ES2785081T3 - Anticuerpos biespecíficos similares a receptores de células T específicos para un péptido de WT1 presentado por HLA-A2 - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo biespecífico, que comprende: (I) una primera porción de unión a antígeno que enlaza específicamente conWT1/HLA, que comprende: (A) una región variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 38, 39 y 40; y una región variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las SEQ ID NOS: 44, 45 y 46; o (B) una VH y VL que comprende la primera y la segunda secuencias de aminoácidos, respectivamente, de las SEQ ID NOS: 50 y 52; o (C) la SEQ ID NO: 54; y (II) una segunda porción de unión a antígeno que enlaza específicamente con CD3.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos biespecíficos similares a receptores de células T específicos para un péptido de WT1 presentado por HLA-A2
Listado de Secuencias
Esta solicitud contiene un Listado de Secuencias, creado el 29 de marzo de 2012; el archivo, en formato ASCII, está designado 3314013AWO_Sequence Listing_ST25.txt. El archivo se incorpora por la presente por referencia en su totalidad en la solicitud.
Campo Técnico
La presente invención se refiere de manera general a anticuerpos biespecíficos contra proteínas citosólicas. Más particularmente, la invención se refiere a anticuerpos biespecíficos contra la proteína del oncogén del tumor de Wilms (WT1), específicamente anticuerpos biespecíficos que reconocen un péptido de WT1 en conjunción con un antígeno de histocompatibilidad principal.
Antecedentes de la Invención
La proteína del oncogén del tumor de Wilms (WT1) es una diana atractiva para inmunoterapia para la mayoría de leucemias y una amplia variedad de cánceres. La WT1 es un factor de transcripción de dedos de zinc que se expresa normalmente en tejidos mesodérmicos durante la embriogénesis. En tejido adulto normal, la expresión de WT1 se limita a niveles bajos en células madre hematopoyéticas CD34+ pero se sobre-expresa en leucemias de múltiples linajes y una amplia variedad de tumores sólidos (1-2). Más recientemente, se ha informado que la expresión de WT1 es un marcador de enfermedad residual mínima. Aumentar los niveles de transcripción en pacientes con leucemia mieloide aguda (AML) en remisión morfológica ha sido predictivo de recaída clínica manifiesta (3, 4). Además, los anticuerpos para WT1 se detectan en pacientes con tumores malignos y tumores sólidos, indicando que la WT1 es un antígeno altamente inmunogénico (7).
En la mayor parte, los anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAbs) aprobados reconocen estructuras de proteínas de la superficie celular. La WT1, sin embargo, es una proteína nuclear y, por lo tanto, es inaccesible a la terapia con anticuerpos clásica. Hasta ahora, la inmunoterapia dirigida a WT1 ha estado limitada a enfoques celulares, dirigida exclusivamente a generar respuestas de células CD8 T citotóxicas (CTL) específicas de WT1 que reconocen péptidos presentados en la superficie celular por moléculas MHC Clase I.
Para la inducción de respuestas de CLT, habitualmente se degradan proteínas intracelulares por el proteasoma o endo/lisosomas, y los fragmentos de péptido resultantes se enlazan con una molécula MHC clase i o II. Estos complejos péptido-MHC se muestran en la superficie celular donde proporcionan dianas para el reconocimiento de células T a través de la interacción péptido-MHC (pMHC)-receptor de células T (TCR) (8,9). Las vacunaciones con péptidos derivados de la proteína WT1 inducen células CD8 T citotóxicas HLA restringidas, que con capaces de destruir células tumorales.
Para mejorar la eficacia, los antígenos del cáncer pueden ser objetivo con terapia de anticuerpos monoclonales. La terapia de anticuerpos monoclonales (mAb) ha demostrado ejercer efectos antitumorales potentes por mecanismos múltiples, incluyendo citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) e inhibición celular directa o efectos inductores de apoptosis en células tumorales que sobre-expresan las moléculas diana. Además, los mAb pueden usarse como portadores para administrar específicamente una fracción citotóxica como un radionúclido, fármaco citotóxico o toxina a las células tumorales (18).
Existirá un tremendo beneficio si, además, de un enfoque de inmunoterapia celular, estuviese disponible un enfoque de inmunoterapia humoral para apuntar antígenos tumorales superficiales no celulares. Por lo tanto, un anticuerpo monoclonal (mAb) que imitan un receptor de células T en que es específico para una diana que comprende un fragmento de una proteína intracelular en conjunción con una molécula MHC, por ejemplo un complejo péptido de WT1/HLA-A2, sería un agente terapéutico nuevo y efectivo individualmente o como un vehículo capaz de administrar reactivos anti-cancerígenos potentes, como fármacos, toxinas y elementos radioactivos. Tales mAbs serían también útiles como herramientas de diagnóstico o pronóstico. La WO 2009/108372 divulga anticuerpos similares a TCR dirigidos a complejos péptido/HLA y métodos para generarlos.
Sumario de la Invención
La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
La presente divulgación identifica y caracteriza proteínas que enlazan con el antígeno, como anticuerpos, que son capaces de apuntar proteínas citosólicas/intracelulares, por ejemplo, la oncoproteína WT1. Los anticuerpos divulgados apuntan a un complejo péptido/MHC como aparecería típicamente en la superficie de una células tras el procesamiento por el antígeno de la proteína WT1 y la representación por la célula. A este respecto, los anticuerpos imitan los receptores de células T en que los anticuerpos tienen la capacidad de reconocer específicamente y enlazar con un péptido de una manera restringida por MHC, es decir, cuando el péptido está enlazado a un antígeno de MHC. El complejo péptido/MHC recapitula el antígeno como aparecería típicamente en la superficie de una célula tras el procesamiento del antígeno y presentación de la proteína WT1 a una célula T.
Los anticuerpos divulgados reconoces específicamente y enlazan con epítopos de un complejo péptido/HLA-A2, particularmente un complejo WT1/HLA-A0201. Ejemplos de péptidos que son reconocidos por las proteínas que enlazan con el antígeno de la divulgación como parte de un complejo HLA-péptido incluyen, pero no están limitadas a, las mostradas en la Tabla 7, por ejemplo, un péptido con la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1.)
En un aspecto, por lo tanto, la divulgación se refiere a un anticuerpo aislado, o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo, que enlaza con un péptido con la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL, cuando dicho péptido está enlazado con un antígeno de MCH, como HLA-A2 como se define en la reivindicación 1 añadida.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una proteína que enlaza con el antígeno aislada, anticuerpo, o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo, que comprende (A) (i) una región variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 2, 3, y 4; y una región variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 8, 9 y 10; (ii) una región variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 20, 21 y 22; y una región variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LCCDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SeQ ID No S: 26, 27 y 28; (iv) una región variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 56, 57 y 58; y una región variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LCCDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 62, 63 y 64; (v) una región variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 74, 75 y 76; y una región variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LCCDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 80, 81 y 82; o (vi) una región variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 92, 93 y 94; y una región variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LCCDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 98, 99 y 100.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una proteína que enlaza con el antígeno aislada, anticuerpo, o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo, que comprende una Vh y una Vl que comprende la primera y segunda secuencias de aminoácidos, respectivamente, seleccionadas de las SEQ ID NOS: 14 y 16; 32 y 34; 68 y 70; 86 y 88; y 104 y 106.
En otro aspecto más, la divulgación se refiere a una proteína que enlaza con el antígeno aislada, anticuerpo, o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NOS: 18, 36, 72, 90, y 108.
En un aspecto relacionado, la proteína que enlaza con el antígeno aislada comprende una región de enlace con el antígeno como se divulga en cualquiera de las Tablas 1-8. La proteína que enlaza con el antígeno puede ser una proteína de fusión.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un inmunoconjugado que comprende un primer componente que es una proteína que enlaza con el antígeno, anticuerpo o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo como se divulga en la presente. El inmunoconjugado comprende un segundo componente que es una citotoxina, un marcador detectable, un radioisótopo, un agente terapéutico, una proteína de enlace, o una molécula que tiene una segunda secuencia de aminoácidos. Cuando el segundo componente es una proteína de enlace o segundo anticuerpo, la proteína de enlace o segundo anticuerpo tiene especificidad de enlace con una diana que es diferente del complejo HLA-péptido para el que la primera es específica.
La presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende una proteína que enlaza con el antígeno o fragmento funcional de la misma como se describe en la presente y se define en las reivindicaciones adjuntas.
En otro aspecto más, la divulgación se refiere a ácidos nucleicos que codifican proteínas que enlazan con el antígeno, incluyendo anticuerpos y receptores del antígeno quiméricos específicos para una complejo péptido de WT1/HLA, en particular el complejo de péptido de WT1 RMFPNAPYL/HLA-A0201.
En otro aspecto relacionado, la divulgación se refiere a células que comprenden los ácidos nucleicos o proteínas que enlazan con el antígeno divulgadas en la presente, incluyendo células efectoras inmunes recombinantes, como, células T modificadas genéticamente para expresar un receptor del antígeno quimérico que comprende una región de enlace con el antígeno de acuerdo con la presente divulgación. Las células que se han diseñado para producir anticuerpos de acuerdo con esta divulgación también están abarcadas por la divulgación.
En un aspecto relacionado, la divulgación se refiere a vectores que comprenden los ácidos nucleicos que codifican las proteínas que enlazan con el antígeno divulgadas en la presente, incluyendo vectores que facilitan la expresión y/o secreción de una proteína que enlaza con el antígeno como un anticuerpo o receptor del antígeno quimérico de acuerdo con la presente divulgación.
En un aspecto relacionado, la divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas que enlazan con el antígeno, anticuerpos, ácidos nucleicos, vectores o células que comprenden los ácidos nucleicos o proteínas que enlazan con el antígeno divulgadas en la presente, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para detecta WT1 en la superficie de células o tejidos usando anticuerpos de WT1 de la divulgación.
En otro aspecto más, la divulgación puede usarse en métodos para tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad positiva en WT1, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína que enlaza con el antígeno, anticuerpo o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo, ácido nucleico que codifica a la proteína que enlaza con el antígeno o anticuerpo o una célula que comprende los ácidos nucleicos o proteínas como se divulga en la presente. La enfermedad positiva en WT-1 es una leucemia crónica, leucemia aguda o cáncer WT1 seleccionado del grupo que consiste de leucemia mielocítica crónica, mieloma múltiple (MM), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide/mielógena aguda (AML), síndrome mielodisplásico (MDS), mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer gastrointestinal, cáncer de mama, cáncer de próstata y glioblastoma. En algunas realizaciones, al proteína que enlaza con el antígeno o anticuerpo es un conjugado del mismo que tiene una fracción citotóxica ligada al mismo.
Breve descripción de los Dibujos
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína del tumor de Wilms (Número de acceso de GenBank P19544) con algunos péptidos HLA restringidos en negrita. El péptido 121-140 abarca además un 9-mer (subrayado), RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1), que, además a los análogos del mismo, ha demostrado que induce la actividad de células T citotóxicas específicas de WT1.
La Figura 2 es un gráfico que muestra que la vacunación con péptidos de WT1 induce células T citotóxicas contra células de leucemia WT1+.
La Figura 3 muestra los resultados de un ELISA de fagos para enlace específico de WT1/A2 (WA) frente a control de PBS o R3/HLAA0201 (R3).
La Figura 4 muestra el enlace específico de donde se seleccionaron solamente anticuerpos del fago de WT1 que enlazan con células T2 pulsadas con el péptido de WT1A.
La Figura 5 muestra la afinidad de enlace de una IgG1 de un anticuerpo de WT1 para el complejo RMF/A0201 probado por titulación del anticuerpo a varias concentraciones. Los resultados se muestran para células T2 pulsadas con 50 ug/ml de RMF (panel superior). El anticuerpo de control se muestra en el panel inferior.
La Figura 6 muestra la dependencia en la densidad del complejo RMF/HLA-A0201 reconocido por el anticuerpo de WT1 en células T2 pulsadas con RMF (panel superior) o control, RHAMM-R3 (panel inferior). La Figura 7 muestra un vector de expresión para la expresión de anticuerpos humanos.
La Figura 8 muestra los resultados de un análisis SDS-PAGE de anticuerpos de WT1/A2 bajo condiciones reductoras y no reductoras.
La Figura 9 muestra los resultados del análisis de enlace cinético de un anticuerpo de WT1/A2 que demuestra la afinidad del anticuerpo hacia WT1/A2.
La Figura 10 muestra la afinidad (Kd) del anticuerpo que enlaza con el complejo WT1/A2.
La Figura 11 muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) por citometría de flujo de la titulación de péptidos en el enlace de algunas realizaciones, mAb clon 5 (panel superior), clon 15 (panel medio) y control (panel inferior) para células T2 vivas pulsadas con concentraciones variables de péptido, WT1-A, WT1-A1 o control.
La Figura 12 muestra los resultados de la titulación de péptido en el enlace de un anticuerpo de WT1, mAb 5 (panel superior), mAb 15 (panel inferior) para células T2 pulsadas con concentraciones variables de péptido de WT1A.
La Figura 13 muestra la especificidad de enlace de una realización, mAb 5, a diferentes concentraciones (50 |jg/ml superior; 25 jg/ml medio; y 12,5 jg/ml inferior) del péptido (R3, WT1-A1, WT1-A o sin péptido).
La Figura 14 muestra la especificidad de enlace de una realización, mAb 15, a diferentes concentraciones (50 jg/ml superior; 25 jg/ml inferior) del péptido (R3, WT1-A1, WT1 -A o sin péptido).
La Figura 15 muestra el enlace dependiente de la dosis de mAbs 5 (panel superior) y 15 (panel inferior) para células T2 pulsadas con péptido WT1-A, WT1-A1, o RHAMM-R3.
La Figura 16 muestra el enlace de mAbs 5 y 15 para U266, una línea celular de mieloma.
La Figura 17 muestra el enlace de mAb 15 para BV173, una línea celular derivada de un individuo con leucemia aguda (Ph1) positiva.
La Figura 18 muestra el enlace específico de ESK1 (#13) para el complejo WT1/A2 en la superficie de células T2 pulsadas con péptido de WT1.
Las Figuras 19 y 20 muestran que el anticuerpo de WT1 es capaz de reconocer el péptido de RMF en el que se hace la sustitución de diferentes posiciones del péptido de RMG con alanina (ver también Tabla 10) y que la pérdida de enlace observado con la sustitución de la posición 1 por ya sea alanina (WT1-A1-B) o tirosina (WT1-A1), no se debió a la reducción de la afinidad de enlace del péptido para la molécula HLA-A2, ya que ambos péptidos mostraron el enlace más fuerte en el ensayo de estabilización T2 usando el mAb específico para la molécula HLA-A2, clon BB7.
La Figura 21 muestra el reconocimiento por el anticuerpo de WT1 del complejo RMF/HLA-A0201 presentado naturalmente en la superficie celular de líneas celulares de mesotelioma humanas, JMN (WT1+/A0201+) pero no MSTO (WT1+/HLA-A0201-).
La Figura 22 muestra el enlace de anticuerpos de WT1 con la línea celular derivada de CML humana BV173. La Figura 23 es un análisis Scatchard basado en el enlace del anticuerpo WT1 para células JMN y muestra una constante de avidez de aproximadamente 0.2nM.
La Figura 24 muestra el enlace del anticuerpo de WT1 para un panel de células de mesotelioma y leucemia. La Figura 25 muestra los resultados de análisis de citometría de flujo en blastocitos AML doble positivos CD33 y CD34 de un paciente positivo en HLA-A2. ESK1 enlaza con blastocitos de leucemia.
La Figura 26 muestra los resultados de análisis de citometría de flujo sincronizadas en blastocitos AML doble positivos CD33 y CD34 de un paciente negativo en HLA-A2. EL WT1mAb ESK1 no enlazó con los blastocitos. La Figura 27 muestra ADCC mediada porWT1mAb ESK1 contra células T2 pulsadas con un péptido RMF. La Figura 28 muestra la capacidad del anticuerpo de WT1 para mediar ADCC con efectores humanos en la línea celular JMN y de leucemia (panel inferior) pero no células MSTO.
La Figura 29 muestra que los mAbs de WT1 son efectivo contra la línea celular de leucemia humana BV173 pero no células HL60, que no son HLA-A2+.
La Figura 30 muestra el anticuerpo de WT1 induce ADCC contra fibroblastos AML primarios de un paciente positivo en HLA-A2.
La Figura 31 muestra los resultados del tratamiento de BV173 humana en ratones NSG usando anticuerpos de la divulgación.
La Figura 32 muestra que en puntos temporales posteriores, los ratones tratados con anticuerpo de WT1 sólo comenzaron a recaer, mientras que el anticuerpo con efectores curó de 2 a 5 ratones.
La Figura 33 muestra que el anticuerpo de WT1 reduce significativamente la carga tumoral de una manera dependiente de la dosis.
La Figura 34 muestra que el anticuerpo con carbohidrato alterado en Fc(MAGE) es más activo en ADCC que el anticuerpo original.
Descripción Detallada de la Invención
Al poner en práctica la presente invención, se usan muchas técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, biología celular, bioquímica, e inmunología, que están dentro del estado de la técnica. Estas técnicas se describen con mayor detalle en, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual 3a edición, J.F. Sambrook y D.W. Russell, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001; Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Melvyn Little, ed. Cambridge University Press 2009; "Cligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001). A lo largo de la solicitud se usan las siguientes abreviaturas:
Ab: Anticuerpo
ADCC: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
ALL: leucemia linfocítica aguda
AML: leucemia mieloide aguda
APC: célula presentadora de antígeno
P2M: microglubulina beta-2
BITE: anticuerpo de acoplamiento a células T bi-específico
CAR: receptor del antígeno quimérico
CDC: citotoxicidad dependiente del complemento
CMC: citotoxicidad mediada por el complemento
CDR: Región determinante de la complementariedad (ver también HVT a continuación)
Cl : dominio constante de la cadena ligera
CH i : 1erdominio constante de la cadena pesada
CH i , 2, 3 : 1er, 2° y 3er dominios constantes de la cadena pesada
CH 2, 3 : 2° y 3er dominios constantes de la cadena pesada
CHO: Ovario de hámster chino
CTL: célula T citotóxica
Proporción E:T: proporción efector:diana
Fab: fragmento que enlaza con el anticuerpo
FACS: clasificación celular citométrica asistida por flujo
FBS: Suero bovino fetal
FR: Región marco
HC: Cadena pesada
HLA: antígeno de leucocito humano
HVR-H: región hipervariable-cadena pesada (ver también CDR)
HVR-L: región hipervariable-cadena ligera (ver también CDR)
Ig: inmunoglobulina
IRES: Sitio de entrada del ribosoma interno
Kd : constante de disociación
K off : tasa de disociación
K on : tasa de asociación
MHC: Complejo principal de histocompatibilidad
MM: mieloma múltiple
scFv: fragmento variable de la cadena ligera
TCR: receptor de células T
Vh : cadena pesada variable incluye la región hipervariable de la cadena pesada y la región marco variable de la cadena pesada
Vl : cadena ligera variable incluye la región hipervariable de la cadena ligera y la región marco variable de la cadena ligera
WT1: proteína 1 del tumor de Wilms
En la descripción que sigue, se seguirán ciertas convenciones respecto al uso de terminología. Generalmente, los términos usados en la presente se pretende que se interpreten consistentemente con el significado de esos términos como se conocen por los expertos en la técnica.
Una "proteína que enlaza con el antígeno" es una proteína o polipéptido que comprende una región de enlace con el antígeno o porción de enlace con el antígeno, es decir, tienen una afinidad fuerte con otra molécula con la que enlaza. Las proteínas que enlazan con el antígeno abarcan, anticuerpos, receptores de antígenos quiméricos (CARs) y proteínas de fusión.
"Anticuerpo" y "anticuerpos" son los términos que se conocen en la técnica para referirse a proteínas que enlazan con el antígeno del sistema inmune. El término "anticuerpo" como se refiere en la presente incluye anticuerpos de longitud completa totales que tienen una región de enlace con el antígeno, y cualquier fragmento del mismo en el que se retiene la "porción de enlace con el antígeno" o "región de enlace con el antígeno" , o cadenas sencillas, por ejemplo, fragmento variable de la cadena sencilla (scFv), del mismo. Un "anticuerpo" de origen natural es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente como Vh) y una región constante de la cadena pesada (CH). La región constante de la cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente como Vl) y una región constante de la cadena ligera Cl. La región constante de la cadena ligera está comprendida de un domino, Cl. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad., denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl está compuesta de tres DCRs y cuatro FRs dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en el enlace de la inmunoglobulina con tejidos huésped o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.
El término "porción de enlace con el antígeno" o "región de enlace con el antígeno" de un anticuerpo, como se usa en la presente, se refiere a esa región o porción del anticuerpo que enlaza con el antígeno y que confiere especificad de antígeno al anticuerpo; los fragmentos de proteínas que enlazan con el antígeno, por ejemplo anticuerpos incluyen uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de enlazar específicamente con un antígeno (por ejemplo, un complejo péptido/HLA). Se ha demostrado que la función de enlace con el antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de enlace con el antígeno abarcados dentro del término "fragmentos de anticuerpo" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios Vl, Vh, Cl y CH1; un fragmento F(ab)2 que consiste de los dominios Vh y C1; un fragmento Fv que consiste de los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo; un fragmento dAB (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546),, que consiste de un dominio Vh; y una región determinante de la complementariedad aislada (CDR).
Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un conector sintético que les permita hacerse como una cadena de proteínas sencilla en la que las regiones Vl y Vh se emparejen para formar moléculas monovalentes. Estas se conocen como Fv de cadena sencilla (scFv); ver por ejemplo Bird et al., 1988 Science 242:423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan por utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Un "anticuerpo aislado" o "proteína de enlace con el antígeno aislada" es una que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los "anticuerpos sintéticos" o "anticuerpos recombinantes" se generan generalmente usando tecnología recombinante o usando técnicas sintéticas de péptidos conocidas por los expertos en la técnica.
Tradicionalmente, el complejo MHC-péptido sólo podía ser reconocido por un receptor de células T (TCR), limitando nuestra capacidad para detectar un epítopo de interés usando ensayos de lectura basados en células T. En la presente divulgación, se describen proteínas que enlazan con el antígeno, incluyendo los anticuerpos, que tienen una región de enlace con el antígeno en base a scFvs que se han seleccionado de bibliotecas de presentación de fagos de scFv humanos usando complejos HLA-péptido recombinantes. Estas moléculas demostraron especificidad exquisita, por ejemplo como se muestra con anticuerpos anti-WT1 que reconocen solamente complejos HLA-A2-RMFPNAPYL. Además, junto con su incapacidad para enlazar con complejos HLA que contienen otros péptidos, las moléculas también eran incapaces de enlazar con los mismos péptidos, demostrando adicionalmente su especificidad similar a TCR.
Los scFvs de la divulgación seleccionados por presentación de fagos se probaron inicialmente por su capacidad de enlazar con péptidos presentados en la superficie de células HLA-positivas. Tras incubar células T2 en presencia del péptido, podrían usarse anticuerpos etiquetados por fluorescencia para reconocer selectivamente las células pulsadas por antígeno usando citometría de flujo.
En algunas realizaciones, la divulgación incluye anticuerpos que tienen la secuencia de scFV fusionada con uno o más dominios constantes de la pesada para formar un anticuerpos con una región Fc de una inmunoglobulina humana para producir una proteína bivalente, aumentando la avidez y estabilidad totales del anticuerpo. Además, la porción Fc permite la conjugación directa de otras moléculas, incluyendo pero no limitada a colorantes fluorescentes, citotoxinas, radioisótopos, etc. con el anticuerpo por ejemplo, para su uso en estudios de cuantificación de antígenos, para inmovilizar el anticuerpo para mediciones de afinidad, para la administración dirigida de un agente terapéutico, para la prueba de citotoxicidad mediada por Fc usando células efectoras inmunes y muchas otras aplicaciones.
Los resultados mostrados en la presente resaltan la especificidad, sensibilidad y utilidad de los anticuerpos de la divulgación para apuntar a complejos MHC-péptido.
Las moléculas de la divulgación se basan en la identificación y selección de fragmentos variables de la cadena sencilla (scFV) usando presentación de fagos, la secuencia de aminoácidos de la cual confiere la especificidad de las moléculas para el péptido MHC restringido de interés y forma la base de todas las proteínas que enlazan con el antígeno de la divulgación. La scFv, por lo tanto, puede usarse para diseñar una matriz diversa de moléculas de "anticuerpo" incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de los mismos, como minicuerpos Fab y F(ab')2, proteínas de fusión, incluyendo fusiones de scFv-Fc, anticuerpos multivalentes, es decir, anticuerpos que tienen más de una especificidad para el mismo antígeno o antígenos diferentes, por ejemplo, anticuerpos que acoplan con células T biespecíficos (BiTe), tricuerpos, etc. (ver Cuesta et al., Multivalent antibodies: when design surpasses evolution. Trends in Biotechnology 28:355-3622010).
En una realización, en la que la proteína que enlaza con el antígeno es un anticuerpo de longitud completa, las cadenas pesada y ligera del anticuerpos de la divulgación pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo puede incluir al menos una, y preferiblemente dos, cadenas pesadas completas, y al menos uno, y preferiblemente dos, cadenas ligeras completas) o puede incluir una porción de enlace con el antígeno (un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fc de cadena sencilla ("scFv")). En otras realizaciones, la región constate de la cadena pesada del anticuerpo se elige de, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE. En algunas realizaciones, el isotipo de inmunoglobulina se selecciona de IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, más particularmente, IgG1 (por ejemplo, IgG1 humana). La elección del tipo de anticuerpo dependerá de la función efectora inmune que el anticuerpo está diseñado para provocar.
Al construir una inmunoglobulina recombinante, las secuencias de aminoácidos apropiadas para las regiones constantes de varios isotipos de inmunoglobulina y los métodos para la producción de una matriz amplia de anticuerpos son conocidos por los expertos en la técnica.
En una realización, el anticuerpo u otra proteína de enlace con el antígeno es un scFV anti-WT1/HLA-A2 o un fragmento que enlaza con el antígeno del mismo que tiene una región de enlace con el antígeno que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 y enlaza específicamente con un péptido con la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1) en conjunción con HLA-A0201. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-WT1 es una proteína de fusión scFV-Fc o IgG humana de longitud completa con regiones VH y VL o CDRs seleccionadas de la Tabla 1.
Tabla 1
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(continuación)
Figure imgf000010_0001
En otra realización, el anticuerpo o proteína que enlaza con el antígeno es un scFv anti-WT1 o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo que tiene una región de enlace con el antígeno que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36 y enlaza específicamente con un péptido con la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1) en conjunción con HLA-A0201. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-WT1 es una proteína de fusión scFv-Fc o IgG humana de longitud completa con regiones VH y VL o CDRs seleccionadas de la Tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000011_0001
(continuación)
Figure imgf000012_0001
En otra realización, el anticuerpo o proteína que enlaza con el antígeno es un scFv anti-WT1 o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo que tiene una región de enlace con el antígeno que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:54 y enlaza específicamente con un péptido con la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1) en conjunción con HLA-A0201. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-WT1 es una proteína de fusión scFv-Fc o IgG humana de longitud completa con regiones VH y VL o CDRs seleccionadas de la Tabla 3.
Tabla 3
Figure imgf000013_0001
(continuación)
Figure imgf000014_0001
En otra realización, el anticuerpo o proteína que enlaza con el antígeno es un scFv anti-WT1 o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo que tiene una región de enlace con el antígeno que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:72 y enlaza específicamente con un péptido con la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1) en conjunción con HLA-A0201. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-WT1 es una proteína de fusión scFv-Fc o IgG humana de longitud completa con regiones VH y VL o CDRs seleccionadas de la Tabla 4.
Tabla 4
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Figure imgf000016_0001
En otra realización, el anticuerpo o proteína que enlaza con el antígeno es un scFv anti-WT1 o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo que tiene una región de enlace con el antígeno que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:90 y enlaza específicamente con un péptido con la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1) en conjunción con HLA-A0201. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-WT1 es una proteína de fusión scFv-Fc o IgG humana de longitud completa con regiones VH y VL o CDRs seleccionadas de la Tabla 5.
Tabla 5
Figure imgf000017_0001
(continuación)
Figure imgf000018_0001
En otra realización, el anticuerpo o proteína que enlaza con el antígeno es un scFv anti-WT1 o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo que tiene una región de enlace con el antígeno que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:108 y enlaza específicamente con un péptido con la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1) en conjunción con h La -A0201. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-WT1 es una proteína de fusión scFv-Fc o IgG humana de longitud completa con regiones VH y VL o CDRs seleccionadas de la Tabla 6.
Tabla 6
Figure imgf000019_0001
(continuación)
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Otras realizaciones de los anticuerpos divulgados y proteínas que enlazan con el antígeno abarcan las que comprenden regiones hipervariables y regiones constantes ligeras y pesadas, por ejemplo como se muestra en las Tablas 7 (cadena pesada), 8 (cadena ligera) y 9 (regiones constantes).
Tabla 7
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
T l
Figure imgf000024_0002
continuación
Figure imgf000025_0002
T l
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La divulgación se refiere a proteínas que enlazan con el antígeno recombinantes, anticuerpos y fragmentos de enlace con el antígeno del mismo que reconocen específicamente epítopos de un complejo de un fragmento péptido/proteína derivado de una proteína intracelular, y una molécula MHC clase I, por ejemplo, ya que el complejo podría presentarse en la superficie celular durante la presentación del antígeno. Las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de la divulgación pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo puede incluir al menos una, y preferiblemente dos, cadenas pesadas completas, y al menos una, y preferiblemente dos, cadenas ligeras completas) o pueden incluir una porción de enlace al antígeno (un Fab, F(ab')2, Fv o fragmento de Fv de cadena sencilla (scFv"). En otras realizaciones, la región constante de la cadena pesada del anticuerpo se elige de, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE, particularmente se elige de , por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, más particularmente IgG1 (por ejemplo IgG1 humana). En otra realización, la región constante de la cadena ligera del anticuerpo se elige de, por ejemplo, kappa o lambda, particularmente kappa.
Los anticuerpos y proteínas que enlazan con el antígeno de la presente divulgación se pretende que abarquen anticuerpos biespecíficos, incluyendo anticuerpos que acoplan con células T biespecíficos, es decir, anticuerpos que comprenden dos dominios variables de anticuerpos en una cadena de polipéptidos sencilla que son capaces de enlazar con don dos antígenos separados. Donde una primera porción de un anticuerpo biespecífico enlaza con un antígeno en una célula tumoral por ejemplo y una segunda porción de un anticuerpo biespecífico reconoce un antígeno en la superficie de una célula efectora inmune humana, el anticuerpo es capaz de reclutar la actividad de esa célula efectora enlazando específicamente con el antígeno efector en la célula efectora inmune humana. En algunas situaciones, los anticuerpos biespecíficos, por lo tanto, son capaces de formar un enlace entre células efectoras, por ejemplo, células T y células tumorales, mejorando de este modo la función efectora.
En una realización, la región constante/región marco se altera, por ejemplo, por sustitución de aminoácidos, para modificar las propiedades del anticuerpos (Por ejemplo, para aumentar o disminuir uno o más de: afinidad de enlace del antígeno, enlace del receptor Fc, carbohidratos del anticuerpo, por ejemplo, glicosilación, fucosilación, etc., el número de residuos de cisteína, función celular efectora, función del complemento o introducción de un sitio de conjugación). Además, también se contempla la conjugación del anticuerpo a un fármaco, toxina, radioisótopo, citoquina, péptido inflamatorio o agente citotóxico.
En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-WT1/A2 y comprende la región constante de IgG1 humana y el dominio de Fc mostrado en la Tabla 9. En una realización, el anticuerpo anti-WT1/A2 comprende una secuencia kappa humana, o una secuencia lambda humana que tiene la secuencia expuesta en la Tabla 9. Las secuencias de aminoácidos para algunas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de anticuerpos de la divulgación se muestran en las Tablas 1-2 y 4-8. Las secuencias de aminoácidos para algunas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de anticuerpos de la divulgación se muestran en la Tabla 3.
La presente divulgación se basa en la identificación de secuencias de enlace específicas del antígeno a partir de las cuales se puede producir una variedad de proteínas que enlazan con el antígeno. Además de los anticuerpos específicos para un antígeno que representa un complejo fragmento de proteína (péptido)/HLA similar al típicamente reconocido por un receptor de células T tras el procesamiento del antígeno y la presentación de la proteína a la célula T, también puede usarse la identificación de secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos como se divulgan en la presente para la preparación de anticuerpos para generar otras moléculas que enlazan con el antígeno incluyendo receptores de antígenos quiméricos (CARs), con especificidad para el complejo fragmento de proteína (péptido)/HLA. Estos pueden incorporarse en las células para hacerlas específicamente citotóxicas a la célula que expresa el antígeno.
La presente divulgación emplea un nuevo enfoque para obtener anticuerpos terapéuticos para cualquier proteína, incluyendo esas proteínas que son inaccesibles debido a que no se expresan en la superficie celular. Casi cualquier proteína intracitoplásmica o intranuclear (Además de las proteínas de la superficie celular) es una diana potencial para el enfoque descrito en la presente. Estas incluye, pero no están limitadas a, proteínas oncogénicas, factores de transcripción, enzimas, etc.
Para apuntar a antígenos tumorales derivados de proteínas intracelulares o nucleares, se requirió el desarrollo de un anticuerpo terapéutico de un enfoque no común. Este enfoque es para generar mAbs recombinantes que reconocen el complejo péptido/MHC expresado en la superficie celular, con la misma especificidad que un receptor de células T (Tc R). Tales mAbs comparten homología funcional con TCRs respecto al reconocimiento de dianas, pero confieren mayor afinidad y capacidades de armarse con agentes citotóxicos potentes que presentan los anticuerpos. Técnicamente, los mAbs similar a TCR pueden generarse por técnicas de hibridomas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, para producir anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos.
Además, se prefieren mAbs completamente humanos para uso terapéutico en humanos debido a que los anticuerpos murinos provocan una reacción de inmunogenicidad, conocida como la respuesta HAMA (anticuerpos anti-ratón humanos) (24, 25), cuando se administran a humanos, provocando efectos secundarios serios, incluyendo anafilaxis y reacciones de hipersensibilidad. Esta reacción de inmunogenicidad se activa por el sistema inmune humano que reconoce los anticuerpos murinos como extraños debido a las secuencias de aminoácidos ligeramente diferentes de los anticuerpos humanos naturales. Pueden emplearse los métodos de humanización conocidos en la técnica (26, 27) para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos de origen murino (28).
Recientemente, el uso de bibliotecas de presentación de fagos ha hecho posible seleccionar grandes números de repertorios de Ab para Abs únicos y raros contra epítopos muy definidos (para más detalles en la presentación de fagos ver McCafferty et al., Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature, 348: 552-554.). La rápida identificación de fragmentos de Fab humanos o Fv de cadena sencilla (ScFV) altamente específicos para moléculas del complejo péptido-MHC derivado de antígenos tumorales se ha hecho por lo tanto posible (19-22). Más recientemente, se ha demostrado que inmuno-toxinas, generadas fusionando Fab similar a TCR específicos para melanoma Ag MART-1 26-35/A2 o gp100 280-288/A2 a una forma truncada de endotoxina de Pseudomonas inhiben el crecimiento del melanoma humano tanto in vitro como in vivo (23). Además, diseñando mAb de longitud completa usando los fragmentos Fab, es posible generar directamente un mAb humano terapéutico, pasando por alto meses de trabajo que consume tiempo, necesario normalmente para desarrollar mAbs terapéuticos. La presente divulgación implica el desarrollo de un mAb completamente humano similar a TCR, que reconoce, por ejemplo, el complejo péptido de WT1/HLA-A2 (RMFPNAPYL, SEQ ID NO: 1) para terapia contra el cáncer.
Los anticuerpos recombinantes con especificidad similar a TCR representan una nueva y valiosa herramienta para aplicaciones de investigación y terapéuticas en la inmunología e inmunoterapia tumorales. El WT1 es un antígeno tumoral bien establecido y validado que ha sido investigado en todo el mundo como un marcador, factor de pronóstico y diana terapéutica. Se ha priorizado recientemente como el antígeno tumoral más prioritario por un grupo de trabajo del NCI (29).
Identificación de péptidos con enlace altamente predictivo para moléculas HLA
En una realización, la presente divulgación se refiere a un método para la generación de anticuerpos que enlazan específicamente con péptidos HLA restringidos, que, cuando se presentan como parte de un complejo péptido/MHC son capaces de provocar una respuesta de células T citotóxica específica. Las moléculas HLA clase I presentan péptidos derivados endógenos de aproximadamente 8-12 aminoácidos de longitud para linfocitos citotóxicos T CD8+. Los péptidos para ser usados en el método de la presente divulgación son generalmente de aproximadamente 6-22 aminoácidos de longitud, y en algunas realizaciones, entre aproximadamente 9 y 20 aminoácidos y comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de una proteína de interés, por ejemplo proteína WT1 humana (Número de acceso de GenBank P19544) o análogo de la misma.
Los péptidos adecuados para su uso en la generación de anticuerpos de acuerdo con el método de la presente divulgación pueden determinarse en base a la presencia de motivos de enlace de HLA-A0201 y los sitios de escisión para proteasomas e inmunoproteasomas usando modelos de predicción informáticos conocidos por los expertos en la técnica. Para predecir los sitios de enlace de MCH clase I, tales modelos incluyen, pero no están limitados a, ProPred1 (descrito con más detalle en Singh y Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001), y SYFPEITHI (ver Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-932007;.
La HLA-A*0201 se expresa en el 39-46% de todos los caucásicos y por lo tanto, representa una elección adecuada del antígeno MHC para su uso en el presente método. Para la preparación de una realización de un antígeno del péptido de WT1, se identificaron secuencias de aminoácidos y enlace predicho de epítopos CD84+ putativos para moléculas HLA-A0201 usando el algoritmo predictivo de la base de datos SYFPEITHI (ver Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-932007;.
Una vez que se han identificado los péptidos apropiados, puede realizarse la síntesis de péptidos de acuerdo con protocolos bien conocidos por los expertos en la técnica. Debido a su relativamente pequeño tamaño, los péptidos de la divulgación pueden sintetizarse directamente en solución o en un soporte sólido de acuerdo con técnicas de síntesis de péptidos convencionales. Hay disponibles comercialmente varios sintetizadores automáticos y pueden usarse de acuerdo con protocolos conocidos. La síntesis de péptidos en fase de solución se ha vuelto un procedimiento bien establecido para la producción a gran escala de péptidos sintéticos y como tal es un método alternativo adecuado para preparar los péptidos de la divulgación. (Ver por ejemplo, Solid Phase Peptide Synthesis por John Morrow Stewart y Martin et al. Application of Almez-mediated Amidation Reactions to Solution Phase Peptide Synthesis, Tetrahedron Letters Vol. 39, páginas 1517-15201998.)
Cada uno de los péptidos usados en los protocolos descritos en la presente se adquirieron y sintetizaron por Genemed Synthesis, Inc. (San Antonio, TX) usando química de fluorenilmetoxicarbonilo y síntesis de fase sólida y se purificaron por cromatografía líquida de alta presión. La calidad de los péptidos se evaluó por análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento. Los péptidos eran estériles y puros del 70% al 90%. Los péptidos se disolvieron en d Ms O y se diluyeron en PBS (pH 7,4) o solución salina a 5 mg/ml y se almacenaron a -80° C.
Posterior a la selección del péptido, se probó la actividad de enlace de los péptidos seleccionados usando la línea celular T2 deficiente en el procesamiento de antígenos, que aumenta la expresión de HLA-A cuando se estabiliza por un péptido en la ranura presentadora de antígenos. Brevemente, las células T2 se pulsan con péptido durante un tiempo suficiente para inducir la expresión de HLA-A. La expresión de HLA-A de células T2 se mide luego por inmunotinción con un anticuerpo monoclonal fluorescentemente marcado específico para HLA-A (por ejemplo, BB7.2) y citometría de flujo. El índice de fluorescencia (FI) se calcula como la intensidad de fluorescencia media (MFI) de HLA-A0201 en células T2 como se determina por análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia, usando la fórmula FI=(MFI[células T2 con péptido]/MFI [células T2 sin péptido]-1.
Se produjeron anticuerpos similares al receptor de células T (TCR) completamente humanos para la proteína del oncogén del tumor de Wilms (WT1) usando el método divulgado en la presente. Los anticuerpos anti-WT1 similares a TCR generados por tecnología de presentación de fagos son específicos para un complejo péptido de WT1/HLA similar al que inducen las células T CD8 citotóxicas HLA restringidas.
La secuencia de la proteína WT1 se cribó usando el algoritmo SYFPEITHI y se identificaron los péptidos de WT1 (por ejemplo, los péptidos designados 428, 328 y 122) que habían predicho enlace de alta afinidad con múltiples moléculas HLA que se expresan altamente en la población caucásica. El péptido 428 abarca los aminoácidos de WT1 428-459, el péptido 328 abarca los aminoácidos de WT1 328-349, y el péptido 122 abarca los aminoácidos de WT1 122-140 (ver Figura 1).
También pueden diseñarse péptidos heteróclitos por sustituciones de aminoácidos conservadoras de residuos que enlazan con MHC que se espera mejoren la afinidad hacia el alelo de MHC clase 1, como se prevé por el algoritmo de predicción. El péptido de WT1 122 comprende dentro él un epítopo de CD8+ conocido (126-134). En una realización, por lo tanto, puede usarse un péptido modificado del péptido que abarca los residuos de aminoácidos de WT1 126-134 y contiene un aminoácido modificado en las posiciones. Los péptidos usados para la mutagénesis de alanina de WT1 (designado de otro modo RMF) se nombraron en base a la posición donde se hizo la sustitución. Ejemplos de péptidos de WT1 que pueden usarse se muestra en la Tabla 10 junto con péptidos irrelevantes, RHAMM-R3 y EW.
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Una vez se ha identificado un péptido adecuado, el antígeno diana a ser usado para el cribado de la biblioteca de presentación de fagos, es decir, un complejo péptido/HLA (Por ejemplo, péptido deWt1/HLA-A0201) se prepara juntado el péptido y el antígeno de histocompatibilidad en la solución para formar el complejo.
Selección de un ScFV de alta afinidad contra un péptido de WT1
El siguiente paso es la selección del fago que enlaza con el antígeno diana de interés con afinidad alta, a partir de un fago en una biblioteca de presentación de fagos que o no enlazan o que enlazan con afinidad más baja. Esto se consigue por enlace iterativo del fago en el antígeno que se enlaza a un soporte sólido, por ejemplo, perlas o células mamíferas seguido por la eliminación del fago no enlazado y por la elución del fago enlazado específicamente. En una realización, los antígenos son primero biotinilados para la inmovilización a, por ejemplo, Dynabeads M-280 conjugadas con estreptavidina. La biblioteca de fagos se incuba con las células, perlas u otro soporte sólido y el fago no enlazado se elimina por lavado. Los clones que enlazan se seleccionan y prueban.
Una vez seleccionados, los clones scFv positivos se prueban para su enlace con complejos HLA-A2/péptido en superficies de células T2 vivas por citometría de flujo indirecta. Brevemente, los clones de fagos se incuban con células T2 que se han pulsado con péptido de Wt1-A, o un péptido irrelevante (control). Las células se lavan y luego con un mAb de proteína de recubrimiento anti M13 de ratón. Las células se lavan de nuevo y se marcan con una Ig anti-ratón FITC-(Fab)2 de cabra antes de la citometría de flujo.
En otras realizaciones, los anticuerpos anti-WT1/A pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos de la región marco diseñadas para mejorar la estabilidad de la proteína, el enlace del anticuerpo, los niveles de expresión o para introducir un sitio para la conjugación de agentes terapéuticos. Estos scFv se usan luego para producir Igs monoclonales humanas recombinantes de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica.
También se incluyen métodos para reducir la proliferación de células de leucemia, que comprenden poner en contacto células de leucemia con un anticuerpo de WT1 de la divulgación. En un aspecto relacionado, los anticuerpos de la divulgación pueden usarse para la prevención o tratamiento de la leucemia. La administración de anticuerpos terapéuticos es conocida en la técnica.
Conjugados de anticuerpos con Agentes Anti-cancerígenos
Los anticuerpos monoclonales representan el vehículo preferido para la administración dirigida de agentes bioactivos a sitios cancerígenos, incluyendo la administración basada en anticuerpos de citotóxicos, radionucleidos o citoquinas inmunomoduladoras. Los conjugados de los anticuerpos de la divulgación con agentes terapéuticos, incluyendo sin limitación, fármacos (como calecheamicina, aureastatina, doxorrubicina) o toxinas (como ricina, difteria, gelonina) o radioisótopos que emiten partículas alfa o beta (como, 90Y, 131I, 225Ac , 213Bi, 223Ra y 227Th), péptidos inflamatorios como (lL2, TNF, IFN-y) están abarcados por la divulgación.
Composición Farmacéutica y Métodos de Tratamiento
Los anticuerpos de WT1 de la presente divulgación pueden administrarse para tratamientos terapéuticos a un paciente que sufre de un tumor o afección patológica asociada con WT1 en una cantidad suficiente para prevenir, inhibir, o reducir la progresión del tumor o afección patológica. La progresión incluye, por ejemplo, el crecimiento, invasividad, metástasis y/o reaparición del tumor o afección patológica. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la enfermedad y el estado general del propio sistema inmune del paciente. Los programas de dosificación también variarán con el estado de la enfermedad y el estado del paciente, y variarán típicamente de una dosificación de bolo único a la infusión continua para administraciones múltiples por día (por ejemplo, cada 4-6 horas), o como se indique por el médico tratante y la condición del paciente.
La identificación de condiciones médicas tratables por los anticuerpos de WT1 de la presente divulgación está dentro de la capacidad y el conocimiento del experto en la técnica. Por ejemplo, individuos humanos que estén o sufriendo de una enfermedad leucémica clínicamente significativa o que estén en riesgo de desarrollar síntomas clínicamente significativos son adecuados para la administración de los presentes anticuerpos de WT1. Un practicante clínico experto en la técnica pude determinar fácilmente, por ejemplo, por el uso de pruebas clínicas, el examen físico y el historial médico/familiar, si un individuo es un candidato para dicho tratamiento.
Ejemplos no limitativos de afecciones patológicas caracterizadas por la expresión de WT1 incluyen leucemia mielocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide/mielógena aguda (AML) y síndrome mielodisplásico (MDS). Además, los tumores sólidos, en general y en particular, los tumores asociados con mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer gastrointestinal, cáncer de mama, cáncer de próstata y glioblastoma son susceptibles de tratamiento usando anticuerpos de WT1.
En otra realización, por lo tanto, la presente divulgación se usa en un método para tratar una afección médica administrando un anticuerpo de WT1 de la presente divulgación en combinación con uno o más de otros agentes. Por ejemplo, una realización de la presente divulgación proporciona un método para tratar una afección médica administrando un anticuerpo de WT1 de la presente invención con un agente antineoplásico o antiangiogénico. El anticuerpo de WT1 puede ligarse químicamente o biosintéticamente con uno o más de los agentes antineoplásicos o antiangiogénicos.
Puede usarse cualquier método o vía adecuados para administrar un anticuerpo de WT1 de la presente divulgación, y opcionalmente, para coadministrar agentes antineoplásicos y/o antagonistas de otros receptores. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Debe enfatizarse sin embargo, que la presente divulgación no está limitada a ningún método o vía de administración particular.
Se observa que un anticuerpo de WT1 de la presente divulgación puede administrarse como un conjugado, que enlaza específicamente con el receptor y administrar una carga tóxica, letal tras la internalización del ligandotoxina.
Se entiende que los anticuerpos de WT1 de la divulgación se administrarán en la forma de una composición que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. Los portadores farmacéuticamente aceptables puede comprender adicionalmente cantidades menores de sustancias auxiliares como agentes humectantes y emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o efectividad de las proteínas de enlace. Las composiciones de la inyección pueden, como es bien conocido en la técnica, formularse para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo tras la administración al mamífero.
Otros aspectos de la divulgación se refieren a, sin limitación, el uso de anticuerpos y ácidos nucleicos que los codifican para al tratamiento de la enfermedad asociada con WT1, para aplicaciones de diagnóstico o pronóstico así como herramientas de investigación para la detección de WT1 en células y tejidos. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y ácidos nucleicos divulgados están abarcadas por la divulgación. Los vectores que comprenden los ácidos nucleicos de la divulgación para el tratamiento basado en anticuerpos por inmunoterapia de vectores también están contemplados por la presente divulgación. Los vectores incluyen vectores de expresión que permiten la expresión y secreción de anticuerpos, así como vectores que están dirigidos a la expresión de superficie celular de las proteínas que enlazan con el antígeno, como receptores de antígenos quiméricos.
Las células que comprenden los ácidos nucleicos, por ejemplo células que han sido transfectadas con los vectores de la divulgación también están abarcadas por la divulgación.
Para el uso en aplicaciones de diagnóstico e investigación, también se divulgan kits que contienen un anticuerpo de WT1 o ácidos nucleicos de la divulgación, reactivos de ensayo, tampones y similares.
Se describirá ahora el método de la presente divulgación con más detalle respecto a las realizaciones representativas.
Materiales
Muestras celulares, líneas celulares y anticuerpos. Tras consentimiento informado de los protocolos aprobados en la Junta de Revisión Institucional del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes y pacientes sanos tipificados HLA por centrifugación de densidad de Ficol. Las fuentes para obtener líneas celulares de mesotelioma humanas se han descrito anteriormente (29). Las líneas celulares incluyen, H-Meso1A, JMN , VAMT, H2452 , H2373, H28, MSTO, Meso 11, Meso 34, Meso 37, Meso 47, y Meso 56. Todas la células fueron tipificadas HLA por el Departamento de Inmunología Celular en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Las líneas celulares de leucemia LAMA81, BV173, and 697, (WT1 , A0201 ) se proporcionaron amablemente por el Dr. H. J. Stauss (University College London, Londres, Reino Unido). La línea celular de melanoma MeWo (WT1-, A201+), SKLY16 (linfoma de células B; WT1-, A0201+); K562, RwLeu4, y HL60, todas las leucemias de WT1+, y la línea celular T2 deficiente en TAP se obtuvieron del American Type Culture Collection. Las líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 5% de FCS, penicilina, estreptomicina, 2 mmol/l de glutamina, y 2-mercaptoetanol a 37 C/5% de CO2.
Se adquirieron Ab monoclonal contra HLA-A2 humano (clonBB7.2) conjugado con FITC o APC, y su IgG2b/FITC o APC de ratón de control de isotipo , para CD3, CD19, CD56, Cd33, CD34 humano o de ratón (BD Biosciences, San Diego), IgG anti-humana de F(ab)2 de cabra conjugado con PE o FITC e Ig anti-ratón de F(ab)2 de cabra conjugado a fluorescente (In Vitrogen, City). Se obtuvo mAb de ratón para HLA-clase I (W6/32) de la Instalación Central de anticuerpos monoclonales de MSKCC.
Péptidos. Todos los péptidos se adquirieron y sintetizaron por Genemed Synthesis, Inc. (San Antonio, TX). los péptidos eran > 90% puros. (Tabla 1).Los péptidos se disolvieron en DMSO y se diluyeron en solución salina a 5 mg/ml y se congelaron a -180C. Los complejos de péptido de WT1 de la cadena sencilla biotinilado/HLA-A0201 y RHAMM-3/HLA-A0201 se sintetizaron replegando los péptidos con HLA-A2 recombinante y beta2 microglobulén (p2M) en la instalación Tetramer en MSkCc .
Animales. se adquirieron ratones NOD.Cg-Prkdc scid IL2rgtm1Wjl/SzJ de ocho a diez semanas de edad, conocidos como NOD scid gamma (NSG), de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) o se obtuvieron de la instalación de cría de animales del MSKCC.
Métodos
Análisis de citometría de flujo. Para la tinción de la superficie celular, las células se incubaron con mAbs apropiados durante 30 minutos en hielo, se lavaron e incubaron con reactivos de anticuerpos secundarios cuando fue necesario. Los datos de la citometría de flujo se recogieron en un FACS Calibur (Becton Dickinson) y se analizaron con software FlowJo V8.7.1 y 9.4.8.
Selección y caracterización de scFv específico para complejos péptido de WT1/HLA-A0201. Se usó una biblioteca de presentación de fagos de anticuerpos scFv humanos para la selección de clones de mAb. Para reducir el cambio conformacional que el complejo MHC1 introduce inmovilizando sobre superficies plásticas, se uso un método de selección por afinidad de soluciones en lugar de selección por afinidad de placas convencionales. Brevemente, se mezclaron primero antígenos biotinilados con la biblioteca de fagos de scFv humanos, después los complejos antígeno-anticuerpo scFv se desplegaron por Dynabeads M-280 conjugadas con estreptavidina a través de una rejilla magnética. Se eluyeron luego los clones enlazados y se usaron para infectar E.Coli XL1-Blue. Los clones de fago scFv expresados en las bacterias se purificaron (35, 36). Se realizó selección por afinidad durante 3-4 ciclos para enriquecer los clones de fagos scFv que enlazaban específicamente con el complejo HLA-A0201/WT1. Los clones positivos se determinaron por método ELISA estándar frente a complejos HLA-A0201/péptido de WT1 de cadena sencilla biotinilado. Los clones positivos se probaron adicionalmente para su enlace con los complejos HLA-A2/péptido en superficies de células vivas por citometría de flujo, usando una línea celular HLA-A0201 deficiente en TAP, T2. Las células T2 se pulsaron con péptidos (50 ug/ml) en el medio RPMI1640 libre de suero, en presencia de 20 |jg/ml de p2 M ON. Las células se lavaron y se realizó la tinción en los pasos siguientes.
Las células se tiñeron primero con clones de fagos de scFv purificados, y se siguió por tinción con un mAb anti-M13 de ratón, y finalmente el conjugado de Ig anti-ratón F(ab)2 de cabra para FITC. Cada paso de la tinción se hizo entre 30-60 minutos en hielo y las células se lavaron dos veces entre cada paso de la tinción.
Diseño de Amb de longitud completa usando fragmentos de scFv seleccionados. La IgG1 humana de longitud completa de los clones de fagos seleccionados se produjo en líneas celulares HEK293 y ovario de hámster chino (CHO), como se describe (37). Brevemente, las regiones variables del anticuerpo se subclonaron en vectores de expresión mamíferos, con la región constante de la cadena ligera lambda o kappa humana concordante y secuencias de la región constante de IgG1 humana. Se midió el peso molecular de los anticuerpos de IgG de longitud completa purificados bajo tanto condiciones reductoras como no reductoras por electroforesis.
Diseño de receptores de antígenos quiméricos y células efectoras inmunes. Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y las proteínas que enlazan con el antígeno identificados en la presente pueden usarse como células efectoras inmunes recombinantes diseñadas. Los métodos y vectores para generar células T genéticamente modificadas, por ejemplo, se conocen en la técnica (ver Brentjens et al., Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias in Blood 118(18):4817-4828, Noviembre de 2011).
Caracterización de la IgG1 humana de longitud completa para el complejo WT1p/A2. Inicialmente, se determinaron las especificidades de los mAbs de IgG1 humanos completos para el complejo péptido de WT1/A2 tiñendo células T2 pulsadas con o sin péptidos de control RMF o RHAMM-R3, seguido por conjugado de mAb de IgG anti-humano F(ab)2 de cabra secundario con PE o FITC. Se midió la intensidad de la fluorescencia por citometría de flujo. Se usó el mismo método para determinar el enlace de mAbs con células y líneas celulares tumorales nuevas.
Radioinmunoensayos. El WT1 ab1 se marcó con 125-I (PerkinElmer) usando el método cloramina-T (38). Se reaccionaron 100 jg de anticuerpo con 1 mCi de 125-I y 20 jg de cloramina-T, neutralizada con 200 jg de metabisulfito de Na, luego se separaron del 125-I libre usando una columna 10DC (compañía) equilibrada con2% de albúmina de suero bovino en PBS. Las actividades específicas de los productos estaban en el intervalo de 7-8 mCi/mg.
Se obtuvieron líneas celulares hematopoyéticas, líneas celulares adherentes (recolectadas con un separador celular no enzimático (nombre)), PBMCs de donantes normales y pacientes AML como se ha descrito. Las células se lavaron una vez con PBS y se re-suspendieron en 2% de suero humano en PBS a 107 células/ml a 00. Las células (106 tubo por duplicado) se incubaron con WT1 AB1 marcado con 125-I (1 jg/ml) durante 45 minutos en hielo, después se lavaron extensivamente con 1% de albúmina de suero bovino en PBS a 00. Para determinar el enlace específico, se ensayó un conjunto duplicado de células tras la pre-incubación en presencia de WT1 AB1 sin marcar 50 veces en exceso durante 20 minutos en hielo. Se midió la radioactividad de enlace por un contador gamma, se determinó el enlace específico, y se calculó el número de anticuerpos enlazados por célula a partir de la actividad específica.
Citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Las células diana usadas para la ADCC eran células T2 pulsadas con o sin péptidos de WT1 o RHAAM-3, y líneas celulares tumorales sin pulsación de péptidos. Se incubaron WT1 ab1 o su IgG1 humana de control de isotipo a varias concentraciones con células diana y PBMCs nuevas a diferente proporción efector: diana (E:T) durante 16 horas. Los sobrenadantes se recolectaron y se midió la citotoxicidad por ensayo de liberación de LDH usando el kit no radioreactivo Cytotox 96 de Promega siguiendo sus instrucciones. También se midió la citotoxicidad por ensayo de liberación de 51Cr de 4 horas estándar.
Transducción y selección de células luciferasa/GFP positivas. Se diseñaron células BV173 y JMN para expresar nivel alto de la proteína de fusión GFP-luciferasa, usando vectores lentivirales que contienen un plásmido que codifica luc/GFP (39). Usando clonación de células individuales, sólo se seleccionaron las células que mostraban nivel alto de expresión de GFP por análisis de citometría de flujo t se mantuvieron y usaron para el estudio animal.
Pruebas terapéuticas del WT1 ab1 en un modelo NSG de xenoinjerto de leucemia humana. Se inyectaron IV dos millones de células de leucemia humanas BV173 en ratones NSG. En el día 5, se confirmo el injerto del tumor por formación con imágenes de luciferasa de luciérnaga en todos los ratones que se iban a tratar; los ratones se dividieron luego aleatoriamente en diferentes grupos de tratamiento. En el día 6 y el día 10, el mAb WT1 ab1 o el mAb de control de isotipo se inyectaron IV. En animales que también recibieron células efectoras humanas con o sin mAb, se inyectaron IV células ( PBMCx humanas de donantes sanos vaciadas de CD34 y CD3) en ratones (107 células/ratón) 4 horas antes de las inyecciones de mAb. El crecimiento tumoral se evaluó por formación de imágenes con luminiscencia una o dos veces a la semana, y se la actividad clínica se evaluó diariamente.
Selección y caracterización de scFv específico para los complejos péptido de WT1/HLA-A0201. La selección de un scFv específico de WT1 se logro usando un péptido 9-mer derivado de WT1 que comprende los aminoácidos 126-134 RMFPNAPYL, SEQ ID NO: 1) de WT1. Este péptido ha demostrado que se procesa y presenta por HLA-A0201 para inducir células T CD8+ citotóxicas que son capaces de destruir células tumorales WT1-positivas.
Los datos representativos de un paciente con AML tras las vacunaciones con un péptido deWT1 RMF se muestran en la Figura 2 como evidencia de que los péptidos de WT1 son inmunogénicos en humanos. Las células T CD3 se estimularon con péptido de WT1-A (aminoácidos 126-134) y la citotoxicidad se midió usando un ensayo de liberación de 51Cr estándar contra las líneas celulares 697 (A0201+ WT1+) o SKLY-16 (A0201 WT1-). Las células SKLY-16 pulsadas con WT1-A o péptido EW irrelevante se usaron como controles positivos y negativos para la especificidad de la destrucción. Las proporciones Efector: Diana (E:T) se indican en el eje X. Los datos demuestran que las células T destruyeron células tumorales WT1+ de una manera restringida por HLA- A0201.
Se usaron bibliotecas de presentación de fagos y métodos de cribado bien establecidos conocidos por los expertos en la técnica para seleccionar fragmentos de scFv altamente específicos para un complejo péptido de WT1-A/HLA-A2. En una realización, se usó una biblioteca de presentación de fagos de anticuerpos scFv humanos (7x1010 clones) para la selección de clones de mAb. Para reducir el cambio conformacional del complejo MHC1 introducido inmovilizándolo en superficies plásticas, se uso un método de selección por afinidad de la solución en lugar de la selección por afinidad de placas convencional. Brevemente, se mezclaron primero antígenos biotinilados con la biblioteca de fagos de scFv humanos, luego se desplegaron los complejos antígeno-anticuerpo de fago de scFv por Dynabeads M-280 conjugadas con estreptavidina a través de una rejilla magnética.
Los clones enlazados se eluyeron luego y se usaron para infectar E.Coli XL1-Blue. Se purificaron los clones de fagos de scFv expresados en las bacterias (35, 36). La selección por afinidad se realizó durante 3-4 ciclos para enriquecer los clones de fagos de scFv que enlazaban con el complejo HLA-A0201/WT1 específicamente. Los clones positivos se determinaron por método ELISA estándar contra complejos HLA-A0201/péptido de WT1 de cadena sencilla biotinilados (Figura 3). Los clones positivos se probaron adicionalmente para su enlace con complejos HLA-A2/péptido en superficies de células vivas por citometría de flujo, usando una línea celular , HLA-A0201+, deficiente en TAP, T2. Las células T2 se pulsaron con péptidos (50 pg/ml) en medio RPMI1640 libre de suero, en presencia de 20 pg/ml de p2 M durante la noche. Las células se lavaron, y la tinción se realizó como sigue.
Las células se tiñeron primero con clones de fagos de scFv purificados, seguido por tinción con un mAb anti-M13 de ratón y finalmente, una Ig anti-ratón F(ab)2 de cabra conjugada con FITC. Cada paso de la tinción se hizo durante 30-60 minutos enhielo. Las células se lavaron dos veces entre cada paso de tinción. Los resultados se muestran en la Figura 4. Se demostró que el clon de fago de WT1 ab1 enlaza con células T2 pulsadas sólo con péptido de WT1-A (RMFPNAPYL: abreviado en lo sucesivo como RMF), pero no con células T2 solas, las células T2 pulsadas con péptido de EW de control, o péptido heteróclito de WT1-A.
La afinidad de enlace de la IgG1 de longitud completa de WT1 ab1 con el complejo péptido/A0201 se probó por titulación de WT1 ab1 a las concentraciones indicadas. Las células T2 se pulsaron con 50 pg/ml o 10 pg/ml, seguido por IgG/PE antihumano F(ab) de cabra secundario. Los resultados se muestran en la Figura 5.
La Figura 6 muestra la densidad del complejo péptido/HLA-A0201 reconocido por WT1 ab. Las células T2 se pulsaron durante la noche (ON) con péptidos de RMF (panel superior) o RHAMM-R3 (panel inferior) a las concentraciones indicadas, y se analizó el enlace de WT1 ab1, WT1 ab3 y WT1 ab5 a una concentración de 1 pg/ml por citometría de flujo.
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Los clones de scFv positivos se probaron para su enlace con los complejos HLA-A2/péptido en superficies de células vivas por citometría de flujo indirecta: (i) células T2 de HLA-A0201 deficientes en TAP con péptido de WT1 o péptido irrelevante; (ii) líneas celulares de W t1+ HLA-A0201+ como BV173, U266 y la línea celular de WTI-HLA-A0201 de control SKLY-16, o la línea celular de WT1+ HLAA0201-, K562, sin pulsación con péptido. La última determinó el reconocimiento y afinidad de enlace del scFV con el complejo WT1p/A2 procesado de manera natural en células tumorales.
Se cribaron un total de 28 clones de fagos por su capacidad para producir mAb específicos para el complejo péptido de WTI-A/A2. El reconocimiento del complejo WT1p/A2 en células vivas se midió por el enlace del scFv del fago con células T2 pulsadas con el péptido de W t I-A y los otros péptidos que enlazan con HLA-A (50 pg/ml). Estos incluyen: células T2 solas; células t 2 pulsadas con péptido de WTI-A, células T2 pulsadas con péptido heteroclitico de WTl-A1; células T2 pulsadas con péptido de EW irrelevante (péptido 9-mer de enlace con HLA-A0201, derivado de sarcoma de Ewing), o RHAMM-R3 (Figura 4).
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Diseño de mAb de longitud completa usando los fragmentos de ScFv seleccionados
La tecnología de presentación de fagos permite la selección y producción rápidas de scFv y fragmentos Fab específicos del antígeno, que son útiles por sí mismos, o que pueden desarrollarse adicionalmente para proporcionar anticuerpos completos, proteínas que enlazan con el antígeno o fragmentos de enlace con el antígeno de los mismos. Los mAbs completos con dominios de Fc tienen una variedad de ventajas sobre los scFv y anticuerpos Fab. Primero, sólo los Abs de longitud completa ejercen función inmunológica como CDC y ADCC mediadas por el dominio de Fc. Segundo, los mAbs bivalentes ofrecen afinidad de enlace con el antígeno más fuerte que los Abs de Fab monoméricos. Tercero, la vida útil del plasma y la depuración renal serán diferentes con el Fab y el mAb bivalente. Las características y ventajas particulares de cada uno pueden hacerse coincidir con la estrategia efectora planificada. Cuatro, el mAb bivalente puede internalizarse a diferentes tasas que el scFV y Fab, alternando la función inmune o la función portadora. Los emisores alfa, por ejemplo, no necesitan ser internalizados para destruir las dianas, pero muchos fármacos y toxinas se beneficiaran de la internalización del complejo inmune. En una realización, por lo tanto, una vez que se obtuvieron los clones de scFv específicos para WT1p/A2 a partir de la biblioteca de presentación de fagos, se produjo un mAb de IgG de longitud completa usando los fragmentos scFV. Para producir IgG monoclonal humana recombinante en células de ovario de hámster chino (CHO), se diseñó un mAB de IgG de longitud completa en base a un método conocido por los expertos en la técnica (Tomomatsu et al., Production of human monoclonal antibodies against FceRIa by a method combining in vitro immunization with phage display. Biosci Biotechnol Biochem 73(7): 1465-1492009). Brevemente, las regiones variables de los anticuerpos se subclonaron en vectores de expresión mamíferos (Figura 7), con secuencias constantes de la cadena ligera Lambda o Kappa coincidentes e IgG1 subclase Fc (por ejemplo, ver Tabla 9) (33, 34). Los anticuerpos de IgG de longitud completa purificados mostraron el peso molecular esperado bajo condiciones tanto reductoras como no reductoras (Figura 8). El análisis de enlace cinético (35) confirmó el enlace específico de la IgG de longitud completa con WT1/A2, con un KD en el intervalo nanomolar (Figuras 9 y 10).
EJEMPLO 1
Selección de ScFV específico para el complejo WT1p/A2 usando una biblioteca de presentación de fagos completamente humana.
La presentación de fagos contra el complejo HLA-A0201/péptido de WT1 se realizó para 3-4 rondas de selección por afinidad para enriquecer los clones de fagos de scFv que enlazan con el complejo HLA-A0201/péptido de WT1 específicamente. Los clones de fagos de scFv individuales positivos para el complejo péptido de WT1/A2 se determinaron por ELISA y los clones que poseían secuencias de codificación de ADN únicas se sometieron a caracterización adicional. Para probar si el ScFv enlazaba con el complejo WT1p/A2 en células vivas, los clones de fagos positivos se probaron para enlace con la línea celular HLA-A0201-positiva deficiente en TAP, T2. Las células T2 pueden presentar solamente los péptidos exógenos y por lo tanto se han usado ampliamente para la detección de epítopos específicos presentados por moléculas HLA-A2. Se cribaron un total de 35 clones de fagos en células T2 y 15 clones mostraron enlace específico con células T2 pulsadas con solamente péptido de WT1 RMF, pero no con células T2 solas o pulsadas con el péptido de RHAMM-3 de control (Figura 4). Los clones de fagos de scFv fueron incapaces de enlazar con varias líneas celulares tumorales que son positivas para WT1- y HLA-A2 sugiriendo la afinidad del ScFv como débil, en comparación con el mAb bivalente de longitud completa.
EJEMPLO 2
Generación de IgG1 humana de longitud completa
La función inmunológica como CDC y ADCC depende en el dominio de Fc de la IgG bivalente. Además, los mAbs bivalentes ofrecen avidez de enlace con el antígeno más fuerte que los Abs de scFv monoméricos. Por lo tanto, se seleccionaron 6 clones de fagos de ScFv entre 15 clones de fagos positivos para producir la IgG1 monoclonal humana de longitud completa en células HEK293 y de ovario de hámster chino (CHO). Brevemente, las regiones variables de los mAbs se subclonaron en vectores de expresión mamíferos con las secuencias de la región constante de la cadena ligera lambda o kappa humana y la región constante de IgG1 humana coincidentes. Los anticuerpos de IgG de longitud completa purificados mostraron el peso molecular esperado bajo condiciones tanto reductoras como no reductoras (Figura 9). Se diseñaron con éxito cinco clones en IgG1 humana.
EJEMPLO 3
Especificidad y avidez de enlace del mAb de IgG1
Enlace con líneas celulares humanas
Se usaron inicialmente células T2, pulsadas con o sin péptidos RMF o RHAMM-3, para determinar la especificidad de enlace del mAb. Tres de cinco IgG1 humanas, incluyendo WT1 ab1, mostraron enlace específico con las células T2 que se habían pulsado sólo con el péptido de WT1, pero no con T2solas o T2 pulsadas con péptido de control RHAMM-R3. La avidez de enlace del mAb estaba sustancialmente potenciada (50 a 100 veces), en comparación con sus clones de fagos de scFv parentales. Dos mAbs entre los cinco mostraron enlace con células T2 solas o pulsadas con el péptido de control RHAMM-R3, aunque el enlace fue enormemente potenciado pulsando las células con péptido RMF. Esto sugirió que estos dos mAb también tenían alta avidez para epítopos en la molécula HLA-A2 sola y por lo tanto se excluyeron de investigación adicional. Esto no era inesperado, ya que ha sido un problema común para producir dicho mAb contra complejos péptido/MHC, dada la predominancia de los epítopos de moléculas MHC clase I dentro de los complejos. También sugiere que la especificad precisa del mAb para los complejos podría no determinarse fácilmente en la etapa de scFv, debido a la afinidad inferior en comparación con el mAb de IgG1 bivalente.
La afinidad de enlace de los tres mAb restantes específicos para el complejo WT1p/A2 se investigó primero en células T2 pulsadas con o sin péptidos RMF y RHAMM-R3 de control (50 ug/ml) por titulación de los mAbs. el mAb WT1 ab1 mostró el enlace más fuerte, hasta una concentración de 0,01 ug/ml. La IgG1 humana de control de isotipo no mostró enlace a ninguna concentración probada (Figura 5). Además del WT1 ab1, los otros dos mAb, WT1 ab3 y WT1 ab5, mostraron enlace específico a un intervalo de <1 ug/ml de las concentraciones de mAb usadas. El reconocimiento específico del mAb también dependió de la densidad antigénica en la superficie celular. Las células T2 se pulsaron con péptidos RMF o R3 a 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13 u 1,6 ug/ml; los mAb de prueba se usaron a 1 ug/ml para el ensayo de enlace con T2. La WT1 ab1 podría detectar el complejo péptido RMF/A2 en células T2 de una manera dependiente de la concentración a concentraciones tan bajas como 1,6 ug/ml, con intensidad de fluorescencia significativamente más alta que los otros 2 mAb (Figura 6). Estos resultados confirmaron adicionalmente que el WT1 ab1 poseía la avidez más alta para el complejo RMFp/A0201.
EJEMPLO 4
Mapeado del epítopo
Para investigar con más precisión el epítopo para el reconocimiento de WT1 ab1, los péptidos RMF se sustituyeron en las posiciones 1, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 con alanina y se pulsaron sobre células T2 y probaron para el enlace de WT1 ab1. Las posiciones 2 y 9 del r Mf se dejaron intactas, ya que estas son los residuos de anclaje para el enlace del péptido con la molécula HLA-A0201. Excepto para la posición 1, las sustituciones de alanina en otras posiciones no afectaron mucho al enlace del WT1 ab1, en comparación con el péptido RMF nativo (Figura 19). Sin embargo, la sustitución de la posición 1 por o alanina (WT1-A1-B) o tirosina (WT1-A1), anuló completamente el enlace de WT1 ab1. La pérdida de enlace no se debió a la reducción de la afinidad de enlace del péptido con la molécula HLA-A2, ya que ambos péptidos mostraron el enlace más fuerte en el ensayo de estabilización de T2 usando el mAb específico para la molécula HLA-A2, clon BB7 (Figura 20). Estos resultados muestran que la arginina en la posición 1 del péptido RMF es una de las más cruciales para el reconocimiento de WT1 ab1. El papel de los residuos en las posiciones #2 y 9, no pudo ser evaluado.
La siguiente cuestión importante era si el WT1 ab1 era capaz de reconocer el RMF del epítopo de WT1 procesado de manera natural presentado por moléculas HLA-A0201 en la superficie celular. Se seleccionó un panel de líneas celulares basadas en la expresión de ARNm de WT1 y genotipado de HLA (Tabla 12).
T l 12
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El nivel de expresión de ARNm de WT1 se estimó de acuerdo con un estudio previo (Rena), por RT-PCR cuantitativo.
Entre las líneas celulares de mesotelioma humano que son positivas para tanto HLA-A0201 y ARNm de WT1, WT1 ab1 enlazado con 6 de 7 líneas celulares, pero no con las células que eran o HLA-A0201 negativas (MSTO y VAMT) o ARNm de WT1 negativas, como la línea celular de melanoma, Mewo (Figura 21).
De manera similar, entre las 9 líneas celulares de leucemia probadas, el WT1 ab1 enlazó con 3 líneas celulares BV173 (Figura 22), BA25 y ALL-3, que son positivas para tanto ARNm de WT1 y HLA-A0201, pero no con las líneas celulares HLA-A2-negativas HL60 y K562, que se ha demostrado que expresan un nivel alto de transcripciones de WT1 en numerosos estudios.
Como se esperaba, la intensidad del enlace del WT1 AB1 también parecía que estaba directamente asociado con el nivel de expresión de la molécula HLA-A0201, como se muestra en las células de mesotelioma H2373, líneas celulares de leucemia 697 y LAMA, y la línea celular de mieloma U266. Aunque estas líneas celulares eran positivas para tanto transcripciones de WT1 como HLA-A2, el nivel de expresión de la HLA-A2 era bajo (Tabla 12) y el mAb no mostró enlace. Por otro lado, los resultados obtenidos con células T2 argumentan en contra de la posibilidad de que WT1 ab1 enlace con HLA-A0201 sola ya que las células T2 expresaron un nivel alto de la molécula HLA-A2. En particular, el WT1 ab1 no enlazó con células T2 solas o pulsadas con R3 y otros péptidos que enlazan con HLA-A0201 como péptido derivado de sarcoma de Ewing (EW) o el heteróclito para el péptido r Mf , WT1-A1; estos dos péptidos han demostrado que tienen afinidad más alta para la molécula HLA-A0201 en el ensayo de estabilización T2 (28). Estos resultados proporcionaron evidencias fuertes de que el reconocimiento de WT1 ab1 era específico para epítopos compuestos conjuntamente del péptido RMF y la molécula A0201 en un complejo. El enlace de los otros dos mAb, WT1 ab3 y WT1 ab5, con las células BV173 y JMN era también más débil que el de WT1 ab1.
EJEMPLO 5
Cuantificación de Sitios de Enlace de WT1 ab1 en Células
Se usó un radioinmunoensayo usando WT1 ab1 marcado con 15I para confirmar la especificidad del anticuerpo para las líneas celulares WT1 HLA-A0201+, para determinar la constante de afinidad y para evaluar el número de sitios de enlace del anticuerpo por célula en un panel de líneas celulares. El análisis Scatchard basado en el enlace con células JMN mostró una constante de avidez de aproximadamente 0,2 nM (Figura 23). Este número se confirmó por interferometría usando un dispositivo Forte Bio. Se usó WT1 ab1 marcado con 125-I para confirmar la especificidad del anticuerpo para las líneas celulares WT1+ HLA-A0201+, y para evaluar el número de sitios de enlace del anticuerpo en un panel de partículas finas celulares (Figura 24). Como no podemos determinar si el mAb bivalente está enlazando con 1 ó 2 complejos en la superficie, los epítopos totales por célula podrían ser tan altos como dos veces el número de sitios de enlace de mAb. De nuevo el WT1 ab1 enlazó con JMN, ALL-3, BA25, BV173, que son positivas para tanto HLA-A0201 y ARNm de WT1, pero no negativas para HLA-A0201 (HL60) o negativas para células ARNm de WT1 (SKLY-16). El WT1 no enlazó con 697 células, que son tanto HLA-A0201 como WT1 positivas en WT1, pero contienen niveles menores de HLA-A0201 (Tabla 12), confirmando que un cierto nivel del complejo MHC total es necesario para presentar suficiente péptido de WT1 para el enlace de WT1 ab1. T2 pulsadas con RMf enlazaron el mayor número de mAb (50.000 por célula), seguido por células JMN que enlazaron ~6x103 moléculas de WT1 ab1 por célula, traduciendo a entre 6x103 y 1,2x104 complejos péptido RMF/A2 por célula asumiendo enlace de anticuerpos monovalente o bivalente, respectivamente. Las tres líneas celulares de leucemia positivas enlazaron entre 1x103 y 2x103 moléculas WT1 ab1, o 2x103-4x103 sitios de enlace (Figura 24). Estos resultados se confirmaron por la citometría de flujo cuantitativa.
EJEMPLO 6
Enlace de WT1 ab1 con muestras de pacientes leucémicos
Investigamos luego si el WT1 ab1 es capaz de detectar el epítopo RMF en células AML primarias. El radioinmunoensayo mostró enlace significativo de WT1 AB1 con blastocitos de AML del paciente 1, que es HLA-A2 positivo y ARNm+ de WT1. El WT1 ab1 enlazó con células CD33+ y CD34+ doble positivas que representan más del 83% de las poblaciones de células completas (Figura 25). El WT1 ab1 no enlazó con células de otros 3 pacientes que son o HLA-A2 positivos pero ARNm negativos o HLA-A2 negativos. El WT1 ab1 no enlazó con PBMCs de ya sea donantes sanos HLA-A2 positivos o negativos. Los resultados se confirmaron por análisis de citometría de flujo. El WT1 AB1 no mostró enlace significativo con los blastocitos de los pacientes que eran A0201 negativos (Figura 26). Los resultados eran consistentes con los resultados obtenidos con la expresión de ARN, de las células. Estos datos confirman que el nivel de RMFp/HLA-A0201 en la superficie de células de leucemia es adecuado para permitir la reactividad con el WT1 ab1 y los niveles en células sanas WT1 negativas no son significativos.
EJEMPLO 7
El WT1 AB1 media la ADCC contra células tumorales
Se considera que la ADCC es uno de los principales mecanismos efectores de mAb terapéuticos en humanos. En presencia de PBMC humano, el WT1 ab1 medió la ADCC de PBMC dependiente de la dosis contra células T2 cargadas con péptido RMF, pero no células T2 solas o células T2 pulsadas con péptido R3 de control (Figura 27). Cabe señalar, que el WT1 ab1 fue capaz de mediar la ADCC contra el epítopo RMF presentado de forma natural por la molécula HLA-A0201 en células tumorales, como la línea celular de mesotelioma, JMN (Figura 33), y la línea celular de leucemia BV173 (Figura 34), pero no las células HLA-A2 negativas MSTO (Figura 28) o HL-60 (Figura 29). La destrucción se observo consistentemente a 1 pg/ml o por debajo de WT1 ab1 usando PBMCS como células efectoras de múltiples donantes sanos. Cabe señalar, que elWTI ab1 también destruyó blastocitos A-0201 positivos primarios que eran positivos para el enlace de WT1 ab1, pero no los blastocitos que eran HLA-A0201 negativos (Figura 30). Estos resultados demostraron que WT1 ab1 media la ADCC específica contra células que expresan de manera natural RMF y el complejo HLA-A0201 a niveles fisiológicos así como en líneas celulares. EJEMPLO 8
El WT1 AB1 elimina células de leucemia humanas en ratones NSG
Se probó la eficacia del WT1 ab1 in vivo en ratones NOD SCID gamma (NSG) xenoinjertados intravenosamente 6 días antes con leucemia linfoblástica aguda positiva en BV173 bcr/abl. En el momento del tratamiento, los ratones tenían leucemia en su hígado, bazo, y BM visible por formación de imágenes por luciferasa. Los ratones NSG carecían de células B-, T- y NK- maduras, y nosotros hipotetizamos que introduciendo células efectoras humanas (CD3‘, CD34', PBMCs) junto con tratamiento de WT1 ab1 recapitularía in vivo los efectos antitumorales mediados por ADCC observados in vitro. La inyección de efectores junto con dos dosis de 100 pg de WT1 ab1 casi extirpó el crecimiento tumoral en comparación con los controles (Figura 31). Este efecto fue duradero a lo largo del curso del experimento (Figura 3). Curiosamente, al principio de las pruebas, las células efectoras solas o combinadas con IgG de control parece que promovieron el crecimiento más rápido de leucemia en relación a ratones inyectados solamente con leucemia, demostrando que el efecto anti-tumoral no estaba relacionado con los efectores por sí mismos. Varios de los ratones a los que se les dieron efectores (con o sin mAb de control) murieron pronto en el experimento con la infiltración masiva de la BV173.
Sorprendentemente, el tratamiento con WT1 ab1 sin efectores humanos también redujo dramáticamente la carga tumoral así como el WT1 ab1 combinado con efectores durante aproximadamente 30 días (Figura 32), aunque los tumores eventualmente reincidieron mucho más rápidamente en el grupo de solo WT1 ab1, cuando se compara con el WT1 ab1 combinado con grupo de efectores (Figura 32). Confirmamos el efecto del WT1 ab1 solo y titulamos la dosificación para evaluar la potencia. El WT1 ab1 solo produjo una reducción marcada en la carga tumoral en puntos temporales tempranos en todas las dosis probadas (25-100 pg por 2 dosis). Los tumores en todos los grupos de tratamiento reincidieron lentamente después de detener la terapia con anticuerpos; y por el día 23 (13 días después de la última inyección de anticuerpos), pudo observarse significativamente mayor reincidencia del tumor en el grupo de 25 pg en comparación con el grupo de dosis de 100 pg, indicando una respuesta a la dosis a la terapia de WT1 ab1 (Figura 33). Antes del tratamiento, los ratones mostraron la mayor carga tumoral en el hígado, que fue despejado rápidamente por WT1 ab1. Tras la reincidencia, el tumor en el grupo de dosis más alta pareció desarrollarse principalmente en la médula ósea, mientras que el tumor volvió más rápidamente al hígado enratones tratados con la dosis más baja.
EJEMPLO 9
Diseño de anticuerpos para potenciar sus capacidades citotóxicas
Se construyen anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto el complejo WT1/A2 como CD3 en células T inmunes como se describe (43, 44) con un Fc de IgG1 humana. Los anticuerpos biespecíficos se espera que recluten y apunten a células T citotóxicas para células cancerosas WT1/A2 positivas, a la vez que mantienen las funciones efectoras de Fc y la vida media larga in vivo. Tres mecanismos están implicados en la destrucción específica de células cancerosas mediada por anticuerpos biespecíficos: i) destrucción por células T activadas; ii) actividad de ADCC; iii) actividad de CDC. Pueden construirse otros formatos de anticuerpos biespecíficos, como moléculas scFv en tándem (taFv), diacuerpos (Db), o diacuerpos de cadena sencilla (scDb), y proteína de fusión con albúmina de suero humano (45, 46, 47, 48), pero están vacíos de funciones efectoras de Fc con distintos perfiles farmacocinéticos.
La actividad ADCC específica de la diana de WT1/A2 se potencia expresando anticuerpos de manera recombinante en células CHO diseñadas con glicol como se describe en las patentes U.S. 8.025.879; 8.080.415 y 8.084.022. El N-glicano oligosacáridos modificado en Asn297 altera las funciones efectoras de la manera siguiente: 1) enlace de mayor afinidad con CD16/FcRIIIa para actividad de ADCC mejorada mediada por células destructoras naturales; 2) afinidad de enlace reducida con CD32b/FcRIIb, un receptor inhibidor expresado en múltiples tipos de células inmunes (excepto células NK), para actividad de ADCC mejorada mediada por células efectoras como neutrófilos y presentación de antígenos por macrófagos y células DC (50, 51, 52). Se espera que los anticuerpos potenciados logren mejor eficacia para el tratamiento contra el cáncer in vivo.
Las variantes de glicosilación (especialmente la fucosilación) de Fc de IgG pueden producirse usando células de expresión del huésped y métodos descritos en las patentes U.S. 8.025.879; 8.080.415; y 8.084.022. Brevemente, el ARN mensajero (ARNm) que codifica para la cadena pesada o ligera de los anticuerpos divulgados en la presente, se obtiene empleando técnicas estándar de purificación por aislamiento de ARN y opcionalmente aislamiento basado en el tamaño. Los ADNcs correspondientes a ARNms que codifican la cadena pesada y ligera se producen y se aíslan luego usando técnicas conocidas en la técnica, como construcción de biblioteca de ADNc, construcción de biblioteca de fagos y cribado o RT-PCR usando cebadores relevantes específicos. En algunas realizaciones, la secuencia de ADNc puede ser una que está completa o parcialmente fabricada usando técnicas de manipulación de ADN in vitro conocidas para producir un ADNc específico deseado. La secuencia de ADNc puede luego posicionarse en un vector que contiene un promotor en el marco de lectura con el gen y compatible con la células huésped modificada con fucosa baja.
Se conocen en la técnica numerosos plásmidos que contienen promotores, secuencias de control, sitios de enlace de ribosomas, y sitios de terminación de las transcripción apropiados, y opcionalmente marcadores convenientes, estos incluyen pero no están limitados a, los vectores descritos en las Patentes U.S. N° 4.663.283 y 4.456.748. En una realización, el ADNc que codifica la cadena ligera y que codifica la cadena pesada puede insertarse en plásmidos de expresión separados. En una realización alternativa, el ADNc que codifica la cadena ligera y que codifica la cadena pesada puede insertarse junto en el mismo plásmido, siempre y cuando cada uno esté bajo el promotor y el control de traducción adecuados. Los resultados se muestran en la Figura 34.
Referencias
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Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo biespecífico, que comprende:
(I) una primera porción de unión a antígeno que enlaza específicamente con WT1/HLA, que comprende: (A) una región variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 38, 39 y 40; y una región variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las SEQ ID NOS: 44, 45 y 46; o
(B) una VH y VL que comprende la primera y la segunda secuencias de aminoácidos, respectivamente, de las SEQ ID NOS: 50 y 52; o
(C) la SEQ ID NO: 54; y
(II) una segunda porción de unión a antígeno que enlaza específicamente con CD3.
2. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc de IgG1 humano.
3. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo biespecífico es un scFv en tándem (taFv), un diacuerpo (Db), un diacuerpo de cadena sencilla (scDb), o una proteína de fusión con albúmina de suero humano.
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