JP7382343B2 - Ｍｆａｐ４に対する抗体 - Google Patents
Ｍｆａｐ４に対する抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7382343B2 JP7382343B2 JP2020558681A JP2020558681A JP7382343B2 JP 7382343 B2 JP7382343 B2 JP 7382343B2 JP 2020558681 A JP2020558681 A JP 2020558681A JP 2020558681 A JP2020558681 A JP 2020558681A JP 7382343 B2 JP7382343 B2 JP 7382343B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mfap4
- antibody
- seq
- amino acid
- has0326
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101000947699 Homo sapiens Microfibril-associated glycoprotein 4 Proteins 0.000 title claims description 79
- 102100036103 Microfibril-associated glycoprotein 4 Human genes 0.000 title claims description 60
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 60
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 41
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 37
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 34
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 27
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 14
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 14
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 13
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 13
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 8
- 208000034038 Pathologic Neovascularization Diseases 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 206010012688 Diabetic retinal oedema Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008069 Geographic Atrophy Diseases 0.000 claims description 3
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 3
- 201000011190 diabetic macular edema Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038926 Retinopathy hypertensive Diseases 0.000 claims description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims description 2
- 201000001948 hypertensive retinopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 claims 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 75
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 58
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 208000005590 Choroidal Neovascularization Diseases 0.000 description 23
- 206010060823 Choroidal neovascularisation Diseases 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 21
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 18
- 102000044791 human MFAP4 Human genes 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 16
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 16
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 12
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 12
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 12
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 101100023106 Mus musculus Mfap4 gene Proteins 0.000 description 9
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 9
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 9
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 9
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 9
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 9
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 9
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 8
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000000208 Wet Macular Degeneration Diseases 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 8
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 7
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 7
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 7
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 7
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Substances OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000013534 fluorescein angiography Methods 0.000 description 7
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 5
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 4
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 4
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 4
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 4
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 101710138747 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(3-oxido-6-oxoxanthen-9-yl)benzoate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=O)C=C2OC2=CC([O-])=CC=C21 NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000008650 pH stress Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 2
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N Tropicamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CO)C(=O)N(CC)CC1=CC=NC=C1 BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 2
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 2
- 229960003733 phenylephrine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- OCYSGIYOVXAGKQ-FVGYRXGTSA-N phenylephrine hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].CNC[C@H](O)C1=CC=CC(O)=C1 OCYSGIYOVXAGKQ-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 2
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229960004791 tropicamide Drugs 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C1C(C(O)=O)N(C(=O)OC(C)(C)C)CC1NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCCVCJAQMHDWJY-UHFFFAOYSA-N 5-(2-ethyl-1,3-dihydroinden-2-yl)-1h-imidazole;hydrochloride Chemical compound Cl.C1C2=CC=CC=C2CC1(CC)C1=CN=CN1 PCCVCJAQMHDWJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 5-aminoisoindole-1,3-dione Chemical compound NC1=CC=C2C(=O)NC(=O)C2=C1 PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 101100126625 Caenorhabditis elegans itr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000005696 Diammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100040777 Fibrinogen C domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010018429 Glucose tolerance impaired Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000892088 Homo sapiens Fibrinogen C domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- 101000851018 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 101100426589 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) trp-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241000404883 Pisa Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 208000001280 Prediabetic State Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101000781681 Protobothrops flavoviridis Disintegrin triflavin Proteins 0.000 description 1
- 101000877889 Pseudomonas putida Flavin reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000032594 Vascular Remodeling Diseases 0.000 description 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- -1 antibodies Substances 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 229960001352 atipamezole hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000000339 bright-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000005119 human aortic smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001631 hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229940101737 isoflo Drugs 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 229960004184 ketamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 229940015418 ketaset Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 208000013441 ocular lesion Diseases 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000000649 photocoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 201000009104 prediabetes syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、一般に抗体医薬およびその用途に関する。本発明は特に新規抗体、とりわけヒトミクロフィブリル関連タンパク質4（MFAP4）と結合するヒト化モノクローナル抗体に関する。
MFAP4は、潜在的なインテグリン結合性RGD配列と、これに続くフィブリノーゲン関連ドメイン（FReD）を含む短いＮ末端領域を含む36kDaの糖タンパク質である。このタンパク質は自然の条件下ではホモオリゴマー構造を形成する。FReD（複数）は、凝固、血管新生、組織成長やリモデリングおよび先天性免疫などの種々の機能に関与する種々のヒトタンパク質群に見られる。
MAGP-36/MFAP4は、アミノ酸組成と動脈中のECMに局在している点で、テネイシンに似たタンパク質であると最初は同定された。MAGP-36は、エラスチン、コラーゲン、またはカルバスクリンを含むECM線維と直接相互作用することがその後示された。MAGP-36と細胞インテグリン受容体との相互作用は、固定化MAGP-36に結合したヒト大動脈平滑筋細胞のRGD含有ペプチドによる阻害を用いて示された。
WO 2014/114298はMFAP4を標的とする種々の抗体（HG-HYB 7-5を含む）を開示する。
WO 2016/008498もMFAP4を標的とする抗体（HG-HYB 7-1を含む）を開示する。
WO 2014/114298はMFAP4を標的とする種々の抗体（HG-HYB 7-5を含む）を開示する。
WO 2016/008498もMFAP4を標的とする抗体（HG-HYB 7-1を含む）を開示する。
したがって、MFAP4に対する改良された抗体が有益であり、特にMFAP4に結合する、より効率のよい、および／または信頼性のある抗体が有益である。さらに、MFAP4抗体の新規用途が有益である。
発明の概要
本発明は、ヒト化抗体を含む、MFAP4を標的とする新規抗体を提供する。これらの抗体は、MFAP4を標的とする公知の抗体と比べて異なる配列と異なる結合特性をもつ。全てのRGD依存性インテグリンがこのRGD部位と相互作用する可能性があるが、インテグリンaVb3/5が、血管リモデリング、血管新生、血管漏出および炎症の研究と高度に関連する。
本発明は、ヒト化抗体を含む、MFAP4を標的とする新規抗体を提供する。これらの抗体は、MFAP4を標的とする公知の抗体と比べて異なる配列と異なる結合特性をもつ。全てのRGD依存性インテグリンがこのRGD部位と相互作用する可能性があるが、インテグリンaVb3/5が、血管リモデリング、血管新生、血管漏出および炎症の研究と高度に関連する。
本発明による抗体の医薬用途を実施例の部において記載する。
したがって、本発明の目的はMFAP4を標的とする新規リガンド（抗体）を提供することである。特にMFAP4に対するヒト化抗体を提供することが本発明の目的である。
よって、本発明の一面はMFAP4の新規エピトープに結合する抗体などのタンパク質リガンドに関する。
本発明の別の一面は、以下のものを含む、抗体などのタンパク質リガンドまたは本発明のリガンドに関する：
・配列番号9のCDR1領域、配列番号10のCDR2領域、および配列番号11のCDR3領域を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号12のCDR1領域、配列番号13のCDR2領域、および配列番号14のCDR3領域を含む重鎖可変領域。
・配列番号9のCDR1領域、配列番号10のCDR2領域、および配列番号11のCDR3領域を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号12のCDR1領域、配列番号13のCDR2領域、および配列番号14のCDR3領域を含む重鎖可変領域。
本発明のさらに別の一面は、以下のものを含む、抗体などのタンパク質リガンドまたは本発明のリガンドを提供する：
・配列番号1または3のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列1または3と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、または少なくとも95％の配列同一性をもつ配列を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号2または4のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列2または4と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、または少なくとも95％の配列同一性をもつ配列を含む重鎖可変領域。
・配列番号1または3のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列1または3と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、または少なくとも95％の配列同一性をもつ配列を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号2または4のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列2または4と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、または少なくとも95％の配列同一性をもつ配列を含む重鎖可変領域。
本発明のさらに別の一面は本発明のリガンドをコードするベクターを提供することである。
さらなる一面は本発明のリガンドを発現する細胞、および／または本発明のベクターを含む細胞に関する。
さらに別の一面は本発明のリガンド、および１以上の生理学的に受容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤を含む組成物に関する。
さらなる一面は本発明のリガンドおよび／または本発明の組成物を医薬として用いることに関する。
さらに別の一面は本発明のリガンドまたは本発明の組成物を、哺乳動物における病理学的増殖または血管漏出または炎症または繊維症および／または関連疾患で特徴づけられる血管疾患の予防または治療に用いることに関する。
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
発明の詳細な説明
定義
本発明をさらに詳細に議論する前に、以下の用語と慣例をまず定義する。
本発明のリガンド（抗体や抗原結合ドメインなど）はMFAP4と選択的に結合する、すなわち他の抗原よりも大きな結合アフィニティでMFAP4と優先的に結合する。当該抗体はヒトMFAP4と選択的に結合しうるが、また非ヒトMFAP4、たとえばネズミMFAP4とも検出可能的に結合しうる。あるいは、当該抗体はヒトMFAP4と限定的に結合して、非ヒトMFAP4とは検出可能な結合をしない。
発明の詳細な説明
定義
本発明をさらに詳細に議論する前に、以下の用語と慣例をまず定義する。
本発明のリガンド（抗体や抗原結合ドメインなど）はMFAP4と選択的に結合する、すなわち他の抗原よりも大きな結合アフィニティでMFAP4と優先的に結合する。当該抗体はヒトMFAP4と選択的に結合しうるが、また非ヒトMFAP4、たとえばネズミMFAP4とも検出可能的に結合しうる。あるいは、当該抗体はヒトMFAP4と限定的に結合して、非ヒトMFAP4とは検出可能な結合をしない。
用語「タンパク質リガンド」は、抗体またはその断片のような、主としてアミノ酸から構成されるリガンドをいう。また、本明細書に開示するように、タンパク質リガンドは検出可能な標識または毒性あるいは治療活性を有する物質のような部分を含んでいてもよい。
用語「モノクローナル抗体」は、本質的に均一な抗体の集合から得られる抗体をいい、ここで各モノクローナル抗体は典型的に抗原上の１つのエピトープを認識する。用語「モノクローナル」は、抗体を作製する何らかの特定の方法に限定されない。たとえば、本発明のモノクローナル抗体はKohlerら、Nature 256, 495 (1975)に記載のハイブリドーマ法で作製してもよく、あるいはここに記載する方法を用いてファージライブラリーから単離してもよい。
用語「抗原結合ドメイン」または「抗原結合領域」または「その断片または誘導体」は、選択的結合剤（抗体分子など）の一部をいい、これが抗原と相互作用して結合剤に抗原に対する特異性とアフィニティを与えるアミノ酸残基を含む。好ましくは、抗原結合領域はヒト由来である。別の態様では、抗原結合領域は他の動物種由来であってよく、特に家畜およびウサギ、ラットまたはハムスターなどのげっ歯類であってよい。MFAP4ペプチドと免疫反応性である抗体またはその抗原結合ドメイン、断片または誘導体に関して用いる場合には、用語「有効量」および「治療的有効量」は、MFAP4の１以上の生物学的活性のレベルにおいて観察しうる変化を支えるのに有効または必要な選択的結合剤の量をいい、ここで該変化はMFAP4活性のレベルの増加または減少のいずれかでありうる。
本発明の文脈において、用語「配列同一性」または「相同（ホモログ）」は、2つのアミノ酸配列間又は2つの核酸配列間における相同性度の量的測定をいう。比較する2つの配列が同じ長さでない場合には、ギャップを入れたり、これらをポリペプチド配列または核酸配列の末端で切断して最大の適合をするように並列させる。配列同一性は、式
アミノ酸配列または核酸配列に関する本発明の全ての態様に関して、1以上の配列間の配列同一性のパーセントは、デフォルト設定でclustalWソフトウェア（http://www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html）を用いる並列に基づいてもよい。ヌクレオチド配列の並列についての設定は以下の通りである：並列＝３Dfull、ギャップオープン10.00、ギャップエグジット0.20、ギャップセパレーションDist.4、DNAウェイトマトリックス：同一性（IUB）。アミノ酸配列の並列についての設定は以下の通りである：並列＝３Dfull、ギャップオープン10.00、ギャップエグジット0.20、ギャップセパレーションDist.4、タンパク質ウェイトマトリックス：Gonnet。
あるいは、ヌクレオチド配列は、プログラムDNASIS Maxを用いて分析し、配列の比較は、http://www.paralign.org/で行ってもよい。このサービスはSmith-Waterman (SW)およびParAlignと呼ばれる2つの比較アルゴリズムに基づいている。1つ目のアルゴリズムはSmithおよびWaterman (1981)によって出版され、2つの配列の最適な局地的並列を見出す十分確立された方法である。もう１つのアルゴリズムであるParAlignは配列並列のための発見的手法であり、この方法の詳細はRognes (2001)によって出版されている。スコアマトリックスおよびギャップペナルティのためのデフォルト設定がE値とともに用いられた。
本発明の文脈では、用語「KD」または「KD値」は、抗体（リガンド）とその抗原との間の平衡解離定数をいう。KD値は抗体濃度（特定の試験のために必要な抗体量）と関連し、したがってKD値が低ければ（低濃度）抗体のアフィニティは高くなる。本発明の文脈では、KDはBiacore T200で測定される。
本発明の文脈では、「配列番号XのAA-yy」という定義は、AAはアミノ酸を、そして-yyは配列番号X中のアミノ酸の位置を示すものと理解すべきである。したがって、たとえば「配列番号2のTrp-33」は配列番号2中の33位にあるTrpと理解すべきである。
本発明の文脈において、「多くても5アミノ酸」という定義は、せいぜい5アミノ酸であること、すなわち、5アミノ酸、4アミノ酸、3アミノ酸、2アミノ酸または1アミノ酸であると理解すべきである。
本発明の文脈において、「多くてもxxアミノ酸が配列番号Xと異なる配列」という定義は、xxアミノ酸以外は配列番号Xと同じである配列であり、これは配列中のアミノ酸と異なる、すなわち、異なるアミノ酸の配列であると理解すべきである。したがって、多くても2アミノ酸が配列番号9と異なるとは、配列番号9と２、1、または0アミノ酸が異なる配列であると理解すべきである。「X」は、配列表の配列番号1-14のいずれでもあると理解すべきである。あるいは、「X」は、配列表の配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14のいずれかであると理解すべきである。「xx」は、5、4、3、2、または1のいずれかであると理解すべきである。
リガンド
上述したように、本明細書ではヒト化抗体を含む、MFAP4に対する新規抗体を開示する。これらの抗体は、MFAP4に対する公知の抗体とは異なる配列および異なる結合特性を有する。抗体の医薬用途が実施例の部に記載される。したがって、本発明は一面において、MFAP4の新規エピトープに結合する抗体などのタンパク質リガンドに関する。
上述したように、本明細書ではヒト化抗体を含む、MFAP4に対する新規抗体を開示する。これらの抗体は、MFAP4に対する公知の抗体とは異なる配列および異なる結合特性を有する。抗体の医薬用途が実施例の部に記載される。したがって、本発明は一面において、MFAP4の新規エピトープに結合する抗体などのタンパク質リガンドに関する。
本発明者らは、本発明の抗体が公知の抗-MFAP4抗体とは異なるCDR配列を有することを同定した。したがって、別の一面において、本発明は以下のものを含む、抗体などのタンパク質リガンドまたは本発明のリガンドに関する：
・配列番号9のCDR1領域、配列番号10のCDR2領域、および配列番号11のCDR3領域を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号12のCDR1領域、配列番号13のCDR2領域、および配列番号14のCDR3領域を含む重鎖可変領域。
・配列番号9のCDR1領域、配列番号10のCDR2領域、および配列番号11のCDR3領域を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号12のCDR1領域、配列番号13のCDR2領域、および配列番号14のCDR3領域を含む重鎖可変領域。
本発明の抗体のパラトープおよびMFAP4のエピトープのＸ線結晶学法によって、また当業者に公知の方法を用いて、本発明者らはMFAP4のエピトープと強く相互作用し、よって抗体のパラトープがMFAP4のエピトープと結合するのに重要である軽鎖可変領域と重鎖可変領域のCDR中のアミノ酸をさらに同定した。したがって、本発明は一態様において、以下のものを含む、抗体などのタンパク質リガンドまたは本発明のリガンドに関する：
・以下のものを含む軽鎖可変領域：
・配列番号9、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号9と異なる配列のCDR1領域、ただし、9位のアミノ酸はTyrである；
・配列番号10、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号10と異なる配列のCDR2領域；および
・配列番号11、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号11と異なる配列のCDR3領域、ただし、6位のアミノ酸はTyrである；および
・以下のものを含む重鎖可変領域：
・配列番号12、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号12と異なる配列のCDR1領域、ただし、3位のアミノ酸はTrpである；
・配列番号13、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号13と異なる配列のCDR2領域；および
・配列番号14、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号14と異なる配列のCDR3領域、ただし、１位のアミノ酸はGluであり、9位のアミノ酸はTrpである。
・以下のものを含む軽鎖可変領域：
・配列番号9、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号9と異なる配列のCDR1領域、ただし、9位のアミノ酸はTyrである；
・配列番号10、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号10と異なる配列のCDR2領域；および
・配列番号11、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号11と異なる配列のCDR3領域、ただし、6位のアミノ酸はTyrである；および
・以下のものを含む重鎖可変領域：
・配列番号12、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号12と異なる配列のCDR1領域、ただし、3位のアミノ酸はTrpである；
・配列番号13、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号13と異なる配列のCDR2領域；および
・配列番号14、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号14と異なる配列のCDR3領域、ただし、１位のアミノ酸はGluであり、9位のアミノ酸はTrpである。
また、当業者に公知の方法を用いて実施したＸ線結晶学法によって、本発明者らは抗体のパッケージングに強く関与する重鎖可変領域のCDR中のアミノ酸をさらに同定した。したがって、本発明はさらなる一態様において、以下のものを含む、抗体などのタンパク質リガンドまたは本発明のリガンドに関する：
・以下のものを含む軽鎖可変領域：
・配列番号9、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号9と異なる配列のCDR1領域、ただし、9位のアミノ酸はTyrである；
・配列番号10、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号10と異なる配列のCDR2領域；および
・配列番号11、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号11と異なる配列のCDR3領域、ただし、6位のアミノ酸はTyrである；および
・以下のものを含む重鎖可変領域：
・配列番号12、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号12と異なる配列のCDR1領域、ただし、3位のアミノ酸はTrpであり、2位のアミノ酸はMetである；
・配列番号13、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号13と異なる配列のCDR2領域、ただし、4位のアミノ酸はProである；および
・配列番号14、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号14と異なる配列のCDR3領域、ただし、1位のアミノ酸はGluであり、9位のアミノ酸はTrpである。
・以下のものを含む軽鎖可変領域：
・配列番号9、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号9と異なる配列のCDR1領域、ただし、9位のアミノ酸はTyrである；
・配列番号10、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号10と異なる配列のCDR2領域；および
・配列番号11、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号11と異なる配列のCDR3領域、ただし、6位のアミノ酸はTyrである；および
・以下のものを含む重鎖可変領域：
・配列番号12、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号12と異なる配列のCDR1領域、ただし、3位のアミノ酸はTrpであり、2位のアミノ酸はMetである；
・配列番号13、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号13と異なる配列のCDR2領域、ただし、4位のアミノ酸はProである；および
・配列番号14、または多くても5アミノ酸が、たとえば多くても4アミノ酸が、たとえば多くても3アミノ酸が、たとえば多くても2アミノ酸が、たとえば多くても1アミノ酸が配列番号14と異なる配列のCDR3領域、ただし、1位のアミノ酸はGluであり、9位のアミノ酸はTrpである。
したがって、上記の態様によると、CDR領域は、配列番号9-14に定める配列と異なるが、ここに示した特定のアミノ酸がエピトープ結合に重要である（実施例12参照）。
実施例の部に示すように、MFAP4に対する新規抗体が作製された（実施例3および4と対応の図参照）。これらの抗体は、他のMFAP4抗体とは異なる結合特性を有する（実施例5参照）。これらの抗体はMFAP4に対する他の抗体と比較して以下に記載するいくつかの利点を示す：
・ヒト化抗体は、溶液中でより安定であり、凝集が少ない（実施例6および実施例10参照）。
・抗体は、病理学的眼血管新生、は血管漏出および炎症などに有益な効果を示す（実施例7-9参照）。
・ヒト化抗体は、溶液中でより安定であり、凝集が少ない（実施例6および実施例10参照）。
・抗体は、病理学的眼血管新生、は血管漏出および炎症などに有益な効果を示す（実施例7-9参照）。
また、本発明者らは本発明のリガンドの軽鎖および重鎖を同定した。したがって、一態様において、リガンドは以下のものを含む：
・配列番号1または3のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列1または3と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、または少なくとも95％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号2または4のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列2または4と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、または少なくとも95％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
・配列番号1または3のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列1または3と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、または少なくとも95％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号2または4のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列2または4と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、または少なくとも95％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
配列番号1と2はmAS0326由来の軽鎖および重鎖であり、配列番号3と4はhAS0326由来の軽鎖および重鎖である。
別の一態様において、リガンドは以下のものを含む：
・配列番号3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
したがって、この態様ではリガンドはhAS0326由来の軽鎖および重鎖を含む。
・配列番号3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
したがって、この態様ではリガンドはhAS0326由来の軽鎖および重鎖を含む。
さらに別の一態様において、リガンドは以下のものを含む：
・配列番号1または3のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列1または3と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、たとえば少なくとも95％の配列同一性、たとえば98％の配列同一性、または99％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、ただし、32位のアミノ酸はTyrであり、94位のアミノ酸はTyrである；および
・配列番号2または4のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列2または4と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、たとえば少なくとも95％の配列同一性、たとえば98％の配列同一性、または99％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ただし、33位のアミノ酸はTrpであり、99位のアミノ酸はGluであり、107位のアミノ酸はTrpである。
・配列番号1または3のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列1または3と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、たとえば少なくとも95％の配列同一性、たとえば98％の配列同一性、または99％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、ただし、32位のアミノ酸はTyrであり、94位のアミノ酸はTyrである；および
・配列番号2または4のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列2または4と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、たとえば少なくとも95％の配列同一性、たとえば98％の配列同一性、または99％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ただし、33位のアミノ酸はTrpであり、99位のアミノ酸はGluであり、107位のアミノ酸はTrpである。
さらに別の一態様において、リガンドは以下のものを含む：
・配列番号1または3のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列1または3と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、たとえば少なくとも95％の配列同一性、たとえば98％の配列同一性、または99％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ただし、32位のアミノ酸はTyrであり、94位のアミノ酸はTyrである；および
・配列番号2または4のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列2または4と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、たとえば少なくとも95％の配列同一性、たとえば98％の配列同一性、または99％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ただし、33位のアミノ酸はTrpであり、34位のアミノ酸はMetであり、53位のアミノ酸Proであり、99位のアミノ酸はGluであり、107位のアミノ酸はTrpである。
・配列番号1または3のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列1または3と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、たとえば少なくとも95％の配列同一性、たとえば98％の配列同一性、または99％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ただし、32位のアミノ酸はTyrであり、94位のアミノ酸はTyrである；および
・配列番号2または4のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列2または4と少なくとも80％の配列同一性、たとえば少なくとも90％の配列同一性、たとえば少なくとも95％の配列同一性、たとえば98％の配列同一性、または99％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ただし、33位のアミノ酸はTrpであり、34位のアミノ酸はMetであり、53位のアミノ酸Proであり、99位のアミノ酸はGluであり、107位のアミノ酸はTrpである。
したがって、上記の態様によると、領域は、配列同一性の程度を変えることにより配列番号1-4に定める配列と異なるが、ここに示した特定のアミノ酸がエピトープ結合に重要である（実施例12参照）。
リガンドは種々の形で作製できる。したがって、一態様では、リガンドはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、重鎖と軽鎖が柔軟なリンカーで連結された抗体、Fv分子、抗原結合性断片、Fab断片、F(ab’)2分子、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体からなる群から選択される。一態様では、リガンドはF(ab’)2分子である。さらに好ましい態様では、リガンドはモノクローナル抗体、Fab断片、およびヒト化モノクローナル抗体からなる群から選択される。また別の好ましい態様では、抗体はヒト化および／またはモノクローナル、好ましくはヒト化モノクローナル抗体である。
本発明のリガンドに種々の分子を結合することも有利である。したがって、別の態様では、リガンドは検出可能な標識又は毒性あるいは治療活性を有する物質と結合される。
もちろん、リガンドが十分な結合効率で標的と結合できることが重要である。したがって、別の態様では、リガンドは1＊10-7未満、たとえば1＊10-8未満、またはたとえば1＊10-9M未満、またはたとえば1＊10-7から1＊10-12Mの領域、またはたとえば1＊10-7から1＊10-10Mの領域のrhMFAP4に対するKD値をもつ。実施例2は本発明の抗体についてのKD値を示す。
本発明のリガンドが医薬として用いられるためには、十分可溶性でなければならず、沈殿などの凝集物を形成してはならない。したがって、さらなる態様では、本発明のリガンドは主として単量体（PBS中、pH 7.4で測定して）である。「主として」とは、リガンドの少なくとも90％、たとえば少なくとも95％が単量体であると理解すべきである。
本発明のリガンドの結合特異性はMFAP4に結合する他の公知の抗体とは異なる。したがって、さらに別の態様では、リガンドはrhMFAP4中のRGD－インテグリン相互作用配列と（直接）結合しないが、インテグリン結合の立体障害で示されるMFAP4－仲介性活性をブロックする。本発明の抗体の結合データを実施例5に示す。
RGD－インテグリン相互作用ドメインはフィブリノーゲン関連ドメイン（FReD）（シグナルペプチドを含むときには26-28位、シグナルペプチドを含まないときには6-8位）に先行する短いN-末端領域に位置する。
ベクター
本発明のリガンドは1以上のベクターで発現される。したがって、本発明の一態様は本発明のリガンドをコードする1（または複数）のベクターに関する。たとえば軽鎖または重鎖が2つの異なるベクターから発現されてもよいと理解すべきである。一態様では、ベクターはプラスミドである。
本発明のリガンドは1以上のベクターで発現される。したがって、本発明の一態様は本発明のリガンドをコードする1（または複数）のベクターに関する。たとえば軽鎖または重鎖が2つの異なるベクターから発現されてもよいと理解すべきである。一態様では、ベクターはプラスミドである。
細胞
ベクターは細胞中でリガンドを発現することができる。したがって、本発明のさらなる態様は本発明のリガンドを発現する細胞、および／または本発明のベクターを含む細胞に関する。一態様では、細胞はCHO細胞である。
ベクターは細胞中でリガンドを発現することができる。したがって、本発明のさらなる態様は本発明のリガンドを発現する細胞、および／または本発明のベクターを含む細胞に関する。一態様では、細胞はCHO細胞である。
組成物
本発明のリガンドはもちろん組成物（医薬組成物など）中に存在しうる。したがって、さらなる態様では、本発明は本発明のリガンド、および1以上の生理学的に受容できる担体、賦形剤および／または希釈剤を含む組成物に関する。一態様では、組成物は1以上の安定化剤および／または1以上の緩衝剤を含む。別の態様では、安定化剤は界面活性剤である。
本発明のリガンドはもちろん組成物（医薬組成物など）中に存在しうる。したがって、さらなる態様では、本発明は本発明のリガンド、および1以上の生理学的に受容できる担体、賦形剤および／または希釈剤を含む組成物に関する。一態様では、組成物は1以上の安定化剤および／または1以上の緩衝剤を含む。別の態様では、安定化剤は界面活性剤である。
さらに別の態様では、組成物はVEGF-A（スプライスフォームを含む）またはVEGF-受容体（VEGFR1/VEGFR2）アンタゴニストまたは抗-VEGF抗体のような抗-VEGF薬をさらに含む。実施例の部で示すように、このような組合せで一定の場合に有利な効果がみられる。
医薬
本発明のリガンドおよび／または組成物は医薬として用いられる。したがって、本発明のさらなる態様は本発明のリガンドおよび／または組成物を医薬として使用することに関する。
本発明のリガンドおよび／または組成物は医薬として用いられる。したがって、本発明のさらなる態様は本発明のリガンドおよび／または組成物を医薬として使用することに関する。
一態様では、リガンドまたは組成物を哺乳類における血管増殖性疾患および／または関連障害の予防または治療に用いる。好ましい態様では哺乳類はヒトである。
別の態様では、血管増殖性疾患および／または関連障害は血管の過形成またはリモデリングによって引き起こされる。
別の態様では、血管増殖性疾患および／または関連障害は病理学的血管新生によって引き起こされるか、または血管漏出もしくは炎症および／または哺乳類の関連障害とともに存在する。
さらなる態様では、疾患および／または関連障害は細気管支過形成またはアレルギー性喘息における好酸球炎症である。
さらなる態様では、血管増殖性疾患および／または関連障害は眼の病理学的血管新生で特徴づけられる。関連する態様では、眼の病理学的血管新生で特徴づけられる障害は、地図状萎縮および増殖性AMDを含む加齢性黄斑変性症（AMD）、網膜静脈閉塞症、網膜症、高血圧性網膜症、硝子体牽引症、および増殖性DRおよび糖尿病黄斑浮腫を含む糖尿病性網膜症（DR）からなる群から選択される。
一態様では、血管増殖性疾患および／または関連障害は癌またはその他の悪性腫瘍である。関連する態様では、癌または悪性腫瘍は、膠芽腫、頭、首および肺の癌からなる群から選択される。
リガンドまたは組成物は様々な経路で投与できる。したがって、一態様では、リガンドまたは組成物は静脈内、眼内（眼に投与）または皮下で投与される。
血管増殖性疾患の予防又は治療法
さらに別の一面では、本発明は哺乳類における血管増殖性疾患および／または関連障害の予防または治療法に関し、該方法は本発明のリガンドまたは組成物を（これを必要とする）哺乳類に投与することを含む。好ましい態様では、哺乳類はヒトである。
さらに別の一面では、本発明は哺乳類における血管増殖性疾患および／または関連障害の予防または治療法に関し、該方法は本発明のリガンドまたは組成物を（これを必要とする）哺乳類に投与することを含む。好ましい態様では、哺乳類はヒトである。
一態様では、該方法は、病理学的血管新生によって引き起こされる血管増殖性疾患および／または関連障害を予防または治療するためのものである。
さらなる態様では、該方法は、細気管支過形成またはアレルギー性喘息における好酸球炎症疾患を予防または治療するためのものである。
さらに別の態様では、該方法は、眼の病理学的血管新生で特徴づけられる障害を予防または治療するためのものである。関連する態様ではが、眼の病理学的血管新生で特徴づけられる障害は、地図状萎縮および増殖性AMDを含む加齢性黄斑変性症（AMD）、網膜静脈閉塞症、網膜症、高血圧性網膜症、硝子体牽引症、増殖性DRおよび糖尿病黄斑浮腫を含む糖尿病性網膜症（DR）からなる群から選択される。
一態様では、血管増殖性疾患および／または関連障害は癌またはその他の悪性腫瘍である。関連する態様では、癌または悪性腫瘍は、膠芽腫、頭、首および肺の癌からなる群から選択される。
リガンドまたは組成物は様々な経路で投与できる。したがって、一態様では、リガンドまたは組成物は静脈内、眼に投与、眼内または皮下で投与される。
本発明の態様および種々の面についての文脈において記載する特徴は本発明の他の面にも適用されることに注意すべきである。
本出願で引用したすべての特許文献および非特許文献はその全体を参照することによりここに含まれる。
本発明を以下の非限定的な実施例においてさらに詳細に説明する。
実施例
実施例1 材料および方法
本実施例では以下の実施例で用いた材料と方法を記載する。
実施例1 材料および方法
本実施例では以下の実施例で用いた材料と方法を記載する。
緩衝液
トリス緩衝食塩水 (TBS): 140mM NaCl、10mM Tris-HCl、0.02% (w/v) NaN2、pH 7.4; TBS/Tw: 0.05% (v/v) Tween 20 (ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、MERCK-Schuchardt)を含むTBS；リン酸緩衝食塩水 (PBS): 137mM NaCl、3mM KCl、8mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、pH 7.4；基質緩衝液: 35 mM クエン酸、67 mM Na2HPO4、pH 5.0。
トリス緩衝食塩水 (TBS): 140mM NaCl、10mM Tris-HCl、0.02% (w/v) NaN2、pH 7.4; TBS/Tw: 0.05% (v/v) Tween 20 (ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、MERCK-Schuchardt)を含むTBS；リン酸緩衝食塩水 (PBS): 137mM NaCl、3mM KCl、8mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、pH 7.4；基質緩衝液: 35 mM クエン酸、67 mM Na2HPO4、pH 5.0。
マウスモノクローナル抗体の作製
免疫に用いたhrMFAP4は文献記載のように作製した（Sakmose ら、 PLoS One. 2013 Dec 4;8(12))。
hrMFAP4に対する親和性をもつモノクローナル抗体を標準のハイブリドーマ法とMFAP4欠失マウスを用いて作製した。この方法によって以下のものを含む一連のモノクローナル抗体を得た：
・ヒト組換えMFAP4（hrMFAP4）に対するネズミモノクローナル抗体HG Hyb 7-1（たとえばWO 2016/008498に記載）
・ヒト組換えMFAP4（hrMFAP4）に対するネズミモノクローナル抗体HG Hyb 7-5（たとえばWO 2014/114298に記載）
・ヒト組換えMFAP4（hrMFAP4）に対するネズミモノクローナル抗体であってヒト化のために選ばれたmAS0326。
全ての抗体は標準法を用いてアミノ酸配列を決定した。
免疫に用いたhrMFAP4は文献記載のように作製した（Sakmose ら、 PLoS One. 2013 Dec 4;8(12))。
hrMFAP4に対する親和性をもつモノクローナル抗体を標準のハイブリドーマ法とMFAP4欠失マウスを用いて作製した。この方法によって以下のものを含む一連のモノクローナル抗体を得た：
・ヒト組換えMFAP4（hrMFAP4）に対するネズミモノクローナル抗体HG Hyb 7-1（たとえばWO 2016/008498に記載）
・ヒト組換えMFAP4（hrMFAP4）に対するネズミモノクローナル抗体HG Hyb 7-5（たとえばWO 2014/114298に記載）
・ヒト組換えMFAP4（hrMFAP4）に対するネズミモノクローナル抗体であってヒト化のために選ばれたmAS0326。
全ての抗体は標準法を用いてアミノ酸配列を決定した。
抗体のヒト化
mAS0326抗体をGenscript（www.Genscript.com）によって、所有者の方法を用いてヒト化した。可変ドメイン配列をヒト生殖細胞系に対してBLASTして、いくつかのフレームワーク領域FR1、FR2およびFR3を、マウス抗体と最大の同一性を示すヒトFRから独立に選択した。選択したFRをオーバーラップPCRを用いてmAS0326 CDRに組み立て、Fab断片を発現するためのファージディスプレイライブラリーを構築した。Genscriptの所有するFASEBAスクリーニング法を用いてパニングを3回行った後、MFAP4タンパク質と強く結合するファージを選択した。選択したFab遺伝子をファージDNAから増幅した。Fabをコードする遺伝子をヒトIgG1の適切な定常領域をコードする遺伝子と融合して全IgGを作製した。このシリーズではBiacore T200を用いて、hAS0326を最適な組換えヒトMFAP4の結合体として選択し、得られた軽鎖および重鎖構築物を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1 plus中にクローン化した。
mAS0326抗体をGenscript（www.Genscript.com）によって、所有者の方法を用いてヒト化した。可変ドメイン配列をヒト生殖細胞系に対してBLASTして、いくつかのフレームワーク領域FR1、FR2およびFR3を、マウス抗体と最大の同一性を示すヒトFRから独立に選択した。選択したFRをオーバーラップPCRを用いてmAS0326 CDRに組み立て、Fab断片を発現するためのファージディスプレイライブラリーを構築した。Genscriptの所有するFASEBAスクリーニング法を用いてパニングを3回行った後、MFAP4タンパク質と強く結合するファージを選択した。選択したFab遺伝子をファージDNAから増幅した。Fabをコードする遺伝子をヒトIgG1の適切な定常領域をコードする遺伝子と融合して全IgGを作製した。このシリーズではBiacore T200を用いて、hAS0326を最適な組換えヒトMFAP4の結合体として選択し、得られた軽鎖および重鎖構築物を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1 plus中にクローン化した。
ヒト化抗体の発現とMFAP4の組換え形
ExpiCHO-S 細胞をヒトMFAP4発現プラスミド(pcDNA 3.4-hMFAP4 TOPOR TA)、マウスMFAP4発現プラスミド(pcDNA5/FRT/V5-His TOPOR TA)、ヒトMFAP4 RGD-AAA変異(pcDNA 3.1 plus)およびhAS0326 軽鎖および重鎖発現プラスミド (pcDNA3.1 plus- hAS0326 軽鎖)および (pcDNA3.1 plus- hAS0326 重鎖) にExpiFectamine を用いて製造者プロトコルに従ってトランスフェクトした(hAS0326 軽鎖とhAS0326 重鎖を1:1 のモル比で共トランスフェクトした)。ExpiFectamine CHO Enhancer および ExpiCHO Feedを添加した後、細胞を37℃、8％CO2で10日間振とうして培養した。
ExpiCHO-S 細胞をヒトMFAP4発現プラスミド(pcDNA 3.4-hMFAP4 TOPOR TA)、マウスMFAP4発現プラスミド(pcDNA5/FRT/V5-His TOPOR TA)、ヒトMFAP4 RGD-AAA変異(pcDNA 3.1 plus)およびhAS0326 軽鎖および重鎖発現プラスミド (pcDNA3.1 plus- hAS0326 軽鎖)および (pcDNA3.1 plus- hAS0326 重鎖) にExpiFectamine を用いて製造者プロトコルに従ってトランスフェクトした(hAS0326 軽鎖とhAS0326 重鎖を1:1 のモル比で共トランスフェクトした)。ExpiFectamine CHO Enhancer および ExpiCHO Feedを添加した後、細胞を37℃、8％CO2で10日間振とうして培養した。
MFAP4の組換え形の精製
ExpiCHO-S 細胞の培地に放出された組換えMFAP4タンパク質をLausen ら記載の方法 (J Biol Chem (1999) 274(45):32234-40)でアフィニティ精製し、次いでAkta FPLC 装置(Amersham Pharmacia Biotech)で、Resource Q カラム(GE Healthcare Life Sciences) 上で陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。タンパク質の純度をSDS-PAGEで試験し、次にSimplyBlue(TM) SafeStain (Invitrogen)を用いるクマシー染色で試験した。
ExpiCHO-S 細胞の培地に放出された組換えMFAP4タンパク質をLausen ら記載の方法 (J Biol Chem (1999) 274(45):32234-40)でアフィニティ精製し、次いでAkta FPLC 装置(Amersham Pharmacia Biotech)で、Resource Q カラム(GE Healthcare Life Sciences) 上で陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。タンパク質の純度をSDS-PAGEで試験し、次にSimplyBlue(TM) SafeStain (Invitrogen)を用いるクマシー染色で試験した。
抗体の精製
抗体をAkta FPLC 装置(Amersham Pharmacia Biotech)で標準のタンパク質G精製を用いて精製した。培養上清をカラムにかけて、カラムをPBS (0.5M NaCl)で洗浄し、クエン酸濃度を順次増加して抗体を溶出した。抗体含有分画を直ちにNa2CO3で中和して集めた。精製抗体の集合をPBSに透析した。
抗体をAkta FPLC 装置(Amersham Pharmacia Biotech)で標準のタンパク質G精製を用いて精製した。培養上清をカラムにかけて、カラムをPBS (0.5M NaCl)で洗浄し、クエン酸濃度を順次増加して抗体を溶出した。抗体含有分画を直ちにNa2CO3で中和して集めた。精製抗体の集合をPBSに透析した。
ビオチニル化
抗体を3% (w/v) Na2CO3でpH 8.5 に調節したリン酸緩衝食塩水に透析し、ビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Sigma H-1759、ジメチルスルホキシド中 40 mg/ml) を0.17 mg/mg タンパク質で添加した。混合物を4℃で十分な時間インキュベートし、PBSに透析した。
抗体を3% (w/v) Na2CO3でpH 8.5 に調節したリン酸緩衝食塩水に透析し、ビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Sigma H-1759、ジメチルスルホキシド中 40 mg/ml) を0.17 mg/mg タンパク質で添加した。混合物を4℃で十分な時間インキュベートし、PBSに透析した。
競合ELISAによる抗体のエピトープマッピング
96ウェルプレート(Nunc-MaxiSorp)を、PBS中の組換えヒトMFAP4 0.5 μgで4℃で十分な時間コーティングし、次いで洗浄し、TBS/Tw中4℃で十分な時間ブロッキングした。ビオチニル化Mab(0.5 μg/ml)と非標識Mab (20 μg/mlから156 ng/mlに2倍希釈)をTBS/Tw中、別のミクロタイタープレートであらかじめ混合し、これをMFAP4でコーティングしたミクロタイタープレートに加えた。プレートを2時間室温でインキュベートした。プレートをTBS/Twで3回洗浄し、TBS/Tw 中、1:2000 に希釈したストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合体(Invitrogen)と20分間インキュベートした。3回の最終洗浄の後、結合酵素の量を、基質緩衝液(0.03% 新しく調製した H2O2)中に溶解したo-フェニレンジアミン(OPD、0.8mg/ml、Kementec, Taastrup, Denmark)を添加して、暗室、室温で15分間反応させることにより評価した。100 μlの1 M H2SO4を添加して発色を止めて、OD600 nmを参考としてOD492nmでプレートを読み取った。
96ウェルプレート(Nunc-MaxiSorp)を、PBS中の組換えヒトMFAP4 0.5 μgで4℃で十分な時間コーティングし、次いで洗浄し、TBS/Tw中4℃で十分な時間ブロッキングした。ビオチニル化Mab(0.5 μg/ml)と非標識Mab (20 μg/mlから156 ng/mlに2倍希釈)をTBS/Tw中、別のミクロタイタープレートであらかじめ混合し、これをMFAP4でコーティングしたミクロタイタープレートに加えた。プレートを2時間室温でインキュベートした。プレートをTBS/Twで3回洗浄し、TBS/Tw 中、1:2000 に希釈したストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合体(Invitrogen)と20分間インキュベートした。3回の最終洗浄の後、結合酵素の量を、基質緩衝液(0.03% 新しく調製した H2O2)中に溶解したo-フェニレンジアミン(OPD、0.8mg/ml、Kementec, Taastrup, Denmark)を添加して、暗室、室温で15分間反応させることにより評価した。100 μlの1 M H2SO4を添加して発色を止めて、OD600 nmを参考としてOD492nmでプレートを読み取った。
組換えマウスMFAP4、組換えヒトMFAP4、およびRGD配列をAAA配列に変異させた組換えヒトMFAP4との抗体結合試験
96-ウェルプレート(Nunc-MaxiSorp) ( Nunc(TM))を、0.5 μgの組換えマウスMFAP4、組換えヒトMFAP4、およびRGD配列をAAA配列に変異させた組換えヒトMFAPでPBS中、4℃で十分な時間コーティングした。コーティングの後、洗浄し、TBS/Tw中、4℃で十分な時間ブロッキングした。ブロッキングの後、最初の濃度100 ng/ml から2倍希釈したビオチニル化抗体を添加した。次いでプレートを室温で2時間インキュベートした。プレートをTBS/Twで3回洗浄し、TBS/Tw 中、1:2000 に希釈したストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合体(Invitrogen)で20分間インキュベートした。3回の最終洗浄の後、結合酵素の量を、基質緩衝液(0.03% 新しく調製した H2O2)中に溶解したOPD（0.8mg/ml、Kementec, Taastrup, Denmark)を添加して、暗室、室温で15分間反応させることにより評価した。100 μlの1 M H2SO4を添加して発色を止めて、OD600 nmを参考としてOD492nmでプレートを読み取った。
96-ウェルプレート(Nunc-MaxiSorp) ( Nunc(TM))を、0.5 μgの組換えマウスMFAP4、組換えヒトMFAP4、およびRGD配列をAAA配列に変異させた組換えヒトMFAPでPBS中、4℃で十分な時間コーティングした。コーティングの後、洗浄し、TBS/Tw中、4℃で十分な時間ブロッキングした。ブロッキングの後、最初の濃度100 ng/ml から2倍希釈したビオチニル化抗体を添加した。次いでプレートを室温で2時間インキュベートした。プレートをTBS/Twで3回洗浄し、TBS/Tw 中、1:2000 に希釈したストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合体(Invitrogen)で20分間インキュベートした。3回の最終洗浄の後、結合酵素の量を、基質緩衝液(0.03% 新しく調製した H2O2)中に溶解したOPD（0.8mg/ml、Kementec, Taastrup, Denmark)を添加して、暗室、室温で15分間反応させることにより評価した。100 μlの1 M H2SO4を添加して発色を止めて、OD600 nmを参考としてOD492nmでプレートを読み取った。
サンドイッチELISAアッセイ
サンドイッチELISAアッセイでは、種々の抗-MFAP4抗体を96-ウェルプレート(Nunc-MaxiSorp)のウェルにPBS 中、1μg/mlで4℃で十分な時間固定化した。TBS/Twで３回洗浄し、TBS/Tw中、4℃で十分な時間ブロッキングした。プレートをヒト、マウス、およびMFAP4欠失マウス由来の血清で、最初の1：50希釈から2倍希釈物で、4℃で十分な時間インキュベートした。プレートをTBS/Twで３回洗浄し、ビオチニル化抗体(TBS/Tw 中 0.5 μg /ml)で室温、2時間インキュベートした。プレートをTBS/Twで3回洗浄し、TBS/Tw 中、1:2000 に希釈したストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合体(Invitrogen)で20分間インキュベートした。3回の最終洗浄の後、結合酵素の量を、基質緩衝液(0.03% 新しく調製した H2O2)中に溶解したOPD（0.8mg/ml、Kementec, Taastrup, Denmark)を添加して、暗室、室温で15分間反応させることにより評価した。100 μlの1 M H2SO4を添加して発色を止めて、OD600 nmを参考としてOD492nmでプレートを読み取った。
サンドイッチELISAアッセイでは、種々の抗-MFAP4抗体を96-ウェルプレート(Nunc-MaxiSorp)のウェルにPBS 中、1μg/mlで4℃で十分な時間固定化した。TBS/Twで３回洗浄し、TBS/Tw中、4℃で十分な時間ブロッキングした。プレートをヒト、マウス、およびMFAP4欠失マウス由来の血清で、最初の1：50希釈から2倍希釈物で、4℃で十分な時間インキュベートした。プレートをTBS/Twで３回洗浄し、ビオチニル化抗体(TBS/Tw 中 0.5 μg /ml)で室温、2時間インキュベートした。プレートをTBS/Twで3回洗浄し、TBS/Tw 中、1:2000 に希釈したストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合体(Invitrogen)で20分間インキュベートした。3回の最終洗浄の後、結合酵素の量を、基質緩衝液(0.03% 新しく調製した H2O2)中に溶解したOPD（0.8mg/ml、Kementec, Taastrup, Denmark)を添加して、暗室、室温で15分間反応させることにより評価した。100 μlの1 M H2SO4を添加して発色を止めて、OD600 nmを参考としてOD492nmでプレートを読み取った。
凝集試験のための抗体濃縮
タンパク質G精製した抗体をVivaspin 2遠心濃縮器(Viva products)を用いて濃縮し、4℃、2時間インキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。濃縮抗体の純度をSDS-PAGEで試験し、次にSimplyBlue(TM) SafeStain (Invitrogen)を用いてクマシー染色した。抗体濃度を光学密度測定（OD280）で評価した。
タンパク質G精製した抗体をVivaspin 2遠心濃縮器(Viva products)を用いて濃縮し、4℃、2時間インキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。濃縮抗体の純度をSDS-PAGEで試験し、次にSimplyBlue(TM) SafeStain (Invitrogen)を用いてクマシー染色した。抗体濃度を光学密度測定（OD280）で評価した。
サイズ排除クロマトグラフィー
濃縮抗体50 μl を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。抗体試料を、Akta FPLC システム (Amersham Pharmacia Biotech)に連結した分析用Superose 6カラムに適用し、0.05％Emulphogeneを含むPBS、pH7.4を溶離液として用い、0.4 ml/分の流速で実施した。
濃縮抗体50 μl を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。抗体試料を、Akta FPLC システム (Amersham Pharmacia Biotech)に連結した分析用Superose 6カラムに適用し、0.05％Emulphogeneを含むPBS、pH7.4を溶離液として用い、0.4 ml/分の流速で実施した。
動物倫理
マウスおよびラットは、眼科および視覚研究における動物使用のためのARVO Statement、the Universit of Nottingham Biological Services Unit、UK Home Office licenseに従って処置した。
マウスおよびラットは、眼科および視覚研究における動物使用のためのARVO Statement、the Universit of Nottingham Biological Services Unit、UK Home Office licenseに従って処置した。
マウス脈絡膜血管新生（CNV）モデル
メスC57/BL6Jマウスを試験に用いた。動物に50mg/kgのKetaset（塩酸ケタミン、Zoetis）を腹腔内（IP）注射して麻酔し、0.5mg/kgのSedastop（塩酸アティパメゾール、Animalcare）をIP注射して回復させた。5％塩酸フェニレフリン（Bausch & Lomb）および0.8％トロピカミド（Bausch & Lomb）を局所投与して瞳を膨張し、脱水を防止するため眼をルブリタール（Dechura）で覆った。
Meridian Merilas 532a緑色レーザー光凝固器を用いて1眼当たり4か所、両眼で脈絡膜を貫通して病巣を作った。網膜下の泡の存在で脈絡膜破壊の成功を確認した。レーザー設定は各光凝固病巣につき450mWで130msに維持した。
マウスに1μg m/hAS0326、5μg m/hAS0326、1μgマウスIgG（DAKO）または対照としての食塩水、または1μg抗-VEGF-A（Biolegend）を眼内注射した。抗体は滅菌PBSで0.5μg/μl（5μg注射につき2.5μg/μl)に希釈し、眼を安定化するための細い鉗子付きの36ゲージのハミルトン針（World Precision Instruments）で2μl投与した。抗体は0日目（病巣作製日）と7日目に投与した。
血管新生と病巣の進展をin vivoで可視化（7日目および14日目）するために、食塩水中の100mg/mlフルオレセインナトリウム（Sigma-Aldrich）200μlを腹腔内注射してゆきわたらせた後、Micron IV網膜画像顕微鏡（Phoenix Research Labs）で画像を撮った。白内障の進展は、いくつかの眼が連続的な眼底フルオレセイン血管造影（FFA）から除外されることを意味した。
メスC57/BL6Jマウスを試験に用いた。動物に50mg/kgのKetaset（塩酸ケタミン、Zoetis）を腹腔内（IP）注射して麻酔し、0.5mg/kgのSedastop（塩酸アティパメゾール、Animalcare）をIP注射して回復させた。5％塩酸フェニレフリン（Bausch & Lomb）および0.8％トロピカミド（Bausch & Lomb）を局所投与して瞳を膨張し、脱水を防止するため眼をルブリタール（Dechura）で覆った。
Meridian Merilas 532a緑色レーザー光凝固器を用いて1眼当たり4か所、両眼で脈絡膜を貫通して病巣を作った。網膜下の泡の存在で脈絡膜破壊の成功を確認した。レーザー設定は各光凝固病巣につき450mWで130msに維持した。
マウスに1μg m/hAS0326、5μg m/hAS0326、1μgマウスIgG（DAKO）または対照としての食塩水、または1μg抗-VEGF-A（Biolegend）を眼内注射した。抗体は滅菌PBSで0.5μg/μl（5μg注射につき2.5μg/μl)に希釈し、眼を安定化するための細い鉗子付きの36ゲージのハミルトン針（World Precision Instruments）で2μl投与した。抗体は0日目（病巣作製日）と7日目に投与した。
血管新生と病巣の進展をin vivoで可視化（7日目および14日目）するために、食塩水中の100mg/mlフルオレセインナトリウム（Sigma-Aldrich）200μlを腹腔内注射してゆきわたらせた後、Micron IV網膜画像顕微鏡（Phoenix Research Labs）で画像を撮った。白内障の進展は、いくつかの眼が連続的な眼底フルオレセイン血管造影（FFA）から除外されることを意味した。
動物を殺して眼の解剖をした（14日目）後、脈絡膜を平らに置いて血清中（5％ヤギ血清、3％トリトンX-100、1％ BSA）でブロックし、Isolectin-B4（IB4）（Sigma Aldrich、ビオチン結合）5μg/mlおよびCD45（Abcan）5μg/mlで一晩、4℃で染色した。IB4およびCD45染色をそれぞれ検出するために、ストレプトアビジン結合Alexafluor 488 2μg/mlおよびロバ抗-ウサギAlexafluor 555 4μg/mlを用いた。DAPIを含む封入剤Fluoroshieldとともにカバーグラスをおいた。Leica TCS SPE共焦点顕微鏡で画像を得たが、画像間の設定は全て同じにした。病巣および炎症細胞領域はImaris（Bitplane, UK）で直接μm2で測定した。併合したすべての病巣、あるいは反対側の眼が平均から2標準偏差よりおおきい火傷をもつ動物は分析から除外した。
ラットストレプトゾトシン（STZ）誘導糖尿病モデル
糖尿病を誘導するために、オスNorway Brownラット（250-300g、Envigo, US）にストレプトゾトシン（STZ、50mg/kg、Sigma-Aldrich）を1回腹腔内投与した。対照ラットには300μlの食塩水を腹腔内投与した。インシュリンペレット（LinShin）の3分の1を次の4週間の体重維持のために皮下に埋め込んだ。誘導後4日目に尾静脈から血液を採取して血液グルコースレベルを測定した。15mmol/l以上の血液グルコースのラットを糖尿病とみなした。4日目に高血糖にならなかったSTZ誘導ラットには翌朝STZを再注射した。
糖尿病を誘導するために、オスNorway Brownラット（250-300g、Envigo, US）にストレプトゾトシン（STZ、50mg/kg、Sigma-Aldrich）を1回腹腔内投与した。対照ラットには300μlの食塩水を腹腔内投与した。インシュリンペレット（LinShin）の3分の1を次の4週間の体重維持のために皮下に埋め込んだ。誘導後4日目に尾静脈から血液を採取して血液グルコースレベルを測定した。15mmol/l以上の血液グルコースのラットを糖尿病とみなした。4日目に高血糖にならなかったSTZ誘導ラットには翌朝STZを再注射した。
ラットを3-5％イソフルラン（IsoFlo、Abbott Laboratories）で麻酔して、5％塩酸フェニレフリン（Bausch & Lomb）および0.8％トロピカミド（Bausch & Lomb）を局所投与して瞳を膨張し、脱水を防止するため眼をルブリタール（Dechura）で覆った。動物に1μg m/hAS0326、5μg m/hAS0326、対照としての食塩水、または1μg抗-VEGF-A（Biolegend）を眼内注射した。抗体は滅菌PBSで0.5μg/μl（5μg注射につき2.5μg/μl)に希釈し、眼を安定化するための細い鉗子付き36ゲージのハミルトン針（World Precision Instruments）で2μl投与した。抗体は0日目（糖尿病前）と7日目（糖尿病後）に投与した。
血管新生と病巣の進展をin vivoで可視化（0、7、14および21日目）するために、食塩水中の100mg/mlフルオレセインナトリウム（Sigma-Aldrich）200μlを眼内注射してゆきわたらせた後、Micron IV網膜画像顕微鏡（Phoenix Research Labs）で画像を撮った。白内障の進展は、いくつかの眼が連続的な眼底フルオレセイン血管造影（FFA）から除外されることを意味した。
血管新生と病巣の進展をin vivoで可視化（0、7、14および21日目）するために、食塩水中の100mg/mlフルオレセインナトリウム（Sigma-Aldrich）200μlを眼内注射してゆきわたらせた後、Micron IV網膜画像顕微鏡（Phoenix Research Labs）で画像を撮った。白内障の進展は、いくつかの眼が連続的な眼底フルオレセイン血管造影（FFA）から除外されることを意味した。
エバンスブルー染色の調製、投与およびそれに続く溶解による眼血管透過性の連続モニタリングは文献記載の方法（Ved N, Clin Sci (Lond) 2017）で行った。
統計
全ての統計とグラフはGraphPad Prism 6で作成した。示した統計は処置群間の比較のためである。比較はクラスカル・ウォリス検定およびダンの多重比較検定を用いて行った。グラフ上の有意差は星印で表し、ここで＊ｐ＜0.05、＊＊ｐ＜0.01、＊＊＊ｐ＜0.001、＊＊＊＊ｐ＜0.0001である。
全ての統計とグラフはGraphPad Prism 6で作成した。示した統計は処置群間の比較のためである。比較はクラスカル・ウォリス検定およびダンの多重比較検定を用いて行った。グラフ上の有意差は星印で表し、ここで＊ｐ＜0.05、＊＊ｐ＜0.01、＊＊＊ｐ＜0.001、＊＊＊＊ｐ＜0.0001である。
実施例2 hAS0326およびmAS0326のrhMFAP4との相互作用についてのKD評価
目的
hAS0326およびmAS0326のrhMFAP4との相互作用についてのKD値を評価すること。
材料および方法
所定の抗体とrhMFAP4との間の結合相互作用はGenscriptのBiacore T200を用いて行った。
結果
目的
hAS0326およびmAS0326のrhMFAP4との相互作用についてのKD値を評価すること。
材料および方法
所定の抗体とrhMFAP4との間の結合相互作用はGenscriptのBiacore T200を用いて行った。
結果
結論
これらの結果は、hAS0326がナノモル領域のKDを有する高親和性の抗体であることを示す。hAS0326はmAS0326と比べて低いrhMFAP4親和性を有するが、それでも高親和性を保持していた。
これらの結果は、hAS0326がナノモル領域のKDを有する高親和性の抗体であることを示す。hAS0326はmAS0326と比べて低いrhMFAP4親和性を有するが、それでも高親和性を保持していた。
実施例3 作製したモノクローナル抗体中のCDR配列の並列
作製した抗体HG Hyb 7-5、HG Hyb 7-1、mAS0326およびhAS0326の間のCDR相同性を図１に示す。
・HG Hyb 7-1、mAS0326およびhAS0326の重鎖CDR配列間は100％相同
・HG Hyb 7-5とhAS0326の重鎖CDR間は＜50％相同
・mAS0326とhAS0326の軽鎖CDR配列間は100％相同
・HG Hyb 7-1またはHG Hyb 7-5とhAS0326の軽鎖CDR間は＜50％相同
作製した抗体HG Hyb 7-5、HG Hyb 7-1、mAS0326およびhAS0326の間のCDR相同性を図１に示す。
・HG Hyb 7-1、mAS0326およびhAS0326の重鎖CDR配列間は100％相同
・HG Hyb 7-5とhAS0326の重鎖CDR間は＜50％相同
・mAS0326とhAS0326の軽鎖CDR配列間は100％相同
・HG Hyb 7-1またはHG Hyb 7-5とhAS0326の軽鎖CDR間は＜50％相同
実施例4 モノクローナル抗体間の重鎖および軽鎖可変ドメインの相同性
hAS0326重鎖可変ドメインは作製したマウスモノクローナル抗体と以下の相同性を有する。
・HG Hyb 7-1： 78.7％
・HG Hyb 7-5： 66.1％
・mAS0326： 78.7％
hAS0326軽鎖可変ドメインは作製したマウスモノクローナル抗体と以下の相同性を有する。
・HG Hyb 7-1： 66.4％
・HG Hyb 7-5： 61.7％
・mAS0326： 79.4％
結論
全ての相同性は80％より小さく、これはhAS0326のアミノ酸配列が過去の特許出願に提示される抗体を含む、試験した他の抗体と顕著に異なることを示す。
hAS0326重鎖可変ドメインは作製したマウスモノクローナル抗体と以下の相同性を有する。
・HG Hyb 7-1： 78.7％
・HG Hyb 7-5： 66.1％
・mAS0326： 78.7％
hAS0326軽鎖可変ドメインは作製したマウスモノクローナル抗体と以下の相同性を有する。
・HG Hyb 7-1： 66.4％
・HG Hyb 7-5： 61.7％
・mAS0326： 79.4％
結論
全ての相同性は80％より小さく、これはhAS0326のアミノ酸配列が過去の特許出願に提示される抗体を含む、試験した他の抗体と顕著に異なることを示す。
実施例5 HG HYB7-5と比較したhAS0326/mAS0326のMFAP4結合特性
目的
HG HYB7-5と比較したhAS0326/mAS0326のMFAP4結合特性を評価すること。
結果
競合ELISA試験を用いて、HG HYB7-5はhAS0326およびmAS0326とは異なるエピトープを有することが示された（図２）。精製した組換えマウスMFAP4、組換えヒトMFAP4、およびRGDインテグリン結合モチーフをAAAに変異させた組換えヒトMFAP4を用いる直接結合アッセイでは、RGDモチーフがHG HYB7-5エピトープの本質的部分であるが、hAS0326/mAS0326エピトープの本質的部分ではないことが示された（図３Ａおよび３Ｂ）。さらに、hAS0326/mAS0326はヒトおよびマウスMFAP4と同等によく結合するが、HG HYB7-5はマウスMFAP4と結合しないことが示された（図３Ｃ）。
天然型マウスおよびヒトMFAP4源として血清を用いて、図４は、HG HYB7-5はマウスMFAP4とは結合しないが、hAS0326/mAS0326は結合することを示す。
結論
配列相同性とエピトープのオーバーラップ研究によって、HG Hyb 7-5とmAS0326（およびhAS0326）は低いCDR／可変鎖相同性を有しており、これらは異なる組換えMFAP4エピトープを認識することが明らかとなった。また、HG Hyb 7-5はrhMFAP4中のRGDインテグリン相互作用ドメインを認識するが、mAS0326（およびhAS0326）は組換えヒトMFAP4中のRGDインテグリン相互作用ドメインとは反応しないことが示された。さらに、AS0326はネズミMFAP4と相互作用するが、HG HYB7-5はしないことが示された。
目的
HG HYB7-5と比較したhAS0326/mAS0326のMFAP4結合特性を評価すること。
結果
競合ELISA試験を用いて、HG HYB7-5はhAS0326およびmAS0326とは異なるエピトープを有することが示された（図２）。精製した組換えマウスMFAP4、組換えヒトMFAP4、およびRGDインテグリン結合モチーフをAAAに変異させた組換えヒトMFAP4を用いる直接結合アッセイでは、RGDモチーフがHG HYB7-5エピトープの本質的部分であるが、hAS0326/mAS0326エピトープの本質的部分ではないことが示された（図３Ａおよび３Ｂ）。さらに、hAS0326/mAS0326はヒトおよびマウスMFAP4と同等によく結合するが、HG HYB7-5はマウスMFAP4と結合しないことが示された（図３Ｃ）。
天然型マウスおよびヒトMFAP4源として血清を用いて、図４は、HG HYB7-5はマウスMFAP4とは結合しないが、hAS0326/mAS0326は結合することを示す。
結論
配列相同性とエピトープのオーバーラップ研究によって、HG Hyb 7-5とmAS0326（およびhAS0326）は低いCDR／可変鎖相同性を有しており、これらは異なる組換えMFAP4エピトープを認識することが明らかとなった。また、HG Hyb 7-5はrhMFAP4中のRGDインテグリン相互作用ドメインを認識するが、mAS0326（およびhAS0326）は組換えヒトMFAP4中のRGDインテグリン相互作用ドメインとは反応しないことが示された。さらに、AS0326はネズミMFAP4と相互作用するが、HG HYB7-5はしないことが示された。
実施例6 抗体凝集
目的
hAS0326およびmAS0326の凝集特性を比較すること。
結果
抗体溶液を濃縮した後、hAS0326とmAS0326の凝集特性は異なることが示された（図５）。hAS0326は本質的に単量体形にとどまる。対照的にmAS0326は凝集を形成する。
結論
溶液中でhAS0326はmAS0326よりも安定であり、mAS0326は調製後まもなく凝集を形成し、したがって臨床用途には適していない。hAS0326が凝集しないということは、この抗体が現在の形で臨床用途に適しているであろうことを示している。
目的
hAS0326およびmAS0326の凝集特性を比較すること。
結果
抗体溶液を濃縮した後、hAS0326とmAS0326の凝集特性は異なることが示された（図５）。hAS0326は本質的に単量体形にとどまる。対照的にmAS0326は凝集を形成する。
結論
溶液中でhAS0326はmAS0326よりも安定であり、mAS0326は調製後まもなく凝集を形成し、したがって臨床用途には適していない。hAS0326が凝集しないということは、この抗体が現在の形で臨床用途に適しているであろうことを示している。
実施例7 マウスレーザー誘導脈絡膜血管新生（CNV）モデルおよび滲出型加齢性黄斑変性症（wet AMD）における眼の血管新生、血管漏出および炎症を減少するmAS0326の能力
目的
マウスレーザー誘導脈絡膜血管新生（CNV）モデルおよび滲出型加齢性黄斑変性症（wet AMD）における眼の血管新生、血管漏出および炎症を減少するmAS0326の能力を評価すること。
結果
レーザー誘導CNVの７日目および１４日目にフルオレセインナトリウムを注射して目の血管系を可視化し、レーザー火傷と漏出領域を示した。７日目にはIgG陰性対照と抗－VEGF陽性対照との間に顕著な違いは見られなかった（図６Ａ）。5μgのmAS0326で処置すると、抗－VEGF陽性対照と比較して病巣の大きさを顕著に減少した（p＜0.05）。
14日目に、採取、組織回収の直前にフルオレセイン血管造影を再度行った。7日目に見られたように、5μgのmAS0326でIgG対照と比較して顕著に病巣を減少することができた（p＜0.01、図中には示さず）（図６Ｂ）。しかし、処置群間では顕著な違いは見られなかった。
内皮マーカーIB4で血管系を染色したところ、図６Ｂの観察と同様に、いずれの処置群間にも火傷の領域に顕著な違いは見られなかった（図６Ｃ）。
CD45発現のために脈絡膜を免疫染色して、炎症細胞のレーザー火傷領域への浸潤を検出した（図６Ｄ）。1μgの抗－VEGF処置は5μgのmAS0326と同様に、IgG陰性対照と比較して炎症細胞の浸潤を顕著に減少した（それぞれp＜0.01およびp＜0.0001、統計は図中には示さず）。さらに、5μgのmAS0326処置は1μgの抗－VEGF陽性対照と比較して炎症細胞の浸潤を顕著に減少した（p＜0.01）。
結論
マウスCNVにおけるwet AMDのためのmAS0326の有効性研究では、病理学的眼の血管新生、血管漏出および炎症に対する有益な効果を概念実証した。観察された有効性は標準の抗－VEGF処置と同等、および／またはそれよりも優れていた。
目的
マウスレーザー誘導脈絡膜血管新生（CNV）モデルおよび滲出型加齢性黄斑変性症（wet AMD）における眼の血管新生、血管漏出および炎症を減少するmAS0326の能力を評価すること。
結果
レーザー誘導CNVの７日目および１４日目にフルオレセインナトリウムを注射して目の血管系を可視化し、レーザー火傷と漏出領域を示した。７日目にはIgG陰性対照と抗－VEGF陽性対照との間に顕著な違いは見られなかった（図６Ａ）。5μgのmAS0326で処置すると、抗－VEGF陽性対照と比較して病巣の大きさを顕著に減少した（p＜0.05）。
14日目に、採取、組織回収の直前にフルオレセイン血管造影を再度行った。7日目に見られたように、5μgのmAS0326でIgG対照と比較して顕著に病巣を減少することができた（p＜0.01、図中には示さず）（図６Ｂ）。しかし、処置群間では顕著な違いは見られなかった。
内皮マーカーIB4で血管系を染色したところ、図６Ｂの観察と同様に、いずれの処置群間にも火傷の領域に顕著な違いは見られなかった（図６Ｃ）。
CD45発現のために脈絡膜を免疫染色して、炎症細胞のレーザー火傷領域への浸潤を検出した（図６Ｄ）。1μgの抗－VEGF処置は5μgのmAS0326と同様に、IgG陰性対照と比較して炎症細胞の浸潤を顕著に減少した（それぞれp＜0.01およびp＜0.0001、統計は図中には示さず）。さらに、5μgのmAS0326処置は1μgの抗－VEGF陽性対照と比較して炎症細胞の浸潤を顕著に減少した（p＜0.01）。
結論
マウスCNVにおけるwet AMDのためのmAS0326の有効性研究では、病理学的眼の血管新生、血管漏出および炎症に対する有益な効果を概念実証した。観察された有効性は標準の抗－VEGF処置と同等、および／またはそれよりも優れていた。
実施例8 wet AMDのマウスレーザー誘導CNVモデルにおける眼の血管新生、血管漏出および炎症を減少するhAS0326の能力
目的
wet AMDのマウスレーザー誘導CNVモデルにおける眼の血管新生、血管漏出および炎症を減少するhAS0326の能力を評価すること。
結果
実施例7で上述したmAS0326のCNV試験とは対照的に、食塩水を陰性対照として用いたhAS0326のCNV試験では対照処置群との違いは明らかだった。7日目に全ての処置は食塩水陰性対照と比較して病巣の大きさを顕著に減少した（p＜0.0001－p＜0.05、統計は示さず）（図７Ａ）。5μgのhAS0326で処置すると、抗－VEGF陽性対照と比較して病巣の大きさを顕著に減少した（それぞれp＜0.001および＜0.0001）（図７Ｂ）。hAS0326処置群間で病巣の大きさに顕著な違いはなく、hAS0326と抗－VEGF処置の組合せに顕著な効果はなかった。
内皮マーカーIB4で血管系を染色したところ、食塩水対照処置と比較して全ての処置で顕著に減少した（統計は示さず）（図７Ｃ）。いずれの処置群間にもIB4で定める火傷の領域に顕著な違いは見られなかった（図７Ｃ）。
CD45発現のために脈絡膜を免疫染色したところ、全ての処置でIgG陰性対照と比較して炎症細胞の浸潤を顕著に減少した（統計は図中に示さず）。組合せ処置は全ての他の処置群と比較して炎症性浸潤を顕著に減少した（図７Ｄ）。
結論
マウスCNVにおけるwet AMDのためのhAS0326の有効性研究では、病理学的眼の血管新生、血管漏出および炎症に対する有益な効果を概念実証した。mAS0326はhAS0326と同様な定性的応答をもつと思われた。hAS0326とは対照的に、CNVモデルにおける眼の病巣サイズを減少するmAS0326処置の能力は抗－VEGF処置と顕著な違いはなかった。観察されたhAS0326の有効性は、CNVモデルにおける標準の抗－VEGF処置の有効性と似ているか、および／またはそれより上回っており、抗－VEGFとhAS0326の組合せ処置は炎症の減少において、いずれかの化合物単独による処置よりも上回っていた。
目的
wet AMDのマウスレーザー誘導CNVモデルにおける眼の血管新生、血管漏出および炎症を減少するhAS0326の能力を評価すること。
結果
実施例7で上述したmAS0326のCNV試験とは対照的に、食塩水を陰性対照として用いたhAS0326のCNV試験では対照処置群との違いは明らかだった。7日目に全ての処置は食塩水陰性対照と比較して病巣の大きさを顕著に減少した（p＜0.0001－p＜0.05、統計は示さず）（図７Ａ）。5μgのhAS0326で処置すると、抗－VEGF陽性対照と比較して病巣の大きさを顕著に減少した（それぞれp＜0.001および＜0.0001）（図７Ｂ）。hAS0326処置群間で病巣の大きさに顕著な違いはなく、hAS0326と抗－VEGF処置の組合せに顕著な効果はなかった。
内皮マーカーIB4で血管系を染色したところ、食塩水対照処置と比較して全ての処置で顕著に減少した（統計は示さず）（図７Ｃ）。いずれの処置群間にもIB4で定める火傷の領域に顕著な違いは見られなかった（図７Ｃ）。
CD45発現のために脈絡膜を免疫染色したところ、全ての処置でIgG陰性対照と比較して炎症細胞の浸潤を顕著に減少した（統計は図中に示さず）。組合せ処置は全ての他の処置群と比較して炎症性浸潤を顕著に減少した（図７Ｄ）。
結論
マウスCNVにおけるwet AMDのためのhAS0326の有効性研究では、病理学的眼の血管新生、血管漏出および炎症に対する有益な効果を概念実証した。mAS0326はhAS0326と同様な定性的応答をもつと思われた。hAS0326とは対照的に、CNVモデルにおける眼の病巣サイズを減少するmAS0326処置の能力は抗－VEGF処置と顕著な違いはなかった。観察されたhAS0326の有効性は、CNVモデルにおける標準の抗－VEGF処置の有効性と似ているか、および／またはそれより上回っており、抗－VEGFとhAS0326の組合せ処置は炎症の減少において、いずれかの化合物単独による処置よりも上回っていた。
実施例9 糖尿病性網膜症のラットストレプトゾトシン（STZ）モデルにおける、hAS0326の眼血管新生を減少する能力
目的
糖尿病性網膜症のラットストレプトゾトシン（STZ）モデルにおける、hAS0326の眼血管新生を減少する能力を評価すること。
結果
STZモデルの発症前には処置群間で血管領域に統計的差はなかった（図８Ａ）。
高血糖の誘導を伴うSTZ処置による発症の21日後（データ示さず）に、5μgのhAS0326単独処置または1μgの抗－VEGFと5μgのhAS032の組合せ処置はいずれも、食塩水陰性対照と比較して病巣の大きさを顕著に減少した（それぞれp＜0.001および＜0.0001、統計は示さず）（図８Ｂ）。処置の効率を比較すると、1μgの抗－VEGFと5μgのhAS032の組合せ処置は、抗－VEGF陽性対照と比較して病巣の大きさを顕著に減少した（p＜0.05）（図８Ｂ）。
結論
糖尿病性網膜症のラットストレプトゾトシン（STZ）モデルにおける、血管漏出の減少におけるhAS0326の有効性研究は、抗－VEGFと同等の有益な効果を概念実証した。
目的
糖尿病性網膜症のラットストレプトゾトシン（STZ）モデルにおける、hAS0326の眼血管新生を減少する能力を評価すること。
結果
STZモデルの発症前には処置群間で血管領域に統計的差はなかった（図８Ａ）。
高血糖の誘導を伴うSTZ処置による発症の21日後（データ示さず）に、5μgのhAS0326単独処置または1μgの抗－VEGFと5μgのhAS032の組合せ処置はいずれも、食塩水陰性対照と比較して病巣の大きさを顕著に減少した（それぞれp＜0.001および＜0.0001、統計は示さず）（図８Ｂ）。処置の効率を比較すると、1μgの抗－VEGFと5μgのhAS032の組合せ処置は、抗－VEGF陽性対照と比較して病巣の大きさを顕著に減少した（p＜0.05）（図８Ｂ）。
結論
糖尿病性網膜症のラットストレプトゾトシン（STZ）モデルにおける、血管漏出の減少におけるhAS0326の有効性研究は、抗－VEGFと同等の有益な効果を概念実証した。
実施例10 低pHおよび熱ストレスはモノクローナル抗体HG HYB 7-5、HG HYB 7-14、mAS0326およびhAS0326の凝集を誘導し、hAS0326の優位な安定性を示す。
目的
HG Hyb 7-5（HYB7-5）、HG Hyb 7-14（HYB7-14）、mAS0326およびhAS0326の安定性を評価、比較するために、モノクローナル抗体（Mabs）を熱ストレスに付した。Mabsを低pHおよび高温にさらすことによりMabsの高分子量形（凝集体）の形成を誘導し、可溶性の凝集体をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）で分析した。不溶性凝集体の量を遠心分離によて試験し、タンパク質濃度を測定した。
材料および方法
サイズ排除クロマトグラフィー
HG Hyb 7-5、HG Hyb 7-14、mAS0326およびhAS0326をHiTrapカラムタンパク質A（GE Healthcare）5mlで精製し、25 mM Tris、25 mM NaCl pH 7.2 で洗浄し、次いで100 mM クエン酸 pH 3.5で溶出した。ウイルス不活性化工程としてMabsを溶出バッファー中で30分インキュベートし、1 M トリス pH 8.6を用いてpH 5 に調整した。50℃で5日および10日インキュベートした後、試料をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。6 mg/mlで調製した各ストレスをかけた試料上澄み30μlを25℃で作動させたカラム(MabPac SEC-1、Thermo Scientific)上に注入し、280nmでの吸光度を記録した。全溶出時間は30分で、流速は0.76 ml／分だった。移動相はリン酸ナトリウム50mm、pH 6.8および塩化ナトリウム300mmを含む。高分子量（HMW）ピークは排除された容積と抗－MFAP4（単量体）ピークの開始との間の領域の全てを含んでいた。集積した領域を全集積領域の比率とした。
凝集体の濃度
凝集体として存在する元のタンパク質の比率を評価するために、50℃で10日間ストレスをかけた試料を12,000rpmで遠心分離して不溶性物質をペレットにし、NanoDrop ONE UV可視分光光度計(Thermo Scientific)上のA280を測定することによって遠心分離の前後のタンパク質濃度を決定した。
目的
HG Hyb 7-5（HYB7-5）、HG Hyb 7-14（HYB7-14）、mAS0326およびhAS0326の安定性を評価、比較するために、モノクローナル抗体（Mabs）を熱ストレスに付した。Mabsを低pHおよび高温にさらすことによりMabsの高分子量形（凝集体）の形成を誘導し、可溶性の凝集体をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）で分析した。不溶性凝集体の量を遠心分離によて試験し、タンパク質濃度を測定した。
材料および方法
サイズ排除クロマトグラフィー
HG Hyb 7-5、HG Hyb 7-14、mAS0326およびhAS0326をHiTrapカラムタンパク質A（GE Healthcare）5mlで精製し、25 mM Tris、25 mM NaCl pH 7.2 で洗浄し、次いで100 mM クエン酸 pH 3.5で溶出した。ウイルス不活性化工程としてMabsを溶出バッファー中で30分インキュベートし、1 M トリス pH 8.6を用いてpH 5 に調整した。50℃で5日および10日インキュベートした後、試料をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。6 mg/mlで調製した各ストレスをかけた試料上澄み30μlを25℃で作動させたカラム(MabPac SEC-1、Thermo Scientific)上に注入し、280nmでの吸光度を記録した。全溶出時間は30分で、流速は0.76 ml／分だった。移動相はリン酸ナトリウム50mm、pH 6.8および塩化ナトリウム300mmを含む。高分子量（HMW）ピークは排除された容積と抗－MFAP4（単量体）ピークの開始との間の領域の全てを含んでいた。集積した領域を全集積領域の比率とした。
凝集体の濃度
凝集体として存在する元のタンパク質の比率を評価するために、50℃で10日間ストレスをかけた試料を12,000rpmで遠心分離して不溶性物質をペレットにし、NanoDrop ONE UV可視分光光度計(Thermo Scientific)上のA280を測定することによって遠心分離の前後のタンパク質濃度を決定した。
結果
SECによってMabsの3つの高分子形が観察され、これらの保持容量を表1に示しており、その保持容量は単量体モノクローナル抗体hAS0326と比較して減少している。したがって、表1はサイズ排除クロマトグラフィー(MabPac SEC-1カラム、Thermo Scientific)で観察された高分子量（HMW）形（凝集体）について、全ての実験とそれぞれの保持容量をまとめて示す。
SECによってMabsの3つの高分子形が観察され、これらの保持容量を表1に示しており、その保持容量は単量体モノクローナル抗体hAS0326と比較して減少している。したがって、表1はサイズ排除クロマトグラフィー(MabPac SEC-1カラム、Thermo Scientific)で観察された高分子量（HMW）形（凝集体）について、全ての実験とそれぞれの保持容量をまとめて示す。
低pHストレス試験
タンパク質Aカラム上でMabsを並行して精製し、pH 3.5、30分でウイルス不活性化工程を行った。表2は、低pHウイルス不活性化行程後の抗－MFAP4 Mabsの高分子量（HMW）形の分布を示し、HG Hyb 7-14とhAS0326のみが単分散を示した。したがって、表2は、タンパク質A精製とpH 3.5、30分でウイルス不活性化を行った後にサイズ排除クロマトグラフィーで観察された抗－MFAP4およびHMWs（可溶性HMW形）の比率を示す。
タンパク質Aカラム上でMabsを並行して精製し、pH 3.5、30分でウイルス不活性化工程を行った。表2は、低pHウイルス不活性化行程後の抗－MFAP4 Mabsの高分子量（HMW）形の分布を示し、HG Hyb 7-14とhAS0326のみが単分散を示した。したがって、表2は、タンパク質A精製とpH 3.5、30分でウイルス不活性化を行った後にサイズ排除クロマトグラフィーで観察された抗－MFAP4およびHMWs（可溶性HMW形）の比率を示す。
時間間隔を伴う熱ストレス試験
Mabsの熱ストレス試験を行い、可溶性HMW形の量を評価するために試料を5日目および10日目にSECで分析した。表3および表4に示すように、hAS0326がどちらの条件でも最小量のHMWを示した。したがって、表3は50℃で5日間熱ストレスをかけた後にサイズ排除クロマトグラフィーで観察された抗－MFAP4およびHMW形の比率を示し、表4は50℃で10日間熱ストレスをかけた後にサイズ排除クロマトグラフィーで観察された抗－MFAP4およびHMW形の比率を示す。
Mabsの熱ストレス試験を行い、可溶性HMW形の量を評価するために試料を5日目および10日目にSECで分析した。表3および表4に示すように、hAS0326がどちらの条件でも最小量のHMWを示した。したがって、表3は50℃で5日間熱ストレスをかけた後にサイズ排除クロマトグラフィーで観察された抗－MFAP4およびHMW形の比率を示し、表4は50℃で10日間熱ストレスをかけた後にサイズ排除クロマトグラフィーで観察された抗－MFAP4およびHMW形の比率を示す。
不溶性の凝集体として存在する元のタンパク質の比率を評価するために、ストレスをかけた試料（50℃で熱ストレス）を12,000rpmで30分遠心分離して不溶性物質をペレットにし、NanoDrop ONE UV可視分光光度計(Thermo Scientific)上のA280を測定することによって遠心分離の前後のタンパク質濃度を決定した。得られた結果を表5に示し、ここでmAS0326およびHG Hyb 7-1とは異なり、hAS0326は50℃、10日間の後にも不溶性凝集体を何ら形成しなかった。
結論
低pHおよび熱ストレス後の凝集体形成は、mAS0326、HG Hyb 7-5、およびHG Hyb 7-14と比較して、hAS0326のでは顕著に低く、これはhAS0326の安定性が顕著に高いことを示す。
低pHおよび熱ストレス後の凝集体形成は、mAS0326、HG Hyb 7-5、およびHG Hyb 7-14と比較して、hAS0326のでは顕著に低く、これはhAS0326の安定性が顕著に高いことを示す。
実施例11 網膜内皮細胞のMFAP4誘導遊走の阻害－in vitro 研究
目的
MFAP4誘導の細胞活性化に対するhAS0326およびその変異体の効果を研究するために、網膜内皮細胞遊走アッセイを行った。全長hAS0326、抗原結合性断片(Fab)、および F(ab’)2 (2つのFabを含む)を試験した。
材料および方法
全長抗体および抗体変異体の発現
全長および抗体断片はEXPI CHO細胞（Thermo Scientific）で製造者の勧めに従って発現させた。
内皮遊走アッセイ
実験は修飾Boyden遊走アッセイとヒト網膜微小血管内皮細胞（Neuromics）を用いて行った。8μmのトランスウェルフィルター（Falcon cat#35097）の下側を組換えヒトMFAP4 10μg/cm2 で終夜4℃でコーティングし、PBSで洗浄した。0.5％FBSを含む0.5 mlの内皮基本培地（PromoCell）中の50,000細胞をフィルターの先端側に加えて、0.5％FBSを含む1 mlの内皮基本培地をフィルターの基底側に加えた。遊走阻害のために、種々のMabsおよびMab変異体をVEGF (25 ng/ml)と一緒に下のチャンバーに加えた。3.5時間後、上側表面を綿棒で優しくなぜて非遊走細胞を除去し、PBS中で洗浄して、フィルターをReastain Quick-Diff キット(Gentaur Molecular Products)で染色した。膜を横切った細胞を明視野顕微鏡（200倍）で数えた。
目的
MFAP4誘導の細胞活性化に対するhAS0326およびその変異体の効果を研究するために、網膜内皮細胞遊走アッセイを行った。全長hAS0326、抗原結合性断片(Fab)、および F(ab’)2 (2つのFabを含む)を試験した。
材料および方法
全長抗体および抗体変異体の発現
全長および抗体断片はEXPI CHO細胞（Thermo Scientific）で製造者の勧めに従って発現させた。
内皮遊走アッセイ
実験は修飾Boyden遊走アッセイとヒト網膜微小血管内皮細胞（Neuromics）を用いて行った。8μmのトランスウェルフィルター（Falcon cat#35097）の下側を組換えヒトMFAP4 10μg/cm2 で終夜4℃でコーティングし、PBSで洗浄した。0.5％FBSを含む0.5 mlの内皮基本培地（PromoCell）中の50,000細胞をフィルターの先端側に加えて、0.5％FBSを含む1 mlの内皮基本培地をフィルターの基底側に加えた。遊走阻害のために、種々のMabsおよびMab変異体をVEGF (25 ng/ml)と一緒に下のチャンバーに加えた。3.5時間後、上側表面を綿棒で優しくなぜて非遊走細胞を除去し、PBS中で洗浄して、フィルターをReastain Quick-Diff キット(Gentaur Molecular Products)で染色した。膜を横切った細胞を明視野顕微鏡（200倍）で数えた。
結果
全長および抗体断片は全て内皮遊走を阻害することができたが、その効率は異なっていた。全長hAS0326は内皮遊走をかなり阻害したが、hAS0326の組換えFab断片は用量を増やしても同等の阻害を推測することはできなかった（図９Ａ）。
hAS0326のF(ab’)2断片はhAS0326と同程度に移動を阻害した（図９Ｂ）。もしも効率のよいF(ab’)2（完全抗体と比較してin vitroで十分作用する）が作製できたら、これらはin vivoで完全抗体よりもうまく作用できることが十分確立されていると考えられる。なぜなら、免疫グロブリン断片の使用は抗体のFc部分と細胞上のFc受容体との間の非特異的結合を排除するからである。したがって、効率のよいhAS0326のF(ab’)2断片の作製は有望な候補となる。
結論
このin vivoアッセイは、全長hAS0326、hAS0326 Fab、およびhAS0326 F(ab’)2 が程度の差はあっても内皮遊走を阻害する能力を示す。
全長および抗体断片は全て内皮遊走を阻害することができたが、その効率は異なっていた。全長hAS0326は内皮遊走をかなり阻害したが、hAS0326の組換えFab断片は用量を増やしても同等の阻害を推測することはできなかった（図９Ａ）。
hAS0326のF(ab’)2断片はhAS0326と同程度に移動を阻害した（図９Ｂ）。もしも効率のよいF(ab’)2（完全抗体と比較してin vitroで十分作用する）が作製できたら、これらはin vivoで完全抗体よりもうまく作用できることが十分確立されていると考えられる。なぜなら、免疫グロブリン断片の使用は抗体のFc部分と細胞上のFc受容体との間の非特異的結合を排除するからである。したがって、効率のよいhAS0326のF(ab’)2断片の作製は有望な候補となる。
結論
このin vivoアッセイは、全長hAS0326、hAS0326 Fab、およびhAS0326 F(ab’)2 が程度の差はあっても内皮遊走を阻害する能力を示す。
実施例12 エピトープとパラトープ間の相互作用のX線結晶学
目的
MFAP4のエピトープに結合するために重要なパラトープのアミノ酸を決定するためにＸ線結晶学を用いた。
材料および方法
Fabを作製するために、抗－MFAP4を20 mM リン酸ナトリウム、10 mM EDTAおよび20 mM L-システイン pH 7.4 中で4時間、37℃で、固定化パパインビーズ（Thermo scientific）と インキュベートした。遠心分離でビーズをペレットとし、上澄みを50mM酢酸ナトリウムpH 5.5で平衡化した1 ml Mono S カラム上に充填した。20から 500 mM NaClの勾配でFabを溶出し、次いで20 mM Hepes、150 mM NaCl pH 7.4中で平衡化した24 ml Superdex 200 Increase上のサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。結晶化の前にMFAP4を自前で調製したEndoglycosidase Hを用いて18時間4℃で脱グリコシル化した。脱グリコシル化MFAP4を過剰のFabと混合し、複合体を20 mM Hepes pH 7.4、150 mM NaCl中で平衡化した24 ml Superdex 200 Increase上で精製した。単離した複合体を6 mg/mlまで濃縮し、0.14 Mリン酸二アンモニウム、14% w/v ポリエチレングリコール3,350を含むリザーバー溶液0.5μlとタンパク質0.5μlと混合した後、19℃で蒸気拡散によって結晶化した。データ収集の前に、20％グリセロールを補充したリザーバー溶液に結晶を漬けて、液体窒素中でフラッシュ冷却した。
回折データをESRF ID23-1で収集し、XDS および XSCALE (Kabsch, W. (2010) Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 133-144)で処理、スケール化した。単量体FIBCD1 (PDB ID 4M7H) および生殖細胞系列Fab (PDB ID 4JPI)をサーチモデルとして用いて、Phaser (McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., および Read, R. J. (2007) Journal of applied crystallography 40, 658-674)による分子置換法によって構造を決定した。反復法で構造を手動でCootに再構築し、位置調整、グループ化B-因子およびTLSグループおよび非結晶学的対称拘束を用いて、Phenix. Refine (Afonine, P. V. et al. (2012) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 68, 352-367)で精密化した。モデルのタンパク質部分を完成した後、文献記載のように (Croll, T. I., et al. (2016) Acta Crystallogr D Struct Biol 72, 1006-1016) 分子動力学拘束実空間フィッティングを用いて、構造を電子密度マップにフィッティングさせた。次にCa2+イオンと2つの水配位分子をそれぞれの位置に挿入し、FIBCD1 (Shrive, A. K. ら(2014) J Biol Chem 289, 2880-2887)での観察に従ってカルシウムリガンド配位構造を拘束した。最終的精密化サイクルにおいて、位置調整に加えていくつかの個々のB-因子精密化サイクルを許可した。最終的な構造は、回折データの分析を考慮するとMolprobity (Chen, V. B. ら (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 12-21)に従う素晴らしい立体化学を示した。分子内インターフェースはPyMol 1.8.6 (Schrodinger, LLC. (2015) The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8.) および PISA (Krissinel, E. et al. (2007) J Mol Biol 372, 774-797)で分析し、図面はPyMolで作成した。
目的
MFAP4のエピトープに結合するために重要なパラトープのアミノ酸を決定するためにＸ線結晶学を用いた。
材料および方法
Fabを作製するために、抗－MFAP4を20 mM リン酸ナトリウム、10 mM EDTAおよび20 mM L-システイン pH 7.4 中で4時間、37℃で、固定化パパインビーズ（Thermo scientific）と インキュベートした。遠心分離でビーズをペレットとし、上澄みを50mM酢酸ナトリウムpH 5.5で平衡化した1 ml Mono S カラム上に充填した。20から 500 mM NaClの勾配でFabを溶出し、次いで20 mM Hepes、150 mM NaCl pH 7.4中で平衡化した24 ml Superdex 200 Increase上のサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。結晶化の前にMFAP4を自前で調製したEndoglycosidase Hを用いて18時間4℃で脱グリコシル化した。脱グリコシル化MFAP4を過剰のFabと混合し、複合体を20 mM Hepes pH 7.4、150 mM NaCl中で平衡化した24 ml Superdex 200 Increase上で精製した。単離した複合体を6 mg/mlまで濃縮し、0.14 Mリン酸二アンモニウム、14% w/v ポリエチレングリコール3,350を含むリザーバー溶液0.5μlとタンパク質0.5μlと混合した後、19℃で蒸気拡散によって結晶化した。データ収集の前に、20％グリセロールを補充したリザーバー溶液に結晶を漬けて、液体窒素中でフラッシュ冷却した。
回折データをESRF ID23-1で収集し、XDS および XSCALE (Kabsch, W. (2010) Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 133-144)で処理、スケール化した。単量体FIBCD1 (PDB ID 4M7H) および生殖細胞系列Fab (PDB ID 4JPI)をサーチモデルとして用いて、Phaser (McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., および Read, R. J. (2007) Journal of applied crystallography 40, 658-674)による分子置換法によって構造を決定した。反復法で構造を手動でCootに再構築し、位置調整、グループ化B-因子およびTLSグループおよび非結晶学的対称拘束を用いて、Phenix. Refine (Afonine, P. V. et al. (2012) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 68, 352-367)で精密化した。モデルのタンパク質部分を完成した後、文献記載のように (Croll, T. I., et al. (2016) Acta Crystallogr D Struct Biol 72, 1006-1016) 分子動力学拘束実空間フィッティングを用いて、構造を電子密度マップにフィッティングさせた。次にCa2+イオンと2つの水配位分子をそれぞれの位置に挿入し、FIBCD1 (Shrive, A. K. ら(2014) J Biol Chem 289, 2880-2887)での観察に従ってカルシウムリガンド配位構造を拘束した。最終的精密化サイクルにおいて、位置調整に加えていくつかの個々のB-因子精密化サイクルを許可した。最終的な構造は、回折データの分析を考慮するとMolprobity (Chen, V. B. ら (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 12-21)に従う素晴らしい立体化学を示した。分子内インターフェースはPyMol 1.8.6 (Schrodinger, LLC. (2015) The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8.) および PISA (Krissinel, E. et al. (2007) J Mol Biol 372, 774-797)で分析し、図面はPyMolで作成した。
結果
パラトープの強く相互作用しパッケージングするアミノ酸は可変重鎖中の3つ全てのCDR由来の残基を含み、一方可変軽鎖では2つのCDRのみ、すなわち、CDR1とCDR3がMFAP4中のエピトープと強く相互作用するアミノ酸を示す。
可変重鎖中の強く相互作用するアミノ酸は以下のものである：
CDR1中：配列番号2および4についてTrp-33；配列番号12についてTrp-3；
CDR3中：配列番号2および4についてGlu-99；配列番号14についてGlu-1；
CDR3中：配列番号2および4についてTrp-107；配列番号14についてTrp-9。
可変軽鎖中の強く相互作用するアミノ酸は以下のものである：
CDR1中：配列番号1および3についてTyr-32；配列番号9についてTyr-9；
CDR3中：配列番号1および3についてTyr-94；配列番号11についてTyr-6。
さらに、結果は可変重鎖中の２つのアミノ酸がパッケージング、すなわち、パラトープの正しい折りたたみにとって重要であることを示した：
CDR1中：配列番号2および4についてMet-34；配列番号12についてMet-4；
CDR2中：配列番号2および4についてPro-53；配列番号13についてPro-4。
結論
X線結晶学によってhAS0326パラトープおよびそのMFAP4エピトープへの結合を定めることに成功した。これらの分析は、パラトープの5つのアミノ酸がエピトープと強く結合し、またパッケージングのためには2つのアミノ酸が重要であることを示す。したがって、これらのアミノ酸の1以上に部位特異的変異導入することによってパラトープのエピトープへの結合をなくしたり、弱めたりできるとの仮説が成り立ちうる。
パラトープの強く相互作用しパッケージングするアミノ酸は可変重鎖中の3つ全てのCDR由来の残基を含み、一方可変軽鎖では2つのCDRのみ、すなわち、CDR1とCDR3がMFAP4中のエピトープと強く相互作用するアミノ酸を示す。
可変重鎖中の強く相互作用するアミノ酸は以下のものである：
CDR1中：配列番号2および4についてTrp-33；配列番号12についてTrp-3；
CDR3中：配列番号2および4についてGlu-99；配列番号14についてGlu-1；
CDR3中：配列番号2および4についてTrp-107；配列番号14についてTrp-9。
可変軽鎖中の強く相互作用するアミノ酸は以下のものである：
CDR1中：配列番号1および3についてTyr-32；配列番号9についてTyr-9；
CDR3中：配列番号1および3についてTyr-94；配列番号11についてTyr-6。
さらに、結果は可変重鎖中の２つのアミノ酸がパッケージング、すなわち、パラトープの正しい折りたたみにとって重要であることを示した：
CDR1中：配列番号2および4についてMet-34；配列番号12についてMet-4；
CDR2中：配列番号2および4についてPro-53；配列番号13についてPro-4。
結論
X線結晶学によってhAS0326パラトープおよびそのMFAP4エピトープへの結合を定めることに成功した。これらの分析は、パラトープの5つのアミノ酸がエピトープと強く結合し、またパッケージングのためには2つのアミノ酸が重要であることを示す。したがって、これらのアミノ酸の1以上に部位特異的変異導入することによってパラトープのエピトープへの結合をなくしたり、弱めたりできるとの仮説が成り立ちうる。
Claims (17)
- ・配列番号１または３のアミノ酸配列、または配列番号１または３と少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号２または４のアミノ酸配列、または配列番号２または４と少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む、抗－ＭＦＡＰ４抗体であって、
前記軽鎖可変領域は配列番号９のＣＤＲ１領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、および配列番号１１のＣＤＲ３領域を含み、
前記重鎖可変領域は配列番号１２のＣＤＲ１領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、および配列番号１４のＣＤＲ３領域を含む、抗－ＭＦＡＰ４抗体。 - 以下のものを含む、請求項１に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体：
・配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。 - 以下のものを含む、請求項１又は２に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体：
・配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
・配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。 - 前記抗－ＭＦＡＰ４抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、重鎖と軽鎖が柔軟なリンカーで連結された抗体、Ｆｖ分子、抗原結合性断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２分子、ヒト化抗体、およびキメラ抗体からなる群から選択される、請求項１－３のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体。
- 前記抗－ＭＦＡＰ４抗体がＦ（ａｂ’）２分子である、請求項１－４のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体。
- 前記抗－ＭＦＡＰ４抗体がヒト化抗体である、請求項１－５のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体。
- 前記抗－ＭＦＡＰ４抗体が検出可能な標識または毒性あるいは治療活性を有する物質と結合されている、請求項１－６のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体。
- １＊１０－７Ｍ未満のｒｈＭＦＡＰ４に対するＫＤ値をもつ、請求項１－７のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体。
- 前記抗－ＭＦＡＰ４抗体の少なくとも９５％が単量体形である、請求項１－８のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体。
- 前記抗－ＭＦＡＰ４抗体がｒｈＭＦＡＰ４ Ｎ－末端ドメイン中のＲＧＤ－インテグリン相互作用配列と結合しない、請求項１－９のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体。
- 請求項１－１０のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体をコードするベクター。
- 請求項１－１０のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体を発現する細胞、および／または請求項１１に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項１－１０のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体、および１以上の生理学的に受容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤を含む薬学的組成物。
- 医薬用途のための請求項１－１０のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体および／または請求項１３に記載の薬学的組成物。
- 病理学的血管新生、血管漏出、炎症または眼の繊維症などで特徴づけられる、哺乳動物における血管増殖性疾患の予防または治療に用いるための請求項１－１０のいずれか一項に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体または請求項１３に記載の薬学的組成物。
- 眼の病理学的血管新生で特徴づけられる障害が、地図状萎縮および増殖性ＡＭＤを含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症、網膜症、高血圧性網膜症、硝子体牽引症、増殖性ＤＲおよび糖尿病黄斑浮腫を含む糖尿病性網膜症（ＤＲ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体または薬学的組成物。
- 血管増殖性疾患が癌である、請求項１５に記載の抗－ＭＦＡＰ４抗体または薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17199552.5 | 2017-11-01 | ||
| EP17199552 | 2017-11-01 | ||
| PCT/EP2018/079949 WO2019086580A1 (en) | 2017-11-01 | 2018-11-01 | Antibodies against mfap4 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021513360A JP2021513360A (ja) | 2021-05-27 |
| JP2021513360A5 JP2021513360A5 (ja) | 2021-12-09 |
| JP7382343B2 true JP7382343B2 (ja) | 2023-11-16 |
Family
ID=60201899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020558681A Active JP7382343B2 (ja) | 2017-11-01 | 2018-11-01 | Ｍｆａｐ４に対する抗体 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11993649B2 (ja) |
| EP (1) | EP3704147A1 (ja) |
| JP (1) | JP7382343B2 (ja) |
| CN (1) | CN111315771B (ja) |
| AU (1) | AU2018359635A1 (ja) |
| CA (1) | CA3118361A1 (ja) |
| WO (1) | WO2019086580A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2022259467A1 (en) | 2021-04-12 | 2023-10-05 | Syddansk Universitet | Mfap4 and treatment of fibrosis |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009103157A1 (en) | 2008-02-22 | 2009-08-27 | University Health Network | Mfap4 as a marker for regulatory cells and anti-cancer cells |
| JP2013018715A (ja) | 2011-07-07 | 2013-01-31 | Kao Corp | Ｍｆａｐ−４産生促進剤 |
| WO2014114298A1 (en) | 2013-01-23 | 2014-07-31 | Syddansk Universitet | Mfap4 binding antibodies blocking the interaction between mfap4 and integrin receptors |
| WO2016008498A1 (en) | 2014-07-17 | 2016-01-21 | Syddansk Universitet | Mfap4 binding antibody blocking the interaction between mfap4 and integrin receptors |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106771201A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-31 | 江西惠肽生物科技有限公司 | 用于肝纤维化诊断试剂盒及其检测方法 |
-
2018
- 2018-11-01 US US16/760,490 patent/US11993649B2/en active Active
- 2018-11-01 CN CN201880070581.2A patent/CN111315771B/zh active Active
- 2018-11-01 CA CA3118361A patent/CA3118361A1/en active Pending
- 2018-11-01 JP JP2020558681A patent/JP7382343B2/ja active Active
- 2018-11-01 WO PCT/EP2018/079949 patent/WO2019086580A1/en unknown
- 2018-11-01 EP EP18800872.6A patent/EP3704147A1/en active Pending
- 2018-11-01 AU AU2018359635A patent/AU2018359635A1/en active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009103157A1 (en) | 2008-02-22 | 2009-08-27 | University Health Network | Mfap4 as a marker for regulatory cells and anti-cancer cells |
| JP2013018715A (ja) | 2011-07-07 | 2013-01-31 | Kao Corp | Ｍｆａｐ−４産生促進剤 |
| WO2014114298A1 (en) | 2013-01-23 | 2014-07-31 | Syddansk Universitet | Mfap4 binding antibodies blocking the interaction between mfap4 and integrin receptors |
| WO2016008498A1 (en) | 2014-07-17 | 2016-01-21 | Syddansk Universitet | Mfap4 binding antibody blocking the interaction between mfap4 and integrin receptors |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3118361A1 (en) | 2019-05-09 |
| EP3704147A1 (en) | 2020-09-09 |
| CN111315771A (zh) | 2020-06-19 |
| AU2018359635A2 (en) | 2020-05-21 |
| AU2018359635A1 (en) | 2020-05-07 |
| WO2019086580A1 (en) | 2019-05-09 |
| JP2021513360A (ja) | 2021-05-27 |
| US20230047179A1 (en) | 2023-02-16 |
| US11993649B2 (en) | 2024-05-28 |
| CN111315771B (zh) | 2023-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2020019135A1 (zh) | 一种抗cd47抗体及其应用 | |
| KR101774121B1 (ko) | 이중특이적 항-vegf/항-ang-2 항체 및 안 혈관 질환의 치료에 있어서 이의 용도 | |
| JP2022101694A (ja) | ＶＥ－ＰＴＰ（ＨＰＴＰ－β）を標的化するヒト化モノクローナル抗体 | |
| JP2013531470A5 (ja) | ||
| JP2008512349A (ja) | タンパク質の安定な液体処方物および凍結乾燥処方物 | |
| JP2020511946A (ja) | グレムリン−１の結晶構造及び阻害抗体 | |
| KR20200138290A (ko) | C3-결합제 및 이의 사용 방법 | |
| CA2915386A1 (en) | Cb1 receptor antigen-binding proteins and uses thereof | |
| EP2734546A1 (en) | Apelin antigen-binding proteins and uses thereof | |
| JP6925981B2 (ja) | Ｖｅｇｆとｎｒｐ１との結合を阻害する抗体 | |
| JP2022514290A (ja) | 改変抗体ｆｃおよび使用方法 | |
| JP7382343B2 (ja) | Ｍｆａｐ４に対する抗体 | |
| US20220251193A1 (en) | Semaphorin 3a antibodies and uses thereof | |
| AU2021304993B2 (en) | Fusion protein including complement pathway inhibitor and angiogenesis inhibitor and use thereof | |
| JP6921943B2 (ja) | 増加した眼球保持を伴う眼科用融合タンパク質 | |
| CA3228501A1 (en) | Bispecific fusion polypeptide and application thereof | |
| US20240067711A1 (en) | Anti-vegf hexameric antibody and composition comprising same | |
| RU2802307C2 (ru) | C3-связывающие агенты и способы их применения | |
| WO2023083243A1 (zh) | 一种抗il-17/vegf双功能融合蛋白及其用途 | |
| KR20220029343A (ko) | 항-ｖｅｇｆ 육량체 항체, 및 이를 포함하는 조성물 | |
| TW202246351A (zh) | Htra1結合劑及其使用方法 | |
| RU2022102753A (ru) | Fab ФРАГМЕНТ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ VEGF И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | |
| TW202228790A (zh) | 用於長效經眼遞送之非共價蛋白質－玻尿酸結合物 | |
| JP2021527679A (ja) | 補体−アナフィラトキシン吸着薬、および眼の創傷および／または線維症を有する対象の治療におけるそれらの使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201030 |
|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20201124 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20201124 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211026 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211026 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220930 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221004 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20221227 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230117 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230509 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230720 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230808 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230922 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231031 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231106 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7382343 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |