PT1207905E

PT1207905E - Métodos e composições para o tratamento de doença inflamatória utilizando agentes moduladores da caderina-11

Info

Publication number: PT1207905E
Application number: PT00964937T
Authority: PT
Inventors: Michael B Brenner; Xavier Valencia
Original assignee: Brigham & Womens Hospital
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2010-12-07
Also published as: EP1207905A1; DK1207905T3; ES2592507T3; EP2267029A2; WO2001017557A1; CA2384115C; ATE479441T1; EP2267029A3; DE60044904D1; EP2267029B1; WO2001017557A9; AU7574700A; CA2384115A1; EP1207905B1

Description

1

DESCRIÇÃO "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO DE DOENÇA INFLAMATÓRIA UTILIZANDO AGENTES MODULADORES DA CADERINA-11"

Domínio da Invenção

Esta invenção refere-se a métodos e composições para o tratamento de perturbações inflamatórias das articulações, como as que invocam hiperplasia sinovial e superprodução de factores biologicamente activos. Os métodos envolvem administrar a um sujeito um agente modulador da caderina-11 para modular a função da caderina-11 em áreas de lesões nas articulações. Também são proporcionados ensaios de rastreio para a identificação de agentes moduladores da caderina-11.

Contexto da Invenção

Crê-se que as interacções adesivas entre células e entre células e a matriz extracelular desempenham papéis críticos numa grande variedade de processos, incluindo, por exemplo, modulação do sistema imunológico, regulação de processos do desenvolvimento e progressão tumoral e metástases. Estas interacções são mediadas por moléculas de adesão que efectuam transdução de informação da matriz extracelular para a intracelular.

Agentes moduladores que intensificam ou inibem a adesão celular mediada por ocludinas foram relatados em WO 99/35166.

Foram identificadas quatro famílias de moléculas de adesão que medeiam estas interacções: as integrinas, as caderinas, 2 as selectinas e moléculas relacionadas com imunoglobulinas. Em geral, as moléculas de adesão são proteínas transmembranares que contêm um domínio extracelular para interacção com uma matriz extracelular ou componente celular, um domínio transmembranar abrangendo a membrana celular e um domínio citoplasmático para interacção com um ou mais componentes citoesqueléticos ou citoplasmáticos.

As caderinas desempenham um papel importante no estabelecimento e manutenção de conexões intercelulares entre células do mesmo tipo (revisto em Geiger B. et al. (1992) Annual Review of Cell Biology 8: 307; Kemler R. (1993) Trends in Gastroenterology 9: 317; Takeichi M. (1990) Annual Review of Biochem. 59: 237; Takeichi M. (1991) Science 251: 1451). As caderinas constituem uma superfamília de moléculas estruturalmente relacionadas com função na adesão homofílica dependente de Ca+2. As caderinas são expressas em células que formam tecidos sólidos e são responsáveis pela segregação e saída de células durante a embriogénese, estabelecimento da polaridade celular e manutenção da morfologia tecidual. Estruturalmente, as caderinas são polipéptidos de cadeia simples que são sintetizados como precursores e clivados durante o processamento pós-tradução. Têm grandes regiões extracelulares constituídas por 5 domínios homólogos, um único segmento transmembranar e uma cauda citoplasmática.

As caderinas são sintetizadas como precursores que são clivados durante o processamento pós-tradução. As caderinas maduras são moléculas de cadeia simples que incluem um dominio extracelular relativamente grande (tipicamente dividido em cinco secções ou "ectodomínios"), uma única região transmembranar e uma cauda citoplasmática. Entre as 3 caderinas clássicas (isto é, P-(placenta), E-(epitelial) e N-(neural) caderinas), o domínio citoplasmático contém o grau mais elevado de homologia. É relatado que o elevado grau de homologia observado para o domínio citoplasmático é um reflexo da associação de caderinas a um grupo de proteínas intracelulares, denominadas cateninas, que estabilizam a conformação activa das caderinas (Kemler R. (1993) Trends in Gastroenterology 9_: 317) . Em geral, crê-se que sequências no domínio extracelular são necessárias para mediar a ligação homofílica (isto é, caderina-caderina) . Uma revisão da literatura indica que a investigação dirigida à compreensão da adesão mediada por caderinas tem centrado esforços na elucidação do mecanismo subjacente à adesão celular homofílica mediada por caderinas. Pouca atenção tem sido dirigida à compreensão de qual o papel, se existir, desempenhado por caderinas na adesão heterofílica. Não obstante ser conhecido, desde há algum tempo, que integrinas e outras moléculas de adesão funcionam na modulação do sistema imunológico, por exemplo, desempenhando um papel na adesão de linfócitos periféricos ao endotélio e endereçamento para nodos linfáticos, sabe-se relativamente pouco sobre o mecanismo pelo qual linfócitos são endereçados e transmigram através do endotélio vascular para abordar de modo específico certas localizações teciduais, como a sinóvia. A sequência mais altamente conservada partilhada por caderinas situa-se no domínio citoplasmático. É esta região que medeia a interacção com as proteínas cateninas citoplasmáticas (Hirano S. et al. Cell 7£: 293-301, 1992). A presença do domínio citoplasmático é essencial para o funcionamento da caderina, pois deleções nesta região abolem a ligação de cateninas e a adesão célula-célula 4 (Hulsken J, et al. J Cell Biol 127: 1375-80, 1994). As cateninas (a, 102 kDa; β, 88-93 kDa, e γ, 80-83 kDa) começam a associar-se a caderinas quase imediatamente por biossintese de um modo estável que não é terminado em detergente TX-100 (Takeichi M. Curr Opin Cell Biol T_: 619-27, 1995) e pensa-se que medeiam a ancoragem de caderinas ao citoesqueleto (Yap AS. et al. Annu Rev Cell Dev Biol 13: 11946-1997). Funcionalmente, a α-catenina é necessária para a adesão homofilica mediada por caderinas. Células tumorais que expressam E-caderina na superfície celular mas estão desprovidas de expressão de α-catenina não conseguem formar contactos célula-célula a menos que a expressão de a-catenina seja restabelecida por transfecção (Chen H. et al. J Cell Sei 1141345-56, 1997, e Knudsen KA. et al. J Cell Biol 130: 67-77, 1995). A β-catenina é homóloga à proteína de polaridade segmentar de Drosophila Armadillo, bem como a proteína associada a caderinas placoglobina. A placoglobina, também denominada γ-catenina, interage mais fracamente com o complexo caderina/catenina e nem sempre é observada em precipitados de caderina.

Alguns clones de cDNA de caderinas identificados de novo têm sido isolados utilizando oligonucleótidos de consenso, correspondentes a sequências de domínios citoplasmáticos que estão altamente conservadas em caderinas, e clonagem por PCR (Suzuki S. et al. Cell Reg 2: 261-70, 1991).

Apesar de a função das caderinas envolver classicamente adesão homofilica célula-célula (isto é, E-caderina liga-se a E-caderina tipicamente noutra célula do mesmo tipo), a E-caderina murina expressa em queratinócitos epidérmicos também medeia a adesão a E-caderina de células de Langerhans (Tang A. et al. Nature 361: 82-5, 1993). 5

Recentemente identificámos outro contra-receptor para a E-caderina, nomeadamente a integrina αΕβ7 que é expressa em células T intra-epiteliais (Cepek KL. et al. Nature 372: 190-3, 1994, e Patente U.S. N° 5,610,281). Isto representa um exemplo da ligação heterofílica da E-caderina ao contra-receptor integrina αΕβ7. A artrite reumatóide (AR) é uma doença autoimune sistémica crónica de etiologia desconhecida que afecta 1-2% da população. É dominada por destruição articular progressiva que pode originar incapacidade acentuada. Histologicamente, as articulações revelam hiperplasia sinovial principalmente de sinoviócitos do tipo A, mas também de sinoviócitos do tipo B, infiltração linfocelular de células T e B e neovascularização. Estes processos conduzem à secreção de factores destrutivos e crescimento invasivo da membrana sinovial (pannus) na cartilagem e osso adjacentes, com destruição consequente da articulação.

Resumo da Invenção A invenção baseia-se, em parte, na descoberta de mRNA da caderina-11 e expressão proteica em células, nomeadamente sinoviócitos do tipo B humanos, recuperadas da sinóvia de pacientes com perturbações inflamatórias das articulações. Antes da presente descoberta, a expressão da caderina-11 não tinha sido relatada na sinóvia. Apesar de não ser pretendido ficar restringido por qualquer teoria particular, é postulado que a expressão de caderina-11 em células da sinóvia está envolvida no endereçamento, retenção e activação de células (como células T e B) nesta área. Adicionalmente, também é postulado que a adesão mediada pela caderina-11 medeia a invasão da sinóvia em 6 cartilagem e osso durante algumas perturbações inflamatórias das articulações. 0 contacto sinoviócito-sinoviócito também pode estar envolvido nalgumas destas perturbações. A adesão mediada pela caderina-11 pode ser caracterizada como homofílica (ligação de caderina-11 a caderina-11) ou heterofilica (ligação de caderina-11 a um contra-receptor que não é caderina-11). Em conformidade, algumas das composições e métodos da presente invenção são dirigidos à inibição da adesão mediada pela caderina-11 que ocorre entre estes e outros tipos de células. Ainda outros métodos e composições proporcionados pela invenção envolvem a modulação de funções celulares que são mediadas pela caderina-11, tais como, por exemplo, sinalização celular, proliferação, apoptose e secreção de factores. A presente invenção proporciona a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor da caderina-11 que inibe a ligação de caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11 que é caderina-11, na preparação de um medicamento para o tratamento de um sujeito com uma perturbação inflamatória das articulações, em que o agente inibidor da caderina-11 é um anticorpo ou seu fragmento, um polipéptido da caderina-11 ou seu fragmento ou uma proteína de fusão com Fc compreendendo um domínio extracelular da caderina-11, em que o agente inibidor da caderina-11 se liga selectivamente à caderina-11.

Também é descrito aqui um método de tratamento de um sujeito com uma perturbação inflamatória das articulações. 0 método envolve administrar a um sujeito necessitado desse tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente modulador da caderina-11. Um agente modulador da caderina-11 é um agente que modula (por exemplo, 7 intensifica, inibe, altera, etc.) uma função da caderina-11. Numa forma de realização particular, o agente modulador da caderina-11 é um agente inibidor da caderina-11. Um agente inibidor da caderina-11 é um agente que inibe a ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11. Em formas de realização preferidas, o sujeito é um humano. Em formas de realização mais preferidas, o sujeito não sofre de uma adesão anormal mediada pela caderina-11 ocorrendo no figado ou no cérebro. A adesão mediada pela caderina-11 é a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor .

Numa forma de realização, a perturbação inflamatória das articulações consiste em sinovite crónica. Noutra forma de realização, a perturbação inflamatória das articulações é uma doença autoimune. Numa forma de realização preferida, a doença autoimune é artrite reumatóide. 0 agente inibidor da caderina-11 pode ser administrado sistemicamente. Em formas de realização preferidas, o agente inibidor da caderina-11 é administrado localmente numa sinóvia ou no fluido sinovial de um sujeito. 0 agente inibidor da caderina-11 pode inibir a ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11 de alguns modos. Numa forma de realização, o agente inibidor da caderina-11 liga-se selectivamente à caderina-11; noutra forma de realização, o agente inibidor da caderina-11 liga-se selectivamente a um contra-receptor da caderina-11. Agentes inibidores exemplificativos são descritos na descrição pormenorizada. Em todas estas formas de realização, a função do agente inibidor da caderina-11 é inibir a adesão mediada pela caderina-11. 8 A caderina-11 e o contra-receptor da caderina-11 podem ser expressos pelo mesmo tipo ou diferentes tipos de células. Não é necessário que o contra-receptor da caderina-11 esteja numa superfície celular, mas sim que faça parte de um material intersticial ou que possa ser um material segregado que se liga a qualquer outra molécula ou superfície. Como exemplo da última forma de realização, o contra-receptor da caderina-11 é um componente de uma matriz extracelular de um tecido, uma cartilagem ou um osso. O contra-receptor da caderina-11 também pode ser uma molécula segregada por uma célula. Em certas formas de realização, a caderina-11 é expressa por uma célula e o contra-receptor da caderina-11 é expresso por outra célula distinta. Células que expressam a caderina-11 podem ser seleccionadas do grupo que consiste num sinoviócito do tipo A ou tipo B, um fibroblasto sinovial, uma célula de revestimento da membrana sinovial, um osteoblasto, uma célula derivada de cartilagem e uma célula derivada de pannus invasivo. Células que expressam contra-receptores da caderina-11 podem ser seleccionadas do grupo que consiste num linfócito T, um linfócito B, uma célula plasmática, um macrófago, uma célula dendrítica, uma célula assassina natural (NK), um mastócito, um sinoviócito do tipo A ou do tipo B, um fibroblasto sinovial, um osteoblasto, uma célula derivada de cartilagem, uma célula de revestimento da membrana sinovial e uma célula derivada de pannus invasivo.

Nalgumas formas de realização, os agentes moduladores da caderina-11, tais como, por exemplo, os agentes inibidores da caderina-11, não são anticorpos, como por exemplo anticorpos monoclonais. Nalgumas formas de realização, os agentes descritos aqui não incluem os anticorpos divulgados 9 na Patente U.S. 5,597,725 e no requerimento PCT PCT/US93/ 03691 (WO/93/21302). Assim, em certas formas de realização relacionadas, os agentes descritos aqui não abrangem os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas designados 30Q8A (HB11316), 30Q4H (HB11317), 45A5G (HB 11318), 30S2F (HB11319), 45C6A (HB 11320), 30T11G (HB 11324) , 64G11F (HB 11527) .

Também é descrito aqui um método de rastreio de uma biblioteca molecular para identificar um agente (por exemplo, um composto protótipo farmacêutico) que modula a adesão mediada pela caderina-11 entre uma primeira célula que expressa a caderina-11 e uma segunda célula que expressa um contra-receptor da caderina-11. O agente pode inibir a adesão mediada pela caderina-11, em cujo caso é um agente inibidor da caderina-11. O método envolve efectuar um primeiro ensaio de adesão entre a primeira célula e a segunda célula, para obter um primeiro resultado do ensaio de adesão, efectuar um segundo ensaio de adesão entre a primeira célula e a segunda célula na presença de pelo menos um membro da biblioteca molecular, para obter um segundo resultado do ensaio de adesão, e comparar o primeiro e o segundo resultados dos ensaios de adesão para determinar se o pelo menos um membro da biblioteca molecular modula a adesão mediada pela caderina-11 entre a primeira célula e a segunda célula. Os tipos de células, moléculas de caderina e agentes inibidores são como descritos acima e na descrição pormenorizada.

De acordo com uma forma de realização, a primeira célula é seleccionada do grupo que consiste num sinoviócito, como um sinoviócito do tipo A, um sinoviócito do tipo B, um fibroblasto sinovial, uma célula de revestimento da 10 membrana sinovial e um osteoblasto. A segunda célula pode ser seleccionada do grupo que consiste num sinoviócito do tipo A, um sinoviócito do tipo B, um fibroblasto sinovial, uma célula de revestimento da membrana sinovial, um osteoblasto, um linfócito T, um linfócito B, uma célula plasmática, um macrófago, uma célula dendritica, uma célula assassina natural e um mastócito. Ainda noutra forma de realização, a primeira célula é derivada do pannus invasivo e a segunda célula é derivada de cartilagem. Noutra forma de realização, a primeira célula é derivada do pannus invasivo e a segunda célula é um osteoblasto.

De acordo com o método de rastreio proporcionado, uma diferença entre o primeiro e o segundo resultados dos ensaios de adesão é indicadora da presença de pelo menos um membro da biblioteca molecular que modula a adesão mediada pela caderina-11 entre a primeira célula e a segunda célula. O ensaio pode ser concebido para identificar agentes que inibem ou intensificam a adesão mediada pela caderina-11. A biblioteca molecular pode ser produzida de modo recombinante ou pode ser sintetizada quimicamente. Ainda noutras formas de realização, a biblioteca molecular é uma biblioteca de péptidos.

Ainda noutro aspecto da invenção, é proporcionado outro método de rastreio de uma biblioteca molecular com a finalidade de identificar um composto protótipo farmacêutico que modula a adesão mediada pela caderina-11. O método envolve efectuar um primeiro ensaio de adesão entre a caderina-11 e um contra-receptor da caderina-11, para obter um primeiro resultado do ensaio de adesão, 11 efectuar um segundo ensaio de adesão entre a caderina-11 e o contra-receptor da caderina-11 na presença de pelo menos um membro da biblioteca molecular, para obter um segundo resultado do ensaio de adesão, e comparar o primeiro e o segundo resultados dos ensaios de adesão para determinar se o pelo menos um membro da biblioteca molecular modula a adesão mediada pela caderina-11.

Em certas formas de realização da invenção, o contra-receptor da caderina-11 é seleccionado do grupo que consiste numa caderina, uma integrina, uma subunidade de integrina, um membro da família das imunoglobulinas e um hidrato de carbono. Em formas de realização preferidas, a caderina é caderina-11. Numa forma de realização, o contra-receptor da caderina-11 é um polipéptido de fusão de caderina-11. Ainda noutra forma de realização, o contra-receptor da caderina-11 é um anticorpo que se liga selectivamente à caderina-11. A caderina-11 e/ou o contra-receptor da caderina-11 podem estar isolados. A caderina-11 e/ou o contra-receptor da caderina-11 também podem ser solúveis.

Ainda noutra forma de realização, a caderina-11 é apresentada por uma célula. Ainda noutra forma de realização, o contra-receptor da caderina-11 é apresentado por uma célula. A célula que expressa a caderina-11 pode ser seleccionada do grupo que consiste num sinoviócito do tipo A ou do tipo B, um fibroblasto sinovial, uma célula de revestimento da membrana sinovial, um osteoblasto, uma célula derivada de cartilagem e uma célula derivada de pannus invasivo. A célula que expressa o contra-receptor da caderina-11 pode ser seleccionada do grupo que consiste num 12 sinoviócito, um fibroblasto sinovial, uma célula de revestimento da membrana sinovial, um osteoblasto, uma célula derivada de cartilagem, uma célula derivada de pannus invasivo, um linfócito T, um linfócito B, uma célula plasmática, um macrófago, uma célula dendritica, um mastócito e uma célula assassina natural. Ainda noutras formas de realização, o contra-receptor da caderina-11 pode ser um componente de uma matriz extracelular de tecido, cartilagem ou osso, ou pode ser uma molécula segregada por uma célula e presente em qualquer parte num tecido.

Também é descrito aqui um método de tratamento de um sujeito com uma perturbação inflamatória das articulações, que compreende administrar a um sujeito necessitado desse tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que modula uma função celular numa célula que expressa a caderina-11, preferivelmente uma função celular diferente da adesão mediada pela caderina-11. 0 agente pode modular a actividade por interacção directamente com a caderina-11 (por exemplo, um agente de ligação que se liga selectivamente à caderina-11 e, desse modo, modula a sua actividade) ou indirectamente por interacção com outro componente celular que então modula a actividade da caderina-11. A função celular pode ser seleccionada do grupo que consiste em proliferação celular, secreção de factores, apoptose, migração e/ou ligação. Em formas de realização importantes, o agente que modula uma função celular numa célula que expressa a caderina-11 não inibe a ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11. Assim, nalgumas formas de realização, a função celular não consiste em ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11 (isto é, a função celular não consiste em adesão mediada pela caderina-11) . 13

Também é descrito e proporcionado aqui um método de rastreio de uma biblioteca molecular para identificar um composto protótipo farmacêutico que modula uma função celular numa célula que expressa a caderina-11 (preferivelmente, uma função celular diferente de adesão mediada pela caderina-11). 0 método compreende determinar um primeiro valor da função celular para uma célula que expressa a caderina-11 na ausência de um membro da biblioteca molecular, determinar um segundo valor da função celular para uma célula que expressa a caderina-11 na presença de pelo menos um membro da biblioteca molecular e comparar o primeiro valor e o segundo valor, para determinar se o pelo menos um membro da biblioteca molecular modula uma função celular numa célula que expressa a caderina-11. A função celular pode ser seleccionada do grupo que consiste em proliferação celular, secreção de factores, apoptose, migração e/ou ligação.

Também é descrito aqui um método semelhante de rastreio de uma biblioteca molecular para identificar um composto protótipo farmacêutico que modula a secreção de factores numa célula que expressa a caderina-11. Numa forma de realização deste último aspecto, a secreção de factores é seleccionada do grupo que consiste na secreção de factores é seleccionada do grupo que consiste em secreção de estromelisina, secreção de colagénio, secreção de colagenase e secreção de IL-6.

De modo semelhante, o método de rastreio pode ser utilizado para identificar compostos protótipos farmacêuticos que modulam uma função celular numa célula que expressa um contra-receptor da caderina-11. Em formas de realização 14 importantes, o composto protótipo farmacêutico é rastreado quanto à sua capacidade para inibir a ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11. Preferivelmente, em certas formas de realização, o composto protótipo farmacêutico não inibe a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor. Assim, nalgumas formas de realização, a função celular que é modulada não é ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11. A invenção também proporciona, noutro aspecto, uma composição farmacêutica (isto é, uma preparação farmacêutica) compreendendo uma quantidade eficaz de um agente modulador da caderina-11 (por exemplo, um agente inibidor da caderina-11) e um transportador farmaceuticamente aceitável, bem como um método de preparação dessa composição. 0 agente modulador da caderina-11 está presente numa quantidade eficaz para modular uma função da caderina-11 I. Se o agente for um agente inibidor da caderina-11, pode estar presente numa quantidade eficaz para inibir a adesão mediada pela caderina-11 (tal como, por exemplo, a que ocorre na sinóvia). Numa forma de realização, a composição está contida numa seringa para injecção localmente na sinóvia, fluido sinovial, articulação ou cápsula articular de um suj eito.

Também é descrito aqui um método de preparação de uma composição farmacêutica, uma preparação farmacêutica e/ou um medicamento, isto é, colocando o agente modulador da caderina-11 (por exemplo, um agente inibidor da caderina-11) da invenção num transportador farmaceuticamente aceitável. A preparação da composição farmacêutica pode conter um ou mais agentes moduladores da caderina-11 e, 15 opcionalmente, outros agentes terapêuticos que são úteis no tratamento de perturbações descritas aqui (por exemplo, NSAIDs).

Estes e outros aspectos da invenção, bem como várias vantagens e utilidades, ficarão mais claros com referência à descrição pormenorizada das formas de realização preferidas e figuras adjuntas.

Descrição Breve das Figuras

Os Exemplos referem-se e incluem uma descrição breve de várias figuras. Deve entender-se que os desenhos ou figuras são apenas ilustrativos e não são requeridos para a habilitação das invenções divulgadas aqui. A Figura 1 ilustra produtos de PCR separados por electroforese em gel. O controlo negativo está apresentado na via 1 e o produto de dimensão esperada de 385 bp obtido em cDNA de sinoviócitos do tipo B está apresentado na via 2. A Figura 2 ilustra resultados de uma análise "Northern" de mRNA da linha 16E6.A5 EpC (via 1), sinoviócitos do tipo B (via 2), células Jurkat (via 3) e a linha de células de neuroblastoma SKNSH (via 4), hibridizado com uma sonda de fragmento de 385 bp da caderina-11 (painel de cima) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Clontech) (painel de baixo) como controlo. Os marcadores de massas moleculares estão indicados à esquerda. A Figura 3 é uma representação esquemática da estrutura da proteína de fusão caderina-ll-Fc humana. Apresenta-se a 16 sequência da região justamembranar extracelular da caderina-11 de tipo selvagem e as alterações resultantes da fusão com a região Fc humana. As regiões correspondentes à porção Fc estão mostradas a cheio. A Figura 4 é uma série de histogramas de citometria de fluxo que mostram a expressão na superfície celular da caderina-11 em células L transfectadas com cDNA de caderina-11. Apresentam-se células L transfectadas com pLK-neo (coluna da esquerda) ou com pLK-neo/Cll (coluna da direita) . A coloração com mAb de controlo P3 está apresentada sem sombreados. A coloração com aCad-11, 3H10, 5H6 e 2G4 está apresentada sombreada. A Figura 5 é uma fotocópia de uma fotografia que ilustra a coloração por imuno-histoquímica de células de revestimento sinovial e algumas células de sub-revestimento em sinovite de AR utilizando mAb 2G4. Secções de tecidos congelados de sinóvia de AR humana (painel A e B) foram coradas pelo método de imunoperoxidase indirecta utilizando mAb 2G4 e foram contra-coradas com hematoxilina (ampliação 20x [painel A] e 60x [painel B] ) . A maior parte das células de revestimento e poucas de sub-revestimento eram 2G4+ (painel B) . A Figura 6 ilustra uma análise de citometria de fluxo de expressão da caderina-11 pela linha de células T sinoviais 5 (painel da esquerda) e células CP-B (painel da direita) . A Figura 7 é um gráfico da percentagem de células da linha de células T sinoviais 5 e células CP-B ligadas a proteínas de controlo ou caderina-11. 17

Listagem de Sequências SEQ ID NO: 1 é a sequência de nucleótidos do cDNA da caderina-11 humana. SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos da proteina caderina-11 humana. SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos dos resíduos 753-762 da E-caderina humana. SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos dos resíduos 840-847 da E-caderina humana. SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos dos resíduos 853-859 da E-caderina humana. SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos dos resíduos 865-875 da E-caderina humana. SEQ ID NO: 7 é a sequência de nucleótidos de um "primer" sentido degenerado. SEQ ID NO: 8 é a sequência de nucleótidos de um "primer" anti-sentido degenerado. SEQ ID NO: 9 é a sequência de nucleótidos do "primer" XVI4. SEQ ID NO: 10 é a sequência de nucleótidos do "primer" XVI5. SEQ ID NO: 11 é a sequência de nucleótidos do "primer" XvCadI IA. 18 SEQ ID NO: 12 é a sequência de nucleótidos do "primer" XVCadllE.

Descrição Pormenorizada da Invenção A invenção assenta, em parte, na descoberta de que o mRNA e proteína da caderina-11 são expressos em células da sinóvia de pacientes com perturbações inflamatórias das articulações. A descoberta foi feita por co-precipitação de caderina-11 com um anti-soro para cateninas em sinoviócitos humanos do tipo B. A demonstração da expressão de uma caderina, nomeadamente caderina-11, na sinóvia de um paciente com artrite reumatóide proporciona uma oportunidade previamente não reconhecida para abordar terapias de melhoramento de artrite reumatóide, bem como outras artrites inflamatórias, onde hiperplasia sinovial e superprodução de factores tóxicos e biologicamente activos medeiam lesões nas articulações. A caderina-11 é uma molécula transmembranar que, inter alia, medeia a ligação de células entre si por interacção consigo própria ou com os seus contra-receptores. Tal como outras caderinas, é proposto que a caderina-11 medeia a adesão de células afins entre si, bem como a adesão de células de diferentes linhagens entre si. De acordo com a descoberta onde se baseia a presente invenção, é proposto que a caderina-11, inter alia, medeia a adesão entre células afins, como sinoviócitos, bem como células diferentes, como sinoviócitos e linfócitos (por exemplo, células T e B). 19

Os genes da caderina-11 humana e de ratinho foram isolados e sequenciados previamente (Suzuki S. et al. Cell Reg 2_: 261-70, 1991). Ver também o número de Acesso da Genbank NM_001797 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2) para o cDNA da caderina-11 humana e sequências de aminoácidos previstas, respectivamente.

Os linfócitos têm capacidade para circular através de vasos sanguíneos e procedem à amostragem de antigenes ou proporcionam protecção imunológica em todos os tecidos. Crê-se que moléculas de adesão específicas (por exemplo, selectinas e integrinas) e seus contra-receptores medeiam o endereçamento e transmigração de linfócitos através do endotélio vascular em sítios de inflamação (Springer TA. Cell 7_6; 301-314, 1994). Cada integrina é um complexo heterodimérico αβ associado de modo não covalente. Foram definidas subfamílias de integrinas pela utilização de cadeias β particulares que muitas vezes emparelham com uma de várias cadeias α diferentes. Apenas integrinas seleccionadas são expressas em células T. Membros da subfamília βι e β3 (α4βι, α2βι, α4βι α5βι e ανβ3) estão principalmente envolvidos na adesão de linfócitos à matriz extracelular, exceptuando o heterodímero (VLA-4) α4βι que se liga à molécula de adesão de células vasculares 1 (VCAM-1), um contra-receptor em endotélio vascular activado (Elices MJ. et al. Cell ¢50: 577-584, 1990). Da subfamília a, LFA-1 (a1^) é expressa em células T e medeia a ligação a contra-receptores ICAM-1 (Marlin SD. et al. Cell 51: 813-819, 1987), ICAM-2 (deFourgerolles AR. et al. J Exp Med 174: 253-267, 1991) e ICAM-3 (deFourgerolles AR. et al. J Exp Med 175: 185-190, 1992; Fawcett J. et al. Nature 360: 481-484, 1992, e Vazeux R. et al. Nature 1992; 360: 481-488). A LFA-1 também medeia a ligação a endotélio vascular 20 inflamado, permitindo a ligação firme de linfócitos T antes da sua transmigração para fora da corrente sanguínea. A migração de linfócitos para sítios inflamatórios envolve um processo em múltiplos passos no qual selectinas (como L-selectina em células T) medeiam o rolamento, após o que a activação de integrinas origina ligação forte mediada por LFA-1 e VLA-4, seguida de transmigração para tecidos. Este tráfego de linfócitos é um requisito para a acumulação de linfócitos em sítios de infecção, ou anormalmente em sítios de inflamação crónica, como a sinóvia reumatóide.

Assim, a invenção abrange a utilização de agentes moduladores da caderina-11 no tratamento de perturbações inflamatórias das articulações. Adicionalmente são proporcionados métodos de rastreio para a identificação de agentes moduladores da caderina-11 que possuem as características descritas aqui.

Os métodos e composições da invenção referem-se a agentes moduladores da caderina-11. Um agente modulador da caderina-11, como usado aqui, abrange agentes que inibem a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor (isto é, agentes inibidores da caderina-11) e agentes que modulam funções celulares em células que expressam a caderina-11 (por exemplo, agentes que desencadeiam ou os que inibem a sinalização associada à caderina-11) . Agentes moduladores da caderina-11 são capazes de modular (1) a proliferação celular, (2) a secreção de moléculas tais como mas não se limitando a estromelisina, colagénio, colagenase e IL-6, (3) apoptose, (4) migração e/ou (5) ligação de células que expressam a caderina-11. Em formas de realização importantes, esses agentes conduzem a um decréscimo da proliferação celular, um decréscimo da secreção de 21 moléculas tais como mas não se limitando a citoquinas, e um aumento da apoptose em células que expressam a caderina-11. De facto, a função destes agentes é preferivelmente abrandar a taxa de crescimento ou, por fim, matar células de caderina-11, como sinoviócitos. Foi previamente relatado noutros tipos de células que a perda de E-caderina pode conduzir a um fenótipo canceroso ou metastático.

Assim, a invenção também abrange agentes inibidores de caderina-11 e seu método de utilização. A menos que afirmado em contrário, deve ser entendido que não é necessário que estas duas categorias de agentes, isto é, agentes que modulam a adesão mediada pela caderina-11 (isto é, agentes inibidores da caderina-11) e agentes que modulam outras funções da caderina-11, como proliferação, secreção de factores e apoptose, sejam mutuamente exclusivas ou sejam completamente sobrepostas. Por exemplo, é esperado que alguns agentes identificados nos ensaios de rastreio da invenção funcionem somente como agentes inibidores da caderina-11 (isto é, com capacidade para bloquear a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor), outros funcionem por modulação (por exemplo, intensificação ou inibição) de funções celulares, como proliferação, secreção, apoptose, ligação e migração, ao passo que ainda outros agentes serão capazes de ambos. Assim, alguns agentes serão capazes de inibir a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor mas não terão nenhum impacto noutras funções mediadas pela caderina-11, como sinalização celular. De modo semelhante, outros agentes irão intensificar ou inibir funções mediadas pela caderina-11, como proliferação, por exemplo, mas não terão nenhum efeito na ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor. 22

Num aspecto, a invenção proporciona a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor da caderina-11 que inibe a ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11 que é caderina-11, na preparação de um medicamento para o tratamento de um sujeito com uma perturbação inflamatória das articulações, em que o agente inibidor da caderina-11 é um anticorpo ou seu fragmento, um polipéptido da caderina-11 ou seu fragmento ou uma proteina de fusão com Fc compreendendo um domínio extracelular da caderina-11, em que o agente inibidor da caderina-11 se liga selectivamente à caderina-11.

Tal como usado aqui, uma perturbação inflamatória das articulações é uma perturbação na qual hiperplasia sinovial e/ou superprodução de factores biologicamente activos medeiam lesões em articulações. Em perturbações inflamatórias de articulações, a sinóvia fica inflamada e espessada e, em casos avançados, segue-se uma invasão da sinóvia para a cartilagem e osso. A sinóvia é a membrana de revestimento da cápsula de uma articulação. A sinovite (isto é, inflamação da sinóvia) pode manifestar-se nas formas aguda ou crónica. Em sinovite aguda, o surgimento de dor e desconforto é habitualmente súbito e de curta duração, tal como no caso de sinovite vilonodular pigmentada. Em contraste, na sinovite crónica, a dor e desconforto são recorrentes e persistentes. Em qualquer dos casos, os sintomas podem surgir devido a artrite, lesão, utilização excessiva da articulação e infecção. 0 agente modulador, como o agente inibidor, é preferivelmente administrado localmente na sinóvia do sujeito. Articulações afectadas que podem ser tratadas são as que existem em todo o corpo, em áreas como os ombros, 23 costas, pulsos, mãos, cotovelos, joelhos, ancas, tornozelos e pés, e são revestidas por uma membrana sinovial.

Estados exemplificativos que resultam ou causam perturbações inflamatórias nas articulações incluem sinovite crónica, perturbações autoimunes, artrite psoriática, artrite associada a doença de Lyme crónica, artrite associada a doença inflamatória do intestino, artrite associada a espondilite anquilosante, síndroma de Reiter, artrite associada a lúpus eritematoso sistémico, artrite associada a artrite juvenil crónica, artrite associada a infecção, artrite associada a resposta imunológica a agentes infecciosos e sinovite inespecífica de etiologia desconhecida. Uma perturbação autoimune é uma perturbação na qual o sistema imunológico do corpo reage contra um ou mais tecidos corporais e, assim, ataca o tecido tal como se fosse um antigene ou patogene estranho. Artrite reumatóide é um exemplo de uma perturbação autoimune na qual os componentes do sistema imunológico perpetuam a inflamação de uma articulação, originando lesões na sinóvia, cartilagem, osso e tecidos de articulações associados.

Um método proporcionado pela invenção envolve a administração a um sujeito necessitado desse tratamento de um agente inibidor da caderina-11. Um agente inibidor da caderina-11 é um agente que inibe a ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11. 0 agente inibidor da caderina-11 é administrado ao sujeito numa quantidade terapeuticamente eficaz. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma dosagem do agente inibidor da caderina-11 suficiente para proporcionar um resultado desejável do ponto de vista médico. No método de tratamento da invenção, 24 a quantidade terapeuticamente eficaz do agente inibidor da caderina-11 pode ser aquela quantidade que é suficiente para reduzir a inflamação ou inchaço da articulação, ou para aliviar a dor na articulação. Tal como é usado aqui, o tratamento abrange a utilização dos agentes inibidores da caderina-11 na redução do estado médico adverso que é mediado pela ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor in vivo, bem como tratamento profiláctico de sujeitos em risco de desenvolver uma perturbação inflamatória das articulações.

Como mencionado anteriormente, os métodos de tratamento descritos aqui abrangem a utilização de qualquer um ou de ambos agentes inibidores da caderina-11 e agentes que modulam funções celulares (por exemplo, sinalização, proliferação, apoptose, etc.) da caderina-11 diferentes da ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11. Assim, como descrito aqui, o método de tratamento de um sujeito com uma perturbação inflamatória das articulações pode alternativamente compreender administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agente que modula uma ou mais funções celulares da caderina-11. Em formas de realização importantes, a uma ou mais funções celulares não incluem a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor.

Um sujeito, como usado aqui, refere-se a qualquer mamífero susceptível a contrair ou sofrendo presentemente de uma perturbação inflamatória das articulações. Preferivelmente, o sujeito sofre de uma perturbação inflamatória das articulações. Em formas de realização mais preferidas, o sujeito é um humano. Em certas formas de realização, o sujeito não sofre de adesão anormal mediada pela caderina-11 no cérebro e/ou fígado. 25

Em geral, agentes inibidores da caderina-11 são agentes que inibem a adesão mediada pela caderina-11. Adesão mediada pela caderina-11, como usado aqui, refere-se à ligação de um polipéptido da caderina-11, daqui em diante referido como caderina-11, a um contra-receptor da caderina-11. Um contra-receptor da caderina-11 é uma molécula que se liga selectivamente à caderina-11 e, nalguns casos, é expressa na superfície de uma célula. Noutros casos, o contra-receptor da caderina-11 não está ligado a células, sendo um componente de uma matriz intersticial, como uma matriz extracelular de tecido, cartilagem ou osso. 0 contra-receptor da caderina-11 também pode ser uma molécula segregada por uma célula. Células exemplificativas que expressam um contra-receptor da caderina-11 incluem sinoviócitos do tipo A e tipo B, fibroblastos sinoviais, células derivadas de cartilagens, osteoblastos, linfócitos T e B, células plasmáticas, macrófagos, células dendríticas, células NK, mastócitos, células de revestimento sinovial e células derivadas do pannus invasivo. Um contra-receptor da caderina-11 abrange caderina-11, membros da superfamília de imunoglobulinas, epítopos de hidratos de carbono de uma glicoproteína ou glicolípido, uma selectina, uma lectina contendo ligando e uma integrina. Foram identificadas pelo menos 21 integrinas diferentes compostas por oito cadeias β diferentes associadas a 15 cadeias α diferentes. Integrinas úteis na invenção incluem α1βι, α2βι, α3βι, α4βι, α5βι, α6βι, α7βι, α8βι, α9βι, αΕβ2, αΜβ2, αχβ2, αΙΙϋβ3, ανβ3, α6β4, ανβ5, α4β7, αΕβ7, α2β7.

Em algumas formas de realização, as integrinas preferidas são α4βι, α2βι, α3βι, α4βι, α5βι, α6βι, αΕβ2, αΜβ2, ανβ3, α4β7 e αΕβ7. 26 A invenção baseia-se em parte na observação de que células T e células B, não tendo sido previamente relatado que as duas expressam caderina-11, são capazes de se ligar a caderina-11 recombinante imobilizada in vitro. Assim, esta descoberta sugere que células T e B expressam um contra-receptor da caderina-11 que não é caderina-11. Este é o primeiro relato de um contra-receptor da caderina-11 que não é caderina-11 expresso por células T e B. Ao comparar células que se ligam a caderina-11 purificada ou isolada (e que se sabe não expressarem caderina-11) com células que são incapazes dessa ligação é possível identificar contra-receptores da caderina-11 que não são caderina-11. Métodos exemplificativos de comparação destes dois tipos de células incluem, por exemplo, rastreio genético utilizando técnicas tais como expressão diferencial, bem como hibridização subtractiva para identificar transcritos que são expressos pelas células de ligação de caderina-11 e não são expressas pelas células não de ligação de caderina-11. Estas técnicas são rotineiramente praticadas pelos profissionais. Estas técnicas permitem o isolamento rápido de ácidos nucleicos que codificam para um contra-receptor da caderina-11. Depois de terem sido identificadas células que se ligam à caderina-11 mas que não expressam a caderina-11, preparações de membranas celulares podem ser analisadas, por exemplo, por purificação de afinidade para isolar o contra-receptor da caderina-11. Por exemplo, uma proteína de fusão GST-caderina-11 imobilizada numa coluna pode ser utilizada para extrair contra-receptores da caderina-11 de uma preparação celular em bruto. Numa forma de realização preferida, são gerados anticorpos monoclonais contra células que expressam um contra-receptor da caderina-11, e os anticorpos resultantes são rastreados quanto à sua 27 capacidade para bloquear a ligação da caderina-11 a essas células.

Os agentes moduladores da caderina-11 da invenção, incluindo os agentes inibidores da caderina-11, abrangem moléculas de ácidos nucleicos, polipéptidos, hidratos de carbono e moléculas produzidas de modo sintético e produzidas de modo recombinante.

Em certas formas de realização diferentes da invenção, o agente modulador da caderina-11 é um polipéptido (isto é, um polipéptido modulador da caderina-11). Como tal, o agente modulador, incluindo o agente inibidor da caderina-11, pode ser (1) um polipéptido da caderina-11 ou seu fragmento (preferivelmente único) ou (2) um polipéptido contra-receptor da caderina-11 ou seu fragmento (preferivelmente único); (3) um "péptido de ligação" à caderina-11 (diferente de um contra-receptor da caderina-11) , e (4) um "péptido de ligação" a contra-receptores da caderina-11 (diferente de um polipéptido da caderina-11). Tal como usado aqui, um péptido de ligação à caderina-11 refere-se a péptidos que se ligam selectivamente à caderina-11. De modo semelhante, um péptido de ligação a contra-receptores da caderina-11 refere-se a um péptido que se liga selectivamente a contra-receptores da caderina-11. Nalgumas formas de realização importantes, o péptido de ligação à caderina-11 não inibe a ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11. 0 mesmo é dizer que, em certas formas de realização, o péptido de ligação não é um agente inibidor da caderina-11, mas ainda pode modular outras funções mediadas pela caderina-11, como proliferação. 0 mesmo pode aplicar-se a péptidos de ligação a contra-receptores da caderina-11. A invenção abrange a 28 utilização destas duas últimas classes de péptidos de ligação no tratamento de sujeitos onde não é necessário inibir a ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11 para efectuar o tratamento. Péptidos de ligação podem ser anticorpos ou fragmentos de anticorpos ("polipéptidos de ligação") com capacidade para se ligarem selectivamente a polipéptidos da caderina-11 ou de contra-receptores da caderina-11. Anticorpos incluem anticorpos policlonais e monoclonais, que podem ser preparados de acordo com metodologia convencional. Péptidos de ligação e polipéptidos de ligação também podem ser derivados de fontes diferentes de tecnologia de anticorpos. Por exemplo, esses péptidos de ligação podem ser proporcionados por bibliotecas de péptidos degenerados que podem ser facilmente preparadas em solução, em forma imobilizada, na forma de bibliotecas de expressão de péptidos de flagelos bacterianos ou na forma de bibliotecas de expressão em fagos. Também podem ser sintetizadas bibliotecas combinatoriais de péptidos contendo um ou mais aminoácidos. Podem ser adicionalmente sintetizadas bibliotecas de péptidos e fracções sintéticas não peptidicas. Péptidos de ligação à caderina-11 exemplificativos que são anticorpos e proteínas de fusão são descritos nos Exemplos. (Ver também USP N° 5,639,634 e 5,597,725 e Requerimento de Patente PCT N° WO93/21302).

Polipéptidos inibidores da caderina-11 podem ser moléculas de adesão celular, como integrinas e caderinas.

Polipéptidos inibidores da caderina-11 são úteis para inibir a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor. Tal como usado aqui, um fragmento de um polipéptido refere-se a 29 um fragmento que é capaz de se ligar à caderina-11 ou ao contra-receptor da caderina-11, consoante o caso. Os polipéptidos inibidores da caderina-11 preferidos da invenção têm a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou um fragmento funcionalmente equivalente da SEQ ID NO: 2. Assim, polipéptidos inibidores da caderina-11 abrangem fragmentos funcionalmente equivalentes, variantes e análogos da SEQ ID NO: 2, desde que os fragmentos, variantes e análogos se liguem à caderina-11 ou a um contra-receptor da caderina-11 e, desse modo, reduzam ou previnam a adesão da caderina-11 ao seu contra-receptor. A invenção também abrange proteínas e péptidos codificados por qualquer uma das moléculas anteriores de ácidos nucleicos inibidores da caderina-11.

Um fragmento único de um polipéptido da caderina-11 tem, em geral, os aspectos e caracteristicas de fragmentos únicos, como discutido aqui relacionado com ácidos nucleicos. Como será reconhecido pelos profissionais, a dimensão do fragmento único irá depender de factores tais como se o fragmento constitui uma porção de um domínio proteico conservado. Assim, algumas regiões da SEQ ID NO: 2 irão requerer que fragmentos maiores sejam únicos, ao passo que outras irão requerer somente segmentos pequenos, tipicamente entre 5 e 12 aminoácidos (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 aminoácidos de comprimento ou mais, incluindo cada inteiro até ao polipéptido completo). Virtualmente qualquer segmento da SEQ ID NO: 2 que tenha 9 ou mais aminoácidos de comprimento e que não seja comum a outros polipéptidos distintos será único. Fragmentos únicos de um polipéptido são preferivelmente aqueles fragmentos que retêm uma capacidade funcional distinta do polipéptido. Capacidades funcionais que podem ser retidas num fragmento 30 único do polipéptido da caderina-11 incluem a capacidade para se ligar a um contra-receptor da caderina-11. De modo semelhante, um fragmento único de um polipéptido contra-receptor da caderina-11 possuirá a capacidade para se ligar a um polipéptido da caderina-11.

Como usado aqui relativamente a polipéptidos, o termo "isolado" significa separado do seu ambiente nativo em forma suficientemente pura para poder ser manipulado ou utilizado em qualquer uma das finalidades da invenção. Assim, isolado significa suficientemente puro para ser utilizado (i) para dirigir e/ou isolar anticorpos, (ii) como reagente num ensaio ou (iii) para sequenciação, etc. A expressão em fagos pode ser particularmente eficaz na identificação de péptidos de ligação úteis de acordo com a invenção. Em resumo, prepara-se uma biblioteca de fagos (utilizando, por exemplo, o fago ml3, fl ou lambda) exibindo inserções com 4 até cerca de 80 resíduos de aminoácidos utilizando procedimentos convencionais. As inserções podem representar, por exemplo, uma série completamente degenerada ou distorcida. É então possível seleccionar inserções contendo fagos que se ligam ao polipéptido da caderina-11 ou do contra-receptor da caderina-11. Este processo pode ser repetido por vários ciclos de nova selecção de fagos que se ligam ao polipéptido da caderina-11 ou do contra-receptor da caderina-11. Rondas repetidas conduzem a um enriquecimento de sequências particulares contendo fagos. A dimensão da sequência peptídica expressa pode variar. À medida que a dimensão aumenta, a complexidade da biblioteca aumenta. É preferido que a dimensão total da sequência peptídica expressa (os aminoácidos aleatórios mais quaisquer 31 aminoácidos espaçadores) não seja maior do que cerca de 100 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente não maior do que 50 aminoácidos de comprimento e muito preferivelmente não maior do que cerca de 25 aminoácidos de comprimento. Em certas formas de realização, as bibliotecas podem ter pelo menos uma restrição imposta na sequência peptidica expressa. Uma restrição inclui mas não se limita a uma carga positiva ou negativa, hidrofobicidade, hidrofilicidade, uma ligação apta a ser clivada e os necessários residuos envolvendo essa ligação, e combinações destas. Em certas formas de realização, está presente mais do que uma restrição em cada uma das sequências peptidicas da biblioteca.

Pode conduzir-se análise de sequências de DNA para identificar as sequências dos polipéptidos expressos. Pode ser determinada a porção linear mínima da sequência que se liga ao polipéptido da caderina-11 ou do contra-receptor da caderina-11. Pode então repetir-se o procedimento utilizando uma biblioteca distorcida contendo inserções que contêm parte ou a totalidade da porção linear mínima mais um ou mais resíduos degenerados adicionais a montante ou a jusante. Também podem ser utilizados métodos de rastreio de dois híbridos de levedura para identificar polipéptidos que se ligam ao polipéptido da caderina-11 ou de contra-receptores da caderina-11. Assim, os polipéptidos da caderina-11 ou de contra-receptores da caderina-11 da invenção, ou seu fragmento, podem ser utilizados para rastrear bibliotecas de péptidos, incluindo bibliotecas de expressão em fagos, para identificar e seleccionar parceiros de ligação peptídicos dos polipéptidos da caderina-11 ou de contra-receptores da caderina-11 da invenção. Essas moléculas podem ser utilizadas, como 32 descrito, para ensaios de rastreio, para protocolos de purificação, para interferir directamente no funcionamento da caderina-11 ou contra-receptor da caderina-11 e para outros fins que serão claros para os profissionais.

Um polipéptido da caderina-11 ou do contra-receptor da caderina-11, ou seu fragmento, também pode ser utilizado para isolar outros parceiros de ligação (por exemplo, contra-receptores da caderina-11 de ocorrência natural). Os parceiros de ligação podem ser isolados de acordo com métodos bem conhecidos. Por exemplo, polipéptidos da caderina-11 ou de contra-receptores da caderina-11 isolados podem ser ligados a um substrato e depois pode aplicar-se no substrato uma solução suspeita de conter um parceiro de ligação da caderina-11 ou de contra-receptores da caderina-11. Se o parceiro de ligação de polipéptidos da caderina-11 ou de contra-receptores da caderina-11 estiver presente na solução, então irá ligar-se ao polipéptido da caderina-11 ou do contra-receptor da caderina-11 ligado ao substrato. 0 parceiro de ligação pode então ser isolado.

Nalgumas formas de realização importantes, o agente inibidor da caderina-11 é um análogo peptidico funcionalmente equivalente da caderina-11 ou de um contra-receptor da caderina-11. Como usado aqui, o termo análogo peptidico funcionalmente equivalente refere-se a um análogo peptidico que é capaz de inibir a ligação da caderina-11 ao contra-receptor da caderina-11 por competição com a caderina-11 quanto à ligação a um contra-receptor da caderina-11, ou com um contra-receptor da caderina-11 quanto à ligação à caderina-11. Análogos peptidicos funcionalmente equivalentes da caderina-11 são identificados, por exemplo, em ensaios de adesão in vitro, 33 como descrito abaixo e nos Exemplos, que medem a capacidade do análogo peptidico para inibir a adesão mediada pela caderina-11 quer entre células que expressam caderina-11 e o seu contra-receptor quer entre caderina-11 isolada e contra-receptor da caderina-11 isolado, ou algumas combinações destes. Em conformidade, análogos peptidicos funcionalmente equivalentes exemplificativos da caderina-11 incluem o dominio extracelular da caderina-11, fragmentos do dominio extracelular e análogos peptidicos do dominio extracelular (por exemplo, péptidos que contêm substituições de aminoácidos conservativas), desde que os fragmentos e análogos peptidicos sejam capazes de inibir a adesão entre a caderina-11 e o seu contra-receptor quando estas moléculas estão presentes em forma isolada ou no contexto de uma membrana celular in vivo e/ou in vitro. Da mesma forma, um análogo peptidico funcionalmente equivalente do contra-receptor da caderina-11 inclui o dominio extracelular do contra-receptor da caderina-11, fragmentos do dominio extracelular e análogos peptidicos do dominio extracelular (por exemplo, péptidos que contêm substituições de aminoácidos conservativas), desde que os fragmentos e análogos peptidicos sejam capazes de inibir a adesão entre a caderina-11 e o seu contra-receptor quando estas moléculas estão presentes em forma isolada ou no contexto de uma membrana celular in vivo e/ou in vitro. Preferivelmente, os fragmentos e/ou análogos peptidicos contêm entre cerca de três e cerca de cem aminoácidos. Mais preferivelmente, os análogos peptidicos contêm entre cerca de dez e cerca de vinte e cinco aminoácidos.

Os agentes inibidores da invenção incluem anticorpos e proteínas de fusão que inibem a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor. Assim, os péptidos da invenção podem 34 ser especificamente reactivos com um anticorpo (preferivelmente um anticorpo monoclonal) que se liga selectivamente à caderina-11 ou um anticorpo que se liga selectivamente ao contra-receptor da caderina-11 e, desse modo, inibem a adesão entre a caderina-11 e um contra-receptor da caderina-11. Assim, polipéptidos de fusão de caderina-11 e contra-receptor da caderina-11 também estão abrangidos pela presente invenção, bem como a sua utilização nos métodos divulgados aqui. Um polipéptido de fusão, como usado aqui, é um polipéptido que contém regiões peptidicas de pelo menos duas proteínas diferentes. Por exemplo, um polipéptido de fusão de caderina-11 pode ser formado por fusão, habitualmente ao nível dos nucleótidos, da sequência codificadora da caderina-11 à sequência codificadora de outra proteína distinta. Como descrito abaixo, uma proteína de fusão de caderina-11 com GST pode ser sintetizada e é útil no rastreio de agentes que se ligam à caderina-11. Também como descrito nos Exemplos, uma proteína de fusão caderina-ll-Fc foi sintetizada por reunião dos domínios extracelulares da caderina-11 com a porção Fc de imunoglobulina. Dependendo da sua natureza, algumas proteínas de fusão são adequadas para utilização in vitro, ao passo que outras são melhor adequadas a utilização in vivo.

Em certas formas de realização preferidas, o agente modulador da caderina-11 é um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo com capacidade para se ligar selectivamente a polipéptidos da caderina-11 ou de contra-receptores da caderina-11. Anticorpos incluem anticorpos policlonais e monoclonais, preparados de acordo com metodologia convencional. 35 É importante notar, como é bem conhecido na área, que apenas uma pequena porção de uma molécula de anticorpo, o paratopo, está envolvida na ligação do anticorpo ao seu epitopo (ver, em geral, Clark, W.R. (1986) "The Experimental Foundations of Modern Immunology" Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque; Roitt, I. (1991) "Essential Immunology", 7a Edição, Blackwell Scientific Publications, Oxford). As regiões pFc' e Fc, por exemplo, são efectores da cascata do complemento, mas não estão envolvidas na ligação de antigenes. Um anticorpo de onde a região pFc' foi enzimaticamente clivada, ou que foi produzido sem a região pFc', designado fragmento F(ab')2, retém ambos os sítios de ligação de antigenes de um anticorpo intacto. De modo semelhante, um anticorpo de onde a região Fc foi enzimaticamente clivada, ou que foi produzido sem a região Fc, designado fragmento Fab, retém um dos sítios de ligação de antigenes de uma molécula de anticorpo intacta. Prosseguindo, fragmentos Fab consistem numa cadeia leve de anticorpo ligada de modo covalente e uma porção da cadeia pesada de anticorpo, designada Fd. Os fragmentos Fd são os determinantes principais da especificidade de anticorpos (um único fragmento Fd pode estar associado a até dez cadeias leves diferentes sem alterar a especificidade do anticorpo) e fragmentos Fd retêm capacidade de ligação de epítopos em forma isolada.

Na porção de ligação de antigenes de um anticorpo, como é bem conhecido na área, há regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que interagem directamente com o epitopo do antigene, e regiões de arcabouço (FRs), que mantêm a estrutura terciária do paratopo (ver, em geral, Clark, 1986; Roitt, 1991) . No fragmento Fd de cadeias pesadas e na cadeia leve de imunoglobulinas IgG há quatro 36 regiões de arcabouço (FR1 até FR4) separadas, respectivamente, por três regiões determinantes de complementaridade (CDR1 até CDR3) . As CDRs e, em particular, as regiões CDR3, e mais em particular a CDR3 da cadeia pesada, são maioritariamente responsáveis pela especificidade dos anticorpos.

Está agora bem estabelecido na área que as regiões não CDR de um anticorpo de mamífero podem ser substituídas por regiões semelhantes de anticorpos co-específicos ou heteroespecíficos mantendo a especificidade epitópica do anticorpo original. Isto está muito claramente manifestado no desenvolvimento e utilização de anticorpos "humanizados", nos quais CDRs não humanas estão covalentemente reunidas a regiões FR e/ou Fc/pFc' humanas para produzir um anticorpo funcional. Assim, por exemplo, a Publicação Internacional PCT Número WO 92/04381 ensina a produção e utilização de anticorpos de RSV murinos humanizados nos quais pelo menos uma porção das regiões FR murinas foi substituída por regiões FR de origem humana. Esses anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos intactos com capacidade de ligação a antigenes, são muitas vezes designados de anticorpos "quiméricos".

Assim, como será claro para o profissional, a presente invenção também proporciona fragmentos F(ab')2, Fab, Fv e Fd; anticorpos quiméricos nos quais as regiões Fc e/ou FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeias leves foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas; anticorpos de fragmentos F(ab')2 quiméricos nos quais as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeias leves foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas; anticorpos de fragmentos Fab 37 quiméricos nos quais as regiões FR e/ou CDRl e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeias leves foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas, e anticorpos de fragmentos Fd quiméricos nos quais as regiões FR e/ou CDRl e/ou CDR2 foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas. A presente invenção também inclui os denominados anticorpos de cadeia simples.

Para inoculação ou utilizações profilácticas, os anticorpos da presente invenção são preferivelmente moléculas de anticorpos intactos incluindo a região Fc. Esses anticorpos intactos terão tempos de semivida maiores do que anticorpos de fragmentos menores (por exemplo, Fab) e são mais adequados para administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-cavidades, subcutânea ou transdérmica.

Fragmentos Fab, incluindo fragmentos Fab quiméricos, são preferidos em métodos nos quais os péptidos da invenção são administrados directamente num ambiente de tecido local. Por exemplo, são preferidos os fragmentos Fab quando o péptido da invenção é administrado directamente na articulação lesionada ou na sinóvia inflamada. Para esta modalidade terapêutica, os Fabs oferecem várias vantagens relativamente a F(ab')2 θ moléculas de imunoglobulinas completas. Em primeiro lugar, uma vez que Fabs têm apenas um sítio de ligação para o seu antigene cognato, é evitada a formação de complexos imunológicos, ao passo que esses complexos podem ser gerados quando F(ab')2 bivalentes e moléculas de imunoglobulinas completas encontram o seu antigene alvo. Isto tem alguma importância, porque a deposição de complexos imunológicos em tecidos pode produzir reacções inflamatórias adversas. Em segundo lugar, uma vez que Fabs não têm uma região Fc, não conseguem 38 desencadear reacções inflamatórias adversas que são activadas por Fc, como a activação da cascata do complemento. Em terceiro lugar, é provável que a penetração em tecidos da pequena molécula Fab seja muito melhor do que a do anticorpo completo maior. Em quarto lugar, Fabs podem ser produzidos facilmente e de modo económico em bactérias, como E. coli, ao passo que moléculas de anticorpos de imunoglobulinas completas requerem células de mamífero para a sua produção em quantidades úteis. A produção de Fabs em E. coli torna possível produzir estes fragmentos de anticorpos em grandes fermentadores, que são menos dispendiosos do que produtos derivados de cultura de células.

Um agente modulador da caderina-11 também pode ser uma molécula de ácido nucleico (isto é, uma molécula de ácido nucleico moduladora da caderina-11) . Uma molécula de ácido nucleico moduladora da caderina-11 é uma molécula de ácido nucleico cuja função é modular uma função celular da caderina-11, tal como, por exemplo, proliferação celular, secreção de factores, apoptose, migração e ligação. Uma molécula de ácido nucleico inibidora da caderina-11 é uma molécula de ácido nucleico cuja função é inibir a adesão mediada pela caderina-11. Estas moléculas de ácidos nucleicos podem funcionar directamente (por exemplo, como moléculas de ácido nucleico anti-sentido) ou indirectamente (por exemplo, via os péptidos e/ou polipéptidos que codificam). Uma molécula de ácido nucleico moduladora da caderina-11 e uma molécula de ácido nucleico inibidora da caderina-11 podem ser seleccionadas de um grupo que consiste em moléculas de ácidos nucleicos que (1) codificam um polipéptido da caderina-11 ou seu fragmento (preferivelmente único); (2) codificam um polipéptido 39 contra-receptor da caderina-11 ou seu fragmento (preferivelmente único), ou (3) são moléculas anti-sentido de caderina-11 ou contra-receptor da caderina-11 que inibem a transcrição ou tradução das moléculas de ácidos nucleicos anteriores.

Numa forma de realização, um ácido nucleico modulador da caderina-11, tal como, por exemplo, um ácido nucleico inibidor da caderina-11, (1) hibridiza em condições restritas para um ácido nucleico com uma sequência da SEQ ID NO: 1 e (2) codifica para um polipéptido da caderina-11 ou seu fragmento (preferivelmente único) que é capaz de se ligar especificamente à caderina-11 ou a um contra-receptor da caderina-11. Numa forma de realização, o polipéptido da caderina-11, ou seu fragmento, liga-se a um contra-receptor da caderina-11 I na superfície de outra célula e, desse modo, inibe a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor e, opcionalmente, inibe a ligação de uma célula a outra. Também é contemplada a inibição da ligação de uma célula à matriz extracelular. A molécula de ácido nucleico inibidora da caderina-11 preferida tem uma sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 1. As moléculas de ácidos nucleicos moduladoras da caderina-11 descritas aqui também incluem homólogos e alelos de uma molécula de ácido nucleico com uma sequência da SEQ ID NO: 1.

As moléculas de ácidos nucleicos moduladoras da caderina-11 e, preferivelmente, as moléculas de ácidos nucleicos inibidoras da caderina-11 podem codificar polipéptidos que são polipéptidos solúveis da caderina-11 ou polipéptidos ligados a membranas. Os polipéptidos solúveis da caderina-11 não têm um domínio transmembranar e, de modo óptimo, contém aminoácidos adicionais que tornam o polipéptido 40 solúvel (por exemplo, proteínas de fusão, contendo a totalidade ou parte da caderina-11, que inibem a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor). Agentes moduladores da caderina-11 ligados a membranas (ou associados a membranas) contêm preferivelmente um domínio transmembranar.

As moléculas de ácidos nucleicos moduladoras da caderina-11 e, preferivelmente, as moléculas de ácidos nucleicos inibidoras da caderina-11 também abrangem moléculas de ácidos nucleicos que codificam para um polipéptido da caderina-11 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 mas que podem diferir da sequência da SEQ ID NO: 1 devido à degenerescência do código genético. De modo semelhante, a molécula de ácido nucleico moduladora da caderina-11 e, preferivelmente, a molécula de ácido nucleico inibidora da caderina-11 podem codificar polipéptidos de contra-receptores da caderina-11 e seus fragmentos que são solúveis ou ligados a membranas.

Nalgumas formas de realização importantes, os ácidos nucleicos que modulam a função celular da caderina-11 preferivelmente não codificam um polipéptido da caderina-11 ou de um contra-receptor da caderina-11 ou seu fragmento que é capaz de inibir a ligação da caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11, nem são moléculas anti-sentido que inibem a transcrição ou tradução das moléculas de ácidos nucleicos anteriores.

As moléculas de ácidos nucleicos moduladoras da caderina-11 descritas aqui podem ser identificadas por técnicas convencionais, por exemplo, por identificação de sequências de ácidos nucleicos que codificam para o polipéptido da caderina-11 e que hibridizam para uma molécula de ácido 41 nucleico com a sequência da SEQ ID NO: 1 em condições restritas. O termo "condições restritas", como usado aqui, refere-se a parâmetros familiares na área. Mais especificamente, condições restritas, como usado aqui, refere-se a hibridização a 65°C em tampão de hibridização (3,5 X SSC, formamida 0,02%, polivinilpirrolidona 0,02%, albumina do soro bovino 0,02%, NaH2PC>4 2,5 mM (pH 7), SDS 0,5%, EDTA 2 mM). SSC é cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,15 M, pH 7; SDS é dodecilsulfato de sódio, e EDTA é ácido etilenodiaminotetracético. Após a hibridização, a membrana para a qual é transferido o DNA é lavada a 2x SSC à temperatura ambiente e depois a 0,lx SSC/0,lx SDS a 65°C. Há outras condições, reagentes e assim por diante que podem ser utilizados que originam um grau semelhante de restrição. O profissional estará familiarizado com essas condições e, assim, não são apresentadas aqui. Entender-se-á, no entanto, que o profissional será capaz de manipular as condições de modo a permitir a identificação clara de homólogos e alelos das moléculas de ácidos nucleicos da invenção. O profissional também está familiarizado com a metodologia de rastreio de células e bibliotecas para a expressão de moléculas, como moléculas de ácidos nucleicos inibidoras da caderina-11, que podem ser isoladas e sequenciadas. No rastreio de sequências da caderina-11 I, por exemplo, pode ser efectuada uma coloração "Southern" utilizando as condições anteriores, juntamente com uma sonda radioactiva. Após lavagem da membrana para onde é finalmente transferido o DNA, a membrana pode ser colocada contra filme de raios X para a detecção do sinal radioactivo. 42

Em geral, homólogos e alelos da caderina-11 partilham tipicamente pelo menos 70% de identidade de nucleótidos com a SEQ ID NO: 1 e, nalguns casos, partilham pelo menos 75% de identidade de nucleótidos e, ainda noutros casos, partilham pelo menos 80% de identidade de nucleótidos. Também são contemplados complementos de Watson-Crick dos ácidos nucleicos anteriores. Os homólogos preferidos da caderina-11 têm pelo menos 85% de homologia de sequências com a SEQ ID NO: 1. Mais preferivelmente, os homólogos da caderina-11 I têm pelo menos 90% e muito preferivelmente pelo menos 95% de homologia de sequências com a SEQ ID NO: 1. A homologia pode ser calculada utilizando várias ferramentas de "software" publicamente disponíveis desenvolvidas pelo NCBI (Bethesda, Maryland) que podem ser obtidas pela "internet" (ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/pub/). Ferramentas exemplificativas incluem o sistema BLAST disponível em http:I/wwww.ncbi.nlm.nih.gov. Alinhamentos em pares e por ClustalW (parâmetro da matriz BLOSUM30), bem como análise hidropática de Kyte-Doolittle, podem ser obtidos utilizando o "software" de análise de sequências MacVetor (Oxford Molecular Group).

Também são contemplados ácidos nucleicos degenerados que incluem codões alternativos aos presentes no ácido nucleico de ocorrência natural que codifica, por exemplo, o polipéptido da caderina-11 humana. Como é bem conhecido na área e como exemplo, resíduos serina são codificados pelos codões TCA, AGT, TCC, TCG, TCT e AGC. Cada um dos seis codões é equivalente para a finalidade de codificar um resíduo serina. Assim, será claro para o profissional que pode ser empregue qualquer um dos codões nucleotídicos codificadores de serina para dirigir o aparato da síntese proteica, in vitro ou in vivo, de modo a incorporar um 43 resíduo serina. De modo semelhante, tripletos de sequências de nucleótidos que codificam outros resíduos de aminoácidos incluem mas não estão limitados a CCA, CCC, CCG e CCT (codões de prolina); CGA, CGC, CGG, CGT, AGA e AGG (codões de arginina); ACA, ACC, ACG e ACT (codões de treonina); AAC e AAT (codões de asparagina) , e ATA, ATC e ATT (codões de isoleucina). Outros resíduos de aminoácidos podem ser codificados de modo semelhante por múltiplas sequências de nucleótidos.

Deve ser entendido que também são contemplados homólogos e alelos e degenerados de moléculas de ácidos nucleicos que codificam para um contra-receptor da caderina-11, e podem ser identificados utilizando os mesmos tipos de técnicas e procedimentos descritos aqui relativamente aos homólogos e alelos da caderina-11 e degenerados de moléculas de ácidos nucleicos que codificam para uma caderina-11.

Como usado aqui relativamente a ácidos nucleicos, o termo "isolado" significa: (i) amplificado in vitro, por exemplo, por reacção em cadeia de polimerase (PCR); produzido de modo recombinante por clonagem; (iii) purificado, como por clivagem e separação em gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo, por síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico que é facilmente manipulável por técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na área. Assim, uma sequência de nucleótidos contida num vector em que sítios 5' e 3' de restrição são conhecidos ou para a qual foram divulgadas sequências de "primers" para a reacção em cadeia de polimerase (PCR) é considerada isolada, mas uma sequência de ácido nucleico que existe no seu estado nativo no seu hospedeiro natural não está isolada. Um ácido nucleico isolado pode estar substancialmente purificado, 44 mas não é necessário. Por exemplo, um ácido nucleico que está isolado num vector de clonagem ou expressão não é puro, pois pode compreender apenas uma percentagem muito pequena do material da célula onde reside. No entanto, esse ácido nucleico está isolado, tal como o termo é usado aqui, porque é facilmente manipulável por técnicas comuns conhecidas dos profissionais. A molécula de ácido nucleico descrita aqui (por exemplo, molécula de ácido nucleico inibidora da caderina-11), numa forma de realização, está operativamente ligada a uma sequência de expressão genética que dirige a expressão da molécula de ácido nucleico inibidora da caderina-11 numa célula eucariótica. A "sequência de expressão genética" é qualquer sequência de nucleótidos reguladora, como uma sequência promotora ou combinação promotor-intensificador, que facilita a transcrição e tradução eficientes da molécula de ácido nucleico inibidora da caderina-11 à qual está operativamente ligada. A sequência de expressão genética pode ser, por exemplo, um promotor de mamífero ou virai, como um promotor constitutivo ou indutível. Promotores constitutivos de mamífero incluem mas não estão limitados aos promotores para os genes seguintes: hipoxantina fosforribosil-transferase (HPTR), adenosina desaminase, piruvato quinase, promotor da β-actina e outros promotores constitutivos. Promotores virais exemplificativos que funcionam de modo constitutivo em células eucarióticas incluem, por exemplo, promotores do vírus símio, vírus papiloma, adenovírus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do sarcoma de Rous, citomegalovírus, as repetições terminais longas (LTR) do vírus da leucemia de Moloney e outros retrovírus, e o promotor da timidina quinase do vírus herpes símplex. Os 45 profissionais conhecem outros promotores constitutivos. Os promotores úteis como sequências de expressão genética da invenção também incluem promotores indutiveis. Promotores indutiveis são expressos na presença de um agente indutor. Por exemplo, o promotor da metalotioneina é induzido a promover a transcrição e tradução na presença de certos iões metálicos. Os profissionais conhecem outros promotores indutiveis.

Em geral, a sequência de expressão genética deve incluir, consoante o necessário, sequências 5' não transcritas e 5' não traduzidas envolvidas na iniciação da transcrição e tradução, respectivamente, como uma caixa TATA, sequência "capping", sequência CAAT e afins. Em especial, essas sequências 5' não transcritas incluirão uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controlo da transcrição da molécula de ácido nucleico inibidora da caderina-11 operativamente ligada. As sequências de expressão genética incluem opcionalmente sequências intensificadoras ou sequências activadoras a montante, consoante o desejado.

Também são contempladas moléculas de ácidos nucleicos que codificam para polipéptidos da caderina-11 e seus fragmentos, polipéptidos de contra-receptores da caderina-11 e seus fragmentos e agentes inibidores da caderina-11, como descrito aqui. Estas moléculas de ácidos nucleicos podem ser utilizadas em métodos de tratamento in vivo ou em ensaios de rastreio in vitro. Quando for preferida a expressão do ácido nucleico (em oposição a algumas formas de realização de métodos de tratamento anti-sentido), a molécula de ácido nucleico é ligada a uma sequência de expressão genética que permite a expressão da molécula de 46 ácido nucleico. Moléculas de ácidos nucleicos da invenção podem ser introduzidas numa célula in vitro, seguida da transferência da célula para o sitio da inflamação. A célula onde é introduzida a molécula de ácido nucleico pode ser recolhida do sitio da inflamação (por exemplo, um linfócito, como uma célula T, um sinoviócito, como um sinoviócito do tipo B, um mastócito, um macrófago, uma célula dendritica, uma célula plasmática, um fibroblasto sinovial, uma célula de revestimento da membrana sinovial, um osteoblasto, uma célula derivada de cartilagem ou uma célula derivada de pannus invasivo), ou pode ser uma célula que normalmente não está presente no sítio da inflamação. Uma sequência que permite a expressão do ácido nucleico numa célula localizada numa articulação, tal como, por exemplo, um sinoviócito, é uma sequência que é selectivamente activa do ponto de vista da transcrição na célula e, desse modo, causa a expressão do ácido nucleico nessa célula. Os profissionais serão facilmente capazes de identificar promotores alternativos capazes de expressar essa molécula de ácido nucleico num sinoviócito, um osteoblasto, uma célula derivada de cartilagem, um linfócito ou qualquer outro tipo de célula mencionado aqui. Alternativamente, a célula transduzida pode ser cultivada in vitro para produzir um agente modulador da caderina-11 (por exemplo, agente inibidor da caderina-11), ou pode ser utilizada em ensaios de rastreio in vitro. Por exemplo, a sequência de expressão genética pode ser utilizada para expressar uma molécula de ácido nucleico da caderina-11 numa célula que inerentemente não expressa a caderina-11. A molécula de ácido nucleico da caderina-11 também pode ser expressa numa célula que inerentemente não expressa caderina-11 nem contra-receptor da caderina-11. 47 É dito que as sequências de moléculas de ácidos nucleicos descritas aqui (por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos inibidoras da caderina-11) e a sequência de expressão genética estão "operativamente ligadas" quando estão covalentemente ligadas de modo a colocar a transcrição e/ou tradução da sequência da molécula de ácido nucleico (por exemplo, uma sequência codificadora da caderina-11) sob a influência ou controlo da sequência de expressão genética. Se for desejado que a molécula de ácido nucleico seja traduzida numa proteína funcional, é dito que duas sequências de DNA estão operativamente ligadas se a indução de um promotor na sequência de expressão genética 5' originar a transcrição da molécula de ácido nucleico e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) originar a introdução de uma mutação por deslocamento do quadro de leitura, (2) interferir na capacidade da região promotora para dirigir a transcrição da molécula de ácido nucleico ou (3) interferir na capacidade do transcrito de RN A correspondente para ser traduzido num polipéptido. Assim, uma sequência de expressão genética está operativamente ligada a uma molécula de ácido nucleico se a sequência de expressão genética for capaz de efectuar a transcrição dessa molécula de ácido nucleico de modo que o transcrito resultante possa ser traduzido no polipéptido desejado.

Ainda noutras formas de realização, o agente modulador da caderina-11 é uma molécula de ácido nucleico que, em vez de codificar um polipéptido, funciona como uma molécula anti-sentido. Também são descritos aqui oligonucleótidos anti-sentido que se ligam selectivamente a uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido da caderina-11, ou seu fragmento, ou um contra-receptor da caderina-11 (por 48 exemplo, uma integrina ou uma ou mais das suas subunidades), ou seu fragmento, para diminuir a adesão mediada pela caderina-11. Aquando da utilização de preparações anti-sentido é preferida a administração local na sinóvia ou fluido sinovial.

Como usado aqui, o termo "oligonucleótido anti-sentido" ou "anti-sentido" descreve um oligonucleótido que é um oligorribonucleótido, oligodesoxirribonucleótido, oligorribonucleótido modificado ou oligodesoxirribonucleótido modificado que hibridiza, em condições fisiológicas, para DNA compreendendo um gene particular ou para um transcrito de mRNA desse gene e, desse modo, inibe a transcrição desse gene e/ou a tradução desse mRNA. As moléculas anti-sentido são concebidas de modo a interferir na transcrição ou tradução de um gene alvo por hibridização com o gene ou transcrito alvo. Os profissionais reconhecerão que o comprimento exacto do oligonucleótido anti-sentido e o seu grau de complementaridade com o seu alvo dependerão do alvo especifico seleccionado, incluindo a sequência do alvo e as bases particulares que compreendem essa sequência. É preferido que o oligonucleótido anti-sentido seja construído e disposto de modo a ligar-se selectivamente ao alvo em condições fisiológicas, isto é, de modo a hibridizar substancialmente mais para a sequência alvo do que para qualquer outra sequência na célula alvo em condições fisiológicas. Com base na SEQ ID NO: 1 ou com base em sequências genómicas e/ou de cDNA alélicas ou homólogas, o profissional pode facilmente escolher e sintetizar qualquer uma de um número de moléculas anti-sentido apropriadas para utilização de acordo com a presente invenção. Para serem suficientemente selectivos e 49 potentes para inibição, esses oligonucleótidos anti-sentido devem compreender pelo menos 10 e, mais preferivelmente, pelo menos 15 bases consecutivas que são complementares ao alvo, apesar de, em certos casos, oligonucleótidos modificados tão pequenos quanto com 7 bases de comprimento terem sido utilizados com êxito como oligonucleótidos anti-sentido (Wagner et ai., Nat. Med _1 (11) : 1116-1118, 1995). Muito preferivelmente, os oligonucleótidos anti-sentido compreendem uma sequência complementar de 20-30 bases.

Apesar de poderem ser escolhidos oligonucleótidos que são anti-sentido para qualquer região do gene ou transcritos de mRNA, em formas de realização preferidas, os oligonucleótidos anti-sentido correspondem a sítios N-terminais ou 5' a montante, como sítios de iniciação da tradução, iniciação da transcrição ou promotores. Além disso, regiões 3'-não traduzidas podem ser abordadas de modo selectivo por oligonucleótidos anti-sentido. A abordagem selectiva para sítios de processamento de mRNA também tem sido utilizada na área, mas pode ser menos preferida se ocorrer processamento alternativo de mRNA. Adicionalmente, o anti-sentido é dirigido, de preferência, para sítios onde não é esperada uma estrutura secundária de mRNA (ver, por exemplo, Sainio et ai., Cell Mol. Neurobiol. 1_4 (5) : 439-457, 1994) e onde não é esperada a ligação de proteínas. Por fim, apesar de a SEQ ID NO: 1 divulgar uma sequência de cDNA, o profissional pode facilmente derivar o DNA genómico correspondente a esta sequência. Assim, também são contemplados oligonucleótidos anti-sentido que são complementares ao DNA genómico correspondente à SEQ ID NO: 1. De modo semelhante, são abrangidos anti-sentido para cDNAs e DNAs genómicos alélicos ou homólogos de caderina-11 50 ou, alternativamente, de contra-receptores da caderina-11, sem experimentação desnecessária.

Num conjunto de formas de realização, os oligonucleótidos anti-sentido da invenção podem ser compostos por desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos "naturais", ou qualquer combinação destes. Isto é, a extremidade 5' de um nucleótido nativo e a extremidade 3' de outro nucleótido nativo podem ser covalentemente ligadas, como em sistemas naturais, via ligação inter-nucleósidos de fosfodiéster. Estes oligonucleótidos podem ser preparados por métodos reconhecidos na área, que podem ser implementados manualmente ou com um sintetizador automático. Também podem ser produzidos de modo recombinante por vectores.

No entanto, em formas de realização preferidas, os oligonucleótidos anti-sentido descritos aqui também podem incluir oligonucleótidos "modificados". Isto é, os oligonucleótidos podem ser modificados de alguns modos que não evitam a sua hibridização para o seu alvo, mas que aumentam a sua estabilidade ou abordagem selectiva ou que então aumentam a sua eficácia terapêutica. alquilfosfonatos, O termo "oligonucleótido modificado", como usado aqui, descreve um oligonucleótido no qual (1) pelo menos dois dos seus nucleótidos estão covalentemente ligados via uma ligação inter-nucleósidos sintética (isto é, uma ligação diferente de uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 5' de um nucleótido e a extremidade 3' de outro nucleótido) e/ou (2) um grupo químico não normalmente associado a ácidos nucleicos foi covalentemente ligado ao oligonucleótido. Ligações inter-nucleósidos sintéticas preferidas são fosforotioatos, 51 fosforoditioatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, ésteres de carboximetilo e péptidos. 0 termo "oligonucleótido modificado" também abrange oligonucleótidos com uma base e/ou açúcar covalentemente modificado. Por exemplo, oligonucleótidos modificados incluem oligonucleótidos com açúcares da coluna vertebral que estão covalentemente ligados a grupos orgânicos de baixo peso molecular diferentes de um grupo hidroxilo na posição 3' e diferentes de um grupo fosfato na posição 5'. Assim, oligonucleótidos modificados podem incluir um grupo ribose 2'-O-alquilado. Adicionalmente, oligonucleótidos modificados podem incluir açúcares como arabinose em vez de ribose.

Assim, a presente descrição contempla preparações farmacêuticas contendo moléculas anti-sentido modificadas que são complementares e podem hibridizar, em condições fisiológicas, com ácidos nucleicos que codificam polipéptidos da caderina-11 ou de contra-receptores da caderina-11, juntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Os oligonucleótidos anti-sentido podem ser administrados como parte de uma composição farmacêutica. Essa composição farmacêutica pode incluir os oligonucleótidos anti-sentido em combinação com quaisquer transportadores comuns fisiológica e/ou farmaceuticamente aceitáveis, que são conhecidos na área. As composições devem ser esterilizadas e devem conter uma quantidade terapeuticamente eficaz dos oligonucleótidos anti-sentido numa unidade de peso ou volume adequada para administração a um paciente. 52

Os ácidos nucleicos descritos aqui podem ser distribuídos, por exemplo, na sinóvia e em células das articulações isoladamente ou associados a um vector. No seu sentido mais lato, um "vector" é qualquer veículo capaz de facilitar: (1) a distribuição de uma molécula de ácido nucleico numa célula alvo e/ou (2) a captação de uma molécula de ácido nucleico por uma célula alvo. Preferivelmente, os vectores transportam a molécula de ácido nucleico moduladora da caderina-11 para a célula alvo com degradação reduzida relativamente à extensão da degradação que surgiria na ausência do vector. Opcionalmente, um "ligando de abordagem selectiva" pode ser ligado ao vector para distribuir selectivamente o vector numa célula que expressa, na sua superfície, o receptor cognato para o ligando de abordagem selectiva. Deste modo, o vector (contendo, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico inibidora da caderina-11) pode ser distribuído de modo selectivo no revestimento sinovial de uma cápsula articular. Metodologias de abordagem selectiva incluem conjugados, como os descritos na Patente U.S. 5,391,723. Preferivelmente, as moléculas de ácidos nucleicos descritas aqui são dirigidas para distribuição numa célula localizada numa cápsula articular, como um sinoviócito ou um linfócito.

Em geral, os vectores úteis nesses métodos são divididos em duas classes: vectores biológicos e vectores químicos/ físicos. Vectores biológicos são úteis para distribuição/ captação de ácidos nucleicos para/por uma célula alvo. Vectores biológicos incluem mas não se limitam a plasmídeos, fagemídeos, vírus, outros veículos derivados de fontes virais ou bacterianas que foram manipulados pela inserção ou incorporação das sequências de ácidos nucleicos descritas aqui e fragmentos de ácidos nucleicos adicionais 53 (por exemplo, intensificadores, promotores) que podem ser ligados às sequências de ácidos nucleicos descritas aqui. Vectores virais são um tipo preferido de vector biológico e incluem mas não se limitam a sequências de ácidos nucleicos dos seguintes vírus: adenovírus; vírus adeno-associado; retrovírus, como vírus da leucemia murina de Moloney; vírus do sarcoma murino de Harvey; vírus do tumor mamário murino; vírus do sarcoma de Rous; vírus do tipo SV40; vírus polioma; vírus Epstein-Barr; vírus papiloma; vírus herpes; vírus vacínia; poliovírus, e vírus de RNA, como um retrovírus. É possível empregar facilmente outros vectores não nomeados mas conhecidos na área.

Um vírus particularmente preferido para certas aplicações é o vírus adeno-associado, um vírus de DNA de filamentaçâo dupla. 0 vírus adeno-associado é capaz de infectar uma gama larga de tipos de células e espécies, e pode ser manipulado para ser deficiente para replicação. Tem outras vantagens, como estabilidade térmica e em solventes lipídicos, elevadas frequências de transdução em células de diversas linhagens, incluindo células hematopoiéticas, e ausência de inibição de superinfecção, desse modo permitindo múltiplas séries de transduções. Alegadamente, o vírus adeno-associado pode ser integrado em DNA celular humano de uma forma específica para sítios, desse modo minimizando a possibilidade de mutagénese por inserção e variabilidade de expressão de genes inseridos. Adicionalmente, infecções com vírus adeno-associados de tipo selvagem foram seguidas em cultura de tecidos durante mais de 100 passagens na ausência de pressão selectiva, implicando que a integração genómica do vírus adeno-associado é um acontecimento relativamente estável. O vírus adeno-associado também pode funcionar de um modo extra-cromossómico. 54

Em geral, outros vectores virais preferidos são baseados em virus eucarióticos não citopáticos nos quais genes não essenciais foram substituídos pelo gene de interesse. Vírus não citopáticos incluem retrovírus, cujo ciclo de vida envolve transcrição reversa de RNA virai genómico em DNA com integração pró-viral subsequente em DNA celular hospedeiro. Adenovírus e retrovírus foram aprovados para ensaios humanos de terapia genética. Em geral, os retrovírus são deficientes para replicação (isto é, são capazes de dirigir a síntese das proteínas desejadas mas incapazes de produzir uma partícula infecciosa) . Esses vectores de expressão retrovirais geneticamente alterados têm utilidade geral para a transdução com alta eficiência de genes in vivo. Protocolos comuns para a produção de retrovírus deficientes para replicação (incluindo os passos de incorporação de material genético exógeno num plasmídeo, transfecção de uma linha de células de empacotamento com plasmídeo, produção de retrovírus recombinantes pela linha de células de empacotamento, recolha de partículas virais do meio de cultura de tecidos e infecção das células-alvo com partículas virais) são proporcionados em Kriegler, M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., Nova Iorque (1990), e Murry, E.J. Editor "Methods in Molecular Biology," volume 7, Human Press, Inc., Cliffton, Nova Jersey (1991). Outro vector retroviral preferido é o vector derivado do vírus da leucemia murina de Moloney, descrito em Nabel, E.G., et al., Science, volume 249, páginas 1285-1288 (1990).

Para além dos vectores biológicos, vectores químicos/ físicos são úteis para a distribuição/captação de ácidos nucleicos ou polipéptidos para/por uma célula alvo. Como 55 usado aqui, um "vector químico/físico" refere-se a uma molécula natural ou sintética, diferente das derivadas de fontes bacteriológicas ou virais, capaz de distribuir o agente modulador da caderina-11 numa célula.

Um vector quimico/fisico preferido é um sistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloidal incluem sistemas à base de lipidos, incluindo emulsões óleo-em-água, micélios, micélios mistos e lipossomas. Um sistema coloidal preferido da invenção é um lipossoma. Lipossomas são vasos membranares artificiais que são úteis como vector de distribuição in vivo ou in vitro. Foi mostrado que grandes vasos unilamelares (LUV), cuja dimensão varia entre 0,1 - 4,0 μΜ, conseguem encapsular macromoléculas grandes. RNA, DNA e viriões intactos podem ser encapsulados no interior aquoso e ser distribuídos em células numa forma biologicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sei., volume 6, página 77 (1981)). Para que um lipossoma seja um vector eficiente de transferência genética devem estar presentes uma ou mais das seguintes características: (1) encapsulação do gene de interesse com alta eficiência com retenção da actividade biológica; (2) ligação preferencial e substancial a uma célula alvo em comparação com células não-alvo; (3) distribuição do conteúdo aquoso da vesícula no citoplasma da célula alvo com alta eficiência, e (4) expressão rigorosa e eficaz de informação genética.

Os lipossomas podem ser dirigidos para um tecido particular por acoplamento do lipossoma a um ligando específico, como um anticorpo monoclonal, açúcar, glicolípido ou proteína, específico para o tipo de tecido ou célula particular (por exemplo, proteínas de superfície específicas para 56 sinoviócitos). Adicionalmente, o vector pode ser acoplado a um péptido de abordagem selectiva nuclear, que irá dirigir a molécula de ácido nucleico moduladora da caderina-11 para o núcleo da célula-hospedeiro.

Lipossomas são disponibilizados comercialmente pela Gibco BRL, por exemplo, como LIPOFECTIN™ e LIPOFECTACE™, que são formados por lipidos catiónicos tais como cloreto de N-[l-(2,3-dioleíloxi)-propil]-Ν,Ν,Ν-trimetilamónio (DOTMA) e brometo de dimetildioctadecilamónio (DDAB). Métodos de preparação de lipossomas são bem conhecidos na área e foram descritos em muitas publicações. Os lipossomas também foram revistos por Gregoriadis, G. em Trends in Biotechnology, Volume 3, páginas 235-241 (1985) .

Em geral, as moléculas de ácidos nucleicos moduladoras da caderina-11 podem ser administradas ao sujeito (qualquer receptor mamífero) usando os mesmos modos de administração que são presentemente utilizados para terapia genética em humanos (por exemplo, terapia genética mediada por adenovírus). Um procedimento patenteado para efectuar terapia genética ex vivo é apresentado na Patente U.S. 5,399,346 e em apresentações submetidas no historial dessa patente, todos os quais são documentos publicamente disponíveis. Em geral, terapia genética ex vivo envolve a introdução in vitro de uma cópia funcional de um gene, ou seu fragmento, em célula (s) de um sujeito e repor a(s) célula(s) geneticamente manipuladas no sujeito. A cópia funcional do gene, ou seu fragmento, está sob o controlo operável de elementos reguladores que permitem a expressão do gene na(s) célula (s) geneticamente manipulada(s). Em conformidade, os ácidos nucleicos descritos aqui, incluindo as moléculas de ácidos nucleicos inibidoras da caderina-11, 57 podem ser distribuídos em sinoviócitos ou linfócitos, ou outras células da cápsula articular, ex vivo ou in vivo, para tratar uma perturbação inflamatória das articulações. Numerosas técnicas de transfecção e transdução, bem como vectores de expressão apropriados, são bem conhecidas dos profissionais, e algumas são descritas no requerimento PCT WO 95/00654.

Como exemplo ilustrativo, um vector contendo uma molécula de ácido nucleico é distribuído num sítio de inflamação das articulações num sujeito que é candidato a essa terapia genética. Em seguida, o vector modifica geneticamente os sinoviócitos, osteoblastos, células hematopoiéticas, como macrófagos e células NK, e/ou linfócitos in vivo com DNA que codifica, por exemplo, um polipéptido inibidor da caderina-11 da invenção. É esperado que essas células das articulações geneticamente modificadas interfiram na ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor in vivo.

Numa forma de realização alternativa, sinoviócitos humanos primários podem ser obtidos de um sujeito candidato a essa terapia genética. Em seguida, essas células podem ser geneticamente manipuladas ex vivo com DNA que codifica, por exemplo, um polipéptido inibidor da caderina-11 da invenção. É esperado que essas células recombinantes inibam a adesão mediada pela caderina-11 in vivo. Ainda noutro exemplo, outro tipo de células que não expressam a caderina-11 nem contra-receptores da caderina-11 podem ser geneticamente manipuladas in vitro para expressarem um agente inibidor da caderina-11 e então podem ser introduzidas no sítio da inflamação. 58

Composições exemplificativas que podem ser utilizadas para facilitar a captação in vitro das moléculas de ácidos nucleicos por uma célula alvo incluem fosfato de cálcio e outros mediadores químicos do transporte intracelular, composições para microinjecção, composições para electroporação e recombinação homóloga (por exemplo, para integrar um ácido nucleico numa localização pré-seleccionada no cromossoma da célula alvo).

Também são proporcionados fragmentos únicos isolados de uma molécula de ácido nucleico isolada seleccionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1. Um fragmento de ácido nucleico único é um fragmento que é uma "assinatura" do ácido nucleico maior. Por exemplo, o fragmento único é suficientemente longo para assegurar que a sua sequência precisa não se encontra em moléculas do genoma humano fora das moléculas de ácidos nucleicos da caderina-11 definidas aqui. Os profissionais podem aplicar simplesmente procedimentos de rotina para determinar se um fragmento é único no genoma humano. A invenção também proporciona uma composição farmacêutica (isto é, uma preparação farmacêutica) para modular uma função mediada pela caderina-11 num sujeito. A composição inclui um transportador farmaceuticamente aceitável e um agente modulador da caderina-11 (por exemplo, um agente inibidor da caderina-11) .

As preparações farmacêuticas, descritas acima, são administradas em quantidades eficazes. Para aplicações terapêuticas, é geralmente aquela quantidade suficiente para se obter um resultado desejável do ponto de vista médico. Em geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz é 59 aquela quantidade necessária para retardar o surgimento, inibir a progressão ou interromper o estado particular a ser tratado. Como exemplo, a quantidade eficaz é geralmente aquela quantidade que alivia os sintomas (por exemplo, dor, inflamação, etc.) das perturbações descritas aqui. A quantidade eficaz irá depender do modo de administração, do estado particular a ser tratado e do resultado desejado. Também irá depender da fase de progressão do estado, da gravidade do estado, idade e estado físico do sujeito a ser tratado, a natureza da terapia concorrente, se existir, a duração do tratamento, a via de administração específica e factores afins do âmbito e perícia do médico. Para aplicações profilácticas, é a quantidade suficiente para retardar o surgimento, inibir a progressão ou interromper o estado particular a ser prevenido, e pode ser medida pela quantidade requerida para prevenir o surgimento de sintomas.

Em geral, doses de compostos activos da presente invenção irão desde cerca de 0.01 mg/kg por dia até 1000 mg/kg por dia, preferivelmente desde cerca de 0.1 mg/kg até 200 mg/kg e muito preferivelmente desde cerca de 0.2 mg/kg até cerca de 20 mg/kg, em uma ou mais doses diárias de administração durante um ou mais dias. É esperado que sejam adequadas doses variando entre 1-500 mg/kg, preferivelmente doses variando entre 1-100 mg/kg e ainda mais preferivelmente doses variando entre 1-50 mg/kg. A quantidade preferida pode ser determinada pelo profissional de acordo com a prática comum para determinar níveis óptimos de dosagem do agente. É geralmente preferido que seja utilizada uma dose máxima de um agente modulador da caderina-11 que é a dose mais alta segura de acordo com avaliação médica sustentada. 60

Os agentes moduladores da caderina-11 da invenção podem ser administrados a um sujeito necessitado desse tratamento em combinação com terapia concorrente para tratar uma perturbação inflamatória das articulações. A terapia concorrente pode ser invasiva, como remoção de fluido da cápsula articular, ou pode envolver terapia com fármacos, como a administração de fármacos anti-inflamatórios não esteróides, fármacos anti-reumáticos (por exemplo, ouro e penicilamina), fármacos de modulação imunológica (por exemplo, ciclosporina) e fármacos corticosteróides. Estas terapias com fármacos são bem conhecidas dos profissionais e são administradas por modos conhecidos dos profissionais. As terapias com fármacos são administradas em quantidades que são eficazes para se obterem os objectivos fisiológicos (por exemplo, para reduzir inflamação numa articulação) em combinação, por exemplo, com o agente inibidor da caderina-11 da invenção. Assim, é contemplado que as terapias com fármacos possam ser administradas em quantidades que não são capazes de prevenir ou reduzir as consequências fisiológicas de uma perturbação inflamatória das articulações quando as terapias com fármacos são administradas isoladamente, mas que são capazes de reduzir as consequências quando administradas em combinação com os agentes moduladores da caderina-11 da invenção. O agente modulador da caderina-11 pode ser administrado isoladamente ou em combinação com as terapias de fármacos acima descritas como parte de uma composição farmacêutica. Essa composição farmacêutica pode incluir o agente modulador da caderina-11 em combinação com quaisquer transportadores comuns fisiológica e/ou farmaceuticamente aceitáveis conhecidos na área. As composições devem ser esterilizadas e conter uma quantidade terapeuticamente 61 eficaz do agente modulador da caderina-11 numa unidade de peso ou volume adequada para administração a um paciente. 0 termo "transportador farmaceuticamente aceitável", como usado aqui, significa um ou mais agentes de enchimento, diluentes ou substâncias de encapsulação compatíveis sólidos ou líquidos que são adequados para administração a um humano ou outro animal. 0 termo "farmaceuticamente aceitável" designa um material não tóxico que não interfere na eficácia da actividade biológica dos ingredientes activos. Farmaceuticamente aceitável também significa um material não tóxico que é compatível com um sistema biológico, como uma célula, cultura de células, tecido ou organismo. 0 termo "transportador" designa um ingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual é combinado o ingrediente activo para facilitar a aplicação. As características do transportador irão depender da via de administração. Os componentes das composições farmacêuticas também estão aptos a ser misturados em conjunto com os agentes da presente invenção, e entre si, de modo a não haver nenhuma interacção que enfraqueça substancialmente a eficácia farmacêutica desejada. 0 transportador farmaceuticamente aceitável deve ser esterilizado para administração in vivo. Transportadores fisiológica e farmaceuticamente aceitáveis incluem diluentes, agentes de enchimento, sais, tampões, estabilizadores, solubilizadores e outros materiais que são bem conhecidos na área.

Composições adequadas para administração parentérica compreendem convenientemente uma preparação aquosa esterilizada dos agentes moduladores da caderina-11, que é preferivelmente isotónica com o sangue do receptor. Esta preparação aquosa pode ser formulada de acordo com métodos 62 conhecidos, utilizando agentes dispersantes e humedecedores e agentes de suspensão adequados. A preparação injectável esterilizada também pode ser uma solução ou suspensão injectável esterilizada num diluente ou solvente não tóxico e parentericamente aceitável, por exemplo, uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veiculos e solventes aceitáveis que podem ser empregues contam-se água, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. Adicionalmente, óleos fixos esterilizados são convenientemente empregues como solvente ou meio de suspensão. Para esta finalidade pode ser empregue qualquer óleo fixo brando, incluindo mono- ou diglicéridos sintéticos. Adicionalmente, ácidos gordos, como ácido oleico, podem ser utilizados na preparação de injectáveis. Formulações transportadoras adequadas para administração oral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, etc., podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA.

Está disponível uma variedade de vias de administração. 0 modo particular seleccionado dependerá, obviamente, do fármaco particular seleccionado, da gravidade do estado a ser tratado e da dosagem requerida para eficácia terapêutica. Os métodos da invenção, em termos gerais, podem ser implementados utilizando qualquer modo de administração que seja aceitável do ponto de vista clínico, significando qualquer modo que produza níveis eficazes dos compostos activos sem causar efeitos adversos clinicamente inaceitáveis. Esses modos de administração incluem as vias oral, rectal, tópica, nasal, interdérmica ou parentérica. 0 termo "parentérico" inclui subcutâneo, intravenoso, intramuscular ou por infusão. As vias intravenosa ou intramuscular não são particularmente adequadas para terapia e profilaxia de longa duração. No entanto, podem 63 ser preferidas em situações de emergência. A administração oral será preferida para tratamento profiláctico por conveniência para o paciente e calendarização das dosagens. Em formas de realização preferidas, a composição farmacêutica é administrada directamente na sinóvia, fluido sinovial ou cápsula articular por injecção, preferivelmente com uma seringa.

Formulações para utilização de acordo com os métodos da invenção incluem uma seringa contendo um agente modulador da caderina-11, como um agente inibidor da caderina-11, e um transportador farmaceuticamente aceitável que seja adequado para injecção no fluido sinovial.

As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em forma galénica unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na área farmacêutica. Todos os métodos incluem o passo de associar os agentes moduladores da caderina-11 a um transportador que é constituído por um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições são preparadas por associação uniforme e íntima dos agentes moduladores da caderina-11 a um transportador líquido, um transportador sólido finamente dividido ou ambos, e então, se necessário, configuração do produto. Composições adequadas para administração oral podem ser apresentadas na forma de unidades discretas, como cápsulas, comprimidos, rebuçados, em que cada uma contém uma quantidade predeterminada do agente modulador da caderina-11. Outras composições incluem suspensões em líquidos aquosos ou líquidos não aquosos, como um xarope, elixir ou uma emulsão. 64

Numa forma de realização particular, o veículo preferido para distribuição dos agentes moduladores da caderina-11 da invenção é uma micropartícula ou implante biocompatível que é adequado para implantação numa articulação ou na vizinhança de uma articulação lesionada do receptor. Implantes bioerodíveis exemplificativos que são úteis de acordo com este método são descritos no requerimento internacional PCT n° PCT/US/03307 (Publicação N° WO 95/24929, intitulada "Polymeric Gene Delivery System", que reivindica prioridade para o requerimento de patente U.S. n° de série 213, 668, registado em 15 de Março de 1994). O documento PCT/US/0307 descreve uma matriz polimérica biocompatível, preferivelmente biodegradável, para conter um gene exógeno sob o controlo de um promotor apropriado. A matriz polimérica é utilizada para se obter libertação sustentada do gene exógeno no sujeito. De acordo com a presente invenção, os agentes moduladores da caderina-11 descritos aqui são encapsulados ou dispersos na matriz polimérica biocompatível, preferivelmente biodegradável, divulgada em PCT/US/03307. Preferivelmente, a matriz polimérica está na forma de uma micropartícula, como uma microesfera (na qual, por exemplo, o agente inibidor da caderina-11 é disperso numa matriz polimérica sólida) ou uma microcápsula (na qual, por exemplo, o agente inibidor da caderina-11 é armazenado no núcleo de um invólucro polimérico). Outras formas da matriz polimérica para conter o agente modulador da caderina-11 incluem filmes, revestimentos, géis, implantes e próteses. A dimensão e composição do dispositivo da matriz polimérica são seleccionadas de modo a originar uma cinética de libertação favorável no tecido onde é implantado o dispositivo matricial. A dimensão do dispositivo da matriz polimérica é adicionalmente seleccionado de acordo com o método de 65 distribuição a ser utilizado, tipicamente injecção num tecido, como a articulação, cápsula articular, membrana sinovial ou fluido sinovial, ou administração de uma suspensão por aerossol nas áreas nasal e/ou pulmonar. A composição da matriz polimérica pode ser seleccionada de modo a serem obtidas taxas de degradação favoráveis, e também de modo a ser formada por um material que é bioadesivo, para aumentar adicionalmente a eficácia da transferência quando o dispositivo é administrado na sinóvia de uma articulação. A composição matricial também pode ser seleccionada de modo a não ser degradada, mas sim libertada por difusão durante um período de tempo prolongado.

Matrizes poliméricas não biodegradáveis e biodegradáveis podem ser utilizadas para distribuir os agentes moduladores da caderina-11, incluindo os agentes inibidores da caderina-11, da invenção no sujeito. São preferidas matrizes biodegradáveis. Esses polímeros podem ser polímeros naturais ou sintéticos. São preferidos polímeros sintéticos. 0 polímero é seleccionado com base no período de tempo durante o qual é desejada a libertação, em geral da ordem de algumas horas até um ano ou mais. Tipicamente é muito desejável libertação durante um período que varia entre algumas horas e três até doze meses. Opcionalmente, o polímero está na forma de um hidrogel que pode absorver até cerca de 90% do seu peso em água e, além disso, opcionalmente, está reticulado com iões multivalentes ou outros polímeros.

Em geral, os agentes moduladores da caderina-11 da invenção são distribuídos utilizando o implante bioerodível por meio de difusão ou, mais preferivelmente, por degradação da 66 matriz polimérica. Polímeros sintéticos exemplificativos que podem ser utilizados para formar o sistema de distribuição biodegradável incluem: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenoglicóis, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, álcoois polivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos, haletos de polivinilo, polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polissiloxanos, poliuretanos e seus copolímeros, alquilcelulose, hidroxialquilceluloses, éteres de celulose, ésteres de celulose, nitroceluloses, polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos, metilcelulose, etilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetil-celulose, hidroxibutilmetilcelulose, acetato de celulose, propionato de celulose, acetato de butirato de celulose, acetato de ftalato de celulose, carboxiletilcelulose, triacetato de celulose, sal de sódio de sulfato de celulose, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecilo), polietileno, polipropileno, poli(etilenoglicol), poli(óxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), poli(álcoois vinílicos), acetato de polivinilo, cloreto de polivinilo, poliestireno e polivinilpirrolidona.

Exemplos de polímeros biodegradáveis incluem polímeros sintéticos, tais como polímeros de ácido láctico e ácido glicólico, polianidridos, poli(orto)ésteres, poliuretanos, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico) e poli(láctido-co-caprolactona), e polímeros naturais, como alginato e 67 outros polissacáridos, incluindo dextrano e celulose, colagénio, seus derivados químicos (substituições, adições de grupos quimicos, por exemplo, alquilo, alquileno, hidroxilações, oxidações, e outras modificações habitualmente feitas pelos profissionais), albumina e outras proteínas hidrófilas, zeína e outras prolaminas e proteínas hidrófobas, seus copolímeros e misturas. Em geral, estes materiais degradam-se por hidrólise enzimática ou exposição a água in vivo, por erosão superficial ou em volume.

Polímeros bioadesivos de interesse particular incluem hidrogéis bioerodíveis (descritos por H.S. Sawhney, C.P. Pathak e J.A. Hubell em Macromolecules, 1993, 2_6, 581-587, ácido poli-hialurónicos, casos de gelatina, glutina, polianidridos, ácido poliacrílico, alginato, quitosano, poli(metacrilatos de metilo), poli(metacrilatos de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) e poli(acrilato de octadecilo).

Exemplos de polímeros não biodegradáveis incluem acetato de etilenovinilo, ácido poli(met)acrílico, poliamidas, seus copolímeros e misturas.

Outros sistemas de distribuição podem incluir sistemas de distribuição de libertação calendarizada, libertação retardada ou libertação sustentada. Esses sistemas podem evitar administrações repetidas dos agentes moduladores da caderina-11 descritos acima, aumentando a conveniência para 68 o sujeito e para o médico. Estão disponíveis muitos tipos de sistemas de distribuição por libertação, sendo conhecidos dos profissionais. Incluem os sistemas poliméricos acima descritos, bem como sistemas de base polimérica, como poli(láctido-glicólido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliésteramidas, poliortoésteres, ácido poli-hidroxibutírico e polianidridos. Microcápsulas dos polímeros anteriores contendo fármacos são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 5,075,109. Sistemas de distribuição também incluem sistemas não poliméricos, que consistem nos seguintes: lípidos, incluindo esteróis, como colesterol, ésteres de colesterol e ácidos gordos ou gorduras neutras, como mono-, di- e triglicéridos; sistemas de libertação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas à base de péptidos; revestimentos cerosos; comprimidos utilizando aglutinantes e excipientes convencionais; implantes parcialmente fundidos, e afins. Exemplos específicos incluem mas não estão limitados aos seguintes: (a) sistemas de erosão, nos quais o agente modulador da caderina-11 está contido numa forma dentro de uma matriz como as descritas nas Patentes U.S. N°s 4,452,775, 4,675,189 e 5,736,152, e (b) sistemas de difusão, nos quais um componente activo é permeado de um polímero a uma velocidade controlada, como descrito nas Patentes U.S. N°s 3,854,480, 5,133,974 e 5,407,686. Além disso, podem ser utilizados sistemas de distribuição de equipamento à base de bombas, alguns dos quais estão adaptados para implantação. A utilização de um implante de libertação sustentada de longa duração pode ser particularmente adequada para o tratamento de estados crónicos. Libertação de longa duração, como usado aqui, significa que o implante é 69 construído e afinado para a distribuição de níveis terapêuticos do ingrediente activo durante pelo menos 30 dias e preferivelmente 60 dias. Implantes de libertação sustentada de longa duração são bem conhecidos dos profissionais e incluem alguns dos sistemas de libertação descritos acima.

Outro aspecto da invenção inclui um método de ensaio de rastreio para determinar se um agente inibidor putativo da caderina-11 modula a adesão mediada pela caderina-11. Em certas formas de realização utiliza-se um ensaio de adesão in vitro como ensaio de rastreio para medir a capacidade de um agente, por exemplo, um composto protótipo farmacêutico, um anticorpo ou seu fragmento, um membro de biblioteca ou um análogo peptídico, para inibir a adesão mediada pela caderina-11 entre uma primeira célula que expressa a caderina-11 e uma segunda célula que expressa um contra-receptor da caderina-11 in vitro. O ensaio constitui uma previsão da capacidade do agente para inibir a actividade mediada pela caderina-11 in vivo.

Os parceiros de ligação nos ensaios de adesão são os ligandos e receptores particulares envolvidos na adesão mediada pela caderina-11. Em conformidade, podem ser realizados ensaios de adesão nos quais os parceiros de ligação são: (1) uma célula que expressa uma caderina, como caderina-11 (por exemplo, sinoviócitos, fibroblastos sinoviais, osteoblastos e células transfectadas com caderina-11) e uma célula que expressa um contra-receptor da caderina-11 (por exemplo, sinoviócitos, fibroblastos sinoviais, osteoblastos, linfócitos T e B, células plasmáticas, macrófagos, células dendríticas, mastócitos, células NK e células transfectadas com contra-receptores da 70 caderina-11); (2) uma caderina-11 isolada e uma célula que expressa o contra-receptor; (3) um contra-receptor da caderina-11 isolado e uma célula que expressa caderina-11, e (4) um polipéptido da caderina-11 isolado e o seu contra-receptor isolado. Quando forem utilizados caderina-11 isolada ou um contra-receptor da caderina-11 isolado, estes podem estar presentes em forma imobilizada (por exemplo, imobilizados numa superfície sólida) ou em forma solúvel.

Como usado aqui relativamente a ensaios de adesão, um contra-receptor da caderina-11 pode estar presente na forma de um contra-receptor da caderina-11 isolado, um fragmento ou análogo peptídico funcionalmente equivalente do contra-receptor da caderina-11 isolado, ou uma célula que expressa o contra-receptor de modo extracelular ou seu fragmento ou análogo peptídico funcionalmente equivalente. De modo semelhante, a caderina-11 pode estar presente na forma de um polipéptido da caderina-11 isolado, um fragmento ou análogo peptídico funcionalmente equivalente da caderina-11, ou uma célula que expressa a caderina-11 de modo extracelular ou seu fragmento ou análogo peptídico funcionalmente equivalente. A caderina-11 ou o seu contra-receptor pode ser imobilizado em suportes, como placas de microtítulo ou esférulas, utilizando procedimentos conhecidos do profissional.

Assim, pode ser realizado um ensaio de rastreio de alto rendimento para seleccionar compostos protótipos farmacêuticos no qual, por exemplo, (1) caderina-11 ou o contra-receptor da caderina-11 é imobilizado na superfície de uma cavidade de microtítulo, (2) alíquotas de uma biblioteca molecular contendo membros da biblioteca são adicionadas às cavidades, (3) células que expressam um 71 contra-receptor da caderina-11 ou caderina-11 (consoante o caso) são adicionadas às cavidades e (4) os componentes das cavidades são incubados durante um período de tempo que é suficiente para as células se ligarem à caderina-11 imobilizada. Preferivelmente, as células são etiquetadas (por exemplo, pré-incubadas com 51Cr ou um corante fluorescente) antes da sua adição à cavidade de microtítulo. Após o período de incubação, as cavidades são lavadas, para remover células não aderentes, e determina-se o sinal (atribuído à etiqueta nas células aderentes). Utiliza-se um controlo positivo (por exemplo, sem nenhum membro da biblioteca presente) na mesma placa de microtítulo para determinar o valor da adesão máxima. Utiliza-se um controlo negativo (por exemplo, caderina-11 solúvel adicionada à cavidade de microtítulo) na mesma placa de microtítulo para determinar níveis máximos de inibição da adesão. Como exemplo, caderina-11 pode ser imobilizada na superfície e as células adicionadas podem ser células T. De modo consistente com outras formas de realização da invenção, o ensaio de rastreio de alto rendimento também pode empregar uma caderina-11 e/ou contra-receptor da caderina-11 isolados, e os dois podem estar em forma imobilizada ou solúvel.

Os agentes a serem rastreados podem ser compostos protótipos farmacêuticos sintetizados em bibliotecas moleculares. Estas bibliotecas podem originar péptidos (isto é, bibliotecas de péptidos) ou pequenas moléculas orgânicas ou inorgânicas. Os agentes a serem rastreados também podem ser análogos peptídicos da caderina-11 ou contra-receptor da caderina-11. Preferivelmente, o péptido ou análogo peptídico da caderina-11 ou contra-receptor da caderina-11 corresponde à porção de qualquer um dos 72 polipéptidos responsável pela ligação ao seu parceiro de ligação. Para os dois polipéptidos, esta porção é extracelular.

De acordo ainda com outro aspecto da invenção, é proporcionado um método de rastreio de uma biblioteca molecular para identificar moléculas protótipos farmacêuticos que inibem a adesão in vitro entre uma primeira célula que expressa caderina-11 e uma segunda célula que expressa um contra-receptor da caderina-11. Por exemplo, a capacidade de uma molécula para inibir a ligação de uma célula sinovial a um linfócito T, ou a ligação de uma célula sinovial a outra célula sinovial in vitro pode ser utilizada como ensaio de rastreio para identificar compostos protótipos que inibem a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor. Esses ensaios de adesão são bem conhecidos na área e são ilustrados pelo ensaio apresentado nos Exemplos.

Um método de rastreio preferido envolve realizar um ensaio de adesão entre uma primeira célula e uma segunda célula na presença e ausência de pelo menos um membro da biblioteca molecular, para determinar se o membro da biblioteca modula a adesão entre a primeira célula e a segunda célula in vitro. Preferivelmente, a primeira célula expressa a caderina-11 e a segunda célula expressa um contra-receptor da caderina-11. Esta forma de realização envolve: (1) efectuar um primeiro ensaio de adesão entre a primeira célula e a segunda célula, para obter um primeiro resultado do ensaio de adesão; (2) efectuar um segundo ensaio de adesão entre a primeira célula e a segunda célula na presença do membro da biblioteca, para obter um segundo resultado do ensaio de adesão, e (3) comparar o primeiro e 73 o segundo resultados dos ensaios de adesão, para determinar se o membro da biblioteca modula a adesão entre a primeira célula e a segunda célula. Uma diferença entre o primeiro e o segundo resultados dos ensaios de adesão indica a capacidade do membro da biblioteca para modular a ligação entre a primeira célula e a segunda célula e, desse modo, a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor. Assim, por exemplo, um resultado do ensaio de adesão que exiba ligação reduzida entre a primeira célula e a segunda célula quando o ensaio é conduzido na presença do membro da biblioteca, em comparação com o resultado do ensaio obtido quando o ensaio é realizado na ausência do membro da biblioteca, indica que o membro da biblioteca inibe a ligação entre a primeira célula e a segunda célula. É apresentado nos Exemplos um ensaio de adesão exemplificativo. Outros ensaios de adesão afins são bem conhecidos na área e podem ser desenvolvidos e efectuados utilizando não mais do que experimentação de rotina. Assim, por exemplo, o ensaio de adesão pode ser realizado substituindo a primeira célula e a segunda célula por uma caderina-11 isolada e o seu contra-receptor isolado.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um ensaio de rastreio para compostos protótipos farmacêuticos que modulam a função celular da caderina-11. Estes ensaios de rastreio envolvem determinar um primeiro valor para um parâmetro celular (por exemplo, proliferação celular) de uma célula que expressa a caderina-11 (por exemplo, um sinoviócito) na ausência de um membro da biblioteca molecular, determinar um segundo valor para o mesmo parâmetro celular numa célula que expressa a caderina-11 na presença de um membro da biblioteca molecular e comparar o primeiro e o segundo valores do parâmetro celular como 74 medida do efeito do membro da biblioteca molecular nesse parâmetro celular particular. Como exemplo, um segundo valor que é menor do que o primeiro valor é indicador de uma redução da proliferação celular. A proliferação celular pode ser medida de alguns modos, bem conhecidos do profissional, incluindo mas não se limitando à incorporação de nucleótidos radioactivos (por exemplo, ensaios de captação de timidina) e contagem de células. Um exemplo de um ensaio de proliferação de células T é descrito na Patente U.S. 6,077,833. Nestes ensaios, as células a serem utilizadas podem ter aderido a uma superfície sólida ou podem estar presentes numa suspensão.

De igual modo, o ensaio também pode ser realizado medindo outros parâmetros celulares, como apoptose, migração, ligação e/ou secreção de factores (por exemplo, factores inflamatórios) . Para ensaios de rastreio de apoptose podem utilizar-se contagens de células como leitura da quantidade de apoptose. Outros ensaios de apoptose são descritos na Patente U.S. N° 6,107,088. Para ensaios de secreção de factores, o sobrenadante onde estão as células pode ser testado quanto à presença de factores utilizando outros ensaios funcionais ou ensaios imunológicos (por exemplo, ensaios ELISA, bioensaios, colorações "Western", ensaios RIA e afins para detectar citoquinas particulares). Por exemplo, pode medir-se a secreção de IL-6 utilizando o sobrenadante num ensaio que mede o crescimento celular de células dependentes de IL-6. Também pode ser medida a activação geral de células imunológicas utilizando ensaios como os descritos na Patente U.S. N° 5,569,585.

Nalgumas formas de realização preferidas, a função celular é uma função diferente da ligação da caderina-11 a um 75 contra-receptor da caderina-11. Assim, o composto protótipo farmacêutico preferível, de acordo com este aspecto da invenção, é um composto que intensifica ou inibe uma função celular mediada pela caderina-11, como proliferação, sinalização, apoptose, produção ou secreção de factores, migração ou ligação, mas que não inibe a ligação da caderina- 11 a um contra-receptor da caderina-11.

Preferivelmente, os agentes moduladores da caderina-11 que não inibem a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor são seleccionados de bibliotecas de moléculas pequenas, como bibliotecas de química combinatorial.

Em todos os ensaios acima mencionados é opcionalmente realizado de início um rastreio de ligação preliminar antes dos ensaios de rastreio descritos aqui. Esse rastreio de ligação preliminar enriquece e, nalguns casos, identifica compostos protótipos farmacêuticos que se ligam à caderina-11 ou ao seu contra-receptor. Não é necessário que estes ensaios preliminares meçam a capacidade inibidora ou moduladora do sinal dos compostos identificados, mas sim que sirvam para reduzir o número de compostos a serem adicionalmente rastreados. Assim, como exemplo, uma biblioteca molecular pode ser inicialmente contactada com caderina-11 ou um contra-receptor da caderina-11 (preferivelmente imobilizados), e os membros da biblioteca que se ligam à caderina-11 ou contra-receptor da caderina-11 são adicionalmente rastreados quanto à sua capacidade para inibir a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor, ou para modular uma função celular de células que expressam a caderina-11. Uma vez que agentes que modulam a função celular o fazem em células que expressam a caderina-11, o rastreio preliminar apropriado para estes agentes consistirá na ligação à caderina-11. Para agentes 76 inibidores da invenção, o rastreio preliminar pode testar a ligação à caderina-11 ou contra-receptor da caderina-11.

Os agentes moduladores da caderina-11 da invenção podem ser sintetizados a partir de péptidos ou outras biomoléculas, incluindo mas não se limitando a sacáridos, ácidos gordos, esteróis, isoprenóides, purinas, pirimidinas, derivados ou análogos estruturais dos acima, ou suas combinações e afins. Podem ser utilizadas bibliotecas de expressão em fagos e bibliotecas químicas combinatoriais para desenvolver e seleccionar compostos sintéticos que são agentes moduladores e/ou inibidores da caderina-11. Também é contemplada na invenção a utilização de agentes preparados a partir de peptóides, bio-oligómeros aleatórios (Patente U.S. 5,650,489), benzodiazepinas, diversómeros, como didantoínas, benzodiazepinas e dipéptidos, péptido-miméticos não peptídicos com um suporte de beta-D-glucose, oligocarbamatos ou fosfonatos de peptidilo.

Os agentes da invenção podem ser produzidos em massa utilizando tecnologia de bibliotecas. Nalguns aspectos, os métodos da invenção empregam esta tecnologia de bibliotecas para gerar e subsequentemente identificar moléculas pequenas, incluindo péptidos pequenos, que se ligam a uma caderina-11 ou a um contra-receptor da caderina-11. Uma vantagem da utilização de bibliotecas é a fácil manipulação de milhões de diferentes candidatos putativos de pequena dimensão em pequenos volumes reaccionais (isto é, em reacções de síntese e rastreio). Outra vantagem das bibliotecas é a capacidade para sintetizar agentes que, de outro modo, poderiam não ser obtidos utilizando fontes de ocorrência natural, em particular no caso de fracções não peptídicas. 77

Uma "biblioteca molecular" refere-se a um conjunto de moléculas estruturalmente diversas. Bibliotecas moleculares podem ser sintetizadas quimicamente ou produzidas de modo recombinante. Como usado aqui, um "membro da biblioteca molecular" refere-se a uma molécula que está presente na biblioteca molecular. Em geral, uma biblioteca molecular contém desde duas até 1012 moléculas, e qualquer número inteiro entre estes , por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 102, 103, 104, 101 O τ—1 , io7, CD O τ—1 O τ—1 O τ—1 O τ—1 O τ—1 ) e assim por diante, tal como se cada inteiro tivesse sido descrito aqui. Métodos de preparação de bibliotecas de moléculas são bem conhecidos na área, e muitas bibliotecas estão disponíveis no mercado. Bibliotecas de interesse na invenção incluem bibliotecas de péptidos, bibliotecas de oligonucleótidos aleatórios, bibliotecas orgânicas combinatoriais sintéticas e afins. Bibliotecas de péptidos degenerados podem ser facilmente preparadas em solução, em forma imobilizada, como bibliotecas de expressão de péptidos em flagelos bacterianos ou como bibliotecas de expressão em fagos. Ligandos de péptidos podem ser seleccionados de bibliotecas combinatoriais de péptidos contendo pelo menos um aminoácido. Podem ser sintetizadas bibliotecas de peptóides e fracções sintéticas não peptídicas. Essas bibliotecas podem ser adicionalmente sintetizadas de modo a conterem fracções sintéticas não peptídicas que estão menos sujeitas a degradação enzimática em comparação com os seus correspondentes de ocorrência natural. Também se pretende que bibliotecas incluam, por exemplo, mas não se limitem a péptidos em bibliotecas de plasmídeos, bibliotecas de polissomas, bibliotecas de aptâmeros, bibliotecas de 78 péptidos sintéticos, bibliotecas de moléculas pequenas sintéticas e bibliotecas químicas. As bibliotecas também podem compreender estruturas cíclicas de carbono ou heterocíclicas e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais identificados acima.

Muitos destes agentes da invenção podem ser sintetizados utilizando abordagens de bibliotecas recombinantes ou químicas. Uma vasta série de agentes pode ser gerada de bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Bibliotecas de compostos naturais na forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais estão disponíveis ou podem ser facilmente produzidas. Bibliotecas e compostos naturais e produzidos de modo sintético podem ser facilmente modificados por meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais. Parceiros de ligação conhecidos da caderina-11 podem ser sujeitos a modificações químicas dirigidas ou aleatórias, como acilação, alquilação, esterificação, amidação, etc., para produzir análogos estruturais destes parceiros de ligação, que podem actuar como agonistas ou antagonistas.

Bibliotecas incluem bibliotecas produzidas de modo recombinante de proteínas de fusão. Uma biblioteca exemplificativa produzida de modo recombinante é preparada por ligação de fragmentos de cDNA da caderina-11, por exemplo, ao vector pGEX-2T (Pharmacia, Piscataway, NJ). Este vector contém o terminal carboxi da glutationa S-transferase (GST) de Schistosoma japonicum. A utilização do vector contendo GST facilita a purificação de proteínas de fusão GST-caderina-11 de lisatos bacterianos por cromatografia de afinidade em glutationa sefarose. Após 79 eluição da coluna de afinidade, proteínas de fusão caderina-11 GST são testadas quanto à actividade, por exemplo, por contacto de pelo menos uma proteína de fusão com uma célula que expressa a caderina-11 antes (ou de modo concorrente) do contacto da célula que expressa o contra-receptor da caderina-11 com uma célula que expressa a caderina-11. Proteínas de fusão que inibem a ligação entre as células que expressam o contra-receptor da caderina-11 e as células que expressam a caderina-11 são seleccionadas como compostos protótipos farmacêuticos. Estas proteínas também são úteis na caracterização adicional da porção da caderina-11 à qual se liga o contra-receptor. Ver, por exemplo, Koivunen E. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(27): 20205, que descreve a selecção de péptidos que se ligam à integrina α5βι de uma biblioteca de expressão em fagos.

Bibliotecas sintéticas de DNA e RNA também são habitualmente utilizadas na área. Por exemplo, Ellington e Szostak descrevem a utilização de bibliotecas de polinucleótidos aleatórios para identificar novos ligandos (Ellington e Szostak, Nature, 346, 818-822 (1990)). Como exemplo, podem ser feitas modificações que criam variantes da caderina-11 ao nível da sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido da caderina-11. Podem ser feitas substituições de aminoácidos por mutação dirigida por PCR, mutagénese dirigida a sítios de acordo com o método de Kunkel (Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 8_2: 488-492, 1985), ou por síntese química das moléculas de ácidos nucleicos que codificam a caderina-11 ou um contra-receptor da caderina-11.

Como descrito no documento U.S. 5,908,609, compostos exemplificativos de bibliotecas também incluem mas não se 80 limitam a péptidos, tais como, por exemplo, péptidos solúveis, incluindo mas não se limitando a membros de bibliotecas de péptidos aleatórios (ver, por exemplo, Lam, K.S. et al. 1991, Nature 354: 82-84; Houghten, R et al. 1991, Nature 354: 84-86), e bibliotecas moleculares derivadas por química combinatorial constituídas por aminoácidos com configuração D e/ou L, fosfopéptidos (incluindo mas não se limitando a membros de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidas aleatórias ou parcialmente degeneradas (ver, por exemplo, Songyang, Z. et al. 1993, Cell 7_2: 767-778) , anticorpos (incluindo mas não se limitando a anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos ou de cadeia simples) e fragmentos FAb, F(ab')2 e de bibliotecas de expressão de FAb (e seus fragmentos de ligação de epítopos) e pequenas moléculas orgânicas ou inorgânicas. Outros compostos que podem ser rastreados de acordo com a invenção incluem mas não estão limitados a pequenas moléculas orgânicas.

Compostos da invenção que podem ser concebidos para satisfazer os critérios anteriores incluem polipéptidos e péptido-miméticos. O péptido-mimético pode ser uma molécula híbrida que inclui componentes de aminoácidos e não aminoácidos, por exemplo, o mímico pode incluir componentes de aminoácidos para as regiões de carga positiva e carga negativa e um não aminoácido (por exemplo, piperidina) com o mesmo tamanho e dimensão aproximados de um aminoácido hidrófobo (por exemplo, fenilalanina) como componente hidrófobo.

Também podem ser geradas bibliotecas combinatoriais de moléculas pequenas. Uma biblioteca combinatorial de 81 pequenos compostos orgânicos é um conjunto de análogos proximamente relacionados que diferem entre si num ou mais pontos de diversidade e são sintetizados por técnicas orgânicas utilizando processos de múltiplos passos. Bibliotecas combinatoriais incluem um número vasto de pequenos compostos orgânicos. Um tipo de biblioteca combinatorial é preparado por métodos de síntese paralela para produzir uma série de compostos. Uma "série de compostos", como usado aqui, é um conjunto de compostos que podem ser identificados pelos seus endereços espaciais em coordenadas cartesianas e dispostos de tal modo que cada composto tem um núcleo molecular comum e um ou mais elementos de diversidade estrutural variável. Os compostos dessa série de compostos são produzidos em paralelo em reactores separados, em que cada composto é identificado e seguido pelo seu endereço espacial. Exemplos de misturas de síntese paralela e métodos de síntese paralela são apresentados em U.S.S.N. 08/177,497, registado em 5 de Janeiro de 1994, e o seu correspondente requerimento de patente PCT publicado W095/18972, publicado em 13 de Julho de 1995, e Patente U.S. N° 5,712,171, atribuída em 27 de Janeiro de 1998, e o seu correspondente requerimento de patente PCT publicado W096/22529.

Assim, a invenção proporciona, em parte, compostos de baixo peso molecular que modulam funções mediadas pela caderina-11. Estes compostos podem ser utilizados para modular uma função da caderina-11 ou podem ser utilizados como compostos protótipos para a concepção de compostos melhores utilizando os métodos de concepção de fármacos fundamentados computacionais. 82 0 profissional estará familiarizado com métodos de previsão do efeito na conformação proteica de uma alteração na sequência proteica e, assim, pode "conceber" uma variante que actua como agente modulador de acordo com métodos conhecidos. Um exemplo de um desses métodos é descrito por Dahiyat e Mayo em Science 278: 82-87, 1997, que descreve a concepção de proteínas de novo. 0 método pode ser aplicado a uma proteina conhecida para variar apenas uma porção da sequência polipeptidica. Por aplicação dos métodos computacionais de Dahiyat e Mayo, variantes especificas da caderina-11 ou de um contra-receptor da caderina-11 podem ser propostas e testadas para determinar se a variante retém uma conformação desejada. De modo semelhante, Blake (Patente U.S. N° 5,565,325) ensina a utilização de estruturas de ligandos conhecidas para prever e sintetizar variantes com função semelhante ou modificada. São conhecidos na área outros métodos de preparação ou identificação de péptidos que se ligam a um alvo particular. Por exemplo, pode ser utilizado "imprinting" molecular para a construção de novo de estruturas macromoleculares, como péptidos, que se ligam a uma molécula particular. Ver, por exemplo, Kenneth J. Shea, "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sites", TRIP Volume 2, N° 5, Maio de 1994; Klaus Mosbach, "Molecular Imprinting", Trends in Biochem. Sei., 19(9) Janeiro de 1994, e Wulff, G., em "Polymeric Reagents and Catalysts" (Ford, W. T., Editor) ACS Symposium N° de Série 308, páginas 186-230, American Chemical Society (1986) . Como exemplo, um método de preparação de miméticos de contra-receptores da caderina-11 envolve os passos de (i) polimerização de monómeros funcionais em redor de um 83 substrato conhecido (o modelo ou, neste caso, domínio de ligação de contra-receptores da caderina-11) que exibe uma actividade desejada; (ii) remoção da molécula modelo, e então (iii) polimerização de uma segunda classe de monómeros no espaço vazio deixado pelo modelo, para originar uma nova molécula que exibe uma ou mais propriedades desejadas que são semelhantes à do modelo. Para além da preparação de péptidos deste modo, também podem ser preparadas outras moléculas de ligação, como polissacáridos, nucleósidos, fármacos, nucleoproteínas, lipoproteínas, hidratos de carbono, glicoproteínas, esteróides, lípidos e outros materiais biologicamente activos. Este método é útil para conceber uma grande variedade de miméticos biológicos que são mais estáveis do que os seus correspondentes naturais, pois são tipicamente preparados pela polimerização com radicais livres de monómeros funcionais, originando um composto com uma coluna vertebral não biodegradável. Outros métodos de concepção dessas moléculas incluem, por exemplo, concepção de fármacos com base em relações estrutura actividade que requerem a síntese e avaliação de alguns compostos e modelação molecular.

Como mencionado acima, a invenção também abrange agentes compreendendo resíduos péptido-miméticos, incluindo aminoácidos de ocorrência não natural. Essas variantes podem ser sintetizadas substituindo resíduos de aminoácidos envolvidos em funções mediadas pela caderina-11 por resíduos péptido-miméticos. Por exemplo, resíduos glutamina (Glu) podem ser substituídos por moléculas a-aminoadipato, e posições de tirosina podem ser substituídas por 4-carboximetil-Phe. Nas variantes podem ser utilizados análogos à base de fósforo e não à base de fósforo, como 84 miméticos fosforotirosina. Análogos de tirosina que podem ser utilizados em vez dos resíduos tirosina incluem fenil-alanina (Phe), pentafluorofenilalanina (PfPhe), 4-carboxi-metil-L-fenilalanina (cmPhe), 4-carboxidifluorometil-L-fenilalanina (F2cmPhe), 4-fosfonometilfenilalanina (Pmp), (difluorofosfonometil)fenilalanina (F2Pmp), O-malonil-L-tirosina (malTyr ou OMT) e fluoro-O-maloniltirosina (FOMT). Miméticos à base de fosfonato que substituem a ligação éster de fosfato de tirosilo por uma unidade metileno também podem ser incorporados em agonistas e antagonistas sintéticos. Adicionalmente, resíduos de ácido glutâmico podem ser modificados de modo a possuírem um grupo metileno adicional, ou podem ser simplesmente substituídos com a-aminoadipato (Adi). Outros resíduos que podem ser utilizados incluem o aminoácido de ocorrência não natural ácido 1-aminociclo-hexilcarboxílico (Acec) e 3-(2-hidroxi-naftalen-l-il)-propilo, ou ácido 2-azetidinocarboxílico ou ácido pipecólico (que têm estruturas em anel com 6 membros e 4 membros, respectivamente) que substituem resíduos prolina, S-etilisotioureia, 2-NH2-tiazolina e 2-NH2-tiazolo. Na síntese de variantes também é útil a utilização de substitutos do resíduo asparagina, como 3-indolil-propilo. Será claro para o profissional que a invenção abrange a síntese de uma grande variedade de variantes possuindo qualquer combinação de análogos de aminoácidos e/ou resíduos péptido-miméticos, como descrito acima e conhecido na área. Potenciais modificações adicionais abrangidas pela invenção incluem modificações de cisteínas, histidinas, lisinas, argininas, tirosinas, glutaminas, asparaginas, prolinas e grupos carboxilo, bem conhecidas na área e descritas no documento USP 6,037,134. A síntese das variantes acima mencionadas é descrita nas referências citadas e pertence ao âmbito do profissional. 85

As variantes também podem ser modificadas para introduzir ou estabilizar certas caracteristicas estruturais. Como exemplo, curvaturas β podem ser incorporadas nas variantes preferivelmente peptidicas, ou então as variantes podem ser sintetizadas na forma de péptidos cíclicos, por exemplo, por incorporação de ligações tioéter.

Os métodos de rastreio da invenção proporcionam informações úteis para a concepção fundamentada de fármacos de novos agentes que, por exemplo, são capazes de modular uma resposta do sistema imunológico. Procedimentos exemplificativos para a concepção fundamentada de fármacos são apresentados em Saragovi, H. et al., (1992) Biotechnology 1_0: 773; Haber E., (1983) Biochem. Pharmacol. 32_(13) : 1967, e Connolly Y., (1991) "Methods of Enzymology" 203, Capítulo 29 "Computer-Assisted Rational Drug Design" páginas 587-616.

Assim, o conhecimento das estruturas primária, secundária ou terciária de ligandos e receptores de ocorrência natural pode ser utilizado para escolher ou conceber de modo fundamentado moléculas que irão ligar-se ao ligando ou receptor. Em particular, o conhecimento das regiões de ligação de ligandos e receptores pode ser utilizado para escolher ou conceber de modo fundamentado compostos que são mais potentes do que os ligandos de ocorrência natural na indução da sua resposta normal, ou que são inibidores competitivos da interacção ligando-receptor.

Depois de escolhidos ou concebidos de modo fundamentado e seleccionados, os membros da biblioteca podem ser alterados, por exemplo, na sua sequência primária, para 86 produzir péptidos novos e diferentes. Estes fragmentos podem ser produzidos por mutagénese dirigida a sítios, ou podem ser sintetizados in vitro. Estes novos fragmentos podem então ser testados quanto à sua capacidade para se ligarem ao receptor ou ligando e, por variação das suas sequências primárias e observação dos efeitos, podem ser produzidos péptidos com ligação ou capacidade inibidora aumentada.

Em alternativa, as sequências de nucleótidos e aminoácidos dos agentes moduladores da caderina-11 da presente invenção, por exemplo, as correspondentes ao dominio extracelular da caderina-11, podem ser utilizadas em sistemas computacionais de modelação para prever a estrutura secundária e terciária do dominio extracelular. Esses sistemas computacionais são bem conhecidos dos profissionais da área da concepção fundamentada de fármacos. Com base na estrutura terciária de uma proteína receptora é muitas vezes possível identificar uma região de ligação que está envolvida na sua actividade biológica. A partir desta informação podem ser concebidos de modo fundamentado péptidos ou outros compostos que incluem ou imitam esta estrutura e/ou que são capazes de se ligar a ela. Deste modo podem ser concebidos novos compostos que imitam a actividade do receptor ou ligando ou que irão actuar como inibidores competitivos do receptor ou ligando.

Os profissionais apreciarão que podem ser feitas várias modificações nos análogos peptídicos anteriores sem sair da natureza essencial da invenção. Em conformidade, é pretendido que também estejam abrangidos nos ensinamentos da invenção péptidos que incluem substituições conservativas, e proteínas acopladas nas quais um péptido 87 da invenção está acoplado a um suporte sólido, como uma esférula polimérica, uma molécula transportadora, como hemocianina de lapa californiana, ou um grupo repórter, como uma etiqueta radioactiva ou outra marcação.

Como usado aqui, "substituição conservativa de aminoácidos" refere-se a uma substituição de aminoácidos que não altera as caracteristicas de carga relativa ou dimensão do péptido onde é feita a substituição de aminoácidos. Substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições feitas entre aminoácidos pertencentes aos grupos seguintes: (a) MILV; (b) FYW; (c) KRH; (d) AG; (e) ST; (f) QN, e (g) ED.

Os anticorpos monoclonais da invenção que inibem a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor também são úteis em ensaios de rastreio para identificar compostos protótipos farmacêuticos em bibliotecas moleculares. Os anticorpos da invenção ligam-se especificamente a uma caderina ou a um contra-receptor de uma caderina e, desse modo, inibem a ligação destas duas moléculas entre si. Assim, ensaios de rastreio utilizando anticorpos monoclonais também são úteis para avaliar a capacidade de uma molécula da biblioteca para inibir a ligação da caderina-11 ao seu contra-receptor. Esses ensaios de rastreio à base de anticorpos são efectuados por contacto de um anticorpo (que se liga especificamente à caderina-11 e, por exemplo, inibe a adesão entre um linfócito T e uma célula que expressa a caderina-11) com caderina-11 na presença e ausência de pelo menos um membro da biblioteca molecular, e determinação de se o membro da biblioteca modula a ligação entre o anticorpo e a caderina-11. Numa forma de realização particularmente preferida, a caderina-11 é apresentada na forma de uma célula que expressa a caderina-11, uma 88 caderina-11 isolada ou um péptido isolado relacionado ou derivado do domínio extracelular da caderina-11. De modo semelhante, o contra-receptor da caderina-11 pode ser apresentado em qualquer uma destas formas.

Numa forma de realização particularmente preferida na qual o anticorpo é um anticorpo anti-caderina-11, o método de rastreio com anticorpo envolve: (1) realizar um primeiro ensaio de anticorpo na presença do anticorpo e caderina-11 e na ausência da molécula da biblioteca, para obter um primeiro resultado do ensaio de anticorpo; (2) realizar um sequndo ensaio de anticorpo na presença do anticorpo, caderina-11 e a molécula da biblioteca, para obter um segundo resultado do ensaio de anticorpo, e (3) comparar o primeiro e o segundo resultados dos ensaios de anticorpo, para determinar se o membro da biblioteca molecular modula a ligação entre o anticorpo e a caderina-11. De acordo com esta forma de realização, ligação reduzida entre o anticorpo e caderina-11 na presença do membro da biblioteca indica que o membro da biblioteca inibiu a ligação do anticorpo à caderina-11. Ensaios de ligação de anticorpos também podem ser utilizados para avaliar a capacidade relativa de um membro da biblioteca molecular para bloquear a ligação entre um anticorpo específico para o contra-receptor da caderina-11 e o contra-receptor, utilizando apenas experimentação de rotina.

Estes e outros ensaios de rastreio também podem ser utilizados para identificar os análogos peptídicos da caderina-11 funcionalmente equivalentes da invenção que são úteis para inibir a ligação da caderina-11 ao seu contra- receptor . 89

Os agentes moduladores da caderina-11 também podem ser utilizados, por exemplo, para dirigir uma toxina (por exemplo, ricina) ou um agente detectável (por exemplo, uma etiqueta radioactiva, uma etiqueta fluorescente, uma etiqueta enzimática) para células que expressam contra-receptores da caderina-11 ou caderina-11. Métodos de acoplamento dessas toxinas e/ou agentes a proteínas e/ou anticorpos para aplicações in vivo e in vitro são divulgados, por exemplo, em Killen e Lindstrom (1984), "Specific killing of lymphocytes that cause experimental Autoimmune Myestenia Gravis by toxin-acetylcholine receptor conjugates", J. Immun. 133: 1335; Jansen, F.K., et al. (1982), "Immunotoxins: Hybrid molecules combining high specificity and potent cytotoxicity", Immunolog. Rev. 62: 185-216, ver também as Patentes U.S. N°s 3,652,761; 4,478,946, e 4,554,088. A invenção será compreendida de modo mais completo por referência aos exemplos seguintes. No entanto, é pretendido que estes exemplos sejam meramente ilustrativos das formas de realização da invenção e não sejam considerados limitadores do âmbito da invenção. Também deve ser entendido que as figuras de referência são apenas ilustrativas e não são essenciais para a habilitação da invenção reivindicada.

Exemplos A importância das cateninas na mediação da adesão célula-célula dependente de caderinas sugeriu que poderão ser utilizadas como sondas para identificar novas caderinas. Assim, para estes estudos, obtivemos anti-soros para a- e β-catenina humanas, tendo sido utilizados para identificar 90 proteínas de co-precipitação em sinoviócitos humanos do tipo B, pois não era conhecido que este tipo de células expressa uma caderina. Adicionalmente, com base em alinhamentos da E-, P- e N-caderina humanas, podem ser apreciadas quatro regiões de identidade. Utilizando estas regiões sintetizámos oligonucleótidos sentido e anti-sentido e efectuámos PCR em condições de restrição normal utilizando como modelo RNA de sinoviócitos humanos do tipo B. Os clones derivados de PCR foram então sequenciados para identificar aqueles que são sequências de caderina bona fide. Esses clones candidatos foram depois utilizados como sondas em análise de coloração "Northern" utilizando RNA de sinoviócitos.

Antes da presente invenção não havia sido relatado que caderinas são expressas em sinoviócitos. A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de que células do tipo fibroblastos sinoviais e células de revestimento da membrana sinovial expressam uma caderina. O gene que codifica esta caderina foi clonado, prepararam-se anticorpos monoclonais contra aquela e foi demonstrada a sua expressão foi demonstrada em células transfectantes, sinoviócitos humanos cultivados e em sinóvia reumatóide humana isolada de fresco.

Exemplo 1

Materiais e Métodos

Anticorpos. O anti-soro de P-catenina foi previamente descrito (Cepek KL. et al. Proc Natl Acad Sei USA 93: 6567-71, 1996). O anti-soro de pan-caderina dirigido contra os 24 aminoácidos C-terminais de N-caderina de galinha foi 91 previamente descrito (Geiger B. et ai. J Cell Sei 9T_: 607-14, 1990) e obtido da Sigma (St. Louis, MO). Os mAbs de ratinho específicos contra a E-caderina humana (E4.6, IgGi) foram preparados neste laboratório (Cepek KL. et al. Nature 372: 190-3, 1994), o anti-N-caderina humana (13A9, IgGi) foi amavelmente fornecido por M. Wheelock (Departamento de Biologia, Universidade de Toledo, Toledo OH), o anti-VE-caderina humana (BV9, IgGi) foi uma oferta de M.G. Lampugnani (Laboratório de Biologia Vascular, Instituto Mario Negri, Milão, Itália) e o anti-P-caderina humana (NCC-CAD-299, IgGi) foi fornecido por S. Hirohashi (Divisão de Patologia, Instituto Nacional de Investigação de Cancro, Tóquio, Japão), Leu 4 (anti-CD3) da Becton Dickinson (Mountain View, CA), OKT4 (anti-CD4), OKT8 (anti-CD8) da Ortho Pharmaceutical Corp. (Raritan, NJ) e anti-CD68 da Dako (Carpenteira, CA).

Cultura de Células. As membranas sinoviais de pacientes com AR diagnosticados com base em critérios correntes (Arnett FC. et al. Arthritis Rheum _31: 315-324, 1988) foram obtidas durante procedimentos cirúrgicos de sinovectomia da mão e pulso e substituição de articulações. Preparou-se tecido sinovial picando-o e submetendo-o a tratamento com 1 mg/mL de colagenase (tipo 1, Worthington Biochemicals, Frehold, NJ) , 0,15 mg/mL de Dnase I (Sigma, St. Louis, MO) e CaCl2 5 nM em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Gibco, Grand Island, NY), e foi submetido a movimento oscilatório a 37°C durante 1 hora. Fez-se passar a suspensão de células num crivo de metal de malha 40, tendo sido colocada num balão de cultura de tecidos de 75 cm2 (BD Labware, Lincoln Park, NJ) . As células libertadas do tecido sinovial foram plaqueadas em balões em DME suplementado com soro de vitelo 10% e soro humano 10%, L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 92 1 mM, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de sulfato de estreptomicina e 2-mercaptoetanol 50 μΜ, e foram mantidas em 10% de C02. Verificou-se que monocamadas confluentes são compostas maioritariamente pelos sinoviócitos do tipo II (tipo fibroblastos) após a terceira passagem. A linha de células L de fibroblastos murinos (ATCC CCL1.3) cresceu em DMEM, rico em glucose com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone), HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais 10 μΜ (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de sulfato de estreptomicina e 2-mercaptoetanol 50 μΜ, e foi mantida em 10% de 002. Os transfectantes de células L cresceram no meio acima com G418 (Gibco) a 1 mg/mL. Células HEK293 de rim embrionário humano (obtidas da ATCC) foram mantidas em FBS inactivado pelo calor 10% (volume/volume) (Hyclone Labs Inc., Logan, UT) e meio DME (Gibco BRL) a 37°C em 10% de C02. Células Cos-7 cresceram em DMEM, rico em glucose com Soro Nu 10% (Collaborative Research, Inc., Bedford, MA), HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de sulfato de estreptomicina e 2-mercaptoetanol 50 μΜ, e foram mantidas em 10% de C02. Células epiteliais da mama humana 16E6.A5 foram mantidas como descrito (Cepek KL. et al. Proc Natl Acad Scí USA 93: 6567-71, 1996) .

Os linfócitos T foram isolados de PBMC derivadas com gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque utilizando anti-CD3 (ou mAb anti-CD2) e esférulas magnéticas. Podem ser 93 utilizados directamente após a libertação utilizando Detach-a-bead, ou estimulados com PHA e cultivados em meio contendo IL-2 na forma de linhas de células T de longa duração. Os linfócitos frescos isolados serão utilizados em ensaios de adesão a monocamadas de células sinoviais. A adesão será examinada em ensaios estáticos célula-célula em placas de 96 cavidades, utilizando linfócitos etiquetados de modo fluorescente. Determina-se a percentagem de células T etiquetadas de modo fluorescente que se ligam a monocamadas de células sinoviais utilizando um leitor de placas de fluorescência, e podem ser determinados os efeitos bloqueadores de mAb específicos.

Etiquetagem e Imunoprecipitação. 1 x 107 monocamadas de sinoviócitos confluentes foram etiquetadas na superfície com Na125I 2 mCi (Du Pont-New England Nuclear, Boston, MA) utilizando lactoperoxidase e peróxido de hidrogénio em 0,5 mL de PBS como previamente descrito (Brenner, et al. 1987). As células foram solubilizadas em tampão de lise contendo solução salina tamponada com Tris (TBS, Tris-base 50 mM, pH 7,6, NaCl 140 mM) com Triton X-100 1%, iodoacetamida (IAA) 8 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF, Sigma, St. Louis, MO) CaCl2 1 mM durante 1 hora a 4°C. O material insolúvel em detergente foi removido por centrifugação durante 20 minutos a 8,000 g a 4°C. O sobrenadante foi pré-clarificado com 6 pL de soro normal de coelho e 300 pL de mAb 187.1 como sobrenadante de cultura durante 30 minutos, seguido de duas rondas (1 hora e 12 horas) de 200 pL de uma suspensão de células 10% (peso/volume) de estirpe fixada de Staphylococcus aureus Cowen I (PANSCORBIN, Calbiochem, San Diego, CA) . Os lisatos contendo o equivalente a 2 x 106 células foram imunoprecipitados com 10-15 pL de anti-soro de coelho ou 15 pL de anti-soro anti-β catenina ou 1 pL de 94 ascites E4.6, e 100 yL de cada um dos sobrenadantes dos mAbs 13A9, BV9, Cad-299, 2G4, 5H6, 3H10, mais 100 pL de sobrenadante de cultura de mAb de rato anti-cadeia K de ratinho 187.1, para ligação óptima de proteína A. Os complexos imunológicos foram então incubados com proteína A-Sefarose (Pharmacia Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) durante 1 hora a 4°C com movimento oscilatório. Os imunoprecipitados foram lavados três vezes com Triton X-100 0,5% (volume/volume) em NaCl 0,5 M com CaCl2 50 mM, 1 mM. O grânulo de resina ferveu em tampão de amostras (glicerol 10%, SDS 3%, Tris 0,5 M, pH 6,8) contendo 2-mercaptoetanol (concentração final de 5%, condições redutoras) e foi analisado por SDS-PAGE 7,5% como descrito (Laemmli UK.

Nature 227: 680-5, 1970) e sujeito a procedimentos fluorográficos comuns.

Clonagem Molecular do Gene Codificador da Caderina

Sinovial. Alguns clones novos de cDNA da caderina foram isolados utilizando oligonucleótidos de consenso baseados em PCR correspondentes a sequências do domínio citoplasmático que estão altamente conservadas entre caderinas (Suzuki S. et al. Cell Reg 2_: 261-70, 1991). Com base em alinhamentos das caderinas humanas podem ser apreciadas quatro regiões de identidade, correspondentes aos resíduos da E-caderina humana 753-762 (£Ε®θ-geedqd) (SEQ ID NO: 3), resíduos 840-847 (SLSSLNSSi (SEQ ID NO: 4), resíduos 853-859 ÍQBYDYLN) (SEQ ID NO: 5) e resíduos 865-875 (fkkladmvgsg) (SEQ ID NO: 6), que, em cada caso, são idênticas nas E-, P- e N-caderinas. Utilizando estas regiões concebemos os seguintes oligonucleótidos degenerados sentido s^scgssatc-cGAisAROGísoNGeNGA-a1 (SEQ ID NO: 7) e anti-sentido s:eGQGAGCT0ictGCiARvrnmRAA*3' (N = A, T, G, C; I =

Inosina; Y = C, T e R = A, G) (SEQ ID NO: 8) . Extraiu-se 95 mRNA de sinoviócitos reumatóides, tendo sido transcritos de forma reversa e utilizados como modelo para amplificação por PCR utilizando 0,5 U/reacção de Taq polimerase e as seguintes condições: desnaturação a 95°C durante 30 segundos, hibridização a 60°C durante 1 minuto, extensão a 72°C durante 1 minuto durante 30 ciclos. Os produtos de PCR com a dimensão esperada de 385 bp foram clonados no plasmideo pCRII utilizando o sistema de clonagem TA (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) e subsequentemente foram sequenciados com o estojo Sequenase (United Stated Biochemical Corp., Cleveland, OH) para identificar os que aparentaram ser sequências de caderina bona fide. Pesquisámos a base de dados da GenBank utilizando o programa FASTA/BLAST.

Coloração "Northern".Para confirmar a expressão da caderina clonada em sinoviócitos realizámos análise de coloração "Northern". mRNA isolado de sinoviócitos do tipo B, células 16A5, células Jurkat e uma SKNSH foram hibridizadas com o fragmento de 385 bp da caderina clonado por PCR e gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, como controlo, ambos os quais foram etiquetados com [32P] dCTP/dGTP por inicialização aleatória. A hibridização foi conduzida a 43°C durante 16 horas. Após a hibridização, a membrana foi lavada, a uma restrição final de 0,1 x SSC, com SDS 2% (p/v) a 56°C e foi submetida a auto-radiografia em filme Kodak MS a -70°C.

Construção do Clone Completo. Caderina-11 completa foi construída por PCR utilizando os "primers" seguintes XV14 (S-XGAAAAATGlAAGSAGAÍtCTACT-ã’) (SEQ ID NO: 9) e XVI5 fSCGGGG<3ATCCATTGTTMGAATCGT-CATCAAA-3'S (SEQ ID NO: 10) compreendendo a região codificadora da caderina-11. O produto de ~2,4 kb 96 foi subclonado nos sítios Hind III/Bam Hl de pBluescrpt SK e foi sequenciado, para confirmar que não foram introduzidas mutações durante a PCR.

Construção do Vector de Expressão de Caderina-ll-Fc. Um adaptador de DNA de filamentação dupla contendo uma extremidade plana 5' Msc I, os cinco codões finais da região extracelular da caderina-11 humana e uma extremidade coesiva 3' Xho I foi produzido por hibridização dos oligonucleótidos complementares XVCadllA (S-GCTGeCACCGTGGTTGGGAGAGT^y} (SEQ ID NO: 11) Θ XVCadll E (5,-GG6GGG&TGGA©G!AGGCCTCTGC|GTTSCAGG-3’i (SEQ ID NO: 12) utilizando Pyrococcus Furiosus (PFU) (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com as recomendações do fabricante. Este adaptador foi então ligado na extremidade 3' de um fragmento Hind III-Msc I que codifica o restante da região extracelular da caderina-11 humana do clone completo de caderina-11 gerado previamente. 0 fragmento Hind III-Xho I resultante foi introduzido na estrutura a montante da codificadora para a região de articulação e região Fc da IgGi humana num derivado do pCDM8 (pCDM8Fc) também clivado com Hind III-Xho I. A sequência da região de junção está apresentada na Figura 3. A construção foi sequenciada para confirmar a sua integridade na região de junção utilizando um sequenciador de DNA automático (Perkin Elmer) . Por fim, o cDNA de caderina-ll-Fc foi excisado de pCDM8 utilizando Hind III e Not I e foi inserido no vector de expressão pCEP4 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA) clivado com Hind III e Not I.

Produção de Proteínas Caderina-ll-Fc. Células HEK293 (106 células por balão de 75 cm2) foram transfectadas de forma estável com 20 pg de DNA plasmidico utilizando o estojo de 97

Transfecção de mamífero (Stratagene). Após crescimento durante 24 horas em meio não selectivo, as células foram transferidas para placas de cultura de tecido de 96 cavidades e foram incubadas em meio selectivo contendo 200 pg/mL de higromocina B. Após 15 dias, os sobrenadantes de cavidades contendo colónias resistentes foram avaliados quando a proteínas de fusão por ELISA.

Para produzir a proteína caderina-ll-Fc, clones positivos cresceram em balões de 500 cm2 de camada tripla (Nunc, Roskilde, Dinamarca) em Ig FBS ultra-baixo 10% (v/v) (GIBCO BRL), 200 pg/mL de higromicina B e DMEM. Após 7-10 dias de cultura, o sobrenadante foi recolhido e filtrado numa membrana de 0,2 pm. A proteína de fusão caderina-ll-Fc foi depois purificada numa coluna previamente não utilizada GammaBind G-Sefarose (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). A coluna foi lavada com TBS e CaCl2 1 mM, pH 7,4, e depois eluiu com glicina 0,2 M e CaCl2 1 mM, pH 2,3. As fracções contendo proteína de fusão purificada foram dialisadas em TBS e CaCl2 1 mM, pH 7,4, e foram armazenadas a -20°C. A pureza da proteína de fusão foi avaliada por SDS-PAGE e coloração com azul de Coomassie, e determinou-se a concentração por ensaio de Bradford utilizando BSA como padrão (BioRad Labs., Hercules, CA).

Geração de Transfectantes Estáveis de Células L-Caderina-11. Para produzir células que expressam caderina-11 na superfície, células L foram transfectadas com 20 pg de pLK/Cadll ou com o vector pLK neo isoladamente utilizando o estojo de Transfecção de mamífero (Stratagene) . As células transfectadas foram seleccionadas por cultura em 1 mg/mL de G418. 98

Geração de Anticorpos Monoclonais de Ratinho Contra a Caderina-11. Os mAbs 2G4, 5H6 e 3H10 foram produzidos por imunização de ratinhos BALB/c com três injecções intraperitoneais de 20 pg de caderina-ll-Fc purificada. A injecção inicial foi em CFA e as 2 subsequentes foram em IFA com intervalos de 2 semanas, seguidas de um reforço final IV de 30 pg. Três dias após a imunização intravenosa, esplenócitos foram isolados e fundidos com células de mieloma murino NS1 na presença de PEG (PM 1450) como descrito previamente (Lerner EA. Yale J Biol Med h4: 387-402, 1981) . Foram seleccionados hibridomas com meio contendo aminopterina, e sobrenadantes de hibridomas foram rastreados por ELISA diferencial em placas revestidas com 301-Fc, E-cad-Fc e IgGi humana. Foi efectuado um rastreio subsequente nos clones seleccionados por FACS em células que expressam a caderina-11, em comparação com células positivas para E-caderina. Os hibridomas seleccionados foram subclonados três vezes por diluição limitante. Os isotipos de 2G4 (IgGi), 5H6 (IgGi) e 3H10 (IgGi) foram determinados por ELISA utilizando mAb especifico para isotipos murinos (Jackson Immunoresearch Lab).

Imuno-histoquímica. Amostras de tecido humano normal foram obtidas e congeladas de imediato em composto OCT (Ames Co., Elkart, IN) , arrefecido com azoto liquido para cerca de -140°C. Secções de tecido congelado foram seccionadas (6 pm) com um criostato CM 10800 (Leica Inc. Deerfield, IL) e depois foram fixadas em acetona durante 10 minutos, foram brevemente secas ao ar e coradas por um método indirecto de imunoperoxidase utilizando o complexo avidina-biotina-peroxidase (Vector Labs, Burlingame, CA) e 3-amino-9-etilcarbazolo (Sigma, St. Louis, MO) como cromogénio. 99

Resultados

Clonagem da Caderina de Sinoviócitos. A clonagem com oligonucleótidos degenerados com base em PCR de uma caderina em cDNA de sinoviócitos do tipo B revelou um produto especifico em sinoviócitos que estava ausente no controlo negativo (Figura 1). Este produzo foi identificado como sendo um fragmento da caderina-11 quando sequenciado e comparado com a base de dados da GenBank. Em seguida confirmámos a expressão de caderina-11 em RNA sinovial por coloração "Northern" utilizando como sonda o fragmento de 385 bp clonado por PCR. A Figura 2 mostra a hibridização positiva da sonda cad-11 em sinoviócitos do tipo B e num controlo positivo, uma linha de células de neuroblastoma (SKNSH), e estava ausente em células epiteliais (16EA5) e células Jurkat. Para obter o gene completo gerámos um clone compreendendo a sequência codificadora completa da caderina-11 humana por PCR. 0 produto de PCR obtido foi sequenciado para confirmar a ausência de mutações.

Produção da Proteína de Fusão Caderina-11 Humana-Fc. Uma construção que codifica a porção extracelular da caderina-11 humana foi ligada na estrutura a uma construção que codifica a região Fc da IgGi humana (incluindo a região de articulação e dominios CH2 e CH3) . A transfecção de células HEK293 e selecção com higromicina B conduziram à geração de linhas estáveis que expressam a proteína de fusão caderina-11-Fc solúvel. Era esperado que a proteína de fusão caderina-ll-Fc fosse dimérica, devido à presença de ligações dissulfureto na (Figura 3), possivelmente semelhante a dímeros de caderina na superfície celular (Shapiro L. et al. Nature 374: 327-37, 1995; Nagar BM. et al. 380: 360-4, 1996). Após purificação em proteína G- 100

Sefarose, SDS-PAGE revelou a presença de uma proteína com a dimensão esperada (~123 kD) após redução.

Geração de Anticorpos Monoclonais Anti-Caderina-11. Para produzir mAbs que reconheceram especificamente a região extracelular da caderina-11, ratinhos BALB/c foram imunizados com a proteína de fusão caderina-ll-Fc purificada. Os mAbs que reagiram preferencialmente com caderina-ll-Fc mas não IgGi humana nem E-caderina-Fc por ELISA foram seleccionados para estudos adicionais. Três destes anticorpos mAbs 3H10, 5H6 e 2G4 reconheceram especificamente a caderina-ll-Fc em ELISA. Estes mAbs também coram a caderina-11 expressa na superfície de células L transfectadas com caderina-11 completa, como mostrado na Figura 4. Estes três mAb também precipitaram uma proteína de 123 kD dos sinoviócitos etiquetados na superfície.

Para estudar o padrão de distribuição tecidual da proteína realizámos imuno-histoquímica indirecta em secções de tecidos congelados. Notámos o padrão de coloração notável, no qual mAb anti-caderina-11 corou preferencialmente as células de revestimento em sinóvia de AR. Isto sugere que a caderina-11 desempenha um papel importante na determinação da adesão das células de revestimento sinovial entre si e, desse modo, determina a arquitectura tecidual da sinóvia. Este papel pode ser crítico para o crescimento e proliferação, bem como para a activação das células da membrana sinovial. De notar que membranas sinoviais não têm uma camada epitelial e, ao invés, têm a camada de revestimento sinovial. É interessante notar que estes mAbs anti-caderina-11 também reconheceram poucas células no sub- 101 revestimento adjacente às áreas de células T que infiltram a sinóvia (Figura 6, painéis A e B).

Exemplo 2: Ensaios de Adesão

Monocamadas de células aderentes (isto é, sinoviócitos humanos) cresceram em placas de cultura de tecidos Linbro de 96 cavidades de fundo plano. Adicionaram-se por cavidade 104 células aderentes em 100 pL de meio completo, que cresceram durante dois até três dias até atingirem a confluência. Imediatamente antes da adição de células T ou células COS 7 transfectadas com contra-receptor da caderina-11, as monocamadas de células aderentes foram lavadas com meio de ensaio. Para etiquetar células T ou células COS-7 diluiram-se 25 pg de 2 ',7'-bis-(2-carboxi-etil)-5(e -6)-carboxifluoresceína (BCECF-AM, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) em 5 pL de DMSO, tendo sido adicionados a uma suspensão de 5 X 106/mL de células T ou células COS-7 em meio completo. As células foram incubadas a 37°C durante 25 minutos e depois foram lavadas duas vezes em meio de ensaio (PBS contendo CaCl2 1 mM, MgCl2 2 mM e HEPES 10 mM) . Após a lavagem, 50 000 células T ou células COS-7 etiquetadas em 100 pL de meio de ensaio foram adicionadas às monocamadas de células aderentes. Células T ou células COS-7 assentaram sobre monocamadas de células aderentes durante 25 ou 40 minutos a 37°C. As células não ligadas foram removidas por recolha de meio da placa. As células ligadas foram detectadas utilizando um leitor de placas de Fluorescência (IDEXX Co., Portland, ME). Quando foi efectuado bloqueio de anticorpos, as células T, células COS-7 ou monocamadas de sinoviócitos foram pré-incubadas com uma diluição 1:250 de fluido de ascites ou 10 pg/mL de mAb purificado durante cinco minutos a 37°C, antes do 102 encontro com o segundo tipo de células. Realizaram-se pelo menos quatro repetições. Calcula-se a % de células ligadas por leitura das unidades de fluorescência obtidas depois de células não ligadas terem sido removidas por lavagem, dividindo este número pelas unidades de fluorescência de entrada e multiplicando por 100. Diluições em série de células etiquetadas mostraram que apenas 1000 células são detectadas na gama linear.

Exemplo 3: Um ensaio de adesão para seleccionar membros de biblioteca como compostos protótipos farmacêuticos O ensaio de adesão descrito aqui baseia-se no ensaio descrito por Cepek, K., et al., em J. Immunol. 150 (8) : 3459-3470 (1993).

Para rastrear uma biblioteca molecular, ou outra mistura, quanto à presença de um análogo peptidico funcionalmente equivalente ou um membro da biblioteca capaz de inibir a adesão mediada pela caderina-11, células T são lavadas com HBSS (solução salina tamponada de Hank, Gibco) e pré-equilibradas com diluições em série, contendo HBSS, da biblioteca ou outra solução contendo péptidos ou contendo moléculas pequenas (numa gama ampla de concentrações (por exemplo, 1 ng/mL até 100 pg/mL) durante tempos seleccionados (por exemplo, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas) a 37°C antes da incubação com monocamadas sinoviais que foram lavadas com HBSS. Análogos peptidicos funcionalmente equivalentes ou agentes inibidores da caderina-11 são identificados pela sua capacidade para inibir a ligação de células T à monocamada sinovial.

Exemplo 4: Contra-Receptor da Caderina-11 em células T e B 103

Realizou-se análise de citometria de fluxo da linha de células T sinoviais 5 e células CP-B com anticorpo monoclonal anti-caderina-11 2G4. Efectuou-se coloração de controlo com o anticorpo monoclonal de controlo P3. A Figura 6 demonstra a ausência de coloração da linha de células T ou B com o anticorpo monoclonal específico para a caderina-11.

Para testar a ligação da caderina-11 a células T e B utilizou-se a linha de células T sinoviais 5 e células CP-B. Trataram-se placas com caderina-ll-Fc ou ICAM-1-Fc e IgGi. Ambas as linhas de células foram etiquetadas com um corante fluorescente, foram adicionadas às placas e determinou-se a fluorescência de entrada num leitor de placas de fluorescência. As células aderiram durante 30 minutos a 37°C, subsequentemente foram lavadas e determinou-se a razão entre células ligadas e fluorescência. Determinou-se a percentagem de células ligadas utilizando a equação: fluorescência após lavagem/ fluorescência de entrada x 100. A ligação a caderina-ll-Fc, mas não a proteínas de controlo ICAM-1-Fc e IgGl, é bloqueada pelo anticorpo monoclonal anti-caderina-11 7D3. Os resultados estão expressos em média + 1 DP (n=4), como mostrado na Figura 7. Vários tipos de resultados corroboram a possibilidade de a caderina-11 se ligar a um contra-receptor expresso em linfócitos B e T. Em primeiro lugar, a análise imuno-histoquímica de sinóvia de RNA demonstrou expressão de caderina-11 em células de sub-revestimento em contacto próximo com linfócitos. Em segundo lugar, algumas linhas de células T derivadas de sinóvia de AR e células B derivadas 104 do sangue periférico ligam-se especificamente a caderina-11-Fc, e esta interacção é bloqueada por mAbs anti-caderina-11. Em terceiro lugar, a caderina-11 não foi expressa nestas linhas de leucócitos, sugerindo que a interacção não é mediada por uma ligação homofílica, mas sim heterofílica a um receptor da caderina-11 (C11CR) expresso em células B e T.

Discussão

Descrevemos aqui pela primeira vez a presença de uma caderina expressa em sinoviócitos. As caderinas são expressas em todas as células que formam tecidos sólidos e são responsáveis pela segregação e saida de células durante a morfogénese tecidual. Desempenham um papel no estabelecimento da polaridade celular e manutenção da morfologia tecidual em tecidos adultos. Apesar de a função clássica das caderinas consistir em mediar a adesão homofilica célula-célula, por vezes ligam-se a caderinas não idênticas ou a integrinas, como a integrina αΕβ7.

As nossas descobertas da expressão preferencial de caderina-11 no revestimento de sinóvia de AR sugerem que esta molécula de adesão pode ser a molécula chave utilizada pelo pannus invasivo para ligação a cartilagem e, por fim, erosão em osso, em particular porque foi relatado que esta caderina é expressa por osteoblastos. Isto é particularmente relevante porque podemos interferir no processo destrutivo crónico caracteristico de AR se conseguirmos modular a função adesiva da caderina-11.

Consideramos a identificação de caderina-11 de sinoviócitos humanos do tipo B uma descoberta importante, e a sua 105 distribuição tecidual na sinóvia de AR corrobora o seu papel relevante na invasão e, por fim, erosão do osso adjacente.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> The Brigham and Women's Hospital, Inc. <120> Métodos e Composições para o Tratamento de Doença Inflamatória Utilizando Agentes Moduladores da Caderina-11

<130> B0801/7187WO/ERP/MAT <150> US 60/152,456 <151> 1999-09-03 <150> US 60/153,490 <151> 1999-09-13 <16 0 > 12 <170> FastSEQ para Windows Versão 3.0 <210> 1 <211> 2625 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (156) ... (2546) 106 <400> 1 agítggtcfcgc «0 asgtggfcfas 130 tas tgt 173 eggeafçest gaegtffttga gçtcaaççag çsagagaeatt çcstseeaag sgítggfcefcg gtgacgogte cggfaggce» eeete&ge&a gaeeaeegta eagtr.ggt *Se%S6Rt$e feaqtgtgçôt aeeaegfcaae eaaa* &fcg aa§ g&g s ítefc 3¾¾ âlu Mn lyr cys 1 5 etf t§e c&c age eafe gca 223. Ma Cys ais Ser 10 Hie Ala cc?c fcac fcfce eafc S9S cacj 3*9 Pro Ser PTas 35 Mis Gly His saf «fC tsc sagr csgt «SfO 317 Arg 50 sar Lys Arg <3ly gag t.SiC *ee sm ccfc S«o 3S5 slu ss Tyr Thr Qly j*ro fisp 70 afct gae fcet gat S99 413 n« Aap Ser «ly Ãisp SS Qly ttã caa Hçe gce cí® «tf tge etgr 9fe atg Leu Gin Ma Mã ao le» Vai Cys Mu &ly AS Mrt tfct gce CCS S»3 easf cgg fSfS® CSC ctg «99 Pbe Ala Pro as Gle Arg Arg aiy ais 30 lai Arg cat S*ã ®Ag aee SLâp aw W9 cag gtg ttâ His CHLu 40 I»ys ®y m SIu oiy 45 Gin Vai l>eti tS3 gte tgg sac eeg fcfce tfce gtg ata gag SS ¥ai txp Ma Sii« m PÍSê Vai xis Slu fiCC ftg ctt §t3 S3«·' 'mi ctt eafc t-ea gat ?r<j Vai £stl Vàl Sly Axgf 7S beu ais ser A8p 80 481 107 sas atfc «aa fcae atfc etc feea ggg g&& gga fet gga «ca att tfet gfcg Mu Xis l*ya Xyr lie I«u sor <5ly Si® ely Ma Sly Vfcx Ele $>hà Vai 90 Η .1.90 att gafc gas asa fcea 059 a&ç att cafc gec acs asg aeg c.tg g&t ega Il« Rsp Aap S>ys Ser <Sly Mu Elê Kls ala VM Lys Tte feti Mp Mgr' 105 US EIS §aa gag «gs gee eag taç aeg ttg atg gs*. çag gcg gteg gae agg g«c 81« (llu MS Ma Gla Γ/r TM Mu SSsfc Ria 81» Ma Vai àsp Agg Asp ' 135 IM 130 aac aat cgf eca ctff fag oca eegr teg gaa fcte att gfc« mg gt« <?ag T&t Mu Mg fre m Glu fxo teo Ser 61« Ste xis Vai Xfya Vai 61n 135 140 54$ ISO gac afcfc ast gae ase sat ccg gag tts ctg eac gag aso tafc cafc ges . Μφ H» M» Asp Am. »*e »»o O** PM &*» iía 81« 5J*r Tyx Hie M* 155 100 1SS ase gtg eat gag agg toe «afe gfcg gga sôg fceá gta. ate esg gtg «ca Mu Vai Mo Sis Mg êer Ma Vai Sly T&r Ser Vai íle 81¾ vai Th-χτ. X39 1?5 ISO get tea g«t gsa gat gao esc set fcafe ggs aafc age ges asf tfc* gfcg Âl*. Ser Mj Ai* Mp tep Me «te «yr Qly as» Set Ala &ys lsu vai . liS ISO 1»9 fcse sgt ato ete gg* gga eas eec fcat fctt tog gfcg gtta gea eag a*« Tyr ssr Xl« .Ls«. Oiu sly ®1a. Me Tyr VAa Ser vai sla Ala 81® TM aos aos 210 ggt ate ate ega aea gee eta eee aae «tg gao agg geg gee aag gag sly xis lie Mg Ti» Ais isa p?e Ma Mst J^p Mg 8iu M« lym glu 215 220 235 230 gag fc»c cac gtg gtg ato cag geç ã«g gac atf ggt gga oafc «sg gge 8&u t^ír Ria Vai Vai Xis 81» Ala X.ys Mp M»& Sly Sly Hls Mefc ®iy 335 340 245 gga cfce tea 339 «ea aee asa grtg acg ate *ea et? aee gat gt.« sai; Ofty kii smx Sly tte tfer Xy» Vai 9fet Xle *te Mu Tte Asp vai Am 250 255 300 gac ase eea cea aag tfet ceg eag agf cta feac eag stg feet geg tos Mp Ma £>ro pro Lya P&e Me Qin Apg l*» Tyt SX® Msfc Ssa Vai Ser »55 220 375 ga« gea goc gta ect ggg gas gt* gga ags gtg asa g«t asa gat Glti M* Ala vai Pro G.ly 61« Glu vsl eiy Aeg Vai Lys Ala Lys Asp 350 255 2$>0 coa gaç «et gga ga» ast gge feta. gte »os tee ast att gtt gat ggs Pro Mp Xle Gly slu Asa Gly £«« Vai Tte Tyr as» II s Vsl Asp eiy 2S5 '305 305 310 509 55? 505 «S3

?0E ?« ?9? 545 SS3 942 959 1,037 2085 gat ggt atg gas tsg ttt gas ate aca acg gac t&fc ga» a.ca cag g«g 1233 108 AAp ®Xy Mt Qla Ser Vhs Π* «se tfctf Asg Ty* <51© ΤΑ*· ela GI« 3i« 3Sã 325 ggg && ata «ag ©tg aaa sag «et fta gafe fctt gaa aae pta aga gge iisi

Oty vai iie X*ya feau fey© Aye Pro vai Asp K&s Olu Tísr siu A*g al« 330 335 340 tsfc age fctgr seg gfea fsg ges gee aaç gtg ©a© ate gac c©g aag fcfcfe 1223

Tyr Ser &a» Vai Giu Ms Ala Asa vai Kls Xle jvtp p*© lya pite 345 350 355 «te age «afc ggc eefe fct« áàg g*« aefc gtg aec gfco &ag ate toa fta 131?

Xle Ser &bjí Sly Kro Sfbe Lyss Aap fhx Vai T%uc Vai hy» ria Ser Vai 360 361 110 ga« gate gefc gafe gag «ss ect «fcg tt« tfeg gatt «ca agt tae ate eae 1325 alti Asp Ala Asp 01« Pm Pm s?at £hs lew Ala ire Ser: tyr lia ais 313 390 385 380 gaa ge© eaa gaa aat gea gefe gct gger mstt gtg gtt ggg aga gtSf cate J.313 íSiw vai 31» <Slu AMl Al» Ala Ma Gly sfcje Vai Vai Giy Asg Vai Sia 3SS 900 406 gcv aaa gae eç© gafe gefc ge« aao age «eg ata ãggr tat tec ate gafe Mil

Ala L-ys Aap $xq Aap Ala Ala Assa Sar Kro 11« Arg tyr $®x lie Asp 410 415 420 ©gfc eae aet ga* etc gac «$& fcfefc fete act att aat «ea <$eg gafe ggt 1468 A*g HiiS Th* Asg leu Aíffe A*g Ah a Phc xia Aaa Px© eia Aíg> Sly 420 430 435

fctt «fefc aaa aet a*» aso ect otg gafe «ga. gag ga« soa geo tgg eee 1SH 8fee Si* Lya Th* Th* &y» Pm tóu Asp A*g Slu 3H> Th* Ala 'Arp Leu . 440· 445 450 a&c ate act çrfeo fett gea gea gaa ate ©ao safe ©gg eafe cag gaa gs© 1585

e*a gte «oa gtg gs© afet «^9 Sto efefc gafc gte «ae gafe safe grefc «esc WW OO» vai m» Vai Ma rn Asg vai Isaa. .Aap vai Asa Asp Aaa Aia y*o

475 480 48S aag fctfe gct g«« ©et fcat gaa ggrfc fetc ate fegt gag agfe gafe esg acc iSSi &y» £*t» Ala Ala Kr© Tyr ®.iv <3Xy 3%« lia Cy» Siu S«* Aap ela f&r 480 49S 5-00 «ag ee» «tt toe «*e cag ce« «tt gte aea «tt agfc gea g«t gae »ag i49t hys p*© feeu 5«r Asa Gi» Fr© 11« Vai :feh* lie 6ax Ma Asp Aap ty» SOS βίο Si.5 gat gas a©p gc© aat gga oo* sga tfet afee tt© age ©ta cce cot gaa 1151 ftag Asp Th*· Ala Asa SXy t«© fttg Pisa. ile ph» Sex 1«« t?r« Κχβ Ôl» 52» S33 530

180 S ato «tt eae aat eea'safc ftte ata fte aga g«e aeo eg» gafe aae aea

Hi Si* lis Asn, Kr© Asa Kfcfe Vbs Vál Axg Ã*p asm. ,A*g Aap Asa. Tbr· 535 540 s 545 58Θ 109 gea gge gtg feae gee egg cgt gga ggg tte »8* «B9 «*3 »*9 *»» 3»® .ais Siy vai fyr M« Mg *itf Siy «ly «1» $** **9 ®ia ^ Bla ^ SSS SÉO S$£

tfcgp tae «st efcg cce ais gfcg afee age grafe g$fe 9ÊTC et-e ecg cec afcg MU ty*· MM *β» Sft» Jl* V*t lie sei? Ju»? «ly ei¥ il» **» 1W» *** S70 575 SOO agt age acç .8*c aes esc! acc ats aas gto tgc ggg tgc gac gfcg' ase $er $es? t&r Rs» Tfcr Leu Thjf 11 e hy» vai Cfs Gly Cy» Asp vai M®

S9S SSS S®S ggg gea çtg efcc tc-e fege aee gea gag gce tae att «kff s«* gec SfSFO Siy Ria ítsu £eu Ser Cys Ma Ala <51 a Ala fyr 11 é X-éU Mn MS í51y «88 SOS 610

Ct<j age aea ggç g-çg çfeg ate gee ate etc g®c tgc »tc gfcc sfcfc etc Itftn Seç tiíx Giy Ala Lsw tl» Ria ϊίβ Re» Ria Cye li* Vai lia leu SIS 620 £3S #S0 ©fegr gfce ait gtea gfea fcfeg tfet gfcg «se «tg *8»· *98' «*# «ag aa» gpwt hm vai ii« vai vai m ta» vai nx hm tom tom «i» i*y® sar* el« 05 $40 645 cc* etc afefe gfee fctt gag ga& gaa gafe gto cft yag a*e ato afcfc aot P*e .Léu Ϊΐβ Wi *R« £5i» eia <&» Ra» Vai Mg <&» R«» tt« lia *k*

ÇSO SSS SSQ fcafe gafe gafe g*t ggg 88* SSS 9«* ga* ««« «ca S»a gee fefefe 8»t att

Syr Asp Ra» eOta «Xy «y ®Ly 6iu 91« Asp T&jp »1« RXat Fha Mj> lia S5S «70 675 g-pe ace etc *®g aat cct gafe ggfc afee aafe gga fefet ate aeç ege aa»

Ria Ths Laa OX» Mc Mp 6ly Xle Asn. eiy &jia lis Mo Argr lys seo sss $so gac ate a*a cct gag feat cag tae »tg cct aga cct ggg cte egg cca Aag lie Lye ftro Qlu ^yr ala xyr sfefe Pro Rig Pro Siy Mu Rrg- sao 695 708 7ÔS 71.fi gcg cee aac sgc gtg gat gte gat g«c fette ate aac aeg aga ata cag Ala Pxc As» Ser Vai Aag vai As» Mjp vh» lie Rb» ttr arg lia eia. 73.5 720 726 gag gea gae «*fe gac ocw at^r $et c«t. cct tat gac fece afet caa ate ®la Ria Mp M» Aap Sre t&y Ria Λ» Sra lyr Mp Ser ll« ôio lie 730 735 740 tac ggfe tat gaa ggc agg gfc fcee gtg gee ggg fecc ctg age tefi sta tyr <3ly yyr glu 9ly Rsg ély Ser vai Ria Sly Ser Mu Ser s«x leu 745 750 ?S$ geg teg gee ace »e» gafe tea gee tfeg gae tat gafe feât cta eag a»e «lu Sar M» íàr Thx Mp Ser Asp íeu Mp Tyr Mp ryr Leu. Cio As» ?S0 76S 770 tgg gga cefe cgt ttt sag aaa cia gea gafe tfcg feafe ggt tee aaa gac trp Qiy Pro Mg Pha λγμ hyn lés Alá Mp to Tyr Qly Êôr iy» Rap 77S 7S0 7ÔS 750 act ttt g«t gac gat tet taa caataacgafe aeaaatfetfg ecttaagaac 56x Phs Astp Asp As» Ser * 755 tgtgtctggc gitcfecaafa atctagaaga tfigfeaaeag gfeatttttfc 1853 IMl xms 1557 2845 30»3 2141 2139 2237 2235 2333 238:1 2428 2477 252S 2S7$ asas 110 <210> 2 <211> 796 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 2

Môfc %» Qlu Asa ty® Cya teu Glu Ma Ma teu Val Cya teu Gly Kefc . 3. $ 10 3.S teu Cys His ser His fila PM Ma Pr© elsâ M§ Mg Gly His teu arg 20 25 30 5¾¾ 5a® pfea ais Gly Hl a Sis Glu Lya Gly Lya gi» Gly Gi» Vai te» 35 40 45

Sia Argr Sér Hys Mg Qly Trp val Ttp As» Q!» físa Pisa vai lie Glti 50 55 30 G.lu Tyr Tta Gly Os» Aap Pr© Vai teu Vai Gly Mg teu Bis Se® fisp §5 70 75 m lie Asp pe® Gly Aep ely As» Xle Xys tyr lie Leu Ser Sly Gl« sly 8$ 50 $5

Ala Sly Th® Xle P&a Vai Xla Asp Ssp Lys Per Sly Asa 3le His Ala 190 105 110

Thr Lys Tkr teu Aap Arg Glu Slu Arg Má Gin Ty® Thr teu Met Ma. ilS ISO 12$

Gin Ala Vai Asp Arg Asp Thr As» Mg Pr» teu viu Pro Pro Bar Viu 130 135 140 p$s» il e VM Lys val si» Asp í.l® Ase ftsp A*» too too Gl» pbm teu

145 150 155 ISO

His Slu Thz? tyr Sis Ma Aen Vai Pss Glu Arg ser Asa Vai Gly th® 155 170 175

Per Vai 11» Gl» Vai ffc® Ma Sé® Asp Ma Mo Aop Pr© T&r Ty® gly 180: 1S5 130 te» Ser Ala Lys leu Vai Tyr Ser Ile teu õlu sly Gl» Pr© Tyr Pise 155 300 20$

Se® Val GXu Ma Gla Th® Sly S.1# íle Mg thx Ala teu Pro ssa Ket 210 215 230 fisp Arg Glu Má t.ys Slu Glu 7¾¾ His Val Vál II» Si» Ma i»ys Asp 225 230 MS 2êÔ

Met Gly Gly His Mefc Gly Gly tew Se® Gly Th® Th® Xys Val Th® II s 245 2S0 2$5

2yr Gl» Kefc Ser Val Ser Gl« Ala Ala Vál Pr© Gly Glu Glu Vál Gly 27$ 200 2SS A®g Val Lyg Ala ϊφβ Mp Pr© Asp He Gly Glu As» Gly teu Val th® 250 2SS 300

Tyr As» Ile Val asp Sly Asp Gly Hefc Glu Per Pte 81« Me th® Th® 305 310 MS 320

Hm ®u th* Glu Axg Ala ty® Ser te» iys Val Gl» Ala Ma Asa Val 111 340 345 350

Eis n« Aap Pr© hys mas 11« ser M« sly Pre m& Lys Asg S&x Vai 35S 36¾ 365 fbr val lys Ile Ser Vsl ele Mp Ala Asp Sle vr& Pro «et Ph® Me 320 375 350

Ala Prs Sex syr Xle Bis GX« Vai 61» 31% Am Ala Ma Ala Sly Thr 385 390 335 400

Vai Va! Qly Síg Vai Bis Ala lys Mp Pr® Aep Ala Ala Asa Ser Pr© 405 Jie Axg tyx Ser Sis Asp Arg Eia 420 ils Aén Pr© Glu Asp Gly PM 11® 435 440 Slu Ql» Thr Ala τερ leu Ase 2le 4 $8 «55 Asa Arg Mis GXú Gie Ala Sln Vai -456 470 Vai ftijR Aisp Am Ala Pr* L-ys PM 485 Cy& Gly Ser Asp Sla Thr Lys Pr© S»« He Sex Ala Asp Mp l*ya Asp Asg ' 515 520 pm ser ua pxe »xe olu xi* XI* 530 535 Ssp M» Mg Asp ΜΆ 7ht Ala Ôly 545 SSS Ser A*«f Gin Lys Qla Mp Mu lyr $65 Siy Gly ii© Vro Pr© 1¾¾ San Ser sa© Cy* Gly Cya Mp vai Ase <&y Ala SSS 600 Tyr IX® Ase Ala Sly 1«« Ser 6X0 «15 Ala Cya XX® Vai XX® Lee !*% Vai 62$ 630 Arg Arg 61a tys Ay» Glu Pro leu 54$ Arg Glu A8B XX* Xis tSsx 5*yr Aap 640 VAr Si» Ai a J?.he Asp lie Ala Vfer 425 6SÔ Gly phs íle Prõ Axg I>ys Mp Xle 690 69S Arg pxô Giy Mu Axg Pr® ala Pr® 705 7X0 11* Me TAr Mg il* Gin Giu Ala 725 Tyr tep Ser Xle Gle Ile Tyr Sly 7m Gly Ser Mu Ser Ser í»eu Glu se? 755 760 t-λ Asp Tyr leu 31a Mm ytp Gly 730 775 teu Tyr Gly Ssx tiya’ Asg fhr P&e 785 , 790 4X0 . 4X5 tfer Asg Mu Mp Arg Phe PM Tísx 425 430

iy» Thr Tfcr Xys Pro Ma Asp Arg 44S ΏϊΤ Vai 'She Ala Ala Ql» Ile Kiçs 440

Pro Vai Ma ile Arg Vai Mu Ssp 475 480

Ala Ala Pre Tyr Glu Gly ítee ilé 400 455

Leu Ser Asm Glú Pró ilé Vai T&r SOS 510

ICfcr Ala Aan Gly Pxe Jhxg Pte lie S2S

His Aan Ens As® Fhe 73xr Vai Axg i40

Vai T^'r Ma Arg Arj Gly Qly PA® 555 540

MU leu Pxe lie Vai 11® Ser Aapt S70 S7S

Thr Aete Tte te PAr lia I.ye Vai S95 SS0

Mu Xe» Ser Cya Me Ala Glu Ala 505 fSír Gly Ala Mu lie Ma lie leu 620 XI* Vai Vai Mu í>&« Vai *Rw; Mu 635 540 lie Vál tis® Si» ÔXu 61« Asp Vai 650 £S$

Asp Mu Gly Gly Gly Glu «iu Asp 665 670

Asn Ser Vai Assp vai Asp Mp Pite® 3XS 720 &Mp Mn Aep Pr® Thr Ma Px® Pr® 730 73$ lyr Glu Gly Arg Gly Ser Vai Ala 745 750

Ala Viax r.ur Asp ser Asp xau Asp 765

Pro Arg phe Lya Ays leu Ma Asp 780

Asp Mp Asp Ser 775 <210> 3 <211> 10 112

<212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 3 <31 li <31 li Giy Gly Gly GTu <31u Gla Asp X S 10

<210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 4 se» lièa ser se» ws» ft-sn ssr ser % $

<210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 5 <3lu Asp Tyr asjs 'íyr Seu Am 1 5

<210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 PM liy* hys Leu táa Aap Mafc Tyr Qly 1 5 10 <210> 7 <211> 26

<212> DNA <213> Homo sapiens 113 <2 2 Ο > <221> variação <222> (12)...(12) <223> Ν = inosina <221> variação <222> (18)...(18) <223> Ν = isosina <221> variação <222> (21) . .. (21) <223> Ν = A, C, G, Τ <221> variação <222> (24) . . . (24) <223> Ν = A, C, G, Τ < 4 0 0 > 7 gcgggateog angafggugg nggnga 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variação <222> (12) ... (12) <223> N = inosina <221> variação <222> (15)... (15) <223> N = inosina 2ô ggggagetel cngenarytt ytfraa <210> 9 <211> 22

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ccaaaaatga aggagaacta st 2; <210> 10 <211> 31

<212> DNA <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 10 gggggataca ttgtiaagaa tcgtealeasi a <210> 11 <211> 23

<212> DNA <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 11 gdggcacog tggítgggag agt 23 <210> 12 <211> 32

<212> DNA <213> Homo sapiens 115 < 4 Ο Ο > 12 sgggggctog aggla^goct ctgcgttge» gg 32

Lisboa, 29 de Novembro de 2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor da caderina-11, que inibe a ligação de caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11 que é caderina-11, na preparação de um medicamento para o tratamento de um sujeito que tem uma perturbação inflamatória das articulações, em que o agente inibidor da caderina-11 é um anticorpo ou seu fragmento, um polipéptido da caderina-11 ou seu fragmento ou uma proteina de fusão com Fc compreendendo um dominio extracelular da caderina-11, em que o agente inibidor da caderina-11 se liga selectivamente à caderina-11.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a perturbação inflamatória das articulações é qualquer uma de entre sinovite crónica ou uma doença autoimune, como artrite reumatóide.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o agente inibidor da caderina-11 se destina a ser administrado localmente numa sinóvia do sujeito.

4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o agente inibidor da caderina-11 é um anticorpo.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal dirigido contra o dominio extracelular da caderina-11. 2

6. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o agente inibidor da caderina-11 é um polipéptido da caderina-11 solúvel.

7. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a caderina-11 é expressa por uma célula seleccionada do grupo que consiste num sinoviócito do tipo A, um sinoviócito do tipo B, um fibroblasto sinovial, uma célula de revestimento da membrana sinovial, um osteoblasto, uma célula derivada de cartilagem e uma célula derivada de pannus invasivo.

8. Método de rastreio de uma biblioteca molecular para identificar um composto protótipo farmacêutico que modula a adesão mediada pela caderina-11, em que o método compreende: efectuar um primeiro ensaio de adesão in vitro entre a caderina-11 e um contra-receptor da caderina-11, para obter um primeiro resultado do ensaio de adesão in vitro, efectuar um segundo ensaio de adesão in vitro entre a caderina-11 e o contra-receptor da caderina-11 na presença de pelo menos um membro da biblioteca molecular, para obter um segundo resultado do ensaio de adesão in vitro, e comparar o primeiro e o segundo resultados dos ensaios de adesão in vitro para determinar se o pelo menos um membro da biblioteca molecular modula a adesão mediada pela caderina-11, em que um ou ambos de caderina-11 e o contra-receptor da caderina-11 estão isolados, e em que o contra-receptor da caderina-11 é caderina-11, uma proteína de fusão caderina-11 Fc ou um domínio extracelular da caderina-11. 3

9. Método da reivindicação 8, em que a caderina-11 está isolada.

10. Método da reivindicação 8, em que a caderina-11 é apresentada por uma célula.

11. Método da reivindicação 10, em que a célula é seleccionada do grupo que consiste num sinoviócito do tipo A, um sinoviócito do tipo B, um fibroblasto sinovial, uma célula de revestimento da membrana sinovial, um osteoblasto, uma célula derivada de cartilagem e uma célula derivada de pannus invasivo.

12. Método da reivindicação 8, em que o contra-receptor da caderina-11 está isolado.

13. Método da reivindicação 8, em que o contra-receptor da caderina-11 é apresentado por uma célula.

14. Método da reivindicação 8, em que a caderina-11 é solúvel.

15. Método da reivindicação 8, em que o contra-receptor da caderina-11 é solúvel.

16. Método da reivindicação 8, em que a caderina-11 está imobilizada.

17. Método da reivindicação 8, em que o contra-receptor da caderina-11 está imobilizado. 4

18. Método da reivindicação 8, em que a biblioteca molecular é produzida de modo recombinante ou sintetizada quimicamente.

19. Método da reivindicação 8, em que a biblioteca molecular é uma biblioteca de péptidos.

20. Composição compreendendo uma proteína de fusão caderina-ll-Fc, compreendendo um domínio extracelular da caderina-11 humana da SEQ ID NO: 2 fundido a um domínio Fc humano, para utilização como medicamento.

21. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma perturbação inflamatória das articulações, compreendendo um agente inibidor da caderina-11, que inibe a ligação de caderina-11 a um contra-receptor da caderina-11 que é caderina-11, em que o agente inibidor da caderina-11 é um anticorpo ou seu fragmento, um polipéptido da caderina-11 ou seu fragmento ou uma proteína de fusão com Fc compreendendo um domínio extracelular da caderina-11, em que o agente inibidor da caderina-11 se liga selectivamente à caderina-11.

22. Composição farmacêutica da reivindicação 21, em que a perturbação inflamatória das articulações é sinovite crónica ou uma doença autoimune, como artrite reumatóide.

23. Composição farmacêutica da reivindicação 21, em que o tratamento compreende a administração do agente inibidor da caderina-11 localmente numa sinóvia de um sujeito que sofre da perturbação inflamatória das articulações. 5

24. Composição farmacêutica da reivindicação 21, em que o polipéptido da caderina-11 ou seu fragmento é um polipéptido da caderina-11 solúvel.

25. Composição farmacêutica da reivindicação 21, em que o agente inibidor da caderina-11 é um anticorpo.

26. Composição farmacêutica da reivindicação 25, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal dirigido contra um dominio extracelular da caderina-11. Lisboa, 29 de Novembro de 2010