KR101962476B1 - 면역성 접합체 및 그 제조방법 - Google Patents

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데브라 탐바키스
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마이클 폴 위트크로프트
데이빗 레옹
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Abstract

본 발명은 골격 영역 1 내에 위치된 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하는 면역 글로불린 가변 영역을 포함하는 분리된 단백질을 제공하며, 상기 시스테인 잔기들의 적어도 두 개가 다른 화합물에 접합되지 않으면 이황화 결합이 상기 시스테인 잔기들 사이에 형성되도록 한다. 바람직하게, 상기 단백질은 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 가변 영역들 중 적어도 하나는 상기 두 개의 시스테인 잔기들을 포함한다. 본 발명은 또한 TAG72에 결합하는 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 단백질 및 다른 화합물의 접합체들을 제공한다.

Description

면역성 접합체 및 그 제조방법{IMMUNO-CONJUGATES AND METHODS FOR PRODUCING THEM}
본 출원은 2009년 7월 3일 출원된 "면역성-접합체 및 그 제조방법"을 발명의 명칭으로 하는 호주 특허 출원 No.2009903127; 2009년 7월 6일 출원된 "면역성-접합체 및 그 제조방법"을 발명의 명칭으로 하는 미국 특허 출원 No.61/223353; 및 2009년 10월 30일 출원된 "가변 도메인 분자 및 그 사용방법"을 발명의 명칭으로 하는 미국 특허 출원 No.61/256703으로부터의 우선권을 주장하며, 그들의 전체 내용이 참조로서 포함된다.
본 발명은 단백질에 화합물의 접합(conjugation)을 촉진하도록 변형된 면역 글로불린 가변 영역을 포함하거나 단백질에 접합된 화합물을 포함하는 단백질에 대한 것이다.
면역 글로불린, 예를 들어 항체 및 항체 유사 분자(예를 들어, 카메리드(camelid) 면역 글로불린 또는 연골조직 피쉬(cartilaginous fish)로부터의 면역 글로불린 신규 항원 수용체(immunoglobulin new antigen receptors(IgNARs))) 또는 그것의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질의 높은 특이적 결합성은 그들이 피험자 내의 특정 타겟에 분자를 전달하는 데에 특히 적합하게 한다. 예로서, 면역 글로불린 또는 그것의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질은 예를들어 암세포(Lambert, 2005)와 같은 세포의 성장을 저해하거나 죽이기 위한 세포 독성 또는 세포 활동(증식) 억제성 화합물, 예를 들어 약물에 접합될 수 있다. 그러한 접합체는 세포 독성 또는 세포 활동(증식) 억제성 화합물의, 면역 글로불린 또는 단편이, 피험자 전체를 통해서는 오히려 비-특이적으로, 결합하는 항원을 발현하는 세포로의 표적화된 전달을 촉진한다. 그러한 접합체는 피험자 내에서 그것이 보다 체계적으로 요구되는 사이트에 대한 화합물의 독성 수준의 전달을 보장함으로써 피험자에 대해 일반적으로 독성인 화합물의 사용을 허용할 수 있다. 나아가 항체 또는 그것의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질의, 예를들어 형광단(fluorophore) 또는 방사선 동위원소와 같은 검출 가능한 화합물에 대한 접합은, 예를들어 체내 이미지-기반의 방법을 사용하여, 암세포와 같은 병든 세포의 검출을 촉진하는 것과 같은, 피험자 내에서 타겟 분자의 검출을 촉진한다.
통상적인 의미에서 항체 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질에 대한 화합물의 연결은 일반적으로 그 화합물이 항체 상의 수많은 사이트에 달라붙는 분자들의 이종의 혼합물(heterogeneous mixture)을 유도한다. 예를들어, 화합물은 항체 또는 그것의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질에, 항체 또는 항원 결합 도메인 내의 종종 수많은 라이신 잔기들을 통해 전형적으로 접합되어, 이종의 항체-화합물 접합체 혼합물을 생산한다. 사용된 반응 조건에 따라, 상기 이종의 혼합물은 전형적으로 0 내지 약 8개 또는 그 이상이 달라붙은(attached) 화합물과의 접합체들의 분산(distribution)을 포함한다. 추가적으로, 항체 또는 단백질에 대한 화합물의 특정 정수비를 갖는 접합체들의 각 서브 그룹 내에는, 화합물이 항체 또는 단백질 상의 다양한 사이트에 달라붙은 잠재적으로 이종의 혼합물이 존재한다. 분석적 및 예비적 방법들은 접합 반응으로부터 비롯된 이종의 혼합물 내에서 다양한 접합 종(species)을 분리하고 특성화하기에 부적절하다.
나아가, 항체 또는 그것의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질에 대한 화합물의 비특이적 접합은, 예를들어 상기 화합물이 항원 결합을 위해 요구되는 영역에 접합되면 항원에 대한 항체/단백질의 결합을 감소시키거나 완전히 막는다. 이러한 위험은 그 안에 항원 결합을 위해 중요하지 않은 접합에 적합한 잔기가 거의 존재하지 않을 수 있는 비변형(intact) 항체에서 보다 훨씬 작은 항원 결합 도메인들을 포함하는 단백질들 내에서 증가된다. 예로서, 항체의 항원 결합 도메인을 좀 더 많이 포함하는 단백질들은, 화합물이 항원 결합을 감소 또는 막는 일 없이 접합될 수 있는 사이트를 거의 포함하지 않는다.
항체의 Fc 영역 상의 탄수화물은 달라붙는 화합물에 대한 고유의 사이트이다. 일반적으로, 상기 탄수화물은 과요오드 산화에 의해 변형되어 반응성 알데히드를 생산하여, Schiff 염기 형성에 의해 반응성 아민을 포함하는 화합물을 달라붙도록 하는데 사용될 수 있다. 상기 알데히드는 아민 그룹과 반응할 수 있으므로, 반응은 상기 항체 또는 항원 결합 도메인 내의 라이신 잔기들이 양성자화(protonated) 또는 비반응화 되도록 하는 낮은 pH에서 수행된다. 히드라자이드 그룹은 낮은 pH에서 반응성이어서 히드라존(hydrazone) 연결을 형성하므로 상기 생산된 알데히드에 달라붙기에 가장 적합하다. 상기 연결은 히드라진 연결을 형성하는 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)에 의한 환원에 의해 보다 안정화될 수 있다(Rodwell 외, 1986). 이러한 접근의 단점은 연결을 위하여 요구되는, 어떤 항체 분자를 응집시키거나 손상시킬 수 있는 가혹한 조건을 포함한다는 것이다. 예로서, 어떤 항체 가변 영역에 존재하는 메티오닌 잔기는 항원 결합 친화성(avidity)의 손상을 가져올 수 있는 과요오드에 의한 산화에 특히 영향을 받는다. 히스티딘 및/또는 트립토판 잔기 또한 산화에 영향을 받는다. 나아가, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 많은 단백질은 반드시 Fc 영역을 포함하는 것은 아니며, 이는 그들이 상술한 과정을 이용하여 화합물에 접합될 수 없음을 의미한다.
시스테인 티올은 pH 7 근처에서 양성자화되어 덜 친핵성이 되는 대부분의 아민과 달리, 중성의 pH에서 반응성이다. 자유 티올 그룹은 상대적으로 반응성이므로, 시스테인 잔기를 갖는 단백질은 종종 이황화 연결된(disulfide linked) 올리고머와 같이 산화된 형태로 존재하거나 내부적으로 브릿지된 이황화 그룹을 포함한다. 세포외 단백질은 일반적으로 자유 티올을 포함하지 않는다(Garman, 1997). 시스테인 잔기는 유전 공학적 기술에 의해 단백질로 도입되어 리간드에 공유 결합을 형성하거나 새로운 분자 내의 이황화 결합을 형성한다. 그러나, 단백질에 삽입 또는 치환된 시스테인 티올 그룹은 특히 반응 또는 산화에 상대적으로 접근 되기 쉬운 경우, 즉 화합물의 접합에 사용되는 사이트에 위치된 경우에 잠재적으로 문제가 된다. 이는 상기 단백질의 농축 용액내에서, Escherichia coli. 원형질막, 배양 상청액, 또는 일부 또는 전부 정제된 단백질 내에서 상기 단백질 표면 상의 시스테인 잔기가 짝을 이루고 산화되어 분자내 이황화물 및 그에 따른 단백질 응집물(protein aggregates)을 형성할 수 있기 때문이다. 그러한 단백질 응집물은 예를들어 바림직한 생물학적 반응성을 갖는 등 유용한 형태의 분리된 단백질에 대한 낮은 수율을 종종 유도한다. 나아가, 상기 단백질은 새롭게 가공된 시스테인 및 존재하는 시스테인 잔기 사이에서 산화적으로 분자 내의 이황화 결합을 형성할 수 있어, 상기 단백질을 4차원 구조의 미스폴딩(misfolding) 또는 손실에 의해 비반응성 또는 비특이성으로 만들수 있다. 상술한 문제점 각각은, 서로 결합하여 정확한 폴딩 및 안정성, 결과로서 항원 결합 반응성을 보장하는 수개의 시스테인 잔기를 일반적으로 포함하는 항체 및 그것의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 내에서 악화된다.
본 기술 분야에서 그것에 대한 화합물의 단순한 접합을 허용하도록 변형된 면역 글로불린의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질에 대한 요구가 존재한다는 것은 상술한 사항으로부터 숙련된 기술자에게 분명할 것이다. 바람직한 단백질은 바람직하게 결과적으로 분자 내부의 결합에 의해 연결된 다중 결합된 응집물(mulimeric aggregates)의 고려할 만한 수준을 가져오지 않으면서, 다양한 시스템 내에서의 재조합 생산을 촉진할 것이다.
Abuchowski 외, J. Biol. Chem., 252: 3582-3586, 1977; Adams 외, Cancer Res 53:4026-4034, 1993; Al-Lazikani 외, J Mol Biol 273, 927-948, 1997; Albrecht 외, Bioconjug Chem. 15:16-26, 2004; Andersson-Engels 외, Phys. Med. Biol, 42:815-824, 1997; F.M. Ausubel 외 (editors), 분자 생물학에서의 현재의 프로토콜(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Pub. Associates 및 Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 업데이트를 포함하는); Axworthy 외 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4): 1802-1807, 2000; Bateman 외, Nucleic Acids Res. 32: D138-41, 2004; Bendele J Musculoskel Neuron Interact; 1(4):377-385, 2001; Bernhard 외 Bioconjugate Chem. 5:126-132, 1994; Bork 외, J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994; Borrebaeck (ed), 항체 조작(Antibody Engineering), Oxford University Press, 1995 (ISBN0195091507); Bowie 외, Science, 253:164-70, 1991; Bradl 및 Linington Brain Pathol., 6:303-311, 1996 Bradley, 외 Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:14819-14824, 2001; Brennan 외, Science, 229: 81-83, 1985; Brinkmann 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7538-7542, 1993; Carmichael 외 J. Mol. Biol. 326: 341- 351, 2003; Carpino and Han, J. Org. Chem., 37:3403-3409, 1972; Carter 외 Nucleic Acids Res. 13:4431- 4443, 1985; Carter 외 Bio/Technology 10: 163-167, 1992; Chari 외 Cancer Research 52:127-131, 1992; Chen 외 Nature, 446:203-207, 2007; Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917, 1987; Chothia 외 Nature 342, 877-883, 1989; Chou 외, Biochemistry 13:222-45, 1974; Chou 외, Biochemistry 13:211-22, 1974; Chou 외, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-48, 1978; Chou 외, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276, 1978; Chou 외, Biophys. J. 26:367-84, 1979; Clark, 외 Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Clark 외, Protein Sci. 15: 949-960, 2006; Coussens 외 Science 230(4730): 1132-1139, 1985; Eisen 외, J. Am. Chem. Soc., 75: 4583-4585, 1953; Feild 외 Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582, 1999; Frangioni, Curr. Opin. Chem. Biol, 7:626-634, 2003; Froyen 외, Mol. Immunol., 37: 515-521, 1995; Gaertner 및 Offord, Bioconj. Chem., 7: 38-44, 1996; Garman, 비-방사성 활성 표지화(Non-Radioactive Labelling): A Practical Approach, Academic Press, London, 1997; Gaugitsch 외 J. Biol. Chem. 267 (16):1 1267-1273, 1992; Gelfand 외 Protein Eng. 11: 1015-1025, 1998a; Gelfand 외, Journal of computational biology 5: 467-477, 1998b; Gendler 외, J. Biol. Chem. 265: 15286-15293, 1990; Getz 외 Anal. Biochem. 273:73-80, 1999; Gillies 외, J. Immunol. Methods 125:191-202, 1989; Goding, 모노클로날 항체(Monoclonal Antibodies): Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103; Goodson and Katre, Biotechnology, 8: 227-231, 1990; Gribskov 외, Methods Enzymol. 183:146-59, 1990; Gribskov 외, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 84:4355-58, 1989; Grossman 외, Biochemistry, 21: 6122-6128, 1981; Guan 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13206-10, 1998; Guss 외 EMBO J. 5: 1567-1575, 1986; Guy 외, Mol Cell Biol. 12(3):954-61, 1992; Halaby 외, Protein Engineering 12: 563-571, 1999; Harlow 및 Lane, 항체: 실험실 매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Press, 1988; Higuchi, in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press, 1990; Ito 외 Gene 102:67-70, 1991; Ho 외 Gene (Amst.) 77:51-59, 1989; Holliger 외 Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448, 1993; Hollinger 및 Hudson Nature Biotechnology, 23: 1126-1136, 2005; Holm 외, Nucleic Acids Res. 27:244-47, 1999; Hu 외, Cancer Res., 56: 3055-3061, 1996; Hubert, 외 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 14523-14528, 1999; Hudson and Kortt J. Immunol. Methods, 231: 177-189, 1999; Hunter 외, Nucleic Acids Research 37: D211-D215, 2009; Hust 외, BMC Biotechnology 7:14, 2007; Iwamoto 외, Oncogene. 5(4):535-42, 1990; Johnson 및 Wu, Nucleic acids research 28: 214-218, 2000; Jakobovits 외 Nature Biotechnology 25, 1134-1143, 2007 Jones 외 Nature, 321:522-525, 1989; Jones, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87, 1997; Jones, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87, 1997; Junutula 외, Nature Biotechnology 26: 925-932, 2008; Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 및 1991; Karpusas 외, J Mol Biol. 327:1031-1041, 2003; Kam 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605, 2005; Kawabata 외, Proteins 41: 108-122, 2000; Kawabata, Nucleic Acids Res. 31: 3367-3369, 2003; Kim. 외, Mol Cancer Ther. 7: 2486-2497, 2008; King 외, Biochemistry, 17: 1499-1506, 1978; Kohler 및 Milstein Nature, 256:495-497, 1975; Kortt 외 Protein Eng, 10: 423-433, 1997; Kortt 외, Biomol. Eng., 18: 95-108, 2001; Kostelny 외, J. Immunol., 148(5):1547-1553, 1992; Kruif 및 Logtenberg J. Biol. Chem., 271: 7630-7634, 1996; Kunkel 외 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1987; Lambert Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549, 2005; Largaespada 외, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 166, 91-96, 1990; Larson 외, J. Mol. Biol. 348: 1177-1190, 2005; Laue 외, 생물학 및 폴리머 과학에서의 분석적 초원심분리(Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science) 1992:90-125, 1992; Le Gall 외 FEBS Lett, 453: 164-168, 1999; Lefanc, Exp Clin Immunogenet 18: 242-254, 2001a; Lefranc, Exp Clin Immunogenet 18: 161-174, 2001b; Lewis 외 Bioconj. Chem. 9:72-86, 1998; Li 외, Bioconjug Chem 17: 68-76, 2006; Li 외, Bioconjug Chem. 19: 89-96, 2008; Lindmark 외 J Immunol Meth. 62: 1 -13, 1983; Lonberg, N. "인간 모노클로날 항체에 대한 이식 유전자적 접근(Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies)." Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, 1994; Lukacs 외 J. Exp. Med., 194: 551-555, 2001; Marsh 외 Hum. Mol. Genet. 9, 13-25, 2000; Matsui 외, Cell.61(6):1147-55, 1990; Matusik 외, 전립선 암의 이식 유전자 마우스 모델(Transgenic mouse models of prostate cancer). In: Transgenics in Endocrinology, ed. by MM Matzuk, CW Brown, 및 TR Kumar. The Humana Press Inc (Totowa, NJ) Chapter 19, pp 401-425, 2001 Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963; Morrison 외 Proc. Natl Acad. Sci USA 81:6851-6855, 1984; Morrison, Science 229:1202, 1985; Moult, Curr. Opin. Biotechnol. 7:422-27, 1996; Muller 외 Eur. J. Immunol. 22 (6): 1621-1625, 1992; Muller 외 EMBO J.9(3):907-13, 1990; Murzin 외, J. Mol. Biol. 247: 536-540, 1995; Mutsushima 외, Chem. Lett., 773-776, 1980; Nakayama 외 Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124- 127, 2000; Oi 외, BioTechniques 4:214, 1986; Pallares 외, Exp Clin Immunogenet 16: 36-60, 1999; Panchenko 외 J. Mol. Biol. 296: 1319-1331, 2000; Pei 외 Proc Natl Acad Sci U S A. 94: 9637-9642, 1997; Perisic 외 Structure 2: 1217-1226, (1994); Pluthun, Immunol. Revs., 130:151-188, 1992; Presta Curr Op Struct Biol, 2:593-59, 1992; Presta 외, Cancer Res., 57: 4593-4599, 1997 Ramseier 및 Chang Analyt. Biochem., 221: 231-233, 1994; Ramanujam 외, IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 48:1034-1041, 2001; Reddy 외, Synthesis Stutgart: 999-1002, 1988; Reiter 외 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Riechmann 외 Nature, 332:323-329, 1988; Risma 외, Proc Natl Acad Sci U S A.;92(5):1322-6, 1995; Roberge 외, Protein Eng. Des. Sel. 19: 141-145, 2006; Roby 외, Carcinogenesis. 21(4):585-91, 2000; Rodwell 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2632-2636, 1986; Rost 외 270: 471-480, 1997; Roux 외 J. Immunol. 161:4083, 1998; Saha 외, BcePred: 물리-화학적 특성을 사용하는 항원의 서열 내에서의 연속적인 B-세포 항원 결정기에 대한 예측(Prediction of Continuous B-Cell Epitopes in Antigenic Sequences Using Physico-chemical Properties). In Nicosia, Cutello, Bentley and Timis (Eds.) ICARIS 2004, LNCS 3239, 197-204, Springer,2004; Sakaguchi 외 Nature, 426: 454-460; Sali 및 Blundell, J. Mol. Biol. 234, 779-815, 1993; Sambrook 외 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989; Sanders 외, Thyroid 17: 395-410, 2007; Schelte 외, Bioconj. Chem. 11: 118-123, 2000; Schuck Biophys J; 78:1606-19, 2000; Shalaby 외, J. Exp. Med., 175: 217-225, 1992; Shen 외, Protein Sci. 15: 2507- 2524, 2006; Sippl 외, Structure 4:15-19, 1996; Sirk 외, Bioconjug Chem. 19: 2527-2534, 2008; Skerra 외, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262, 1993; Solovyev 및 Salamov 생물 과학에서의 컴퓨터 응용(Computer Applications in the Biosciences),10,661-669, 1994; Stanfield 외, J Virol. 80:6093-6105, 2006; Tang 외 J. Exp. Med., 199: 1455-1465, 2004; Todorovska 외, J. Immunol. Methods, 248: 47-66, 2001; Trenado 외 J. Clin.Invest., 112: 1688-1696, 2002; Vallette 외 Nuc. Acids Res. 17:723-733, 1989; Van der Sluis 외 Gastroenterology 131: 117-129, 2006; Verhoeyen 외 Science, 239:1534-1536, 1988; Wang 외 J Clin Invest. 118(7): 2629-2639, 2008; Weissinger 외 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88, 8735-8739, 1991; Wells 외 Gene 34:315-323, 1985; Xu 및 Xu Proteins: 구조, 기능 및 유전학(Structure, Function, and Genetics) 40: 343-354, 2000; Yazaki 외, Bioconjug Chem 12: 220-228, 2001; Yem 외, J. Biol. Chem., 267: 3122-3128, 1992; Zalipsky 외, J. Bioact. Compat. Polym., 5: 227-231, 1990 Zalipsky 외, Biotechnol. Appl. Biochem., 15: 100-114, 1992; Zhang and Tam, Anal. Biochem. 233: 87-93, 1996; Zhou 외, Proc Natl Acad Sci U S A. 102: 14575-14580, 2005; Zoller 외 Methods Enzymol. 100:468-500, 1983; 및 Zoller 및 Smith. Nucl. Acids Res. 10:6487-6500, 1982.
본 발명의 목적은 면역성 접합체 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 이르도록 한 작업에서, 발명자들은 예를들어 항체와 같은 면역 글로불린의 가변 영역 내에서 항원에 대한 그 가변 영역의 결합을 막지 않으면서 그것에 대한 화합물의 접합을 허용하는 사이트를 찾아내기 위해 노력했다. 본원에 예시된 바와 같이, 본 발명자들은 접합에 접근 가능하며, 그곳에 접합된 화합물이 항원 결합을 방해 또는 막을 것 같지 않는 가변 영역의 항원 결합 사이트로부터 충분히 제거된, 가변 영역의 프레임 워크 영역 1(FR1) 내의 수많은 사이트를 지정하여 왔다. 이러한 사이트는 중쇄(heavy chain) 가변 영역(VH) 및 경쇄(light chain) 가변 영역(VL) 내 모두에서 보존된다. 이러한 지정을 바탕으로 하여, 본 발명자들은 두 개의 시스테인 잔기들이 FR1으로 삽입된 돌연변이된 가변 영역을 포함하는 다양한 단백질을 생산하였다. 이러한 시스테인 잔기들은 그들 사이에 이황화 결합이 형성될 수 있도록 위치한다. 재조합 생산 및/또는 정제 중에, 상기 시스테인 잔기들은 그에 의해 이들 잔기가 동일 단백질 또는 다른 단백질 내 다른 시스테인 잔기와의 결합이 감소 또는 방지되는, 이황화 결합에 의해 연결된다. 이것은 연결된 다중결합자(multimers) 및/또는 엉뚱하게 폴드된 가변 영역의 생산에 대한 가능성을 감소시키고, 기능성 단백질의 생산 및/또는 분리를 허용한다. 분리에 후속적으로, 상기 시스테인 잔기들은 환원되거나, 그렇지 않을 경우 절단 되어 상기 단백질에 대한 화합물의 접합을 허용한다. 본 발명자들은 또한, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 벌키 화합물 및 방사성 동위원소와 같은 이미징 화합물을 포함하는 이러한 단백질로의 수많은 화합물의 접합이 항원에 대한 가변 영역의 결합을 막지 않는다는 것을 보여주었다.
일 실시예에서, 본 발명은 골격 영역 (FR) 1 내에 위치하는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하는 면역 글로불린 가변 영역을 포함하는, 적어도 하나의 상기 시스테인 잔기가 화합물과 접합하지 않는다면 상기 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합이 형성 가능한, 분리된 단백질을 제공한다.
다른 예로서, 본 발명은 골격 영역 (FR) 1 내에 위치하는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하는 면역 글로불린 가변 영역을 포함하는, 적어도 두 개의 상기 시스테인 잔기들이 화합물과 접합하지 않는다면 상기 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합이 형성 가능한, 분리된 단백질을 제공한다.
대안적인 또는 추가적인 실시예에서, 본 발명은 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 적어도 하나의 가변 영역이 골격 영역(FR) 1 내에 위치하는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하며, 적어도 하나의 상기 시스테인 잔기가 화합물과 접합하지 않는다면 상기 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합이 형성 가능한, 분리된 단백질을 제공한다.
대안적인 또는 추가적인 실시예에서, 본 발명은 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 적어도 하나의 가변 영역이 골격 영역(FR) 1 내에 위치하는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하며, 적어도 두개의 상기 시스테인 잔기가 화합물과 접합하지 않는다면 상기 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합이 형성 가능한, 분리된 단백질을 제공한다.
바람직하게, 상기 단백질은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 적어도 하나의 VL 및 적어도 하나의 VH를 포함한다.
바람직하게, 상기 시스테인 잔기들은 상기 이황화 결합이 비-환원성 조건 하에 존재하도록 위치한다.
바람직하게, 상기 시스테인 잔기들은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기(residue) 2 및 상보성 결정 영역(complementary determining region) (CDR) 1 사이에 위치한다.
일 실시예에서, 상기 시스테인 잔기들은 FR1의 하나 이상의 루프 영역 내에 위치한다.
대안적인 또는 추가적인 실시예에서, 상기 시스테인 잔기들은 VH 내에 있고 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기들 2 내지 30 사이에 위치한다. 바람직하게, 상기 시스테인 잔기들은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기들 7-20 및/또는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기들 24-30 사이에 위치하며, 더욱 바람직하게는 잔기들 7-20 사이에 위치한다. 추가적인 실시예에서, 상기 잔기들은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기들 6-16 사이에 위치한다. 추가적인 실시예에서, 상기 잔기들은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기들 7-16 사이에 위치한다.
대안적인 또는 추가적인 실시예에서, 상기 시스테인 잔기들은 VL내에 있고 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기들 2 내지 22 사이에 위치한다. 바람직하게, 상기 시스테인 잔기들은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기들 7-20 사이에 위치한다. 추가적인 실시예에서, 상기 잔기들은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기들 7-19 사이에 위치한다. 추가적인 실시예에서, 상기 잔기들은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기들 7-17 사이에 위치한다.
본 발명의 예시화된 형태에서 상기 시스테인 잔기들은 VH 및/또는 VL 내에 보존된 시스테인 잔기에 추가된다. 숙련된 기술자는 상기 보존된 시스테인 잔기가 적어도 자연적으로 형성된 항체의 대부분에서 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 VL 내에서의 잔기 23 및/또는 VH 내에서의 잔기 22에 있다는 것을 알고 있을 것이다.
본 발명의 바람직한 형태에서 상기 시스테인 잔기들은 상기 보존된 시스테인 잔기에 대한 N-말단에 위치한다. 바람직하게, 상기 시스테인 잔기들은 하기의 하나 이상에 위치한다:
(i) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 κVL의 잔기 8 및 잔기 11;
(ii) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 κVL의 잔기 14 및 잔기 17;
(iii) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 λVL의 잔기 7 및 잔기 11;
(iv) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 λVL의 잔기 14 및 잔기 17;
(v) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 λVL의 잔기 8 및 잔기 12;
(vi) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 VH의 잔기 7 및 잔기 10; 및/또는
(vi) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 VH의 잔기 13 및 잔기 16.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 상기 시스테인 잔기들은 하기의 하나 이상에 위치한다:
(i) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 κVL의 잔기 13 및 잔기 19;
(ii) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 λVL의 잔기 13 및 잔기 19;
(iii) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 VH의 잔기 6 및 잔기 9; 및/또는
(vi) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 VH의 잔기 12 및 잔기 18.
본 발명은 상기 가변 영역 내 또는 그것을 포함하는 단백질 내에서 추가적인 잔기들을 변형시키는 것을 분명히 고려한다. 예로서, 본 발명자들은 시스테인 잔기들 사이에 위치하는 잔기들을 치환하거나 또는 나아가 CDRs 내에서 자연적으로 발생된 시스테인 잔기들을 대체하는 것이 본 발명의 단백질이 항원에 결합하는 것을 막지 않는다는 것을 명확히 보여주었다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 VL이 적어도 하나의 VH에 결합하여 항원 결합 사이트를 형성하는 본 발명의 적어도 하나의 단백질을 함유하는, FV를 포함하는 분리된 단백질을 제공한다.
상기 단백질의 일 형태는 단일 폴리펩티드 쇄 내에서 항원 결합 사이트를 형성하는 VL 및 VH를 포함한다. 예로서, 상기 단백질은 하기의 것이다:
(i) 단일 쇄 Fv 단편(scFv);
(ii) 이합체(dimeric) scFv(di-scFv); 또는
(iii) Fc 또는 중쇄 고정(constant) 도메인 (CH)2 및/또는 CH3에 연결된 적어도 하나의 (i) 및/또는 (ii).
대안적으로, 상기 단백질은 서로 다른 폴리펩티드 쇄 내에서 항원 결합 사이트를 형성하는 VL 및 VH를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 단백질 내의 폴리펩티드 쇄 각각은 VL 및 VH를 포함한다. 바람직하게, 그러한 단백질은 하기와 같다:
(i) 이원 항체(diabody);
(ii) 삼원 항체(triabody); 또는
(iii) 사원 항체(tetrabody).
다른 실시예에서, 본 발명의 단백질은 면역 글로불린, 바람직하게는 항체이다. 면역 글로불린의 예시적 형태는 본원에 개시되며 필요한 변경을 가하여 본 발명의 본 실시예에 적용되는 것으로 여겨진다.
본 발명의 어떤 실시예에서, 본 발명의 단백질은 이황화 결합에 의해 연결되는 시스테인 잔기들을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 단백질은 상기 시스테인 잔기들의 적어도 하나에 접합된 화합물을 포함하며, 상기 화합물의 접합은 항원에 대한 상기 단백질의 결합을 방해하지 않는다. 예시적 화합물은 방사성 동위원소, 검출 가능한 지표, 치료적 화합물, 콜로이드, 독소, 핵산, 펩타이드, 단백질, 피험자 내에서 단백질의 반감기를 증가시키는 화합물 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물을 포함한다. 숙련된 기술자는 상기 용어 단백질이 하나 이상의 면역 글로불린 가변 영역을 포함하는 단백질, 예로서 본원에 개시된 바와 같은 단백질을 함유하는 Fv를 포함하는 항체 또는 그 단편을 망라한다는 것을 인식할 것이다.
일 실시예에서, 본 발명의 단백질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된다. 예로서, 상기 PEG는 단분산(monodisperse) PEG이다.
일 실시예에서, 상기 PEG는 약 4000 Da를 초과하지 않는 분자량, 예를들어 약 2000 Da를 초과하지 않는 분자량, 약 1500 Da를 초과하지 않는 것과 같은 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, 상기 PEG는 1000 Da를 초과하지 않는, 900 Da를 초과하지 않는 것과 같은, 예로서 800 Da를 초과하지 않는, 600 Da를 초과하지 않는 것과 같은 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, 상기 PEG는 약 550 Da 내지 약 1000 Da의 분자량을 갖는다.
다른 실시예에서, 상기 PEG는 약 70 또는 75 또는 77을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 50을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 바람직하게, 상기 PEG는 48을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 40을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 30을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 27을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 24를 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 15를 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 12를 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 바람직하게, 상기 PEG는 약 12 내지 27의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 단백질은 SEQ ID NO: 57 에 나열된 서열과 적어도 약 80% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하며, FR1 내의 시스테인 잔기들 중 적어도 하나에 접합된 짧은 단분산된 PEG를 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 상기 PEG는 15 내지 30의 에틸렌 글리콜 단위 및 바람직하게 24 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 상기 단백질은 하나 이상의 및 바람직하게 10 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2보다 적은 치환, 바람직하게 보존적인(conservative) 아미노산의 치환 또는 제거 또는 삽입을 포함한다. 상기 언급된 서열에 대한 예시적인 변형은 N-말단 세린을 제거하는 것 또는 다른 아미노산 잔기를 대신하여 세린으로 치환하는 것(바람직하게 보존적인 아미노산의 치환) 및/또는 C-말단 라이신 및/또는 아르기닌을 제거 또는 치환하는 것을 포함한다.
본 발명자들은 또한 가변 영역을 포함하는 단백질이 N-말단(terminus)에서 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하도록 변형시켰다. 이러한 잔기는 그곳에의 화합물의 사이트-특이적 접합을 허용한다. N-말단 세린/트레오닌 돌연변이와 상기 논의된 시스테인 돌연변이를 결합함으로써, 본 발명자들은 그들이 적어도 두개의 다른 화합물을 접합할 수 있는 단백질을 제조하였다.
이에 따라, 본 발명의 일 실시예는 적어도 하나의 N-말단 트레오닌 또는 세린 잔기를 추가적으로 포함하는 본 발명의 단백질을 제공한다. 상기 세린 또는 트레오닌 잔기는 상기 단백질의 N-말단에 추가될 것이다(즉, 상기 단백질의 서열에 추가된다). 바람직하게, 상기 세린 또는 트레오닌 잔기는 상기 단백질의 N-말단에서 자연적으로 발생된 아미노산 잔기를 대체하여, 즉, 치환적 돌연변이를 유도한다. 선택적으로, 상기 트레오닌 또는 세린 잔기는 상기 기재된 화합물과 같은 화합물에 연결된다.
일 실시예에서, 본 발명의 단백질은 상기 시스테인 잔기의 적어도 하나에 접합된 제1 화합물 및 상기 트레오닌 또는 세린 잔기에 접합된 제2 화합물을 포함하며, 이때 상기 제2 화합물은 상기 제1 화합물과 다르다.
본 발명은 어떤 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 고려한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 인간 상피 성장 인자(Human epidermal growth factor(Her)2), 종양과 연관된 글리코프로테인(tumour associated glycoprotein) Tag72, MUCI 또는 전립선 특이성 멤브레인 항원(prostate specific membrane antigen(PSMA))으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 단백질은 복수 개의 항원, 예를들면 앞서 열거된 항원들에, 상호-반응성 또는 다중-특이성인 단백질을 통하여 결합된다.
본 발명의 예시적 단백질은 SEQ ID NOs: 55, 59, 61, 109, 115 또는 117의 어느 하나에 나열된 서열과 80% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 또는 100% 동일하며, FR1 내에 위치되는 두 개 이상을 포함하도록 변형된 서열을 포함한다. 변형에 적합한 사이트는 본원에 개시되며 또한 필요한 변경을 가하여 본 발명의 본 실시예에 적용되는 것으로 여겨진다. 예로서, 상기 단백질은 그 단백질이 FR1 내에 시스테인 잔기들을 포함한다면, SEQ ID NOs: 57, 63, 65, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 또는 105, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 또는 133의 어느 하나에 나열된 서열과 적어도 약 80% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 또한 N-말단 트레오닌 또는 세린 잔기를 포함하는 단백질을 제조하였다. 또한 이러한 사이트는 심지어 FR1 내에 시스테인 잔기들이 부재(absence)하는 경우에도, 화합물의 접합에 유용하다.
이에 따라, 본 발명은 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 및 면역 글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 상기 가변 영역 중 적어도 하나가 N-말단 트레오닌 잔기 또는 세린 잔기를 포함하는, 분리된 단백질을 또한 제공한다. 상기 세린 또는 트레오닌 잔기는 상기 단백질의 N-말단(terminus)에 부가될 것이다. 바람직하게, 상기 세린 또는 트레오닌 잔기는 상기 단백질의 N-말단에서 자연적으로 생성되는 아미노산 잔기를 대체하여, 즉, 치환적 돌연변이의 결과를 가져온다.
바람직한 단백질은 N-말단 트레오닌 또는 세린 잔기를 포함하는 적어도 하나의 본 발명의 단밸질을 포함하는 Fv를 포함하며, 적어도 하나의 VL이 적어도 하나의 VH와 결합하여 항원 결합 사이트를 형성한다.
일 실시예에서, 상기 항원 결합 사이트를 형성하는 상기 VL 및 상기 VH는 단일 폴리펩티드 쇄 내에 있다. 예로서, 상기 단백질은 하기의 것이다:
(i) 단일 쇄 Fv 단편(scFv);
(ii) 이합체(dimeric) scFv(di-scFv); 또는
(iii) Fc 또는 중쇄 고정(constant) 도메인 (CH)2 및/또는 CH3에 연결된 적어도 하나의 (i) 및/또는 (ii).
대안적으로, 상기 항원 결합 사이트를 형성하는 상기 VL 및 상기 VH는 다른 폴리펩티드 쇄들 내에 있다. 일 실시예에서, 상기 단백질 내의 폴리펩티드 쇄 각각은 VL 및 VH를 포함한다. 바람직하게, 그러한 단백질은 하기와 같다:
(i) 이원 항체(diabody);
(ii) 삼원 항체(triabody); 또는
(iii) 사원 항체(tetrabody).
다른 실시예에서, 본 발명의 단백질은 면역 글로불린, 바람직하게 항체이다. 면역 글로불린의 예시적 형태는 본원에 개시되며 또한 필요한 변경을 가하여 본 발명의 본 실시예에 적용되는 것으로 여겨진다.
일 실시예에서, 상기 단백질은 부가적으로 상기 트레오닌 또는 세린 잔기에 접합된 화합물을 포함한다. 예시적인 화합물은 본원에 개시되며 또한 필요한 변경을 가하여 본 발명의 본 실시예에 적용되는 것으로 여겨진다.
일 실시예로서, 단백질은 SEQ ID NOs: 55, 59, 61, 109, 115 또는 117의 어느 하나에 나열된 서열과 80% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 또는 100% 동일하며, N-말단 트레오닌 또는 세린 잔기를 포함하도록 변형된 서열을 포함한다. 예로서, 상기 단백질은 그 단백질이 N-말단 트레오닌 또는 세린 잔기를 포함한다면, SEQ ID NOs: 57, 63, 65, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 또는 133의 어느 하나에 나열된 서열과 적어도 약 80% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
또한 본 발명은, 본 발명이 골격 영역(Framework region(FR)) 1 내에 위치되는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들 및/또는 N-말단 트레오닌 또는 세린 잔기를 포함하는 변형된 면역 글로불린 가변 영역을 포함하며, 및 변형되지 않은 형태의 가변 영역은 적어도 하나의 상기 시스테인 잔기들(바람직하게 적어도 두 개의 모든 시스테인 잔기들) 및/또는 상기 트레오닌 또는 세린 잔기를 포함하지 않는 단백질을 부가적을 제공하도록 제공한다. 시스테인 잔기들 및/또는 트레오닌 또는 세린 잔기를 위치시키기(positioning) 위한 적합한 사이트가 본원에 개시되며 필요한 변경을 가하여 발명의 본 실시예에 적용되는 것으로 여겨진다.
일 실시예에서, 본 발명의 단백질은 인간의, 인간화된, 비면역화된 또는 키메릭(chimeric)이다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산을 망라한다. 예시적인 핵산은 SEQ ID NOs: 54, 58, 60, 108, 114 또는 116의 어느 하나 이상에 나열된 서열과 적어도 약 80% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 또는 100% 동일하며, FR1 내에 위치된 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 및/또는 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 인코딩하는 코돈(codons)을 포함하도록 개조된 서열을 갖는 것들을 포함한다. 일 실시예에서, 본 발명의 핵산은, 서열이 FR1 내의 적어도 두 개의 시스테인 잔기들 및/또는 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하는 단백질을 인코드한다면, SEQ ID NOs: 56, 62, 64, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132의 어느 하나 이상에 나열된 서열과 적어도 약 80% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 상기 숙련된 기술자는 코돈 용도의 퇴화로 인하여 수많은 뉴클레오티드 서열이 본 발명의 단백질을 인코드할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 모든 그러한 뉴클레오티드 서열은 본 발명에 의해 망라될 것이다. 예로서, 코돈 최적화된 핵산은 특이적 세포 타입 또는 기관에서의 발현을 촉진하도록 제조될 수 있다.
본 발명의 핵산은 그것에 의해 발현 구조를 제조할 수 있도록 조작적으로(operably) 프로모터에 연결될 수 있다. 그러한 발현 구조 또는 핵산은 바람직하게 벡터, 바람직하게 세포 내의 복제 가능한 벡터, 예를들면 플라스미드 또는 파지미드(phagemid) 또는 코스미드(cosmid) 또는 인공의 염색체 내에 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 외인성(exogenous) 핵산 또는 발현 구조를 포함하는 분리된 세포, 바람직하게 상기 세포는 본 발명의 단백질을 발현하는 분리된 세포를 제공한다. 예시적 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 포유류 세포 또는 곤충 세포를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의해 제공되는 핵산 및/또는 발현 구조 및/또는 세포는 또한 본 발명의 단백질을 제조하기 위한 방법의 기초를 제공한다. 이에 따라, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 제조하는 방법, 상기 인코딩된 단백질이 제조되기에 충분한 조건 하에서 본 발명의 발현 구조를 유지하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 예로서, 상기 방법은 상기 단백질에 대해 인코딩된 것이 제조되기에 충분한 조건 하에 본 발명의 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 방법은 부가적으로 상기 단백질을 분리하는 것을 포함한다. 상기 방법은 부가적으로 예를들어 결합 반응성 또는 친화성을 위해 상기 단백질을 테스트하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 부가적으로 상기 단백질을 약제학적 조성물로 조제(formulating)하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 포함하는 접합체(congugates)를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) 골격 영역(framework region(FR)) 1 내에 위치되는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하는 본 발명의 단백질을 획득하는 것; 및
(ii) 그에 의해 상기 접합체를 제조하기 위해 상기 시스테인 잔기들 중 적어도 하나에 화합물을 접합시키는 것.
일 실시예에서, (i)에서 얻어진 단백질 내의 상기 시스테인 잔기들은 이황화 결합에 의해 연결되고 상기 방법은 부가적으로 상기 화합물을 상기 시스테인 잔기(들)에 연결시키기 전에 환원 또는 그렇지 않으면 상기 이황화 결합을 깨뜨리는(breaking) 것을 포함한다. 바람직하게, 상기 이황화 결합을 환원시키는 것 또는 그렇지 않으면 깨뜨리는 것은 상기 단백질 내에 자유 티올 그룹을 생산하며 상기 화합물은 티올 반응성 그룹을 포함한다. 상기 티올 반응성 그룹과 상기 화합물의 반응에 의해 상기 접합체가 제조된다.
일 실시예에서, 상기 화합물은 말레이미드(maleimide)를 사용하여 단백질에 접합된다. 예로서, 상기 단백질은 말레이미드 기능성 그룹을 포함하는 화합물에 접촉되어 접합이 일어난다.
본 발명의 추가적인 실시예에서, 상기 단백질은 부가적으로 적어도 하나의 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하고, 상기 방법은 부가적으로 상기 세린 또는 트레오닌 잔기에 화합물을 접합시키는 것을 포함한다. 바람직하게, 상기 세린 또는 트레오닌 잔기에 접합되는 화합물은 상기 시스테인 잔기(들)에 접합되는 화합물과 다르다.
본 발명은 본 발명의 단백질을 포함하는 접합체를 제조하기 위한 대안적인 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) N-말단 트레오닌 또는 세린 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 획득하는 것; 및
(ii) 그에 의해 상기 접합체를 제조하기 위해 상기 단백질의 상기 N-말단에서의 트레오닌 또는 세린 잔기의 적어도 하나에 화합물을 접합시키는 것.
선택적으로, 접합체를 제조하기 위한 본 발명의 방법은 부가적으로 상기 접합체를 분리하는 것 및/또는 상기 접합체를 약제학적 조성물로 조제하는 것을 포함한다.
숙련된 기술자에게 있어 상술한 것을 바탕으로, 본 발명자들이 병든 세포, 조직 또는 기관(예를들어 암)으로의 독소 화합물 또는 방사성 동위원소의 전달 및/또는 체내 이미징 및/또는 단백질의 안정성 증가를 위한 것을 포함하는 다양한 응용에 유용한 시약(reagents)을 제조하여 왔다는 점은 분명할 것이다.
이에 따라, 본 발명은 또한 약제(medicine)에서의 본 발명의 단백질 또는 조성물의 용도를 제공한다. 예로서, 본 발명은 질환(condition)를 치료 또는 예방하기 위한 약의 제조에서의 본 발명의 단백질의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 피험자 내의 질환을 치료 또는 예방하는 방법, 그것의 요구에 의해 피험자에 대해 본 발명의 단백질 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 예시적 질환은 본원에 개시되며 필요한 변경을 가하여 본 발명의 본 실시예에 적용되는 것으로 여겨진다. 나아가 본 발명 단백질의 예시적인 접합된 형태는 본원에 개시되며 필요한 변경을 가하여 본 발명의 본 실시예에 적용되는 것으로 여겨진다.
본 발명은 부가적으로 세포에 화합물을 전달하기 위한 방법으로, 상기 화합물 또는 그것을 포함하는 조성물에 접합된 본 발명의 단백질과 상기 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일 실시예로서, 상기 세포는 피험자에 상기 단백질 또는 조성물을 투여함으로써 접촉된다.
본 발명은 또한 피험자 내에서 항원을 찾아내고(localizing) 검출하는 방법과 같은 이미징 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) 피험자에 본 발명의 단백질을, 일정 시간 동안 및 상기 단백질이 항원에 결합하기에 충분한 조건 하에서 투여하는 것으로, 상기 단백질은 검출 가능한 표지에 접합된 것임; 및
(ii) 체내에서 상기 검출 가능한 표지를 찾아내고 검출하는 것
숙련된 기술자는 상술한 방법이 세포, 종양과 같은 세포의 그룹, 조직 및 기관 또는 항원을 발현하는 그들의 일부를 찾아내고 검출해 내는데 유용하다는 것을 인식할 것이다. 예시적인 항원은 본 명세서를 통하여 기재되며 필요한 변경을 가하여 본 발명의 본 실시예에 적용되는 것으로 여겨진다.
본 발명은 또한 피험자 내 질환을 진단하고 예후하기(prognosing) 위한 방법, 상기 피험자로부터의 샘플과 본 발명의 단백질 또는 조성물을 일정 시간 동안 및 상기 단백질이 항원에 결합하여 복합체를 형성하기에 충분한 조건 하에서 접촉시키고 상기 복합체를 검출하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 상기 복합체의 검출은 상기 질환에 대해 진단적 또는 예후적이다. 바람직하게, 상기 단백질은 검출 가능한 표지에 접합되고 상기 표지의 검출은 상기 복합체를 표시한다.
일 실시예에서, 상기 방법은 상기 복합체의 수준을 결정하는 방법을 포함하며, 대조 샘플과 비교하여 상기 복합체의 향상된 또는 감소된 수준은 상기 질환에 대해 진단적 또는 예후적이다.
본 발명은 부가적으로 본 발명의 복수 개의 단백질을 포함하는 라이브러리(library)를 제공한다. 일 실시예로서, 상기 단백질은 파티클(예를들면, 파지 또는 리보솜) 또는 세포의 표면 상에서 보여진다. 분명하게도, 본 발명은 또한 본 발명의 복수 개의 단백질을 포함하는 상기 라이브러리를 인코딩하는 핵산의 라이브러리를 제공한다.
본 발명은 부가적으로 본 발명의 단백질을 분리하는 방법, 본 발명의 라이브러리를 일정 시간 동안 및 단백질이 항원에 결합하기에(또는 그 결과로서 결합하도록) 충분한 조건 하에 항원과 접촉시키고 상기 단백질을 분리하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 부가적으로 본 발명의 복수 개의 단백질을 포함하는 라이브러리를 제조하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) 면역 글로불린 가변 영역을 포함하는 복수 개의 단백질을 인코딩하는 핵산을 획득 또는 제조하는 것으로, 상기 가변 영역은 골격 영역 (FR) 1 내에 위치하는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들 및/또는 N-말단 트레오닌 또는 세린 잔기를 포함하는 것;
(ii) 하기의 조작적으로 연결된 핵산을 포함하는 발현 구조의 라이브러리를 제조하는 것:
(a) 프로모터;
(b) (i)에서 획득 또는 제조된 핵산; 및
(c) 세포 또는 파티클 내/상(in/on)에서의 단백질을 포함하는 상기 가변 영역의 보여짐(display)을 촉진하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산; 및
(iii) 세포 또는 파티클 내/상(in/on)에서 보여지도록 발현 구조에 의해 인코딩된 단백질을 발현하는 것.
상기 시스테인 잔기들 및/또는 트레오닌 또는 세린 잔기를 위치시키기 위한 적합한 사이트는 본원에 개시되며 필요한 변경을 가하여 본 발명의 본 실시예에 적용되는 것으로 여겨진다.
일 실시예에서, 상기 단백질의 CDRs 내의 아미노산은 랜덤 또는 세미 랜덤하거나 인간 항체로부터 유도된다.
일 실시예에서, 상기 방법은 부가적으로 상기 단백질을 인코딩하는 핵산을 분리하는 것을 포함한다. 그러한 핵산은 발현 구조 속으로 도입될 수 있다. 선택적으로, 상기 단백질은 발현될 수 있다.
본 발명자들은 또한 종양 항원 TAG72에 특이적으로 결합 가능한 면역 글로불린 가변 영역을 포함하는 단백질을 제조하였다. 본 발명자들은 이러한 단백질이 체내에서 안정하다는 것을 발견하였다.
이에 따라, 본 발명은 부가적으로 각각 VH 및 VL이 서로 연결되도록 허용하기에 불충분한 수의 아미노산을 포함하는 영역에 의해 연결된 면역 글로불린 VH 및 면역 글로불린 VL을 포함하는 복수 개의 폴리펩티드를 포함하는 분리된 단백질을 제공하며, 여기서:
(i) 상기 폴리펩티드들 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 111에 나열된 서열 또는 그것에 적어도 약 60% 동일한 서열을 포함하는 VH를 포함하며; 및
(ii) 상기 폴리펩티드들 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 113에 나열된 서열 또는 그것에 적어도 약 60% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
이때 (i)에서의 상기 폴리펩티드의 VH 및 (ii)에서의 상기 폴리펩티드의 VL 는 서로 연결되어 종양 항원 TAG72에 특이적으로 결합 가능한 Fv를 형성한다. 본원에 개시된 내용에서, 이러한 단백질은 항-TAG72 단백질로 참조된다. 그러나, 여기서 "본 발명의 단백질"에 관련하여 어떠한 기재도, 그 내용이 다른 것을 가르키는 것이 아닌 한, 이러한 단백질로 동등하게 적용된다.
일 실시예에서, 상기 항-TAG72 단백질은 6개 또는 소수의 아미노산, 예로서 5개 또는 그 미만의 아미노산, 4개 또는 그 미만의 아미노산과 같은, 예를들면 3개 또는 그 미만의 아미노산, 2개 또는 그 미만의 아미노산과 같은, 예로서 1개 또는 0개 아미노산을 갖는 VH 및 VL을 연결하는 영역을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항-TAG72 단백질은 Kabat 넘버링 시스템에 의해 번호 매겨진 위치 5에서의 트레오닌 및/또는 Kabat 넘버링 시스템에 의한 위치 53에서의 트레오닌 및/또는 Kabat 넘버링 시스템에 의해 번호 매겨진 위치 79에서의 글루탐 산(glutamic acid)을 포함하는 VL을 포함한다.
대안적 또는 부가적인 실시예에서, 본 발명의 항-TAG72 단백질은 Kabat 넘버링 시스템에 의해 번호 매겨진 위치 80에서의 류신을 포함하는 VH를 포함한다.
일 실시예에서, 항-TAG72 단백질은 적어도 두 개의 폴리펩티드들을 포함하며, 각각은 하기를 포함한다:
(i) SEQ ID NO:111에 나열된 서열 또는 그것에 적어도 약 60% 동일한 서열을 포함하는 VH; 및
(ii) SEQ ID NO:113에 나열된 서열 또는 그것에 적어도 약 60% 동일한 서열을 포함하는 VL,
여기서 하나의 폴리펩티드의 VH 및 다른 폴리펩티드의 VL은 연결되어 TAG72에 특이적으로 결합 가능한 Fv를 형성한다.
예시적인 항-TAG72은 이원 항체(diabody); 삼원 항체(triabody) 또는 사원 항체(tetrabody)이다.
본 발명의 일 실시예에서:
(i) 적어도 하나의 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:111에 나열된 서열을 포함하는 VH의 상보적 결정 영역(complementarity determining region (CDRs))을 포함하는 VH를 포함하며; 및
(ii) 적어도 하나의 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:113에 나열된 서열을 포함하는 VL의 CDRs를 포함하는 VL을 포함한다.
예시적 CDRs는 하기와 같다:
(i) CDRH1은 SEQ ID NO:111의 아미노산들 31 내지 35에 나열된 서열을 포함한다;
(ii) CDRH2는 SEQ ID NO:111의 아미노산들 50 내지 66에 나열된 서열을 포함한다;
(iii) CDRH3는 SEQ ID NO:111의 아미노산들 99 내지 104에 나열된 서열을 포함한다;
(iv) CDRL1은 SEQ ID NO:113의 아미노산들 24 내지 40에 나열된 서열을 포함한다;
(v) CDRL2는 SEQ ID NO:113의 아미노산들 56 내지 62에 나열된 서열을 포함한다; 및
(vi) CDRL3는 SEQ ID NO:113의 아미노산들 95 내지 103에 나열된 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항-TAG72 단백질은 적어도 두 개의 폴리펩티드를 포함하며, 그 두 개는 하기를 포함한다:
(i) SEQ ID NO:111에 나열된 서열을 포함하는 VH 또는 그것의 인간화된 또는 비면역화된 형태; 및
(ii) SEQ ID NO:113에 나열된 서열을 포함하는 VL 또는 그것의 인간화된 또는 비면역화된 형태.
본 발명의 실시예는 각각이 SEQ ID NO: 55, 115 또는 117에 나열된 서열을 포함하는 적어도 두 개의 폴리펩티드를 포함하는 항-TAG72 단백질을 제공한다.
일 실시예에서 상기 항-TAG72 단백질 내의 폴리펩티드들 중 적어도 하나는 본원에서 상기 기재된 바와 같이 골격 영역 (FR) 1 내에 위치하는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함한다. 예시적인 서열은 상술한 바이다. 예로서, 상기 서열은 SEQ ID NOs: 57, 63, 75, 77, 99, 103, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 또는 133의 어느 하나 이상에 나열된 서열과 적어도 약 80% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 또는 100% 동일하며, 상기 시스테인 잔기들을 포함한다. 바람직하게, 상기 서열은 SEQ ID NO: 57에 나열된 서열과 적어도 약 80% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 또는 100% 동일하며, 상기 시스테인 잔기들을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 단백질은 단일의 폴리펩티드를 포함하며 SEQ ID NO: 101에 나열된 서열과 적어도 약 80% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항-TAG72 단백질은 그에 접합된 화합물을 포함한다. 예로서, 상기 화합물은 상기 단백질 내의 폴리펩티드들 중 적어도 하나에서 시스테인 잔기 또는 세린 잔기 또는 라이신 잔기에 접합된다.
일 실시예로서, 상기 항-TAG72 단백질 내의 적어도 하나의 폴리펩티드는 FR1 내에 위치하는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하며, 이때 적어도 두 개의 시스테인 잔기들이 화합물에 접합되지 않으면, 이황화 결합이 상기 시스테인 잔기들 및/또는 N-말단 세린 및/또는 트레오닌 잔기 사이에 형성될 수 있고, 이때 상기 화합물은 상기 시스테인 잔기들의 적어도 하나 및/또는 상기 세린 잔기에 접합된다. 예로서, 상기 폴리펩티드는 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린 및/또는 트레오닌 잔기를 포함하며, 이때 상기 화합물은 상기 시스테인 잔기들의 적어도 하나에 접합되고, 다른 화합물이 상기 세린 잔기에 접합된다.
예시적 화합물은 방사성 동위원소, 검출 가능한 표지, 치료적 화합물, 콜로이드, 독성, 핵산, 펩타이드, 단백질, 피험자 내에서 그 단백질의 반감기를 증가시키는 화합물 및 이들의 혼합물로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명자들는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 본 발명의 단백질로의 접합이 실질적으로 그것의 안정성 및 종양 섭취를 증가시킨다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 작은 분자량을 갖는 단분산된 PEGs 및/또는 PEG가 실질적으로 더 높은 분자량의 PEG와 동일한 수준으로 안정성 및/또는 종양 섭취를 증가시킨다는 사실을 발견하였다. 이는 더 큰 분자가 일반적으로 더 작은 분자보다 느리게 피험자로부터 제거되므로 직관에 반대되는 것처럼 보인다. 더 큰 PEGs는 일반적으로 다양한 분자량의 분자들의 혼합물을 포함하므로, 더 작은 및/또는 단분산된 PEGs의 사용은 그것이 그 분자 수준에서와 유사한 단백질 접합체의 제조를 촉진한다는 점에서 장점을 제공한다. 그러한 접합체들은 체내 적용을 위해 바람직하다.
따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 항-TAG72 단백질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된다. 예로서, 상기 PEG는 단분산된 PEG이다.
일 실시예에서, 상기 PEG는 약 4000 Da를 초과하지 않는 분자량, 예를들어 약 2000 Da를 초과하지 않는 분자량, 약 1500 Da를 초과하지 않는 것과 같은 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, 상기 PEG는 1000 Da를 초과하지 않는 분자량, 900 Da를 초과하지 않는 것과 같은, 예로서 800 Da를 초과하지 않는, 600 Da를 초과하지 않는 것과 같은 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, 상기 PEG는 약 550 Da 내지 약 1000 Da의 분자량을 갖는다.
다른 실시예에서, 상기 PEG는 약 70 또는 75 또는 77을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 50을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 바람직하게, 상기 PEG는 48을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 40을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 30을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 27을 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 24를 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 15를 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 예로서, 상기 PEG는 약 12를 초과하지 않는 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 바람직하게, 상기 PEG는 약 12 내지 27의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 PEG는 예를들어 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라 아세트산(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA))과 같은, 거대 고리 킬레이팅제의 킬레이팅제와 같은 부가적인 화합물에 접합된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-TAG72 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 제공한다.
본 발명은 부가적으로 본 발명의 항-TAG72 단백질 내의 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 발명은 나아가 본 발명의 항-TAG72 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구조 또는 그로부터의 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 부가적으로 본 발명의 항-TAG72 단백질을 발현하는 분리된 세포를 제공한다. 예로서, 상기 세포는 본 발명의 항-TAG72 단백질을 인코딩하는 핵산 및 그로부터의 폴리펩티드 및/또는 그것을 포함하는 발현 구조를 포함한다.
본 발명은 부가적으로 본 발명의 항-TAG72 단백질을 제조하기 위한 방법으로, 이를 인코딩하는 발현 구조를 유지하여 인코딩된 폴리펩티드 및 상기 단백질이 제조되도록 하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
예로서, 상기 방법은 상기 단백질에 대해 인코딩된 것이 제조되기에 충분한 조건하에서 세포를 배양시키는 것을 포함한다.
일 실시예로서, 상기 방법은 부가적으로 상기 단백질을 분리하는 것을 포함한다.
본 발명은 부가적으로 적어도 하나의 시스테인 잔기에 접합된 화합물을 포함하는 본 발명의 항-TAG72 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) FR 1 내의 시스테인 잔기들을 포함하는 본 발명의 항-TAG72 단백질을 획득하는 것; 및
(ii) 그에 의해 상기 단백질을 제조하기 위해 상기 폴리펩티드(들)의 FR1 내의 상기 시스테인 잔기들 중 적어도 하나에 화합물을 접합시키는 것.
일 실시예에서, (i)에서 얻어진 단백질 내의 폴리펩티드(들) 내의 시스테인 잔기들은 이황화 결합에 의해 연결되고 상기 방법은 부가적으로 상기 화합물을 상기 시스테인 잔기(들)에 연결시키기 전에 상기 이황화 결합을 환원 또는 그렇지 않으면 깨뜨리는 것을 포함한다. 예로서, 상기 이황화 결합을 환원시키는 것 또는 그렇지 않으면 깨뜨리는 것은 상기 단백질 내에 자유 티올 그룹을 생산하며 상기 화합물은 상기 화합물의 상기 단백질에의 접합을 허용하는 티올 반응성 그룹을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 단백질 내의 적어도 하나의 폴리펩티드는 적어도 하나의 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하며 상기 방법은 부가적으로 화합물을 상기 세린 또는 트레오닌 잔기에 접합시키는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기에 접합된 화합물을 포함하는 본 발명의 항-TAG72 단백질을 제조하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) N-말단 트레오닌 및/또는 세린 잔기를 포함하는 본 발명의 항-TAG72 단백질을 획득하는 것; 및
(ii) 그에 의해 상기 단백질을 제조하기 위해 상기 폴리펩티드의 N-말단에서의 트레오닌 또는 세린 잔기의 적어도 하나에 화합물을 접합하는 것.
일 실시예에서, 화합물에 접합된 단백질을 제조하는 방법은 PEG에 상기 단백질을 접합시키는 것을 포함한다.
본 발명은 부가적으로 피험자 내에서 암을 찾아내고 및/또는 검출해 내고 및/또는 진단하고 및/또는 예후하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) 본 발명의 항-TAG72 단백질 또는 그 동일물을 포함하는 조성물을 그것이 만약 존재한다면 종양 항원 TAG72에 결합하도록 피험자에 투여하고; 및
(ii) 체내에서 상기 TAG72에 결합된 단백질을 검출하는 것, 이때 상기 결합된 단백질의 검출은 상기 암을 찾아내고 및/또는 검출하고 및/또는 진단하고 및/또는 예후한다.
본 발명은 부가적으로 피험자 내에서 암을 진단하거나 예후하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) 피험자로부터의 샘플을 본 발명의 항-TAG72 단백질 또는 그 동일물을 포함하는 조성물과 그것이 만약 존재한다면 종양 항원 TAG72에 결합하도록 접촉시키는 것; 및
(ii) 상기 TAG72에 결합된 단백질을 검출하는 것, 이때 상기 결합된 단백질의 검출은 상기 암에 대해 진단적 또는 예후적이다.
상기 두 실시예들 중 어느 하나의 실시예에서, 상기 단백질은 검출 가능한 표지에 접합되고 상기 방법은 TAG72에 결합된 단백질을 검출하도록 상기 표지를 검출하는 것을 포함한다.
본 발명은 부가적으로 암을 치료하는 방법으로, 본 발명의 항-TAG72 단백질 또는 그 동일물을 포함하는 조성물을 투여하여 그것이 암 세포 상의 종양 항원 TAG72에 결합하여 상기 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 단백질 또는 그 접합된 화합물은 암 세포의 죽음을 유도한다.
일 실시예에서, 상기 단백질은 암 세포의 죽음을 유도하는 화합물에 접합된다.
도 1은 in silico 상동(homology) 모델화된, 비돌연변이화된 AVP04-07 이원 항체(diabody)(SEQ ID NO:57에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)를 보여주는 도식적 표현이다. 골격 잔기들은 회색으로 보여지고, CDR 잔기들은 검은색으로 보여지며, 돌연변이화를 위한 것으로 확인되는 잠재적 이황화 삽입 잔기들은 흰색으로 보여진다. 화살표는 Kabat 넘버링에 의한 Fvs 중 하나 내의 잔기들을 표시한다.
도 2는 in silico 상동(homology) 모델화된, 비돌연변이화된 AVP07-17 이원 항체(diabody)(SEQ ID NO:59에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)를 보여주는 도식적 표현이다. 골격 잔기들은 회색으로 보여지고, CDR 잔기들은 검은색으로 보여지며, 돌연변이화를 위한 것으로 확인되는 잠재적 이황화 삽입 잔기들은 흰색으로 보여진다. 화살표는 Kabat 넘버링에 의한 Fvs 중 하나 내의 잔기들을 표시한다.
도 3은 in silico 상동(homology) 모델화된, 비돌연변이화된 AVP02-60 이원 항체(diabody)(SEQ ID NO:61에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)를 보여주는 도식적 표현이다. 골격 잔기들은 회색으로 보여지고, CDR 잔기들은 검은색으로 보여지며, 돌연변이화를 위한 것으로 확인되는 잠재적 이황화 삽입 잔기들은 흰색으로 보여진다. 화살표는 Kabat 넘버링에 의한 Fvs 중 하나 내의 잔기들을 표시한다.
도 4a는 in silico 상동(homology) 모델화된, AVP04-07 이원 항체(diabody)(SEQ ID NO:57에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 VH 및 VL 내에서의 골격 1 내부의(intra-Framework 1) 이황화 삽입 돌연변이를 보여주는 도식적 표현이다. 중쇄는 검은색으로 표시되고, 경쇄는 회색으로 표시되며, in silico 돌연변이화된 이황화 삽입 돌연변이 측쇄들은 볼 및 스틱으로 표시된다. 좌측: 비돌연변이화된 및 두 개의 이황화 삽입 돌연변이로 발생된 이원 항체(diabody) 모델로부터 정렬된 Fvs. 중앙: 좌측으로부터 단지 FR1을 보여 줌. 우측: 중앙으로부터 수평축 상에서 100°회전된 것임.
도 4b는 in silico 상동(homology) 모델화된, AVP04-07 이원 항체(diabody)(SEQ ID NO:57에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 VH 및 VL 내에서의 골격 1 내부의(intra-Framework 1) 이황화 삽입 돌연변이를 보여주는 도식적 표현이다. 도시된 것은 표시된 바와 같이 다양한 돌연변이를 포함하는 FR1의 모델이다. H=중쇄. L=경쇄. 숫자들은 시스테인 잔기들(만약 존재한다면)의 위치를 표시한다. 비돌연변이화된 FR1 H/비돌연변이화된 FR1 L=AVP04-07, H7-H10=AVP04-84, L8-L11=AVP04-50, H13-H16=AVP04-85, L14-L17=AVP04-78.
도 5는 AVP04-xx 아비바디들(Avibodies)의 CDR 그룹(CDRs) 및 이황화물에 대한 잔기 당 평균 용매 접근성 표면 영역(accessible surface area (ASA))의 그래프이다. VH 유도된 컬럼은 회색으로 보여지고, VL 유도된 컬럼은 흰색으로 보여진다. CDR 그룹 내 잔기들, 보존된 내부 시트 이황화물 잔기들(H22-H92 및 L23-L88) 및 이황화 삽입 돌연변이 잔기들에 대한 평균 잔기 당 ASA로 보여지고, 에러 바는 표준편차를 보여준다. H=중쇄. L=경쇄. 숫자들은 시스테인 잔기들(만약 존재한다면)의 위치를 표시한다, H7-H10=AVP04-84, L8-L11=AVP04-50, H13-H16=AVP04-85, L14-L17=AVP04-78.
도 6a는 in silico 상동(homology) 모델화된, AVP02-60 이원 항체(diabody)(SEQ ID NO:61에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 VH 및 VL 내에서의 골격 1 내부의(intra-Framework 1) 이황화 삽입 돌연변이를 보여주는 도식적 표현이다. 중쇄는 검은색으로 표시되고, 경쇄는 회색으로 표시되며, in silico 돌연변이화된 이황화 삽입 돌연변이 측쇄들은 볼 및 스틱으로 표시된다. 좌측: 비돌연변이화된 및 두 개의 이황화 삽입 돌연변이로 발생된 이원 항체(diabody) 모델로부터 정렬된 Fvs. 중앙: 좌측으로부터 단지 FR1을 보여 줌. 우측: 중앙으로부터 수평축 상에서 100°회전된 것임.
도 6b는 in silico 상동(homology) 모델화된, AVP02-60 이원 항체(diabody)(SEQ ID NO:61에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 VH 및 VL 내에서의 골격 1 내부의(intra-Framework 1) 이황화 삽입 돌연변이를 보여주는 도식적 표현이다. 도시된 것은 표시된 바와 같이 다양한 돌연변이를 포함하는 FR1의 모델이다. H=중쇄. L=경쇄. 숫자들은 시스테인 잔기들(만약 존재한다면)의 위치를 표시한다. 비돌연변이화된 FR1 H/비돌연변이화된 FR1 L=AVP02-60, H7-H10=AVP02-104, L8-L11=AVP02-101, H13-H16=AVP02-105, L14-L17=AVP02-102.
도 7a는 in silico 상동(homology) 모델화된, AVP07-17 이원 항체(diabody)(SEQ ID NO:59에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 VH 및 VL 내에서의 골격 1 내부의(intra-Framework 1) 이황화 삽입 돌연변이를 보여주는 도식적 표현이다. 중쇄는 검은색으로 표시되고, 경쇄는 회색으로 표시되며, in silico 돌연변이화된 이황화 삽입 돌연변이 측쇄들은 볼 및 스틱으로 표시된다. 좌측: 비돌연변이화된 및 두 개의 이황화 삽입 돌연변이로 발생된 이원 항체(diabody) 모델로부터 정렬된 Fvs. 중앙: 좌측으로부터 단지 FR1을 보여 줌. 우측: 중앙으로부터 수평축 상에서 100°회전된 것임.
도 7b는 in silico 상동(homology) 모델화된, AVP07-17 이원 항체(diabody)(SEQ ID NO:59에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 VH 및 VL 내에서의 골격 1 사이의(intra-Framework 1) 이황화 삽입 돌연변이를 보여주는 도식적 표현이다. 도시된 것은 표시된 바와 같이 다양한 돌연변이를 포함하는 FR1의 모델이다. H=중쇄. L=경쇄. 숫자들은 시스테인 잔기들(만약 존재한다면)의 위치를 표시한다. 비돌연변이화된 FR1 H/비돌연변이화된 FR1 L=AVP07-17, H7-H10=AVP07-90, L7-L11=AVP07-88, H13-H16=AVP07-91, L14-L17=AVP07-89.
도 8은 AVP02-xx 아비바디들(Avibodies)의 CDR 그룹 및 이황화물에 대한 평균 잔기 당 용매 ASAs의 그래프로서, VH 유도된 컬럼은 회색으로 보여지고, VL 유도된 컬럼은 흰색으로 보여진다. CDR 그룹 내 잔기들, 보존된 내부 시트 이황화물 잔기들 및 이황화 삽입 돌연변이 잔기들에 대한 평균 잔기 당 ASA로 보여지고, 에러 바는 표준편차를 보여준다. H=중쇄. L=경쇄. 숫자들은 시스테인 잔기들(만약 존재한다면)의 위치를 표시한다, H7-H10=AVP02-104, L8-L11=AVP02-101, H13-H16=AVP02-105, L14-L17=AVP02-102.
도 9는 AVP07-xx 아비바디들(Avibodies)의 CDR 그룹 및 이황화물에 대한 평균 잔기 당 용매 ASAs의 그래프로서, VH 유도된 컬럼은 회색으로 보여지고, VL 유도된 컬럼은 흰색으로 보여진다. CDR 그룹 내 잔기들, 보존된 내부 시트 이황화물 잔기들 및 이황화 삽입 돌연변이 잔기들에 대한 평균 잔기 당 ASA로 보여지고, 에러 바는 표준편차를 보여준다. H=중쇄. L=경쇄. 숫자들은 시스테인 잔기들(만약 존재한다면)의 위치를 표시한다, H7-H10=AVP07-90, L7-L11=AVP07-88, H13-H16=AVP07-91, L14-L17=AVP07-89.
도 10a는 AVP04-50(SEQ ID NO:57에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함) His-Tag 친화성 크로마토그래피 정제(His-Tag affinity chromatography purification)의 280nm 크로마토그래프를 보여주는 그래프적 도시이다. 화살표는 관심 대상의 용출(elution) 피크를 표시한다. 점선은 용출 버퍼의 비율을 나타낸다.
도 10b는 AVP04-50(SEQ ID NO:57에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 양이온 정제(cation purification)의 결과를 보여주는 그래프적 도시이다. 화살표는 관심 대상의 용출(elution) 피크를 표시한다. 점선은 용출 버퍼의 비율을 나타낸다.
도 10c는 AVP04-50(SEQ ID NO:57에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)의 결과를 보여주는 그래프적 도시이다. 화살표는 관심 대상의 용출(elution) 피크를 표시한다. 점선은 관심 대상의 분획물(fractions)을 윤곽화한 것이다.
도 10d는 AVP04-50(SEQ ID NO:57에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 정제 후 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)의 결과를 보여주는 그래프적 도시이다. 화살표는 관심 대상의 용출(elution) 피크를 표시한다.
도 10e는 AVP04-50(SEQ ID NO:57에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함) 정제 후의 순도를 보여주는 환원 SDS-PAGE 젤(reducing SDS-PAGE gel)의 결과를 보여주는 사진이다. Lane 1: 인비트로겐 벤치마크 예비 염색된(Invitrogen Benchmark Pre-stained) 분자량 마커, Lane 2: AVP04-50 단백질 밴드.
도 11a-c는 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 따른 본원에서 언급된 정제된 아비바디들(표시된 바와 같이, 명명법은 본문을 통하여 및 서열 목록 내에서 사용되는 것에 따른다)의 그래프적 도시를 포함한다.
도 12a-c는 본원에서 언급된 아비바디들(표시된 바와 같이, 명명법은 본문을 통하여 및 서열 목록 내에서 사용되는 것에 따른다)의 면역 반응성을 결정하기 위해 사용되는 컬럼 이동 에세이(column shift assay)의 그래프적 도시를 포함한다. 각 그래프는 두 개의 포개진 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 프로파일을 포함한다; 항원의 존재(실선) 및 부재(점선) 각각에서 배양된 아비바디의.
도 13a는 SDS-PAGE에 의한 비-PEG화된(unpegylated) 대조군("네이키드"(naked)) 아비바디에 대한 분자량의 증가를 나타내는 mal-PEG24-MeOH와의 아비바디 접합의 결과를 보여주는 사진적 표현을 포함한다. Lane 1 및 10: 벤치마크 예비 염색된(Benchmark pre-stained) 분자량 기준, Lane 2 및 3: 각각 네이키드(Naked) AVP07-71 및 AVP07-71-PEG24. Lane 4 및 5: 각각 네이키드(Naked) AVP07-88 및 AVP07-88-PEG24. Lane 6 및 7: 각각 네이키드(Naked) AVP02-101 및 AVP02-101-PEG24. Lane 8 및 9: 각각 네이키드(Naked) AVP04-50 및 AVP04-50-PEG24.
도 13b는 SDS-PAGE에 의한 비-PEG화된(unpegylated) 대조군("네이키드"(naked)) 아비바디에 대한 분자량의 증가를 나타내는 mal-PEG24-MeOH와의 아비바디 접합의 결과를 보여주는 사진적 표현을 포함한다. Lane 1: 벤치마크 예비 염색된(Benchmark pre-stained) 분자량 기준, Lane 2 및 3: 각각 네이키드(Naked) AVP04-70 및 AVP04-70-PEG24. Lane 4 및 5: 각각 네이키드(Naked) AVP04-84 및 AVP04-84-PEG24.
도 13c는 SDS-PAGE에 의한 mal-PEG24-MeOH와의 아비바디 접합의 결과를 보여주는 사진적 표현을 포함한다. Lane 1: 벤치마크 예비 염색된(Benchmark pre-stained) 분자량 기준, Lane 2: AVP04-74-PEG24 접합. Lane 3: AVP04-78-PEG24 접합.
도 14a는 접합에 따른 단백질 플러스 두 분자의 PEG24 부가에 비례하는 질량(30078.36 amu)을 보여주는 항-HER2 scFv AVP07-71 (SEQ ID NO: 105)의 원자량 단위(atomic mass unit (AMU))의 그래프적 도시이다.
도 14b는 단량체-쇄 당 접합에 따른 단백질 플러스 두 분자의 PEG24 부가에 비례하는 질량(28166.84 amu)을 보여주는 항-TAG72 AVP04-50 (SEQ ID NO: 57)의 AMU의 그래프적 도시이다.
도 14c는 단량체-쇄 당 접합에 따른 단백질 플러스 두 분자의 PEG24 부가에 비례하는 질량(29196.72 amu)을 보여주는 항-HER2 이원 항체(diabody) AVP07-88 (SEQ ID NO: 87)의 AMU의 그래프적 도시이다.
도 14d는 단량체-쇄 당 한 분자의 PEG24 접합된 (24749.05 amu)것을 보여주는 항-MUC1 이원 항체(diabody) AVP02-101 (SEQ ID NO: 79)의 AMU의 그래프적 도시이다.
도 15a-c는 본원에서 언급된 PEG화된 아비바디들(표시된 바와 같이, 명명법은 본문을 통하여 및 서열 목록 내에서 사용되는 것에 따른다)의 면역 반응성을 결정하기 위해 사용되는 컬럼 이동 에세이(column shift assay)의 그래프적 도시를 포함한다. 각 그래프는 두 개의 포개진 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 프로파일을 포함한다; 항원의 존재(실선) 및 부재(점선) 각각에서 아비바디-PEG 접합체의.
도 16은 유로퓸(europium)-접합된 AVP04-50 (SEQ ID NO: 57) 아비바디의 면역반응성을 결정하기 위해 사용되는 컬럼 이동 에세이(column shift assay)의 그래프적 도시를 포함한다. 각 도시는 두 개의 포개진 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 프로파일을 포함한다; 항원의 존재(실선) 및 부재(점선) 각각에서 아비바디-유로퓸europium) 접합체의.
도 17은 항원 포지티브 (LS174T, 실선) 및 네가티브 (SK-OV-3, 점선) 세포 계(cell lines) 상에서의 세포 결합 에세이(cell binding assay)에 의해 결정되는 바와 같은 유로퓸(europium) 접합된 AVP04-50 (SEQ ID NO: 57)의 면역 반응성의 그래프적 도시이다.
도 18a는 안정화된 LS-174T 제노그래프트 마우스(xenograft mice)에서 125I 및 111In-표지된 AVP04-07 (SEQ ID NO: 55에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)을 보여주는 그래프이다. 개방 화살=종양 섭취 커브, 폐쇄 화살=신장 섭취 커브, 고리 화살=혈액 세정 커브.
도 18b는 안정화된 LS-174T 제노그래프트 마우스(xenograft mice)에서 125I 및 111In-표지된 AVP04-50 (SEQ ID NO: 57에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)을 보여주는 그래프이다. 개방 화살=종양 섭취 커브, 폐쇄 화살=신장 섭취 커브, 고리 화살=혈액 세정 커브.
도 19는 안정화된 SKOV3 제노그래프트 마우스(xenograft mice)에서 125I 표지된 AVP07-17 (SEQ ID NO: 59에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함) 및 AVP07-63 (SEQ ID NO: 65에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)을 보여주는 그래프이다. 어두운 회색 바(bars)=AVP07-63, 개방형 바(bars)=AVP07-17.
도 20은 안정화된 LS-174T 제노그래프트 마우스(xenograft mice)에서 Panel A: 랜덤 표면 라이신에 대해 PEG3400과 접합된 111In-표지된 AVP04-07 (SEQ ID NO: 55에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함) 및 Panel B: 조작된(engineered) 골격 1 내부의(intra-Framework 1) 이황화 돌연변이에 대해 접합된 사이즈-단분산된 PEG48 과 접합된 111In-표지된 AVP04-50 (SEQ ID NO: 57에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)를 보여주는 그래프이다. 개방 화살=종양 섭취 커브, 폐쇄 화살=신장 섭취 커브, 고리 화살=혈액 세정 커브.
도 21a 및 b는 안정화된 LS-174T 제노그래프트 마우스(xenograft mice)에서 64Cu-표지된, 비-peg화된 AVP04-07 (SEQ ID NO: 55에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함) 랜덤 표면 라이신에 대해 사이즈-단분산된 PEG27 과 접합된 AVP04-07 및 조작된 골격 1 내부의(intra-Framework 1) 이황화 돌연변이에 대해 접합된 사이즈-단분산된 PEG48 과 접합된 AVP04-50 (SEQ ID NO: 57에 나열된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함함)의 PET 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)를 보여주는 그래프적 도시이다. 위 방향 화살표=종양의 위치, 아래 방향 화살표=신장의 위치.
도 22a는 LS-174T 제노그래프트(xenograft)를 포함하는 누드 마우스에서 111In-표지된 비변형(intact) AVP04-07 이원 항체(diabody)의 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)를 보여주는 그래프적 도시이다. 개방 화살=종양 섭취 커브, 폐쇄 화살=신장 섭취 커브, 고리 화살=혈액 세정 커브.
도 22b는 LS-174T 제노그래프트(xenograft)를 포함하는 누드 마우스에서 125I-표지된 비변형(intact) AVP04-07 이원 항체(diabody)의 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)을 보여주는 그래프적 도시이다. 개방 화살=종양 섭취 커브, 폐쇄 화살=신장 섭취 커브, 고리 화살=혈액 세정 커브.
도 22c는 LS-174T 제노그래프트(xenograft)를 포함하는 누드 마우스에서 PEG3400에 접합된 111In-표지된 AVP04-07 이원 항체(diabody)의 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)을 보여주는 그래프적 도시이다. 개방 화살=종양 섭취 커브, 폐쇄 화살=신장 섭취 커브, 고리 화살=혈액 세정 커브.
도 23a는 1, 비변형 AVP04-07 이원 항체(diabody); 2, AVP04-07-PEG27 접합체; 3, AVP04-07-PEG12 접합체 (20:1 비율); 4, AVP04-07-PEG12 접합체 (50:1 비율); 5, AVP04-07-PEG3400 접합체의 등전위 포커싱(isoelectric focusing)의 결과를 보여주는 사진적 표현이다.
도 23b는 비변형 AVP04-07 이원 항체(diabody); 2, AVP04-07-PEG27 접합체; 3, AVP04-07-PEG12 접합체 (20:1 비율); 4, AVP04-07-PEG12 접합체 (50:1 비율); 5, AVP04-07-PEG3400 접합체의 SDS 겔 전기영동법(gel electrophoresis)의 결과를 보여주는 사진의 복사이다.
도 24는 111In-방사성 표지된 비변형 AVP04-07 이원 항체(diabody) 및 PEG 접합체(임의의 단위로 보여지는 방사성 활성)의 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)의 결과를 보여주는 그래프적 도시이다. 우측으로부터 좌측으로의 피크: 표지된 no.1: DOTA-비변형 이원 항체(diabody), no.2: DOTA-PEG12-Cys-VS-이원 항체(diabody) 접합체, no.3: DOTA-PEG27-Cys-VS-이원 항체(diabody) 접합체, no.4: DOTA-Cys-VS-PEG3400-이원 항체(diabody) 접합체.
도 25는 DOTA-PEG-Cys-VS 합성을 위한 공정(scheme)의 도식적 표현이다. FMOC-아미도-PEG-산은 표준 활성화 화학(standard activation chemistry)(DCC/HOBt)을 사용하여 왕(Wang) 레진 상에서의 S-t-부틸 시스테인에 접합되었다. 상기 FMOC는 피페리딘으로 제거되었고 표준 활성화 화학(DCC/HOBt)을 사용하여 DO3AtBuAc에 접합되었다. 생성물은 TFA로 상기 레진으로부터 제거되었고, 역상 HPLC(reverse phase HPLC)에 의해 정제되었고, DMF 내의 과량의 비닐 술폰과 반응되었고, 및 역상 HPLC에 의해 재정제되었다.
도 26a는 LS-174T 제노그래프트(xenograft)를 포함하는 누드 마우스에서 111In-표지된 PEG27 접합된 AVP04-07 이원 항체(diabody)의 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)을 보여주는 그래프적 도시이다.
도 26b는 LS-174T 제노그래프트(xenograft)를 포함하는 누드 마우스에서 125I-표지된 PEG27 접합된 AVP04-07 이원 항체(diabody)의 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)을 보여주는 그래프적 도시이다.
도 26c는 LS-174T 제노그래프트(xenograft)를 포함하는 누드 마우스에서 111In-표지된 PEG12 접합된 AVP04-07 이원 항체(diabody)의 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)을 보여주는 그래프적 도시이다.
도 26d는 LS-174T 제노그래프트(xenograft)를 포함하는 누드 마우스에서 125I-표지된 PEG12 접합된 AVP04-07 이원 항체(diabody)의 생물 분포(바이오디스트리뷰션, biodistribution)을 보여주는 그래프적 도시이다.
도 27a는 64Cu-표지된 비변형 AVP04-07 이원 항체(diabody)로 주입된 단일 마우스에 대한 이미징의, 주입 후 1h, 4h, 2h 및 46h에서의 시간 경과 PET 이미지를 보여주는 그래프적 도시이다.
도 27b는 64Cu-표지된 PEG27 AVP04-07 이원 항체(diabody)로 주입된 단일 마우스에 대한 이미징의 시간 경과 PET 이미지를 보여주는 그래프적 도시이다.
도 27c는 64Cu-표지된 PEG12 AVP04-07 이원 항체(diabody)로 주입된 단일 마우스에 대한 이미징의 시간 경과 PET 이미지를 보여주는 그래프적 도시이다.
서열 목록의 요지
SEQ ID NO: 1 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 2 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 3 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 4 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 5 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 6 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 7 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 8 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 9 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 10 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 11 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 12 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 13 - 인간 항체 중쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 14 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 15 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 16 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 17 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 18 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 19 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 20 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 21 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 22 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 23 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 24 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 25 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 26 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 27 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 28 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 29 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 30 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 31 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 32 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 33 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 34 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 35 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 36 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 36 - 인간 항체 κ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 37 - 인간 항체 λ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 38 - 인간 항체 λ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 39 - 인간 항체 λ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 40 - 인간 항체 λ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 41 - 인간 항체 λ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 42 - 인간 항체 λ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 43 - 인간 항체 λ경쇄의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 44 - 카메리드(camelid) 면역 글로불린의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 45 - 카메리드(camelid) 면역 글로불린의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 46 - 카메리드(camelid) 면역 글로불린의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 47 - 카메리드(camelid) 면역 글로불린의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 48 - 카메리드(camelid) 면역 글로불린의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 49 - 카메리드(camelid) 면역 글로불린의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 50 - 카메리드(camelid) 면역 글로불린의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 51 - 스피니 도그피쉬 상어(spiny dogfish shark) IgNAR의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 52 - 너스 상어(nurse shark) IgNAR의 FR1의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 53 - 연결자(linker)의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 54 - AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 55 - AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 56 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-50을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 57 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-50의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 58 - AVP07-17 항-Her2 이원 항체(diabody)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 59 - AVP07-17 항-Her2 이원 항체(diabody)의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 60 - AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 61 - AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody)의 아미노산 서열
SEQ ID NO: 62 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-84를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 63 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-84의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 64 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-Her2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-63를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 65 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-Her2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-63의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 66 - AVP04-07에서 N-말단 Gln 잔기를 Ser 잔기로 치환하기 위한 돌연변이 유발 프라이머의 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 67 - AVP04-07에서 N-말단 Gln 잔기를 Ser 잔기로 치환하기 위한 돌연변이 유발 프라이머의 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 68 - AVP04-07으로의 알라닌 잔기를 시스테인으로 대체하기 위한 돌연변이 유발 프라이머의 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 69 - AVP04-07으로의 알라닌 잔기를 시스테인으로 대체하기 위한 돌연변이 유발 프라이머의 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 70 - 인간 Her2의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 71 - 인간 PSMA의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 72 - 인간 MUC1의 등형상(isoform)의 아미노산 서열; 및
SEQ ID NO: 73 - 몇 가지 형태의 암에서 발현된 인간 MUC1의 등형상(isoform)의 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 74 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-85를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 75 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-85의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 76 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-78을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 77 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-78의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 78 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody) 지정된 AVP02-101을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 79 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody) 지정된 AVP02-101의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 80 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody) 지정된 AVP02-104를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 81 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody) 지정된 AVP02-104의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 82 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody) 지정된 AVP02-102를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 83 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody) 지정된 AVP02-102의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 84 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody) 지정된 AVP02-105를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 85 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody) 지정된 AVP02-105의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 86 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-88을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 87 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-88의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 88 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-90을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 89 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-90의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 90 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-89를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 91 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-89의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 92 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-91를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 93 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-91의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 94 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody) 지정된 AVP02-103을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 95 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP02-60 항-MUC1 이원 항체(diabody) 지정된 AVP02-103의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 96 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-68을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 97 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-68의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 98 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-51을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 99 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-51의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 100 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 scFv 지정된 AVP04-70을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 101 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 scFv 지정된 AVP04-70의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 102 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 삼원 항체(triabody) 지정된 AVP04-74을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 103 - FR1에서의 시스테인 잔기들 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 삼원 항체(triabody) 지정된 AVP04-74의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 104 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 scFv 지정된 AVP07-71을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 105 - FR1에서의 시스테인 잔기들, CDR3H에서의 시스테인 잔기들의 제거 및 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 scFv 지정된 AVP07-71의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 106 - AVP04-07 내 VL 쇄의 FR1 영역의 Kabat 위치 L8 및 L11에서의 시스테인 잔기들을 도입하기 위한 돌연변이 유발 프라이머의 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 107 - AVP04-07 내 VL 쇄의 FR1 영역의 Kabat 위치 L8 및 L11에서의 시스테인 잔기들을 도입하기 위한 돌연변이 유발 프라이머의 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 108 - CDR3H 시스테인 잔기들 Cys104 (Kabat 넘버링 H100) 및 Cys109 (H100E)을 알라닌들로 대체하고 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-86을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 109 - CDR3H 시스테인 잔기들 Cys104 (Kabat 넘버링 H100) 및 Cys109 (H100E)을 알라닌들로 대체하고 N-말단 세린을 포함하는 변형된 AVP07-17 항-HER2 이원 항체(diabody) 지정된 AVP07-86의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 110 - AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)의 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 111 - AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)의 VH의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 112 - AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)의 VL을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO:113 - AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)의 VL의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 114 - 연결자 서열이 결여된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)(지정된 AVP04-69)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 115 - 연결자 서열이 결여된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)(지정된 AVP04-69)의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 116 - 연결자 서열 및 VH 내 연결자에 대한 아미노산 N-말단이 결여된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)(지정된 AVP04-09)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 117 - 연결자 서열 및 VH 내 연결자에 대한 아미노산 N-말단이 결여된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)(지정된 AVP04-09)의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 118 - VL의 FR1 내에 시스테인 잔기들을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-50을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 119 - VL의 FR1 내에 시스테인 잔기들을 포함하는 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-50의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 120 - VL의 FR1 내에 시스테인 잔기들을 포함하고 연결자 서열이 결여된 변형된 AVP04-69 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-50을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 121 - VL의 FR1 내에 시스테인 잔기들을 포함하고 연결자 서열이 결여된 변형된 AVP04-69 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-50의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 122 - VL의 FR1 내에 시스테인 잔기들을 포함하고 연결자 서열 및 VH 내 연결자에 대한 아미노산 N-말단이 결여된 변형된 AVP04-69 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-50을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 123 - VL의 FR1 내에 시스테인 잔기들을 포함하고 연결자 서열 및 VH 내 연결자에 대한 아미노산 N-말단이 결여된 변형된 AVP04-69 항-TAG72 이원 항체(diabody) 지정된 AVP04-50의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 124 - VH 내 N-말단 세린 잔기를 가진 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 125 - VH 내 N-말단 세린 잔기를 가진 변형된 AVP04-07 항-TAG72 이원 항체(diabody)의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 126 - 연결자 서열이 결여되고 및 VH 내 N-말단 세린 잔기를 포함하는 변형된 AVP04-69 항-TAG72 이원 항체(diabody)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 127 - 연결자 서열이 결여되고 및 VH 내 N-말단 세린 잔기를 포함하는 변형된 AVP04-69 항-TAG72 이원 항체(diabody)의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 128 - 연결자 서열 및 VH 내 연결자에 대한 아미노산 N-말단이 결여되고 및 VH 내 N 말단 세린 잔기를 포함하는 변형된 AVP04-09 항-TAG72 이원 항체(diabody)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 129 - 연결자 서열 및 VH 내 연결자에 대한 아미노산 N-말단이 결여되고 및 VH 내 N 말단 세린 잔기를 포함하는 변형된 AVP04-09 항-TAG72 이원 항체(diabody)의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 130 - VL의 FR1 내 시스테인 잔기들 및 VH 내 N-말단 세린 잔기를 포함하고 연결자 서열이 결여된 변형된 AVP04-50 항-TAG72 이원 항체(diabody)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 131 - VL의 FR1 내 시스테인 잔기들 및 VH 내 N-말단 세린 잔기를 포함하고 연결자 서열이 결여된 변형된 AVP04-50 항-TAG72 이원 항체(diabody)의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 132 - VL의 FR1 내 시스테인 잔기들 및 VH 내 N-말단 세린 잔기를 포함하고 연결자 서열 및 VH 내 연결자에 대한 아미노산 N-말단이 결여된 변형된 AVP04-50 항-TAG72 이원 항체(diabody)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
SEQ ID NO: 133 - VL의 FR1 내 시스테인 잔기들 및 VH 내 N-말단 세린 잔기를 포함하고 연결자 서열 및 VH 내 연결자에 대한 아미노산 N-말단이 결여된 변형된 AVP04-50 항-TAG72 이원 항체(diabody)의 아미노산 서열;
SEQ ID NO: 134은 연결자의 아미노산 서열이다; 및
SEQ ID NO: 135은 연결자의 아미노산 서열이다.
일반
본 명세서를 통하여, 특별히 다르게 언급되거나 본 내용이 다르게 요구하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성물, 단계들의 그룹 또는 물질의 조성물들의 그룹에 대한 참조는 하나 및 복수(즉, 하나 이상)의 그러한 단계들, 물질의 조성물들, 단계들의 그룹 또는 물질의 조성물들의 그룹을 포함하는 것으로 여겨진다.
본 기술에서 숙련된 자들은 본원에 개시된 발명이 특별히 기재된 것 이상의 변화 및 변형들에 적용될 수 있다고 인식할 것이다. 본 발명은 그러한 모든 변화 및 변형들을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재 또는 참조된 모든 단계들, 구성들, 조성물들 및 화합물들을 개별적으로 또는 집합적으로, 및 어떠한 및 모든 조합들 또는 어떠한 둘 이상의 상기 단계들 또는 구성들을 포함한다.
본 발명은 본원에 개시된, 단지 예시의 목적으로 의도된 특별한 실시예들에 의해 범위에 있어 제한되는 것이 아니다. 기능적으로-동등한 생성물들, 조성물들 및 방법들은 본원에 개시된 바와 같이, 분명히 본 발명의 범위 내이다.
여기의 어떠한 실시예도, 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 필요한 변경을 가하여 어떤 다른 실시예에 적용되는 것으로 여겨진다.
특별히 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 기술 분야(예로서, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 생화학 및 상동 모델링에서)에서의 보통의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지는 것으로 여겨질 것이다.
다르게 기재되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기술은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있는 표준 공정이다. 그러한 기술들은 J. Perbal, 분자 클로닝에 대한 실용적 가이드(A Practical Guide to Molecular Cloning), John Wiley 및 Sons (1984), J. Sambrook 외. 분자 클로닝(Molecular Cloning): 실험실 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 실험실(Cold Spring Harbour Laboratory) 판 (1989), T.A. Brown (editor), 주요 분자 생물학 (Essential Molecular Biology): 실질적 접근, 볼륨 1 및 2, IRL Press (1991), D.M. Glover 및 B.D. Hames (editors), DNA 클로닝: 실질적 접근, 볼륨 1-4, IRL Press (1995 및 1996), 및 F.M. Ausubel 외. (editors), 분자 생물학에서의 현재 프로토콜(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Pub. Associates 및 Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 업데이트를 포함함), Ed Harlow 및 David Lane (editors) 항체(Antibodies): 실험실 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 실험실(Cold Spring Harbour Laboratory), (1988), 및 J.E. Coligan 외. (editors) 면역학에서의 현재 프로토콜(Current Protocols in Immunology), John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트를 포함함)와 같은 소스에서의 문서를 통해 기재 및 설명된다.
여기서의 가변 영역 및 그 부분, 면역 글로불린, 항체 및 그 단편들의 기재 및 정의는 예를들면, Kabat (1987 및/또는 1991), Bork 외 (1994) 및/또는 Chothia 및 Lesk (1987 및 1989) 또는 Al-Lazikani 외 (1997)에서의 논의에 의해 더욱 명확할 것이다.
용어 "및/또는", 예를들면 "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"의 어느 쪽을 의미하는 것으로 이해될 것이며, 양자의 의미 또는 어느 한 쪽의 의미를 위한 분명한 뒷받침을 제공하는 것으로 여겨진다.
여기서 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기의 위치를 정의하는 내용 중 용어 "사이(between)"는 두 개의 언급된 잔기들 및 두 개의 언급된 잔기들 사이에 위치된 어떤 잔기들을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예로서, 용어 "잔기들 8-11 사이"는 κVL 또는 VH의 내용 중 잔기들 8, 9, 10 및 11을 포함하는 것으로 이해될 것이며 및/또는 λVL 의 내용 중 용어 "잔기들 8-12 사이"는 λVL 는 Kabat 넘버링 시스템에서 잔기 10을 포함하지 않으므로 잔기들 8, 9, 11 및 12를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서를 통하여 단어 "포함한다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형들은 언급된 구성, 성분 또는 단계, 또는 구성들, 성분들 또는 단계들의 그룹의 포함, 그러나 어떤 다른 구성, 성분 또는 단계, 또는 구성들, 성분들 또는 단계들의 그룹에 대한 배제는 아닌 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
여기서 사용된 바와 같이 용어 "으로부터 유도된"은 특정 완전체가 특정한 소스로부터 그러나 상기 소스로부터 반드시 직접적이지는 않을지라도 얻어짐을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
선택된 정의들
여기서 사용된 바로서, 용어 "면역 글로불린"은 항체 또는 항체-관련의 단백질을 의하는 것으로 여겨질 것이다. 숙련된 기술자는 항체가 일반적으로 복수 개의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 가변 영역, 예를들면 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 단백질로 인식된다는 것을 알고 있을 것이다. 항체는 또한 일반적으로 고정 영역 또는 고정 단편 또는 결정화 가능한 단편(fragment crystallisable(Fc))으로 배열될 수 있는 고정 도메인들을 포함한다. 항체들은 하나 또는 수 개의 근접하게 연결된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일반적으로, 항체들은 그들의 기본 단위로서 네 개 쇄 구조를 포함한다. 완전한 길이의 항체들은 공유적으로 연결된 두 개의 중쇄들(~50-70 kD) 및 두 개의 경쇄들(각각 ~23 kD)을 포함한다. 경쇄는 일반적으로 가변 영역 및 고정 도메인을 포함하며 포유류에서는 κ경쇄 또는 λ경쇄의 어느 것이다. 중쇄는 일반적으로 가변 영역 및 부가적인 고정 도메인(들)에 힌지 영역(hinge region)에 의해 연결된 하나 또는 두 개의 고정 도메인(들)을 포함한다. 포유류의 중쇄들은 하기 타입들 α, δ, ε, γ또는 μ 중의 하나이다. 각 경쇄는 또한 중쇄들 중 하나에 공유적으로 연결된다. 예로서, 두 개의 중쇄 및 중쇄 및 경쇄들은 쇄간(inter-chain) 이황화 결합 및 비-공유적 인력에 의해 서로 홀드된다. 쇄간 이황화 결합의 수는 항체의 다른 형태에서 다를 수 있다. 각 쇄는 N-말단 가변 영역(각각이 ~110 아미노산 길이인 VH 또는 VL ) 및 C-말단에서의 하나 이상의 고정 도메인들을 갖는다. 상기 경쇄의 고정 도메인(~110 아미노산 길이인 CL)은 상기 중쇄의 제1 고정 도메인(~330-400 아미노산 길이인 CH)과 정렬되거나 이황화 결합된다. 상기 경쇄 가변 영역은 상기 중쇄 가변 영역과 정렬된다. 항체 중쇄는 2 이상의 부가적인 CH 도메인(CH2, CH3 등과 같은)을 포함할 수 있고 CH1, Cm 고정 도메인들 사이에서 확인될 수 있는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 항체들은 어떤 타입(예를들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예를들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 바람직하게, 상기 항체는 뮤린(마우스 또는 쥐) 항체 또는 영장류(바람직하게 인간) 항체이다. 용어 "항체"는 또한 인간화된 항체들, 영장류화된 항체들, 인간 항체들 및 키메릭 항체들을 망라한다. 항체에 연관된 단백질, 및 그에 따라 용어 "면역 글로불린"에 의해 망라되는 것은 도메인 항체들, 카메리드 항체들 및 카르틸라지너스 피쉬(cartilaginous fish)(즉, 면역 글로불린 신규 항원 수용체(IgNARs))로부터의 항체들을 포함한다. 일반적으로 카메리드 항체들 및 IgNARs는 VH를 포함하지만, 반면 VL은 결여되어 있으며 종종 중쇄 면역 글로불린들로서 참조된다. 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "면역 글로불린"은 T 세포 수용체들 및 예를들면 가변 영역을 포함하는 항원 결합 사이트를 통해 항원에 결합될 수 없는 단백질들을 포함하는 다른 면역 글로불린-유사 도메인은 포함하지 않는다. 나아가, 상기 용어 "면역 글로불린"은 FR1을 포함하지 않는 면역 글로불린 도메인을 포함하는 단백질, 본 발명은 그러한 단백질로는 수행될 수 없으므로, 은 포함하지 않는다.
여기서 사용된 것으로서, "가변 영역"은 CDRs; 즉, CDRl, CDR2, 및 CDR3, 및 FRs의 아미노산 서열을 포함하는, 본원에서 정의된 바로서 항체 또는 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄의 부분들(portions)으로 참조된다. IgNARs의 경우에 용어 "가변 영역"은 CDR2의 존재를 요구하지 않는다. VH는 중쇄의 가변 영역으로 참조된다. VL은 경쇄의 가변 영역으로 참조된다. 본 발명에서 사용된 방법에 따르면, CDRs 및 FRs로 부여되는 아미노산 위치들은 Kabat(1987 및 1991)에 따라 정의된다. 숙련된 기술자는 또한 본 발명의 수행에서 다른 넘버링 시스템, 예를들면 Chothia 및 Lesk (1987 및/또는 1989) 및/또는 Al-Lazikani 외 (1997)의 과가변성(hypervariable) 루프 넘버링 시스템을 충분히 사용할 수 있을 것이다.
여기서 사용된 것으로서, 용어 "중쇄 가변 영역" 또는 "VH"는 하나 이상의 항원들에 결합 가능한, 바람직하게는 하나 이상의 항원들에 특이적으로 결합 가능하고 적어도 약 30 아미노산들을 포함하는 하나의 FR1을 적어도 포함하는 단백질을 의미하는 것으로 여겨질 것이다. 중쇄로부터의 예시적인 FR1의 서열은 본원에 제공된다(예로서, SEQ ID NOs: 1 내지 13 참조). 바람직하게, 상기 중쇄는 세 개의 CDRs와 함께 세 개 또는 네 개의 FRs (예를들면, FR1, FR2, FR3 및 선택적으로 FR4)를 포함한다. 바람직하게, 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨지는, 하기의 잔기들 1-25 또는 1-30 (FRl ), 31-25 (CDR1), 36-49 (FR2), 50-65 (CDR2), 66-94 (FR3), 95-102 (CDR3) 및 103- 113 (FR4)로서 위치되는 FRs 및 CDRs을 포함한다. 일 실시예로서, 상기 중쇄는 상기 중쇄 및 복수 개의(바람직하게 3 또는 4) 고정 도메인들을 포함하거나 고정 단편(Fc)에 연결된 면역 글로불린으로부터 유도된다.
여기서 사용된 것으로서, 용어 "경쇄 가변 영역" 또는 "VL"은 하나 이상의 항원들에 결합 가능한, 바람직하게는 하나 이상의 항원들에 특이적으로 결합 가능하고 약 23 아미노산들을 포함하는 하나의 FR1을 적어도 포함하는 단백질을 의미하는 것으로 여겨질 것이다. 경쇄로부터의 예시적인 FR1의 서열은 본원에 제공된다(예로서, SEQ ID NOs: 14 내지 43 참조). 바람직하게, 상기 경쇄는 세 개의 CDRs와 함께 세 개 또는 네 개의 FRs (예를들면, FR1, FR2, FR3 및 선택적으로 FR4)를 포함한다. 바람직하게, 경쇄는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진, 하기의 잔기들 1-23 (FRl), 24-34 (CDR1), 35-49 (FR2), 50-56 (CDR2), 57-88 (FR3), 89-97 (CDR3) 및 98-107 (FR4)로서 위치되는 FRs 및 CDRs을 포함한다. 일 실시예로서, 상기 경쇄는 하나의 고정 도메인에 연결된 및/또는 고정 단편(Fc)에 연결되지 않은 상기 경쇄를 포함하는 면역 글로불린으로부터 유도된다.
본 발명의 어떤 실시예에서 용어 "골격 영역들(framework regions)"은 CDR 잔기들 외 이러한 가변 영역 잔기들을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 자연적으로 발생된 면역 글로불린(예를들면, 항체)의 각 가변 영역은 전형적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 확인되는 네 개의 FRs를 갖는다. CDRs이 Kabat에 따라 정의된다면, 예시적인 경쇄 FR(LCFR) 잔기들은 약 잔기들 1-23 (LCFRl ), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), 및 98-107 (LCFR4)에 위치된다. λCFR1는 κCFR1에 포함되는 잔기 10을 포함하지 않음에 주목한다. 예시적인 중쇄 FR (HCFR) 잔기들은 약 잔기들 1-30 (HCFRl), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3), 및 103- 113 (HCFR4)에 위치된다.
본 발명의 모든 면역 글로불린 가변 영역들에 대하여, "골격 영역 1(framework regopn 1)"(FR1)은 자연적인 N-말단 잔기 및 상보성을 결정하는 영역 No. 1(complementarity determining region No. 1, CDR1)의 시작 사이의 잔기들로서 정의된다. 이러한 잔기들은 1) Kabat(1987 및또는 2001) 및 2) Chothia 및 Lesk (1987, 1989 및 Al-Lazikani 외 1997)인 적어도 두 개의 명명법들에 의해 번호 매겨져 왔다. Chothia 및 Lesk 넘버링 시스템은 잘 정립된 Kabat 시스템을 기초로 하며 3차원 구조에서 그들의 실제 위치를 더 잘 맞추기 위하여 면역 글로불린 가변 영역들 내의 경쇄 CDR1 및 중쇄 CDR1 서열 길이 가변성의 넘버링을 수정하고자 하였다. Chothia 및 Lesk에 의해 채택된 CDR-특이적 넘버링은 이후 1989년에 변형되었으나 그런 뒤 1997년 복귀되었다. CDR 루프들 내에서 발견되는 잔기들을 다루는데 있어 이러한 넘버링 시스템들 사이에는 미묘한 차이점이 있다.
숙련된 자가 인식할 것과 같이, 골격 영역 1 내에는, 및 따라서 CDR1에 앞서는, 단일의 높은-보존성의 시스테인 잔기(Cys)가 일반적으로 존재한다. kappa 및 lambda 가변적 경쇄 모두에서, 이 보존성의 시스테인은 불변적으로 Kabat 포지션 23이며 CDR2 및 CDR3 사이에서, 골격 영역 3으로 정의된 영역 내에서, 불변적으로 Kabat 포지션 88내의 다른 고 보존성 시스테인 잔기와 이황화 결합을 형성한다. 그러나, 본 발명은, FR1의 다른 아미노산에 상대적으로 보존성인 시스테인의 위치를 개조하는, 예를들면 하나, 두 개 또는 세 개의 아미노산의 삽입제거(indels), 보통 인간이 만든 삽입제거를 고려한다.
높은 보존성 시스테인의 짝지음(paring)은 가변 중쇄들 내에서 미묘하게 다르며, 불변적 Kabat 포지션 22(FR1 내) 및 92(FR3 내)에서의 보존성 시스테인들 사이에서 발생한다. 그러나, 이러한 짝지음은 대부분 모든 면역 글로불린 내에서 거의 완전하게 보존되며, 이러한 이황화 결합이 Ig-루프 다양화의 시작에 아마도 이미 존재하였고 선택적인 압력 하에 유지되었음을 시사한다. 이황화 결합의 거의 완벽한 보존은 나아가 그것이 Ig-루프의 안정성에 중요하게 기여한다는 것을 시사한다.
여기서 사용된 것으로서, 용어 "상보성을 결정하는 영역(complementarity determining regions)"(동일하게 CDRs; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3 또는 과가변성 영역)은 그 존재가 항원 결합에 필요한 면역 글로불린 가변 영역의 아미노산 잔기들로 참조된다. 각 가변 영역은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 획인되는 세 개의 CDR 영역들을 갖는다. 각 CDR 영역은 Kabat(1987 및/또는 1991)에 의해 정의된 바와 같이 "상보성을 결정하는 영역"으로부터의 아미노산 잔기들을 포함할 것이다. 예로서, 중쇄 가변 영역에서 CDRH1은 잔기들 31-35 사이이며, CDRH2는 잔기들 50-65 사이이고 CDRH3는 잔기들 95-102 사이이다. 경쇄에서 CDRL1은 잔기들 24-34사이이고, CDRL2는 잔기들 50-56 사이이고 CDR3는 잔기들 89-97사이이다. 이러한 CDRs은 또한 예를들면 Kabat(1987 및/또는 1991)에 기재된 바와 같은, 수많은 삽입들을 포함한다.
여기서 사용된 바로서, 용어 "고정 영역"(동일하게 CR 또는 결정성 단편 또는 Fc)은 적어도 하나의 고정 도메인을 포함하는 면역 글로불린의 일부로서 참조되며, 일반적으로(반드시는 아닐지라도) 글리코스화되고, 하나 이상의 F 수용체들 및/또는 상보성 캐스캐이드의 성분들(예를들면, 효과기(effector) 기능들을 부여한다)에 결합한다. 상기 중쇄 고정 영역은 다섯 가지 이소타이프들(isotypes): α, δ, ε, γ또는 μ 중의 어느 것으로부터 선택될 수 있다. 나아가, 다양한 서브클래스들의 중쇄들(IgG 서브클래스들의 중쇄들과 같은)은 다른 효과기 기능들을 초래하고, 따라서 바람직한 중쇄 고정 영역을 선택함으로써 바람직한 효과기 기능을 갖는 단백질들이 제조될 수 있다. 바람직한 중쇄 고정 영역들은 감마 1(IgG1), 감마 2(IgG2) 및 감마 3(IgG3)이다.
"고정 도메인"은 그것의 서열이 면역 글로불린들/그들의 항체들 내에서 매우 유사한 면역 글로불린 내의 도메인, 예를들면 IgG 또는 IgM 또는 IgE이다. 면역 글로불린의 고정 영역은 일반적으로 복수의 고정 도메인들을 포함하여, 예를들면 γ, α 및 δ 중쇄들의 고정 영역은 세 개의 고정 도메인을 포함하고, γ, α 및 δ중쇄들의 Fc는 두 개의 고정 도메인들을 포함한다. μ 및 ε 중쇄들의 고정 영역은 네 개의 고정 도메인들을 포함하고 상기 Fc 영역은 두 개의 고정 도메인들을 포함한다.
여기 사용된 바로서, 용어 "Fv"는 다중 폴리펩티드들 또는 단일 폴리펩티드의 어느 것으로든 구성되는, 그 내부에서의 VL 및 VH 가 연결되어 항원 결합 사이트를 갖는, 즉 항원에 특이적으로 결합 가능한, 복합체를 형성하는 어떠한 단백질을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 상기 항원 결합 사이트를 형성하는 VL 및 VH는 단일 폴리펩티드 내 또는 서로 다른 폴리펩티드 내일 수 있다. 나아가 본 발명의 Fv(본 발명의 어떠한 단백질도 마찬가지로)는 동일한 항원에 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 다수의 항원 결합 사이트들을 포함할 수 있다. 이러한 용어는 재조합 기술을 이용하여 제조되는 그러한 단편에 대응하는 단백질들 뿐만 아니라 면역 글로불린으로부터 직접적으로 유도되는 단편들을 망라하는 것으로 이해될 것이다. 일부 실시예에서, VH는 중쇄 고정 도메인(CH)1에 연결되지 않으며 및/또는 VL은 경쇄 고정 도메인 (CL)에 연결되지 않는다. 폴리펩티드들 또는 단백질들을 함유하는 예시적 Fv는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 단편, scFv, 이원 항체(diabody), 삼원 항체(triabody), 사원 항체(tetrabody) 또는 더 높은 수준(order)의 복합체, 또는 상술의 그들의 고정 영역 또는 도메인에 연결된 어떤 것, 예를들면 CH2 또는 CH3 도메인을 포함한다. "Fab 단편"은 면역 글로불린의 1가의(monovalent) 항원-결합 단편으로 구성되며, 비변형 경쇄 및 중쇄의 일부로 구성된 단편을 수득하기 위하여, 효소 파파인(papain)으로 전체 면역 글로불린의 소화에 의해 제조될 수 있거나 제조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 면역 글로불린의 "Fab' 단편"은 비변형 경쇄 및 중쇄의 일부로 구성된 분자를 수득하기 위하여, 환원에 의해 연속되는, 펩신으로 전체 면역 글로불린을 처리함으로써 얻어질 수 있다. 두 개의 Fab's 단편들은 이러한 방법으로 처리된 면역 글로불린 마다 얻어진다. Fab' 단편은 또한 재조합 수단들에 의해 제조될 수 있다. 면역 글로불린의 "F(ab')2 단편"은 두 개의 이황화 결합에 의해 서로 홀드된 두 개의 Fab' 단편들의 이합체로 구성되며, 전체 면역 글로불린 분자를 뒤따르는 환원 없이 효소 펩신으로 처리함으로써 얻어진다. "Fab2" 단편은 예를들어 류신 지퍼 또는 CH3 도메인을 이용하여 연결된, 두개의 Fab 단편들을 포함하는 재조합 단편이다. "단일 쇄 Fv" 또는 "scFv"는 그 안에 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역이, 적당하고, 유연성 있는 폴리펩티드 연결자에 의해 공유적으로 연결된 면역 글로불린의 가변 영역 단편(Fv)을 함유하는 재조합 분자이다. 본 용어의 범위 내로 떨어지는 단백질들을 포함하는 예시적인 Fv의 구체적인 논의는 하기에서 제공된다.
여기서 사용된 바로서, 용어 "항원 결합 사이트"는 항원에 특이적으로 결합 가능한 단백질에 의해 형성된 구조를 의미하는 것으로 여겨질 것이다. 상기 항원 결합 사이트는 연속적인 아미노산들, 또는 나아가 단일 폴리펩티드 쇄 내 아미노산들의 일련(series)일 필요는 없다. 예로서, 두 개의 다른 폴리펩티드 쇄들로부터 제조된 Fv 내에서 항원 결합 사이트는 항원과 상호 작용하고 일반적으로, 그러나 언제나 각 가변 영역 내 하나 이상의 CDRs 내에 있는 것은 아닌 VL 및 VH 영역들의 일련으로 이루어진다.
"Kabat 넘버링 시스템"에 의하면 Kabat(1987 및/또는 1991)에서 설명된 바와 같이 넘버링 시스템은 면역 글로불린의 가변 영역 내에서의 FRs 및 CDRs의 위치를 결정하는 것으로 의미된다.
용어 "단백질"은 단일 폴리펩티드 쇄, 즉 펩티드 결합에 의해 연결된 연속적인 아미노산들의 일련 또는 서로 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된 폴리펩티드 쇄들의 일련(즉, 폴리펩티드 복합체)을 포함하는 것으로 여겨질 것이다. 예로서, 폴리펩티드 쇄들의 일련은 적당한 화학적 또는 이황화 결합을 이용하여 공유적으로 연결될 수 있다. 비-공유적 결합의 예는 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스 력, 및 소수성 인력을 포함한다. 본 발명에 의해 고려되는 비-공유적 결합은 VH 및 VL 사이, 예를들면, 이원 항체 또는 삼원 항체 또는 사원 항체의 어떤 형태에서의 인력이다.
용어 "폴리펩티드 쇄"은 상술된 단락으로부터 펩티드 결합들에 의해 연결된 연속적인 아미노산들의 일련을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
숙련된 기술자는 "이황화 결합"이 티올 그룹들의 커플링에 의해 형성된 공유 결합이라는 것을 인식할 것이다. 상기 결합은 또는 SS 결합 또는 이황화 브리지로 불려진다. 단백질에서, 이황화 결합은 일반적으로 시스틴을 제조하기 위한 두 개의 시스테인 잔기들의 티올 그룹들 사이에 발생된다.
숙련된 기술자는 또는 용어 "비-환원성 조건"은 단백질 내에서 메르캅트기(sulfhydryl(-SH)) 그룹들의 산화를 위한 충분한, 예를들면 이황화 결합 형성을 위해 허용적인 조건을 포함한다는 것을 알고 있을 것이다.
여기서 사용된 바로서, 용어 "항원"은 그것에 대항하여 면역 글로불린 반응(예를들면 항체 반응)이 일어날 수 있는 어떤 물질의 조성을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예시적인 항원은 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 탄수화물, 포스페이트 그룹, 포스포-펩티드 또는 폴리펩티드, 글리코스화된(glycosylated) 펩티드 또는 펩티드 등을 포함한다.
여기서 사용된 바로서, 용어 "특이적으로 결합한다"는 본 발명의 단백질이 그것이 대체의 항원 또는 세포들과 반응 또는 연결되는 것보다 더욱 자주, 더욱 빠르게, 더 큰 지속성(duration)으로 및/또는 더 큰 친화력으로 특정한 항원 또는 항원들 또는 그것을 발현하는 세포와 반응하거나 연결되는 것을 의미하는 것으로 여겨질 것이다. 예로서, 특이적으로 항원에 결합하는 단백질은 그것이 다른 항원들에 결합하는 것보다 더 큰 친화력(affinity), 친화력(avidity)으로 더 빠르게, 및/또는 더 큰 지속성(duration)으로 그 항원과 결합한다. 이것은 또한 이러한 정의를 해석함에 의해, 예로서 제1 항원에 특이적으로 결합하는 단백질은 제2 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 결합하지 않을 수 있다는 것으로 이해된다. 따라서, "특이적 결합"은 반드시 다른 항원에 대한 배타적 결합 또는 비-검출적(non-detectable) 결합을 요구하는 것은 아니며, 이는 용어 "선택적인 결합"에 의해 의미되는 것이다. 일반적으로, 그러나 반드시 그렇지는 않지만, 결합으로 참조되는 것은 특이적 결합을 의미하며, 각각의 용어는 다른 용어를 위한 분명한 뒷받침을 제공하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 단백질의 항원에 대한 결합의 내용 중에서 용어들 "방지하는", "방지한다" 또는 "방지"는 그 항원에 대한 결합의 완벽한 폐지(abrogation) 또는 완벽한 방해(inhibition)를 의미하는 것으로 여겨질 것이다.
단백질을 포함하는 가변 영역
본 발명은 하나 이상의 항원들에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는, 어떠한 실시예에 따라 본원에 개시된 대로 변형된 면역 글로불린 가변 영역을 포함하는 어떤 단백질을 고려한다. 바람직한 단백질들은 적어도 하나의 VH 및 적어도 하나의 VL을 포함한다. 예시적인 면역 글로불린 가변 영역들은 항체 및 그들의 변형된 형태(예를들면, 인간화된 항체들)들 및 카메리드 면역 글로불린 및 IgNAR 과 같은, 중쇄 항체들로부터의 가변 영역들이다.
면역 글로불린 가변 영역들
항체 가변 영역들
여기서의 기재를 바탕으로 숙련된 기술자에게 분명할 것과 같이, 본 발명의 단백질들은 FR1 내에서 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하도록 변형된 항체로부터의 하나 이상의 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 항체 분자들을 제공한다. 그러한 항체들은 먼저 관심 있는 항원에 대한 항체를 제조하고, 그러한 항체를 변형함으로써(예를들면 재조합 기술을 이용하여) 또는 미리 제조된 항체를 변형함으로써 제조될 수 있을 것이다.
항체를 제조하는 방법은 본 기술 분야에서 알려져 있다. 예로서, 융합 세포종(hybridoma) 기술과 같은 모노클로널 항체들을 제조하기 위한 방법은 Kohler 및 Milstein(1975)에 의한다. 융합 세포종 방법에서, 마우스, 햄스터, 또는 다른 적당합 호스트 동물은 전형적으로 상기 면역원 또는 항원에 특이하게 결합할 항체들을 제조할 수 있고 제조하는 림프구(lymphocytes)를 유도하기 위하여 면역원 또는 항원 또는 그들을 발현하는 세포에 의해 면역화될 수 있다. 면역화된 동물로부터의 림프구 또는 비장(spleen) 세포는 다음으로 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합제를 사용하여 불멸화된(immortalized) 세포계(cell line)와 융합되어, 융합 세포종 세포를 형성한다(Goding, 1986). 결과적인 융합 세포종 세포들은 바람직하게 비융합의, 불멸화된 세포들의 성장 또는 생존을 방해하는 하나 이상의 물질들substance)을 함유하는 적당한 배양 조건에서 배양될 것이다. 예로서, 부모 세포들(parental cells)이 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT 또는 HPRT))가 결여된 경우, 융합 세포종을 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin), 및 티미딘(thymidine)을 포함할 것이어서("HAT medium"), 그 물질은 HGPRT-부족 세포의 성장을 방지한다. 항체들을 제조하는 다른 방법들, 예를들어 Largaespada (1990) 또는 Weissinger 외. (1991)에 일반적으로 자세하게 기재된 ABL-MYC 기술을 이용하는 것은 또한 본 발명에 의해 고려된다.
대안적으로, 상기 항체, 또는 그것을 인코딩하는 서열은 관심의 항체를 발현하는 미리 제조된 세포, 예를들면 융합 세포종 또는 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 제조된다. 그러한 융합 세포종 및/또는 트랜스펙토마(transfectoma)의 다양한 소스들은 숙련된 기술자에게 분명할 것이며, 예로서 미국형 배양 콜렉션(American Type Culture Collection (ATCC)) 및/또는 유럽형 세포 배양의 콜렉션(European Collection of Cell Cultures (ECACC))을 포함한다. 항체로부터의 가변 영역을 인코딩하는 서열을 분리 및/또는 변형하기 위한 방법은 숙련된 기술자에게 및/또는 본원에 개시된 바로 명확할 것이다.
항체 제조 및/또는 그것을 인코딩하는 서열의 분리에 따라, 상기 항체는 어떠한 실시예에 의해 본원에 개시된 바와 같은 사이트에서 FR1 내에서의 시스테인 잔기들을 포함하도록 변형된다. 일반적으로, 이것은 그 항체를 인코딩하는 핵산을 분리하고, 변형된 항체를 발현하고 영역을 인코딩하는 FR1 내에서의 요구되는 사이트에서 시스테인 잔기들을 인코딩하는 코돈들(즉, TGT 또는 TGC)을 포함하기 위해 그것의 서열을 변형하는 것을 포함한다.
예시적인 인간 항체 중쇄 FR1 서열은 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 1); QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLT (SEQ ID NO: 2);QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 3);QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFT (SEQ ID NO: 4); QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS (SEQ ID NO: 5); QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS (SEQ ID NO: 6); QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLS (SEQ ID NO: 7); QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS (SEQ ID NO: 8); QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 9); EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 10); EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 11); EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFD (SEQ ID NO: 12); 및 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 13)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다:
예시적인 인간 항체 κ경쇄 FR1 서열은 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 14) ; DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 15); EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ ID NO: 16); EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 17); EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 18); DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 19); DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC (SEQ ID NO: 20); DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 21); EIVMTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 22); DIQMTQSPDFLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 23); EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 24); DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISC (SEQ ID NO: 25); DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC (SEQ ID NO: 26); EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITC (SEQ ID NO: 27); ETTLTQSPAFMSATPGDKVNISC (SEQ ID NO: 28); AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 29); AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 30); NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 31); DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC (SEQ ID NO: 32); DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISC (SEQ ID NO: 33); DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITC (SEQ ID NO: 34); VIWMTQSPSLLSASTGDRVTISC (SEQ ID NO: 35); 및 AIRMTQSPSSFSASTGDRVTITC (SEQ ID NO: 36)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
예시적인 인간 항체 λ경쇄 FR1 서열은 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISC (SEQ ID NO: 37); QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC (SEQ ID NO: 38); QSALTQPASVSGSPGQSITISC (SEQ ID NO: 39); QSALTQPRSVSGSPGQSVTISC (SEQ ID NO: 40); SYVLTQPPSVSVAPGKTARITC (SEQ ID NO: 41); SYELTQPPSVSVSPGQTASITC (SEQ ID NO: 42); 및 QLVLTQSPSASASLGASVKLTC (SEQ ID NO: 43)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
앞선 서열들은 단지 본 발명을 수행하는데 사용될 서열들의 예시일 뿐 그러한 서열들의 완전한 리스트는 아니다. 이러한 예들은 본 발명을 기재하는 그러나 본 발명을 제한하는 것은 아닌 목적을 위해 제공된다. 공지의 방법을 사용하여 및/또는 예로서 Kabat (1987 및/또는 2001)에 개시된 바를 바탕으로 하여 부가적인 FR1의 서열을 결정하는 것은 숙련된 기술자의 능력 내이다.
FR1 영역들의 앞선 예들은 어떤 예 또는 실시예에서 본원에 개시된 바와 같은 포지션들에서의 두 개 이상의 시스테인 잔기들을 포함하도록 용이하게 변형된다.
숙련된 기술자는 본 기술 분야에서의 공지 및/또는 본원에 개시된 서열을 바탕으로 하여 FR1을 인코딩하는 핵산의 서열을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
키메릭, 비면역화된, 인간화된 및 인간 항체들 ( Chimeric, Deimmunized, Humanized and Human Antibodies)
본 발명의 단백질은 인간화된 항체들 또는 인간 항체들 또는 그들로부터 유도된 가변 영역들이거나 또는 그들로부터 유도될 것이다. 용어 "인간화된 항체"는 일반적으로 재조합 기술을 이용하여 제조되는, 비-인간 종으로부터의 항체로부터 유도된 항원 결합 사이트 및 인간 항체의 구조 및/또는 서열을 바탕으로 하는 분자의 남아있는(remaining) 항체 구조를 포함하는, 키메릭(chimeric) 분자를 참조하는 것으로 이해될 것이다. 항원 결합 사이트는 바람직하게 인간 항체의 가변 영역들 및 인간 항체로부터의 남아있는 영역들 내 적합한 FRs 상에 그래프트된 비-인간 항체 로부터의 CDRs를 포함한다. 항원 결합 사이트는 와일드 타입이거나 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 것이다. 어떤 예에서, 인간 면역 글로불린의 골격 잔기들은 상응하는 비-인간 잔기들에 의해 대체된다. 인간화된 항체들은 또한 수용체 항체 내 또는 유입된 CDR 또는 골격 서열 내에서도 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 및 전형적으로 두 개의 가변 영역들 모두를 포함할 것이며, 그 안에서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역들은 비-인간 면역 글로불린의 그것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역들은 인간 면역 글로불린 공통(consensus) 서열의 그것들이다. 비-인간 항체들을 인간화하기 위한 방법은 본 기술 분야에 알려져 있다. 인간화는 하기 US5225539, US6054297 또는 US5585089의 방법에 따라 본질적으로 수행될 수 있다. 항체를 인간화하기 위한 다른 방법들은 배제되지 않는다. 숙련된 기술자는 예를들어 가변 도메인이 인간화될 수 있음과 같이 완벽한 항체가 아닌 본 발명의 단백질이 또한 인간화될 수 있음을 이해할 것이다.
항체 분자들 및 결합 단백질들과 연관되어 본원에서 사용된 바로서 용어 "인간 항체"는 가변 및, 선택적으로, 인간에서, 예로서 인간 생식 계열(germline) 또는 체세포의(somatic) 세포들에서 발견되는 서열로부터 유도되거나 그에 상응하는 고정 항체 영역들을 갖는 항체들로 참조된다. "인간" 항체들은 인간 서열들에 의해 인코드되지 않는 아미노산 잔기들을, 예로서 랜덤하게 도입된 돌연변이들 또는 체내에서의 사이트 지향성의 돌연변이들(특히 작은 수의 항체 잔기들, 예를들면 1, 2, 3, 4 또는 5의 항체 잔기들, 바람직하게 예를들면 항체의 하나 이상의 CDRs를 구성하는 1, 2, 3, 4 또는 5의 잔기들 내에서 보존적인 치환들 또는 돌연변이들을 포함하는 돌연변이들)을 포함할 수 있다. 이러한 "인간 항체들"은 실질적으로는 인간에 의해 제조될 필요는 없고, 오히려 그들은 재조합 방법에 의해 제조되거나 및/또는 인간 항체 고정 및/또는 가변 영역들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 이식된(transgenic) 동물(예를들면, 마우스)로부터 분리될 수 있다. 인간 항체 또는 그 단편들은 파지 디스플레이 라이브러리(phage display libraries) (예를들면, US6300064; US5885793; US6204023; US6291158; 또는 US6248516)에 기재된 바와 같이 본 기술 분야에서 알려진 다양한 기술을 이용하거나, 인간 면역 글로불린 유전자를 발현하는 유전자 이식된 동물들을 이용하여(예를들면, WO2002/066630; Lonberg 외. (1994) 또는 Jakobovits 외. (2007)에 기재된 바와 같이) 제조될 수 있다.
일 실시예에서 본 발명의 단백질은 키메릭 항체 또는 그 일부, 예를들면 Fab 단편이다. 용어 "키메릭 항체"는, 그 안에 중 및/또는 경쇄의 부분이 특정 종(예를들면, 마우스와 같은 뮤린)으로부터 유도된 항체들에서의 상응하는 서열과 동일 또는 상응(homologous)하거나 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하고, 반면 그들이 바람직한 생물학적 활성을 보이는 한, 그 쇄(들)의 나머지는 다른 종(예를들면, 인간과 같은 영장류)로부터 유도된 항체들에서의 상응하는 서열과 동일 또는 상응하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스, 또한 그러한 항체들의 단편들에 속하는, 항체들로 참조된다(US4,816,567). 전형적으로 키메릭 항체들은, 압도적으로 인간 도메인들을 구비하는 항체를 생산하기 위하여, 쥐 또는 토끼 가변 영역들 및 인간 고정 영역들을 이용한다. 예로서, 키메릭 항체는 인간 고정 도메인 및/또는 인간 고정 영역에 융합된 본 발명의 어떤 실시예에 따라 변형된 마우스 항체로부터의 가변 영역을 포함한다. 그러한 키메릭 항체들의 제조는 본 기술 분야에서 알려져 있으며, 표준화된 수단(예로서, US5,807,715; US4,816,567 및 US4,816,397에 기재된 바와 같이)에 의해 도달될 수 있다.
본 발명은 또한 비면역화된 단백질을 고려한다. 비-면역화된 단백질들은 하나 이상의 항원 결정기들(epitotes), 예를들면 B세포 항원 결정기들 또는 T 세포 항원 결정기들이 제거된(즉, 돌연변이화된) 것들을 포함하여 그에 의해 피험자이 단백질에 대한 면역 반응성을 일으킬 가능성을 감소시킨다. 비면역화된 단백질을 제조하기 위한 방법은 본 기술 분야에서 알려져 있고 예로서 WO00/34317, WO2004/108158 및 WO2004/064724에 기재되어 있다. 예로서, 상기 방법은 단백질 내에서의 항원 결정기를 예측하기 위하여 in silico 분석을 수행하고 예측된 항원 결정기에서의 하나 이상의 잔기들을 돌연변이화하여 그에 의해 그 면역성(immunogenicity)을 감소시키는 것을 포함한다. 상기 단백질은 그런 다음 그것이 항원에 결합될 능력을 보유하고 있음을 확인하기 위하여, 예를들면 in silico 또는 체내 또는 체외에서 분석된다. CDR 내에서 발생되는 바람직한 항원 결정기는 그 돌연변이가 항원 결합성을 감소시킬 가망이 없는 게 아닌 한 돌연변이화되지 않는다. 항원을 예측하기 위한 방법은 본 기술 분야에서 알려져 있으며 예로서, Saha(2004)에 기재되어 있다. AVP04-07 내에서 예시적인 잠재적 항원 결정기는 하기의 위치들 SEQ ID NO: 55: 35-41; 68-77; 84-90; 109-119; 122-128; 160-169; 및 185-194에서 발생한다. 돌연변이화되어 잠재적으로 면역성을 감소시킬 수 있는 잔기들은 K38, T71, A72, K74, T87, T112, V113, S114, S115, G116, T125, Q163, Q164, P166, F188, T189, G190 또는 S191을 포함한다.
중쇄 면역 글로불린
중쇄 면역 글로불린은 그들이 중쇄를 포함하지만 경쇄를 포함하지 않는 한, 면역 글로불린(예를들면, 항체)의 많은 다른 형태들과 구조적으로 다르다. 따라서, 이러한 면역 글로불린들은 또한 "중쇄 유일 항체들"로 참조된다. 중쇄 면역 글로불린은 예로서 카메리드 및 카르틸라지너스 피쉬(cartilaginous fish)(또한 IgNAR로 불리는)에서 발견된다.
자연적으로 발생하는 중쇄 면역 글로불린 내에 존재하는 가변 영역들은, 그들을 통상적인 4-쇄 항체들("VH 도메인들"로 참조되는)에 존재하는 중쇄 가변 영역들 및 통상적인 4-쇄 항체들("VL 도메인들"로 참조되는)에 존재하는 경쇄 가변 영역들로부터 구분하기 위하여, 일반적으로 카메리드 Ig 내 및 IgNAR 내 V-NAR에서의 "VHH 도메인들"로 참조된다.
중쇄 면역 글로불린은 높은 친화력 및 높은 특이성을 가지고 연관된 항원에 결합하는 경쇄의 존재를 요구하지 않는다. 이러한 구성은 중쇄 면역 글로불린을 VH 및 VL 도메인들을 모두 포함하는 어떤 통상적인 4-쇄 항체들("VH 도메인들"로 참조되는)로부터 구분짓는다. 이는 단편들에 결합하는 단일 도메인이, 발현되기 쉽고 일반적으로 안정되고 용해성인 중쇄 면역 글로불린으로부터 유도될 수 있다는 것을 의미한다. 중쇄 면역 글로불린 및 그것의 가변 영역 도메인들 그로부터 유도된 도메인들은, 또한 효소와 같은 항원 내 및 전염성 질병의 원인이 되는 바이러스 및 시약의 단백질 표면 상에서 종종 발견되는 공동(cavities)의 통과 및 결합을 촉진하는 긴 표면 루프(특히 CDR3)를 포함할 수 있다.
카메리드로부터의 중쇄 면역 글로불린들 및 그것의 가변 영역들 및 그들의 제조 및/또는 분리 및/또는 사용을 위한 방법들에 대한 일반적인 기재는 그 중에서도 특히 하기의 참조들 WO94/04678, WO97/49805 및 WO 97/49805에서 발견된다.
카메리드의 중쇄 면역 글로불린들로부터의 골격 1 도메인들의 예시적 서열은 하기, GGSVQTGGSLRLSCEISGLTFD (SEQ ID NO: 44); GGSVQTGGSLRLSCAVSGFSFS (SEQ ID NO: 45); GGSEQGGGSLRLSCAISGYTYG (SEQ ID NO: 46); GGSVQPGGSLTLSCTVSGATYS (SEQ ID NO: 47); GGSVQAGGSLRLSCTGSGFPYS (SEQ ID NO: 48); GGSVQAGGSLRLSCVAGFGTS (SEQ ID NO: 49); 및 GGSVQAGGSLRLSCVSFSPSS (SEQ ID NO: 50)을 포함한다.
카르틸라지너스 피쉬(cartilaginous fish)로부터의 중쇄 면역 글로불린들 및 그들의 가변 영역들 및 그들의 제조 및/또는 분리 및/또는 사용에 대한 방법들의 일반적인 기재는 그 중에서도 특히 WO2005/118629에서 발견된다. 타입 3 스피니 도그피쉬 상어(Type 3 spiny dogfish shark) IgNAR FR1에 대한 예시적인 공통 서열(consensus sequence)은 서열 AWVEQTPRTAKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 51)을 포함한다. 타입 3 너스 상어(Type 3 nurse shark) IgNAR FR1에 대한 예시적인 공통 서열(consensus sequence)은 서열 ARVDQTPKTITKETGESLTINCVLS (SEQ ID NO: 52)을 포함한다.
단백질들을 함유하는 가변 영역
이원 항체(diabodies), 삼원 항체(triabodies), 사원 항체(tetrabodies)
면역 글로불린 가변 영역을 포함하는 예시적인 바람직한 단백질들은 이원 항체들(diabodies), 삼원 항체들(triabodies), 사원 항체들(tetrabodies) 및 WO98/044001 및 WO94/007921에 기재된 바와 같은 더 높은 차원의 단백질 복합체들이다.
여기 사용된 바로서, 용어 "이원 항체(diabody)"는 두 개의 연결된 폴리펩티드 쇄들을 포함하는 단백질로서, 각각의 폴리펩티드 쇄는 VL-X-VH 또는 VH-X-VL 구조를 포함하고, 여기서 VL은 면역 글로불린 경쇄 가변 영역이고, VH는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역이며, X는 단일 폴리펩티드 쇄 내의 VL 및 VH가 연결되는 것(또는 Fv를 형성하는 것)을 허용하기에 불충분한 잔기들을 포함하는 연결자(linker)이거나 또는 부재(absent)이고, 및 여기서 하나의 폴리펩티드 쇄의 VH가 다른 폴리펩티드 쇄의 VL과 결합하여 항원 결합 사이트를 형성하는, 즉 하나 이상의 항원들에 특이적으로 결합 가능한 Fv 분자를 형성하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 상기 VL 및 VH는 각 폴리펩티드 쇄 내에서 동일할 수 있고 또는 상기 VL 및 VH는 각 폴리펩티드 쇄 내에서 달라서 2-특이성(bispecific) 이원 항체(diabody)(즉, 다른 특이성을 갖는 두 개의 Fvs를 포함하는)를 형성할 수 있다.
여기 사용된 바로서, 용어 "삼원 항체(triabody)"는 세 개의 연결된 폴리펩티드 쇄들을 포함하는 단백질로서, 각각의 폴리펩티드 쇄는 VL-X-VH 또는 VH-X-VL 구조를 포함하고, 여기서 VL은 면역 글로불린 경쇄 가변 영역이고, VH는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역이며, X는 단일 폴리펩티드 쇄 내의 VL 및 VH가 연결되는 것(또는 Fv를 형성하는 것)을 허용하기에 불충분한 잔기들을 포함하는 연결자이거나 또는 부재이고, 및 여기서 하나의 폴리펩티드 쇄의 VH가 다른 폴리펩티드 쇄의 VL에 연결되어서 삼합체의(trimeric) 단백질(삼원 항체(triabody))을 형성하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예로서, 제1 폴리펩티드 쇄의 VH는 제2 폴리펩티드 쇄의 VL과 연결되고, 제2 폴리펩티드 쇄의 VH는 제3 폴리펩티드 쇄의 VL과 연결되며 제3 폴리펩티드 쇄의 VH는 제1폴리펩티드 쇄의 VL과 연결된다. 상기 VL 및 VH는 연결되어 항원 결합 사이트, 즉 하나 이상의 항원들에 특이적으로 결합 가능한 Fv 분자를 형성한다. 상기 VL 및 VH는 각 폴리펩티드 쇄 내에서 동일할 수 있고(즉, 모노 특이성(monospecific) 삼원 항체(triabody)를 제조하기 위함) 또는 두 개의 VL 및 두 개의 VH는 동일할 수 있고 각각의 세 번째의 것은 제3의 폴리펩티드 쇄 내에서 달라서 2-특이성(bispecific) 단백질을 형성하거나 또는 상기 VL 및 VH는 각 폴리펩티드 쇄 내에서 달라서 삼중 결합(trivalent) 단백질을 형성할 수 있다.
여기 사용된 바로서, 용어 "사원 항체(tetrabody)"는 네 개의 연결된 폴리펩티드 쇄들을 포함하는 단백질로서, 각각의 폴리펩티드 쇄는 VL-X-VH 또는 VH-X-VL 구조를 포함하고, 여기서 VL은 면역 글로불린 경쇄 가변 영역이고, VH는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역이며, X는 단일 폴리펩티드 내의 VL 및 VH가 연결되는 것(또는 Fv를 형성하는 것)을 허용하기에 불충분한 잔기들을 포함하는 연결자이거나 또는 부재이고, 및 여기서 하나의 폴리펩티드 쇄의 VH가 다른 폴리펩티드 쇄의 VL에 연결되어서 사합체의(tetrameric) 단백질(사원 항체(tetrabody))을 형성하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 상기 VL 및 VH는 연결되어 항원 결합 사이트, 즉 하나 이상의 항원들에 특이적으로 결합 가능한 Fv 분자를 형성한다. 예로서, 제1 폴리펩티드 쇄의 VH는 제2 폴리펩티드 쇄의 VL과 연결되고, 제2 폴리펩티드 쇄의 VH는 제3 폴리펩티드 쇄의 VL과 연결되며, 제3 폴리펩티드 쇄의 VH는 제4폴리펩티드 쇄의 VL과 연결되고, 제4 폴리펩티드 쇄의 VH는 제1폴리펩티드 쇄의 VL과 연결된다. 상기 VL 및 VH는 각 폴리펩티드 쇄 내에서 동일할 수 있고(즉, 모노 특이성(monospecific) 사원 항체(tetrabody)를 제조하기 위함) 또는 상기 VL 및 VH는 두 개의 폴리펩티드 쇄들 내에서 하나의 타입이고 다른 두개의 폴리펩티드 쇄들 내에서 다른 타입이어서 2-특이성(bispecific) 사원 항체(tetrabody)를 형성하거나 또는 상기 VL 및 VH는 각각의 폴리펩티드 쇄 내에서 달라서 4-특이성(tetraspecific) 사원 항체(tetrabody)를 형성할 수 있다.
숙련된 기술자는 이원 항체(diabodies), 삼원 항체(triabodies) 및/또는 사원 항체(tetrabodies) 및 그들의 제조 방법을 알고 있을 것이다. 일반적으로 이러한 단백질들은 그 내부의 VH 및 VL이 직접 또는 상기 VH 및 VL이 연결되는 것을 허용하기에 불충분한 길이의 연결자를 사용하여 연결된 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 상기 VH 및 VL은 어떠한 순서, 즉 VL-VH 또는 VH-VL로 위치할 수 있다. 상기 VH 및 VL은 예를들어 하나 이상의 관심의 가변 영역(들)을 포함하는 면역 글로불린(항체 또는 키메릭 항체 또는 인간화된 항체 또는 인간 항체)을 발현하는 세포로부터 또는 VH 및 VL 폴리펩티드 쇄들을 발현하는 재조합 라이브러리(예를들어 scFv 라이브러리, 예를들어 EP0239400 또는 US4946778에 기재된 바와 같이)로부터 이러한 폴리펩티드 쇄들을 인코딩하는 핵산을 분리함으로써 용이하게 얻어진다. 상기 VH 및/또는 VL 은 그런 다음 어떤 실시예에 따라 본원에 개시된 바와 같이 요구되는 시스테인 잔기들을 포함하도록 용이하게 변형될 수 있다.
VH 및 VL 을 포함하는 단백질은 연결되어 (만약 존재한다면) 연결자의 길이 및/또는 VH 및 VL 도메인의 수준(order)에 따라 이원 항체, 삼원 항체 및/또는 사원 항체를 형성한다. 바람직하게, 상기 연결자는 12 이하의 아미노산들을 포함한다. 예로서, N 에서 C 순서의 VH-X-VL 내에 정렬된 하기의 구조를 갖는 폴리펩티드 쇄들의 경우에, 여기서 X는 연결자이고, 3-12 잔기들을 갖는 연결자는 일반적으로 이원 항체들 형성의 결과를 가져오고, 1 또는 2 잔기들을 갖는 연결자 또는 연결자가 부재인 경우는 삼원 항체들 형성의 결과를 가져온다. N 에서 C 순서의 VL-X-VH 내에 정렬된 하기의 구조를 갖는 폴리펩티드 쇄들의 경우에, 여기서 X는 연결자가고, 3-12 잔기들을 갖는 연결자는 일반적으로 이원 항체들 형성의 결과를 가져오고, 1 또는 2 잔기들을 갖는 연결자는 이원 항체들, 삼원 항체들 및 사원 항체들 형성의 결과를 가져오며 연결자가 결여된 폴리펩티드는 일반적으로 삼원 항체들 또는 사원 항체들을 형성한다.
융합 단백질에서의 사용을 위한 연결자들은 본 기술 분야에서 알려져 있다. 연결자 서열 조성은 융합 단백질의 폴딩 안정성에 영향을 줄 수 있다. 융합된 단백질들에 관련되지 않는 연결자를 통한 단백질의 간접적인 융합에 의해, 두 개의 단백질들 사이의 입체 방해(steric hindrance)가 회피되며 연결에 대한 자유도가 달성된다.
단백질의 유연성 및 결과적으로 그것의 기능적 활성을 제한할 수 있는, α-나선 또는 β-가닥 구조들을 채택하는 높은 성향을 갖는 연결자 서열을 갖는 것이 종종 비선호된다. 오히려, 더 바람직한 연결자는 확장된 형태(conformation)를 채택하고자 하는 선호도를 갖는 서열이다. 실제에서, 대부분의 현재 설계된(designed) 연결자 서열은 그 연결자가 루프 구조를 채택하도록 강제하는 글리신 잔기들의 높은 함량을 갖는다. 글리신은 β-탄소의 부재가 다른 아미노산들에 대해서는 에너지적으로 허락되지 않는 폴리펩티드 백본이 이면각(dihedral angles)에 접근하는 것을 허용하기 때문에 일반적으로 설계되는 연결자에서 사용된다.
일 실시예에서, 상기 연결자는 글리신 풍부(rich) 연결자이다. 바람직하게, 상기 연결자는 부가적으로 알라닌 및/또는 세린을 포함하는 글리신 연결자이다. 그러한 연결자들은 유연성을 제공하고, 친수성을 향상시키며 및 상대적으로 프로테라제 저항성(protease resistant)이다, 예를들어 Kortt 외. 2001 참조.
글리신에 의해 주어진 형태적 유연성(conformational flexibility)은 단백질의 C 말단과 연결자의 N 말단 사이에서의 접합(junction)에서 중요할 수 있다. 따라서, 단백질의 C 말단에 인접한 영역 내에서의 글리신을 포함하는 연결자가 바람직하다. 이 점에 있어서, 이것이 연결자의 제1 아미노산 잔기가 글리신이어야 한다는 요구를 의미하는 것은 아니다.
프롤린 잔기들은 연결자에 포함되어 연결자에 의한 심각한 이차적인 구조적 성분의 형성을 방지할 수 있다. 예로서, 연결자는 n이 약 1 및 약 5 사이의 숫자인 서열 Glyn-Pro-Glyn 을 포함한다.
바람직한 연결자들은 G; GG; GGG; GGGG (SEQ ID NO: 134); GGGGS (SEQ ID NO: 135); S; SG; SGG; 및 SGGG로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
이원 항체들 및 더 높은 수준의 다합체들(multimers)는 또한 공유적으로 연결된, 예를들면 단백질들 사이의 이황화 결합에 의해, 예를들면 WO2006/113665에 기재된 바와 같이, 단백질들을 포함한다.
다중 특이성의(multispecific) 이원 항체들 및 더 높은 수준의 다합체들(multimers)은 짧은 연결자에 의해 다른 면역 글로불린의 VL 도메인에 연결된 하나의 면역 글로불린으로부터의 VH 도메인을 포함하는 두 개의 단쇄 융합 생성물들의 비공유적 연결을 통해 제조될 수 있으며, 그에 의해 두 개의 Fvs를 형성하고, 각각은 다른 면역 글로불린으로부터이다, 예로서 Hudson 및 Kortt(1999)를 참조. 마찬가지로, 다중 특이성의 삼원 항체들은 하기와 같은 세 개의 단쇄 융합 단백질의 비공유적 연결에 의해 제조될 수 있다:
(i) 제2 면역 글로불린의 VL 도메인에 짧은 연결자에 의해 연결된 제1 면역 글로불린으로부터의 VH 도메인을 포함하는 제1 단백질;
(ii) 제3 면역 글로불린의 VL 도메인에 짧은 연결자에 의해 연결된 제2 면역 글로불린으로부터의 VH 도메인을 포함하는 제2 단백질; alc
(iii) 제1 면역 글로불린의 VL 도메인에 짧은 연결자에 의해 연결된 제3 면역 글로불린으로부터의 VH 도메인을 포함하는 제3 단백질,
숙련된 기술자는 2-특이성 삼원 항체들, 2-특이성 사원 항체들, 3-특이성 사원 항체들 및 4-특이성 사원 항체들을 제조하기 위하여 전술한 것에 대한 적당한 변형들을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
본 발명은 어떠한 항원에 대한 이원 항체, 삼원 항체, 사원 항체 또는 더 높은 수준의 다원체 또는 그들의 조합을 고려하며, 특정 항원에 결합하는 것들에 한정되는 것으로 여겨지지 않는다. 예시적인 항원들은 제한이 아닌 예시의 목적으로 본원에 개시된다.
예시적인 이원 항체들, 삼원 항체들 및/또는 사원 항체들은 SEQ ID NO: 55의 아미노산들 1-115 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산들 1-129 또는 SEQ ID NO: 61의 아미노산들 1-120 또는 SEQ ID NO: 109의 아미노산들 1-129에 나열된 VH 서열을 포함하며, FR1 내에서 두 개 이상의 시스테인 잔기들 및/또는 N-말단 트레오닌/세린 잔기를 포함하도록 변형된다. 예로서 상기 VH는 하기에 나열된 서열을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 57의 아미노산들 1-115;
(ii) SEQ ID NO: 63의 아미노산들 1-115;
(iii) SEQ ID NO: 75의 아미노산들 1-115;
(iv) SEQ ID NO: 77의 아미노산들 1-115;
(v) SEQ ID NO: 99의 아미노산들 1-115;
(vi) SEQ ID NO: 65의 아미노산들 1-129;
(vii) SEQ ID NO: 87의 아미노산들 1-129;
(viii) SEQ ID NO: 89의 아미노산들 1-129;
(ix) SEQ ID NO: 91의 아미노산들 1-129;
(x) SEQ ID NO: 93의 아미노산들 1-129;
(xi) SEQ ID NO: 97의 아미노산들 1-129;
(xii) SEQ ID NO: 79의 아미노산들 1-120;
(xiii) SEQ ID NO: 81의 아미노산들 1-120;
(xiv) SEQ ID NO: 83의 아미노산들 1-120;
(xv) SEQ ID NO: 85의 아미노산들 1-120; 및/또는
(xvi) SEQ ID NO: 95의 아미노산들 1-120.
상기 이원 항체들, 삼원 항체들 및/또는 사원 항체들은 SEQ ID NO: 55의 아미노산들 121-234 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산들 135-245 또는 SEQ ID NO: 61의 아미노산들 126-232 또는 SEQ ID NO: 109의 아미노산들 135-245에 나열된 VL 서열을 포함하며, FR1 내에서 두 개 이상의 시스테인 잔기들 및/또는 N-말단 트레오닌/세린 잔기를 포함하도록 변형된다. 예로서 상기 VL은 하기에 나열된 서열을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 57의 아미노산들 121-234;
(ii) SEQ ID NO: 63의 아미노산들 121-234;
(iii) SEQ ID NO: 75의 아미노산들 121-234;
(iv) SEQ ID NO: 77의 아미노산들 121-234;
(v) SEQ ID NO: 99의 아미노산들 121-234;
(vi) SEQ ID NO: 65의 아미노산들 135-245;
(vii) SEQ ID NO: 87의 아미노산들 135-245;
(viii) SEQ ID NO: 89의 아미노산들 135-245;
(ix) SEQ ID NO: 91의 아미노산들 135-245;
(x) SEQ ID NO: 93의 아미노산들 135-245;
(xi) SEQ ID NO: 97의 아미노산들 135-245;
(xii) SEQ ID NO: 79의 아미노산들 126-232;
(xiii) SEQ ID NO: 81의 아미노산들 126-232;
(xiv) SEQ ID NO: 83의 아미노산들 126-232;
(xv) SEQ ID NO: 85의 아미노산들 126-232; 및/또는
(xvi) SEQ ID NO: 95의 아미노산들 126-232.
전술의 단락들에서 기재된 VH 및 VL은 어떤 순서로든 정렬될 수 있으며 본원에 개시된 바와 같은 적당한 연결자에 의해 연결될 수 있다. 이원 항체에 대하여 상기 연결자는 바람직하게 서열 GGGS를 포함한다. 삼원 항체 또는 사원 항체에 대하여, 바람직하게 연결자가 없거나 단일 글리신 잔기이다.
일 실시예에서, 이원 항체는 TAG72에 결합하고 SEQ ID NO: 55에 나열된 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄(바람직하게는 각각 포함하는 두 개의 폴리펩티드 쇄들)을 포함하며, FR1 내에서 두 개 이상의 시스테인 잔기들 및/또는 N-말단 트레오닌/세린 잔기를 포함하도록 변형된다. 예로서, 이원 항체는 하나 이상의 SEQ ID NO: 57, 63, 75, 77 또는 79에 나열된 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄(바람직하게는 각각 포함하는 두 개의 폴리펩티드 쇄들)을 포함한다.
일 실시예에서, 삼원 항체는 TAG72에 결합하고 SEQ ID NO: 102에 나열된 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄(바람직하게는 각각 포함하는 두 개 또는 세 개의 폴리펩티드 쇄들)을 포함한다.
다른 실시예에서, 이원 항체는 Her2에 결합하고 SEQ ID NO: 109에 나열된 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄(바람직하게는 각각 포함하는 두 개의 폴리펩티드 쇄들)을 포함하며, FR1 내에서 두 개 이상의 시스테인 잔기들 및/또는 N-말단 트레오닌/세린 잔기를 포함하도록 변형된다. 예로서, 이원 항체는 하나 이상의 SEQ ID NO: 65, 87, 89, 91, 93 또는 97에 나열된 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄(바람직하게는 각각 포함하는 두 개의 폴리펩티드 쇄들)을 포함한다.
다른 실시예에서, 이원 항체는 MUC1에 결합하고 SEQ ID NO: 61에 나열된 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄(바람직하게는 각각 포함하는 두 개의 폴리펩티드 쇄들)을 포함하며, FR1 내에서 두 개 이상의 시스테인 잔기들 및/또는 N-말단 트레오닌/세린 잔기를 포함하도록 변형된다. 예로서, 이원 항체는 하나 이상의 SEQ ID NO: 79, 81, 83, 85 또는 95에 나열된 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄(바람직하게는 각각 포함하는 두 개의 폴리펩티드 쇄들)을 포함한다.
단쇄 Fv(scFv) 단편
숙련된 기술자는 scFv가 단일 폴리펩티드 쇄 내에서의 VH 및 VL 영역들을 포함한다는 것을 알고 있을 것이다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드 쇄는 나아가 상기 VH 및 VL 사이에 폴리펩티드 연결자를 포함하여 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하도록 한다(즉, 단일 폴리펩티드 쇄의 VH 및 VL 이 서로 연결되어 Fv를 형성함). 이것은 다른 폴리펩티드 쇄들로부터의 가변 영역들이 서로 연결 또는 결합된 이원 항체 또는 더 높은 수준의 다합체로부터 구분된다. 예로서, Gly4Ser)3 (즉, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53))로 12 아미노산 잔기들을 초과하여 포함하는 연결자는 scFv에 대한 더욱 선호되는 연결자의 하나이다.
예시적인 scFvs는 SEQ ID NO: 55의 아미노산들 1-115 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산들 1-129 또는 SEQ ID NO: 61의 아미노산들 1-120 또는 SEQ ID NO: 109의 아미노산들 1-129에 나열된 VH 서열을 포함하며, FR1 내에서 두 개 이상의 시스테인 잔기들 및/또는 N-말단 트레오닌/세린 잔기를 포함하도록 변형된다. 일 실시예에서 TAG72에 scFv는 결합하고 그 VH는 하기 중 하나에 나열된 서열을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 57의 아미노산들 1-115;
(ii) SEQ ID NO: 63의 아미노산들 1-115;
(iii) SEQ ID NO: 75의 아미노산들 1-115;
(iv) SEQ ID NO: 77의 아미노산들 1-115; 또는
(v) SEQ ID NO: 99의 아미노산들 1-115;
및 그 VL은 하기 중 하나에 나열된 서열을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 57의 아미노산들 121-234;
(ii) SEQ ID NO: 63의 아미노산들 121-234;
(iii) SEQ ID NO: 75의 아미노산들 121-234;
(iv) SEQ ID NO: 77의 아미노산들 121-234; 또는
(v) SEQ ID NO: 99의 아미노산들 121-234.
일 실시예에서, scFv는 TAG72에 결합하고 SEQ ID NO: 101에 나열된 서열을 포함한다.
다른 실시예에서, scFv는 Her2에 결합하고 그 VH는 하기 중 하나에 나열된 서열을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 65의 아미노산들 1-129;
(ii) SEQ ID NO: 87의 아미노산들 1-129;
(iii) SEQ ID NO: 89의 아미노산들 1-129;
(iv) SEQ ID NO: 91의 아미노산들 1-129;
(v) SEQ ID NO: 93의 아미노산들 1-129; 또는
(vi) SEQ ID NO: 97의 아미노산들 1-129.
및 그 VL은 하기 중 하나에 나열된 서열을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 65의 아미노산들 135-245;
(ii) SEQ ID NO: 87의 아미노산들 135-245;
(iii) SEQ ID NO: 89의 아미노산들 135-245;
(iv) SEQ ID NO: 91의 아미노산들 135-245;
(v) SEQ ID NO: 93의 아미노산들 135-245; 또는
(vi) SEQ ID NO: 97의 아미노산들 135-245.
다른 실시예에서, scFv는 HER2에 결합하고 SEQ ID NO: 105에 나열된 서열을 포함한다.
또 다른 실시예에서, scFv는 MUC1에 결합하고 그 VH는 하기 중 하나에 나열된 서열을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 79의 아미노산들 1-120;
(ii) SEQ ID NO: 81의 아미노산들 1-120;
(iii) SEQ ID NO: 83의 아미노산들 1-120;
(vi) SEQ ID NO: 85의 아미노산들 1-120; 또는
(v) SEQ ID NO: 95의 아미노산들 1-120.
및 그 VL은 하기 중 하나에 나열된 서열을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 79의 아미노산들 126-232;
(ii) SEQ ID NO: 81의 아미노산들 126-232;
(iii) SEQ ID NO: 83의 아미노산들 126-232;
(iv) SEQ ID NO: 85의 아미노산들 126-232; 또는
(v) SEQ ID NO: 95의 아미노산들 126-232.
본 발명은 또한 그 내부에서 단일 시스테인 잔기가 VH의 FR 및 VL의 FR로 도입되고, 안정한 Fv(예로서 Brinkmann 외., 1993 참조)를 수득하기 위해 시스테인 잔기가 이황화 결합에 의해 연결된, 이황화 안정화된 Fv(또는 diFv 또는 dsFv)를 고려한다.
대안적으로, 또는 부가적으로, 본 발명은 이합체의(dimeric) scFv, 즉 비공유적 또는 공유적 연결에 의해 연결된 두 개의 scFv 분자들을 포함하는 단백질을 제공한다. 그러한 이합체 scFv의 예는, 예로서 류신 지퍼(zipper) 도메인에 의해 연결된 두 개의 scFvs(예를들면 Fos 또는 Jun으로부터 유도된)로서, 그에 의해 류신 지퍼 도메인들은 이합체 화합물(예로서 Kostelny 1992 또는 Kruif 및 Logtenberg, 1996 참조)을 형성한다. 대안적으로, 두 개의 scFvs는, 예를들어 US20060263367에 기재된 바와 같이, 두 개의 scFvs가 형성되어 항원에 결합하는 것을 허용하는 충분한 길이의 펩타이드 연결자에 의해 연결된다. 추가적인 예에서, 각 scFv는, 예를들어 연결자 영역 내 또는 말단에서, 시스테인 잔기를 포함하도록 변형되고, 상기 scFvs는, 예를들어 Albrecht 외., (2004)에 기재된 바와 같이, 이황화 결합에 의해 연결된다.
예를들어 US623322에 기재된 바와 같이, 글리코스화(glycosylation)를 허용하기 위해 변형된 연결자를 포함하는 scFv와 같이, scFv의 변형된 형태는 또한 본 발명에 의해 고려된다.
숙련된 기술자는 scFv 또는 본원에 개시된 바를 기초로 하는 본 발명에 따라 적당히 변형된 VH 및/또는 VL을 포함하는 그로부터 변형된 형태를 용이하게 제조할 수 있을 것이다. 예시적인 VH 및/또는 VL의 서열은 본원에 개시되며 필요한 변경을 가하여 본 발명의 본 실시예에 적용되는 것으로 여겨진다.
scFv의 부가적인 기재는, 예로서 US5260203에서 발견된다.
소체(minibodies)
숙련된 기술자는 소체(minibody)가 면역 글로불린의 CH2 및/또는 CH3 도메인에 융합된 면역 글로불린의 VH 및 VL 도메인들을 포함하는 것을 알고 있다. 선택적으로, 상기 소체는 VH 및 VL 사이에 힌지 영역을 포함하며, 종종 이러한 형태(conformation)는 Flex Minibody(Hu 외., 1996)로 참조된다. 소체는 CH1 또는 CL을 포함하지 않는다. 바람직하게, 상기 VH 및 VL 도메인들은 상기 힌지 영역 및 면역 글로불린의 CH3 도메인에 융합된다. 상기 영역들 각각은 동일한 면역 글로불린으로부터 유도된다. 대안적으로, VH 및 VL 도메인들은 하나의 면역 글로불린으로부터 및 그 힌지 및 CH2/CH3는 다른 것으로부터 유도될 수 있으며, 또는 그 힌지 및CH2/CH3 또한 서로 다른 면역 글로불린으로부터 유도될 수 있다. 본 발명은 또한 하나의 면역 글로불린으로부터의 VH 및 VL 및 다른 면역 글로불린으로부터의 VH 및 VL을 포함하는 다원 특이성(multispecific) 소체를 고려한다. 상기 소체의 가변 영역들 중 적어도 하나는 본원에 개시된 바와 같이 FR1 영역 내 시스테인 잔기들을 포함한다.
숙련된 기술자는 본원에서 제공되는 교시(teaching)와 함께 본 기술 분야에서 알려진 방법을 사용하여 본 발명의 소체를 용이하게 제조할 수 있다.
전술한 바를 바탕으로, 숙련된 기술자는 소체들이 단일 단백질 쇄 내에서 인코딩된 전체 면역 글로불린의 작은 형태(version)로, 항원 결합 영역, 이중 결합 분자 내로 조립(assembly)을 허용하는 CH3 도메인(또는 CH2 도메인) 및 이황화 연결들에 의한 이합화를 수용하는 면역 글로불린 힌지를 보유한다는 것을 이해할 것이다.
예시적인 소체들 및 그들의 제조 방법은 예로서 WO94/09817에 기재되어 있다.
단백질을 함유하는 다른 가변 영역
US5,731,168은 Fv 쌍(pair) 사이에서의 인터페이스가 재조합 세포 배양으로부터 회수된 이종 이합체(heterodimer)들의 함유율을 최대화하여 그에 의해 2-특이성(bi-specific) 단백질들을 제조할 수 있도록 조작된 분자들을 기재하고 있다. 바람직한 인터페이스는 적어도 하나의 CH3 도메인의 부분을 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 단밸직의 인터페이스로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄들은 더 큰 측쇄들(예를들면 티로신 또는 트립토판)로 대체될 수 있다. 큰 측쇄(들)에 대한 동일 또는 유사한 크기의 보상적(compensatory) "공동들(cavities)"은 작은 것들(예를들면 알라닌 또는 트레오닌)에 의해 큰 아미노산 측쇄들을 대체함으로써 제2 단백질의 인터페이스 상에 생성된다.
가변 영역들을 포함하는 2-특이성 단백질들은 교차-연결된(cross-linked) 또는 "이종접합(heteroconjugate)" 단백질들을 포함한다. 예로서, 이종 접합 내 단백질들의 하나는 아비딘(avidin)과, 다른 하나는 비오틴(biotin)과 커플될 수 있다. 그러한 단백질들은, 예로서 면역 시스템 세포들을 원치 않은 세포들에 대해 표적으로 하도록(target) 제안되어 왔다(US4,676,980). 가변 영역들을 포함하는 이종 접합 단백질은 어떠한 편의적 교차-연결 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 교차-연결제(cross-linking agents)들이 본 기술 분야에서 알려져 있고, 수많은 교차-연결 기술들과 함께 US4,676,980에 기재되어 있다.
가변 영역들을 포함하는 2-특이성 단백질들은 또한 화학적 연결을 이용하여 제조될 수 있다. Brennan(1985)은 비변형 항체들이 F('ab)2 단편들을 생산하기 위하여 단백질 분해적(proteolytically) 갈라지는(cleaved) 과정을 기재한다. 이러한 단편들은 디티올(dithiol) 복합제, 소듐 아르세나이트(sodium arsenite)의 존재하에 근접의(vicinal) 디티올을 안정화하고 분자간 이황화 형성을 방지하기 위하여 환원된다. 생성된 Fab' 단편들은 다음으로 티오니트로벤조에이트(thionitobenzoate(TNB)) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체들 중 하나는 다음으로 메르캅토에틸아민(mercaptoethylamine)에 의한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 다른 Fab'-TNB 유도체 동 몰량과 혼합되어 2-특이성 단백질을 형성한다.
진행은 가변 영역들을 포함하는 2-특이성 단백질들을 형성하기 위해 화학적으로 커플될 수 있는 E. coli로부터의 Fab'-SH 단편들의 직접적 회수(recovery)를 촉진하여 왔다. Shalaby(1992)는 완전히 인간화된 2-특이성 F(ab')2 분자의 제조를 기재한다. 각 Fab' 단편은 E.coli로부터 개별적으로 분비되었고 가변 영역들을 포함하는 2-특이성 단백질을 형성하도록 하기 위해 체외에서의 직접적인 화학적 커플링 하에 놓여졌다. 이에 따라 형성된 2-특이성 단백질은 관련된 항원 및 정상 인간 T 세포들을 발현하는 세포들에 결합될 수 있고, 나아가 인간 가슴 종양 타겟들에 대한 인간 세포 독성 림프구들의 분해 활성을 촉발할 수 있었다.
부가적인 가변 영역을 포함하는 단백질들은 예로서 도메인 항체들(dAbs) 및 그들의 융합체(fusions), 단일 쇄 Fab(예로서, Hust 외., 2007) 또는 Fab3(예로서, EP19930302894에 기재된 바와 같이)를 포함한다(예로서, US6248516에 기재된 바와 같이).
고정 도메인 융합체
본 발명은 가변 영역 및 고정 영역(예로서 Fc) 또는 그들의 도메인, 예로서 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 단백질들을 망라한다. 예로서, 본 발명은 소체(minibody)(앞서 논의된) 또는 scFv-Fc 융합체 또는 이원 항체-Fc 융합체 또는 삼원 항체-Fc 융합체 또는 사원 항체-Fc 융합체 또는 scFc-CH2 융합체 또는 이원 항체-CH2 융합체 또는 삼원 항체-CH2 융합체 또는 사원 항체-CH2 융합체 또는 scFv-CH3 융합체 또는 이원 항체-CH3 융합체 또는 삼원 항체-CH3 융합체 또는 사원 항체-CH3 융합체를 제공한다. 이러한 단백질들의 어느 것은 가변 영역 및 고정 영역 또는 고정 도메인 사이에서의 연결자, 바람직하게 면역 글로불린 힌지 영역을 포함할 수 있다.
여기 사용된 바로서, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 접합하는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이러한 힌지 영역은 약 25 잔기들을 포함하고 유연하며, 따라서 두 개의 N-말단 항원 결합 영역들이 독립적으로 이동하도록 한다. 힌지 영역들은 세 개의 구분되는 도메인들: 위, 중간 및 아래 힌지 도메인들로 하위 분류될 수 있다.
여기 사용된 바로서, 용어 "CH2 도메인"은, 예를들면 Kabat EU 넘버링 시스템에 따라 약 포지션들 231-340 사이로부터 확장되는 중쇄 면역 글로불린 분자의 부분을 포함한다. 두 개의 N-연결된 분지형(branched) 탄수화물 쇄들은 일반적으로 비변형 네거티브 IgG 분자의 두 개의 CH2 도메인들 사이에 끼워진다(interposed). 일 실시예에서, 본 발명의 단백질은 IgG1 분자(예로서 인간 IgG1 분자)로부터 유도된 CH2 도메인을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 단백질은 IgG4 분자(예로서 인간 IgG4 분자)로부터 유도된 CH2 도메인을 포함한다.
여기 사용된 바로서, 용어 "CH3 도메인"은, CH2 도메인의 N-말단, 예를들면 약 포지션 341-446b(Kabat EU 넘버링 시스템)으로부터, 약 110 잔기들을 확장하는 중쇄 면역 글로불린 분자의 부분을 포함한다. CH3 도메인은 전형적으로 면역 글로불린의 C-말단 부분을 형성한다. 어떤 면역 글로불린에서, 그러나 부가적인 도메인들은 분자의 C-말단을 형성하기 위해 CH3 도메인으로부터 확장할 수 있다(예를들면 IgM의 μ 쇄 및 IgE의 e 쇄 내 CH4 도메인). 일 실시예에서, 본 발명의 단백질은 IgG1 분자(예로서 인간 IgG1 분자)로부터 유도된 CH3 도메인을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 단백질은 IgG4 분자(예로서 인간 IgG4 분자)로부터 유도된 CH3 도메인을 포함한다.
본 발명의 단백질들을 제조하는데 유용한 고정 도메인 서열들은 많은 다른 소스들로부터 얻어질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 단백질의 고정 도메인 또는 그 일부는 인간 면역 글로불린으로부터 유도된다. 그러나 상기 고정 영역 또는 그 일부는, 예를들면 설치류(예로서, 마우스, 쥐, 토끼, 기니 피그) 또는 비인간 영장류(예로서, 침팬지, 마카쿠(macaque)) 종을 포함하는 다른 포유류 종의 면역 글로불린으로부터 유도될 수 있다. 나아가 고정 도메인 또는 그 일부는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE을 포함하는, 어떤 면역 글로불린 클래스, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 어떤 면역 글로불린 아이소타이프로부터 유도될 수 있다. 바람직한 예로서, 인간 아이소타이프 IgG1이 사용된다.
다양한 고정 영역 유전자 서열들(예를들면 인간 고정 영역 유전자 서열들)이 공개적으로 접근 가능한 기탁들의 형태에서 입수될 수 있거나 또는 그 서열은 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스로부터 입수될 수 있다. 고정 영역 도메인들은 특정 효과기 기능을 갖는(또는 특정 효과기 기능이 결여된) 또는 면역성을 감소시키기 위하여 특정한 변형을 가진 것으로 선택될 수 있다.
여기 사용된 바로서, 용어 "효과기 기능(effector function)"은 단백질들 및/또는 면역 시스템의 세포들에 결합하고 다양한 생물학적 효과들을 매개하는 Fc 영역 또는 그 일부(즉, CH2 도메인)의 기능적 능력으로 참조된다. 효과기 기능들은 항원-의존적 도는 항원-독립적일 수 있다. "항원-의존적 효과기 기능"은 보통 상응하는 항원에 대한 면역 글로불린의 결합에 따라 보통으로 유도되는 효과기 기능으로 참조된다. 전형적인 항원-독립적 효과기 기능들은 상보적 단백질(complement protein) (예를들면, C1q)에 결합하는 능력을 포함한다. 예로서, Fc 영역에 대한 상보성 C1 성분의 결합은 세포 병원균의 옵소니세이션(opsonisation) 및 분해를 유도하는 정통적인 상보 시스템, 상보적-의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity (CDCC)으로 참조되는 과정을 활성화한다. 상보성의 활성은 또한 염증 반응을 자극하여 자가 면역 과민성으로 발전될 수 있다. 다른 항원-의존적 효과기 기능들은, 세포들 상의 Fc 수용체들("FcRs")에 대한, 그들의 Fc 영역을 통한, 면역 글로불린의 결합에 의해 매개된다. IgG (감마 수용체들, 또는 IgλRs), IgE (입실론 감마 수용체들, 또는 IgεRs), IgA (알파 수용체들, 또는 IgαRs) 및 IgM (뮤 수용체들, or IgμRs)을 포함하는 면역 글로불린의 다른 클래스에 대해 특이적인 많은 Fc 수용체들이 있다. 세포 표면들 상에서 Fc 수용체들에 대한 면역 글로불린의 결합은, 면역 복합체들의 엔도시토시스(endocytosis), 면역 글로불린-코팅된 파티클들 또는 미세 기관들(microorganisms)의 섭식(engulfment) 또는 파괴(destruction)(또한 항체-의존적 식균 작용(antibody-dependent phagocytosis), 또는 ADCP로도 불리는), 면역 복합체들의 제거(clearance), 킬러 세포들에 의한 항체-코팅된 타겟 세포들의 분해(lysis)(항체-의존적 세포-매개의 세포 독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 또는 ADCC로 불리는), 염증성 매개체들의 방출(release), 면역 시스템 세포 활성의 조절, 면역 글로불린 생성물의 태반 전달(placental transfer) 및 조절을 포함하는, 많은 중요하고 다양한 생물학적 반응들을 촉발한다.
여기 사용된 바로서, 용어 "항원-독립적 효과기 기능"은 그것이 그것에 상응하는 항원에 결합되었는지에 상관없이, 면역 글로불린에 의해 유도될 수 있는 효과기 기능으로 참조된다. 전형적인 항원-독립적 효과기 기능들은 세포 이동(cellular tranport), 면역 글로불린의 반감기 및 제거율 순환, 및 정제의 촉진을 포함한다. 구조적으로 특별한 Fc 수용체, "신생아 Fc 수용체" 또는 "FcRn", 또한 구조(salvage) 수용체로 알려져 있는, 는 반감기 및 세포 이동을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 미생물 세포(예를들면, Staphylococcal 단백질 A 또는 G)로부터 정제된 다른 Fc 수용체들은 높은 친화력을 가지고 Fc 영역에 결합할 수 있고 Fc-함유 단백질의 정제를 촉진하는데 이용될 수 있다.
고정 도메인들은, 예를들면 폴리머라아제 쇄 반응 및 관심의 도메인을 증폭시키기 위해 선택된 프라이머들을 사용하여 복제될(cloned) 수 있다. 면역 글로불린 서열들의 클로닝은 예로서 US5,658,570에 기재되어 있다.
본 발명의 단백질은 다른 타입들의 어떤 수의 고정 영역 도메인들을 포함할 수 있다.
단백질의 고정 영역을 이루는 고정 영역 도메인들 또는 그들의 일부들은 다른 면역 글로불린 분자들로부터 유도될 수 있다. 예로서, 단백질은 IgG1 분자로부터 유도된 CH2 도메인 또는 그 일부 및 IgG3 분자로부터 유도된 CH3 도메인 또는 그 일부를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 본 발명의 단백질은 적어도 하나의 FcRn 결합을 부여하기에 충분한 Fc 영역을 포함한다. 예로서, FcRn에 결합된 Fc 영역의 일부는 Kabat 넘버링에 의한 IgG1의 약 282-438 아미노산들으로부터 포함한다.
일 예에서, 본 발명의 단백질은 그 내부 또는 그 안의 더 많은 고정 영역 도메인들이 부분적으로 또는 완전히 삭제된("도메인-삭제된 고정 영역들") 개조된 합성의 고정 영역을 포함한다. 본 발명은 또한 변형된 Fc 영역들 또는 그 개조된, 예를들면 향상 또는 감소된 효과기 기능을 갖는 부분들을 망라한다. 많은 그러한 변형된 Fc 영역들은 본 기술 분야에서 알려져 있으며, 예로서 US7217797; US7217798; 또는 US20090041770 (향상된 반감기를 갖는) 또는 US2005037000 (향상된 ADCC)에 기재되어 있다.
단백질에 대한 돌연변이
본 발명은 본 발명 단백질의 돌연변이 형태들의 사용을 고려한다. 예로서, 그러한 돌연변이 폴리펩티드는 본원에 개시된 서열과 비교되는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환들을 포함한다. 몇몇 예들에서, 폴리펩티드는 10 이하, 예를들어 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2의 보존적 아미노산 치환들을 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은 그 내부의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄 및/또는 수치료성(hydropathicity) 및/또는 친수성을 갖는 아미노산으로 대체되는 것이다.
바람직한 예로서, 돌연변이 단백질은 자연적으로 발생하는 단백질에 비교할 때 유일한, 또는 많아야 하나 또는 두 개 또는 세 개 또는 네 개의 아미노산 변화들을 포함한다. 보존적 아미노산 변화들의 상술은 하기에 제공된다. 숙련된 기술자에게 알려져 있는 바와 같이, 그러한 작은 변화들은 재조합 세포에서 발현될 때 폴리펩티드의 활성을 개조시키지 않기 위해 합리적으로 예측될 수 있다.
유사 측쇄들을 갖는 아미노산 잔기들의 군들은, 염기성 측쇄들(예를들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄들(예를들면, 아스파트산, 글루타민산), 하전 되지 않은 극성 측쇄들(예를들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄들(예를들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-분지형 측쇄들(예를들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄들(예를들면 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함하며, 본 기술 분야에서 정의되어 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 서열과 비교할 때 하나 이상의 삽입들 또는 삭제들을 고려한다. 어떤 예들에서, 폴리펩티드는 10 이하, 예를들어 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2의 삽입들 및/또는 삭제들을 포함한다.
시스테인 잔기들의 포지셔닝
본 발명은 어떤 실시예 또는 예에서 본원에 개시된 바와 같이 FR1 내 어떤 사이트에서의 시스테인 잔기들의 포지셔닝에 관심을 갖는다.
일 예로서, 본 발명은 골격 영역(FR) 1 내에 위치되는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하는 면역 글로불린 가변 영역을 포함하는 분리된 단백질을 제공하며, 그 내부에서 상기 시스테인 잔기들은 적어도 하나의 잔기가 화합물에 접합될 수 있도록 위치되고 및 만약 시스테인 잔기들 중 적어도 하나가 화합물에 접합되지 않는다면 이황화 결합이 상기 시스테인 잔기들 사이에 형성될 수 있다.
다른 예에서, 본 발명의 단백질은 골격 영역(FR) 1 내에 위치되는 적어도 두개의 시스테인 잔기들을 포함하는 면역 글로불린 가변 영역을 포함하는 분리된 단백질을 제공하며, 그 내부에서 상기 시스테인 잔기들은 적어도 하나의 잔기가 화합물에 접합될 수 있도록 위치되고 및 만약 시스테인 잔기들 중 적어도 두 개가 화합물에 접합되지 않는다면 이황화 결합이 상기 시스테인 잔기들 사이에 형성될 수 있다.
대안적인 또는 부가적인 예에서, 본 발명은 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 및 면역 글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 분리된 단백질을 제공하며, 가변 영역들의 적어도 하나가 골격 영역(FR) 1 내에 위치되는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하고, 그 내부에서 상기 시스테인 잔기들은 적어도 하나의 잔기가 화합물에 접합될 수 있도록 위치되고 및 만약 시스테인 잔기들 중 적어도 하나가 다른 화합물에 접합되지 않는다면 이황화 결합이 상기 시스테인 잔기들 사이에 형성될 수 있다.
대안적인 또는 부가적인 예에서, 본 발명은 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 및 면역 글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 분리된 단백질을 제공하며, 가변 영역들의 적어도 하나가 골격 영역(FR) 1 내에 위치하는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하고, 그 내부에서 상기 시스테인 잔기들은 적어도 하나의 잔기가 화합물에 접합될 수 있도록 위치되고 및 만약 시스테인 잔기들 중 적어도 두 개가 다른 화합물에 접합되지 않는다면 이황화 결합이 상기 시스테인 잔기들 사이에 형성될 수 있다.
본 발명의 상기 실시예 각각에서, 적어도 두 개 또는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들은 그들이 화합물에 접합될 수 있도록 위치된다.
본 발명의 일 예에서, 시스테인 잔기들은 FR1의 루프 영역 내에 위치한다. 본원에서 사용된 바로서, 용어 "FR1의 루프 영역"은 서로 연결되거나 결합하기 위해 FR1 의 두 개 영역들 및/또는 두 개 아미노산들에 유연성을 제공하는, 예를들면 베타 시트 내 두 개의 아미노산들이 서로 연결되거나 또는 결합할 수 있도록 충분한 유연성을 제공하는, FR1 내에서의 아미노산들의 서열을 의미하는 것으로 여겨질 것이다. FR1의 루프 영역은 CDR1의 부분이 아니다.
다른 실시예에서, FR1 내 시스테인 잔기들은 상기 잔기들 사이에서 이황화 결합의 형성을 허용할 수 있도록 위치된다.
"이황화 결합의 형성을 허용할 수 있도록 위치된다"는 것에 의해 두 개의 시스테인 잔기들이 단백질 내에서 상기 단백질이 폴드될 때 그들이 충분히 가까워서 이황화 결합이 잔기들 사이에서 형성될 수 있도록 위치되는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예로서, 두 개의 시스테인 잔기들 내 두 개의 탄소 원소들 사이의 거리는 서로 약 6-7Å 또는 서로 2-9Å, 서로 약 3.5-6.8Å와 같이, 예를들면 서로 약 4Å 내일 수 있다. 단백질 내에서 잔기들의 근접(proximity)을 예측하는 것 및/또는 이황화 결합 형성의 가능성을 예측하는 것은 숙련된 기술자에게 명확할 것이며 및/또는 본원에 기재될 것이다.
따라서, 일 예로서, 본 발명의 단백질은 골격 영역 (FR) 1 내에 위치하는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하며, 그 내부에서 상기 시스테인 잔기들은 서로 약 2-9Å 내, 바람직하게, 서로 약 6-7Å 내이다.
다른 실시예에서, 상기 시스테인 잔기들은 그들의 측쇄가 용매에 노출될 수 있는 단백질 내 잔기들에 위치된다. 용매 노출 또는 용매 접근성 표면 영역을 결정하는 방법은 본 기술 분야에서 알려져 있으며, 예로서 Shrake-Rupley 알고리즘 또는 LCPO 방법을 포함한다.
또 다른 예에서, 본 발명의 단백질은 골격 영역 (FR) 1 내에 위치하는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하며, 그 내부에서 상기 시스테인 잔기들은 그들의 측쇄들(바람직하게 그들의 티올 그룹들)이 용매에 노출될 수 있도록 위치된다.
"용매에 노출"에 의해 시스테인 잔기들의 측쇄들이, 폴드될 때 그들이 단백질이 존재하거나 부유된 용매와 접촉할 수 있도록 단백질의 표면 상에 있는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 바람직하게, 상기 측쇄들의 적어도 하나(또는 하나 또는 둘)는 용매에 충분히 노출되어 화합물이 거기에 접합될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 단백질은 적어도 두 개의, 하나 이상의, 바람직하게 두 개 이상의, 바람직하게 모두의 하기에 위치되는 시스테인 잔기들을 포함한다:
(i) 그들의 측쇄들이 서로를 향하여 굽어져 있도록 위치되는;
(ii) 그들의 측쇄 원소들이 용매에 노출되도록 위치되는; 및/또는
(iii) 그들의 Cα 탄소 원소들이 서로 약 6-7Å이 되도록 위치됨.
본 발명의 단백질들(어떤 하나의 또는 더 많은 본 발명의 예에 의해 본원에 개시된 바와 같이)은 따라서 골격 영역 (FR) 1 내에 위치하고 FR1 내에서 이황화 결합을 형성하고 대안적으로 화합물들의 화학정량적 접합을 위해 환원될 수 있는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 제공한다. 이러한 본 발명의 생성물들은 골격 영역(FR) 1 내에 위치하여 FR1 내에 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 제공하지 않는 다른 시스테인 접합 기술들(strategies)에 비해 장점을 갖는다. 이러한 앞선 및 비효율적인 기술들은 단일 시스테인 잔기들(Kim 외., 2008), C-말단 시스테인 잔기들(Sirk 외., 2008) 및 비변형 항체들 내 단일 시스테인 잔기들(Junutula 외., 2008)을 포함하며 이들 모두는 열악한 발현 수율, 가변적 접합 및 더 큰 스케일의 공정을 위한 복잡함을 가져온다. 나아가, 쇄간-이황화 결합들의 부분적 환원에 의해 시스테인 잔기들 상에 접합된 항체들은 가변적인 화학정량성(항체 당 0 내지 8 약(drug)) 및 잠재적으로 수율>100 종(species)을 갖는다(Junutula 외., 2008).
폴드된 단백질 내에서 루프들 및/또는 잔기들의 위치를 예측하는 방법은 숙련된 기술자에게 분명할 것이며, in silico 방법을 포함한다. 예로서, 단백질의 구조적 형태들(features)는 국가 건강 협회(National Institutes of Health), 8600 락빌 파이크(Rockville Pike), 베쎄다 MD(Bethesda MD) 20894의 생물공학 정보를 위한 국가 센터(National Center for Biotechnology Information (NCBI))의 웹사이트 상에서 입수될 수 있는 적합한 소프트웨어, 예로서 X-ray 결정학(crystallography) 및/또는 NMR 광분석학(spectroscopy)를 이용하여 결정되는 3차원의 생체 분자 구조들을 포함하는 NCBI 분자 모델링 데이터 베이스(Molecules Modelling Database (MMDB))를 사용하여 결정될 수 있다. NCBI 보존된 도메인 데이터 베이스(conserved domain database (CDD))는 알려진 Smart 및 Pham 콜렉션들로부터의 도메인들을 포함하고, 3D-구조 뷰어(Cn3D)에 대해 연결된다. NCBI 보존 도메인 구조 검색 툴(Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (CDART))은 그 도메인 구조에 의한 이웃하는 단백질들에 대해 예비 계산된 도메인 할당들(assignments)을 이용한다.
단백질 또는 펩타이드 이차 구조를 예측하기 위한 부가적인 방법들은 본 기술 분야에서 알려져 있고 및/또는 예로서 Moult, 1996; Chou 외., 1974; Chou 외., 1974; Chou 외., 1978; Chou 외., 1978; 또는 Chou 외., 1979에 기재되어 있다.
부가적으로, 컴퓨터 프로그램들이 단백질 또는 펩타이드 이차 구조를 예측하는데 보조하기 위해 현재 입수 가능하다. 이차 구조를 예측하는 그러한 방법은 상동 모델링에 기초한다. 예로서, 30% 보다 높은 서열의 동일성, 또는 40% 보다 높은 유사성을 갖는 두 개의 단백질들은 종종 유사한 구조적 토폴로지(structural topologies)를 갖는다. 단백질 구조적 데이터 베이스(protein structural database (PDB))의 최근 성장은, 단백질 구조 내 잠재적 폴딩 수를 포함하는, 이차 구조의 향상된 예측성을 제공한다(Holm 외., 1999). 예로서, 단백질 구조를 정하는 방법은 예로서 US20020150906에 기재되거나 컴퓨터 프로그램 또는 알고리즘, 예로서 MODELLER, (Sali 및 Blundell, 1993)을 사용한다. 이러한 기술들은 특정화된 구조를 갖는 단백질들의 서열들로 단백질의 서열을 정렬하는 것에 의한다. 그러한 정렬 알고리즘들은 본 기술 분야에서 알려져 있으며 예로서 BLAST at NCBI와 같은 소프트웨어 패키지를 통해 접근된다. 다음으로 구조적 정보, 즉 질의된 단백질의 3차 구조는 미리 특정된 단백질들 또는 펩타이드들 내에 정렬된 서열 또는 하위 서열들에 상응하는 구조적 정보를 기초로 하여 예측된다. 이러한 방법에서 면역 글로불린의 FR1 영역에 상응하는 단백질들의 3차 구조들의 라이브러리를 제작하는 것이 가능하다.
이차 구조를 예측하는 부가적인 방법들은, 예로서 "쓰레딩(threading)" (Jones, 1996), "프로파일 분석(profile analysis)" (Bowie 외, 1991; Gribskov 외., 1990; Gribskov 외., 1989), 및 "진화적 연결(evolutionary linkage)"을 포함한다. 통상적인 단백질 서열의 쓰레딩(threading)은 단백질의 3D 구조 스캐폴드를 예측하는데 이용된다. 전형적으로, 쓰레딩은 서열을 2차 구조 및 용매 노출과 같은 국지적 변수들과 함께 포함하는 스코어링(scoring) 성능을 사용하여, 단백질의 구조적 원형들(templates)(예를들면, Fv 또는 Fabs 또는 FR1의 알려진 구조)의 라이브러리에 대해 그것의 서열을 쓰레딩(또는 비교)함으로써 단백질의 폴딩을 할당하는 과정이다(Rost 외. 1997; Xu 및 Xu 2000; 및 Panchenko 외. 2000). 예로서, 상기 쓰레딩 과정은 아미노산 서열의 이차 구조 및 질의된 서열의 각 잔기에 대한 용매 접근성의 예측으로부터 시작한다. 예측된 구조의 결과적인 1차(1D) 프로파일이 알려진 3D 구조들의 라이브러리의 각 일원으로 꿰어진다(threaded). 각 서열-구조 쌍을 위한 최적의 쓰레딩이 동력학적 프로그램을 사용하여 얻어진다. 전반적으로 가장 좋은 서열-구조 쌍은 질의된 서열에 대해 예측되는 3D 구조를 구성한다. 본 발명의 경우에 쓰레딩은 그 이차 구조가 해결되어져 있는 많은 수의 면역 글로불린들의 Fv 및 Fab 단편들 때문에 비교적 간단하게 이루어진다.
두 개 이상의 시스테인 잔기들을 포함하는 단백질들의 경우에, 짝수의 시스테인 잔기들이 포함되는 것이 바람직하다, 예를들면 4 또는 6 또는 8 또는 10 시스테인 잔기들이 포함된다. 예로서, 상기 시스테인 잔기들은 짝지어진다, 즉 두 개의 잔기들의 조합들이 이황화 결합이 그들 사이에 형성되도록 배열된다.
바람직하게, 본 발명의 단백질은 비환원성 조건들 하에서 FR1 내 자유 티올을 포함하지 않고 및/또는 비환원성 조건들 하에서 다른 시스테인 잔기에 또는 화합물에 연결되지 않는 시스테인 잔기는 포함하지 않는다.
단백질 제조
돌연변이 유발
가변 영역들을 포함하는 단백질을 인코딩하는 DNA는 본 기술 분야에서 표준화된 방법들을 사용하여 분리된다. 예로서, 프라이머들은 관심 영역의 옆에 있는 가변 영역 내 보존된 영역들에 어닐하도록 설계되며, 다음으로 이러한 프라이머들은, 예를들면 PCR에 의해 중재하는 핵산을 증폭시키는 데에 사용된다. 적당한 방법들 및/또는 프라이머들은 본 기술 분야에 알려져 있고 및/또는, 예로서 Borrebaeck(ed), 1995 및/또는 Froyen 외., 1995에 기재되어 있다. 그러한 증폭 방법들에 대한 적당한 원형 DNA 소스들은, 예로서 융합 세포종들, 트랜스펙토마들(transfectomas) 및/또는 예를들면, 본원에 개시된 바와 같이 가변 영역을 포함하는 단백질들을 발현하는 세포들로부터 유도된다.
분리에 이어, DNA는 본 기술 분야에서 알려져 있는 다양한 방법들의 어느 것에 의해 요구되는 위치들에서 시스테인 잔기들을 포함하도록 변형된다. 이러한 방법들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 사이트-지향성의(또는 올리고뉴클레오티드-매개의) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 단백질을 인코딩하는 미리 준비된 DNA의 카세트(cassette) 돌연변이 유발에 의한 준비를 포함한다. 재조합 단백질들의 변형체(variants)들은 또한 제한 단편 조정(restriction fragment manipulation) 에 의해 또는 합성의 올리고뉴클레오티드로 오버랩 확대 PCR에 의해 제조될(constructed) 수 있다. 돌연변이 유발의 프라이머들은 시스테인 코돈 대체물(들)을 인코드한다, 예로서 시스테인을 인코딩하는 코돈(즉, TGT 또는 TGC)을 이루는 잔기들을 포함한다. 표준 돌연변이 유발 기술들은 그러한 돌연변이 DNA를 인코딩하는 DNA를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 일반적인 안내는 Sambrook 외 1989; 및/또는 Ausubel 외 1993에서 발견될 수 있다.
사이트-지향성의 돌연변이 유발은 치환 변형체들, 즉 돌연변이 단백질들을 준비하기 위한 하나의 방법이다. 이러한 기술은 본 기술 분야에서 알려져 있다(예로서, Carter 외 1985; Ho 외 1989; 및 Kunkel 1987 참조). 간단하게, DNA의 사이트-방향성의 돌연변이 유발을 수행하는데 있어서, 출발 DNA는 우선 단일 가닥의 그러한 출발 DNA에 바람직한 돌연변이를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드를 융합(예를들어, 하나 이상의 시스테인 인코딩 코돈들의 삽입)함으로써 개조될 수 있다. 융합 후에, 상기 융합된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고 및 상기 출발 DNA의 단일 가닥을 원형으로 사용하여, 완전한 제2 가닥을 합성하기 위해 DNA 폴리머라아제가 사용된다. 따라서, 바람직한 돌연변이를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드는 결과적인 이중 가닥된 DNA에 혼입된다. 사이트-지향성의 돌연변이 유발은 발현 플라스미드 내에서 돌연변이화되는 단백질을 발현하는 유전자 내에서 수행될 수 있고 결과적인 플라스미드는 바람직한 시스테인 대체 돌연변이들의 도입을 확인하기 위해 서열화될 수 있다. 사이트-지향성의 프로토콜들 및 포맷들은 상업적으로 입수 가능한 키트들, 예를들면 QuikChange®Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)를 포함한다.
PCR 돌연변이 유발은 또한 출발 단백질의 아미노산 서열 변형체를 제조하기에 적합하다, Higuchi, 1990; Ito 외 1991; Bernhard 외 1994; 및 Vallette 외 1989 참조. 간단하게, 소량의 DNA 원형이 PCR 내에서의 출발 물질로 사용될 때, 원형 DNA 내에서의 상응하는 영역으로부터의 서열과 약간 차이가 나는 프라이머들은, 그 프라이머들이 원형과 다른 위치들에서만 원형 서열과 차이가 나는, 비교적 대량의 특이적 DNA 단편을 제조하는데 사용될 수 있다.
변형체들, 카세트 돌연변이 유발을 제조하기 위한 또 다른 방법은 Wells 외, 1985에 의해 기재된 기술을 바탕으로 한다. 출발 물질은 돌연변이화될 출발 단백질 DNA를 포함하는 플라스미드(또는 다른 벡터)이다. 돌연변이화될 출발 DNA 내에서의 코돈(들)은 확인된다. 상기 확인된 돌연변이 사이트(들)의 각 사이드 상에는 특별한 제한 핵산 중간 분해 효소 사이트(restriction endonuclease site) 가 있어야 한다. 그러한 제한 사이트가 존재하지 않으면, 그들은 그들을 출발 DNA 내 적당한 위치로 도입시키는 상기 기재된 올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이 유발 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 상기 플라스미드 DNA는 그것을 선형화하는 사이트에서 절단된다. 제한 사이트들 사이에서 DNA의 서열을 인코딩하지만 바람직한 돌연변이(들)는 포함하지 않는 이중-가닥의 올리고뉴클레오티드는, 두 개의 올리고뉴클레오티드 가닥들이 각각 합성되고 다음으로 표준 공정을 사용하여 함께 융합되는 표준 공정을 사용하여 합성된다. 이러한 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드는 카세트로 참조된다. 이러한 카세트는 선형화된 플라스미드의 말단들에 부합하는 5' 및 3' 종점들(ends)을 갖도록 설계되어, 플라스미드에 직접적으로 결찰될(ligated) 수 있다. 이러한 플라스미드는 이제 돌연변이화된 DNA 서열을 함유한다. 인코딩된 시스테인 대체물들(replacements)을 함유하는 돌연변이 DNA는 DNA 서열화에 의해 확인될 수 있다.
단일 돌연변이들은 또한 이중 가닥의 플라스미드 DNA를 PCR 기반의 돌연변이 유발에 의한 원형으로 사용하는 올리고뉴클레오티드 지향된 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다(Sambrook 및 Russel, 2001; Zoller 외 1983; Zoller 및 Smith, 1982).
재조합 발현
재조합 단백질의 경우, 그것을 인코딩하는 핵산은 바람직하게 발현 벡터 내로 놓여지며, 다음으로 재조합 숙주 세포들 내에서 단백질들의 합성을 얻기 위하여, 숙주 세포들, 바람직하게 이황화 연결(bridge) 또는 결합을 제조할 수 있는 세포들, E. coli 세포들, 효모 세포들, 곤충 세포들, 유인원 COS 세포들, 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary)(CHO) 세포들, 또는 골수종(myeloma) 세포들과 같은, 포유류 세포들과 같은, 그렇지 않을 경우 면역 글로불린 단백질을 제조하지 않는, 내로 복제된다(transfected). Skerra 외, (1993) and Pluckthun, (1992). 을 포함하는, 면역 글로불린을 인코딩하는 DNA의 박테리아 내에서의 재조합 발현에 대한 기재들을 리뷰하라. 이러한 목적에 도달하기 위한 분자 복제 기술들은 본 기술 분야에서 알려져 있고, 예로서 Ausubel 또는 Sambrook에 기재되어 있다. 복제의 폭넓은 다양성 및 체외 증폭 방법들은 재조합 핵산들의 제조에 적합하다. 재조합 면역 글로불린들을 제조하는 방법들은 또한 본 기술 분야에 알려져 있다. US4,816,567; US5225539, US6054297, US7566771 또는 US5585089 참조.
분리에 이어, 본 발명의 단백질을 인코딩하는 핵산은 추가적인 복제(DNA의 증폭)를 위하여 또는 세포-자유 시스템 내 또는 세포들 내에서의 발현을 위하여 바람직하게 발현 구조 또는 반복 가능한(replicable) 벡터 내로 삽입된다. 바람직하게, 상기 핵산은 조작적으로(operably) 프로모터에 연결된다.
여기 사용된 바로서, 용어 "프로모터"는 그의 가장 넓은 문맥 내에서, TATA 박스 또는 개시 성분을 포함하는, 예를들면 발달상의 및/또는 외부의 자극에 반응하여, 또는 조직 특이적 방법으로 핵산의 발현을 개조시키는 부가적 조절 성분들(예를들면, 위 방향의(upstream) 활성화 서열들, 전사 인자 결합 사이트들(transcription factor binding sites), 인핸서들(enhancers) 및 슬라이서들(silencers))로 또는 이들의 부재 중에서, 정확한 전사 개시에 요구되는, 게놈 유전자의 전사적 조절 서열들을 포함한다. 본 문맥에서, 상기 용어 "프로모터"는 또한 그것이 조작적으로 연결되는 핵산의 발현을 부여하고, 활성화하며 또는 향상시키는 재조합, 합성의 또는 융합 핵산, 또는 유도체를 기재하기 위해 사용된다. 바람직한 프로모터들은 나아가 상기 핵산의 발현을 향상시키고 및/또는 공간적 발현 및/또는 임시적 발현을 개조(alter)하기 위하여 하나 이상의 특이적 조절 성분들의 부가적인 복제들을 포함할 수 있다.
여기 사용된 바로서, 용어 "조작적으로(operably) 연결된"은 핵산의 발현이 프로모터에 의해 조절될 수 있도록 핵산에 대하여 프로모터을 포지셔닝하는 것을 의미한다.
세포 자유 발현 시스템들은 또한 본 발명에 의해 고려된다. 예로서, 본 발명의 단백질을 인코딩하는 핵산은 적합한 프로모터, 예를들어 T7 프로모터에 조작적으로 링크되어 전사 및 번역에 충분한 환경에 노출되는 발현 구조를 도출한다. 체외 발현 또는 세포 자유 발현을 위한 전형적인 발현 벡터들이 기재되어 왔으며, TNT T17 및 TNT T3 시스템들(Promega), pEXP1-DEST 및 pEXP2-DEST 벡터들 (Invitrogen)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포들 내 발현을 위한 많은 벡터들이 입수 가능하다. 벡터 성분들은 일반적으로 하나 이상의 하기를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 신호 서열, 본 발명의 단백질을 인코딩하는 서열(예를들면 본원에서 제공되는 정보로부터 유도된), 인핸서 성분, 프로모터, 및 전사 종결 서열. 숙련된 기술자는 단백질 발현에 적합한 서열들을 알고 있을 것이다. 예로서, 예시적인 신호 서열들은 원핵 생물 분비 신호들(prokaryotic secretion signals) (예를들면, pelB, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase), 페니실리나제(penicillinase), Ipp, 또는 열-안정성 장독소(heat-stable enterotoxin) II), 효모 분비 신호들(yeast secretion signals) (예를들면, 전화 효소 리더(invertase leader), α factor leader, 또는 산 포스파타제 리더(acid phosphatase leader)) 또는 포유류 분비 신호들(mammalian secretion signals) (예를들면, 단순 포진(herpes simplex) gD 신호)를 포함한다.
예시적인 프로모터들은 원핵 생물들에서 활성인 것(예를들면, phoA 프로모터, β-락타마제(lactamase) 및 락토스 프로모터 시스템들, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase), 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 tac 프로모터와 같은 융합 프로모터들) 들을 포함한다. 이러한 프로모터는 Gram-네가티브 또는 Gram-포지티브 기관들, 예로서, B. subtilis 및 B. licheniformis와 같은 바실리(Bacili), P. aeruginosa와 같은 Pseudomonas, 및 Streptomyces 뿐만 아니라, 예를들면 E. coli의 Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, 예를들면 Salmonella typhimurium의 Salmonella, 예를들면 Serratia marcescans의 Serratia, 및 Shigella와 같은 장내 세균 분해 효소(Enterobacteriaceae)와 같은 유박테리아(eubacteria)를 포함하는 원핵 생물 내에서의 발현에 유용하다. 바람직하게, 숙주는 E. coli이다. E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC 31,537), 및 E. coli W3110 (ATCC 27,325), DH5α 또는 DH10B와 같은 다른 가닥들이 적합하기는 하지만, 하나의 바람직한 E. coli 복제 숙주는 E. coli 294(ATCC 31,446)이다.
포유류 세포들 내에서 활성인 예시적인 프로모터들은 거세포 바이러스 (cytomegalovirus) 즉석 초기 프로모터(immediate early promoter) (CMV-IE), 인간 연장 인자(human elongation factor) 1-a 프로모터 (EF1), 소핵(small nuclear) RNA 프로모터들 (U1a 및 U1b), α-미오신 중쇄 프로모터(α-myosin heavy chain promoter), 유인원 바이러스 40 프로모터(Simian virus 40 promoter) (SV40), 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스 프로모터 (RSV), 아데노바이러스(Adenovirus) 주요 후기 프로모터(major late promoter), β-액틴 프로모터(β-actin promoter); CMV 인핸서/β-액틴 프로모터를 포함하는 융합 조절 성분(hybid regulatory element) 또는 면역 글로불린 프로모터 또는 그것의 활성 단편을 포함한다. 유용한 포유류 숙주 세포계들(cell lines)의 예는 SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 변형된 원숭이 신장(monkey kidney) CV1 라인; 인간 배세포 신장 라인(human embryonic kidney line (부유 배양 내에서의 성장을 위해 하위 복제된(subcloned) 293 또는 293 세포들) ; 어린 햄스터 신장 세포들(baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10); 또는 중국 햄스터 난소 세포들(Chinese hamster ovary cells (CHO)이다.
예로서 Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae 및 S. pombe을 포함하는 그룹으로부터 선택된 효모 세포와 같은 효모 세포들 내에서의 발현에 적합한 전형적인 프로모터들은, 이에 한정되는 것은 아니나, ADH1 프로모터, GAL1 프로모터, GAL4 프로모터, CUP1 프로모터, PHO5 프로모터, nmt 프로모터, RPR1 프로모터, 또는 TEF1 프로모터이다.
곤충 세포들 내에서의 발현에 적합한 프로모터들은, 이에 한정되는 것은 아니나, OPEI2 프로모터, Bombyx muri로부터 분리된 곤충 액틴 프로모터, Drosophila sp. dsh 프로모터(Marsh 외 2000) 및 유도성의(inducible) 메탈로티오닌(metallothionein) 프로모터 이다. 재조합 단백질들의 발현에 바람직한 곤충 세포들은 BT1-TN-5B1-4 세포들, 및 Spodoptera frugiperda 세포들 (e.g., sf19 세포들, sf21 세포들)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 곤충 세포를 포함한다. 핵산 단편들의 발현에 적합한 곤충들은, 이에 한정되는 것은 아니나 Drosophila sp. 이다. S. frugiperda 의 사용 역시 고려된다.
분리된 핵산 분자 또는 그것을 포함하는 유전자 구조를 발현을 위한 세포 내로 도입하는 방법은 본 기술 분야의 숙련된 자들에게 알려져 있다. 주어진 세포를 위해 사용되는 기술은 공지의 성공적인 기술들에 의존된다. 재조합 DNA를 세포들 내로 도입하는 수단들은 미세 주입, DEAE-덱스트란에 의해 매개되는 트랜스펙션(transfection), 리포펙타민(Gibco, MD, USA) 및/또는 셀펙틴(cellfectin)(Gibco, MD, USA)을 이용하는 것에 의하는 것과 같은 리포솜들에 의해 매개되는 트랜스펙션(transfection), PEG-매개된 DNA 섭취, 전기 천공법(electroporation) 및 다른 것들 중에서도 DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 입자들(Agracetus Inc., WI, USA)를 이용하는 것에 의하는 것과 같은 미세 입자 폭발법(micropartocle bombardment)을 포함한다.
본 발명의 단백질을 생산하는 숙주 세포들은, 이용되는 세포 형태에 따라 다양한 배지들에서 배양될 것이다. 통상적으로 입수 가능한 Ham's Fl0 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMl-1640 (Sigma), 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma)과 같은 배지들이 포유류 세포들을 배양하기에 적합하다. 다른 세포 형태들을 배양하기 위한 본원에서 논의된 배지들은 본 기술 분야에 알려져 있다.
단백질의 분리
본 발명의 단백질은 바람직하게 분리된다. "분리되는(isolated)" 것은 단백질이 실질적으로 정제되는 또는 그것의 자연적으로 발생되는 환경으로부터, 예를들면 이종 기원의(heterologous) 환경에 있는 것으로부터 제거되는 것을 의미한다. "실질적으로 정제되는" 것은 단백질이 실질적으로 오염시키는 제재들이 없는 것, 예를들면 적어도 약 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 오염시키는 제재들이 없는 것을 의미한다.
본 발명의 단백질을 정제하는 방법들은 본 기술 분야에 알려져 있고 및/또는 본원에 개시된다.
재조합 기술들을 사용할 때, 본 발명의 단백질은 세포 내부에서(intracellularly), 플라스미드 주위(periplasmid) 공간 내에서 제조되어, 또는 직접적으로 배지로 분비될 수 있다. 단백질이 세포 내부적으로 제조되면, 제1 단계로서, 특정 잔해(debris), 숙주 세포들 또는 분해된 단편들은 예를들면, 원심 분리 또는 초여과(ultrafiltration)에 의해 제거된다. Carter 외. (1992)는 E.Coli의 플라스미드 주위 공간으로 분비된 항체들을 분리하는 과정을 기재한다. 간단하게, 세포 페이스트가 소듐 아세테이트(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(phenylmethylsulfonylfluoride, PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 녹여진다(thawed). 세포 잔해는 원심 분리에 의해 제거될 수 있다. 단백질이 배지로 분비되면, 그러한 발현 시스템들로부터의 상청액들은 일반적으로 통상적으로 입수 가능한 단백질 농축 여과, 예로서 Amicon 또는 Millipore Pellicon 초세정 유닛을 사용하여 우선 농축된다. PMSF와 같은 단백질 분해 효소(protease) 저해제가 단백질 분해를 저해하기 위해 상기 단계들 중 어느 것에 포함될 수 있으며 항생 물질들이 우연한 오염원들의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포들로부터 제조된 단백질은 예로서, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)가 바람직한 정제 기술인, 하이드록실 아파티트(hydroxyl apatite) 크로마토그래피, 겔 전기영동(gel electrophoresis), 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 단백질 A의 친화성 리간드로서의 적합성은 종(species) 및 단백질 내에 존재하는 면역 글로불린 Fc 도메인(만약 존재한다면)의 아이소타입(isotype)에 의존한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄들(Lindmark 외. 1983)을 기반으로 하는 면역 글로불린들을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 G가 모든 마우스 아이소타입들에 대하여 및 인간 γ3(Guss 외. 1986)에 대하여 추천된다. 그렇지 않을 경우 친화성 정제(affinity purification)가 본 발명의 단백질 내 가변 영역이 결합하는 또는 일어나는 항원 또는 항원 결정기적(epitopic) 결정자를 사용하여 수행될 수 있다. 친화성 리간드가 붙은 매트릭스는 가장 흔히 아가로스이나, 다른 매트릭스들도 가능하다. 조절된 포어 글래스 또는 폴리(스티렌디비릴)벤젠(poly(styrenedivinyl)benzene)과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스들은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 흐름률 및 더 짧은 공정 시간에 대해 허용된다. 이온 교환 컬럼 상 분류, 에탄올 침전, 역상 HPLC(Reverse Phase HPLC), 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 레진(폴리아스파트산 컬럼(a polyaspartic acid column)과 같은) 상의 헤파린 SEPHAROSETM 크로마토그래피 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술들이 또한 제거되는 단백질에 따라 사용 가능하다.
숙련된 기술자는 또한 본 발명의 단백질이 정제 또는 검출을 촉진시키기 위한 태그, 예를들면 폴리-히스티딘 태그, 예를들면 헥사-히스티딘 태그, 또는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 태그 또는 유인원 바이러스 5(Simian Virus 5(V5)) 태그, 또는 FLAG 태그, 또는 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그를 포함하도록 변형될 수 있음을 알 것이다. 바람직하게, 상기 태그는 헥사-히스 태그이다. 상기 도출된 단백질은 다음으로 친화성 정제와 같은, 본 기술 분야에서 알려진 방법들을 사용하여 정제된다. 예로서, 헥사-히스 태그를 포함하는 단백질은, 고체 또는 세미 고체 서포트 상에 고정된 헥사-히스 태그에 특이적으로 결합하는 니켈-니트릴로트리아세트산(nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA)과 상기 단백질을 포함하는 샘플을 접촉시키고, 결합되지 않는 단백질을 제거하기 위해 상기 샘플을 세척하며, 후속적으로 고정된 단백질을 용리함으로써 정제된다. 대안적으로, 또는 부가적으로 태그에 결합하는 리간드 또는 항체가 친화성 정제법에서 사용된다.
어떤 예비적인 정제 단계(들)에 이어, 본 발명의 단백질 및 오염원들을 포함하는 혼합물은 낮은 pH 소수성 상호 작용 크로마토그래피(low pH hydrophobic chromatography) 하에 놓여질 것이다.
단백질 합성
본 발명의 단백질은 그것의 결정되는 아미노산 서열로부터 표준화된 기술들, 예를들면 BOC 또는 FMOC 화학(FMOC chemistry)을 사용하여 용이하게 합성된다. 합성 펩타이드들은 고체 상, 액체 상, 또는 펩타이드 응축, 또는 이들의 어떤 조합의 알려진 기술들을 사용하여 제조되며, 자연적 및/또는 비자연적인 아미노산들을 포함할 수 있다. 펩타이드 합성에 사용되는 아미노산들은 Merrified, 1963의 고유 고체 상 공정의 탈보호(deprotecting), 중성화, 커플링 및 세척 프로토콜들을 갖는 표준 Boc (Nα-아미노 보호된 Nα-t-부틸옥시카보닐(Nα-amino protected Nα-t-butyloxycarbonyl)) 아미노산 레진, 또는 Carpino 및 Han, 1972에 의해 기재된 염기-불안정성의 Nα-아미노 보호된 9-플루오레닐메톡시카보닐(Nα-amino protected 9-fluorenylmethoxycarbonyl, Fmoc) 아미노산들일 수 있다. Fmoc 및 Boc Nα-아미노 보호된 아미노산들 모두는, 예로서 Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem, or Peninsula Labs과 같은, 다양한 통상의 소스들로부터 얻어질 수 있다.
접합
본 발명은 또한 어떤 실시예에 의해 본원에 개시된 단백질의 접합을 제공한다. 단백질이 접합될 수 있는 화합물들의 예는 방사성 동위원소, 검출 가능한 지표, 치료적 화합물, 콜로이드, 독소, 핵산, 펩타이드, 단백질, 피험자 내에서 단백질의 반감기를 증가시키는 화합물 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물이다. 예시적인 치료적 제재들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 항-맥관형성(anti-angiogenic) 제, 항-신혈관신생 및/또는 다른 혈관화제, 항-증식제, 프로-아폽토틱(apoptotic)제, 화학 요법제 또는 치료적 핵산이다.
독소는 세포들에 대해 해로운(예로서 죽이는) 어떤 제재를 포함한다. 본 기술 분야에서 알려져 있는 이러한 클래스의 약물들, 및 그들의 기작 메카니즘의 기재에 대해서는 Goodman 외, Goodman 및 Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Ed., Macmillan Publishing Co., 1990을 참조한다. 면역 글로불린-면역 독소 접합체들(immunoglobulin-immunotoxin conjugates)의 제조와 관련된 부가적인 기술들은 예로서 Vitetta(1993) 및 US5,194,594에 제공된다. 예시적인 독소들은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(exotoxin A chain)(Pseudomonas aeruginosa로부터의), 리신 A 쇄, 아브린(abrin) A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사신(sarcin), Aleurites fordii 단백질들, 디안틴(dianthin) 단백질들, Phytolaca americana 단백질들(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모디카 카라니타(momordica charantia) 저해제, 커신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 리스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테신(tricothecenes)이다. 예로서 WO93/21232 참조.
본 발명의 면역 접합체들을 형성하기에 적합한 화학 요법제들은 택솔(taxol), 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 이메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜키신(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미토크신트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 액티온마이신 D(actinomycin D), 1-디-하이드로테스토스테론(1-de-hydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라노롤(propranolol), 및 퓨로마이신(puromycin), 대사 길항 물질들(antimetabolites) (메토트렉세이트(methotrexate), 6-메르캅도퓨린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 플루다라빈(fludalabin), 5-플로오로우라실(5-fluorouracil), 데카바진(decarbazine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 아스파라기나제(asparaginase), 젬시타빈(gemcitabine), 클래드리빈(cladribine)과 같은), 알킬레이팅제들(메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파(thioepa), 클로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카뮤스틴(carmustine) (BSNU), 로뮤스틴(lomustine) (CCNU), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 다카바진(dacarbazine) (DTIC), 프로카바진(procarbazine), 미토마이신 C(mitomycin C), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin)과 같은 다른 백금 유도체와 같은), 항생 물질들 (닥티노마이신(dactinomycin) (이전의 액티노마이신(actinomycin)), 블레오마이신(bleomycin), 다우노루비신(daunorubicin) (이전의 다우노마이신(daunomycin)), 독소루비신(doxorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 미토크산트론(mitoxantrone), 필리카마이신(pilicamycin), 안트라마이신(anthramycin) (AMC)과 같은)을 포함한다.
맥관발생 저해제들(angiogenesis inhibitors)(anti-angiogenic agents) 의 적합한 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 우로키나제 저해제들(urokinase inhibitors), 매트릭스 메탈로프로테아제 저해제들(matrix metalloprotease inhibitors) (마리마스태트(marimastat), 네오바스태트(neovastat), BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 및 유사 제재들과 같은), 내피 세포 이동 및 증식 저해제들(TNP-470, 스쿠알라민(squalamine), 2-메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol), 콤브레타스타틴(combretastatins), 엔도스타틴(endostatin), 안지오스타틴(angiostatin), 페니실라민(penicillamine), SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) 및 유사 제재들과 같은), 맥관발생 성장 인자 길항제들(ZD6474, SU6668, 길항제들에 대한 항체들(antibodies against angiogenic agents) 및/또는 그들의 수용체들(VEGF, bFGF, 및 앤지오포이에틴-1(angiopoietin-1)과 같은), 탈리도마이드(thalidomide), 탈리도마이드(thalidomide) 유사물들(CC-5013와 같은), Sugen 5416, SU5402, 항맥관발생 리보자임(antiangiogenic ribozyme)(앤지오자임(angiozyme)과 같은), 인터페론-α(인터페론-α와 같은), 수라민(suramin) 및 유사 제재들), VEGF-R 키나아제 저해제들 및 다른 항-맥관발생 티로신 키나아제 저해제들(SU011248와 같은), 내피-특이적 인테그린(integrin)/생존 신호의 저해제들(비탁신(vitaxin) 및 유사 제재들과 같은), 구리 길항제들/킬레이터들(테트라티오몰립데이트(tetrathiomolybdate), 캡토프릴(captopril) 및 유사 제재들과 같은), 카복실아미도-트리아졸(carboxyamido-triazole) (CAI), ABT-627, CM101, 인터루킨-12 (IL-12), IM862, PNU145156E 및 맥관형성을 저해하는 뉴클레오티드 분자들(역배열(antisense)-VEGF-cDNA, 앤지오스타틴(angiostatin)에 대해 코딩하는 cDNA, p53에 대해 코딩하는 cDNA 및 부족한 VEGF 수용체-2에 대해 코딩하는 cDNA) 및 유사 제재들을 포함한다. 맥관형성, 신혈관신생, 및/또는 다른 혈관신생 저해제의 다른 예들은, 항-맥관형성 헤파린 유도체들(angiogenic heparin derivatives) 및 관련 분자들(예로서, 헤페리나제 III(heperinase III)), 테모졸로마이드(temozolomide), NK4, 마트로파지 이동 저해 인자(macrophage migration inhibitory factor) (MIF), 시클로옥시지나제-2 저해제들(cyclooxygenase-2 inhibitors), 히폭시아-유도 인자 1 저해제들(inhibitors of hypoxia-inducible factor 1), 항-맥관형성 소이 이소플라본들(anti-angiogenic soy isoflavones), 올티프라즈(oltipraz), 푸마질린(fumagillin) 및 그 유사물들, 소마토스타틴 유사물들(somatostatin analogues), 펜토산 폴리설페이트(pentosan polysulfate), 테코갈란 소듐(tecogalan sodium), 달테파린(dalteparin), 튬스타틴(tumstatin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), NM-3, 콤브레스타틴(combrestatin), 칸스타틴(canstatin), 아마스타틴(astatin), 다른 관련 타겟들에 대한 항생 물질들(항-알파-v/베타-3 인테그린 및 항-키니노스타틴 mAbs) 및 유사 제재들이다.
일 예로서, 어떤 실시예에 의해 본원에 개시된 단백질은, 본 발명의 다른 단백질 또는 예를들면 본원에 개시된 바와 같이, 면역 글로불린 또는 그로부터 유도된 단백질과 같은 면역 글로불린 가변 영역을 포함하는 단백질을 포함하는, 다른 단백질에 접합 또는 연결된다. 다른 단백질들은 배제되지 않는다. 부가적인 단백질들은 숙련된 기술자에게 명확할 것이고, 예로서 면역 조절자 또는 반감기 연장 단백질 또는 펩타이드 또는 다른 것들 중에서도 세럼 알부민에 결합하는 다른 단백질을 포함한다.
예시적인 면역 조절자들은 사이토킨들(cytokines) 또는 키모킨들(chemokines)을 포함한다. 용어 "사이토킨"은 세포 내부의 매개체들로서 다른 세포 상에서 활동하는 하나의 세포 군집에 의해 방출되는 단백질들 또는 펩타이드들에 대한 유전적 용어이다. 사이토킨들의 예들은 림토킨들, 모노킨들, 성장 인자들 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬들을 포함한다. 사이토킨들 중에 포함되는 것은 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 보빈 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬들; 파라티로이드(parathyroid) 호르몬, 티록신, 인슐린, 프로인슐린, 릴락신(relaxin), 프로릴락신(prorelaxin), 폴리클 자극 호르몬(FGH), 티로이드 자극 호르몬(TSH) 및 황체 형성 호르몬(LH), 헤파틱 성장 인자와 같은 당단백질 호르몬들; 프로스타글란딘, 피브로블라스트 성장 인자, 프로락틴(prolactin), 태반 유선자극제(placental lactogen), OB 단백질, 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮐러 의태(mullerian)-저해 물질, 고나도트로핀(gonadotropin)-관련 펩타이드, 인히빈(inhibin), 엑티빈(activin), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor), 인테그린, 트롬보포이틴(thrombopoietin(TPO)), NGF-B와 같은 신경 성장 인자들, 혈소판-성장 인자, TGF-α및 TGF-β와 같은 변환 성장 인자들(transforming growth factor)(TGFs), 인슐린-유사 성장 인자-I 또는 -II, 에리트로포이틴(erythropoietin(EPO)), 골 유도 인자들(osteoinductive factor), 인터페론-α, -β 또는 -γ와 같은 인터페론들; 대식세포-CSF(M-CSF), 과립성 백혈구(granulocyte)-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립성 백혈구-CSF(G-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자들(CSFs), IL-1, IL-lα IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-9, IL-IO5 IL-Il, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21 및 LIF와 같은 인터루킨(ILs)이다.
키모킨들(chemokines)은 일반적으로 면역 효과기 세포들을 키모킨 발현 사이트에 조달하는 화학유인물질들(chemoattractants)로 작용한다. 키모킨들은, 이에 제한되는 것은 아니나, RANTES, MCAF, MIP1-알파 또는 MIP1-베타를 포함한다. 숙련된 기술자는 어떤 키모킨들이 또한 화학유인물질 효과들을 가지는 것으로 알려져 있으며, 또한 용어 키모틴들 하에 분류될 수 있다는 것을 인식하고 있을 것이다.
예시적 혈청 알부민 결합 펩타이드들 또는 단백질은 US20060228364 또는 US20080260757에 기재되어 있다.
다양한 방사성 뉴클레오티드들이 방사성 접합된 단백질들의 제조에 이용될 수 있다. 예는, 그러나 이에 제한되는 것은 아닌, 13C, 15N, 2H, 1251, 1231, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, 111In 등의 낮은 에너지 방사성 핵들(예를들면, 진단 목적에 적합한)을 포함한다. 바람직하게, 방사성 핵종은 투여(administration) 및 이미징 사이트에의 배치(localization) 사이의 경과된 시간 후 활성 및 검출을 허용하기에 충분한 반감기를 갖는 감마, 광전자, 또는 양전자-방출 방사성 핵종이다. 본 발명은 또한 1251, 1311, 1231, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 등의 높은 에너지 방사성 핵들(예를들면, 치료적 목적의)을 포함한다. 이러한 동위 원소들은 전형적으로 짧은 경로 길이를 갖는 높은 에너지 α- 또는 β-파티클들을 생산한다. 그러한 방사성 핵종들은 바로 가까이에 있는 세포들, 예로서 그것에 접합이 붙거나 도입된 신생성 세포들을 죽인다. 그들은 비-국지화된(non-localized) 세포 상에서 적은 또는 효과를 가지지 않으며 본질적으로 비-면역성이다. 대안적으로, 고-에너지 동위 원소들은 예로서 보론 중성자-포획 치료법(boron neutron -capture therapy)(Guan 외, 1998)에서와 같이, 그렇지 않을 경우 안정한 동위 원소의 열적 조사에 의해 생성될 수 있다.
다른 실시예에서, 단백질은, 그 접합체가 환자에 대해 투여되고, 세정 제재를 사용하는 순환으로부터 비결합 접합체의 제거 및 다음으로 치료적 제재(예를들면, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드"(예를들면, 아비딘)의 투여가 이어지는, 세포 예비 타겟팅에서의 사용을 위해 "수용체"(스트렙타비딘과 같은)에 접합된다.
본 발명의 단백질들은 본 기술 분야에서 알려져 있으며 용이하게 입수 가능한 부가적인 비단백질적 조각들(moities)을 포함하도록 변형될 수 있다. 바람직하게, 단백질의 유도체화에 적합한 상기 조각들은 수용성 폴리머이다. 수용성 폴리머들의 비제한적 예는, 그러나 이에 한정되지 않는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알콜(PVA), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체들, 카복실메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레익 무수물 공중합체, 폴리아미노산들(단독 중합체들 또는 랜덤 공중합체들), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜(PPG) 단독 중합체들, 프로일프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체들, 폴리옥시에틸레이티드 폴리올들(예를들면, 글리세롤; POG), 폴리비닐 알콜, 및 그들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인하여 제조시 장점을 갖는다.
상기 폴리머는 전형적으로 예로서 약 2 내지 약 1000, 또는 약 2 내지 약 300의 반복 단위들을 갖는 것으로 특정된다.
예로서 PEG에 제한되는 것이 아닌, 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO), 폴리옥시에틸렌(POE), 폴리비닐 알콜, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 또는 덱스트란을 포함하는, 수용성 폴리머들은 통상적으로 단백질들에 접합되어 단백질의 안정성 또는 크기 등을 증가시킨다.
PEG, PEO 또는 POE는 에틸렌 옥사이드의 올리고머 또는 폴리머로 참조된다. PEG의 경우에, 이러한 올리고머들 또는 폴리머들은 예를들면, 에폭시 고리 상의 하이드록사이드 이온의 친핵성 공격에 의해 개시되는 에틸렌 옥사이드의 음이온성 고리 개시 중합에 의해 제조된다. 단백질 변형에 대해 PEG의 가장 유용한 형태들 중 하나는 모노메톡시 PEG(mPEG)이다.
바람직한 PEGs는 단분산 또는 다분산성이며, 바람직하게 단분산성이다. 숙련된 기술자는 PEG가 다분산성 또는 단분산성일 수 있다고 알고 있을 것이다. 다분산성 PEG는 다른 분자량들을 갖는 PEGs 혼합물들을 포함한다. 다분산성 PEGs의 경우에, 특정 분자량에 대한 참조는 혼합물 내 PEGs의 수평균 분자량으로 참조되는 것으로 이해될 것이다. 사이즈 분산은 통계적으로 질량 평균 분자량(MW) 및 그것의 수평균 분자량(Mn)에 의해 특정되어지며, 그 비율이 다분산도(polydispersity) 지표(Mw/Mn)이라 불리는 것이다. 어떤 관점에서, 질량 분광기에 의해 MW 및 Mn은 측정된다. 대부분의 PEG-단백질 접합체들은, 특히 1KD 보다 큰 PEG에 접합된 것들은 모 PEG 분자의 다분산성 성질로 인하여 넓은 범위의 분자량들을 나타낸다. 예로서, mPEG2K(Sunbright ME-020HS, NOF)의 경우, 실질적인 분자 질량들은 1.36의 다분산도 지표를 갖는 1.5~3.0KD 범위에 걸쳐 분산되어 있다.
상기 내용을 바탕으로, 숙련된 기술자는 단분산성 PEG가 실질적으로 같은 분자량을 갖는 PEGs의 혼합물을 포함한다는 것을 알 것이다. 단분산성 PEGs는 예로서, Polypure AS, 노르웨이로부터 통상적으로 입수 가능하다.
PEG의 평균 또는 바람직한 분자량은 약 500Da 내지 약 200 kDa의 범위이다. 예로서, PEG의 분자량은 약 1 내지 약 100 kDa, 약 1.5 내지 약 50 kDa, 약 1.5 내지 약 10 kDa, 약 1.5 kDa 내지 약 5 kDa, 약 1.5 kDa 내지 약 kDa, 약 1.5 내지 약 2 kDa이다.
바람직하게, 상기 PEG는 단분산성이며 약 500Da의 분자량을 갖는다. 바람직하게, 상기 PEG는 약 1.5 kDa의 분자량을 갖는다. 바람직하게, 상기 PEG는 약 2 kDa의 분자량을 갖는다.
바람직하게, 상기 PEG는 말레이미드 그룹과 같은 반응성 그룹을 포함한다. 바람직하게, 상기 PEG는 PEG24-말레이미드이다.
생리학적으로 허용되는 폴리머는 특정 구조에 제한되는 것이 아니며, 다양한 관점에서, 선형(예를들면, 알콕시 PEG 또는 2 기능성 PEG), 분지형 또는 다중-팔뻐쳐진(armed)(예를들면, 포크형 PEG 또는 폴리올 코어에 붙은 PEG), 덴트리틱(dentritic), 또는 분해 가능한 연결들(linkages)을 갖는다. 나아가, 상기 폴리머의 내부 구조는 많은 수의 다른 형태들로 구조화되며, 단독 중합체, 교차 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교차 삼합체, 랜덤 삼합체, 및 블록 삼합체로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
단백질에 붙은 폴리머들의 수는 다양할 수 있으며, 하나 이상의 폴리머가 붙는다면, 그들은 동일 또는 다른 분자들일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 폴리머들의 수 및/또는 형태는, 이에 제한되는 것은 아니나, 그 단백질 유도체가 정의된 조건들 하에서의 치료에 사용되는 등에서 단백질의 특정 성질 또는 기능이 향상되는지를 포함하는 고려를 바탕으로 결정될 수 있다.
숙련된 기술자는 단백질에 대한 접합에 앞서 폴리머(예를들면, PEG)가 하나 또는 두 개의 말단들에서 기능성 그룹을 포함하는 유도체를 제조함으로써 활성화되는 것이 필요할 수 있음을 알 것이다.
본 발명의 단백질에 대한 접합을 위해 특히 바람직한 화합물은 표 1에 개시된다.
그룹 내용
방사성 동위원소 (직접 또는 간접적) ● 1 23I, 125I, 130I, 133I, 135I, 47Sc, 72As , 72Sc, 90Y, 88Y, 97Ru, 100Pd, 101mRh, 101mRh, 119Sb, 128Ba, 197Hg, 211At, 212Bi, 153Sm, 169Eu, 212Pb, 109Pd, 111In , 67Gu, 68Gu, 67Cu, 75Br, 76Br , 77Br, 99mTc, 11C, 13N, 15O, 18I, 188Rc, 203Pb, 64Cu, 105Rh, 198Au, 199Ag 또는 177Lu
반감기 연장자 ● 폴리에틸렌 글리콜
● 글리세롤
● 글루코스
형광 프로브 ● 피코에리쓰린(Phycoerythrin(PE))
● 알로피코시아닌(Allophycocyanin(APC))
● Alexa Fluor 488
● Cy5.5
생물제재 ● 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase), GFP과 같은 형광 단백질들
● 면역 조절자들
● 독소들
● 면역 글로불린들
● 알부민과 같은 반감기 연장자들
화학요법제 ● 탁솔(TAxol)
● 5-FU
● 독소루비신(Doxorubicin)
● 이다루비신(Idarubicin)
본 발명의 일 예에서, 간격자(spacer) 조각(moiety)이 화합물 및 그것이 접합되는 단백질 사이에 포함된다. 본 발명의 간격자 조각들은 쪼갤 수 있거나(벽개성, cleavable) 또는 쪼갤 수 없는(비벽개성, non-cleavable) 것이다. 예로서, 벽개성 간격자 조각은 산화 환원-벽개성 간격자 조각이어서, 상기 간격자 조각은 고농도의 자유 메르캅트기(sulfhydryl) 그룹 함유 분자를 포함하는 세포질 및 다른 영역과 같은, 낮은 산화 환원 전위의 환경에서 쪼개질 수 있다. 산화 환원 전위의 변화로 인해 쪼개질 수 있는 간격자 조각들의 예들은 이황화물들을 함유하는 것들을 포함한다. 쪼개짐 자극(cleaving stimulus)은 세포질의 낮은 산화 환원 전위가 간격자 조각의 쪼개짐을 촉진하는 접합된 단백질의 세포 내 섭취에 의해 제공될 수 있다.
다른 예에서, pH의 감소는 그에 의해 타겟 세포로의 화합물을 방출(release)시키는 간격자의 쪼개짐을 유발한다. pH의 감소는 많은 엔도솜(endosome) 트래피킹(endosom trafficking), 종양 성장, 염증, 및 심근 허혈과 같은 생리학적 및 병리학적 과정들에 관련된다. pH는 엔도솜에서 생리학적 7.4 에서 5-6으로 리소좀(lysosome)에서 4-5로 감소한다. 암 세포들의 리소좀들 또는 엔도솜들을 표적하기 위해 사용될 수 있는 산 민감성 간격자 조각들의 예는, 아세탈, 케탈, 오소에스테르(orthoesters), 하이드라존(hydrazones), 트리틸(trityls), 시스-아코니틸(cis-aconityls), 또는 티오카바모일(thiocarbamoyls)에서 발견되는 것과 같은 산-벽개성 결합들을 갖는 것들을 포함한다(예로서 US Pat. Nos. 4,569,789, 4,631,190, 5,306,809, 및 5,665,358 참조). 다른 예시적 산-민감성 간격자 조각들은 디펩티드 서열들 Phe-Lys 및 Val-Lys를 포함한다.
벽개성 간격자 조각들은 특정 표적 세포와 관련되어 있는 생물학적으로 공급되는 벽개성 제재들, 예로서, 리소소말(lysosomal) 또는 종양-관련 효소들에 민감할 수 있다. 효소적으로 쪼개질 수 있는 연결자 조각들의 예들은, 이에 제한되는 것은 아닌, 펩타이드들 및 에스테르들을 포함한다. 예시적인 효소 백개성 연결 조각들은 카텝신 B(Cathepsin B) 또는 플라스민(plasmin)과 같은 종양-관련 단백질 분해제들에 민감한 것들을 포함한다. 카텝신 B(Cathepsin B) 벽개성 사이트들은 디펩타이드 서열들 발린-시트룰린 및 페닐알라닌-라이신을 포함한다.
접합 방법
시스테인에 대한 접합(티올)
화합물을 시스테인 잔기에 접합하기 위한 다양한 방법들이 본 기술 분야에 알려져 있으며 숙련된 기술자에게 분명할 것이다. 그러한 접합을 위한 제재들은 전형적으로 (i) 표지된 단백질을 형성하는 시스테인의 시스테인 티올과 직접적으로, (ii) 연결자-표지 중간체를 형성하는 연결자 시약과, 또는 (iii) 표지된 단백질을 형성하는 연결자 단백질과 반응할 수 있는 반응성 기능성을 갖는다. 연결자의 경우에 (1) 활성화된 화합물과의 반응에 의해 뒤이어지는, 공유 결합을 통해, 단백질-연결자 중간체를 형성하는 본 발명의 단백질의 시스테인 그룹과 연결자 제재의 반응; 및 (2) 본 발명의 단백질의 시스테인 그룹과의 반응에 의해 뒤이어지는, 공유 결합을 통해, 화합물-연결자 중간체를 형성하는 화합물의 친핵성 그룹과 연결자 시약의 반응을 포함하며, 유기 화학 반응들, 조건들, 및 시약들을 이용하는 몇 가지 루트가 본 기술 분야의 숙련된 자들에게 알려져 있다. 전술한 바로부터 숙련된 기술자에게 분명할 것과 같이, 2 기능성 연결자들이 본 발명에서 사용된다. 예로서, 2 기능성 연결자는 시스테인 잔기(들)과 공유적 연결을 위한 티올 변형 그룹, 및 화합물과의 공유적 또는 비공유적 연결을 위한 적어도 하나의 부착 조각(attatchment moiety)(예를들면, 제2 티올 변형 조각)을 포함한다.
다양한 단백질들 및 화합물들, (및 연결자들)이 본 발명의 접합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 티올 그룹들은 친핵성이며 연결자 시약들 상의 친 전자성 그룹들 또는 화합물-연결자 중간체들 또는 (i) NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포메이트(haloformates), 및 산할로겐화물(acid halides)와 같은 활성 에스테르들, (ii) 알킬 및 할로아세트아미드와 같은 벤질 할로겐화물들; 및 (iii) 알데히드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드 그룹들; (iv) 이황화 교환에 의해 피리딜 이황화물들을 포함하는 이황화물들을 포함하는 약물들과 공유 결합들을 형성하기 위한 반응이 가능하다. 화합물 또는 연결자 상의 친핵성 그룹들은, 연결자 조각들 및 연결자 시약들 상의 친 전자성 그룹들과 공유 결합들을 형성하기 위한 반응이 가능한, 이에 한정되는 것은 아닌, 아민, 티올, 히드록실, 히드라자이드, 옥심, 히드라진, 티오세미카바존(thiosemicarbazone), 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라자이드 그룹들을 포함한다.
바람직한 표지 시약들은, 다른 기능성 그룹들이 또한 사용될 수 있으나, 말레이미드, 할로아세틸, 요오드아세트아미드 숙신이미딜 에스테르, 이소티오시아네이트, 술포닐 클로라이드, 2,6-디클로로트리아지닐(2,6-dichlorotriazinyl), 펜타플루오로페닐 에스테르, 및 포스포아미디트(phosphoramidite)를 포함한다.
메이탄신(maytansine)은, 이황화 연결자와 함께 메이탄시노이드(maytansinoid)-면역 접합체를 생성하기 위하여, 예로서, 자유 티올, May-SH로 환원될 수 있으며, 본 발명의 단백질과 반응할 수 있는 May-SSCH3로 전환될 수 있다(Chari 외, 1992). 이황화 연결자와 메이탄시노이드 접합체들은 보고되어 있다(WO 04/016801; US 6884874; 및 WO 03/068144). 이황화 연결자 SPP는 연결자 시약 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(N-succinimidyl 4-(2-pyridylthio) pentanoate)로 구성될 수 있다.
다른 예시적 반응성 기능 그룹은 화합물, 예를들면 비오틴 또는 형광 염색제 또는 독소 또는 단백질의 카복실 그룹 치환기(substituent)의 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르(N-hydroxysuccinimidyl ester, NHS)이다. 화합물의 NHS 에스테르는 형성되고, 분리되고, 정제되고 및/또는 특징화되며, 또는 그것은 인시츄적으로 형성되어 단백질의 친핵성 그룹과 반응할 수 있다. 전형적으로, 화합물의 카복실 형태는 카보디이미딜 시약, 예를들면 디시클로헥실카보디이미드, 디이소프로필카보디이미드, 또는 우로늄(uronium) 시약, 예를들면 TSTU (O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, HBTU (O-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), 또는 HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), 화합물의 NHS 에스테르를 주기 위한 1-히드록실 벤조트리아졸(HOBt), 및 N-히드록실숙신이미드와 같은 활성화제의 어떤 조합과 반응함으로써 활성화된다. 어떤 경우들에, 상기 화합물과 단백질은 화합물의 인시츄 활성화 및 하나의 단계에서 접합체를 형성하는 상기 단백질과의 반응에 의해 커플링될 수 있다. 다른 활성화 및 커플링 시약들은 TBTU (2-(1H-벤조트리아조-1-일)-1-1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트)(2-(1H-benzotriazo-l-yl)-l-l,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate), TFFH(N,N'N',N'-테트라메틸우로늄 2-플루오로-헥사플루오로포스페이트)(N,N',N ,N'-tetramethyluronium 2-fluoro- hexafluorophosphate), PyBOP(벤조트리아조-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트)(benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate), EEDQ(2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디히드로-퀴놀린)(2-ethoxy- 1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydro-quinoline), DCC(이시클로헥실카보디이미드)(dicyclohexylcarbodiimide); DIPCDI(디이소프로필카보디이미드)(diisopropylcarbodiimide), MSNT(1-(메시틸렌-2-술포닐)-3-니트로-1H-1,2,4-트리아졸)(l-(mesitylene-2-sulfonyl)-3-nitro-lH-l ,2,4-triazole), 및 아릴 술포닐 할라이드들, 예를들면 트리이소프로필벤젠술포닐 클로라이드를 포함한다.
부가적인 접합 방법들은, 화합물과 반응성인 티오에테르(thioeter)를 제조하기 위하여 시스테인의 티올과 반응하는, 예로서, 말레이미드, 요오드아세트이미드 또는 할로아세틸/알킬 할라이드, 아지리딘, 아크릴로일 유도체들의 사용을 포함한다(예를들면, Schelte 외, 2000(말레이미드들의 사용); Reddy 외, 1998(말레이미드 유도체들의 사용); Ramseier 및 Chang, 1994(요오드아세트이미드의 사용); Eisen 외, 1953(2,4-디니트로벤젠술포산의 사용); Grssmam 외, 1981(아지리딘의 사용); 또는 Yem 외, 1992(아크릴로일 유도체들의 사용). 활성화된 피리딜디술파이드(piridyldisulphide)와 자유 티올의 이황화 교환은 또한 접합체를 생산하는데 유용하다(King 외, 1978 및 그 언급된 참고, 예로서 5-티오-2-니트로벤조(TNB)산의 사용). 바람직하게, 말레이미드가 사용된다.
방사능 표지된 접합체들에 대하여, 본 발명의 단백질들은 직접적으로 표지화 되거나(요오드화 처리를 통하는 것과 같은) 또는 킬레이팅제의 사용을 통하여 간접적으로 표지화될 수 있다. 본원에 사용된 바로서, 용어 "간접적인 표지화" 및 "간접적인 표지화 접근" 양자는 킬레이팅제가 단백질에 공유적으로 붙어 적어도 하나의 방사성 핵종이 킬레이팅제와 연결되는 것을 의미한다. 그러한 킬레이팅제들을 전형적으로 그들이 단백질 및 방사성 동위 원소 양자에 결합하는 2 기능성 킬레이팅제들로 참조된다. 예시적인 킬레이팅제들은 1-이소티오시마토벤질-3-메틸디오넬렌 트리아민펜타아세트산(1-isothiocycmatobenzyl- 3-methyldiothelene triamine pentaacetic acid) ("MX-DTPA"), 및 시클로헥실 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(cyclohexyl diethylenetriamine pentaacetic acid) ("CHX-DTPA") 유도체, 또는 DOTA를 포함한다. DOTA-말레이미드(4-말레이미도부티라미도벤질-DOTA(4-maleimidobutyramidobenzyl-DOTA))와 같은 연결자 시약들은 이소프로필클로로포메이트(isopropylchloroformate (Aldrich))에 의해 활성화된 말레이미도부티릭 산(Fluka)과 아미노벤질-DOTA의 반응에 의해 제조될 수 있다, 하기 Axworthy 외, (2000)의 공정. DOTA-말레이미드 시약들은 본 발명 단백질들의 자유 시스테인 아미노산들과 반응하여 그 위에 금속 복합체 리간드를 제공한다(Lewis 외, 1998). DOTA-NHS(l,4,7,10-테트라아자시틀로도데칸-l,4,7,10-테트라아세트산 모노(N-히드록시숙신이미드 에스테르(l,4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacetic acid mono (N-hydroxysuccinimide ester)) 와 같은 킬레이팅 연결자 표지화 시약들은 상업적으로 입수 가능하다(Macrocyclics, Dallas, TX).
연결에 앞서 본 발명의 단백질은 DTT(Cleland's 시약, 디티오트레이톨(dithiothreitol)) 또는 TCEP(트리스(2-카복실에틸)포스핀 하이드로클로라이드(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride); Getz 외, 1999; Soltec Ventures, Beverly, MA)와 같은 환원제로의 처리에 의해 연결자 시약들과의 접합을 위한 반응성이 되는 것이 바람직하다. 이황화 결합들은 실온에서 희석된 (200nM) 황산구리 수용액에 의한 연결이 요구되지 않는, 시스테인 잔기들 사이에서 재안정화될 수 있다. 다른 산화제들, 즉 본 기술 분야에서 알려진, 산화시키는 제재들, 및 산화시키는 조건들이 사용될 수 있다. 대기 산화가 또한 효과적이다. 이러한 온화하고, 부분적인 재산화 단계는 높은 정확도로 쇄 간 이황화물을 효과적으로 형성한다.
트레오닌/세린에 대한 접합
화합물을 트레오닌 또는 세린 잔기에 접합하기 위한 방법들은 또한 본 기술 분야에 알려져 있다. 예로서, Zhang 및 Tam(1996)은 과요오드산 염에 의해 선택적으로 및 빠르게 알데히드 형태로 변환될 수 있는 카보닐 전구체들이, 세린 또는 트레오닌의 1,2-아미노알콜로부터 유도되는 방법을 기재하였다. 본 발명의 단백질에 붙은 화합물 내의 시스테인의 1,2-아미노티올과 알데히드의 반응은 안정한 티아졸리딘 생성물을 형성한다. 이러한 방법은 특히 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기들에서 표지화된 단백질들에 유용하다.
PEG화(PEGylation) 방법
화합물들, 예로서 PEG를 단백질에 접합하기 위한 다양한 방법들이 본 기술 분야에 알려져 있다. PEG의 경우, 그 분자는 아민 또는 이미다졸, 카복실 그룹, 히드록실 그룹 또는 메르캅트 그룹에 대한 그것의 결합을 촉진하도록 활성화될 수 있다.
예로서, Abuchowski 외(1977)는 PEG 디클로로트리아진 유도체를 제조하기 위하여 시아누릭 클로라이드(cyanuric chloride)를 사용하여 PEG를 활성화시켰다. 이러한 유도체는 라이신, 세린, 티로신, 시스테인 및 히스티딘과 같은 다중 기능성 친핵성 기능성 그룹들과 반응할 수 있다. 이러한 프로토콜의 변형된 형태는 낮은 반응성을 가지며 라이신 또는 시스테인 잔기들과 더욱 선택적으로 접합하는 PEG-클로로트리아진을 생성하였다(Mutsushima 외, 1980).
단백질들에 대한 접합에 사용되는 PEG의 두 개의 광범위한 형태들은 숙신이미딜 카보네이트 PEG(SC-PEG; Zalipsky 외, 1992) 및 벤조트리아졸 카보네이트 PEG((BTC-PEG; US 5,560,234)이다. 이러한 화합물들 양자는 카바메이트 연결들을 형성하기 위하여 라이신 잔기들와 선호적으로 반응하며, 그러나 히스티딘 및 티로신과도 반응하는 것으로 알려져 있다. SC-PEG가 BTC-PEG보다 가수분해에 대해 좀 더 저항성이다.
단백질들과 접합을 위해 사용되는 또다른 PEG는 PEG-프로피온알데히드(US5,252,714)이다. 이러한 화학의 장점은 산성 조건들(약 pH 5) 하에서 그것이 N-말단 α-아민에 대해 훨씬 선택적이어서 비-특이성 접합으로 인한 잠재적인 문제점들을 피할수 있다는 것이다. PEG-프로피온알데히드의 아세탈 유도체, 즉 PEG-아세트알데히드는 그것이 PEG-프로피온알데히드(US5,990,237)보다 더 긴 저장성을 제공한다는 점에서 부가적인 장점을 제공한다.
PEG 카복실산의 활성 에스테르들은 단백질 접합을 위한 가장 많이 사용되는 아실화제들 중의 하나일 것이다. 활성 에스테르들은 안정한 아미드들을 형성하기 위하여 생리학적 조건들 근처에서 1차 아민들과 반응한다. PEG-카복실산의 숙신이미딜 활성 에스테르로의 활성은 PEG-카복실산을 N-히드록시숙신이미드(NHS 또는 HOSu) 및 카보디이미드와 반응시킴에 의해 달성될 수 있다. PEG의 예시적 카복실산 유도체들은 카복시메틸화된(crboxymethylated) PEG(CM-PEG; Zalipsky 외, 1990), 부타노익(butanoic) 산 유도체들 및 프로피오닉 산 유도체들(US 5,672,662)을 포함한다. 메틸렌 유닛들의 부가에 의해 활성 에스테르와 PEG 백본 사이의 거리를 변화시키는 것은 물 및 아민들에 대한 반응성에 매우 큰 영향을 줄 수 있다(예를들면, 가수분해를 감소시키는 것에 의해). 대안적으로 또는 부가적으로, 가수분해는 α-분지형(branching) 조각을 카복실산에 도입시킴으로써 감소될 수 있다.
단백질 내 자유 시스테인 잔기들의 PEG화(PEGylation)는 사이트-특이성 접합에 유용하다(예를들면, 본원에 개시된 바와 같이 시스테인 잔기들을 포함하기 위해 변형된 단백질을 사용하여). 시스테인 접합을 위한 예시적인 PEG 유도체들은 PEG-말레이미드, PEG-비닐술폰, PEG-요오드아세트아미드 및 PEG-오소피리딜 디설파이드를 포한한다. PEG를 시스테인 잔기들에 접합시키기 위한 예시적인 방법들이 Gooson 및 Katre(1990) 및/또는 상기에 기재되어 있다. PEG-비닐술폰을 이용하는 접합을 위한 예시적인 방법들이 예로서 Li 외 (2006)에 기재되어 있다.
US 5985263은 PEG를 1차 아민보다 낮은 pKa를 갖는 히스티딘의 2차 아민 그룹에 접합시키는 방법을 개시한다. 이러한 접근의 장점은 단백질이 천천히 방출되는 것을 의미하는(즉, 접합이 서방성 제형 또는 프로-드러그로 행동한다) 아실-히스티딘 결합이 안정하지 않다는 것이다.
PEG화를 위한 다른 접근은 상기 기재된 바와 같이 과요오드산염으로 전환되는 N-말단 세린 또는 트레오닌을 활용하는 것이다. 이러한 접근을 사용하여, PEG는 생활성 단백질들에 접합되어 왔다(예를들면, Gaertner 및 Offord, 1996).
PEG는 또한 탄수화물 그룹들에 접합될 수 있다.
본 발명은 또한 가역적인 PEG화 기술들의 사용을 포함한다.
용도
본 발명의 단백질들은, 연구, 진단적 및 치료적 응용들을 포함하는, 다양한 응용들에서 유용하다. 단백질이 결합되는 항원에 따라 그것은, 예를들면 세포를 죽이거나 성장을 방지하기 위하여 세포로 화합물을 전달하는 데에 및/또는 이미징하는 데에 및/또는 체외 분석을 하는 데에 유용할 수 있다. 일 예로서, 단백질은 세포 독성제를 세포에 이미징 및 전달하기 위하여 모두 유용하다, 즉 그것은 검출 가능한 표지 및 세포 독성제 또는 그 일부가 세포 독성제에 접합되고 그 일부가 검출 가능한 표지에 접합되는 단백질들의 혼합물을 포함하는 조성물에 접합된다.
본원에 개시된 단백질들은 또한 (a) 수용체에 대한 (예를들면, 리간드, 저해제의) 결합, (b) 수용체 신호 기능, 및/또는 (c) 자극 기능을 저해하는(감소시키거나 방지하는) 저해제들로서 작용할 수 있다. 수용체 기능의 저해제들로 작용하는 단백질들은 리간드 결합을 직접적으로 또는 간접적으로(예를들면, 구조적 변화를 유발함으로써) 차단할 수 있다.
항원
본 발명은 어떠한 항원(들)에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 FR1 내에 포함하는 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 단백질을 고려한다, 즉 본 발명의 일 예는 특정한 항원을 요구하는 것에 반하는 총괄적인 것이다.
본 발명의 예들은, 예를들면, 암 또는 암의/변환된 세포와 관련되는 또는 발현되는 및/또는 자가면역 질병에 관련되는 및/또는 염증성 질병 또는 질환과 관련되는 및/또는 신경 쇠약 질병과 관련되는 및/또는 면역 부족 이상과 관련되는, 질병 또는 질환(즉, 상태)과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 고려한다.
그에 대항하여 본 발명의 단백질이 생산될 수 있는 예시적인 항원들은 BMPRIB(뼈 형태 발생 단백질(bone morphogenetic protein) 수용체-타입 IB, Dijke 외 1994, WO2004063362); E16(LATl , SLC7A5, WO2004048938); STEAPl (6개의 경막성(transmembrane) 전립선의 상피 항원(epithelial antigen of prostate),; WO2004065577); CA125 (MUC16, WO2004045553); MPF (MSLN, SMR, 거대 핵세포 강화 인자(megakaryocyte potentiating factor), 메조텔린(mesothelin), WO2003101283); Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 전달자 패밀리 34(solute carrier family 34); WO2004022778); 세마 5b(Sema 5b) (FLJ10372, KIAA1445, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b (Semaphorin 5b), 세마 도메인(sema domain), 7개의 트롬보스폰딘 반복체(seven thrombospondin repeats) (타입 1 and 타입 Hike), 경막성 도메인(transmembrane domain) (TM) and 짧은 세포질 도메인(short cytoplasmic domain), (semaphorin) 5B, WO2004000997); PSCA (US2003129192); ETBR (엔도텔린 타입 B 수용체(Endothelin type B receptor), WO2004045516); MSG783 (RNF124, WO2003104275); STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-I , PCANAPl, STAMPl , STEAP2, STMP, 전립선 암 관련 유전자 1(prostate cancer associated gene 1) , 전립선 암 관련 단백질 1(prostate cancer associated protein 1) , 전립선 2의 6개 경막성 상피 항원 (six transmembrane epithelial antigen of prostate 2), 6개 경막성 전립선 단백질(six transmembrane prostate protein), WO2003087306); TrpM4 (BR22450, FLJ20041 , TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재성 양이온 채널(transient receptor potential cation channel), 서브패밀리 M(subfamily M), 멤버 4, US2003143557); CRIPTO (CR, CRl, CRGF, CRIPTO, TDGFl, 테라토카시노마-유도된 성장 인자(teratocarcinoma-derived growth factor), US2003224411); CD21 (CR2 (상보성 수용체 T(Complement receptor T)) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바 바이러스 수용체 (Epstein Barr virus receptor)) WO2004045520); CD79b (CD79B, CD79β IGb (면역 글로불린-관련된 베타(immunoglobulin-associated beta)), B29, WO2004016225); FcRH2 (DFGP4, IRTA4, SPAPlA (SH2 도메인 함유 포스페이트 앵커 단백질(domain containing phosphatase anchor protein) Ia), SPAPlB, SPAPlC, WO2004016225); HER2 (ErbB2, WO2004048938); NCA (CEACAM6, WO2004063709); MDP (DPEPl, WO2003016475); IL20Rα(IL20Ra, ZCYTOR7, EP1394274); 브레비칸(Brevican) (BCAN, BEHAB, US2003186372); EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, WO2003042661); ASLG659 (B7h, US20040101899); PSCA (전립선 줄기 세포 항원 전구체(Prostate stem cell antigen precursor), WO2004022709); GEDA (지방종(lipoma) HMGIC 융합-파트너 유사 단백질(fusion-partner-like protein) WO2003054152); BAFF-R (B 세포-활성 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3, WO2004058309); CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 동일 형태(isoform), BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, WO2003072036); CD79a (CD79A, CD79α 면역 글로불린-관련된 알파(immunoglobulin-associated alpha), Ig beta (CD79B)와 공유적으로 상호 작용하고 Ig M 분자들과 표면 상에 복합체를 형성하며, B-세포 분화에 관여하는 신호를 전달하는 B 세포 특이성 단백질; WO2003088808); CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1(Burkitt's lymphoma receptor 1), CXCL13 키모킨(chemokine)에 의해 활성화되고, 림프구 이동 및 체액성 방어(humoral defense)에서 기능하고, HIV-2 감염 및 아마도 AIDS, 림프종 (lymphoma), 골수종 (myeloma), 및 백혈병의 발생에 중요한 역할을 하는 G 단백질-커플된 수용체 WO2004040000); HLA-DOB (펩타이드들에 결합하고 CD4+ T 림프구들에 그들을 주는 MHC 클래스 II 분자의 베타 서브유닛 (Ia antigen); WO9958658); P2X5 (퓨리너직 수용체 P2X 리간드-게이트의 이온 채널 5(Purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 5), 스냅스 전달(synaptic transmission) 및 신경 발생(neurogenesis)에 관여하고 결핍이 특발성 배뇨근 불안정성(idiopathic detrusor instability)의 병리 생리학의 원인이 될 수 있는 세포 밖 ATP(extracellular ATP)에 의해 게이트되는 이온 채널,; WO2004047749); CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2; WO2004042346); LY64 (림프구 항원 64(Lymphocyte antigen 64) (RP 105), B-세포 활성 및 아폽토시스(apoptosis)를 조절하고, 기능의 손실이 체계적인 낭창 홍반(systemic lupus erythematosis)을 갖는 환자에서의 증가된 질병 활성과 관련된, 류신 풍부 반복(leucine rich repeat (LRR)) 패밀리의 타입 I 멤브레인 단백질, ; US2002193567); FcRHl (Fc 수용체 유사 단백질 1, C2 타입 Ig 유사 및 ITAM 도메인을 포함하고, B-림프구 분화에서 역할할 수 있는 면역 글로불린 Fc 도메인을 위한 추정적 수용체 WO2003077836); IRTA2 (면역 글로불린 슈퍼패밀리 수용체 이동 관련된 2(Immunoglobulin superfamily receptor translocation associated 2), B 세포 발현 및 림프종 발생; 어떤 B 세포 악성 종양 내에서 발생하는 전이에 의한 유전자의 폐지에서 가능한 역할을 갖는 추정정 면역 수용체; WO2003077836); TENB2 (TMEFF2, 토모레굴린(tomoregulin), TPEF, HPPl, TR, EGF/성장 인자 및 폴리스타틴(follistatin)의 헤레굴린 패밀리(heregulin family)에 관련된 추정적 경막성 프로테오글리칸(transmembrane proteoglycan); WO2004074320); CD20 (WO94/11026); VEGF-A (Presta 외., 1997); p53; EGFR; 황체 호르몬(progesterone) 수용체; 카팁신 D(cathepsin D); Bcl-2; E 캐드헤린(E cadherin); CEA; 루이스 X(Lewis X); Ki67; PCNA; CD3; CD4; CD5; CD7; CD11c; CD11d; c-Myc; tau; PrPSC; 또는 Aβ를 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 단백질은 Her2(예를들면, SEQ ID NO: 70에 나열된 서열을 포함하는), MUC1 (예를들면, SEQ ID NO: 72 또는 73에 나열된 서열을 포함하는), TAG72 (고분자량 뮤신 유사 단백질 예를들면, Johnson 외, 1986에 기재된 바와 같은) or PSMA (예를들면, SEQ ID NO: 71에 나열된 서열을 포함하는)에 특이적으로 결합한다. 예로서, 본 발명은 Her2에 특이적으로 결합한다. 예로서, 본 발명은 MUC1에 특이적으로 결합한다. 예로서, 본 발명은 TAG72에 특이적으로 결합한다. 예로서, 본 발명은 PSMA에 특이적으로 결합한다.
그로부터 본 발명의 단백질이 유도될 수 있는 다른 예시적 항체들은 숙련된 기술자에게 명백할 것이며, 예로서 Rituximab (C2B8; WO94/11026); 또는 비베이시쥬마(bevacizumab) (인간화된 A.4.6.1; Presta 외, 1997))를 포함한다.
예시적 2 특이성 단백질들은 관심 있는 항원의 두 개의 다른 항원 결정기ㄷ드들(epitopes)에 결합할 수 있다. 다른 그러한 단백질들은 다른 단백질에 대한 결합 사이트를 갖는 항원 결합 사이트와 결합할 수 있다. 대안적으로, 관심 영역의 항-항원은 T 세포 수용체 분자(예를들면, CD3), 또는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및/또는 FcγRIII(CD16)과 같은 IgG에 대한 Fc 수용체들(FcγR)과 같은 백혈구 상에서의 촉발시키는 분자(triggering molecule)에 결합하는 영역에 결합될 수 있어, 관심 있는 항원을 발현하는 세포에 대한 세포적 방어 메카니즘에 집중하고 및 찾아낼 수 있다. 2 특이성 단백질들은 또한 관심 있는 항원을 발현하는 세포에 대한 세포 독성제를 찾아내는데 사용될 수 있다. 이러한 단백질은 관심 있는 항원에 결합하는 영역 및 세포 독성제들(예를들면, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 리신(ricin) A 쇄, 메소트렉세이트(methotrexate) 또는 방사성 동위 원소 부착소(radioactive isotope hapten))을 결합하는 영역을 포함한다. WO 96/16673은 2 특이성 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체를 기재하고, US 특허 번호 5,837,234는 2 특이성 항-ErbB2/항-FcγRI 항체를 기재한다. 2 특이성 항-ErbB2/항-Fcα 항체는 WO 98/02463에 보여진다. US 5,821,377은 2 특이성 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시한다.
약제학적 조성물 및 치료 방법
본 발명의 단백질들(동일하게, 활성 성분들)은 예방적 또는 치료적 처치를 위한 비경구적, 국소적(topical), 경구적 또는 국부적(local) 투여, 에어로졸 투여, 또는 경피적(transdermal) 투여에 유용하다. 약제학적 조성물들은 투여 방법에 따라 다양한 단위 용량 형태들로 투여될 수 있다. 예로서, 경구 투여를 위해 적합한 단위 용량 형태들은 분말, 타블렛, 알약, 캡슐 및 마름모꼴을 포함하며 또한 비경구적 투여에 의한다. 본 발명의 약제학적 조성물들은 경구적으로 투여되었을 때에 소화로부터 방어되어야 한다는 것이 인식되어 있다. 이는 전형적으로 그것에 산성 및 효소적 가수분해에 저항성을 부여하는 조성물로 단백질들을 복합체화 하거나 또는 리포좀과 같은 적당한 저항성 담체 내에 화합물을 패키징함으로써 달성된다.
전형적으로, 치료적 유효량의 단백질이 피험자에 대한 투여를 위한 조성물로 제형화될 것이다. 상기 절 "치료적 유효량"은 피험자 내에서 처치 또는 다른 치료적 효과를 촉진, 유도 및/또는 향상시키기 위한 충분한 양을 의미한다. 명확하게도, 이러한 제형화에서 본 발명의 단백질의 농도는 넓은 범위에 걸쳐 변화될 수 있고, 선택된 특정 모드의 투여 및 환자의 요구에 따라 플루이드 부피, 점도, 몸무게 등을 우선적으로 바탕으로 하여 선택될 것이다. 질병의 형태 및 심각성에 따라, 치료적 유효량은 예로서, 하나 이상의 분리된 투여들에 의한, 또는 연속적인 주입에 의한, 약 1㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를들면 0.1-20 mg/kg)의 분자일 수 있다. 전형적인 매일의 복용량은 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 초과의 범위일 수 있다. 환자에게 투여되는 단백질의 양은 환자 몸무게 당 약 0.1 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 질환에 따라 수 일 또는 더 길게 반복되는 투여에 대하여, 질병의 증세의 바람직한 억제가 나타날 때까지 처치가 유지된다. 예시적인 복용법은 약 4 mg/kg의 초기 투여 량, 이어서 주 단위로 약 2 mg/kg 단백질의 지속적 복용이다. 다른 복용법들이 유용할 수도 있다. 이러한 치료의 진행은 통상의 기술들 및 분석법들에 의해 용이하게 모니터링된다.
대안적으로, 본 발명의 단백질은 피험자에의 투여에 앞서 치료상의 효과적인 양으로 희석되는 농축된 양으로 제형화된다.
본 발명의 약제약적 조성물들은 특히 비경우적 투여에 유용하며, 예를들면 정맥, 근육내, 피하, 경피적, 또는 연동성(peristaltic) 투여 및 종양 또는 질병 사이트로의 직접적 침투(공동간(intracavity) 투여)를 포함하는, 다른 그러한 루트들을 통한 주입을 위해 제형된다. 투여를 위한 조성물들은 통상 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게 수성 담체 내 용해된 본 발명의 단백질들의 용액을 포함할 것이다. 예를들면 버퍼 식염수 등 다양한 수성 담체들이 사용될 수 있다. 다른 예시적인 담체들은 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액(dextrose solution), 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함한다. 혼합 오일 및 에틸 올레이트와 같은 비수성 운반자들도 또한 사용될 수 있다. 리포좀 또한 담체로 사용될 수 있다. 그러한 운반자는 등장성(isotonicity) 및 화학적 안정성을 향상시키기 위해 소량의 첨가제, 예를들면 버퍼 및 보존제를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 pH 조절 및 버퍼링 제재들, 독성 조절 제재들 등, 예로서 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 락테이트 등과 같이 병리 생리학적 상태에 가깝게 하기 위해 요구되는 약학적으로 허용되는 보조 성분들을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물을 제조하는 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. Mack Publishing Company, 1980에 예시된 바와 같이 본 기술 분야에 일반적으로 알려져 있다.
WO2002/080967은, 본 발명의 단백질의 투여에도 적합할 수 있는, 예를들면 천식의 치료를 위한 단백질들을 포함하는 에어로졸화된 조성물들을 투여하는 방법들 및 그 조성물들을 기재한다.
본 발명 화합물들의 적당한 복용량은 특정 단백질, 진단되는/처치되는/예방되는 질환 및/또는 처치되는 피험자에 따라 달라질 수 있다. 예를들면 최적 또는 유용한 복용량을 정하기 위해 최적화된 복용량 미만으로 시작하여 점진적으로 복용량을 수정함으로써 적당한 복용량을 결정하는 것은 숙련된 의사의 능력 내이다. 대안적으로, 처치/예방을 위해 적합한 복용량을 결정하기 위하여, 세포 배양 에세이 또는 동물 연구가 사용되며, 이때 적합한 복용량은 극소량 또는 독성이 없는 활성 화합물의 ED50을 포함하는 유동 농도(circulating concentrations)의 범위 내에 있다. 복용량은 사용된 복용 형태 및 이용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 가변적일 수 있다. 치료상으로/예방상으로 효과적인 복용량은 처음으로 세포 배양 분석으로부터 예측될 수 있다. 복용량은 세포 배양 내에서 결정된 IC50(즉, 증상의 반-최대 저해(half-maximal inhibition)에 도달하는 화합물의 농도) 을 포함하는 유동 혈장 농도 범위에 도달하기 위해 동물 모델 내에서 공식화될 수 있다. 그러한 정보는 더욱 정확하게 인간에서의 유용한 복용량을 정하는 데에 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은, 예로서 고성능 액상 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 단백질은 약제학적 조합 제형, 또는 조합 치료로서의 복용법(dosing regimen) 내에서 2차 화합물과 결합될 수 있다. 약제학적 조합 제형 또는 복용법의 2차 화합물은 바람직하게 조합의 단백질에 대해 보충적인 활성을 가져 그들은 서로 부정적으로 영향을 주지 않는다.
상기 2차 화합물은 화학요법 제재, 세포독성 제재, 사이토킨(cytokine), 성장 저해 제재, 항-호르몬 제재, 및/또는 심장보호제(cardioprotectant)일 수 있다. 그러한 분자들은 의도된 목적을 위한 효과적인 양으로 조합 내에 적당하게 존재한다. 본 발명의 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 또한 치료적 유효량의 튜불린(tubulin)-형성 저해제, 토포이소머라제(topoisomerase) 저해제, 또는 DNA 바인더와 같은 화학요법 제재를 포함할 수 있다. 약학적으로 "느린 방출(서방성)" 캡슐들 또는 조성물들이 또한 사용된다. 서방성 제형들은 일반적으로 연장된 기간에 걸쳐 일정한 약물 수준을 부여하도록 설계되며, 본 발명의 화합물들을 전달하는데 사용될 것이다.
본 발명은 또한 피험자의 질환을 처치 또는 예방하는 방법, 치료적 유효량의 본 발명 단백질을 그것의 요구가 있는 피험자에 대해 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
여기 사용된 바로서, 질환을 예방하는 문맥 내에서의 용어 "예방하는", "예방한다" 또는 "예방"은 특정 질병 또는 질환의 적어도 한 증상의 발전을 멈추게 하거나 방해하기에 충분한 양의 본원에 개시된 단백질을 투여하는 것을 포함한다.
여기 사용된 바로서, 용어 "처치하는", "처치한다" 또는 "처치"는 특정 질병 또는 질환의 적어도 한 증상을 감소시키거나 제거하기에 충분한 치료적 유효량의 본원에 개시된 저해제(들) 및/또는 제재(들)를 투여하는 것을 포함한다.
여기 사용된 바로서, 용어 "대상"은 인간을 포함하는 어떠한 동물로서, 바람직하게 포유류이다. 예시적인 피험자들은 이에 한정되는 것은 아니나 인간, 영장류, 가축(예를들면, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 동반자 동물들(예를들면, 개, 고양이), 실험실 테스트 동물들(예를들면, 마우스, 토끼, 쥐, 기니 피그, 햄스터), 포획된 야생 동물들(예를들면, 여우, 사슴)을 포함한다. 바람직하게 포유류는 인간 또는 영장류이다. 더욱 바람직하게 포유류는 인간이다.
여기 사용된 바로서, "질환(condition)"는 정상적 기능의 파괴 또는 방해이고, 어떤 특정 질환에 제한되는 것은 아니며, 질병들 또는 이상들(disorders)을 포함할 것이다. 예로서, 질환은 암 또는 면역 병리학적 이상이다.
예시적인 암들은, 이에 제한되는 것은 아닌, 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 및 백혈병 또는 임파 악성 종양(lymphoid malignancies)을 포함한다. 그러한 암의 더욱 특정한 예들은 편평상피(偏平上皮) 세포(squamous cell) 암 (예를들면, 상피의 편평 상피 세포 암), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 폐의 비선암(non-, adenocarcinoma of the lung) 및 폐의 편평 상피 암종(squamous carcinoma of the lung)을 포함하는 폐암, 복막암(cancer of the peritoneum), 간세포 암(hepatocellular cancer), 위장암(gastrointestinal cancer)을 포함하는 위의 또는 위암(gastric or stomach cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 신경교아세포종(glioblastoma), 자궁 경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간세포암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장 암(colorectal cancer), 자궁 내막 또는 자궁 암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘선 암종(salivary gland carcinoma), 신장 또는 신장부 암(kidney or renal cancer), 전립선 암(prostate cancer), 외음부 암(vulval cancer), 갑상선 암(thyroid cancer), 간암(hepatic carcinoma), 항문 암(anal carcinoma), 페니스 암(penile carcinoma), 및 머리 및 목 암을 포함한다. 바람직하게 암은 유방암 또는 난소암 또는 전립선 암이다.
본 발명의 일 예에서, 암은 Her2를 발현시킨다. 예시적인 암들은 유방암, 난소암, 위암 또는 자궁암을 포함하며, 바람직하게 유방암이다. 그러한 암은 예로서 Her2에 결합하는 본 발명의 단백질로 처치될 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 암은 PSMA를 발현시킨다. 예시적인 암들은 전립선 암이다. 그러한 암은 예로서 PSMA에 결합하는 본 발명의 단백질로 처치될 수 있다.
본 발명의 추가적인 예에서, 암은 TAG72를 발현시킨다. 예시적인 암들은 결장직장 암, 위암(gastric cancer), 췌장암, 난소암, 자궁 내막암(endometrial cancer), 유방암, 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 및 전립선 암과 같은 암종(carcinomas)을 포함한다. 그러한 암은 예로서 TAG72에 결합하는 본 발명의 단백질로 처치될 수 있다.
본 발명의 추가적인 예에서, 암은 MUC1, 바람직하게 MUC1 관련된 암의 당형태(glycoform)을 발현시킨다. 예시적인 암들은 결장직장 암, 위암(gastric cancer), 췌장암, 유방암, 폐암, 및 방광암과 같은 암종(carcinomas)을 포함한다. 그러한 암은 예로서 MUC1에 결합하는 본 발명의 단백질로 처치될 수 있다.
면역 생리학은 면역학적 원인을 갖는 질병의 연구이고, 면역성 질병은 항원에 대한 면역 글로불린의 반응에 원인이 있는 어떠한 질환이다. 따라서, "면역 생리학적 질병"은 항원들에 대한 피험자의 면역 체계 반응으로부터 발생하는 이상으로 정의될 수 있다. 면역 생리학적 이상들은 자가면역 질병 및 과민성 반응을 포함한다(예를들면, 타입 I: 과민증(anaphylaxis), 발진(hives), 식품 알러지(food allergies), 천식(asthma); 타입 II: 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune haemolytic anemia), 수혈 반응(blood transfusion reactions); 타입 III: 혈청병(serum sickness), 괴사 혈관염(necrotizing vasculitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 낭창(lupus); 타입 IV: 접촉성 피부염(contact dermatitis), 이식 거부(graft rejection)). 자가면역 질병은 류마티스성 이상들(rheumatologic disorders) (예로서, 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), Sjogren's 증후군, 피부 경화증(scleroderma), SLE 및 낭창 신염(lupus nephritis)과 같은 낭창(lupus), 다중 근염(polymyositis)/피부 근염(dermatomyositis), 한랭 글로불린혈(증)(cryoglobulinemia), 항-포스포리피드 항체 증후군(anti-phospholipid antibody syndrome), 및 건선 관절염(psoriatic arthritis)와 같은), 골관절염(osteoarthritis), 자가면역성 위장 및 간 이상들(autoimmune gastrointestinal and liver disorders) (예로서, 염증성 장 질병(inflammatory bowel diseases) (예를들면, 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 Crohn's 질병)), 자가면역성 위염 및 악성 빈혈(autoimmune gastritis and pernicious anemia), 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis), 초기 담즙 간경변(primary biliary cirrhosis), 초기 경화성 수담관염(primary sclerosing cholangitis), 및 소아 지방변증(celiac disease)과 같은), 혈관염(vasculitis) (예로서, Churg-Strauss 혈관염(vasculitis)을 포함하는 ANCA-관련된 혈관염(vasculitis), Wegener's 육아종증(granulomatosis), 및 다중 동맥염(polyarteriitis)과 같은), 자가면역성 신경 이상들(autoimmune neurological disorders) (예로서, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 옵소클로너스 간대성(間代性) 근경련증 증후군(opsoclonus myoclonus syndrome), 중증 근무력증(myasthenia gravis), neuromyelitis optica, 및 자가면역성 다중신경장애(autoimmune polyneuropathies)와 같은), 신장 이상들(renal disorders) (예로서, 사구체신염(glomerulonephritis), Goodpasture's 증후군, 및 Berger's 질병과 같은), 자가면역성 피부 이상들(autoimmune dermatologic disorders) (예로서, 건선(psoriasis), 두드러기(urticaria), 발진(hives), 심상성 수포창(pemphigus vulgaris), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 및 피부 홍반성 낭창(cutaneous lupus erythematosus)과 같은), 혈액학 이상들(hematologic disorders) (예로서, 혈소판 감소 자반병(thrombocytopenic purpura), 혈전증의 혈소판 감소 자반병(thrombotic thrombocytopenic purpura), 수혈 후 자반병(post-transfusion purpura), 및 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia)과 같은), 아테로마성 동맥 경화증(atherosclerosis), 포도막염(uveitis), 자가면역성 청각 질병들(autoimmune hearing diseases) (예로서, 귀 내부 질병(inner ear disease) 및 청각 손실(hearing loss)과 같은), Behcet's 질병, Raynaud's 증후군, 장기 이식(organ transplant), 및 자가면역성 내분비 이상들(autoimmune endocrine disorders) (예로서, 인슐린-의존성 진성 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM))과 같은 당뇨병-관련 자가면역성 질병, Addison's 질병, 및 자가면역성 갑상선 장애(autoimmune thyroid disease) (예를들면, Graves' 질병 and 갑상선염(thyroiditis))와 같은)을 포함한다. 더욱 바람직한 그러한 질병은, 예로서 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), ANCA-관련된 혈관염, 낭창, 다발성 경화증, Sjogren's 증후군, Graves' 질병, IDDM, 악성 빈혈(pernicious anemia), 갑상선염(thyroiditis), 및 사구체신염(glomerulonephritis)을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 이상은 염증성 질병이다. 염증은 자극 및 손상에 대한 신체 조직의 방어적 반응이며, 급성 또는 만성일 수 있다. 따라서, 염증성 이상들은 호중구(neutrophils), 단핵 백혈구(monocytes), 비만 세포(mast cells), 호염기성 세포(basophils), 호산구(eosinophils), 사이토킨(cytokine) 방출, 히스티딘 방출, 산화제 분출, 식균 작용(phagocytosis), 다른 과립 효소(granule enzymes) 및 주화성(走化性)(chemotaxis)의 방출이 일어나는 대식 세포들이 관여되는 질병들을 포함한다. 과민성 반응들(상기 면역 병리학적 이상 하에 정의된)은 그들이 종종 호중구(neutrophils), 비만 세포(mast cells), 호염기성 세포(basophils) 등과 같은 바이러스 백혈구들의 보체(complement) 활성 및 유인(recruitment)/침투(infiltration)에 관여되기 때문에 염증성 질병들(급성 또는 만성)로 간주될 수 있다.
본 발명의 조성물들은 투약 제형(dosage formulation)에 부합되는 방법으로 및 치료상으로/예방상으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형들은 예를들면, 섭취 또는 주사 또는 흡입에 의한 여러 가지 방법들로 용이하게 투여될 것이다.
다른 치료상의 요양법들(therapeutic regimens)은 본 발명 단백질의 투여와 결합된다. 결합 치료법은 동시적 또는 연속적 요양법으로 투여된다. 연속적으로 투여될 때, 결합은 둘 이상의 투여들로 투여된다. 결합된 투여는 별도의 제형들 또는 단일의 약제학적 제형을 이용하는, 동시-투여, 및 바람직하게 두 개의(또는 모든) 활성 제재들이 동시에 그들의 생물학적 활성을 발휘하는 시간 주기가 있는, 어떤 순서로 연속적인 투여를 포함한다.
치료상의 사용에 앞서, 본 발명의 단백질은 예를들면, 하기 기재되는 바와 같이, 바람직하게 체외에서 및/또는 체내에서 테스트된다.
체외 테스팅
일 예에서, 본 발명의 단백질은 화합물에 접합되더라도 항원에 결합된다. 상기 단백질은 항원 및 적어도 그것이 유도되는 단백질에도 결합한다. 대안적으로, 단백질 또는 그것을 포함하고 있는 접합체는, 적어도 그것이 유도되는 단백질 또는 시스테인 잔기들이 결여되고 및/또는 화합물에 접합되지 않는 단백질 형태의 친화성 또는 친화력의 약 10% 또는 20% 또는 30% 또는 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90%를 갖고 있는 항원에 결합한다.
단백질의 결합 친화력을 결정하는 예시적인 방법들은 항원을 표적으로 하는 비변형 단백질 또는 비접합된 단백질의 결합을 막는 단백질의 능력을 보여주는 간단한 면역 분석, 예를들면, 경쟁적 결합 분석을 포함한다. 경쟁적 결합은 테스트 하의 단백질이 통상적인 항원에 대한 기준 단백질의 특이적 결합을 저해하는 분석에서 결정된다. 많은 형태의 경쟁적 결합 분석법들이 알려져 있다, 예로서 고체상 직접 또는 간접 방사성 면역 분석(radioimmunoassay (RIA)), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역 분석(enzyme immunoassay (EIA)), 샌드위치 경쟁 분석; 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA; 고체상 직접 표지된 분석, 고체상 직접 표지된 샌드위치 분석; 125I 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA; 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA; 또는 직접 표지된 RIA(예로서 Harlow 및 Lane, 1988 참조). 전형적으로, 그러한 분석법은 고체 표면에 결합된 정제된 항원, 또는 비표지된 테스트 단백질 및 표지된 기준 단백질 중 어느 것을 포함하는 세포들의 사용에 관련된다. 경쟁적 저해는 테스트 단백질의 존재 하에 고체 표면 또는 세포들에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다.
본 발명은 또한 본 발명 단백질의 활성을 테스트하기 위한 방법을 포함한다. 다양한 분석법들이 체외에서 본 발명 단백질의 활성을 분석하는 데에 사용될 수 있다. 예로서, 본 발명의 단백질은 그것이 세포에 결합될 수 있는지 및/또는 세포에 의해 억제 되는지에 상관없이 세포 또는 그것의 군집에 투여된다. 그러한 분석은 본 발명의 단백질을 검출 가능한 표지로 표지화 함(즉, 접합체의 제조)으로써 촉진될 수 있으나, 이는 본 발명의 단백질이 또한 표지화된 단백질로 검출될 수 있으므로 필수적인 것은 아니다. 그러한 분석법은 세포로 화합물을 전달하는(즉, 탑재하는(payload)) 본 발명의 단백질의 능력 및/또는 이미징에서의 그 유용성을 평가하는데에 유용하다. 바람직하게 상기 세포는 본 발명의 단백질에 결합하는 항원을 발현하고 더욱 바람직하게는 검출되거나 처치되는 것이 바람직한 세포 형태의 세포계 또는 주요 세포 배양물이다.
일반적으로, 본 발명 단백질의 세포 독성 또는 세포 활동 억제(cytostatic) 활성, 예를들면 세포 독성 분자에 대해 접합된 것은: 본 발명의 단백질이 결합하는 항원을 발현하는 세포들을 본 발명의 단백질에 노출시키고; 단백질이 생물학적 효과를 발휘하기 위한 적당한 기간 동안, 예를들면 약 6 시간 내기 약 5 시간, 세포들을 배양시키고; 및 세포 생존력, 세포 독성 및/또는 세포 소멸을 측정하는 것에 의해 평가된다. 생존력(증식력), 세포 독성, 및 세포 소멸 측정에 유용한 세포-기초의 체외 분석법들은 본 기술 분야에 알려져 있다.
예로서, CellTiter-Glo®Luminescent Cell Viability Assay, 딱정벌레 목 발광효소(Coleoptera luciferase)의 재조합 발현에 기초하는 동질 분석(homogeneous assay)(US Patent Nos. 5583024; 5674713 and 5700670)이 상업적으로 입수 가능하ㄷ다(Promega Corp., Madison, WI). 이러한 세포 증식 분석은 대사적으로 활성인 세포의 지표인 세포 내에 존재하는 ATP의 정량화를 기반으로 하는 배양물 내의 생존력 있는 세포들의 수를 결정하는 것이다(US 6602677). 대안적으로, 세포 생존력은 본 발명 단백질의 존재 하에 배양된 세포들에 부가되는 비-형광성 레사주린(resazurin)을 이용하여 분석된다. 생존력 있는 세포들은 레사주린(resazurin)을, 예로서 현미경 또는 형광 플레이트 리더(fluorescent plate reader)를 사용하여 용이하게 검출되는, 붉은-형광성 레소루핀(resorufin)으로 환원시킨다. 세포 생존력의 분석을 위한 키트는, 예로서 Molecular Probes, Eugene, OR, USA으로부터 입수 가능하다. 세포 생존력을 위한 다른 분석법은, 그것이 합성될 때에 3H-티미딘(thymidine) 또는 14C-티미딘(thymidine)의 DNA로의 혼입을 결정하는 것을 포함하는 것으로, 세포 분리(division)와 관련된 DNA 합성에 대한 분석이다. 그러한 분석에서, 세포는 세포의 분리가 일어나기에 충분한 시간 동안 표지화된 티미딘의 존재 하에서 배양된다. 이어서 어떤 결합되지 않은 티미드의 제거를 위해 세척하고, 예를들면 섬광 카운터(scintilation counter)를 사용하여 표지(예를들면, 방사성 표지)가 검출된다. 세포적 증식을 결정하는 대안적 분석법들은, 예로서 BrdU 혼입에 의한 DNA 합성의 측정을 포함한다(ELISA 또는 면역조직화학(immunohistochemistry), Amersham Pharmacia Biotech으로부터 입수 가능한 키트에 의한). 세포 소멸을 검출하기 위한 예시적 분석법들은 아폽토시스(apoptosis)에서 세포들을 초기에 염색하고, 세포 샘플의 고정을 요구하지 않는 APOPTEST (Immunotech로부터 입수 가능한)를 포함한다. 이 방법은 아폽토시스(apoptosis) 진행 중인 세포의 특징인 세포막 재-구성(re-configuration)을 검출하기 위하여 부속되는(annexin) V 항체를 사용한다. 이러한 방법으로 염색된 아폽토틱(apoptotic) 세포들은 다음으로 형광 활성 세포 분류(FACS), ELISA에 의하거나 또는 고정된 부속의 V 항체를 이용하는 접착 및 패닝(adhesion and panning)에 의하여 분류될 수 있다. 대안적으로, 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소(deoxynucleotidyl transferase)-매개의 비오틴화된(biotinylated) UTP 닉-말단 표지화(nick end-labelling)(TUNEL) 분석이 세포 소멸의 수준을 결정하는데 사용된다. TUNEL 분석은 비오틴화된(biotinylated) 뉴클레오티드를 갖는, 아폽토시스(apoptosis) 동안 생성되는, 표지 3'-OH DNA 말단들에 대한 효소 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소(deoxynucleotidyl transferase)를 사용한다. 그런다음 상기 비오틴화된(biotinylated) 뉴클레오티드들은, 검출 가능한 마커에 접합하는 스트렙타비딘(streptavidin)을 사용하여 검출된다. TUNEL 염색을 위한 키트는, 예로서 Intergen Company, Purchase, NY로부터 입수 가능하다.
본 발명 단백질의 안정성은 또한 본 발명 단백질을 혈청 및/또는 세포에 노출시키고 후속적으로 본 발명의 단백질을, 예로서 면역 친화성 정제를 사용하여 분리함으로써 평가될 수 있다. 회수된 본 발명 단백질에서의 감소된 양은 본 발명의 단백질이 혈청에서 또는 세포에 노출되었을 때에 분해된 것을 나타낸다.
다른 예로서, 수용체에 대한 리간드의 결합을 막는 본 발명 단백질의 능력은 표준화된 방사성-면역 분석 또는 형광-면역 분석을 사용하여 평가된다.
체내 테스팅
본 발명의 단백질은 또한 체내에서의 그 안정성 및/또는 효능에 대하여 평가될 수 있다. 예로서, 본 발명의 단백질은 피험자에 투여되고, 예를들면 ELISA를 사용하거나 또는 단백질에 접합된 검출 가능한 표지를 검출함으로써 그 단백질의 혈청 수준이 시간에 걸쳐 검출된다. 이는 본 발명 단백질의 체내 안정성의 결정을 허용한다.
본 발명의 단백질은 또한 인간 질병의 동물 모델에 투여될 수 있다. 숙련된 기술자는 본 발명의 단백질이 결합하는 항원을 기반으로 하는 적당한 모델을 또한 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 예로서 인간 암의 예시적인 모델들이 본 기술 분야에 알려져 있다. 예로서, 유방암의 마우스 모델은 섬유 아 세포 성장 인자 3(fibroblast growth factor 3)(Muller 외, 1990); TGF-알파(Matsui 외, 1990) ; erbB2 (Guy, 외, 1992); RET-1 (Iwamoto et 외, 1990) 를 과발현하는 마우스 또는 SCID 마우스로의 인간 유방암 세포의 이식을 포함한다. 난소암의 모델은 마우스로의 난소암 세포의 이식(예를들면, Roby 외, 2000에 기재된 바와 같이); 만성적으로 황체 형성 호르몬을 분비하는 유전자 이식된 마우스(Risma 외, 1995); 또는 Wx/Wv 생쥐를 포함한다. 전립선 암의 마우스 모델들이 본 기술 분야에 알려져 있으며, 예로서 SV40 초기 유전자들의 강제된 발현으로부터 도출되는 모델들(예로서, SV40 초기 유전자들을 발현하기 위한 최소의 쥐 프로바신 프로모터(minimal rat probasin promoter) 또는 큰 T 항원(large T antigen)을 발현하기 위한 긴 프로바신 프로모터(long probasin promoter)를 사용하는 TRAMP 모델, 집합적으로 명명되는 'LADY' 모델) 또는 c-myc 또는 Bcl-2 또는 Fgf8b 을 발현하는 또는 압도적인 네가티브 TGFβ를 발현하는 마우스(전립선 암의 유전자 이식된 모델의 리뷰를 위한 Matusik 외, 2001 참조)를 포함한다.
본 발명 단백질은 또한 암 외의 다른 질병의 동물 모델, 예로서 당뇨병을 억제, 예방, 처치 또는 지연시키는 데 있어 그들의 능력을 평가하기 위한 NOD 마우스(예를들면, Tang 외(2004)에 기재된 바와 같이) 및/또는 GVHD의 마우스 모델(예를들면, Trenado(2002)에 기재된 바와 같이) 및/또는 건선(psoriasis)의 마우스 모델(예를들면, Wang 외(2008)) 및/또는 류마티스성 관절염의 모델, 예를들면 SKG 과로(strain)의 마우스(Sakaguchi 외), 쥐 타입 II 콜라겐 관절염 모델, 마우스 타입 II 콜라겐 관절염 모델 또는 수 개 종(species) 내에서 항원 유도된 관절염 모델(Bendele, 2001) 및/또는 다발성 경화증 모델(예로서, 실험적 자가면역성 뇌척수염(encephalomyelitis)(EAE; Bra이 및 Linington, 1996) 및/또는 염증성 기도(airway) 질병(예로서, OVA 공격(challenge) 또는 바퀴벌레 항원 공격 (cockroach antigen challenge )(Chen 외, 2007; Lukacs 외, 2001) 및/또는 염증성 장 질병의 모델들(예를들면, 덱스트란 소듐 술페이트(DSS)-유도된 대장염(colitis) 또는 대장염의 Muc2 부족 마우스 모델(Van der Sluis 외, 2006))에 투여될 수 있다.
진단적/예후적 방법들
일 예에서, 본 발명은 질환을 진단하거나 예후하는 방법들을 제공한다.
여기서 사용된 바로서, 용어 "진단" 및 이에 제한되는 것이 아닌, "진단", "진단된"또는 "진단하는"과 같은 그 다양한 형태는 만성적인 질환의 어떠한 주요한 진단 또는 재발성 질병의 진단을 포함한다.
여기 사용된 바와 같은 "예후", "예후하는" 및 그 다양한 형태들은 회복 또는 재발의 가능성을 포함하는, 질병의 가능성 있는 결과 또는 과정을 의미한다.
일 예에서, 상기 방법은 샘플 내 항원의 양을 결정하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 단백질들은, 진단적 또는 연구 목적을 위한 세포 분류(예를들면, 흐름 혈구 계산(flow cytometry), 형광 활성된 세포의 분류)와 같은 응용에서의 유용성을 갖는다. 예로서, 샘플은 일정 시간 동안 그것이 항원에 결합하여 복합체를 형성하기에 충분한 조건 하에서 본 발명의 단백질과 접촉되고, 그런다음 상기 복합체가 검출되거나 또는 복합체의 수준이 결정된다. 이러한 목적을 위하여, 상기 단백질들은 표지화 또는 비표지화될 수 있다. 그 단백질들은 직접적으로, 예를들면 본원에 개시된 방법을 사용하여 표지화될 수 있다. 비표지화될 때, 상기 단백질들은 적당한 수단, 예로서 응집 분석법(agglutination assays)을 사용하여 검출될 수 있다. 또한 비표지화된 항체 또는 단편들이, 단백질 또는 다른 적당한 시약(예를들면, 표지화된 단백질 A)과 반응하는 표지화된 항체(예를들면, 2차 항체)와 같은, 단백질을 검출하는데 사용될 수 있는 다른(즉, 하나 이상의) 적당한 시약과 조합하여 사용될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 단백질은 면역 분석에서 사용된다. 바람직하게, 면역 조직 화학(immunohistochemistry), 면역 형광법(immunofluorescence), 효소 연결된 면역 흡착체 분석(enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), 형광 연결된 면역 흡착체 분석(fluorescence linked immunosorbent assay (FLISA) , 웨스턴 블라팅(Western blotting), RIA, 바이오센서 분석, 단백질 칩 분석 및 면역 염색 분석(immunostaining assay) (예를들면, 면역 형광법(immunofluorescence))으로 구성된 그룹으로부터 선택된 분석을 사용하여.
표준화된 고체상의 ELISA 또는 FLISA 포맷은 특히 다양한 샘플로부터의 단백질 농도를 결정하는데 유용하다.
일 형태에서 그러한 분석법은 예로서 폴리스티렌 또는 폴리카보네이트 마이크로 웰 또는 딥스틱(dipstick) 과 같은 고체 매트릭스, 멤브레인, 또는 유리 지지체(예를들면, 유리 슬라이드) 상에 생물학적 샘플을 고정시키는 것을 포함한다. 관심 있는 항원에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단백질은 고정된 샘플과 직접적으로 접촉되어, 상기 샘플 내에 있는 표적 항원의 어느 것과 직접적인 결합을 형성한다. 본 발명의 단백질은 일반적으로, 예로서 FLISA의 경우에 형광 표지(예를들면 FITC 또는 Texas Red) 또는 형광 반도체 나노 결정체(US 6,306,610에 기재된 바와 같이) 또는 ELISA의 경우에 효소(예를들면, 서양 고추냉이 퍼록시다아제(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스페이트(AP) 또는 β-갈락토시다아제) 와 같은 검출 가능한 리포터 분자로 표지화되며, 또는 대안적으로 본 발명의 단백질에 결합하는 표지화된 항체가 사용될 수 있다. 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위한 세척에 이어 상기 표지는, 형광 표지인 경우에는 직접적으로, 또는 효소 표지인 경우에는 예로서 과산화수소, TMB, 또는 톨루이딘(toluidine), 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌-베타-D-갈라오토피라노시드(5-bromo-4-chloro-3-indol-beta-D-galaotopyranoside)(x-겔)과 같은 치환기의 부가를 통하여 검출될 수 있다. 그러한 ELISA 또는 FLISA를 기반으로 하는 시스템들은, 특히 그 단백질이 결합하는 알고 있는 양의 기준 단백질, 예로서 분리된 및/또는 재조합 단백질 또는 그 면역성(immunogenic) 단편 또는 그 항원 결정기(epitope)와 같은, 에 대해 검출 시스템을 조정함으로써, 단백질 샘플 내 단백질 양의 정량화에 적합하다.
다른 형태에서, ELISA 또는 FLISA는 본 발명의 단백질 및 관심 있는 항원에 결합하는 항체를, 예로서 멤브레인, 폴리스티렌 또는 폴리카보네이트 마이크로 웰, 폴리스티렌 또는 폴리카보네이트 딥스틱(dipstick) 또는 유리 지지체 상에 고정시키는 것을 포함한다. 샘플은 그런 다음 상기 본 발명의 단백질과의 물리적인 연결이 이루어지고, 및 상기 화합물이 결합하는 단백질은 결합되거나 또는 "포획된다". 다음으로 결합된 단백질은, 다른 단백질 또는 그 동일 단백질 내 다른 사이트와 결합하는, 표지화된 본 발명의 단백질을 이용하여 검출된다. 대안적으로, 제3의 표지화된 항체가 제2(검출하는) 항체에 결합하는데 이용될 수 있다.
이미징 방법들
상술한 바로부터 숙련된 기술자에게 명백할 것과 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 이용하는 이미징 방법을 고려한다. 이미징을 위하여, 본 발명의 단백질은, 이미징에 의해 검출 가능한 신호를 방출할 수 있는 어떤 분자 또는 제재일 수 있는, 검출 가능한 표지에 접합된다. 예로서, 검출 가능한 표지는 단백질, 방사성 동위원소, 형광단(fluorophore), 가시광선 방출 형광단, 적외선 방출 형광단, 금속, 강자성 물질, 전자기 방출 물질, 특이한 MR 분광학적 시그니쳐를 갖는 물질, X-레이 흡수 또는 반사 물질, 또는 사운드 변화 물질일 수 있다.
본 발명의 단백질은 이미징 과정에 앞서, 시스템적으로, 또는 국지적으로 이미지되는 종양, 기관, 또는 조직에 투여될 수 있다. 일반적으로, 단백질은, 종양, 조직 또는 기관의 바람직한 광학적 이미지를 달성하기에 효과적인 양으로 투여된다. 그러한 양은, 사용되는 특정 단백질, 이미징 과정에 놓여지는 종양, 조직, 또는 기관, 사용될 이미징 장비 등에 따라 광범위하게 달라질 수 있다.
본 발명의 어떤 실시예에서, 본 발명의 단백질은, 이에 제한되는 것이 아닌, 종양의 이미징, 기관의 단층 촬영(tomographic) 이미징, 기관 기능의 모니터링, 관상 동맥 혈관 촬영법(coronary angiography), 형광 내시경 검사법(fluorescence endoscopy), 레이저 가이드 수술, 광청각 및 음형광 방법(photoacoustic and sonofluorescence methods) 등을 포함하는 다양한 생의학적 응용들에서의 조직들 및 기관들의 체내 광학적 이미징 제재로서 사용된다. 본 발명의 단백질이 이미징을 위해 사용되는 예시적 질병들, 예를들면 암들이 본원에 개시되며 필요한 변경을 가하여 본 발명의 실시예에 적용되는 것으로 여겨질 것이다. 일 예에서, 본 발명의 단백질 접합체들은, 피험자 내에서 본 발명의 특정 단백질이 농축된 곳에서 모니터링 함으로써 종양 또는 다른 이상 징후들 존재의 검출에 유용하다. 다른 실시예에서, 본 발명의 단백질은, 복강경 검사법(laparoscopy)에 의한 종양의 미세-전이(micro-metastases)의 검출 용으로 레이저-보조의 가이드된 수술에 대해 유용하다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 단백질은 죽상 경화증 치석(atherosclerotic plaques) 및 혈전(blood clots)의 진단에 유용하다.
이미징 방법들의 예는 자기공명이미징(MRI), MR 분광기, 방사선 사진법(radiography), CT, 초음파, 평면 감마 카메라 이미징(planar gamma camera imaging), 단일 광자 방출 단층 촬영(single-photon emission computed tomography (SPECT)), 양전자 방사 단층 촬영(positron emission tomography (PET)), 다른 핵 의학 기반 이미징(nuclear medicine-based imaging), 가시광선을 사용하는 광학적 이미징, 발광효소(liciferase)를 사용하는 광학적 이미징, 형광단(fluorophore)를 사용하는 광학적 이미징, 다른 광학적 이미징, 근적외선을 사용하는 이미징, 또는 적외선을 사용하는 이미징을 포함한다.
나아가 본 발명 방법들의 어떤 예들은 피험자에 대한 수술 과정 동안에 조직을 이미징하는 것을 포함한다.
다양한 이미징 기술들이 본 기술 분야에서 평균적으로 숙련된 자들에게 알려져 있다. 이러한 기술의 어느 것도 검출 가능한 표지로부터의 신호를 측정하는 본 발명 이미징 방법의 내용에 적용될 수 있다. 예로서, 광학적 이미징은 특정한 의학 영역에서 광범위하게 허용됨을 획득한 하나의 이미징 양태이다. 예들은 세포 성분의 광학적 표지화 및 플루오레세인 혈관 촬영법(fluorescein angiography) 및 인도시아닌록 혈관 촬영법(indocyanine green angiography)과 같은 혈관 촬영법을 포함한다. 광학적 이미징 제재들의 예들은, 예로서 플로오레세인(fluorescein), 플로오로세인 유도체, 인도시아닌록(indocyanine green), 오레곤록(Oregon green), 오레곤록 그린 유도체의 유도체(derivative of Oregon green derivative), 로다민록(rhodamine green), 로다민록의 유도체, 에오신(eosin), 에리틸로신(erytilrosin), 텍삿 레드(Texas Red), 텍사스 레드의 유도체, 말라카이트 그린 (malachite green), 나노 금 술포숙신이미딜 에스테르(nanogold sulfosuccinimidyl ester), 캐스캐이드 블루(cascade blue), 쿠머린 유도체(coumarin derivative), 나프탈렌, 피리딜옥사졸 유도체(pyridyloxazole derivative), 캐스캐이드 옐로우 다이(cascade yellow dye), 댑옥실 아디(dapoxyl dye)를 포함한다.
감마 카메라 이미징은 검출 가능한 표지로부터 유도되는 신호를 측정하기 위해 사용될 수 있는 이미징 방법으로서 고려된다. 본 기술 분야의 통상의 기술자는 감마 카메라 이미징의 적용을 위한 기술에 익숙할 것이다. 일 실시예에서, 신호를 측정하는 것은 111In 또는 99mTc 접합, 특히 111In- 옥트레오티드(octreotide) 또는 99mTc-소마토스타틴 유사물 (somatostatin analogue)의 감마-카메라 이미징의 사용을 포함할 것이다.
컴퓨터 단층 촬영(Computerized tomography (CT)) 본 발명의 내용 내에서 이미징 양태로서 고려된다. 다양한 각도로부터의 X-ray 시리즈를 얻고 그들을 컴퓨터로 조합함으로써, CT는 신체 어느 부분의 3차원적 이미지를 만드는 것이 가능하다. 컴퓨터는 어떤 각도로부터 및 어떤 깊이에서의 2차원적 슬라이스를 보여주도록 프로그램 된다. 상기 슬라이스들이 조합되어 3차원적 표현을 건설할 수 있다.
CT에서, 관심있는 항원에 결합하는, 본 발명의 단백질에 접합된 방사성 불투과성의 대조 제재(radiopaque contrast agent) 의 정맥 주사가, 초기 CT 스캔이 진단에 유용하지 못한 연약 조직 덩어리의 확인 및 묘사(delineation)를 보조할 수 있다. 유사하게, 대조 제재들은 연약 조직 손상의 혈관질(vascularity)를 측정하는 데에도 보조한다. 예로서, 조영제의 사용은 종양과 그 주변의 혈관 구조의 관계의 묘사를 도울 수 있다.
CT 대조 제재들은, 예로서 요오드화된 대조 배지이다. 이러한 제재들의 예들은 이오탈라메이트(iothalamate), 이오헥사올(iohexol), 디아트리조에이트(diatrizoate), 이오파미돌(iopamidol), 에티요오돌(ethiodol), 및 이오파노에이트(iopanoate)를 포함한다. 가돌리늄(Gadolinium) 제재, 예로서 가도펜테이트(gadopentate) 역시 CT 대조 제재로서의 사용이 보고되어 있다.
자기 공명 이미징(MRI)은 이미지들을 생성하기 위하여 높은 강도의 자석 및 무선 주파수(radio-frequency) 신호들을 사용하는 이미징 양태이다. MRI 에서, 이미지되는 샘플은 강한 정적 자기장(static magnetic field) 내에 놓여지고 샘플 내에 네트 자화(net magnetization)를 생성하는 무선 주파수 방사 펄스(pulse of radio frequency (RF) radiation)로 여기된다. 그런다음 다양한 자장의 기울기(gradient) 및 다른 RF 펄스가 공간적 정보를 기록되는 신호들로 코드하도록 작용한다. 이러한 신호들을 집합하고 분석함으로써, CT 이미지에서와 같이 보통으로는 2 차원적 슬라이스들 내에서 보여지는, 3 차원적 이미지를 컴퓨팅하는 것이 가능하다. 상기 슬라이스들은 3 차원적 표현을 구조하도록 조합될 수 있다.
MRI 또는 MR 분광학 이미징에서 사용되는 대조 제재들은 다른 이미징 기술들에서 사용되는 것과 다르다. MRI 대조 제재들의 예들은 가돌리늄 킬레이트, 망간 킬레이트, 크롬 킬레이트, 및 철 파티클들을 포함한다. 예로서, 본 발명의 단백질은 스칸듐, 티탄, 바나듐, 크롬, 망간, 철, 코발트, 니켈, 구리, 몰리브덴, 루테늄, 세륨, 인듐, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 프로메티움, 사마륨, 유로퓸, 가돌리늄, 테르븀, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 툴륨, 및 예테르븀으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 상자성 금속의 킬레이트를 포함하는 화합물에 접합된다. 본 발명을 위한 유용한 이미징 제재들의 추가적 예는, PFOB와 같은 함(含)할로겐 탄소 화합물(halocarbon) 기반의 나노 파티클 또는 다른 플루오르 기반의 MRI 제재이다. CT 및 MRI 모두 조직 경계들과 혈관 구조를 구분하는데 도움이 되는 해부학적 정보를 제공한다.
세포 생존력과 같은 세포 수준의 정보에 부속되는 정보를 제공하는 이미징 양태들은 양성자 방출 단층 촬영(positron emission tomography (PET)) 및 단일 광자 방출 계산된 단층 촬영(single-photon emission computed tomography (SPECT))을 포함한다. PET에서, 환자는 그 물질이 신체를 통해 이동할 때에 모니터될 수 있는 양성자들을 방출하는 방사성 물질을 흡수 또는 그것으로 주입된다.
PET에 가깝게 관련되어 있는 것이 단일 광자 방출 계산된 단층 촬영(single- photon emission computed tomography) 또는 SPECT이다. 양자의 큰 차이는 양성자를 방출하는 물질 대신에, SPECT는 고에너지 광자들을 방출하는 방사성 추적자를 사용한다는 것이다. SPECT는 관상 동맥 질병(coronary artery disease)을 포함하는 여러 질병들(multiple illnesses)을 진단하는데 유용하며, 이미 매년 약 2.5 만의 SPECT 심장 연구들이 미국에서 수행된다.
PET를 위하여, 본 발명의 단백질은 통상적으로 11C, 13N, 15O, 18F, 82Rb, 62Cu, 및 68Ga과 같은 양성자 방출자(positron emitter)로 표지화된다. SPECT를 위하여, 본 발명의 단백질은 99mTc, 201Tl, 및 67Ga, 111In과 같은 양성자 방출자로 표지화된다.
동물 및 인간의 비침입성 형광 이미징(Non-invasive fluorescence imaging)이 또한 체내 진단적 정보를 제공할 수 있고 넓은 다양성의 임상 전문 분야들에서 사용될 수 있다. 예로서, 형광단들의 UV 여기(UV excitation of fluorophores)에 이어 발전된 장비를 사용하는 복잡한 분광학적 이미징(예를들면, Andersson-Engels 외, 1997 참조)에 이르기까지 간단한 관측들을 포함하는 기술들이 수 년에 걸쳐 개발되어 왔다. 예를들면, 형광단들(fluorophores) 또는 형광 단백질들의 체내 검출을 위한 기술에서 알려진 특정 장비들 또는 방법들은, 이에 한정되는 것은 아닌, 체내 근적외선 형광법(in vivo near-infrared fluorescence) (예를들면, Frangioni, 2003 참조), Maestro®체내 형광 이미징 시스템(in vivo fluorescence imaging system) (Cambridge Research & Instrumentation, Inc.; Woburn, MA), 비산점 주사(飛散點走査)기(flying-spot scanner)를 사용하는 체내 형광 이미징(in vivo fluorescence imaging)(예를들면, Ramanujam 외,, 2001 등 참조)을 포함한다.
광학적 반응을 검출하는 다른 방법들 또는 장비들은, 제한 없이, 시각적 관찰(visual inspection), CCD 카메라, 비디오 카메라, 사진 필름, 레이저 스캐닝 장비, 형광계(fluorometers), 감광성 반도체 소자(photodiodes), 양자 카운터(quantum counters), 형광외 현미경(epifluorescence microscopes), 주사형 현미경(scanning microscopes), 흐름 혈구 계산기(flow cytometers), 형광 미세 혈소판 판독기(fluorescence microplate readers), 또는 광전자 증배관을 이용하는 신호 증폭을 포함한다.
어떤 예들에서, 이미징 제재는 예를들면, 본원에 개시된 모델을 사용하여, 인간에서의 사용에 앞서 체외 또는 체내 분석을 이용하여 평가된다.
제조품(Articles of Manufacture)
본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 포함하는 제조품, 또는 "키트"를 제공한다. 제조품은 선택적으로, 용기 및 표지 또는 상기 용기 상에 또는 그에 결합되는, 예를들면 어떤 실시예에 따라 본원에 개시된 방법으로 본 발명의 단백질을 사용하는 설명을 제공하는 패키지 삽입물을 포함한다. 적당한 용기는, 예로서 병, 바이알, 주사기, 블리스터 팩(blister pack) 등이다. 상기 용기들은 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 소재들로부터 형성 가능하다. 용기는 본 발명의 단백질 조성물을 유지하며 살균 액세스 포트를 구비할 수 있다(sterile access port )(예로서 용기는 정맥 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 스타퍼를 구비하는 바이알일 수 있다). 대안적으로, 또는 부가적으로, 제조품은 부가적으로, 주입용 세균 발육 억제수(bacteriostatic water)(BWFI), 포스페이트 버퍼의 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액(dextrose solution)과 같은, 약학적으로 허용되는 버퍼를 포함하는 제2 의(또는 제3의) 용기를 추가적으로 포함할 수 있다. 기타 버퍼, 희석제, 필터, 니들, 및 주사기를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 기구들이 추가적으로 포함될 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 예들에서 더욱 더 기재된다.
실시예 1-분자 모델링
1.1 아비바디(Avibodies)에 대한 분자 모델 제조
아비바디는 항체의 다양한 도메인을 포함하는 재조합 단백질이다. 아비바디는, VH-내지-VL 또는 VL-내지-VH 방향으로 단(short) 연결자 영역에 의해 배열된 단일 폴리펩티드 내로 그들을 융합시킴으로써 단일 클론 항체들의 가변 영역들을 이용한다. 연결자 길이에 따라서, 이러한 아비바디는 하나, 둘, 셋 또는 넷의 기능성 결합 사이트를 각각 갖는 안정된, 생물학적으로 활성인 일원항체(monobodies)(scFv), 이원 항체(diabodies), 삼원 항체(triabodies) 또는 사원 항체(tetrabodies)로 설계된다.
아비바디 모델의 VH 및 VL 도메인 서열들은 BLAST 및/또는 FASTA 연구 양자를 사용하는 RCSB PDB 데이타 은행(www.pdb.org)을 연구하는데 사용되었다. 가장 높은 서열의 동일성, 해상도 및 완벽성을 갖는 구조가 모델화된 아비바디의 Fv 도메인을 위한 원형으로의 사용을 위해 선택되었다. pdb 파일 내의 비대칭 유닛이 하나를 초과하는 원형 모델을 포함하면 모든 원형들이 동일하게 사용 및 처리되었다.
아비바디 이원 항체들 및 삼원 항체들을 위해, 4 개의 원형들이 원형 Fvs의 배열을 공간 상에 세트하고 이러한 아비바디들의 모델링을 허용하기 위해 사용되었다. 이원 항체들을 위해 1LMK(Perisic 외, 1994) 또는 1MOE(Carmichael 외, 2003)이 다양하게 사용되었고, 삼원 항체들을 위해 1NQB(Pei 외, 1997)이 모델링을 위해 원형들을 4차 공간 상에 배열하기 위해 사용되었다.
4차 배열을 위하여, Fv 도메인을 위해 Israel Gelfand 에 의해 제조된 핵심 좌표 집합(core coordinate set)의 본(copies)((Gelfand 외, 1998a) 은, "코어" 호모-이합체 또는 호모-삼합체를 형성하기 위한 4차 원형에 따라 정렬된 최소의 스퀘어였다. 다음으로 각 아비바디을 위해 선택된 Fv 원형은, 원형 호모-이합체 또는 호모-삼합체를 형성하기 위한 이러한 "코어" 호모-이합체 또는 호모-삼합체 내의 각 Fv에 따라 정렬되는 최소의 스퀘어였다. 이러한 파일들은 다양한 아비바디들을 모델링하기에 요구되는 연결성을 나타내도록 계속하여 교정되었다.
모든 경우에서, "코어" 4차 모델들은 최종 모델링 실행들에서의 Fv 도메인 모델링을 위해서는 사용되지 않았고, 연결 잔기들은 "처음부터" 루프들로서 모델되었다.
아비바디의 분자들의 모델은, 소프트웨어 내 삽입되고 소프트웨어 내 포함된 채점 기능을 사용하여 평가되는 MODELLER 알고리즘 (Sali 및 Blundell, 1993)을 사용하는, Discovery Studio (DS) Software (v2.5, Accelrys, CA, USA)을 사용하여 제조되었다. 베스트 모델은 종합적인 물리 에너지를 위하여 MODELLER 생성된 확률 밀도 함수(Probability Density Function (PDF)) 각각에서의 높은 랭킹 점수의 존재 및 이산 최적화 된 단백질 에너지(Discrete Optimized Protein Energy (DOPE)) 점수, (Shen et. al., 2006)를 기반으로 하여 선택되었다. 선택된 모델은 추가적인 분석을 위하여 pdb 파일로 기록되었다. 결론적인 모델들의 이미지는 또한 DS를 사용하여 제조되었다.
각 선택된 모델의 추가적인 분석은 그래픽 워크스테이션 상의 시각적 관찰 및 관련 잔기들의 용매 접근 가능한 표면 영역(solvent accessible surface area (ASA))을 포함했다. 상기 ASA는 여기서 모델화된 이황화 돌연변이의 접합에 대한 이용 가능성이 있는지에 대한 능력을 평가하는데 사용되었다. 그런 다음 중심 ASA로부터의 표준 편차(Excel에서 계산된)는 이황화물 내의 시스테인 잔기들 또는 다른 그룹의 잔기들(즉, CDRs)의 양자 또는 어느 한쪽이 유사하게 노출되는지에 대한 표시로서 사용되었다. 예로서, 큰 표준 편자는 이황화물 내 잔기들 중 하나가 환원 및/또는 접합을 위해 덜 노출될 것을 의미한다. 또한 평균 잔기 당 평균 ASA이 CDRs에 대해, 일반적으로 노출되는 잔기들의 그룹에 대한 이황화물들의 비교를 촉진하기 위해 포함된다. 내부-시트 보존된 이황화물의 평균 ASA 는 일반적으로 매몰된 비접근성 잔기들의 그룹에 대한 이황화물들의 비교를 촉진하기 위해 사용되었다.
본원에 개시된 작업에 대해, 그들이 단량체, 이합체 또는 삼합체 접합이든지, 또는 각 scFvs가 VH 에서 VL 방향인지 또는 VL에서 VH 방향이든지, 접합 가능성의 표지로서 ASA의 관점에서 모델화된 이황화 돌연변이의 접근성에서는 큰 차이가 없음이 명확하였다.
1.2 AVP04-07 이원 항체를 위한 V H 에서 V L 연결된 분자 모델의 제조
AVP04-07 아비바디(SEQ ID NO. 55)는 이론적인 pI/Mw: 8.0 / 51 KDa, VLκ 경쇄 및 서브그룹 I VH 쇄를 포함하는 재조합 이원 항체이다. AVP04-07 은 항원 TAG72 관련 종양을 인식한다.
이러한 아비바디는 두 개의 기능성 결합 사이트들을 포함하는 안정된, 생물학적으로 활성인 이원 항체를 형성하기 위해 서열 내 그들을 융합시킴으로써 뮤린 모노클로날 항체 CC49의 가변 영역을 사용한다. CC49의 가변 도메인들은 예외적인 체외 및 체내 특성들을 갖는 고-발현성 및 높은 안정성 재조합 분자에 도달하기 위하여 아미노산 서열 내에서 변형되어왔다(Roberge 외, 2006).
AVP04-07의 VH 및 VL 도메인 서열들을 갖는 PDB의 연구에서, PDB 내 하나의 항체로서, 갭-비포함 정렬(un-gapped alignment) 내의 VH 및 VL 의 양 도메인들 내에서 AVP04-07 과 82% 동일성을 갖는 1ZA6 (Larson 외, 2005)를 강조하였다.
1ZA6 원형은 항-종양 CH2-도메인-삭제된 인간화된 항체의 구조를 인코드한다. 또한 이러한 재조합 인간화된 항체는 TAG72 항원을 인식한다.
1ZA6 pdb 파일 내의 Fv 구조는 AVP04-07 이원 항체의 Fv 도메인을 모델링하는데 사용되었다. 상기 언급된 1LMK가 상기 언급된 방법에서 AVP04-07을 형성하기 위한 원형의 4차 공간적 정렬을 위해 사용되었다. 선택된 가장 높은 점수의 AVP04-07 모델이 도 1에 도시되고, 이러한 아비바디 이합체의 "비-돌연변이적" 형태를 나타낸다.
1.3 AVP04-17 이원 항체를 위한 V H 에서 V L 연결된 분자 모델의 제조
AVP04-17 아비바디(SEQ ID NO. 59)는 이론적인 pI/Mw: 6.4 / 55 KDa, 예외적으로 긴 CDRH3 루프 VLλ경쇄 및 서브그룹 I VH 쇄를 포함하는 재조합 이원 항체이다. AVP04-17 은 항원 HER2 관련된 종양을 인식한다.
AVP04-17 아비바디는 AVP04-07 아비바디와 비교하여 표준 Fasta 및 Blast 연구를 사용할 때 RCSB pdb에서 입수 가능한 구조들과 낮은 동일성을 갖는다. VL 및 VH 쌍의 어떤 Fv도 AVP04-07 아비바디에 대해 얻어지는 결과와 비교할 때 AVP04-17 아비바디와는 높은 동일성을 보여주지 않았다.
PDB를 연구하는 대안적인 방법들이 완전한 Fv 도메인들에 대한 원형 선택을 향상시키기 위해 평가되었다. MATRAS 서버(Kawabata 2003, Kawabata 외, 2000)는 원형 선택을 보조하기 위해 정열된 영역의 그래프적인 도시를 구비하는 BLAST를 사용하는 현재의 PDB에 대항하여 표준 서열 상동을 사용한다. 이러한 방법은 양자 모두 VL 및 VH 도메인 모두에서 64% 보다 큰 서열 동일성을 갖는 두 개의 우수한 원형을 발견하였다.
선택된 Fv 원형들은 pdb 파일들 a) 연결자 잔기들 및 CDRH3를 제외하고 AVP07-17에 대해 80.6%의 동일성을 갖는 2B1H (Stanfield 외, 2006) 및 b) 연결자 잔기들 및 CDRH3를 제외하고 AVP07-17에 대해 73.5%의 동일성을 갖는 3G04 (Sanders 외, 2007) 내에 포함되었다.
상기 기재된 1LMK 이원 항체가 상기 기재된 방법에서 AVP07-17("비돌연변이적")을 형성하기 위한 원형 Fvs의 4차 공간적 정렬을 위해 사용되었다. 또한 AVP07-17의 긴 CDRH3 루프 길이는 원형으로서의 사용에 대해서 어떠한 상동적 구조 가 발견되지 않을 수 있으므로 모델링에 있어 문제성이었다. 이들은 원형 강제(template constraints)가 없는 루프(본질적으로 "처음부터")로서 모델되었고, 모델링 후에는 구조적 방해에 대해 평가되었다. 여기 나타낸 모든 경우에서, CDR3 루프들은 낮은 신뢰성 수준으로 모델링 되며, 그들이 아비바디의 모든 구조 또는 골격 영역들에 영향을 미치는 것으로 간주되지 않았던 어떤 분석들에서는 포함되지 않는다.
AVP07-17 이원 항체의 선택된 가장 높은 점수의 모델은 도 2에서 보여지며 이러한 아비바디 이합체의 "비-돌연변이화된" 형태를 나타낸다.
1.4 AVP02-60 이원 항체를 위한 분자 모델의 제조
AVP02-60 아비바디(SEQ ID NO. 61)는 이론적인 pI/Mw: 8.47 / 50.1 KDa, VL 쇄 카파 및 서브그룹 III VH 쇄를 포함하는 재조합 이원 항체이다. 이것은 MUC1 유전자, CD227(Gendle 외, 1990)에 의해 인코드되는 뮤신 관련 유방암을 인식하는 주요 마우스 모노클로날 C595 항체를 기반으로 한다. 이것은 뮤신의 단백질 핵, 서열에서 약 40 회 반복되는 모티브(motif) 내에서 항원 결정기(epitope) RPAP를 인식한다.
VL 또는 VH 로의 Blast 및 Fasta 연구는 VL 및 VH 양자의 도메인들을 포함하는 높은 동일성 점수를 갖는 수 개의 원형들을 나타내었다. 그러나, 단지 하나의 원형이 서열 상 충분한 동일성 및 CDRH3를 모델링하기 위한 길이를 갖는 VH를 포함한다. 따라서 두 개의 원형들이 VH 및 VL 의 모델링을 위해 선택되었지만, 반면 하나의 여분의 원형이 VH 만의 모델링을 위해 선택되었다. 선택된 원형은 a) 1MHP VH 및 VL (86.9% 동일, 89.6% 상동; Karpusas, 외, 2003), b) 2B2X VH 및 VL (85.7% 동일, 88.3% 상동; Clark, 외, 2006) 및 c) CDRH3를 위한 갭이 없는 정렬을 구비하는 유일한 원형이며 이러한 Fv의 VL 도메인은 모델링에서 사용되지 않았던 2ADG VH: (86.8% 동일, 96.5% 상동; Zhou 외, 2005)이었다.
모든 원형들을 통해 AVP02-60는 88.4% 및 동일성 및 91.1% 상동성을 갖는다. 상기 기재된 1LMK 이원 항체가 상기 기재된 방법에서 AVP07-17("비돌연변이적")을 형성하기 위한 원형 Fvs의 4차 공간적 정렬을 위해 사용되었다.
AVP02-60 이원 항체의 선택된 가장 높은 점수의 모델은 도 3에서 보여지며 이러한 아비바디 이합체의 "비-돌연변이화된" 형태를 나타낸다.
1.5 조작적 대체 시스테인 돌연변이를 위한 골격 1 시스테인 삽입 위치의 확인 및 그것의 분자 모델링
면역 글로불린 V 도메인의 구조에서 골격 1(FR1)은, 그것이 두 β-시트들 중 하나의 가장자리에 위치하며, 따라서 일반적으로 보존된 내부 도메인 이황화 결합에 근접한 잔기들을 제외하고는 용매에 잘 노출되기 때문에 시스테인 대체를 조작하기 위해서 좋은 후보이다. 따라서 이 영역은 이황화를 포함하는 구조로의 접합 화학에 대한 자유로운 접근을 허용해야 한다.
조작된 골격 1 내부(intra-framework 1) 시스테인 대체를 포함하는 아비바디들은 여기서 "티올화된 아비바디("Thiolated Avibody")로 참조된다.
항체의 VL 및 VH 도메인들은 전형적인 위상(topology) 및 연결성을 갖는 두 시트들 내에서 고유의 7-10β 가닥들을 포함하는 면역 글로불린 거대 군(superfamily)의 1차적 멤버들이다. 이러한 도메인들은 도메인 축 내에서의 B-시트들에 대한 대칭성을 보여주는 V 타입 면역 글로불린들의 2차적 멤버들이다(Halaby, 외, 1999). 항체 V 타입 또는 V 세트 도메인들은 SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.c.b.b.b.html, Murzin, 외, 1995), InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/IEntry?ac=IPR013106, Hunter 외, 2009) 및 Pfam (http://pfam.sbc.su.se/family/PF07686, Bateman, 외, 2004)와 같은 온라인 데이타베이스들 내에서 구분되는 VH (타입 1-4), VLκ, VLλ 도메인들이다.
이들의 유사성을 잘 정의한다면, AVP04-07 VLκ 도메인 내에서 확인된 모든 잠재적인 골격 1 내부 시스테인 쌍 대체 돌연변이들은 VH (타입 1-4) 도메인들 및 VLλ 도메인들 모두에 대해 구조적으로 전달 가능하여야 한다고 가정하는 것은 합리적이다.
AVP04-07에 대해 제조된 모델의 VL 도메인은, 시스테인으로 돌연변이화될 수 있고 골격 1 내부 이황화 브릿지들을 형성할 수 있으며 또한 환원 및 그에 따라 유효 하중 (payload)에 대한 접합이 가능한 잔기들의 쌍들에 대한 그래픽 워크 스테이션에서 관찰되었다. 서로를 향하도록 일반적으로 편향된(angled) 측쇄들을 가지며, 측쇄 원소들이 일반적으로 용매에 노출되게 하며 Cα 탄소 원소들이 ~6-7Å떨어지게 하는 FR1 내 잔기들의 쌍은 이황화 결합을 형성 가능하게 하는 골격 1 내의 시스테인 삽입에 대한 좋은 후보로 여겨졌다.
VH 도메인들로의 전사를 위하여, Gelfand 중심 공-좌표(core co-ordinates) (Gelfand 외, 1998a; Gelfand 외, 1998b)의 VH 및 VL 도메인들의 구조적 정렬이 생성되었다. 이러한 정렬된 VL 및 VH 중심들(cores)은 이어서 각 비돌연변이화된 Fv 도메인 모델로부터의 VH 및 VL 도메인들을 정렬시키는데 사용되었다. 이러한 구조적인 정렬은 다음으로 VH 도메인 시스테인 삽입 돌연변이들을 모델링하기 위해 사용되는, VL 에서 VH 서열들로 확인되는 시스테인 돌연변이의 쌍들을 맵핑하는데 사용되었다. 각 경우에서, 단일 모델링의 실행은 각 VL 및 VH 도메인 내의 단일의 유사 시스테인 돌연변이 쌍들을 포함하는, 이중 시스테인 삽입 돌연변이 모델을 생성하는데 사용되었다.
1.6 시스테인 대체 돌연변이를 조작하기 위해 확인되는 골격 1 시스테인 삽입 위치들 및 AVP04 아비바디 이원 항체에서의 분자 모델링
비돌연변이화된 AVP04-07 모델은 본원에 개시된 바와 같이 골격 1 내의 시스테인 삽입 돌연변이의 맵핑을 위한 출발점이었다. 이러한 맵핑은 확인된 VL 시스테인 삽입의 위치가 정말로 구조적으로 용이하게 VH 도메인으로 맵핑될 수 있으며 이러한 잔기들이 이황화 결합을 형성할 것이라는 점을 보여주었다.
AVP04-07의 골격 1 VL(Kabat 잔기들 1 내지 23 함유의) 및 골격 1 VH(Kabat 잔기들 1 내지 30 함유의) 내에서, 골격 1 내부 시스테인 삽입을 위한 바람직한 위치는 하기와 같이 확인되었다:
●경쇄 골격 1 Kabat 잔기들 L8 및 L11(AVP04-50, SEQ ID NO:57)
●중쇄 골격 1 Kabat 잔기들 H7 - H10(AVP04-84, SEQ ID NO:63)
●경쇄 골격 1 Kabat 잔기들 L14 및 L17(AVP04-78, SEQ ID NO:77)
●중쇄 골격 1 Kabat 잔기들 H13 - H16(AVP04-85, SEQ ID NO:75)
모델링은 상기 바람직한 돌연변이를 나타내는 서열의 입력을 제외하고, 동일한 입력 파라미터들을 사용하는 AVP04-07 모델(실시예 1.2)을 위해 설명된 방법을 사용하여 반복되었다. 또한 모델의 평가는 AVP04-07 모델에서와 같이 수행되었다.
각 시스테인 삽입은 하나의 VL 시스테인 쌍 돌연변이로의 모델링 하에 놓였졌고, 그 유사 VH 시스테인 쌍 돌연변이가 각 모델링 실행(run) 내에 포함되었다. AVP04-07 FR1 구조 상으로 시스테인 삽입 모델링의 결과가 도 4a 및 b에 보여진다. 도 4b는 이황화 결합이 형성될 때에도 조작된 골격 1 내부 시스테인 돌연변이 근처에서는 구조적 변화가 거의 존재하지 않았음을 보여준다.
예상되는 바와 같이, 환원 및 이어지는 유효 하중(payload)에 대한 접합이 가능한 돌연변이성 잔기 쌍들을 정의하기 위한 목적에서, 각 시스테인 돌연변이 쌍에 대한 용매 접근성 표면 영역(ASA)의 값은, 강하게 보존된, 그리고 구조적으로 매몰된, 시스테인 쌍 H22-H92 및 L23-L88 보다 훨씬 높았으며 구조적으로 노출된 CDR 잔기들과는 유사하게 나타났다(도 5).
1.7 시스테인 대체 돌연변이 조작을 위해 확인되는 골격 1 시스테인 삽입 단백질 위치들 및 AVP07-xx 및AVP02-xx 아비바디 이원 항체들 내에서의 분자 모델링
상술한 바와 같이, 항체 군(family) 을 통해 VH(타입 1-4), VLκ, VLλ도메인 사이의 구조적 유사성이 알려져 있고 허용된다. 이러한 구조적 유사성으로 인하여, AVP04-07 모델로부터 확인되는 시스테인 삽입의 위치들은, AVP02-xx 및 AVP07-xx 시스테인 삽입 아비바디 모델들로 구조적으로 전달되었다.
AVP02-60의 경우에, 시스테인 삽입에 바람직한 Kabat 위치들은 AVP04-07의 그것과 동일하였다, 즉:
●경쇄 골격 1 Kabat 잔기들 L8 및 L11(AVP02-101, SEQ ID NO:79)
●중쇄 골격 1 Kabat 잔기들 H7 - H10(AVP02-104, SEQ ID NO:81)
●경쇄 골격 1 Kabat 잔기들 L14 및 L17(AVP02-102, SEQ ID NO:83)
●중쇄 골격 1 Kabat 잔기들 H13 - H16(AVP02-105, SEQ ID NO:85)
AVP02-60 모델은 Kabat H7-H10의 영역에서 AVP04-07 및 AVP07-17의 VH 타입 I 도메인과 구조적으로 약간 다른 VH 타입 III 도메인을 갖는다. 그러나 AVP04-07 시스테인 삽입의 구조적 전달은, a) H7 및 H10의 Cα위치들이 매우 유사하고 및 b) 개재하는(intervening) H8 및 H9 잔기 위치들이 다르더라도, 이러한 잔기들 모두 작고 다른 아미노산들에 대해 더욱 유연한 잔기인 Gly였으므로, 여전히 달성될 수 있다. 온라인 면역 유전학 데이터베이스(Immunogenetics Database); IMGT (http://imgt.cines.fr)에 의해 제공되는 V-유전자 생식 세포 서열들을 기반으로, 인간 서열들의 98%는 H8에서 Gly을 가지며, 48%는 H9에서 Gly를 갖는다. 이러한 유연성은 AVP04-84로부터 AVP02-114로의 H7-H10 이황화물의 구조적 전달을 가능하게 한다. 골격 1 내부 시스테인 삽입/AVP02-60 FR1 구조상의 이황화 결합 형성 모델링의 결과는 도 6a 및 b에 보여진다.
AVP07-xx 아비바디들의 경우에, 이 구조는 VLλ 쇄를 포함하므로, AVP04-50 및 AVP02-101 아비바디를 포함하는 양자의 VLκ에서 발견되는, Kabat 위치 L8-L11에서의 시스테인 삽입은 구조적으로 L7-L11로 번역된다. 따라서 AVP07에서, 바람직한 골격 1 내 시스테인 삽입 위치들은 하기와 같이 확인되었다:
●경쇄 골격 1 Kabat 잔기들 L7 및 L11(AVP07-88, SEQ ID NO:87)
●중쇄 골격 1 Kabat 잔기들 H7 - H10(AVP07-90, SEQ ID NO:89)
●경쇄 골격 1 Kabat 잔기들 L14 및 L17(AVP07-89, SEQ ID NO:91)
●중쇄 골격 1 Kabat 잔기들 H13 - H16(AVP07-91, SEQ ID NO:93)
Kabat 넘버링 시스템 내의 VLλ는 L10 서열 위치가 결여되어 있으며(Johnson 및 Wu, 2000), 이는 상기 언급된 것의 재번호 매김을 필요로 한다. 그러나 구조적으로, 현재의 발명 내용에서, VLκ L8-L11은 잔기들의 결여없이 VLλ L7-L11에 상당한다. 이는 각각 이러한 특정한 경우에서 서열 내의 잔기 삭제가 N-말단 시스테인 삽입인, 도 4 및 도 7의 AVP04-07 VL FR1 및 AVP07-17 VL FR1을 위한 모델들을 비교할 때 분명히 보여질 수 있다.
AVP04-07에 대해 설명된 시스테인 삽입 위치들로 관찰되는 경향에 따라, AVP02(도 8) 및 AVP07(도 9)에서, 각 바람직한 시스테인 삽입에 대한 접근 가능한 표면 영역(ASA) 값은, 강하게 보존된, 그리고 구조적으로 매몰된/비접근성의, 시스테인 쌍 H22-H92 및 L23-L88 보다 훨씬 높았으며 구조적으로 노출된 CDR 잔기들과는 유사하게 나타났다.
항체들의 V 도메인들(VH 및 VL)은, 서열적인 및 구조적인 하위 형태들로서, 예로서 VH 타입 I-IV 및 VLκ 및 VLλ로 오래동안 하위 분류되어져 왔다. 이러한 하위 형태들은 주로 FR1 서열 및 이러한 도메인들의 구조에서의 차이를 기반으로 한다((Lefranc, 2001a; LeFranc, 2001b; Pallares, 1999). 현재의 작업은 이러한 하위 분류에도 불구하고 다양한 이러한 하위 형태들의 모델에서 바람직한 이황화 삽입 위치들이 비돌연변이화된 모델 골격의 현저한 비틀림없이 용이하게 전달될 수 있음을 보여준다.
그러나, 본 발명자들은 비돌연변이화된 구조적 모델의 시각적 관찰을 통해, 어떤 VL/VH 하위 형태들은, 골격 1 내 시스테인 삽입들이 놓여질 수 있는 부가적(대체적) 위치들을, 일반적으로 상기 1-2 잔기들에 의해 기술된 바람직한 이황화 삽입 위치들을 N-말단(예로서 AVP02-103, FR1 H6-H9 돌연변이를 포함하는, SEQ ID NO:95)으로, 또는 1-2 잔기들에 의해 기술된 바람직한 이황화 삽입 위치들을 폴리펩티드 쇄의 C-말단(예로서 상응하는 클론들 AVP07-63(SQEQ ID NO:65) 및 AVP07-68(SEQ ID NO:97), FR1 L8-L12을 포함하는)으로 이동시킴으로써, 포함하는 것에 주목하였다.
그러나 상기 논의된 모든 경우에서, 골격 1 내부 이황화 삽입에 적합한 것으로 확인되는, 바람직한 및/또는 대안적 위치들은 모두 실시예 1.5에 기재된 중요 모델링 제약들을 만족하였다.
실시예 2 아비바디 구조의 합성
2.1 조작된 골격 1 내부 이황화 삽입이 없는 "비-돌연변이화된" 아비바디의 합성
TAG72(SEQ ID NO:54)에 특이적인 마우스 mAb, HER2(SEQ ID NO:58)에 특이적인 인간 mAb 및 HUC1(SEQ ID NO:60)에 특이적인 뮤린 mAb의 VH 및 VL 영역을 인코딩하는 DNA 구조가 적당한 제한 사이트들로 합성되었고, GenScript((Piscataway, NJ, USA)에 의해 pUC57로 복제되었다. 아비바디들은 V 영역의 어떤 방향, 즉 VH-연결자-VL 및 VL-연결자-VH(Carmichael 외., 2003) 으로도 분리되어 왔지만, 본원에 개시된 모든 구조들은 VH-연결자-VL 로 배열되었다.
모든 DNA 조작들이 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs (Ipswich, MA, USA))으로부터 구입된 표준 프로토콜에 따라 수행되었다. DNA 구조를 인코딩하는 이원 항체는 적당한 제한 효소로 pUC57로부터 절단되었고, 1%(w/v) 아가로스 겔 상에 용해되었으며 Qiaquick 겔 추출 키트 (gel extraction kit (Qiagen))를 사용하여 겔로부터 정제되었다. 구조들은 유사하게 준비된 pET22b 발현 벡터에 결찰되었고 결찰 혼합물은 전기 천공법(electroporation)에 의해 E. coli XL1-Blue 세포로 형질 변환되었다. Miniprep DNA 이 Qiagen miniprep 스핀 키트 (miniprep spin kit)를 사용하여 형질 변환체(transformants)로부터 추출되었고, 및 T7 프로모터 및 종결자 프라이머들로 서열화 함으로써 확인된 재조합 클론이, AmpliTaq를 구비하는 염료 종결자 사이클 서열화 키트 (Dye Terminator Cycle Sequencing kits)를 사용하여 추출되었다. VH-Gly4Ser-VL 방향의 항-TAG72 mAb의 V 영역들을 포함하는 클론은 AVP04-07 (SEQ ID NO: 54)로 지정되었다. VH-Gly4Ser-VL 방향의 항-HER2 mAb의 V 영역들을 포함하는 클론은 AVP07-17 (SEQ ID NO: 58)로 지정되었다. VH-Gly4Ser-VL 방향의 항-MUC1 mAb의 V 영역들을 포함하는 클론은 AVP02-60 (SEQ ID NO: 60)으로 지정되었다. 이러한 세 개의 클론들은 그로부터 모든 다른 티올화된 아비바디들(Thiolated Avibodies)이 유도되는, 염기성의 모 서열들(base parental sequences)을 형성하였다.
이러한 클로닝 방법은 타겟 단백질 및 카복시-말단 (His)6 태그 또는 카복시-말단 Myc+(His)6 태그 어느 것의 원형질막 발현(periplasmic expression)을 위한 아미노-말단 pelB 리더 서열의 삽입에 대해 허용하였다. (His)6 와 같은 친화성 태그의 부가가 아래 방향으로의(downstream) 정제 과정을 능률적으로 하기 위해 언제나 처럼 사용되었고 생물학적 활성에서 중성인 것으로 알려져 있다.
어떤 경우에, 동일한 VH/VL 아비바디 서열이 카복시-말단 (His)6 태그 및 카복시-말단 Myc+(His)6 태그 양자의 버전들 내에서 구조되었다. 이것의 일 예는 Myc+(His)6 태그를 포함하는 AVP07-63 (SEQ ID NO: 64), 및 단지 (His)6 태그만을 포함하는 AVP07-68 (SEQ ID NO: 96)이다. 이러한 두 개의 아비바디들은 다른 카복시-말단 태그들을 포함하더라도, VH 및 VL 서열은 완벽하게 동일하였으며 따라서 이 두 개의 구조는 상호 교환적으로 사용되었다.
2.2 골격 1 내부 조작된 시스테인들의 도입 및 사이트-지향된 돌연변이 유발에 의한 N-말단 세린의 치환
제조된 모델링 데이터를 기반으로 하여, 골격 1 내부 조작된 시스테인 삽입 돌연변이들이 하기의 티올화된 아비바디를 형성하기 위해서 AVP04-07, AVP07-17 및 AVP02-60의 비돌연변이화된 아비바디 서열들 내로 도입되었다 :
AVP04-xx 군 원형 서열들 (TAG72-특이적):
여기서 논의된 바와 같이 아비바디 이름의 내용 중 부호 "xx"의 사용은 동일한 시리즈의 수 많은 아비바디들이 존재하고 그 기재가 그 시리즈 내의 모든 아바바디들에 대해 관련된다는 것을 의미한다. 상기 "xx"를 특별한 숫자로 대체하는 것은 그 기재가 그 숫자를 갖는 아비바디를 의미한다는 것을 표시한다 (여기 사용된 명명법을 기초로 하여)
●AVP04-50 이원 항체 핵산 서열 (SEQ ID NO: 56), Kabat 잔기들 L8 및 L11, (SEQ ID NO: 57)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는
●AVP04-51 이원 항체 핵산 서열 (SEQ ID NO: 98), Kabat 잔기들 L13 및 L19 (SEQ ID NO: 99)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는
●AVP04-78 이원 항체 핵산 서열 (SEQ ID NO: 76), Kabat 잔기들 L14 및 L17 (SEQ ID NO: 77)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는
●AVP04-84 이원 항체 핵산 서열 (SEQ ID NO: 62), Kabat 잔기들 H7 및 H10 (SEQ ID NO: 63)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는.
●AVP04-85 이원 항체 핵산 서열 (SEQ ID NO: 74), Kabat 잔기들 H13 및 H16 (SEQ ID NO: 75)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는.
●AVP04-70 scFv 핵산 서열 (SEQ ID NO: 100), Kabat 잔기들 L8 및 L11 (SEQ ID NO: 101)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는
●AVP04-74 삼원 항체 핵산 서열 (SEQ ID NO: 102), Kabat 잔기들 L8 및 L11 (SEQ ID NO: 103)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는
AVP07-xx 군 원형 서열들 (HER2-특이적):
●AVP07-88 이원 항체 핵산 서열 (SEQ ID NO:86), Kabat 잔기들 L7 및 L11 (SEQ ID NO:87)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는.
●AVP07-71 scFv nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 104), Kabat 잔기들 L8 및 L12 (SEQ ID NO: 105)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는.
●AVP07-63 이원 항체 핵산 서열 (SEQ ID NO: 64), Kabat 잔기들 L8 및 L12 (SEQ ID NO: 65)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는.
●AVP07-68 이원 항체, 카복시-말단 (His)6 태그를 포함하고 카복시-말단 Myc+(His)6 태그를 포함하지 않는다는 것을 제외하고 AVP07-63와 동일한, 핵산 서열 (SEQ ID NO: 96), Kabat 잔기들 L8 및 L12 (SEQ ID NO: 97)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는.
AVP02-xx 군 원형 서열들 (MUC1-특이적):
●AVP02-101 이원 항체 핵산 서열 (SEQ ID NO: 78), Kabat 잔기들 L8 및 L11 (SEQ ID NO: 79)에서 돌연변이화된 아비바디를 형성하는.
이러한 티올화된 아비바디들은, 바람직한 골격 1 내부 조작된 시스테인 삽입 돌연변이들이 a) VL 및 VH 도메인들 및 그들의 다른 하위 형태들 사이에서 기능적으로 전달 가능하며, b) 단일 (scFv) 또는 다중의 (이원 항체/삼원 항체) Fv 도메인들을 포함하는 단백질들 (예를 들면, 아비바디)에 부합하고 c) 바람직한 골격 1 내부 이황화 위치의 어느 쪽으로든 기능성을 폐기하지 않고 이동(예를 들면, +/- 1-2 잔기)을 허용하기에 충분히 견고하다는 것을 보여주기 위해서, 모델링에 의해 실현 가능한 것으로 제안된 바와 같이 (실시예 1.7 참조) 여기서 예시화 되었다.
모든 경우들에서, 시스테인 잔기들은 설명에 따른 QuikChange®사이트-지향된 돌연변이 발생 방법 (QuikChange®site-directed mutagenesis method) (Stratagene) 을 사용하여 관심의 특이적 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열들을 개조하기 위해 도입되었다. 설명한 바와 같이 AVP04-07 아비바디를 사용하여 Kabat 위치 L8 (FR1 VL 영역)에서의 프로린 잔기는 서열 CCG에 의해 인코딩되고 Kabat 위치 L11 (FR1 VL 영역)의 류신 잔기는 서열 CTG에 의해 인코딩된다. QuikChange®사이트-지향된 돌연변이 발생 기술들은 이러한 뉴클레오티드 서열들 양자를 모두, 시스테인을 인코드하는 TGC로 개조시키는데 사용되었다.
QuikChange®사이트-지향된 돌연변이 발생 PCR-기반 방법은 이중 가닥화된 돌연변이 PCR 생성물을 합성하기 위하여 프라이머들로서 바람직한 돌연변이들 및 원형으로서 플라스미드 DNA를 포함하는 두 개의 상보적 합성 올리고 뉴클레오티드들을 사용한다. 상기 예를 사용하여 AVP04-07 내 VL 쇄의 FR1 영역의 Kabat 위치들 L8 및 L11에 시스테인 잔기를 도입하기 위하여, 하기의 서열 5' - GAT ATC GTG ATG ACC CAG AGC TGC AGC AGC TGC CCG GTG AGC GTG GGC GAA AAA G - 3' (SEQ ID NO: 106)을 포워드 프라이머로서 사용하였고, 5' - C TTT TTC GCC CAC GCT CAC CGG GCA GCT GCT GCA GCT CTG GGT CAT CAC GAT ATC - 3' (SEQ ID NO: 107) 를 리버스 프라이머로서 사용하였다. 연속적으로 하기의 조건을 사용하여 증식을 수행하였다 : 95oC 에서 30초간; 95oC 에서 30초간, 55oC 에서 30초간 및 68oC 에서 13분으로 이루어지는 18 사이클; 68oC 에서 7분간의 최종 확장. 원형은 DpnI로 37oC 에서 1시간 동안 침지되었다. 형질 변환체들이 제조자의 설명에 따라 획득되었고, 상기 기재된 바와 같은 DNA의 서열화에 의해 확인되었다.
유사한 돌연변이 발생의 접근들이 모든 티올화된 아비바디들을 생성하기 위해 이용되거나 단백질의 고유 N-말단 잔기를 세린 잔기로 대체하기 위해 이용되었다. N-말단 세린 치환은 골격 1 내부 이황화 돌연변이의 도입 전 또는 후에 수행되었다. AVP04-07의 N-말단 Gln을 Ser 잔기로 치환하기 위해 사용된 예시적 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 66 및 SEQ ID NO: 67 내에 나타내어진다.
2.3 아비바디 구조들의 서열 변형
본 기술 분야에서 숙련된 자들에게 알려진 표준 분자 생물 기술들이 본원에 개시된 DNA 서열에 대한 모든 다른 변형들을 위해 사용되었다. 아비바디 서열이 모델링 데이타 (도 5, 도 8 및 도 9 참조)에 의해 제시된 바와 같이 노출된 표면일 가능성이 큰 위치들인, 과 가변성의 (hypervariable) CDR 영역들 내에 '고유의' 시스테인 잔기들을 포함할 때, 상기 잔기들은 상기 기재된 바와 같이 본질적으로 사이트-지향된 돌연변이 발생에 의해 대안적인, 비-티올-함유 아미노산으로 돌연변이화되었다. 예로서, AVP07 패밀리; AVP07-17의 모 클론(parental clone)은 두 개의 그러한 시스테인 잔기들; VH CDR3 영역 내 Cys104 (Kabat 넘버링 H100) 및 Cys109 (H100E)를 포함하였다. 그러한 잔기들은 유전 변이 발생의 프라이머 SEQ ID NO: 68 및 SEQ ID NO: 69를 사용하는 표준화된 QuikChange®사이트-지향된 돌연변이 발생을 사용하여 알라닌으로 치환되었다. 모든 AVP07-xx 티올화된 아비바디들은, 골격 1 내부 이황화 돌연변이 기술에 적합한 AVP07-xx 군을 만들어 주는 VH CDR3의 이러한 여분의 변형을 포함한다.
티올화된 아비바디들은 또한 scFv 또는 삼원 항체들의 티올화된 형태들을 제조하기 위하여 변형된 연결자 길이들로 제조되었다. 연결자 조성물 및 길이의 변형이 아비바디 다합체들의 형성에 영향을 준다는 것이 항체 분야에서 공개된 문서로부터 잘 알려져 있다 (Kortt외 1997). scFv 형성의 촉진은 여분의 잔기들을 인코딩하는 돌연변이 발생 프라이머를 사용하여, 전형적으로 GGGGS (SEQ ID NO: 135)인 다섯 개의 잔기들로부터 열 다섯 개, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 53)로 이원 항체 모체의 연결자 길이를 변형시킴으로써 조작되었다.
유사하게, 삼원 항체 형성은 연결자 잔기들의 제거 및, 어떤 경우에 있어, 나아가 앞선 가변 도메인의 최대 두 개의 잔기들의 제거에 의해 촉진되었다. 예로서, AVP04-74 아비바디 (SEQ ID NO: 102)를 인코딩하는 핵산은 연결자 영역 대신에 잔기들 'VTVSS-DIVM'을 갖는 삼원 항체를 인코딩한다. 이 클론은 모체 AVP04-50으로부터 상기 바람직한 서열을 인코딩하는 돌연변이 발생의 프라이머들을 사용하는 삭제 돌연변이 발생에 의해 조작되었다.
실시예 3 박테리아 발현을 사용하는 "비- 돌연변이화된 " 및 티올화된 아비바디들의 발현 및 정제
개별적인 아비바디 구조들의 DNA가 제조자의 표준 프로토콜 (Stratagene) 을 사용하여 화학적으로 적당한 E. coli BL21 세포로 형질 변환되었다. E. coli BL21 발현 성질이 예시화된 모든 아비바디에 대한 주요 발현 성질로서 사용되었다. 발현은 예상된 수율 요구에 따라 두 개의 상호 교환 가능한 접근의 방법에 의했다; 박테리아 세이크-플라스크 발현 (bacterial shake-flask expression) 또는 박테리아 페드-배치 발효 (bacterial fed-batch fermentation). 어느 방법으로부터의 단백질 아비바디에 대한 질적 평가는 상기 두 방법들이 상호 교환 가능하고 단백질의 질과 특성들은 비교할 만하다는 것을 분명히 보여 주었다.
3.1 박테리아 세이크-플라스크 발현(Bacterial Shake-Flask Expression)
단일 형질 변환체 콜로니가 1% D-글루코스 및 100㎍/ml 앰피실린 (ampicillin)을 포함하는 500ml 2xYT로 접종되었고 220 rpm으로 세이킹하면서, 37℃에서 하루 밤 동안 배양되었다. 18L의 동일한 배지가 0.1의 최종 OD600까지 상기 하룻밤 배양물(culture)으로 시드 되었고, OD600가 약 0.6-0.8 사이가 될 때까지 30℃에서 배양되었다. 상기 배양물은 12℃로 옮겨졌고 인덕션 온도에 이를 때까지 쉐이킹이 계속되었다. 단백질의 발현은 0.2mM IPTG의 부가로 유도되었고 배양물은 12℃에서 15 시간 동안 배양되었다. 박테리아 펠렛들이 10,000 xg 에서의 원심 분리에 의해 제조되었고, 수확되었으며, 칭량 되었고 및 -20℃에 보관되었다.
이 발현 시스템으로부터 발현된 단백질을 함유하는 박테리아 펠렛들은 평균적으로 약 6g/L의 배지였다.
3.2 박테리아 페드-배치 발효(Bacterial Fed-Batch Fermentation)
시드 배양물이 500mL의 복합체 매개를 함유하는 2L 배플된(baffled) Erlenmeyer 플라스크에서 성장되었고 37℃에서 200 rpm으로 쉐이킹하면서 16 시간 동안 배양되었다; 상기 복합체 매개는 (L 당): 트립토판, 16g; 효모 추출물, 5g; NaCl, 5g; 앰피실린, 200mg 을 포함하였다. 한정된 매개가 단백질 발현을 위해 사용되었고 (L 당): KH2PO4, 10.64 g; (NH4)2HPO4, 4.0 g; 및 시트르산 모노하이드레이트(citric acid monohydrate), 1.7 g; 글루코스 25 g; MgSO4.7H2O, 1.25 g; PTM4 미량 염들, 5 mL; 앰피실린(ampicillin), 200 mg; 티아민-HCl, 4.4 mg을 함유하였다. PTM4 미량 염들은 (L 당): CuSO4.5H2O, 2.0 g; NaI, 0.08 g; MnSO4.H2O, 3.0 g; NaMoO4.2H2O, 0.2 g; H3BO3, 0.02 g; CoC12.6H2O, 0.5 g; ZnCl2, 7.0 g; FeSO4.7H2O, 22.0 g; CaSO4.2H2O, 0.5 g; H2SO4, 1 mL을 함유하였다. 여과 살균된 PTM4 미량 염, 티아민 하이드로클로라이드 및 앰피실린을 제외한 모든 매개 및 첨가제는 121℃에서 30분간 오토클레이브에 의해 살균되었다.
단백질 발현은 1.6L의 한정된 매개를 포함하는 2L 유리 바이오스태트 B 생물 반응기(Biostat B bioreactors) (Sartorius Stedim Biotech, Germany)에서 완성되었다. 용해된 산소 농도는 교반 속도를 500 및 1200 rpm 사이에서 및 에어레이션(aeration)(5% 산소로 보충된 공기)을 0.3 및 1.5 L분-1 사이에서 자동적으로 변화시킴으로써 약 20%로 유지되었다. 공기 흐름의 산소 보충은 필요에 따라 수동적으로 증가하였다. 배양의 pH는 10%(v/v) H3PO4 또는 10%(v/v) NH3 용액의 자동적인 첨가를 통해 7.0 에서 조절되었고 거품은 소포제( antifoaming agent ) [10%(v/v) 폴리프로필렌 2025)]의 자동적 첨가에 의해 조절되었다. 다른 것으로 특정되지 않는 한, 용기 온도는 37℃로 유지되었다. 생물 반응기는 0.25의 출발 광밀도(600 nm에서 측정된)에 도달할 때까지 시드 배양물로 접종되었다.
매개에 첨가된 글루코스의 완전한 사용 후에, (L 당): 글루코스, 600 g; 및 MgSO4.7H2O 22.4 g을 포함하는 영양 용액(피드)이 40 mLh-1의 흐름 속도로 생물 반응기 내로 펌프되었다. 피드의 시작 2 시간 후에 용기 온도를 20℃까지 2.5 시간 주기 동안(6.8℃h-1) 천천히 감소시켰고, 그 후 단백질 발현이 0.2 mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었으며 피드 속도는 6mLh-1로 감소되었다. 유도 12 시간 후에 배양물이 수확되었으며 전형적으로 광밀도(600 nm에서 측정되는) 110에 도달하였고 약 300g의 젖은 세포 페이스트가 각 2L 배양물로부터 회수되었다.
3.3 E.coli 에서 발현된 아비바디의 정제
수행된 발현 방법에 관계없이, 모든 아비바디 단백질들이 본질적으로 하기 기재된 바와 같이 정제되었다.
발현 배양물으로부터 수확된 박테리아 펠렛들(발현 방법에 따라 약 50-400g)이 용해되었고, 단백질이 추출되었으며 이어서 표준 크토마토그래피 기술들에 의해 정제되었다. 박테리아 펠렛 각 그램에 대해 5mL 의 His-태그 친화성 크로마토그래피 용해 버퍼(20mM 포스페이트, 500mM NaCl, 20mM 이미다졸, 0.25mg/ml 리소자임, 1mM PMSF, 50ug/ml DNAseI, pH 7.4)가, 기계적 균질화 및 다음으로 초음파(얼음 상 6x30 초 펄스)처리되거나 또는 Emulsiflex-C5 세포 파괴기(cell disruptor) (AVESTIN Inc., Canada)를 통한 세 개의 경로들에 의한 용해 이전에 세포 펠렛을 재부유(resuspend)시키기 위해 사용되었다. 이어서 박테리아 용해물(lysate)이 원심분리(16000xg, 30분) 및 여과(0.45㎛ 여과막) 이전에 실온에서 1시간 배양되었다.
다음으로 AKTA 정제기 10(GE LifeSciences)을 사용하는 His-태그 친화성 크로마토그래피 정제가 여과된 박테리아 용해물(lysate)로부터 이원 항체들을 정제하는데 사용되었다. 정제를 위해 정제 스케일에 따라 1 및 4 사이의 5 mL HisTrapTM(GE LifeSciences) 크루드 FF 컬럼들이 일련하여 사용되었다. 용해물은 외부 P960 펌프를 통해 HisTrapTM 컬럼을 통과하여 지나갔다. HisTrapTM 컬럼들은 10 컬럼 부피의 His-태그 친화성 크로마토그래피 추출 버퍼(20mM 소듐 포스페이트, 500mM NaCl, 20mM 이미다졸, pH 7.4)로 세척되었다. 정제된 단백질은 50% His-태그 친화성 크로마토그래피 용리(elution) 버퍼(20mM 소듐 포스페이트, 500mM NaCl, 500mM 이미다졸, pH 7.4) 및 50% His-태그 친화성 크로마토그래피 추출 버퍼(260mM 이미다졸의 최종 농도)로 용리되었다. 용리된 단백질을 함유하는 (AKTA Unicorn 소프트웨어 상의 280mM 흡수도(absorbance)에 의해 결정되는 바와 같이) 분획물들이 수집 되었고, 모아 졌으며(pooled), 단백질 농도가 결정되었고 적당한 이온 교환 버퍼 내에서 투석되었다. TAG72-특이적 AVP04-50(SEQ IDNO:57) 이원 항체를 사용하는, 전형적인 His-태그 친화성 크로마토그래피 용리 프로파일이 도 10a에 보여진다. 본원에 개시된 모든 아비바디들은 유사한 용리 프로파일을 보여주었다.
부분적으로 정제된 아비바디들은 후속적으로, 단백질의 계산된 pI(양이온 교환에 대하여)보다 1.0-1.5 pH 유닛 낮은 버퍼 내에서 또는 단백질의 pI(음이온 교환에 대하여)보다 1.0-1.5 pH 유닛 높은 버퍼 내에서 투석되었다. 전형적으로, 7.0-8.0의 pI를 갖는 아비바디들은 MES 버퍼(50mM MES, 양이온 교환에 대하여 pH 6.0) 내에서 투석되었고, 8.0-9.0의 pI를 갖는 것들은 포스페이트 버퍼(50mM 포스페이트, 양이온 교환에 대하여 pH 7.0) 내에서 투석되었으며 5.0-6.5의 pI를 갖는 것들은 트리스 버퍼(20mM 트리스-HCl, 음이온 교환에 대하여 pH 8) 내에서 투석되었다. 모든 아비바디 pI 값들은 이러한 범위들 내로 떨어졌다. 아비바디들은 2시간 이상 간격(no less than 2 hours apart)의 세 개의 버퍼 교환들을 구비하고 있는 200x 부피보다 큰 버퍼 내로 투석되었다. 투석은 4℃에서 Spectrapor 6-8000 Da MW 컷-오프 투석 튜빙을 사용하여 수행되었다.
투석에 이어, 변성된 불용해성 재료를 이온 교환 이전에 펠렛화하기 위하여, 단백질 샘플은 3220 xg에서 10분간 원심분리되었다. 이온 교환은 AKTA 정제기 10을 사용하고, 최대 두개의 5mL HiTrapTM SP HP 컬럼을 연속으로 사용하며, 깨끗하게 투석된 재료를 P960 외부 펌프를 통해 컬럼을 통과하여 지나가게 하는 것으로 수행되었다. 이러한 단계에 이어, 컬럼은 컬럼으로부터 단백질의 용리를 위한 선형 버퍼 기울기(염 기울기)의 개시에 앞서, 10 컬럼 부피의 이온 교환 버퍼로 세척되었다. 이 과정에서, 이온 교환 버퍼는 선형 기울기에 걸쳐 1M의 최종 농도에 이르기까지 NaCl의 첨가를 갖는 동일한 버퍼로 대체되었다. 용리 기울기는 600mL NaCL의 최종 농도로 300mL에 걸쳐 수행되었다.
용리된 이원 항체(Unicorn 소프트웨어 상 280nm 흡수도 프로파일에 의해 결정되는)에 대응하는 분획들(fractions)이 모아지고 정량화 되었다. AVP04-50에 대한 전형적인 이온 교환 용리 프로파일은 도 10b에 보여진다. AVP04-50 이원 항체는 일반적으로, 다른 전하 및 크기의 다양한 것들로부터 AVP04-50의 주요 이합체 아이소폼(isoform)(화살표)이 쉽게 분리되는, 약 37 mS/cm 또는 32% B의 염 농도에서 용리되었다. 이원 항체 클론들, 나아가 다른 군들로부터인 것들도, 일반적으로 염 기울기 내의 유사한 지점에서 용리되었다. 어떤 경우들에서, 풀링(pooling) 전에 특정 분류의 바람직한 종 또는 조성의 피크 동일성(peak identity)을 확인하기 위하여 1xPBS 버퍼 (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, pH7.4,) 내에서 눈금 검정된(calibrated) perdex 200 10/300 컬럼 (GE LifeSciences)을 사용하는 분석적 사이즈 배제(analytical size exclusion) 가 수행되었다. 관심의 주요 아이소폼(isoform)을 함유하는 용리의 분획물들은 아래 방향의 정제(downstream purification)를 위해 모아졌다.
이온 교환에 이어서, 용리된 단백질 물질은 겔 여과 전에 4℃ 에서 약 3mg/mL로 농축되었다. 겔 여과는 AKTA 정제기(Purifier) 10 상의 PBS 내에서 Pharmacia Amersham (GE LifeSciences) Superdex®75 26/60 프렙-그레이드(prep-grade) 컬럼을 사용하여 수행되었다. 예로서 AVP04-50 이원 항체를 사용하여, 상기 이원 항체는 주입 후 약 140ml(또는 53.5 분) 에서 용리되었다(도 10c). AVP04 군(family) 및 다른 것들 양자 내에서, 이원 항체의 변형체들은 일반적으로 약 54 kD의 분자량을 갖는 구형의(globular) 단백질에서 예상되는 바와 같은 유사한 용리 부피에서 용리되었다. 용리된 AVP04-50 이합체에 상응하는, 도 10c에 표시된 마진들(margins) 내의 분획물들이 모아졌고, 3200 xg, 4℃에서 10K MWCO (Millipore, USA) 를 구비하는 Amicon Ultrafree 스핀 농축기를 사용하여 0.5-3 mg/ml 사이로 농축되었다.
정제된 생성물의 최종 순도는 Superdex®200 10/300 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피 및 SDS-PAGE 전기영동(electrophoresis)에 의해 일상적으로 측정되었다. 예로서, AVP04-50의 정제 방법은 일상적으로, 겔 여과(도 10d) 상 단일의 분명한 용리 피크를 가져오는 순도를 갖는 단백질 및 SDS-PAGE 전기영동(도 10e) 상에서 단일 정의된 종을 돌려주었다(returned).
정제 기술 및 결과물 순도 프로파일은 테스트된 다른 어떤 아비바디들과도 크게 다르지 않았다. 도 11a-c는 본원에 개시된 아비바디들의 최종 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 프로파일을 강조하며(highlight) 또한 도면들에 표시된 바와 같다. 예상되는 바와 같이, 다른 아비바디 군들 내 및 사이 모두에서 작은 정도의 변형을 제외하고, 아비바디들의 용리 시간은 예상된 분자 크기에 잘 대응하였다; 삼원 항체들은 scFvs 보다 후에 용리된 이원 항체들보다 먼저 용리되었다. 본원에 개시된 모든 아비바디들은 기능적으로 발현되었고 실질적 균질성일 때 까지 정제되었다. 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이들의 존재는, 기능적으로 발현하고 아비바디를 실질적인 균일성으로까지 정제하는 능력에 어떠한 영향도 미치지 않았고, 티올화된 아비바디들의 골격 1 내의 조작된 시스테인의 위치를 제안하는 모델링 데이터를 부분적으로 확인하는 것은 아비바디 불안정화를 가져오는 해로운 구조적 형태 변화의 원인이 되지 않았다.
실시예 4-이원 항체의 체외 면역 반응성 평가
용해성 항원에 대한 결합 활성은 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하는 컬럼 이동 분석(column shift assay)에 의해 확인되었다. AVP04-xx 아비바디들에 대한 항원은, 보빈 submaxillary 뮤신(BSM)(Sigma)로부터의 용해성 형태로 입수 가능한, TAG72이다. AVP07-xx 아비바디들에 대해서는, 용해성 항원은 재조합 HER2 엑토도메인(ectodomain)이다. AVP02-xx 아비바디들에 대해서는, 용해성 항원은 재조합 전체 길이(full length)의 MUC1이다. 아비바디 또는 항원에 상관없이, 컬럼 이동 분석은 본질적으로 하기와 같이 수행되었다.
이원 항체에 대한 용해성 항원의 적어도 두 배의 몰 농도 과량이 실온에서 PBS 버퍼 내에서 1시간 동안 배양되었다. 결합 활성은 결과적인 아비바디-항원 복합체 피크를 자유 이원 항체 피크와 비교하는 것으로 결정되었다. 포지티브 결합 결과는 자유 아비바디에 대응하는 피크의 감소 및/또는 배양 후 아비바디-항원 복합체에 대응하는 피크의 증가된 크기로 생각되었다. 아비바디 또는 아비바디-항원 복합체의 용리 프로파일은 280nm 에서의 흡수도를 통해 모니터 되었다. 모든 경우에서, 아비바디는 단독으로 28-33 분 사이에서 용리되었고, 아비바디-항원 복합체들은 10-25 분에서 용리되었다.
본원에 개시된 모든 아비바디들의 면역 반응성은 상기 기재된 프로토콜을 사용하여 측정되었고 결과는 도 12a-c에 기술되었다. 모든 경우에서, 겔 여과에서 용리 시간의 현저한 단축 및/또는 비결합 아비바디의 감소된 양에 의해 증명되는 바와 같이, 아비바디-항원 복합체의 형성이 관찰되었다; 아비바디들이 면역 반응성임을 나타내는. scFv 아비바디들은 각 분자 상에 적어도 하나의 결합 사이트를 가지며, 따라서 다중 결합 사이트를 갖는, 그에 따라 강한 결합성을 보이는 이원 항체 및 삼원 항체보다 약한 결합 특성을 보여줄 것으로 예상된다. 예상되는 바와 같이, 다른 SEC 프로파일에 의해 증명되는 바로서, AVP04-70 scFv는 이원 항체 또는 삼원 항체 클론들보다 덜 안정된 아비바디:항원 복합체를 형성한다. 그러나, 그것이 면역 반응성임을 나타내는, '비결합된' AVP04-70 피크의 감소 및 아비바디:항원 복합체의 형성은 프로파일 내에서 분명하다.
복합체 형성은 아비바디들이 관련이 없는 항원과 함께 배양되었을 때에는 관찰되지 않으며, 이것은 특이적 결합의 상호 작용이 발생하였음을 나타낸다.
아비바디들에서 티올화된 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이의 존재 또는 부재는 결합을 폐기하지(abrogate) 않았고, 나아가 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이 사이트는 아비바디의 기능성 특성들에 매우 적은 또는 영향을 미치지 않는 위치에서 조작되었음을 나타낸다.
실시예 5-티올화된 아비바디에서 자유 메르캅트 기의 정량화
티올화된 아비바디들은 통상적으로 발현되어 실질적인 균질성으로 까지 정제될 수 있었으며 기능적으로 활성인 것으로 나타났다. 티올화된 아비바디들에서 조작된 골격 1 내부 이황화 브릿지의 존재 및 그들의 환원 가능성은 비색계 분석(colorimetric assay)에 의해 측정되었다.
티올화된 아비바디들은 실온에서 25분간 PBS 내 3.8mM의 TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스파인 하이드로클로라이드)(Pierce, Rockford, IL, USA) 로 배양되었다. 환원에 이어서, TCEP는 100mM 포스페이트 버퍼 + 1mM EDTA pH 6.5PD10로 예비 평형된(pre-equilibrated) 탈염화 컬럼(desalting column)으로 제거되었으며, 0.5mL 분획물들(fractions)을 수집하였다. 피크 단백질 분획물은 UV 분광기로 확인되었고, 모아졌다(pooled).
반응성 티올들을 테스트하기 위하여, 50-75 ㎍의 환원된 단백질이 100mM 소듐 포스페이트 버퍼, 1mM EDTA, 5μl의 4mg/mL Ellman's 시약 (5,5'-디티오-비스(2-니트로 벤조산); DTNB) (Pierce, Rockford, Il)를 포함하는 pH 8.0 내에서 희석되었다. 반응은 실온에서 15분 동안 진행되도록 허용되었다. 반응성 메르캅트기의 농도는, 이러한 버퍼 시스템 내에서 412nm에서의 TNB의 몰 농도 소멸 계수(molar extinction coefficient)가 14,150M-1cm-1인 것으로 가정하는 분광기에 의해 정량화되었다. 이원 항체 당 반응성 메르캅트기 그룹들의 평가(estimate)는 이원 항체의 몰 농도에 의해 메르캅트 기들의 몰 농도를 나눔으로써 얻어졌다. 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이들을 포함하지 않는 비변형 IgG 및 비-티올화된 아비바디(상호 교환적으로 AVP04-07 또는 AVP02-60인)가 표준화된 대조군들로 사용되었다.
이러한 환원 조건하에, 불변의(invariant) Kabat 위치들 L23 및 L88 사이 및 불변의 Kabat 위치들 H22 및 H92 사이에서 보존된 이황화 결합은 예상되는 바와 같이 반응성이지 않았고 접합에 대해 가능하지 않았다.
상기 기재된 환원 조건들을 사용하여, 서열 분석으로부터 예상되었던 것과 같이, 비변형 IgG 대조군은 환원 후 8 반응성 티올들을 평균적으로 나타내었다. 대조적으로, AVP04-07 및 AVP02-60과 같은 대조군 아비바디는 변함없이 자유 또는 반응성 티올들을 보이지 않았다.
표 2는 VL L8-L11(또는 VLλ을 포함하는 AVP07-xx의 경우에 L7-L11) 내에서 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이로 티올화된 AVP04-xx, Avp02-xx 및 AVP07-xx 의 하위 세트(subset)를 보여준다. 모든 경우들에서, 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이를 함유하는 환원되지 않은 아비바디들은 그 표면 상에서 0.5 미만의 반응성 티올들을 포함하는 것으로 나타났으며, 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이들은, 그 비환원된 상태에서, 이황화 브릿지를 확실히 형성한다는 것을 분명하게 나타낸다.
이러한 이황화 브릿지는 기재된 바와 같이 용이하게 환원될 수 있고, 그들을 접합에 가능하게 만든다. 환원된 상태에서, 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이를 포함하는 모든 아비바디들은 평균 4의 반응성 티올들을 보여주었다.
샘플 단백질 농도
(mol/L)		 S-H 농도
(mol/L)		 반응성 티올의 평균 수
고유의AVP04-50 1.838E-05 7.915E-06 0.4
환원된 AVP04-50 1.268E-05 5.853E-05 4.6
고유의 AVP02-101 1.179E-05 5.497E-06 0.5
환원된 AVP02-101 6.369E-05 2.869E-04 4.5
고유의 AVP07-88 8.758E-06 1.187E-05 1.4
환원된 AVP07-88 7.532E-06 3.769E-05 5.0
실시예 6-티올화된 아비바디들 내에서 환원된 조작된 이황화물에 대한 유효하중 접합(Payload Conjugation)
티올화된 아비바디들 내에서 조작된 골격 1 내부 이황화 브릿지들의 환원 가능성은 어떤 수의 티올-반응성 유효 하중도 노출된 및 환원된 시스테인에 접합될 수 있음을 나타내었다.
이러한 능력을 보여주는 것으로서, 본질적으로 본원에 개시된 바와 같이, 말레이미드-PEG24-메톡시 유효 하중은 환원된 조작된 골격 1 내부 시스테인들에 접합되었다.
티올화된 아비바디들의 환원 및 환원제의 제거 후에, 과량의 말레이미드-PEG24-메톡시 (mal-PEG24-OMe) (Quanta Biodesign, OH, USA) 가 아비바디 당 20 당량으로 첨가되었고 4℃에서 하루밤 동안 반응되었다. PEG화 후에, 비반응된 PEG는 강한 투석으로 제거되었고 PEG 하중(loading of PEG)의 성공이 SDS-PAGE 및 질량 분광기에 의해 결정되었다.
SDS-PAGE 분석을 위해, 2㎍의 총 단백질이 웰(well) 당 부가되었고 MES-SDS 버퍼(Invitrogen) 내에서 PAGE 4-12% 비스-트리스 겔(bis-tris gel)을 사용하여 분석되었다. 결과적인 단백질 밴드는 코마식 블루 염색(Coomassie Blue stain)을 사용하여 시각화되었다. 성공적인 PEG화는 단량체-쇄 당 5kDa의 대략적인 질량 증가를 재현성 있게 보여주었다(도 13a-c).
질량 분광기 분석을 위해, MassPREP 온라인 탈염 브릿지(MassPREP on-line desalting cartridge )(Waters Corporation, USA))를 구비한 Agilent esiTOF 질량 분광계(mass spectrometer)가 PEG 화된 아비바디들의 질량 스펙트럼을 기록하는데 사용되었다. 이러한 시스템은 5% CH3CN로 1분 동안, 이어서 9분에 걸친 5-95% 아세토니트릴의 용리 기울기에 의해 평형화되었다. PEG화된 아비바디들은 전형적으로 7 분에서 용리되었다. MassHunter 소프트웨어가 생성된 관련 m/z 전하 피크(relevant m/z charge peaks)의 분해(deconvolution)에 의해 샘플의 평균 질량을 결정하는데 사용되었다. 표 3에 기록되어 있는 데이터는 질량 스펙트럼의 분석에 따라 얻어진 평균 단량체-쇄 아비바디 질량을 요약한 것이다. PEG24의 공식 질량은 1239.44 g/mol로 보고되어 있으며, 따라서 적어도 2478.88 질량 유닛의 증가가 조작된 시스테인에 대한 완전한 접합을 나타낸다. AVP07-71, AVP04-50, AVP07-88 및 AVP02-101에 대한 전형적인 질량 스펙트럼의 예가 도 14a-d에 각각 보여진다.
구조 관측된 질량
(Da.)		 PEG화된 질량
(Da.)		 질량 증가
(Da.)		 하중된 PEG
AVP04-50 25685.99 28166.84 2480.85 2
AVP04-70 27453.01 29933.96 2480.95 2
AVP04-74 26506.93 28987.58 2480.65 2
AVP04-78 26816.32 29296.94 2480.62 2
AVP04-84 26816.32 29297.16 2480.84 2
AVP07-68 54564.88 57046.4 2481.52 2
AVP07-71 27597.92 30078.36 2480.44 2
AVP07-88 26780.09 29196.72 2416.63 2
AVP07-89 26343.95 28824.74 2480.79 2
AVP02-101 23509.78 24749.05 1239.27 1
실시예 7-유효 하중-접합된 티올화된 아비바디들의 체외 면역 반응성 평가
티올화된 아비바디들은 발현, 정제될 수 있으며 그들의 고유(비-접합된) 상태에서 면역 반응성인 것으로 보여졌다. 상기 기록된 데이터는 조작된 시스테인에 대한 화학정량적으로 한정된 접합이 높은 효율로 발생되고 있음을 분명히 나타내었다. 후술될 데이터는 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이가 선택적으로 환원되고 적은, 티올-반응성 유효 하중이 접합될 때 면역 반응성이 없어지지 않았음을 보여준다.
이를 위해, 말레이미드-PEG24-메톡시(실시예 6)로 유효 하중된 티올화된 아비바디들이 실시예 4에 기재된 바와 같이 본질적으로 면역 반응성에 대해 평가되었다.
모든 경우에서, 겔 여과에서의 용리 시간의 현저한 단축에 의해 증명되는, 아비바디-항원 복합체 형성이 관찰되었다(도 15a-c). 모든 경우들에서, 아비바디 단독은 28-33 분 사이에 용리되었고, 아비바디-항원 복합체는 10-25 분에 용리되었다. 예상되는 바와 같이, 복합체 형성은 아비바디들이 관계 없는 항원으로 배양되었을 때에는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 티올화된 아비바디들에서 환원된 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이에 대한 상대적으로 작은 유효 하중(payload)의 접합은 결합을 폐기하지(abrogate) 않았음을 나타내었다.
그러나 조작된 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이에 대한 유효 하중은 PEG 또는 PEG 유사 분자들에 한정되지 않는다.
티올화된 아비바디들이 상기 예시된 PEG-접합과 매우 다른 유효 하중과, 또한 결합의 폐기(abrogation)없이, 접합될 수 있음을 보여주기 위하여, AVP04-50은 검출 가능한 표지 유로퓸(Europium)으로 하중되었다.
1-(p-요오드아세트아미도벤질)디에틸렌트리아민-N1-N1,N2,N3,N3-펜트아세트산 (DTPA) (PerkinElmer, Turku, Finland)의 Eu3+ 킬레이트가 제조자의 설명에 따라 AVP04-50 내 환원된 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이에 대한 접합에서 사용되었다. 간단하게, 단백질은 50-100mM 나트륨 수소(sodium hydrogen) 카보네이트 버퍼 +4mM EDTA, pH 8.5 내에서 3mg/ml으로 농축되었다. AVP04-50을 환원시키기 위하여 Eu-DTPA가 30 배 과량의 몰 농도(Eu-DTPA: 단백질)로 첨가되었다. 반응은 이어서 4℃에서 3-16 시간 완성되었다. 비반응성 Eu-DTPA는 Superdex®200 10/300 컬럼 상의, 트리스-버퍼 식염수, pH 7.4로 예비-평형된 겔 크로마토그래피에 의해 단백질로부터 분리되었다. 각 결과적인 분획물은 향상 용액(Enhancement Solution (PerkinElmer, Turku, Finland)) 내에 희석되었고 빅터 시간 분석 형광계(Victor time resolved flurometer)를 사용하여 유로퓸 카운트를 위해 분석되었다. 피크 단백질 분획물(fractions)에 상응하는 피크 유로퓸 카운트가 모아졌고 0.1%의 고순도 BSA로 안정화되었으며, 4℃에서 보관되었고, 빛으로부터 차단되었다. 혼입된 Eu-DTPA의 농도는 키트로부터 공급된 100nM Eu 표준에 대해 샘플의 Eu 카운트를 계산함으로써 결정되었다.
Eu3+-DTPA 접합된 AVP04-50은 본질적으로 실시예 4에서 기재된 바와 같은 방법들에 의해 면역 반응성인 것을 보여주었다. Eu3+-DTPA 접합된 AVP04-50은 항원:아비바디 복합체의 형성에 의해 나타나는 바와 같이 BSM에 대한 특이성을 보였다. 이러한 복합체 형성은 Superdex®200 10/300 컬럼 상의 겔 크로마토그래피에서 단백질 용리 시간의 단축에 의해 증명되었다(도 16).
Eu3+-DTPA 접합된 AVP04-50의 면역 반응성은 세포 결합 분석법(cell binding assay)에 의해 결정되었다. 표지된 아비바디는 TAG72 포지티브 (LS174T) 및 네가티브 (SK-OV-3) 세포계들(cell lines)로 배양되었다. 배양 기간(1 시간, 주위 온도) 후에, 세포들은 강하게 세척되었고 유로퓸 활성에 대하여 분석되었다. 유로퓸 표지된 AVP04-50은 SK-OV3 (TAG72 네가티브) 세포계와 비교하여 LS174T(TAG72 포지티브) 상에서 형광 강도의 현저한 증가에 의해 나타내어지는 바와 같이 비변형 면역 반응성 및 항원 특이성을 보여주었다(도 17).
함께 얻어진 이러한 데이터는 티올화된 아비바디들 내 조작된 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이들에 대해 사이트-특이적 유효 하중(payloads)을 접합하는 것이 가능하다는 것을 제시한다.
실시예 8-방사성 표지된 AVP04-xx 아비바디들의 체내 성능
티올화된 아비바디들에서 골격 1 내부 조작된 시스테인 돌연변이들이 체내 안정성 또는 성능에 영향을 주지 않았다는 것을 보여주기 위하여, 티올화된 아비바디 AVP04-50이 체내(in vivo) 마우스 제노그래프트 모델(xenograft model)에서 사용되었다. AVP04-50의 (125I 또는 111In)을 사용하는 생물 분포(biodistribution)가 "비-돌연변이화된" 모 AVP04-07의 그것과 비교되었다.
8.1 125 I로 아비바디들의 방사성 표지화
125I(Perkin Elmer)에 의한 AVP04-07 및 AVP04-50 아비바디들의 방사성 요오드화가 표준 요오드겐 방법(Iodogen method (Yazaki 외, 2001)을 사용하여 수행되었다. Na 125I (26 mBq) 의 요구되는 부피(5-10μL)가 20㎍의 요오드겐(Iodogen (Pierce))으로 미리 고팅된 튜브 내에서의 200㎍의 아비바디에 첨가되었다. 실온에서 3분 동안의 배양 후에, 표지된 물질은 상기 기재된 바와 같은 Superdex-75 또는 200 컬럼을 사용하는 FPLC에 의해 정제되었다. 컬럼 용리가 분획되고(fractionated) 및 카운트 되었고, 그 후 피크 분획물들(fractions)이 모아져 체내 및 체외 연구를 위해 사용되었다. 방사성 표지화 수율은 전형적으로 80-100% 였다.
8.2 아비바디들에 대한 NHS-DOTA의 접합 및 111 In로 방사성 표지화
AVP04-07은 NHS-DOTA[1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 모노(N-히드록시숙신이미드 에스테르), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid mono (N-hydroxysuccinimide ester)]에 접합되었다. AVP04-07 및 AVP04-50은 Amicon Centricon YM-10 (10 kDa MWCO) 윈심 분리의 필터 장치 (Millipore Corp, Bedford, MA, USA)를 사용하여 4℃에서 4,000 rpm에서 원심 분리에 의해 3-6 mg/mL로 농축되었다. 금속 오염원들을 제거하기 위하여, 단백질(0.4 mL)은, Biomax 초여과막(ultrafiltration membrane (Millipore, PBQK02510)을 구비하는 변형된 초여과 셀을 사용하여, 14 부피 접합 버퍼(0.1M 소듐 바이카보네이트, 5mM 9 디에틸렌트리아멘 펜트아세테이트(diethylenetriamene pentaacetate)(DTPA), pH 8.5)에 대해서 2 시간 동안 투석되었다. 혈장 등급수(plasmagrade water) (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 내 10 mg/mL (0.19 mg, 250 nmole) 에서의 NHS-DOTA(B-280; Macrocyclics, Dallas, TX, USA) 19μL가 원심분리 세포 내 5 배 과량 몰 농도에서의 아비바디(Avibodies (2.5 mg, 48 nmole))로 첨가되었고 실온에서 1시간 동안 스터링되었다. 이어서 단백질은 14 부피의 250mM 소듐 아세테이트, pH 7.2에 대해 투석되었고 4℃에서 보관되었다.
DOTA-접합된 아비바디(AVP04-07-DOTA 및 AVP04-50-DOTA)의 방사성 금속 표지화가 111InCl2 (Trace Life 11 Sciences, Denton, TX, USA)을 사용하여 수행되었다. 전형적인 실험에서, 19 mBq 의 111InCl2 는 첨가되는 0.1M HCl에 의해 희석되었고 0.25M 암모늄 아세테이트 pH 7.0 내(5.5로 조정된 최종 pH)에서의 125㎍의 DOTA-접합된 AVP04-07에 첨가되었다. 43℃에서 45분 동안의 배양 후에, 어떤 잔기적 111In 에 결합하기 위해 용액은 0.1mM DTPA로 조정되었으며 실온에서 추가적으로 10분 동안 배양되었다. 방사성 표지화의 수율은 전형적으로 70-90% 였다. 다음으로 표지된 물질은 Superdex-75 또는 200 컬럼을 사용하는 HPLC에 의해 정제되었고, 컬럼 용리가 분획되었고 및 카운트되었다.
8.3 LS-174T 제노그래프트를 사용하는 체내 생물 분포( In vivo Biodistribution)
마우스 제노그래프트 모델을 위하여 암컷, 무흉선 (athymic) nu/nu 마우스 (Charles River Laboratories), 6-8 주령이 LS-174T 세포들 (ATCC) (106) 로 옆구리의 피하 내에 주입 되었고, 연구 전에 약 10일 동안 종양이 성장되도록 하였다. LS-174T 제노그래프트를 포함하는 마우스는 생물 분포 연구를 위하여 370 kBq의 125I- 및 150 kBq의 111In- 표지화된 AVP04-07 또는 AVP04-50 (2-6㎍의 총 단백질)의 혼합물(200μl)로 정맥주사 되었다. 마우스(4-6 마우스/그룹)는 여러 시간 시점에서 안락사되었고, 종양, 혈액 및 주요 기관들이 수집, 칭량 및 카운트 되었다. 카운트는 125I 채널 내에서의 111In 카운트의 교차를 위해 수정되었다. 조직의 그램 당 퍼센트 주입량 (%ID/g) 이 각 방사성 핵종에 대해서 계산되었다.
8.4 아비바디들의 체내 생물 분포 (biodistribution)
125I- 및 111In- DOTA 표지된 아비바디들의 생물 분포는 LS-174T 제노그래프트를 포함하는 무흉선 (athymic) 마우스에서 측정되었다.
AVP04-07 및 AVP04-50 아비바디들의 체내에서의 성능은 절대적으로 유사하며, 모델링-한정된 내부 골격 I 이황화 브릿지 도입이 아비바디의 성능을 불안정화 시키거나 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 제안한다 (도 18a 및 b).
두 개의 방사성 추적자들(125I- 및 111In)은 AVP04-50과 AVP04-07의 제거 사이에서 관찰되는 단지 근소한 차이를 갖는 유사한 방법으로 혈액으로부터 제거되었다. 주입 후 1 시간까지 약 50%가 제거되었고 약 6-12%가 4 시간에서 여전히 순환된다. 이러한 크기의 단백질에 대해서 예상되는 바와 같이, 111In-표지된 아비바디에 대해, 그러나 125I-표지된 아비바디에 대해서는 아닌 고려할 만한 신장 섭취(24시간에서 >100 %ID/g)가 존재하였으며, 이는 신장이 제거의 주요 경로임을 나타내었다.
111In-AVP04-07에 대하여, 주입 후 4 시간과 같이 초기에 관찰되는 25 %ID/g 및 48 시간에서 종양 내 여전히 존재하는 20 %ID/g 초과를 갖는, 종양 내에서의 현저한 섭취가 있었다. 주입 후 0-4시간 주기에서의 111In-AVP04-50의 종양 섭취는 111In-AVP04-07의 그것과 동일하지만, 24시간에서는 30%ID/g 초과의 최대 종양 섭취에 도달하여 111In-AVP04-07의 그것을 초과했다. 종양 섭취는 주입 후 48시간에서 111In-AVP04-07 및 111In-AVP04-50 모두에 대해 여전히 유사하게 남아있다. 111In-AVP04-07에 대한 종양 대 혈액 비는 24시간에서 >50:1이었다. 111In-AVP04-50의 경우에 종양 대 혈액 비는 24시간에서 >60:1로 증가되었다. 요오드-125 표지된 아비바디는 다소 낮은 종양 대 혈액 비 및 종양 섭취 (AVP04-07에 대해서는 4시간 및 48시간에서 각각 약 17% 및 10%ID/g 그리고 AVP04-에 50대해서는 4시간 및 48시간에서 각각 19% 및 10%ID/g)를 보여주었다. 예상되는 바와 같이, 125I-표지된 아비바디는 이러한 조직에서 보유되지 못한 반면, 어떤 111In은 비장, 간, 및 시체(carcass)에 보유되었다.
AVP04-07 및 AVP04-50의 생물 분포에 더하여, 티올화된 HER2-특이적 아비바디, AVP07-63 (SEQ ID NO:65)은 그것의 비-티올화된 모 (parental) AVP07-17에서와 같이 체내 효율적인 것으로 또한 나타났다.
이러한 체내 실험들에서, AVP07-17 및 AVP07-63은 본질적으로 (Adams 외 1993)에 기재된 바와 같이, 클로라민 T 방법 (chloramine T method) (125I: 단백질 비, 1:10)을 사용하여 125I로 방사성 표지화되었다. 방사성 제약들의 질 및 면역 반응성은 (Adams 외 1993)에 기재된 바와 같이, 살아있는 세포-결합 분석법으로 및 SDS-PAGE에 의해 평가되었다. CB.17 Icr scid 마우스 6-8 주령이 SKOV3 세포들 (2.5x106) 로 복부 피하 내에 이식되었다. 종양이 50-200mg (약 8주)의 크기에 도달하였을 때, 방사성 요오드의 갑상선 축적을 막기 위하여 Lugol's 용액이 그들의 식수에 놓여졌고, 생물 분포 연구가 개시되었다. 20 마이크로그램 (100ml)의 방사성 요오드화된 AVP07-17 또는 AVP07-63은 각 마우스에 대해 정맥 내 꼬리 정맥 주사에 의해 투여되었다. 125I-아비바디를 받은 다섯 마리의 마우스 그룹들이 주사 후 24시간에서 희생되었다. 조직 (%ID/g) 및 혈관 (%ID/ml) 내의 각 방사성 제약의 보유의 평균 및 SEM이, (Adams 외 1993)에 기재된 바와 같이, 소멸-보정된 카운트(decay-corrected counts)로부터 결정되었다.
24시간 생물 분포의 결과들은 AVP04-17 및 AVP07-63의 종양 섭취가 3.0-3.6 %ID/g 사이의 범위에서 매우 유사하였음을 나타내었다 (도 19). 티올화된 및 비-티올화된 아비바디 사이에서 종양 섭취가 매우 유사하였음에도 불구하고, 모든 다른 조직에서, 24시간에서 AVP07-63 섭취가 모 (parental), 비-티올화된 AVP07-17의 그것보다 훨씬 적었다.
이러한 결과는 체내 성능, 안정성 또는 기능에 나쁜 영향을 미치지 않고 골격 1 내부 이황화 삽입을 받아들이는 골격 1 영역의 강건함을 명확하게 나타낸다. 나아가, 바람직한 골격 1 내부 이황화 삽입(AVP04-50에서와 같이)의 부가는, 중심 모델링 제약들이 만족되는 한, 아비바디 성능 또는 이황화 형성에 영향을 미치지 않고 1-2 잔기들 만큼 약간 이동될 수 있다(AVP07-63에서와 같이).
실시예 9-유효 하중-접합된 티올 아비바디들의 체내 성능은 Non "비-돌연변이화된" 아비바디들에 비해 우수하다.
이황화 삽입의 돌연변이는 Fv 포함 단백질에 대하여 사이트-특이적이고 화학정량적으로 한정된 유효 하중-접합을 허용하도록 설계되었다. 조작된 골격 1 내부 이황화 브릿지의 삽입은 티올화된 아비바디의 성능에 대해, 체외 및 체내 모두에서, 영향을 미치지 않는다는 것으로 보여졌다.
체내로 제공된 아비바디의 표면 상에 조작된 골격 1 내부 이황화 삽입 돌연변이들에 대해 사이트-특이적이고 화학정량적으로 한정된 유효 하중 접합은, 라이신과 같은 다른 아비바디 표면 잔기들에 대한 랜덤한 유효 하중에 비해 체내 장점을 제공한다는 것을 보여주기 위해, 사이즈 단분산된 48-PEG 반복의 폴리에틸렌 글리콜(dPEG48, Quanta Biodesign Ltd, OH, USA)이 조작된 골격 1 내부 사이트들을 통해 AVP04-50에 대해 접합되었다. 이러한 시약(PEG48-AVP04-50)의 생물 분포는, PEG가 표면 라이신에 접합된 AVP04-07의 PEG-접합체(PEG3400-AVP04-07)에 대해 얻어진 체내 생물 분포와 비교되었다.
9.1 AVP04-07 아비바디의 DOTA-Cys-VS-PEG3400 접합체의 제조
NHS-PEG3400-VS는 앞선 기재(Li 외, 2008)에서와 같이, 15:1의 몰 비 및 pH 6.0에서 AVP04-07 이원 항체에 접합되었다. 간단하게, NHSPEG3400-VS(3.1mg, 800 nnmole)가 1mL의 pH 7.5 PBS 내의 2.75mg(50nmole)의 이원 항체(52,500 달톤의 이합체 분자량을 기반으로 하는)와 혼합되었고, pH 는 0.1M NaOH로 6.0으로 조정되었으며, 그 혼합물은 실온에서 2시간 동안 반응되었다. 반응이 SDS 겔에 의해 모니터되었을 때에, 그것은 2시간까지 >70% 완료인 것으로 나타났다. 2시간 후에 완전한 반응 혼합물은 Superdex 75 컬럼에 적용되었고 16.3 분에서 용리된 접합체가 수집되었다. 그 접합체(8 mL)는 10,000 kDa 컷-오프 Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech, Germany)내에서 0.35ml로 농축되었고, 1.4 mg(2.76 μmole)의 시스테인아미도-DOTA(Lewis 외, 1998)과 혼합되었으며, 그 pH는 8.5로 조정되었고, 그 혼합물은 샘플 회전기(sample rotator) 상에서 실온에서 17시간 동안 반응되었다. 샘플은 0.25m 암모늄 아세테이트에 대해 투석되었고, 10,000 kDa 컷-오프 Vivaspin 상에서 1-3 mg/L로 농축되었으며 살균 여과되었다. 결과적 접합체는 실시예 8.2에 기재된 바와 같이 본질적으로 111In로 방사성 표지화되었다.
9.2 AVP04-50 이원 항체의 DOTA-PEG 48 접합체의 제조
N-FMOC-아미도-PEG48-산(0.1 mmole)이 실온에서 90분 동안 메틸피롤리돈/디클로로메탄 내의 N-DCC/HOBt로 활성화되었고, 여과에 의해 DCU가 제거되었으며, 및 활성화된 N-FMOC-아미도-PEG48-산이 75℃에서 3분 동안 Cys-폴리스티렌 왕(Wang) 레진(0.3 nmole cys/g 레진)에 커플되었다. FMOC 그룹은 65℃에서 3분 동안 에탄올/DMF(13:200, v/v) 내의 0.5M 피페라진으로 제거되었고, DMF, 에탄올 및 DCM로 세척되었으며, 다음으로 상술한 바와 같이 트리-t-부틸-DOTA(0.5 mmole)의 활성 에스테르에 커플되었다. 상기 레진은 40℃에서 60분 동안 5mL의 TFA(5% 물, 5% 트리스-이소프로필 실란, 5% 에탄 디티올)로 처리되었다. 크루드(crude) 생성물은 DCM/헥산(5mL, 2:5 v/v, 5x)으로 추출되었으며, -20℃에서 10mL의 t-부틸메틸 에테르로 침전되었고 및 100% A (0.1 TFA, 94.9 물, 5 MeCN) 내지 100% B (0.1 TFA, 29.9 물, 70 MeCN)의 기울기를 사용하는 PRP-1 컬럼 (Hamilton, Reno, NV, 10 x 250 mm) 상에서 8mL/분의 흐름으로 15분에 걸쳐 크로마토그래프되었다. DMF 내의 DOTA-PEG48-Cys은 비닐 술폰 및 트리에틸렌아민이 부가되었으며, 그 반응 혼합물은 아르곤 하에서 실온에서 23 시간 동안 스터링되었다. 용매 증발 후에, 그 잔류물은 물에 재용해되었고, Gemini C18 컬럼 (Phenomenex, CA)을 사용하는 역상 HPLC( reversed phase HPLC )에 의해 정제되었으며, 동결 건조되었다. DOTA-PEG48-Cys-VS이 20:1 및 50:1 사이의 몰 비로 이원 항체에 접합되었다. 간단하게, AVP04-50은 기재된 비로 DOTA-PEG48-Cys-VS에 접합되었고 0.1 NaOH로 pH는 9.0으로 조정되었다. 혼합물은 회전기 상에서 실온에서 18시간 동안 반응되었다. 샘플은 0.25M 암모늄 아세테이트에 대하여 투석되었고, 10,000 kDa 컷-오프 Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech, Germany)에서 1~4mg/mL로 농축되었으며, 살균 여과되었다. 정제물은 SDS 및 IEF 겔 크로마토그래피 및 질량 분광기에 의해 접합을 확인하기 위해 제거되었다.
9.3 AVP04-07-PEG3400 및 AVP04-50-PEG 48 의 비교 생물 분포
PEG3400을 사용하는 생물 분포는 비-PEG화된 AVP04-07과 비교할 때 신장 섭취를 현저하게 감소시켰다. PEG3400-AVP04-07은 24시간에서 약 8.4%ID/g(도 20 Panel A)의 신장 섭취를 보여준다. PEG화로 신장 섭취의 큰 감소는 24시간에서 22 에서 46%ID/g으로의 종양 섭취에서의 증가에 동반되었다(도 18에 보여지는 바와 같이 비-PEG화된 AVP04-07에 대해). 종양 보유에서의 증가는 명백하게 비-PEG화된 이원 항체(tl/2b, 18시간)에 비하여 PEG화된 이원 항체의 연장된 혈액 세정(tl/2b, 36시간)에 기인한다.
PEG48-VP04-50(조작된 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이에 대해 PEG화된)의 생물 분포는 PEG3400-AVP04-07에 대하여 종양 섭취에서의 더 일반적인 향상, 더 빠른 혈액 세정 및 더 높은 종양 대 혈액 비를 보여주었다(도 20 Panel B). PEG48-VP04-50 종양 섭취는, 24시간에서 11:1의 종양 대 혈액 비를 갖고, 48시간에는 19:1로까지 증가한, 70%ID/g으로 까지 더욱 증가되었다.
PEG3400-AVP04-07과 같은 라이신-지향성 접합체들에 관하여, PEG3400-AVP04-50에 대해서 관찰되는 향상된 종양 대 혈액 비, 더 높은 종양 섭취 및 허용 가능한 비-특이적 신장 섭취는 분명히 조작된 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이에 대한 유효 하중의 접합이 체내 성능 또는 기능에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
9.4 AVP04-07-PEG3400 및 AVP04-50-PEG 48 의 비교 PET 이미징
비교 PET 이미징은 본질적으로 그 밖에 기재된 바와 같이(Li 외, 2008) 수행되었다. 요약하면, 종양-함유 마우스는 64Cu 표지된 AVP04-07 또는 AVP04-07 이원 항체-PEG 접합체(라이신에 대해 접합된) 또는 AVP04-50 이원 항체-PEG 접합체(조작된 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이들)로 정맥 내 주사되었고, 1, 4, 21-22 및 45-46 시간에서 작은 동물 PET 스캐너(microPET 모델 R4; Siemens/CTIMI)로 이미지되었다. 이소플루란(isoflurane)으로 마취된 마우스는 1 및 4 시간 시점들에서 20 분동안; 21-22 시간에서 45 분 및 45-46 시간에서 60 분 동안 스캔되었다. 데이터는 퓨리에 리비닝 방법(Fourier rebinning method)을 사용하여 2차원 시노그램(sinogram) 내로 분류되었고. 내부 스캔 방사능 감소(intrascan radiodecay), 검출기 비균일성(detector nonuniformity) 및 무작위 동시발생 노이즈(random coincidence noise)에 대해 수정되었다. 이미지들은 반복 주문되는-대상 기대 최대화 방법(iterative ordered-subsets expectation maximization method (4 반복, 16 대상)에 의해 재건조되었다(reconstructed).
비변형된 및 비접합된 AVP04-07로부터 얻어진 PET 이미지는 이러한 사이즈의 단백질에 대해 예상되는 바와 같이, 현저한 신장 섭취를 보여주었다(도 21a). 이는 상기 도 18 내에 기록된 AVP04-07의 111In 생물 분포에 상당한다(parallels). 무작위 표면 AVP04-07 라이신에 대하여 27-잔기들의 사이즈-단분산된 PEG(가능한 최상의 체내 생물 분포를 제공하도록 최적화된 크기)의 부가는 종양 섭취를 증가시키고 신장 섭취를 현저하게 감소시키는 것에 의해 전반적인 생물 분포를 현저하게 향상시켰다(도 21a).
AVP04-50의 조작된 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이에 대한 사이즈-단분산된 PEG의 사이트 특이적 및 화학정량적으로 한정된 부가는 또한 비-PEG화된 AVP04-07에 대하여 생물 분포를 향상시켰고(도 21b), 원하지 않은 신장 섭취에서의 현저한 감소 및 종양-특이적 섭취에서의 일반적 향상을 보여준다. 라이신에서 PEG화된 AVP04-07 및 조작된 티올에서 PEG화된 AVP04-50에 대해 생성된 PET 이미지가 매우 유사하였음에도, 재생산가능성(reproducibility), 조작된 골격 1 내부 시스테인 대체 돌연변이에 대한 사이트- 및 화학정량적으로 한정된 접합은 체내 성능에 부정적인 영향을 미치는 일 없이 강한 임상적 장점을 제공한다.
실시예 10-항-TAG72 이원 항체 접합체 및 이미징을 위한 그들의 용도
10.1 실험 과정
LS-174T 세포들이 ATCC로부터 얻어졌고 10% 열 비활성화된 어린 소(fetal bovine) 혈청(FBS) (Omega Scientific, Tarzana, CA, USA), 1% L-글루타민, 10mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate) 및 0.1mM 불필수(non-essential) 아미노산으로 보충된 Eagle's Minimal Essential Media 1 x (EMEM) (Cellgro, Herndon, VA, USA)로 이루어진 멸균 성장 배지 내에서 유지되었다. 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리스(t-부틸 아세테이트)-10-아세트산(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7-tris(t-butyl acetate)-10-acetic acid)이 Macrocyclics, Inc., Dallas, TX로부터 얻어졌다. NHS-PEG3400-VS (Cat No 4M5B0F02) 이 Nektar (San Carlos, CA)로부터 구입되었다. N-FMOC-아미도-dPEG-27 산이 Novabiochem (EMD Biosciences, San Diego, CA) 로부터 얻어졌고, N-FMOC-아미도-dPEG-12 산이 Quanta Biodesign Ltd (Powell, OH)로부터 구입되었다. 킬레이트 접합된 항체들은, 실질적으로 앞서 기재된 바와 같은(Lewis 외, 1994) 111In 클로라이드 (Amersham, 2-9 mCi/mg 의 단백질) 또는 64Cu (Washington University School of Medicine, 10 mCi/mg 의 항체), 또는 (실질적으로Yazaki 외, 2001에 기재된 바와 같은) 요오드겐 방법에 의한 125I (Perkin Elmer, 3-9 mCi/mg 의 항체) 로 방사선 표지되었다. 퍼센트 표지화는 ITLC에 의해 또는 Superdex 75 또는 200 컬럼 (1 x 30 cm, GE Healthcare) 상에서의 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography (SEC))에 의해 결정되었다. 방사선 표지된 항체는 동일한 컬럼(식염수 내, 흐름 속도 0.5mL/분, 분류 사이즈는 0.5mL 였다) 상에서 SEC에 의해 정제되었다. 질량 스펙트럼이 Agilent 6520 4극 타임-오브-플라이트 액상 크로마토그래피 질량 분광기 장비(Quadrupole time-of-flight liquid chromatography mass spectrometry device) 상에 기록되었다.
항-TAG72 이원 항체의 구조, 클로닝, 발현, 및 정제
항-TAG72 이원 항체를 인코딩하는 서열이 CC49 모노클로날 항체를 인코딩하는 서열 및 E.coli 발현을 위해 최적화된 코돈으로부터 유도되었다. DNA 구조는 5-잔기 연결자(G4S)에 의해 보존되고 연결된 V 도메인들의 방향(VH-VL)을 갖는 것으로 설계되었다. DNA 서열은 적당한 제한 사이트들(NcoL 및 NotI)로 합성되었으며 GenScript Corp (Piscataway, NJ, USA)에 의해 pUC57 내로 클론되었다. 그 서열은 NcoI 및 NotI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)로 pUC57로부터 절단되었고, 정제되어 pET22b (+) 발현 벡터(Novagen, Madison, WI, USA) 내로 클론되었고, 및 E. coli XL1-Blue (recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lacI q ZΔM15 Tn10 (Tetr)]) (Stratagene, La Jolla, CA, USA)내로 전기천공되었다(electroporated). 서열화에 의해 포지티브 클론이 확인되었고, AVP04-07로 지정되었다(이원 항체를 인코딩하는 서열은 SEQ ID NO:54로 나열된다).
AVP04-07의 박테리아적 생산 및 정제
AVP04-07은 표준화된 프로토콜을 사용하여 E. coli BL21 (DE3)(F' ompT hsdS B(rB - mB -) gal dcm (DE3)) (Novagen) 내로 하위 클론되었다. 단일 콜로니가 1%(v/v) D-글루코스 및 100 mg/mL 앰피실린을 포함하는 500mL 2xYT를 주입하는데 사용되었고 37℃에서 하루밤 동안 쉐이킹하면서 배양되었다. 18 리터의 동일 배지(글루코스가 0.1%로 감소된)가 하룻밤 배양물로 최종 0.1의 A600nm로 시드되었고 30℃에서 OD600이 0.6-0.8가 될 때까지 배양되어 그 시점에서 배양물은 12℃로 이동되었다. AVP04-07 발현은 0.2mM의 이소프로필-b-D-티오글락토피라노시드(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside (IPTG))(Promega, Madison, WI, USA) 의 첨가로 유도되었고 배양물은 12℃에서 하룻밤 배양되었다. 박테리아 펠렛들이 원심분리에 의해 수확되었고, 칭량되었으며 -20℃에서 정제될 때까지 보관되었다.
정제의 개시에서, 발현된 박테리아 펠렛들은 0.25mg/mL 리소자임(lysozyme)(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), 1 mM PMSF (Sigma) 및 25 U 벤조나제(Benzonase) (Merck, Darmstadt, Germany)를 포함하는, HisTrap 추출 버퍼(HisTrap extraction buffer )(20mM 포스페이트, 500mM NaCl, 20mM 이미다졸, pH 7.4)에 용해 및 재분산되었고 4℃에서 Misonix S-4000 소니케이터(sonicator) (Misonix, Farmingdale, NY, USA)를 사용하여 절단되었다. 박테리아 절단물은 원심분리(16,000xg, 30분)에 의한 세정 및 0.45㎛에서의 여과에 앞서, 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 발현된 AVP04-07을 포함하는 세정된 용해물은 AKTA Purifier 10 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 사용하는 3 단계의 정제 기술에 따라 정제되었다.
AVP04-07을 포함하는 세정된 용해물은 예비-평형된 HisTrap Crude FF 컬럼들 (2 x 5 mL) (GE Healthcare) 상에 하중되었다(loaded). 비결합 단백질은 HisTrap 용리 버퍼(20 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 260 mM 이미다졸) 내의 컬럼으로부터 AVP04-07을 용리하기 전에, HisTrap 추출 버퍼(HisTrap extraction buffer)로 세척되었다. 용리된 AVP04-07은 4℃에서 50mM MES, pH 6.0 에 대해 투석되었고, 원심분리에 의해 어떤 침전물들로부터 세정되었다. 투석된 AVP04-07은 50 mM MES, pH 6.0 내에 예비-평형된 HiTrap SP HP 컬럼들(2 x 5 mL) (GE Healthcare)상에 하중되었다. 비결합된 단백질은, 선형 증가하는 NaCl 기울기(0-600mM NaCl)하의 50 mM MES, pH 6.0 내에서 결합된 AVP04-07을 용리하기에 앞서, 50 mM MES, pH 6.0 내에서 컬럼들을 세척함으로써 제거되었다. 용리된 AVP04-07 이원 항체를 포함하는 분획물들은, PBS pH 7.2 내에서 Superdex 75 (26/60 prep-grade) 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하는 사이즈 배제 크로마토그래피 하에 놓여지기 전에 모아지고(pooled), 정량화되고, 농축되었다. 280nm에서 단일 피크에 상응하는 분획물들이 모아지고, 정량화되고, ~3mg/ML로 까지 농축되었으며, PBS에 대해 투석되었고 4℃에서 보관되었다.
분석적 초원심분리(Analytical Ultracentrifugation)에 의한 AVP04-07 아이소폼(isoform) 형성
정제된 AVP04-07은 분석적 초원심분리에 의해 이합체인 것으로 확인되었다. 침전 속도(Sedimentation velocity) 실험이 베크만 모델 XL-I 분석적 초원심분리(Beckman model XL-I analytical ultracentrifuge) (Fullerton, CA, USA) 를 사용하여 20℃에서 수행되었다. 정제된 AVP04-07은 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.4에 대해 투석되었고, 이중 섹터 수정 셀(double sector quartz cell) 내로 하중되었고, Beckman 4-홀(hole) An-60 Ti 회전 날개(rotor) 내에 탑재되었다. AVP04-07 및 기준 용액이 40,000 rpm의 회전 날개(rotor) 속도에서 원심분리되었고, 데이터가 30초의 시간 간격 및 0.003cmdml 단계-크기를 사용하는 연속적인 모드로서 A290nm에서 평균화 없이 수집되었다. 용매 밀도(1.00499 g/mL at 20℃), 용매 점도 (1.0214 cp)의 산출 및 AVP04-07에 대한 부분 특정 부피(partial specific volume)의 산출이 프로그램 SEDNTERP를 사용하여 컴퓨팅되었다. 프로그램 SEDFIT를 사용하여 여러 시간 시점에서의 침전 속도 데이터가 연속 사이즈-분포 모델에 대해 피팅되었다.
면역 반응성의 체외 측정
소 위턱 뮤신(Bovine Submaxillary Mucin) (BSM, Aldrich-Sigma (St. Louis, MO))에 존재하는 항원 TAG-72를 결합하는 AVP04-07의 용해성 능력은 컬럼 이동 분석(column shift assay)에 의해 측정되었다. 2 몰 농도 과량의 BSM가 55℃에서 5 분 동안 가열되었고, AVP04-07의 첨가 이전에 원심분리로 세정되었으며, 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 샘플은 즉시 Superdex 200 컬럼 상의 겔 여과에 의해 분석되었다. 이원 항체-항원 복합체의 형성은 관련 대조군의 용리 프로파일과의 비교에 의해 결정되었다.
NHS-DOTA에 대한 AVP04-07의 접합
AVP04-07은 DOTA-NHS[l,4,7,10-테트라아자시틀로도데칸-l,4,7,10-테트라아세트산 모노(N-히드록시숙신이미드 에스테르(l,4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacetic acid mono (N-hydroxysuccinimide ester)]에 접합하였다. AVP04-07은 Amicon Centricon YM-10 (10 kDa MWCO) 원심분리 여과 장치(Millipore Corp, Bedford, MA, USA)를 사용하여 4℃에서 4,000rpm에서 원심분리에 의해 5.8 mg/mL로 농축되었다. 금속 오염원들을 제거하기 위하여, 단백질(0.5mL)은, Biomax 초여과막(ultrafiltration membrane (Millipore, PBQK02510)을 구비하는 변형된 초여과 셀을 사용하여, 14 부피 접합 버퍼(0.1M 소듐 바이카보네이트, 5mM 디에틸렌트리아멘 펜트아세테이트(diethylenetriamene pentaacetate)(DTPA), pH 8.5)에 대해 2 시간 동안 투석되었다. 혈장-등급수((Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 내 10 mg/mL의 NHS-DOTA(B-280; Macrocyclics, Dallas, TX, USA)가 초여과 셀 내 15 배 몰 농도 과량의 AVP04-07로 부가되었고 실온에서 1시간 동안 스터링되었다. 단백질은 후속적으로 14 부피 250mM 소듐 아세테이트,pH 7.2에 대해 투석되었고, 카세트(cassette)로부터 제거되었으며 4℃에 보관되었다.
DOTA-PEG에 대한 AVP04-07의 접합
DOTA-Cys-VS-PEG3400-이원 항체. NHS-PEG3400-VS가 상기 기재된 바와 같이 (Lewis 외, 2008) 30:1의 몰 농도 비 및 pH 6.0에서 AVP04-07 이원 항체에 접합되었다. 간단하게, NHS-PEG3400-VS(3.1 mg, 800nmole)이 1mL의 pH 7.5의 PBS 내 2.75mg(50 nmole)의 이원 항체와 혼합되었고 pH는 0.1M NaOH로 6.0로 조정되었고, 혼합물은 실온에서 2 시간 동안 반응되었다. 반응이 SDS 겔에 의해 모니터되었을 때, 2시간의 종료에서 >70% 완료로 나타났다. 2시간의 종료에서 완전한 반응 혼합물이 Superdex 75 컬럼(1 x 30 cm, 0.5 ml/min, Pharmacia)에 적용되었고, 16.3 분에서 용리된 접합체가 수집되었다. 상기 접합체(8mL)는 10,000 kDa 컷-오프 Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech, Germany) 내에서 0.35mL로 농축되었고, 1.4mg(2.76μmole) 시스테인아미도-DOTA와 혼합되었고, pH가 8.5로 조정되었으며, 혼합물은 실온에서 17 시간 동안 샘플 회전기(sample rotator) 상에서 반응되었다. 샘플은 0.25 M 암모늄 아세테이트에 대하여 투석되었고, 10,000 kDa 컷-오프 Vivaspin 상에서 1-3mg/L로 농축되었고 멸균 여과되었다. 접합체는 SDS 및 IEF 겔 전기영동(gel electrophoresis)에 의해 특정되었다.
DOTA-PEG27-Cys-VS-이원 항체. N-FMOC-아미도-PEG27-산(0.1 mmole)이 N-메틸피롤리딘/디클로로메탄 내의 DCC/HOBt로 실온에서 90분 동안 활성화되었으며, DCU가 여과에 의해 제거되었고, 활성화된 N-FMOC-PEG 산이 75℃에서 3 분 동안 Cys-폴리스티렌 왕(Wang) 레진(0.3 mmole cys/g 레진)과 커플되었다. FMOC 그룹이 65℃에서 3 분 동안 에탄올/DMF(13:200, v/v) 내 0.5M 피페라진으로 제거되었고, DMF, 에탄올 및 DCM으로 세척되었으며, 다음으로 상기 트리-t-부틸-DOTA(0.5 mmole)의 활성 에스테르에 커플되었다. 레진은 40℃에서 60분 동안 5mL의 TFA(5% 물, 5% 트리-이소프로필 실란, 5% 에탄 디티올)로 처리되었다. 조(crude) 생성물은 DCM/헥산(5mL, 2:5 v/v, 5x)로 추출되었고, -20℃에서 10mL의 t-부틸메틸 에테르로 침전되었으며, 100% A (0.1 TFA, 94.9 물, 5 MeCN) 내지 100% B (0.1 TFA, 29.9 물, 70 MeCN)의 기울기를 사용하는 PRP-1 컬럼 (10 x 250 mm) 상에서 15분에 걸쳐 8 mL/분의 흐름에서 크로마토그래피되었다. DMF 내 200 μL의 DOTA-PEG27-Cys (30 mg, 16.6 μmol)에 비닐 술폰(12μl, 116 μmol) 및 트리에틸아민(6μl, 43μmol)이 첨가되었고, 반응 혼합물은 실온에서 23 시간 동안 아르곤 하에서 스터링되었다. 용매 증발 후에, 그 잔류물은 300μl 물에 재용해되었고, Gemini C18 컬럼 (Phenomenex, CA) 상의 역상 HPLC(reversed phase HPLC)에 의해 정제되었고, 동결 건조 되었다(수율 55%). DOTA-PEG27-Cys-VS 은 50:1의 몰 농도 비에서 이원 항체에 접합하였다. 간단하게, 2mg(38 nmole)의 이원 항체(2.75 mg/mL in PBS)가 22μL의 DOTA-PEG27-Cys-VS (0.175 mg/mL 물 내에서, 2 μmoles)에 첨가되었고, pH는 0.1 NaOH에 의해 9.0으로 조정되었으며, 혼합물은 회전기에서 실온에서 18시간 동안 반응되었다. 샘플은 0.25 M 암모늄 아세테이트에 대하여 투석되었고, 10,000 kDa 컷-오프 Vivaspin(Sartorius stedim biotech, Germany) 내에서 1~4 mg/mL의 농도로 농축되었으며, 멸균 여과되었다. 정제물은 SDS 및 IEF 겔 크로마토그래피 및 질량 분광기에 의해 접합체를 확인하기 위해 제거되었다.
이원 항체-VSC-PEG12-DOTA. 20:1 및 50:1의 몰 농도 비에서의 이원 항체에 대한 DOTA-PEG12-Cys-VS 합성 및 접합이 상기 기재된 바와 같이 수행되었다.
AVP04-07 접합체들의 등전위 포커싱(Isoelectric Focusing )
등전위 포커싱 겔 전기영동(Isoelectric focusing gel electrophoresis)이 IEF Precast 겔 (pH 3-10) (Novex) 상에서 또는 Pharmacia PhastGel 상에서 제조자의 설명에 따라 수행되었다.
AVP04-07 및 그 접합체들의 방사성 표지화
125I (Perkin Elmer) 로의 AVP04-07 및 그 접합체들의 방사선 표지화가 표준 요오드겐 방법(standard Iodogen method (Yazaki 외, 2001))을 사용하여 수행되었다. Na 125I (26 mBq) 의 요구되는 부피(5-10μL)가 20㎍의 요오드겐으로 예비 코팅된 튜브(Pierce) 내의 200㎍의 AVP04-07에 첨가되었다. 실온에서 3분 동안의 배양 후에, 상기 표지화된 물질은 Superdex-75 또는 200 10/300 GL FPLC 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하는 HPLC에 의해 정제되었다. 컬럼 용리는 분획되었고 카운트되었으며, 그 후 피크 분획물들이 모아지고(pooled) 체외 및 체내 연구를 위하여 사용되었다. 방사성 표지화의 수율은 전형적으로 80~100%였다.
DOTA-AVP04-07의 방사성 금속 표지화는 111InCl2 (Trace Life Sciences, Denton, TX, USA) 또는 64CuCl2 (Washington University, St. Louis, MO.)를 사용하여 수행되었다. 전형적인 실험에서, 19 mBq 의 111InCl2 가 부가되는 0.1M HCl 로 희석되었고, 0.25M 암모늄 아세테이트 pH 7.0(5.5로 조정된 최종 pH) 내의 125㎍의 DOTA-접합된 AVP04-07로 첨가되었다. 43℃에서 45분 동안 배양 후에, 용액은 어떤 잔류의 111In과 결합하기 위하여 0.1mM DTPA로 조정되었고 실온에서 추가적으로 10분 동안 배양되었다. 64Cu 표지화가 동일한 방법으로 수행되었다. 방사성 표지화 수율은 전형적으로 70-90%였다. 표지화된 물질은 다음으로 HPLC에 Superdex-75 또는 200 10/300 GL FPLC 컬럼을 사용하여 정제되었고, 컬럼 용리는 분획되었고 카운트되었다.
방사성 표지화된 생성물은 Superose-6 10/300 GL 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하는 HPLC-SEC에 의해 순도에 대해 분석되었다. 방사성 표지화된 단백질(4 kBq)은 1% HSA/PBS 내에서 희석되었고 0.5ml/분으로 컬럼 상에 주입되었다. 방사성 활성 및 UV 흡광도가 흐름-쓰루 검출기(flow-thru detectors)를 사용하여 검출되었다.
LS-174T 제노그래프트 모델
암컷, 무흉선 nu/nu 마우스(athymic nu/nu mice (Charles River Laboratories)), 6-8 주령이 LS-174T 세포(ATCC) (106) 로 옆구리에서 피하 내로 주사되었고, 연구에 앞서 종양이 약 10일 동안 성장되도록 하였다. 생물 분포 연구를 위하여 LS-174T 제노그래프트를 포함하는 마우스는 370 kBq 의 125I- 및 150 kBq 의 111In- 표지된 AVP04-07 (2-6㎍의 총 단백질)의 혼합물(200μl)로 정맥 내 주사되었다. 마우스는 다양한 시간 지점들에서 희생되었고 종양, 혈액 및 주요 기관들이 수집되었으며, 칭량 및 카운트되었다. 카운트는 배경 및 125I 채널 내 111In 카운트의 포함을 위해 수정되었다. 조직의 그램 당 주입된 양의 퍼센트(Percentages of the injected dose per gram)가 각 방사성 핵종에 대해 계산되었다.
PET 이미징
종양-함유 마우스(21-25g)가 64Cu-표지된 이원 항체 또는 이원 항체-PEG 접합체들로 정맥 내 주사되었고, 작은 동물 PET 스캐너(small-animal PET scanner)(microPET Model R4; Siemens/CTIMI, Knoxvillle, TN)로 1.0 시간, 4 시간, 21-22 시간 및 45-46 시간에서 시작하여 이미지되었다. 주사된 활성 및 단백질 하중은 각각 63 내지 169 kBq/g 및 0.4 내지 0.7 mg/g의 범위였다. 스캐닝 잠시 전에, 마우스는 이소플루란으로 마취되었고, 엎드린 (prone) 위치로 보존되었으며 기기 필드의 시야 내에 중심 위치되었다. 스캔 지연(scan duration)은 1 및 4 시간 지점에 대하여 20 분, 21-22 시간 지점에 대하여 45 분 및 45-46 시간 지점에 대하여 60분이었다. microPET의 레이저 정렬 기구가, 꼬리의 베이스를 각 스캔에서의 8.0 cm 길이 필드 시야의 축 중심으로부터 약 4.0 cm에 위치시키는 데에 사용되었다.
최종 스캔의 완료 직후에, 혈액 샘플(0.2 cc)이 심장 펑크(cardiac puncture)로부터 얻어졌고, 마우스는 희생되었으며, 종양 및 여러 기관들이 분리되고, 칭량되었으며 및 카운트되었다. 측정된 활성은 주사 후 방사성 소멸에 대해 수정되었고, %ID/g이 각 표본에 대해 계산되었다. 희생의 시점에서 종양은 107 내지 275 mg 범위의 무게였다.
이미지 과정은 표준화된 microPET 소프트웨어로 수행되었다. 스캔 데이터는 퓨리에 리비닝 방법(Fourier rebinning method)를 사용하여 2차원 시노그램(sinogram) 내로 분류되었고 내부 스캔 방사능 감소(intrascan radiodecay), 검출기 비균일성(detector nonuniformity) 및 무작위 동시발생 노이즈(random coincidence noise)에 대해 수정되었다. 이미지들은 반복 주문되는-대상 기대 최대화 방법(iterative ordered-subsets expectation maximization method (4 반복, 16 대상)에 의해 재건조되었다.
10.2 결론
AVP04-07 이원 항체의 건조, 발현 및 특성화
AVP04-07은 E.coli BL21(DE3) 내 용해성 단백질로 생성되었고 3 단계의 정제 기술에 의해 정제되었다. 정제된 생성물은 Superdex 200 겔 여과 컬럼으로부터 단일 종으로 용리되었다. 연속적인 질량 c(M)-분포 분석들은, 잔류물들의 무작위 분포 및 최상의 피트들(즉, 모든 rmsd 값 < 0.0054 및 Runs test Z 값 < 14.4)을 위해 결론되는 통계적 변수들에 의해 나타내어지는 바와 같이, 우수한 피트를 수득하였다. AVP04-07의 c(M) 분포 분석은 그것이 분명히 52.5 kDa의 분자량을 가진 단분산된 이합체(즉, 이원 항체)로서 존재한다는 것을 제시했다.
정제된 AVP04-07은 Superdex 200 컬럼 상에서의 컬럼 이동 분석(column shift assay)에 의해 체외에서 용해성 항원에 결합하는 것으로 보여졌다. BSM 배경 내에서 그 항원과 결합하도록 되었을 때, AVP04-07의 용리 프로파일은 AVP04-07 단독의 그것으로부터 현저하게 변화되었다. 정제된 AVP04-07 단독의 예상되는 31분 용리 시간과 비교할 때, 주요 단백질 피크가 약 16분에서 컬럼으로부터 용리되었다. 이원 항체-항원 복합체의 형성을 나타내는 유사한 용리 시간의 감소가 비 연관된 이원 항체 및 비 연관된 항원으로는 관찰되지 않았다.
누드 마우스 LS-174T 제노그래프트 내 111 In-DOTA- 및 125 I- AVP04-07의 생물 분포 및 이미징
생물 분포가 125I- 또는 111In-DOTA-AVP04-07 로 주사된 LS174T 제노그래프트를 함유하는 무흉선 마우스에서 측정되었다. 두 개의 방사선 추적자들이 유사한 방법, 주입 후 1시간까지 약 50% 제거되고, 4 시간에서 약 10%가 순환 내에 여전히 존재하는(도 22a 및 b) 것으로서 혈액으로부터 제거되었다. 이러한 사이즈의 단백질에 대해 예상되는 바와 같이, 111In-표지에 대해서, 그러나 125I-표지된 이원 항체에 대해서는 아닌, 고려할 만한 신장 섭취 (24시간에 100%ID/g)가 있었고, 이는 신장이 세정의 주요 경로였음을 보여준다.
111In-AVP04-07에 대하여, 주입 후 4시간과 같이 초기에 관찰되는 25%ID/g 및 48시간에서 종양 내 여전히 20% ID/g 초과로 존재하는, 종양 내 현저한 섭취가 있었다. 111In-AVP04-07에 대한 종양 대 혈액 비는 24시간에서 >50:1이었다. 요오드-125 표지된 AVP-04-07은 다소 낮은 종양 대 혈액 비 및 종양 섭취 (4시간 및 48시간에서 각각 약 17% 및 10%ID/g)를 보여주었다. 예상되는 바와 같이, 125I-AVP04-07은 이러한 조직들에서 보유되지 못한 반면, 어떤 111In은 비장, 간, 및 시체(carcass)에 보유되었다.
DOTA-Cys-VS-PEG3400-AVP04-07 의 생성 및 생물 분포의 연구
AVP04-07은 본질적으로 상기 기재된 바(Li 외, 2006)와 같이 DOTA-Cys-VS-PEG3400-NHS 에 접합되었다. VS-PEG3400-NHS는 (활성 에스테르를 통하여) 단백질들의 표면 라이신들에 1차로 접합할 수 있고, (비닐 술폰을 통하여) 반응성 티올을 함유하는 시약과 반응하는 이종 이중 기능성(heterobifunctional) PEG화 제재이다. DOTA의 티올 버전, 즉 DOTA-Cys(Lewis 외, 1998)이 VS-PEG3400-AVP04-07에 접합되었고, 그 접합체는 IEF 및SDS 겔 전기영동에 의해 분석되었다(도 23). 그 결과는 산성 DOTA의 부가로 인하여 더 낮은 pI로의 이동(IEF 겔, 도 23a) 및 PEG3400의 부가로 인하여 더 높은 분명한 분자 크기로의 이동(SDS 겔, 도 23b)을 나타낸다. 접합체는 111In으로 방사성 표지화되었고, Superdex 75 상에서 크로마토그래프되었으며, 비접합된 AVP04-07과 비교되었다(도 23a-b). PEG3400 유도체의 분명한 분자 크기는 비접합된 이원 항체에 대한 50 kDa과 비교하여 80 kDa였다. 분명한 분자 크기의 증가는 단백질의 Stoke 반경(Stoke's radius) 에 대한 PEG화의 효과에 기인할 수 있다.
111In 방사성 표지된 AVP04-07에 대한 생물 분포의 결과들은 도 22c에 보여진다. 신장 섭취는 비변형된 이원 항체에 대하여 24시간에서 98%ID/g 이었고(도 7a), PEG화된 이원 항체에 대하여 24시간에서 8.4%ID/g 이었다(도 22c). 신장 섭취의 큰 감소는, 24시간에서의 23%로부터 47%ID/g의 종양 섭취에서의 증가 및 종양/혈액 비에서의 감소(24시간에서 >46:1 에서 2:1로)에 의해 동반된다. 종양 보유에서의 증가는 분명히 비접합된 이원 항체 (t1/2=18h)에 비해 PEG화된 이원 항체에서의 연장된 혈액 세정(t1/2=36h)에 기인한다. 놀랍게도, 신장 섭취에서의 감소는 111In-DOTA-Cys-VS-PEG3400 항-CEA-이원 항체 (Li 외, 2006)로 종전에 관찰된 것보다 훨씬 컸다.
단분산된 PEG 27 AVP04-07 접합의 제조 및 생물 분포의 연구
PEG3400 조각에 대한 AVP04-07의 접합이 바람직한 신장 섭취 감소에 도달하였다 하더라도, PEG3400은 그것의 고유한 다분산성 및 그로인한 화학적으로 특정화하기에 쉬운 생성물을 제조할 수 없는 것으로 인하여, 임상적 생성물로서 단점을 가질 것이다. 이러한 점에서, 펩타이드 합성 절차를 사용하여 이종 이중 기능성 시약으로 전환될 수 있는 수 개의 단분산된 PEG 결합 블록들은 상업적으로 입수 가능하다. 이종 이중 기능성의 단분산된 PEG화 제재는 상업적으로 입수 가능한 단분산된 PEG FMOC-NH-PEG27-산, 이 카테고리 내에서 입수 가능한 가장 큰 PEG들 중 하나를 사용하여 생산될 수 있었다. PEG 유도체의 활성 에스테르는 표준 펩타이드 합성 프로토콜을 통해 Cys-폴리스티렌 왕(Wang) 레진에 1 차적으로 커플되었고, FMOC가 제거되었으며, 상업적으로 입수 가능한 트리-t-부틸 보호된 모노-산 유도체를 사용하여 DOTA에 커플되었다. DOTA-PEG27-Cys 은 TFA로 레진으로부터 절단되었고, 정제되었으며, 과량의 비닐 술폰과 반응되었고, 및 역상 HPLCl를 사용하여 재정제되었다. 생성물의 합성은 도 10에 보여진다. DOTA-PEG27-Cys-VS 은 대략적으로 PEG3400 분자량의 절반인, 1928.6의 예상되는 분자량을 가지며, 부가적인 분자 크기가 신장 제거에서의 감소에 영향을 미치기에 충분한지에 대해서는 분명하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 그것은 pH 9.5 및 50:1의 몰 농도 비에서 이원 항체의 표면 라이신에 접합되었다. 접합체가 IEF 및 SDS 겔 전기영동에 의해 특정화되었을 때(도 8), pI 및 분자 크기에서의 예상되던 이동이 관찰되었다. 이중의 111In 및 125I 방사성 표지된 생성물은 Superdex 75상에서 크로마토그래프 되었고(도 24), 주요 피크가 수집되었으며 생물 분포 연구가 수행되었다. 크로마토그램의 조사 및 비접합된 이원 항체에 대한 비교는 PEG3400-이원 항체 유도체와 동등한 외관상 분자 크기에서의 이동을 나타낸다.
생물 분포 연구의 결과는 도 26a-b에 보여진다. PEG3400 유도체와 비교할 때 PEG27 유도체의 더 낮은 분자 크기에도 불구하고, 거의 동등한 결과가 얻어졌다. 24시간에서, 111In-표지된 접합에 대한 신장 섭취는 8.3%ID/g, 종양 섭취는 49%ID/g, 및 종양 대 혈액 비는 4.2:1이었다. PEG27 유도체에 대한 놀랍게도 좋은 결과가 주어진다면, PEG12 유도체가 생성되었다.
단분산된 PEG 12 AVP04-07의 생성 및 생물 분포 연구
FMOC-NH-PEG12-카복실은 상기와 동일한 화학에 의해 DOTA-PEG12-Cys-VS 로 전환되었고(도 25) pH 9.0에서 20:1 및 50:1의 몰 농도 비를 사용하여 AVP04-07에 접합되었다. 비변형된 것 및 두 개의 접합체들이 그들의 치환도를 결정하기 위하여 고해상도 나노 스프레이 질량 분광기(high resolution nanospray mass spectrometry )에 의해 분석되었다. 비변형된 이원 항체는 분해되었을 때 아미노산 서열로부터 예측되는 것과 잘 일치되는 질량, 26,869의 계산된 질량을 제공하는, m/z 종(species)의 시리즈를 제공한다. 20:1의 몰 농도 비에서 DOTA-PEG12-Cys-VS 에 접합되었을 때, 모두가 DOTA-PEG12-Cys-VS의 예상되는 질량, 1225 매스 유닛(mass units)만큼 차이가 나는 분해된 피크들의 시리즈가 얻어졌다. 마찬가지로 질량 차이는 50:1 몰 농도 비 접합에 대해 동일하였고, 단자 더 높은 치환도로 이동되었다. 예상되는 가우시안 분포가 이 형태의 반응에 대하여 얻어졌으므로, 피크 높이들은 존재하는 각 종의 실제 양에 상응한다는 가정은 합리적이다. 예측으로서 피크 높이들을 사용하여, 20:1 접합체에 대하여 이원 항체 당 평균 1.7 PEGs가 예측되었고, 50:1 접합체에 대하여 접합체 당 평균 3.0 PEGs가 예측되었다. 각 접합체가 111In (178 mBq/mg)로 테스트 표지화 되었을 때, 20:1 접합체는 방사성 표지의 8.3% 혼입 및 50:1은 92%의 혼입을 가져왔다. 이러한 결과는 결과적으로 더 높은 수준의 치환을 갖는 더 높은 몰 농도 비가 방사성 표지화에 대해 더 우수한 결과를 가져옴을 나타낸다.
생물 분포 연구는 이중의 111In 및 125I- 표지된 DOTA-PEG12-Cys-VS-AVP04-07로 수행되었다. 전반적으로, 종양 및 신장 섭취, 혈액 세정, 및 종양 대 혈액 비는 PEG3400 및 PEG27 유도체들(도 26b)과 동등하였다. 그중에서도, 신장 섭취는 PEG27 접합체에 비해 PEG12에서 초기에 높았으나(13.4% ID/g), 96시간까지 더 낮은 수준(6.1%ID/g)으로 떨어졌다. 그러나, 종양 섭취 수준 및 혈액 세정 커브는 두 접합체들 사이에서 거의 동일하다.
DOTA-PEG 접합체 AVP04-07의 64 Cu 이미징
64Cu, 반감기 13시간을 갖는 양성자 방출자는 PEG화된 AVP04-07의 혈액 세정 동력학(blood clearance kinetics (t1/2b = 18h))에 잘 매치된다. DOTA-PEG 접합체들에 대한 AVP04-07의 PET 이미징 특성은 LS174T 제노그래프트 모델을 사용하여 평가되었다. 도 27a에 보여지는 비-PEG화된 이원 항체에 대한 결과는 이미징 실험의 2일 시간 경로를 통하여 상대적으로 온화한 종양 섭취 및 매우 높은 신장 섭취를 나타낸다. 대조적으로, PEG12 및 27 접합체들은 전체를 통해서 상대적으로 적은 신장 섭취 및 21-22시간과 같이 초기의 높은 종양 섭취를 보여주었다. PEG27 접합체는 7.9:1의 종양 대 혈액 비를 갖는 46시간에서 종양에 대한 종양 섭취가 45.1% ID/g 인 것으로 측정되었다(도 27b). PEG12에 대하여 측정된 종양 섭취는, (9±4):1의 종양 대 혈액 비를 갖는 46 시간에서의 종양에 대해 49±3% ID/g 였다(값들은 중앙값이다±SD, n=2)(도 27c). 이러한 결과는 111In-표지된 접합체에 대한 생물 분포 결과들에 근접하게 일치하며 방사성 금속의 선택이 생물 분포에 거의 영향을 미치지 않음을 제시한다.
10.3 논의
이미징 제재(imaging agent)를 기반으로 하는 이상적인 방사성 표지된 항체에 대한 연구는, 그들의 빠른 혈액 세정이 이른 시간에 비변형 IgGs 보다 향상된 종양 대 혈액 비를 가져오기 때문에 항체 단편들에 초점이 맞추어져왔다. 그러나, 증가된 혈액 세정에 대한 통상의 메카니즘은 신장을 통한 분비이며, 방사성 금속 표지된 단편들의 경우에, 신장 내에서의 전체 축적은 그들의 주요 장점을 상쇄시킨다. 나아가, 너무 빠른 혈액 세정 경로는 종양 타겟팅에 대하여 적당한 시간을 허용하지 않고, 따라서 적당한 이미지에 도달하기 위하여 높은 용량의 방사성 표지의 투여를 요구한다. PEG화는 신장 축적을 감소시키기 위한 매력적인 방법이다. Yazaki 외. (2001) 는 항-CEA 이원 항체에 대한 상대적으로 큰, 다분산된 PEG3400를 접합시킴에 의해 신장 섭취가 24시간에서 200%ID/g 으로부터 50%ID/g 까지 감소될 수 있었음을 보여주었다. 현저하기는 하지만, 이러한 감소는 여전히 허용되지 않는 신장 섭취의 결과를 가져온다. 여기서 처음으로 더 작은, 단분산된 PEG로 이원 항체를 PEG화하는 것은 24-48 시간에서 신장 섭취를 12%ID/g 미만의 수준으로 까지 감소시킬 수 있는 것으로 기재된다. 이 결과들은 모든 PEG화된 접합체들이 비변형된 이원 항체보다 우수하다는 것을 나타낸다. 체내에서 얻어진 결과들로부터, 하기의 체내에서의 향상의 순서가 결론 내려질 수 있다: 비변형<< PEG3400<PEG27<PEG12.
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gcctggaatg gattggctat tttagcccgg gcaacgatga ttttaaatat 180 aacgaacgtt ttaaaggcaa agcgaccctg accgcggata aaagcagcag caccgcgtat 240 ctgcagctga acagcctgac cagcgaagat agcgcggtgt atttttgcac ccgtagcctg 300 aatatggcgt attggggtca gggcacctcg gtcaccgtga gcagcggtgg cggcggcagc 360 gatatcgtga tgacccagag ctgcagcagc tgcccggtga gcgtgggcga aaaagtgacc 420 ctgagctgca aaagcagcca gagcctgctg tatagcggca atcagaaaaa ctatctggcg 480 tggtatcagc agaaaccggg tcagagcccg aaactgctga tttattgggc gagcacccgt 540 gaaagcggcg tgccggatcg ttttaccggc agcggtagcg gcaccgattt taccctgagc 600 attagcagcg tggaaaccga agatctggcg gtgtattatt gccagcagta ttatagctat 660 ccgctgacct ttggtgcggg caccaaactg gtgctgaaac gt 702 <210> 57 <211> 234 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP04-07 anti-TAG72 diabody designated AVP04-50 comprising cysteine residues in FR1 and a N-terminal serine <400> 57 Ser Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 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ggcgtgccga gccgttttag cggcagcggc agcggcaccg attatacctt taccattagc 600 agcctgcagc cggaagatat tgcgacctat tattgccagc agtggagcag caacccgccg 660 acctttggcc agggcaccaa actgcagatt aaacgt 696 <210> 61 <211> 232 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of AVP02-60 anti-MUC1 diabody <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Asp Gly Tyr Asp Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln 115 120 125 Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 130 135 140 Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 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gtcaccgtga gcagcggtgg cggcggcagc 360 gatatcgtga tgacccagag cccgagcagc ctgccggtga gcgtgggcga aaaagtgacc 420 ctgagctgca aaagcagcca gagcctgctg tatagcggca atcagaaaaa ctatctggcg 480 tggtatcagc agaaaccggg tcagagcccg aaactgctga tttattgggc gagcacccgt 540 gaaagcggcg tgccggatcg ttttaccggc agcggtagcg gcaccgattt taccctgagc 600 attagcagcg tggaaaccga agatctggcg gtgtattatt gccagcagta ttatagctat 660 ccgctgacct ttggtgcggg caccaaactg gtgctgaaac gt 702 <210> 63 <211> 234 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP04-07 anti-TAG72 diabody designated AVP04-84 comprising cysteine residues in FR1 and a N-terminal serine <400> 63 Ser Val Gln Leu Gln Gln Cys Asp Ala Cys Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Lys Gln Asn Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Phe Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 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agcgtgcagc tggtgcagtc tggggcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagta catggggctc atctatcctg gtgactctga caccaaatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagtcgaca agtccgtcag cactgcctac 240 ttgcaatgga gcagtctgaa gccctcggac agcgccgtgt atttttgtgc gagacatgac 300 gtgggatatg cgagtagttc caacgcggca aagtggcctg aatacttcca gcattggggc 360 cagggcaccc tggtcaccgt ttcctcaggt ggaggcggtt cacagtctgt gttgacgcag 420 ccgtgcagca gctgcgcggc cccaggacag aaggtcacca tctcctgctc tggaagcagc 480 tccaacattg ggaataatta tgtatcctgg taccagcagc tcccaggaac agtccccaaa 540 ctcctcatct atggtcacac caatcggccc gcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc 600 aagtctggca cctcagcctc cctggccatc agtgggttcc ggtccgagga tgaggctgat 660 tattactgtg cagcatggga tgacagcctg agtggttggg tgttcggcgg agggaccaag 720 ctgaccgtcc taggt 735 <210> 65 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP07-17 anti-Her2 diabody designated AVP07-63 comprising cysteine residues in FR1, removal of cysteine residues in CDR3H and a N-terminal serine <400> 65 Ser Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Ala Ser Ser Ser Asn Ala Ala Lys Trp 100 105 110 Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Cys Ser Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser 145 150 155 160 Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly 165 170 175 Thr Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly 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ccggataaag gcctggaact ggtggcgacc attaacagca acggtggaag cacctattat 180 ccggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt agccgtgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg taccgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgtgatcgt 300 gatggctatg atgaaggctt tgattattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 ggtgggggcg gaagccagat tcagctgacc cagagcccga gcagcctgag cgcatgcgtg 420 ggttgccgtg tgaccattac ctgcagcgcg agcagcagcg tgagctatat gcattggtat 480 cagcagaaac cgggcaaagc gccgaaacgt tggatttatg ataccagcaa actggcgagc 540 ggcgtgccga gccgttttag cggcagcggc agcggcaccg attatacctt taccattagc 600 agcctgcagc cggaagatat tgcgacctat tattgccagc agtggagcag caacccgccg 660 acctttggcc agggcaccaa actgcagatt aaacgt 696 <210> 83 <211> 232 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP02-60 anti-MUC1 diabody designated AVP02-102 comprising cysteine residues in FR1 and a N-terminal serine <400> 83 Ser Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 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DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding modified AVP02-60 anti-MUC1 diabody designated AVP02-105 comprising cysteine residues in FR1 and a N-terminal serine <400> 84 agcgtgcagc tggttgaaag cggtggcgga gtggtgtgcc caggttgcag cctgcgtctg 60 agctgcgcag caagcggttt tacctttagc agctatggca tgagctgggt gcgtcaggcg 120 ccggataaag gcctggaact ggtggcgacc attaacagca acggtggaag cacctattat 180 ccggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt agccgtgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg taccgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgtgatcgt 300 gatggctatg atgaaggctt tgattattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 ggtgggggcg gaagccagat tcagctgacc cagagcccga gcagcctgag cgcaagcgtg 420 ggtgatcgtg tgaccattac ctgcagcgcg agcagcagcg tgagctatat gcattggtat 480 cagcagaaac cgggcaaagc gccgaaacgt tggatttatg ataccagcaa actggcgagc 540 ggcgtgccga gccgttttag cggcagcggc agcggcaccg attatacctt taccattagc 600 agcctgcagc cggaagatat tgcgacctat tattgccagc agtggagcag caacccgccg 660 acctttggcc agggcaccaa actgcagatt aaacgt 696 <210> 85 <211> 232 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP02-60 anti-MUC1 diabody designated AVP02-105 comprising cysteine residues in FR1 and a N-terminal serine <400> 85 Ser Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Cys Pro Gly Cys 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Asp Gly Tyr Asp Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln 115 120 125 Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 130 135 140 Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr 145 150 155 160 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp 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ttcctcaggt ggaggcggtt cacagtctgt gttgacgcag 420 ccgccctcag tgtctgcggc cccaggacag aaggtcacca tctcctgctc tggaagcagc 480 tccaacattg ggaataatta tgtatcctgg taccagcagc tcccaggaac agtccccaaa 540 ctcctcatct atggtcacac caatcggccc gcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc 600 aagtctggca cctcagcctc cctggccatc agtgggttcc ggtccgagga tgaggctgat 660 tattactgtg cagcatggga tgacagcctg agtggttggg tgttcggcgg agggaccaag 720 ctgaccgtcc taggt 735 <210> 87 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP07-17 anti-HER2 diabody designated AVP07-88 comprising cysteine residues in FR1, removal of cysteine residues in CDR3H and a N-terminal serine <400> 87 Ser Val Gln Leu Val Gln Cys Gly Ala Cys Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 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removal of cysteine residues in CDR3H and a N-terminal serine <400> 88 agcgtgcagc tggtgcagtg tggggcatgt gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagta catggggctc atctatcctg gtgactctga caccaaatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagtcgaca agtccgtcag cactgcctac 240 ttgcaatgga gcagtctgaa gccctcggac agcgccgtgt atttttgtgc gagacatgac 300 gtgggatatg cgagtagttc caacgcggca aagtggcctg aatacttcca gcattggggc 360 cagggcaccc tggtcaccgt ttcctcaggt ggaggcggtt cacagtctgt gttgacgcag 420 ccgccctcag tgtctgcggc cccaggacag aaggtcacca tctcctgctc tggaagcagc 480 tccaacattg ggaataatta tgtatcctgg taccagcagc tcccaggaac agtccccaaa 540 ctcctcatct atggtcacac caatcggccc gcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc 600 aagtctggca cctcagcctc cctggccatc agtgggttcc ggtccgagga tgaggctgat 660 tattactgtg cagcatggga tgacagcctg agtggttggg tgttcggcgg agggaccaag 720 ctgaccgtcc taggt 735 <210> 89 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP07-17 anti-HER2 diabody designated AVP07-90 comprising cysteine residues in FR1, removal of cysteine residues in CDR3H and a N-terminal serine <400> 89 Ser Val Gln Leu Val Gln Cys Gly Ala Cys Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Ala Ser Ser Ser Asn Ala Ala Lys Trp 100 105 110 Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 130 135 140 Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser 145 150 155 160 Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly 165 170 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gcattggggc 360 cagggcaccc tggtcaccgt ttcctcaggt ggaggcggtt cacagtctgt gttgacgcag 420 ccgccctcag tgtctgcgtg tccaggatgt aaggtcacca tctcctgctc tggaagcagc 480 tccaacattg ggaataatta tgtatcctgg taccagcagc tcccaggaac agtccccaaa 540 ctcctcatct atggtcacac caatcggccc gcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc 600 aagtctggca cctcagcctc cctggccatc agtgggttcc ggtccgagga tgaggctgat 660 tattactgtg cagcatggga tgacagcctg agtggttggg tgttcggcgg agggaccaag 720 ctgaccgtcc taggt 735 <210> 91 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP07-17 anti-HER2 diabody designated AVP07-89 comprising cysteine residues in FR1, removal of cysteine residues in CDR3H and a N-terminal serine <400> 91 Ser Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln 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AVP07-91 comprising cysteine residues in FR1, removal of cysteine residues in CDR3H and a N-terminal serine <400> 92 agcgtgcagc tggtgcagtc tggggcagag gtgaaatgtc ccgggtgttc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagta catggggctc atctatcctg gtgactctga caccaaatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagtcgaca agtccgtcag cactgcctac 240 ttgcaatgga gcagtctgaa gccctcggac agcgccgtgt atttttgtgc gagacatgac 300 gtgggatatg cgagtagttc caacgcggca aagtggcctg aatacttcca gcattggggc 360 cagggcaccc tggtcaccgt ttcctcaggt ggaggcggtt cacagtctgt gttgacgcag 420 ccgccctcag tgtctgcggc cccaggacag aaggtcacca tctcctgctc tggaagcagc 480 tccaacattg ggaataatta tgtatcctgg taccagcagc tcccaggaac agtccccaaa 540 ctcctcatct atggtcacac caatcggccc gcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc 600 aagtctggca cctcagcctc cctggccatc agtgggttcc ggtccgagga tgaggctgat 660 tattactgtg cagcatggga tgacagcctg agtggttggg tgttcggcgg agggaccaag 720 ctgaccgtcc taggt 735 <210> 93 <211> 245 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cgtgagcagc 360 ggtgggggcg gaagccagat tcagctgacc cagagcccga gcagcctgag cgcaagcgtg 420 ggtgatcgtg tgaccattac ctgcagcgcg agcagcagcg tgagctatat gcattggtat 480 cagcagaaac cgggcaaagc gccgaaacgt tggatttatg ataccagcaa actggcgagc 540 ggcgtgccga gccgttttag cggcagcggc agcggcaccg attatacctt taccattagc 600 agcctgcagc cggaagatat tgcgacctat tattgccagc agtggagcag caacccgccg 660 acctttggcc agggcaccaa actgcagatt aaacgt 696 <210> 95 <211> 232 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP02-60 anti-MUC1 diabody designated AVP02-103 comprising cysteine residues in FR1 and a N-terminal serine <400> 95 Ser Val Gln Leu Val Cys Ser Gly Cys Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Asp Gly Tyr Asp Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln 115 120 125 Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 130 135 140 Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr 145 150 155 160 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser 165 170 175 Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala 195 200 205 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln 210 215 220 Gly Thr Lys Leu Gln Ile Lys Arg 225 230 <210> 96 <211> 735 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding modified AVP07-17 anti-HER2 diabody designated AVP07-68 comprising cysteine residues in FR1, removal of cysteine residues in CDR3H and a N-terminal serine <400> 96 agcgtgcagc tggtgcagtc tggggcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagta catggggctc atctatcctg gtgactctga caccaaatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagtcgaca agtccgtcag cactgcctac 240 ttgcaatgga gcagtctgaa gccctcggac agcgccgtgt atttttgtgc gagacatgac 300 gtgggatatg cgagtagttc caacgcggca aagtggcctg aatacttcca gcattggggc 360 cagggcaccc tggtcaccgt ttcctcaggt ggaggcggtt cacagtctgt gttgacgcag 420 ccgtgcagca gctgcgcggc cccaggacag aaggtcacca tctcctgctc tggaagcagc 480 tccaacattg ggaataatta tgtatcctgg taccagcagc tcccaggaac agtccccaaa 540 ctcctcatct atggtcacac caatcggccc gcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc 600 aagtctggca cctcagcctc cctggccatc agtgggttcc ggtccgagga tgaggctgat 660 tattactgtg cagcatggga tgacagcctg agtggttggg tgttcggcgg agggaccaag 720 ctgaccgtcc taggt 735 <210> 97 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP07-17 anti-HER2 diabody designated AVP07-68 comprising cysteine residues in FR1, removal of cysteine residues in CDR3H and a N-terminal serine <400> 97 Ser Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Ala Ser Ser Ser Asn Ala Ala Lys Trp 100 105 110 Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Cys Ser Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser 145 150 155 160 Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly 165 170 175 Thr Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly 180 185 190 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 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aacgaacgtt ttaaaggcaa agcgaccctg accgcggata aaagcagcag caccgcgtat 240 ctgcagctga acagcctgac cagcgaagat agcgcggtgt atttttgcac ccgtagcctg 300 aatatggcgt attggggtca gggcacctcg gtcaccgtga gcagcggtgg cggcggcagc 360 ggtggcggcg gcagcggtgg cggcggcagc gatatcgtga tgacccagag ctgcagcagc 420 tgcccggtga gcgtgggcga aaaagtgacc ctgagctgca aaagcagcca gagcctgctg 480 tatagcggca atcagaaaaa ctatctggcg tggtatcagc agaaaccggg tcagagcccg 540 aaactgctga tttattgggc gagcacccgt gaaagcggcg tgccggatcg ttttaccggc 600 agcggtagcg gcaccgattt taccctgagc attagcagcg tggaaaccga agatctggcg 660 gtgtattatt gccagcagta ttatagctat ccgctgacct ttggtgcggg caccaaactg 720 gtgctgaaac gt 732 <210> 101 <211> 244 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP04-07 anti-TAG72 scFv designated AVP04-70 comprising cysteine residues in FR1 and a N-terminal serine <400> 101 Ser Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 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tggtcaccgt ttcctcaggt ggaggcggtt caggtggagg cggttcaggt 420 ggaggcggtt cacagtctgt gttgacgcag ccgtgcagca gctgcgcggc cccaggacag 480 aaggtcacca tctcctgctc tggaagcagc tccaacattg ggaataatta tgtatcctgg 540 taccagcagc tcccaggaac agtccccaaa ctcctcatct atggtcacac caatcggccc 600 gcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc aagtctggca cctcagcctc cctggccatc 660 agtgggttcc ggtccgagga tgaggctgat tattactgtg cagcatggga tgacagcctg 720 agtggttggg tgttcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggt 765 <210> 105 <211> 255 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP07-17 anti-HER2 scFv designated AVP07-71 comprising cysteine residues in FR1, removal of cysteine residues in CDR3H and a N-terminal serine <400> 105 Ser Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 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mutagenic primer for introducing cysteine residues at Kabat positions L8 and L11 of the FR1 region of the VL chain in AVP04-07 <400> 106 gatatcgtga tgacccagag ctgcagcagc tgcccggtga gcgtgggcga aaaag 55 <210> 107 <211> 55 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence of mutagenic primer for introducing cysteine residues at Kabat positions L8 and L11 of the FR1 region of the VL chain in AVP04-07 <400> 107 ctttttcgcc cacgctcacc gggcagctgc tgcagctctg ggtcatcacg atatc 55 <210> 108 <211> 735 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding modified AVP07-17 anti-HER2 diabody designated AVP07-86 replacing CDR3H Cysteine residues Cys104 (Kabat numbering H100) and Cys109 (H100E) with Alanines and comprising a N-terminal serine <400> 108 agcgtgcagc tggtgcagtc tggggcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagta catggggctc atctatcctg gtgactctga caccaaatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagtcgaca agtccgtcag cactgcctac 240 ttgcaatgga gcagtctgaa gccctcggac agcgccgtgt atttttgtgc gagacatgac 300 gtgggatatg cgagtagttc caacgcggca aagtggcctg aatacttcca gcattggggc 360 cagggcaccc tggtcaccgt ttcctcaggt ggaggcggtt cacagtctgt gttgacgcag 420 ccgccctcag tgtctgcggc cccaggacag aaggtcacca tctcctgctc tggaagcagc 480 tccaacattg ggaataatta tgtatcctgg taccagcagc tcccaggaac agtccccaaa 540 ctcctcatct atggtcacac caatcggccc gcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc 600 aagtctggca cctcagcctc cctggccatc agtgggttcc ggtccgagga tgaggctgat 660 tattactgtg cagcatggga tgacagcctg agtggttggg tgttcggcgg agggaccaag 720 ctgaccgtcc taggt 735 <210> 109 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP07-17 anti-HER2 diabody designated AVP07-86 replacing CDR3H Cysteine residues Cys104 (Kabat numbering H100) and Cys109 (H100E) with Alanines and comprising a N-terminal serine <400> 109 Ser Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Ala Ser Ser Ser Asn Ala Ala Lys Trp 100 105 110 Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 130 135 140 Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser 145 150 155 160 Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly 165 170 175 Thr Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly 180 185 190 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu 195 200 205 Ala Ile Ser Gly Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp 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Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 130 135 140 Leu Tyr Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 145 150 155 160 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 165 170 175 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 180 185 190 Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr 195 200 205 Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 210 215 220 Leu Val Leu Lys Arg 225 <210> 128 <211> 684 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding modified AVP04-09 anti-TAG72 diabody lacking a linker sequence and amino acid N-terminal to linker and comprising a N terminal serine residue <400> 128 agcgtgcagc tgcagcagag cgatgcggaa ctggtgaaac cgggcgcgag cgtgaaaatt 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc gatcatgcga ttcattgggt gaaacagaat 120 ccggaacagg gcctggaatg gattggctat tttagcccgg gcaacgatga ttttaaatat 180 aacgaacgtt ttaaaggcaa agcgaccctg accgcggata aaagcagcag caccgcgtat 240 ctgcagctga acagcctgac cagcgaagat agcgcggtgt atttttgcac ccgtagcctg 300 aatatggcgt attggggtca gggcacctcg gtcaccgtga gcgatatcgt gatgacccag 360 agcccgagca gcctgccggt gagcgtgggc gaaaaagtga ccctgagctg caaaagcagc 420 cagagcctgc tgtatagcgg caatcagaaa aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 480 ggtcagagcc cgaaactgct gatttattgg gcgagcaccc gtgaaagcgg cgtgccggat 540 cgttttaccg gcagcggtag cggcaccgat tttaccctga gcattagcag cgtggaaacc 600 gaagatctgg cggtgtatta ttgccagcag tattatagct atccgctgac ctttggtgcg 660 ggcaccaaac tggtgctgaa acgt 684 <210> 129 <211> 228 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP04-09 anti-TAG72 diabody lacking a linker sequence and amino acid N-terminal to linker and comprising a N terminal serine residue <400> 129 Ser Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Lys Gln Asn Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Phe Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Leu Asn Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser 115 120 125 Val Gly Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu 130 135 140 Tyr Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 145 150 155 160 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 165 170 175 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 180 185 190 Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Val Leu Lys Arg 225 <210> 130 <211> 687 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding modified AVP04-50 anti-TAG72 diabody comprising cysteine residues in FR1 and a N-terminal serine residue and lacking a linker sequence <400> 130 agcgtgcagc tgcagcagag cgatgcggaa ctggtgaaac cgggcgcgag cgtgaaaatt 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc gatcatgcga ttcattgggt gaaacagaat 120 ccggaacagg gcctggaatg gattggctat tttagcccgg gcaacgatga ttttaaatat 180 aacgaacgtt ttaaaggcaa agcgaccctg accgcggata aaagcagcag caccgcgtat 240 ctgcagctga acagcctgac cagcgaagat agcgcggtgt atttttgcac ccgtagcctg 300 aatatggcgt attggggtca gggcacctcg gtcaccgtga gcagcgatat cgtgatgacc 360 cagagctgca gcagctgccc ggtgagcgtg ggcgaaaaag tgaccctgag ctgcaaaagc 420 agccagagcc tgctgtatag cggcaatcag aaaaactatc tggcgtggta tcagcagaaa 480 ccgggtcaga gcccgaaact gctgatttat tgggcgagca cccgtgaaag cggcgtgccg 540 gatcgtttta ccggcagcgg tagcggcacc gattttaccc tgagcattag cagcgtggaa 600 accgaagatc tggcggtgta ttattgccag cagtattata gctatccgct gacctttggt 660 gcgggcacca aactggtgct gaaacgt 687 <210> 131 <211> 229 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP04-50 anti-TAG72 diabody comprising cysteine residues in FR1 and a N-terminal serine residue and lacking a linker sequence <400> 131 Ser Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Lys Gln Asn Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Phe Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Leu Asn Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Cys Ser Ser Cys Pro Val 115 120 125 Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 130 135 140 Leu Tyr Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 145 150 155 160 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 165 170 175 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 180 185 190 Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr 195 200 205 Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 210 215 220 Leu Val Leu Lys Arg 225 <210> 132 <211> 684 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding modified AVP04-50 anti-TAG72 diabody comprising cysteine residues in FR1 and a N-terminal serine residue and lacking a linker sequence and amino acid N-terminal to linker <400> 132 agcgtgcagc tgcagcagag cgatgcggaa ctggtgaaac cgggcgcgag cgtgaaaatt 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc gatcatgcga ttcattgggt gaaacagaat 120 ccggaacagg gcctggaatg gattggctat tttagcccgg gcaacgatga ttttaaatat 180 aacgaacgtt ttaaaggcaa agcgaccctg accgcggata aaagcagcag caccgcgtat 240 ctgcagctga acagcctgac cagcgaagat agcgcggtgt atttttgcac ccgtagcctg 300 aatatggcgt attggggtca gggcacctcg gtcaccgtga gcgatatcgt gatgacccag 360 agctgcagca gctgcccggt gagcgtgggc gaaaaagtga ccctgagctg caaaagcagc 420 cagagcctgc tgtatagcgg caatcagaaa aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 480 ggtcagagcc cgaaactgct gatttattgg gcgagcaccc gtgaaagcgg cgtgccggat 540 cgttttaccg gcagcggtag cggcaccgat tttaccctga gcattagcag cgtggaaacc 600 gaagatctgg cggtgtatta ttgccagcag tattatagct atccgctgac ctttggtgcg 660 ggcaccaaac tggtgctgaa acgt 684 <210> 133 <211> 228 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of modified AVP04-50 anti-TAG72 diabody comprising cysteine residues in FR1 and a N-terminal serine residue and lacking a linker sequence and amino acid N-terminal to linker <400> 133 Ser Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Lys Gln Asn Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Phe Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Leu Asn Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Cys Ser Ser Cys Pro Val Ser 115 120 125 Val Gly Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu 130 135 140 Tyr Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 145 150 155 160 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 165 170 175 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 180 185 190 Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Val Leu Lys Arg 225 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Linker <400> 134 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 135 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Linker <400> 135 Gly Gly Gly Gly 1

Claims (102)

  1. 삭제
  2. 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 및 면역 글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 단백질로서,
    (i) 두 개 이상의 시스테인 잔기들은 모두 VH의 FR1 내에 위치되고 Kabat 위치들 H2 내지 H6, H8 내지 H24 또는 H26 내지 H30 중 어느 하나에 위치되거나; 또는
    (ii) 두 개 이상의 시스테인 잔기들은 모두 VL의 FR1 내에 위치되고 Kabat 위치들 L2 내지 L19 또는 L21 중 어느 하나에 위치되며;
    만일 상기 두 개 이상의 시스테인 잔기들이 화합물에 접합되지 않으면, 이황화 결합이 VH의 FR1 내 또는 VL의 FR1 내의 두 개 이상의 시스테인 잔기들 사이에 형성될 수 있는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  3. 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 및 면역 글로불린 경쇄 가변 영역(VL)이 상호 연관되도록 하는 6개 또는 그 미만의 아미노산을 포함하는 영역에 의해 연결되는 VH 및 VL을 각각 포함하는 복수 개의 폴리펩티드들을 포함하는 단리된 단백질로서,
    (i) 상기 단백질은 SEQ ID NO: 57, 63, 75, 77, 99, 103, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 또는 133 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (ii) 두 개 이상의 시스테인 잔기들은 모두 폴리펩티드들 중 하나의 VH의 FR1 내에 위치되고 Kabat 위치들 H7 내지 H20 중 어느 하나에 위치되거나; 또는
    (iii) 두 개 이상의 시스테인 잔기들은 모두 폴리펩티드들 중 하나의 VL의 FR1 내에 위치되고 Kabat 위치들 L7 내지 L20 중 어느 하나에 위치되며;
    상기 (ii)에서의 폴리펩티드의 VH와 상기 (iii)에서의 폴리펩티드의 VL은 연관되어 종양 항원 TAG72에 특이적으로 결합할 수 있는 Fv를 형성하고,
    만일 두 개 이상의 시스테인 잔기들이 화합물에 접합되지 않으면, 이황화 결합이 VH의 FR1 내 또는 VL의 FR1 내의 두 개 이상의 시스테인 잔기들 사이에 형성될 수 있는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 시스테인 잔기들은 VH 내에 있으며, 하기 영역들 중 하나 이상에 위치되는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질:
    (i) Kabat 넘버링 시스템에 따른 잔기 2 내지 6, 8 내지 24 또는 26 내지 30 사이;
    (ii) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기 8 내지 20 또는 잔기 26 내지 30 사이; 또는
    (iii) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기 8 내지 20 사이.
  7. 제 2 항에 있어서,
    상기 시스테인 잔기들은 VL 내에 있으며, 하기 영역들 중 하나 이상에 위치되는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질:
    (i) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기 2 내지 19 및 21 사이; 또는
    (ii) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 잔기 7 내지 19 사이.
  8. 제 2 항에 있어서,
    상기 시스테인 잔기들은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 상기 VL 내의 잔기 23 또는 상기 VH 내의 잔기 22에서 가변 영역 내에 보존된 시스테인 잔기에 부가되는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 시스테인 잔기들은 상기 보존된 시스테인 잔기에 대한 N-말단에 위치되는 것을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  10. 제 2 항에 있어서,
    상기 시스테인 잔기들은 하기 중 하나 이상에서 위치되는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질:
    (i) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 κVL의 잔기 8 및 잔기 11;
    (ii) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 κVL의 잔기 14 및 잔기 17;
    (iii) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 λVL의 잔기 7 및 잔기 11;
    (iv) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 λVL의 잔기 14 및 잔기 17;
    (v) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 λVL의 잔기 8 및 잔기 12;
    (vi) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 κVL의 잔기 13 및 잔기 19;
    (vii) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 λVL의 잔기 13 및 잔기 19;
    (viii) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 VH의 잔기 13 및 잔기 16;
    (ix) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 VH의 잔기 6 및 잔기 9; 또는
    (x) Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 VH의 잔기 12 및 잔기 18.
  11. 삭제
  12. 제 3 항에 있어서,
    상기 VL은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 5번 위치에서 트레오닌 또는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 53번 위치에서 트레오닌 또는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 79번 위치에서 글루탐산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  13. 제 3 항에 있어서,
    상기 VH는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 번호 매겨진 80번 위치에서 류신을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  14. 삭제
  15. 제 3 항에 있어서,
    (i) 상기 폴리펩티드들 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 111에 나열된 서열을 포함하는 VH의 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함하는 VH를 포함하며; 그리고
    (ii) 상기 폴리펩티드들 중 적어도 다른 하나는 SEQ ID NO: 113에 나열된 서열을 포함하는 VL의 CDR들을 포함하는 VL을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  16. 제 3 항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO: 111에 나열된 서열 또는 그의 인간화된 형태를 포함하는 VH; 및
    (ii) SEQ ID NO: 113에 나열된 서열 또는 그의 인간화된 형태를 포함하는 VL
    을 모두 포함하는 두 개 이상의 폴리펩티드들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  17. 제 2 항에 따른 단백질을 적어도 하나 포함하는 Fv를 포함하며, 적어도 하나의 VL이 적어도 하나의 VH에 결합하여 항원 결합 사이트를 형성하는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  18. 제 17 항에 있어서,
    항원 결합 사이트를 형성하는 VL 및 VH는 단일 폴리펩티드 쇄 내에 있거나, 항원 결합 사이트를 형성하는 VL 및 VH는 상이한 폴리펩티드 쇄 내에 있는 것을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  19. 제 18 항에 있어서,
    만일 VL 및 VH가 단일 폴리펩티드 쇄 내에 있다면, 단백질은:
    (i) 단일 쇄 Fv 단편(scFv);
    (ii) 이합체 scFv(di-scFv); 또는
    (iii) Fc 또는 중쇄 고정 도메인(heavy chain constant domain (CH)) 2 또는 CH3에 연결된 (i) 또는 (ii) 중 적어도 하나이거나, 또는
    만일 VL 및 VH가 별개의 폴리펩티드 쇄 내에 있다면, 단백질은:
    (iv) 이원 항체(diabody);
    (v) 삼원 항체(triabody);
    (vi) 사원 항체(tetrabody); 또는
    (vii) 면역 글로불린
    인 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  20. 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시스테인 잔기들은 이황화 결합에 의해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  21. 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시스테인 잔기들 중 적어도 하나에 접합된 화합물을 포함하되, 상기 화합물의 접합은 항원에 대한 단백질의 결합을 감소시키는 것이 아닌 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  22. 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 N-말단 트레오닌 또는 세린 잔기를 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 트레오닌 또는 세린 잔기에 접합된 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 화합물은 방사성 동위원소, 검출 가능한 표지, 치료적 화합물, 콜로이드, 독소, 핵산, 펩타이드, 단백질, 피험자 내에서 단백질의 반감기를 증가시키는 화합물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  25. 제 23 항에 있어서,
    상기 화합물은 생물학적으로 허용가능한 폴리머인 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 화합물은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 PEG는 단분산된 PEG인 것을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  28. 제 23 항에 있어서,
    시스테인 잔기들 중 적어도 하나에 접합된 제1 화합물, 및 트레오닌 또는 세린 잔기에 접합된 제2 화합물을 포함하되, 상기 제2 화합물은 상기 제1 화합물과 다른 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  29. 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 상피 성장 인자 2(human epidermal growth factor (Her) 2), 종양 연관 당단백질 TAG72(tumour associated glycoprotein TAG72), MUC1 또는 전립선 특이성 멤브레인 항원(prostate specific membrane antigen (PSMA))에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 단리된 단백질은:
    (i) FR1 내에 위치된 두 개 이상의 시스테인 잔기들을 포함하도록 변형된, SEQ ID NOs: 55, 59, 61 또는 109 중 어느 하나에 나열된 서열과 95% 이상 동일한 서열을; 또는
    (ii) SEQ ID NOs: 57, 63, 65, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 또는 105, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 또는 133 중 어느 하나 이상에 나열된 서열과 95% 이상 동일한 서열을 포함하고,
    상기 서열은 FR1 내에 위치된 두 개 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 단백질.
  31. 삭제
  32. 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산.
  33. 프로모터에 작동하도록(operably) 연결된 제 32 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 구조체.
  34. 제 33 항에 따른 발현 구조체를 포함하는 단리된 세포.
  35. 제 33 항에 따른 발현 구조체를 단리된 세포 내로 도입하는 단계, 및
    제 33 항에 따른 발현 구조체를 포함하는 단리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제 33 항에 따른 발현 구조체에 의해 인코딩된 단백질을 제조하는 방법.
  36. 삭제
  37. (i) 골격 영역(framework region(FR)) 1 내에 위치되는 적어도 두 개의 시스테인 잔기들을 포함하는 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 얻는 단계; 및
    (ii) 상기 단백질의 FR1에서 시스테인 잔기들 중 적어도 하나에 화합물을 접합시켜 단백질 접합체를 제조하는 단계를 포함하는, 단백질 접합체를 제조하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서,
    상기 단백질은 적어도 하나의 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하며, 상기 방법은 세린 또는 트레오닌 잔기에 화합물을 접합시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 단백질 접합체를 제조하는 방법.
  39. 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 포함하는 암의 진단 또는 예후용 조성물로서,
    상기 암은 인간 상피 성장 인자 2(human epidermal growth factor (Her) 2), 종양 연관 당단백질 TAG72(tumour associated glycoprotein TAG72), MUC1 또는 전립선 특이성 멤브레인 항원(prostate specific membrane antigen (PSMA))을 발현시키는 암인 것을 특징으로 하는, 암의 진단 또는 예후용 조성물.
  40. 제 39항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 전립선암, 결장직장암, 난소암, 위암, 췌장암, 폐암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암의 진단 또는 예후용 조성물.
  41. 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 암은 인간 상피 성장 인자 2(human epidermal growth factor (Her) 2), 종양 연관 당단백질 TAG72(tumour associated glycoprotein TAG72), MUC1 또는 전립선 특이성 멤브레인 항원(prostate specific membrane antigen (PSMA))을 발현시키는 암인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  42. 제 41항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 전립선암, 결장직장암, 난소암, 위암, 췌장암, 폐암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  43. 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 체외 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 체외 세포에 화합물을 전달하는 방법.
  44. (i) 피험자로부터의 생물학적 샘플과, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 접촉시켜, 단백질에 검출 가능한 표지를 접합하는 단계; 및
    (ii) 생물학적 샘플 내에서 검출 가능한 표지가 접합된 단백질을 검출하거나 또는 찾아내는 단계를 포함하는, 체외에서 항원을 찾아내거나 또는 검출하는 방법.
  45. (i) 피험자로부터의 생물학적 샘플과, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 12 항, 제 13 항 및 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 접촉시켜 복합체를 형성하는 단계;
    (ii) 생물학적 샘플 내에서 상기 복합체를 검출하는 단계; 및
    (iii) 상기 복합체의 수준을 대조 샘플의 수준과 비교하여 복합체의 향상된 또는 감소된 수준에서 암의 진단 또는 예후를 결정하는 단계를 포함하는, 암의 진단 또는 예후를 결정하기 위한 정보 제공 방법으로서,
    상기 암은 인간 상피 성장 인자 2(human epidermal growth factor (Her) 2), 종양 연관 당단백질 TAG72(tumour associated glycoprotein TAG72), MUC1 또는 전립선 특이성 멤브레인 항원(prostate specific membrane antigen (PSMA))을 발현시키는 암인 것을 특징으로 하는, 암의 진단 또는 예후를 결정하기 위한 정보 제공 방법.
  46. 제 45항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 전립선암, 결장직장암, 난소암, 위암, 췌장암, 폐암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암의 진단 또는 예후를 결정하기 위한 정보 제공 방법.
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
EP1996716B1 (en) 2006-03-20 2011-05-11 The Regents of the University of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
US8940298B2 (en) 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
ES2712732T3 (es) 2009-02-17 2019-05-14 Cornell Res Foundation Inc Métodos y kits para el diagnóstico de cáncer y la predicción de valor terapéutico
SG176947A1 (en) * 2009-07-03 2012-01-30 Avipep Pty Ltd Immuno-conjugates and methods for producing them
CN102753194B (zh) 2009-12-02 2015-07-08 伊麦吉纳博公司 靶向人前列腺特异性膜抗原的j591微抗体和双抗体
SG181814A1 (en) 2009-12-23 2012-07-30 Avipep Pty Ltd Immuno-conjugates and methods for producing them 2
JP2014518615A (ja) 2011-04-22 2014-08-07 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー 前立腺特異的膜抗原結合タンパク質および関連組成物ならびに方法
US20130052130A1 (en) 2011-08-30 2013-02-28 University Of Washington Branched Discreet PEG Constructs
US10112988B2 (en) 2012-01-09 2018-10-30 Icb International, Inc. Methods of assessing amyloid-beta peptides in the central nervous system by blood-brain barrier permeable peptide compositions comprising a vab domain of a camelid single domain heavy chain antibody against an anti-amyloid-beta peptide
US10112987B2 (en) * 2012-01-09 2018-10-30 Icb International, Inc. Blood-brain barrier permeable peptide compositions comprising a vab domain of a camelid single domain heavy chain antibody against an amyloid-beta peptide
PT3218005T (pt) 2014-11-12 2023-04-11 Seagen Inc Compostos que interagem com glicano e métodos de uso
WO2016187571A2 (en) * 2015-05-20 2016-11-24 Viventia Bio Inc. Her2 immunotoxins and methods of using the same
US11254744B2 (en) 2015-08-07 2022-02-22 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
UA126278C2 (uk) 2015-09-21 2022-09-14 Аптево Рісьорч Енд Девелопмент Ллс Поліпептиди, які зв'язують cd3
IL302822A (en) 2015-11-12 2023-07-01 Seagen Inc Compounds interacting with glycans and methods of use
SG10201912825XA (en) * 2015-11-27 2020-02-27 Cartherics Pty Ltd Genetically modified cells and uses thereof
WO2017132486A1 (en) * 2016-01-27 2017-08-03 Siamab Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeting cancer stem cells
WO2018094143A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
JP2020510671A (ja) 2017-03-03 2020-04-09 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド グリカン相互作用化合物および使用の方法
CN108862289B (zh) * 2018-07-26 2021-10-15 南京邮电大学 一种小粒径大孔径的介孔二氧化硅纳米粒子及其制备方法
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
CN117683133A (zh) * 2019-09-03 2024-03-12 百奥泰生物制药股份有限公司 一种抗tigit免疫抑制剂及应用
CN114423793A (zh) 2019-09-18 2022-04-29 分子模板公司 包含志贺菌毒素a亚基支架的pd-l1结合分子
WO2021055816A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds
CA3213295A1 (en) 2021-03-17 2022-09-22 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens
CN115850449A (zh) * 2022-09-29 2023-03-28 苏州智核生物医药科技有限公司 抗体和缀合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006116076A2 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Genencor International, Inc. Tab molecules
US20090028856A1 (en) 2007-07-16 2009-01-29 Genentech, Inc. Anti-CD79B Antibodies and Immunoconjugates and Methods of Use

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US623322A (en) 1899-04-18 Turret-lathe
US4631190A (en) 1981-06-26 1986-12-23 Shen Wei C Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
NZ238473A (en) 1990-06-19 1993-11-25 Keith James Ross Lever lock having levers protected by an internal lever housing
US5194594A (en) 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
JPH04334377A (ja) 1990-12-31 1992-11-20 Akzo Nv 酸−不安定性リンカー分子
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
ES2162823T5 (es) 1992-08-21 2010-08-09 Vrije Universiteit Brussel Inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras.
JPH08504320A (ja) 1992-09-25 1996-05-14 コモンウエルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼーション 標的結合性ポリペプチド
WO1994009817A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 City Of Hope Novel antibody construct
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
AU4289496A (en) 1994-12-02 1996-06-19 Chiron Corporation Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JPH08336393A (ja) 1995-04-13 1996-12-24 Mitsubishi Chem Corp 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US20020193567A1 (en) 1995-08-11 2002-12-19 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
ATE374248T1 (de) 1996-06-27 2007-10-15 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antikörpermoleküle, die spezifisch mit dem aktiven zentrum oder dem aktiven spalt eines zielmoleküls interagieren
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
AU4078599A (en) 1998-05-13 1999-11-29 Epimmune, Inc. Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same
US6306610B1 (en) 1998-09-18 2001-10-23 Massachusetts Institute Of Technology Biological applications of quantum dots
CN1202128C (zh) 1998-12-08 2005-05-18 拜奥威神有限公司 修饰蛋白的免疫原性
US20030129192A1 (en) 1999-09-10 2003-07-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
WO2001040269A2 (en) 1999-11-30 2001-06-07 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer
US20060228364A1 (en) 1999-12-24 2006-10-12 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20030119115A1 (en) 2000-05-17 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
KR20030043908A (ko) 2000-07-12 2003-06-02 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 1 차 단백질 서열의 3 차원 단백질 구조 결정법
AR030612A1 (es) 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US8178098B2 (en) 2001-04-03 2012-05-15 National Jewish Health Method to inhibit airway hyperresponsiveness using aerosolized T cell receptor antibodies
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
WO2003016475A2 (en) 2001-08-14 2003-02-27 The General Hospital Corporation Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain
US20040241703A1 (en) 2002-08-19 2004-12-02 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
AU2002366951A1 (en) 2001-12-10 2003-07-09 Nuvelo,Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
EP1456410A2 (en) 2001-12-11 2004-09-15 AlgoNomics N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US7452675B2 (en) 2002-01-25 2008-11-18 The Queen's Medical Center Methods of screening for TRPM4b modulators
AU2003224624B2 (en) 2002-02-21 2008-08-28 Duke University Reagents and treatment methods for autoimmune diseases
WO2004000997A2 (en) 2002-03-19 2003-12-31 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
BR0308953A (pt) 2002-04-05 2006-03-14 Agensys Inc composições, proteìna, polinucleotìdeo, método de geração de uma resposta imune, método de detecção, composição farmacêutica, anticorpo ou seu fragmento, animal transgênico, hibridoma, método de fornecimento de um agente citotóxico ou agente de diagnóstico e método de inibição do crescimento de células cancerosas
JP2005536190A (ja) 2002-04-16 2005-12-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
WO2003101283A2 (en) 2002-06-04 2003-12-11 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
BRPI0311822B8 (pt) 2002-06-06 2021-05-25 Oncotherapy Science Inc composição farmacêutica para o tratamento de câncer
DK1517921T3 (da) * 2002-06-28 2006-10-09 Domantis Ltd Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf
JP2004121218A (ja) 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法
ES2361739T3 (es) 2002-08-16 2011-06-21 Immunogen, Inc. Reticulantes con elevada reactividad y solubilidad y su uso en la preparación de conjugados para el suministro dirigido de fármacos de molécula pequeña.
AU2002951346A0 (en) 2002-09-05 2002-09-26 Garvan Institute Of Medical Research Diagnosis of ovarian cancer
MXPA05002455A (es) 2002-09-06 2005-06-03 Mannkind Corp Secuencias de epitopes.
AU2003300776A1 (en) 2002-09-09 2004-05-25 Omeros Corporation G protein coupled receptors and uses thereof
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1578372A4 (en) 2002-11-15 2007-10-17 Univ Arkansas CA125 GENE AND ITS USE IN DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC INTERVENTIONS
EP1569685B8 (en) 2002-11-15 2012-12-05 MUSC Foundation For Research Development Complement receptor 2 targeted complement modulators
CA2507044A1 (en) 2002-11-21 2004-06-10 Mary Lucero Purinergic modulation of smell
US20040253606A1 (en) 2002-11-26 2004-12-16 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
AU2003299819A1 (en) 2002-12-23 2004-07-22 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha conjugate, neutrokine-alpha complex, and uses thereof
WO2004063709A2 (en) 2003-01-08 2004-07-29 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
US20050227301A1 (en) 2003-01-10 2005-10-13 Polgen Cell cycle progression proteins
EP1583820A4 (en) 2003-01-14 2007-07-18 Bristol Myers Squibb Co ASSOCIATED POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES ASSOCIATED WITH THE NF-KB WAY
US7501494B2 (en) 2003-01-15 2009-03-10 United Biomedical, Inc. Designed deimmunized monoclonal antibodies for protection against HIV exposure and treatment of HIV infection
CA2516128A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Sagres Discovery, Inc. Therapeutic targets in cancer
US20030224411A1 (en) 2003-03-13 2003-12-04 Stanton Lawrence W. Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
CA2527726A1 (en) 2003-06-02 2004-12-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. De-immunized anti-cd3 antibody
CA2545539A1 (en) 2003-10-15 2005-04-28 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis of positions 250, 314 and/or 428 of the heavy chain constant region of ig
KR20070039911A (ko) 2004-06-01 2007-04-13 도만티스 리미티드 증강된 혈청 반감기를 가지는 이특이성 융합 항체
DK2330121T3 (en) 2004-06-02 2014-12-15 Adalta Pty Ltd Binding moieties based on shark IgNar domains
EP1769000B1 (en) * 2004-07-16 2014-12-24 Amgen Research (Munich) GmbH Expression-enhanced polypeptides
SI1791565T1 (sl) 2004-09-23 2016-08-31 Genentech, Inc. Cisteinsko konstruirana protitelesa in konjugati
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US9296816B2 (en) 2005-04-15 2016-03-29 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US20060263367A1 (en) 2005-05-23 2006-11-23 Fey Georg H Bispecific antibody devoid of Fc region and method of treatment using same
CA2644663A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Agonist antibody to human thrombopoietin receptor
PL2502938T3 (pl) 2006-10-27 2015-07-31 Genentech Inc Przeciwciała i immunokoniugaty oraz ich zastosowanie
ES2528922T3 (es) 2007-07-16 2015-02-13 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-CD79b humanizados e inmunoconjugados y métodos de uso
MY157403A (en) 2008-01-31 2016-06-15 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
ES2537566T3 (es) * 2009-06-04 2015-06-09 Novartis Ag Métodos para identificación de sitios para conjugación de IgG
SG176947A1 (en) * 2009-07-03 2012-01-30 Avipep Pty Ltd Immuno-conjugates and methods for producing them

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006116076A2 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Genencor International, Inc. Tab molecules
US20090028856A1 (en) 2007-07-16 2009-01-29 Genentech, Inc. Anti-CD79B Antibodies and Immunoconjugates and Methods of Use

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Mol. Biol. 377(2): 478-488(2008.3.21.)
Mol. Immunol. 32(4): 249-258(1995.3.)*

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