CN116234822A - 一种包括补体途径抑制剂和血管生成抑制剂的融合蛋白及其用途 - Google Patents

一种包括补体途径抑制剂和血管生成抑制剂的融合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种融合蛋白二聚体，其包含CRIg的细胞外结构域或其片段和特异性结合VEGF的蛋白。该蛋白不仅可以抑制补体相关途径，还可以有效调节血管生成。因此，融合蛋白二聚体可以有效地用于治疗和预防补体相关疾病，特别是黄斑变性等眼部疾病，因而具有较高的工业适用性。

Description

一种包括补体途径抑制剂和血管生成抑制剂的融合蛋白及其 用途
背景技术
本发明涉及一种含有补体途径抑制蛋白和血管生成抑制蛋白的融合蛋白；以及使用其治疗眼部疾病，特别是黄斑变性的组合物。
黄斑变性是指以与布鲁赫膜、脉络膜、神经视网膜和/或视网膜色素上皮异常相关的中央视觉丧失为特征的疾病。直径约为1/3至1/2厘米的黄斑存在于视网膜的中心。在视网膜下方，脉络膜是嵌入纤维组织中的血管集合，色素上皮(PE)位于脉络膜层上方。在这种情况下，脉络膜血管为视网膜提供营养。脉络膜和PE位于眼睛的前部。
年龄相关性黄斑变性(AMD)，是黄斑变性的一种，是一种与视野中央部分进行性视觉丧失、颜色辨别能力的改变、暗适应和敏感性异常相关的疾病。AMD大致分为干性AMD和湿性AMD。干性AMD与用于阅读、驾驶或面部识别等活动的良好视觉所需的中央视网膜或黄斑的萎缩细胞死亡有关。大约10％至20％的干性AMD患者进展为2型AMD，即湿性AMD。
这两种AMD发病的最显著危险因素是年龄和脉络膜小疣(drusen)的沉积(位于视网膜色素上皮后面的异常的细胞外沉积物)。脉络膜小疣是与AMD相关的特征性沉积物。已知脉络膜小疣包括补体激活剂、抑制剂、激活特异性补体片段和末端通路因子(terminalpathway factor)，例如细胞膜攻击复合物(MAC或C5b-9)。此外，湿性AMD与脉络膜新血管形成(CNV)有关。新脉络膜新血管形成的致病机制鲜为人知，但诸如炎症、局部缺血和血管生成因子的局部产生等因素被认为是重要的。
同时，补体系统是对微生物感染的先天免疫的关键组成部分，并且包括通常以非活性状态存在于血清中的蛋白质群。蛋白质通过经典途径、凝集素途径和旁路途径被激活。微生物表面的分子激活上述途径，导致称为C3转化酶的蛋白酶复合物的形成。
补体途径的激活产生生物活性片段，包括补体蛋白例如C3a和C5a的过敏毒素以及C5b-9细胞膜攻击复合物(MAC)，其介导白细胞趋化性中的炎症反应，活化巨噬细胞、中性粒细胞、血小板、肥大细胞和内皮细胞，增加血管通透性、细胞溶解和组织损伤。此外，据报道，一些眼部疾病与补体有关(日本专利申请号2007-536964)。然而，到目前为止，对有效治疗眼部疾病，特别是黄斑变性的药物的需求一直在增加，因此对黄斑变性治疗剂的研究仍在进行中。
发明概述
因此，作为有效治疗和预防眼部疾病，特别是黄斑变性的研究的结果，本申请发明人已经证实一种融合蛋白，其阻断补体相关途径和血管生成途径，可用作黄斑变性的治疗剂，从而完成了本发明。
本发明的一个方面，提供一种融合蛋白，其包含免疫球蛋白超家族(CRIg)的细胞外结构域或其片段，以及一种特异性结合血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白。
本发明的另一方面，提供了一种融合蛋白二聚体，其中两种融合蛋白是连接的。
本发明的另一方面，提供了一种编码所述融合蛋白的多核苷酸。
本发明的另一方面，提供了一种包含所述多核苷酸的载体。
本发明的另一方面，提供了一种导入所述载体的转化细胞。
本发明的另一方面，提供了一种用于治疗或预防眼部疾病的药物组合物，其包括作为活性成分的所述融合蛋白或所述融合蛋白二聚体。
本发明的另一方面，提供了一种融合蛋白或其二聚体在治疗眼部疾病中的应用，其中，所述融合蛋白或其二聚体包含CRIg的细胞外结构域或其片段和特异性结合VEGF的蛋白。
本发明的另一方面，提供了一种融合蛋白或其二聚体在制备用于治疗或预防眼部疾病的药物中的应用，其中，所述融合蛋白包含CRIg的细胞外结构域或其片段和特异性结合VEGF的蛋白。
本发明的另一方面，提供了一种治疗和/或预防眼部疾病的方法，所述方法包括向受试者施用融合蛋白或其二聚体，所述融合蛋白包含CRIg的细胞外结构域或其片段和特异性结合VEGF的蛋白。
所述融合蛋白是用于抑制补体相关途径的蛋白，并且含有CRIg的细胞外结构域或其片段和特异性结合VEGF的蛋白。其不仅可以有效地抑制补体相关机制，而且可以有效地抑制血管生成。因此，补体系统引起的眼部疾病和血管生成引起的眼部疾病可以得到有效的治疗或预防。结果，所述融合蛋白可被有用地用于有效治疗黄斑变性，特别是干性黄斑变性和湿性黄斑变性。
附图说明
从以下结合附图的描述中可以更详细地理解示例性实施方案，其中：
图1为C1.01、C1.02、C1.03、C1.04、C1.05和C1.06的SDS-PAGE结果的图像。
图2为C1.03m、C1.04m和阿柏西普(aflibercept)的SDS-PAGE结果的图像。
图3为C1.01m、C1.02m、C1.06m和C1.07m的SDS-PAGE结果的图像。
图4为兔C3、兔C3b、大鼠C3和大鼠C3b的SDS-PAGE结果的图像。
图5为融合蛋白的示意图，并依次表示CRIg-Fc(C1.01，左)、CRIg-Fc-VEGF结合子(C1.02，中)和VEGF结合子-Fc-CRIg(C1.04，右)。
图6a和6b为通过Biacore分析按浓度显示C1.01和C1.02与人C3b和人VEGF165结合亲和力的图。
图7a和7b为通过Biacore分析按浓度显示C1.01m和C1.02m与小鼠C3b和人VEGF165结合亲和力的图。
图8a为通过ELISA显示C1.01、C1.02、C1.03和C1.04与人C3b结合亲和力的图。
图8b为通过ELISA显示阿柏西普、C1.02、C1.04和C1.05与人VEGF165结合亲和力的图。
图8c为通过ELISA显示C1.01、C1.02和C1.03与小鼠C3b结合亲和力的图。
图8d为通过ELISA显示C1.02与人C3b、人C2和人C4结合亲和力的图。
图9a为通过动态光散射分析表示C1.01的流体动力学半径图。
图9b为通过动态光散射分析表示C1.02的流体动力学半径图。
图10为根据C1.02浓度表示粘度的图。
图11a为通过溶血分析(AH50)显示C1.01、C1.02和C1.06的补体旁路途径抑制作用的图。
图11b是通过溶血分析(AH50)显示C1.02、C1.04、C1.04m和C1.05的补体旁路途径抑制作用的图。
图11c是通过溶血分析(AH50)显示C1.01m、C1.02m、C1.06m和C1.07m的补体旁路途径抑制作用的图。
图12a是通过溶血分析(CH50)显示C1.01、C1.02和C1.06的补体旁路途径抑制作用的图。
图12b是通过溶血分析(CH50)显示C1.02、C1.04、C1.04m和C1.05的补体经典途径抑制作用的图。
图12c是通过溶血分析(CH50)显示C1.01m、C1.02m、C1.06m和C1.07m的补体经典途径抑制作用的图。
图13是使用报告细胞显示阿柏西普、C1.01、C1.02、C1.05和C1.06的VEGF信号抑制作用的图。
图14是通过伤口愈合测定方法显示C1.01、C1.02和C1.05的VEGF信号通路抑制作用的图。
图15a是通过ELISA显示人和食蟹猴的C3b与C1.02的结合能力，以及人和食蟹猴的C3b与C1.06的结合能力的图。
图15b是通过ELISA显示人、大鼠和兔的C3b与C1.02的结合能力，以及人、大鼠和兔的C3b与C1.06的结合能力的图。
图15c是通过ELISA显示人、食蟹猴、大鼠和兔的VEGF与C1.02的结合能力，以及人、食蟹猴、大鼠和兔的VEGF与C1.01结合的能力的图。
图16a是通过荧光素血管造影确认在对脉络膜新生血管形成的小鼠模型在诱导时(第0天)和诱导后7天(第7天)每个实验组的脉络膜新生血管形成获得的图。
图16b为各实验组在对用于脉络膜新生血管形成的小鼠模型在诱导时(第0天)、诱导后3天(第3天)和诱导后7天(第7天)的体重图。
图16c为对每个实验组的脉络膜新生血管形成的小鼠模型诱导时(第0天)至诱导后7天(第7天)的脉络膜新生血管形成程度的量化图。
图17为对每个实验组的脉络膜新生血管形成的兔模型诱导后7天和14天脉络膜新生血管形成强度的量化图。
图18a为对每个实验组的脉络膜新生血管形成的大鼠模型诱导时和诱导后10天是否存在脉络膜新生血管形成的量化。
图18b为对每个实验组的脉络膜新生血管形成的大鼠模型诱导时和诱导后10天的血管渗漏面积的量化。
图19为显示图像的视图，该图像显示每个实验组的干性黄斑变性模型(图19a至19c)的外核层(ONL)、外核层中的细胞计数(图19d)、外核层面积(图19e)和视网膜中C3表达水平(图19f)的图。
图20a是通过给兔玻璃体内注射2,500μg C1.02后玻璃体液中C1.02的浓度图；和
图20b是通过给兔玻璃体内注射2,500μg C1.02后房水中C1.02的浓度图。
发明详述
融合蛋白含有CRIg胞外结构域
本发明的一个方面，提供了一种融合蛋白，其含有免疫球蛋白超家族(CRIg)的胞外结构域或其片段，以及一种特异性结合血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白。
如本文所用，术语“CRIg”是指由VSIG4基因编码的补体受体免疫球蛋白，也称为Z39Ig蛋白。CRIg属于四种类型补体受体中4型补体受体的受体，在巨噬细胞(例如在肝脏中执行吞噬作用的Kupffer细胞)的表面上表达。CRIg是一种膜蛋白(膜整合蛋白)，与包括免疫球蛋白结构域在内的细胞外区域结合。CRIg结合补体片段C3b和iC3b，并具有通过吞噬细胞识别和消除进入人体的细菌或血液中的感染性细菌的功能。
所述CRIg包括CRIg的亚型或剪切形式。亚型包括CRIg亚型1、2或3。剪切形式包括CRIg(L)或CRIg(S)。CRIg(L)可以包括V型和C2型末端Ig结构域，并且CRIg(S)可以仅包括V型结构域。具体地，CRIg(S)可以包含如SEQ ID NO:20所示的序列。
所述CRIg的细胞外结构域可以是排除跨膜结构域和细胞质结构域的受体的一部分。
所述CRIg可以包括CRIg的细胞外结构域的片段。CRIg的细胞外结构域的片段是指具有与CRIg的细胞外结构域相同或相似的活性的切割形式。具体地，所述片段是指CRIg的片段，该片段具有通过与C3b或iC3b结合促进补体作用或吞噬作用的活性。
在一个实施方案中，所述CRIg可以包含如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列。具体地，人CRIg可以包含如SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列，而小鼠CRIg可以包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。此外，小鼠CRIg的细胞外结构域可以包含如SEQ IDNO:75所示的氨基酸序列，并且人CRIg的细胞外结构域可以包含如SEQ ID NO:22或SEQ IDNO:74所示的氨基酸序列。
如本文所用，术语“血管内皮生长因子(VEGF)”是指由刺激血管形成的细胞产生的血管内皮生长因子。VEGF是一种重要的信号蛋白，通过分裂和增殖血管内皮细胞并增加血管通透性参与血管生成。已知VEGF会刺激湿性AMD视网膜的异常血管增生。
此外，如本文所用，VEGF或以VEGF为基础的蛋白质可统称为术语“VEGF”。以VEGF为基础的蛋白质可能具有与VEGF相同或相似的活性。这里，“活性”可以指例如特异性结合VEGF受体，并且这种特异性结合可以通过本领域技术人员已知的方法进行测量。
在一个实施方案中，以VEGF为基础的蛋白可以是一个或多个选自由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盘生长因子(PlGF)和重组VEGF组成的组中的任一个。优选地，VEGF可以是VEGF-A、B或PlGF。
如本文所用，术语“胎盘生长因子(PlGF)”是指由染色体2p21-p16编码的跨膜蛋白。PlGF作为VEGFR-1的选择性配体，可促进血管生成。PlGF与VEGF的氨基酸组成具有40％或更高的同一性。在一个实施方案中，PlGF可以是PlGF-1或PlGF-2。
如本文所用，术语“重组VEGF”是指通过拼接替换外显子进行重组VEGF。根据氨基酸的数量，重组VEGF可以是VEGF111、VEGF121、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF183、VEGF189或VEGF206。在一个实施方案中，重组VEGF可以是VEGF165。
如本文所用，术语“特异性结合VEGF的蛋白”是指特异性结合VEGF或VEGF受体的细胞外结构域的抗体。
如本文所用，术语“VEGF受体”是指结合VEGF的受体。在这种情况下，VEGF受体可以是选自VEGF受体1(VEGFR-1)、VEGF受体2(VEGFR-2)和VEGF受体3(VEGFR-3)组成的组中的任一种。VEGF受体包括免疫球蛋白(Ig)样结构域、细胞外结构域和细胞内分离的激酶结构域。VEGF受体通过与VEGF配体结合而被激活，从而可能发生二聚化或磷酸化。在一个实施方案中，VEGF受体可以是VEGF受体1或2。
如本文所用，术语“VEGF受体的细胞外结构域”是指结合VEGF的VEGF受体的结构域。具体地，VEGF受体的细胞外结构域是指除了VEGF受体的跨膜区域和细胞质区域之外，包括VEGF配体的细胞外结构域部分。
此外，VEGF受体的细胞外结构域可以是结合VEGF的VEGF受体的片段。在一个实施方案中，VEGF受体的片段包括VEGF受体的结构域D1、D2或D3，其是VEGF结合的区域或其组合。优选地，所述VEGF受体的片段可包括D2和D3。
在一个实施方案中，VEGF受体的细胞外结构域包括VEGF受体1或2的D2和D3结构域。此外，VEGF受体的细胞外结构域可能与VEGF-A、VEGF-B或PlGF结合以抑制血管生成。这种情况下，在一个实施方案中，VEGF受体的细胞外结构域可以含有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。此外，VEGF受体的细胞外结构域可以是含有如SEQ ID NO:14所示的VEGF受体的细胞外结构域的一部分被切割或替换的形式。
如本文所用，“特异性结合VEGF的抗体”是指通过特异性结合VEGF或其片段引起抗原抗体反应的抗体，也称为抗VEGF抗体。
抗体是能够结合VEGF形成特异性抗原抗体的分子的通用术语。此外，只要抗体含有能够特异性结合VEGF的抗原结合结构域，就可以以任何形式使用抗体。抗体或其片段可以是抗原结合片段(Fab)、F(ab)2、单链可变片段(scFv)、di-scFv、单域抗体(sdAb)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或其变体。
抗VEGF抗体可以是纳米抗体。在这种情况下，抗体可以含有如SEQ ID NO:49所示的CDR1、如SEQ ID NO:50所示的CDR2和如SEQ ID NO:51所示的CDR3。具体地，抗体可以是BI-836880。
抗VEGF抗体可以包括选自阿柏西普、贝伐单抗(bevacizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、布洛塞住单抗(brolucizumab)、法瑞西单抗(faricimab)、KSI-301、伐努赛珠单抗(vanucizumab)、BI-836880、HuMab G6-31、B20-4.1、BAT-5906、那赛昔珠单抗(navicixizumab)、迪帕西单抗(dilpacimab)、hPV-19和AT-001的组中任一种。优选地，抗VEGF抗体可以包括阿柏西普、贝伐单抗、雷珠单抗、布洛塞住单抗、KSI-301、伐努赛珠单抗、BI-836880或BAT-5906的可变区。
在这种情况下，阿柏西普是指抑制血管中VEGF-A和PlGF的重组人源融合蛋白。在这里，阿柏西普可以直接注射到眼球中。贝伐单抗是一种抗体，是一种血管生成抑制剂，可抑制血管中的VEGF-A以抑制血管的生长。在治疗黄斑变性的情况下，贝伐单抗可以直接注射到眼球中。雷珠单抗是一种Fab，具有通过抑制血管生成来治疗湿性黄斑变性的作用。雷莫芦单抗是一种血管生成介导的物质，或抑制VEGF受体2的抗体。布洛塞住单抗是一种scFv，可与VEGF-A结合，抑制血管生成并治疗湿性黄斑变性。法瑞西单抗是一种抑制VEGF-A和血管生成素-2的双特异性抗体。
所述KSI-301抗体具有治疗湿性黄斑变性的作用。伐努赛珠单抗是一种双特异性人源化单克隆抗体，可抑制VEGF-A和血管生成素-2。BI-836880是一种人源化双特异性纳米抗体，可抑制VEGF和血管生成素-2。G6-31是一种抑制人VEGF的Fab片段。B20-4.1是一种抑制人VEGF的scFv片段。
所述BAT-5906抗体具有治疗湿性黄斑变性的作用。那赛昔珠单抗是一种抗DLL4/VEGF双特异性抗体。迪帕西单抗是一种抗DLL4/VEGF双特异性抗体，也称为ABT-165。hPV-19是一种抗VEGF的抗体，具有抗血管生成和抗肿瘤活性。AT-001是一种抑制人VEGF受体3以抑制血管生成的抗体。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括BI-836880的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:49所示的CDR1、如SEQ ID NO:50所示的CDR2和如SEQ ID NO:51所示的CDR3的重链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括贝伐单抗的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:77所示的HCDR1、如SEQ ID NO:78所示的HCDR2和如SEQ ID NO:79所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:80所示的LCDR1、如SEQ ID NO:81所示的LCDR2和如SEQ ID NO:82的LCDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括雷珠单抗的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:83所示的HCDR1、如SEQ ID NO:84所示的HCDR2和如SEQ ID NO:85所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:86所示的LCDR1、如SEQ ID NO:87所示的LCDR2和如SEQ ID NO:88所示的LCDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括雷莫西单抗的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:89所示的HCDR1、如SEQ ID NO:90所示的HCDR2和如SEQ ID NO:91所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:92所示的LCDR1、如SEQ ID NO:93所示的LCDR2和如SEQ ID NO:94所示的LCDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括法瑞西单抗的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:101所示的HCDR1、如SEQ ID NO:102所示的HCDR2和如SEQ ID NO:103所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:104所示的LCDR1、如SEQ ID NO:105所示的LCDR2和如SEQ ID NO:106所示的LCDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括KSI-301的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:107所示的HCDR1、如SEQ ID NO:108所示的HCDR2和如SEQ ID NO:109所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:110所示的LCDR1、如SEQ ID NO:111所示的LCDR2和如SEQ ID NO:112所示的LCDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括伐努赛珠单抗的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:113所示的HCDR1、如SEQ ID NO:114所示的HCDR2和如SEQ ID NO:115所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:116所示的LCDR1、如SEQ ID NO:117所示的LCDR2和如SEQ ID NO:118所示的LCDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括BAT-5906的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:119所示的HCDR1、如SEQ ID NO:120所示的HCDR2和如SEQ ID NO:121所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:122所示的LCDR1、如SEQ ID NO:123所示的LCDR2和如SEQ ID NO:124所示的LCDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括那赛昔珠单抗的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:125所示的HCDR1、如SEQ ID NO:126所示的HCDR2和如SEQ ID NO:127所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:128所示的LCDR1、如SEQ ID NO:129所示的LCDR2和如SEQ ID NO:130所示的LCDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括迪帕西单抗的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:131所示的HCDR1、如SEQ ID NO:132所示的HCDR2和如SEQ ID NO:133所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:134所示的LCDR1、如SEQ ID NO:135所示的LCDR2和如SEQ ID NO:136所示的LCDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可包括hPV-19的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:137所示的HCDR1、如SEQ ID NO:138所示的HCDR2和如SEQ ID NO:139所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:140所示的LCDR1、如SEQ ID NO:141所示的LCDR2和如SEQ ID NO:142所示的LCDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括AT-001的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:143所示的HCDR1、如SEQ ID NO:144所示的HCDR2和如SEQ ID NO:145所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:146所示的LCDR1、如SEQ ID NO:147所示的LCDR2和如SEQ ID NO:148所示的LCDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体可以包括：如SEQ ID NO:36所示的重链和如SEQID NO:37所示的轻链；如SEQ ID NO:38所示的重链和如SEQ ID NO:39所示的轻链；如SEQID NO:40所示的重链和如SEQ ID NO:41所示的轻链；如SEQ ID NO:43所示的重链和如SEQID NO:44所示的轻链；如SEQ ID NO:45所示的重链和如SEQ ID NO:46所示的轻链；如SEQID NO:47所示的重链和如SEQ ID NO:48所示的轻链；如SEQ ID NO:64所示的重链和如SEQID NO:65所示的轻链；如SEQ ID NO:66所示的重链和如SEQ ID NO:67所示的轻链；如SEQID NO:68所示的重链和如SEQ ID NO:69所示的轻链；如SEQ ID NO:70所示的重链可变区和如SEQ ID NO:71所示的轻链可变区；或如SEQ ID NO:72所示的重链可变区和如SEQ ID NO:73所示的轻链可变区。
抗VEGF抗体的片段可以是单链可变片段(scFv)。在这种情况下，scFv是指重链可变区和轻链可变区通过肽接头连接的形式。具体地，scFv可以包括包含如SEQ ID NO:95所示的CDR1、如SEQ ID NO:96所示的CDR2、如SEQ ID NO:97所示的CDR3、如SEQ ID NO:98所示的CDR4、如SEQ ID NO:99所示的CDR5和如SEQ ID NO:100所示的LCDR6的可变区。此外，scFv可以包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。在这种情况下，scFv的一个实施方案可以是布洛塞住单抗。
抗VEGF抗体可以包括HuMab G6-31或B20-4.1的可变区。具体地，抗体可以包括包含如SEQ ID NO:52所示的HCDR1、如SEQ ID NO:53所示的HCDR2和如SEQ ID NO:54所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:55所示的LCDR1、如SEQ ID NO:56所示的LCDR2和如SEQ ID NO:57所示的LCDR3的轻链可变区。此外，该抗体可能包括包含如SEQ ID NO:58所示的HCDR1、如SEQ ID NO:59所示的HCDR2和如SEQ ID NO:60所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:61所示的LCDR1、如SEQ ID NO:62所示的LCDR2和如SEQ ID NO:63所示的LCDR3的轻链可变区。
特异性结合VEGF的抗体可以指本领域技术人员已知的抗体，但不限于此。在另一个实施方案中，美国专利9,527,925B2、美国专利8,268,314B2或美国公开2019-0167790A1中公开的抗VEGF抗体或其片段，其可用作抗体。
所述CRIg或其片段的细胞外结构域，以及特异性结合VEGF的蛋白可以通过接头连接。
此外，所述CRIg或其片段的细胞外结构域，其可通过接头与免疫球蛋白片段连接。接头连接两种蛋白质。在一个实施方案中，接头可包括1-50个氨基酸、白蛋白或其片段、或Fc结构域的免疫球蛋白。在这种情况下，免疫球蛋白的Fc结构域是指包括免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)的蛋白质，但不包括免疫球蛋白的重链和轻链的可变区以及轻链恒定区1(CH1)。免疫球蛋白可以是IgG、IgA、IgE、IgD或IgM，最好是IgG1。本说明书中的Fc结构域可以指除了铰链区之外的包括CH2和CH3域的区域。
此外，融合蛋白可由结构式(I)或(II)组成。
N'-X-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-Y-C' (I)
N'-Y-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-X-C' (II)
在结构式(I)和(II)中，
N'为融合蛋白的N末端，
C'为融合蛋白的C末端，
X为CRIg的细胞外结构域或其片段，
Y为特异性结合VEGF的蛋白，
接头(1)和接头(2)为肽接头，并且
n和m各自独立为0或1。
特异性结合VEGF的蛋白、CRIg或其片段的细胞外结构域、以及Fc结构域均如上所述。Fc结构域可以包括免疫球蛋白的Fc重链的CH2和CH3区。此外，免疫球蛋白的Fc结构域可以是Fc结构域变体以及野生型Fc结构域。此外，如本文所用，术语“Fc结构域变体”可以指具有与野生型Fc结构域不同的糖基化模式的Fc结构域，或者可以与野生型Fc结构域相比具有升高的糖基化，与野生型Fc结构域相比具有降低的糖基化或具有去糖基化。此外，还包括非糖基化的Fc结构域。Fc结构域或其变体可以通过培养条件或宿主的基因操作而适于具有调整数量的唾液酸、岩藻糖基化和糖基化。
此外，免疫球蛋白的Fc结构域的糖基化可以通过常规方法进行修饰，例如化学方法、酶法和使用微生物的基因工程方法。此外，Fc结构域变体可以是免疫球蛋白IgG、IgA、IgE、IgD或IgM的相应Fc区混合的形式。此外，Fc结构域变体可以是Fc结构域的某些氨基酸被其它氨基酸取代的形式。
如本文所用，术语“Fc结构域变体”是指通过改变野生型Fc结构域的糖基化而形成的变体，其中Fc结构域序列混合的Fc结构域，或者通过缺失、替换、取代和/或添加野生型Fc结构域的某些氨基酸而形成的变体。通过缺失、替换、取代和/或添加野生型Fc结构域的一些氨基酸形成的变体可以通过本领域技术人员已知的方法制备。在一个实施方案中，Fc结构域变体可以通过取代和/或添加野生型Fc结构域的一些氨基酸序列来形成。
通过取代和/或添加引入的“氨基酸”可以是选自由赖氨酸(K)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、苯基丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)组成的组中的任一种。
Fc结构域变体可以调节抗体的活性或功能。在一个实施方案中，Fc结构域变体可以调节抗体的效应器功能或细胞毒性活性。
在一个实施方案中，所述Fc结构域变体可以包括DANG突变或NG突变。此外，Fc结构域变体可以是IgG1 Fc结构域中的第265位序列从D到A取代的变体，其中第297位序列从N到G取代的变体，或其组合。
在一个实施方案中，Fc结构域可以具有选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11和SEQID NO:76组成的组中的任一个氨基酸序列。Fc结构域可以由如SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:33所示的多核苷酸序列编码。
肽接头(1)可以由5-80个连续氨基酸、20-60个连续氨基酸、25-50个连续氨基酸或30-40个氨基酸组成。在一个实施方案中，肽接头(1)可以由30个氨基酸组成。此外，肽接头(1)可以含有至少一个半胱氨酸。具体地，可以含有一个、两个或三个半胱氨酸。此外，肽接头(1)可以衍生自免疫球蛋白的铰链。在一个实施方案中，肽接头(1)可以是由如SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成的肽接头。
肽接头(2)可以由1-50个连续氨基酸、3-30个连续氨基酸或5-15个氨基酸组成。在一个实施方案中，肽接头(2)可以是(G4S)n(此处，n位1至10的整数)。在这种情况下，(G4S)n中的n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，肽接头(2)可以是由如SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成的肽接头。
优选地，所述融合蛋白可由结构式(I)组成。
在一个实施方案中，融合蛋白可以含有选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:10组成的组中的任一个氨基酸序列。
在另一个实施方案中，融合蛋白的多肽可包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10组成的组中的任一个氨基酸序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
这种情况下，同一性可以通过例如同源性百分比，或同源性比较软件例如由国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BlastN软件确定。
融合蛋白二聚体
本发明的另一方面提供了一种融合蛋白二聚体，其中含有CRIg的细胞外结构域或其片段和特异性结合VEGF蛋白的两种融合蛋白相连接。
在这种情况下，构成二聚体的融合蛋白之间的连接可以通过存在于接头中的半胱氨酸形成二硫键，但不限于此。构成二聚体的融合蛋白可以相同，也可以彼此不同。优选地，所述二聚体可以是同源二聚体。
编码融合蛋白的多核苷酸
本发明的另一方面，提供了一种编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白含有CRIg的细胞外结构域或其片段和特异性结合VEGF的蛋白。
在一个实施方案中，所述多核苷酸包含的核酸序列可以与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％的同一性。
在一个实施方案中，所述多核苷酸的碱基序列可以与选自由SEQ ID NO:24、SEQID NO:26、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32组成的组的任一个具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％的同一性。
所述多核苷酸还可以含有编码信号序列或前导序列的核酸。如本文中所用，术语“信号序列”是指指导靶蛋白分泌的信号肽。在宿主细胞中，信号肽被翻译，然后被切割。具体地，信号序列是启动蛋白质跨内质网(ER)膜转运的氨基酸序列。
本领域众所周知信号序列的这些特征在。这种信号序列通常含有16至30个氨基酸残基，但可以含有比上述氨基酸残基更多或更少的氨基酸残基。典型的信号肽由三个区域组成：碱性N末端区域、中央疏水区域和极性更强的C末端区域。中央疏水区域包含4至12个疏水残基，在未成熟多肽的转运过程中，这些疏水残基通过膜脂质双层固定信号序列。
启动后，信号序列在ER的腔内被细胞酶(被通常称为信号肽酶)切割。在这种情况下，信号序列可以是组织纤溶酶原激活(tPa)、单纯疱疹病毒糖蛋白D的信号序列(HSV gDs)或生长激素分泌信号序列。优选地，可以使用用于包括哺乳动物等在内的高等真核细胞的分泌信号序列。此外，可以使用野生型信号序列，或者可以使用在宿主细胞中具有高表达频率的密码子取代的信号序列。
含有编码融合蛋白的多核苷酸的载体
本发明的另一方面，提供了一种包含上述多核苷酸的载体。
载体可以被引入宿主细胞中，与宿主细胞基因组重组并插入其中。或者，载体被理解为包括多核苷酸序列的核酸手段，该多核苷酸序列可作为附加体自主复制。所述载体包括线性核酸、质粒、噬菌体、粘粒(cosmid)、RNA载体、病毒载体及其类似物。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。
具体地，所述载体可以是质粒DNA、噬菌体DNA等，以及商业开发的质粒(pUC18、pBAD、pIDTSAMRT-AMP等)、大肠杆菌衍生质粒(pYG601BR322、pBR325、pUC118、pUC119等)、枯草芽孢杆菌衍生质粒(pUB110、pTP5等)、酵母衍生质粒(YEp13、YEp24、YCp50等)、噬菌体DNA(Charon4A、Charon21A，EMBL3，EMBL4，λgt10，λgt11，λZAP等)，动物病毒载体(逆转录病毒，腺病毒，牛痘病毒等)或昆虫病毒载体(杆状病毒等)。由于载体根据宿主细胞表现出不同的表达水平和蛋白修饰，因此优选选择和使用最适合目标的宿主细胞。
如本文所用，术语靶蛋白的“基因表达”或“表达”被理解为DNA序列的转录、mRNA转录本的翻译以及融合蛋白产物或其片段的分泌。有用的表达载体可以是RcCMV(Invitrogen，Carlsbad)或其变体。表达载体可以包括用于促进哺乳动物细胞中靶基因连续转录的人巨细胞病毒(CMV)启动子，以及用于提高转录后RNA稳定性水平的牛生长激素聚腺苷酸化信号序列。
表达融合蛋白的转化细胞
本发明的另一方面，提供了一种导入上述载体的转化细胞。
转化细胞的宿主细胞的实例可以包括但不限于原核细胞、真核细胞和哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。作为原核细胞的一个例子，可以使用大肠杆菌。此外，作为真核细胞的一个例子，可以使用酵母。此外，对于哺乳动物细胞，可以使用CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞等，但不限于此。任何本领域技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的细胞都可以使用。
此外，为了将表达载体引入宿主细胞，使用CaCl2沉淀法、通过在CaCl2沉淀法中使用还原剂(二甲基亚砜(DMSO))来提高效率的Hanahan法、电穿孔法、磷酸钙沉淀法、原生质体融合法、使用碳化硅纤维搅拌法、农杆菌介导的转化法、使用PEG、硫酸葡聚糖盐、脂质体或干燥/抑制介导的转化法，或类似转化法。
如上所述，为了优化融合蛋白作为治疗剂的性质或用于任何其它目的，融合蛋白的糖基化模式(例如，唾液酸、岩藻糖基化和糖基化)可以通过本领域技术人员已知的方法操纵宿主细胞的糖基化相关基因来调节。
生产融合蛋白的方法
本发明的另一方面，提供了一种生产融合蛋白或其二聚体的方法，该方法包括：培养转化细胞，其中融合蛋白含有CRIg的细胞外结构域或其片段和VEGF特异性结合的蛋白。
生产方法可包括：i)培养转化细胞得到培养基；ii)从培养基中收集融合蛋白或其二聚体。
转化细胞的培养方法可以使用本领域公知的方法进行。具体地，所述培养可以在分批进料过程中进行，或者在分批进料或重复分批进料过程中连续进行。
融合蛋白或其二聚体的应用
本发明的另一方面，提供了用于治疗或预防眼部疾病的药物组合物，包括作为活性成分的融合蛋白，或两种融合蛋白结合的融合蛋白二聚体。
所述融合蛋白和融合蛋白二聚体均如上所述。
如本文所述，术语“眼部疾病”可以是用于表述眼睛是发病部位的疾病的通用术语。眼部疾病可能是指由补体活性或血管生成引发或加重的眼部疾病，或包括过度血管生成作为主要疾病症状的眼部疾病。眼部疾病可以是选自年龄相关性黄斑变性(AMD)、地图状萎缩(GA)、脉络膜新生血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病和其他缺血相关性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、冯·希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)、眼组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜血管形成和视网膜血管形成的组中的任一种。
所述CRIg的细胞外结构域或其片段，以及特异性结合VEGF的蛋白如上所述。
药物组合物的优选剂量根据患者的状况和体重、疾病的严重程度、药物形式以及给药途径和持续时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当选择。在本发明的用于治疗或预防眼部疾病的药物组合物中，活性成分可以根据用途、剂型、混合目的等以任意量(有效量)含有，只要活性成分可以表现出治疗眼部疾病的活性或特别是对黄斑变性的治疗效果。其常规有效量将基于组合物的总重量在0.001wt％至20.0wt％的重量范围内确定。如本文所述，术语“有效量”是指活性成分的量，其能够诱导改善或治疗眼部疾病状况的效果，特别是改善或治疗黄斑变性状况的效果。这种有效量可以在本领域技术人员的公知范围内通过实验确定。
如本文所述，术语“治疗”可用于表示治疗性和预防性治疗。在本申请情况下，预防可用于表示缓解或减轻受试者的病理状况或疾病。在一个实施方案中，术语“治疗”包括用于治疗哺乳动物(包括人类)的疾病的任何形式的给药或应用。此外，该术语包括抑制或减轻疾病的进展，并包括恢复或修复受损或丧失的功能，以部分或完全缓解疾病的含义，刺激低效过程，或缓解严重疾病。
药代动力学参数(例如生物利用度)和基础参数(例如清除率)也可能影响疗效。因此，“增强的功效”(例如功效的改善)可以归因于药代动力学参数的改善和疗效的改善，并且可以通过比较实验动物或人类受试者的眼部疾病，诸如测量清除率和治疗或改善等参数。
如本文所述，术语“治疗有效量”或“药学有效量”是指有效预防或治疗目标疾病的化合物或组合物的量，并且还指足以治疗具有适用于医学治疗的合理益处/风险比的疾病的量，并且不会引起副作用。有效量的水平可以根据包括患者的健康状况、疾病种类、严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药方法、给药时间、给药途径、排泄率、治疗持续时间、组合或同时使用的药物，以及医学领域公知的其他因素来确定。在一个实施方案中，治疗有效量是指有效治疗眼部疾病的药物的量。
在这种情况下，所述药物组合物还可含有药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是任何载体，只要载体是适合递送给患者的无毒物质。可以含有蒸馏水、酒精、脂肪、蜡和惰性固体作为载体。药学上可接受的佐剂(缓冲剂或分散剂)也可以包含在药物组合物中。
具体地，所述药物组合物含有除活性成分外的药学上可接受的载体，并且可以通过本领域已知的常规方法按照给药途径制备肠胃外剂型。这里，术语“药学上可接受的”表示它不抑制活性成分的活性，并且不具有超出应用(处方)受试者适应性的毒性。
当药物组合物制备为肠胃外剂型时，可以按照本领域已知的方法将其与合适的载体一起制成注射剂、透皮给药剂、鼻吸入剂或栓剂形式的制剂。当配制成注射液时，可以使用无菌水、乙醇、多元醇如甘油或丙二醇，或其混合物作为合适的载体，并且优选可使用林格氏溶液、含有三乙醇胺的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、和等渗溶液，例如注射用无菌水或5％葡萄糖等。所述药物组合物的配方是本领域已知的，并且可以具体参考雷明顿的《药物科学》(第19版，1995)等。本文件并入本发明说明书的一部分。
根据患者的状况、体重、性别、年龄、患者的严重程度或给药途径，药物组合物的优选剂量可以在每天0.01μg/kg至10g/kg的范围内或0.01mg/kg至1g/kg的范围内。给药可以每天施用一次，也可以分次进行几次。这样的剂量不应被理解为在任何方面限制本发明的范围。
可应用(处方)药物组合物的受试者是哺乳动物和人，特别优选人。除活性成分之外，本申请的药物组合物还可以含有任何已知具有治疗眼部疾病，特别是黄斑变性效果的化合物或天然提取物。
本发明的另一方面，提供了一种融合蛋白或其二聚体用于治疗眼部疾病的用途，其中融合蛋白含有CRIg的细胞外结构域或其片段及特异性结合VEGF的蛋白。
本发明的另一方面，提供了一种融合蛋白或其二聚体在制备用于治疗或预防眼部疾病的药物中的用途，其中融合蛋白含有CRIg的细胞外结构域或其片段及特异性结合VEGF的蛋白。
本发明的另一方面，提供了治疗和/或预防眼部疾病的方法，该方法包括：向受试者施用融合蛋白或其二聚体，其中融合蛋白含有CRIg的细胞外结构域或其片段及特异性结合VEGF的蛋白。
所述融合蛋白、二聚体和眼部疾病均如上所述。在这种情况下，受试者可以是患有眼部疾病的受试者。此外，受试者可以是哺乳动物，优选为人。
关于融合蛋白或融合蛋白二聚体的给药途径、剂量和给药频率，可以根据患者的状况和是否存在副作用以各种方式和量向受试者施用，并且本领域技术人员可在适当范围内选择最佳给药方法、剂量和给药频率。此外，融合蛋白或融合蛋白二聚体可以与对所治疗的疾病具有已知的疗效的其它药物或生理活性物质组合施用，或者可以与其他药物配制成组合制剂的形式。
在一个实施方案中，融合蛋白可抑制补体途径、吞噬作用和/或血管生成。因此，融合蛋白可以有效地用于眼部疾病如湿性或干性黄斑变性。特别是，证实了将CRIg的细胞外结构域或其片段与特异性结合VEGF的蛋白结合的情况与包含他们中的一种的情况相比具有更好的效果并且还具有协同作用。结果，融合蛋白可以通过有效抑制补体途径和血管生成来有效治疗干湿性黄斑变性。
在下文中，将参照以下实施例对本发明进行更详细的描述。在此，以下实施例仅用于说明性地描述本发明，并不限制本发明的保护范围。
制备实施例1.含CRIg的融合蛋白的制备
[表1]
编码 格式 描述 对应序列
C1.01 Fc-融合 hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG SEQ ID NO:1
C1.02 Fc-融合 hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG-VEGF结合子 SEQ ID NO:2
C1.03 Fc-融合 hu IgG1 Fc DANG-hu CRIg SEQ ID NO:3
C1.04 Fc-融合 VEGF结合子-hu IgG1 Fc DANG-hu CRIg SEQ ID NO:4
C1.05 Fc-融合 VEGF结合子-hu IgG1 Fc DANG SEQ ID NO:5
C1.06 Fc-融合 hu IgG1 Fc DANG SEQ ID NO:6
C1.01m Fc-融合 mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG SEQ ID NO:7
C1.02m Fc-融合 mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG-VEGF结合子 SEQ ID NO:8
C1.03m Fc-融合 mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg SEQ ID NO:9
C1.04m Fc-融合 VEGF结合子-mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg SEQ ID NO:10
C1.06m Fc-融合 mu IgG2a Fc DANG SEQ ID NO:11
C1.07m Fc-融合 mu IgG2a Fc DANG-VEGF结合子 SEQ ID NO:12
阿柏西普 Fc-融合 阿柏西普 SEQ ID NO:13
C1.01(SEQ ID NO:1)由人CRIg蛋白的细胞外结构域(20至283)、接头和人IgG1Fc组成，其中通过DANG突变(D265A，N297G)去除效应器功能。
C1.02(SEQ ID NO:2)由人CRIg蛋白的细胞外结构域(20至283)、接头、人IgG1FcDANG、接头和阿柏西普的VEGF结合子组成。
C1.03(SEQ ID NO:3)由人IgG1 Fc DANG、接头和人CRIg蛋白的细胞外结构域(20至283)组成。
C1.04(SEQ ID NO:4)由阿柏西普的VEGF结合子、接头、人IgG1 Fc DANG、接头和人CRIg蛋白的细胞外结构域(20至283)组成。
C1.05(SEQ ID NO:5)由阿柏西普的VEGF结合子、接头和人IgG1 Fc DANG组成。
C1.06(SEQ ID NO:6)由人IgG1 Fc DANG组成。
C1.01m(SEQ ID NO:7)由小鼠CRIg蛋白的细胞外结构域(20至187)、接头和小鼠IgG2a Fc组成，其中通过DANG突变(D265A，N297G)去除效应器功能。
C1.02m(SEQ ID NO:8)由小鼠CRIg蛋白的细胞外结构域(20至187)、接头、小鼠IgG2a Fc DANG、接头和阿柏西普的VEGF结合子组成。
C1.03m(SEQ ID NO:9)由小鼠IgG2a Fc DANG、接头和小鼠CRIg蛋白的细胞外结构域(20至187)组成。
C1.04m(SEQ ID NO:10)由阿柏西普的VEGF结合子、接头、小鼠IgG2a Fc DANG、接头和小鼠CRIg蛋白的细胞外结构域(20至187)组成。
C1.06m(SEQ ID NO:11)由小鼠IgG2a Fc DANG组成。
C1.07m(SEQ ID NO:12)由小鼠IgG2a Fc DANG、接头和阿柏西普的VEGF结合子组成。
[SEQ ID NO:1]hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG
RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[SEQ ID NO:2]hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG-VEGF结合子
RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK
[SEQ ID NO:3]hu IgG1 Fc DANG-hu CRIg
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPG
[SEQ ID NO:4]VEGF结合子-hu IgG1 Fc DANG-hu CRIg
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPG
[SEQ ID NO:5]VEGF结合子-hu IgG1 Fc DANG
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
[SEQ ID NO:6]hu IgG1 Fc DANG
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
[SEQ ID NO:7]mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG
HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[SEQ ID NO:8]mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG-VEGF结合子
HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK
[SEQ ID NO:9]mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSHPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPG
[SEQ ID NO:10]VEGF结合子-mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSHPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPG
[SEQ ID NO:11]mu IgG2a Fc DANG
APNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[SEQ ID NO:12]mu IgG2a Fc DANG-VEGF结合子
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK
[SEQ ID NO:13]阿柏西普
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
制备实施例2.制备人蛋白(C1.01至C1.06和阿柏西普)和小鼠蛋白(C1.03m和C1.04m)
制备实施例2.1.载体构建和质粒最大制备
表2和表3列出了使用的试剂和设备，如下所示。
[表2]
Figure BDA0004097255470000221
[表3]
设备和仪器 生产商 型号名称
生物安全柜 NUAIRE LabGard class II
离心机 Eppendorf 5424
凝胶成像系统 Tanon 2500R
将合成的DNA片段通过PCR扩增，PCR产物经凝胶纯化。用限制性内切酶EcoRI和BamHI切割pTT5载体，然后用凝胶纯化。使用In-Fusion试剂盒连接每个PCR产物和线性载体。将产生的载体转化至ECOS101 DH5α感受态细胞中，并在含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT琼脂平板上培养。所有操作过程均根据标准转换协议执行。通过菌落PCR确认阳性重组体，并对重组质粒进行序列验证测序。选择单个菌落并将菌种接种到含有5ml、100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中。在37℃下振荡培养8小时。
此后，将菌种以1:1,000的比例稀释于200ml 2×YT选择性培养基中。在37℃下振荡培养16小时。通过在4℃、4,700rpm下离心10分钟收集细菌细胞。将细菌沉淀重悬于12ml的RES-EF缓冲液中。随后，加入12ml的LYS-EF缓冲液，将密封的试管剧烈倒置以充分混合，然后在室温下培养5分钟。向裂解物中加入12ml NEU-EF缓冲液，并将试管剧烈倒置以快速彻底混合。
在将裂解物注入
Figure BDA0004097255470000222
Xtra柱过滤器之前，通过倒置裂解液管三次制备沉淀物的均匀悬浮液，以防止过滤器堵塞。随后，用10ml过滤器洗涤缓冲液FIL-EF洗涤
Figure BDA0004097255470000231
Xtra柱过滤器和/>
Figure BDA0004097255470000232
Xtra柱。取出/>
Figure BDA0004097255470000233
Xtra柱过滤器，或通过倒置柱将其取出。用90ml洗涤缓冲液END洗涤/>
Figure BDA0004097255470000234
Xtra柱。
用45ml洗涤缓冲液WASH-EF洗涤
Figure BDA0004097255470000235
Xtra柱。用15ml洗脱缓冲液ELU洗脱质粒DNA。将洗脱液收集在50ml离心管中。加入10.5ml室温异丙醇以沉淀洗脱的质粒DNA。涡旋后，将混合物放置2分钟。
此后，向沉淀中加入5ml的70％乙醇。使用移液器吸头小心地将乙醇完全从管中除去。将沉淀在室温(20℃至25℃)下干燥。然后，用1,000μl H2O溶解DNA沉淀。
制备实施例2.2.细胞转染和蛋白表达
表4列出了所使用的材料和试剂，如下所示。
[表4]
Figure BDA0004097255470000236
将含有完整培养基的293F菌株保持在130rpm、37℃和8％CO2的培养箱振荡器中。细胞以0.3×106个细胞/ml至0.4×106个细胞/ml的密度培养，每2至3天更换一次培养基。转染前24小时，以2.6×106个细胞/ml制备新鲜传代培养的293F细胞。将制备好的细胞在振荡培养箱中以130rpm，37℃和8％CO2培养。在转染当天，使用新鲜培养基将细胞密度调节至5.0×106个细胞/ml。在3-L摇瓶中以1L的总体积进行调节。用50ml OPTI MEM I稀释0.4mgHC和0.6mg LC质粒，并用0.22μm的过滤器过滤。然后，用50ml OPTI MEM I稀释2mg PEI以制备转染试剂。
将稀释后的PEI加入到DNA混合物中，然后立即混合。随后，在室温下培养15分钟。将DNA-PEI混合物加入到以2.6×106个细胞/ml制备的293F细胞中。然后将细胞在振荡培养箱中以130rpm，37℃和8％CO2连续培养24小时。转染24小时后，将10％蛋白胨加入1/20的培养基中，使终浓度为0.5％。然后将细胞在振荡培养箱中以130rpm，37℃和8％CO2连续培养。在转染后2至5天内每天测量和记录细胞的密度/活力。在转染后7天或细胞活力低于70％时收集细胞进行纯化。
制备实施例2.3.蛋白质纯化
表5至表7示出了用于蛋白质纯化的试剂、各缓冲液的组成和设备，如下所示。
[表5]
试剂 生产商 货号
Mabselect SuRe GE Healthcare 11003493
Tris SIGMA 77-86-1
NaCl ACROS ORGANIVS 7647-14-5
柠檬酸钠 Adamas-beta 76198B
柠檬酸 GENERAL-Reagent G83162B
精氨酸 VETEC V900343-500G
琥珀酸 Sigma-Aldrich S9512-500G
Triton X-100 ABCONE X10010-1L
TRITON X-114 SIGMA-ALDRICH X114
Millex-GP过滤单元，0.22μm，无菌 MILLIPORE SLGP033RS
NaOH Merck B146369740
[表6]
Figure BDA0004097255470000241
[表7]
仪器 生产商 型号名称
AKTA Pure GE Healthcare 29-0182-24
离心机 Beckman J-26xp
凝胶成像系统 Tanon 2500R
Sartopore 2filter Sartorius 5445307H9-OO-A
采用MabSelect Sure柱纯化蛋白质。具体地，通过在4℃和2,000×g下离心20分钟收集上清液。随后，用Sartopore 2过滤器过滤上清液。将澄清的上清液上样到用缓冲液A平衡的5ml MabSelect Sure柱上。然后用缓冲液A洗涤柱，直到A280吸光度达到基线。用10CV的缓冲液B洗涤柱。用10CV的缓冲液A洗涤柱。结合的蛋白质用6CV缓冲液C洗脱，加入1/6体积的缓冲液D中和洗脱液，进行SDS-PAGE分析和SEC-HPLC分析。
此后，通过HIC柱纯化蛋白质。然后将蛋白质在4℃下对缓冲液E透析过夜。将上清液上样到用缓冲液E平衡的HIC柱上。然后用缓冲液E洗涤柱，直到A280吸光度达到基线。结合的蛋白质通过梯度洗脱(10CV的缓冲液F，0％至40％)洗脱。用2CV的100％缓冲液F洗脱结合的蛋白质，并进行SDS-PAGE分析。
纯化蛋白质后，将蛋白质收集在一个地方，然后在4℃下对最终缓冲液透析过夜。随后，进行了SDS-PAGE分析和SEC-HPLC分析。
结果，如图1和图2所示，通过SDS-PAGE证实了纯化的C1.01、C1.02、C1.03、C1.04、C1.05、C1.06、C1.03m、C1.04m和阿柏西普。
制备实施例3.小鼠融合蛋白的制备(C1.01m、C1.02m、C1.06m和C1.07m)
制备实施例3.1.蛋白质的制备
表8示出了所使用的材料和试剂，如下所示。
[表8]
材料和试剂 供应商 货号
EXPI293FTM细胞 Gibco A14527
EXPI293TM表达系统试剂盒 Gibco A14635
MabSelect SuRe GE Lifesciences 17543803
Superdex 200increase 10/300 GE Lifesciences 28990944
MPCTM羟基氟磷灰石陶瓷(Ceramic Hydroxyfluoroapatite) Bio-rad 1570200
在Genewiz(No.80-383034849)中合成了对应于该蛋白质序列的DNA片段。通过PCR扩增相应的DNA片段，并使用线性化的pcDNA3.3表达载体导入。通过测序验证其构建，然后通过大规模质粒制备工艺获得足够量的DNA进行细胞转染。
首先，以2.94×106个细胞/ml制备Expi293F细胞(其中95％或更多在2-L细胞培养基中存活)。将质粒DNA和EXPIFECTAMINETM 293试剂先在Opti-MEM中稀释，然后混合并添加到细胞培养基中。在平台摇床中以150rpm的搅拌速度进行细胞培养。温度保持在37℃，CO2浓度保持在8％。转染后18至20小时，向细胞培养基中添加增强子1和增强子2。
细胞培养6天后，将细胞在25℃下以4,000rpm离心10分钟。收集上清液进行纯化和凝胶电泳。根据NUPAGETM 4％至12％ Bis-Tris Protein Gels(赛默飞世尔)的说明将上清液上样到SDS-PAGE凝胶上。将PAGERULERTM Unstained Protein Ladder(赛默飞世尔)与蛋白质样品一起使用，以测量蛋白质的分子量。每种蛋白质的剩余上清液用于随后的纯化过程。
蛋白质纯化如下进行。具体地，蛋白质A柱与MabSelect Sure树脂一起预包装。在细胞培养基上样之前，用0.1M Tris(pH 7.0)平衡柱。上样细胞培养基后，用0.1M Tris(pH7.0)洗涤柱，然后用0.1M甘氨酸(pH 3.5)洗脱。通过加入0.1M Tris(pH 9.0)中和洗脱液。随后，将样品在PBS缓冲液(Sangon Biotech，B548117-0500)中透析。
在上样样品之前，用PBS平衡SEC柱(GE生命科学，Superdex 200increase 10/300)。上样后，用PBS洗脱样品并通过色谱收集。进行SDS-PAGE以分析其每个峰。将每个样品在配方缓冲液(10mM磷酸钠，0.3至0.4M NaCl，pH 6.8)中透析。
将CHT色谱柱与CHT树脂(Bio-rad，MPCTM羟基氟磷灰石陶瓷)预包装在一起，并在上样样品前用缓冲液A(10mM磷酸钠，30mM NaCl，pH 6.8)平衡。上样后，用30％缓冲液B(10mM磷酸钠，1M NaCl，pH 6.8)洗脱柱，然后用30％至90％线性梯度缓冲液B和最终100％缓冲液B洗脱。用SDS-PAGE对洗脱液进行鉴定，并将样品在配方缓冲液(10mM磷酸钠，0.3至0.4MNaCl，pH 6.8)中透析。用0.2μm的过滤器过滤最终蛋白质，并以0.5ml的量无菌分配到每个1.5ml管中。
结果，如图3所示，通过SDS-PAGE确认纯化的C1.01m、C1.02m、C1.06m和C1.07m。
制备实施例3.2.蛋白质的鉴定
使用纳米滴在280nm处测量蛋白质的浓度。通过SDS-PAGE和HPLC-SEC证实了蛋白质的纯度。
通过将15μl纯化的蛋白质和5μl的4×上样缓冲液混合，并将混合物煮沸5分钟来制备SDS-PAGE样品。将15μl混合样品上样到4％至12％的NuPAGE Bis-Tris Mini Gels中。为了进行SEC-HPLC分析，将80μl纯化蛋白上样到HPLC系统1260Infinity II的TSKgelG3000SWxl柱上，并使用50mM磷酸钠(pH 7.0)和150mM氯化钠作为电泳缓冲液。
制备实施例4.兔和大鼠C3和C3b的纯化
制备实施例4.1.兔和大鼠C3的纯化
表9至表11示出了用于纯化兔和大鼠的C3的试剂、各缓冲液的组成和仪器，如下所示。
[表9]
材料和试剂 生产商 货号
NaCl ACROS ORGANIVS 7647-14-5
NaOH Merck B146369740
KH2PO4 GENERAL-Reagent 7778-77-0
NaH2PO4 GENERAL-Reagent 7558-80-7
EDTA GENERAL-Reagent 60-00-4
苯甲脒 Adamas 618-39-3
PBS Gibco C10010500BT
MgCl2 GENERAL-Reagent 7786-30-3
因子B Complement Technology A135
因子D Complement Technology A136
[表10]
Figure BDA0004097255470000261
Figure BDA0004097255470000271
[表11]
仪器 生产商 型号名称
AKTAPure GE Healthcare 29-0182-24
离心机 Beckman J-26xp
凝胶成像系统 Tanon 2500R
Millex-GP过滤单元，0.22μm，无菌 MILLIPORE SLGP033RS
DEAE 16/10FF GE Healthcare 10294207
Mono S 5/50GL GE Healthcare 10298955
Sephadex S200 GE Healthcare 17104-302
HPLC Waters E2695
在蛋白质纯化之前，进行了从血浆中除去高分子量物质的步骤。测定血浆的体积，然后在搅拌的同时将10％(重量/体积比)的Na2SO4(无水)粉末状盐晶体缓慢加入蛋白质溶液中。随后，在4℃下搅拌2小时。使用Sorvall超速离心机在4℃、26,892×g下离心30分钟后，获得上清液并测量其体积。将获得的上清液与5L DEAE缓冲液A透析，2小时后，用5L新溶液替换。为了获得最佳结果，在4℃下过夜进行透析。为了确认透析是否完成，测量透析液的体积、A280和电导率。当溶液浑浊或沉淀时，在4℃、4,000×g下离心15分钟以除去沉淀物。用0.2μm的过滤器过滤透析液，并储存在冰上直至进行纯化。
所述蛋白质纯化依次为阴离子交换色谱、阳离子交换色谱和尺寸排阻色谱。在上样透析液之前，用缓冲液A(10mM KH2PO4，5mM EDTA，1mM苯甲脒，pH 7.8)平衡DEAE色谱柱(GEHealthcare，HIPREPTM DEAE Fast Flow 16/10)。上样后，用缓冲液A洗涤色谱柱，并用0％至50％线性梯度缓冲液B(10mM KH2PO4，5mM EDTA，1mM苯甲脒，1M NaCl，pH 7.8)洗脱。通过SDS-PAGE分析洗脱液的馏分，收集含有C3的馏分，并测量其A280。将获得的洗脱物质在2LMono S缓冲液A(50mM磷酸钠)中于4℃透析2小时。
在上样透析液之前，用缓冲液A(50mM磷酸钠)平衡Mono S柱(GE Healthcare，
Figure BDA0004097255470000272
5/50GL)。上样DEAE洗脱液后，用缓冲液A洗涤柱，并用0％至35％线性梯度缓冲液B(50mM磷酸钠，1M NaCl，pH 5.5)洗脱。通过SDS-PAGE分析洗脱物质的馏分，合并位于中心的峰馏分，并测量其A280。
在上样样品之前，用PBS平衡SEC柱(GE Lifesciences，Superdex 200increase10/300)。上样后，用PBS洗脱样品并通过色谱收集。进行SDS-PAGE以分析其每个峰。集中位于中心的峰C3馏分，并测量其A280。
制备实施例4.2.兔和大鼠C3b的纯化
C3用0.5mg/ml PBS稀释制得。通过加入0.4μM因子B，0.05μM因子D和5mM MgCl2并在25℃下培养30分钟，将C3转化为C3b。C3b通过Superdex 200(60ml)凝胶过滤柱进一步纯化。随后对兔C3、兔C3b、大鼠C3和大鼠C3b进行SDS-PAGE分析和SEC-HPLC分析
结果，如图4所示，证实了兔C3、兔C3b、大鼠C3和大鼠C3b被纯化。
实验实施例1.融合蛋白结合力的测量
实验例1.1.Biacore表面等离子体共振(SPR)分析技术
为了测量融合蛋白的结合力，使用Biacore 8K(GE Healthcare，29129951)仪器分析所制备的融合蛋白的物理性质。
表12示出了所使用的材料和试剂，如下所示。
[表12]
试剂 生产商 货号
CM5传感器芯片 GE Healthcare 29-1496-03
HBS-EP+缓冲液(10γ) GE Healthcare BR-1006-69
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1006-33
人抗体捕获试剂盒 GE Healthcare 29234600
10mM甘氨酸1.5 GE Healthcare BR-1003-54
C3b，C2，和C4 Complement Technology A114，A112，和A105
实验实施例1.2.抗人免疫球蛋白G(Fc)抗体在CM5传感器芯片上的固定
1L 1×HBS-EP+缓冲液由100ml 10×HBS-EP+缓冲液和900ml Milli-Q水混合制备。50mM NHS和200mM EDC以1:1的比例混合420秒后，以10μl/min的流速激活CM5芯片。为了达到约10,000RU的固定水平，以10μl/ml的速率注射25μg/ml抗人免疫球蛋白G(Fc)抗体(pH为5.0的乙酸盐)400秒。通过以10μl/min的速率注入1M乙醇胺(pH 8.5)420秒来封闭剩余的活化酯基团。为了稳定基线，用1×HBS-EP+以10μl/min的速率洗涤传感器芯片16小时。
实验实施例1.3.结合动力学的测量
为了稳定基线，进行了三次由样品步骤和再生步骤组成的启动循环。样品步骤：以30μl/min的流速将1×HBS-EP+缓冲液注入流通池中120秒，然后进行120秒的裂解阶段和30秒的稳定阶段。再生步骤：以30μl/min的速率将10mM甘氨酸(pH 1.5)注入流通池中30秒，然后进行稳定步骤30秒。
此后，按以下方式进行结合动力学的测量。
使用1×HBS-EP+缓冲液将C3b储备溶液稀释至50nM。使用1×HBS-EP+缓冲液将人VEGF165稀释至5nM。然后将50nM和5nM溶液稀释至0.78125nM和0.078125nM。在样品步骤中，将稀释的抗原以30μl/min的速率注入流通池中。使用两个0nM抗原(1×HBS-EP+缓冲液)并从参考信号中去除。进行结合180秒和分离400秒。分离时间后，进行60秒的稳定步骤。在再生步骤中，以30μl/min的速率将10mM甘氨酸(pH1.5)注入流通池中30秒，然后进行60秒的稳定步骤。
实验实施例1.4.分析和结果
从样品值中减去参考值和0nM值后，使用Biacore Insight评估软件(版本2.0.15.12933)和用于曲线拟合的1:1结合模型计算结合动力学。
表13示出了被测物质的结合亲和力，如下所示。
[表13]
捕获1溶液 分析物1溶液 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
0.5μg/ml C1.01 C3b 3.47E+06 1.21E-02 3.47E-09
2μg/ml C1.02 C3b 3.66E+06 1.59E-02 4.34E-09
2μg/ml C1.02 人VEGF165 3.94E+06 2.47E-04 6.28E-11
通过Biacore分析测定C1.01和C1.02与人C3b和人VEGF165的结合亲和力以及C1.01m和C1.02m与小鼠C3b和人VEGF165的结合亲和力。
结果，如表13和图6和图7所示，确认人和小鼠的C1.01和C1.02均对C3b具有高结合亲和力，并且人和小鼠的C1.02对人VEGF165具有高结合亲和力。
实验实施例2.通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量融合蛋白与补体蛋白和VEGF的结合亲和力
为了证实补体途径是否被一个实施方案的融合蛋白二聚体抑制，通过酶联免疫吸附测定法分析C1.01、C1.02、C1.03、C1.04和C1.01m至C1.03m是否与C3b蛋白结合。
具体地，将人C3b蛋白固定在平板上，并将C1.01、C1.02、C1.03和C1.04以及hIgG1作为对照结合上去。接下来，将抗人免疫球蛋白G抗体和抗辣根过氧化物酶(HRP)抗体依次与其结合。此外，将小鼠C3b蛋白固定在平板上，将含有小鼠CRIg的C1.01m至C1.03m与小鼠C3b结合。
结果，如图8a所示，证实含有CRIg的C1.01、C1.02、C1.03和C1.04以浓度依赖性方式与人C3b结合。而且，如图8c所示，证实含有C1.01m至C1.03m的小鼠CRIg也以浓度依赖性方式与小鼠C3b结合。
为了证实根据一个实施方案的融合蛋白是否具有抗VEGF作用，通过酶联免疫吸附测定法分析融合蛋白与人VEGF165蛋白是否结合，并通过ELISA测定阿柏西普、C1.02、C1.04和C1.05与人VEGF165的结合亲和力。
具体地，将人VEGF165蛋白固定在平板上，并将C1.02、C1.04和C1.05以及作为对照的阿柏西普和hIgG1结合上去。接下来，将抗人免疫球蛋白G抗体和抗辣根过氧化物酶(HRP)抗体依次与其结合。
结果，如图8b所示，作为通过酶联免疫吸附测定法测量的结果，证实具有抗VEGF的阿柏西普、C1.02、C1.04和C1.05以浓度依赖性方式与人VEGF165结合。
为了证实根据一个实施方案的的融合蛋白与旁路途径的C3b结合以抑制旁路途径，但不与经典途径的人C2或C4蛋白结合，因此不抑制经典途径，通过ELISA分析是否根据一个实施方案的融合蛋白C1.01与人Cb3、C2和C4蛋白结合。
具体地，将人Cb3、C2或C4蛋白固定在平板上，并将C1.02与其结合。接下来，将抗人免疫球蛋白G抗体和抗辣根过氧化物酶(HRP)抗体依次与其结合。
结果，如图8d所示，证实C1.02与C3b结合，不与C2和C4结合。
实验实施例3.动态光散射(DLS)分析
根据是否包含VEGF结合子来测量融合蛋白的流体动力学半径，通过动态光散射方法分析了C1.01和C1.02的流体动力学半径。
具体地，将C1.01和C1.02在12,000×g下离心10分钟，并将上清液加入到96孔板中，随后在25℃下使用Zetasizer APS(Marlvern)作为DLS分析设备进行测量。
表14是表示C1.01和C1.02的流体动力学半径的表，如下所示。
[表14]
Figure BDA0004097255470000301
结果，如表14和图9a和9b所示，经测量证实含有VEGF结合子的C1.02的流体动力学半径长于不含VEGF结合子的C1.01的流体动力学半径。
实验实施例4.C1.02粘度的测量
通过浓度测量C1.02的粘度，使用微量粘度计(m-VROC，RheoSence)和vROC-mB05(RheoSence)芯片测量C1.02在33、65和130mg/ml处的粘度。此外，作为对照，还测量了134mg/ml的人血清白蛋白的粘度。
表15表示测得的粘度，如下所示。
[表15]
Figure BDA0004097255470000302
结果，如表15和图10所示，确定C1.02的粘度随其浓度的增加而增加。
实验实施例5.通过溶血分析来分析补体旁路途径抑制作用
表16为所用试剂的表格，如下。
[表16]
试剂 生产商
C1q-缺乏血清 Comptech
兔RBC Yuduo biolody
Gelatin Veronal Buffer(5mM巴比妥) Boston bioproducts
测定平板 Corning
为确定上述实施方案的融合蛋白抑制补体旁路途径，对C1.01、C1.02、C1.04、C1.01m、C1.02m和C1.04m进行溶血分析(AH50)。
具体地，用TBS在400×g离心机上洗涤3ml兔红细胞10分钟，重复该过程两次后，使用GVB EGTA缓冲液在400×g离心机上洗涤兔红细胞10分钟。然后，使用GVB EGTA缓冲液将兔红细胞的浓度调节至1×109个细胞/ml。
通过致敏红细胞分析AH50，将9％的人C1q-缺乏血清加入到96孔板(50μl/孔)中。此外，对C1.01、C1.02、C1.01m和C1.02m进行了不同浓度的处理。在4℃下培养30分钟后，加入兔红细胞(2×106个细胞/孔，50μl/孔)。在37℃下培养1.5小时，在600×g下离心10分钟。收集110μl上清液后，测量其OD415值。
通过AH50溶血分析证实了C1.01、C1.02、C1.04、C1.01m、C1.02m和C1.04m的补体旁路途径抑制作用。
结果，如表16和图11a至11c所示，证实C1.01、C1.02、C1.04、C1.01m、C1.02m和C1.04m以浓度依赖性方式抑制了补体旁路途径的溶血作用。
实验实施例6.通过溶血分析来分析补体经典途径抑制作用
表17是所用试剂的表格，如下。
试剂 生产商
Factor B-Dpl血清因子 Comptech
绵羊RBC Yuduo biolody
溶血素 Yuduo biolody
Gelatin Veronal Buffer(GVB；5mM巴比妥) Boston bioproducts
测定平板 Corning
为确定根据一个实施方案的融合蛋白二聚体不抑制补体经典途径，对C1.01、C1.02、C1.04、C1.05、C1.06、C1.01m、C1.02m、C1.04m、C1.06m和C1.07m进行溶血分析(CH50)。
具体地，将绵羊红细胞在TBS中以400×g离心10分钟，并在重复此过程两次后，加入1ml的20％绵羊红细胞，并与溶血素在4℃下孵育30分钟。随后，使用用TBS在400×g离心机上洗涤绵羊红细胞10分钟，重复该过程两次后，使用用GVB++缓冲液在400×g离心机上洗涤绵羊红细胞10分钟。接下来，使用GVB++缓冲液将致敏绵羊红细胞的浓度调节至1×109个细胞/ml。
为通过致敏红细胞分析CH50，将3％或4.5％的人因子B-缺乏血清加入到96孔板(50μl/孔)中，然后以各种浓度处理C1.01、C1.02、C1.06、C1.01m、C1.02m、C1.06m和C1.07m。在4℃下培养30分钟后，加入致敏绵羊红细胞(2.5×106个细胞/孔，50μl/孔)。在37℃下培养30分钟。在600×g下离心10分钟，收集110μl上清液，然后测定其OD415值。
结果，如表16和图12a至12c所示，证实C1.01、C1.02、C1.04、C1.05、C1.06、C1.01m、C1.02m、C1.04m、C1.06m和C1.07m均不通过补体经典途径抑制溶血作用。
实验实施例7.使用VEGF报告细胞对融合蛋白进行功效分析
为证实一个实施方案的融合蛋白是否有效抑制VEGF蛋白，分析了其与VEGF和VEGF受体的结合是否受到抑制。
使用报告细胞证实了阿柏西普、C1.01、C1.02、C1.05和C1.06的VEGF信号抑制作用。具体地，使用VEGF报告细胞(GA3001，Promega，美国)通过发光强度分析了阿柏西普、C1.02和C1.05是否抑制与VEGF和VEGF受体的结合，这些VEGF报告细胞在结合VEGF时通过受体介导的信号传导发光。
结果，如图13所示，证实阿柏西普、C1.02和C1.05以浓度依赖性方式抑制了VEGF介导的受体信号传导。
实验实施例8.融合蛋白评估伤口愈合测定
通过融合蛋白二聚体对伤口愈合能力的抑制作用，证实根据一个实施方案的融合蛋白二聚体是否有效抑制VEGF蛋白。
具体地，基于细胞的伤口愈合测定方法证实了VEGF信号通路对C1.01、C1.02和C1.05的抑制作用。用成人视网膜色素上皮细胞系-19(ARPE-19)进行分析。ARPE-19细胞使用10％胎牛血清(FBS)在Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)/F12培养基中培养。将ARPE-19细胞(80,000个细胞/孔)在24孔板中培养过夜。第二天，均匀地损伤各孔，然后将VEGF(6ng/ml)和C1.01，C1.02和C1.05(35nM)加入培养基中，24小时后，分析每种融合蛋白的伤口愈合抑制能力。
结果，如图14所示，与对照组相比，C1.02显著抑制伤口愈合(p＝0.0031)，并且这种效果比C1.01(p＝0.0146)和C1.05(p＝0.0482)显著。
实验实施例9.物种交叉反应性试验
为了证实根据一个实施方案的融合蛋白二聚体的物种交叉反应性，通过ELISA分析C1.02是否结合C3b和衍生自其他物种的VEGF。
通过ELISA证实人与食蟹猴C3b与C1.02的结合能力，人与食蟹猴C3b与C1.06的结合能力，人、食蟹猴、大鼠、兔VEGF与C1.02的结合能力，以及人、食蟹猴、大鼠和兔VEGF与C1.01的结合能力。具体来说，将人、食蟹猴、大鼠或兔C3b或VEGF固定在平板上，并将C1.01、C1.02或C1.06与其结合。接下来，将抗人免疫球蛋白G抗体和抗辣根过氧化物酶(HRP)抗体依次与其结合。
结果，如图15a至15c所示，证实C1.02通过与食蟹猴、兔和大鼠的C3b和VEGF结合而具有物种交叉反应性。
实验实施例10.使用小鼠动物模型治疗湿性黄斑变性的疗效评估
为证实根据一个实施方案的融合蛋白对湿性黄斑变性(湿性年龄相关性黄斑变性)的治疗效果，在小鼠动物模型中诱导脉络膜新生血管形成，然后将根据一个实施方案的融合蛋白二聚体直接注射到眼球中，并分析效果。
为在小鼠中诱导脉络膜新生血管形成表型，在诱导之前通过光谱域光学相干断层扫描(Envisu R2200 SD-OCT系统，Bioptigen,Inc.，USA)确认小鼠是否存在结构异常。
接着，通过使用二极管激光(OcuLight TX-Green 532nm Laser；IridexCorporate，USA)穿透小鼠右眼中的布鲁赫膜(Bruch’s membrane)诱导3个脉络膜新生血管形成(第0天)。诱导脉络膜新生血管形成后，使用光谱域光学相干断层扫描和荧光素血管造影(HRA2 FA系统；Heidelberg Engineering GmbH，德国)确认模型是否成功诱导。
在诱导时立即，通过玻璃体内注射C1.02m(350μM；48.3μg/μl，2μl)、阿柏西普(Eylea；350μM；40.0μg/μl，2μl)或溶剂对照(2μl)。使用光谱域光学相干断层扫描和荧光素血管造影系统在诱导脉络膜新生血管形成时(第0天)和诱导后7天(第7天)进行体内成像。荧光素血管造影系统照片中各脉络膜新生血管，有血管渗漏则打1分，无血管渗漏则打0分，然后计算病变概率。例如，100％的符号表示在三个脉络膜新生血管形成中均观察到血管渗漏。
结果，如图16a至16c所示，证实在给药7天后，C1.02m组具有与阿柏西普组相似的保护作用，并且与溶剂组相比具有显着的保护作用。
实验实施例11.兔动物模型对湿性黄斑变性的疗效评价
为确认根据一个实施方案的融合蛋白对湿性黄斑变性(湿性年龄相关性黄斑变性)的治疗效果，在兔动物模型中诱导脉络膜新生血管形成，然后将根据一个实施方案的融合蛋白直接注射到眼球中，并分析其效果。
通过与实验实施例10中所述方法类似的方法，在兔中诱导脉络膜新生血管形成来制备湿性黄斑变性模型，不同之处在于诱导了6个脉络膜新生血管形成。诱导脉络膜新生血管形成后，立即通过玻璃体内注射C1.01(350μM；38.45μg/μl，50μl)，阿柏西普(350μM；40μg/μl，50μl)或溶剂对照(50μl)。使用荧光素血管造影系统在脉络膜新生血管形成诱导时(第0天)、诱导后7天(第7天)和诱导后14天(第14天)进行体内成像。通过测量脉络膜新生血管形成中的荧光素强度来测量血管渗漏。
结果，如图17所示，证实诱导7天后，C1.01组具有与阿柏西普组相似的保护作用，并且与溶剂组相比具有显着的保护作用。
实验实施例12.使用大鼠动物模型对湿性黄斑变性的疗效评价
为了证实根据一个实施方案的融合蛋白对湿性黄斑变性的治疗效果，在大鼠动物模型中诱导脉络膜新生血管形成，然后将根据一个实施方案的融合蛋白直接注射到眼球中，并分析效果。
通过与实验实施例10中所述方法类似的方法，在大鼠中诱导脉络膜新生血管形成来制备湿性黄斑变性，不同之处在于诱导了4个脉络膜新生血管形成。诱导脉络膜新生血管形成后，立即通过玻璃体内注射注射C1.02(350μM；54.93μg/μl，5μl)，阿柏西普(350μM；40μg/μl，5μl)或溶剂对照(5μl)，然后在第0天和第10天使用荧光素血管造影系统和光谱域光学相干断层扫描进行体内成像。通过成像，量化并显示诱导时和诱导后10天有无脉络膜新生血管形成和血管渗漏区域。
结果，如图18a和18b所示，证实诱导10天后，C1.02组的脉络膜新生血管形成数量和血管渗漏面积显著减少，使得C1.02组具有与阿柏西普组相似的保护作用，并且与溶剂组相比具有显著的保护作用。
实验实施例13.使用小鼠动物模型对干性黄斑变性的疗效评估
为了证实根据一个实施方案的融合蛋白对干性黄斑变性(干性年龄相关性黄斑变性)的治疗效果，在小鼠动物模型中诱导干性黄斑变性，然后将根据一个实施方的融合蛋白直接注射到眼球中，并分析效果。
首先，通过尾静脉注射向8周龄的C57BL/6小鼠注射20mg/kg碘酸钠(NaIO3)诱导干性黄斑变性的小鼠动物模型。
模型诱导后，在第0天和第7天通过玻璃体内注射施用C1.02m(260μM；36.1μg/μl，1.5μl)或溶剂对照(1.5μl)。模型诱导后2周，对实验动物实施安乐死，然后摘除眼睛并在4℃的戴维森溶液中固定24小时。随后，将固定样品在4℃的30％蔗糖溶液中储存3天。将样品冷冻在OCT化合物(货号4583，Sakura)中，然后切片成20μm的厚度。在切片组织中，使用免疫荧光对C3(货号MA1-40046，赛默飞世尔)蛋白进行染色，并使用DAPI(货号H-1200，VectorLaboratories)染色方法对外核层(ONL)进行染色。使用共聚焦显微镜(LSM700；蔡司，德国)对染色样品进行分析。具体地，测量干性黄斑变性模型的每个实验组的外核层(ONL)、外核层中的细胞计数，外核层的面积和视网膜中的C3表达水平。
结果，如图19a至19f所示，证实了在细胞计数和外核层面积的测量中，与溶剂组相比，C1.02m组的视网膜退化受到显著抑制。此外，证实了溶剂组C3的表达明显高于非AMD组，且C1.02m组C3表达明显降低。
实验实施例14.C1.02药代动力学特征分析
为了分析根据一个实施方案的融合蛋白二聚体的药代动力学特征，将15只新西兰白兔分为五组(G01至G05)每组三只兔子。分组后，通过玻璃体内注射施用2,500μg C1.02(50μl/眼)。
为了获得用于分析药代动力学特征的样品，首先每小时从兔静脉收集0.5ml血液。从获得的血液样品中分离血浆，然后冷冻保存在-60℃。此外，每小时收集玻璃体液(0.2ml)和房水(0.2ml)，然后冷冻保存在-60℃。
表18显示按兔实验组、受试者和采集时间获得的兔子样本，如下。
[表18]
Figure BDA0004097255470000351
使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血浆、玻璃体液和房水中C1.02的浓度。通过对测量值进行非房室药代动力学分析获得药代动力学参数。表19显示了通过非房室药代动力学分析获得的药代动力学参数，如下所示。
[表19]
Figure BDA0004097255470000352
Figure BDA0004097255470000361
/>
下表20是显示通过玻璃体内注射给兔体内施用2,500μg C1.02后玻璃体液中C1.02浓度的表格。RB#表示动物编号，BQL表示“低于可量化限值”，ND表示“未确定”。
[表20]
时间(h) RBn001* RBn002 RBn003 平均值 SD CV(％)
n＝1 1 2789070 3594376 3229369 3204272 403239 12.6
n＝2 24 1561470 1336610 2160474 1686185 425856 25.3
n＝3 72 1638252 2031203 2506814 2058756 434936 21.1
n＝4 168 1659880 1767054 1783308 1736747 67064 3.86
n＝5 336 1206629 1286796 317153 936859 538176 57.4
下表21是显示通过玻璃体内注射向兔施用2,500μg C1.02后房水中C1.02浓度的表格。RB#表示动物编号，BQL表示“低于可量化限值”，ND表示“未确定”。
[表21]
时间(h) RBn001* RBn002 RBn003 平均值 SD CV(％)
n＝1 1 1542 4803 304769 103705 174135 168
n＝2 24 84982 54751 85448 75061 17590 23.4
n＝3 72 38192 78324 90493 69003 27368 39.7
n＝4 168 30505 37937 29392 32612 4646 14.2
n＝5 336 BQL** BQL BQL ND*** ND ND
下表22是显示通过玻璃体内注射向兔施用2,500μg C1.02后血浆中C1.02浓度的表格。RB#表示动物编号，BQL表示“低于可量化限值”，ND表示“未确定”。
[表22]
时间(h) RBn001* RBn002 RBn003 平均值 SD CV(％)
n＝1 1 BQL** BQL BQL ND*** ND ND
n＝2 24 BQL BQL BQL ND ND ND
n＝3 72 BQL BQL BQL ND ND ND
n＝4 168 BQL BQL BQL ND ND ND
n＝5 336 BQL BQL BQL ND ND ND
经玻璃体内注射给予家兔2,500μg C1.02后，测定玻璃体液和房水中C1.02的浓度。
结果，如表20至22和图20a和20b所示，证实当通过玻璃体内注射施用2,500μgC1.02时，玻璃体液中的半衰期为226小时，房水中的半衰期为114小时。由于在血浆中没有观察到显着的浓度，因此在血浆中无法进行药代动力学特征分析。
SEQUENCE LISTING
<110> 治纳辅医药科技有限公司
<120> 一种包括补体途径抑制剂和血管生成抑制剂的融合蛋白及其用途
<130> P22119976WP
<150> KR 10-2020-0083536
<151> 2020-07-07
<160> 151
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG
<400> 1
Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln
20 25 30
Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile
35 40 45
Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln
50 55 60
Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln
65 70 75 80
Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val
85 90 95
Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr
100 105 110
Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr Val Thr Thr
115 120 125
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130 135 140
Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile Trp Tyr Lys
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Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr Leu Ser Thr
165 170 175
Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys
180 185 190
Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp Ile Val Lys
195 200 205
Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys Thr Glu Ala
210 215 220
Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Val Lys Gln
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Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly Glu Thr Ser
245 250 255
Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr
260 265 270
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro
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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
325 330 335
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
370 375 380
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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
450 455 460
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115 120 125
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165 170 175
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405 410 415
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435 440 445
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<213> 人工序列
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420 425 430
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Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr
435 440 445
Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu
450 455 460
Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile
465 470 475 480
Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala
485 490 495
Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln
500 505 510
Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu
515 520 525
Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu
530 535 540
Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His
545 550 555 560
Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser
565 570 575
Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg
580 585 590
Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr
595 600 605
Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
610 615 620
<210> 9
<211> 411
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg
<400> 9
Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Ala Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
50 55 60
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
65 70 75 80
Asp Tyr Gly Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
85 90 95
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
100 105 110
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
115 120 125
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
130 135 140
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
145 150 155 160
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
165 170 175
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
195 200 205
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser His Pro Thr Leu Lys Thr Pro Glu Ser Val Thr Gly Thr Trp
245 250 255
Lys Gly Asp Val Lys Ile Gln Cys Ile Tyr Asp Pro Leu Arg Gly Tyr
260 265 270
Arg Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Arg His Gly Ser Asp Ser Val
275 280 285
Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Thr Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys
290 295 300
Tyr Arg Gly Arg Leu Lys Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser
305 310 315 320
Leu Gln Ile Asn Thr Leu Gln Met Asp Asp Arg Asn His Tyr Thr Cys
325 330 335
Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Ile Arg Asp Lys
340 345 350
Ile Ile Glu Leu Arg Val Arg Lys Tyr Asn Pro Pro Arg Ile Asn Thr
355 360 365
Glu Ala Pro Thr Thr Leu His Ser Ser Leu Glu Ala Thr Thr Ile Met
370 375 380
Ser Ser Thr Ser Asp Leu Thr Thr Asn Gly Thr Gly Lys Leu Glu Glu
385 390 395 400
Thr Ile Ala Gly Ser Gly Arg Asn Leu Pro Gly
405 410
<210> 10
<211> 621
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF结合子-mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg
<400> 10
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Ala Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser
260 265 270
Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His
275 280 285
Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile
290 295 300
Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn
305 310 315 320
Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys
325 330 335
Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe
355 360 365
Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu
370 375 380
Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
385 390 395 400
Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg
405 410 415
Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His
420 425 430
Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser His Pro Thr Leu Lys Thr Pro Glu Ser Val Thr Gly
450 455 460
Thr Trp Lys Gly Asp Val Lys Ile Gln Cys Ile Tyr Asp Pro Leu Arg
465 470 475 480
Gly Tyr Arg Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Arg His Gly Ser Asp
485 490 495
Ser Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Thr Gly Asp His Ile Gln Gln
500 505 510
Ala Lys Tyr Arg Gly Arg Leu Lys Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp
515 520 525
Val Ser Leu Gln Ile Asn Thr Leu Gln Met Asp Asp Arg Asn His Tyr
530 535 540
Thr Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Ile Arg
545 550 555 560
Asp Lys Ile Ile Glu Leu Arg Val Arg Lys Tyr Asn Pro Pro Arg Ile
565 570 575
Asn Thr Glu Ala Pro Thr Thr Leu His Ser Ser Leu Glu Ala Thr Thr
580 585 590
Ile Met Ser Ser Thr Ser Asp Leu Thr Thr Asn Gly Thr Gly Lys Leu
595 600 605
Glu Glu Thr Ile Ala Gly Ser Gly Arg Asn Leu Pro Gly
610 615 620
<210> 11
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu IgG2a Fc DANG
<400> 11
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Ala Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
35 40 45
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
50 55 60
Asp Tyr Gly Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
85 90 95
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
100 105 110
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
130 135 140
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
210 215
<210> 12
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu IgG2a Fc DANG-VEGF结合子
<400> 12
Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Ala Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
50 55 60
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
65 70 75 80
Asp Tyr Gly Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
85 90 95
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
100 105 110
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
115 120 125
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
130 135 140
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
145 150 155 160
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
165 170 175
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
195 200 205
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile
245 250 255
Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys
260 265 270
Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu
275 280 285
Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys
290 295 300
Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr
305 310 315 320
Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr
325 330 335
His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His
340 345 350
Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala
355 360 365
Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser
370 375 380
Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln
385 390 395 400
Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly
405 410 415
Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly
420 425 430
Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿柏西普（aflibercept）
<400> 13
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
195 200 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
210 215 220
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
225 230 235 240
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
245 250 255
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
260 265 270
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
275 280 285
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
290 295 300
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
305 310 315 320
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
340 345 350
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
355 360 365
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
370 375 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
385 390 395 400
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
405 410 415
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
420 425 430
<210> 14
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF结合子 (VEGFR1 D2-VEGFR2 D3)
<400> 14
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人接头-1
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
20
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头-2
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠接头-1
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Lys Cys Pro
20
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头-2
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 19
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 完整人CRIg
<400> 19
Met Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val Asp
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro
20 25 30
Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly
35 40 45
Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro
50 55 60
Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala
65 70 75 80
Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val
85 90 95
Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr
100 105 110
Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp
115 120 125
Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr
130 135 140
Val Thr Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg
145 150 155 160
Ile Ser Leu Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile
165 170 175
Trp Tyr Lys Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr
180 185 190
Leu Ser Thr Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser
195 200 205
Tyr Phe Cys Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp
210 215 220
Ile Val Lys Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys
225 230 235 240
Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr
245 250 255
Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly
260 265 270
Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala Ile Ile
275 280 285
Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala Tyr Ile
290 295 300
Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu Ala Ala
305 310 315 320
Arg Ala His Ala Arg Glu Ala Asn Asp Ser Gly Glu Thr Met Arg Val
325 330 335
Ala Ile Phe Ala Ser Gly Cys Ser Ser Asp Glu Pro Thr Ser Gln Asn
340 345 350
Leu Gly Asn Asn Tyr Ser Asp Glu Pro Cys Ile Gly Gln Glu Tyr Gln
355 360 365
Ile Ile Ala Gln Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Arg Leu Leu Asp Thr Val
370 375 380
Pro Leu Asp Tyr Glu Phe Leu Ala Thr Glu Gly Lys Ser Val Cys
385 390 395
<210> 20
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CRIg(VSIG4) 亚型3
<400> 20
Met Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val Asp
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro
20 25 30
Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly
35 40 45
Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro
50 55 60
Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala
65 70 75 80
Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val
85 90 95
Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr
100 105 110
Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp
115 120 125
Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys His Ser Ser Lys Leu Leu Lys
130 135 140
Thr Lys Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr
145 150 155 160
Ser Thr Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr
165 170 175
Leu Gly Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala
180 185 190
Ile Ile Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala
195 200 205
Tyr Ile Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu
210 215 220
Ala Ala Arg Ala His Ala Arg Glu Ala Asn Asp Ser Gly Glu Thr Met
225 230 235 240
Arg Val Ala Ile Phe Ala Ser Gly Cys Ser Ser Asp Glu Pro Thr Ser
245 250 255
Gln Asn Leu Gly Asn Asn Tyr Ser Asp Glu Pro Cys Ile Gly Gln Glu
260 265 270
Tyr Gln Ile Ile Ala Gln Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Arg Leu Leu Asp
275 280 285
Thr Val Pro Leu Asp Tyr Glu Phe Leu Ala Thr Glu Gly Lys Ser Val
290 295 300
Cys
305
<210> 21
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 完整小鼠CRIg
<400> 21
Met Glu Ile Ser Ser Gly Leu Leu Phe Leu Gly His Leu Ile Val Leu
1 5 10 15
Thr Tyr Gly His Pro Thr Leu Lys Thr Pro Glu Ser Val Thr Gly Thr
20 25 30
Trp Lys Gly Asp Val Lys Ile Gln Cys Ile Tyr Asp Pro Leu Arg Gly
35 40 45
Tyr Arg Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Arg His Gly Ser Asp Ser
50 55 60
Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Thr Gly Asp His Ile Gln Gln Ala
65 70 75 80
Lys Tyr Arg Gly Arg Leu Lys Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val
85 90 95
Ser Leu Gln Ile Asn Thr Leu Gln Met Asp Asp Arg Asn His Tyr Thr
100 105 110
Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Ile Arg Asp
115 120 125
Lys Ile Ile Glu Leu Arg Val Arg Lys Tyr Asn Pro Pro Arg Ile Asn
130 135 140
Thr Glu Ala Pro Thr Thr Leu His Ser Ser Leu Glu Ala Thr Thr Ile
145 150 155 160
Met Ser Ser Thr Ser Asp Leu Thr Thr Asn Gly Thr Gly Lys Leu Glu
165 170 175
Glu Thr Ile Ala Gly Ser Gly Arg Asn Leu Pro Ile Phe Ala Ile Ile
180 185 190
Phe Ile Ile Ser Leu Cys Cys Ile Val Ala Val Thr Ile Pro Tyr Ile
195 200 205
Leu Phe Arg Cys Arg Thr Phe Gln Gln Glu Tyr Val Tyr Gly Val Ser
210 215 220
Arg Val Phe Ala Arg Lys Thr Ser Asn Ser Glu Glu Thr Thr Arg Val
225 230 235 240
Thr Thr Ile Ala Thr Asp Glu Pro Asp Ser Gln Ala Leu Ile Ser Asp
245 250 255
Tyr Ser Asp Asp Pro Cys Leu Ser Gln Glu Tyr Gln Ile Thr Ile Arg
260 265 270
Ser Thr Met Ser Ile Pro Ala Cys
275 280
<210> 22
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CRIg的细胞外结构域
<400> 22
Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln
20 25 30
Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile
35 40 45
Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln
50 55 60
Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln
65 70 75 80
Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val
85 90 95
Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr
100 105 110
Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr Val Thr Thr
115 120 125
Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg Ile Ser Leu
130 135 140
Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile Trp Tyr Lys
145 150 155 160
Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr Leu Ser Thr
165 170 175
Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys
180 185 190
Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp Ile Val Lys
195 200 205
Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys Thr Glu Ala
210 215 220
Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Val Lys Gln
225 230 235 240
Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly Glu Thr Ser
245 250 255
Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro
260
<210> 23
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG的核苷酸序列
<400> 23
cggcctatcc tggaggtgcc agagtccgtg accggaccat ggaagggcga cgtgaacctg 60
ccctgcacct acgatcctct gcagggctat acacaggtgc tggtgaagtg gctggtgcag 120
aggggcagcg accctgtgac catcttcctg cgcgacagct ccggcgatca catccagcag 180
gccaagtacc agggcaggct gcacgtgtct cacaaggtgc ctggcgatgt gagcctgcag 240
ctgtccaccc tggagatgga cgatcgcagc cactatacat gtgaggtgac ctggcagaca 300
ccagacggca atcaggtggt gcgggataag atcaccgagc tgagagtgca gaagctgtcc 360
gtgtctaagc caaccgtgac cacaggcagc ggctacggct tcacagtgcc ccagggcatg 420
aggatctccc tgcagtgcca ggcaaggggc tctccaccta tcagctacat ctggtataag 480
cagcagacca acaatcagga gcctatcaag gtggccaccc tgtccacact gctgttcaag 540
ccagccgtga tcgccgacag cggctcctat ttttgtacag caaagggaca agtgggctcc 600
gagcagcact ctgacatcgt gaagtttgtg gtgaaggatt ctagcaagct gctgaagacc 660
aagacagagg cccctaccac aatgacctac ccactgaagg ccaccagcac agtgaagcag 720
tcctgggact ggaccacaga catggatggc tatctgggcg agacatctgc cggaccaggc 780
aagagcctgc caggaggagg cggcagcgat aagacccaca catgcccacc ctgtcctgca 840
ccagagctgc tgggaggacc atccgtgttc ctgtttcctc caaagcctaa ggacaccctg 900
atgatctctc ggaccccaga ggtgacatgc gtggtggtgg ccgtgagcca cgaggacccc 960
gaggtgaagt ttaactggta cgtggatggc gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagccc 1020
cgggaggagc agtacggctc cacctataga gtggtgtctg tgctgacagt gctgcaccag 1080
gattggctga acggcaagga gtataagtgc aaggtgtcca ataaggccct gcccgcccct 1140
atcgagaaga ccatctctaa ggcaaaggga cagccaaggg agccacaggt gtacacactg 1200
cccccttcca gagacgagct gaccaagaac caggtgtctc tgacatgtct ggtgaagggc 1260
ttctatccct ctgatatcgc cgtggagtgg gagagcaatg gccagcctga gaacaattac 1320
aagaccacac cacccgtgct ggactccgat ggctctttct ttctgtatag caagctgacc 1380
gtggataagt ccagatggca gcagggcaac gtgttttctt gtagcgtgat gcacgaggcc 1440
ctgcacaatc actacacaca gaagtccctg tctctgagcc ccggcaag 1488
<210> 24
<211> 2130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG-VEGF结合子的核苷酸序列
<400> 24
cgccctatcc tggaggtgcc agagtccgtg accggaccat ggaagggcga cgtgaacctg 60
ccctgcacct acgatcctct gcagggctat acacaggtgc tggtgaagtg gctggtgcag 120
aggggcagcg accctgtgac catcttcctg cgcgacagct ccggcgatca catccagcag 180
gccaagtacc agggcaggct gcacgtgtcc cacaaggtgc ctggcgacgt gagcctgcag 240
ctgtctaccc tggagatgga cgatcgcagc cactatacat gtgaggtgac ctggcagaca 300
ccagacggca atcaggtggt gagggataag atcaccgagc tgcgcgtgca gaagctgtcc 360
gtgtctaagc caaccgtgac cacaggctct ggctacggct tcacagtgcc ccagggcatg 420
aggatcagcc tgcagtgcca ggcaaggggc agcccaccta tctcctacat ctggtataag 480
cagcagacca acaatcagga gcctatcaag gtggccaccc tgtccacact gctgttcaag 540
ccagccgtga tcgccgacag cggctcctac ttttgtacag ccaagggcca agtgggctct 600
gagcagcaca gcgacatcgt gaagtttgtg gtgaaggatt ctagcaagct gctgaagacc 660
aagacagagg cccctaccac aatgacctac ccactgaagg ccacctccac agtgaagcag 720
tcttgggact ggaccacaga catggatggc tatctgggag agacaagcgc cggacctggc 780
aagtccctgc caggaggcgg cggctccgat aagacccaca catgcccacc atgtcctgca 840
ccagagctgc tgggaggacc tagcgtgttc ctgtttcctc caaagccaaa ggacaccctg 900
atgatctccc ggaccccaga ggtgacatgc gtggtggtgg ccgtgtctca cgaggacccc 960
gaggtgaagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagccc 1020
cgggaggagc agtacggctc tacctataga gtggtgagcg tgctgacagt gctgcaccag 1080
gattggctga acggcaagga gtataagtgc aaggtgagca ataaggccct gcccgcccct 1140
atcgagaaga ccatctccaa ggcaaaggga cagccaaggg agccacaggt gtacacactg 1200
cccccttcca gagacgagct gaccaagaac caggtgtctc tgacatgtct ggtgaagggc 1260
ttttatccct ctgatatcgc cgtggagtgg gagagcaatg gccagcctga gaacaattac 1320
aagaccacac cacccgtgct ggactctgat ggcagcttct ttctgtattc caagctgacc 1380
gtggacaagt ctagatggca gcagggcaac gtgttctctt gcagcgtgat gcacgaggcc 1440
ctgcacaatc actacaccca gaagtccctg tctctgagcc caggaggagg aggaggctct 1500
ggaggaggag gctcctctga tacaggcagg ccctttgtgg agatgtatag cgagatccct 1560
gagatcatcc acatgaccga gggaagggag ctggtcatcc catgtagagt gacatcccct 1620
aacatcaccg tgacactgaa gaagttccca ctggacaccc tgatccccga tggcaagcgg 1680
atcatctggg acagcagaaa gggctttatc atctccaatg ccacatacaa ggagatcggc 1740
ctgctgacct gcgaggccac agtgaacggc cacctgtaca agaccaatta tctgacacac 1800
cgccagacca acacaatcat cgatgtggtg ctgtccccat ctcacggcat cgagctgagc 1860
gtgggcgaga agctggtgct gaattgtacc gcccggacag agctgaacgt gggcatcgac 1920
ttcaattggg agtaccctag ctccaagcac cagcacaaga agctggtcaa ccgggatctg 1980
aagacccaga gcggctccga gatgaagaag tttctgagca ccctgacaat cgacggcgtg 2040
accagatccg atcagggcct gtatacatgt gccgcctcta gcggcctgat gaccaagaag 2100
aatagcacat ttgtgagggt gcacgagaag 2130
<210> 25
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu IgG1 Fc DANG-hu CRIg的核苷酸序列
<400> 25
gataagaccc acacatgccc accctgtcct gcaccagagc tgctgggagg accatccgtg 60
ttcctgtttc ctccaaagcc taaggacacc ctgatgatct ctcggacccc agaggtgaca 120
tgcgtggtgg tggccgtgag ccacgaggac cccgaggtga agtttaactg gtacgtggat 180
ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag ccccgggagg agcagtacgg ctccacctat 240
agagtggtgt ctgtgctgac agtgctgcac caggattggc tgaacggcaa ggagtataag 300
tgcaaggtgt ccaataaggc cctgcccgcc cctatcgaga agaccatctc taaggcaaag 360
ggacagccaa gggagccaca ggtgtacaca ctgccccctt ccagagacga gctgaccaag 420
aaccaggtgt ctctgacatg tctggtgaag ggcttctatc cctctgatat cgccgtggag 480
tgggagagca atggccagcc tgagaacaat tacaagacca caccacccgt gctggactcc 540
gatggctctt tctttctgta tagcaagctg accgtggata agtccagatg gcagcagggc 600
aacgtgtttt cttgtagcgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac acagaagtcc 660
ctgtctctga gccccggcgg cggaggcggg tctggaggtg gagggagtcg gcctatcctg 720
gaggtgccag agtccgtgac cggaccatgg aagggcgacg tgaacctgcc ctgcacctac 780
gatcctctgc agggctatac acaggtgctg gtgaagtggc tggtgcagag gggcagcgac 840
cctgtgacca tcttcctgcg cgacagctcc ggcgatcaca tccagcaggc caagtaccag 900
ggcaggctgc acgtgtctca caaggtgcct ggcgatgtga gcctgcagct gtccaccctg 960
gagatggacg atcgcagcca ctatacatgt gaggtgacct ggcagacacc agacggcaat 1020
caggtggtgc gggataagat caccgagctg agagtgcaga agctgtccgt gtctaagcca 1080
accgtgacca caggcagcgg ctacggcttc acagtgcccc agggcatgag gatctccctg 1140
cagtgccagg caaggggctc tccacctatc agctacatct ggtataagca gcagaccaac 1200
aatcaggagc ctatcaaggt ggccaccctg tccacactgc tgttcaagcc agccgtgatc 1260
gccgacagcg gctcctattt ttgtacagca aagggacaag tgggctccga gcagcactct 1320
gacatcgtga agtttgtggt gaaggattct agcaagctgc tgaagaccaa gacagaggcc 1380
cctaccacaa tgacctaccc actgaaggcc accagcacag tgaagcagtc ctgggactgg 1440
accacagaca tggatggcta tctgggcgag acatctgccg gaccaggcaa gagcctgcca 1500
gga 1503
<210> 26
<211> 2133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF结合子-hu IgG1 Fc DANG-hu CRIg的核苷酸序列
<400> 26
tccgatactg gcagaccctt cgtcgagatg tacagcgaga ttcctgagat catccacatg 60
acagagggac gggaactggt gattccttgc agagtgacat ctccaaacat cacagtgacc 120
ctgaagaagt ttcctctgga caccctgatc cctgacggca agcgcatcat ctgggacagc 180
agaaagggat tcatcatcag caacgccacc tacaaggaaa tcggcctcct gacctgcgag 240
gccaccgtga acggacacct gtataaaacc aattacctga cacaccggca aacaaacacc 300
atcatcgacg tggtgctgag ccctagccac ggcatcgagc tgagcgtggg cgagaagctg 360
gtgctgaact gcaccgccag aaccgaactg aacgtgggca tcgatttcaa ctgggaatac 420
ccctcctcta agcaccagca taagaaactg gttaatagag atctgaaaac ccagagcggc 480
agcgaaatga aaaagttcct gtctacactg accatcgacg gcgtgaccag aagcgaccag 540
ggcctgtaca cctgtgccgc ttctagcggc ctgatgacca agaagaacag cacattcgtg 600
cgggtgcacg agaagggagg aggcggcagc gataagaccc acacatgccc accctgtcct 660
gcaccagagc tgctgggagg accatccgtg ttcctgtttc ctccaaagcc taaggacacc 720
ctgatgatct ctcggacccc agaggtgaca tgcgtggtgg tggccgtgag ccacgaggac 780
cccgaggtga agtttaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag 840
ccccgggagg agcagtacgg ctccacctat agagtggtgt ctgtgctgac agtgctgcac 900
caggattggc tgaacggcaa ggagtataag tgcaaggtgt ccaataaggc cctgcccgcc 960
cctatcgaga agaccatctc taaggcaaag ggacagccaa gggagccaca ggtgtacaca 1020
ctgccccctt ccagagacga gctgaccaag aaccaggtgt ctctgacatg tctggtgaag 1080
ggcttctatc cctctgatat cgccgtggag tgggagagca atggccagcc tgagaacaat 1140
tacaagacca caccacccgt gctggactcc gatggctctt tctttctgta tagcaagctg 1200
accgtggata agtccagatg gcagcagggc aacgtgtttt cttgtagcgt gatgcacgag 1260
gccctgcaca atcactacac acagaagtcc ctgtctctga gccccggcgg aggtggcggt 1320
tctgggggag gcggaagccg gcctatcctg gaggtgccag agtccgtgac cggaccatgg 1380
aagggcgacg tgaacctgcc ctgcacctac gatcctctgc agggctatac acaggtgctg 1440
gtgaagtggc tggtgcagag gggcagcgac cctgtgacca tcttcctgcg cgacagctcc 1500
ggcgatcaca tccagcaggc caagtaccag ggcaggctgc acgtgtctca caaggtgcct 1560
ggcgatgtga gcctgcagct gtccaccctg gagatggacg atcgcagcca ctatacatgt 1620
gaggtgacct ggcagacacc agacggcaat caggtggtgc gggataagat caccgagctg 1680
agagtgcaga agctgtccgt gtctaagcca accgtgacca caggcagcgg ctacggcttc 1740
acagtgcccc agggcatgag gatctccctg cagtgccagg caaggggctc tccacctatc 1800
agctacatct ggtataagca gcagaccaac aatcaggagc ctatcaaggt ggccaccctg 1860
tccacactgc tgttcaagcc agccgtgatc gccgacagcg gctcctattt ttgtacagca 1920
aagggacaag tgggctccga gcagcactct gacatcgtga agtttgtggt gaaggattct 1980
agcaagctgc tgaagaccaa gacagaggcc cctaccacaa tgacctaccc actgaaggcc 2040
accagcacag tgaagcagtc ctgggactgg accacagaca tggatggcta tctgggcgag 2100
acatctgccg gaccaggcaa gagcctgcca gga 2133
<210> 27
<211> 1308
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF结合子-hu IgG1 Fc DANG的核苷酸序列
<400> 27
tccgatactg gcagaccctt cgtcgagatg tacagcgaga ttcctgagat catccacatg 60
acagagggac gggaactggt gattccttgc agagtgacat ctccaaacat cacagtgacc 120
ctgaagaagt ttcctctgga caccctgatc cctgacggca agcgcatcat ctgggacagc 180
agaaagggat tcatcatcag caacgccacc tacaaggaaa tcggcctcct gacctgcgag 240
gccaccgtga acggacacct gtataaaacc aattacctga cacaccggca aacaaacacc 300
atcatcgacg tggtgctgag ccctagccac ggcatcgagc tgagcgtggg cgagaagctg 360
gtgctgaact gcaccgccag aaccgaactg aacgtgggca tcgatttcaa ctgggaatac 420
ccctcctcta agcaccagca taagaaactg gttaatagag atctgaaaac ccagagcggc 480
agcgaaatga aaaagttcct gtctacactg accatcgacg gcgtgaccag aagcgaccag 540
ggcctgtaca cctgtgccgc ttctagcggc ctgatgacca agaagaacag cacattcgtg 600
cgggtgcacg agaagggagg aggcggcagc gataagaccc acacatgccc accctgtcct 660
gcaccagagc tgctgggagg accatccgtg ttcctgtttc ctccaaagcc taaggacacc 720
ctgatgatct ctcggacccc agaggtgaca tgcgtggtgg tggccgtgag ccacgaggac 780
cccgaggtga agtttaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag 840
ccccgggagg agcagtacgg ctccacctat agagtggtgt ctgtgctgac agtgctgcac 900
caggattggc tgaacggcaa ggagtataag tgcaaggtgt ccaataaggc cctgcccgcc 960
cctatcgaga agaccatctc taaggcaaag ggacagccaa gggagccaca ggtgtacaca 1020
ctgccccctt ccagagacga gctgaccaag aaccaggtgt ctctgacatg tctggtgaag 1080
ggcttctatc cctctgatat cgccgtggag tgggagagca atggccagcc tgagaacaat 1140
tacaagacca caccacccgt gctggactcc gatggctctt tctttctgta tagcaagctg 1200
accgtggata agtccagatg gcagcagggc aacgtgtttt cttgtagcgt gatgcacgag 1260
gccctgcaca atcactacac acagaagtcc ctgtctctga gccccggc 1308
<210> 28
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu IgG1 Fc DANG的核苷酸序列
<400> 28
tccgtgttcc tgtttccacc caagcccaag gataccctga tgatcagcag gaccccagag 60
gtgacatgcg tggtggtggc cgtgtcccac gaggaccctg aggtgaagtt caactggtac 120
gtggatggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccac gggaggagca gtacggctcc 180
acctatagag tggtgtctgt gctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 240
tataagtgca aggtgtctaa taaggccctg cctgccccaa tcgagaagac catcagcaag 300
gcaaagggac agccaaggga gcctcaggtg tacacactgc ctccatcccg cgacgagctg 360
accaagaacc aggtgtctct gacatgtctg gtgaagggct tctatccttc tgatatcgcc 420
gtggagtggg agagcaatgg ccagccagag aacaattaca agaccacacc ccctgtgctg 480
gactctgatg gcagcttctt tctgtatagc aagctgaccg tggataagtc caggtggcag 540
cagggcaacg tgtttagctg ttccgtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacacag 600
aagtctctga gcctgtcccc tggc 624
<210> 29
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG的核苷酸序列
<400> 29
caccctacac tgaagacacc cgagtccgtc accggcacat ggaagggaga cgtcaagatc 60
cagtgcatct acgaccccct cagaggctat agacaagtgc tcgtcaaatg gctcgtgaga 120
cacggctccg atagcgtgac catctttctg agagacagca ccggcgacca tatccagcaa 180
gccaagtata gaggcagact gaaggtgagc cacaaggtgc ccggcgatgt gtctctgcag 240
atcaacacac tgcagatgga tgatagaaac cactatacat gcgaggtcac atggcagacc 300
cccgatggaa accaagtgat tagagacaag atcatcgagc tgagggtgag gaagtacaac 360
ccccctagga tcaacaccga ggctcctacc acactgcaca gctctctgga ggccacaaca 420
atcatgtcca gcaccagcga tctgacaacc aacggaaccg gcaagctgga agagaccatc 480
gccggcagcg gaaggaatct gcccggcgga ggaggcagcg agcctagagg acccacaatt 540
aagccttgcc ccccttgcaa atgtcccgcc cctaatctgc tcggcggccc cagcgtgttc 600
atcttccccc ccaagattaa ggacgtgctg atgatctctc tgtcccccat tgtgacatgc 660
gtggtcgtgg ctgtctccga ggacgacccc gacgtccaga tcagctggtt cgtcaacaat 720
gtggaggtcc ataccgccca gacacagacc catagagagg attacggcag cacactgaga 780
gtggtcagcg ctctgcccat ccaacaccaa gactggatga gcggcaagga gttcaagtgt 840
aaagtgaaca acaaggatct gcccgccccc attgagagga ccatctccaa acctaagggc 900
agcgtgaggg ctcctcaagt gtatgtgctc cccccccccg aggaggaaat gaccaagaag 960
caagtgacac tgacatgcat ggtcaccgac ttcatgcccg aggacatcta cgtggagtgg 1020
accaacaacg gcaagaccga gctgaattac aagaacaccg aacccgtgct ggatagcgat 1080
ggctcctact tcatgtacag caagctgaga gtggagaaaa agaactgggt cgagaggaac 1140
agctacagct gctccgtcgt gcatgagggc ctccacaacc accatacaac caagagcttc 1200
tctaggacac ccggcaaatg a 1221
<210> 30
<211> 1863
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG-VEGF结合子的核苷酸序列
<400> 30
caccctacac tgaagacacc cgagtccgtc accggcacat ggaagggaga cgtcaagatc 60
cagtgcatct acgaccccct cagaggctat agacaagtgc tcgtcaaatg gctcgtgaga 120
cacggctccg atagcgtgac catctttctg agagacagca ccggcgacca tatccagcaa 180
gccaagtata gaggcagact gaaggtgagc cacaaggtgc ccggcgatgt gtctctgcag 240
atcaacacac tgcagatgga tgatagaaac cactatacat gcgaggtcac atggcagacc 300
cccgatggaa accaagtgat tagagacaag atcatcgagc tgagggtgag gaagtacaac 360
ccccctagga tcaacaccga ggctcctacc acactgcaca gctctctgga ggccacaaca 420
atcatgtcca gcaccagcga tctgacaacc aacggaaccg gcaagctgga agagaccatc 480
gccggcagcg gaaggaatct gcccggcgga ggaggcagcg agcctagagg acccacaatt 540
aagccttgcc ccccttgcaa atgtcccgcc cctaatctgc tcggcggccc cagcgtgttc 600
atcttccccc ccaagattaa ggacgtgctg atgatctctc tgtcccccat tgtgacatgc 660
gtggtcgtgg ctgtctccga ggacgacccc gacgtccaga tcagctggtt cgtcaacaat 720
gtggaggtcc ataccgccca gacacagacc catagagagg attacggcag cacactgaga 780
gtggtcagcg ctctgcccat ccaacaccaa gactggatga gcggcaagga gttcaagtgt 840
aaagtgaaca acaaggatct gcccgccccc attgagagga ccatctccaa acctaagggc 900
agcgtgaggg ctcctcaagt gtatgtgctc cccccccccg aggaggaaat gaccaagaag 960
caagtgacac tgacatgcat ggtcaccgac ttcatgcccg aggacatcta cgtggagtgg 1020
accaacaacg gcaagaccga gctgaattac aagaacaccg aacccgtgct ggatagcgat 1080
ggctcctact tcatgtacag caagctgaga gtggagaaaa agaactgggt cgagaggaac 1140
agctacagct gctccgtcgt gcatgagggc ctccacaacc accatacaac caagagcttc 1200
tctaggacac ccggcggcgg aggcggatcc ggaggaggcg gcagctccga taccggaaga 1260
cctttcgtgg agatgtattc cgagattccc gagatcatcc acatgaccga gggaagagag 1320
ctggtcatcc cttgtagagt cacaagcccc aacattaccg tgaccctcaa gaagttccct 1380
ctggacacac tgattcccga cggcaagagg attatctggg actctaggaa gggcttcatc 1440
atcagcaacg ccacctataa agagatcgga ctgctgacat gcgaggccac agtgaatggc 1500
cacctctaca agaccaacta tctgacccat agacaaacca acaccattat cgacgtggtg 1560
ctgagcccta gccacggcat cgaactcagc gtgggagaga aactggtgct gaattgcacc 1620
gctaggaccg aactcaacgt gggaatcgac ttcaactggg agtacccctc cagcaagcac 1680
cagcacaaga agctcgtgaa tagagatctg aagacccaga gcggaagcga gatgaagaaa 1740
ttcctctcca cactgaccat cgatggcgtg acaaggagcg accaaggact gtacacatgc 1800
gctgcttcca gcggactgat gacaaagaag aacagcacct tcgtgagggt ccacgaaaaa 1860
tga 1863
<210> 31
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg的核苷酸序列
<400> 31
gagcctagag gcccaacaat caagccttgt cctccttgca aatgccctgc tcctaacctg 60
ctgggcggcc ctagcgtctt tatcttccct cctaagatca aagacgtgct gatgatcagc 120
ctgagcccta tcgtgacctg cgtggtggtg gccgtgtctg aggacgatcc tgacgtgcag 180
atcagctggt tcgtgaacaa tgtggaagtg cacacagccc agacacaaac acacagagag 240
gattacggca gcacactgcg cgtggtttcc gccctgccaa tccagcacca ggactggatg 300
agcggcaagg aattcaagtg caaagtgaac aacaaggacc tgcctgcccc tatcgagaga 360
accattagca agcccaaggg atcagttaga gcccctcagg tgtacgtgct gccccccccc 420
gaggaggaaa tgaccaaaaa gcaggtgacc ctgacatgca tggtgactga cttcatgcct 480
gaggacatct acgtggaatg gaccaacaac ggaaagaccg agctcaacta caagaacacc 540
gagcccgtgc ttgattctga cggcagctac ttcatgtaca gcaagctgcg ggtggaaaag 600
aagaactggg tggaaagaaa tagctatagc tgttctgtgg tgcacgaggg cctgcataat 660
caccacacca ccaagtcctt cagccggacc cctggcggcg gcggaggatc cggcggaggc 720
gggagccacc ccaccctgaa aacccccgag agcgtgacag gaacatggaa gggcgatgtc 780
aagatccaat gtatctacga ccccctgaga ggctacagac aggtgctggt gaagtggctg 840
gtcaggcacg gcagcgacag cgtgaccatc tttctgcggg actctacagg agatcacatc 900
cagcaggcca agtaccgggg cagactgaag gtctcccaca aggtgcctgg cgacgtgtcc 960
ctgcagatca acacactgca gatggatgac agaaaccact acacctgcga ggtgacctgg 1020
cagacccctg atggcaacca ggtgatcaga gataagatca tcgagctgcg ggtgcggaag 1080
tacaaccccc cgcggatcaa caccgaggcc ccaaccaccc tccattctag cctggaagct 1140
acaaccatca tgagcagcac cagcgacctg accaccaatg gcacaggcaa gctggaagag 1200
acaatcgccg gctctggcag aaacctgcct ggc 1233
<210> 32
<211> 1863
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF结合子-mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg的核苷酸序列
<400> 32
tccgatactg gcagaccctt cgtcgagatg tacagcgaga ttcctgagat catccacatg 60
acagagggac gggaactggt gattccttgc agagtgacat ctccaaacat cacagtgacc 120
ctgaagaagt ttcctctgga caccctgatc cctgacggca agcgcatcat ctgggacagc 180
agaaagggat tcatcatcag caacgccacc tacaaggaaa tcggcctcct gacctgcgag 240
gccaccgtga acggacacct gtataaaacc aattacctga cacaccggca aacaaacacc 300
atcatcgacg tggtgctgag ccctagccac ggcatcgagc tgagcgtggg cgagaagctg 360
gtgctgaact gcaccgccag aaccgaactg aacgtgggca tcgatttcaa ctgggaatac 420
ccctcctcta agcaccagca taagaaactg gttaatagag atctgaaaac ccagagcggc 480
agcgaaatga aaaagttcct gtctacactg accatcgacg gcgtgaccag aagcgaccag 540
ggcctgtaca cctgtgccgc ttctagcggc ctgatgacca agaagaacag cacattcgtg 600
cgggtgcacg agaagggcgg cggaggtagc gagcctagag gcccaacaat caagccttgt 660
cctccttgca aatgccctgc tcctaacctg ctgggcggcc ctagcgtctt tatcttccct 720
cctaagatca aagacgtgct gatgatcagc ctgagcccta tcgtgacctg cgtggtggtg 780
gccgtgtctg aggacgatcc tgacgtgcag atcagctggt tcgtgaacaa tgtggaagtg 840
cacacagccc agacacaaac acacagagag gattacggca gcacactgcg cgtggtttcc 900
gccctgccaa tccagcacca ggactggatg agcggcaagg aattcaagtg caaagtgaac 960
aacaaggacc tgcctgcccc tatcgagaga accattagca agcccaaggg atcagttaga 1020
gcccctcagg tgtacgtgct gccccccccc gaggaggaaa tgaccaaaaa gcaggtgacc 1080
ctgacatgca tggtgactga cttcatgcct gaggacatct acgtggaatg gaccaacaac 1140
ggaaagaccg agctcaacta caagaacacc gagcccgtgc ttgattctga cggcagctac 1200
ttcatgtaca gcaagctgcg ggtggaaaag aagaactggg tggaaagaaa tagctatagc 1260
tgttctgtgg tgcacgaggg cctgcataat caccacacca ccaagtcctt cagccggacc 1320
cctggcggcg gcggaggatc cggcggaggc gggagccacc ccaccctgaa aacccccgag 1380
agcgtgacag gaacatggaa gggcgatgtc aagatccaat gtatctacga ccccctgaga 1440
ggctacagac aggtgctggt gaagtggctg gtcaggcacg gcagcgacag cgtgaccatc 1500
tttctgcggg actctacagg agatcacatc cagcaggcca agtaccgggg cagactgaag 1560
gtctcccaca aggtgcctgg cgacgtgtcc ctgcagatca acacactgca gatggatgac 1620
agaaaccact acacctgcga ggtgacctgg cagacccctg atggcaacca ggtgatcaga 1680
gataagatca tcgagctgcg ggtgcggaag tacaaccccc cgcggatcaa caccgaggcc 1740
ccaaccaccc tccattctag cctggaagct acaaccatca tgagcagcac cagcgacctg 1800
accaccaatg gcacaggcaa gctggaagag acaatcgccg gctctggcag aaacctgcct 1860
ggc 1863
<210> 33
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mu IgG2a Fc DANG的核苷酸序列
<400> 33
gcccccaatc tgctgggagg cccttccgtc ttcatcttcc cccccaagat caaggacgtg 60
ctgatgatct ctctgagccc catcgtgaca tgcgtggtgg tggccgtgag cgaggacgat 120
cccgacgtgc agatcagctg gttcgtcaac aacgtggagg tgcataccgc ccaaacacag 180
acccatagag aggactacgg ctccacactg agagtggtgt ccgctctgcc catccagcat 240
caagactgga tgagcggcaa ggagttcaag tgcaaggtga acaacaagga tctgcccgcc 300
cctatcgaga ggaccatctc caagcccaaa ggctccgtga gagctcccca agtgtatgtg 360
ctgcctcccc ccgaggagga gatgaccaag aagcaagtga cactgacatg catggtgacc 420
gatttcatgc ccgaagacat ctacgtggag tggaccaaca acggcaagac cgagctcaac 480
tacaagaaca ccgagcccgt gctcgacagc gacggcagct acttcatgta cagcaagctg 540
agggtcgaga agaaaaactg ggtggagagg aacagctaca gctgtagcgt ggtgcacgag 600
ggactgcaca accaccatac caccaagagc ttctccagaa cacccggcaa gtga 654
<210> 34
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mu IgG2a Fc DANG-VEGF结合子的核苷酸序列
<400> 34
gagcctagag gacccacaat taagccttgc cccccttgca aatgtcccgc ccctaatctg 60
ctcggcggcc ccagcgtgtt catcttcccc cccaagatta aggacgtgct gatgatctct 120
ctgtccccca ttgtgacatg cgtggtcgtg gctgtctccg aggacgaccc cgacgtccag 180
atcagctggt tcgtcaacaa tgtggaggtc cataccgccc agacacagac ccatagagag 240
gattacggca gcacactgag agtggtcagc gctctgccca tccaacacca agactggatg 300
agcggcaagg agttcaagtg taaagtgaac aacaaggatc tgcccgcccc cattgagagg 360
accatctcca aacctaaggg cagcgtgagg gctcctcaag tgtatgtgct cccccccccc 420
gaggaggaaa tgaccaagaa gcaagtgaca ctgacatgca tggtcaccga cttcatgccc 480
gaggacatct acgtggagtg gaccaacaac ggcaagaccg agctgaatta caagaacacc 540
gaacccgtgc tggatagcga tggctcctac ttcatgtaca gcaagctgag agtggagaaa 600
aagaactggg tcgagaggaa cagctacagc tgctccgtcg tgcatgaggg cctccacaac 660
caccatacaa ccaagagctt ctctaggaca cccggcggcg gaggcggatc cggaggaggc 720
ggcagctccg ataccggaag acctttcgtg gagatgtatt ccgagattcc cgagatcatc 780
cacatgaccg agggaagaga gctggtcatc ccttgtagag tcacaagccc caacattacc 840
gtgaccctca agaagttccc tctggacaca ctgattcccg acggcaagag gattatctgg 900
gactctagga agggcttcat catcagcaac gccacctata aagagatcgg actgctgaca 960
tgcgaggcca cagtgaatgg ccacctctac aagaccaact atctgaccca tagacaaacc 1020
aacaccatta tcgacgtggt gctgagccct agccacggca tcgaactcag cgtgggagag 1080
aaactggtgc tgaattgcac cgctaggacc gaactcaacg tgggaatcga cttcaactgg 1140
gagtacccct ccagcaagca ccagcacaag aagctcgtga atagagatct gaagacccag 1200
agcggaagcg agatgaagaa attcctctcc acactgacca tcgatggcgt gacaaggagc 1260
gaccaaggac tgtacacatg cgctgcttcc agcggactga tgacaaagaa gaacagcacc 1320
ttcgtgaggg tccacgaaaa atga 1344
<210> 35
<211> 1293
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿柏西普（aflibercept）的核苷酸序列
<400> 35
tccgatactg gcagaccctt cgtcgagatg tacagcgaga ttcctgagat catccacatg 60
acagagggac gggaactggt gattccttgc agagtgacat ctccaaacat cacagtgacc 120
ctgaagaagt ttcctctgga caccctgatc cctgacggca agcgcatcat ctgggacagc 180
agaaagggat tcatcatcag caacgccacc tacaaggaaa tcggcctcct gacctgcgag 240
gccaccgtga acggacacct gtataaaacc aattacctga cacaccggca aacaaacacc 300
atcatcgacg tggtgctgag ccctagccac ggcatcgagc tgagcgtggg cgagaagctg 360
gtgctgaact gcaccgccag aaccgaactg aacgtgggca tcgatttcaa ctgggaatac 420
ccctcctcta agcaccagca taagaaactg gttaatagag atctgaaaac ccagagcggc 480
agcgaaatga aaaagttcct gtctacactg accatcgacg gcgtgaccag aagcgaccag 540
ggcctgtaca cctgtgccgc ttctagcggc ctgatgacca agaagaacag cacattcgtg 600
cgggtgcacg agaaggacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 660
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 720
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 780
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 840
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 900
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 960
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1020
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1080
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1140
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1200
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1260
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggt 1293
<210> 36
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF 抗体贝伐单抗（bevacizumab）的重链
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 37
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF抗体贝伐单抗（bevacizumab）的轻链
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 38
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF 抗体雷珠单抗（ranibizumab）的可变重链
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Leu
225 230
<210> 39
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF抗体雷珠单抗（ranibizumab）的轻链
<400> 39
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 40
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF抗体雷莫芦单抗（ramucirumab）的重链
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 41
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF抗体雷莫芦单抗（ramucirumab）的轻链
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 42
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF 抗体布洛塞住单抗（brolucizumab）（VL-接头-VL）的scFv
<400> 42
Met Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
130 135 140
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser
145 150 155 160
Leu Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr
180 185 190
Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp
225 230 235 240
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 43
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF抗体法瑞西单抗（faricimab）的重链
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 44
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF抗体法瑞西单抗（faricimab）的轻链
<400> 44
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 45
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF抗体KSI-301的重链
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
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210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Cys Ser Pro Gly Lys
450
<210> 46
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF抗体KSI-301的轻链
<400> 46
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 47
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF抗体伐努赛珠单抗（vanucizumab）的重链
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 48
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF抗体伐努赛珠单抗（vanucizumab）的轻链
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF VHH-抗体BI-836880的CDR1
<400> 49
Ser Tyr Ser Met Gly
1 5
<210> 50
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF VHH-抗体BI-836880的CDR2
<400> 50
Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu Gly
1 5 10 15
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF VHH-抗体BI-836880的CDR3
<400> 51
Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Glu
1 5 10 15
Tyr
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuMab G6-31的HC-CDR1
<400> 52
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuMab G6-31的HC-CDR2
<400> 53
Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuMab G6-31的HC-CDR3
<400> 54
Asp Tyr Trp Ile His
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuMab G6-31的LC-CDR1
<400> 55
Gln Gln Gly Tyr Gly Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuMab G6-31的LC-CDR2
<400> 56
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuMab G6-31的LC-CDR3
<400> 57
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B20-4.1的HC-CDR1
<400> 58
Trp Gly His Ser Thr Ser Pro Trp Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B20-4.1的HC-CDR2
<400> 59
Ala Ile Trp Pro Phe Gly Gly Tyr Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B20-4.1的HC-CDR3
<400> 60
Phe Ser Ile Asn Gly Ser Trp Ile
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B20-4.1的LC-CDR1
<400> 61
Gln Gln Ser Asn Thr Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B20-4.1的LC-CDR2
<400> 62
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B20-4.1的LC-CDR3
<400> 63
Arg Ala Ser Gln Val Ile Arg Arg Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 64
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BAT-5906的重链
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys
50 55 60
Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
Ile Ile Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 65
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BAT-5906的轻链
<400> 65
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 66
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 那赛昔珠单抗（navicixizumab）的重链
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Ser Tyr Lys Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Ile His Tyr Asp Asp Lys Tyr Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys
210 215 220
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Lys Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Lys Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 67
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 那赛昔珠单抗（navicixizumab）的轻链
<400> 67
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Lys Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 68
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 迪帕西单抗（dilpacimab）的重链
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Pro Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Asn Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gln Leu
115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp
145 150 155 160
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn
165 170 175
Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe
180 185 190
Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn
195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro
210 215 220
His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
245 250 255
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
260 265 270
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
275 280 285
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
290 295 300
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
305 310 315 320
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
325 330 335
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
340 345 350
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
355 360 365
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
370 375 380
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
385 390 395 400
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
420 425 430
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
435 440 445
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
450 455 460
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
485 490 495
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
500 505 510
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
530 535 540
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
545 550 555 560
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570 575
Lys
<210> 69
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 迪帕西单抗（dilpacimab）的轻链
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Thr Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
115 120 125
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser
130 135 140
Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
145 150 155 160
Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser
165 170 175
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
180 185 190
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
195 200 205
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
210 215 220
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
225 230 235 240
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
245 250 255
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
260 265 270
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
275 280 285
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
290 295 300
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
305 310 315 320
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330
<210> 70
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPV-19的重链可变区
<400> 70
Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Asn Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Asp Gly Tyr Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val
115
<210> 71
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPV-19的轻链可变区
<400> 71
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 72
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AT-001的重链可变区
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Arg Ser Met Val Arg Gly Val Ile Ile Pro Phe Asn Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AT-001的轻链可变区
<400> 73
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 74
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Crig的人lgV的氨基酸序列
<400> 74
Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln
20 25 30
Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile
35 40 45
Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln
50 55 60
Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln
65 70 75 80
Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val
85 90 95
Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr
100 105 110
Glu Leu Arg Val Gln Lys
115
<210> 75
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠CRIg的细胞外结构域
<400> 75
His Pro Thr Leu Lys Thr Pro Glu Ser Val Thr Gly Thr Trp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Val Lys Ile Gln Cys Ile Tyr Asp Pro Leu Arg Gly Tyr Arg Gln
20 25 30
Val Leu Val Lys Trp Leu Val Arg His Gly Ser Asp Ser Val Thr Ile
35 40 45
Phe Leu Arg Asp Ser Thr Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Arg
50 55 60
Gly Arg Leu Lys Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln
65 70 75 80
Ile Asn Thr Leu Gln Met Asp Asp Arg Asn His Tyr Thr Cys Glu Val
85 90 95
Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Ile Arg Asp Lys Ile Ile
100 105 110
Glu Leu Arg Val Arg Lys Tyr Asn Pro Pro Arg Ile Asn Thr Glu Ala
115 120 125
Pro Thr Thr Leu His Ser Ser Leu Glu Ala Thr Thr Ile Met Ser Ser
130 135 140
Thr Ser Asp Leu Thr Thr Asn Gly Thr Gly Lys Leu Glu Glu Thr Ile
145 150 155 160
Ala Gly Ser Gly Arg Asn Leu Pro
165
<210> 76
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1 Fc DANG-K
<400> 76
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
1 5 10 15
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp
20 25 30
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
35 40 45
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val
50 55 60
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
65 70 75 80
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
85 90 95
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
100 105 110
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
115 120 125
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
130 135 140
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
145 150 155 160
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
165 170 175
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
180 185 190
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
195 200 205
Lys
<210> 77
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贝伐单抗（bevacizumab）的HCDR1
<400> 77
Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln
20 25 30
Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile
35 40 45
Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln
50 55 60
Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln
65 70 75 80
Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val
85 90 95
Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr
100 105 110
Glu Leu Arg Val Gln Lys
115
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贝伐单抗（bevacizumab）的HCDR2
<400> 78
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 79
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贝伐单抗（bevacizumab）的HCDR3
<400> 79
Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贝伐单抗（bevacizumab）的LCDR1
<400> 80
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贝伐单抗（bevacizumab）的LCDR2
<400> 81
Phe Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贝伐单抗（bevacizumab）的LCDR3
<400> 82
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷珠单抗（ranibizumab）的HCDR1
<400> 83
Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷珠单抗（ranibizumab）的HCDR2
<400> 84
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 85
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷珠单抗（ranibizumab）的HCDR3
<400> 85
Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷珠单抗（ranibizumab）的LCDR1
<400> 86
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷珠单抗（ranibizumab）的LCDR2
<400> 87
Phe Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷珠单抗（ranibizumab）的LCDR3
<400> 88
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷莫芦单抗（ramucirumab）的HCDR1
<400> 89
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn
1 5 10
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷莫芦单抗（ramucirumab）的HCDR2
<400> 90
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷莫芦单抗（ramucirumab）的HCDR3
<400> 91
Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷莫芦单抗（ramucirumab）的LCDR1
<400> 92
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷莫芦单抗（ramucirumab）的LCDR2
<400> 93
Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷莫芦单抗（ramucirumab）的LCDR3
<400> 94
Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 布洛塞住单抗（brolucizumab）的CDR1
<400> 95
Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 布洛塞住单抗（brolucizumab）的CDR2
<400> 96
Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 97
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 布洛塞住单抗（brolucizumab）的CDR3
<400> 97
Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser Thr Asn Gly Ala Asn
1 5 10
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 布洛塞住单抗（brolucizumab）的CDR4
<400> 98
Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr
1 5 10
<210> 99
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 布洛塞住单抗（brolucizumab）的CDR5
<400> 99
Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 布洛塞住单抗（brolucizumab）的CDR6
<400> 100
Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 法瑞西单抗（faricimab）的HCDR1
<400> 101
Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 102
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 法瑞西单抗（faricimab）的HCDR2
<400> 102
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 103
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 法瑞西单抗（faricimab）的HCDR3
<400> 103
Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 法瑞西单抗（faricimab）的LCDR1
<400> 104
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 法瑞西单抗（faricimab）的LCDR2
<400> 105
Phe Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 法瑞西单抗（faricimab）的LCDR3
<400> 106
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 107
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KSI-301的HCDR1
<400> 107
Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KSI-301的HCDR2
<400> 108
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 109
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KSI-301的HCDR3
<400> 109
Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KSI-301的LCDR1
<400> 110
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KSI-301的LCDR2
<400> 111
Phe Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KSI-301的LCDR3
<400> 112
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伐努赛珠单抗（vanucizumab）的HCDR1
<400> 113
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 114
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伐努赛珠单抗（vanucizumab）的HCDR2
<400> 114
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 115
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伐努赛珠单抗（vanucizumab）的HCDR3
<400> 115
Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伐努赛珠单抗（vanucizumab）的LCDR1
<400> 116
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伐努赛珠单抗（vanucizumab）的LCDR2
<400> 117
Phe Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伐努赛珠单抗（vanucizumab）的LCDR3
<400> 118
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BAT-5906的HCDR1
<400> 119
Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BAT-5906的HCDR2
<400> 120
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 121
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BAT-5906的HCDR3
<400> 121
Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 122
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BAT-5906的LCDR1
<400> 122
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BAT-5906的LCDR2
<400> 123
Phe Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BAT-5906的LCDR3
<400> 124
Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 125
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 那赛昔珠单抗（navicixizumab）的HCDR1
<400> 125
Asn Tyr Trp Met His
1 5
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 那赛昔珠单抗（navicixizumab）的HCDR2
<400> 126
Asp Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Ser Tyr Lys Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 127
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 那赛昔珠单抗（navicixizumab）的HCDR3
<400> 127
His Tyr Asp Asp Lys Tyr Tyr Pro Leu Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 128
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 那赛昔珠单抗（navicixizumab）的LCDR1
<400> 128
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Lys
1 5 10 15
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 那赛昔珠单抗（navicixizumab）的LCDR2
<400> 129
Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
<210> 130
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 那赛昔珠单抗（navicixizumab）的LCDR3
<400> 130
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly
1 5 10
<210> 131
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 迪帕西单抗（dilpacimab）的HCDR1
<400> 131
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 132
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 迪帕西单抗（dilpacimab）的HCDR2
<400> 132
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg
1 5 10 15
<210> 133
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 迪帕西单抗（dilpacimab）的HCDR3
<400> 133
Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 迪帕西单抗（dilpacimab）的LCDR1
<400> 134
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 迪帕西单抗（dilpacimab）的LCDR2
<400> 135
Phe Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 136
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 迪帕西单抗（dilpacimab）的LCDR3
<400> 136
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
1 5
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPV-19的HCDR1
<400> 137
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Ser Gly Ile Asn
1 5 10
<210> 138
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPV-19的HCDR2
<400> 138
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
1 5 10
<210> 139
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPV-19的HCDR3
<400> 139
Phe Gly Asp Gly Tyr Tyr Trp Phe Phe Asp
1 5 10
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPV-19的LCDR1
<400> 140
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 141
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPV-19的LCDR2
<400> 141
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 142
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPV-19的LCDR3
<400> 142
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly
1 5 10
<210> 143
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AT-001的HCDR1
<400> 143
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AT-001的HCDR2
<400> 144
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 145
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AT-001的HCDR3
<400> 145
Gly Arg Ser Met Val Arg Gly Val Ile Ile Pro Phe Asn Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AT-001的LCDR1
<400> 146
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AT-001的LCDR2
<400> 147
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AT-001的LCDR3
<400> 148
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 149
<211> 1673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔C3的氨基酸序列
<400> 149
Met Ala Glu Pro Trp Pro Leu Ala Leu Met Leu Leu Leu Cys Gly Ser
1 5 10 15
Pro Leu Tyr Arg Ala Glu Pro Leu Tyr Ile Leu Val Thr Pro Arg Val
20 25 30
Leu Arg Leu Gly Ser Pro Glu Asn Ile His Val Gln Ala His Ser Glu
35 40 45
Ser Arg Glu Arg Leu Gln Gly Ser Phe Lys Val Asn Leu Thr Val Trp
50 55 60
Asp Phe Pro Leu Arg Lys Thr Leu Leu Ala Ser Ser Arg Val Val Leu
65 70 75 80
Ser Ala Thr Asn Asp Phe Met Glu Gln Thr Pro Val Thr Val Pro Glu
85 90 95
Ser Leu Leu Phe Pro Arg His Glu Lys Pro Gly Gln His Tyr Val Ile
100 105 110
Ile Arg Ala Asp Trp Lys Pro Thr Ser Val Ser Ser Phe Met Glu Lys
115 120 125
Ile Val Leu Val Ala Pro His Ala Gly Tyr Ile Phe Ile Gln Thr Asp
130 135 140
Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Asp His Met Val Gln Tyr Arg Val Phe Ala
145 150 155 160
Val Asn His Lys Met Asp Pro Val Asn Arg Ala Ile Leu Leu Asp Ile
165 170 175
Lys Asn Pro Asp Gly Val Thr Val Ile Ser His Ser Arg Gln Val Ile
180 185 190
Asn Gly Leu Phe Asp Ser Ser Phe His Leu Pro Glu Leu Val Ser Leu
195 200 205
Gly Thr Trp Thr Ile Glu Ala Ser Tyr Gln Ser Ala Gly Lys Gln Lys
210 215 220
Phe Lys Ala Thr Phe Asp Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro Ser Phe Glu
225 230 235 240
Val Gln Leu Thr Pro Asn Lys Thr Phe Phe Thr Leu Asn Asp Glu Ala
245 250 255
Leu Gly Val Asp Ile Gln Ala Arg Tyr Ile Phe Asn Lys Pro Val Asp
260 265 270
Gly His Ala Leu Ala Ile Phe Gly Leu Lys Val Asp Asn Ile Arg Thr
275 280 285
Thr Ile Gln Gly Ser Leu Gln Arg Val Glu Val Ser Glu Gly Gln Gly
290 295 300
His Val Ser Leu Gln Lys Asp Thr Leu Leu Ala Ala Phe Gln Asp Pro
305 310 315 320
Glu Gly Asp Phe Ser Gly Ala Ser Ile Phe Val Asn Val Thr Val Phe
325 330 335
Ser Ser Gly Gly Glu Met Val Gln Ala Glu Thr Ser Gly Val Lys Ile
340 345 350
Thr Arg Lys Ala Phe Asn Ile Lys Phe Thr Lys Thr Pro Gln Tyr Phe
355 360 365
Lys Pro Gly Met Pro Phe His Phe Arg Val Phe Val Ser Asn Pro Asp
370 375 380
Gly Ser Pro Ala Ala Arg Val Leu Val Arg Cys Gln Asn His Lys Val
385 390 395 400
Tyr Thr Ser Asp Asn Gly Ile Ala Ala Leu Ala Ile Asn Thr Asp Ala
405 410 415
Ala Ser Ser Glu Leu Thr Val Leu Val Glu Thr Glu Ser Pro His Pro
420 425 430
Glu Gln Gln Val Ser Ala Arg Met Thr Ala Trp Pro Tyr Ser Thr Gln
435 440 445
Glu Asn Ser Gly Asn Phe Leu His Val Glu Val Asn Thr Met Gly Thr
450 455 460
Asp Val Gly Asn Ser Leu Gln Leu Ser Leu Asn Thr Arg His Ala Asn
465 470 475 480
Pro Ala Thr Lys Asp Glu Ile Thr His Phe Thr Ile Met Val Leu Ser
485 490 495
Lys Gly Arg Val Val Ser Ala Arg Gln Gln Leu Lys Ser Ser Gly Ser
500 505 510
Val Tyr Thr Ser Ala Ile Ile Asp Val Thr Pro Glu Met Leu Pro Ser
515 520 525
Phe Arg Ile Val Ala Phe Tyr Leu Leu Pro Arg Gly Met Ser Gln Asn
530 535 540
Pro Glu Leu Val Ala Asp Ser Ile Trp Ile Asp Val Asn Asp Arg Cys
545 550 555 560
Met Gly Thr Leu Lys Val Gly Leu Lys Arg Asp Gly Val Ile Gln Pro
565 570 575
Leu Glu Pro Gln Ser Gln Val Glu Leu Lys Val Thr Gly Asp Ala Glu
580 585 590
Ala Arg Val Trp Leu Leu Ala Val Asp Lys Ala Val Tyr Ala Leu Asn
595 600 605
Ser Lys His Lys Leu Thr Gln Lys Lys Val Trp Asp Val Val Glu Glu
610 615 620
His Asp Ile Gly Cys Thr Ala Gly Ser Gly Lys Asn Asn Phe Ala Val
625 630 635 640
Phe Lys Asp Ala Gly Leu Asp Leu Lys Ile Ser Thr Gly Met Asp Thr
645 650 655
Leu Ala Ser Ser Asp Trp Arg Cys Pro Gln Ser Pro Pro Pro Ser Arg
660 665 670
Arg Arg Arg Ser Leu Arg Arg Leu Glu Ala Lys Arg Asp Ala Val Asn
675 680 685
Lys Phe Lys Thr Glu Leu Glu Arg Lys Cys Cys Glu Ala Gly Leu Lys
690 695 700
Glu Asn Pro Ala Gly Leu Ala Cys Glu Glu Arg Thr Arg His Val Leu
705 710 715 720
His Gly Pro Ser Cys Met Ala Ala Phe Leu Asp Cys Cys Gln Leu Ser
725 730 735
Glu Thr Leu Thr Arg Glu Ala Arg Glu Glu Arg Leu Leu Leu Gly Thr
740 745 750
Thr Asp Asp Asp Asp Glu Phe Leu Asp Asp Ile Phe Leu Asp Asp Leu
755 760 765
Pro Val Arg Thr Leu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Arg Ser Val Thr
770 775 780
Leu Pro Glu Ser Ala Ser Gly Thr Ser His Leu Leu Thr Leu Val Ser
785 790 795 800
Met Pro Asp Ser Ile Thr Thr Trp Glu Phe Val Ala Val Ser Leu Lys
805 810 815
Ala Gly Arg Gly Leu Cys Val Ser Asp Pro Phe Glu Leu Thr Val Met
820 825 830
Lys Ser Phe Phe Val Asp Leu Lys Leu Pro Ser Ser Val Val Arg Asn
835 840 845
Glu Gln Ile Gln Ile Gln Ala Val Leu Tyr Asn Phe Arg Ser Arg Gln
850 855 860
Val Lys Val Arg Val Glu Phe Pro Tyr Lys Glu Pro Leu Cys Ser Ala
865 870 875 880
Ser Lys Pro Gly Ala Pro Ser Arg Gln Val Val Thr Val Pro Pro Thr
885 890 895
Ser Ser Lys Ile Val Pro Phe Val Leu Leu Pro Leu Glu Leu Gly Glu
900 905 910
Val Glu Val Glu Val Lys Ala Val Gly Pro Glu Ala Arg Asp His Val
915 920 925
Lys Lys Thr Leu Leu Val Arg Ala Gly Gly Gln Val Gln Arg Leu Ser
930 935 940
His Ser Phe Leu Leu Asn Pro Gln Gly Arg Thr Gln Thr Glu Leu Val
945 950 955 960
Pro Arg Arg Glu Leu Leu Asn Lys Val Pro Asp Thr Glu Ala Glu Val
965 970 975
Phe Val Ser Val Gln Gly Asp Ile Leu Gly Glu Thr Ile Val Gly Ser
980 985 990
Leu Thr Pro Lys Glu Thr Arg Lys Leu Leu Thr Val Pro Thr Gly Cys
995 1000 1005
Pro Glu Gln Thr Leu Ser Lys Leu Ala Pro Val Ile Ile Leu Thr Lys
1010 1015 1020
Tyr Leu Asp Ser Thr Gly Gln Trp Ser Lys Val Gly Val Glu His Arg
1025 1030 1035 1040
Glu Gln Val Leu Lys Asn Leu Val Ile Gly His Thr Gln Met Leu Arg
1045 1050 1055
Tyr Arg Ser Ala Asp Gly Ile Tyr Arg Leu Thr Gln Asn Ser Pro Gly
1060 1065 1070
Ser Thr Trp Phe Thr Ser Tyr Met Phe Arg Ile Phe Ala Leu Ala Tyr
1075 1080 1085
Pro Ile Met Thr Asp Lys Leu Pro Arg Leu Ser Glu Leu Cys Ala Met
1090 1095 1100
Ala Lys Trp Val Ile Thr Gln Arg Gln Ala Glu Asp Gly His Phe Leu
1105 1110 1115 1120
Glu Asn Gly Pro Val Val Met Lys Ser Met Gln Gly Gly Tyr Lys Gly
1125 1130 1135
Ser Glu Ala Asp Ile Ser Leu Thr Ala Leu Val Leu Ile Ala Leu His
1140 1145 1150
Ser Gly Gln Glu Leu Cys Ser Pro Thr Met Gln Asn Leu Asp Ala Ser
1155 1160 1165
Ile Lys Arg Ala Ser Asn Phe Leu Glu Thr Lys Leu Pro Thr Ile Gln
1170 1175 1180
Thr Thr Phe Ala Ile Ala Ile Val Ser Tyr Ala Leu Ala Leu Ala Asn
1185 1190 1195 1200
Ser Pro Lys Ala Asn Asp Arg Leu Asp Ser Phe Ala Asn Tyr Ser His
1205 1210 1215
Cys Gly Asp Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Lys Thr Tyr Trp Pro Val
1220 1225 1230
Gly Glu Pro Asp Glu Asp Ser Leu Tyr Thr Ile Glu Ala Thr Ala Tyr
1235 1240 1245
Ala Leu Met Gln Lys Leu Gln Leu Gly Arg Phe Asn Glu Thr His Ala
1250 1255 1260
Ile Ala Asn Trp Leu Leu Glu Lys Arg Glu Leu Gly Gly Gly Phe Lys
1265 1270 1275 1280
Ser Thr Gln Thr Thr Val Val Ala Ile Glu Ala Leu Thr Ser Phe Arg
1285 1290 1295
Lys Asn Val Pro Phe Glu Gly Glu Gln Asn Leu Asp Val Gln Ile Ser
1300 1305 1310
Val Pro Lys Arg Ala Val His Val Asn Trp Leu Ile Asn His Asn Asn
1315 1320 1325
Ala Tyr Gln Gln Arg Ser Ala Lys Phe Phe Ser Gln Asp Asp Leu Val
1330 1335 1340
Ile Thr Ala Ser Gly His Gly Thr Gly Thr Ile Ser Ile Leu Thr Thr
1345 1350 1355 1360
Tyr Tyr Lys Ser Pro Glu Ser Trp Glu Ser Pro Cys Thr Arg Tyr His
1365 1370 1375
Leu Asn Val Thr Leu His Ser Thr Pro Glu Ala Asn Lys Lys Gly Glu
1380 1385 1390
Glu Thr Phe Arg Leu Arg Met Glu Thr Arg Tyr Leu Gly Ala Gln Asp
1395 1400 1405
Ala Thr Met Thr Ile Met Glu Val Ser Leu Leu Thr Gly Phe Tyr Pro
1410 1415 1420
Asn Gln Glu Asp Leu Lys Gln Leu Thr Asn Asn Val Glu Pro Tyr Ala
1425 1430 1435 1440
Phe Gln Tyr Glu Thr Lys Thr Ser Ser Ser Asp Ser Ser Val Val Leu
1445 1450 1455
Tyr Leu Glu Lys Leu Ser His Gln Glu Asn Thr Val Leu Gly Phe Arg
1460 1465 1470
Ile His Gln Met Leu Gln Ala Asp Phe Leu Gln Ala Ala Met Val Thr
1475 1480 1485
Val Tyr Asp Tyr Tyr Glu Pro Ser His Arg Cys Ser Ala Phe Tyr Asn
1490 1495 1500
Leu Pro Thr Glu Arg Ser Ser Leu Arg Lys Ile Cys His Lys Asp Val
1505 1510 1515 1520
Cys Arg Cys Ala Glu Gly Gln Cys Thr Ala Leu Arg Thr Asp Ser Ser
1525 1530 1535
Arg Leu Ser Lys Glu Glu Leu Gln Glu Ala Ala Cys Glu Ala Gly Val
1540 1545 1550
Asp Phe Val Tyr Lys Ile Lys Leu Glu Gly Val Glu Ala Ser Ala Thr
1555 1560 1565
Thr Pro Tyr Val Tyr Tyr Asn Met Arg Leu Gln Ala Val Ile Lys Ser
1570 1575 1580
Gly Thr Asp Pro Val Ile Pro Asn Thr Leu Lys Lys Phe Val Ser His
1585 1590 1595 1600
Ala Thr Cys His Asp Ser Leu Asp Leu Gln Glu Gln Glu Ser Tyr Leu
1605 1610 1615
Val Met Gly Gln Thr Ser Asp Leu Trp Lys Val Lys Ser Asp Tyr Thr
1620 1625 1630
Tyr Val Leu Gly Lys Asp Thr Phe Leu Met Leu Trp Pro Ala Asp Gly
1635 1640 1645
Asp Val Arg Arg Arg Lys Leu Leu Gly Glu Leu Glu Glu Phe Ser Glu
1650 1655 1660
Tyr Leu Thr Thr His Gly Cys Gln Ser
1665 1670
<210> 150
<211> 1639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠C3(25-1663)的氨基酸序列
<400> 150
Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn Val Leu Arg Leu Glu Ser
1 5 10 15
Glu Glu Thr Phe Ile Leu Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro
20 25 30
Val Thr Val Thr Val Gln Asp Phe Leu Lys Lys Gln Val Leu Thr Ser
35 40 45
Glu Lys Thr Val Leu Thr Gly Ala Thr Gly His Leu Asn Arg Val Phe
50 55 60
Ile Lys Ile Pro Ala Ser Lys Glu Phe Asn Ala Asp Lys Gly His Lys
65 70 75 80
Tyr Val Thr Val Val Ala Asn Phe Gly Ala Thr Val Val Glu Lys Ala
85 90 95
Val Leu Val Ser Phe Gln Ser Gly Tyr Leu Phe Ile Gln Thr Asp Lys
100 105 110
Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr Val Phe Tyr Arg Ile Phe Thr Val
115 120 125
Asp Asn Asn Leu Leu Pro Val Gly Lys Thr Val Val Ile Val Ile Glu
130 135 140
Thr Pro Asp Gly Val Pro Ile Lys Arg Asp Ile Leu Ser Ser His Asn
145 150 155 160
Gln Tyr Gly Ile Leu Pro Leu Ser Trp Asn Ile Pro Glu Leu Val Asn
165 170 175
Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala Phe Tyr Glu His Ala Pro Lys Gln
180 185 190
Thr Phe Ser Ala Glu Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro Ser Phe
195 200 205
Glu Val Leu Val Glu Pro Thr Glu Lys Phe Tyr Tyr Ile His Gly Pro
210 215 220
Lys Gly Leu Glu Val Ser Ile Thr Ala Arg Phe Leu Tyr Gly Lys Asn
225 230 235 240
Val Asp Gly Thr Ala Phe Val Ile Phe Gly Val Gln Asp Glu Asp Lys
245 250 255
Lys Ile Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Arg Val Leu Ile Glu Asp Gly
260 265 270
Ser Gly Glu Ala Val Leu Ser Arg Lys Val Leu Met Asp Gly Val Arg
275 280 285
Pro Ser Ser Pro Glu Ala Leu Val Gly Lys Ser Leu Tyr Val Ser Val
290 295 300
Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser Asp Met Val Glu Ala Glu Arg Ser
305 310 315 320
Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro Tyr Gln Ile His Phe Thr Lys Thr
325 330 335
Pro Lys Phe Phe Lys Pro Ala Met Pro Phe Asp Leu Met Val Phe Val
340 345 350
Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala Arg Arg Val Pro Val Val Thr Gln
355 360 365
Gly Ser Asp Ala Gln Ala Leu Thr Gln Asp Asp Gly Val Ala Lys Leu
370 375 380
Ser Val Asn Thr Pro Asn Asn Arg Gln Pro Leu Thr Ile Thr Val Ser
385 390 395 400
Thr Lys Lys Glu Gly Ile Pro Asp Ala Arg Gln Ala Thr Arg Thr Met
405 410 415
Gln Ala Gln Pro Tyr Ser Thr Met His Asn Ser Asn Asn Tyr Leu His
420 425 430
Leu Ser Val Ser Arg Val Glu Leu Lys Pro Gly Asp Asn Leu Asn Val
435 440 445
Asn Phe His Leu Arg Thr Asp Ala Gly Gln Glu Ala Lys Ile Arg Tyr
450 455 460
Tyr Thr Tyr Leu Val Met Asn Lys Gly Lys Leu Leu Lys Ala Gly Arg
465 470 475 480
Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln Asp Leu Val Val Leu Ser Leu Pro Ile
485 490 495
Thr Pro Glu Phe Ile Pro Ser Phe Arg Leu Val Ala Tyr Tyr Thr Leu
500 505 510
Ile Gly Ala Asn Gly Gln Arg Glu Val Val Ala Asp Ser Val Trp Val
515 520 525
Asp Val Lys Asp Ser Cys Val Gly Thr Leu Val Val Lys Gly Asp Pro
530 535 540
Arg Asp Asn Arg Gln Pro Ala Pro Gly His Gln Thr Thr Leu Arg Ile
545 550 555 560
Glu Gly Asn Gln Gly Ala Arg Val Gly Leu Val Ala Val Asp Lys Gly
565 570 575
Val Phe Val Leu Asn Lys Lys Asn Lys Leu Thr Gln Ser Lys Ile Trp
580 585 590
Asp Val Val Glu Lys Ala Asp Ile Gly Cys Thr Pro Gly Ser Gly Lys
595 600 605
Asn Tyr Ala Gly Val Phe Met Asp Ala Gly Leu Thr Phe Lys Thr Asn
610 615 620
Gln Gly Leu Gln Thr Asp Gln Arg Glu Asp Pro Glu Cys Ala Lys Pro
625 630 635 640
Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Leu Met Glu Arg Arg Met Asp
645 650 655
Lys Ala Gly Gln Tyr Thr Asp Lys Gly Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp
660 665 670
Gly Met Arg Asp Ile Pro Met Pro Tyr Ser Cys Gln Arg Arg Ala Arg
675 680 685
Leu Ile Thr Gln Gly Glu Ser Cys Leu Lys Ala Phe Met Asp Cys Cys
690 695 700
Asn Tyr Ile Thr Lys Leu Arg Glu Gln His Arg Arg Asp His Val Leu
705 710 715 720
Gly Leu Ala Arg Ser Asp Val Asp Glu Asp Ile Ile Pro Glu Glu Asp
725 730 735
Ile Ile Ser Arg Ser His Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Thr Ile Glu
740 745 750
Glu Leu Lys Glu Pro Glu Lys Asn Gly Ile Ser Thr Lys Val Met Asn
755 760 765
Ile Phe Leu Lys Asp Ser Ile Thr Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val Ser
770 775 780
Leu Ser Asp Lys Lys Gly Ile Cys Val Ala Asp Pro Tyr Glu Ile Thr
785 790 795 800
Val Met Gln Asp Phe Phe Ile Asp Leu Arg Leu Pro Tyr Ser Val Val
805 810 815
Arg Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg Ala Val Leu Phe Asn Tyr Arg Glu
820 825 830
Gln Glu Lys Leu Lys Val Arg Val Glu Leu Leu His Asn Pro Ala Phe
835 840 845
Cys Ser Met Ala Thr Ala Lys Lys Arg Tyr Tyr Gln Thr Ile Glu Ile
850 855 860
Pro Pro Lys Ser Ser Val Ala Val Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu Lys
865 870 875 880
Ile Gly Leu Gln Glu Val Glu Val Lys Ala Ala Val Phe Asn His Phe
885 890 895
Ile Ser Asp Gly Val Lys Lys Ile Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Met
900 905 910
Arg Val Asn Lys Thr Val Ala Val Arg Thr Leu Asp Pro Glu His Leu
915 920 925
Asn Gln Gly Gly Val Gln Arg Glu Asp Val Asn Ala Ala Asp Leu Ser
930 935 940
Asp Gln Val Pro Asp Thr Asp Ser Glu Thr Arg Ile Leu Leu Gln Gly
945 950 955 960
Thr Pro Val Ala Gln Met Ala Glu Asp Ala Val Asp Gly Glu Arg Leu
965 970 975
Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile
980 985 990
Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala Val His Tyr Leu Asp Gln Thr Glu
995 1000 1005
Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu Lys Arg Gln Glu Ala Leu Glu Leu
1010 1015 1020
Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln Leu Ala Phe Lys Gln Pro Ile Ser
1025 1030 1035 1040
Ala Tyr Ala Ala Phe Asn Asn Arg Pro Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala
1045 1050 1055
Met Trp Ser Arg Ser Phe Ser Leu Ala Ala Asn Leu Ile Ala Ile Asp
1060 1065 1070
Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln
1075 1080 1085
Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu Asp Gly Pro Val Ile His Gln Glu
1090 1095 1100
Met Ile Gly Gly Phe Arg Asn Thr Lys Glu Ala Asp Val Ser Leu Thr
1105 1110 1115 1120
Ala Phe Val Leu Ile Ala Leu Gln Glu Ala Arg Asp Ile Cys Glu Gly
1125 1130 1135
Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Glu Tyr Leu
1140 1145 1150
Glu Ala Ser Tyr Leu Asn Leu Gln Arg Pro Tyr Thr Val Ala Ile Ala
1155 1160 1165
Gly Tyr Ala Leu Ala Leu Met Asn Lys Leu Glu Glu Pro Tyr Leu Thr
1170 1175 1180
Lys Phe Leu Asn Thr Ala Lys Asp Arg Asn Arg Trp Glu Glu Pro Gly
1185 1190 1195 1200
Gln Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu
1205 1210 1215
Leu Leu Leu Lys Asp Phe Asp Ser Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu
1220 1225 1230
Asn Asp Glu Arg Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr
1235 1240 1245
Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala Gln Tyr Arg Ala Asp Val Pro Asp
1250 1255 1260
His Lys Asp Leu Asn Met Asp Val Ser Leu His Leu Pro Ser Arg Ser
1265 1270 1275 1280
Ser Pro Thr Val Phe Arg Leu Leu Trp Glu Ser Gly Ser Leu Leu Arg
1285 1290 1295
Ser Glu Glu Thr Lys Gln Asn Glu Gly Phe Ser Leu Thr Ala Lys Gly
1300 1305 1310
Lys Gly Gln Gly Thr Leu Ser Val Val Thr Val Tyr His Ala Lys Val
1315 1320 1325
Lys Gly Lys Thr Thr Cys Lys Lys Phe Asp Leu Arg Val Thr Ile Lys
1330 1335 1340
Pro Ala Pro Glu Thr Ala Lys Lys Pro Gln Asp Ala Lys Ser Ser Met
1345 1350 1355 1360
Ile Leu Asp Ile Cys Thr Arg Tyr Leu Gly Asp Val Asp Ala Thr Met
1365 1370 1375
Ser Ile Leu Asp Ile Ser Met Met Thr Gly Phe Ile Pro Asp Thr Asn
1380 1385 1390
Asp Leu Glu Leu Leu Ser Ser Gly Val Asp Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr
1395 1400 1405
Glu Met Asp Lys Ala Phe Ser Asn Lys Asn Thr Leu Ile Ile Tyr Leu
1410 1415 1420
Glu Lys Ile Ser His Ser Glu Glu Asp Cys Leu Ser Phe Lys Val His
1425 1430 1435 1440
Gln Phe Phe Asn Val Gly Leu Ile Gln Pro Gly Ser Val Lys Val Tyr
1445 1450 1455
Ser Tyr Tyr Asn Leu Glu Glu Ser Cys Thr Arg Phe Tyr His Pro Glu
1460 1465 1470
Lys Asp Asp Gly Met Leu Ser Lys Leu Cys His Asn Glu Met Cys Arg
1475 1480 1485
Cys Ala Glu Glu Asn Cys Phe Met His Gln Ser Gln Asp Gln Val Ser
1490 1495 1500
Leu Asn Glu Arg Leu Asp Lys Ala Cys Glu Pro Gly Val Asp Tyr Val
1505 1510 1515 1520
Tyr Lys Thr Lys Leu Thr Thr Ile Glu Leu Ser Asp Asp Phe Asp Glu
1525 1530 1535
Tyr Ile Met Thr Ile Glu Gln Val Ile Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val
1540 1545 1550
Gln Ala Gly Gln Glu Arg Arg Phe Ile Ser His Val Lys Cys Arg Asn
1555 1560 1565
Ala Leu Lys Leu Gln Lys Gly Lys Gln Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser
1570 1575 1580
Ser Asp Leu Trp Gly Glu Lys Pro Asn Thr Ser Tyr Ile Ile Gly Lys
1585 1590 1595 1600
Asp Thr Trp Val Glu His Trp Pro Glu Ala Glu Glu Arg Gln Asp Gln
1605 1610 1615
Lys Asn Gln Lys Gln Cys Glu Asp Leu Gly Ala Phe Thr Glu Thr Met
1620 1625 1630
Val Val Phe Gly Cys Pro Asn
1635
<210> 151
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRIg (VSIG4)亚型2
<400> 151
Met Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val Asp
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro
20 25 30
Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly
35 40 45
Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro
50 55 60
Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala
65 70 75 80
Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val
85 90 95
Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr
100 105 110
Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp
115 120 125
Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr
130 135 140
Val Thr Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg
145 150 155 160
Ile Ser Leu Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile
165 170 175
Trp Tyr Lys Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr
180 185 190
Leu Ser Thr Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser
195 200 205
Tyr Phe Cys Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp
210 215 220
Ile Val Lys Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys
225 230 235 240
Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr
245 250 255
Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly
260 265 270
Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala Ile Ile
275 280 285
Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala Tyr Ile
290 295 300
Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu Ala Ala
305 310 315 320
Arg

Claims (25)

1.一种融合蛋白，其包括：
免疫球蛋白超家族(CRIg)的补体受体的细胞外结构域或其片段；和
特异性结合血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述CRIg的细胞外结构域或其片段和特异性结合VEGF的蛋白通过接头连接。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述接头为肽接头、免疫球蛋白片段或其组合。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白片段包括DANG突变或NG突变。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白片段包括如SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，特异性结合VEGF的所述蛋白包括抗体，所述抗体特异性结合VEGF或其片段和VEGF受体的细胞外结构域。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述VEGF受体为VEGF受体1或VEGF受体2。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述VEGF受体的细胞外结构域包括如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由结构式(I)或(II)组成：
N'-X-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-Y-C'(I)
N'-Y-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-X-C'(II)
在结构式(I)和(II)中，
N'是融合蛋白的N末端，
C'是融合蛋白的C末端，
X是CRIg的细胞外结构域或其片段，
Y是特异性结合VEGF的蛋白，
接头(1)和接头(2)是肽接头，并且
n和m各自独立为0或1。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述接头(1)包含如SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述接头(2)包含如SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由结构式(I)组成。
13.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10组成的组中的任一种。
14.一种融合蛋白二聚体，其中结合了两种根据权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白二聚体，其特征在于，所述融合蛋白二聚体为同源二聚体。
16.一种编码根据权利要求1至13中任一项所述融合蛋白的多核苷酸。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自由SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32组成的组中的任一种。
18.一种包含根据权利要求16所述的多核苷酸的载体。
19.一种导入根据权利要求18所述的载体的转化细胞。
20.一种用于治疗或预防眼部疾病的药物组合物，其包括作为活性成分的根据权利要求1所述的融合蛋白或根据权利要求14所述的融合蛋白二聚体。
21.根据权利要求20所述的用于治疗或预防眼部疾病的药物组合物，其特征在于，所述眼部疾病选自由年龄相关性黄斑变性(AMD)、地图状萎缩(GA)、脉络膜新生血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病和其它缺血相关的视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、冯·希佩尔-林道病、眼部组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜血管生成和视网膜血管生成组成的组中的任一种。
22.根据权利要求20所述的用于治疗或预防眼部疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
23.一种融合蛋白或其二聚体在治疗眼部疾病中的应用，其中，所述融合蛋白包括CRIg的细胞外结构域或其片段和特异性结合VEGF的蛋白。
24.一种融合蛋白或其二聚体在制备治疗或预防眼部疾病药物中的应用，其中，所述融合蛋白包括CRIg的细胞外结构域或其片段和特异性结合VEGF的蛋白。
25.一种治疗和/或预防眼部疾病的方法，其包括向受试者施用融合蛋白或其二聚体，其中所述融合蛋白含有CRIg的细胞外结构域或其片段和特异性结合VEGF的蛋白。
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