CN111315771A - 针对mfap4的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体，包括结合人微丝相关蛋白4(MFAP4)的人源化抗体。本发明还涉及此类抗体的用途。

Description

针对MFAP4的抗体
技术领域
本发明总体上涉及药物和抗体的用途。本发明具体地涉及新型抗体，特别是结合人微丝相关蛋白4(MFAP4)的人源化单克隆抗体。
背景技术
MFAP4是一种36kDa的糖蛋白，由一个短N端区域组成，包含一个潜在的结合整联蛋白的RGD序列，随后有一个纤维蛋白原相关域(FReD)。该蛋白质在天然条件下形成同源寡聚结构。在各种各样的人类蛋白质中发现了FReD，这些蛋白质涉及不同的功能，例如凝血、血管生成、组织生长和重塑以及天然免疫。
MAGP-36/MFAP4首先被鉴定为在氨基酸组成上与腱糖蛋白相似的蛋白质，并定位于动脉中的ECM。随后证明了MAGP-36与ECM纤维(包括弹性蛋白、胶原蛋白或钙调蛋白)的直接相互作用。通过利用人主动脉平滑肌细胞中含RGD的肽与固定的MAGP-36结合的抑制作用，证明了MAGP-36与细胞整联蛋白受体之间的相互作用。
WO 2014/114298公开了靶向MFAP4的不同抗体(包括HG-HYB 7-5)。
WO 2016/008498也公开了靶向MFAP4的抗体(包括HG-HYB 7-1)。
因此，改进的针对MFAP4的抗体将是有利的，特别是与MFAP4结合更有效和/或可靠的抗体将是有利的。此外，MFAP4抗体的新用途将是有利的。
发明内容
本发明提供了靶向MFAP4的新型抗体，包括人源化抗体。与已知的靶向MFAP4的抗体相比，这些抗体具有不同的序列和不同的结合特性。
所有RGD依赖性整联蛋白都可潜在地与此RGD位点相互作用，不过整联蛋白αVβ3/5与血管重塑、血管生成、血管渗漏和炎症的研究高度相关。
在实施例部分中描述了本发明所述的抗体的医学用途。
因此，本发明的目的涉及提供靶向MFAP4的新型配体(抗体)。特别地，本发明的目的是提供针对MFAP4的人源化抗体。
因此，本发明的一方面涉及一种与MFAP4的新表位结合的蛋白质配体，例如抗体。
本发明的另一方面涉及一种蛋白质配体，例如一种抗体，或者如本发明所述的配体，包括
轻链可变区，包括如SEQ ID NO：9所示的CDR1区，如SEQ ID NO：10所示的CDR2区和如SEQ ID NO：11所示的CDR3区；和
重链可变区，包括如SEQ ID NO：12所示的CDR1区，如SEQ ID NO：13所示的CDR2区和如SEQ ID NO：14所示的CDR3区。
本发明的再一方面是提供一种蛋白质配体，例如一种抗体，或者如本发明所述的配体，包括
一轻链可变区，包括SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1或3具有至少80％序列同一性，例如至少90％序列同一性，或例如至少95％序列同一性的序列。
一重链可变区，包括SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2或4具有至少80％序列同一性，例如至少90％序列同一性，或例如至少95％序列同一性的序列。
本发明的再一方面是提供一种编码本发明所述的配体的载体。
再一方面涉及一种表达本发明所述的配体的细胞，和/或一种包含本发明所述的载体的细胞。
再一方面涉及一种组合物，包含本发明所述的配体和一种或多种生理学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
另一方面涉及本发明所述的配体和/或本发明所述的组合物作为药物的用途。
另一方面涉及本发明所述的配体或者本发明所述的组合物用于预防或治疗哺乳动物中以病理性增生或血管渗漏或炎症或纤维化为特征的血管疾病和/或相关疾病。
附图说明
图1显示了单克隆抗体的可变重链(HC)和轻链(LC)序列的比对，HG Hyb7-1(HYB7-1)(LC＝SEQ ID NO：5和HC＝SEQ ID NO：6)，HG Hyb 7-5(HYB7-5)(LC＝SEQ ID NO：7和HC＝SEQ ID NO：8)，mAS0326(LC＝SEQ ID NO：1和HC＝SEQ ID NO：2)和hAS0326(LC＝SEQ IDNO：3，HC＝SEQ ID NO：4)。CDR序列用下划线表示。
图2显示了经竞争性ELISA检测的抗体的表位图。生物素化的A)HG HYB 7-5(生物素HYB7-5)，B)hAS0326(生物素hAS0426)和C)mAS0326(bmAS0326)以0.5μg/ml的固定浓度与从20μg/ml起2倍稀释的未标记的IgG同型对照HG HYB 7-18(HYB7-18)，HG HYB 7-5(HYB7-5)，hAS0326和mAS0326混合。所得的结合模式证明，相同的未标记Mab可以抑制目标生物素化单克隆抗体与固定化靶标重组MFAP4的结合。只有HG Hyb 7-5能够抑制HG HYB 7-5与靶标的相互作用。相反，mAS0326能够抑制hAS0326与靶标结合，反之亦然。
图3显示了生物素化单克隆抗体(Mab)hAS0326(生物素hAS0326)，mAS0326(生物素mAS0326)和HG HYB 7-5(生物素HYB7-5)与A)重组人MFAP4，B)RGD整联蛋白结合基序突变为AAA的重组人MFAP4和C)重组小鼠MFAP4的结合。
图4显示了HG HYB 7-5，mAS0326和hAS0326与小鼠血清MFAP4和人血清MFAP4的结合。包含来自MFAP4缺陷小鼠的血清(MFAP4 KO)作为阴性对照。微量滴定板涂布有A)HG HYB7-5，B)mAS0326和C)hAS0326。使用生物素化的HG HYB 7-18作为检测抗体。
图5显示了溶液中的抗体聚集。在进行尺寸排阻色谱法(SEC)之前，将hAS0326和mAS0326浓缩至指示的浓度[7.4mg/ml-67mg/ml]。A)将mAS0326浓缩至44mg/ml和hAS0326浓缩至67mg/ml的SEC色谱图。B)所有测试浓度的SEC色谱图的放大。C)利用SDS-PAGE和Comassie染色，对还原状态(R)和未还原状态(UR)的hAS0326和mAS0326进行3μg/泳道的纯度测试(M＝MW标记)。
图6显示了小鼠激光诱导的CNV模型中mAS0326-介导的对病理性眼部血管生成、血管渗漏和炎性浸润的抑制。激光烧灼后第1天和第7天进行眼内抗体注射。每个治疗组有4-8只小鼠，每只眼睛最多4处病变。每个数据点代表一处病变。A)第7天和B)第14天的眼底荧光素血管造影显示，用mAS0326或抗VEGF治疗的眼睛病变大小(合并血管生成/血管渗漏)减小。比例尺＝100μm。眼内注射mAS0326本质上也减少了血管生成(通过脉络膜的内皮标记凝集素IB4阳性体积来测量)C)和浸润脉络膜的CD45(炎性细胞)阳性细胞D)。比例尺＝100μm。C和D中的数据是在激光诱导的脉络膜新血管形成14天后通过切除的脉络膜组织的共聚焦成像而获得。显示的统计仅用于治疗组之间的比较(具有中位数和四分位数范围的散点图)。*p<0.05，***p<0.001(Kruskal-Wallis检验和Dunn的多重比较检验)。
图7显示了在小鼠激光诱导的CNV模型中hAS0326-介导的对病理性眼部血管生成、血管渗漏和炎性浸润的抑制。激光烧灼后第1天和第7天进行眼内抗体注射。每个治疗组有6-8只小鼠，每只眼睛最多4处病变。每个数据点代表一处病变。与抗VEGF治疗的眼睛相比，在用hAS0326治疗的眼睛中，在A)第7天和B)第14天的眼底荧光血管造影显示病变大小(合并血管生成/血管渗漏)减小。眼内注射hAS0326本质上也减少了血管生成(通过脉络膜的内皮标记凝集素IB4阳性体积来测量)C)和浸润脉络膜的CD45(炎性细胞)阳性细胞。用hAS0326和抗VEGF的组合治疗进一步增强了该作用D)。C和D中的数据是在激光诱导的脉络膜新血管形成14天后通过切除的脉络膜组织的共聚焦成像而获得。显示的统计仅用于治疗组之间的比较(具有中位数和四分位数范围的散点图)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(Kruskal-Wallis检验和Dunn的多重比较检验)。比例尺＝100μm。
图8显示了在链脲佐菌素(STZ)诱导的大鼠糖尿病模型中hAS0326-介导的对病理性眼部渗漏的抑制。STZ(50mg/kg，i.p.)用于诱发Sprague-Dawley大鼠的糖尿病(n＝8)。在STZ治疗开始后的第1天和第7天，通过眼内注射抗体治疗糖尿病大鼠。使用Imaris软件，将血管面积计算为每只动物视网膜的三个部分的平均值，测量为2D平面中Evans Blue染料阳性脉管系统所占的面积。显示的统计仅用于治疗组之间的比较(具有中位数和四分位数范围的散点图)。*p<0.05(Kruskal-Wallis检验和Dunn的多重比较检验)。A)第0天；B)第21天。
图9显示了hAS0326及其变体抑制MFAP4诱导的细胞活化的能力，其通过视网膜内皮迁移测定来评估。使用transwell过滤器测定视网膜内皮向VEGF的迁移。A)全长hAS0326-vs.Fab-介导的内皮迁移抑制作用，以及B)全长hAS0326-vs.F(ab’)2-介导的内皮迁移抑制作用。
现在将在下文更详细地描述本发明。
具体实施方式
定义
在进一步详细讨论本发明之前，将首先定义以下术语和习惯用语：
本发明的配体(例如抗体和抗原结合结构域)选择性地与MFAP4结合，其以比对其他抗原更大的结合亲和力优先地与MFAP4结合。该抗体可选择性地与人MFAP4结合，而且还可检测地与非人MFAP4结合，例如鼠MFAP4。可替代地，该抗体可专门地与MFAP4结合，而与非人MFAP4没有可检测的结合。
术语“蛋白质配体”指主要由氨基酸组成的配体，例如抗体或其片段。另如本文中公开的，蛋白质配体可包括配基(moieties)，例如检测标记或具有毒性或治疗活性的物质。
术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，其中每个单克隆抗体通常将识别抗原上的单个表位。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如，本发明的单克隆抗体可通过如Kohler等人(Nature 256,495(1975))描述的杂交瘤方法制备，或者可使用如本文所述的技术从噬菌体文库中分离。
术语“抗原结合域”或“抗原结合区”或“其片段或衍生物”指选择性结合物质(agent)的部分(例如抗体分子)，其包含与抗原相互作用并且为该结合物质赋予其针对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基。优选地，抗原结合区将具有人类起源。在其他实施方式中，抗原结合区可源自于其他动物物种，特别是家畜和啮齿动物，例如，兔子、大鼠或仓鼠。
在关于抗体或抗原结合区、其片段或衍生物、与MFAP4具有免疫反应性时使用的术语“有效量”和“治疗有效量”指支持在MFAP4的一个或多个生物活性水平可观察到变化的有用或必要的选择性结合物质的量，其中所述变化可以是MFAP4活性水平的增大或减小。
在本发明的上下文中，术语“序列同一性”或“同源物”表示两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的同源程度的定量度量。如果要比较的两个序列长度不相等，则必须将它们进行比对以得到最大可能的匹配，允许在多肽序列或核苷酸序列的末端插入空位或者可替代地截尾。序列同一性可以计算为
Figure BDA0002472302670000051
其中Ngif是比对时两个序列中不同残基的总数，其中Nref是一个序列中的残基数。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75％的序列同一性(Ndif＝2和Nref＝8)。空位计算为具体残基的不同一性，即DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC具有75％的序列同一性(Ndif＝2和Nref＝8)。
对于本发明的所有涉及氨基酸序列或核苷酸序列的实施方式，一个或多个序列之间的序列同一性的百分比也可基于使用clustalW软件(http://www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html)默认设置的比对。对于核苷酸序列比对，这些设置是：比对(Alignment)＝3Dfull，空位开放(Gap Open)10.00，空位延伸(Gap Ext.)0.20，空位分隔距离(Gapseparation Dist.)4，DNA权矩阵(DNA weight matrix)：同一性(IUB)。对于氨基酸序列比对，这些设置如下：比对＝3Dfull，空位开放10.00，空位延伸0.20，空位分隔距离4，蛋白质权矩阵(Protein weight matrix)：Gonnet。
可替代地，核苷酸序列可通过使用程序DNASISMax进行分析，并且可在http//www.paralign.org/完成序列比较。这种服务基于两种比较算法，称为Smith-Waterman(SW)和ParAlign。第一种算法由Smith和Waterman出版(1981)，并且是寻找两个序列的最佳局部比对的成熟方法。另一种算法，ParAlign，是用于序列比对的探索法，Rognes(2001)出版了这些方法的细节。使用得分矩阵和空位罚分以及E值(E-value)的默认设置。
在本文中，术语“KD”或“KD值”指抗体(配体)与其抗原之间的平衡解离常数。KD值与抗体的浓度(特定实验所需的抗体量)有关，因此KD值越低(浓度越低)，则抗体的亲和力越高。在本文中，KD通过Biacore T200测量。
在本发明的上下文中，定义“对于SEQ ID NO：X的AA-yy”应理解为AA＝氨基酸；-yy是氨基酸在SEQ ID NO：X中的位置。因此，例如，“对于SEQ ID NO：2的Trp-33”应理解为在SEQ ID NO：2中第33位的Trp。
在本发明的上下文中，“最多五个氨基酸”的定义应理解为不超过五个氨基酸，即五个氨基酸，四个氨基酸，三个氨基酸，两个氨基酸或一个氨基酸。
在本发明的上下文中，定义“其中最多xx个氨基酸与SEQ ID NO：X不同的序列”应理解为该序列与SEQ ID NO：X相同，但有xx个氨基酸除外，它们可能是有区别的，即是一种与该序列中列出的氨基酸不同的氨基酸。因此，如果最多两个氨基酸与SEQ ID NO：9不同，则应理解为一种与SEQ ID NO：9有两个、一个或没有氨基酸不同的序列。“X”应理解为如本文所列的序列表SEQ ID NO：1-14中的任一个。可替代地，“X”应理解为序列表SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14中的任一个。“xx”应理解为数字五、四、三、二或一。
配体
如上所述，本文公开了靶向MFAP4的新型抗体，包括人源化抗体。与已知的靶向MFAP4的抗体相比，这些抗体具有不同的序列和不同的结合特性。在实施例部分描述了抗体的医学用途。因此，在第一方面，本发明涉及一种与MFAP4的新表位结合的蛋白质配体，例如抗体。
本发明人已经确定，与已知的抗MFAP4抗体相比，根据本发明的抗体具有不同的CDR序列。因此，在另一方面，本发明涉及一种蛋白质配体，例如根据本发明的一种抗体，或配体，包括
轻链可变区，包括如SEQ ID NO：9所示的CDR1区，如SEQ ID NO：10所示的CDR2区和如SEQ ID NO：11所示的CDR3区；和
重链可变区，包括如SEQ ID NO：12所示的CDR1区，如SEQ ID NO：13所示的CDR2区和如SEQ ID NO：14所示的CDR3区。
通过本发明所述的抗体的互补位的X射线晶体学分析和MFAP4的表位并且按照本领域技术人员已知的操作，本发明人进一步鉴定了轻链可变区和重链可变区的CDR中的氨基酸，它们与MFAP4的表位强烈地相互作用，因此对于抗体的互补位与MFAP4的表位的结合很重要。因此，在一种实施方式中，本发明涉及一种蛋白质配体，例如根据本发明的一种抗体，或配体，包括：
轻链可变区，包括
CDR1区，如SEQ ID NO：9所示或者与SEQ ID NO：9最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列，条件是第9位的氨基酸为Tyr；
CDR2区，如SEQ ID NO：10所示或者与SEQ ID NO：10最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列；和
CDR3区，如SEQ ID NO：11所示或者与SEQ ID NO：11最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列，条件是第6位的氨基酸为Tyr；和
重链可变区，包括
CDR1区，如SEQ ID NO：12所示或者与SEQ ID NO：12最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列，条件是第3位的氨基酸为Trp；
CDR2区，如SEQ ID NO：13所示或者与SEQ ID NO：13最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列；和
CDR3区，如SEQ ID NO：14所示或者与SEQ ID NO：14最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列，条件是第1位的氨基酸是Glu以及第9位的氨基酸是Trp。
另外，通过本领域技术人员已知的X射线晶体学，本发明人进一步鉴定了重链可变区的CDR中的氨基酸，其与抗体的包装(packaging)密切相关。因此，在另一种实施方式中，本发明涉及一种蛋白质配体，例如一种抗体，或本发明所述的配体，包括
轻链可变区，包括
CDR1区，如SEQ ID NO：9所示或者与SEQ ID NO：9最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列，条件是第9位的氨基酸为Tyr；
CDR2区，如SEQ ID NO：10所示或者与SEQ ID NO：10最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列；和
CDR3区，如SEQ ID NO：11所示或者与SEQ ID NO：11最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列，条件是第6位的氨基酸为Tyr；和
重链可变区，包括
CDR1区，如SEQ ID NO：12所示或者与SEQ ID NO：12最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列，条件是第3位的氨基酸为Trp以及第2位的氨基酸是Met；
CDR2区，如SEQ ID NO：13所示或者与SEQ ID NO：13最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列，条件是第4位的氨基酸是Pro；和
CDR3区，如SEQ ID NO：14所示或者与SEQ ID NO：14最多有五个氨基酸不同，例如最多四个氨基酸不同，例如最多三个氨基酸不同，例如最多两个氨基酸不同，例如最多一个氨基酸不同的序列，条件是第1位的氨基酸是Glu以及第9位的氨基酸是Trp。
因此，根据上述实施方式，除了被证明对于与表位的结合重要的特定氨基酸之外，CDR区可不同于如SEQ ID NO：9-14所定义的序列(见实施例12)。
如实施例部分中所示，已经产生了针对MFAP4的新型抗体(见实施例3和4+相应的附图)。与其他MFAP4抗体相比，这些抗体具有不同的结合特性(见实施例5)。与针对MFAP4的其他抗体相比，这些抗体显示出几种优势：
-通过显示较少的聚集，人源化类型在溶液中可能更稳定(见实施例6和实施例10)。
-这些抗体针对例如病理性眼部血管生成、血管渗漏和炎症(见实施例7-9)显示出有益效果。
发明人还确定了本发明所述的配体的轻链和重链。因此，在一种实施方式中，所述配体包括：
轻链可变区，包括如SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1或3具有至少80％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性的序列；
重链可变区，包括如SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2或4具有至少80％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性的序列。
SEQ ID NO：1和2是来自mAS0326的轻链和重链，而SEQ ID NO：3和4是来自hAS0326的轻链和重链。
在另一种实施方式中，所述配体包括
轻链可变区，包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列；和
重链可变区，包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
因此，在该实施方式中，所述配体包含来自hAS0326的轻链和重链。
在另一种实施方式中，配体包括：
轻链可变区，包括SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1或3具有至少80％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如98％序列同一性，或例如99％序列同一性的序列，条件是第32位的氨基酸为Tyr以及第94位的氨基酸为Tyr；
重链可变区，包括SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2或4具有至少80％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如98％序列同一性，或例如99％序列同一性的序列，条件是第33位的氨基酸是Trp，第99位的氨基酸是Glu以及第107位的氨基酸是Trp。
在另一种实施方式中，所述配体包括：
轻链可变区，包括SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1或3具有至少80％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如98％序列同一性，或例如99％的序列同一性的序列，条件是第32位的氨基酸为Tyr以及第94位的氨基酸为Tyr；
重链可变区，包括如SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2或4具有至少80％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如至少98％序列同一性，或者例如99％序列同一性的序列，条件是第33位的氨基酸是Trp，第34位的氨基酸是Met，第53位的氨基酸是Pro，第99位的氨基酸是Glu以及第107位的氨基酸是Trp。
因此，根据上述实施方式，除了被证明对于结合表位重要的特定氨基酸以外，这些区域可通过改变序列同一性的程度而不同于SEQ ID NO：1-4所描述的序列(见实施例12)。
配体可以不同的形式产生。因此，在一种实施方式中，所述配体选自多克隆抗体、单克隆抗体、其中所述重链和轻链通过柔性接头连接的抗体、Fv分子、抗原结合片段、Fab片段、F(ab’)2分子、全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。在一种实施方式中，所述配体是F(ab’)2分子。在又一种优选的实施方式中，所述配体选自单克隆抗体、Fab片段和人源化单克隆抗体。在另一种优选的实施方式中，所述抗体是人源化的和/或单克隆的，优选地是人源化单克隆抗体。
将不同的配基(moieties)偶联到根据本发明的配体上也可能是有利的。因此，在一种实施方式中，所述配体与检测标记或具有毒性或治疗活性的物质偶联。
当然重要的是配体能够以足够的结合效率结合至靶标。因此，在另一种实施方式中，所述配体对rhMFAP4的KD值低于1*10-7，例如低于1*10-8，或者例如低于1*10-9M，或者例如在1*10-7至1*10-12M的范围，或者例如在1*10-7至1*10-10M的范围。实施例2显示了本发明所述抗体的KD值。
为了使本发明所述的配体用作药物，它们必须是足够可溶的并且不形成可能沉淀的聚集体。因此，在又一种实施方式中，本发明所述的配体主要为单体形式(在PBS中测量，pH 7.4)。“主要地”应理解为至少90％的配体为单体形式，例如至少95％。
本发明所述的配体的结合特异性不同于结合MFAP4的其他已知抗体。因此，在另一种实施方式中，配体不(直接)结合至rhMFAP4中的RGD-整联蛋白相互作用序列，但仍阻断由整联蛋白连接的空间位阻所暗含的MFAP4介导的活性。实施例5中提供了本发明所述的抗体的结合数据。
RGD-整联蛋白相互作用结构域位于纤维蛋白原相关结构域(FReD)之前的短N端区域(第26-28位(包含信号肽时)和第6-8位(不包含信号肽时)。
载体
本发明所述的配体可由一种或多种载体表达。因此，一方面，本发明涉及编码本发明所述的配体的一种(或多种)载体。应当理解，例如，轻链或重链可由两个不同的载体表达。在一种实施方式中，所述载体是质粒。
细胞
所述载体可在细胞中表达配体。因此，本发明的另一方面涉及表达本发明所述的配体的细胞，和/或包含本发明所述的载体的细胞。在一种实施方式中，所述细胞是CHO细胞。
组合物
当然，本发明所述的配体可以是在组合物(例如药物组合物)中。因此，在另一方面，本发明涉及一种组合物，包括本发明所述的配体和一种或多种生理上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。在一种实施方式中，所述组合物包括一种或多种稳定剂和/或一种或多种缓冲剂。在又一种实施方式中，所述稳定剂是表面活性剂。
在另一种实施方式中，所述组合物还包括VEGF-A(包括其剪接形式)或VEGF-受体(VEGFR1/VEGFR2)拮抗剂或抗-VEGF药物，例如抗-VEGF抗体。如实施例部分显示，在某些情况下，通过这种组合看到了有益的效果。
药物
本发明所述的配体和/或组合物可用作药物。因此，本发明的又一方面涉及本发明所述的配体和/或组合物作为药物的用途。
在一种实施方式中，所述配体或组合物用于预防或治疗哺乳动物中的血管增生性疾病和/或相关疾病。在一种优选的实施方式中，哺乳动物是人。
在又一种实施方式中，所述血管增生性疾病和/或相关疾病是由血管的增生或重塑引起的。
在又一种实施方式中，所述血管增生性疾病和/或相关疾病是由病理性新血管形成引起或在哺乳动物中表现为血管渗漏或炎症或纤维化和/或相关疾病。
在又一种实施方式中，所述疾病和/或相关病症是过敏性哮喘中的支气管增生或嗜酸性炎症。
在另一种实施方式中，所述血管增生性疾病和/或相关疾病以眼中病理性新血管形成为特征。在一种相关的实施方式中，所述以眼中病理性新血管形成为特征的疾病选自年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括地理萎缩和增生性AMD，视网膜静脉阻塞，视网膜病变，高血压性视网膜病变，玻璃体牵引和糖尿病性视网膜病变(DR)，包括增生性DR和糖尿病性黄斑水肿。
在一种实施方式中，所述血管增生性疾病和/或相关疾病是癌症或其他恶性肿瘤。在一种相关的实施方式中，所述癌症或恶性肿瘤选自胶质母细胞瘤、头癌、颈癌和肺癌。
所述配体或组合物可通过不同途径施用。因此，在一种实施方式中，所述配体或组合物通过静脉内、眼部(对眼睛)或皮下施用。
预防或治疗血管增生性疾病的方法
在另一方面，本发明涉及预防或治疗哺乳动物中血管增生性疾病和/或相关疾病的方法，所述方法包括向(有需要的)哺乳动物施用本发明所述的配体或组合物。在一种优选的实施方式中，所述哺乳动物是人。
在一种实施方式中，所述方法用于预防或治疗由病理性新血管形成引起的血管增生性疾病和/或相关疾病。
在又一种实施方式中，所述方法用于预防或治疗过敏性哮喘中的支气管增生和嗜酸性粒细胞炎症。
在另一种实施方式中，所述方法用于预防或治疗以眼中病理性新血管形成为特征的疾病。在一种相关的实施方式中，所述以眼中病理性新血管形成为特征的疾病选自年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括地理萎缩和增生性AMD，视网膜静脉阻塞，视网膜病变，高血压性视网膜病变，玻璃体牵引和糖尿病性视网膜病变(DR)，包括增生性DR和糖尿病性黄斑水肿。
在一种实施方式中，所述血管增生性疾病和/或相关疾病是癌症或其他恶性肿瘤。在一种相关的实施方式中，所述癌症或恶性肿瘤选自胶质母细胞瘤、头癌、颈癌和肺癌。所述配体或组合物可通过不同途径施用。因此，在一种实施方式中，所述配体或组合物通过静脉内、对眼睛、眼部或皮下施用。
应注意的是，在本发明的一个方面的上下文中描述的实施例和特征也适用于本发明的其他方面。
本申请中引用的所有专利和非专利参考文献均通过引用全文并入本文。
现在将在以下非限制性实施例中更详细地描述本发明。
实施例
实施例1-材料和方法
本实施例中描述了以下实施例中使用的材料和方法。
缓冲液
Tris缓冲盐水(TBS)：140mM NaCl,10mM Tris-HCl，0.02％(w/v)NaN2，pH 7.4；TBS/Tw：TBS含有0.05％(v/v)的Tween20(聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯，MERCK-Schuchardt)；磷酸盐缓冲盐水(PBS)：137mM NaCl，3mM KCl，8mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，pH7.4；底物缓冲液：35mM柠檬酸，67mM Na2HPO4，pH 5.0。
小鼠单克隆抗体的产生
如前所述产生用于免疫的hrMFAP4(
Figure BDA0002472302670000131
et al.PLoS One.2013Dec 4；8(12))。使用标准杂交瘤技术和MFAP4缺陷小鼠生产对hrMFAP4具有亲和力的单克隆抗体。
此过程产生了一系列单克隆抗体，包括：
产生针对人重组MFAP4(hrMFAP4)的HG Hyb 7-1鼠单克隆抗体(描述于例如WO2016/008498中)
产生针对人重组MFAP4(hrMFAP4)的HG Hyb 7-5鼠单克隆抗体(描述于例如WO2014/114298中)
产生针对人重组MFAP4(hrMFAP4)的mAS0326鼠单克隆抗体并选择抗体用于人源化。
使用标准技术对所有抗体进行氨基酸测序。
抗体人源化
使用专有技术，通过Genscript(www.Genscript.com)将mAS0326抗体进行人源化。对人种系进行可变结构域序列的blast处理，并从与小鼠抗体具有最高同一性的人FR中独立选择几个框架区FR1、FR2和FR3。使用重叠PCR，将所选的FR与mAS0326 CDR组装在一起，并构建用于Fab片段表达的噬菌体展示库。经过三轮淘选后，使用Genscript专有的FASEBA筛选方法选出高MFAP4蛋白结合噬菌体。从噬菌体DNA扩增所选择的Fab基因。将编码Fab的基因与编码人IgG1的适当恒定区的基因融合，以便生成完整的IgG。使用Biacore T200，选出hAS0326为该系列中最佳的重组人MFAP4结合物，并将所得的轻链和重链构建体克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1+中。
人源化抗体的表达和重组形式的MFAP4
根据制造商的方案，使用ExpiFectamine，用人MFAP4表达质粒(pcDNA 3.4-hMFAP4
Figure BDA0002472302670000141
)、小鼠MFAP4表达质粒(pcDNA5/FRT/V5-His
Figure BDA0002472302670000142
)、人MFAP4 RGD-AAA突变(pcDNA 3.1+)和hAS0326轻链和重链表达质粒(pcDNA3.1+-hAS0326轻链)和(pcDNA3.1+-hAS0326重链)转染ExpiCHO-S细胞(hAS0326轻链和hAS0326重链以摩尔比1：1共转染)。加入ExpiFectamine CHO增强剂和ExpiCHO Feed后，将细胞在8％CO2中于37℃振荡孵育10天。
重组形式的MFAP4的纯化
将释放到ExpiCHO-S细胞培养基中的重组MFAP4蛋白按照Lausen等人所描述的进行亲和纯化(J Biol Chem(1999)274(45):32234-40)，然后在
Figure BDA0002472302670000144
仪器(AmershamPharmacia Biotech)的Resource Q柱(GE Healthcare Life Sciences)上进行阴离子交换层析。通过SDS-PAGE测试蛋白质的纯度，然后使用SimplyBlueTM SafeStain(Invitrogen)进行考马斯染色。
抗体的纯化
使用标准Protein G纯化，在
Figure BDA0002472302670000143
仪器(Amersham Pharmacia Biotech)上纯化抗体。将培养上清液加到柱子上，并在PBS(0.5M NaCl)中洗涤柱子，并通过增加柠檬酸的浓度洗脱抗体。立即用Na2CO3中和含抗体的级分并合并。将合并的纯化抗体对PBS进行透析。
生物素化
将对磷酸盐缓冲液透析的抗体用3％(w/v)Na2CO3调节pH至8.5，并以0.17mg/mg蛋白的量添加生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma H-1759，40mg/ml在二甲基亚砜中)。将该混合物在约4℃孵育过夜(O.N)，并对PBS透析。
通过竞争性ELISA进行抗体的表位作图
将96孔板(Nunc-MaxiSorp)用0.5μg重组人MFAP4于PBS中4℃包被过夜，然后洗涤，然后在TBS/Tw中4℃封闭过夜。将生物素化的单克隆抗体(0.5μg/ml)和未标记的单克隆抗体(从20μg/ml至156ng/ml进行2倍稀释)在另一个微量滴定板于TBS/Tw中预先混合，然后添加到MFAP4包被的微量滴定板中。然后将板在室温下孵育2小时。将板在TBS/Tw中洗涤3次，并用在TBS/Tw中以1：2000稀释的链霉亲和素辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Invitrogen)孵育20分钟。经过三次最终洗涤后，通过加入溶解于底物缓冲液(0.03％新鲜制备的H2O2)中的邻苯二胺(OPD，0.8mg/ml，Kementec，Taastrup，Denmark)，并使其在暗处室温反应15分钟，来估算结合酶的量。通过添加100μl 1M H2SO4停止显色，并在OD492 nm处读取板，以OD600 nm作为参照。
测试抗体对重组小鼠MFAP4、重组人MFAP4和RGD序列突变为AAA序列的重组人 MFAP4的抗体的结合力
96孔板(Nunc-MaxiSorp)(NuncTM)用0.5μg重组小鼠MFAP4，重组人MFAP4和RGD序列突变为AAA的重组人MFAP4于PBS中4℃包被过夜。包被之后进行洗涤，然后在TBS/Tw中4℃封闭过夜。封闭后，添加从初始浓度100ng/ml经2倍稀释的生物素化抗体。然后将板于室温孵育2小时。将板在TBS/Tw中洗涤3次，并用在TBS/Tw中以1：2000稀释的链霉亲和素辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Invitrogen)孵育20分钟。最终三次洗涤后，通过加入溶解在底物缓冲液(0.03％新鲜制备的H2O2)中的OPD(0.8mg/ml，Kementec，Taastrup，Denmark)并在暗处室温反应15分钟来评估结合酶的量。通过添加100μl 1M H2SO4停止显色，并在OD492 nm处读取板，以OD600 nm作为参照。
夹心ELISA测定
在夹心ELISA测定中，将各种抗MFAP4抗体以1μg/ml的浓度固定在96孔板(Nunc-MaxiSorp)的孔中的PBS中，4℃过夜。在TBS/Tw中洗涤3次，然后用TBS/Tw于4℃封闭过夜。将这些板用两倍稀释的来自人、小鼠和来自MFAP4缺陷型小鼠的血清于4℃孵育过夜，血清最初1:50稀释，4℃过夜。将板在TBS/Tw中洗涤3次，然后与生物素化抗体(0.5μg/ml于TBS/Tw中)室温孵育2小时。然后将板在TBS/Tw中洗涤3次，并与在TBS/Tw中以1：2000稀释的链霉亲和素辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Invitrogen)孵育20分钟。最终三次洗涤后，通过加入溶解在底物缓冲液(使用前立即添加的0.03％H2O2)中的OPD(0.8mg/ml，Kementec，Taastrup，Denmark)并在暗处室温反应15分钟来评估结合酶的量。通过添加100μl 1M H2SO4停止显色，并在OD492nm处读取板，以OD600nm作为参照。
浓缩抗体用于聚集研究
使用Vivaspin 2离心浓缩器(Viva产品)浓缩Protein G纯化的抗体，然后在进行尺寸排阻色谱之前于4℃孵育2小时。浓缩抗体的纯度通过SDS-PAGE测试，然后使用SimplyBlueTM SafeStain(Invitrogen)进行考马斯染色。使用光密度测定(OD280)评估抗体浓度。
尺寸排阻色谱
使用50μl的浓缩抗体进行尺寸排阻色谱。将抗体样品以0.4ml/min的流速上样至与
Figure BDA0002472302670000161
系统相连的分析型Superose 6色谱柱，使用pH 7.4的PBS和0.05％emulphogene作为洗脱液。
动物伦理
根据英国内政部的许可，根据诺丁汉大学生物服务部的ARVO眼科和视觉研究中使用动物的声明，对小鼠和大鼠进行了治疗。
小鼠脉络膜新血管形成(CNV)模型
将雌性C57/BL6J小鼠用于该研究。通过腹膜内(IP)注射50mg/kg Ketaset(盐酸氯胺酮，Zoetis)麻醉动物，并用腹膜内注射0.5mg/kg的Sedastop(阿替美唑盐酸盐，Animalcare)恢复。通过局部应用5％苯肾上腺素盐酸盐(Bausch&Lomb)和0.8％托吡卡胺(Bausch&Lomb)扩张瞳孔，并用Lubrithal(Dechra)涂眼睛以防止脱水。
使用Meridian Merilas 532α绿激光光凝器以每只眼睛4个点的速度穿透两只眼睛，从而产生病变。用视网膜下气泡的存在来确定布鲁赫膜的成功破裂。对于每处光凝损伤，激光设置为在450mW保持130ms。
小鼠接受眼内注射1μg m/hAS0326、5μg m/hAS0326、1μg小鼠IgG(DAKO)或生理盐水作为对照，或1μg抗VEGF-A(Biolegend)。将抗体在无菌PBS中稀释至0.5μg/μl(对于5μg注射，稀释为2.5μg/μl)，并用细镊子稳定眼睛，用36号汉密尔顿针头(世界精密仪器公司)施予2μl。在第0天(病变后)和第7天施予抗体。
为了使体内的血管和病变发展(第7天和第14天)形象化，腹膜内注射200μl100mg/ml荧光素钠生理盐水溶液(Sigma-Aldrich)，并且允许在Micron IV视网膜成像显微镜(Phoenix Research Labs)成像之前进行循环。白内障的发展意味着一些眼睛将从随后的眼底荧光素血管造影术(FFA)中排除。
在动物终止并进行眼解剖(第14天)后，将脉络膜固定并封闭在血清(5％山羊血清，3％Triton X-100，1％BSA)中，并用Isolectin-B4(IB4)(Sigma Aldrich，生物素偶联)5μg/ml和CD45(Abcam)5μg/ml于4℃染色过夜。用链霉亲和素偶联的Alexafluor 488 2μg/ml和驴抗兔Alexafluor 555 4μg/ml分别检测IB4和CD45染色。盖玻片用带有DAPI的Fluoroshield固定。使用Leica TCS SPE共聚焦显微镜获得图像，并且在成像之间保持所有设置。用Imaris(Bitplane，UK)直接测量以μm2为单位的病变和炎性细胞面积。任何合并的病变、或者对侧眼睛有烧伤，测量与平均值的偏差大于2个标准偏差的动物，均从分析中排除。
大鼠链脲佐菌素(STZ)-诱导的糖尿病模型
为诱发糖尿病，对雄性挪威布朗大鼠(250-300g，Envigo，US)进行了单次IP注射链脲佐菌素(STZ，50mg/kg，Sigma-Aldrich)。对照大鼠经IP注射300μl生理盐水。皮下植入三分之一的胰岛素颗粒(LinShin)，以在接下来的4周内保持体重。诱导后第4天，从尾静脉采血并测量血糖水平。血糖>15mmol/l的大鼠被认为患有糖尿病。经STZ注射的大鼠在第4天未出现高血糖的，于次日早晨再次注射STZ。
用3-5％异氟烷(IsoFlo，Abbott Laboratories)麻醉大鼠，通过局部施予5％苯肾上腺素盐酸盐(Bausch&Lomb)和0.8％托吡卡胺(Bausch&Lomb)扩张瞳孔，并用Lubrithal(Dechra)涂眼睛防止脱水。动物接受眼内注射1μg m/hAS0326、5μg m/hAS0326、生理盐水作为对照，或1μg抗VEGF-A(Biolegend)。将抗体在无菌PBS中稀释至0.5μg/μl(对于5μg注射，为2.5μg/μl)，并用细镊子稳定眼睛，用36号汉密尔顿针头(世界精密仪器公司)施予2μl。在第0天(糖尿病病变后)和第7天(糖尿病病变后)施予抗体。
为了使体内的血管和病变发展(第0、7天、14和21天)形象化，腹膜内注射200μl100mg/ml荧光素钠生理盐水溶液(Sigma-Aldrich)，并且允许在Micron IV视网膜成像显微镜(Phoenix Research Labs)成像之前进行循环。白内障的发展意味着一些眼睛将从随后的眼底荧光素血管造影术(FFA)中排除。
Ved N,Clin Sci(Lond)2017早先描述了伊文思蓝(Evans Blue)染料的制备、施用以及通过溶解对眼部血管通透性进行连续监测。
统计数据
所有统计数据和图表均在GraphPad Prism 6中生成。显示的统计数据用于治疗组之间的比较。使用Kruskall-Wallis检验和Dunn的多重比较检验进行比较。图表上的显着差异用星号表示，其中：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
实施例2-hAS0326和mAS0326对rhMFAP4相互作用的KD评估
目的
为了评估hAS0326和mAS0326与rhMFAP4之间的相互作用的KD值。
材料和方法
使用GenScript的Biacore T200进行目标抗体和rhMFAP4之间的结合相互作用。
结果
抗体 K<sub>D</sub>
hAS0326 1.14*10<sup>-9</sup>M.
嵌合抗体(具有人Fc的mAS0326，CHO表达) 5.04*10<sup>-10</sup>M
mAS0326 1.4<sup>-10</sup>M
结论
这些结果表明，hAS0326是一种高亲和力抗体，KD在纳摩尔范围内。hAS0326具有的rhMFAP4亲和力比mAS0326低，但仍保持高亲和力。
实施例3-产生的单克隆抗体中CDR序列的比对
产生的抗体HG Hyb 7-5，HG Hyb 7-1，mAS0326和hAS0326之间的CDR同源性如图1所示。
HG Hyb 7-1，mAS0326和hAS0326的重链CDR序列之间100％同源性。
HG Hyb 7-5和hAS0326重链CDR之间<50％同源性。
mAS0326和hAS0326的轻链CDR序列之间100％同源性。
HG Hyb 7-1或HG Hyb 7-5与hAS0326轻链CDR之间<50％同源性。
实施例4-单克隆抗体之间的重链和轻链可变域同源性
hAS0326重链可变域与产生的小鼠单克隆抗体具有以下同源性：
HG Hyb 7-1:78.7％
HG Hyb 7-5:66.1％
mAS0326:78.7％
hAS0326轻链可变域与产生的小鼠单克隆抗体具有以下同源性：
HG Hyb 7-1:66.4％
HG Hyb 7-5:61.7％
mAS0326:79.4％
结论
所有同源性均＜80％，这表明hAS0326氨基酸序列相对于其他测试的抗体(包括先前专利申请中提出的抗体)显著不同。
实施例5-hAS0326/mAS0326与HG HYB7-5相比的MFAP4结合特性
目的
评估hAS0326/mAS0326与HG HYB7-5相比的MFAP4结合特性。
结果
利用竞争性ELISA设置证明，与hAS0326和mAS0326相比，HG HYB7-5具有不同的表位(图2)。在使用纯化的重组小鼠MFAP4、重组人MFAP4，以及RGD整联蛋白结合基序突变为AAA的重组人MFAP4进行的直接结合测定中，证明了RGD基序是HG HYB7-5表位的重要组成部分，而它并非hAS0326/mAS0326表位的一部分(图3A和3B)。此外，已证明尽管hAS0326/mAS0326同样地与人和小鼠MFAP4结合，但HYB7-5却不与小鼠MFAP4结合(图3C)。
使用天然小鼠和人MFAP4来源的血清，图4证明HG HYB 7-5不结合小鼠MFAP4，而hAS0326/mAS0326会结合。
结论
序列同源性和表位重叠的研究表明，HG Hyb 7-5和mAS0326(和hAS0236)具有较低的CDR/可变链同源性，并且它们识别不同的重组MFAP4表位。另外，证明了HG Hyb 7-5识别rhMFAP4中的RGD-整联蛋白相互作用域，而mAS0326(和hAS0236)不与重组人MFAP4中的RGD-整联蛋白相互作用域反应。此外，证明了AS0326与鼠MFAP4具有相互作用，而HG HYB 7-5没有。
实施例6-抗体聚集
目的
比较hAS0326和mAS0326的聚集特性
结果
在浓缩抗体溶液后，证明了hAS0326和mAS0326的聚集特性不同(图5)。hAS0326基本保持单体形式。相反，mAS0326形成聚集体。
结论
hAS0326在溶液中比mAS0326更稳定，后者在制备后不久就形成聚集体，因此不适合临床使用。hAS0326的聚集少表明该抗体可适合以目前形式用于临床。
实施例7-mAS0326在湿性年龄诱发的黄斑变性(湿性AMD)的小鼠激光诱发的脉络膜新血管形成(CNV)模型中减少眼血管生成，血管渗漏和炎症的能力
目的
评估mAS0326在湿性年龄诱发的黄斑变性(湿性AMD)的小鼠激光诱发的脉络膜新血管形成(CNV)模型中减少眼血管生成，血管渗漏或炎症的能力。
结果
激光诱导的CNV后第7天和第14天，注射荧光素钠突出了眼内的脉管系统，并显示出激光灼伤和渗漏区域。在第7天，IgG阴性对照和抗-VEGF阳性对照之间没有显著差异(图6A)。与抗VEGF阳性对照相比，用5μg mAS326处理可显著减少病变大小(P<0.05)。
在第14天，在剔除和组织收集之前立即进行进一步的荧光素血管造影。如在第7天所见，与IgG对照相比，5μg mAS0326能够显著减小病变大小(p<0.01，未在图中显示)(图6B)。然而，治疗组之间没有发现显著差异。与图6B中的观察结果一致，用内皮标记物IB4染色脉管系统显示，任何治疗组之间的灼伤面积没有显著差异(图6C)。
对脉络膜进行CD45表达免疫染色，以检测炎性细胞浸润到激光烧伤区域中(图6D)。相对于IgG阴性对照，1μg抗VEGF和5μg mAS0326处理均显著降低了炎症细胞浸润(分别为p<0.01和p<0.0001，统计数据未在图中显示)。此外，相对于1μg抗VEGF阳性对照，5μgmAS0326处理显著降低了炎症细胞浸润(p<0.01)。
结论
对于湿性AMD的小鼠CNV中进行的mAS0326功效研究显示了对病理性眼部血管生成、血管渗漏和炎症的有益作用的概念验证。所观察到的功效类似于和/或优于标准治疗抗-VEGF的功效。
实施例8-hAS0326减少小鼠激光诱导的湿性AMD CNV模型中眼血管生成，血管渗漏和炎症的能力
目的
在小鼠激光诱导的湿性AMD CNV模型中评估hAS0326减少眼血管生成，血管渗漏或炎症的能力。
结果
与上述mAS0326 CNV试验相反(实施例7)，在使用生理盐水作为阴性对照的hAS0326 CNV试验中，对照治疗组的区分是很清晰的。在第7天，与生理盐水阴性对照相比，所有治疗组的病变大小均显著减小(p<0.0001-p<0.05，统计未显示)(图7A)。与抗VEGF阳性对照相比，用5μg hAS326治疗可显著减小病变大小(分别为p<0.001和<0.0001)(图7B)。在各hAS0326治疗组之间，病变大小无显着差异，并且将hAS0326与抗VEGF治疗联合使用无明显效果。
与盐水对照治疗相比，所有治疗组均显著减少了内皮标记物IB4对脉管系统的染色(统计数据未显示)(图7C)。在任何治疗组之间，IB4定义的灼伤面积均无显著差异(图7C)。
针对CD45表达的脉络膜免疫染色显示，相对于IgG阴性对照，所有治疗组均显著降低了炎性细胞浸润(统计数据未在图中显示)。与所有其他治疗组相比，联合治疗显著降低了炎性浸润(图7D)。
结论
对于湿性AMD的小鼠CNV中进行的hAS0326功效研究显示了对病理性眼部血管生成、血管渗漏和炎症的有益作用的概念验证。mAS0326出现的定性反应与hAS0326相同。与hAS0326相反，mAS0326治疗降低CNV模型中眼部病变大小的能力与抗-VEGF治疗组无显著差异。在CNV模型中，观察到的hAS0326功效类似于和/或优于标准治疗抗-VEGF的功效，并且在降低炎症方面，用抗VEGF和hAS0326联合治疗优于单独使用任一化合物治疗。
实施例9-hAS0326减少糖尿病性视网膜病变的大鼠链脲佐菌素(STZ)模型中眼部血管生成的能力
目的
评估hAS0326减少糖尿病性视网膜病变的大鼠链脲佐菌素(STZ)模型中眼部血管生成的能力。
结果
STZ模型发病前，治疗组的血管面积之间无统计学差异(图8A)。诱发高血糖的STZ治疗开始后21天(数据未显示)，与生理盐水阴性对照组相比，单独5μg hAS0326治疗或1μg抗-VEGF和5μg hAS0326联合治疗均明显减小了病变大小(分别p<0.001和p<0.0001，统计数据未显示)(图8B)。比较治疗效果时，与抗-VEGF阳性对照相比，用1μg抗-VEGF和5μghAS0326联合治疗可显著减小病变大小(p<0.05)(图8B)。
结论
hAS0326在减少糖尿病性视网膜病变大鼠链脲佐菌素(STZ)模型中血管渗漏的功效研究显示了与抗-VEGF相当的有益作用的概念验证。
实施例10-低pH和热应激诱导单克隆抗体HG HYB 7-5，HG HYB 7-14，mAS0326和hAS0326的聚集，并显示出hAS0326的优异稳定性
目的
为了评估和比较HG Hyb 7-5(HYB7-5)，HG Hyb 7-14(HYB7-14)，mAS0326和hAS0326的稳定性，我们对单克隆抗体(Mabs)进行了热应力。通过将单克隆抗体置于低pH和高温条件下，诱导单克隆抗体的高分子形式(聚集体)的形成，并通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析可溶性聚集体。用离心然后测量蛋白质浓度来检验不溶性聚集体的量。
材料与方法
尺寸排阻色谱
使用5ml HiTrap柱蛋白A(GE Healthcare)纯化HG Hyb 7-5，HG Hyb 7-14，mAS0326和hAS0326，在25mM Tris，25mM NaCl pH 7.2中洗涤，然后在100mM柠檬酸pH 3.5中洗脱。作为病毒灭活步骤，将单克隆抗体在洗脱缓冲液中孵育30分钟，然后使用1M tris pH8.6调节至pH 5。在50℃下孵育5天和10天后，通过尺寸排阻色谱分析样品。将6mg/ml的每种应力样品制备的30μl上清液(每种受压样品)注入到色谱柱(来自Thermo Scientific的MabPac SEC-1)中于25℃操作，并记录280nm处的吸光度。流速为0.76ml/min，总洗脱时间为30min。流动相包含50mm磷酸钠，pH 6.8和300mm氯化钠。高分子量(HMW)峰包括排除体积与抗MFAP4(单体)峰起点之间范围内的所有峰。其积分面积视为占总的峰积分面积的百分比。
聚集体浓度
为了评估以聚集体形式存在的原始蛋白质的百分比，将在50℃放置10天后的应力样品以12,000rpm离心以沉淀不溶物，并通过在NanoDrop ONE紫外可见分光光度计上测量A280来确定离心前后的蛋白质浓度(Thermo Scientific)。
结果
通过SEC观察到单克隆抗体的三种高分子量形式，它们的保留体积如表1所示，其保留体积与单体的单克隆抗体hAS0326相比有所降低。因此，表1显示了汇集所有实验的通过尺寸排阻色谱法(来自Thermo Scientific的Mab Pac SEC-1柱)观察到的高分子量(HMW)形式(聚集体)以及它们各自的保留体积的概况。
表1
类型 大约体积(ml)
HMW1 6.1
HMW2 7.7
HMW3 8.1
抗-MFAP4 hAS0326(单体) 10.1
HMW＝高分子量：1HMW1>HMW2>HMV3>抗-MFAP4 hAS0326(单体)
低pH压力测试
将单克隆抗体在蛋白A柱上并行纯化，然后在pH3.5进行病毒灭活步骤30分钟。表2显示了低pH值病毒灭活步骤后，抗MFAP4单克隆抗体高分子量(HMV)形式的分布，仅HG Hyb7-14和hAS0326表现出单分散分布。因此，表2显示了在蛋白A纯化和在pH3.5病毒灭活30分钟后，通过尺寸排阻色谱法(可溶性HMW形式)观察到的抗MFAP4和HMW的百分比。
表2
样品 ％抗-MFAP4(单体) ％HMW1 ％HMW2 ％HMW3
HG Hyb 7-5 97.7％ 0.0％ 0.0％ 2.3％
HG Hyb 7-14 100.0％ 0.0％ 0.0％ 0.0％
mAS0326 96.8％ 0.0％ 0.0％ 3.2％
hAS0326 100.0％ 0.0％ 0.0％ 0.0％
以时间间隔进行热应力测试
进行单克隆抗体的热应力测试，并在第5天和第10天使用SEC分析样品，以评估可溶性HMW形式的量。如表3和表4所示，hAS0326在两种情况下均显示出最低量的HMW形式。因此，表3显示了在50℃热应力5天后通过尺寸排阻色谱法观察到的抗-MFAP4和HMW形式的百分比，表4显示了在50℃热应力10天后通过尺寸排阻色谱法观察到的抗MFAP4和HMW形式的百分比。
表3
Figure BDA0002472302670000241
表4
样品 ％抗-MFAP4(单体) ％HMW1 ％HMW2 ％HMW3
HG Hyb 7-5 84.6％ 13.8％ 0.0％ 1.6％
HG Hyb 7-14 90.8％ 8.9％ 0.0％ 0.3％
mAS0326 91.7％ 8.2％ 0.0％ 0.1％
hAS0326 96.4％ 0.0％ 2.5％ 2.1％
为了评估原始蛋白质作为不溶性聚集体的百分比，将应力样品(热应力在50℃)以12,000rpm离心30分钟以沉淀不溶性物质，并通过在NanoDrop ONE(Thermo Scientific)上测量A280来确定离心前后的蛋白质浓度(Thermo Scientific)。由此获得的结果显示在表5中，说明与mAS0326和HG Hyb 7-1不同，hAS0326在50℃放置10天后未形成任何不溶性聚集体。
表5
样品 前<sup>*</sup> 后<sup>**</sup>
HG Hyb 7-5 100％ 100％
HG Hyb 7-14 100％ 71％
mAS0326 100％ 51％
hAS0326 100％ 100％
*热应激前的可溶性蛋白
**热应激后的可溶性蛋白(10天)
结论
与mAS0326，HG Hyb 7-5和HG Hyb 7-14相比，hAS0326在低pH和热应力后的聚集体形成明显降低，表明hAS0326的稳定性明显更高。
实施例11-抑制MFAP4诱导的视网膜内皮细胞迁移-体外研究
目标
为了研究hAS0326及其变体对阻断MFAP4诱导的细胞活化的作用，进行了视网膜内皮细胞迁移试验。测试了全长hAS0326，抗原结合片段(Fab)和F(ab’)2(包括两个Fab)。
材料与方法
全长抗体和抗体变体的表达
按照制造商的建议，在EXPI CHO细胞(Thermo Scientific)中表达全长和抗体片段。
内皮迁移试验
本实验是使用改良的Boyden迁移测定法和人视网膜微血管内皮细胞(Neuromics)进行。将10μg/cm2的重组人MFAP4涂在8μm Transwell过滤器(Falcon cat#35097)的下侧于4℃过夜，然后在PBS中洗涤。将含有0.5％FBS的0.5ml内皮基础培养基(PromoCell)中的50.000个细胞添加到过滤器的顶部，并将含有0.5％FBS的1ml内皮基础培养基添加到过滤器的底部。为了抑制迁移，在下腔室中加入各种单克隆抗体和单克隆抗体变体以及VEGF(25ng/ml)。3.5小时后，通过在上表面轻轻擦拭棉芽，然后在PBS中洗涤，除去未迁移的细胞，然后用Reastain Quick-Diff试剂盒(Gentaur Molecular Products)对过滤器进行染色。在明视野显微镜下(放大200倍)对穿过膜的细胞进行计数。
结果
全长和抗体片段都能够抑制内皮迁移，但效率不同。全长hAS0326显著抑制了内皮迁移，而hAS0326的重组Fab片段即使在剂量增加时也无法推断出相同程度的抑制作用(图9A)。
hAS0326的F(ab’)2片段抑制迁移的程度与hAS0326相似(图9B)。公认的是，如果可以产生有效的F(ab)’(与完整抗体相比，其在体外的表现良好)，它们在体内可能比完整的抗体更好地发挥作用，因为使用免疫球蛋白片段消除了抗体的Fc部分与细胞上Fc受体之间的非特异性结合。因此，hAS0326的有效F(ab’)2片段的产生使其成为有希望的候选者。
结论
这项体外试验证明了全长hAS0326，hAS0326 Fab和hAS0326 F(ab’)2抑制内皮迁移的能力，即使效率不一样。
实施例12-表位和互补位之间相互作用的X射线晶体学
目的
用X射线晶体学来确定对于结合至MFAP4的表位来说重要的互补位氨基酸。
材料和方法
对于Fab生成，将抗-MFAP4用固定的木瓜蛋白酶珠(Thermo science)在20mM磷酸钠，10mM EDTA和20mM L-半胱氨酸pH 7.4中于37℃孵育4小时。通过离心使珠粒沉淀，并将上清液上样到于50mM乙酸钠pH 5.5中平衡的1ml Mono S柱上。用20至500mM的NaCl梯度洗脱Fab，随后通过尺寸排阻色谱法在24ml Superdex 200increase(在20mM Hepes，150mMNaCl pH 7.4中平衡)上纯化。结晶之前，将MAP4用自行制备的糖苷内切酶H于4℃进行18个小时的去糖基化。将去糖基化的MFAP与过量的Fab混合，并将该复合物在24ml Superdex200Increase(在20mM Hepes pH 7.4、150mM NaCl中平衡)上纯化。将0.5μl蛋白质与含0.14M磷酸氢二铵，14％w/v聚乙二醇3,350的0.5μl池液混合后，将分离的复合物浓缩至6mg/ml，然后于19℃通过蒸汽扩散进行结晶。在收集数据之前，将晶体浸泡在补充有20％甘油的池液中，并在液氮中快速冷却。
在ESRF ID23-1上收集衍射数据，并使用XDS和XSCALE进行处理和缩放(Kabsch,W.(2010)Acta crystallographica.Section D,Biological crystallography 66,133-144)。使用单体FIBCD1的结构(PDB ID 4M7H)和种系Fab(PDB ID 4JPI)作为搜索模型，通过用Phaser进行分子替代来确定结构(McCoy,A.J.,Grosse-Kunstleve,R.W.,Adams,P.D.,Winn,M.D.,Storoni,L.C.,and Read,R.J.(2007)Journal of applied crystallography40,658-674)。以迭代的方式在Coot中手动重建结构，并用Phenix.refine(Afonine,P.V.etal.(2012)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 68,352-367)利用位置精修、分组B因子和TLS组以及位置非晶体对称性约束对其进行精修。模型的蛋白质部分完成后，利用分子动力学约束的真实空间拟合将结构拟合到电子密度图(Croll,T.I.,et al.(2016)ActaCrystallogr D Struct Biol 72,1006-1016)。随后，将Ca2+离子和两个配位水分子插入各个位点，并根据FIBCD1中所观察的来约束钙-配体配位几何(Shrive,A.K.et al.(2014)JBiol Chem 289,2880-2887)。在最后的精修周期中，除了位置精修之外，还允许几个周期的个别B因子精修。考虑了衍射数据的分辨率，最终结构经Molprobity验证显示出出色的立体化学(Chen,V.B.et al.(2010)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66,12-21)。利用PyMol 1.8.6(Schrodinger,LLC.(2015)The PyMOL Molecular Graphics System,Version1.8.)和PISA(Krissinel,E.et al.(2007)J Mol Biol 372,774-797)以及在PyMol中制作的图来分析分子间界面。
结果
互补位的强烈相互作用和包装的氨基酸包括可变重链中所有三个CDR的残基，而可变轻链中仅两个CDR，即CDR1和CDR3显示出与MFAP4中的表位强烈相互作用的氨基酸。
可变重链中的强烈相互作用氨基酸如下：
在CDR1中：SEQ ID NO：2和4的Tyr-33；SEQ ID NO：12的Tyr-3；
在CDR3中：SEQ ID NO：2和4的Glu-99；SEQ ID NO：14的Glu-1；
在CDR3中：SEQ ID NO：2和4的Trp-107；SEQ ID NO：14的Trp-9。
可变轻链中的强烈相互作用氨基酸如下：
在CDR1中：SEQ ID NO：1和3的Tyr-32；SEQ ID NO：9的Tyr-9；
在CDR3中：SEQ ID NO：1和3的Tyr-94；SEQ ID NO：11的Tyr-6。
结果进一步证明，可变重链中的两个氨基酸对于包装，即互补位的正确折叠是重要的：在CDR1中：SEQ ID NO：2和4的Met-34；SEQ ID NO：12的Met-4；
在CDR2中：SEQ ID NO：2和4的Pro-53；SEQ ID NO：13的Pro-4。
结论
X射线晶体学成功明确了hAS0326互补位及其与MFAP4表位的结合。分析显示，互补位的五个氨基酸与表位强烈结合，并且两个氨基酸对于包装(packaging)很重要。因此，可以假设定点诱变这些氨基酸中的一个或多个可消除或减弱互补位与表位的结合。
SEQUENCE LISTING
<110> 赛丹思科大学
<120> 针对MFAP4的抗体
<130> 62429PC01
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 1
Asp Val Gln Ile Ile Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Arg Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Ser Glu Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Met Trp Asn Tyr Gly Asn Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 122
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 4
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Met Trp Asn Tyr Gly Asn Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 113
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Val Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Ser Thr Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 6
<211> 122
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Ser Glu Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Met Trp Asn Tyr Gly Asn Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 108
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Ser Trp
35 40 45
Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 8
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Glu Ile Phe Phe Asp Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 9
Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 10
Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 11
Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Phe Thr Phe
1 5 10
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 12
Ser Tyr Trp Met His Trp
1 5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 13
Val Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Ser
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 抗体序列
<400> 14
Glu Met Trp Asn Tyr Gly Asn Ser Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10

Claims (17)

1.一种蛋白质配体，例如一种抗体，包括
轻链可变区，包括如SEQ ID NO：9所示的CDR1区，如SEQ ID NO：10所示的CDR2区，和如SEQ ID NO：11所示的CDR3区；和
重链可变区，包括如SEQ ID NO：12所示的CDR1区，如SEQ ID NO：13所示的CDR2区，和如SEQ ID NO：14所示的CDR3区。
2.一种蛋白质配体，例如一种抗体，或者如权利要求1所述的配体，包括
轻链可变区，包括如SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1或3具有至少80％序列同一性，例如至少90％序列同一性，或者例如至少95％序列同一性的序列；和
重链可变区，包括如SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2或4具有至少80％序列同一性，例如至少90％序列同一性，或者例如至少95％序列同一性的序列。
3.如权利要求1或2所述的配体，包括
轻链可变区，包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列；和
重链可变区，包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
4.如前述权利要求中任一项所述的配体，其中所述配体选自多克隆抗体、单克隆抗体、其中所述重链和轻链通过柔性接头连接的抗体、Fv分子、抗原结合片段、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2分子、全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。
5.如前述权利要求中任一项所述的配体，其中所述配体是F(ab’)2分子。
6.如前述权利要求中任一项所述的配体，其中所述配体是人源化的，优选地是人源化单克隆抗体。
7.如前述权利要求中任一项所述的配体，与检测标记或具有毒性或治疗活性的物质偶联。
8.如前述权利要求中任一项所述的配体，对rhMFAP4的KD值低于1*10-7，例如低于1*10-8，或者例如低于1*10-9M，或者例如在1*10-7至1*10-12M的范围，或者例如在1*10-7至1*10-10M的范围。
9.如前述权利要求中任一项所述的配体，主要为单体形式。
10.如前述权利要求中任一项所述的配体，其中所述配体不结合rhMFAP4N-末端结构域中的RGD-整联蛋白相互作用序列。
11.一种编码如前述权利要求中任一项所述的配体的载体。
12.一种表达如权利要求1-10中任一项所述的配体的细胞，和/或包括如权利要求11所述的载体的细胞。
13.一种组合物，包括如权利要求1-10中任一项所述的配体，和一种或多种生理学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
14.如权利要求1-10中任一项所述的配体和/或如权利要求13所述的组合物，作为药物的用途。
15.如权利要求1-10中任一项所述的配体或如权利要求13所述的组合物，在预防或治疗哺乳动物中，例如以眼睛的病理性新血管形成、血管渗漏、炎症或纤维化为特征的血管增生性疾病和/或相关疾病中的用途。
16.如权利要求15所述的用途的配体或组合物，其中以眼睛的病理性新血管形成为特征的疾病选自年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括地理萎缩和增生性AMD，视网膜静脉阻塞，视网膜病变，高血压性视网膜病变，玻璃体牵引，和糖尿病性视网膜病变(DR)，包括增生性DR和糖尿病性黄斑水肿。
17.如权利要求15所述的用途的配体或组合物，其中所述血管增生性疾病和/或相关疾病是癌症或其他恶性肿瘤。
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