeneration macular relacionada con la edad), infarto agudo de miocardio (AMI), aterosclerosis, glomerulonefritis, asma y esclerosis multiple. En algunas realizaciones, el medicamento se utiliza para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria incluyendo, pero sin limitacion, enfermedad de Alzheimer, uveitis autoinmunitaria, lupus eritematoso sistemico (SLE), nefritis lupica, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad Crohn, sindrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS), esclerosis multiple, diabetes mellitus, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriasica, trastornos inflamatorios del SNC, miastenia grave, glomerulonefritis y trombocitopenia autoinmunitaria. En algunas realizaciones, el medicamento se utiliza para el tratamiento de una enfermedad relacionada con el complemento incluyendo, pero sin limitacion, aneurisma, sindrome uremico hemolitico atipico, purpura trombocitopenica trombotica, purpura trombocitopenica idiopatica, AMD, perdida espontanea fetal, perdida recurrente fetal, lesion cerebral traumatica, psoriasis, anemia hemolitica autoinmunitaria, angioedema hereditario, ictus, choque hemorragico, choque septico, complication de cirugia tal como cirugia de injerto de derivation aortocoronaria (CABG), complicaciones pulmonares tales como enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), lesion por isquemia-reperfusion, rechazo de trasplante de organo y disfuncion multiorganica. En algunas realizaciones, el cancer que puede tratarse o prevenirse con las proteinas de fusion descritas en el presente documento incluyen cancer colorrectal, cancer metastasico, cancer pulmonar no microcitico, linfoma, leucemia, adenocarcinoma, glioblastoma, cancer de rinon, cancer de rinon metastasico, cancer gastrico, cancer de prostata, retinoblastoma, cancer de ovario, cancer endometrial, y cancer de mama. En otras realizaciones el medicamento se utiliza para el tratamiento de una enfermedad ocular incluyendo, pero sin limitacion, degeneracion macular humeda relacionada con la edad, degeneracion macular seca relacionada con la edad, retinopatia diabetica, edema retinal diabetico, edema macular diabetico, fibroplasia retrolental, obstruction de la vena central de la retina, obstruccion de la vena de la retina, retinopatia isquemica, retinopatia hipertensiva, uveitis (por ejemplo, anterior, intermedia, posterior, o panuveitis), enfermedad de Behcet, distrofia cristalina de Biett, blefaritis, glaucoma (por ejemplo, glaucoma de angulo abierto), glaucoma neovascular, neovascularizacion de la cornea, neovascularizacion coroidea (CNV), neovascularizacion subretiniana, inflamacion de la cornea, y complicaciones de trasplante de cornea.

Dosificaciones farmaceuticas

Las dosificaciones y concentration de farmaco deseadas de las composiciones farmaceuticas de la presente invention pueden variar dependiendo del uso particular previsto. Un experto en la materia conoce bien la determination de la dosificacion o via de administration apropiada. Los experimentos con animales proporcionan una orientation fiable para la determinacion de dosis eficaces para terapia humana. La graduation de dosis eficaces entre especies puede realizarse siguiendo los principios basados en Mordenti, J. y Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics” In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, Nueva York 1989, pags. 42-46.

Para la administracion in vivo de los polipeptidos de fusion descritos en el presente documento, las cantidades de dosificacion normales pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de un individuo o mas al dla, preferentemente de aproximadamente 1 mg/kg/dla a 10 mg/kg/dla, dependiendo de la via de administracion. Para administraciones repetidas durante varios dlas o mas, dependiendo de la gravedad de la enfermedad o del trastorno que vaya a tratarse, el tratamiento se prolonga hasta obtener una supresion deseada de los slntomas.

Un regimen de dosificacion a modo de ejemplo comprende administrar una dosis inicial de una protelna de fusion de aproximadamente 2 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 1 mg/kg cada dos semanas. Otros reglmenes de dosificacion pueden ser utiles dependiendo del patron de descomposicion farmacocinetica que el medico espera conseguir. Por ejemplo, en la presente memoria se contempla una

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dosificacion de un individuo de una a veintiuna veces por semana. En determinaciones realizaciones, puede utilizarse una dosificacion varla de aproximadamente 3 pg/kg a aproximadamente 2 mg/kg (tal como de aproximadamente 3 pg/kg, aproximadamente 10 pg/kg, aproximadamente 30 pg/kg, aproximadamente 100 pg/kg, aproximadamente 300 pg/kg, aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 2 mg/kg). En determinaciones realizaciones, la frecuencia de dosificacion es de tres veces al dla, dos veces al dla, una vez al dla, incluso una vez cada dos dlas, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada nueve semanas, una vez cada diez semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una veces cada tres meses o mas. El progreso de la terapia se monitoriza facilmente con tecnicas y ensayos convencionales. El regimen de dosificacion, incluyendo la protelna de fusion administrada, puede variar con el tiempo independientemente de la dosis que se utilice.

Las dosificaciones para una protelna de fusion particular pueden determinarse emplricamente en individuos que han recibido una o mas administraciones de una protelna de fusion. Los individuos reciben dosis incrementadas de una protelna de fusion. Para evaluar la eficacia de una protelna de fusion, puede monitorizarse un slntoma cllnico de una enfermedad inflamatoria (tal como AMD).

La administracion de una protelna de fusion de acuerdo con los metodos de la invencion puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de la afeccion fisiologica del receptor, de si el proposito de la administracion es terapeutico o profilactico y de otros factores conocidos por los expertos en la materia. La administracion de una protelna de fusion puede ser esencialmente continua durante un periodo de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis separadas, por ejemplo, bien durante o despues del desarrollo de una enfermedad inflamatoria (tal como AMD).

En la bibliografla se proporciona orientacion respecto a dosificaciones y a metodos particulares de suministro; veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Esta dentro del ambito de la invencion que diferentes formulaciones sean eficaces para diferentes tratamientos y diferentes enfermedades o trastornos y que la administracion pretende tratar un organo o tejido especlfico que puede necesitar la liberacion de una manera diferente de otra en otro organo o tejido. Ademas, las dosificaciones pueden administrarse mediante una o mas administraciones distintas o mediante infusion continua. Para administraciones repetidas durante varios dlas o mas, dependiendo de la afeccion, el tratamiento se prolonga hasta que se produce una supresion deseada de los slntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser utiles otros reglmenes de dosificacion. El progreso de esta terapia se monitoriza facilmente con tecnicas y analisis convencionales.

Administracion de las formulaciones

Una protelna de fusion de la invencion (y cualquier agente terapeutico adicional) puede administrarse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo administracion parenteral, intrapulmonar, intranasal y, si se desea para tratamiento local, administracion intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administracion intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutanea. La dosificacion puede ser mediante cualquier via adecuada, por ejemplo, inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutaneas, dependiendo en parte de si la administracion es breve o cronica. En la presente memoria se contemplan diversas pautas de dosificacion, incluyendo, pero sin limitation, administraciones sencillas o multiples durante diversos momentos, administracion en embolada, e infusion en pulsos. En algunas realizaciones, las composiciones se administran directamente al ojo o al tejido ocular. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por via topica al ojo, por ejemplo, en gotas oculares. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por inyeccion en el ojo (inyeccion intraocular) o en los tejidos asociados al ojo. Las composiciones pueden administrarse, por ejemplo, mediante inyeccion intraocular, periocular, subretiniana, intravltrea, transeptal, subescleral, intracoroidea intracamara, subconjuntival, subtenoniana, retrobulbar, peribulbar o administracion yuxtaescleral posterior. Las composiciones tambien pueden administrarse, por ejemplo, en el vltreo, nervio optico, humor acuoso, esclerotica, conjuntivo y en la zona entre la esclerotica y el conjuntivo, en los tejidos coroideos de la retina, en la macula, o en otras zonas en o cerca del ojo de un individuo. En algunas realizaciones, las composiciones se administran al individuo como un implante ocular.

Las protelnas de fusion de la invencion pueden formularse, dosificarse y administrarse de una manera coherente con la buena practica medica. Los factores a tener en cuenta en este contexto incluyen, la enfermedad o el trastorno particular que vaya a tratarse, el mamlfero particular que vaya a tratarse, la afeccion cllnica del paciente individual, la causa de la enfermedad o del trastorno, el lugar donde se suministra el agente, el metodo de administracion, el programa de administracion y otros factores conocidos por los medicos tratantes. La protelna de fusion no requiere formularse, aunque opcionalmente se formula, con uno o mas agentes normalmente utilizados para prevenir o tratar la enfermedad o trastorno en cuestion. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de protelna de fusion presente en la formulation, del tipo de enfermedad o de trastorno o de tratamiento y de otros factores comentados anteriormente. Generalmente, estos se utilizan en las mismas dosificaciones y con vlas de administracion como se describe en el presente documento, o de aproximadamente 1 a 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificacion y mediante cualquier via que sea apropiada que se determine emplrica/cllnicamente.

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Tratamiento de combination

Las protelnas de fusion de la invencion pueden utilizarse en solitario o en combinacion con uno o mas agentes terapeuticos adicionales. Dichas terapias de combinacion incluyen administration combinada (en la que dos o mas agentes terapeuticos se incluyen en la misma formulation o en formulaciones distintas), y administracion distinta, en cuyo caso, la administracion de la protelna de fusion de la invencion puede producirse antes, simultaneamente y/o despues de la administracion del agente y/o adyuvante terapeutico adicional.

En algunas realizaciones, una protelna de fusion se administra en combinacion con un agente terapeutico incluyendo, pero sin limitation, un inhibidor del complemento (por ejemplo, ARC1905, TT30, Compstatina y/o POT- 4), un anticuerpo del complemento (por ejemplo, Eculizumab, FCFD4514S, TNX-558 y/o TNX-234), un inhibidor de VEGFR (por ejemplo, Sunitinib, Sorafenib, Vatalanib, y/o Vandetanib), un anticuerpo contra VEGFR (por ejemplo, Ramucirumab), o un anticuerpo contra VEGF (por ejemplo, Bevacizumab, Ranibizumab, Aflibercept y/o Pegaptanib). Para agentes a modo de ejemplo contra protelnas del complemento vease Ehrnthaller, C., et al, (2011), Mol. Med., 17: 317 - 329. En realizaciones adicionales, una protelna de fusion se administra en combinacion con agentes incluyendo, pero sin limitacion, antioxidantes (por ejemplo, vitamina C, vitamina E, beta-caroteno, lutelna y/o zeaxantina), acidos grasos omega-3 de cadena larga (por ejemplo, acido docosahexaenoico y/o acido eicosapentaenoico), cinc o cobre. En una realization adicional, una protelna de fusion se administra en combinacion con citocinas neuroprotectoras incluyendo, pero sin limitacion, factor neurotrofico ciliar. En realizaciones adicionales, una protelna de fusion se administra en combinacion con tratamiento laser (por ejemplo, terapia fotodinamica) en el caso de AMD. En algunas realizaciones, la combinacion de una cantidad eficaz de la protelna de fusion con uno o mas agentes terapeuticos adicionales es mas eficaz en comparacion con una cantidad eficaz de la protelna de fusion u otro agente terapeutico en solitario.

En algunas realizaciones, la protelna de fusion se administra mediante una via de administracion diferente que la de uno o mas agentes terapeuticos adicionales. En algunas realizaciones, uno o mas agentes terapeuticos adicionales se administran por via parenteral (por ejemplo, inyeccion por llnea venosa central, intraarterial, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradermica o subcutanea), por via oral, gastrointestinal, topica, nasofarlngea y pulmonar (por ejemplo inhalation o por via intranasal).

VII. Composiciones

Las composiciones farmaceuticas de una protelna de fusion como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicha protelna de fusion que tiene el grado de pureza deseado con uno o mas vehlculos opcionales farmaceuticamente aceptables en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. En el presente documento se describen vehlculos, excipientes o estabilizadores farmaceuticamente aceptables y se conocen bien en la tecnica (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edition, Mack Publishing (2000)). Generalmente, los vehlculos farmaceuticamente aceptables no son toxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, pero sin limitacion: tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (tal como cloruro de octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butllico o bencllico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menor de aproximadamente 10 restos); protelnas, tales como albumina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; pollmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de protelna - Zn); y/o tensioactivos no ionicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehlculos farmaceuticamente aceptables a modo de ejemplo del presente documento incluyen adicionalmente agentes de dispersion de farmacos intersticiales, tales como glucoprotelnas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoprotelnas hialuronidasas PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). En un aspecto, una sHASEGP se combina con uno o mas glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.

La formulacion del presente documento tambien puede contener mas de un principio activo segun sea necesario para la indication particular que se este tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no influyen entre si de modo adverso. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente un anticuerpo contra VEGF o un inhibidor del complemento. Dichos principios activos estan presentes adecuadamente en combinacion en cantidades que son eficaces para el proposito deseado.

Los principios activos pueden incluirse en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli(metil metacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de farmacos coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nano-partlculas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Dichas tecnicas se desvelan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edicion, Osol, A. Ed. (1980).

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En algunas realizaciones, las formulaciones farmaceuticas que comprenden la protelna de fusion son adecuadas para administracion parenteral. Entre los vehlculos y disolventes aceptables estan el agua, la solucion de Ringer, la solucion salina tamponada con fosfato y la solucion de cloruro de sodio isotonico. Ademas, se emplean convencionalmente aceites esteriles, no volatiles, como medio disolvente o de suspension. Para esta finalidad puede emplearse cualquier aceite mineral o no mineral blando no volatil incluyendo mono- o digliceridos sinteticos. Ademas, los acidos grasos, tales como el acido oleico, encuentran uso en la preparation de inyectables. En algunas realizaciones, las formulaciones farmaceuticas que comprenden la protelna de fusion son adecuadas para suministro subcutaneo, intramuscular, intraperitoneal e intravenoso.

Puede prepararse preparaciones de liberation sostenida. Como ejemplos adecuados de preparaciones de liberation sostenida se incluyen matrices semipermeables de pollmeros hidrofobos solidos que contienen la protelna de fusion, cuyas matrices estan en forma de artlculos conformados, por ejemplo, pellculas o microcapsulas. Las composiciones farmaceuticas son adecuadas para su uso en diversos sistemas de suministro de farmacos. Para una breve revision de los presentes metodos para el suministro de farmacos, vease Langer, R. (1990) Science 249: 1527-33 (1990).

Las formulaciones a usar para la administracion in vivo son generalmente esteriles. La esterilidad puede conseguirse facilmente, por ejemplo, por filtration a traves de membranas de filtration esteriles.

VIII. Artlculos de fabricacion o kits

En otro aspecto, se proporciona un artlculo de fabricacion o kit que contiene una formulation de la protelna de fusion. El artlculo o kit puede comprender adicionalmente instrucciones para su uso en los metodos de la invention. Por tanto, en determinadas realizaciones, el artlculo de fabricacion o kit comprende instrucciones para el uso de la protelna de fusion en metodos para el tratamiento o la prevention de una enfermedad inflamatoria (tal como degeneration macular relacionada con la edad), enfermedad relacionada con el complemento y/o cancer en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una protelna de fusion. En determinadas realizaciones el individuo es un ser humano.

El artlculo de fabricacion o kit puede comprender adicionalmente un envase. Como envases adecuados se incluyen, por ejemplo, frascos, viales (por ejemplo, viales de doble camara), jeringas (tales como jeringas de una o doble camara) y tubos de ensayo. El envase puede formarse a partir de diversos materiales tales como vidrio o plastico. El envase contiene la formulacion. El artlculo de fabricacion o kit puede comprender adicionalmente una etiqueta o un prospecto, que esta sobre el envase o asociado al mismo, que puede indicar instrucciones para la reconstruction y/o uso de la formulacion. La etiqueta o prospecto puede indicar adicionalmente que la formulacion es util o esta destinada para modos de administracion subcutanea u otros modos de administracion, para el tratamiento o prevencion de una enfermedad inflamatoria (tal como degeneracion macular relacionada con la edad), una enfermedad relacionada con el complemento y/o cancer en un individuo. El envase que contiene la formulacion puede ser un vial de un solo uso o un vial multiuso, que permite realizar administraciones repetidas (por ejemplo, 2-6 administraciones) de la formulacion reconstituida. El artlculo de fabricacion o kit puede comprender adicionalmente un segundo envase que comprende un diluyente adecuado (por ejemplo, BWFI). Despues de mezclar el diluyente y la formulacion liofilizada, la concentration final de la protelna, polipeptido o molecula pequena en la formulacion reconstituida sera generalmente de al menos 50 mg/ml. El artlculo de fabricacion o kit puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial, terapeutico y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para su uso.

El artlculo de fabricacion o kit del presente documento comprende opcionalmente ademas un envase que comprende un segundo medicamento, en el que el polipeptido de fusion es un primer medicamento, y cuyo artlculo comprende adicionalmente instrucciones en el prospecto para el tratamiento del sujeto con el segundo medicamento en una cantidad eficaz. El segundo medicamento puede ser cualquiera de los expuestos anteriormente, siendo un ejemplo de un segundo medicamento un inhibidor del complemento (por ejemplo, ARC1905, TT30, Compstatina y/o POT-4), un anticuerpo contra el complemento (por ejemplo, Eculizumab, FCFD4514S, TNX-558, y/o TNX-234), un inhibidor de VEGFR (por ejemplo, Sunitinib, Sorafenib, Vatalanib y/o Vandetanib), un anticuerpo contra VEGFR (por ejemplo, Ramucirumab), o un anticuerpo contra VEGF (por ejemplo, Bevacizumab, Ranibizumab, Aflibercept y/o Pegaptanib) si la protelna fusion se utiliza para el tratamiento de degeneracion macular relacionada con la edad.

En otra realization, en el presente documento se proporciona un artlculo de fabricacion o kit que comprende las formulaciones descritas en el presente documento para la administracion en un dispositivo autoinyector. Un autoinyector puede describirse como un dispositivo de inyeccion que despues de la activation, liberara su contenido sin una action necesaria adicional desde el paciente o administrador. Se adapta particularmente para la automedicacion de formulaciones terapeuticas cuando la tasa de suministro debe ser constante y el tiempo de suministro es mayor que algunos momentos.

Tambien se proporcionan formas de dosificacion unitaria para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad inflamatoria (tal como degeneracion macular relacionada con la edad), una enfermedad relacionada con el complemento y/o cancer, las formas de dosificacion comprenden una cualquiera de las protelnas de fusion o

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formulaciones descritas en el presente documento.

La invention se entendera mas completamente por referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no deben considerarse como limitantes del alcance de la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1: Expresion y purificacion de protefnas anti-complemento (ACP, Anti-Complement Proteins)

Para producir una serie de protelnas de fusion que comprenden un dominio inhibidor del complemento (CID) y un dominio Fc, los ADNc que codifican diversos CID se sintetizaron y fusionaron con el extremo N terminal (vease ACP- 1 - ACP-5 en la Figura 1A) o con el extremo C terminal (vease ACP-6-ACP-10 de la Figura 1A) del dominio Fc de IgG1. Los CID son partes de la region extracelular de CR1 humano. Especlficamente, CID-WT de ACP-1 y ACP-6 era CR1 SCR1-3 humano de tipo silvestre; CID-KN de ACP-2 y ACP-7 era CR1 SCR1-3 humano con las mutaciones por sustitucion de aminoacidos N29K y D109N; CID-YD de ACP-3 y ACP-8 era CR1 SCR1-3 humano con las mutaciones por sustitucion de aminoacidos S37Y y G79D; CID-KYDN de ACP-4 y ACP-9 era CR1 SCR1-3 humano con las mutaciones por sustitucion de aminoacidos N29K, S37Y, G79D y D109N; y CID-NT de ACP-5 y ACP10 era CR1 SCR 8-10 humano (Figura 1A). Los ADNc de los CID sintetizados y el dominio Fc de IgG1 se ligaron en un vector de expresion de mamlfero pCI-neo digerido con EcoRI/Not I (Promega Catalogo N.° E1841). Se utilizo un peptido flexible corto de seis restos de glicina entre el CID y el dominio Fc. Todas las protelnas de fusion Fc contenlan el peptido senal SP2 en el extremo N para permitir la secretion extracelular de las ACP.

Los plasmidos construidos para ACP-1 a ACP-10 se transfectaron de manera transitoria en celulas HEK293. Los medios de cultivo celular en los que se secretaron las ACP se recogieron 72 horas despues de la transfection y cada ACP se purifico mediante cromatografla con protelna A. En resumen, sobrenadantes de cultivo que contenlan las ACP secretadas se mezclaron con perlas de agarosa de Protelna A durante una noche antes de aplicar una columna de polipropileno. Las perlas se lavaron con Tris 0,1 M, pH 8,0 antes de la elucion de las ACP con tampon de elucion (tampon glicina 0,1 M, pH 2,5) y neutralization con tampon Tris pH 8,0. Las ACP eluldas se concentraron y dializaron frente a solution salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la determination de la concentration de protelna final por ensayo BCA. Se determino que la pureza de cada ACP aislada era >90 %. Una muestra de 2 gig de cada ACP-6 purificada (carril 5), ACP-7 (carril 4), AcP-8 (carril 3), ACP-9 (carril 2) y ACP-10 (carril 1) se cargo en un gel de SDS-PAGE en condiciones no reductoras (Figura 2A). Los pesos moleculares de las protelnas de fusion Fc dimericas eran de ~94 kD.

Las ACP en las que cada uno de DAF SCR2-4, MCP SCR2-4, Factor H SCR 1-4 o C4BPA SCR1-3 se fusionaron como un CID con el dominio Fc de IgG1, se construyeron, expresaron y purificaron de manera similar.

Ejemplo 2: Inhibicion de la ruta clasica del complemento por las ACP

Para cuantificar el grado de actividad de la ruta clasica del complemento se utilizo el ensayo CH50. Este ensayo determina la capacidad funcional de los componentes del complemento en suero de la ruta clasica (es decir, presente en una muestra) para productor la lisis de eritrocitos de oveja previamente cubiertos con anticuerpo de conejo anti-eritrocito de oveja (EA, eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpo, Complement Technology Catalogo N.° B200). Cuando los EA se incuban por ejemplo, con suero de ensayo, iones magnesio e iones calcio, la ruta clasica del complemento se activa y se produce la hemolisis. Se anade un volumen fijo de EA optimamente sensibilizados a cada dilution en suero. Despues de incubation, la mezcla se centrifuga y el grado de hemolisis se cuantifica midiendo la absorbancia de la hemoglobina liberada en el sobrenadante a ~540 nm. La cantidad de actividad del complemento se determina examinando la capacidad de varias diluciones de suero de ensayo para producir la lisis de EA. El resultado del ensayo se expresa como el reclproco de la dilucion de suero necesaria para producir la lisis de 50 % de numeros definidos de eritrocitos en condiciones estandar.

El ensayo CH50 es sensible a la reduction, a la ausencia y/o inactividad de cualquier componente de la ruta clasica del complemento y por tanto se utilizo para evaluar las capacidades de ACP-6, -7, -9 y -10 para inhibir la activation de la ruta clasica del complemento. Para este ensayo, primero se determino la dilucion del suero humano normal (Complement Technology Catalogo N.° NHS) que producla la lisis del 90 % de 1 x 107 EA/ml despues de 1 hora de incubacion a 37 °C. El ensayo se realizo en tampon GVB++ (gelatina al 0,1 %, Veronal 5 mM, NaCl 145 mM, NaN3 al 0,025 %, pH 7,3) que contenla CaCl2 0,15 mM y MgCh 0,5 mM. La inhibicion de la ruta clasica del complemento se activo mezclando la dilucion de suero humano normal que pudo efectuar la lisis del 90 % de EA con 0 - 500 nM de las protelnas de fusion ACP-6, ACP-7, ACP-9 o ACP-10 durante 1 hora a 37 °C. La hemolisis de EA se ensayo despues tras 1 hora de incubacion del suero y EA midiendo la absorbancia a una DO de 541 nm. Los datos se analizaron mediante un ajuste de curva sigmoidea utilizando Prism 4 (CrraphPad, Inc.).

El analisis del porcentaje de hemolisis de EA en presencia de las protelnas de fusion demostro que ACP-6, en la que el dominio SCR1-3 CR1 humano se fusiono con el extremo C terminal de Fc de IgG1, mostrando una fuerte inhibicion de la actividad del complemento con una CE50 de 16,2 nM (Figura 3A, clrculo en negrita). La ACP-7, en la que la variante N29K/D109N de SCR1-3 de CR1 humana estaba fusionada al extremo C terminal de Fc de IgG1,

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potencio significativamente el efecto inhibidor 10 veces con una CE50 de 1,6 nM (Figura 3A, cuadrado en negrita). La ACP-9, en la que la variante N29K/D109N S37Y/G79D de SCR1-3 de CR1 humana estaba fusionada con el extremo C terminal de IgG1, reforzo la actividad inhibidora 2,7 veces mas con una CE50 de 0,6 nM (Figura 3A, triangulo en negrita). En cambio, la ACP-10, en la que la SCR 8-10 de CR1 humana estaba fusionada con el extremo C terminal de IgG1, no mostro ninguna inhibicion de la actividad del complemento hasta 500 nM (Figura 3A, triangulo invertido).

La inhibicion de la ruta clasica del complemento por las ACP que contenlan los CID de DAF SCR2-4, MCP SCR2-4, Factor H SCR 1-4 o C4BPA SCR1-3 se ensayo de manera similar.

Ejemplo 3: Inhibicion de la ruta alternativa del complemento por las ACP

A diferencia de las rutas clasica y de la lectina del complemento, que para la activacion requieren iones tanto de calcio como de magnesio, la activacion de la ruta alternativa del complemento requiere solo iones magnesio. Por tanto, para cuantificar la actividad de la ruta alternativa del complemento en presencia de las ACP, el ensayo descrito anteriormente se modifico de tal manera que se incubaron eritrocitos de conejo (Er, rabbit erytrocytes) con suero, ACP 0 - 500 nM, Mg2+ 5 mM y EGTA 5 mM, que preferentemente quela iones calcio.

Para este ensayo, primero se determino la dilucion de suero humano normal (Complement Technology Catalogo N.° NHS) que produjo la lisis del 90 % de 1,25 x 107 eritrocitos de conejo /ml (Er, Complement Technology Catalogo N.° B300) despues de 30 minutos de incubacion a 37 °C. El ensayo se realizo en tampon GVB0 (gelatina al 0,1 %, Veronal 5 mM, NaCl 145 mM, NaN3 0,025 %, pH 7,3) que contenla 5 mM de MgCl2 y 5 mM de EGTA. La inhibicion de la ruta alternativa del complemento se inicio mezclando la dilucion de suero humano normal que podrla producir la lisis del 90 % de Er con 0-500 nM de las protelnas de fusion Fc ACP-6, ACP-7, ACP-9 o ACP-10 durante 1 hora a 37 °C. La hemolisis de Er se ensayo despues de 30 minutos de incubacion del suero y Er midiendo la absorbancia a una DO de 412 nm. Los datos se analizaron mediante un ajuste de curva sigmoidea utilizando Prism 4.

El analisis del porcentaje de hemolisis de EA en presencia de las protelnas de fusion demostro que la ACP-6 mostraba una actividad inhibidora muy baja con una CE50 de 319,9 nM (Figura 3B, clrculo en negrita). La ACP-7 mostro un efecto inhibidor mejorado (2,5 veces) con una CE50 de 127,0 nM (Figura 3B, cuadrado en negrita). La ACP-9 mostro un efecto inhibidor incluso mas elevado con una CE50 de 31,9 nM, es decir, 10 veces mejor que la secuencia de tipo silvestre (APC-6) (Figura 3B, triangulo en negrita). Por otro lado, la ACP-10 no mostro ningun efecto sobre la actividad del complemento hasta 500 nM (Figura 3B, triangulo invertido).

La inhibicion de la ruta alternativa del complemento por las ACP que contenlan los CID de DAF SCR2-4, MCP SCR2-4, Factor H SCR 1-4 o C4BPA SCR1-3 se ensayo de manera similar.

Ejemplo 4: Expresion y purificacion de las protelnas ACVP biespecfficas que inhiben las rutas tanto del complemento como la de VEGF

Se produjo una serie de protelnas de fusion biespeclficas que comprendlan un dominio inhibidor del complemento (CID), un dominio inhibidor de VEGF (VID) y un dominio Fc (es decir, la region Fc de la IgG1 humana) (Figura 1B). El VID utilizado para las protelnas de fusion biespeclficas fue una fusion VEGFR1_D2-VEGFR2_D3 del segundo dominio de tipo Ig de VEGFR1 y del 3er dominio de tipo Ig de VEGFR2, es decir, similar a VEGF-trap-eye (intravltreo ), que tambien se conoce como Aflibercept (vease, por ejemplo, Frampton (2012). Drugs Aging 29: 83946 y Ohr et al. (2012). Expert Opin. Pharmacother. 13: 585-91). En el plasmido pV 131 se construyo un acido nucleico que codificaba la protelna de fusion ACVP-1 insertando un acido nucleico que codificaba el VID aguas abajo del peptido senal SP2 en el N terminal de ACP-9. El plasmido construido con ACVP-1 se utilizo transfectando de manera transitoria en celulas HEK293. El medio de cultivo celular que contenla la ACVP-1 secretada se recogio 72 horas despues de la transfeccion y la protelna se purifico mediante cromatografla de Protelna A. En resumen, el sobrenadante del cultivo que contenla la ACVP-1 secretada se mezclo con perlas de agarosa recubiertas con protelna A durante una noche antes de aplicar a una columna de polipropileno. Las perlas se lavaron con Tris 0,1 M, pH 8,0 antes de la elucion de la ACVP-1 con tampon de elucion (tampon de glicina 0,1 M, pH 2,5) y neutralization con tampon Tris pH 8,0. La protelna elulda se concentro y se dializo frente a solution salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la determination de la concentration final de protelna mediante el ensayo BCA. Se determino que la pureza de cada ACVP-1 aislada era >90 %. Una muestra de 2 pg de ACVP-1 purificada (carriles 1 y 3) se comparo con una ACP-9 purificada (carriles 2 y 4) procesando en un gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras (carriles 3 y 4) o no reductoras (carriles 1 y 2) (Figura 2B). El peso molecular de la ACVP-1 dimerica fue de ~139 kD.

Las posiciones del dominio de Fc, CID y VID de la ACVP-1 se reorganizaron unas con respecto a otras. Ademas, se utilizaron CID alternativos, tales como los presentes en las ACP, y VID alternativos. Se prepararon construcciones de acido nucleico que codificaban cualquiera de las ACVP representadas en la Figura 1B y se expresaron en celulas de mamlfero, como se ha descrito anteriormente. De manera similar, dichas ACVP se purificaron mediante cromatografla de Protelna A, como se describe en el presente documento.

Se construyeron ACVP que contenlan los CID de DAF SCR2-4, MCP SCR2-4, Factor H SCR 1-4 o C4BPA SCR1-3.

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Ejemplo 5: Union in vitro de las ACVP con VEGF

Se realizaron ensayos ELISA para determinar si las ACVP se unlan directamente con VEGF. En resumen, los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos se recubrieron con VEGF-A 100 ng (disponible en R&D Systems). Despues, a cada pocillo se anadio ACVP 0 - 10 nM purificada y se incubo durante 1 hora. Despues de lavar tres veces con PBS 400 pl que contenla Tween 20 al 0,1 % (v/v), a cada pocillo se anadio una dilucion de 100 pl a 1:5000 de anti-Fc conjugado con HRP (Sigma Catalogo N.° A0170-1ML) para incubar durante 1 hora. Despues de lavar tres veces con PBS 400 pl que contenla Tween 20 al 0,1 % (v/v), a cada pocillo se anadio reactivo de detencion para Sustrato TBM (Sigma Catalogo N.° S5814-100ML) a cada pocillo, y se midio la absorbancia a una DO de 450 nm. Los datos se analizaron mediante ajuste de curva sigmoidea utilizando Prism 4. Como se muestra en la Figura 4A, la ACVP-1 mostro una fuerte union con VEGF, con una CE50 de 0,22 nM.

Para evaluar mejor la afinidad de union de las ACVP con VEGF en solucion, se incubaron 5 pM de VEGF-A con 0 - 100 pM de una ACVP purificada durante una noche a 4 °C en un tampon de dilucion RD5K (R&D Systems Catalogo N.° DVE00). Despues de la incubacion, la concentracion de VEGF libre en el tampon se determino mediante ELISA de tipo sandwich utilizando el Kit ELISA Quantikine VEGF Humano (R&D Systems Catalogo N.° DVE00). Los datos de dos experimentos independientes utilizando ACVP-1 se analizaron mediante un ajuste de curva sigmoidea utilizando Prism 4. Como se muestra en la Figura 4B, la ACVP-1 mostro identica union fuerte con VEGF con una afinidad de 3,4 pM.

Tambien se realizaron ensayos ELISA para comparar las afinidades de union de ACVP-1, VID y Avastin con VEGF- A. El VID ensayado fue un fragmento de ACVP-1 en el que el VID tenia el dominio Fc fusionado a su extremo C. Aproximadamente, se incubo 40 pM de VEGF165 (293-vE) con 1 nM de ACVP-1, VID o Avastin purificado durante 45 minutos a 37 °C. Despues de la incubacion, se detecto VEGF libre utilizando el Kit de Desarrollo ELISA DuoSet VEGF Humano ((R&D Systems Catalogo N.° DY293B) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se analizaron mediante ajuste de curva sigmoidea utilizando Prism 4. Como se muestra en la Figura 4C, la ACVP-1 presenta una afinidad por VEGF (con una CE50 de ~0,01 nM) que es 70 veces mayor que la union de Avastin o VID con VEGF (cada uno con una CE50 de ~0,7 nM).

Otras ACVP (por ejemplo, que contienen DAF SCR2-4, MCP SCR2-4, Factor H SCR 1-4 o C4BPA SCR1-3 como CID) se ensayaron con respecto a sus capacidades para unirse con VEGF y determinar sus afinidades de union por VEGF como se describe anteriormente.

Ejemplo 6: Union in vitro de las ACP o ACVP con C3b o C4b.

La union de las ACP o ACVP con C3b o C4b se ensayo en experimentos Elisa directos. Los pocillos de placas ELISA de 96 pocillos se recubrieron con 100 ng/pocillo de C3b o C4b (disponible en Complement Technology, Inc.). Despues, a cada pocillo se anadio 0 - 1 pM de una ACP o ACVP purificada representada en la Figura 1 y se incubo durante 1 hora. Despues de retirar con agua el C3b o C4b no unido, se anadieron 100 pl de una dilucion 1:5000 de anti-Fc conjugado con HRP (Sigma Catalogo N.° A0170-1ML) y se incubo durante 1 hora. Despues de lavar, se anadio reactivo de detencion para sustrato TMB (Sigma Catalogo N.° S5814-100ML) y se midieron las absorciones a una DO de 450 nm.

Ejemplo 7: Inhibicion de DAA para las convertasas alternativas por las ACP o ACVP

La actividad aceleradora de la descomposicion (DAA) para la C3-convertasa alternativa se determino mediante ensayo ELISA. Los pocillos de placas de ELISA de 96 pocillos se recubrieron primero con 1 pg/ml de C3b (disponible en Complement Technology, Inc.) y despues se bloquearon. Despues, cada pocillo se incubo con 400 ng/ml de Factor B (disponible en Complement Technology, Inc.), 25 ng/ml de Factor D (disponible en Complement Technology, Inc.) y 2 mM de NiCh. Despues de lavar, los complejos C3bBb(Ni2+) unidos a la placa se incubaron con diversas concentraciones de ACP o ACVP. Despues de un segundo lavado, los complejos C3bBb(Ni2+) restantes, unidos a la placa se detectaron con anticuerpo policlonal de cabra anti-Factor B (disponible en Complement Technology, Inc.) seguido de anticuerpo policlonal de conejo anti cabra conjugado con HRP (Sigma, Inc.). Despues de lavar, se anadio reactivo de detencion para Sustrato tMb (Catalogo Sigma N.° S5814-100ML) y se midieron las absorciones a una DO de 450 nm.

La DAA para la C5-convertasa alternativa se determino mediante ensayo ELISA como se ha descrito anteriormente, excepto que los pocillos de las placas ELISA se recubrieron con 1 pg/ml de dlmeros de C3b. Los dlmeros de C3b se generaron tratando 2 mg de C3 (disponible en Complement Technology, Inc.) con 20 pg de tripsina (disponible en Sigma, Inc.) en 200 pl de PBS durante 3 min a 37 °C. Despues, la reaccion se detuvo con 200 pg de inhibidor de tripsina de soja (disponible en Sigma, Inc.). Despues, los dlmeros de C3b se formaron tras la rotura del enlace tioester durante 3 dias a 4 °C utilizando 15 pg de bis-maleimido hexano 0,34 mM (disponible en Pierce, Inc.) disuelto en metanol. El dimero de C3b se purifico por cromatografia de exclusion por tamano, SEC.

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Ejemplo 8: Inhibicion de la ruta clasica del complemento por las ACVP

La capacidad de las ACVP para inhibir la ruta clasica del complemento se ensayo como se describe en el Ejemplo 2. El ensayo se realizo en tampon GVB++ (gelatina al 0,1 %, Veronal 5 mM, NaCl 145 mM, NaN3 0,025 %, pH 7,3) que contenla CaCl2 0,15 mM y MgCl2 0,5 mM. La inhibicion de la ruta clasica del complemento se activo mezclando la dilucion de suero humano normal que podia causar la lisis del 90 % de EA con 0 - 500 nM de ACVP-1 durante 1 hora a 37 °C. Los datos inhibidores se analizaron mediante ajuste de curva sigmoidea utilizando Prism 4. Como se muestra en la Figura 5A, la protelna de fusion biespeclfica ACVP-1 mostro un efecto inhibidor muy fuerte sobre la activacion de la ruta clasica del complemento, con una CE50 de 0,19 nM.

Se ensayaron otras ACVP (por ejemplo, que contenlan DAF SCR2-4, MCP SCR2-4, Factor H SCR 1-4 o C4BPA SCR1-3 como CID) como se describe en el presente documento, para determinar sus capacidades para inhibir la ruta clasica del complemento.

Ejemplo 9: Inhibicion de la ruta alternativa del complemento por las ACVP

La capacidad de las ACVP para inhibir la ruta alternativa del complemento se ensayo como se describe en el Ejemplo 3. El ensayo se realizo en tampon GVB0 (gelatina al 0,1 %, Veronal 5 mM, NaCl 145 mM, NaN3 0,025 %, pH 7,3) que contenla 5 mM de MgCh y 5 mM de EGTA. La inhibicion de la ruta alternativa del complemento se inicio mezclando la dilucion de suero humano normal que podia causar la lisis del 90 % de Er con 0-500 nM de ACVP-1 durante 1 hora a 37 °C. La hemolisis de Er se ensayo despues de 30 minutos de incubacion del suero y Er. Los datos inhibidores se analizaron mediante ajuste de curva sigmoidea utilizando Prism 4. Como se muestra en la Figura 5B, la protelna de fusion biespeclfica ACVP-1 mostro un efecto inhibidor muy fuerte sobre la activacion de la ruta alternativa del complemento, con una CE50 de 21,1 nM.

Se ensayaron otras ACVP (por ejemplo, que contenian DAF SCR2-4, MCP SCR2-4, Factor H SCR 1-4 o C4BPA SCR1-3 como CID) como se ha descrito anteriormente para determinar sus capacidades para inhibir la ruta alternativa del complemento.

Ejemplo 10: Inhibicion por ACVP mediante ensayo de proliferacion de HUVEC dependiente de VEGF

En un ensayo basado en celulas se evaluo la capacidad de las ACVP para inhibir la ruta de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF). Con frecuencia se utilizan celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC, Lonza, Inc.) para demostrar que la proliferacion celular dependiente de VEGF puede inhibirse a traves de la union de las ACVP con VEGF. En este ensayo, las celulas HUVEC se mantuvieron en Medio de Crecimiento Celular endotelial (Lonza, Inc.) con FBS al 2 %. Una placa de microtitulacion de fondo plano de 96 pocillos se recubrio con colageno y despues se incubo con 50 gl de 1 nM de VEGF-A (R&D Systems, Inc.) y diversas concentraciones de ACVP en cada pocillo durante 1 hora a 37 °C. Despues incubar durante 1 hora, a cada pocillo se anadieron 50 gl de HUVEC a 1 x 105 celulas/ml en Medio-199 (FBS al 10 %, Hyclone, Inc.). Despues de un tiempo de incubacion de 72 horas a 37 °C con CO2 al 5 %, se evaluo la proliferacion celular anadiendo a cada pocillo 10 gl de CCK-8 (Dojindo, Inc.). La proliferacion celular se midio a una absorbancia de DO de 450/650 nm.

Por ejemplo, en este ensayo basado en celulas, se ensayo la capacidad de ACVP-1 para inhibir la ruta de senalizacion de VEGF (por ejemplo, inhibicion de la actividad de VEGF) y se comparo con la actividad inhibidora de VEGF de un CID y de un VID. El VID ensayado era un fragmento de ACVP-1 en el que el VID tenia el dominio Fc fusionado con su extremo C. El CID ensayado era un fragmento de ACVP-1 en el que CID tenia el dominio Fc fusionado con su extremo N. Para medir la proliferacion de las celulas endoteliales, se sembraron celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC, disponibles en Lonza, Inc.) en placas de 96 pocillos (4x104 celulas/pocillos) con el Kit de Medio Completo EndoGRO-VEGF. Despues de 24 horas, las celulas se lavaron con PBS y se incubaron con 35 nM por ml de ACVP-1, VID o CID en presencia de VEGF165 0,3 nM en DMEM complementado con FBS al 20 %. Para los controles, las celulas se incubaron con PBS, DMEM complementado con FBS al 20 %, VEGF165 0,3 nM en DMEM con FBS al 20 % o con 35 nM por ml de IgG en DMEM con FBS al 20 %. Despues de 48 horas, se anadieron 10 gl de CCK-8 (Dojindo, Inc.) a cada pocillo y la proliferacion celular se midio a una absorbancia de DO de 450/570 nm en un lector de microplaca. Analisis estadlsticos utilizando el ensayo de la t de student mostraron que ACVP-1 inhibla de manera significativa la proliferacion de HUVEC inducida por VEGF en comparacion con el control DMEM+ VEGF (**p<0,01) y el efecto inhibidor de ACVP-1 fue mayor que el de VID o CID (Figura 6).

Ejemplo 11: Las ACVP inhiben la activacion de ERK y AKT en celulas HUVEC a traves de la ruta de VEGFR2

La capacidad de las ACVP para inhibir la activacion de la senalizacion intracelular aguas abajo se ensayo a traves de una ruta de VEGFR. En este ensayo, las HUVEC se trataron previamente con 3 nmol/ml de IgG, VID, CID o una ACVP durante 30 minutos y despues se estimularon con VEGF165 3 nmol/ml durante 10 minutos mas. Las celulas se recogieron y analizaron por transferencia de Western, donde se evaluo la fosforilacion de VEGFR (por ejemplo, VEGFR1, VEGFR2 o VEGFR3), AKT y ERK. Se utilizo GAPDH como un control de carga. Las membranas bloqueadas se exploraron con anticuerpos primarios contra VEGFR (por ejemplo, VEGFR1, VEGFR2 o VEGFR3)

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fosforilado, GAPDH (dilucion 1:3000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA), Erk fosforilada (p-Erk), protelna Erk, AKT fosforilada (p-Akt) y protelna Akt durante una noche a 4 °C. Despues de retirar con lavado los anticuerpos primarios, se anadieron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rabano picante (HRP, horseradish peroxidase) a las membranas y se incubo a temperatura ambiente durante 1 hora antes de lavar despues y la protelna se visualizo con un sustrato quimioluminiscente para HRP.

Por ejemplo, se ensayo la capacidad de ACVP-1 para inhibir la activacion de ERK y AKT a traves de la ruta de VEGFR2. En este ensayo, las HUVEC se trataron previamente con 3 nmol/ml de IgG, VID, CID o ACVP-1 durante 30 minutos y despues se estimularon con VEGFR165 3 nmol/ml durante 10 minutos mas. El VID ensayado era un fragmento de ACVP-1 en el que el VID tenia el dominio Fc fusionado con su extremo C terminal. El CID ensayado era un fragmento de ACVP-1 en el que el CID tenia el dominio Fc fusionado con su extremo N terminal. Las celulas se recogieron y analizaron por transferencia de Western, en donde se evaluo la fosforilacion de VEGFR2, AKT y ERK. Se utilizo GAPDH como un control de carga. Las membranas bloqueadas se exploraron con anticuerpos primarios contra VEGFR2 fosforilado, (dilucion 1:1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA), GAPDH (dilucion 1:3000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA), Erk fosforilada (p-Erk), proteina Erk, Akt fosforilada (p-Akt) y proteina Akt durante una noche a 4 °C. Despues de retirar con lavado los anticuerpos primarios, se anadieron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rabano picante (HRP) a las membranas y se incubo a temperatura ambiente durante 1 hora antes de lavar despues y la proteina se visualizo con un sustrato quimioluminiscente para HRP. Como se muestra en la Figura 7, ACVP-1 y VID inhibieron la fosforilacion de VEGFR2, ERK y AKT inducida VEGF165, y la fosforilacion de ERK inhibida por CID.

Ejemplo 12: Inhibicion de CNV inducida por laser en ratones mediante ACVP

La neovascularizacion coroidea (CNV) es un sintoma habitual de degeneration macular relacionada con la edad (AMD) humeda. La CNV se produce cuando nuevos vasos sangulneos que se originan en la capa coroidea del ojo crecen a traves de una rotura o defecto en la membrana de Bruch e invaden el epitelio pigmentario subretiniano o espacio subretiniano. Este proceso forma un tejido cicatricial que finalmente produce ceguera. La neovascularizacion coroidea (CNV) inducida por laser como un modelo animal se utiliza habitualmente en tratamientos de ensayo de la AMD humeda. Por ejemplo, este modelo puede utilizarse para evaluar la capacidad de las ACVP para inhibir la CNV.

La CNV inducida por laser en ratones se utiliza para ensayar la capacidad de las ACVP y ACP para inhibir la CNV. En este ensayo, se anestesiaron ratones con clorhidrato de quetamina (100 mg/kg de peso corporal) y las pupilas se dilataron con tropicamida al 1 %, en cada retina se suministraron tres quemaduras de fotocoagulacion con diodo laser de 532 nm. Las quemaduras se realizaron en las posiciones 9, 12 y 3 del reloj del polo posterior de la retina. La production de una burbuja en el momento del laser, que indica la rotura de la membrana de Bruch, es un importante factor en la obtencion de CNV. Para ensayar las capacidades de una ACVP o ACP para prevenir la formation de CNV inducida por laser, se inyectaron por via intravltrea 4 pig de una ACVP o ACP el mismo dia de las quemaduras con laser. A los 14 dias de la lesion con el laser, los ratones recibieron una inyeccion intravenosa de 50 mg de dextrano marcado con fluorescelna y se sometieron sacrificaron. Los ojos de los ratones se diseccionaron despues para realizar cortes planos coroidales para evaluar el cambio de tamano de las lesiones de CNV.

Ejemplo 13: Inhibicion de CNV inducida por laser en monos mediante ACVP

La CNV inducida por laser en monos se utilizo para ensayar la capacidad de las ACVP y ACP para inhibir la CNV. En resumen, en cada ojo, se suministraron de 6 a 9 quemaduras de fotocoagulacion con diodo laser de 532 nm alrededor de la macula. Por via intravltrea se inyecto una dosificacion de 0,1 a 0,5 mg de un ACVP el mismo de las quemaduras realizadas con laser. Aproximadamente 20 dias despues, los animales se sedaron con pentobarbitona soluble al 2,5 % intravenosa (1 ml/kg). Los parpados se fijaron para mantener el ojo abierto y accesible. Se tomaron fotograflas a color utilizando una camara retinografica. Despues de la fotografla inicial, se inyecto colorante fluorescelna (fluoresceina de sodio al 20 %, 0,05 ml/kg) a traves de una vena de la extremidad inferior. Se tomaron fotografias a diversos momentos despues de la inyeccion del colorante, incluyendo la fase arterial, fase arteriovenosa temprana y varias fases arteriovenosas tardias. La filtration de la fluoresceina asociada con las lesiones de CNV se monitorizo.

Por ejemplo, se configuro un modelo de CNV inducido por laser en monos Rhesus, cuya edad variaba de 3 a 6 anos. Un total de 8 monos se dividieron en los cuatro grupos siguientes, a los que se administro: 1) control con vehiculo (PBS); 2) ACVP1 (0,5 mg/ojo); 3) VID (0,5 mg/ojo); o 4) CID (0,5 mg/ojo). En total habia dos monos (cuatro ojos) por grupo. El VID ensayado era un fragmento de ACVP-1 en el que el VID tenia el dominio Fc fusionado con su extremo C terminal. El CID ensayado era un fragmento de ACVP-1 en el que el CID tenia el dominio Fc fusionado con su extremo N terminal. En cada ojo, se suministraron aproximadamente de 6 a 9 quemaduras de fotocoagulacion con diodo laser de 532 nm alrededor de la macula. Se inyecto control con vehiculo (PBS) o una dosificacion de ACVP-1, VID o CID de 0,5 mg por via intravltrea despues de 21 dias de las quemaduras con laser. Catorce dias despues de la administration de la dosis, los animales se sedaron con pentobarbitona soluble al 2,5 % intravenosa (1 ml/kg). Los parpados se fijaron para mantener el ojo abierto y accesible. Se tomaron fotograflas a color utilizando una camara retinografica. Despues de la fotografla inicial, se inyecto colorante fluorescelna (fluoresceina de sodio al 20 %; 0,05 ml/kg) a traves de una vena de la extremidad inferior. Se tomaron fotografias 5 minutos despues de la inyeccion del

5

10

15

20

25

30

35

colorante, incluyendo la fase arterial, fase arteriovenosa temprana y varias fases arteriovenosas tardlas para monitorizar la filtracion de la fluorescelna asociada con lesiones CNV. Se midio un area de mancha en la imagen fotografica como un area de filtracion. Los analisis de las fotograflas de la filtracion en la mancha mostraron que el area de filtracion media en el grupo tratado con vehlculo era mayor 14 dlas despues de la inyeccion en comparacion con el area de filtracion antes de la inyeccion con PBS (Figura 8A). En cambio, la filtracion en monos a los que se inyecto ACVP-1 (Figura 8B), VID (Figura 8C) o CID (Figura 8D) se redujo 14 dlas despues de la inyeccion en comparacion con el area de filtracion antes de la inyeccion. Un analisis estadlstico utilizando el ensayo de la t de student mostro que el numero de manchas y el area de filtracion era significativamente menor en comparacion con la dosis previa en animales tratados con ACVP-1 o VID (Tabla 3). En los animales tratados con CID, el area de filtracion tambien era significativamente menor en comparacion con la dosis previa (Tabla 3). En general, ACVP-1 tenia una mejor eficacia que VID y CID en cuanto a la inhibicion de la CNV inducida por laser.

Tabla 3. Numero de manchas y area de filtracion en el modelo de CNV en monos

Grupo: Numero de animales Numero de ojos Pre-dosis 14 dias despues de la dosis

Numero de manchas: Area de filtracion (mm2) Numero de manchas Area de filtracion (mm2)

PBS: 2 4 5,50 ± 2,65 10,7 ± 6,3 5,50 ± 2,65 12,3 ± 5,2

ACVP-1: 2 4 5,25 ± 2,63 12,9 ± 6,3 1,50 ± 1,29** 0,5 ± 0,3**

VID: 2 4 5,00 ± 2,16 10,4 ± 4,1 2,00 ± 1,82* 1,6 ± 0,7**

CID: 2 4 5,25 ± 1,71 11,4 ± 3,5 4,25 ± 1,50 6,5 ± 2,8*

En comparacion con la pre-dosis, *p<0,05, **p<0,01

Ejemplo 14: Inhibicion del crecimiento tumoral humano en ratones con xenoinjerto mediante ACP y ACVP

Se utilizaron diversas celulas de cancer humano, tales como celulas Hep3B de carcinoma hepatocelular humano (ATCC n.° HB-8064) y celulas LoVo de cancer colorrectal humano (ATCC n.° CCL-229) para establecer modelos de xenoinjerto en ratones atlmicos. Para evaluar los efectos inhibidores de las ACP y ACVP sobre el crecimiento tumoral, se administraron diversas concentraciones de cada ACP y de cada ACVP (por ejemplo, de 0,1 a 10 mg/kg) dos veces a la semana por via intravenosa a los ratones despues del implante de las celulas tumorales. El crecimiento tumoral se midio semanalmente hasta 7 semanas.

Ejemplo 15: Evaluacion farmacocinetica de las ACP y ACPV en ratones y monos

Se administro una dosificacion de 10 a 40 mg/kg de cada ACP y ACVP a ratones o monos mediante inyeccion subcutanea o intravenosa. Se tomaron muestras de suero a diferentes momentos despues de la inyeccion durante hasta 15 dlas. Las concentraciones de cada proteina de fusion ACP o ACVP en las muestras de suero se determinaron utilizando un ensayo ELISA de tipo sandwich.

SECUENCIAS

Secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos de CR1 SCR1-3 de ser humano

1 caatgcaatg ccccagaatg gcttccattt gccaggccta ccaacctaac tgatgaattt QCN APE WLPF ARP TNL TDEF

61 gagtttccca ttgggacata tctgaactat gaatgccgcc ctggttattc cggaagaccg EFP IGT YLNY ECR PGY SGRP

121 ttttctatca tctgcctaaa aaactcagtc tggactggtg ctaaggacag gtgcagacgt FSI ICL KNSV WTG A K D RCRR

181 aaatcatgtc gtaatcctcc agatcctgtg aatggcatgg tgcatgtgat caaaggcatc KSC RNP PDPV NGM VHV IKGI

241 cagttcggat cccaaattaa atattcttgt actaaaggat accgactcat tggttcctcg QFG SQI KYSC TKG YRL IGSS

301 tctgccacat gcatcatctc aggtgatact gtcatttggg ataatgaaac acctatttgt SAT CII SGDT VIW DNE TPIC

361 gacagaattc cttgtgggct accccccacc atcaccaatg gagatttcat tagcaccaac DRI PCG LPPT ITN GDF ISTN

421 agagagaatt ttcactatgg atcagtggtg acctaccgct gcaatcctgg aagcggaggg REN FHY GSVV TYR CNP GSGG

481 agaaaggtgt ttgagcttgt gggtgagccc tccatatact gcaccagcaa tgacgatcaa RKV FEL VGEP SIY CTS NDDQ

541 gtgggcatct ggagcggccc cgcccctcag tgcatt (SEQ ID NO:17)

V G I WSG PAPQ Cl (SEQ ID NO: 1)

Secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos de CR1 SCR1-3 N29K/D109N de ser humano 5

61 gagtttccca ttgggacata tctgaaatat gaatgccgcc ctggttattc cggaagaccg EFP IGT YLKY ECR PGY SGRP

301 tctgccacat gcatcatctc aggtaatact gtcatttggg ataatgaaac acctatttgt SAT CII SGNT VIW DNE TPIC

5

541 gtgggcatct ggagcggccc cgcccctcag tgcatt (SEQ ID NO:18)

V G I WSG PAPQ Cl (SEQ ID NO: 2)

Secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos de CR1 SCR1-3 S37Y/G79D de ser humano

61 gagtttccca ttgggacata tctgaactat gaatgccgcc ctggttatta cggaagaccg EFP IGT YLNY ECR PGY YGRP

181 aaatcatgtc gtaatcctcc agatcctgtg aatggcatgg tgcatgtgat caaagacatc KSC RNP PDPV NGM VHV IKDI

361 gacagaattc cttgtgggct accccccacc atcaccaatg gagatttcat tagcaccaac

imagen2

Secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos de CR1 SCR1-3 N29K/S37Y/G79D/D109N de ser humano

61 gagtttccca ttgggacata tctgaaatat gaatgccgcc ctggttatta cggaagaccg

E F P

IGT YLKY ECR PGY

Y G R P

121 ttttctatca tctgcctaaa aaactcagtc tggactggtg ctaaggacag gtgcagacgt

F S

ICL KNSV WTG A K D RCRR

181 aaatcatgtc gtaatcctcc agatcctgtg aatggcatgg tgcatgtgat caaagacatc

KSC RNP PDPV NGM VHV

K D I

241 cagttcggat cccaaattaa atattcttgt actaaaggat accgactcat tggttcctcg

QFG SQI KYSC TKG YRL

G S

301 tctgccacat gcatcatctc aggtaatact gtcatttggg ataatgaaac acctatttgt

SAT

C

SGNT V I W DNE

T P

C

361 gacagaattc cttgtgggct accccccacc atcaccaatg gagatttcat tagcaccaac

DRI PCG LPP

T N

G D F

S T N

421 agagagaatt ttcactatgg atcagtggtg acctaccgct gcaatcctgg aagcggaggg

REN FHY GSVV TYR

C N P

G S G G

481 agaaaggtgt ttgagcttgt gggtgagccc tccatatact gcaccagcaa tgacgatcaa

RKV FEL VGEP

C T

N D D Q

541 gtgggcatct ggagcggccc cgcccctcag tgcatt (SEQ ID NO:20)

V G I

W S G

P A P Q

C

(SEQ ID NO:4)

5

Secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos de CR1 SCR8-10 der ser humano

1 cactgtcaag ccccagatca ttttctgttt gccaagttga aaacccaaac caatgcatct HCQ APD HFLF A K L KTQ TNAS

61 gactttccca ttgggacatc tttaaagtac gaatgccgtc ctgagtacta cgggaggcca

D F P

I G T

LKY ECR PEY YGRP

121 ttctctatca catgtctaga taacctggtc tggtcaagtc ccaaagatgt ctgtaaacgt

F S

T C L D N L V

W S

P K D V C K R

181 aaatcatgta aaactcctcc agatccagtg aatggcatgg tgcatgtgat cacagacatc

KSC KTP PDPV NGM VHV

T D

241 caggttggat ccagaatcaa ctattcttgt actacagggc accgactcat tggtcactca

QVG SRI NYSC TTG HRL

G H S

301 tctgctgaat gtatcctctc gggcaatgct gcccattgga gcacgaagcc gccaatttgt

S A E

C

SGNA A H W STK PP

C

361 caacgaattc cttgtgggct accccccacc atcgccaatg gagatttcat tagcaccaac

QRI PCG LPP

IAN G D F

T N

481 agaaaggtgt ttgagcttgt gggtgagccc tccatatact gcaccagcaa tgacgatcaa

RKV FEL VGEP

I Y CIS

N D D Q

541 gtgggcatct ggagcggccc ggcccctcag tgcatt (SEQ ID NO:21)

V G I

W S G

P A P Q

C

(SEQ ID NO:5)

5 Secuencias acidos nucleicos y de aminoacidos de CR1 SCR1-10 de ser humano

181 aaatcatgtc gtaatcctcc agatcctgtg aatggcatgg tgcatgtgat caaaggcatc

KSC RNP PDPV NGM VHV

K G I

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Una protelna de fusion que comprende:

(a) un dominio inhibidor del complemento (CID), un dominio inhibidor de VEGF (VID) y un dominio prolongador de la semivida, o

(b) desde el extremo N al extremo C, un dominio inhibidor de VEGF (VID), una region Fc de inmunoglobulina y un dominio inhibidor del complemento (CID),

en la que, en cada caso, la protelna de fusion inhibe la activacion del complemento y la actividad de VEGF.
2. La protelna de fusion de la reivindicacion 1(a), en la que el dominio prolongador de la semivida comprende una region Fc de inmunoglobulina.
3. La protelna de fusion de la reivindicacion 2, en donde la protelna de fusion comprende dichos VID, CID y Fc desde el extremo N al extremo C en un orden seleccionado del grupo que consiste en (1) VID, Fc, CID; (2) CID, Fc, VID; (3) CID, VID, Fc; (4) VID, CID, Fc; (5) Fc, VID, CID; y (6) Fc, CID, VID.
4. La protelna de fusion de las reivindicaciones 1(b), 2 o 3, en la que la region Fc es una Fc humana de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
5. La protelna de fusion de las reivindicaciones 1(b), 2 o 3, en la que la region Fc comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7 o 39, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7 o 39.
6. La protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el CID comprende al menos una repeticion de consenso corta (SCR) de una protelna reguladora del complemento humano, seleccionada del grupo que consiste en CR1, Factor H, C4-BP, DAF y MCP.
7. La protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el CID comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-6 y 13-16.
8. La protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el VID comprende una parte del dominio extracelular de un receptor de VEGF humano, en donde el VID comprende opcionalmente un dominio 2 de tipo inmunoglobulina (Ig) de VEGFR-1 humano y un dominio 3 de tipo Ig de VEGFR-2 humano.
9. La protelna de fusion de la reivindicacion 8, en la que el VID comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 o 38, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 o 38.
10. La protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la protelna de fusion comprende adicionalmente un enlazador peptldico entre los dominios, en donde el enlazador peptldico esta opcionalmente entre la region Fc y el CID, y en donde el enlazador peptldico comprende opcionalmente la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8.
11. La protelna de fusion de la reivindicacion 1(b), en donde la protelna de fusion comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12 o 40, o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12 o 40.
12. Una protelna de fusion que o bien

(a) se produce cultivando una celula hospedadora que comprende un acido nucleico que codifica la protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en un estado que produce la protelna de fusion, y la recuperacion de la protelna de fusion producida por la celula hospedadora, o

(b) es una protelna de fusion dimerica que comprende dos protelnas de fusion, en donde cada protelna de fusion comprende la protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Una composicion que comprende la protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y un vehlculo farmaceuticamente aceptable, en la que la protelna de fusion esta opcionalmente en forma dimerica.
14. Un acido nucleico que codifica la protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o un vector que comprende dicho acido nucleico o una celula hospedadora que comprende dicho acido nucleico.
15. Un metodo de produccion de una protelna de fusion que comprende cultivar una celula hospedadora que comprende un acido nucleico que codifica la protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en un estado que produce la protelna de fusion, y la recuperacion de la protelna de fusion producida por la celula hospedadora, en donde la protelna de fusion se recupera opcionalmente del medio de cultivo celular y se purifica, y

5 en donde la celula hospedadora es opcionalmente una celula de mamlfero o una celula de levadura, y en donde la protelna de fusion recuperada es opcionalmente un dlmero.
16. Una protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para su uso en un metodo de tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una

10 enfermedad ocular o un cancer, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una cantidad eficaz de la protelna de fusion, en donde el sujeto tiene opcionalmente artritis reumatoide, psoriasis, degeneracion macular (humeda o seca, relacionada con la edad), retinopatla diabetica, obstruccion de la vena central de la retina, trasplante de cornea, cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, cancer de rinon, cancer gastrico, cancer de ovario o retinoblastoma, y en donde el metodo comprende opcionalmente ademas, administrar un

15 segundo agente terapeutico para el tratamiento de la enfermedad.
17. Un kit que comprende la protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo el kit un envase que contiene la protelna de fusion que esta en forma de una formulacion.

20 18. Una protelna de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en un metodo de

tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.

imagen1

imagen2

188 kO

98 kD-

62 kD- 49 kl>

&£........:

38 k[>

w8m

I,.:,::.::..:..::

188 kD

98 kD

62 kD

49 kD

Figura 2B

imagen3

nhibicion de a ruta c asica

150n

ACP6CE50 16,2 nM

ACP7CE50 1,6 nM

ACP9 CE50 0,6 nM

100

ACP10

13 50

Fusion de Fc Log [nM]

Figura 3B

Inhibicion de la ruta alternativa

150n

ACP6CE50 319,9 nM

ACP7CE50 127,0 nM

ACP9CE50 31,9 nM

= 100

ACP10

-n 50

Fusion de Fc Log [nM]

imagen4

Union directa con VEGF de ACVP1 en Elisa

CE50 0.22 nM

□ 2-

Fusion de Fc Log [nM]

Figura 4B

Union con VEGF de ACVP1 en solucion

Exp N. 1 CE50 3.44 pM

Exp N.° 2 CE50 3,42 pM

- 2-

Fusion de Fc Log [nM]

Figura 4C

u,5-i

V D

CE5o=0,07313 nM

ACVP1

0,3-

CE50=O,O1651 nM

avastina

0,2-

CE50=O,O7749 nM

> 0,1-

Concentracion Fc LOG [nM]

imagen5

D0450/D0570

imagen6

VEGF igG VID CIO ACVP1

imagen7

imagen8