PT1569685E - Recetor do complemento 2 direcionado a moduladores do complemento - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"RECETOR DO COMPLEMENTO 2 DIRECIONADO A MODULADORES DO COMPLEMENTO"

Antecedentes da invenção

Complemento é o termo coletivo para uma série de proteínas do sangue e é um mecanismo efetor principal do sistema imunitário. A ativação do complemento e a sua deposição nas estruturas alvo pode levar à lise celular direta mediada pelo complemento, ou pode levar indiretamente à destruição da célula ou do tecido devido à geração de moduladores poderosos de inflamação e ao recrutamento e ativação de células efetoras imunitárias. Produtos da ativação do complemento que medeiam a lesão do tecido são gerados em vários pontos na via do complemento. A ativação inapropriada do complemento no tecido hospedeiro desempenha um papel importante na patologia de várias doenças autoimunes e inflamatórias, e é igualmente responsável por vários estados de doença associados com bioincompatibilidade, e.g., inflamação pós-cardiopulmonar e rejeição do transplante. A inibição do complemento representa uma modalidade terapêutica potencial para o tratamento de tais doenças imunomediadas e estados de doença. Proteínas inibidoras do complemento que inibem sistemicamente o complemento têm-se mostrado eficazes em vários modelos animais da doença (e em alguns ensaios clínicos), mas os inibidores do complemento que são direcionados a um local de doença e de ativação do complemento oferecem vantagens potenciais significativas no que diz respeito à segurança e eficácia.

Em indivíduos saudáveis, a deposição do complemento nas membranas do tecido hospedeiro é evitada por proteínas 2 inibidoras do complemento expressas à superfície da célula. Estas proteínas inibidoras do complemento são também expressas na superfície de células tumorais, muitas vezes em níveis aumentados, e são consideradas como sendo um importante fator que contribui para a resistência de células tumorais à imunoterapia mediada por anticorpos monoclonais (anticorpos monoclonais que visam células tumorais e ativam o complemento). 0 sistema complemento compreende uma coleção de cerca de 30 proteínas e é um dos mecanismos efetores principais do sistema imunitário. A cascata do complemento é ativada principalmente através quer da via clássica (usualmente dependente de anticorpos), quer da via alternativa (usualmente independente de anticorpos). A ativação através de qualquer das vias leva à geração de convertase C3, a qual é o complexo enzimático central da cascata. A convertase C3 quebra o soro C3 em C3a e C3b, a última dos quais se liga covalentemente ao local de ativação e leva a uma nova geração de convertase C3 (circuito de amplificação) . O produto da ativação C3b (e também a C4b gerada somente através da via clássica) e os seus produtos de degradação são opsoninas importantes e estão envolvidos na promoção da lise mediada por células das células alvo (por fagócitos e células MN) , bem como no transporte e solubilização do imunocomplexo. Os produtos da ativação C3/C4 e os seus recetores em várias células do sistema imunitário são igualmente importantes na modulação da resposta imunitária celular. As convertases C3 participam na formação da convertase C5, um complexo que quebra a C5 para render C5a e C5b. A C5a tem propriedades pró-inflamatórias e quimiotáticas poderosas e pode recrutar e ativar células efetoras imunitárias. A formação da C5b inicia a via terminal do complemento resultando na montagem sequencial das proteínas do complemento C6, C7, C8 e (C9)n 3 para formar o complexo de ataque da membrana (CAM ou C5b-9) . A formação do CAM numa membrana da célula alvo pode resultar na lise direta da célula, mas pode também causar a ativação da célula e a expressão/libertação de vários moduladores inflamatórios.

Existem duas grandes classes de inibidores do complemento de membrana; inibidores da via de ativação do complemento (inibem a formação da convertase C3) , e inibidores da via terminal do complemento (inibem a formação do CAM) . Os inibidores de membrana de ativação do complemento incluem o recetor do complemento 1 (RC1), o fator de aceleração do decaimento (FAD) e a proteína cofator de membrana (PCM). Todos eles têm uma estrutura proteica que consiste em números variáveis de unidades repetidas de cerca de 60-70 aminoácidos denominadas repetições de consenso pequenas (RCP) que são uma caracterí stica comum das proteínas de ligação a C3/C4. Foram identificados inibidores da ativação do complemento em roedores homólogos de humanos. A proteína de roedor Ycrr é um inibidor da ativação do complemento largamente distribuído que funciona de modo similar que ao FAD que à PCM. Os roedores também expressam o FDA e a PCM, embora o Ycrr pareça ser funcionalmente o regulador da ativação do complemento mais importante nos roedores. Embora não haja um homólogo do Ycrr encontrado em humanos, o estudo do Ycrr e o seu uso em modelos animais é clinicamente relevante. O controlo da via terminal do complemento e da formação do CAM em membranas da célula hospedeira ocorre principalmente através da atividade da CD59, uma glicoproteína de 20 kD largamente distribuída ligada a membranas plasmáticas por uma âncora glicofosfatidilinositol (GPI). A CD59 liga-se à C8 e à C9 no CAM a ser montado e evita a inserção da membrana. 4 Vários tipos de proteínas inibidoras do complemento estão correntemente sob investigação para terapia de doença inflamatória e estados de doença associados com bioincompatibilidade. Dois dos melhores inibidores do complemento humanos terapeuticamente caracterizados são uma forma solúvel do recetor do complemento 1 (sRCl) e um anticorpo monoclonal anti-C5. Estas proteínas inibidoras sistemicamente ativas têm mostrado eficácia em vários modelos animais de doença e mais recentemente em ensaios clínicos (1-5, 6:#1037). 0 Acm anti-C5 inibe a geração da C5a e do CAM, enquanto que a sRCl é um inibidor da ativação do complemento e também inibe a geração dos produtos de ativação C3. Formas solúveis do fator de aceleração do decaimento (FAD) humano e da proteína cofator de membrana (PCM), inibidores de membrana da ativação do complemento, têm-se igualmente mostrado serem protetores em modelos animais de inflamação e bioincompatibilidade (7-11). A CD59 é um inibidor do complemento de membrana que bloqueia a montagem do CAM, mas não afeta a geração de opsoninas do complemento ou da C3a e da C5a. As formas solúveis de CD59 têm sido produzidas, mas a sua baixa atividade funcional in vitro, particularmente na presença de soro, indica que a sCD59 terá pouca ou nenhuma eficácia terapêutica (12-15). 0 direcionamento de inibidores do complemento a locais de ativação do complemente e de doença é provável que melhore a sua eficácia. Uma vez que o complemento desempenha um papel importante na defesa do hospedeiro e no catabolismo do imunocomplexo, os inibidores do complemento direcionados podem também reduzir efeitos secundários potencialmente sérios, particularmente com a inibição do complemento a longo prazo. Recentemente, uma forma modificada de sRCl decorada com sialil Lewis x (sLex) foi preparada e mostrou que se liga a células endoteliais expressando seletinas P e 5 E. A sRClsLex mostrou ser um terapêutico mais potente do que a sRCl em modelos de roedores de doença inflamatória (16, 17). Em estudos de viabilidade in vitro, as proteínas de fusão anticorpo-FAD (18) e anticorpo-CD59 (19) mostraram ser mais efetivas na proteção de células direcionadas do que células não direcionadas do complemento. 0 direcionamento à membrana não específico de inibidores do complemento recombinantes pode também ser alcançado pela união de inibidores a péptidos insertos na membrana (20, 21) .

Os fragmentos de ativação C3 são opsoninas do complemento abundantes encontradas num local de ativação do complemento, e elas servem como ligandos para vários recetores de C3. Um tal recetor, recetor do complemento 2 (RC2), uma proteína transmembranar, desempenha um papel importante na imunidade humoral por via da sua expressão predominantemente em células B maduras e em células dendríticas foliculares (22, 23) . O RC2 é um membro da família de proteínas de ligação a C3 e consiste em 15-16 domínios de repetições de consenso pequenas (RCP), unidades estruturais que são características destas proteínas, com o local de ligação a C3 estando contido nas duas RCPs N-terminal (24, 25). O RC2 não é um inibidor do complemento e não se liga à C3b, ao contrário dos inibidores do complemento (FAD, PCM, RC1 e Ycrr). Ligandos naturais para RC2 são iC3b, C3dg e C3d, fragmentos da degradação ligados à célula da C3b que se ligam aos dois domínios da RCP N-terminal do RC2 (26, 27). A clivagem da C3 resulta inicialmente na geração e deposição de C3b na superfície da célula ativadora. O fragmento C3b está envolvido na geração de complexos enzimáticos que amplificam a cascata do complemento. Numa superfície da célula, o C3b é rapidamente convertido para inativar o iC3b, particularmente quando é depositado numa superfície do hospedeiro contendo 6 reguladores da ativação do complemento (ie. a maioria do tecido do hospedeiro). Mesmo na ausência de reguladores do complemento ligados à membrana, niveis substanciais de iC3b são formados. 0 iC3b é subsequentemente digerido até aos fragmentos ligados à membrana C3dg e depois a C3d por proteases do soro, mas este processo é relativamente lento (28, 29) . Portanto, os ligandos de C3 para o RC2 são relativamente de longa duração uma vez gerados e estarão presentes em altas concentrações em locais de ativação do complemento. A patente E.U.A. 6,458,360 descreve proteínas fundidas recombinantes solúveis as quais são estáveis no sistema circulatório mamífero compreendendo um polipéptido o qual contém um local de reconhecimento para uma molécula alvo, tal como um local de recetor do complemento, ligado à extremidade N-terminal de uma cadeia de imunoglobulina.

Sumário da invenção

De acordo com os propósitos desta invenção, como concretizado e amplamente descrito aqui, esta invenção, num aspeto, relaciona-se com RC2 direcionado a moduladores da atividade do complemento. Em particular, a invenção proporciona uma composição compreendendo uma construção, em que a construção compreende: (a) um RC2 ou um seu fragmento, em que o fragmento contém pelo menos os dois primeiros domínios de RCP N-terminal da proteína de RC2; e (b) um modulador da atividade do complemento, em que o modulador da atividade do complemento compreende um inibidor do complemento ou um seu fragmento, em que o dito inibidor do complemento é selecionado do fator de aceleração do decaimento (FAD), CD59 humana, CD59 de camundongo, Ycrr, proteína cofator de membrana (PCM), 7 recetor do complemento 1 (RC1) e um anticorpo anti-C5, em que o seu fragmento compreende RCPs 1-4 do FAD, RCPs 2-4 do FAD, CD59 humana solúvel sem a sua âncora glicosilfosfatidilinositol, CD59 de camundongo solúvel sem a sua âncora glicosilfosfatidilinositol, RCPs 1-5 do Ycrr, RCPs 1-4 da PCM, RCPs 1-4 do RC1, RCPs 8-11 do RC1, RCPs 15-18 do RC1 ou o local de ligação Clq do RC1.

Vantagens adicionais da invenção serão estabelecidas em parte na descrição que se segue, e em parte serão óbvias a partir da descrição, ou podem ser aprendidas pela prática da invenção. As vantagens da invenção serão realizadas e atingidas por meio dos elementos e das combinações particularmente apontados nas reivindicações anexas. É para ser entendido que quer a descrição geral acima mencionada, quer a descrição detalhada que se segue são somente exemplares e explicativas e não são restritivas da invenção, como reivindicado.

Breve descrição dos desenhos

Os desenhos acompanhantes, os quais são incorporados e constituem uma parte desta especificação, ilustram várias formas de realização da invenção e em conjunto com a descrição, servem para explicar os principios da invenção. A Figura 1 ilustra um diagrama de exemplos de proteínas de fusão de inibição de RC2-complemento. A Figura 2 ilustra uma análise SDS-Page e uma transferência de Western de proteínas de fusão recombinantes purificadas e de inibidores do complemento solúveis. Os géis (10% acrilamida) foram corados com azul de Coomasie. Foram desenvolvidas transferências de Western usando anticorpos para os inibidores do complemento como os anticorpos primários. A Figura 3 ilustra a ligação de proteínas de fusão recombinantes a células OHC C3-opsonizadas. As células OHC sensibilizadas para o anticorpo foram incubadas num soro deficiente em Cçjr lavadas e incubadas com inibidor do complemento solúvel (traço preto), ou com proteína de fusão com RC2 no N-terminal (traço cinzento claro) ou no exterminai (traço cinzento escuro) a 20yg/mL. A ligação das células às proteínas recombinantes foi detetada por citometria de fluxo usando Acms anti-FAD ou anti-CD59. A inibição de células OHC com TFS em vez de com inibidor do complemento deu um perfil de fluorescência similar à sFAD e sCD59. Representativas de 3 experiências separadas. A Figura 4 ilustra a análise da interação entre proteínas de fusão RC2 e C3d por ressonância de plasma de superfície. As linhas contínuas indicam diferentes concentrações de proteínas de fusão RC2. As linhas descontínuas ilustram curvas ajustadas a um modelo de ligação de Langmuir 1:1. A Figura 5 ilustra a inibição da lise mediada pelo complemento por proteínas de fusão sFAD e FAD recombinantes. Células OHC sensibilizadas para o anticorpo (painel a) ou eritrócitos de ovelha (painel b) foram incubados com proteína recombinante e 10% de soro humano (células OHC) ou 0,33% de soro humano (eritrócitos). Estas concentrações resultaram em aproximadamente 90% de lise de células não protegidas. A lise foi determinada depois de incubação de 45 min. a 37°C. A lise de fundo determinada pela incubação de células em soro inativado pelo calor foi menos de 5% e foi subtraída. Média +/- DP, n=4. 9 A Figura 6 ilustra a inibição da lise mediada pelo complemento por proteínas de fusão sCD59 e CD59 recombinantes. Células OHC sensibilizadas para o anticorpo (painel a) ou eritrócitos de ovelha (painel b) foram incubados com proteína recombinante e 10% de soro humano (células OHC) ou 0,33% de soro humano (eritrócitos). Estas concentrações resultaram em aproximadamente 90% de lise de células não protegidas. A lise foi determinada depois de incubação de 45 min. a 37°C. A lise de fundo determinada pela incubação de células em soro inativado pelo calor foi menos de 5% e foi subtraída. Média +/- DP, n=4. A Figura 7 ilustra o efeito das proteínas de fusão recombinantes na adesão de células U937. Eritrócitos de ovelha foram sensibilizados com anticorpo IgM e incubados em soro deficiente em C6. Eritrócitos com C3 opsonizada foram coincubados com células U937 na presença de 500 nM de proteína de fusão recombinante ou TFS. Depois da incubação, o número médio de células U937 ligadas por eritrócito foi determinado por microscopia. Média +/- DP, n=3. A Figura 8 ilustra a sequência < de nucleótidos e de aminoácidos prevista de RC2-FDA humana madura. Os aminoácidos sublinhados representam sequências ligantes entre RC2 e FAD. A Figura 9 ilustra a sequência < de nucleótidos e de aminoácidos previstos de RC2-CD59 humana madura. Os aminoácidos sublinhados representam sequências ligantes entre RC2 e CD5 9. A Figura ! 10 ilustra ε i sequência de nucleótidos e de aminoácidos previstos de FDA-RC2 humana madura. Os aminoácidos sublinhados representam sequências ligantes entre FAD e RC2. 10 A Figura 11 ilustra a sequência de nucleótidos e de aminoácidos previstos de CD59-RC2 humana madura. Os aminoácidos sublinhados representam sequências ligantes entre CD59 e RC2.

A Figura 12 ilustra o direcionamento de proteínas de fusão contendo RC2 a células OHC revestidas a C3. O ligando C3 foi gerado em células OHC pela incubação de células num antissoro 10% anti-OHC e num soro humano 10% empobrecido em C6 (para evitar a formação do complexo de ataque da membrana e a lise celular). As células foram lavadas e incubadas com proteína de fusão (20ug/mL, 4°C, 30 min) . A ligação foi detetada por análise de citometria de fluxo usando anticorpos contra um inibidor do complemento apropriado (FDA ou CD59). Linha preta: controlo (nenhuma proteína de fusão); Cinzento claro: RC2 no C-terminal; Cinzento escuro: RC2 no N-terminal. A Figura 13 ilustra a análise da ligação da RC2-FAD a C3dg por ressonância de plasma de superfície. A Figura 14 ilustra a análise da ligação da RC2-CD59 a C3dg por ressonância de plasma de superfície. A Figura 15 ilustra a análise da ligação da FAD-RC2 a C3dg por ressonância de plasma de superfície. A Figura 16 ilustra a análise da ligação da CD59-RC2 a C3dg por ressonância de plasma de superfície. A Figura 17 ilustra o efeito de FAD direcionado e não direcionado na lise mediada pelo complemento de células OHC. As células OHC foram sensibilizadas ao complemento com 11 antissoros anti-OHC (10% concentração, 4°C, 30 min) e subsequentemente incubadas com soro humano normal 10% (SHN) (37°C, 60 min) na presença de concentrações variáveis de proteínas inibidoras do complemento. A lise celular foi depois determinada por ensaio de exclusão de azul tripano. Experiência representativa mostrando média +/- DP (n=3). Três experiências separadas usando diferentes preparações de proteina de fusão foram realizadas. A Figura 18 ilustra o efeito de CD59 direcionada e não direcionada na lise mediada pelo complemento de células OHC. Ensaio realizado como descrito na legenda da Figura 17. Experiência representativa mostrando média +/- DP (n=3) . Três experiências separadas usando diferentes preparações de proteina de fusão foram realizadas. A Figura 19 ilustra o efeito de FAD direcionado e não direcionado na lise mediada pelo complemento de células OHC. Os eritrócitos (E) de ovelha foram sensibilizados com anticorpo E anti-ovelha e subsequentemente incubados com uma diluição 1/300 de SHN (37°C, 60 min) na presença de concentrações variáveis de proteínas inibidoras do complemento. A lise celular foi depois determinada por medição da hemoglobina liberta (absorvância a 412 nm) . Experiência representativa mostrando média +/- DP (n=3). Duas experiências separadas usando diferentes preparações de proteína de fusão foram realizadas. A Figura 20 ilustra o efeito de CD59 direcionada e não direcionada na lise mediada pelo complemento de células OHC. Ensaio realizado como descrito na legenda da Figura 19. Experiência representativa mostrando média + /- DP (n=3) . Duas experiências separadas usando diferentes preparações de proteína de fusão foram realizadas. 12 A Figura 21 ilustra a sequência de nucleótidos e de aminoácidos prevista do Fc IgGl RC2 humano maduro. Os aminoácidos sublinhados representam sequências ligantes entre RC2 e a região Fc. O plasmídeo de expressão contém a região Fc genómica (dobradiça-intrão-CH2-intrão-CH3). A Figura 22 ilustra a análise SDS-PAGE da proteína de fusão RC2-Fc. A RC2-Fc purificada foi corrida sob condições não redutoras (linha 1) ou redutoras (linha 2). Gel corado por azul de Coomassie (para PM dos marcadores na linha 3, ver Figura 2). A Figura 23 ilustra o direcionamento de RC2-Fc a células OHC revestidas a C3. 0 ligando C3 foi gerado como descrito (legenda da Figura 12). As células foram lavadas e incubadas com RC2-Fc (20ug/mL, 4°C, 30 min). A ligação foi detetada por análise de citometria de fluxo usando anticorpos contra Fc humano conjugado com ITCF. O painel de cima mostra os resultados da incubação de RC2-Fc com células OHC revestidas a C3, e o painel de baixo mostra os resultados da incubação de RC2-Fc com células OHC de controlo. A Figura 24 ilustra o sensograma da ressonância de plasma de superfície mostrando a ligação de RC2-Fc ao ligando C3d imobilizado no chip. A Figura 25 ilustra a biodistribuição de 125I-RC2-FAD e 125I-sFAD em camundongos NZB/W F1 com 34 semanas de idade. Proteínas radiomarcadas foram injetadas na veia da cauda e a biodistribuição radiomarcada determinada após 24 hr. Cada proteína foi injetada em 2 camundongos. A Figura 26 ilustra a imagem de RC2-FAD ligada aos glomérulos dos camundongos MRL/lpr com 24 semanas de idade. 13 A ligação glomerular de CD2-FAD (a) e sFAD (b) foi analisada 24 horas após a injeção na veia da cauda de cada proteina. A figura ilustra a coração de imunofluorescência de secções do rim. A Figura 27 ilustra a construção do anticorpo CD59- Ycrr de cadeia única. A figura mostra que a construção compreende uma cadeia leve variável (LV) e uma cadeia pesada variável (PV) de Acm K9/9. A construção foi preparada no vetor de expressão da levedura pPICZalph (Invitrogen) . A Figura 28 ilustra a biodistribuição dos inibidores do complemento e o Ac de cadeia única K9/9 em ratos. Proteínas recombinantes iodadas administradas 4 dias depois do tratamento PAN e radioatividade nos órgãos medida 48 hr. depois. A Figura 29 ilustra a depuração de Creatinina em ratos tratados com PAN e recetores da terapia indicada (n=4, +/- DP) . A Figura 30 ilustra o córtex renal corado com APS. A Figura 30A ilustra o controlo sem PAN, Figura 30B: PAN com tratamento de TFS, Figura 30C: PAN com tratamento de Ycrr K9/9 direcionadas, e Figura 30D: PAN com tratamento de sYcrr. A Figura 31 ilustra a atividade inibidora do complemento no soro depois da administração de proteínas recombinantes. Medida por lise de eritrócitos de ovelha sensibilizados. Percentagem da atividade inibidora mostrada relativa ao soro de ratos de controlo.

Descrição detalhada 14 A presente invenção pode ser mais facilmente entendida por referência à seguinte descrição detalhada das formas de realização preferenciais da invenção e dos Exemplos incluidos aqui e às Figuras e sua descrição prévia e seguinte descrição. A. Definições

Tal como usadas na especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Portanto, por exemplo, a referência a "um transportador farmacêutico" inclui misturas de dois ou mais de tais transportadores, e similares.

As gamas podem ser expressas aqui a partir de "cerca de" um valor particular, e/ou até "cerca de" outro valor particular. Quando uma tal gama é expressa, outra forma de realização inclui do valor particular e/ou até ao outro valor particular. Similarmente, quando os valores são expressos como aproximações, através do uso do antecedente "cerca de", será entendido que o valor particular forma outra forma de realização. Será ainda entendido que os pontos finais das gamas são significantes quer na relação com o outro ponto final, quer independentemente do outro ponto final.

Nesta especificação e nas reivindicações que se seguem, será feita uma referência a um número de termos que deverão ser definidos para ter os significados seguintes: "Opcional" ou "opcionalmente" significa que os eventos ou circunstâncias subsequentemente descritos podem ou não ocorrer, e que a descrição inclui instâncias onde o dito evento ou circunstância ocorre e instâncias onde eles não ocorrem. 15 "Tratamento" ou "tratando" significa administrar uma composição a um sujeito com uma condição, em que a condição pode ser qualquer doença patogénica, doença autoimune, cancro ou condição inflamatória. 0 efeito da administração da composição ao sujeito pode ter o efeito de mas não se limita a redução dos sintomas da condição, redução da severidade da condição, ou ablação completa da condição.

Aqui, "inibição" ou "inibe" significa reduzir a atividade. É entendido que inibição pode significar uma ligeira redução na atividade a uma ablação completa de toda a atividade. Um "inibidor" pode ser qualquer coisa que reduza a atividade.

Aqui, "ativação" ou "ativa" significa aumentar a atividade. É entendido que ativação pode significar um aumento na atividade existente bem como uma indução de nova atividade. Um "ativador" pode ser qualquer coisa que aumente a atividade. B. Inibição do Complemento e Construções Ativadoras

Divulgadas são composições compreendendo uma construção, em que a construção compreende RC2 e um modulador da atividade do complemento. 0 RC2 consiste de uma porção extracelular consistindo em 15 ou 16 unidades repetidas conhecidas como repetições de consenso pequenas (RCPs). Os aminoácidos 1-20 compreendem o péptido lider, os aminoácidos 23-82 compreendem a RCP1, os aminoácidos 91-146 compreendem a RCP2, os aminoácidos 154-210 compreendem a RCP3, os aminoácidos 215-271 compreendem a RCP4. O local ativo (local de ligação ao C3dg) está localizado na RCP 1-2 (as primeiras duas RCPs com N-terminal). As unidades de RCP estão separadas por pequenas 16 sequências de comprimento variável que servem como espaçadores. É entendido que qualquer número de RCPs contendo o local ativo pode ser usado. Numa forma de realização, a construção contém as quatro unidades de RCP N-terminal. Numa outra forma de realização, a construção inclui as primeiras duas RCPs N-terminal. Numa outra forma de realização, a construção inclui as primeiras três RCPs N-terminal. É entendido que existe variação de espécies e de estirpe para os péptidos, polipéptidos, proteínas, fragmentos e composições de proteína divulgados. Especialmente divulgadas são todas as variações de espécies e estirpe para os péptidos, polipéptidos, proteínas, fragmentos e composições de proteína divulgados.

Igualmente divulgadas são composições, em que a construção é uma proteína de fusão.

Aqui, uma "proteína de fusão" significa dois ou mais componentes compreendendo péptidos, polipéptidos, ou proteínas operacionalmente ligadas. 0 RC2 pode ser ligado a inibidores ou ativadores do complemento por uma sequência ligante de aminoácidos. Exemplos de ligantes são bem conhecidos na técnica. Exemplos de ligantes podem incluir mas não se limitam a (Gly4Ser) 3 (G4S) , (GlysSer) 4 (G3S) ,

SerGly4, e SerGly4SerGly4. As sequências ligantes podem também consistir de sequências ligantes "naturais" encontradas entre unidades de RCP em proteínas humanas (ou de camundongo), por exemplo VSVFPLE, a sequência ligante entre RCP 2 e 3 do RC2 humano. As proteínas de fusão podem também ser construídas sem sequências ligantes.

Igualmente divulgadas são composições da invenção, em que as proteínas de fusão inibem o complemento. 17

Igualmente divulgadas são composições da invenção, em que o modulador da atividade do complemento compreende um inibidor do complemento.

Igualmente divulgadas são composições da invenção; por exemplo, em que o inibidor do complemento é o fator de aceleração do decaimento (FAD) SEQ ID NO: 1 (nucleotidica) e SEQ ID NO: 2 (aminoácida) . Por exemplo, o FAD pode ser FAD humano solúvel compreendendo os quatro domínios de RCP sem a âncora glicofosfatidil e a região rica em serina-treonina. 0 FAD pode também ser FAD humano solúvel compreendendo os quatro domínios de RCP e a região rica em serina-treonina mas sem a âncora glicofosfatidil. A região extracelular do FAD consiste em 4 unidades de RCP no N-terminal seguidas da região rica em serina/treonina. Os aminoácidos 1-34 compreendem o péptido líder, os aminoácidos 35-95 compreendem a RCP1, os aminoácidos 97-159 compreendem a RCP2, os aminoácidos 162-221 compreendem a RCP3, os aminoácidos 224-284 compreendem a RCP4, e os aminoácidos 287-356 compreendem a região S/T. Numa forma de realização da invenção, a composição da invenção compreende todas as 4 unidades de RCP. Numa outra forma de realização da invenção, a composição compreende as RCP2-4 do FAD.

Divulgadas são composições da invenção, em que o inibidor do complemento compreende uma proteína de fusão entre a CD59 e outro inibidor do complemento selecionado de um grupo consistindo em FAD, PCM, Ycrr e RC1. Também divulgadas são composições da invenção, em que o inibidor do complemento é uma proteína de fusão de dois ou mais inibidores do complemento. 18

Também divulgadas são composições da invenção, em que a proteina de fusão compreende RC2-FAD (SEQ ID NO: 6). Também divulgadas são composições da invenção em que a proteina de fusão é codificada por um nucleótido compreendendo a SEQ ID NO: 5 .

Também divulgadas são composições da invenção, em que a proteina de fusão compreende FAD-RC2 (SEQ ID NO: 10) . Também divulgadas são composições da invenção em que a proteina de fusão é codificada por um nucleótido compreendendo a SEQ ID NO: 9.

Também divulgadas são composições da invenção, em que o inibidor do complemento é CD59 humana (SEQ ID NO: 3 (nucleotidica) e SEQ ID NO: 4 (aminoácida) ) . A CD59 humana pode ser CD59 humana solúvel compreendendo a proteina madura sem a âncora glicofosfatidil.

Também divulgadas são composições da invenção, em que a proteina de fusão compreende RC2-CD59 humana (SEQ ID NO: 8) . Também divulgadas são composições da invenção em que a proteina de fusão é codificada por um nucleótido compreendendo a SEQ ID NO: 7.

Também divulgadas são composições da invenção, em que a proteina de fusão compreende CD59 humana-RC2 (SEQ ID NO: 12). Também divulgadas são composições da invenção em que a proteina de fusão é codificada por um nucleótido compreendendo a SEQ ID NO: 10.

Também divulgadas são composições da invenção, em que o inibidor do complemento é RC1 (SEQ ID NO: 13 (nucleotidica) e SEQ ID NO: 14 (aminoácida)). A região extracelular de RC1 compreende 30 unidades de RCP. É uma forma de realização da invenção que a composição possa compreender a região extracelular inteira de RC1. Numa outra forma de realização 19 da invenção, a composição compreende [um] local[ais] ativo[s] de RCl. Os locais ativos de RC1 são os aminoácidos 1-46 que compreendem o péptido lider, os aminoácidos 47-300 que compreendem a RCP-4 (local de ligação a C4b, afinidade mais baixa para C3b), os aminoácidos 497-750 que compreendem as RCP8-11 (local de ligação a C3b, afinidade mais baixa para C4b), os aminoácidos 947-1200 que compreendem as RCP15-18 (local de ligação a C3b, afinidade mais baixa para C4b), e os aminoácidos 1400-1851 que compreendem o local de ligação a Clq. Numa forma de realização adicional da invenção, a composição da invenção pode compreender [uma ou] qualquer combinação ou todos os locais ativos de RCl.

Também divulgadas são composições da invenção, em que o inibidor do complemento compreende os locais ativos de RCl, e em que [um] local[ais] ativo[s] compreende[m] ainda um péptido lider compreendendo os aminoácidos 6-46, os aminoácidos 47-300 que compreendem a RCP-4 (local de ligação a C4b, afinidade mais baixa para C3b), os aminoácidos 497-750 que compreendem as RCP8-11 (local de ligação a C3b, afinidade mais baixa para C4b), os aminoácidos 947-1200 que compreendem as RCP15-18 (local de ligação a C3b, afinidade mais baixa para C4b), e os aminoácidos 1400-1851 que compreendem o local de ligação a Clq. Numa forma de realização adicional da invenção, a composição da invenção pode compreender [uma ou] qualquer combinação ou todos os locais ativos do RCl.

Igualmente divulgadas são composições da invenção, em que o inibidor do complemento é PCM (SEQ ID NO: 15 (nucleotídica) e SEQ ID NO: 16 (aminoácida)). A região extracelular consiste em 4 unidades de RCP seguidas pela região ser/thr. Os aminoácidos 1-34 compreendem o péptido lider, os aminoácidos 35-95 compreendem a RCP1, os aminoácidos 96-158 20 compreendem a RCP2, os aminoácidos 159-224 compreendem a RCP3, os aminoácidos 225-285 compreendem a RCP4, e os aminoácidos 286-314 compreendem a região S/T.

Igualmente divulgadas são composições da invenção, em que o inibidor do complemento é Ycrr (SEQ ID NO: 17). O Ycrr pode ser Ycrr de camundongo solúvel compreendendo os 5 domínios de RCP N-terminal sem a região transmembranar.

Igualmente divulgadas são composições da invenção, em que o inibidor do complemento é CD59 de murino. A CD59 de murino pode ser CD59 de murino solúvel compreendendo a proteína madura sem a âncora glicofosfatidil.

Divulgadas são composições da invenção, em que a proteína de fusão ativa o complemento.

Divulgadas são composições da invenção, em que a construção está num vetor.

Divulgadas são células compreendendo o vetor da invenção.

Os grupos reativos que podem ser direcionados usando um reticulador incluem aminas primárias, sulfidrilos, carbonilos, carboidratos e ácidos carboxílicos, ou grupos ativos podem ser adicionados às proteínas. Exemplos de ligantes químicos são bem conhecidos na técnica e podem incluir mas não se limitam a bismaleimidohexano, m-maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster, Reticulados de NHS-Ésteres-Maleimido tais como MBS, Sulfo-MBS, SMFB, Sulfo-SMFB, GMBS, Sulfo-GMBS, EMCS, Sulfo-EMCS; Reticulados de Imidoéster tais como DMA, DMP, DTBP; EDC[l-Etilo-3- (3-Dimetilaminopropilo)carbodiimida Cloridrato], [ 2 — (4 —

Hidroxifenilo)etilo]-4-N-maleimidometilo)-ciclohexano-1-carboxamida, DTME: Ditio-bis-maleimidoetano, DMA (Dimetilo 21 adipimidato-2 HC1), DMP (Dimetilo pimelimidato-2 HC1), DMS (Dimetilo suberimidato-2 HC1), DTBP (dimetilo 3,3'- ditiobisproprionimidato -2 HC1), MBS (m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster), Sulfo-MBS (m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster), Sulfo-SMFB (Sulfosuccinimidilo 4-[p-maleimidofenilo]butirato), GMBS (N[·- maleimidobutiriloxi] éster), EMCS (N[·- maleimidocaproílicooxi]succinimida éster), e Sulfo-EMCS (N[ ·-maleimidocaproílicooxi]sulfosuccinimida éster) . C. Métodos de utilização das composições Vários tipos de proteínas inibidoras do complemento estão correntemente sob investigação para terapia de doença inflamatória e estados de doença associados com bioincompatabilidade. Dois dos melhores inibidores do complemento humano caraterizados terapeuticamente são uma forma solúvel do recetor do complemento 1 (RC1) e um anticorpo monoclonal anti-C5. Estas proteínas inibidoras sistemicamente ativas têm mostrado eficácia em vários modelos animais de doença e mais recentemente em ensaios clínicos (1-5, 6:#1037 os quais incluem ensinamentos sobre eficácia in vivo e resultados clínicos). A composição da invenção pode ser usada em métodos de tratamento de uma condição afetada pelo complemento num sujeito. É entendido que a administração da composição ao sujeito pode ter o efeito de, mas não se limita a, redução dos sintomas da condição, uma redução na severidade da condição, ou uma ablação completa da condição. 1. Métodos de utilização das composições para inibirem o complemento

Divulgada é a composição da invenção para uso em métodos de tratamento de uma condição afetada pelo complemento num 22 sujeito, em que a composição irá inibir a atividade do complemento. É entendido que o efeito da administração da composição ao sujeito pode ter o efeito de mas não se limita a redução dos sintomas da condição, uma redução na severidade da condição, ou uma ablação completa da condição.

Divulgada é a composição da invenção para uso em métodos de redução dos danos mediados pelo complemento, cuja composição inibe o complemento. A condição tratada pode ser uma condição inflamatória. A condição inflamatória pode ser selecionada do grupo consistindo em asma, lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatoide, espondiloartrite, vasculite sistémica, diabete mellitus dependente de insulina, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica experimental, sindrome de Sjõgren, doença do enxerto contra hospedeiro, doença inflamatória do intestino incluindo doença de Crohn, colite ulcerosa, lesão de isquemia-reperfusão, infarto miocardial, doença de Alzheimer, rejeição do transplante (alogénica ou xenogénica); trauma térmico, qualquer inflamação induzida pelo complexo imunitário, glomerulonefrite, miastenia grave, lúpus cerebral, sindrome de Guillain-Barre, vasculite, esclerose sistémica, anaflaxia, reações ao cateter, ateroma, infertilidade, tiroidite, SDRA, sindrome pós bypass, hemodiálise, reumatoide juvenil, sindrome de Behcets, anemia hemolítica, pênfigo, penfigoide bolhoso, acidente vascular cerebral, aterosclerose, e esclerodermia. A condição pode ser uma infeção virai. A infeção virai pode ser selecionada da lista de virus consistindo em virus Influenza A, virus Influenza B, virus sincicial respiratório, virus do Dengue, virus da febre Amarela, virus do Ébola, virus de Marburg, virus da febre de Lassa, 23 vírus da Encefalite Equina Oriental, vírus da Encefalite Japonesa, vírus da Encefalite de St. Louis, vírus da febre de Murray Valley, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre do Rift Valley, Rotavírus A, Rotavírus B, Rotavírus C, vírus de Sindbis, Hantavírus. A condição pode ser uma resposta inflamatória a um vetor virai. 0 vetor virai pode ser selecionado da lista de vírus consistindo em adenovírus, vírus vaccinia, vírus adenoassociados, vírus de vaccinia ancara modificados, e citomegalovírus. É entendido que outros vetores virais estão em uso na distribuição de vacinas. Especificamente divulgados aqui são todos e cada um dos vetores virais conhecidos na técnica. É entendido na técnica que a Candida expressa uma proteína semelhante a RC3 que tem propriedades ligantes similares às de RC2. A proteína semelhante a RC3 parece estar envolvida na patogénese. Portanto, uma forma de realização da invenção é o tratamento do sujeito com uma infeção fúngica, em que o tratamento bloqueia a função de "RC3" fúngica bem como inibe o complemento, compreendendo a administração ao sujeito da composição da invenção.

Divulgados aqui são usos da invenção, em que o inibidor do complemento pode melhorar o resultado da terapia baseada em apoptose (e.g. terapia génica com adenovírus expressando o ligando Fas). A ocorrência de apoptose durante o desenvolvimento normal é não inflamatória e está envolvida na indução de tolerância imunológica. Embora a morte apoptótica das células possa ser inflamatória dependendo de como é ativada e em que tipos de células (por exemplo, agentes terapêuticos que se ligam a Fas são capazes de induzir inflamação) , a morte 24 necrótica das células resulta numa resposta inflamatória sustentada e poderosa mediada pelos conteúdos da célula libertos e pelas citocinas pró-inflamatórias libertas por fagócitos estimulados. As células apoptóticas e vesículas são normalmente removidas por fagócitos, evitando assim as consequências pró-inflamatórias da lise da célula. Neste contexto, tendo sido mostrado que as células apoptóticas e os corpos apoptóticos fixam diretamente o complemento, e que o complemento pode sustentar uma resposta anti-inflamatória devido à opsonização e fagocitose melhorada das células apoptóticas. A inflamação está envolvida no recrutamento não especifico de células imunitárias que podem influenciar respostas imunes inatas e adaptativas. A modulação da ativação do complemento durante a terapia tumoral baseada na apoptose para inibir uma captação fagocitica das células/corpos apoptóticos aumenta a resposta imunitária inflamatória/inata dentro do ambiente do tumor. Em acréscimo, as células apoptóticas podem ser uma fonte de autoantigénios imunogénicos e corpos apoptóticos não depurados podem resultar em autoimunização. Além de criar um ambiente imunoestimulatório aumentado, a modulação do complemento num local no qual as células do tumor foram induzidas a sofrer apoptose ainda aumenta ou desencadeia uma imunidade especifica contra um tumor ao qual o hospedeiro é normalmente tolerante.

As composições divulgadas da invenção podem atuar como antagonistas de RC2 e RC3. A atividade do complemento pode ser inibida através da inibição de RC2 compreendendo a administração da composição da invenção a um sujeito. A atividade do complemento pode ser inibida através da inibição de RC3 compreendendo a administração da composição da invenção a um sujeito. Como um antagonista de RC2 pode 25 modular a resposta imunitária, um antagonista de RC3 pode ter um segundo mecanismo anti-inflamatório de ação uma vez que o RC3 é integrina que se liga à MAIC1 endotelial. A MAIC1 é expressa em locais de inflamação e está envolvida na adesão de leucócitos e na diapedese. Em acréscimo, a expressão da MAIC1 é regulada para cima pelos produtos da ativação do complemento. 3. Métodos de utilização das composições como ferramentas de pesquisa

As composições divulgadas podem ser usadas numa variedade de maneiras como ferramentas de pesquisa. Por exemplo, as composições divulgadas podem ser usadas para estudar o inibidor da ativação do complemento.

As composições divulgadas podem ser usadas como ferramentas de diagnóstico relacionadas com doenças associadas com a ativação do complemento, tais como cancro, infeções virais, infeções bacterianas, infeções parasíticas, e infeções fúngicas. As proteínas de fusão RC2 serão direcionadas a um local de ativação do complemento e uma proteína de fusão RC2 marcada pode diagnosticar condições associadas com a ativação do complemento. Por exemplo, um anticorpo reativo ao tumor ativaria o complemento em células do tumor, às quais o RC2 se poderia de seguida direcionar. 0 RC2-Fc marcado poderia então amplificar o sinal após o direcionamento do anticorpo. D. Composições

Divulgados são os componentes a serem usados para preparar as composições divulgadas bem como as composições elas próprias a serem usadas nos métodos descritos aqui. Estes e outros materiais são divulgados aqui, e é entendido que quando combinações, subconjuntos, interações, grupos, etc. 26 destes materiais são divulgados que enquanto uma referência especifica a cada uma das várias combinações individuais e coletivas e permutações destes compostos possa não ser explicitamente feita, cada é especificamente contemplado e descrito aqui. Por exemplo, se RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr particular, é descrito, e/ou uma sua combinação especifica é divulgada e discutida e/ou um número de modificações que possam ser feitas a um número de moléculas incluindo RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, e/ou uma sua combinação são discutidos, são especificamente contempladas toda e cada combinação e permutação de RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, ou as suas combinações e as modificações que são possíveis, a não ser que seja especificamente indicado o contrário. Assim, se uma classe de moléculas A, B e C são divulgadas bem como uma classe de moléculas D, E e F e um exemplo de uma molécula de combinação, A-D é divulgada, então mesmo se cada uma não for individualmente recitada cada é individualmente e coletivamente contemplada significando que as combinações A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, e C-F são consideradas divulgadas. Do mesmo modo, cada subconjunto ou combinação destas é também divulgado. Assim, por exemplo, o subgrupo de A-E, B-F, e C-E seriam considerados divulgados. Este conceito aplica-se a todos os aspetos desta aplicação incluindo, mas não se limitando a, passos em métodos de elaboração e utilização das composições divulgadas. Assim, se existir uma variedade de passos adicionais que possam ser desempenhados é entendido que cada um destes passos adicionais pode ser desempenhado com qualquer forma de realização específica ou combinação de formas de realização dos métodos divulgados. 1. Similaridades de sequências É entendido que como discutido aqui o uso dos termos homologia e identidade significa a mesma coisa do que similaridade. Assim, por exemplo, se o uso da palavra 27 homologia é usado entre duas sequências não naturais, é entendido que isto não é necessariamente indicador de uma relação evolucionária entre estas duas sequências, mas antes um olhar sobre a similaridade ou parentesco entre as suas sequências de ácido nucleico. Muitos dos métodos para determinação da homologia entre duas moléculas evolutivamente relacionadas são rotineiramente aplicados a quaisquer dois ou mais ácidos nucleicos ou proteínas com o propósito de medir a similaridade das sequências independentemente do facto de elas serem evolutivamente relacionadas ou não.

No geral, é entendido que uma maneira de definir quaisquer variantes ou derivados conhecidos ou aqueles que possam surgir, dos genes e proteínas divulgados aqui, é através da definição das variantes ou derivados em termos da homologia a sequências conhecidas específicas. Esta identidade de sequências particulares divulgadas aqui é igualmente discutida noutras partes deste documento. Por exemplo, a SEQ ID NO: 25 estabelece uma sequência particular de um RC2 e a SEQ ID NO: 26 estabelece uma sequência particular da proteína codificada pela SEQ ID NO: 25, uma proteína RC2. Especificamente divulgadas aqui são variantes destes e de outros genes e proteínas divulgados aqui que têm pelo menos, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por cento de homologia com a sequência estabelecida. Aqueles peritos na técnica percebem prontamente como determinar a homologia de duas proteínas ou ácidos nucleicos, tais como genes. Por exemplo, a homologia pode ser calculada depois de alinhar as duas sequências de modo a que a homologia esteja no seu nível mais alto.

Outra forma de calcular a homologia pode ser realizada por algoritmos publicados. Um alinhamento ideal de sequências 28 para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 85: 2444 (1988), por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software da Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção.

Os mesmos tipos de homologia podem ser obtidos para ácidos nucleicos por exemplo pelos algoritmos divulgados em Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods

Enzymol. 183:281 -306,1989 para pelo menos material relacionado com o alinhamento de ácidos nucleicos. É entendido que qualquer dos métodos tipicamente pode ser usado e que em certas instâncias os resultados destes vários métodos podem diferir, mas o perito na técnica percebe que se uma identidade é encontrada em pelo menos um destes métodos, as sequências dir-se-iam ter a identidade estabelecida, e ser divulgadas aqui.

Por exemplo, como usado aqui, a sequência recitada como tendo uma percentagem de homologia particular a outra sequência refere-se a sequências que têm a homologia recitada como calculada por qualquer um ou mais dos métodos de cálculo descritos acima. Por exemplo, uma primeira sequência tem 80 por cento de homologia, como definido aqui, a uma segunda sequência se a primeira sequência for calculada ter 80 por cento de homologia à segunda sequência usando o método de cálculo de Zuker mesmo se a primeira sequência não tenha 80 por cento de homologia à segunda sequência calculada por qualquer dos outros métodos de 29 cálculo. Como outro exemplo, uma primeira sequência tem 80 por cento de homologia, como definido aqui, a uma segunda sequência se a primeira sequência for calculada ter 80 por cento de homologia à segunda sequência usando quer o método de cálculo de Zuker, quer o método de cálculo de Pearson e Lipman mesmo se a primeira sequência não tenha 80 por cento de homologia à segunda sequência calculada pelo método de cálculo de Smith e Waterman, pelo método de cálculo de Needleman e Wunsch, pelo método de cálculo de Jaeger, ou por qualquer dos outros métodos de cálculo. Ainda como outro exemplo, uma primeira sequência tem 80 por cento de homologia, como definido aqui, a uma segunda sequência se a primeira sequência for calculada ter 80 por cento de homologia à segunda sequência usando cada um dos métodos de cálculo (embora, na prática, os diferentes métodos de cálculo irão frequentemente resultar em diferentes percentagens calculadas de homologia). 2. Ácidos nucleicos

Existe uma variedade de moléculas divulgadas aqui que são baseadas em ácidos nucleicos, incluindo por exemplo os ácidos nucleicos que codificam, por exemplo RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM-RC2, RC2-Ycrr, Ycrr-RC2, RC2-anti-C5, bem como vários ácidos nucleicos funcionais. Os ácidos nucleicos divulgados são compostos de por exemplo, nucleótidos, análogos de nucleótidos, ou substitutos de nucleótidos. Exemplos não limitadores destas e de outras moléculas são discutidos aqui. É entendido que por exemplo, quando um vetor é expresso numa célula, o mRNA expresso irá tipicamente ser composto de A, C, G, e U. Do mesmo modo, é entendido que se, por exemplo, uma molécula antissenso for introduzida numa célula ou num ambiente da célula através por exemplo de distribuição exógena, é vantajoso que a molécula antissenso seja composta de análogos de nucleótido 30 que reduzam a degradação da molécula antissenso no ambiente da célula. a) Nucleótidos e moléculas relacionadas

Um nucleótido é uma molécula que contém uma fração de base, uma fração de açúcar e uma fração de fosfato. Os nucleótidos podem ser interligados através das suas frações de fosfato e frações de açúcar criando uma ligação internucleosidica. A fração de base de um nucleótido pode ser adenin-9-ilo (A), citosin-l-ilo (C), guanin-9-ilo (G), uracil-l-ilo (U), e timin-l-ilo (T). A fração de açúcar de um nucleótido é uma ribose ou uma desoxirribose. A fração de fosfato de um nucleótido é fosfato pentavalente. Um exemplo não limitador de um nucleótido seria 3'-AMF (3'-adenosina monofosfato) ou 5'-GMF (5'-guanosina monofosfato).

Um análogo de nucleótido é um nucleótido que contém algum tipo de modificação às frações quer de base, de açúcar, ou de fosfato. As modificações à fração de base incluiriam modificações naturais e sintéticas de A, C, G, e T/U bem como diferentes bases de purina ou pirimidina, tais como uracil-5-ilo (.psi.), hipoxantin-9-ilo (1), e 2-aminoadenin-9-ilo. Uma base modificada inclui mas não se limita a 5-metilocitosina (5-me-C), 5-hidroximetilo citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo e outros derivados alquilo de adenina e guanina, 2-propilo e outros derivados alquilo de adenina e guanina, 2- tiouracilo, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracilo e citosina, 5-propinilo uracilo e citosina, 6-azo uracilo, citosina e timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo e outros uracilos e citosinas 5-substituídas, 7-metiloguanina e 7-metiloadenina, 8- 31 azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina e 7-deazaadenina e 3-deazaguanina e 3-deazaadenina. Modificações adicionais da base podem ser encontradas por exemplo nas Pat. E.U.A. No. 3,687,808, Englisch et ai., Angewandte Chemie, Edição Internacional, 1991, 30,613, e Sanghvi, Y. S., Capitulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. e Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993. Certos análogos de nucleótidos, tais como pirimidinas 5-substituidas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 0-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiloadenina, 5-propinilouracilo, e 5-propinilocitosina, 5-metilocitosina podem aumentar a estabilidade da formação dupla. Muitas vezes as modificações da base podem ser combinadas com por exemplo uma modificação do açúcar, tal como 2'-0-metoxietilo, para alcançar propriedade únicas tais como estabilidade dupla aumentada. Existem numerosas patentes dos E.U.A. tais como 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; e 5,681,941, que detalham e descrevem uma gama de modificações da base.

Os análogos de nucleótidos podem também incluir modificações na fração de açúcar. Modificações na fração de açúcar incluiriam modificações naturais da ribose e desoxirribose bem como modificações sintéticas. Modificações no açúcar incluem mas não se limitam a as seguintes modificações na posição 2": OH; F; O-, S- ou N-alquilo; O-, S-, ou N-alquenilo; O-, S- ou N-alquinilo; ou O-alquilo-O-alquilo, em que o alquilo, alquenilo e alquinilo podem ser alquilo com Ci a Cio substituídos ou não substituídos, ou alquenilo ou alquinilo com C2 a Cio substituídos ou não substituídos. As modificações de açúcar 2" também incluem mas não se limitam a -O [ (CH2) nO] mCH3, 32 0(CH2), OCH3, -0(CH2), NH2, -0(CH2)nCH3, -0(CH2)n -ONH2, e - 0 (CH2) n0N [ (CH2) nCH03) ] 2, onde nem são de 1 a cerca de 10.

Outras modificações na posição 2' incluem mas não se limitam a: alquilo mais baixo C3 a Cio, alquilo mais baixo substituído, alquarilo, aralquilo, O-alquarilo ou 0-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, S02CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalquarilo, aminoalquiloamina, polialquiloamina, sililo substituído, um grupo de clivagem de ARN, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucleótido, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleótido, e outros substituintes tendo propriedades similares. Modificações similares podem também ser feitas em outras posições no açúcar, particularmente na posição 3" do açúcar do nucleótido de terminal 3" ou em oligonucleótidos ligados por 2'-5' e na posição 5" do nucleótido de terminal 5'. Açúcares modificados incluiriam também aqueles que contém modificações na ponte de oxigénio do anel, tais como CH2 e S. Os análogos de açúcar do nucleótido podem também ter miméticos de açúcar tais como frações de ciclobutilo em lugar do açúcar pentofuranosilo. Existem numerosas patentes dos E.U.A. que ensinam a preparação de tais estruturas com açúcar modificado tais como 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5, 639, 873; 5, 646, 265; 5, 658,873; 5, 670, 633; e 5,700, 920. fosforotioato

Os análogos de nucleótidos podem também ser modificados na fração de fosfato. Frações de fosfato modificadas incluem mas não se limitam àquelas que podem ser modificadas de maneira a que a ligação entre dois nucleótidos contenha um fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, 33 fosforotriester, aminoalquilofosfotriéster, metilo e outros alquilos fosfonatos incluindo 3'-alquileno fosfonatos e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3'-amino fosforamidato e aminoalquilofosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilofosfonatos, tionoalquilofosfotriesteres, e boranofosfatos. É entendido que esta ligação de fosfato ou fosfato modificado entre dois nucleótidos pode ser através de uma ligação 3"-5" ou de uma ligação 2 '-5', e a ligação pode conter polaridade invertida tal como 3"-5" a 5'-3' ou 2'-5' a 5'-2' . Vários sais, sais misturados e formas de ácido livre são também incluídos. Numerosas patentes dos E.U.A. ensinam como elaborar e usar nucleótidos contendo fosfatos modificados e 33 incluem mas não se 4,476,301; 5,023,243; 5,276,019; 5,278,302; 5,405,939; 5,453,496; 5,519,126; 5,536, 821; limitam a, 5,177,196; 5,286,717; 5,455,233; 5,541,306; 3,687,808; 5,188,897; 5,321,131; 5,466,677; 5,550,111; 4,469,863; 5,264,423; 5, 399, 676; 5,476,925; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; e 5,625,050 É entendido que os análogos de nucleótidos necessitam de conter apenas uma simples modificação, mas podem também conter múltiplas modificações dentro de uma das frações ou entre frações diferentes.

Substitutos de nucleótidos são moléculas tendo propriedades funcionais similares aos nucleótidos, mas as quais não contém uma fração de fosfato, tal como um ácido nucleico peptidico (ANP). Os substitutos de nucleótidos são moléculas que irão reconhecer ácidos nucleicos de uma maneira à Watson-Crick ou à Hoogsteen, mas as quais são ligadas em conjunto através de uma fração exceto através de uma fração de fosfato. Os substitutos de nucleótidos são capazes de se conformarem a uma estrutura do tipo dupla 34 hélice quando interagem com o ácido nucleico alvo apropriado.

Os substitutos de nucleótidos são nucleótidos ou análogos de nucleótidos que tiveram a fração de fosfato e/ou a fração de açúcar substituídas. Os substitutos de nucleótidos não contêm um átomo de fósforo padrão. Substitutos para o fosfato podem ser por exemplo, ligações internucleosídicas de alquilo de cadeia curta ou cicloalquilo, heteroátomos misturados e ligações internucleosídicas de alquilo ou cicloalquilo, ou uma ou mais e ligações internucleosídicas heteroatómicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Estes incluem aqueles tendo ligações de morfolino (formadas em parte da porção de açúcar do nucleósido); coluna vertebral de siloxano; colunas vertebrais de sulfureto, sulfóxido e sulfona; colunas vertebrais de formacetilo e tioformacetilo, colunas vertebrais de metileno formacetilo e tioformacetilo; colunas vertebrais contendo alcenos; colunas vertebrais de sulfamatos; colunas vertebrais de metilenoeimino e metilenohidrazino; colunas vertebrais de sulfonato e sulfonamida; colunas vertebrais de amida; e outros tendo partes componentes misturadas de N, 0, S e CH2 . Numerosas patentes dos E.U.A. divulgam como elaborar e usar estes tipos de substituições de fosfatos e incluem mas não se limitam a 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5, 608,046; 5, 610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; e 5,677,439. E igualmente entendido num substituto de nucleótido que ambas as frações de açúcar e de fosfato do nucleótido podem ser substituídas, por por exemplo uma ligação do tipo amida 35 (aminoetiloglicina)(ANP). As patentes dos E.U.A. 5,539,082; 5,714,331;e 5,719,262 ensinam como elaborar e usar moléculas ANP (Ver também Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500). É também possível ligar outro tipo de moléculas (conjugados) aos nucleótidos ou aos análogos de nucleótidos para aumentar por exemplo, a absorção celular. Os conjugados podem ser ligados quimicamente ao nucleótido ou aos análogos de nucleótidos. Tais conjugados incluem mas não se limitam a frações de lípidos tais como uma fração de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., 1989, 86, 6553-6556), ácido eólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), um tioéster, e.g., hexilo-S-tritilotiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sei., 1992,660,306-309; Manoharan et al., Bioorg. : Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), uma cadeia alifática, e.g., dodecandiol ou resíduos de undecilo (Saison-Behmoaras et al.; EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), um fosfolípido, e.g., di-hexadecilo-rac-glicerol ou trietiloamónia 1,2-di-0-hexadecilo-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), ou ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), uma fração de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), ou uma fração de octadeciloamina ou hexiloamino-carbonilo-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937). Numerosas 36 patentes dos E.U.A. ensinam a preparação de tais conjugados e incluem, mas não se limitam a as Pat. E.U.A. Nos. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203; 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599, 923; 5,599, 928 e 5, 688,941.

Uma interação de Watson-Crick é pelo menos uma interação com a face de Watson-Crick de um nucleótido, análogo de nucleótido, ou substituto de nucleótido. A face de Watson-Crick de um nucleótido, análogo de nucleótido, ou substituto de nucleótido inclui as posições C2, NI e C6 de um nucleótido, análogo de nucleótido, ou substituto de nucleótido baseado na purina e as posições C2, N3 e C4 de um nucleótido, análogo de nucleótido, ou substituto de nucleótido baseado na pirimidina.

Uma interação de Hoogsteen é a interação que tem lugar na face de Hoogsteen de um nucleótido ou análogo de nucleótido, a qual é exposta no sulco maior do ADN duplo. A face de Hoogsteen inclui a posição N7 e os grupos reativos (NH2 ou 0) na posição C6 de nucleótidos de purina. b) Sequências

Existe uma variedade de sequências relacionadas com RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM-RC2, RC2-Ycrr ou 37

Ycrr-RC2, genes tendo, por exemplo, as sequências como divulgado aqui ou sequências disponíveis na literatura.

Uma sequência em particular estabelecida em SEQ ID NO: 25 é usada aqui, como um exemplo, para exemplificar as composições e métodos divulgados. É entendido que a descrição relacionada com esta sequência é aplicável a qualquer sequência relacionada com RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM-RC2, RC2-Ycrr ou Ycrr-RC2, a não ser que seja especificamente indicado o contrário. Aqueles peritos na técnica percebem como resolver discrepâncias e diferenças de sequências e ajustar as composições e métodos respeitantes a uma sequência particular a uma outra sequência relacionada (i.e. sequências de RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM-RC2, RC2-Ycrr, Ycrr-RC2) .

Iniciadores e/ou sondas podem ser desenhados para qualquer sequência de RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM- RC2, RC2-Ycrr ou Ycrr-RC2, dada a informação divulgada aqui e conhecida na técnica. 3. Distribuição das composições às células

Existe um número de composições e métodos que podem ser usados para distribuir as presentes composições de proteína de fusão, composições imunoconjugadas, e composições de ácido nucleico às células, quer in vitro, quer in vivo. As composições da invenção são preferencialmente administradas a um sujeito num transportador farmaceuticamente aceitável. Transportadores adequados e as suas formulações são descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19a ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Tipicamente, uma quantidade apropriada de sal farmaceuticamente aceitável é usada na 38 formulação para tornar a formulação isotónica. Exemplos dos transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, emulsões salinas, água:óleo, emulsões óleorágua, emulsões água:óleo:água, e solução de Ringer e solução de dextrose. 0 pH da solução é preferencialmente de cerca de 5 a cerca de 8, e mais preferencialmente de cerca de 7 a cerca de 7,5. Transportadores adicionais incluem preparações de libertação sustentada tais como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes são na forma de artigos moldados, e.g., filmes, lipossomas ou micropartícuias. Será aparente para aquelas pessoas peritas na técnica que certos transportadores podem ser mais preferíveis dependendo, por exemplo, da rota de administração e da concentração do anticorpo a ser administrado.

As composições da invenção podem ser administradas ao sujeito, paciente, ou célula por injeção (e.g., intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular) , ou por outros métodos tais como infusão que assegure a sua distribuição à corrente sanguínea de uma forma eficaz. A injeção local ou intravenosa é preferencial.

Dosagens e horários eficazes para administração das composições da invenção podem ser determinados empiricamente, e fazer tais determinações está ao alcance dos peritos na técnica. Aqueles peritos na técnica perceberão que a dosagem das composições da invenção que têm que ser administradas irão variar dependendo, por exemplo, do sujeito que irá receber a composição, da rota de administração, do tipo particular de composição usada e de outros medicamentos a serem administrados. Uma dosagem diária típica das composições da invenção usadas sozinhas pode variar entre cerca de lyg/kg até lOOmg/kg de peso 39 corporal ou mais por dia, dependendo dos fatores mencionados acima. a) Sistemas de distribuição baseados em ácidos nucleicos

Existe um número de composições e métodos que podem ser usados para distribuir ácidos nucleicos às células, quer in vitro, quer in vivo. Estes métodos e composições podem largamente ser divididos em duas classes: sistemas de distribuição baseados em virus e sistemas de distribuição não baseados em virus. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser distribuídos através de um número de sistemas de distribuição direta tais como, eletroporação, lipofecção, precipitação de fosfato de cálcio, plasmideos, vetores virais, ácidos nucleicos virais, ácidos nucleicos fagos, fagos, cosmideos, ou através da transferência de material genético em células ou transportadores tais como lipossomas catiónicos. Modos apropriados de transfecção, incluindo vetores virais, transfectantes quimicos, ou métodos físico-mecânicos tais como eletroporação e difusão direta do ADN, são descritos por, por exemplo, Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990); e Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991) . Tais métodos são bem conhecidos na técnica e facilmente adaptáveis para uso com as composições e métodos descritos aqui. Em certos casos, os métodos serão modificados para funcionarem especificamente com moléculas grandes de ADN. Mais, estes métodos podem ser usados para direcionar certas doenças e populações de células usando as características de direcionamento do transportador.

Vetores de transferência podem ser qualquer construção de nucleótido usada para distribuir genes em células (e.g., um plasmídeo) , ou como parte de uma estratégia geral para distribuir genes, e.g., como parte de retrovírus ou 40 adenovírus recombinantes (Ram et al. Câncer Res. 53:83-88, (1993)).

Como usados aqui, vetores virais ou plasmídicos são agentes que transportam os ácidos nucleicos divulgados, tais como SEG ID NO: 25 para células sem degradação e incluem um promotor rendendo a expressão do gene nas células nas quais é distribuído. Em algumas formas de realização, RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM-RC2, RC2-Ycrr ou Ycrr-RC2, são derivados quer de um vírus, quer de um retrovírus. Vetores virais são, por exemplo, Adenovírus, vírus Adenoassociados, vírus de Herpes, vírus Vaccinia, vírus Polio, vírus da SIDA, vírus trófico neuronal, vírus de Sindbis ou outro ARN, incluindo estes vírus com a coluna vertebral do VIH. Igualmente preferenciais são quaisquer famílias virais que partilhem as propriedades destes vírus que os tornam adequados para uso como vetores. Retrovírus incluem vírus da Leucemia Murina de Maloney, VLMM, e retrovírus que expressam as propriedades desejadas do VLMM como um vetor. Os vetores retrovirais são capazes de transportar uma maior carga genética, i.e., um transgene ou gene marcador, do que outros vetores virais, e por esta razão são um vetor comummente usado. No entanto, eles não são tão úteis em células não proliferadoras. Os vetores de adenovírus são relativamente estáveis e fáceis de trabalhar com, têm títulos altos, e podem ser distribuídos numa formulação de aerossol, e podem transfectar células não divisoras. Os vetores virais de pox são largos e têm vários locais para a inserção de genes, eles são termoestáveis e podem ser armazenados à temperatura ambiente. Uma forma de realização preferencial é um vetor virai que tenha sido concebido de modo a suprimir a resposta imunitária do organismo hospedeiro, provocada pelos antigénios virais. 41

Vetores preferenciais deste tipo irão transportar regiões codificantes para Interleucina 8 ou 10.

Os vetores virais podem ter faculdades de transação (habilidade em introduzir genes) maiores do que métodos químicos ou físicos para introduzir genes em células. Tipicamente, os vetores virais contém, genes precoces não estruturais, genes tardios estruturais, um transcrito de polimerase III de ARN, repetições terminais invertidas necessárias para replicação e encapsidação, e promotores para controlar a transcrição e replicação do genoma virai. Quando concebidos como vetores, os vírus tipicamente têm um ou mais dos genes precoces removidos e uma cassete génica ou gene/promotor é inserida no genoma virai no lugar do ADN virai removido. As construções deste tipo podem transportar até cerca de 8 kb de material genético estranho. As funções necessárias dos genes precoces removidos são tipicamente fornecidas por linhas celulares que foram concebidas pra expressar os produtos do gene dos genes precoces em trans. (1) Vetores Retrovirais

Um retrovírus é um vírus animal pertencendo à família de vírus dos Retroviridae, incluindo quaisquer tipos, subfamílias, géneros, ou tropismos. Os vetores retrovirais, em geral, são descritos por Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. Em Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985). Exemplos de métodos para uso de vetores retrovirais para terapia génica são descritos nas Patentes E.U.A. Nos. 4,868,116 e 4,980,286; Aplicações PCT WO 90/02806 e WO 89/07136; e Mulligan, (Science 260:926-932 (1993)).

Um retrovírus é essencialmente um pacote que tem nele empacotado uma carga de ácido nucleico. A carga de ácido 42 nucleico transporta consigo um sinal de empacotamento, o qual assegura que as moléculas filhas replicadas serão eficazmente empacotadas dentro no revestimento do pacote. Em adição ao sinal de empacotamento, existe um número de moléculas que são precisas em cis, para a replicação, e empacotamento do virus replicado. Tipicamente um genoma retroviral, contém os genes gag, pol, e env que estão envolvidos na elaboração do revestimento proteico. São os genes gag, pol, e env que são tipicamente substituídos pelo ADN estranho que é para ser transferido à célula alvo. Os vetores de retrovirus tipicamente contém um sinal de empacotamento para incorporação no revestimento do pacote, uma sequência que sinaliza o inicio da unidade de transcrição do gag, elementos necessários à transcrição reversa, incluindo um local de ligação do iniciador para ligar o iniciador de tARN da transcrição reversa, sequências de repetição terminais que guiam a mudança dos cordões de ARN durante a sintese de ADN, uma sequência 5" a 3" RTL rica em purina que serve como o local iniciador para a sintese do segundo cordão da síntese de ADN, e sequências específicas ao pé das extremidades das RTLs que permitem a inserção do estado de ADN do retrovirus no genoma do hospedeiro. A remoção dos genes gag, pol, e env permite que cerca de 8 kb da sequência estranha seja inserida no genoma virai, seja reversamente transcrita, e em consequência da replicação seja empacotada numa nova partícula retroviral. Esta quantidade de ácido nucleico é suficiente para a distribuição de um para muitos genes dependendo do tamanho de cada transcrito. É preferencial incluir marcadores selecionados quer positivos, quer negativos juntamente com outros genes na inserção.

Uma vez que a maquinaria de replicação e as proteínas de empacotamento foram removidas (gag, pol, e env) na maioria dos vetores retrovirais, os vetores são tipicamente gerados 43 colocando-os numa linha de células de empacotamento. Uma linha de células de empacotamento é uma linha de células que foi transfectada ou transformada com o retrovirus que contém a maquinaria de replicação e de empacotamento, mas carece de qualquer sinal de empacotamento. Quando o vetor transportando o ADN de escolha é transfectado nestas linhas celulares, o vetor contendo o gene de interesse é replicado e empacotado em novas partículas retrovirais, pela maquinaria proporcionada em cis pela célula ajudante. Os genomas para a maquinaria não são empacotados porque eles carecem dos sinais necessários. (2) Vetores Adenovirais A construção de adenovírus defeituosos na replicação tem sido descrita (Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274 (1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987); Zhang "Generation and Identification of recombinant adenovírus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872 (1993)). O beneficio do uso destes vírus como vetores é que eles estão limitados na medida em que se podem espalhar a outros tipos de células, uma vez que se podem replicar dentro de uma célula infetada inicial, mas são incapazes de formar novas partículas virais infecciosas. Adenovírus recombinantes têm mostrado alcançar uma transferência génica de alta eficácia depois da distribuição in vivo, direta ao epitélio das vias aéreas, hepatócitos, endotélio vascular, parênquima do SNC e um número de outros locais de tecido (Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 44 267:25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); e Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)). Os adenovírus recombinantes alcançam a transdução do gene pela ligação a recetores específicos da superfície da célula, depois da qual o vírus é internalizado por endocitose mediada pelo recetor, na mesma maneira do que adenovírus do tipo selvagem ou defeituosos na replicação (Chardonnet e Dales, Virology 40:462-477 (1970); Brown e Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson e Persson, J. Virology 55:442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984); Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)).

Um vetor virai pode ser um baseado num adenovírus que teve o gene EI removido e estes virões são gerados numa linha de células tal como a linha de células humana 293. Numa outra forma de realização preferencial, ambos os genes EI e E3 são removidos do genoma do adenovírus. (3) Vetores virais adenoassociados

Outro tipo de vetor virai é baseado num vírus adenoassociado (VAA). Este parvovírus defeituoso é um vetor preferencial porque ele pode infetar muitos tipos de células e é não patogénico para humanos. Vetores do tipo VAA podem transportar cerca de 4 a 5 kb e o VAA de tipo selvagem é conhecido por se inserir estavelmente no cromossoma 19. Os vetores que contêm esta propriedade de integração num local específico são preferenciais. Uma forma de realização especialmente preferencial deste tipo 45 de vetor é o vetor P4.1 C produzido pela Avigen, São Francisco, CA, que pode conter o gene de timidina cinase do virus de herpes simples, VHS-tc, e/ou um gene marcador, tal como o gene codificando a proteína fluorescente verde (PFV).

Noutro tipo de vírus VAA, o VV contém um par de repetições terminais invertidas (RTIs) que flanqueiam pelo menos uma cassete contendo um promotor que direciona a expressão específica de células ligada operacionalmente a um gene heterólogo. Heterólogo neste contexto refere-se a qualquer sequência de nucleótido ou gene que não é nativo do VAA ou do parvovírus B19.

Tipicamente as regiões codificantes do VAA e do B19 foram apagadas, resultando num vetor seguro, não citotóxico. As RTIs do VAA, ou modificações delas, conferem infetividade e integração específica do local, mas não citotoxicidade, e o promotor direciona a expressão específica da célula. A Patente E.U.A. No. 6,261,834 descreve o material relacionado com o vetor VAA.

Os vetores da presente invenção proporcionam portanto moléculas de ADN que são capazes de integração num cromossoma de mamífero sem uma toxicidade substancial.

Os genes inseridos em vírus e retrovírus contém usualmente promotores, e/ou melhoradores para ajudar a controlar a expressão do produto do gene desejado. Um promotor é geralmente uma sequência ou sequências de ADN que funciona(m) quando numa localização relativamente fixa no que diz respeito ao local de início da transcrição. Um promotor contém elementos centrais necessários para a interação básica da polimerase de ARN e dos fatores de 46 transcrição, e pode conter elementos a montante e elementos de resposta. (4) Vetores virais de grande carga

Experiências de genética molecular com grandes herpesvirus humanos têm proporcionado um meio pelo qual grandes fragmentos de ADN heterólogo podem ser clonados, propagados e estabelecidos em células permissivas à infeção com herpesvirus (Sun et al., Nature genetics 8: 33-41, 1994; Cotter e Robertson, Curr Opin Mol Ther 5: 633-644, 1999) .

Estes grandes virus de ADN (virus da herpe simples (VHS) e virus de Epstein-Barr (VEB)) têm o potencial de distribuir fragmentos de ADN heterólogo humano > 150 kb a células especificas. VEB recombinantes podem manter grandes pedaços de ADN nas células B infetadas como ADN epissomal. Clones individuais transportaram inserções genómicas humanas até 330 kb e pareceram geneticamente estáveis. A manutenção destes epissomas requer uma proteina nuclear do VEB específica, PNEB1, expressa constitutivamente durante a infeção com VEB. Adicionalmente, estes vetores podem ser usados para a transfecção, onde grandes quantidades de proteína podem ser geradas transientemente in vitro. Sistemas de amplicão de herpesvirus estão também a ser usados para empacotar pedaços de ADN > 220 kb e para infetar células que possam manter ADN estavelmente como epissomas.

Outros sistemas úteis incluem, por exemplo, vetores do vírus vaccinia replicantes e não replicantes restritos a hospedeiros. b) Sistemas não baseados em ácidos nucleicos

As composições divulgadas podem ser distribuídas às células alvo numa variedade de maneiras. Por exemplo, as 47 composições podem ser distribuídas através de eletroporação, ou através de lipofecção, ou através da precipitação do fosfato de cálcio. 0 mecanismo de distribuição escolhido irá depender em parte do tipo de célula direcionada e se a distribuição está a ocorrer por exemplo in vivo ou in vitro.

Portanto, as composições podem compreender, em acréscimo aos divulgados RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM-RC2, RC2-Ycrr, ou Ycrr-RC2, ou vetores por exemplo, lípidos tais como lipossomas, tais como lipossomas catiónicos (e.g. DOTMA, DOFE, DC-colesterol) ou lipossomas aniónicos. Os lipossomas podem compreender ainda proteínas para facilitar o direcionamento a uma célula em particular, se desejado. A administração de uma composição compreendendo um composto e um lipossoma catiónico pode ser administrada ao sangue aferente ao órgão alvo ou inalada para o trato respiratório para se direcionar a células do trato respiratório. No que diz respeito aos lipossomas, veja, e.g. Brigham et al. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1:95-100 (1989); Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sei E.U.A. 84:7413-7417 (1987); Pat. E.U.A. No. 4,897,355. Além disso, o composto pode ser administrado como um componente de uma microcápsula que pode ser direcionada a tipos de células específicos, tais como macrófagos, ou onde a difusão de um composto ou distribuição de um composto da microcápsula é desenhada para uma taxa ou dosagem específica.

Nos métodos descritos acima que incluem a administração e captação de ADN exógeno às células do sujeito (i.e. transdução ou transfecção do gene), a distribuição das composições às células pode ser através de uma variedade de mecanismos. Como um exemplo, a distribuição pode ser 48 através de uma lipossoma, usando preparações de lipossomas comercialmente disponíveis tais como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemanha) e TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), bem como outros lipossomas desenvolvidos de acordo com procedimentos padrão na técnica. Em acréscimo, o ácido nucleico ou vetor desta invenção pode ser distribuída in vivo por eletroporação, a tecnologia para a qual está disponível pela Genetronics, Inc (San Diego, CA) bem como por meio de uma máquina de SONOPORAÇÃO (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ).

Os materiais podem estar em solução, suspensão (por exemplo, incorporados em micropartícuias, lipossomas, ou células). Estes podem ser direcionados a um tipo de células particular através de anticorpos, recetores, ou ligandos recetores. As referências seguintes são exemplos do uso desta tecnologia para direcionar proteínas específicas ao tecido do tumor (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Câncer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Câncer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Câncer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz e McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); e Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). Estas técnicas podem ser usadas para uma variedade de outros tipos de células específicos. Veículos tais como "furtivos" e outros lipossomas conjugados com anticorpos (incluindo direcionamento de medicamentos mediado por lípidos a um carcinoma colónico), direcionamento mediado por um recetor de ADN através de ligandos específicos da célula, direcionamento de tumor dirigido por linfócitos, e direcionamento retroviral terapêutico altamente específico de células do glioma de 49 murino in vivo. As seguintes referências são exemplos do uso desta tecnologia para direcionar proteínas específicas ao tecido do tumor (Hughes et al., Câncer Research, 49:6214-6220, (1989); e Litzinger e Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). No geral, os recetores estão envolvidos em vias de endocitose, quer constitutiva, quer induzida por ligandos. Estes recetores agrupam-se em poços revestidos a clatrina, entram na célula através de vesículas revestidas a clatrina, passam através de uma endossoma acidificado no qual os recetores são ordenados, e depois ou se reciclam para a superfície da célula, tornando-se armazenados intracelularmente, ou são degradados em lisossomas. As vias de internalização servem uma variedade de funções, tais como captação de nutrientes, remoção de proteínas ativadas, libertação de macromoléculas, entrada oportunista de vírus e toxinas, dissociação e degradação de ligandos, e regulação do nível de recetores. Muitos recetores seguem mais do que uma via intracelular, dependendo do tipo de célula, da concentração do recetor, do tipo de ligando, da valência do ligando, e da concentração do ligando. Mecanismos celulares e moleculares de endocitose mediada por recetores têm sido examinados (Brown e Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).

Os ácidos nucleicos que são distribuídos a células que são para ser integradas no genoma da célula hospedeira, tipicamente contém sequências de integração. Estas sequências são por vezes sequências relacionadas com vírus, particularmente quando são usados sistemas baseados em vírus. Estes sistemas de integração virai podem também ser incorporados em ácidos nucleicos que são para ser distribuídos usando um sistema de distribuição não baseado em ácidos nucleicos, tal como um lipossoma, de modo a que o 50 ácido nucleico contido no sistema de distribuição possa ficar integrado no genoma do hospedeiro.

Outras técnicas gerais para integração no genoma do hospedeiro incluem, por exemplo, sistemas desenhados para promover a recombinação homóloga com o genoma do hospedeiro. Estes sistemas tipicamente apoiam-se em sequências que flanqueiam o ácido nucleico a ser expresso que têm homologia suficiente com a sequência alvo dentro do genoma da célula hospedeira que a recombinação entre o ácido nucleico vetor e o ácido nucleico alvo tem lugar, fazendo com que o ácido nucleico distribuido seja integrado no genoma do hospedeiro. Estes sistemas e os métodos necessários para promover a recombinação homóloga são conhecidos daqueles peritos na técnica. c) In vivo/ex vivo

Como descrito acima, as composições podem ser administradas num transportador farmaceuticamente aceitável e podem ser distribuídas às células dos sujeitos in vivo e/ou ex vivo por uma variedade de mecanismos bem conhecidos na técnica (e.g., captação de ADN nu, fusão de lipossomas, injeção intramuscular de ADN através de uma arma de genes, endocitose e similares).

Se são empregues métodos ex vivo, as células ou tecidos podem ser removidos e mantidos fora do corpo de acordo com protocolos padrão bem conhecidos na técnica. As composições podem ser introduzidas dentro das células através de qualquer mecanismos de transferência de genes, tais como, por exemplo, distribuição de genes mediada por fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção ou proteolipossomas. As células transduzidas podem depois ser infundidas (e.g., num transportador farmaceuticamente aceitável) ou 51 transplantadas homotopicalmente de volta no sujeito por métodos padrão para o tipo de célula ou tecido. São conhecidos métodos padrão para a transplantação ou infusão de várias células num sujeito. 4. Sistemas de expressão

Os ácidos nucleicos que são distribuídos às células tipicamente contêm sistema de controlo da expressão. Por exemplo, os genes inseridos em sistemas virais e retrovirais usualmente contém promotores, e/ou melhoradores para ajudar a controlar a expressão do produto de gene desejado. Um promotor é geralmente uma sequência ou sequências de ADN que funciona(m) quando numa localização relativamente fixa no que diz respeito ao local de inicio da transcrição. Um promotor contém elementos centrais necessários para a interação básica da polimerase de ARN e dos fatores de transcrição, e pode conter elementos a montante e elementos de resposta. a) Promotores e Melhoradores Virais

Promotores preferenciais para o controlo da transcrição de vetores em células hospedeiras de mamífero podem ser obtidos de várias fontes, por exemplo, os genomas de vírus tais como: polioma, Vírus Símio 40 (VS40), adenovírus, retrovírus, vírus da hepatite-B e mais preferencialmente citomegalovírus, ou de promotores de mamífero heterólogos, e.g., promotor de beta actina. Os promotores precoces e tardios do vírus VS40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição do VS40 que também contém a origem de replicação virai do VS40 (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)). O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindiII (Greenway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 52 (1982) ). Claro, promotores da célula hospedeira ou espécies relacionadas são também úteis aqui.

Melhorador geralmente refere-se a uma sequência de ADN que funciona a uma distância não fixa do local de inicio da transcrição e pode ser quer 5" (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 78: 993 (1981)) ou 3' (Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)) relativamente à unidade de transcrição. Além disso, os melhoradores podem estar dentro de um intrão (Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983) ) bem como dentro da própria sequência codificante (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)). Eles são usualmente entre 10 e 300 pb em comprimento, e funcionam em cis. Os melhoradores funcionam para aumentar a transcrição de promotores próximos. Os melhoradores também muitas vezes contêm elementos de resposta que medeiam a regulação da transcrição. Os promotores podem também conter elementos de resposta que medeiam a regulação da transcrição. Os melhoradores muitas vezes determinam a regulação da expressão de um gene. Enquanto muitas sequências de melhoradores são hoje conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, -fetoproteína e insulina), tipicamente usa-se um melhorador de um vírus de uma célula eucariótica para expressão geral. Exemplos preferenciais são o melhorador de VS40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o melhorador promotor precoce do citomegalovírus, o melhorador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e melhoradores de adenovírus. O promotor e/ou o melhorador podem ser especificamente ativados por eventos químicos quer leves, quer específicos que desencadeiam a sua função. Os sistemas podem ser regulados por reagentes tais como tetraciclina e 53 dexametasona. Existem também meios de melhorar a expressão de genes do vetor virai pela exposição à irradiação, tais como irradiação gama, ou medicamentos de quimioterapia alquilantes .

Em certas formas de realização, a região do promotor e/ou do melhorador pode atuar como um promotor e/ou um melhorador constitutivo para maximizar a expressão da região da unidade de transcrição a ser transcrita. Em certas construções, a região do promotor e/ou do melhorador está ativa em todos os tipos de células eucarióticas, mesmo se for somente expressa num tipo particular de célula num momento particular. Um promotor preferencial deste tipo é o promotor CMV (650 bases). Outros promotores preferenciais são promotores de VS40, citomegalovirus (promotor de comprimento total), e o vetor retroviral LTF.

Tem sido mostrado que todos os elementos reguladores específicos podem ser clonados e usados para construir vetores de expressão que são seletivamente expressos em tipos de células específicos tais como células de melanoma. O promotor da proteina glial fibrilar ácida (PGFA) tem sido usado para expressar seletivamente genes em células de origem glial.

Os vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (levedura, fungo, inseto, planta, animal, humano ou células nucleadas) podem também conter sequências necessárias para a terminação da transcrição que pode afetar a expressão de mARN. Estas regiões são transcritas como segmentos poliadenilados na porção não traduzida da proteina de fator do tecido codificante do mARN. As regiões 3" não traduzidas também incluem locais de terminação da transcrição. É preferencial que a unidade de transcrição também contenha uma região de poliadenilação. Um beneficio 54 desta região é que ela aumenta a probabilidade de a unidade transcrita ser processada e transportada como mARN. A identificação e o uso de sinais de poliadenilação em construções de expressão estão bem estabelecidos. É preferencial que sinais de poliadenilação homólogos sejam usados nas construções transgénicas. Em certas unidades de transcrição, a região de poliadenilação é derivada do sinal de poliadenilação precoce do VS40 e consiste em cerca de 400 bases. É também preferencial que as unidades transcritas contenham outras sequências padrão sozinhas ou em combinação com as sequências acima que melhorem a expressão, ou a estabilidade, da construção. b) Marcadores

Os vetores virais podem incluir sequências de ácido nucleico codificando um produto marcador. Este produto marcador é usado para determinar se o gene foi distribuído à célula e uma vez distribuído está a ser expresso. Os genes marcadores preferenciais são o gene lacZ de E.Coli, quen codifica a β-galactosidade, e a proteína fluorescente verde.

Em algumas formas de realização o marcador pode ser um marcador selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero são dihidrofolato redutase (DHFR), timidina cinase, neomicina, análogo de eneomicina G418, hidromicina, e puromicina. Quando tais marcadores selecionáveis são transferidos com sucesso para uma célula hospedeira de mamífero, a célula hospedeira de mamífero transformada pode sobreviver se colocada sob pressão seletiva. Existem duas categorias distintas largamente usadas de regimes seletivos. A primeira categoria é baseada no metabolismo da célula e o uso de uma linha de células mutantes que carece da faculdade de crescer independente de um meio complementado. Dois 55 exemplos são: células -OHC DHFR e células-LTC de camundongo. Estas células carecem da faculdade de crescer sem a adição de tais nutrientes como timidina ou hipoxantina. Porque estas células carecem de certos genes necessários para uma via de síntese de nucleótidos completa, eles não conseguem sobreviver a não ser que os nucleótidos em falta sejam proporcionados num meio complementado. Uma alternativa à complementação do meio é introduzir um gene de DHFR ou TC intacto nas células carecendo dos respetivos genes, alterando assim as suas necessidades de crescimento. Células individuais que não foram transformadas com o gene de DHFR ou TC não serão capazes de sobreviverem num meio não complementado. A segunda categoria é a seleção dominante a qual se refere a um esquema de seleção usado em qualquer tipo de células e não requer o uso de uma linha de células mutantes. Estes esquemas tipicamente usam um medicamento para deter o crescimento de uma célula hospedeira. Exemplos de tal seleção dominante usam os medicamentos neomicina (Southern P. e Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan, R.C. e Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) ou higromicina (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)). Os três exemplos empregam genes bacterianos sob controlo eucariótico para transmitir resistência ao medicamento G418 ou neomicina (geneticina) , xgpt (ácido micofenólico) ou higromicina apropriados, respetivamente. Outros incluem o análogo de neomicina G418 e puramicina. 56 5. Péptidos a) Variantes de proteína

Como discutido aqui existem numerosas variantes das proteinas RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM-RC2, RC2-Ycrr e Ycrr-RC2, que são conhecidas e aqui contempladas. Em adição às variantes de estirpe funcionais conhecidas RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM- RC2, RC2-Ycrr e Ycrr-RC2, existem derivados das proteinas RC2, FAD, CD5 9, RC1, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM-RC2, RC2-Ycrr e Ycrr-RC2, que também funcionam nos métodos e composições divulgados. Os Variantes e derivados de proteina são bem entendidos por aqueles peritos na técnica e podem envolver modificações da sequência de aminoácidos. Por exemplo, as modificações da sequência de aminoácidos tipicamente caiem numa ou em mais de três classes: variantes substitucionais, insercionais e deletoras. As inserções incluem fusões terminais de amino e/ou carboxilo bem como inserções intrasequenciais de resíduos de aminoácido simples ou múltiplos. As inserções serão vulgarmente inserções menores do que aquelas das fusões terminais de amino ou carboxilo, por exemplo, na ordem de um a quatro resíduos. Os derivados de proteína de fusão imunogénica, tais como os descritos nos exemplos, são feitos pela fusão de uma polipéptido suficientemente grande para conferir imunogenicidade à sequência alvo pela ligação cruzada in vitro ou pela cultura de células recombinantes transformada com o ADN codificando a fusão. As deleções são caracterizadas pela remoção de um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência proteica. Tipicamente, não mais do que cerca de 2 a 6 resíduos são deletados em qualquer local dentro da molécula 57 de proteína. Estas variantes são vulgarmente preparadas por mutagénese específica do local de nucleótidos no ADN codificando a proteína, produzindo assim ADN codificando a variante, e depois disso expressando o ADN na cultura de células recombinantes. Técnicas para fazer mutações de substituição em locais predeterminados no ADN tendo uma sequência conhecida são bem conhecidas, por exemplo, mutagénese do promotor M13 e mutagénese de PCR. As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos simples, mas podem ocorrer num número de diferentes localizações de uma vez; as inserções usualmente serão na ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácidos; e as deleções irão variar de cerca de 1 a 30 resíduos. As deleções ou inserções são preferencialmente feitas em pares adjacentes, i.e. uma deleção de 2 resíduos ou inserção de 2 resíduos. As substituições, deleções, inserções ou as quaisquer suas combinações podem ser combinadas para chegar à construção final. As mutações não podem colocar a sequência fora do quadro de leitura e preferencialmente não irão criar regiões complementares que possam produzir uma estrutura de mARN secundária. As variantes substitucionais são aquelas nas quais pelo menos um resíduo foi removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar. Tais substituições geralmente são feitas em acordo com as Tabelas 1 e 2 seguintes e são referidas como substituições conservativas.

58 TABELA 1: Abreviaturas de aminoácidos Aminoácido Abreviaturas alanina Ala A aloisoleucina Alie arginina Arg R asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D cisterna Cys C Ácido glutâmico Glu E glutamina Gin Q glicina Gly G histidina His H isoleucina lie I leucina Leu L lisina Lys K fenilalanina Phe F prolina Pro P Ácido piroglutâmico pGlu serina Ser S treonina Thr T tirosina TyrY triptofano Trp W valina Vai V

59

Mudanças substanciais na função ou identidade imunológica são feitas selecionando as substituições que são menos conservativas do que aquelas na Tabela 2, i.e., selecionando os resíduos que diferem mais significativamente no seu efeito de manter (a) a estrutura da coluna vertebral do polipéptido na área da substituição, por exemplo como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) a parte restante da cadeia lateral. As substituições que em geral são esperadas que produzam as maiores mudanças nas propriedades da proteína serão aquelas nas quais (a) um resíduo hidrofílico, e.g. serilo ou treonilo, é substituído por (ou pelo) um resíduo hidrofóbico, e.g. leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo ou alanilo; (b) uma cisterna ou prolina é substituída por (ou pelo) qualquer outro resíduo; (c) um resíduo tendo uma cadeia lateral eletropositiva, e.g., lisilo, arginilo, ou histidilo, é substituído por (ou pelo) um resíduo eletronegativo, e.g., glutamilo ou aspartilo; ou (d) um resíduo tendo uma cadeia lateral restante, e.g., fenilalanina, é substituída por (ou pelo) um não tendo uma cadeia lateral, e.g., glicina, neste caso, (e) aumentando o número de locais para sulfatação e/ou glicosilação.

Por exemplo, a substituição de um resíduo de aminoácido com outro que é biologicamente e/ou quimicamente similar é conhecida daqueles peritos na técnica como uma substituição conservativa. Por exemplo, uma substituição conservativa seria substituir um resíduo hidrofóbico por outro, ou um resíduo polar por outro. As substituições incluem combinações tais como, por exemplo, Gly, Ala; Vai, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg; e Phe, Tyr. Tais variações conservativamente substituídas de cada sequência explicitamente divulgada são incluídas dentro dos polipéptidos mosaico proporcionados aqui. 60 A mutagénese substitucional ou deletora pode ser empregue para inserir locais para N-glicosilação (Asn-X-Thr/Ser) ou O-glicosilação (Ser ou Thr). Deleções de cisterna ou outros residuos lábeis podem ser também desejáveis. As deleções ou substituições de locais de proteólise potencial, e.g. Arg, são realizadas por exemplo pela deleção de um dos residuos básicos ou pela substituição de um por residuos de glutaminilo ou histidilo.

Certas derivatizações pós-translacionais são o resultado da ação de células hospedeiras recombinantes no polipéptido expresso. Os residuos de glutaminilo e asparaginilo são frequentemente deamidados postranslacionalmente aos correspondentes residuos de glutamilo e asparilo. Alternativamente, estes residuos são deamidados sob condições ligeiramente ácidas. Outras modificações pós-translacionais incluem a hidroxilação da prolina e lisina, a fosforilação dos grupos hidroxilo do serilo ou residuos de treonilo, a metilação dos grupos o-amino das cadeias laterais da lisina, arginina, e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., São Francisco, pp 79-86 [1983]), a acetilação da amina N-terminal e, em algumas instâncias, a amidação do carboxilo C-terminal. É entendido que um meio de definir as variantes e derivados das proteínas divulgadas aqui é através da definição das variantes e derivados em termos de homologia/identidade a sequências conhecidas específicas. Por exemplo, a SEQ ID N: 26 estabelece uma sequência particular de RC2 e a SEQ ID N: 2 estabelece uma sequência particular de uma proteína FAD. Especificamente divulgadas são variantes destas e de outras proteínas aqui divulgadas que têm pelo menos 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% de homologia à sequência estabelecida. Aqueles peritos na técnica entendem 61 prontamente como determinar a homologia de duas proteínas. Por exemplo, a homologia pode ser calculada depois de alinhar as duas sequências de modo a que a homologia esteja no seu nível mais alto.

Outra forma de calcular a homologia pode ser realizada por algoritmos publicados. Um alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 85: 2444 (1988), por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software da Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção.

Os mesmos tipos de homologia podem ser obtidos para ácidos nucleicos por por exemplo os algoritmos divulgados em Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281 -306,1989 que incluem pelo menos material relacionado com o alinhamento de ácidos nucleicos. É entendido que a descrição de mutações conservativas e da homologia pode ser combinada juntamente em qualquer combinação, tal como formas de realização que tenham pelo menos 70% de homologia a uma sequência particular em que as variantes são mutações conservativas.

Como esta especificação discute várias proteínas e sequências de proteínas é entendido que os ácidos nucleicos que possam codificar essas sequências de proteínas são 62 também divulgados. Isto incluiria todas as sequências degeneradas relacionadas com a sequência de proteínas específica, i.e. todos os ácidos nucleicos tendo uma sequência que codifique uma sequência de proteínas particular bem como todos os ácidos nucleicos, incluindo ácidos nucleicos degenerados, codificando as variantes e derivados divulgados das sequências de proteínas. Portanto, enquanto cada sequência de ácido nucleico particular possa não estar escrita aqui, é entendido que toda e cada sequência é de facto divulgada e descrita aqui através da sequência de proteínas divulgada. Por exemplo, uma das várias sequências de ácido nucleico que podem codificar a sequência de proteínas estabelecida na SEQ ID N: 26 é estabelecida na SEQ ID N: 25. Em acréscimo, por exemplo, um derivado conservativo divulgado da SEQ ID N: 26 é mostrado na SEQ ID N: 29, onde a isoleucina (I) na posição 9 é mudada para uma valina (V) . É entendido que para esta mutação todas as sequências de ácido nucleico que codificam este derivado particular de qualquer uma das sequências divulgadas são também divulgadas. É também percebido que enquanto nenhuma sequência de aminoácidos indica qual a sequência de ADN particular que codifica essa proteína dentro de um organismo, onde as variantes particulares de uma proteína divulgada são divulgadas aqui, a sequência de ácido nucleico conhecida que codifica essa proteína da qual essa proteína surge é também conhecida e aqui divulgada e descrita. 6. Anticorpos

Um inibidor do complemento pode ser um anticorpo anti-C5. a) Anticorpos Geralmente 63 0 termo "anticorpos" é usado aqui num sentido amplo e inclui os anticorpos quer policlonais, quer monoclonais. Em acréscimo às moléculas de imunoglobulina intactas, também incluídos no termo "anticorpos" são fragmentos ou polímeros dessas moléculas de imunoglobulina, e versões humanas ou humanizadas de moléculas de imunoglobulina ou seus fragmentos, como descrito aqui. Os anticorpos são testados quanto à sua atividade desejada usando ensaios in vitro descritos aqui, ou por métodos análogos, depois dos quais as suas atividades terapêuticas e/ou profiláticas in vivo são testadas de acordo com métodos de testes clínicos conhecidos.

Como usado aqui, o termo "anticorpo" engloba, mas não se limita a, imunoglobulina inteira (i.e., um anticorpo intacto) de qualquer classe. Anticorpos nativos são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (P) idênticas. Tipicamente, cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve tem também pontes de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem numa extremidade um domínio variável (V(P)) seguido de um número de domínios constante. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (V(L)) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares formem uma interface entre os domínios variáveis das cadeias leve e pesada. As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie vertebrada podem ser atribuídas a um de dois tipos 64 claramente distintos, chamados kappa (k) e lambda (1) , baseados nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco grandes classes de imunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser divididas ainda em subclasses (isótopos), e.g., IgG-1, IgG-2, IgG-3, e IgG-4; IgA-1 e IgA-2. Um perito da técnica reconheceria as classes comparáveis para o camundongo. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem a diferentes classes de imunoglobulinas são chamados alfa, delta, épsilon, gama, e mu, respetivamente. 0 termo "variável" é usado aqui para descrever certas porções dos domínios variáveis que diferem na sequência de entre os anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular ao seu antigénio particular. No entanto, a variabilidade não é usualmente uniformemente distribuída através dos domínios variáveis dos anticorpos. Ela está tipicamente concentrada em três segmentos chamados regiões determinadoras de complementaridade (RDCs) ou regiões hipervariáveis nos domínios variáveis quer da cadeia leve, quer da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de estrutura (ES). Cada um dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreende quatro regiões ES, adotando largamente uma configuração em folha-b, conectadas por três RDCs, os quais formam laços conectando, e em alguns casos formando parte de, a estrutura em folha-b. As RDCs em cada cadeia são mantidas juntas em grande proximidade pelas regiões ES e, com as RDCs da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação aos antigénios dos anticorpos (ver Kabat E. A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological 65

Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) ). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo. 0 termo "anticorpo ou seus fragmentos" engloba anticorpos quiméricos e anticorpos híbridos, com especificidades de antigénio ou epítopo duais ou múltiplas, e fragmentos, tais como cuFv, uFv, F(la')2, Fia', Fia e similares, incluindo fragmentos híbridos. Assim, os fragmentos dos anticorpos podem reter a faculdade de se ligar aos seus antigénios específicos. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem manter atividade de ligação ao complemento. Tais anticorpos e fragmentos podem ser elaborados por técnicas conhecidas na técnica e podem ser rastreados para a especificidade e atividade de acordo com os métodos estabelecidos nos Exemplos e os métodos gerais para produção de anticorpos e rastreamento de anticorpos para a especificidade e atividade (ver Harlow e Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, Nova Iorque, (1988) ).

Igualmente incluídos no significado de "anticorpo ou seus fragmentos" são conjugados de fragmentos de anticorpos e proteínas ligantes a antigénios (anticorpos de cadeia única) como descritos, por exemplo, na Pat. E.U.A. No. 4,704,692.

Como usado aqui, o termo "anticorpo" ou "anticorpos" pode-se também referir a um anticorpo humano e/ou um anticorpo humanizado. Muitos anticorpos não humanos (e.g., aqueles derivados camundongos, ratos, ou coelhos) são naturalmente antigénicos em humanos, e assim podem dar origem a respostas imunitárias indesejáveis quando administrados a humanos. Assim sendo, o uso de anticorpos humanos ou 66 humanizados nos métodos da invenção serve para diminuir a probabilidade que um anticorpo administrado a um humano evoque uma resposta imunitária indesejável.

Opcionalmente, os anticorpos são qerados em outras espécies e "humanizados" para administração em humanos. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (e.g., murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos delas (tais como Fc, cuFv, uFv, Fv, Fia, Fia', F(la')2, ou outras subsequências de anticorpos ligantes a antigénios) que contém sequências mínimas derivadas de imunoglobulina não humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais resíduos de uma região determinadora de complementaridade (RDC) do recipiente são substituídos por resíduos de uma RDC de uma espécie não humana (anticorpo doador) tais como camundongo, rato e coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em algumas instâncias, resíduos de estrutura de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente nem nas RDCs importadas ou sequências de estrutura. No geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões RDC correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões ES são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também irá compreender otimamente pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); e Presta, Curr. Op.

Struct. Biol., 2:593-596 (1992)). 67 Métodos para humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos em si de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são por vezes referidos como resíduos "de importação", os quais são tipicamente retirados de um domínio variável "de importação". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colegas de trabalho (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), substituindo RDCs ou sequências de RDC de roedores para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Conformemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Pat. E.U.A. No. 4,816,567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de RDC e possivelmente alguns resíduos de ES são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a serem usados na elaboração de anticorpos humanizados é muito importante a fim de reduzir a antigenicidade. De acordo com o método "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionado de uma biblioteca inteira de sequências de domínio variável humanas conhecidas. A sequência humana que for a mais próxima daquela do roedor é então aceite como a estrutura (ES) humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993) e Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método usa uma estrutura 68 particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de uma alta afinidade para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objetivo, de acordo com um método preferencial, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceptuais usando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulina estão comummente disponíveis e são familiares para aqueles peritos na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise dos resíduos que influenciam a faculdade da imunoglobulina candidata de se ligar aos seus antigénios. Desta forma, os resíduos de ES podem ser selecionados e combinados a partir da sequência de importação e de consenso de modo a que a característica do anticorpo desejada, tal como uma afinidade aumentada para o(s) antigénio(s) alvo, seja alcançada. No geral, os resíduos de RDC estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antigénio (ver, WO 94/04679, publicado em 3 Março 1994).

Os fragmentos Fia produzidos na digestão do anticorpo também contêm os domínios constantes da cadeia leve e o 69 primeiro dominio constante da cadeia pesada. Os fragmentos Fia" diferem dos fragmentos Fia pela adição de alguns resíduos no terminal carboxi do domínio de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisternas da região da dobradiça do anticorpo. 0 fragmento F(la')2 é um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fia" ligados por uma ponte de dissulfeto na região da dobradiça. Fla"-SH é a designação agui para Fia" nos quais o(s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes carrega(m) um grupo de tiol livre. Os fragmentos de anticorpo foram originalmente produzidos como pares dos fragmentos Fia" que têm cisternas da dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos são também conhecidos.

Um paratopo ou fragmento imunogenicamente específico isolado de um anticorpo é também proporcionado. Um epítopo imunogénico específico pode ser isolado do anticorpo inteiro por disrupção química ou mecânica da molécula. Os fragmentos purificados assim obtidos são testados para determinar a sua imunogenicidade e especificidade pelos métodos ensinados aqui. Paratopos imunorreativos do anticorpo, opcionalmente, são sintetizados diretamente. Um fragmento imunorreativo é definido como uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de dois a cinco aminoácidos consecutivos derivados da sequência de aminoácidos do anticorpo.

Um método para produção de proteínas compreendendo os anticorpos da presente invenção é ligar dois ou mais péptidos ou polipéptidos em conjunto por técnicas de química de proteínas. Por exemplo, os péptidos e polipéptidos podem ser sintetizados quimicamente usando equipamento de laboratório correntemente disponível usando química de ou Fmoc (9-fluorenilometilooxicarbonilo) ou Boc (tert-butilooxicarbonoílo). (Applied Biosystems, Inc., 70

Foster City, CA) . Um perito na técnica pode prontamente apreciar que um péptido ou polipéptido correspondente ao anticorpo da presente invenção, por exemplo, pode ser sintetizado por reações quimicas padrão. Por exemplo, um péptido ou polipéptido pode ser sintetizado e não clivado da sua resina de sintese enquanto o outro fragmento de um anticorpo pode ser sintetizado e subsequentemente clivado da resina, expondo assim um grupo terminal que está funcionalmente bloqueado no outro fragmento. Por reações de condensação de péptidos, estes dois fragmentos podem ser covalentemente juntos através de uma ligação peptídica nos seus terminais carboxilo e amino, respetivamente, para formar um anticorpo, ou fragmento dele. (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N. I. (1992); Bodansky M e Trost B., Ed. (1993) Principies of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NI). Alternativamente, o péptido ou polipéptido é independentemente sintetizado in vivo como descrito acima. Uma vez isolados, estes péptidos ou polipéptidos independentes podem ser ligados para formar um anticorpo ou um seu fragmento através de reações de condensação de péptidos similares.

Por exemplo, a ligação enzimática de segmentos de péptidos clonados ou sintéticos permite que fragmentos de péptidos relativamente pequenos sejam juntos para produzir fragmentos de péptidos maiores, polipéptidos ou dominios da proteína inteiros (Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)). Alternativamente, a ligação química nativa de péptidos sintéticos pode ser utilizada para construir sinteticamente péptidos ou polipéptidos grandes de fragmentos de péptidos mais pequenos. Este método consiste numa reação química com dois passos (Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 71 266:776-779 (1994)). 0 primeiro passo é a reação quimioseletiva de um péptido-alfa-tioéster sintético não protegido com outro segmento de péptidos não protegido contendo um residuo de Cys amino-terminal para resultar um intermediário ligado ao tioéster como o produto covalente inicial. Sem uma mudança nas condições da reação, este intermediário sofre uma reação intramolecular espontânea e rápida para formar uma ligação peptídica nativa no local de ligação. A aplicação deste método de ligação quimica nativa à sintese total de uma molécula de proteina é ilustrada pela preparação de interleucina 8 (IL-8) humana (Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).

Alternativamente, segmentos de péptidos não protegidos são quimicamente ligados onde a ligação formada entre os segmentos de péptidos como um resultado da ligação quimica é uma ligação antinatural (não peptidica) (Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)). Esta técnica tem sido usada para sintetizar análogos de domínios de proteína bem como grandes quantidades de proteínas relativamente puras com completa atividade biológica (deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, Nova Iorque, pp. 257-267 (1992)).

Os fragmentos de polipéptidos da presente invenção podem ser proteínas recombinantes obtidas pela clonagem de ácidos nucleicos codificando o polipéptido num sistema de expressão capaz de produzir os fragmentos de polipéptidos daí, tais como um sistema de expressão de adenovírus ou baculovírus. Por exemplo, pode-se determinar o domínio ativo de um anticorpo de um hibridoma específico que pode 72 causar um efeito biológico associado com a interação do anticorpo com um recetor Fc. Por exemplo, os aminoácidos que se descobriu não contribuírem quer para a especificidade da atividade ou da ligação, quer para a afinidade do anticorpo podem ser deletados sem uma perda na respetiva atividade. Por exemplo, em várias formas de realização, os aminoácidos amino ou carboxi-terminais são sequencialmente removidos quer da molécula não imunoglobulina modificada ou nativa, quer da molécula de imunoglobulina e a sua atividade ensaiada num de muitos ensaios disponíveis. Num outro exemplo, um fragmento de um anticorpo compreende um anticorpo modificado em que pelo menos um aminoácido foi substituído pelo aminoácido que ocorre naturalmente numa posição especifica, e uma porção de aminoácidos quer amino terminais, quer carboxi terminais, ou até uma região interna de um anticorpo, foi substituída com um fragmento de polipéptidos ou outra fração, tal como biotina, a qual pode facilitar na purificação do anticorpo modificado.

Os fragmentos, quer anexados a outras sequências, quer não, incluem inserções, deleções, substituições, ou outras modificações selecionadas de regiões particulares ou residuos de aminoácidos específicos, desde que a atividade do fragmento não seja significativamente alterada ou comprometida em comparação com o anticorpo ou o fragmento de anticorpo não modificados. Estas modificações podem proporcionar alguma propriedade adicional, tal como remover ou adicionar aminoácidos capazes de ligação de dissulfeto, aumentar a sua biolongevidade, alterar as suas caracteristicas secretoras, etc. Em todo o caso, o fragmento tem de possuir uma propriedade bioativa, tal como atividade de ligação, regulação da ligação num dominio de ligação, etc. As regiões funcionais ou ativas do anticorpo podem ser identificadas por mutagénese de uma região 73 específica da proteína, seguida de expressão e teste do polipéptido expresso. Tais métodos são prontamente aparentes a um profissional perito na técnica e podem incluir a mutagénese local específica do ácido nucleico codificando o antigénio. (Zoller MJ et al. Nucl. Acids Res. 10:6487-500 (1982)) .

Uma variedade de formatos de imunoensaios pode ser usada para selecionar os anticorpos que se ligam seletivamente com uma proteína, variante, ou fragmento particular. Por exemplo, imunoensaios ELISA de fase sólida são rotineiramente usados para selecionar anticorpos seletivamente imunorreativos com uma proteína, variante de proteína, ou seus fragmentos. Ver Harlow e Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, Nova Iorque, (1988), para uma descrição de formatos e condições de imunoensaios que poderiam ser usados para determinar a ligação seletiva. A afinidade de ligação de um anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Um conjunto de reagente de anticorpo pode compreender recipientes do anticorpo monoclonal ou seus fragmentos e um ou mais reagentes para deteção da ligação do anticorpo ou um seu fragmente à molécula do recetor Fc. Os reagentes podem incluir, por exemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas enzimáticas, ou outras etiquetas. Os reagentes podem também incluir anticorpos secundários ou terciários ou reagentes para reações enzimáticas, em que as reações enzimáticas produzem um produto que pode ser visualizado. b) Anticorpos humanos 74

Os anticorpos humanos da invenção podem ser preparados usando qualquer técnica. Exemplos de técnicas para a produção de anticorpos monoclonais humanos incluem aquelas descritas por Cole et al. (Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985) e por Boerner et al. (J. Immunol., 147(1):86-95, 1991). Os anticorpos humanos da invenção (e seus fragmentos) podem também ser produzidos usando bibliotecas de exibição de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991).

Os anticorpos humanos da invenção podem também ser obtidos de animais transgénicos. Por exemplo, foram descritos camundongos transgénicos, mutantes que são capazes de produzir um repertório completo de anticorpos humanos, em resposta à imunização (ver, e.g., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., 90:2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al. , Year in Immunol., 7:33 (1993)). Especificamente, a deleção homozigota do gene da região de junção da cadeia pesada (J(H)) do anticorpo nestes camundongos mutantes quiméricos e de linha germinal resulta na completa inibição da produção endógena do anticorpo, e a transferência com sucesso do ensaio de gene do anticorpo de linha germinal humano em tais camundongos mutantes de linha germinal resulta na produção de anticorpos humanos após o desafio do antigénio. Os anticorpos tendo a atividade desejada são selecionados usando complexos Env-CD4-co-recetor como descrito aqui. c) Administração de anticorpos

Os anticorpos desta invenção são preferencialmente administrados a um sujeito num transportador farmaceuticamente aceitável. Transportadores adequados e as 75 suas formulações são descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19a ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Tipicamente, uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável é usada na formulação para tornar a formulação isotónica. Exemplos do transportador farmaceuticamente aceitável incluem, mas não se limitam a, salino, solução de Ringer e solução de dextrose. 0 pH da solução é preferencialmente de cerca de 5 a cerca de 8, e mais preferencialmente de cerca de 7 a cerca de 7,5. Transportadores adicionais incluem preparações de libertação sustentada tais como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes são na forma de artigos moldados, e.g., filmes, lipossomas ou micropartícuias. Será aparente para aquelas pessoas peritas na técnica que certos transportadores podem ser mais preferenciais dependendo, por exemplo, da rota de administração e da concentração do anticorpo a ser administrado.

Os anticorpos podem ser administrados ao sujeito, paciente, ou célula por injeção (e.g., intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular), ou por outros métodos tais como infusão que assegure a sua distribuição à corrente sanguínea de uma forma eficaz. A injeção local ou intravenosa é preferencial.

Dosagens e horários eficazes para administração dos anticorpos da invenção podem ser determinados empiricamente, e fazer tais determinações está ao alcance dos peritos na técnica. Aqueles peritos na técnica perceberão que a dosagem dos anticorpos que têm que ser administrados irão variar dependendo, por exemplo, do sujeito que irá receber o anticorpo, da rota de administração, do tipo particular de anticorpo usado e de outros medicamentos a serem administrados. Orientação na 76 seleção de dosagens apropriadas para anticorpos é encontrada na literatura sobre usos terapêuticos de anticorpos, e.g., Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) cap. 22 e pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, Nova Iorque (1977) pp. 365-389. Uma dosagem diária tipica do anticorpo usado sozinho pode variar entre cerca de lyg/kg até lOOmg/kg de peso corporal ou mais por dia, dependendo dos fatores mencionados acima.

Depois da administração de um anticorpo para tratamento, inibição, ou prevenção de uma infeção de VIH, a eficácia do anticorpo terapêutico pode ser avaliada de várias formas bem conhecidas do profissional perito. Por exemplo, um dos vulgares peritos na técnica perceberá que um anticorpo da invenção é eficaz no tratamento ou inibição da infeção de VIH num sujeito pela observação de que o anticorpo reduz a carga virai ou evita um aumento adicional na carga virai. As cargas virais podem ser medidas por métodos que são conhecidos na técnica, por exemplo, usando ensaios de reação em cadeia da polimerase para detetar a presença do ácido nucleico do VIH ou ensaios de anticorpo para detetar a presença da proteína do VIH numa amostra (e.g., mas não limitado a, sangue) de um sujeito ou paciente, ou medindo o nivel de niveis de anticorpo anti-VIH circulantes no paciente. A eficácia do tratamento de anticorpo pode também ser determinada pela medição do número de células T CD4+ no sujeito infetado pelo VIH. Um tratamento de anticorpo que iniba umas iniciais ou diminua mais as células T CD4+ num sujeito ou paciente seropositivo para o VIH, ou que resulte num aumento no número de células T CD4+ num sujeito seropositivo para o VIH, é um tratamento de anticorpo eficaz. 77 d) Abordagens de ácido nucleico para a distribuição de anticorpos

As composições da invenção podem também ser administradas a pacientes ou sujeitos como uma preparação de ácido nucleico (e.g., ADN ou ARN) que codifique o anticorpo ou fragmento de anticorpo, de tal forma que as próprias células do paciente ou do sujeito captam o ácido nucleico e produzem e secretam a composição codificada (e.g., RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM-RC2, RC2-Ycrr, ou Ycrr-RC2). e) Distribuição de ácido nucleico

Nos métodos descritos acima que incluem a administração e captação de ADN exógeno às células do sujeito (i.e. transdução ou transfecção do gene), os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser na forma de ADN ou ARN nus, ou os ácidos nucleicos podem estar num vetor para distribuição dos ácidos nucleicos às células, pelo que o fragmento de ADN codificando o anticorpo está sob a regulação transcricional de um promotor, como deveria ser bem entendido de um dos vulgares peritos na técnica. 0 vetor pode ser uma preparação comercialmente disponível, tal como um vetor de adenovírus (Quantum Biotechnologies, Inc. (Lavai, Quebeque, Canadá)). A distribuição do ácido nucleico ou do vetor às células pode ser através de uma variedade de mecanismos. Como um exemplo, a distribuição pode ser através de um lipossoma, usando preparações de lipossomas comercialmente disponíveis tais como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemanha) e TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), bem como outros lipossomas desenvolvidos de acordo com procedimentos padrão na técnica. Em acréscimo, o ácido nucleico ou vetor desta invenção pode ser distribuído in vivo por eletroporação, a 78 tecnologia para a qual está disponível pela Genetronics, Inc (San Diego, CA) bem como por meio de uma máquina de SONOPORAÇÃO (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ).

Como um exemplo, a distribuição do vetor pode ser através de um sistema virai, tal como um sistema de vetor retroviral que possa empacotar um genoma retroviral recombinante (ver e.g., Pastan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 85:4486, 1988; Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895, 1986). 0 retrovírus recombinante pode então ser usado para infetar e assim distribuir às células infetadas o ácido nucleico codificando um anticorpo amplamente neutralizante (ou um seu fragmento ativo) da invenção. 0 método exato de introdução do ácido nucleico alterado em células de mamífero não é, claro, limitado ao uso de vetores retrovirais. Outras técnicas estão largamente disponíveis para este procedimento incluindo o uso de vetores adenovirais (Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5:941-948, 1994), vetores virais adenoassociados (VAA) (Goodman et al., Blood 84:1492-1500, 1994), vetores lentivirais (Naidini et al., Science 212:263-261, 1996), vetores retrovirais pseudotipados (Agrawal et al., Exper. Hematol. 24:738-747, 1996). Podem também ser usadas técnicas de transdução física, tais como distribuição de lipossomas e mecanismos mediados por recetores e outros de endocitose (ver, por exemplo, Schwartzenberger et al., Blood 87:472-478, 1996) . Esta invenção pode ser usada em conjunto com quaisquer destes ou de outros métodos de transferência de gene comummente usados.

Como um exemplo, se o ácido nucleico codificando uma construção modulador do complemento desta invenção for distribuído às células de ume sujeito num vetor de adenovírus, a dosagem para a administração do adenovírus a 79 humanos pode variar de cerca de 101 2 a 103 4 5 unidades formadoras de placas (ufp) por injeção mas pode ser tão alta como 106 ufp por injeção (Crystal, Hum. Gene Ther. 8:985-1001, 1997; Alvarez e Curiel, Hum. Gene Ther. 8:597-613, 1997) . Um sujeito pode receber uma injeção simples, ou, se injeções adicionais forem necessárias, elas podem ser repetidas a intervalos de seis meses (ou outros intervalos de tempo apropriados, como determinado pelo profissional perito) por um período indeterminado e/ou até que a eficácia do tratamento tenha sido estabelecida. A administração parenteral do ácido nucleico ou do vetor da presente invenção, se usada, é geralmente caracterizada pela injeção. Os injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, tanto como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução de suspensão em líquido antes da injeção, como como emulsões. Uma abordagem mais recentemente revista para administração parenteral envolve o uso de um sistema de libertação lenta ou libertação sustentada de tal modo que a dosagem constante é mantida. Ver, e.g., Patente E.U.A. No. 3,610,795. Para discussão adicional de formulações adequadas e várias rotas de administração de compostos terapêuticos, ver, e.g., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19a ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. 1

Transportadores farmacêuticos/Distribuição de produtos 2 farmacêuticos 3

Como descrito acima, as composições podem também ser 4 administradas in vivo num transportador farmaceuticamente 5 aceitável. Por "farmaceuticamente aceitável" entende-se um material que não é indesejável biologicamente ou de outro modo, i.e., o material pode ser administrado a um sujeito, 6 em conjunto com o ácido nucleico ou vetor, sem causar 80 quaisquer efeitos biológicos indesejáveis nem interagir de uma maneira deletéria com qualquer dos outros componentes da composição farmacêutica na qual está contido. 0 transportador seria naturalmente selecionado para minimizar qualquer degradação do ingrediente ativo e para minimizar quaisquer efeitos colaterais no sujeito, como seria bem conhecido de um perito na técnica.

As composições podem ser administradas oralmente, parenteralmente (e.g., intravenosamente), por injeção intramuscular, por injeção intraperitoneal, transdermalmente, extracorporeamente, topicamente ou similarmente, embora a administração intranasal tópica ou a administração por inalante seja tipicamente preferencial. Como usada aqui, "administração intranasal tópica" significa a distribuição das composições pelo nariz e pelas passagens nasais através de uma ou ambas as narinas e pode compreender a distribuição por um mecanismo de pulverização ou mecanismo de gotículas, ou através da aerossolização do ácido nucleico ou vetor. Esta última é eficaz quando um grande número de animais é para ser tratado simultaneamente. A administração das composições por inalante pode ser através do nariz ou da boca através da distribuição por um mecanismo de pulverização de goticulas. A distribuição pode também ser diretamente a qualquer área do sistema respiratório (e.g., pulmões) através de intubação. A quantidade exata das composições necessária irá variar de sujeito para sujeito, dependendo da espécie, idade, peso e condição geral do sujeito, da severidade da desordem alérgica a ser tratada, do ácido nucleico ou vetor particular usado, do seu modo de administração e similares. Assim, não é possível especificar uma quantidade exata para cada composição. No entanto, uma quantidade apropriada pode ser determinada por um dos vulgares peritos na técnica 81 usando somente experimentação rotineira dados os ensinamentos aqui. A administração parenteral da composição, se usada, é geralmente caracterizada pela injeção. Os injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, tanto como soluções ou suspensões liquidas, formas sólidas adequadas para solução de suspensão em liquido antes da injeção, como como emulsões. Uma abordagem mais recentemente revista para administração parenteral envolve o uso de um sistema de libertação lenta ou libertação sustentada de tal modo que a dosagem constante é mantida. Ver, e.g., Patente E.U.A. No. 3,610,795.

Os materiais podem estar em solução, suspensão (por exemplo, incorporados em micropartículas, lipossomas, ou células) . Estes podem ser direcionados para um tipo de células particular através de anticorpos, recetores, ou ligandos recetores. As referências seguintes são exemplos do uso desta tecnologia para direcionar proteínas específicas ao tecido do tumor (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Câncer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Câncer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Câncer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz e McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); e Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). Veículos tais como "furtivos" e outros lipossomas conjugados com anticorpos (incluindo o direcionamento de medicamentos mediado por lípidos a um carcinoma colónico), direcionamento mediado por um recetor de ADN através de ligandos específicos da célula, direcionamento de tumor dirigido por linfócitos, e direcionamento retroviral 82 terapêutico altamente específico de células do glioma de murino in vivo. As seguintes referências são exemplos do uso desta tecnologia para direcionar proteínas específicas ao tecido do tumor (Hughes et al., Câncer Research, 49:6214-6220, (1989); e Litzinger e Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). No geral, os recetores estão envolvidos em vias de endocitose, quer constitutiva, quer induzida por ligandos. Estes recetores agrupam-se em poços revestidos a clatrina, entram na célula através de vesículas revestidas a clatrina, passam através de um endossoma acidificado no qual os recetores são ordenados, e depois ou se reciclam para a superfície da célula, tornam-se armazenados intracelularmente, ou são degradados em lisossomas. As vidas de internalização servem uma variedade de funções, tais como captação de nutrientes, remoção de proteínas ativadas, libertação de macromoléculas, entrada oportunista de vírus e toxinas, dissociação e degradação de ligandos, e regulação do nível de recetores. Muitos recetores seguem mais do que uma via intracelular, dependendo do tipo de célula, da concentração do recetor, do tipo de ligando, da valência do ligando, e da concentração do ligando. Mecanismos celulares e moleculares de endocitose mediada por recetores têm sido examinados (Brown e Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)). a) Transportadores Farmaceuticamente Aceitáveis

As composições, incluindo anticorpos, podem ser usadas terapeuticamente em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.

Os transportadores farmacêuticos são conhecidos daqueles peritos na técnica. Estes mais tipicamente seriam transportadores padrão para a administração de medicamentos 83 a humanos, incluindo soluções tais como água estéril, salino, e soluções tamponadas a um pH fisiológico. As composições podem ser administradas intramuscularmente ou subcutaneamente. Outros compostos serão administrados de acordo com procedimentos padrão usados por aqueles peritos na técnica.

As composições farmacêuticas podem incluir transportadores, espessantes, diluentes, tampões, conservantes, agentes tensioativos e similares em acréscimo à molécula de escolha. As composições farmacêuticas podem também incluir um ou mais ingredientes ativos tais como agentes antimicrobianos, agentes anti-inflamatórios, anestésicos, e similares. A composição farmacêutica pode ser administrada num número de maneiras dependendo se o tratamento local ou sistémico é desejado, e na área a ser tratada. A administração pode ser topicamente (incluindo oftalmicamente, vaginalmente, retalmente, intranasalmente), oralmente, por inalação, ou parenteralmente, por exemplo por gotejamento intravenoso, injeção subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular. Os anticorpos divulgados podem ser administrados intravenosamente, intraperitonealmente, subcutaneamente, intracavitária, ou transdermalmente.

As preparações para administração parenteral incluem soluções aquosas ou não aquosas estéreis, suspensões, e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis tais como etil oleato. Transportadores aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo meios salinos e tamponados. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, cloreto 84 dextrose e sódio, lactato de Ringer, ou óleos fixos. Os veiculos intravenosos incluem reabastecedores de nutriente e fluido, reabastecedores de eletrólito (tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer), e similares. Os conservantes e outros aditivos podem também estar presentes tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes e similares.

As formulações para administração tópica podem incluir pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizadores, líquidos e pós. Transportadores farmacêuticos convencionais, bases de pó ou oleosas, espessantes e similares podem ser necessários ou desej áveis.

As composições para administração oral incluem pós ou grânulos, suspensões ou soluções em água ou outros meios não aquosos, cápsulas, saquetas, ou comprimidos. Espessantes, aromas, diluentes, emulsificantes, agentes de dispersão ou agentes ligantes podem ser desejáveis.

Algumas das composições podem ser administradas como um sal de adição de ácido ou base farmaceuticamente aceitável, formado pela reação com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociânico, ácido sulfúrico, e ácido fosfórico, e ácidos orgânicos tais como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, e ácido fumárico, ou pela reação com uma base inorgânica tal como hidróxido de sódio, hidróxido de amónio, hidróxido de potássio, e bases orgânicas tais como aminas mono-, di-, trialquilo e arilo e etanolaminas substituídas. 85 a) Usos terapêuticos

As gamas de dosagem para a administração das composições são aquelas largas o suficiente para produzir o efeito desejado no qual a desordem dos sintomas é efetuado. A dosagem não deve tão grande que cause efeitos colaterais adversos, tais como reações cruzadas não desejadas, reações anafiláticas, e similares. Geralmente, a dosagem irá variar com idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente e pode ser determinada por um perito na técnica. A dosagem pode ser ajustada pelo médico individual no caso de quaisquer contraindicações. A dosagem pode variar, e pode ser administrada em uma ou mais administrações de dosagem diariamente, por um ou vários dias. 8. Meios legíveis por computador É entendido que os ácidos nucleicos e as proteínas divulgados podem ser representados como uma sequência consistindo dos nucleótidos dos aminoácidos. Existe uma variedade de meios de exibir estas sequências, por exemplo a guanosina do nucleótido pode ser representada por G ou g. Do mesmo modo, o aminoácido valina pode ser presentado por Vai ou V. Aqueles peritos na técnica entendem como exibir e expressar qualquer sequência de proteína e ácido nucleico em qualquer variedade de meios que existem, cada um dos quais é considerado aqui divulgado. Especificamente contemplada aqui é a exibição destas sequências em meios legíveis por computador, tais como, disquetes comercialmente disponíveis, fitas, microplacas, discos rígidos, discos compactos, e discos de vídeos, ou outros meios legíveis por computador. Também divulgadas são as representações de código binário das sequências divulgadas. Aqueles peritos na técnica entendem que meios legíveis por computador. Portanto, os meios legíveis por computador nos 86 quais as sequências de proteína e ácidos nucleicos são gravadas, armazenadas e guardadas. 9. Composições identificadas por rastreio com composições a) Desenho de medicamento assistido por computador

As composições divulgadas podem ser usadas como alvos para qualquer técnica de modelação molecular para identificar quer a estrutura das composições divulgadas, quer as moléculas potenciais ou atuais, tais como moléculas pequenas, que interagem de um modo desejado com as composições divulgadas. Os ácidos nucleicos, péptidos, e moléculas relacionadas divulgados aqui podem ser usados em qualquer programa ou abordagem de modelação molecular. É entendido que quando se usam as composições divulgadas em técnicas de modelação, serão identificadas moléculas, tais como moléculas macromoleculares, que tenham propriedades desejadas particulares tais como a inibição ou estimulação ou a função da molécula alvo. As moléculas identificadas e isoladas quando se usam as composições divulgadas, tais como RC2, FAD, CD59, RC1, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM-RC2, RC2-

Ycrr ou Ycrr-RC2, são também divulgadas. Portanto, os produtos produzidos usando abordagens de modelação molecular que envolvem as composições divulgadas, tais como, RC2, FAD, CD59, RCl, PCM, Ycrr, RC2-FAD, FAD-RC2, RC2-CD59, CD59-RC2, RC2-RC1, RC1-RC2, RC2-PCM, PCM-RC2, RC2-Ycrr ou Ycrr-RC2, são também considerados aqui divulgados.

Portanto, uma maneira de isolar moléculas que se ligam a uma molécula de escolha é através do desenho racional. Isto 87 é alcançado através de informação estrutural e modelação por computador. A tecnologia de modelação por computador permite a visualização da estrutura atómica tridimensional de uma molécula selecionada e o desenho racional de novos compostos que irão interagir com a molécula. A construção tridimensional tipicamente depende de dados de análises cristalográficas de raios X ou imagem de RMN da molécula selecionada. A dinâmica molecular requer dados do campo de forças. Os sistemas gráficos do computador possibilitam a predição de como um novo composto se irá ligar à molécula alvo e permitem a manipulação experimental das estruturas do composto e da molécula alvo para aperfeiçoar a especificidade de ligação. A predição de qual será a interação molécula-composto quando mudanças pequenas são feitas num ou em ambos requer software de mecânica molecular e computadores computacionalmente intensivos, usualmente acoplados com interfaces conviviais e com menus entre o programa de desenho molecular e o utilizador.

Exemplos de sistemas de modelação molecular são os programas CHARMn e QUANTA, Polygen Corporation, Waltham, MA. CHARMm realiza as funções de minimização de energia e dinâmica molecular. QUANTA realiza a construção, modelação gráfica e análise da estrutura molecular. QUANTA permite a construção interativa, modificação, visualização, e análise do comportamento de moléculas com cada uma.

Um número de artigos reveem a modelação por computador de medicamentos interativa com proteínas específicas, tais como Rotivinen, et al., 1988 Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (16 Junho, 1988); McKinaly e Rossmann, 1989 Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29, 111-122; Perry e Davies, QSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R.

Liss, Inc. 1989); Lewis e Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236, 125-140 e 141-162; e, em relação a um modelo enzimático para os componentes de ácido nucleico, Askew, et al., 1989 J. Am. Chem. Soc. 111, 1082-1090. Outros programas de computador que rastreiam e descrevem graficamente químicos estão disponíveis de companhias tais como BioDesign, Inc., Pasadena, CA., Allelix, Inc, Mississauga, Ontário, Canada, e Hypercube, Inc., Cambridge, Ontário. Embora estes sejam primariamente desenhados para aplicação a medicamentos específicos a proteínas particulares, eles podem ser adaptados para desenhar moléculas especificamente interagindo com regiões específicas de ADN ou ARN, logo que essa região seja identificada.

Embora descritos acima com referência ao desenho e geração de compostos que possam alterar a ligação, pode-se também rastrear bibliotecas de compostos conhecidos, incluindo produtos naturais ou químicos sintéticos, e materiais biologicamente ativos, incluindo proteínas, para compostos que alterem a ligação do substrato ou a atividade enzimática. 10. Conjuntos

Divulgados aqui são conjuntos que são atraídos para reagentes que possam ser usados na prática dos métodos divulgados aqui. Os conjuntos podem incluir qualquer reagente ou combinação de reagentes discutidos aqui ou que se entenderia ser necessário ou benéfico na prática dos métodos divulgados. Por exemplo, os conjuntos poderiam incluir iniciadores para realizar as reações de amplificação discutidas aqui em certas formas de realização dos métodos, bem como os tampões e enzimas necessários para uso dos iniciadores como pretendido. Por exemplo, divulgado 89 é um conjunto para avaliar o risco de um sujeito para cancro, asma, lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatoide, artrite reativa, espondiloartrite, vasculite sistémica, diabete mellitus dependente de insulina, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica experimental, sindrome de Sjõgren, doença do enxerto contra hospedeiro, doença inflamatória do intestino incluindo doença de Crohn, colite ulcerosa, lesão de isquemia-reperfusão, infarto miocardial, doença de Alzheimer, rejeição do transplante (alogénica ou xenogénica), trauma térmico, qualquer inflamação induzida pelo complexo imunitário, glomerulonefrite, miastenia grave, esclerose múltipla, lúpus cerebral, sindrome de Guillain-Barre, vasculite, esclerose sistémica, anaflaxia, reações ao cateter, ateroma, infertilidade, tiroidite, SDRA, sindrome pós bypass, hemodiálise, reumatoide juvenil, sindrome de Behcets, anemia hemolitica, pênfigo, penfigoide bolhoso, acidente vascular cerebral, aterosclerose, e esclerodermia. E. Métodos para elaborar as composições

As composições divulgadas aqui e as composições necessárias para realizar os métodos divulgados podem ser elaboradas usando qualquer método conhecido daqueles peritos na técnica para aquele reagente ou composto particular a não ser que seja especificamente notado o contrário.

Divulgados são métodos de elaboração de uma composição compreendendo uma construção, em que a construção compreende um RC2 e um modulador do complemento. Também divulgados são métodos de elaboração de uma composição, em que a composição é a composição da invenção. 1. Sintese de péptidos 90

Um método para produção das proteínas divulgadas, tais como SEQ ID NO: 6, é ligar dois ou mais péptidos ou polipéptidos em conjunto por técnicas de química de proteínas. Por exemplo, podem ser sintetizados péptidos ou polipéptidos quimicamente usando equipamento de laboratório correntemente disponível usando química de ou Fmoc (9-fluorenilometilooxicarbonilo) ou Boc (tert-butilooxicarbonoílo). (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) . Um perito na técnica pode prontamente apreciar que um péptido ou polipéptido correspondente às proteínas divulgadas, por exemplo, pode ser sintetizado por reações químicas padrão. Por exemplo, um péptido ou polipéptido pode ser sintetizado e não clivado da sua resina de síntese enquanto o outro fragmento de um péptido ou proteína pode ser sintetizado e subsequentemente clivado da resina, expondo assim um grupo terminal que está funcionalmente bloqueado no outro fragmento. Por reações de condensação de péptidos, estes dois fragmentos podem ser covalentemente juntos através de uma ligação peptídica nos seus terminais carboxilo e amino, respetivamente, para formar um anticorpo, ou fragmento dele. (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.I. (1992); Bodansky M e Trost B., Ed. (1993) Principies of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NI (que inclui material relacionado com a síntese do péptido)). Alternativamente, o péptido ou polipéptido é independentemente sintetizado in vivo como descrito aqui. Uma vez isolados, estes péptidos ou polipéptidos independentes podem ser ligados para formar um péptido ou fragmento dele através de reações de condensação de péptidos similares.

Por exemplo, a ligação enzimática de clonados ou sintéticos permite que relativamente pequenos sejam segmentos de fragmentos de para j untos péptidos péptidos produzir 91 fragmentos de péptidos maiores, polipéptidos ou domínios da proteína inteiros (Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)). Alternativamente, a ligação química nativa de péptidos sintéticos pode ser utilizada para construir sinteticamente péptidos ou polipéptidos grandes de fragmentos de péptidos mais pequenos. Este método consiste numa reação química com dois passos (Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). 0 primeiro passo é a reação quimioseletiva de um péptido-alfa-tioéster sintético não protegido com outro segmento de péptidos não protegido contendo um resíduo de Cys amino-terminal para dar um intermediário ligado ao tioéster como o produto covalente inicial. Sem uma mudança nas condições da reação, este intermediário sofre uma reação intramolecular espontânea e rápida para formar uma ligação peptídica nativa no local de ligação (Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).

Alternativamente, segmentos de péptidos não protegidos são quimicamente ligados onde a ligação formada entre os segmentos de péptidos como um resultado da ligação química é uma ligação antinatural (não peptídica) (Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)). Esta técnica tem sido usada para sintetizar análogos de domínios de proteína bem como grandes quantidades de proteínas relativamente puras com completa atividade biológica (deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, Nova Oirque, pp. 257-267 (1992)). 2. Processo para elaborar as composições 92

Divulgados são processos para elaborar as composições bem como para elaborar os intermediários que levam às composições. Por exemplo, divulgados são ácidos nucleicos na SEQ ID NOs: 5. Existe uma variedade de métodos que podem ser usados para elaborar estas composições, tais como métodos de síntese química e métodos de biologia molecular padrão. É entendido que os métodos de elaborar estas e outras composições divulgadas são especificamente divulgados.

Divulgados são moléculas de ácido nucleico produzidas pelo processo compreendendo a ligação de um modo operatório de um ácido nucleico compreendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO:25 e uma sequência controlando a expressão do ácido nucleico.

Também divulgadas são moléculas de ácido nucleico produzidas pelo processo compreendendo a ligação de um modo operatório de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência tendo 80% de identidade a uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:25, e uma sequência controlando a expressão do ácido nucleico.

Divulgados são animais não humanos produzidos pelo processo de transfecção de uma célula dentro do animal com qualquer das moléculas de ácido nucleico divulgadas aqui. Divulgados são animais não humanos produzidos pelo processo de transfecção de uma célula dentro do animal com qualquer das moléculas de ácido nucleico divulgadas aqui, em que o animal é um mamífero. Também divulgados são animais não humanos produzidos pelo processo de transfecção de uma célula dentro do animal com qualquer das moléculas de ácido nucleico divulgadas aqui, em que o animal é camundongo, rato, coelho, vaca, ovelha, porco, ou primata. 93

Também divulgados são animais produzidos pelo processo de adicionar ao animal qualquer das células divulgadas aqui. F. Exemplos

Os seguintes exemplos apresentam-se de forma a proporcionar àqueles peritos na técnica uma divulgação e descrição completa de como os compostos, composições, artigos, dispositivos e/ou métodos reivindicados aqui são elaborados e avaliados, e são destinados a ser puramente exemplares da invenção e não se destinam a limitar o âmbito do que o Dr. Tomlinson considerou como invenção deles. Têm sido feitos esforços para assegurar precisão no que respeita aos números (e.g., quantidades, temperatura, etc), mas alguns erros e desvios devem ser contabilizados. A não ser que seja indicado o contrário, partes são partes por peso, a temperatura é em °C ou é a temperatura ambiente, e a pressão é à ou próxima da pressão atmosférica. 1. Exemplo 1: Direcionamento mediado pelo recetor do complemento 2 (RC2) de inibidores do complemento a locais de ativação do complemento a) Métodos (1) Linhas celulares e ADN.

Todas as manipulações de ADN foram levadas a cabo no vetor de expressão de mamífero PBM, derivado de pll8-mlgGl (30) pela deleção da região codificadora IgGl, Fc de camundongo. Células do ovário do hamster chinês (OHC) foram usadas para a expressão de proteínas e foram mantidas no meio de Eagle modificado por Dulbecco (MEMD)(GIBCO Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) complementado com 10% SFB. Clones de células 94 OHC estavelmente transfectas foram cultivados na presença de G148, e para a expressão de proteína recombinante foram cultivadas células em suspensão em OHC-S-MSF II sem SFB (GIBCO). Células U937 foram cultivadas em RPMI (GIBCO),10% SFB. (2) Anticorpos, reagentes e soro.

Antissoro de coelho a membrana celular de OHC, FAD e CD59 humanos purificados foram preparados por técnicas padrão (31). Acm anti-FAD de camundongo 1H4 (32), Acm anti-CD59 de rato YTH53.1 (33) e Acm RC2 anti-humano de camundongo 171 (liga-se a RCP 1-2) são descritos. IgM de eritrócito anti-ovelha foi de Research Diagnostic Inc. (Flanders, NJ). Todos os anticorpos secundários foram adquiridos de Sigma (St.Louis, MO). sCD59 recombinante purificada foi um presente do Dr. B.P. Morgan (University of Wales, Cardiff, RU). Soro humano empobrecido em C6 foi adquirido de Quidel (San Diego, CA) e soro humano normal (SHN) foi obtido do sangue de voluntários saudáveis no laboratório. (3) Construção de plasmideos de expressão e expressão de proteína.

As proteínas de fusão recombinantes e os inibidores do complemento solúveis preparados estão representados na Figura 1. As construções de cADN foram preparadas juntando a sequência de RC2 codificando as 4 unidades RCP N-terminal (resíduos 1-250 de proteína madura, acesso Swisspro no. P20023) a sequências codificando as regiões extracelulares de FAD e CD59. As sequências do inibidor do complemento usadas codificavam os resíduos 1-249 da sequência de proteína FAD madura (acesso Swisspro no. P08174) e os resíduos 1-77 da sequência de proteína CD59 madura (acesso Swisspro no. P13987). Para juntar RC2 às sequências do inibidor do complemento, foram usadas as sequências 95 ligantes codificando SS(GGGGS)3 e (GGGS)2 para proteínas de fusão contendo RC2 no C-terminal e no N-terminal, respetivamente. As construções de gene foram preparadas por metodologia padrão de RCP (35). Todos os passos de clonagem foram realizados no vetor PBM que foi também foi usado para a expressão de proteína (30) . Para a expressão, os plasmídeos foram transfectados em células OHC usando lipofetamina de acordo com as instruções do fabricante (GIBCO). Os clones estavelmente transfectados foram selecionados pela limitação da diluição como descrita (30) e a expressão de proteína dos clones quantificada por ELISA. (4) ELISA e ensaios de proteína. A deteção de proteínas recombinantes e a determinação da concentração relativa de proteína em supernadantes da cultura foram alcançadas usando uma técnica padrão de ELISA (31) . Dependendo de qual o tipo de proteína recombinante que estava a ser ensaiada, o anticorpo de captura era ou o Acm anti-FAD 1H4 ou o Acm anti-CD59 YTH53.1. Os anticorpos de deteção primária eram anticorpos monoclonais de coelho ou anti-FAD ou anti-CD59. Em algumas ELISAs, o Acm anti-RC2 A-3 foi também usado como anticorpo de deteção primária, e embora menos sensível, foram obtidos dados similares. A concentração de proteína das proteínas recombinantes foi determinada quer por absorvância UV, quer usando um conjunto de ensaio da proteína ABC (Pierce Chemical Company, Rockford 111). (5) Purificação de proteína.

As proteínas recombinantes foram purificadas do supernadante da cultura por cromatografia de afinidade. As colunas de afinidade foram preparadas acoplando ou o Acm anti-FAD 1H4 ou o Acm anti-CD59 YTH53.1 a colunas de 96 afinidade HiTrap ativadas por SHN (Pharmacia Biotech, Nova Jérsia, EUA) como descrito pelo fabricante. Os supernadantes da cultura contendo as proteínas recombinantes foram ajustados a pH 8,0 e aplicados a colunas de afinidade a um caudal de 0,5 mL/min. A coluna foi lavada com 6 a 8 volumes de coluna de TFS, e as proteínas recombinantes eluídas com 2 a 3 volumes de coluna de 0,1 M de glicina, pH 2,4. As frações contendo proteína de fusão foram recolhidos em tubos contendo 1 M de tampão de Tris, pH 8,0 e dialisadas contra TFS. (6) SDS-PAGE e transferência de Western.

As proteínas recombinantes purificadas foram separadas em géis de 10% de acrilamida de SDS-PAGE (Bio-Rad Life Science, Hercules, CA) sob condições não redutoras. Os géis foram corados com azul de Coomassie. Para a transferência de Western, foram seguidos procedimentos padrão (31). Brevemente, as proteínas separadas foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno, e as proteínas transferidas detetadas por meio ou do Acm anti-FAD 1H4 ou do Acm anti-CD59 YTH53.1. As membranas foram desenvolvidas com o conjunto de deteção de QLM (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . A RC2-CD59 foi também analisada por SDS-PAGE seguindo-se tratamento de glicanase. A RC2-CD59 (2 mg) foi aquecida a 95°C por 3 min. num tampão de fosfato de sódio 15 mM (pH 7,5) contendo 0,1% de SDS, 10 nM de 2-mercaptoetanol e 2 nM de AEDT. Depois de arrefecimento, a RC2-CD59 foi incubada com 3 U de N-glicanase de Flavobacterium meningosepticum (EC 3.1.5.52, Sigma) por 20 h a 37°C na presença de 1% de Nonidet P40 e 0,3 mM de PMSF. (7) Citometria de fluxo. A ligação das proteínas de fusão recombinantes a células C3-opsonizadas foi determinada por citometria de fluxo. 97 Células OHC foram incubadas num antissoro anti-OHC 10% (30 min/4°C), lavadas e incubadas em SHN 10% empobrecido em C6 (45 min/37°C). As células C3-opsonizadas foram então lavadas e incubadas com 1 μΜ de proteína recombinante (60 min/4°C). Depois da lavagem, as células foram incubadas com 10pg/mL de ou Acm anti-FAD 1H4 ou Acm anti-CD59 YTH53.1 conforme apropriado (30 min/4°C), seguido do anticorpo secundário ITCF-conjugado (1:100, 30 min/4°C). As células foram então lavadas, fixadas com 2% de paraformaldeído em TFS, e analisadas usando um citómetro de fluxo FACScan ((Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) . Todas as incubações e lavagens foram realizadas em MEMD. (8) Análise da ligação da proteina de fusão RC2 ao ligando C3. A análise cinética da interação das proteínas de fusão RC2 com a biotina-C3dg foi realizada usando medições de ressonância de plasma de superfície (RPS) feitas num instrumento BIAcore 3000. A biotina-C3dg humana, preparada como descrito (36), foi ligada à superfície de chips sensores de estreptavidina (EA) da BIAcore pela injeção de biotina-C3dg a 50 pg/mL sobre a superfície de uma célula de fluxo do chip a 2 pL/minuto por 20 minutos. O tampão de fluxo foi 0.5X TFS + 0.05% de Tween 20. O sinal de RPS dos C3dg capturados gerou unidades de resposta do BIAcore variando de 250-500. Células de fluxo de controlo revestidas a estreptavidina foram corridas na ausência de proteina. A ligação foi avaliada numa gama de concentrações de proteina de fusão RC2 (15, 6-500 nM) em 0.5X TFS, 0.05% de Tween 20 a 25°C a um caudal de 25 pL/minuto. Amostras da proteina de fusão RC2 foram injetadas em alíquotas de 50 pL usando o comando kinject. A associação das proteínas de fusão com o ligando foi monitorizada durante 120 segundos, depois dos quais foi permitido que o complexo se 98 dissociasse na presença de tampão somente por 120 segundos adicionais. A superficie de ligação foi regenerada entre análises de diferentes concentrações de proteina de fusão por um pulso de 10 segundos de 200 mM de carbonato de sódio (pH 9,5) a 50 pL/min. A ligação dos fragmentos da proteina de fusão RC2 a células de fluxo imobilizadas a C3d foi corrigida pela ligação a células de fluxo de controlo. Os dados da ligação foram ajustados a um modelo de ligação de Langmuir 1:1 usando o software BIAevaluation Versão 3.1 (BIAcore) e avaliados para o melhor ajuste por valores de residual e χ2 baixos. Os perfis de dissociação cinética obtidos foram usados para calcular taxas on e off (ka e kd) e constantes de afinidade (KD) usando o programa BIAevaluation Versão 3.1. Entre experiências, a superficie de estreptavidina foi regenerada com um pulso de 60 s de 20 mM de hidróxido de sódio (pH 9,5) a 50 pL/minuto, e a biotina-C3dg foi reaplicada como descrito acima. (9) Ensaios de lise do complemento. Células OHC a uma confluência de 60%-80% foram separadas com verseno (GIBCO), lavadas duas vezes, e ressuspensas a até loVmL em MEMD. As células foram sensibilizadas ao complemento pela adição de 10% de antissoro de membrana de célula anti-OHC de coelho às células (30 min/4°C). O antissoro foi então removido e as células ressuspensas em SHN diluido em MEMD. Os volumes finais do ensaio foram ou 50 ou 100 pL. Depois de 45 min a 37°C, a viabilidade celular foi determinada quer por exclusão de azul de tripano (contadas ambas as células vivas e mortas), quer pela libertação de 51Cr (37). Ambos os ensaios deram resultados similares. Para ensaiar a atividade inibidora do complemento de proteínas recombinantes, as proteínas foram diluídas em MEMD e adicionadas ao SHN antes da adição das células OHC. Uma concentração final de 10% de SHN foi usada a qual resultou em aproximadamente 90% de lise das células 99 OHC sensibilizadas a anticorpo não protegidas. A inibição da hemólise mediada pelo complemento foi determinada usando eritrócitos de ovelha sensibilizados a anticorpos (EA) (Advanced Research Technologies, San Diego, CA) . Foram levados a cabo eEnsaios hemoliticos num tampão veronal gelatinoso (TBG++) (Advanced Research Technologies) num volume final de 300 pL contendo 2,5xl07 de EA, SHN a uma diluição final de 1/300 e concentrações incrementais de proteína de fusão. As misturas da reação foram incubadas a 37°C por 60 min e as reações foram paradas pela adição de 300 pL de TFS contendo 10 mM de AEDT. A células foram removidas por centrifugação e a lise celular ensaiada pela quantificação espetrofotomética da hemoglobina no supernadante a 413 nm. (10) Adesão de células U937 a eritrócitos.

Ensaios da adesão dependentee de RC3 a eritrócitos C3-opsonizados foram realizados essencialmente como descritos (38). Brevemente, eritrócitos frescos de ovelha (GVO) foram sensibilizados com uma quantidade subaglutinante predeterminada de IgM anti-GVO de coelho por 30 min a 37°C em TGV (Advanced Research Technologies). Depois de lavados duas vezes, GVO C3b-opsonizados foram preparados por incubação de GVO sensibilizados a IgM com um volume igual a uma diluição 1:2 de soro humano deficiente em C6 em TGV (120 min/37°C). As células foram lavadas duas vezes e as pelotas ressuspensas em TGV. A maioria do C3 ligado aos eritrócitos depois deste tratamento está na forma de produtos de degradação de iC3b ou C3d (ligandos de RC2) devido à pequena meia vida do C3b no soro. Células U937 (4xl05 células em 200 pL) foram adicionadas a 50 pL de GVO C3-opsonizados (2xl06 células) e a mistura centrifugada (4min/40 x g) e deixada a temperatura ambiente por 90 min. As células foram então examinadas por microscopia de contraste de fase e o número de células U937 aderentes aos 100 eritrócitos determinado. Pelo menos 100 eritrócitos foram marcados por amostra, e o número médio de células U937 calculado. Foram feitas determinações triplicadas para cada experiência realizada. Em algumas experiências, as células U937 foram cultivadas por 3 dias na presença de 50 ng/mL de acetato miristato de forbol (AMF) antes da colheita, um tratamento que resulta na regulação para cima de RC3 (39, 40). Células incubadas somente com GVO revestidos a IgM, ou GVO incubados diretamente com soro humano deficiente em C6 foram usadas como controlos. (11) Estudos de biodlstrlbulção.

Procedimentos padrão para determinação da distribuição nos tecidos de proteínas radiomarcadas injetadas seguiram-se (41, 42). Brevemente, 1,7 yg de RC2-FAD marcada com 125I (4,20xl06 cpm/mg) ou sFAD (4,84xl06 cpm/mg) foram injetados na veia da cauda de camundongos fémea NZB/NZW F1 com 34 semanas de idade (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) . Depois de 24 horas, uma amostra de sangue foi tirada e os órgãos maiores foram removidos, picados e lavados em TFS contendo 10 mM de AEDT, pesados e contados. A especificidade de direcionamento foi avaliada como a dosagem injetada percentual por grama de tecido. As proteínas foram iodadas usando método do Iodogénio de acordo com as instruções do fabricante (Pierce Chemical Co.). (12) Microscopia de imunofluorescência. RC2-FAD ou sFAD (270 yg) foram injetadas na veia da cauda de camundongos MRL/lpr com 44 semanas de idade. Vinte e quatro horas depois, os rins foram removidos e congelados. Secções de criostato (5 ym) foram preparadas dos rins congelados, foram fixadas em acetona e processadas por microscopia de imunofluorescência indireta. Uma mistura equimolar de FAD anti-humano de camundongo 1A10 e Acms 1H6 101 foram usados como anticorpos de deteção primária (concentração final, 10 yg/mL) com um anticorpo secundário conjugado com ITCF especifico de Fc IgC anti-camundongo (F4143, Sigma-Aldrich). Foram seguidos procedimentos padrão (49, incorporado aqui por referência aos seus ensinamentos de técnicas de coloração de anticorpo), com exceção de que para reduzir a coloração de fundo, mais provavelmente causada por imunocomplexos depositados no rim de camundongo, o anticorpo marcado com ITCF secundário foi diluido 1:800 (10 vezes a diluição recomendada). Foram adquiridas e otimizadas imagens digitais com o Adobe Photoshop usando definições idênticas. b) Resultados (1) Desenho, expressão e purificação de construções.

As proteínas de fusão recombinantes continham as quatro unidades RCP N-terminal do RC2 humano ligadas quer ao N quer ao C terminal de formas solúveis de CD59 ou FAD humanos (construções retratadas na Figura 1). As proteínas recombinantes foram purificadas do sobrenadante da cultura dos clones de células OHC estavelmente transfectadas com rendimentos de entre 100-200 yg/L. A análise das proteínas recombinantes purificadas por SDS-PAGE e por transferência de Western revelaram proteínas dentro da gama expectável de peso molecular (Figura 2), e exceto para a RC2-CD59, todas as proteínas migraram como uma única banda. As duas bandas vistas para a RC2-CD59 foram devidas a diferenças na glicosilação, uma vez que a RC2-CD59 migrou como uma única banda após o tratamento de glicanase. (2) Direcionamento de proteínas de fusão a células opsonizadas do complemento. 102 O ligando C3 para o RC2 foi depositado em células OHC por incubação das células OHC com o anticorpo ativador do complemento e soro empobrecido em C6 (para evitar formação de CAM e lise celular). Todas as proteínas de fusão contendo RC2, mas não a sCD59 ou a sFAD, se ligaram às células OHC revestidas a C3 (Figura 3). (3) Análise cinética da interação entre as proteínas de fusão e o ligando C3dg.

Uma comparação da afinidade das diferentes proteínas de fusão recombinantes para o ligando C3dg do RC2 foi determinada por medições de ressonância de plasma de superfície. As experiências foram realizadas passando concentrações variáveis de proteínas de fusão sobre chips de estreptividina da Biacore contendo biotina-C3dg capturada (aproximadamente 2000 unidades de resposta). A análise cinética dos dados mostrou que o melhor ajuste era a um modelo de interação da ligação (Langmuir) 1:1 usando parâmetros de ajuste universais (Figura 4) . Ambas as proteínas de fusão com RC2 no N-terminal (RC2-FAD e RC2-CD59) mostraram perfis de ligação similares, com uma taxa de associação rápida e de dissociação rápida. Em contraste, a ligação de proteínas de fusão com RC2 no C-terminal (FAD-RC2 e CD59-RC2) mostrou taxas de associação e de dissociação lentas (Figura 4, Tabela 1) . As proteínas de fusão RC2 com N-terminal, no entanto, ligaram-se com a afinidade maior (Tabela 1) . As proteínas de fusão CD59 ligaram-se com uma afinidade maior do que as proteínas de fusão FAD. O FAD solúvel e a sCD59 não se ligaram ao C3dg imobilizado. (4) Atividade inibidora do complemento de proteínas de fusão. 103 A atividade inibidora do complemento dos inibidores do complemento direcionados e não direcionados foi analisada pela medição do seu efeito na lise mediada pelo complemento quer em células OHC, quer em eritrócitos. Nestas experiências, células sensibilizadas a anticorpo e proteínas recombinantes foram incubadas em soro humano a uma concentração que resultou em 90-100% de lise das células não protegidas. Para ambos os tipos de células, os inibidores do complemento direcionados foram significativamente mais eficazes do que as suas respetivas proteínas não direcionadas na inibição da lise mediada pelo complemento. As proteínas FAD direcionadas foram inibidores mais eficazes do que as CD59 direcionadas (Figuras 5 e 6) . As proteínas de fusão contendo RC2 ligadas ao N-terminal de quer do FAD, quer da CD59 foram inibidores mais eficazes do que proteínas de fusão RC2 com C-terminal. O inibidor mais potente da lise do complemento foi a RC2-FAD, requerendo uma concentração de 18 nM para 50% de inibição da lise de células OHC. Em contraste, a sFAD não direcionada necessitou de uma concentração de 375 nM para 50% de inibição da lise de células OHC, uma diferença de 20 vezes (Figura 5a). A sCD59 foi um inibidor do complemento particularmente pobre e proporcionou apenas 25% de proteção da lise de células OHC a 500 nM, a mais alta concentração testada. A RC2-CD59, no entanto, proporcionou 50% de inibição da lise de células OHC a 102 nM e foi mais eficaz do que sFAD não direcionada (Figura 6a). A Tabela 4 compara as atividade inibidoras dos diferentes inibidores do complemento recombinantes. A mais alta atividade inibidora do complemento das proteínas de fusão RC2 N-terminal correlacionada com a mais alta afinidade que estas proteínas exibiram para o ligando C3dg (Tabela 3).

Existiram algumas diferenças entre as eficácias relativas dos inibidores do complemento na proteção das células OHC e 104 dos eritrócitos da lise mediada pelo complemento. Isto foi particularmente verdade para os inibidores FAD; sFAD foi significativamente mais eficaz na proteção de eritrócitos do que células OHC do complemento, embora o FAD direcionado tivesse sido ainda mais eficaz. Existiu também pouca diferença na atividade inibidora de RC2-FAD e FAD-RC2 quando os eritrócitos eram as células alvo para a lise do complemento. (5) Efeito das proteínas de fusão RC2 na adesão celular. O recetor do complemento 3 é um recetor de leucócitos envolvido na adesão endotelial e na diapedese e na ativação dos mecanismos citoliticos da célula (fagocitose e desgranulação) . Uma vez que RC2 e RC3 partilham o mesmo ligando do complemento iC3b, foi determinado se as proteínas de fusão RC2 interferiam com a ligação de células mediada por RC3. Para estas experiências, U937, uma linha de células promonocíticas bem caracterizada (RC2~, RC3+) que se liga aos eritrócitos revestidos a iC3b num mecanismo dependente de RC3, foi usada (40). Todas as proteínas de fusão RC2, mas não sFAD ou sCD59, inibiram significativamente a ligação das células U937 a eritrócitos de ovelha C3-opsonizados (P<0,01). Cada proteína de fusão RC2 inibiu a ligação de U937 a uma extensão semelhante a uma concentração de 500 nM (Figura 7) . Dados similares foram obtidos numa experiência usando células U937 que foram estimuladas com AMF, um tratamento que resulta numa regulação para cima do RC3 (39, 40) . Para a opsonização do complemento dos eritrócitos, foi usada IgM para ativar o complemento uma vez que a IgC depositada nos eritrócitos iria envolver recetores Fcy expressos nas células 937. As células U937 também expressam RC4 (pl50,95, CDllc/CD18), um terceiro recetor partilhando o ligando iC3b. No entanto, a ligação de células U937 a eritrócitos C3-opsonizados é independente de RC4, provavelmente devido à associação de 105 RC4 com o citoesqueleto e a sua imobilidade na membrana (40) . (6) Direcionamento de RC2-FAD aos rins de camundongos nefriticos.

Para determinar se uma proteina de fusão RC2 se irá direcionar a um local de ativação do complemento e de doença in vivo, foi realizado um estudo de biodistribuição de RC2-FAD e sFAD em camundongos NZB/W F1 fémea. Os camundongos NZB/W F1 desenvolvem uma doença autoimune espontânea que é muito similar ao lúpus eritematoso sistémico (LES), com a produção de autoanticorpos e o desenvolvimento de glomerulonefrite severa mediada pelo imunocomplexo que está associada com a deposição do

complemento das 2 6 às 2 8 semanas de idade (4, 52) . A biodistribuição de [125I ] RC2-FAD e [125I]sFAD em camundongos NZB/W F1 fémea de 34 semanas de idade foi determinada às 24 horas e 48 horas depois da injeção. Vinte e quatro horas depois da injeção na veia da cauda de [125I] RC2-FAD, uma proporção significativamente maior da radioatividade estava localizada no rim ao invés de em outros órgãos que foram examinados (Figura 25a) . A 48 horas depois da injeção de [125I ] RC2-FAD, existia um nivel similar de radioatividade no rim como às 24 horas, mas a radioatividade no figado e no baço aumentou e a radioatividade do sangue diminuiu (Figura 25b). 0 figado e o baço são locais de depuração do imunocomplexo e provavelmente explicam o direcionamento aumentado de [ IJRC2-FAD a estes orgãos no ponto de tempo final. [125I]sFAD mostrou nenhuma ligação preferencial no rim ou qualquer outro órgão (Figura 25, a e b) . Nos camundongos NZB/W F1 nefríticos de 8 semanas de idade, não houve nenhuma evidência de direcionamento de [125I ] RC2-FAD ao rim (Figura 25c). De mais interesse, [125I]sFAD foi removida muito mais rapidamente da circulação do que 106 [125Ι ] RC2-FAD, sugerindo que a fração de RC2 está a funcionar para prolongar a meia vida circulatória da proteína de fusão. No entanto, o nível de [125I] RC2-FAD no sangue de camundongos mais novos às 24 horas foi de cerca de metade do que foi registado nos camundongos mais velhos, e longa meia vida circulatória de [125I ] RC2-FAD pode ser uma consequência, pelo menos em parte, de se ligar a imunocomplexos circulantes. O direcionamento de RC2-FAD ao complemento depositado no rim foi também examinado noutro modelo de murino de LES pela examinação direta de secções do rim. De modo semelhante aos camundongos NZB/W F1 fémea, os camundongos MRL/lpr desenvolvem glumerolunefrite proliferativa severa com a deposição do complemento em associação com imunodepósitos glomerulares às 24 semanas de idade (53, incorporado aqui pelos seus ensinamentos deste modelo de rato) . RC2-FAD e sFAD foram injetados na veia da cauda de camundongos MRL/lpr de 24 semanas de idade, e foram analisadas secções do rim 24 horas depois quanto à imunoreatividade ao FAD humano por microscopia de fluorescência. Secções do rim de um camundongo injetado com RC2-FAD mostraram um alto nível de coloração de FAD, com localização preferencial em glomérulos num padrão idêntico àquele visto para os imunocomplexos. Nenhuma coloração de FAD foi evidente em glomérulos de um camundongo injetado com sFAD (Figura 26). c) Conclusões

Este estudo descreve a geração e caracterização de FAD e CD59 solúveis humanos contendo proteínas que são direcionadas a um local de ativação do complemento. As proteínas direcionadas foram significativamente mais potentes na inibição do complemento do que os seus homólogos não direcionados. O direcionamento de CD59 e FAD 107 foi alcançado pela ligação dos inibidores a um fragmento de RC2 humano que se liga aos produtos de ativação C3 do complemento. Os ligandos C3 para RC2 têm uma vida relativamente longa e são ligados covalentemente, por vezes em grandes quantidades, a locais de ativação do complemento. Portanto, o direcionamento mediado por RC2 da inibição do complemento é de beneficio terapêutico para numerosas doenças associadas ao complemento ou estados de doença. Consistente com esta hipótese, a RC2-FAD mostrou direcionar-se aos rins de camundongos NZB/W F1 nefriticos. Estes camundongos produzem autoanticorpos com a consequente formação e deposição de imunocomplexos no rim que resultam na ativação e deposição do complemento (2, 43). RC2 humano liga-se aos ligandos C3 humanos e de camundongo com afinidades similares (44), e os estudos de biodistribuição estabelecem que uma proteina de fusão RC2 retém a função de direcionamento in vivo. Este estudo estabelece a viabilidade desta abordagem para a inibição do complemento humano. A abordagem do direcionamento pode também ser eficaz para outros inibidores da ativação do complemento tais como RC1 solúvel, o qual está em ensaios clínicos e é um inibidor do complemento mais potente do que o FAD in vitro (9) .

As afinidades relativas para o C3dg das diferentes proteínas de fusão RC2 são reminiscentes das afinidades das RCP 1-2 do RC2 e RCP 1-15 do RC2 para C3dg. Os valores de CD para as interações RC2 RCP 1-2 e RC2 RCP 1-15 com o C3dg foram similares, mas a RC2 RCP 1-2 associou-se e dissociou-se muito mais rapidamente, indicando uma contribuição dos domínios de RCP adicionais para a afinidade global (36). A análise da estrutura da solução de outra RCP contendo proteína, fator H, indicou que os domínios de RCP são dobrados para trás sobre si mesmos e as interações entre os domínios de RCP podem modular as características de ligação 108 ao ligando C3 (45) . Prevê-se que a variabilidade conformacional entre os dominios de RCP resulte de diferentes comprimentos de ligantes (nativos), com ligantes mais longos a proporcionarem uma maior flexibilidade conformacional. Neste contexto, os dominios da RCP RC2 e FAD são ligados com um ligante de ser-gly relativamente longo, e isto pode permitir que os parceiros de fusão se dobrem de volta um sobre o outro resultando em interações RCP-RCP que podem modular a afinidade de ligação de RC2.

Ensaios de lise mediada pelo complemento foram realizados usando células OHC ou eritrócitos de ovelha sensibilizados para anticorpo como alvos. Existiram diferenças marcantes nas atividades relativas de alguns dos inibidores do complemento em protegerem as diferentes células da lise mediada pelo complemento. sFAD, FAD-RC2, e CD59-RC2 foram significativamente mais eficazes na proteção de eritrócitos de ovelha do que as células OHC da lise mediada pelo complemento. Ao contrário dos eritrócitos, a lise mediada pelo complemento de células nucleadas não é devida inteiramente à desregulação osmótica coloide, e a deposição das CAMs múltiplos na membrana do plasma é necessária (46— 48) . A maioria dos estudos prévios que investigaram a atividade inibidora de inibidores do complemento solúveis (não direcionados) foram realizados usando eritrócitos como células alvo para a lise mediada pelo complemento. No entanto, as células OHC provavelmente representam um alvo mais fisiologicamente relevante para experiências in vitro. Diferentes mecanismos de danos mediados pelo complemento estão implicados em diferentes condições de doença e diferentes doenças podem beneficiar de estratégias de inibição atuando em diferentes pontos na via. Por exemplo, se aplicável à doença, um beneficio particular de bloquear o complemento num passo tardio da via seria que as funções de defesa do hospedeiro e os mecanismos de homeostase imune 109 permaneceriam intactos. Portanto, um inibidor baseado em CD59 proporcionaria vantagens sobre inibidores da ativação do complemento em doenças nas quais a via citolitica terminal esteja implicada na patogénese. Não é provável que a CD59 solúvel tenha beneficio terapêutico devido à sua atividade muito pobre in vitro, mas foi mostrado aqui que o direcionamento mediado por RC2 de CD59 aumentou significativamente a sua atividade inibidora do complemento. De facto, RC2-CD59 foi mais eficaz na inibição da lise mediada pelo complemento do que sFAD, e sFAD tem mostrado eficácia terapêutica in vivo (8) . Análogos de roedores de RC2-CD59 podem também ser uma ferramenta útil para dissecar os papéis relativos dos produtos de ativação do complemento precoces vs a formação de CAM na patogénese de doenças. As contribuições relativas dos diferentes produtos de ativação do complemento a lesão dos tecidos em muitas doenças são pouco entendidas e controversas.

As proteínas de fusão RC2 inibiram a ligação das células U937 a eritrócitos C3-opsonizados. Ambos os RC2 e RC3 se ligam a iC3b, e este dado indica que as proteinas de fusão RC2 atuam como antagonistas de RC3 uma vez que a ligação de U937 a eritrócitos C3-opsonizados é dependente de RC3 (40). Como uma molécula de adesão, o RC3 medeia a adesão endotelial e a diapedese em locais de inflamação através da sua interação de alta afinidade com a molécula de adesão intercelular- (MAIC-1). Como um recetor do complemento, o RC3 promove e aumenta a fagocitose e desgranulação através da sua interação com iC3b. Quer a MAIC-1, quer o iC3b se ligam a epitopos sobrepostos em RC3 (ver revisão de Ross). O RC3 pode portanto ser um determinante importante na promoção da lesão de tecido mediada pela célula nos locais de inflamação, e os anticorpos que bloqueiam o RC3 têm mostrado eficácia em várias condições inflamatórias (ver revisão de Ross). O efeito antagónico da ligação de RC2 a 110 RC3 indica portanto um segundo mecanismo de ação anti-inflamatório das proteínas de fusão inibidoras RC2-complemento que atuam sinergicamente com a inibição do complemento. O direcionamento de inibidores do complemento a locais de ativação do complemento e doença pode consideravelmente aumentar a sua eficácia. De facto, para estados de doença que beneficiariam de terapia baseada em CD59, o direcionamento de CD59 ao local de ativação do complemento será um requisito. Uma vantagem do direcionamento mediado por RC2 sobre outras abordagens de direcionamento, tais como o direcionamento mediado por anticorpo, é que a fração de RC2 se direciona a qualquer local acessível de ativação do complemento e tem uma aplicação terapêutica ampla. As proteínas de fusão RC2 podem também atuar como antagonistas de RC3, e isto pode representar um segundo benefício terapêutico importante. As proteínas de fusão inibidoras RC2-complemento humanas são também muito menos prováveis de ser imunogénicas do que inibidores recombinantes contendo regiões variáveis de anticorpo. A faculdade prevista dos inibidores direcionados da ativação do complemento em proporcionar uma concentração local eficaz com níveis baixos de inibição sistémica também diminui a possibilidade de comprometer mecanismos de defesa do hospedeiro, particularmente com a inibição do complemento sistémica de longo prazo (isto é uma consideração menos importante para inibidores baseados em CD59). Inibidores direcionados a RC2 podem-se também direcionar a agentes infecciosos que ativam o complemento. 2. Exemplo 2: Inibição do complemento direcionada e ativação 111 a) Inibidores do complemento (inflamação/bioincompatibilidade)

Os inibidores do complemento são promissores consideráveis para a terapia de muitas doenças autoimunes e inflamatórias, e estados de doença associados com bioincompatibilidade. Um inibidor do complemento farmacêutico seguro e eficaz não está correntemente disponível. As pesquisas têm-se focado largamente em desenvolver inibidores solúveis baseados em proteínas reguladoras do complemento ligadas à membrana do hospedeiro. Formas recombinantes de RC1, PCM, FAD e Ycrr solúveis têm sido produzidas pela remoção das regiões ligadas às membranas, e todas as proteínas têm mostrado ser eficazes na redução da inflamação e de danos do tecido mediados pelo complemento em vários modelos da doença. RC1 solúvel e um anticorpo que bloqueia a função da proteína do complemento C5 estão em ensaios clínicos. Existem, no entanto, sérias questões no que concerne o uso clinico de inibidores do complemento solúveis administrados sistemicamente. 0 complemento desempenha um papel crucial na imunidade quer inata, quer adaptativa, e a geração de C3b é critica para a opsonização e depuração mediada por leucócitos de muitos microrganismos patogénicos. Em acréscimo, o produto da ativação do complemento de fase fluida C5a tem mostrado ser importante no controlo da infeção e pode ser importante na depuração de substâncias patogénicas da circulação. É portanto provável que a inibição sistémica do complemento tenha sérias consequências para o hospedeiro no que respeita à sua faculdade de controlar a infeção. 0 complemento é também crucial para o catabolismo eficaz dos imunocomplexos, e isto é uma consideração particularmente importante no uso de inibidores do complemento no tratamento de doenças autoimunes e do imunocomplexo. 112 0 direcionamento dos inibidores do complemento a locais de ativação do complemento e doença pode permitir uma concentração de soro eficaz muito mais baixa e significativamente reduzir o nivel da inibição sistémica do complemento. Uma eficácia aumentada é um importante beneficio de inibidores do complemento direcionados, e o direcionamento podem também abordar o problema de uma meia vida pequena dos inibidores do complemento recombinantes solúveis em circulação.

Em acréscimo às considerações acima no que respeita ao direcionamento de inibidores do complemento, bloquear seletivamente diferentes partes da via do complemento pode permitir a geração de produtos de ativação do complemento benéficos, mas inibir a geração de produtos de ativação do complemento envolvidos da patogénese da doença. Por exemplo, os inibidores da ativação do complemento (tais como RC1, FAD, Ycrr) inibem a geração de C3b, C5a e C5b-9. Anticorpos para C5 inibem a geração de C5a e C5b-9. Por outro lado, inibidores baseados em CD59 não afetam a geração de C3b e C5a, mas bloqueiam somente a formação de C5b-9 (ver Figura 8) . A via terminal do complemento e a geração de C5b-9 têm mostrado ser importantes na promoção da inflamação e estão em particular implicados na progressão de algumas doenças do rim (tais como glomerulonefrite do imunocomplexo). Portanto, para certas doenças, um inibidor baseado em CD59 pode inibir a patogénese da doença sem interferir com a geração de produtos de ativação do complemento precoces que são importantes para a defesa do hospedeiro e a depuração de imunocomplexo. No entanto, CD59 solúvel não é um inibidor eficaz do complemento (ao contrário dos inibidores da ativação FAD, RC1, PCM ou Ycrr) , e é improvável que tenha qualquer aplicação clinica. CD59 direcionada à célula, no 113 entanto, pode representar uma terapêutica viável. Dados usando direcionamento de CD59 mediado por anticorpos [Zhang et ai., 1999, J.Clin.Invest., 103, 55-61], e os dados apresentados aqui com o direcionamento de CD59 mediado por RC2 mostram que a CD59 direcionada a uma membrana celular é significativamente mais eficaz do que CD59 não direcionada solúvel. c) RESULTADOS-1 (1) Proteína de fusão inibidora do complemento direcionada

Exemplos de proteínas de fusão humanas que foram expressas, purificadas e caracterizadas para o direcionamento e avaliadas para a função inibidora do complemento in vitro como previamente descritas incluem as seguintes: RC2-FAD, RC2-CD59, FAD-RC2, e CD59-RC2. As sequências de nucleótidos e sequências de aminoácidos previstas de proteínas de fusão humanas maduras são ilustradas nas Figuras 8-11.

(2) EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO

Construções de plasmídeos de cADN codificando as proteínas de fusão foram transfectadas para células OHC e os clones estavelmente expressos isolados. Os clones expressando os maiores níveis de proteína de fusão foram selecionados. Os clones selecionados foram cultivados em bioreatores e as proteínas de fusão isoladas do supernadante da cultura por cromatografia de afinidade. As colunas de afinidade foram preparadas usando anticorpos anti-FAD e anti-CD59 conjugados com sefarose. As proteínas recombinantes foram analisadas por SDS-PAGE e por transferência de Western (Figura 2). (3) LIGAÇÃO DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO A LIGANDOS DE C3 114

Ligandos. (a) Citometria de fluxo

As experiências de citometria de fluxo foram conduzidas como previamente descrito. Todas as proteinas de fusão contendo RC2 se ligaram às células OHC revestidas a C3, como analisado por citometria de fluxo (Figura 12). sFAD e sCD59 não se ligaram às células OHC revestidas a C3.

(b) ELISA

As experiências ELISA foram conduzidas como previamente descrito. Nas experiências ELISA, as construções contendo RC2 foram adicionadas a poços contendo C3dg purificado. A ligação foi detetada por meio de anticorpos inibidores anti-complemento e anticorpos secundários conjugados com enzimas. Todas as construções contendo RC2, mas não sCD59 e sFAD, se ligaram ao C3d. (c) Ressonância de plasma de superfície C3dg (ligando de RC2) biotinilados foram ligados a chips revestidos a estrepavidina da BIAcore e as cinéticas de ligação das proteinas de fusão contendo RC2 medidas (Figuras 13-16) . sFAD e sCD59 não se ligaram aos C3dg capturados. As proteinas de fusão com RC2 no N-terminal ligaram-se com a afinidade maior. As proteinas de fusão contendo CD59 ligaram-se com afinidade maior do que as correspondentes proteinas de fusão contendo FAD.

(4) FUNÇÃO INIBIDORA DO COMPLEMENTO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO A atividade funcional das proteinas de fusão e dos inibidores do complemento solúveis não direcionados foi analisada por medição do efeito das proteinas na lise celular mediada pelo complemento. Foram usados ensaios 115 usando células do ovário do hamster Chinês (OHC) (Figuras 17 e 18) e eritrócitos de ovelha (E) (Figuras 19 e 20) .

Os inibidores do complemento direcionados proporcionaram significativamente mais proteção da lise mediada pelo complemento do que inibidores do complemento solúveis não direcionados. As proteínas de fusão contendo RC2 no N-terminal foram as mais eficazes para ambas as proteínas de fusão contendo FAD e CD59. As proteínas de fusão contendo RC2 no N-terminal também se ligaram a C3d com uma afinidade maior do que as proteínas de fusão contendo RC2 no C-terminal nas experiências da BIAscore (ver acima). RC2-FAD foi significativamente mais eficaz do que RC2-CD59 em proporcionar proteção da lise mediada pelo complemento nestes ensaios. Note-se que, no entanto, sCD59 não direcionada possui uma atividade inibidora do complemento muito fraca mesmo a concentração alta (ao contrário de sFAD), e o direcionamento de CD59 à superfície da célula é um requisito para a função da CD59. A eficácia relativa dos inibidores do complemento direcionados vs. não direcionados para as células OHC e E é diferente. No entanto, os eritrócitos são lisados por "um impacto" (i.e. a formação de um único CAM causa a lise de E), enquanto as células nucleadas (tais como as OHC) possuem mecanismos de resistência adicionais (tais como o nivelamento e sombreamento dos CAMs) e necessitam da deposição de CAMs múltiplos para a lise. Estas diferenças provavelmente explicam as diferenças nos dados de inibição da lise, e as células OHC provavelmente representam o alvo mais fisiologicamente relevante para estas experiências in vitro. 3. Exemplo 3 116 a) Inibidores do complemento direcionados a anticorpo num modelo de rato de lesão tubulointersticial aguda:

Um painel de anticorpos monoclonados de um rim anti-rato de camundongo bem caracterizados foi usado (49, 50, incorporados aqui por referência aos seus ensinamentos no que respeita a estes anticorpos e às suas sequências). A região de ADN variável de um total de 5 anticorpos foi isolada por técnicas de RCP padrão (35, incorporada aqui por referência aos seus ensinamentos no que respeita RCP). Todas foram clonadas com sucesso e algumas foram expressas como anticorpos de cadeia única. Todos os anticorpos de cadeia única reconheceram uma linha de células quer epiteliais, quer endoteliais de rato in vitro. Um dos Acms, K9/9, liga-se a uma glicoproteina identificada na superfície da célula epitelial, e tem especificidade para a parede dos capilares glomerulares e túbulos proximais in vivo (49). Este anticorpo foi escolhido como um veículo de direcionamento para investigação da inibição do complemento mediada por Ycrr e CD59 direcionada num modelo de rato de lesão tubulointersticial aguda. Embora o Acm K9/9 tenha mostrado que induz dano glomerular num estudo prévio (49), o anticorpo foi patogénico somente quando administrado em conjunto com o adjuvante de Freund. De facto, a natureza patogénica do Acm K9/9 (com adjuvante) não foi reproduzida.

Existe uma ligação entre a proteinúria e danos renais progressivos e existem dados que suportam a hipótese de que a própria proteinúria resulta em fibrose intersticial e inflamação. O mecanismo pelo qual a proteinúria leva a lesão nefrotóxica não é conhecido, mas existe evidência de que o complemento desempenha um papel crucial e que o CAM é o principal mediador da lesão tubulointersticial devido à proteinúria. (O papel do complemento e da proteinúria na 117 lesão tubulointerticial foi recentemente revisto (51, 52)). A caracterização prévia do Acm K9/9 (ver acima (49)) sugeriu que o Acm se direciona apropriadamente para uma investigação do uso terapêutico de inibidores do complemento direcionados numa lesão tubuloinsterticial de modelo de rato induzida por proteinúria. A disponibilidade de um inibidor que possa especificamente bloquear a formação de CAM permitiria uma avaliação do papel do CAM na lesão tubuloinsterticial sob condições clinicamente relevantes.

Construções de plasmídeos codificando anticorpo K9/9 de cadeia única ligado a CD59 ou Ycrr de rato foram preparadas (representadas na fig. 27). As construções expressando Ycrr solúvel de rato (sYcrr) e K9/9 de cadeia única (somente veiculo de direcionamento) foram também preparados. Todas as proteínas recombinantes foram expressas no meio de cultura a mais do que 15 mg/litro por fermentação de Pichia num fermentador New Brunswick de 15 litros.

As proteínas recombinantes foram caracterizadas quanto ao direcionamento e à atividade inibidora do complemento in vitro como descrito acima usando uma linha de células epiteliais de rato como células alvo. K9/9 de cadeia única, K9/9-Ycrr e K9/9-CD59 ligaram-se especificamente a células do epitélio de ratos in vitro. sYcrr e K9/9 inibiram a deposição do complemento e a lise, e K9/9-CD59 inibiram a lise mediada pelo complemento. Ambos os inibidores do complemento direcionados, sYcrr e Ac de cadeia única K9/9, foram caracterizados no modelo de nefrose de puromicina aminonucleósida (PAN) de rato (53, incorporada aqui pela referência aos seus ensinamentos de sYcrr e K9/9) (sCD59 não foi avaliada uma vez que CD59 não direcionada tem somente uma atividade inibidora do complemento muito pobre (54)). Primeiro, para confirmar o direcionamento ao rim das 118 proteínas de fusão K9/9, foi determinada a especificidade de ligação in vivo pela biodistribuição de proteínas iodadas como descrito acima (54, 41). K9/9 de cadeia única e as proteínas de fusão K9/9, mas não sYcrr, direcionaram-se especificamente aos rins de rato e foram detetáveis às 48 hr depois da administração (fig. 28). A biodistribuição às 24 hr após administração foi similar, e não houve nenhum radiomarcador remanescente no sangue às 24 hr.

Em estudo terapêuticos, grupos de 4 ratos receberam PAN (150 mg/kg) no dia 0 e ou TFS ou inibidor do complemento (40 mg/kg) nos dias 4, 7 e 10. Urina (gaiolas metabólicas) e sangue foram recolhidos e os animais sacrificados no dia 11. O tratamento PAN debilitou significativamente a função renal tal como medido pela depuração de creatinina (fig. 2 9, segunda barra da esquerda) . Houve um ligeiro mas não significativo melhoramento na função renal de ratos recebendo terapia de sYcrr. No entanto, a depuração de creatinina foi significativamente melhorada em ratos tratados com PAN recebendo terapia de ou Ycrr ou CD59 direcionados (p<0,01). Não houve uma diferença significativa na depuração de creatinina entre ratos de controlo (não proteinúricos) e ratos tratados com PAN recebendo qualquer um dos inibidores do complemento (fig. 29). Como esperado, a proteinúria induzida por PAN foi alta em todos os ratos quer tratados com inibidores do complemento quer não (tabela 1). As secções de rato preparadas de ratos tratados com PAN e não recebendo terapia mostraram uma dilatação da lumina tubulares e uma degeneração de células tubulares e epiteliais como avaliado pela perda da borda em escova (ver fig. 30b, também em apêndice). Um melhoramento mínimo foi visto com a terapia de sYcrr (fig. 30d) . Em contraste, a dilatação e degeneração tubular foram significativamente suprimidas em ratos tratados com PAN recebendo Ycrr e CD59 direcionados 119 (a fig. 30c mostra K9/9-Ycrr, mas a histologia era indistinguível com a de K9/9-CD59) . Estes dados demonstram uma eficácia terapêutica da inibição do complemento neste modelo, demonstram um benefício significativo da inibição do complemento direcionada vs não direcionada e demonstram diretamente um papel importante para o dano mediado pelo CAM em lesão tubulointersticial induzida pela proteinúria. sCD59 não é um inibidor eficaz e este estudo demonstra que CD59 apropriadamente direcionada permite a inibição específica do CAM in vivo.

Numa experiência separada, a meia vida circulatória das proteínas recombinantes iodadas foi determinada como descrito (54, 41, incorporadas aqui por referências às técnicas ensinadas aí). As meias vidas (tl/2) das proteínas foram as seguintes: sYcrr: 19 min, K9/9-Ycrr: 23 min, K9/9-CD59, 29 min, K9/9 de cadeia única: 21 min. Para determinar o efeito das proteínas recombinantes na inibição sistémica do complemento, ratos foram injetados com proteínas a 40 mg/kg e o sangue colhido a tempos correspondentes a 1, 3, 5 e 7 x tl/2. A atividade inibidora do complemento no soro foi determinada pela medição da atividade hemolítica (eritrócitos de ovelha sensibilizados). Como esperado, K9/9-CD59 teve uma atividade inibidora mínima no soro (sistema de ensaio não direcionado) (fig. 31) . Cerca de 3 hr (7 x tl/2) depois da injeção de sYcrr e K9/9-Ycrr, existia uma atividade inibidora do complemento mínima no soro. A tl/2 pequena dos inibidores direcionados e não direcionados, em conjunto com os dados de biodistribuição e o facto de que sYcrr não é protetora, demonstra que os inibidores do complemento direcionados ao rim são eficazes na inibição do complemento localmente e por um período prolongado. 120

Estes dados estabelecem o uso de inibidores do complemento direcionados in vivo e demonstram benefícios importantes da inibição sistémica do complemento direcionada versus não direcionada num modelo de doença. Embora um diferente veiculo de direcionamento seja usado nestes estudos (um fragmento de anticorpo), os mesmos princípios se aplicam a outros veículos de direcionamento, tais como RC2. 4. Exemplo 4

Divulgados aqui são exemplos de construções da presente invenção elaborados de acordo com o ensinamento aqui. A terminologia usada tem o seguinte significado: RCP = repetições de consenso pequenas; PL = Péptido Líder. As construções têm todas a fórmula básica de RC2-ligante-modulador do complemento ou modulador do complemento-ligante-RC2. As notações entre parêntesis indicam detalhes dentro de uma secção particular da composição. Por exemplo, "(completo)" significa que a proteína madura inteira é usada na construção, enquanto "(RCP2-4)" indica que a RCP1 não é parte da construção. É entendido que um ligante pode ser um ligante químico, um ligante peptídico natural, ou sequências ligantes de aminoácidos (e.g., (Gly^Ser)3) . É entendido que esta lista não é limitadora e somente proporciona exemplos de algumas das construções divulgadas na presente aplicação. RC2 (completo) - (Gly4Ser) 3--FAD RC2 (completo) - (Gly4Ser) 3-CD59 humana RC2 (completo) - (Gly4Ser) 3--PCM RC2 (completo) - (Gly4Ser) 3-RCI RC2 (completo) - (Gly4Ser) 3--Ycrr RC2 (completo) - (Gly4Ser) 3-CD59 de camundongo RC2 (completo) - (Gly4Ser) 3-IgGl Fc humano RC2 (completo) - (Gly4Ser) 3-IgM Fc ' humano RC2 (completo) - (Gly4Ser) 3-IgG3 Fc de murino 121

121 RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RCP15-18) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) hidroxisuccinl RC2 (completo) hidroxisuccinl RC2 (completo) éster --PCM - (Gly4Ser) 3-IgM Fc de murino

- (Gly4Ser) 3--FVC

- (Gly3Ser) 4--FAD - (GlysSer) 4-CD59 humana

- (Gly3Ser) 4--PCM - (Gly3Ser) 4-RC1 - (GlysSer) 4-- Ycrr - (Gly3Ser) 4-CD59 de camundongo - (GlysSer) 4-IgGl Fc humano - (GlysSer) 4-IgM Fc humano - (GlysSer) 4-IgG3 Fc de murino - (GlysSer) 4-IgM Fc de murino

- (GlysSer) 4-FVC - (Gly4Ser)3-FAD (RCPs 2-4) - (GlysSer)4-FAD (RCPs 2-4) - (Gly4Ser) 3-RCI (LP--RCP1-4-RCP8-11- - (Gly4Ser) 3-Ycrr (5 N-terminal RCPs)

- VSVFPLE--FAD - VSVFPLE -CD59 humana

- VSVFPLE --PCM - VSVFPLE -RC1 - VSVFPLE --Ycrr - VSVFPLE -CD59 de camundongo - VSVFPLE -IgGl Fc humano - VSVFPLE -IgM Fc humano - VSVFPLE -IgG3 Fc de murino - VSVFPLE -IgM Fc de murino

- VSVFPLE -FVC ---m-Maleimidobenzoilo-iY-

ida éster --FAD ---m-Maleimidobenzoilo-iY- ida éster -CD59 humana -m-Maleimidobenzoilo-iY-hidroxisuccinimida 122 RC2 (completo) -m-Maleimidobenzoí lo-iV-hidroxisuccinimida éster -RC1 RC2 (completo) -m-Maleimidobenzoílo-W-hidroxisuccinimida éster --Ycrr RC2 (completo) -m-Maleimidobenzoí lo-N-hidroxisuccinimida éster-CD59 de camundongo RC2 (completo) - m-Maleimidobenzoyl-iV-hydoxysuccinimide ester-IgGl Fc humano RC2 (completo) -m-Maleimidobenzoí lo-iV-hidroxisuccinimida éster-IgM Fc humano RC2 (completo) -m-Maleimidobenzoí lo-N-hidroxisuccinimida éster-IgG3 Fc de murino RC2 (completo) -m-Maleimidobenzoílo-W-hidroxisuccinimida éster-IgM Fc de murino

RC2 (completo) -m-Maleimidobenzoí lo-N-hidroxisuccinimida éster -FVC

RC2 (completo) - bismaleimidohexano --FAD RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) RC2 (completo) bismaleimidohexano --CD59 humana bismaleimidohexano --PCM bismaleimidohexano -RC1 bismaleimidohexano --Ycrr RC2 (completo) - bismaleimidohexano -CD59 de camundongo RC2 (completo) - bismaleimidohexano -IgGl Fc humano RC2 (completo) - bismaleimidohexano -IgM Fc humano RC2 (completo) - bismaleimidohexano -IgG3 Fc de murino RC2 (completo) - bismaleimidohexano -IgM Fc' de murino.

RC2 (completo) - bismaleimidohexano -FVC

RC2 (RCP1-2) - (Gly4Ser) 3--FAD

RC2 (RCP1-2)- (Gly4Ser) 3-CD59 humana RC2 (RCP1-2) - (Gly4Ser) 3--PCM RC2 (RCP1-2) - (Gly4Ser) 3-RC1 RC2 (RCP1-2) - (Gly4Ser) 3--Ycrr RC2 (RCP1-2)- (Gly4Ser) 3-CD59 de camundongo RC2 (RCP1-2) - (Gly4Ser) 3-IgGl Fc humano 123 RC2 (RCPl-2) - (Gly4Ser; )3-IgM Fc humano RC2 (RCPl-2) - (Gly4Ser; )3-IgG3 Fc de murino RC2 (RCPl-2) - (Gly4Ser; )3-IgM Fc de murino RC2 (RCPl-2) - (Gly4Ser; ) 3 — FVC RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser; ) 4 — FAD RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser; )4-CD59 humana RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser; ) 4 — PCM RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser; ) 4-RC1 RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser' ) 4--Ycrr RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser; )4-CD59 de camundongo RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser; )4-IgGl Fc humano RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser' )4-IgM Fc humano RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser; )4-IgG3 Fc de murino RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser; )4-IgM Fc de murino RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser; ) 4-FVC RC2 (RCPl-2) - (Gly4Ser; )3-FAD (RCPs 2-4) RC2 (RCPl-2) - (Gly3Ser; )4-FAD (RCPs 2-4) RC2 (RCPl-2) - (Gly4Ser; )3-RCl (LP--RCP1-4-RCP8-1 18) RC2 (RCPl-2) - (Gly4Ser; ) 3-Ycrr (5 N-terminal RCP; RC2 (RCPl-2) - VSVFPLE- -FAD RC2 (RCPl-2) - VSVFPLE -CD59 humana RC2 (RCPl-2) - VSVFPLE --PCM RC2 (RCPl-2) - VSVFPLE -RC1 RC2 (RCPl-2) - VSVFPLE --Ycrr RC2 (RCPl-2) - VSVFPLE -CD59 de camundongo RC2 (RCPl-2) - VSVFPLE -IgGl Fc humano RC2 (RCPl-2) - VSVFPLE -IgM Fc humano RC2 (RCPl-2) - VSVFPLE -IgG3 Fc de murino RC2 (RCPl-2) - VSVFPLE -IgM Fc de murino RC2 (RCPl-2) - VSVFPLE -FVC RC2 (RCPl-2) - -- m-Maleimidobenzoílo-N- RCP15-

hidroxisuccinimida éster --FAD RC2 (RCPl-2) --- m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster -CD59 humana 124 RC2 (RCP1-2) --- m-Maleimidobenzoilo-N-

hidroxisuccinimida éster --PCM RC2 (RCP1-2)---m-Maleimidobenzoyl-i\í-hydoxysuccinimide ester -RC1 RC2 (RCP1-2) --- m-Maleimidobenzoyl-N-hydoxysuccinimide ester --Ycrr RC2 (RCP1-2) - m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster —CD59 de camundongo RC2 (RCP1-2) --- m-Maleimidobenzoilo-N- hidroxisuccinimida éster —IgGl Fc humano RC2 (RCP1-2) --- m-Maleimidobenzoilo-N- hidroxisuccinimida éster —IgM Fc humano RC2 (RCP1-2) --- m-Maleimidobenzoilo-N- hidroxisuccinimida éster —IgG3 Fc de murino RC2 (RCP1-2) --- m-Maleimidobenzoilo-N- hidroxisuccinimida éster -IgM Fc de murino RC2 (RCP1-2) éster -FVC - m-Maleimidobenzoílo -N-hidroxisuccinimi< RC2 (RCP1-2) - bismaleimidohexano -FAD RC2 (RCP1-2) - bismaleimidohexano —CD59 humana RC2 (RCP1-2) - bismaleimidohexano -PCM RC2 (RCP1-2) - bismaleimidohexano -RC1 RC2 (RCP1-2) - bismaleimidohexano --Ycrr RC2 (RCP1-2) - bismaleimidohexano —CD59 de camundongo RC2 (RCP1-2) - bismaleimidohexano —IgGl Fc humano RC2 (RCP1-2) - bismaleimidohexano —IgM Fc humano RC2 (RCP1-2) - bismaleimidohexano —IgG3 Fc de murino RC2 (RCP1-2) - bismaleimidohexano —IgM Fc de murino RC2 (RCP1-2) - bismaleimidohexano -FVC RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser) 3--FAD RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser) 3-CD59 humana RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser) 3--PCM RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser) 3-RC1 RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser) 3--Ycrr 125 RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser; )3-CD59 de camundongo RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser; )3-IgGl Fc humano RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser; )3-IgM Fc humano RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser; )3-IgG3 Fc de murino RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser; )3-IgM Fc de murino RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser; ) 3--FVC RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; ) 4 — FAD RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; ) 4-CD59 humana RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; ) 4--PCM RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; ) 4-RC1 RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; ) 4--Ycrr RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; )4-CD59 de camundongo RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; )4-IgGl Fc humano RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; )4-IgM Fc humano RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; )4-IgG3 Fc de murino RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; )4-IgM Fc de murino RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; ) 4-fvc RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser; )3-FAD (RCPs 2-4) RC2 (RCP1-3) - (Gly3Ser; )4-FAD (RCPs 2-4) RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser; )3-RCl (LP--RCP1-4-RCP8-11 18) RC2 (RCP1-3) - (Gly4Ser; ) 3-Ycrr (5 N-terminal RCPs RC2 (RCP1-3) - VSVFPLE- -FAD RC2 (RCP1-3) - VSVFPLE -CD59 humana RC2 (RCP1-3) - VSVFPLE --PCM RC2 (RCP1-3) - VSVFPLE -CRI RC2 (RCP1-3) - VSVFPLE --Ycrr RC2 (RCP1-3) - VSVFPLE —CD59 de camundongo RC2 (RCP1-3) - VSVFPLE —IgGl Fc humano RC2 (RCP1-3) - VSVFPLE —IgM Fc humano RC2 (RCP1-3) - VSVFPLE —IgG3 Fc de murino RC2 (RCP1-3) - VSVFPLE —IgM Fc de murino RC2 (RCP1-3) - VSVFPLE —FVC RC2 (RCP1-3) - -- m-Maleimidobenzoílo-N- RCP15-

hidroxisuccinimida éster --FAD 126 RC2 (RCP1-3) --- m-Maleimidobenzoílo-N- hidroxisuccinimida éster —CD59 humana RC2 (RCP1-3) ---m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida

éster --PCM RC2 (RCP1-3) — m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster —RC1 RC2 (RCP1-3) — m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster --Ycrr RC2 (RCP1-3) — m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster —CD59 de camundongo RC2 (RCP1-3) — m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster —IgGl Fc humano RC2 (RCP1-3) — m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster -IgM Fc humano RC2 (RCP1-3) — m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster —IgG3 Fc de murino RC2 (RCP1-3) — m-Maleimidobenzoílo-N-hidroxisuccinimida éster —IgM Fc de murino

RC2 (RCP1-3) — m-Maleimidobenzoílo -N-hidroxisuccinimida éster —FVC RC2 (RCP1-3) - bismaleimidohexano --FAD RC2 (RCP1-3) - bismaleimidohexano- CD59 humana RC2 (RCP1-3) - bismaleimidohexano --PCM RC2 (RCP1-3) - bismaleimidohexano -RC1 RC2 (RCPl-3) - bismaleimidohexano --Ycrr RC2 (RCP1-3) - bismaleimidohexano -CD59 de camundongo RC2 (RCPl-3) - bismaleimidohexano -IgGl Fc humano RC2 (RCPl-3) - bismaleimidohexano —IgM Fc humano RC2 (RCPl-3) - bismaleimidohexano —IgG3 Fc de murino RC2 (RCPl-3) - bismaleimidohexano -IgM Fc de murino RC2 (RCPl-3) - bismaleimidohexano -FVC RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser) 3--FAD RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser) 3-CD59 humana RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser) 3--PCM 127 127 RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser; >3-rci RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser; ) 3--Ycrr RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser; )3-CD59 de camundongo RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser; )3-IgGl Fc humano RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser; )3-IgM Fc humano RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser; )3-IgG3 Fc do murino RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser; )3-IgM Fc do murino RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser; ) 3 — FVC RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; ) 4--FAD RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; ) 4-CD59 humana RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; ) 4 — PCM RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; ) 4-RC1 RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; ) 4--Ycrr RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; )4-CD59 de camundongo RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; )4-IgGl Fc humano RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; )4-IgM Fc humano RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; )4-IgG3 Fc de murino RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; )4-IgM Fc de murino RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; ) 4-FVC RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser; )3-FAD (RCPs 2-4) RC2 (RCP1-4) - (Gly3Ser; )4-FAD (RCPs 2-4) RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser; )3-RCl (LP--RCP1-4-RCP8-11- 18) RC2 (RCP1-4) - (Gly4Ser; )3-Ycrr (5 N-terminal RCPs) RC2 (RCP1-4) - VSVFPLE- -FAD RC2 (RCP1-4) - VSVFPLE -CD59 humana RC2 (RCP1-4) - VSVFPLE --PCM RC2 (RCP1-4) - VSVFPLE -RC1 CR12 (RCP1-4) RC2 (RCP1-4) RC2 (RCP1-4) RC2 (RCP1-4) RC2 (RCP1-4) RC2 (RCP1-4) - VSVFPLE —Ycrr VSVFPLE -CD59 de camundongo VSVFPLE -IgGl Fc humano VSVFPLE -IgM Fc humano VSVFPLE —IgG3 Fc de murino VSVFPLE -IgM Fc de murino

VSVFPLE-FVC RC2 (RCP1-4) - 128 RC2 (RCP1-4) --- m-Maleimidobenzoílo-N-

hidroxisuccinimida éster --FAD RC2 (RCP1-4) --- m-Maleimidobenzoílo-N- hidroxisuccinimida éster —CD59 humana RC2 (RCP1-4) --- m-Maleimidobenzoílo-N-

hidroxisuccinimida éster --PCM RC2 (RCP1-4) --- m-Maleimidobenzoílo-N- hidroxisuccinimida éster -RC1 RC2 (RCP1-4) --- m-Maleimidobenzoílo-N- hidroxisuccinimida éster --Ycrr RC2 (RCP1-4) --- m-Maleimidobenzoílo-N- hidroxisuccinimida éster -CD59 de camundongo RC2 (RCP1-4) - m-Maleimidobenzoílo-W-hidroxisuccinimida éster -IgGl Fc humano RC2 (RCP1-4) - m-Maleimidobenzoílo-iV-hidroxisuccinimida éster -IgM Fc humano RC2 (RCP1-4) - m-Maleimidobenzoílo-iV-hidroxisuccinimida éster -IgG3 Fc de murino RC2 (RCP1-4) --- m-Maleimidobenzoílo-N- hidroxisuccinimida éster -IgM Fc de murino RC2 (RCP1-4) - m-Maleimidobenzoílo-iV-hidroxisuccinimida

éster -FVC

RC2 (RCP1-4) - bismaleimidohexano --FAD RC2 (RCP1-4) - bismaleimidohexano -CD59 humana

RC2 (RCP1-4) - bismaleimidohexano --PCM RC2 (RCP1-4) - bismaleimidohexano -RC1 RC2 (RCP1-4) RC2 (RCP1-4) RC2 (RCP1-4) RC2 (RCP1-4) bismaleimidohexano --Ycrr bismaleimidohexano -CD59 de camundongo bismaleimidohexano -IgGl Fc humano

bismaleimidohexano -IgM Fc humano RC2 (RCP1-4) - bismaleimidohexano -IgG3 Fc de murino RC2 (RCP1-4) - bismaleimidohexano -IgM Fc de murino RC2 (RCP1-4) - bismaleimidohexano -FVC 129 G. Referências 1. Wang, Y., Rollins, S.A., Madri, J.A., e Matis, L.A. 1995. Anti-C5 monoclonal antibody therapy prevents collagen-induced arthritis and ameliorates established disease. Proc Natl Acad Sei EUA 92:8955-8959. 2. Wang, Y., Hu, Q., Madri, J.A., Rollins, S.A., Chodera, A., e Matis, L.A. 1996. Amelioration of lupus-like autoimmune disease in NZB/W F1 mice after treatment with a blocking monoclonal antibody specific for complement component C5. Proc.Natl.Acad.Sei. EUA 93:8563-8568. 3. Kaplan, M. 2002. Eculizumab (Alexion). Curr Opin Investig Drugs 3:1017-1023. 4. Whiss, P.A. 2002. Pexelizumab Alexion. Curr Opin Investig Drugs 3:870-877. 5. Weisman, H.F., Bartow, T., Leppo, M.K., Marsh, H.C., Carson, G.R., Consino, M.F., Boyle, M.P., Roux, K.H., Weisfeldt, M.L., e Fearon, D.T. 1990. Soluble human complement receptor type 1: in vivo inhibitor of complement suppressing post-ischenic myocardial inflammation and necrosis. Science 249:146-151. 6. Rioux, P. 2001. TP-10 (AVANT Immunotherapeutics). Curr

Opin Investig Drugs 2:364-371. 7. Higgins, P.J., Ko, J.-L., Lobell, R., Sardonini, C., Alessi, M.K., e Yeh, C.G. 1997. A soluble chimeric complement activating inhibitory protein that possesses both decay-accelerating and factor I cofactor activities. J.Immunol. 158:2872-2881. 8. Moran, P., Beasly, H., Gorrel, A., Martin, E., Gribling, P., Fuchs, H., Gillet, N., Burton, L.E., e Caras, I.W. 1992. Human recombinant soluble decay accelerating factor inhibits complement activation in vitro and in vivo. J.Immunol. 149:1736-1743. 130 9. Christiansen, D., Milland, J., Thorley, B.R., McKenzie, I.F., e Loveland, B.E. 1996. A functional analysis of recombinant soluble CD46 in vivo and a comparison with recombinant soluble forms of CD55 and CD35 in vitro. eji 26:578-585. 10. Salerno, C.T., Kulick, D.M., Yeh, C.G., Guzman-Paz, M., Higgins, P.J., Benson, B.A., Park, S.J., Shumway, S.J., Bolman, R.M., 3rd, e Dalmasso, A.P. 2002. A soluble chimeric inhibitor of C3 and C5 convertases, complement activation blocker-2, prolongs graft survival in pig-to-rhesus monkey heart transplantation. Xenotransplantation 9:125-134. 11. Kroshus, T.J., Salerno, C.T., Yeh, C.G., Higgins, P.J., Bolman, R.M., 3rd, e Dalmasso, A.P. 2000. A recombinant soluble chimeric complement inhibitor composed of human CD46 and CD55 reduces acute cardiac tissue injury in models of pig-to-human heart transplantation. Transplantation 69:2282-2289. 12. Rushmere, N.K., Van Den Berg, C.W., e Morgan, B.P. 2000. Production and functional characterization of a soluble recombinant form of mouse CD59. Immunology 99:326-332 . 13. Quigg, R.J., He, C., Hack, B.K., Alexander, J.J., e Morgan, B.P. 2000. Production and functional analysis of rat CD59 and chimeric CD59-Crry as active soluble proteins in Pichia pastoris. Immunology 99:46-53. 14. Sugita, Y., Ito, K., Shiozuka, K., Gushima, H., Tomita, M., e Masuho, Y. 1994. Recombinant soluble CD59 inhibits reactive haemolysis with complement. Immunol. 82:34-41. 15. Meri, S., Lehto, T., Sutton, C.W., Tyynela, J., e Batumann, M. 1996. Structural composition and functional characterization of soluble CD59: heterogeneity of the oligosaccharide and glycophosphoinositol (GPI) anchor 131 revealed by laser-desorption mass spectrometric analysis. Biochem J 316 (Parte 3):923-935. 16. Mulligan, M.S., Warner, R.L., Ritterhaus, C.W., Thomas, L. J., Ryan, U.S., Foreman, K.E., Crouch, L.D., Till, G.O., e Ward, P.A. 1999. Endothelial targeting and enhanced antiinflammatory effects of complement inhibitors possessing silayl lewisX moieties. J.Immunol. 162:4952-4959. 17. Ritterhaus, C.W., Thomas, L.J., Miller, D.P., Picard, M. D., Georhegan-Barek, K.M., Scesney, S.M., Henry, L.D., Sen, A.C., Bertino, A.M., Hannig, G., et al. 1999.

Recombinant glycoproteins that inhibit complement activation and also bind the selectin adhesion molecules. J.Biol.Chem. 274:11237-11244. 18. Zhang Hf, H., Lu, S., Morrison, S.L., e Tomlinson, S. 2001. Targeting of functional antibody-decay accelerating factor (DAF) fusion proteins to a cell surface. J Biol Chem 14:14. 19. Zhang, H.-F., Yu, J., Bajwa, E., Morrison, S.L., e Tomlinson, S. 1999. Targeting of functional antibody-CD59 fusion proteins to a cell surface. J. Clin.Invest. 103:55-6 6. 20. Linton, S.M., Williams, A.S., Dodd, I., Smith, R., Williams, B.D., e Morgan, B.P. 2000. Therapeutic efficacy of a novel membrane-targeted complement regulator in antigen-induced arthritis in the rat. Arthritis Rheum 43:2590-2597. 21. Smith, G.P., e Smith, R.A. 2001. Membrane-targeted complement inhibitors. Mol Immunol 38:249-255. 22. Carroll, M.C. 1998. The role of complement and complement receptors in induction and regulation of immunity. Annu.Rev.Immunol. 16:545-568. 23. Carroll, M.C. 2000. The role of complement in B cell activation and tolerance. Adv Immunol 74:61-88. 132 24. Holers, V.M. 1989. Complement receptors. Year Immunl 4:231-240. 25. Dierich, M.P., Schulz, T.F., Eigentler, A., Huemer, H., e Schwable, W. 1988. Structural and functional relationships among receptors and regulators of the complement system. Mol Immunol 25:1043-1051. 26. Lowell, C.A., Klickstein, L.B., Cárter, R.H., Mitchell, J.A., Fearon, D.T., e Ahearn, J.M. 1989. Mapping of the Epstein-Barr virus and C3dg binding sites to a common domain on complement receptor type 2. J Exp Med 170:1931-1946. 27. Szakonyi, G., Guthridge, J.M., Li, D., Young, K., Holers, V.M., e Chen, X.S. 2001. Structure of complement receptor 2 in complex with its C3d ligand. Science 292:1725-1728. 28. Law, S.K., Fearon, D.T., e Levine, R.P. 1979. Action of the C3b-inactivator on the cell-bound C3b. J Immunol 122 :759-765. 29. Seya, T., e Nagasawa, S. 1985. Limited proteolysis of complement protein C3b by regulatory enzyme C3b inactivator: isolation and characterization of a biologically active fragment, C3d,g. J Biochem (Tóquio) 97:373-382. 30. Quigg, R.A., Kozono, Y., Berthiaume, D., Lim, A., Salant, J., Weinfeld, A., Griffin, P., Kremmer, E., e Holers, V.M. 1998. Blockade of antibody-induced glomerulonephritis with Crry-Ig, a soluble murine complement inhibitor. J. Immunol. 160:4553-4560. 31. Harlow, E., e Lane, D. 1988. Antibodies. A laboratory manual. Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory. 32. Kim, S. 1993. Liposomes as carriers of câncer chemotherapy. Current sataus and future prospects. Drugs 46:618-638. 133 33. Davies, A., Simmons, D.L., Hale, G., Harrison, R.A., Tighe, H., Lachmann, P.J., e Waldmann, H. 1989. CD59, an Ly-6 protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex of homologous cells. Journal of Experimental Medicine 170:637-654 . 34. Guthridge, J.M., Young, K., Gipson, M.G., Sarrias, M.R., Szakonyi, G., Chen, X.S., Malaspina, A., Donoghue, E., James, J.A., Lambris, J.D., et al. 2001. Epitope mapping using the X-ray crystallographic structure of complement receptor type 2 (RC2)/CD21: Identification of a highly inhibitory monoclonal antibody that directly recognizes the RC2-C3d interface. J Immunol 167:5758-5766. 35. 1995. PCR Primer. A laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 36. Guthridge, J.M., Rakstang, J.K., Young, K.A., Hinshelwood, J., Aslam, M., Robertson, A., Gipson, M.G., Sarrias, M.R., Moore, W.T., Meagher, M., et al. 2001. Structural studies in solution of the recombinant N-terminal pair of short consensus/complement repeat domains of complement receptor type 2 (RC2/CD21) and interactions with its ligand C3dg. Biochemistry 40:5931-5941. 37. Yu, J., Caragine, T., Chen, S., Morgan, B.P., Frey, A.F., e Tomlinson, S. 1999. Protection of human breast câncer cells from complement-mediated lysis by expression of heterologous CD59. Clin.Exp.Immunol. 115:13-18. 38. Duits, A.J., Jainandunsing, S.M., van de Winkel, J.G., e Capei, P.J. 1991. Selective enhancement of Leu-CAM expression by interleukin 6 during differentiation of human promonocytic U937 cells. Scand J Immunol 33:151-159. 39. Rothlein, R., e Springer, T.A. 1986. The requirement for lymphocyte function-associated antigen 1 in homotypic leukocyte adhesion stimulated by phorbol ester. J Exp Med 163:1132-1149. 134 40. Ross, G.D., Reed, W., Dalzell, J.G., Becker, S.E., e Hogg, N. 1992. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. J Leukoc Biol 51:109-117. 41. Sharkey, R.M., Motta-Hennessy, C., Pawlyk, D., Siegel, J.A., e Goldenberg, D.M. 1990. Biodistribution and dose estimates for yttrium and iodine labeled monoclonal antibody IgG and fragments in nude in nude mice bearing human colonic tumor xenografts. Câncer Res. 50:2330-2336. 42. Sharkey, R.M., Natale, A., Goldenberg, D.M., e Mattes, M.J. 1991. Rapid blood clearance of immunoglobulin G2a and immunoglobulin G2b in nude mice. Câncer Res 51:3102-3107. 43. Andrews, B.S., Eisenberg, R.A., Theofilopoulos, A.N., Izui, S., Wilson, C.B., McConahey, P.J., Murphy, E.D., Roths, J.B., e Dixon, F.J. 1978. Spontaneous murine lupus-like syndromes. Clinicai and immunopathological manifestations in several strains. J Exp Med 148:1198-1215. 44. Hebell, T., Ahearn, J.M., e Fearon, D.T. 1991. Suppression of the immune response by a soluble complement receptor of B lymphocytes. Science 254:102-105. 45. Aslam, M. , e Perkins, S.J. 2001. Folded-back solution structure of monomeric factor H of human complement by synchrotron X-ray and neutron scattering, analytical ultracentrifugation and constrained molecular modelling. J Mol Biol 309:1117-1138. 46. Koski, C.L., Rainm, L.E., Hainmer, C.H., Mayer, M.M., e Shin, M.L. 1983. Cytolysis of nucleated cells by complement: cell death displays multi-hit characteristics. Proc Natl Acad Sei EUA 80:3816-3820. 47. Ramm, L.E., Whitlow, M.B., e Mayer, M.M. 1982. Transmembrane channel formation by complement: functional analysis of the number of C5b6, C7, C8, and C9 molecules required for a single channel. Proc Natl Acad Sei EUA 79:4751-4755. 135 48. Takeda, J., Kozono, H., Takata, Y., Hong, K., Kinoshita, T., Sayama, K., Tanaka, E., e Inoue, K. 1986. Number of hits necessary for complement-mediated hemolysis. Microbiol Immunol 30:461-468. 49. Mendrick, D.L., e H.G. Rennke. 1988. Induction of proteinuria in the rat by a monoclonal antibody against SGP-115/107. Kidney Int 33:818-830. 50. Mendrick, D.L., H.G. Rennke, R.S. Cotran, T.A. Springer, e A.K. Abbas. 1983. Monoclonal antibodies against rat glomerular antigens: production and specificity. Laboratory Investigation 49:107-117. 51. Hsu, S.I., e W.G. Couser. 2003. Chronic progression of tubulointerstitial damage in proteinuric renal disease is mediated by complement activation: a therapeutic role for complement inhibitors? J Am Soc Nephrol 14:S186-191. 52. Sheerin, N.S., e S.H. Sacks. 2002. Leaked protein and interstitial damage in the kidney: is complement the missing link? Clin Exp Immunol 130:1-3. 5. Hori, Y., K. Yamada, N. Hanafusa, T. Okuda, N. Okada, T. Miyata, W.G. Couser, K. Kurokawa, T. Fujita, e M. Nangaku. 1999. Crry, a complement regulatory protein, modulates renal interstitial disease induced by proteinuria. Kidney Int 56:2096-2106. 54. Song, H., C. He, C. Knaak, J.M. Guthridge, V.M. Holers, e S. Tomlinson. 2003. Complement receptor 2-mediated targeting of complement inhibitors to sites of complement activation. J Clin Invest 111:1875-1885. H. Sequências

1. FAD

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 1 Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 2 136 2. CD59

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 3

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 4

3. RC2-FAD

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 5

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 6 4. RC2-CD59 humana

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 7

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 8 5. FAD-RC2

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 9

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 10 6. CD59 humana-RC2

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 11

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 12 7. RC1

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 13

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 14

8. PCM

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 15

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 16 9. Ycrr de camundongo

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 17 10. IgGl Fc humano 18

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 137 11. IgM Fc humano

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 19 12. RC2-IgGl Fc humano

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 20

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 21 13. IgG3 Fc de camundongo

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 22 14. Fator de veneno de cobra

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 23

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 24 15. RC2 humano

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 25

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 26 16. RC2 de camundongo

Sequência de Nucleótidos corresponde a SEQ ID NO: 27

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 28 17. RC2 humano

Sequência de Aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 29 138

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Fundação MUSC Para Pesquisa de Desenvolvimento <120> Recetor do Complemento 2 Direcionado Moduladores do Complemento <130> 19113.0095P1 <150> 60/426,676 <151> 2002-11-15 <160> 29 <170> FastSEQ para Versão do Windows 4.0

<210> 1 <211> 1041 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <4 0 0> 1 139 gactgtggcc ttcccccaga tgtacctaat tttcccgagg atactgtaat aacgtacaaa gagaaggact cagtgatctg ccttaagggc aatcgtagct gcgaggtgcc aacaaggcta actcagaatt attttccagt cggtactgtt agagaacctt ctctatcacc aaaactaact gtcgaatttt gtaaaaagaa atcatgccct gatgtaccag gtggcatatt atttggtgca aaattatttg gctcgacttc tagtttttgt gacccgttgc cagagtgcag agaaatttat ataattcaag gggaacgtga ccattatgga aaaggattca ccatgattgg agagcactct gagtggagtg gcccaccacc tgaatgcaga acagttcaga aacctaccac agtaaatgtt aaaaccacca caaaaaccac cacaccaaat aggacaacca agcattttca tgaaacaacc actacccgtc ttctatctgg gcacacgtgt gtaaccatgg gcttgctgac t

<210> 2 <211> 380 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequênci sintética gcccagccag ctttggaagg ccgtacaagt 60 tgtgaagaaa gctttgtgaa aattcctggc 120 agtcaatggt cagatattga agagttctgc 180 aattctgcat ccctcaaaca gccttatatc 240 gtggaatatg agtgccgtcc aggttacaga 300 tgccttcaga atttaaaatg gtccacagca 360 aatccgggag aaatacgaaa tggtcagatt 420 accatctcct tctcatgtaa cacagggtac 480 cttatttcag gcagctctgt ccagtggagt 540 tgtccagcac caccacaaat tgacaatgga 600 tatagacagt ctgtaacgta tgcatgtaat 660 atttattgta ctgtgaataa tgatgaagga 720 ggaaaatctc taacttccaa ggtcccacca 780 ccaactacag aagtctcacc aacttctcag 840 gctcaagcaa cacggagtac acctgtttcc 900 ccaaataaag gaagtggaac cacttcaggt 960 fctcacgt.tga c.aggtttgct tgggacgcta 1020 1041

Artificial:/nota = construção <400> 2

Met Thr Vai Ala Arg Pro Ser Vai Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly 15 10 15

Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Vai Leu Leu Cys Leu Pro Ala Vai 20 25 30 140

Trp Asp Cys 35 Gly Leu Pro Pro Asp 40 Glu Gly 50 Arg Thr Ser Phe Pro 55 Glu Glu Glu 65 Ser Phe Vai Lys 70 Ile Pro Leu Lys Gly Ser Gin 85 Trp Ser Asp Cys Glu Vai Pro 100 Thr Arg Leu Asn Ile Thr Gin 115 Asn Tyr Phe Pro Vai 12 0 Arg Pro 130 Gly Tyr Arg Arg Glu 135 Pro Leu Gin 145 Asn Leu Lys Trp 150 Ser Thr Ser Cys Pro Asn Pro 165 Gly Glu Ile Gly Gly Ile Leu 180 Phe Gly Ala Thr Tyr Lys Leu 195 Phe Gly Ser Thr Ser 200 Ser Vai 210 Gin Trp Ser Asp Pro 215 Leu Pro Ala 225 Pro Pro Gin Ile 230 Asp Asn His Tyr Gly Tyr Arg 245 Gin Ser Vai Thr Met Ile Gly 260 Glu His Ser Ile Gly Glu Trp 275 Ser Gly Pro Pro Pro 280 Ser Lys 290 Vai Pro Pro Thr Vai 295 Gin Thr Thr 305 Glu Vai Ser Pro 310 Thr Ser Thr Pro Asn Ala Gin 325 Ala Thr Arg Lys His Phe His 340 Glu Thr Thr Pro Gly Thr Thr 355 Arg Leu Leu Ser Gly 360 Leu Leu 370 Gly Thr Leu Vai Thr 375 Met

Vai Pro Asn Ala Gin 45 Pro Ala Leu Asp Thr Vai Ile 60 Thr Tyr Lys Cys Gly Glu Lys 75 Asp Ser Vai Ile Cys 80 Ile Glu 90 Glu Phe Cys Asn Arg 95 Ser Ser 105 Ala Ser Leu Lys Gin 110 Pro Tyr Gly Thr Vai Vai Glu 125 Tyr Glu Cys Ser Leu Ser Pro 140 Lys Leu Thr Cys Ala Vai Glu 155 Phe Cys Lys Lys Lys 160 Arg Asn 170 Gly Gin Ile Asp Vai 175 Pro Ile 185 Ser Phe Ser Cys Asn 190 Thr Gly Ser Phe Cys Leu Ile 205 Ser Gly Ser Pro Glu Cys Arg 220 Glu Ile Tyr Cys Gly Ile Ile 235 Gin Gly Glu Arg Asp 240 Thr Tyr 250 Ala Cys Asn Lys Gly Phe 255 Tyr 265 Cys Thr Vai Asn Asn 270 Asp Glu Glu Cys Arg Gly Lys 285 Ser Leu Thr Lys Pro Thr Thr 300 Vai Asn Vai Pro Gin Lys Thr 315 Thr Thr Lys Thr Thr 320 Ser Thr 330 Pro Vai Ser Arg Thr 335 Thr Asn 345 Lys Gly Ser Gly Thr 350 Thr Ser His Gly Thr Leu Cys Leu Phe Thr 380 Thr 365 Leu Thr Gly

<210> 3 <211> 306 <212> ADN <213> Sequência Artificial 141 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 3 cagtgctaca gattttgatg tttgagcatt tactgctgca ttatcagaga actgtcctaa cccaactgct gactgcaaaa cagccgtcaa ttgttcatct 60 cgtgtctcat taccaaagct gggttacaag tgtataacaa gtgttggaag 120 gcaatttcaa cgacgtcaca acccgcttga gggaaaatga gctaacgtac 180 agaaggacct gtgtaacttt aacgaacagc ttgaaaatgg tgggacatcc 240 aaacagttct tctgctggtg actccatttc tggcagcagc ctggagcctt 300 306 catccc

<210> 4 <211> 126 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 4

Met Gly ile Gin Gly Gly Ser Vai Leu Phe Gly Leu Leu Leu Vai Leu 1 5 10 15 Ala Vai Phe Cys His Ser Gly His Gin Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro 20 25 30 Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala Vai Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala 35 40 45 Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly Leu Gin Vai Tyr Asn Lys Cys Trp Lys 50 55 60 Phe Glu His Cys Asn Phe Asn Asp Vai Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn 65 70 75 80 Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu 85 90 95 Gin Leu Glu Asn Gly Gly Thr Ser Leu Ser Glu Lys Thr Vai Leu Leu 100 105 110 Leu Vai Thr Pro Phe Leu Ala Ala Ala Trp Ser Leu His Pro 115 120 125 <210> 5 <211> 1485 142

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 5 atttcttgtg gctctcctcc gcctatccta aatggccgga ttagttatta ttctaccccc 60 attgctgttg gtaccgtgat aaggtacagt tgttcaggta ccttccgcct cattggagaa 120 aaaagtctat tatgcataac taaagacaaa gtggatggaa cctgggataa acctgctcct 180 aaatgtgaat atttcaataa atattcttct tgccctgagc ccatagtacc aggaggatac 240 aaaattagag gctctacacc ctacagacat ggtgattctg tgacatttgc ctgtaaaacc 300 aacttctcca tgaacggaaa caagtctgtt tggtgtcaag caaataatat gtgggggccg 360 acacgactac caacctgtgt aagtgttttc cctctcgagt gtccagcact tcctatgatc 420 cacaatggac atcacacaag tgagaatgtt ggctccattg ctccaggatt gtctgtgact 480 tacagctgtg aatctggtta cttgcttgtt ggagaaaaga tcattaactg tttgtcttcg 540 ggaaaatgga gtgctgtccc ccccacatgt gaagaggcac gctgtaaatc tctaggacga 600 tttcccaatg ggaaggtaaa ggagcctcca attctccggg ttggtgtaac tgcaaacttt 660 ttctgtgatg aagggtatcg actgcaaggc ccaccttcta gtcggtgtgt aattgctgga 720 cagggagttg cttggaccaa aatgccagta tgtggaggtg ggtcgggtgg cggcggatcc 780 gactgtggcc ttcccccaga tgtacctaat gcccagccag ctttggaagg ccgtacaagt 840 tttcccgagg atactgtaat aacgtacaaa tgtgaagaaa gctttgtgaa aattcctggc 900 gagaaggact cagtgatctg ccttaagggc agtcaatggt cagatattga agagttctgc 960 aatcgtagct gcgaggtgcc aacaaggcta aattctgcat ccctcaaaca gccttatatc 1020 actcagaatt attttccagt cggtactgtt gtggaatatg agtgccgtcc aggttacaga 1080 agagaacctt ctctatcacc aaaactaact tgccttcaga atttaaaatg gtccacagca 1140 gtcgaatttt gtaaaaagaa atcatgccct aatccgggag aaatacgaaa tggtcagatt 1200 gatgtaccag gtggcatatt atttggtgca accatctcct tctcatgtaa cacagggtac 1260 aaattatttg gctcgacttc tagtttttgt cttatttcag gcagctctgt ccagtggagt 1320 gacccgttgc cagagtgcag agaaatttat tgtccagcac caccacaaat tgacaatgga 1380 ataattcaag gggaacgtga ccattatgga tatagacagt ctgtaacgta tgcatgtaat 1440 aaaggattca ccatgattgg agagcactct atttattgta ctgtg 1485

<210> 6 <211> 495 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética 143 <4 Ο Ο> 6

Ile Ser Cys Gly Ser Pro Pro Pro Ile Leu Asn Gly Arg Ile Ser Tyr 1 5 10 15 Tyr Ser Thr Pro Ile Ala Vai Gly Thr Val Ile Arg Tyr Ser Cys Ser 20 25 30 Gly Thr Phe Arg Leu Ile- Gly Glu Lys Ser Leu Leu Cys Ile Thr Lys 35 • 40 45 Asp Lys Vai Asp Gly Thr Trp Asp Lys Pro Ala Pro Lys Cys Glu Tyr 50 55 60 Phe Asn Lys Tyr Ser Ser Cys Pro Glu Pro Ile Val Pro Gly Gly Tyr 65 70 75 80 Lys Ile Arg Gly Ser Thr Pro Tyr Arg His Gly Asp Ser Val Thr Phe 85 90 95 Ala Cys Lys Thr Asn Phe Ser Met Asn Gly Asn Lys Ser Val Trp Cys 100 105 110 Gin Ala Asn Asn Met Trp Gly Pro Thr Arg Leu Pro Thr Cys Val Ser 115 120 125 Vai Phe Pro Leu Glu Cys Pro Ala Leu Pro Met Ile His Asn Gly His 130 135 140 His Thr Ser Glu Asn Vai Gly Ser Ile Ala Pro Gly Leu Ser Val Thr 145 150 155 160 Tyr Ser Cys Glu Ser Gly Tyr Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile Ile Asn 165 170 175 Cys Leu Ser Ser Gly Lys Trp Ser Ala Val Pro Pro Thr Cys Glu Glu 180 185 190 Ala Arg Cys Lys Ser Leu Gly Arg Phe Pro Asn Gly Lys Val Lys Glu 195 200 205 Pro Pro Ile Leu Arg Vai Gly Val Thr Ala Asn Phe Phe Cys Asp Glu 210 215 220 Gly Tyr Arg Leu Gin Gly Pro Pro Ser Ser Arg Cys Val Ile Ala Gly 225 230 235 240 Gin Gly Vai Ala Trp Thr Lys Met Pro Val Cys Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gin 260 265 270 Pro Ala Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr 275 280 285 Tyr Lys Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser 290 295 300 Vai Ile Cys Leu Lys Gly Ser Gin Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys 305 310 315 320 Asn Arg Ser Cys Glu Vai Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys 325 330 335 Gin Pro Tyr Ile Thr Gin Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu 340 345 350 Tyr Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys 355 360 365 144

Leu Thr 370 Cys Leu Gin Asn Leu 375 Lys Lys 385 Lys Lys Ser cys Pro 390 Asn Pro Asp Vai Pro Gly Gly 405 Ile Leu Phe Asn Thr Gly Tyr 420 Lys Leu Phe Gly Ser Gly Ser 435 Ser Vai Gin Trp Ser 440 Ile Tyr 450 Cys Pro Ala Pro Pro 455 Gin Glu 465 Arg Asp His Tyr Gly 470 Tyr Arg Lys Gly Phe Thr Met 485 Ile Gly Glu

Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys 380 Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gin Ile 395 400 Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys 410 415 Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile 425 430 Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu 445 Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gin Gly 460 Gin Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn 475 480 His Ser Ile Tyr Cys Thr Val 490 495 <210> 7 <211> 1002 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência sintética <400> 7

Artificial:/nota = construção atttcttgtg gctctcctcc gcctatccta aatggccgga ttagttatta ttctaccccc 60 attgctgttg gtaccgtgat aaggtacagt tgttcaggta ccttccgcct cattggagaa 120 aaaagtctat tatgcataac taaagacaaa gtggatggaa cctgggataa acctgctcct 180 aaatgtgaat atttcaataa atattcttct tgccctgagc ccatagtacc aggaggatac 240 aaaattagag gctctacacc ctacagacat ggtgattctg tgacatttgc ctgtaaaacc 300 aacttctcca tgaacggaaa caagtctgtt tggtgtcaag caaataatat gtgggggccg 360 acacgactac caacctgtgt aagtgttttc cctctcgagt gtccagcact tcctatgatc 420 cacaatggac atcacacaag tgagaatgtt ggctccattg ctccaggatt gtctgtgact 480 tacagctgtg aatctggtta cttgcttgtt ggagaaaaga tcattaactg tttgtcttcg 540 ggaaaatgga gtgctgtccc ccccacatgt gaagaggcac gctgtaaatc tctaggacga 600 tttcccaatg ggaaggtaaa ggagcctcca attctccggg ttggtgtaac tgcaaacttt 660 ttctgtgatg aagggtatcg actgcaaggc ccaccttcta gtcggtgtgt aattgctgga 720 cagggagttg cttggaccaa aatgccagta tgttcaggag gaggaggttc cctgcagtgc 780 tacaactgtc ctaacccaac tgctgactgc aaaacagccg tcaattgttc atctgatttt 840 gatgcgtgtc tcattaccaa agctgggtta caagtgtata acaagtgttg gaagtttgag 900 cattgcaatt tcaacgacgt cacaacccgc ttgagggaaa atgagctaac gtactactgc 960 tgcaagaagg acctgtgtaa ctttaacgaa cagcttgaaa at 1002 <210> 8 <211> 334 145

<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 8

Ile Ser Cys Gly Ser Pro Pro Pro Ile Leu Asn Gly Arg Ile Ser Tyr 15 10 15

Tyr Ser Thr Pro Ile Ala Vai Gly Thr Vai Ile Arg Tyr Ser Cys Ser 20 25 30 146

Gly Thr Phe Arg Leu Ile Gly Glu Lys Ser Leu Leu Cys Ile Thr Lys 35 40 45 Asp Lys Vai Asp Gly Thr Trp Asp Lys Pro Ala Pro Lys Cys Glu Tyr 50 55 60 Phe Asn Lys Tyr Ser Ser Cys Pro Glu Pro Ile Vai Pro Gly Gly Tyr 65 70 75 80 Lys Ile Arg Gly Ser Thr Pro Tyr Arg His Gly Asp Ser Vai Thr Phe 85 90 95 Ala Cys Lys Thr Asn Phe Ser Met Asn Gly Asn Lys Ser Vai Trp Cys 100 105 110 Gin Ala Asn Asn Met Trp Gly Pro Thr Arg Leu Pro Thr Cys Vai Ser 115 120 125 Vai Phe Pro Leu Glu Cys Pro Ala Leu Pro Met Ile His Asn Gly His 13 0 135 14 0 His Thr Ser Glu Asn Vai Gly Ser Ile Ala Pro Gly Leu Ser Vai Thr 145 150 155 160 Tyr Ser Cys Glu Ser Gly Tyr Leu Leu Vai Gly Glu Lys Ile Ile Asn 165 170 175 Cys Leu Ser Ser Gly Lys Trp Ser Ala Vai Pro Pro Thr Cys Glu Glu 180 185 190 Ala Arg Cys Lys Ser Leu Gly Arg Phe Pro Asn Gly Lys Vai Lys Glu 195 200 205 Pro Pro Ile Leu Arg Vai Gly Vai Thr Ala Asn Phe Phe Cys Asp Glu 210 215 220 Gly Tyr Arg Leu Gin Gly Pro Pro Ser Ser Arg Cys Vai Ile Ala Gly 225 230 235 240 Gin Gly Vai Ala Trp Thr Lys Met Pro Vai Cys Ser Gly Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Leu Gin Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr 260 265 270 Ala Vai Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala 275 280 285 Gly Leu Gin Vai Tyr Asn Lys Cys Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe 290 295 300 Asn Asp Vai Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys 305 310 315 320 Cys Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gin Leu Glu Asn 325 330

<210> 9 <211> 1554 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética 147 147 <4Ο0> 9 gactgtggcc tttcccgagg gagaaggact aatcgtagct actcagaatt agagaacctt gtcgaatttt gatgtaccag aaattatttg gacccgttgc ataattcaag aaaggattca gagtggagtg gggtcgggtg attagttatt accttccgcc acctgggata cccatagtac gtgacatttg gcaaataata tgtccagcac gctccaggat atcattaact cgctgtaaat gttggtgtaa agtcggtgtg ttcccccaga tgtacctaat gcccagccag ctttggaagg ccgtacaagt 60 atactgtaat aacgtacaaa tgtgaagaaa gctttgtgaa aattcctggc 120 cagtgatctg ccttaagggc agtcaatggt cagatattga agagttctgc 180 gcgaggtgcc aacaaggcta aattctgcat ccctcaaaca gccttatatc 240 attttccagt cggtactgtt gtggaatatg agtgccgtcc aggttacaga 300 ctctatcacc aaaactaact tgccttcaga atttaaaatg gtccacagca 360 gtaaaaagaa atcatgccct aatccgggag aaatacgaaa tggtcagatt 420 gtggcatatt atttggtgca accatctcct tctcatgtaa cacagggtac 480 gctcgacttc tagtttttgt cttatttcag gcagctctgt ccagtggagt 540 cagagtgcag agaaatttat tgtccagcac caccacaaat tgacaatgga 600 gggaacgtga ccattatgga tatagacagt ctgtaacgta tgcatgtaat 660 ccatgattgg agagcactct atttattgta ctgtgaataa tgatgaagga 720 gccca.cca.cc tgaatgcaga tcctctggtg gcggtggctc gggcggaggt 780 gcggcggatc catttcttgt ggctctcctc cgcctatcct aaatggccgg 840 attctacccc cattgctgtt ggtaccgtga taaggtacag ttgttcaggt 900 tcattggaga aaaaagtcta ttatgcataa ctaaagacaa agtggatgga 960 aacctgctcc taaatgtgaa tatttcaata aatattcttc ttgccctgag 1020 caggaggata caaaattaga ggctctacac cctacagaca tggtgattct 1080 cctgtaaaac caacttctcc atgaacggaa acaagtctgt ttggtgtcaa 1140 tgtgggggcc gacacgacta ccaacctgtg taagtgtttt ccctctcgag 1200 ttcctatgat ccacaatgga catcacacaa gtgagaatgt tggctccatt 1260 tgtctgtgac ttacagctgt gaatctggtt acttgcttgt tggagaaaag 1320 gtttgtcttc gggaaaatgg agtgctgtcc cccccacatg tgaagaggca 1380 ctctaggacg atttcccaat gggaaggtaa aggagcctcc aattctccgg 1440 ctgcaaactt tttctgtgat gaagggtatc gactgcaagg cccaccttct 1500 taattgctgg acagggagtt gcttggacca aaatgccagt atgt 1554

<210> 10 <211> 518 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética 148 <400> 10

Asp 1 Cys Gly Leu Pro 5 Pro Asp Vai Gly Arg Thr Ser 20 Phe Pro Glu Asp Glu Ser Phe 35 Vai Lys Ile Pro Gly 40 Lys Gly 50 Ser Gin Trp Ser Asp 55 Ile Glu 65 Vai Pro Thr Arg Leu 70 Asn Ser Thr Gin Asn Tyr Phe 85 Pro Vai Gly Pro Gly Tyr Arg 100 Arg Glu P.ro Ser Gin Asn Leu 115 Lys Trp Ser Thr Ala 120 Cys Pro 130 Asn Pro Gly Glu Ile 135 Arg Gly 145 Ile Leu Phe Gly Ala 150 Thr Ile Lys Leu Phe Gly Ser 165 Thr Ser Ser Vai Gin Trp Ser 180 Asp Pro Leu Pro Ala Pro Pro 195 Gin Ile Asp Asn Gly 200 Tyr Gly 210 Tyr Arg Gin Ser Vai 215 Thr Met 225 Ile Gly Glu His Ser 230 Ile Tyr Glu Trp Ser Gly Pro 245 Pro Pro Glu Ser Gly Gly Gly 260 Gly Ser Gly Gly

Pro Asn 10 Ala Gin Pro Ala Leu 15 Glu Thr 25 Vai Ile Thr Tyr Lys 30 Cys Glu Glu Lys. Asp Ser Vai 45 Ile Cys Leu Glu Glu Phe Cys 60 Asn Arg Ser Cys Ala Ser Leu 75 Lys Gin Pro Tyr Ile 80 Thr Vai 90 Vai Glu Tyr Glu Cys 95 Arg Leu 105 Ser Pro Lys Leu Thr 110 Cys Leu Vai Glu Phe Cys Lys 125 Lys Lys Ser Asn Gly Gin Ile 140 Asp Vai Pro Gly Ser Phe Ser 155 Cys Asn Thr Gly Tyr 160 Phe Cys 170 Leu Ile Ser Gly Ser 175 Ser Glu 185 Cys Arg Glu Ile Tyr 190 Cys Pro Ile Ile Gin Gly Glu 205 Arg Asp His Tyr Ala Cys Asn 220 Lys Gly Phe Thr Cys Thr Vai 235 Asn Asn Asp Glu Gly 240 Cys Arg 250 Ser Ser Gly Gly Gly 255 Gly Gly 265 Gly Ser Ile Ser Cys 270 Gly Ser 149

Pro Pro Pro Ile Leu Asn Gly Arg Ile 275 280 Ala Vai Gly Thr Vai Ile Arg Tyr Ser 290 295 Ile Gly Glu Lys Ser Leu Leu Cys Ile 305 310 Thr Trp Asp Lys Pro Ala Pro Lys Cys 325 Ser Cys Pro Glu Pro Ile Vai Pro Gly 340 345 Thr Pro Tyr Arg His Gly Asp Ser Vai 355 360 Phe Ser Met Asn Gly Asn Lys Ser Vai 370 375 Trp Gly Pro Thr Arg Leu Pro Thr Cys 385 390 Cys Pro Ala Leu Pro Met Ile His Asn 405 Vai Gly Ser Ile Ala Pro Gly Leu Ser 420 425 Gly Tyr Leu Leu Vai Gly Glu Lys Ile 435 440 Lys Trp Ser Ala Vai Pro Pro Thr Cys 450 455 Leu Gly Arg Phe Pro Asn Gly Lys Vai 465 470 Vai Gly Vai Thr Ala Asn Phe Phe Cys 485 Gly Pro Pro Ser Ser Arg Cys Vai Ile 500 505 Thr Lys Met Pro Vai Cys 515

<210> 11 <211> 990 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência sintética <400> 11

Ser Tyr Tyr Ser 285 Thr Pro Ile Cys Ser Gly 300 Thr Phe Arg Leu Thr Lys 315 Asp Lys Vai Asp Gly 320 Glu Tyr 330 Phe Asn Lys Tyr 335 Ser Gly Tyr Lys Ile Arg 350 Gly Ser Thr Phe Ala Cys 365 Lys Thr Asn Trp Cys Gin 380 Ala Asn Asn Met Vai Ser 395 Vai Phe Pro Leu Glu 400 Gly His 410 His Thr Ser Glu 415 Asn Vai Thr Tyr Ser Cys 430 Glu Ser Ile Asn Cys Leu 445 Ser Ser Gly Glu Glu Ala 460 Arg Cys Lys Ser Lys Glu 475 Pro Pro Ile Leu Arg 480 Asp Glu 490 Gly Tyr Arg Leu 495 Gin Ala Gly Gin Gly Vai 510 Ala Trp

Artificial:/nota = construção 150 ctgcagtgct tctgattttg aagtttgagc tactactgct ggcggtggct ccgcctatcc ataaggtaca actaaagaca aaatattctt ccctacagac aacaagtctg gtaagtgttt agtgagaatg tacttgcttg ccccccacat aaggagcctc cgactgcaag acaactgtcc atgcgtgtct attgcaattt gcaagaagga ccggcggagg taaatggccg gttgttcagg aagtggatgg cttgccctga atggtgattc tttggtgtca tccctctcga ttggctccat ttggagaaaa gtgaagaggc caattctccg gcccaccttc taacccaact cattaccaaa caacgacgtc cctgtgtaac tgggtccggt gattagttat taccttccgc aacctgggat gcccatagta tgtgacattt agcaaataat gtgtccagca tgctccagga gatcattaac acgctgtaaa ggttggtgta tagtcggtgt gctgactgca gctgggttac acaacccgct tttaacgaac ggcggcggat tattctaccc ctcattggag aaacctgctc ccaggaggat gcctgtaaaa atgtgggggc cttcctatga ttgtctgtga tgtttgtctt tctctaggac actgcaaact aaacagccgt aagtgtataa tgagggaaaa agcttgaaaa ccatttcttg ccattgctgt aaaaaagtct ctaaatgtga acaaaattag ccaacttctc cgacacgact tccacaatgg cttacagctg cgggaaaatg gatttcccaa ttttctgtga caattgttca 60 caagtgttgg 120 tgagctaacg 180 ttcctctggt 240 tggctctcct 300 tggtaccgtg 360 attatgcata 420 atatttcaat 480 aggctetaca 540 catgaacgga 600 accaacctgt 660 acatcacaca 720 tgaatctggt 780 gagtgctgtc 840 tgggaaggta 900 tgaagggtat 960 990 <210> 12 <211> 330 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência sintética

Artificial:/nota = construção <4 0 0> 12 151

Leu Gin Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala 1 5 10 15 Vai Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly 20 25 30 Leu Gin Vai Tyr Asn Lys Cys Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn 35 40 45 Asp Vai Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys 50 55 60 Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gin Leu Glu Asn Ser Ser Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Ser 85 90 95 Cys Gly Ser Pro Pro Pro Ile Leu Asn Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Ser 100 105 110 Thr Pro Ile Ala Vai Gly Thr Vai Ile Arg Tyr Ser Cys Ser Gly Thr 115 120 125 Phe Arg Leu Ile Gly Glu Lys Ser Leu Leu Cys Ile Thr Lys Asp Lys 130 135 140 Vai Asp Gly Thr Trp Asp Lys Pro Ala Pro Lys Cys Glu Tyr Phe Asn 145 150 155 160 Lys Tyr Ser Ser Cys Pro Glu Pro Ile Vai Pro Gly Gly Tyr Lys Ile 165 170 175 Arg Gly Ser Thr Pro Tyr Arg His Gly Asp Ser Vai Thr Phe Ala Cys 180 185 190 Lys Thr Asn Phe Ser Met Asn Gly Asn Lys Ser Vai Trp Cys Gin Ala 195 200 205 Asn Asn Met Trp Gly Pro Thr Arg Leu Pro Thr Cys Vai Ser Vai Phe 210 215 220 Pro Leu Glu Cys Pro Ala Leu Pro Met Ile His Asn Gly His His Thr 225 230 235 240 Ser Glu Asn Vai Gly Ser Ile Ala Pro Gly Leu Ser Vai Thr Tyr Ser 245 250 255 Cys Glu Ser Gly Tyr Leu Leu Vai Gly Glu Lys Ile Ile Asn Cys Leu 260 265 270 Ser Ser Gly Lys Trp Ser Ala Vai Pro Pro Thr Cys Glu Glu Ala Arg 275 280 285 Cys Lys Ser Leu Gly Arg Phe Pro Asn Gly Lys Vai Lys Glu Pro Pro 290 295 300 Ile Leu Arg Vai Gly Vai Thr Ala Asn Phe Phe Cys Asp Glu Gly Tyr 305 310 315 320 Arg Leu Gin Gly Pro Pro Ser Ser Arg Cys 325 330

<210> 13 <211> 5994 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética 152 <400> 13 caatgcaatg ccccagaatg gcttccattt gccaggccta ccaacctaac tgatgagttt 60 gagtttccca ttgggacata tctgaactat gaatgccgcc ctggttattc cggaagaccg 120 ttttctatca tctgcctaaa aaactcagtc tggactggtg ctaaggacag gtgcagacgt 180 aaatcatgtc gtaatcctcc agatcctgtg aatggcatgg tgcatgtgat caaaggcatc 240 cagttcggat cccaaattaa atattcttgt actaaaggat accgactcat tggttcctcg 300 tctgccacat gcatcatctc aggtgatact gtcatttggg ataatgaaac acctatttgt 360 gacagaattc cttgtgggct accccccacc atcaccaatg gagatttcat tagcaccaac 420 agagagaatt ttcactatgg atcagtggtg acctaccgct gcaatcctgg aagcggaggg 480 agaaaggtgt ttgagcttgt gggtgagccc tccatatact gcaccagcaa tgacgatcaa 540 gtgggcatct ggagcggccc cgcccctcag tgcattatac ctaacaaatg cacgcctcca 600 aatgtggaaa atggaatatt ggtatctgac aacagaagct tattttcctt aaatgaagtt 660 gtggagttta ggtgtcagcc tggctttgtc atgaaaggac cccgccgtgt gaagtgccag 720 gccctgaaca aatgggagcc ggagctacca agctgctcca gggtatgtca gccacctcca 780 gatgtcctgc atgctgagcg tacccaaagg gacaaggaca acttttcacc tgggcaggaa 840 gtgttctaca gctgtgagcc cggctacgac ctcagagggg ctgcgtctat gcgctgcaca 900 ccccagggag actggagccc tgcagccccc acatgtgaag tgaaatcctg tgatgacttc 960 atgggccaac ttcttaatgg ccgtgtgcta tttccagtaa atctccagct tggagcaaaa 1020 gtggattttg tttgtgatga aggatttcaa ttaaaaggca gctctgctag ttactgtgtc 1080 ttggctggaa tggaaagcct ttggaatagc agtgttccag tgtgtgaaca aatcttttgt 1140 ccaagtcctc cagttattcc taatgggaga cacacaggaa aacctctgga agtctttccc 1200 tttggaaaag cagtaaatta cacatgcgac ccccacccag acagagggac gagcttcgac 1260 ctcattggag agagcaccat ccgctgcaca agtgaccctc aagggaatgg ggtttggagc 1320 agccctgccc ctcgctgtgg aattctgggt cactgtcaag ccccagatca ttttctgttt 1380 gccaagttga aaacccaaac caatgcatct gactttccca ttgggacatc tttaaagtac 1440 gaatgccgtc ctgagtacta cgggaggcca ttctctatca catgtctaga taacctggtc 1500 tggtcaagtc ccaaagatgt ctgtaaacgt aaatcatgta aaactcctcc agatccagtg 1560 aatggcatgg tgcatgtgat cacagacatc caggttggat ccagaatcaa ctattcttgt 1620 actacagggc accgactcat tggtcactca tctgctgaat gtatcctctc gggcaatgct 1680 gcccattgga gcacgaagcc gccaatttgt caacgaattc cttgtgggct accccccacc 1740 atcgccaatg gagatttcat tagcaccaac agagagaatt ttcactatgg atcagtggtg 1800 acctaccgct gcaatcctgg aagcggaggg agaaaggtgt ttgagcttgt gggtgagccc 1860 tccatatact gcaccagcaa tgacgatcaa gtgggcatct ggagcggccc ggcccctcag 1920 tgcattatac ctaacaaatg cacgcctcca aatgtggaaa atggaatatt ggtatctgac 1980 aacagaagct tattttcctt aaatgaagtt gtggagttta ggtgtcagcc tggctttgtc 2040· atgaaaggac cccgccgtgt gaagtgccag gccctgaaca aatgggagcc ggagctacca 2100 agctgctcca gggtatgtca gccacctcca gatgtcctgc atgctgagcg tacccaaagg 2160 gacaaggaca acttttcacc cgggcaggaa gtgttctaca gctgtgagcc cggctatgac 2220 ctcagagggg ctgcgtctat gcgctgcaca ccccagggag actggagccc tgcagccccc 2280 acatgtgaag tgaaatcctg tgatgacttc atgggccaac ttcttaatgg ccgtgtgcta 2340 tttccagtaa atctccagct tggagcaaaa gtggattttg tttgtgatga aggatttcaa 2400 ttaaaaggca gctctgctag ttattgtgtc ttggctggaa tggaaagcct ttggaatagc 2460 agtgttccag tgtgtgaaca aatcttttgt ccaagtcctc cagttattcc taatgggaga 2520 cacacaggaa aacctctgga agtctttccc tttggaaaag cagtaaatta cacatgcgac 2580 ccccacccag acagagggac gagcttcgac ctcattggag agagcaccat ccgctgcaca 2640 agtgaccctc aagggaatgg ggtttggagc agccctgccc ctcgctgtgg aattctgggt 2700 cactgtcaag ccccagatca ttttctgttt gccaagttga aaacccaaac caatgcatct 2760 gactttccca ttgggacatc tttaaagtac gaatgccgtc ctgagtacta cgggaggcca 2820 ttctctatca catgtctaga taacctggtc tggtcaagtc ccaaagatgt ctgtaaacgt 2880 aaatcatgta aaactcctcc agatccagtg aatggcatgg tgcatgtgat cacagacatc 2940 caggttggat ccagaatcaa ctattcttgt actacagggc accgactcat tggtcactca 3000 tctgctgaat gtatcctctc aggcaatact gcccattgga gcacgaagcc gccaatttgt 3060 caacgaattc cttgtgggct acccccaacc atcgccaatg gagatttcat tagcaccaac 3120 agagagaatt ttcactatgg atcagtggtg acctaccgct gcaatcttgg aagcagaggg 3180 agaaaggtgt ttgagcttgt gggtgagccc tccatatact gcaccagcaa tgacgatcaa 3240 gtgggcatct ggagcggccc cgcccctcag tgcattatac ctaacaaatg cacgcctcca 3300 aatgtggaaa atggaatatt ggtatctgac aacagaagct tattttcctt aaatgaagtt 3360 153 gtggagttta ggtgtcagcc tggctttgtc atgaaaggac cccgccgtgt gaagtgccag 3420 gccctgaaca aatgggagcc agagttacca agctgctcca gggtgtgtca gccgcctcca 3480 gaaatcctgc atggtgagca taccccaagc catcaggaca acttttcacc tgggcaggaa 3540 gtgttctaca gctgtgagcc tggctatgac ctcagagggg ctgcgtctct gcactgcaca 3600 ccccagggag actggagccc tgaagccccg agatgtgcag tgaaatcctg tgatgacttc 3660 ttgggtcaac tccctcatgg ccgtgtgcta tttccactta atctccagct tggggcaaag 3720 gtgtcctttg tctgtgatga agggtttcgc ttaaagggca gttccgttag tcattgtgtc 3780 ttggttggaa tgagaagcct ttggaataac agtgttcctg tgtgtgaaca tatcttttgt 3840 ccaaatcctc cagctatcct taatgggaga cacacaggaa ctccctctgg agatattccc 3900 tatggaaaag aaatatctta cacatgtgac ccccacccag acagagggat gaccttcaac 3960 ctcattgggg agagcaccat ccgctgcaca agtgaccctc atgggaatgg ggtttggagc 4020 agccctgccc ctcgctgtga actttctgtt cgtgctggtc actgtaaaac cccagagcag 4080 tttccatttg ccagtcctac gatcccaatt aatgactttg agtttccagt cgggacatct 4140 ttgaattatg aatgccgtcc tgggtatttt gggaaaatgt tctctatctc ctgcctagaa 4200 aacttggtct ggtcaagtgt tgaagacaac tgtagaogaa aatcatgtgg acctccacca 4260 gaacccttca atggaatggt gcatataaac acagatacac agtttggatc aacagttaat 4320 tattcttgta atgaagggtt tcgactcatt ggttccccat ctactacttg tctcgtctca 4380 ggcaataatg tcacatggga taagaaggca cctatttgtg agatcatatc ttgtgagcca 4440 cctccaacca tatccaatgg agacttctac agcaacaata gaacatcttt tcacaatgga 4500 aeggtggtaa cttaccagtg ccacactgga ccagatggag aacagctgtt tgagcttgtg 4560 ggagaacggt caatatattg caccagcaaa gatgatcaag ttggtgtttg gagcagccct 4620' ccccctcggt gtatttctac taataaatgc acagctccag aagttgaaaa tgcaattaga 4680 gtaccaggaa acaggagttt cttttccctc actgagatca tcagatttag atgtcagccc 4740 gggtttgtca tggtagggtc ccacactgtg cagtgccaga ccaatggcag atgggggccc 4800 aagctgccac actgctccag ggtgtgtcag ccgcctccag aaatcctgca tggtgagcat 4860 accctaagcc atcaggacaa cttttcacct gggcaggaag tgttctacag ctgtgagccc 4920 agctatgacc tcagaggggc tgcgtctctg cactgcacgc cccagggaga ctggagccct 4980 gaagccccta gatgtacagt gaaatcctgt gatgacttcc tgggccaact ccctcatggc 5040 cgtgtgctac ttccacttaa tctccagctt ggggcaaagg tgtcctttgt ttgcgatgaa 5100 gggttccgat taaaaggcag gtctgctagt cattgtgtct tggctggaat gaaagccctt 5160 tggaatagca gtgttccagt gtgtgaacaa atcttttgtc caaatcctcc agctatcctt 5220 aatgggagac acacaggaac tccctttgga gatattccct atggaaaaga aatatcttac 5280 gcatgcgaca cccacccaga cagagggatg accttcaacc tcattgggga gagctccatc 5340 cgctgcacaa gtgaccctca agggaatggg gtttggagca gccctgcccc tcgctgtgaa 5400 ctttctgttc ctgctgcctg cccacatcca cccaagatcc aaaacgggca ttacattgga 5460 ggacacgtat ctctatatct tcctgggatg acaatcagct acacttgtga ccccggctac 5520 ctgttagtgg gaaagggctt cattttctgt acagaccagg gaatctggag ccaattggat 5580 cattattgca aagaagtaaa ttgtagcttc ccactgttta tgaatggaat ctcgaaggag 5640 ttagaaatga aaaaagtata tcactatgga gattatgtga ctttgaagtg tgaagatggg 5700 tatactctgg aaggcagtcc ctggagccag tgccaggcgg atgacagatg ggaccctcct 5760 ctggccaaat gtacctctcg tgcacatgat gctctcatag ttggcacttt atctggtacg 5820 atcttcttta ttttactcat cattttcctc tcttggataa ttctaaagca cagaaaaggc 5880 aataatgcac atgaaaaccc taaagaagtg gctatccatt tacattctca aggaggcagc 5940 agcgttcatc cccgaactct gcaaacaaat gaagaaaata gcagggtcct tcct 5994

<210> 14 <211> 2048 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética 154 <4 Ο 0> 14

Met Cys Leu Gly Arg Met Gly Ala Ser Ser Pro Arg Ser Pro Glu Pro 15 10 15

Vai Gly Pro Pro Ala Pro Gly Leu Pro Phe Cys Cys Gly Gly Ser Leu 20 25 30 155

Leu Ala Vai Vai Vai Leu Leu Ala Leu Pro Vai Ala Trp Gly Gin Cys 35 40 45 Asn Ala Gin Cys Asn Ala Pro Glu Trp Leu Pro Phe Ala Arg Pro Thr 50 55 60 Asn Leu Thr Asp Glu Phe Glu Phe Pro Ile Gly Thr Tyr Leu Asn Tyr 65 70 75 80 Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Ser Gly Arg Pro Phe Ser ile Ile Cys Leu 85 90 95 Lys Asn Ser Vai Trp Thr Gly Ala Lys Asp Arg Cys Arg Arg Lys Ser 100 105 110 Cys Arg Asn Pro Pro Asp Pro Vai Asn Gly Met Vai His Vai Ile Lys 115 120 125 Gly Ile Gin Phe Gly Ser Gin Ile Lys Tyr Ser Cys Thr Lys Gly Tyr 130 135 140 Arg Leu Ile Gly Ser Ser Ser Ala Thr Cys Ile Ile Ser Gly Asp Thr 145 150 155 160 Vai Ile Trp Asp Asn Glu Thr Pro Ile Cys Asp Arg Ile Pro Cys Gly 165 170 175 Leu Pro Pro Thr Ile Thr Asn Gly Asp Phe Ile Ser Thr Asn Arg Glu 180 185 190 Asn Phe His Tyr Gly Ser Vai Vai Thr Tyr Arg Cys Asn Pro Gly Ser 195 200 205 Gly Gly Arg Lys Vai Phe Glu Leu vai Gly Glu Pro ser Ile Tyr Cys 210 215 220 Thr Ser Asn Asp Asp Gin Vai Gly Ile Trp Ser Gly Pro Ala Pro Gin 225 230 235 240 Cys Ile Ile Pro Asn Lys Cys Thr Pro Pro Asn Vai Glu Asn Gly Ile 245 250 255 Leu Vai Ser Asp Asn Arg Ser Leu Phe Ser Leu Asn Glu Vai Vai Glu 260 265 270 Phe Arg Cys Gin Pro Gly Phe Vai Met Lys Gly Pro Arg Arg Vai Lys 275 280 285 Cys Gin Ala Leu Asn Lys Trp Glu Pro Glu Leu Pro Ser Cys Ser Arg 290 295 300 Vai Cys Gin Pro Pro Pro Asp Vai Leu His Ala Glu Arg Thr Gin Arg 305 310 315 320 Asp Lys Asp Asn Phe Ser Pro Gly Gin Glu Vai Phe Tyr Ser Cys Glu 325 330 335 Pro Gly Tyr Asp Leu Arg Gly Ala Ala Ser Met Arg Cys Thr Pro Gin 340 345 350 Gly Asp Trp Ser Pro Ala Ala Pro Thr Cys Glu Vai Lys Ser Cys Asp 355 360 365 Asp Phe Met Gly Gin Leu Leu Asn Gly Arg Vai Leu Phe Pro Vai Asn 370 375 380 Leu Gin Leu Gly Ala Lys Vai Asp Phe Vai Cys Asp Glu Gly Phe Gin 385 390 395 400 Leu Lys Gly Ser Ser Ala Ser Tyr Cys Vai Leu Ala Gly Met Glu Ser 405 410 415 Leu Trp Asn Ser Ser Vai Pro Vai Cys Glu Gin Ile Phe Cys Pro Ser 420 425 430 Pro Pro Vai Ile Pro Asn Gly Arg His Thr Gly Lys Pro Leu Glu Vai 435 440 445 Phe Pro Phe Gly Lys Ala Vai Asn Tyr Thr Cys Asp Pro His Pro Asp 450 455 460 Arg Gly Thr Ser Phe Asp Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Arg Cys Thr 465 470 475 480 Ser Asp Pro Gin Gly Asn Gly Vai Trp Ser Ser Pro Ala Pro Arg Cys 485 490 495 Gly Ile Leu Gly His Cys Gin Ala Pro Asp His Phe Leu Phe Ala Lys 500 505 510 156

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Asn Leu Gly Ser Arg Gly Arg Lys Vai Phe Glu Leu Vai Gly Glu Pro 1105 1110 1115 1120

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Pro Ala Pro Gin Cys Ile Ile Pro Asn Lys Cys Thr Pro Pro Asn Vai 1140 1145 1150

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Glu Vai Vai Glu Phe Arg Cys Gin Pro Gly Phe Vai Met Lys Gly Pro 1170 1175 1180

Arg Arg Vai Lys Cys Gin Ala Leu Asn Lys Trp Glu Pro Glu Leu Pro 1185 1190 1195 1200

Ser Cys Ser Arg Vàl Cys Gin Pro Pro Pro Glu Ile Leu His Gly Glu 1205 1210 1215

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Lys Ser Cys Asp Asp Phe Leu Gly Gin Leu Pro His Gly Arg Vai Leu 1265 1270 1275 1280

Phe Pro Leu Asn Leu Gin Leu Gly Ala Lys Vai Ser Phe Vai Cys Asp 1285 1290 1295

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Gly Met Arg Ser Leu Trp Asn Asn Ser Vai Pro Vai Cys Glu His Ile 1315 1320 1325

Phe Cys Pro Asn Pro Pro Ala Ile Leu Asn ,Gly Arg His Thr Gly Thr 1330 1335 1340

Pro Ser Gly Asp Ile Pro Tyr Gly Lys Glu Ile Ser Tyr Thr Cys Asp 1345 1350 1355 1360

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Ala Pro Arg Cys Glu Leu Ser Vai Arg Ala Gly His Cys Lys Thr Pro 1395 1400 1405

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Phe Pro Vai Gly Thr Ser Leu Asn Tyr Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Phe 1425 1430 1435 1440

Gly Lys Met Phe Ser Ile Ser Cys Leu Glu Asn Leu Vai Trp Ser Ser 1445 1450 1455

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Phe Asn Gly Met Vai His Ile Asn Thr Asp Thr Gin Phe Gly Ser Thr 1475 1480 1485

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Pro Ile Cys Glu Ile Ile Ser Cys Glu Pro Pro Pro Thr Ile Ser Asn 1525 1530 1535

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Gly Vai Trp Ser Ser Pro Pro Pro Arg Cys Ile Ser Thr Asn Lys Cys 1585 1590 1595 1600

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Gly Pro Lys Leu Pro His Cys Ser Arg Vai Cys Gin Pro Pro Pro Glu 1650 1655 1660

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Ala Ala Ser Leu His Cys Thr Pro Gin Gly Asp Trp Ser Pro Glu Ala 1700 1705 1710

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His Gly Arg Vai Leu Leu Pro Leu Asn Leu Gin Leu Gly Ala Lys Vai 1730 1735 1740

Ser Phe Vai Cys Asp Glu Gly Phe Arg Leu Lys Gly Arg Ser Ala Ser 1745 1750 1755 1760

His Cys Vai Leu Ala Gly Met Lys Ala Leu Trp Asn Ser Ser Vai Pro 1765 ' 1770 1775

Vai Cys Glu Gin Ile Phe Cys Pro Asn Pro Pro Ala Ile Leu Asn Gly 1780 1785 1790

Arg His Thr Gly Thr Pro Phe Gly Asp Ile Pro Tyr Gly Lys Glu Ile 1795 1800 1805

Ser Tyr Ala Cys Asp Thr His Pro Asp Arg Gly Met Thr Phe Asn Leu 1810 1815 1820

Ile Gly Glu Ser Ser Ile Arg Cys Thr Ser Asp Pro Gin Gly Asn Gly 1825 1830 1835 1840

Vai Trp Ser Ser Pro Ala Pro Arg Cys Glu Leu Ser Vai Pro Ala Ala 1845 1850 1855

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Vai Ser Leu Tyr Leu Pro Gly Met Thr Ile ser Tyr Thr Cys Asp Pro 1875 1880 1885

Gly Tyr Leu Leu Vai Gly Lys Gly Phe Ile Phe Cys Thr Asp Gin Gly 1890 1895 1900

Ile Trp Ser Gin Leu Asp His Tyr Cys Lys Glu Vai Asn Cys Ser Phe 1905 1910 1915 1920

Pro Leu Phe Met Asn Gly Ile Ser Lys Glu Leu Glu Met Lys Lys Vai 1925 1930 1935

Tyr His Tyr Gly Asp Tyr Vai Thr Leu Lys Cys Glu Asp Gly Tyr Thr 1940 1945 1950 159

Leu Glu Gly Ser Pro Trp Ser Gin Cys Gin Ala Asp Asp Arg Trp Asp 1955 1960 1965

Pro Pro Leu Ala Lys Cys Thr Ser Arg Ala His Asp Ala Leu Ile Vai 1970 1975 1980

Gly Thr Leu Ser Gly Thr Ile Phe Phe Ile Leu Leu Ile Ile Phe Leu 1985 1990 1995 2000

Ser Trp Ile Ile Leu Lys His Arg Lys Gly Asn Asn Ala His Glu Asn 2005 2010 2015

Pro Lys Glu Vai Ala Ile His Leu His Ser Gin Gly Gly Ser Ser Vai 2020 2025 2030

His Pro Arg Thr Leu Gin Thr Asn Glu Glu Asn Ser Arg Vai Leu Pro 2035 2040 2045

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<210> 16 <211> 378 <212> PRT <213> Sequência Artificial 160 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 16

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<210> 17 <211> 440 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 17

Met Glu Vai Ser Ser Arg Ser Ser Glu Pro Leu Asp Pro Vai Trp Leu 15 10 15

Leu Vai Ala Phe Gly Arg Gly Gly Vai Lys Leu Glu Vai Leu Leu Leu 20 25 30

Phe Leu Leu Pro Phe Thr Leu Gly His Cys Pro Ala Pro Ser Gin Leu 35 40 45

Pro Ser Ala Lys Pro Ile Asn Leu Thr Asp Glu Ser Met Phe Pro Ile 50 55 60 162

Gly 65 Thr Tyr Leu Leu Tyr 70 Glu Cys Phe Ser Ile Thr Cys 85 Lys Gin Asp Lys Cys Ile Arg 100 Lys Gin Cys Lys Leu Vai His 115 Vai His Thr Gly Ile 120 Thr Cys 130 Asn Gin Gly Tyr Arg 135 Leu Vai 145 Ile Thr Asp Gin Ser 150 Val Asp Glu Trp Ile Pro Cys 165 Glu Ile Pro Phe Ser Ser Thr 180 Arg Glu Asp Phe Arg Cys Asn 195 Thr Asp Ala Arg Gly 200 Glu Pro 210 Ser Leu Tyr Cys Thr 215 Ser Ser 225 Gly Pro Pro Pro Gin 230 Cys Ile Pro Tyr Vai Glu Asn 245 Ala Val Met Ser Leu Arg Asp 260 Ile Val Glu Phe Lys Gly Ala 275 Ser Ser Val His Cys 280 Glu Leu 290 Pro Ser Cys Phe Lys 295 Gly Met 305 Ser Gly Phe Gin Lys 310 Gly Leu Gly Glu Asn Val Thr 325 Leu Glu Cys Ser Ser Gin Ser 340 Gin Cys Gin Ser Ala Lys Cys 355 Val Ser Arg Ser Ile 360 Ile Gly 370 Ile Ile Val Phe Ile 375 Leu Ile 385 Leu Lys Tyr Lys Lys 390 Arg Asn Vai Gly Ile His Leu 405 Asn Tyr Lys Ser Leu Leu Thr 420 Ser Gin Glu Asn Asn Ser Leu 435 Thr Gin Glu Val Ser 440

Leu Pro Gly 75 Tyr Ile Lys Arg Gin 80 Ser Thr 90 Trp Thr Ser Ala Glu 95 Asp Thr 105 Pro Ser Asp Pro Glu 110 Asn Gly Gin Phe Gly Ser Arg 125 Ile Asn Tyr Ile Gly Ser Ser 14 0 Ser Ala Val Cys Trp Asp Thr 155 Glu Ala Pro Ile Cys 160 Pro Gly 170 Ile Pro Asn Gly Asp 175 Phe His 185 Tyr Gly Met Val Val 190 Thr Tyr Lys Ala Leu Phe Asn 205 Leu Val Gly Asn Asp Gly Glu 220 Ile Gly Val Trp Glu Leu Asn 235 Lys Cys Thr Pro Pro 240 Leu Ser 250 Glu Asn Arg Ser Leu 255 Phe Arg 265 Cys His Pro Gly Phe 270 Ile Met Gin Ser Leu Asn Lys 285 Trp Glu Pro Val Ile Cys Arg 300 Leu Pro Gin Glu Gly Met Lys 315 Lys Glu Tyr Tyr Tyr 320 Glu Asp 330 Gly Tyr Thr Leu Glu 335 Gly Asp 345 Gly Ser Trp Asn Pro 350 Leu Leu Ser Gly Leu Ile Val 365 Gly Ile Phe Val Ile Ile Val 380 Phe Ile Trp Met Thr Thr Asp 395 Glu Lys Tyr Lys Glu 400 Glu Asp 410 Ser Cys Val Arg Leu 415 Gin Ser 425 Ser Thr Thr Ser Pro 430 Ala Arg

<210> 18 <211> 232 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 163 <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 18

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 14 0 Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

<210> 19 <211> 454 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 19 164

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Vai Ser Cys Glu Asn 1 5 10 15 Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Vai Ala Vai Gly Cys Leu Ala Gin Asp 20 25 30 Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser 35 40 45 Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Vai Leu Arg Gly Gly Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Thr Ser Gin Vai Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gin 65 70 75 80 Gly Thr Asp Glu His Vai Vai Cys Lys Vai Gin His Pro Asn Gly Asn 85 90 95 Lys Glu Lys Asn Vai Pro Leu Pro Vai Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys 100 105 110 Vai Ser Vai Phe Vai Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gin Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gin 130 135 140 Ile Gin Vai Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gin Vai Gly Ser Gly Val 145 150 155 160 Thr Thr Asp Gin Vai Gin Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr 165 170 175 Tyr Lys Vai Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser 180 185 190 Gin Ser Met Phe Thr Cys Arg Vai Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gin 195 200 205 Gin Asn Ala Ser Ser Met Cys Vai Pro Asp Gin Asp Thr Ala Ile Arg 210 215 220 Vai Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser 225 230 235 240 Thr Lys Leu Thr Cys Leu Vai Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val 245 250 255 Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gin Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr 260 265 270 Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu 275 280 285 Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys 290 295 300 Thr Vai Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gin Thr Ile Ser 305 310 315 320 Arg Pro Lys Gly Vai Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro 325 330 . 335 Pro Ala Arg Glu Gin Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys 340 345 350 Leu Vai Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Vai Phe Val Gin Trp Met Gin 355 360 365 Arg Gly Gin Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Vai Thr Ser Ala Pro Met 370 375 380 Pro Glu Pro Gin Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr 385 390 395 400 Vai Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val 405 410 415 Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Vai Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn vai Ser Leu Val Met Ser Asp 435 440 445 Thr Ala Gly Thr Cys Tyr 450 165

<210> 20 <211> 1530 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 20 atgggcgccg cgggcctgct cggggttttc ttggctctcg tcgcaccggg ggtcctcggg 60 atttcttgtg gctctcctcc gcctatccta aatggccgga ttagttatta ttctaccccc 120 attgctgttg gtaccgtgat aaggtacagt tgttcaggta ccttccgcct cattggagaa 180 aaaagtctat tatgcataac taaagacaaa gtggatggaa cctgggataa acctgctcct 240 aaatgtgaat atttcaataa atattcttct tgccctgagc ccatagtacc aggaggatac 300 aaaattagag gctctacacc ctacagacat ggtgattctg tgacatttgc ctgtaaaacc 360 aacttctcca tgaacggaaa caagtctgtt tggtgtcaag caaataatat gtgggggccg 420 acacgactac caacctgtgt aagtgttttc cctctcgagt gtccagcact tcctatgatc 480 cacaatggac atcacacaag tgagaatgtt ggctccattg ctccaggatt gtctgtgact 540 tacagctgtg aatctggtta cttgcttgtt ggagaaaaga tcattaactg tttgtcttcg 600 ggaaaatgga gtgctgtccc ccccacatgt gaagaggcac gctgtaaatc tctaggacga 660 tttcccaatg ggaaggtaaa ggagcctcca attctccggg ttggtgtaac tgcaaacttt 720 ttctgtgatg aagggtatcg actgcaaggc ccaccttcta gtcggtgtgt aattgctgga 780 cagggagttg cttggaccaa aatgccagta tgtgaagaaa ttttttgccc actgcggccg 840 cagtctagag acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 900 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 960 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 1020 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1080 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1140 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagtcc ccatcgagaa aaccatctcc 1200 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1260 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1320 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1380 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1440 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1500 cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1530

<210> 21 <211> 510 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 166 <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 21

Met Gly Ala Ala Gly Leu Leu Gly Vai Phe Leu Ala Leu Vai Ala Pro 1 5 10 15 Gly Vai Leu Gly Ile Ser Cys Gly Ser Pro Pro Pro Ile Leu Asn Gly 20 25 30 Arg Ile Ser. Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Ala Vai Gly Thr Vai Ile Arg 35 40 45 Tyr Ser Cys Ser Gly Thr Phe Arg Leu Ile Gly Glu Lys Ser Leu Leu 50 55 60 Cy s Ile Thr Lys Asp Lys Vai Asp Gly Thr Trp Asp Lys Pro Ala Pro 65 70 75 80 Lys Cys Glu Tyr Phe Asn Lys Tyr Ser Ser Cys Pro Glu Pro Ile Vai 85 90 95 Pro Gly Gly Tyr Lys Ile Arg Gly Ser Thr Pro Tyr Arg His Gly Asp 100 105 110 Ser Vai Thr Phe Ala Cys Lys Thr Asn Phe Ser Met Asn Gly Asn Lys 115 120 125 Ser Vai Trp Cys Gin Ala Asn Asn Met Trp Gly Pro Thr Arg Leu Pro 130 135 140 Thr Cys Vai Ser Vai Phe Pro Leu Glu Cys Pro Ala Leu Pro Met Ile 145 150 155 160 His Asn Gly His His Thr Ser Glu Asn Vai Gly Ser Ile Ala Pro Gly 165 170 175 Leu Ser Vai Thr Tyr Ser Cys Glu Ser Gly Tyr Leu Leu Vai Gly Glu 180 185 190 Lys Ile Ile Asn Cys Leu Ser Ser Gly Lys Trp Ser Ala Vai Pro Pro 195 200 205 Thr Cys Glu Glu Ala Arg Cys Lys Ser Leu Gly Arg Phe Pro Asn Gly 210 215 220 Lys Vai Lys Glu Pro Pro Ile Leu Arg Vai Gly Vai Thr Ala Asn Phe 225 230 235 240 Phe Cys Asp Glu Gly Tyr Arg Leu Gin Gly Pro Pro Ser Ser Arg Cys 245 250 255 167

Vai Ile Ala Gly 260 Gin Gly Vai Ala Glu Ile Phe 275 Cys Pro Leu Arg Pro 280 Cys Pro 290 Pro Cys Pro Ala Pro 295 Glu Leu 305 Phe Pro Pro Lys Pro 310 Lys Asp Glu Vai Thr Cys Vai 325 Vai Vai Asp Lys Phe Asn Trp 340 Tyr Vai Asp Gly Lys Pro Arg 355 Glu Glu Gin Tyr Asn 360 Leu Thr 370 Vai Leu His Gin Asp 375 Trp Lys 385 Vai Ser Asn Lys Ala 390 Leu Pro Lys Ala Lys Gly Gin 405 Pro Arg Glu Ser Arg Glu Glu 420 Met Thr Lys Asn Lys Gly Phe 435 Tyr Pro Ser Asp Ile 440 Gin Pro 450 Glu Asn Asn Tyr Lys 455 Thr Gly 465 Ser Phe Phe Leu Tyr 470 Ser Lys Gin Gin Gly Asn Vai 485 Phe Ser Cys Asn His Tyr Thr 500 Gin Lys Ser Leu

Trp Thr Lys Met Pro Vai Cys Glu 265 270 Gin Ser Arg Asp Lys Thr His Thr , 285 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe 300 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 315 320 Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai 330 335 Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr 345 350 Ser Thr Tyr Arg vai Vai Ser Vai 365 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 380 Vai Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 395 400 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro 410 415 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai 425 430 Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly 445 Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp 460 Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp 475 480 Ser Vai Met His Glu Ala Leu His 490 495 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 505 510

<210> 22 <211> 233 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 22 168

Glu Pro Arg Ile Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Cys Pro 1 5 10 15 Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Vai Thr Cys Vai 35 40 45 Vai Vai Asp Vai Ser Glu Asp Asp Pro Asp Vai His Vai Ser Trp Phe 50 55 60 Vai Asp Asn Lys Glu Vai His Thr Ala Trp Thr Gin Pro Arg Glu Ala 65 70 75 80 Gin Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Ala Leu Pro Ile Gin His 85 90 95 Gin Asp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Vai Asn Asn Lys 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Arg 115 120 125 Ala Gin Thr Pro Gin Vai Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gin Met 130 135 140 Ser Lys Lys Lys Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Thr Asn Phe Phe Ser 145 150 155 160 Glu Ala Ile Ser Vai Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gin Asp 165 170 175 Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Thr Asp Ser Trp Leu Gin Gly Glu Ile 195 200 205 Phe Thr Cys Ser Vai Vai His Glu Ala Leu His Asn His His Thr Gin 210 215 220 Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly Lys 225 230

<210> 23 <211> 4860 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 23 169 gctctctaca ccctcatcac ccctgctgtt ttgcgaacag acacagaaga gcaaattttg 60 gtggaggccc atggagacag tactccaaaa cagcttgaca tctttgttca tgattttcca 120 cggaagcagà aaaccttgtt ccaaaccaga gtagatatga atccagcagg aggcatgctt 180 gtcactccaa ctatagagat tccagcaaaa gaagtgagta cggactccag gcaaaatcaa 240 tatgtggttg tgcaagtaac tggtcctcaa gtgagattgg aaaaggtggt tctcctttct 300 taccagagta gctttctgtt tatccagaca gataaaggca tctatacacc agggtctcca 360 gtactctatc gtgttttttc tatggatcac aacacaagca agatgaacaa aactgtgatt 420 gttgagtttc agactccaga aggcattctt gtcagttcta attcagttga cctaaacttc 480 ttctggcctt acaatttacc agaccttgtc agtttgggga cttggaggat tgtggccaaa 540 tatgaacatt ccccagagaa ttatactgca tattttgatg tcaggaaata tgtgttgcca 600 agctttgaag tccgtctgca accatcagag aagttttttt acattgacgg caatgaaaat 660 ttccacgtgt ctatcactgc aaggtacttg tatggagagg aagtggaagg tgtggccttt 720 gtcctctttg gagtgaaaat agatgatgct aaaaagagta ttccagactc actcacgaga 780 attccgatta ttgatggaga tgggaaagca acactaaaaa gagatacatt ccgttctcga 840 tttccaaatc tcaatgagct tgttgggcat actctgtatg catctgtaac agtcatgaca 900 gaatcaggca gtgatatggt agtgactgag caaagcggca ttcatattgt ggcatctccc 960 tatcagatcc acttcacaaa aacccccaaa tatttcaagc caggaatgcc atatgaactg 1020 acggtgtatg ttaccaaccc tgatggctca ccagctgccc atgtgccagt ggtatcagag 1080 gcctttcatt ctatgggaac cactttgagt gatgggactg ctaagctcat cctgaacata 1140 ccattgaatg ctcaaagcct accaatcact gttagaacta accatggaga cctcccaaga 1200 gaacgccagg caacaaagtc catgacagcc atagcctacc aaacccaggg aggatctgga 1260 aactatcttc atgtagccat tacatctaca gagattaagc ccggagataa cttacctgtc 1320 aatttcaatg tgaagggcaa tgcaaattca ctgaagcaga tcaaatattt cacatacctc 1380 atattgaata aagggaagat tttcaaggtt ggcaggcaac ccaggagaga tgggcagaat 1440 ctggtgacca tgaatctgca tatcactcca gatctcatcc cttccttccg gtttgtggct 1500 tactaccaag tgggaaacaa cgaaattgtg gctgattctg tctgggtgga tgtgaaggat 1560 acctgcatgg gaacgttggt tgtgaaagga gacaatctaa tacaaatgcc aggagctgca 1620 atgaaaatca aattggaagg ggatccaggt gctcgggttg gtcttgtggc tgtggacaaa 1680 gcagtatatg ttctcaatga taaatataag attagccaag ctaagatatg ggacacaata 1740 gaaaagagtg actttggctg tacagctggc agtggccaga ataatctggg tgtgtttgaa 1800 gatgctggac tggctctgac aaccagcact aatctcaaca ccaaacagag atcagctgca 1860 aagtgtcctc agcctgcaaa tcggaggcgt cgcagttctg ttttgctgct tgacagcaac 1920 gcaagcaaag cggcagaatt tcaggatcaa gacctgcgta aatgctgtga agatgtcatg 1980 catgagaacc ccatggggta cacttgtgaa aagcgtgcaa aatacatcca ggagggagat 2040 gcttgtaagg ctgccttcct tgaatgctgt cgctacatca agggggtccg agatgaaaac 2100 170 caacgggaga gcgagttgtt tctggcaaga gatgataatg aagatggttt catagcagat 2160 agtgatatca tctcaaggtc tgatttcccc aagagttggt tgtggctaac aaaggacttg 2220 accgaggagc ctaacagtca agggatttca agcaagacaa tgtcttttta tctgagggat 2280 tccatcacaa cctgggtggt gctggctgta agctttacac ccaccaaagg gatctgtgtg 2340 gctgaacctt atgaaataag agtcatgaaa gtcttcttca ttgatcttca aatgccatat 2400 tcagtagtga agaatgagca ggtggagatt cgagctattc tgcacaacta cgttaacgag 2460 gatatttatg tgcgagtgga actgttatac aacccagcct tctgcagtgc ttccacaaaa 2520 ggacaaagat accgacagca gttcccaatt aaagccctgt cctccagagc agtaccgttt 2580 gtgatagtcc cattagagca aggattgcat gatgttgaga ttaaagcaag tgtccaggaa 2640 gcgttgtggt cagacggtgt gaggaagaaa ctgaaagttg tacctgaagg ggtacagaaa 2700 tccattgtga ctattgttaa actggaccca agggcaaaag gagttggtgg aacacagcta 2760 gaagtgatca aagcccgcaa attagatgac agagtgcctg acaeagaaat tgaaaccaag 2820 attatcatcc aaggtgaccc tgtggctcag attattgaaa actcaattga tggaagtaaa 2880 ctcaaccatc tcattatcac tccttctggc tgtggggagc aaaatatgat ccgcatggcc 2940 gcaccagtta ttgccaccta ctacctggac accacagagc agtgggagac tctcggcata 3000 aatcgcagga ctgaagctgt caatcagatc gtgactggtt atgcccagca gatggtgtac 3060 aagaaagcag atcattccta tgcagcattt acaaaccgtg catctagttc ttggctaaca 3120 gcatatgtcg taaaagtctt tgccatggct gccaaaatgg tagcaggcat tagtcatgaa 3180 atcatttgtg gaggtgtgag gtggctgatt ctgaacaggc aacaaccaga tggagcgttc 3240 aaagaaaatg cccctgtact ttctggaaca atgcagggag gaattcaagg tgctgaagaa 3300 gaagtatatt taacagcttt cattctggtt gcgttgttgg aatccaaaac aatctgcaat 3360 gactatgtca atagtctaga cagcagcatc aagaaggcca caaattattt actcaaaaag 3420 tatgagaaac tgcaaaggcc ttacactaca gccctcacag cctatgcttt ggctgctgca 3480 gaccaactca atgatgacag ggtactcatg gcagcatcaa caggaaggga tcattgggaa 3540 gaatacaatg ctcacaccca caacattgaa ggcacttcct atgccttgtt ggccctgctg 3600 aaaatgaaga aatttgatca aactggtccc atagtcagat ggctgacaga tcagaatttt 3660 tatggggaaa catatggaca aacccaagca acagttatgg catttcaagc tcttgctgaa 3720 tatgagattc agatgcctac ccataaggac ttaaacttag atattactat tgaactgcca 3780 gatogagaag tacctataag gtacagaatt aattatgaaa atgctctcct ggctcggaca 3840 gtagagacca aactcaacca agacatcact gtgacagcat caggtgatgg aaaagcaaca 3900 atgaccattt tgacattcta taacgcacag ttgcaggaga aggcaaatgt ttgcaataaa 3960 tttcatctta atgtttctgt tgaaaacatc cacttgaatg caatgggagc caagggagcc 4020 ctcatgctca agatctgcac aaggtatctg ggagaagttg attctacaat gacaataatt 4080 gatatttcta tgctgactgg ttttctccct gatgctgaag accttacaag gctttctaaa 4140 ggagtggaca gatacatctc cagacatgaa gttgacaata atatggctca gaaagtagct 4200 gttatcattt acttaaacaa ggtctcccac tctgaagatg aatgcctgca ctttaagatt 4260 ctcaagcatt ttgaagttgg cttcattcag ccaggatcag tcaaggtgta cagctactac 4320 aatctagatg aaaaatgtac caagttctac catccagata aaggaacagg ccttctcaat 4380 aagatatgta ttggtaacgt ttgccgatgt gcaggagaaa cctgttcctc gctcaaccat 4440 caggaaagga ttgatgttcc attacaaatt gaaaaagcct gcgagacgaa tgtggattat 4500 gtctacaaaa ccaagctgct tcgaatagaa gaacaagatg gtaatgatat ctatgtcatg 4560 gatgttttag aagttattaa acaaggtact gacgaaaatc cacgagcaaa gacccaccag 4620 tacataagtc aaaggaaatg ccaggaggct ctgaatctga aggtgaatga tgattatctg 4680 atctggggtt ccaggagtga cctgttgccc acgaaagata aaatttccta catcattaca 4740 aagaacacat ggattgagag atggccacat gaagacgaat gtcaggaaga agaattccaa 4800 aagttgtgtg atgactttgc tcagtttagc tacacattga ctgagtttgg ctgccctact 4860

<210> 24 <211> 1620 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética 171 <4Ο0> 24

Ala Leu Tyr Thr Leu Ile Thr Pro Ala Vai Leu Arg Thr Asp Thr Glu 15 10 15 172

Glu Gin Ile Leu Val Glu Ala His Gly Asp Ser Thr Pro Lys Gin Leu 20 25 30 Asp Ile Phe Val His Asp Phe Pro Arg Lys Gin Lys Thr Leu Phe Gin 35 40 45 Thr Arg Vai Asp Met Asn Pro Ala Gly Gly Met Leu Val Thr Pro Thr 50 55 60 Ile Glu Ile Pro Ala Lys Glu Val Ser Thr Asp Ser Arg Gin Asn Gin 65 70 75 80 Tyr Vai Vai Val Gin Val Thr Gly Pro Gin Val Arg Leu Glu Lys Val 85 90 95 Vai Leu Leu Ser Tyr Gin Ser Ser Phe Leu Phe Ile Gin Thr Asp Lys 100 105 110 Gly Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Pro Val Leu Tyr Arg Val Phe Ser Met 115 120 125 Asp His Asn Thr Ser Lys Met Asn Lys Thr Val Ile Val Glu Phe Gin 130 135 14 0 Thr Pro Glu Gly Ile Leu Val Ser Ser Asn Ser Val Asp Leu Asn Phe 145 150 155 160 Phe Trp Pro Tyr Asn Leu Pro Asp Leu Val Ser Leu Gly Thr Trp Arg 165 170 175 Ile Vai Ala Lys Tyr Glu His Ser Pro Glu Asn Tyr Thr Ala Tyr Phe 180 185 190 Asp Vai Arg Lys Tyr Val Leu Pro Ser Phe Glu Val Arg Leu Gin Pro 195 200 205 Ser Glu Lys Phe Phe Tyr Ile Asp Gly Asn Glu Asn Phe His Val Ser 210 215 220 Ile Thr Ala Arg Tyr Leu Tyr Gly Glu Glu Val Glu Gly Val Ala Phe 225 230 235 240 Vai Leu Phe Gly Val Lys Ile Asp Asp Ala Lys Lys Ser Ile Pro Asp 245 250 255 Ser Leu Thr Arg Ile Pro Ile Ile Asp Gly Asp Gly Lys Ala Thr Leu 260 265 270 Lys Arg Asp Thr Phe Arg Ser Arg Phe Pro Asn Leu Asn Glu Leu Val 275 280 285 Gly His Thr Leu Tyr Ala Ser Val Thr Val Met Thr Glu Ser Gly Ser 290 295 300 Asp Met Val Val Thr Glu Gin Ser Gly Ile His Ile Val Ala Ser Pro 305 310 315 320 Tyr Gin Ile His Phe Thr Lys Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met 325 330 335 Pro Tyr Glu Leu Thr Val Tyr Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala 340 345 350 Ala His Val Pro Val Val Ser Glu Ala Phe His Ser Met Gly Thr Thr 355 360 365 Leu Ser Asp Gly Thr Ala Lys Leu Ile Leu Asn Ile Pro Leu Asn Ala 370 375 380 Gin Ser Leu Pro Ile Thr Val Arg Thr Asn His Gly Asp Leu Pro Arg 385 390 395 400 Glu Arg Gin Ala Thr Lys Ser Met Thr Ala Ile Ala Tyr Gin Thr Gin 405 410 415 Gly Gly Ser Gly Asn Tyr Leu His Val Ala Ile Thr Ser Thr Glu Ile 420 425 430 Lys Pro Gly Asp Asn Leu Pro Val Asn Phe Asn Val Lys Gly Asn Ala 435 440 445 Asn Ser Leu Lys Gin Ile Lys Tyr Phe Thr Tyr Leu Ile Leu Asn Lys 450 455 460 Gly Lys Ile Phe Lys Val Gly Arg Gin Pro Arg Arg Asp Gly Gin Asn 465 470 475 480 Leu Vai Thr Met Asn Leu His Ile Thr Pro Asp Leu Ile Pro Ser Phe 485 490 495 173

Arg Phe Vai Ala 500 Tyr Tyr Gin Vai Ser Vai Trp 515 Vai Asp Vai Lys Asp 520 Lys Gly 530 Asp Asn Leu Ile Gin 535 Met Leu 545 Glu Gly Asp Pro Gly 550 Ala Arg Ala Vai Tyr Vai Leu 565 Asn Asp Lys Trp Asp Thr Ile 580 Glu Lys Ser Asp Gin Asn Asn 595 Leu Gly Vai Phe Glu 600 Ser Thr 610 Asn Leu Asn Thr Lys 615 Gin Pro 625 Ala Asn Arg Arg Arg 630 Arg Ser Ala Ser Lys Ala Ala 645 Glu Phe Gin Glu Asp Vai Met 660 His Glu Asn Pro Ala Lys Tyr 675 Ile Gin Glu Gly Asp 680 Cys Cys 690 Arg Tyr Ile Lys Gly 695 Vai Glu 705 Leu Phe Leu Ala Arg 710 Asp Asp Ser Asp Ile Ile Ser 725 Arg Ser Asp Thr Lys Asp Leu 740 Thr Glu Glu Pro Thr Met Ser 755 Phe Tyr Leu Arg Asp 760 Ala Vai 770 Ser Phe Thr Pro Thr 775 Lys Glu 785 Ile Arg Vai Met Lys 790 Vai Phe Ser Vai Vai Lys Asn 805 Glu Gin Vai Tyr Vai Asn Glu 820 Asp Ile Tyr Vai Ala Phe Cys 835 Ser Ala Ser Thr Lys 840 Pro Ile 850 Lys Ala Leu Ser Ser 855 Arg Leu 865 Glu Gin Gly Leu His 870 Asp Vai Ala Leu Trp Ser Asp 885 Gly Vai Arg Gly Vai Gin Lys 900 Ser Ile Vai Thr Lys Gly Vai 915 Gly Gly Thr Gin Leu 920 Asp Asp 930 Arg Vai Pro Asp Thr 935 Glu Gly 945 Asp Pro Vai Ala Gin 950 Ile Ile Leu Asn Hls Leu Ile 965 Ile Thr Pro

Gly 505 Asn Asn Glu Ile Vai 510 Ala Asp Thr Cys Met Gly Thr 525 Leu Vai Vai Pro Gly Ala Ala 540 Met Lys Ile Lys Vai Gly Leu 555 Vai Ala Vai Asp Lys 560 Tyr Lys 570 Ile Ser Gin Ala Lys 575 Ile Phe 585 Gly Cys Thr Ala Gly 590 Ser Gly Asp Ala Gly Leu Ala 605 Leu Thr Thr Arg Ser Ala Ala 620 Lys Cys Pro Gin Ser Vai Leu 635 Leu Leu Asp Ser Asn 640 Asp Gin 650 Asp Leu Arg Lys Cys 655 Cys Met 665 Gly Tyr Thr Cys Glu 670 Lys Arg Ala Cys Lys Ala Ala 685 Phe Leu Glu Arg Asp Glu Asn 700 Gin Arg Glu Ser Asn Glu Asp 715 Gly Phe Ile Ala Asp 720 Phe Pro 730 Lys Ser Trp Leu Trp 735 Leu Asn 745 Ser Gin Gly Ile Ser 750 Ser Lys Ser Ile Thr Thr Trp 765 Vai Vai Leu Gly Ile Cys Vai 780 Ala Glu Pro Tyr Phe Ile Asp 795 Leu Gin Met Pro Tyr 800 Glu Ile 810 Arg Ala Ile Leu His 815 Asn Arg 825 Vai Glu Leu Leu Tyr 830 Asn Pro Gly Gin Arg Tyr Arg 845 Gin Gin Phe Ala Vai Pro Phe 860 Vai Ile Vai Pro Glu Ile Lys 875 Ala Ser Vai Gin Glu 880 Lys Lys 890 Leu Lys Vai Vai Pro 895 Glu Ile 905 Vai Lys Leu Asp Pro 910 Arg Ala Glu Vai Ile Lys Ala 925 Arg Lys Leu Ile Glu Thr Lys 940 Ile Ile Ile Gin Glu Asn Ser 955 Ile Asp Gly Ser Lys 960 Ser Gly 970 Cys Gly Glu Gin Asn 975 Met 174

Ile Arg Met Ala Ala Pro Vai Ile Ala Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Thr 980 985 990

Glu Gin Trp Glu Thr Leu Gly Ile Asn Arg Arg Thr Glu Ala Vai Asn 995 1000 1005

Gin Ile Vai Thr Gly Tyr Ala Gin Gin Met Vai Tyr Lys Lys Ala Asp 1010 1015 1020

His Ser Tyr Ala Ala Phe Thr Asn Arg Ala Ser Ser Ser Trp Leu Thr 1025 1030 1035 1040

Ala Tyr Vai Vai Lys Vai Phe Ala Met Ala Ala Lys Met Vai Ala Gly 1045 1050 1055

Ile Ser His Glu Ile Ile Cys Gly Gly Vai Arg Trp Leu Ile Leu Asn 1060 1065 1070

Arg Gin Gin Pro Asp Gly Ala Phe Lys Glu Asn Ala Pro Vai Leu Ser 1075 1080 1085

Gly Thr Met Gin Gly Gly Ile Gin Gly Ala Glu Glu Glu Vai Tyr Leu 1090 1095 1100

Thr Ala Phe Ile Leu Vai Ala Leu Leu Glu Ser Lys Thr Ile Cys Asn 1105 1110 1115 1120

Asp Tyr Vai Asn Ser Leu Asp Ser Ser Ile Lys Lys Ala Thr Asn Tyr 1125 1130 1135

Leu Leu Lys Lys Tyr Glu Lys Leu Gin Arg Pro Tyr Thr Thr Ala Leu 1140 1145 1150

Thr Ala Tyr Ala Leu Ala Ala Ala Asp Gin Leu Asn Asp Asp Arg Vai 1155 1160' 1165

Leu Met Ala Ala Ser Thr Gly Arg Asp His Trp Glu Glu Tyr Asn Ala 1170 1175 1180

His Thr His Asn Ile Glu Gly Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu 1185 1190 1195 1200

Lys Met Lys Lys Phe Asp Gin Thr Gly Pro Ile Vai Arg Trp Leu Thr 1205 1210 1215

Asp Gin Asn Phe Tyr Gly Glu Thr Tyr Gly Gin Thr Gin Ala Thr Vai 1220 1225 1230

Met Ala Phe Gin Ala Leu Ala Glu Tyr Glu Ile Gin Met Pro Thr His 1235 1240 1245

Lys Asp Leu Asn Leu Asp Ile Thr Ile Glu Leu Pro Asp Arg Glu Vai 1250 1255 1260

Pro Ile Arg Tyr Arg Ile Asn Tyr Glu Asn Ala Leu Leu Ala Arg Thr 1265 1270 1275 1280

Vai Glu Thr Lys Leu Asn Gin Asp Ile Thr Vai Thr Ala Ser Gly Asp 1285 1290 1295

Gly Lys Ala Thr Met Thr Ile Leu Thr Phe Tyr Asn Ala Gin Leu Gin 1300 1305 1310

Glu Lys Ala Asn Vai Cys Asn Lys Phe His Leu Asn Vai Ser Vai Glu 1315 1320 1325

Asn Ile His Leu Asn Ala Met Gly Ala Lys Gly Ala Leu Met Leu Lys 1330 1335 1340

Ile Cys Thr Arg Tyr Leu Gly Glu Vai Asp Ser Thr Met Thr Ile Ile 1345 1350 1355 1360

Asp Ile Ser Met Leu Thr Gly Phe Leu Pro Asp Ala Glu Asp Leu Thr 1365 1370 1375

Arg Leu Ser Lys Gly Vai Asp Arg Tyr Ile Ser Arg Tyr Glu Vai Asp 1380 1385 1390

Asn Asn Met Ala Gin Lys Vai Ala Vai Ile Ile Tyr Leu Asn Lys Vai 1395 1400 1405

Ser His Ser Glu Asp Glu Cys Leu His Phe Lys Ile Leu Lys His Phe 1410 1415 1420

Glu Vai Gly Phe Ile Gin Pro Gly Ser Vai Lys Vai Tyr Ser Tyr Tyr 1425 1430 1435 1440

Asn Leu Asp Glu Lys Cys Thr Lys Phe Tyr His Pro Asp Lys Gly Thr 1445 1450 1455 175 Gly Leu Leu Asn Lys Ile Cys Ile Gly Asn Vai Cys Arg Cys Ala Gly Glu 1460 1465 1470 Thr Cys Ser Ser Leu Asn His Gin Glu Arg Ile Asp Vai Pro Leu Gin 1475 1480 1485 Ile Glu Lys Ala Cys Glu Thr Asn Vai Asp Tyr Vai Tyr Lys Thr Lys 1490 14 95 1500 Leu Leu Arg Ile Glu Glu Gin Asp Gly Asn Asp Ile Tyr Vai Met 1505 1510 1515 1520 Asp Vai Leu Glu Vai Ile Lys Gin Gly Thr Asp Glu Asn Pro Arg Ala 1525 1530 ' 1535 Lys Thr His Gin Tyr Ile Ser Gin Arg Lys Cys Gin Glu Ala Leu Asn 1540 1545 1550 Leu Lys Vai Asn Asp Asp Tyr Leu Ile Trp Gly Ser Arg Ser Asp Leu 1555 1560 1565 Leu Pro Thr Lys Asp Lys Ile Ser Tyr Ile Ile Thr Lys Asn Thr Trp 1570 1575 1580 Ile Glu Arg Trp Pro His Glu Asp Glu Cys Gin Glu Glu Glu Phe Gin 1585 1590 1595 1600 Lys Leu Cys Asp Asp Phe Ala Gin Phe Ser Tyr Thr Leu Thr Glu Phe 1605 1610 ' 1615 Gly Cys Pro Thr 1620

<210> 25 <211> 3039 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 25 176 atttcttgtg gctctcctcc gcctatccta aatggccgga ttagttatta ttctaccccc 60 attgctgttg gtaccgtgat aaggtacagt tgttcaggta ccttccgcct cattggagaa 120 aaaagtctat tatgcataac taaagacaaa gtggatggaa cctgggataa acctgctcct 180 aaatgtgaat atttcaataa atattcttct tgccctgagc ccatagtacc aggaggatac 240 aaaattagag gctctacacc ctacagacat ggtgattctg tgacatttgc ctgtaaaacc 300 aacttctcca tgaacggaaa caagtctgtt tggtgtcaag caaataatat gtgggggccg 360 acacgactac caacctgtgt aagtgttttc cctctcgagt gtccagcact tcctatgatc 420 cacaatggac atcacacaag tgagaatgtt ggctccattg ctccaggatt gtctgtgact 480 tacagctgtg aatctggtta cttgcttgtt ggagaaaaga tcattaactg tttgtcttcg 540 ggaaaatgga gtgctgtccc ccccacatgt gaagaggcac gctgtaaatc tctaggacga 600 tttcccaatg ggaaggtaaa ggagcctcca attctccggg ttggtgtaac tgcaaacttt 660 ttctgtgatg aagggtatcg actgcaaggc ccaccttcta gtcggtgtgt aattgctgga 720 cagggagttg cttggaccaa aatgccagta tgtgaagaaa ttttttgccc atcacctccc 780 cctattctca atggaagaca tataggcaac tcactagcaa atgtctcata tggaagcata 840 gtcacttaca cttgtgaccc ggacccagag gaaggagtga acttcatcct tattggagag 900 agcactctcc gttgtacagt tgatagtcag aagactggga cctggagtgg ccctgcccca 960 cgctgtgaac tttctacttc tgcggttcag tgtccacatc cccagatcct aagaggccga 1020 atggtatctg ggcagaaaga tcgatatacc tataacgaca ctgtgatatt tgcttgcatg 1080 tttggcttca ccttgaaggg cagcaagcaa atccgatgca atgcccaagg cacatgggag 1140 ccatctgcac cagtctgtga aaaggaatgc caggcccctc ctaacatcct caatgggcaa 1200 aaggaagata gacacatggt ccgctttgac cctggaacat ctataaaata tagctgtaac 1260 cctggctatg tgctggtggg agaagaatcc atacagtgta cctctgaggg ggtgtggaca 1320 ccccctgtac cccaatgcaa agtggcagcg tgtgaagcta caggaaggca actcttgaca 1380 aaaccccagc accaatttgt tagaccagat gtcaactctt cttgtggtga agggtacaag 1440 ttaagtggga gtgtttatca ggagtgtcaa ggcacaattc cttggtttat ggagattcgt 1500 cttfcgtaaag aaatcacctg cccaccaccc cctgttatct acaatggggc acacaccggg 1560 agttccttag aagattttcc atatggaacc acggtcactt acacatgtaa ccctgggcca 1620 gaaagaggag tggaattcag cctcattgga gagagcacca tccgttgtac aagcaatgat 1680 caagaaagag gcacctggag tggccctgct cccctatgta aactttccct ccttgctgtc 1740 cagtgctcac atgtccatat tgcaaatgga tacaagatat ctggcaagga agccccatat 1800 ttctacaatg acactgtgac attcaagtgt tatagtggat ttactttgaa gggcagtagt 1860 cagattcgtt gcaaagctga taacacctgg gatcctgaaa taccagtttg tgaaaaagaa 1920 acatgccagc atgtgagaca gagtcttcaa gaacttccag ctggttcacg tgtggagcta 1980 gttaatacgt cctgccaaga tgggtaccag ttgactggac atgcttatca gatgtgtcaa 2040 gatgctgaaa atggaatttg gttcaaaaag attccacttt gtaaagttat tcactgtcac 2100 cctccaccag tgattgtcaa tgggaagcac acagggatga tggcagaaaa ctttctatat 2160 ggaaatgaag tctcttatga atgtgaccaa ggattctatc tcctgggaga gaaaaaattg 2220 cagtgcagaa gtgattctaa aggacatgga tcttggagcg ggccttcccc acagtgctta 2280 cgatctcctc ctgtgactcg ctgccctaat ccagaagtca aacatgggta caagctcaat 2340 aaaacacatt ctgcatattc ccacaatgac atagtgtatg ttgactgcaa tcctggcttc 2400 atcatgaatg gtagtcgcgt gattaggtgt catactgata acacatgggt gccaggtgtg 2460 ccaacttgta tgaaaaaagc cttcataggg tgtccacctc cgcctaagac ccctaacggg 2520 aaccatactg gtggaaacat agctcgattt tctcctggaa tgtcaatcct gtacagctgt 2580 gaccaaggct acctgctggt gggagaggca ctccttcttt gcacacatga gggaacctgg 2640 agccaacctg cccctcattg taaagaggta aactgtagct caccagcaga tatggatgga 2700 atccagaaag ggctggaacc aaggaaaatg tatcagtatg gagctgttgt aactctggag 2760 tgtgaagatg ggtatatgct ggaaggcagt ccccagagcc agtgccaatc ggatcaccaa 2820 tggaaccctc ccctggcggt ttgcagatcc cgttcacttg ctcctgtcct ttgtggtatt 2880 gctgcaggtt tgatacttct taccttcttg attgtcatta ccttatacgt gatatcaaaa 2940 cacagagaac gcaattatta tacagataca agccagaaag aagcttttca tttagaagca 3000 cgagaagtat attctgttga tccatacaac ccagccagc 3039

<210> 26 <211> 1033 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 177 <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 26

Met Gly Ala Ala Gly Leu Leu Gly Vai Phe Leu Ala Leu Vai Ala Pro 1 5 10 15 Gly Vai Leu Gly Ile Ser Cys Gly Ser Pro Pro Pro Ile Leu Asn Gly 20 25 30 Arg Ile Ser Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Ala Vai Gly Thr Vai Ile Arg 35 40 45 Tyr Ser Cys Ser Gly Thr Phe Arg Leu Ile Gly Glu Lys Ser Leu Leu 50 55 60 Cys Ile Thr Lys Asp Lys Vai Asp Gly Thr Trp Asp Lys Pro Ala Pro 65 70 75 80 Lys Cys Glu Tyr Phe Asn Lys Tyr Ser Ser Cys Pro Glu Pro Ile Vai 85 90 95 Pro Gly Gly Tyr Lys Ile Arg Gly Ser Thr Pro Tyr Arg His Gly Asp 100 105 110 Ser Vai Thr Phe Ala Cys Lys Thr Asn Phe Ser Met Asn Gly Asn Lys 115 12 0 125 Ser Vai Trp Cys Gin Ala Asn Asn Met Trp Gly Pro Thr Arg Leu Pro 130 135 140 Thr Cys Vai Ser Vai Phe Pro Leu Glu Cys Pro Ala Leu Pro Met Ile 145 150 155 160 His Asn Gly His His Thr Ser Glu Asn Vai Gly Ser Ile Ala Pro Gly 165 170 175 Leu Ser Vai Thr Tyr Ser Cys Glu Ser Gly Tyr Leu Leu Vai Gly Glu 180 185 190 Lys Ile Ile Asn Cys Leu Ser Ser Gly Lys Trp Ser Ala Vai Pro Pro 195 200 205 178

Thr Cys Glu Glu Ala Arg Cys Lys Ser Leu Gly Arg Phe Pro Asn Gly 210 215 220 Lys Vai Lys Glu Pro Pro Ile Leu Arg Vai Gly Vai Thr Ala Asn Phe 225 230 235 240 Phe Cys Asp Glu Gly Tyr Arg Leu Gin Gly Pro Pro Ser Ser Arg Cys 245 250 255 Vai Ile Ala Gly Gin Gly Vai Ala Trp Thr Lys Met Pro Vai Cys Glu 260 265 270 Glu Ile Phe Cys Pro Ser Pro Pro Pro Ile Leu Asn Gly Arg His Ile 275 280 285 Gly Asn Ser Leu Ala Asn Vai Ser Tyr Gly Ser Ile Vai Thr Tyr Thr 290 295 300 Cys Asp Pro Asp Pro Glu Glu Gly Vai Asn Phe Ile Leu Ile Gly Glu 305 310 315 320 Ser Thr Leu Arg Cys Thr Vai Asp Ser Gin Lys Thr Gly Thr Trp Ser 325 330 335 Gly Pro Ala Pro Arg Cys Glu Leu Ser Thr Ser Ala Vai Gin Cys Pro 340 345 350 His Pro Gin Ile Leu Arg Gly Arg Met Vai Ser Gly Gin Lys Asp Arg 355 360 365 Tyr Thr Tyr Asn Asp Thr Vai Ile Phe Ala Cys Met Phe Gly Phe Thr 370 375 380 Leu Lys Gly Ser Lys Gin Ile Arg Cys Asn Ala Gin Gly Thr Trp Glu 385 390 395 400 Pro Ser Ala Pro Vai Cys Glu Lys Glu Cys Gin Ala Pro Pro As ri Ile 405 410 415 Leu Asn Gly Gin Lys Glu Asp Arg His Met Vai Arg Phe Asp Pro Gly 420 425 430 Thr Ser Ile Lys Tyr Ser Cys Asn Pro Gly Tyr Vai Leu Vai Gly Glu 435 440 445 Glu Ser Ile Gin Cys Thr Ser Glu Gly Vai Trp Thr Pro Pro Vai Pro 450 455 460 Gin Cys Lys Vai Ala Ala Cys Glu Ala Thr Gly Arg Gin Leu Leu Thr 465 470 475 480 Lys Pro Gin His Gin Phe Vai Arg Pro Asp Vai Asn Ser Ser Cys Gly 485 490 495 Glu Gly Tyr Lys Leu Ser Gly Ser Vai Tyr Gin Glu Cys Gin Gly Thr 500 505 510 Ile Pro Trp Phe Met Glu Ile Arg Leu Cys Lys Glu Ile Thr Cys Pro 515 520 525 Pro Pro Pro Vai Ile Tyr Asn Gly Ala His Thr Gly Ser Ser Leu Glu 530 535 540 Asp Phe Pro Tyr Gly Thr Thr Vai Thr Tyr Thr Cys Asn Pro Gly Pro 545 550 555 560 Glu Arg Gly Vai Glu Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Arg Cys 565 570 575 Thr Ser Asn Asp Gin Glu Arg Gly Thr Trp Ser Gly Pro Ala Pro Leu 580 585 590 Cys Lys Leu Ser Leu Leu Ala Vai Gin Cys Ser His Vai His Ile Ala 595 600 605 Asn Gly Tyr Lys Ile Ser Gly Lys Glu Ala Pro Tyr Phe Tyr Asn Asp 610 615 620 Thr Vai Thr Phe Lys Cys Tyr Ser Gly Phe Thr Leu Lys Gly Ser Ser 625 630 635 640 Gin Ile Arg Cys Lys Ala Asp Asn Thr Trp Asp Pro Glu Ile Pro Vai 645 650 555 Cys Glu Lys Glu Thr Cys Gin His Vai Arg Gin Ser Leu Gin Glu Leu 660 665 67 0 Pro Ala Gly Ser Arg Vai Glu Leu Vai Asn Thr Ser Cys Gin Asp Gly 675 680 685 179

Tyr Gin. Leu Thr Gly His Ala Tyr Gin Met Cys Gin Asp Ala Glu Asn 690 695 700 Gly Ile Trp Phe Lys Lys Ile Pro Leu Cys Lys Val Ile His Cys His 705 710 715 720 Pro Pro Pro Vai Ile Vai Asn Gly Lys His Thr Gly Met Met Ala Glu 725 730 735 As η Phe Leu Tyr Gly Asn Glu Val Ser Tyr Glu Cys Asp Gin Gly Phe 740 745 750 Tyr Leu Leu Gly Glu Lys Lys Leu Gin Cys Arg Ser Asp Ser Lys Gly 755 760 765 His Gly Ser Trp Ser Gly Pro Ser Pro Gin Cys Leu Arg Ser Pro Pro 770 775 780 Vai Thr Arg Cys Pro Asn Pro Glu Val Lys His Gly Tyr Lys Leu Asn 785 790 795 800 Lys Thr His Ser Ala Tyr Ser His Asn Asp Ile Val Tyr Val Asp Cys 805 810 815 Asn Pro Gly Phe Ile Met Asn Gly Ser Arg Val Ile Arg Cys His Thr 820 825 830 Asp Asn Thr Trp Vai Pro Gly Val Pro Thr Cys Met Lys Lys Ala Phe 835 840 845 Ile Gly Cys Pro Pro Pro Pro Lys Thr Pro Asn Gly Asn His Thr Gly 850 855 860 Gly Asn Ile Ala Arg Phe Ser Pro Gly Met Ser Ile Leu Tyr Ser Cys 865 870 875 880 Asp Gin Gly Tyr Leu Leu Val Gly Glu Ala Leu Leu Leu Cys Thr His 885 890 895 Glu Gly Thr Trp Ser Gin Pro Ala Pro His Cys Lys Glu Val Asn Cys 900 905 910 Ser Ser Pro Ala Asp Met Asp Gly Ile Gin Lys Gly Leu Glu Pro Arg 915 920 925 Lys Met Tyr Gin Tyr Gly Ala Val Val Thr Leu Glu Cys Glu Asp Gly 93 0 935 940 Tyr Met Leu Glu Gly Ser Pro Gin Ser Gin Cys Gin Ser Asp His Gin 945 950 955 960 Trp Asn Pro Pro Leu Ala Val Cys Arg Ser Arg Ser Leu Ala Pro Val 965 970 975 Leu Cys Gly Ile Ala Ala Gly Leu Ile Leu Leu Thr Phe Leu Ile Val 980 985 990 Ile Thr Leu Tyr Vai Ile Ser Lys His Arg Glu Arg Asn Tyr Tyr Thr 995 1000 1005 Asp Thr Ser Gin Lys Glu Ala Phe His Leu Glu Ala Arg Glu Val Tyr 1010 1015 1020 Ser Vai Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ser 1025 1030

<210> 27 <211> 3042 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 180 <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 27 atttcttgtg accctcctcc tgaagtcaaa aatgctcgga aaccctatta ttctcttccc 60 atagttcctg gaactgttct gaggtacact tgttcaccta gctaccgcct cattggagaa 120 aaggctatct tttgtataag tgaaaatcaa gtgcatgcca cctgggataa agctcctcct 180 atatgtgaat ctgtgaataa aaccatttct tgctcagatc ccatagtacc agggggattc 240 atgaataaag gatctaaggc accattcaga catggtgatt ctgtgacatt tacctgtaaa 300 gccaacttca ccatgaaagg aagcaaaact gtctggtgcc aggcaaatga aatgtgggga 360 ccaacagctc tgccagtctg tgagagtgat ttccctctgg agtgcccatc acttccaacg 420 attcataatg gacaccacac aggacagcat gttgaccagt ttgttgctgg gttgtctgtg 480 acatacagtt gtgaacctgg ctatttgctc actggaaaaa agacaattaa gtgcttatct 540 tcaggagact gggatggtgt catcccgaca tgcaaagagg cccagtgtga acatccagga 600 aagtttccca atgggcaggt aaaggaacct ctgagccttc aggttggcac aactgtgtac 660 ttctcctgta atgaagggta ccaattacaa ggacaaccct ctagtcagtg tgtaattgtt 720 gaacagaaag ccatctggac taagaagcca gtatgtaaag aaattctctg cccaccacct 780 ccacctgttc gtaatggaag tcatacaggc agcttttcag aaaatgtacc atatggaagc 840 acagttacct acacctgtga cccaagccca gagaaaggcg tgagcttcac tcttattgga 900 gagaagacta tcaattgtac tactggtagt cagaagactg ggatctggag tggccctgct 960 ccatattgtg tactttcaac ttctgcagtt ctgtgtttac aaccgaagat caaaagaggg 1020 caaatattat ctattttgaa agatagttat tcatataatg acactgtggc attttcfctgt 1080 gaacctggct tcaccttgaa gggcaacagg agcattcgat gcaatgctca tggcacatgg 1140 gagccaccgg taccagtgtg tgaaaaagga tgtcaggctc ctcctaaaat tatcaatggg 1200 caaaaagaag atagttactt gctcaacttt gaccctggta catccataag atatagctgt 1260 gaccctggct atttactggt gggagaggac actatacatt gcacccctga ggggaagtgg 1320 acacccatta ctccccagtg cacagttgca gagtgtaagc cagtaggacc acatctcttt 1380 aagaggcctc agaatcagtt tattaggaca gctgttaatt cttcttgtga tgaagggttc 1440 cagttaagtg agagtgctta tcaactgtgt caaggtacaa ttccttggtt tatagaaatc 1500 cgtctttgta aagaaatcac ctgcccacca cctcctgtta tacacaacgg gacacataca 1560 tggagttcct cagaagatgt cccatatgga actgtggtca catacatgtg ctatcctggg 1620 ccagaggaag gcgtaaaatt caaactcatc ggggagcaaa ccatccactg tacaagtgac 1680 agcagaggaa gaggctcctg gagtagccct gctcctctct gtaaactttc cctcccagct 1740 gtccagtgca cagacgttca tgttgaaaat ggagtcaagc tcactgacaa taaagcccca 1800 tatttctaca atgatagtgt gatgttcaag tgtgatgatg gatatatttt gagtggaagc 1860 agtcagatcc ggtgtaaagc caataatacc tgggatcctg aaaaaccact ttgtaaaaaa 1920 gaaggatgtg agcctatgag agtacatggc cttccagatg attcacatat aaaactagtg 1980 aaaagaacct gtcaaaatgg gtaccagttg actggatata cttatgagaa gtgtcaaaat 2040 gctgagaatg ggacttggtt taaaaagatt gaagtttgta cagttattct ctgtcaacct 2100 ccaccaaaaa ttgcaaatgg tggtcacaca ggcatgatgg caaagcactt cctatatgga 2160 aatgaagttt cttatgaatg tgatgaaggg ttctatcttt tgggagagaa aagtttgcag 2220 tgcgtaaatg attctaaagg tcatggctct tggagtggac ctccaccaca atgcttacaa 2280 tcttctcctc taactcattg ccccgatcca gaagtcaaac atggttacaa actcaataaa 2340 actcattctg cattttctca taatgacata gtacattttg tctgcaatca aggcttcatc 2400 atgaacggca gccacttgat aaggtgtcat actaataaca catggttacc aggtgtacca 2460 acttgtatca gaaaggcttc tttagggtgt cagtctccat ccacaatccc caatgggaat 2520 catactggtg ggagtatagc tcgatttccc cctggaatgt cagtcatgta cagttgctac 2580 caaggcttcc ttatggctgg agaggcacgt cttatctgta ctcatgaggg tacctggagt 2640 caacctcccc ctttttgcaa agaggtaaac tgtagcttcc ctgaagatac aaatggaatc 2700 cagaagggat ttcaacctgg gaaaacctat cgatttgggg ctactgtgac tctggaatgt 2760 gaggatgggt ataccttgga gggaagtccc cagagccagt gccaggatga cagccaatgg 2820 aaccctccct tggctctttg caaataccgt aggtggtcaa ctattcctct tatttgtggt 2880 atttctgtgg gctcagcact tatcattttg atgagtgtcg gcttctgtat gatattaaaa 2940 cacagagaaa gcaattatta tacaaagaca agacccaaag aaggagctct tcatttagaa 3000 acacgagaag tatattctat tgatccatat aacccagcaa gc 3042 181 <210> 28 <211> 1014 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <4 0 0> 28 Ile Ser Cys Asp Pro Pro Pro Glu 1 5 Vai Lys Asn Ala Arg 10 Lys Pro Tyr 15

Tyr Ser Leu Pro Ile Vai Pro Gly Thr Vai Leu Arg Tyr Thr Cys Ser 20 25 30 182

Pro Ser Tyr Arg Leu Ile Gly Glu Lys Ala Ile Phe Cys Ile Ser Glu 35 40 45 Asn Gin Vai His Ala Thr Trp Asp Lys Ala Pro Pro Ile Cys Glu Ser 50 55 60 Vai Asn Lys Thr Ile Ser Cys Ser Asp Pro Ile Vai Pro Gly Gly Phe 65 70 75 80 Met Asn Lys Gly Ser Lys Ala Pro Phe Arg His Gly Asp Ser Vai Thr 85 90 95 Phe Thr Cys Lys Ala Asn Phe Thr Met Lys Gly Ser Lys Thr Vai Trp 100 105 110 Cys Gin Ala Asn Glu Met Trp Gly Pro Thr Ala Leu Pro Vai Cys Glu 115 120 125 Ser Asp Phe Pro Leu Glu Cys Pro Ser Leu Pro Thr Ile His Asn Gly 130 135 140 His His Thr Gly Gin His Vai Asp Gin Phe Vai Ala Gly Leu Ser Vai 145 150 155 160 Thr Tyr Ser Cys Glu Pro Gly Tyr Leu Leu Thr Gly Lys Lys Thr Ile 165 170 175 Lys Cys Leu Ser Ser Gly Asp Trp Asp Gly Vai Ile Pro Thr Cys Lys 180 185 190 Glu Ala Gin Cys Glu His Pro Gly Lys Phe Pro Asn Gly Gin Vai Lys 195 200 205 Glu Pro Leu Ser Leu Gin Vai Gly Thr Thr Vai Tyr Phe Ser Cys Asn 210 215 220 Glu Gly Tyr Gin Leu Gin Gly Gin Pro Ser Ser Gin Cys Vai Ile Vai 225 230 235 240 Glu Gin Lys Ala Ile Trp Thr Lys Lys Pro Vai Cys Lys Glu Ile Leu 245 250 255 Cys Pro Pro Pro Pro Pro Vai Arg Asn Gly Ser His Thr Gly Ser Phe 260 265 270 Ser Glu Asn Vai Pro Tyr Gly Ser Thr Vai Thr Tyr Thr Cys Asp Pro 275 280 285 Ser Pro Glu Lys Gly Vai Ser Phe Thr Leu Ile Gly Glu Lys Thr Ile 290 295 300 Asn Cys Thr Thr Gly Ser Gin Lys Thr Gly Ile Trp Ser Gly Pro Ala 305 310 315 320 Pro Tyr Cys Vai Leu Ser Thr Ser Ala Vai Leu Cys Leu Gin Pro Lys 325 330 335 Ile Lys Arg Gly Gin Ile Leu Ser Ile Leu Lys Asp Ser Tyr Ser Tyr 340 345 350 Asn Asp Thr Vai Ala Phe Ser Cys Glu Pro Gly Phe Thr Leu Lys Gly 355 360 365 Asn Arg Ser Ile Arg Cys Asn Ala His Gly Thr Trp Glu Pro Pro Vai 370 3 75 380 Pro Vai Cys Glu Lys Gly Cys Gin Ala Pro Pro Lys Ile Ile Asn Gly 385 390 395 400 Gin Lys Glu Asp Ser Tyr Leu Leu Asn Phe Asp Pro Gly Thr Ser Ile 405 410 415 Arg Tyr Ser Cys Asp Pro Gly Tyr Leu Leu Vai Gly Glu Asp Thr Ile 420 425 430 His Cys Thr Pro Glu Gly Lys Trp Thr Pro Ile Thr Pro Gin Cys Thr 435 440 445 Vai Ala Glu Cys Lys Pro Vai Gly Pro His Leu Phe Lys Arg Pro Gin 450 455 460 Asn Gin Phe Ile Arg Thr Ala Vai Asn Ser Ser Cys Asp Glu Gly Phe 465 470 475 480 Gin Leu Ser Glu Ser Ala Tyr Gin Leu Cys Gin Gly Thr Ile Pro Trp 485 490 495 Phe Ile Glu Ile Arg Leu Cys Lys Glu Ile Thr Cys Pro Pro Pro Pro 500 505 510 183

Vai Ile His 515 Asn Gly Thr His Thr 520 Tyr Gly 530 Thr Vai Vai Thr Tyr 535 Met Vai 545 Lys Phe Lys Leu Ile 550 Gly Glu Ser Arg Gly Arg Gly 565 Ser Trp Ser Ser Leu Pro Ala 580 Vai Gin Cys Thr Lys Leu Thr 595 Asp Asn Lys Ala Pro 600 Phe Lys 610 Cys Asp Asp Gly Tyr 615 Ile Cys 625 Lys Ala Asn Asn Thr 630 Trp Asp Glu Gly Cys Glu Pro 645 Met Arg Vai Ile Lys Leu Vai 660 Lys Arg Thr Cys Tyr Thr Tyr 675 Glu Lys Cys Gin Asn 680 Lys Ile 690 Glu Vai Cys Thr Vai 695 Ile Ala 705 Asn Gly Gly His Thr 710 Gly Met Asn Glu Vai Ser Tyr 725 Glu Cys Asp Lys Ser Leu Gin 740 Cys Vai Asn Asp Gly Pro Pro 755 Pro Gin Cys Leu Gin 760 Asp Pro 770 Glu Vai Lys His Gly 775 Tyr Phe 785 Ser His Asn Asp Ile 790 Vai His Met Asn Gly Ser His 805 Leu Ile Arg Pro Gly Vai Pro 820 Thr Cys Ile Arg Pro Ser Thr. 835 Ile Pro Asn Gly Asn 840 Phe Pro 850 Pro Gly Met Ser Vai 855 Met Met 865 Ala Gly Glu Ala Arg 870 Leu Ile Gin Pro Pro Pro Phe 885 Cys Lys Glu Thr Asn Gly Ile 900 Gin Lys Gly Phe Gly Ala Thr 915 Vai Thr Leu Glu Cys 920 Ser Pro 93 0 Gin Ser Gin Cys Gin 935 Asp Ala 945 Leu Cys Lys Tyr Arg 950 Arg Trp Ile Ser Vai Gly Ser 965 Ala Leu Ile Met Ile Leu Lys 980 His Arg Glu Ser

Trp Ser Ser Ser Glu 525 Asp Vai Pro Cys Tyr Pro Gly 540 Pro Glu Glu Gly Gin Thr Ile 555 His Cys Thr Ser Asp 560 Ser Pro 570 Ala Pro Leu Cys Lys 575 Leu Asp 585 Vai His Vai Glu Asn 590 Gly Vai Tyr Phe Tyr Asn Asp 605 Ser Vai Met Leu Ser Gly Ser 620 Ser Gin Ile Arg Pro Glu Lys 635 Pro Leu Cys Lys Lys 640 His Gly 650 Leu Pro Asp Asp ser 655 His Gin 665 Asn Gly Tyr Gin Leu 670 Thr Gly Ala Glu Asn Gly Thr 685 Trp Phe Lys Leu Cys Gin Pro 700 Pro Pro Lys Ile Met Ala Lys 715 His Phe Leu Tyr Gly 720 Glu Gly 730 Phe Tyr Leu Leu Gly 735 Glu Ser 745 Lys Gly His Gly Ser 750 Trp Ser Ser Ser Pro Leu Thr 765 HÍS Cys Pro Lys Leu Asn Lys 780 Thr His Ser Ala Phe Vai Cys 795 Asn Gin Gly Phe Ile 800 Cys His 810 Thr Asn Asn Thr Trp 815 Leu Lys 825 Ala Ser Leu Gly Cys 830 Gin Ser His Thr Gly Gly Ser 845 Ile Ala Arg Tyr Ser Cys Tyr 860 Gin Gly Phe Leu Cys Thr His 875 Glu Gly Thr Trp Ser 880 Vai Asn 890 cys Ser Phe Pro Glu 895 Asp Gin 905 Pro Gly Lys Thr Tyr 910 Arg Phe Glu Asp Gly Tyr Thr 925 Leu Glu Gly Asp Ser Gin Trp 940 Asn Pro Pro Leu Ser Thr Ile 955 Pro Leu Ile Cys Gly 960 Ile Leu 970 Met Ser Vai Gly Phe 975 Cys Asn 985 Tyr Tyr Thr Lys Thr 990 Arg Pro 184

Lys Glu Gly Ala Leu His Leu Glu Thr Arg Glu Vai Tyr Ser Ile Asp 995 1000 1005

Pro Tyr Asn Pro Ala Ser 1010

<210> 29 <211> 1033 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial:/nota = construção sintética <400> 29 185

Met 1 Gly Ala Ala Gly 5 Leu Leu Gly Gly Vai Leu Gly 20 Ile Ser Cys Gly Arg Ile Ser 35 Tyr Tyr Ser Thr Pro 40 Tyr Ser 50 Cys Ser Gly Thr Phe 55 Arg Cys 65 Ile Thr Lys Asp Lys 70 Vai Asp Lys Cys Glu Tyr Phe 85 Asn Lys Tyr Pro Gly Gly Tyr 100 Lys Ile Arg Gly Ser Vai Thr 115 Phe Ala Cys Lys Thr 12 0 Ser Vai 13 0 Trp Cys Gin Ala Asn 135 Asn Thr 145 Cys Vai Ser Vai Phe 150 Pro Leu His Asn Gly His His 165 Thr Ser Glu Leu Ser Vai Thr 180 Tyr Ser Cys Glu Lys Ile Ile 195 Asn Cys Leu Ser Ser 200 Thr Cys 210 Glu Glu Ala Arg Cys 215 Lys Lys 225 Vai Lys Glu Pro Pro 230 Ile Leu Phe Cys Asp Glu Gly 245 Tyr Arg Leu Vai Ile Ala Gly 260 Gin Gly Vai Ala Glu Ile Phe 275 Cys Pro Ser Pro Pro 280 Gly Asn 290 Ser Leu Ala Asn Val 295 Ser Cys 305 Asp Pro Asp Pro Glu 310 Glu Gly Ser Thr Leu Arg Cys 325 Thr Val Asp Gly Pro Ala Pro 340 Arg Cys Glu Leu

Val Phe 10 Leu Ala Leu Val Ala 15 Pro Ser 25 Pro Pro Pro Val Leu 30 Asn Gly Ile Ala Val Gly Thr 45 Val Ile Arg Leu Ile Gly Glu 60 Lys Ser Leu Leu Gly Thr Trp 75 Asp Lys Pro Ala Pro 80 Ser Ser 90 Cys Pro Glu Pro Ile 95 Val Ser 105 Thr Pro Tyr Arg His 110 Gly Asp Asn Phe Ser Met Asn 125 Gly Asn Lys Met Trp Gly Pro 140 Thr Arg Leu Pro Glu Cys Pro 155 Ala Leu Pro Met Ile 160 Asn Val 170 Gly Ser Ile Ala Pro 175 Gly Ser 185 Gly Tyr Leu Leu Val 190 Gly Glu Gly Lys Trp Ser Ala 205 Val Pro Pro Ser Leu Gly Arg 220 Phe Pro Asn Gly Arg Val Gly 235 Val Thr Ala Asn Phe 240 Gin Gly 250 Pro Pro Ser Ser Arg 255 Cys Trp 265 Thr Lys Met Pro Val 270 Cys Glu Pro Ile Leu Asn Gly 285 Arg His Ile Tyr Gly Ser Ile 300 Val Thr Tyr Thr Val Asn Phe 315 Ile Leu Ile Gly Glu 320 Ser Gin 330 Lys Thr Gly Thr Trp 335 Ser Ser 345 Thr Ser Ala Val Gin 350 Cys Pro 186

His Pro Gin Ile Leu Arg Gly Arg Met Val Ser Gly Gin Lys Asp Arg 355 360 365 Tyr Thr Tyr Asn Asp Thr Val Ile Phe Ala Cys Met Phe Gly Phe Thr 370 375 380 Leu Lys Gly Ser Lys Gin Ile Arg Cys Asn Ala Gin Gly Thr Trp Glu 385 390 395 400 Pro Ser Ala Pro Val Cys Glu Lys Glu Cys Gin Ala Pro Pro Asn Ile 405 410 415 Leu Asn Gly Gin Lys Glu Asp Arg His Met Val Arg Phe Asp Pro Gly 420 425 430 Thr Ser Ile Lys Tyr Ser Cys Asn Pro Gly Tyr Val Leu val Gly Glu 435 440 445 Glu Ser Ile Gin Cys Thr Ser Glu Gly Val Trp Thr Pro Pro Val Pro 450 455 460 Gin Cys Lys Vai Ala Ala Cys Glu Ala Thr Gly Arg Gin Leu Leu Thr 465 470 475 480 Lys Pro Gin His Gin Phe Val Arg Pro Asp Val Asn Ser Ser Cys Gly 485 490 495 Glu Gly Tyr Lys Leu Ser Gly Ser Val Tyr Gin Glu Cys Gin Gly Thr 500 505 510 Ile Pro Trp Phe Met Glu Ile Arg Leu Cys Lys Glu Ile Thr Cys Pro 515 ' 520 525 Pro Pro Pro val Ile Tyr Asn Gly Ala His Thr Gly Ser Ser Leu Glu 530 535 540 Asp Phe Pro Tyr Gly Thr Thr Val Thr Tyr Thr Cys Asn Pro Gly Pro 545 550 • 555 560 Glu Arg Gly Val Glu Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Arg Cys 565 570 575 Thr Ser Asn Asp Gin Glu Arg Gly Thr Trp Ser Gly Pro Ala Pro Leu 580 585 590 Cys Lys Leu Ser Leu Leu Ala Val Gin Cys Ser His Val His Ile Ala 595 600 605 Asn Gly Tyr Lys Ile Ser Gly Lys Glu Ala Pro Tyr Phe Tyr Asn Asp 610 615 620 Thr Vai Thr Phe Lys Cys Tyr Ser Gly Phe Thr Leu Lys Gly Ser Ser 625 630 635 640 Gin Ile Arg Cys Lys Ala Asp Asn Thr Trp Asp Pro Glu Ile Pro Val 645 650 655 Cys Glu Lys Glu Thr Cys Gin His Val Arg Gin Ser Leu Gin Glu Leu 6 60 665 670 Pro Ala Gly Ser Arg Val Glu Leu Val Asn Thr Ser Cys Gin Asp Gly 675 680 685 Tyr Gin Leu Thr Gly His Ala Tyr Gin Met Cys Gin Asp Ala Glu Asn 690 695 700 Gly Ile Trp Phe Lys Lys Ile Pro Leu Cys Lys Val Ile His Cys His 705 710 715 720 Pro Pro Pro Val Ile Val Asn Gly Lys His Thr Gly Met Met Ala Glu 725 730 735 Asn Phe Leu Tyr Gly Asn Glu Val Ser Tyr Glu Cys Asp Gin Gly Phe 740 745 750 Tyr Leu Leu Gly Glu Lys Lys Leu Gin Cys Arg Ser Asp Ser Lys Gly 755 760 765 His Gly Ser Trp Ser Gly Pro Ser Pro Gin Cys Leu Arg Ser Pro Pro 770 775 780 Vai Thr Arg Cys Pro Asn Pro Glu Val Lys His Gly Tyr Lys Leu Asn 785 790 795 800 Lys Thr His Ser Ala Tyr Ser His Asn Asp Ile Val Tyr Val Asp Cys 805 810 815 Asn Pro Gly Phe Ile Met Asn Gly Ser Arg Val Ile Arg Cys His Thr 820 825 830 187

Asp Asn Thr Trp Vai Pro Gly Vai Pro Thr Cys Met Lys Lys Ala Phe 835 840 845 Ile Gly Cys Pro Pro Pro Pro Lys Thr Pro Asn Gly Asn His Thr Gly 850 855 860 Gly Asn Ile Ala Arg Phe Ser- Pro Gly Met Ser Ile Leu Tyr Ser Cys 865 870 875 880 Asp Gin Gly Tyr Leu Leu Vai Gly Glu Ala Leu Leu Leu Cys Thr His 885 890 895 Glu Gly Thr Trp Ser Gin Pro Ala Pro His Cys Lys Glu Vai Asn Cys 900 905 910 Ser Ser Pro Ala Asp Met Asp Gly Ile Gin Lys Gly Leu Glu Pro Arg 915 920 925 Lys Met Tyr Gin Tyr Gly Ala Vai Vai Thr Leu Glu Cys Glu Asp Gly 930 935 940 Tyr Met Leu Glu Gly Ser Pro Gin Ser Gin Cys Gin Ser Asp His Gin 945 950 955 960 Trp Asn Pro Pro Leu Ala Vai Cys Arg Ser Arg Ser Leu Ala Pro Vai 965 970 975 Leu Cys Gly Ile Ala Ala Gly Leu Ile Leu Leu Thr Phe Leu Ile Vai 980 985 990 Ile Thr Leu Tyr Vai Ile Ser Lys His Arg Glu Arg Asn Tyr Tyr Thr 995 1000 1005 Asp Thr Ser Gin Lys Glu Ala Phe His Leu Glu Ala Arg Glu Vai Tyr 1010 1015 1020 Ser Vai Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ser 1025 1030

Lisboa, 25 de Outubro de 2012

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição compreendendo uma construção, em que a construção compreende: (a) um RC2 ou um seu fragmento, em que o fragmento contém pelo menos os dois primeiros domínios das repetições de consenso pequenas (RCP) N-terminal; e (b) um modulador da atividade do complemento, em que o modulador da atividade do complemento compreende um inibidor do complemento ou um seu fragmento, em que o dito inibidor do complemento é selecionado do fator de aceleração do decaimento (FAD) , CD59 humana, CD59 de camundongo, Ycrr, proteína de cofator de membrana (PCM), recetor do complemento 1 (RC1) e um anticorpo anti-C5, em que o seu fragmento compreende RCPs 1-4 de FAD, RCPs 2-4 de FAD, CD59 humana solúvel sem a sua âncora glicofosfatidilinositol, CD59 de camundongo solúvel sem a sua âncora glicofosfatidilinositol, RPCs 1-5 de Ycrr, RCPs 1-4 de PCM, RCPs 1-4 de RC1, RCPs 8-11 de RC1, RCPs 15-18 de RC1 ou o local de ligação Clq de RC1.

2. A composição da reivindicação 1, em que o RC2 ou o seu fragmento compreende os quatro domínios RCP N-terminal da proteína RC2.

3. A composição da reivindicação 1 ou 2, em que o RC2 compreende uma proteína RC2 de comprimento total.

4. A composição de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a construção é uma proteína de fusão. 2

5. A composição da reivindicação 4, em que o RC2 ou o seu fragmento é fundido ao N-terminal ou C-terminal do inibidor do complemento ou do seu fragmento.

6. A composição de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a composição compreende SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 14.

7. A composição da reivindicação 1, em que o inibidor do complemento ou o seu fragmento é CD5 9 de murino, CD5 9 de murino sem a sua âncora glicofosfatidilinositol, CD59 de humano sem a sua âncora glicofosfatidilinositol ou CD59 de humano.

8. A composição de qualquer uma das reivindicações precedentes para uso num método de tratamento de uma condição afetada pelo complemento.

9. A composição de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 para uso num método de tratamento de uma infeção virai, uma infeção fúngica ou uma condição inflamatória.

10. A composição da reivindicação 9, em que a condição inflamatória é acidente vascular cerebral ou lesão de isquemia-reperfusão.

11. Uma sequência de nucleótidos codificando a proteina de fusão da reivindicação 4. Lisboa, 25 de Outubro de 2012