JP7394058B2 - 新規抗原結合部分の特異性試験のためのユニバーサルレポーター細胞アッセイ - Google Patents

新規抗原結合部分の特異性試験のためのユニバーサルレポーター細胞アッセイ Download PDF

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Description

本発明の分野
本発明は、一般に、細胞培養を使用する特異性アッセイ、特に、異なるフォーマットで新規抗原結合部分を試験するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞アッセイに関する。さらに、本発明は、抗原結合分子の認識ドメインに特異的に結合することができる標的抗原結合部分を含む操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）でトランスフェクト／形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の使用に関する。本発明はまた、候補抗原結合部分及び／又は操作されたＣＡＲを発現する核酸分子及びベクターの特異性試験のための方法及びキットに関する。
化学療法は、現在まで、がんに対して最も一般的に使用されている治療法の１つである。さらに、抗体ベースの治療法は過去１５年にわたって進化しており、現在、血液悪性腫瘍及び固形腫瘍の治療における化学療法アプローチの価値ある組み合わせ又は代替治療法となっている。化学療法とは異なり、抗体療法はがん細胞上の特異的抗原を標的とするため、より部位特異的な治療が可能となり、それによって健常組織への副作用が軽減される。抗体ベースの治療試薬を開発するプロセスにおいては、臨床試験に持ち込み、最終的に市場に出すための最良の候補を同定するために、様々なアッセイが必要である。最初の前臨床段階では、抗体を作製し、その標的特異性、並びに標的への親和性について分析する必要がある。
結合特性は、ＦＲＥＴに基づく方法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などの様々な蛋白質‐蛋白質相互作用アッセイを用いて分析することができる。しかしながら、利用可能なアッセイ形式は、常にｉｎ ｖｉｖｏの状況を包括的かつ統合的に再現するとは限らない。例えば、細胞表面受容体に結合する治療用抗体でがん細胞を標的化することは、表面分子の結合及び架橋を介した細胞内シグナル伝達、並びに免疫細胞に結合するための腫瘍細胞のマーキングなど、複数のレベルで影響を与え得る。さらに、抗原結合からエフェクター機能、例えばＴ細胞細胞毒性の確立までの認識カスケードは、抗原結合部位の結合親和性がいくつかの要因のうちの一つである細胞表面相互作用の十分に調整された順序を必要とする。したがって、単純なタンパク質－タンパク質親和性相互作用アッセイは、これらのアッセイは早期候補開発のための非常に貴重なツールではあるが、全体像をもたらさない可能性がある。
結論として、標的－抗体結合に対する非特異的影響を可能な限り最小限に抑えるより包括的なセットアップにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏの状況をより厳密に模倣する結合アッセイを開発する必要性が残されている。さらに、抗体治療分子の開発プロセスの初期段階で結合性及び機能性の評価を可能にする組み合せアッセイを設計することは、非常に有益であろう。
本発明の発明者らは、抗体の標的への結合を評価するために、多種多様な異なるがん細胞型に適用可能な新規アッセイを開発した。革新的なアッセイには、レポーター細胞として修飾されたＴ細胞が含まれ、簡単な読み取りと包括的かつ包含的な結果を組み合わせている。
さらに、本発明は、抗体及び抗体様構築物（例えば、リガンド）の結合性及び機能性の評価を組み合わせたアッセイを提供する。新規アッセイは、例えば、ハイスループット形式での治療用抗体薬物候補のスクリーニング又は特徴づけの目的に有用である。
この新しいアッセイは、天然の標的への抗体結合の初期及び後期スクリーニングと特性評価、並びに薬物候補の開発の初期段階で最適なバインダーを同定することを可能にするであろう機能性を評価するための貴重なツールとなる。
本発明の要約
本発明は、一般に、特に薬物開発プロセスにおいて、新規抗原結合部分を選択する方法に関し、例えば腫瘍細胞上の標的抗原への結合の評価と、抗体－標的結合に応答したＴ細胞の活性化とを組み合わせる。提供されるのは、以下の工程：
ａ）抗原結合ドメイン及び認識ドメインを含む抗原結合分子を提供する工程、ここで、抗原結合ドメインは抗原結合部分を含み、抗原結合部分は標的抗原に特異的である；
ｂ）抗原結合分子を、表面上に標的抗原を含む標的細胞、特に標的細胞ががん細胞である標的細胞と接触させる工程；
ｃ）抗原結合分子を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞と接触させる工程、ここで、レポーターＣＡＲ－Ｔ細胞は、
ｉ．認識ドメインに特異的に結合することができるＣＡＲであって、抗原結合部分が応答エレメントに作動可能に連結されているＣＡＲ；
ｉｉ．応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子
を含む；及び
ｄ）抗原結合部分の特異性を確立するためにレポーター遺伝子の発現を決定することによってＴ細胞活性化を決定する工程
を含む、抗原結合部分の特異性を評価するための方法である。
一実施態様において、認識ドメインは免疫グロブリンドメインである。
一実施態様において、認識ドメインはＦｃドメインである。
一実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
一実施態様において、Ｆｃドメインは変異Ｆｃドメインであり、ここで、変異Ｆｃドメインは、非変異親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、ＣＡＲは、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるが、非変異親Ｆｃドメインに特異的に結合することができない。
一実施態様において、変異Ｆｃドメインは、ＥＵ番号付けによるＬ２３４、Ｌ２３５、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｐ３３１、Ｐ３２９及びＨ４３５からなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、特に、アミノ酸変異はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｐ３２９Ｇ及び／又はＨ４３５Ａである。
一実施態様において、変異Ｆｃドメインは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む。
一実施態様において、変異Ｆｃドメインは、ＥＵ番号付けによるＩ２５３、Ｈ３１０、及びＨ４３５からなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸変異、特にアミノ酸変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（「ＡＡＡ」）を含む。
一実施態様において、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、特にファージディスプレイライブラリースクリーニングに由来するＦａｂ断片である。
一実施態様において、ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内刺激シグナル伝達及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
一実施態様において、抗原結合部分の標的抗原への結合及びレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原結合部分を含む抗原結合分子への結合は、細胞内シグナル伝達及び／又は共シグナル伝達ドメインの活性化をもたらす。
一実施態様において、細胞内シグナル伝達及び／又は共シグナル伝達ドメインの活性化は、応答エレメントの活性化をもたらす。
一実施態様において、応答エレメントは、レポーター遺伝子の発現を制御する。
一実施態様において、応答エレメントの活性化は、レポーター遺伝子の発現をもたらす。
一実施態様において、応答エレメントは、ＮＦＡＴ経路、ＮＦ－κＢ経路又はＡＰ－１経路の一部である。
一実施態様において、レポーター遺伝子は、発光タンパク質、特に蛍光タンパク質をコードしている。
一実施態様において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はルシフェラーゼをコードしている。
一実施態様において、標的抗原は細胞表面受容体である。
一実施態様において、標的抗原は、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＴＹＲＰ、ＥＧＦＲ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＷＴ１及びＦｏｌＲ１からなる群から選択される。
一実施態様において、標的抗原は、ヒト主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドである。
一実施態様において、抗原結合部分は、Ｔ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である。
一実施態様において、方法は、追加的に、
ｅ）レポーター遺伝子の発現を参照と比較する工程
を含む。
一実施態様において、参照は、標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現である。
一実施態様において、標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の発現は、標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、又は１００００倍高い。
一実施態様において、方法は、追加的に、
ｆ）標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現と比較して、標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の発現が所定の閾値よりも高い場合、新規抗原結合部分を選択する工程
を含む。
一実施態様において、閾値は、２、３、４、５、１０、１００、１０００、又は１００００である。
一実施態様において、標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の高レベルの発現及び標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の低レベルの発現は、抗原結合部分の高特異性を示す。一実施態様において、標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の高レベルの発現及び標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の低レベルの発現は、抗原結合部分を含むＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の高特異性を示す。
一実施態様において、方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法である
一実施態様において、ＴＣＢ抗体を生成するための方法であって、ＴＣＢ抗体フォーマットが、標的抗原に特異的な第１の抗原結合部分と、Ｔ細胞活性化受容体に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分とを含み、ここで、第１の抗原結合部分が、本明細書に記載の方法に従って選択される、方法が提供される。
一実施態様において、Ｔ細胞活性化受容体はＣＤ３である。
図１は、本発明に従って使用される例示的ＣＡＲの構造を示す。図１Ａに、抗ＰＰ３２９Ｇ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤフォーマット及び抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤフォーマットの構造を示す。Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが示されている。抗原結合部分は、可変重鎖及び可変軽鎖からなる。両者は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーによって連結されている。可変軽鎖に結合したＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーが、抗原認識ドメインを、ＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）に融合されたＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＴＭ）と連結し、次にそのＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）は、ＣＤ３ｚの刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）に融合される。図１Ｂは、抗Ｐ３２９Ｇ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ及び抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤフォーマットの構造を示す。示されるのは、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインである。抗原結合部分はＩｇ重鎖断片とＩｇ軽鎖からなる。重鎖に結合したＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーが、抗原認識ドメインを、ＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ２８膜貫通ドメインと連結し、次にそのＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚの刺激シグナル伝達ドメインに融合される。 図２は、本発明に従って使用されるＣＡＲをコードする例示的な発現構築物のモジュール構成を図示する略図を示す。図２Ａは、Ｐ３９２Ｇ標的ｓｃＦｖフォーマットを示す。図２Ｂは、Ｐ３９２Ｇ標的Ｆａｂフォーマットを示す。 図３は、本発明に従って使用される抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲによって認識される、ＦｃドメインにおいてＰ３２９Ｇ変異を有する例示的なＩｇＧ１分子を示す。 図４は、Ｐ３２９Ｇ変異を有する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合ＩｇＧの略図を示す。この抗体は、次に、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ発現Ｔ細胞によって認識され得、それによって、Ｔ細胞が活性化される。 図５は、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイの略図を示す。Ｐ３２９Ｇ変異を有するＴＡＡ結合ＩｇＧは、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＴ細胞によって認識され得る。この認識は細胞の活性化につながり、発光（ｃｐｓ）を測定することによって検出できる。 図６は、標的細胞としてＣＤ２０発現ＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞レポーターアッセイを示す。Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＣＤ２０ ＩｇＧ抗体（ＧＡ１０１）が使用され、これは、一方では腫瘍関連抗原を認識し、他方ではＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される。図６Ａでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図６Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図７は、標的細胞としてＣＤ２０腫瘍細胞を使用したＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、本発明に従って使用されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される、Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＣＤ２０ ＩｇＧ抗体（ＧＡ１０１）が使用された。図７Ａでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の単一クローン５をレポーター細胞として使用し、ＷＳＵＤＬＣＬ２細胞を腫瘍細胞として使用した。図７Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の単一のクローン２をレポーター細胞として使用し、ＷＳＵＤＬＣＬ２細胞を腫瘍細胞として使用した。図７Ｃでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の単一クローン５をレポーター細胞として使用し、ＳＵＤＨＬ４細胞を腫瘍細胞として使用した。図７Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の単一クローン２をレポーター細胞として使用し、ＳＵＤＨＬ４を腫瘍細胞として使用した。 図８は、標的細胞として付着性ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ ｃ１１９腫瘍細胞を使用して行われたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識されるＰ３２９Ｇ変異を有する抗ＦＡＰ ＩｇＧ抗体クローン４Ｂ９が使用された。Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図８Ａでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｃでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図８は、標的細胞として付着性ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ ｃ１１９腫瘍細胞を使用して行われたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識されるＰ３２９Ｇ変異を有する抗ＦＡＰ ＩｇＧ抗体クローン４Ｂ９が使用された。Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図８Ａでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｃでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図８は、標的細胞として付着性ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ ｃ１１９腫瘍細胞を使用して行われたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識されるＰ３２９Ｇ変異を有する抗ＦＡＰ ＩｇＧ抗体クローン４Ｂ９が使用された。Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図８Ａでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｃでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図８は、標的細胞として付着性ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ ｃ１１９腫瘍細胞を使用して行われたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識されるＰ３２９Ｇ変異を有する抗ＦＡＰ ＩｇＧ抗体クローン４Ｂ９が使用された。Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図８Ａでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｃでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図８Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図９は、標的細胞として付着性ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される、抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンＡ５Ｂ７又は抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンＴ８４ ＬＣＨＡ（両方ともＰ３２９Ｇ変異を有する）のいずれかが使用された。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図９Ａ及び図９Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図９Ｃ及び図９Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図９は、標的細胞として付着性ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される、抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンＡ５Ｂ７又は抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンＴ８４ ＬＣＨＡ（両方ともＰ３２９Ｇ変異を有する）のいずれかが使用された。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図９Ａ及び図９Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図９Ｃ及び図９Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図９は、標的細胞として付着性ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される、抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンＡ５Ｂ７又は抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンＴ８４ ＬＣＨＡ（両方ともＰ３２９Ｇ変異を有する）のいずれかが使用された。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図９Ａ及び図９Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図９Ｃ及び図９Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図９は、標的細胞として付着性ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される、抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンＡ５Ｂ７又は抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンＴ８４ ＬＣＨＡ（両方ともＰ３２９Ｇ変異を有する）のいずれかが使用された。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図９Ａ及び図９Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図９Ｃ及び図９Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図１０は、標的細胞として付着性ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される、抗ＣＥＡクローンＣＨ１Ａ１Ａ ９８ ９９又は抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンｈＭＮ１４ ＩｇＧ（両方ともＰ３２９Ｇ変異を有する）のいずれかが使用された。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図１０Ａ及び図１０Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ 発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図１０Ｃ及び図１０Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図１０は、標的細胞として付着性ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される、抗ＣＥＡクローンＣＨ１Ａ１Ａ ９８ ９９又は抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンｈＭＮ１４ ＩｇＧ（両方ともＰ３２９Ｇ変異を有する）のいずれかが使用された。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図１０Ａ及び図１０Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ 発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図１０Ｃ及び図１０Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図１０は、標的細胞として付着性ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される、抗ＣＥＡクローンＣＨ１Ａ１Ａ ９８ ９９又は抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンｈＭＮ１４ ＩｇＧ（両方ともＰ３２９Ｇ変異を有する）のいずれかが使用された。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図１０Ａ及び図１０Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ 発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図１０Ｃ及び図１０Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図１０は、標的細胞として付着性ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される、抗ＣＥＡクローンＣＨ１Ａ１Ａ ９８ ９９又は抗ＣＥＡ ＩｇＧクローンｈＭＮ１４ ＩｇＧ（両方ともＰ３２９Ｇ変異を有する）のいずれかが使用された。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図１０Ａ及び図１０Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ 発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図１０Ｃ及び図１０Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図１１は、標的細胞として付着性ＴＮＣ発現ＣＴ２６ＴＮＣ ｃｌ １９腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＴＮＣ ＩｇＧクローンＡ２Ｂ１０を、腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識されるＩｇＧ抗体として使用した。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図１１Ａ及び図１１Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ 発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図１１Ｃ及び図１１Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図１１は、標的細胞として付着性ＴＮＣ発現ＣＴ２６ＴＮＣ ｃｌ １９腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＴＮＣ ＩｇＧクローンＡ２Ｂ１０を、腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識されるＩｇＧ抗体として使用した。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図１１Ａ及び図１１Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ 発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図１１Ｃ及び図１１Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図１１は、標的細胞として付着性ＴＮＣ発現ＣＴ２６ＴＮＣ ｃｌ １９腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＴＮＣ ＩｇＧクローンＡ２Ｂ１０を、腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識されるＩｇＧ抗体として使用した。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図１１Ａ及び図１１Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ 発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図１１Ｃ及び図１１Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図１１は、標的細胞として付着性ＴＮＣ発現ＣＴ２６ＴＮＣ ｃｌ １９腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＴＮＣ ＩｇＧクローンＡ２Ｂ１０を、腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識されるＩｇＧ抗体として使用した。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。図１１Ａ及び図１１Ｂでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ 発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。図１１Ｃ及び図１１Ｄでは、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図１２Ａ及び図１２Ｂは、標的細胞として付着性ＴＮＣ発現ＣＴ２６ＴＮＣ ｃｌ １９腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される、Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＴＮＣ ＩｇＧクローンＡ２Ｂ１０を使用した。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。抗Ｐ３２９Ｇ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図１２Ａ及び図１２Ｂは、標的細胞として付着性ＴＮＣ発現ＣＴ２６ＴＮＣ ｃｌ １９腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される、Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＴＮＣ ＩｇＧクローンＡ２Ｂ１０を使用した。さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。抗Ｐ３２９Ｇ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールをレポーター細胞として使用した。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、ＲＭＦペプチド又はＶＬＤペプチドでパルスされたＴ２細胞を用いたＦＡＣＳによるＷＴ１／ＨＬＡバインダー５Ｅ１１及び３３Ｈ０９の特異性の評価を示す。 図１４Ａから図１４Ｄは、ＲＭＦ又はＶＬＤペプチドでパルスされたＴ２細胞に対する、ＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１－ペプチド結合ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧ変異体による、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲ－ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を示す。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールを使用した。各副図は、特定のバインダー（３３Ｆ０５、１１Ｄ０６、３３Ｈ０９及び５Ｅ１１）の希釈物を表す。ＲＭＦペプチド（標的）対ＶＬＤペプチド（標的外）におけるシグナルの比較は、活性化の特異性を評価するのに役立つ。 図１５Ａから図１５Ｆは、ＲＭＦペプチドパルスＴ２細胞へのＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ Ｄ４３ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧ変異体の結合を示す。各副図は、元のＤ４３ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧと比較した単一ａａ（Ｅ７５４、Ｓ５６１、Ｓ５７１、Ｇ７１２、Ｇ７１１、Ｅ３５３及びＩ３５２）の変異体の群を表す。グラフのｙ軸の値は、ＰＧＬＡＬＡを認識するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞におけるルシフェラーゼの相対発光検出を示す。 図１５Ａから図１５Ｆは、ＲＭＦペプチドパルスＴ２細胞へのＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ Ｄ４３ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧ変異体の結合を示す。各副図は、元のＤ４３ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧと比較した単一ａａ（Ｅ７５４、Ｓ５６１、Ｓ５７１、Ｇ７１２、Ｇ７１１、Ｅ３５３及びＩ３５２）の変異体の群を表す。グラフのｙ軸の値は、ＰＧＬＡＬＡを認識するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞におけるルシフェラーゼの相対発光検出を示す。 図１５Ａから図１５Ｆは、ＲＭＦペプチドパルスＴ２細胞へのＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ Ｄ４３ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧ変異体の結合を示す。各副図は、元のＤ４３ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧと比較した単一ａａ（Ｅ７５４、Ｓ５６１、Ｓ５７１、Ｇ７１２、Ｇ７１１、Ｅ３５３及びＩ３５２）の変異体の群を表す。グラフのｙ軸の値は、ＰＧＬＡＬＡを認識するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞におけるルシフェラーゼの相対発光検出を示す。 図１６は、ＲＭＦペプチド又はＶＬＤペプチドでパルスされたＴ２細胞とのインキュベーション時に、選択されたＷＴ１／ＨＬＡ－Ａ２バインダー３３Ｆ０５、３３Ｈ０９、１１Ｄ０６及び５Ｅ１１の特異性を評価するために、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲ－ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を示す。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞を使用する陰性対照には、非パルスＴ２細胞、Ｔ２細胞なし、又はＩｇＧなしのＣＡＲ－Ｔ細胞が含まれる。その後、ルシフェラーゼ基質を添加して発光を測定することにより、活性化（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞からのルシフェラーゼシグナル）を測定した。
詳細な説明
定義
用語は、以下で特に定義されない限り、当該技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞の溶解を導く免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にはＦｃ領域のＮ末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣの低減」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞の数の減少、及び／又は、ＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の増加のいずれかと定義される。ＡＤＣＣの低減は、同じ標準的な産生、精製、製剤化、及び貯蔵方法（当業者に公知であるもの）を使用して、同じ型の宿主細胞により産生される同じ抗体であるが、変異されていないものによって媒介されるＡＤＣＣとの比較である。例えば、そのＦｃドメインにＡＤＣＣを低減させるアミノ酸変異を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低減は、このアミノ酸変異をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号を参照）。
薬剤（例えば、抗体）の「有効量」とは、それが投与される細胞又は組織における生理学的変化をもたらすのに必要な量を指す。
「親和性」は、分子（例えば受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗原結合部分と抗原及び／又は受容体とそのリガンド）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に解離定数（ＫＤ）によって表すことができ、これは解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆとｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、等価な親和性が異なる速度定数を含むことがある。親和性は、本明細書に記載されたものを含む、当該技術分野で公知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための好ましい方法は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）であり、測定のための好ましい温度は２５℃である。
用語「アミノ酸」（「ａａ」）は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式において機能する化学的化合物を指す。アミノ酸は、それらの一般的に知られている３文字記号によって、又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号によって、本明細書中で参照され得る。
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入、及び修飾の任意の組み合わせを、最終構築物が所望の特性、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減を保持するという条件で、最終構築物に到達させるために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変化させる目的で、非保存的アミノ酸置換、すなわち、異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で１つのアミノ酸を置換することは特に好ましい。アミノ酸置換には、非天然アミノ酸による置換、又は２０の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体（例、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）による置換が含まれる。アミノ酸変異は、当該技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。化学修飾のような遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を改変する方法も有用であり得ると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために様々な名称が使用される場合がある。例えば、Ｆｃドメインの３２９位のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示すことができる。
本明細書中の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を包含する。したがって、本発明の文脈では、抗体という用語は、免疫グロブリン分子全体並びにそのような免疫グロブリン分子の一部に関するものである。さらに、この用語は、本明細書で考察されるように、修飾された及び／又は改変された抗体分子、特に、変異した抗体分子に関する。また、この用語は、組換え的又は合成的に生成／合成された抗体にも関係する。本発明の文脈において、抗体という用語は、免疫グロブリンという用語と互換的に使用される。
「抗体断片」とは、インタクトな抗体以外の分子であって、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部を含むものを指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、 Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照のこと）。抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。
本明細書中で使用される用語「抗原結合分子」及び略称「ＡＢＭ」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。ＡＢＭの例は、抗体／免疫グロブリン及び誘導体、例えば、それらの断片である。さらに、この用語は、本明細書で考察されるように、修飾された及び／又は改変されたＡＢＭ、特に、変異された抗体分子に関する。また、この用語は、組換え的又は合成的に生成／合成された抗体にも関係する。本発明の文脈では、ＡＢＭは、好ましくは抗体又はその断片である。
本明細書で使用される用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様において、抗原結合部分は、それが結合している実体（例えば、免疫グロブリン又はＣＡＲ）を標的部位に、例えば抗原決定基を保有する特定の型の腫瘍細胞又は腫瘍間質に、又は腫瘍細胞上の抗原決定基に結合する免疫グロブリンに方向づけることができる。別の実施態様において、抗原結合部分は、その標的抗原を介してシグナル伝達を活性化することができ、例えば、シグナル伝達は、抗原決定基がＴ細胞上のＣＡＲに結合すると活性化される。本発明の文脈では、抗原結合部分は、抗体及びその断片、並びに本明細書でさらに定義されるような抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）及びその断片に含まれ得る。抗原結合部分は、例えば免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含む。「候補抗原結合部分」又は「ＣＡＢＭ」は、本明細書に記載の方法に従って評価される抗原結合部分である。
本発明の文脈では、用語「抗原結合受容体」は、アンカー膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む抗原結合分子に関する。抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）は、異なる供給源からのポリペプチド部分から作製することができる。したがって、それは「融合タンパク質」及び／又は「キメラタンパク質」としても理解され得る。通常、融合タンパク質は、もともと別々のタンパク質をコードしていた２つ以上の遺伝子（又は好ましくはｃＤＮＡ）が結合することによって作り出されるタンパク質である。この融合遺伝子（又は融合ｃＤＮＡ）の翻訳は、好ましくは元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一ポリペプチドを生じる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究又は治療に使用するための組換えＤＮＡ技術によって人工的に作製される。本発明の文脈では、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）は、スペーサー配列によって、それ自体がＣＤ３ｚ及びＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインに融合しているアンカー膜貫通ドメインに融合した抗原結合部分を含む細胞外部分を含む抗原結合受容体であると理解される。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体又はＣＡＲの抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。天然の免疫グロブリン分子は、典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ分子は、典型的には単一の抗原結合部位を有する。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全部と相補的である領域を含む抗体又は抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の免疫グロブリン可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。特に、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原との結合に関与する免疫グロブリン重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co, page 91 (2007)を参照のこと。抗原結合特異性を付与するには通常、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
本明細書で使用される用語「ＡＴＤ」は、細胞の細胞膜に組み込むことができるポリペプチド伸長を規定する「アンカー膜貫通ドメイン」を指す。ＡＴＤは、さらなる細胞外及び／又は細胞内ポリペプチドドメインに融合され得、これらの細胞外及び／又は細胞内ポリペプチドドメインは、同様に細胞膜に限定されるであろう。本発明で使用されるような抗原結合受容体の文脈では、ＡＴＤは、抗原結合受容体、例えば本発明に従って使用されるＣＡＲの膜付着及び限局を付与する。
本発明に従って使用される抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）の文脈において使用される「結合する」という用語は、「抗原相互作用部位」と抗原との結合（相互作用）を定義する。用語「抗原相互作用部位」は、特定の抗原又は特定の抗原群（すなわち、変異したＦｃドメイン）との特異的相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを定義する。前記結合／相互作用は、「特異的認識」を定義するためにも理解される。用語「特異的に認識する」とは、本発明によれば、抗原結合受容体が、認識ドメイン、すなわち本明細書で定義される修飾分子と特異的に相互作用及び／又は結合することが可能であるが、非修飾分子は認識されないことを意味する。抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）の抗原結合部分は、同一分子上の異なるエピトープを認識し、相互作用し、かつ／又は結合することができる。この用語は、抗原結合受容体の特異性、すなわち、本明細書で定義されるように、修飾された分子の特定の領域、すなわち、変異したＦｃドメインを識別するその能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば、抗原を含むポリペプチドのコンフォメーションの変化、抗原を含むポリペプチドのオリゴマー化、抗原結合受容体のオリゴマー化などの誘導に起因して、シグナルの開始をもたらし得る。したがって、抗原相互作用部位のアミノ酸配列中の特異的モチーフと抗原は、それらの一次、二次又は三次構造の結果として、並びに前記構造の二次修飾の結果として、互いに結合する。したがって、結合という用語は、線状エピトープに関係するだけでなく、コンホメーションエピトープ、構造エピトープ、又は標的分子の２つの領域又はその一部からなる不連続エピトープにも関係し得る。この発明の文脈では、コンホメーションエピトープは、ポリペプチドが天然タンパク質に折りたたまれるときに分子の表面上で一緒になる、一次配列において分離された２つ以上の別個のアミノ酸配列によって定義される（Sela, Science 166 (1969), 1365 and Laver, Cell 61 (1990), 553-536）。さらに、用語「に結合する」とは、本発明の文脈において、用語「と相互作用する」と互換的に使用される。ＣＡＲ又は抗体の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖドメイン）が特定の標的抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えばＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様において、無関係なタンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、特にＳＰＲによって測定されるように、標的抗原への抗原結合部分の結合の約１０％未満である。特定の実施態様において、標的抗原に結合する抗原結合部分は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍから１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。本発明に従って使用される用語「特異的結合」は、本発明で使用される分子が、類似構造の（ポリ）ペプチド、すなわち、非変異親Ｆｃドメインと交差反応しない、又は本質的に交差反応しないことを意味する。したがって、本発明に従って使用される抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）は、認識ドメイン、例えば、Ｆｃドメイン、好ましくは変異Ｆｃドメインに特異的に結合／相互作用する。調査中の構築物のパネルの交差反応性は、例えば、従来の条件下での抗原結合部分のパネルの、目的の認識ドメイン、例えば、Ｆｃドメイン及び親の非変異Ｆｃドメインへの結合を評価することにより試験することができる（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)及びUsing Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)を参照）。目的のドメインに結合するが、構造的に密接に関連するドメイン、例えば、非変異親Ｆｃドメインには結合しない、又は本質的に結合しない構築物（Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖなど）のみが、目的の認識ドメインに特異的であると見なされ、本明細書で提供される方法に従って、さらなる研究のために選択される。これらの方法は、特に、構造的に及び／又は機能的に密接に関連したドメインとの結合試験、ブロッキング試験及び競合試験を含み得る。結合試験には、ＦＡＣＳ分析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）による）、分析的超遠心、等温滴定熱量測定、蛍光異方性、蛍光分光法、又は放射性標識リガンド結合アッセイも含まれる。
本明細書で使用される用語「ＣＤＲ」は、当該技術分野で周知である「相補的決定領域」に関する。ＣＤＲは、前記分子の特異性を決定し、特定のリガンドと接触させる免疫グロブリン又は抗原結合受容体の一部である。ＣＤＲは分子の中で最も可変性の高い部分であり、これらの分子の抗原結合の多様性に寄与している。各Ｖドメインには３つのＣＤＲ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が存在する。ＣＤＲ－Ｈは可変重鎖のＣＤＲ領域を示し、ＣＤＲ－Ｌは可変軽鎖のＣＤＲ領域に関連する。ＶＨは可変重鎖を意味し、ＶＬは可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来領域のＣＤＲ領域は、「Ｋａｂａｔ」（Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th edit. NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services (1991); Chothia J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917）又は「Ｃｈｏｔｈｉａ」（Nature 342 (1989), 877-883）に記載されているように決定することができる。
用語「ＣＤ３ｚ」は、「Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖」及び「ＣＤ２４７」としても知られる、Ｔ細胞表面糖蛋白質ＣＤ３ゼータ鎖を指す。
用語「キメラ抗原受容体」又は「キメラ受容体」又は「ＣＡＲ」は、スペーサー配列によって細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ｚ及びＣＤ２８）に融合された抗原結合部分（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ）の細胞外部分から構成される抗原結合受容体を指す。用語「ＣＡＲ」は、その最も広い形態で理解され、任意で１つ又はいくつかのペプチドリンカーを介して、ＣＤ３ｚ及びその断片並びにＣＤ２８及びその断片に融合した抗原結合部分を含む細胞外部分から構成される抗原結合受容体を含む。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「クロスオーバーＦａｂ分子」（「ｃｒｏｓｓＦａｂ」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも呼ばれる）とは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ分子を意味し、すなわち、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、軽鎖可変領域及び重鎖定常領域から構成されるペプチド鎖、並びに重鎖可変領域及び軽鎖定常領域から構成されるペプチド鎖を含む。明確にするために、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域が交換されているｃｒｏｓｓＦａｂ断片において、重鎖定常領域を含むペプチド鎖は、本明細書では、クロスオーバーＦａｂ分子の重鎖と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているｃｒｏｓｓＦａｂ断片において、重鎖可変領域を含むペプチド鎖は、本明細書において、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片の重鎖と呼ばれる。したがって、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、重鎖可変領域及び軽鎖定常領域（ＶＨ－ＣＬ）から構成される重鎖又は軽鎖と、軽鎖可変領域及び重鎖定常領域（ＶＬ－ＣＨ１）から構成される重鎖又は軽鎖とを含む。それとは対照的に、「Ｆａｂ」又は「従来のＦａｂ分子」とは、その天然フォーマットにおけるＦａｂ分子、すなわち、重鎖可変領域及び定常領域（ＶＨ－ＣＨ１）から構成される重鎖と、軽鎖可変領域及び定常領域（ＶＬ－ＣＬ）から構成される軽鎖とを含むＦａｂ分子を意味する。
本明細書中で使用される用語「ＣＳＤ」は、共刺激シグナル伝達ドメインを指す。
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
本明細書において使用される「操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）」、「操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」、「操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」などの用語は、ペプチド骨格のいずれかの操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはその断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、並びにこれらのアプローチの組み合わせが含まれる。
用語「発現カセット」とは、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、数ある配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。
「Ｆａｂ分子」は、抗原結合分子の重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６、又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に及ぶように定義される。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在する場合も存在しない場合もある。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれる「ＥＵ番号付け」システムに従う。本明細書中で使用されるＦｃドメインのサブユニットは、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定な自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）において以下の配列に現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
用語「完全長抗体」は、２つの「完全長抗体重鎖」及び２つの「完全長抗体軽鎖」からなる抗体を意味する。「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）（ＶＨ－ＣＨ１－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３と略される）；任意選択で、サブクラスＩｇＥの抗体の場合、抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）からなるポリペプチドである。好ましくは、「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２及びＣＨ３からなるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドであり、ＶＬ－ＣＬと略される。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）又はλ（ラムダ）であり得る。２つの完全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間、及び完全長抗体重鎖のヒンジ領域の間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して互いに連結されている。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥのような天然抗体である。本発明により使用される完全長抗体は、単一種、例えばヒト由来であり得るか、又はそれらはキメラ化若しくはヒト化抗体であり得る。いくつかの実施態様において、本発明に従って使用される完全長抗体、すなわち、変異Ｆｃドメインを含む抗体は、ＶＨ及びＶＬの対によってそれぞれ形成される２つの抗原結合部位を含み、これらはいずれも同じ抗原に特異的に結合する。さらなる態様において、本発明に従って使用される完全長抗体は、各々がＶＨ及びＶＬの対によって形成される２つの抗原結合部位を含み、ここで、２つの抗原結合部位は、異なる抗原に結合し、例えば、抗体は二重特異性である。前記完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端は、前記重鎖又は軽鎖のＣ末端の最後のアミノ酸を示す。
「融合した」とは、複数の成分（例えば、Ｆａｂ及び膜貫通ドメイン）が、ペプチド結合によって、直接的に、又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介して、連結されることを意味する。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらは初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明に従って使用される抗体を生成するために使用することができる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞等の哺乳動物の培養細胞、又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれるだけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、かつ／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然の４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を有し、かつ／又は抗原認識に関与している。ＶＨ中のＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して本明細書では互換的に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)及びChothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体及び／又は抗原結合受容体又はその変異体のＣＤＲを指す定義のいずれかの適用は、本明細書で定義され、使用される用語の範囲内であることを意図している。上記で引用した参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを含む適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表１に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変わるであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかを日常的に決定することができる。
Figure 0007394058000001
１表１における全てのＣＤＲの定義の番号付けは、Ｋａｂａｔらによって記載される番号付け規則に従う。（下を参照のこと）。
２表Ａにおいて使用されている小文字の「ｂ」を含む「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデル化ソフトウエアによって定義されるＣＤＲを指す。
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムを定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、このＫａｂａｔ番号付けのシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用されるＫａｂａｔ番号付けは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗原結合部分の可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。配列表のポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って番号付けされてはいない。しかしながら、配列表の配列の番号付けをＫａｂａｔ番号付けに変換することは、十分に当業者の通常の技術の範囲内である。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、通常そのポリヌクレオチド分子を含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は染色体外に、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖型及びマイナス鎖型、及び二重鎖型を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの調節エレメントであり得るか、又はそれらを含み得る。
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチド配列がその参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに５個までの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がその参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドを欠失させるか又は別のヌクレオチドで置換しても良く、又は参照配列に含まれる全てのヌクレオチドの最大５％までの複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はそれらの末端位置の間の任意の場所で、参照配列中の残基の間に個別に散在して、又は参照配列内部の１つ又は複数の連続する群において散在して生じ得る。実際的な問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて後述するもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて、従来法で決定することができる。
「単離されたポリペプチド」又はその変異体若しくは誘導体によって、その自然環境にはないポリペプチドが意図される。特定のレベルの精製は必要ではない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然環境から除去することができる。宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって分離され、分画され、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されたと見なされる。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントン Ｄ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ－２は、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムで使用するためにコンパイルする必要がある。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、そのプログラムのＡとＢとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチドに含まれるプリン塩基及びピリミジン塩基を含む塩基の配列に関し、それにより、前記塩基は、核酸分子の一次構造を表す。ここで、核酸分子という用語は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを含む。さらに、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む。さらに、本明細書に記載の核酸分子は、当業者に容易に理解されるように、非天然又は誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。
本明細書中で使用される「ＮＦＡＴ」は、「活性化Ｔ細胞の核因子」を指し、これはほとんどの免疫細胞において発現される転写因子のファミリーである。ＮＦＡＴファミリーの転写因子の活性化はカルシウムシグナル伝達に依存している。一例として、Ｔ細胞シナプスを介するＴ細胞活性化は、カルシウム流入をもたらす。細胞内カルシウム濃度が上昇すると、カルシウム感受性ホスファターゼであるカルシニューリンが活性化され、ＮＦＡＴタンパク質のアミノ末端のセリンリッチ領域（ＳＲＲ）とＳＰリピートが急速に脱リン酸化される。その結果、ＮＦＡＴの核内移行と標的遺伝子の活性化を促進する核局在化シグナルを露出する立体構造変化が生じる。
本明細書中で使用される「ＮＦＡＴ経路」とは、転写因子のＮＦＡＴファミリーのメンバーの活性の調節を導く刺激を指す。ＮＦＡＴ ＤＮＡエレメントは当該技術分野で公知であり、本明細書では「ＮＦＡＴ経路の応答エレメント」とも呼ばれる。したがって、「ＮＦＡＴ経路の受容体」は、ＮＦＡＴの活性の調節を誘発することができる受容体を指す。「ＮＦＡＴ経路の受容体」の例は、例えば、Ｔ細胞受容体及びＢ細胞受容体である。
本明細書で使用される「ＮＦ－κＢ」は、「活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー」を指し、アポトーシス、ウイルス複製、腫瘍発生、様々な自己免疫疾患及び炎症反応のメディエーターをコードする多くの遺伝子の調節に関与する転写因子である。ＮＦκＢはほとんど全ての真核細胞に存在する。一般に、抑制性のカッパＢ（ＩκＢ）タンパク質と複合体を形成するため、不活性状態で細胞質ゾルに位置している。リガンドが膜内在性受容体（「ＮＦ－κＢ経路の受容体」とも呼ばれる）に結合することにより、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）が活性化される。ＩＫＫは２つのキナーゼと１つの調節サブユニットからなる酵素複合体である。この複合体はＩκＢタンパク質をリン酸化し、それがユビキチン化を導き、したがってプロテアソームによるこれらのタンパク質の分解を導く。最後に、遊離ＮＦκＢは活性状態にあり、核に移行し、κＢ ＤＮＡエレメントに結合し、標的遺伝子の転写を誘導する。
本明細書中で使用される「ＮＦ－κＢ経路」とは、ＮＦ－κＢの活性の調節を導く刺激を指す。例えば、リガンド又は抗体のいずれかの結合によるＴｏｌｌ様受容体シグナル伝達、ＴＮＦ受容体シグナル伝達、Ｔ細胞受容体及びＢ細胞受容体シグナル伝達の活性化は、ＮＦ－κＢの活性化をもたらす。その後、リン酸化されたＮＦ－κＢ二量体はκＢ ＤＮＡエレメントに結合し、標的遺伝子の転写を誘導する。κＢ ＤＮＡエレメントは、当該技術分野で公知であり、本明細書では「ＮＦ－κＢ経路の応答エレメント」とも呼ばれる。したがって、「ＮＦ－κＢ経路の受容体」とは、ＮＦ－κＢの活性の調節を誘発することができる受容体を指す「ＮＦ－κＢ経路の受容体」の例は、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＮＦ受容体、Ｔ細胞受容体及びＢ細胞受容体である。
本明細書で使用される「ＡＰ－１」は「アクチベータータンパク質１」を指し、分化、増殖、及びアポトーシスを含む多くの細胞プロセスに関与する転写因子である。ＡＰ－１の機能は、ＡＰ－１二量体に寄与する特異的なＦｏｓサブユニットとＪｕｎサブユニットに依存している。ＡＰ－１は、パリンドロームＤＮＡモチーフ（５’－ＴＧＡ Ｇ／Ｃ ＴＣＡ－３’）に結合して遺伝子発現を調節する。
用語「薬学的組成物」は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である付加的成分を含まない調製物を指す。薬学的組成物は、通常、１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む。
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される担体は、バッファー、添加物、安定剤、又は防腐剤を含むが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結された単量体（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、産物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、ポリペプチドの定義の中に含まれ、ポリペプチドという用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、又はこれらの用語のいずれかと互換的に使用され得る。ポリペプチドという用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、又は組換え技術によって生成され得るが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されるとは限らない。化学合成を含め、どのような方法で生成されてもよい。本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、又は２０００個以上のアミノ酸のサイズであってもよい。ポリペプチドは、定義された三次元構造をもつことがあるが、必ずしもそうした構造をもっているわけではない。定義された３次元構造を持つポリペプチドは、折りたたまれていると言われ、定義された３次元構造を持たず、むしろ多数の異なるコンフォメーションをとることができるポリペプチドは、折りたたまれていないと言われる。
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
用語「固有の蛍光を有するタンパク質」とは、タンパク質内の内部アミノ酸の環化及び酸化を介して、又は蛍光性補助因子の酵素的付加を介して、高度に蛍光性で固有の発色団を形成することができるタンパク質を指す。用語「固有の蛍光を有するタンパク質」には、野生型の蛍光タンパク質及び変化したスペクトル又は物理的特性を示す変異体が含まれる。この用語には、タンパク質内の非修飾チロシン、トリプトファン、ヒスチジン及びフェニルアラニン基の蛍光の寄与のみによって弱い蛍光を示すタンパク質は含まれない。固有の蛍光を有するタンパク質は、当該技術分野で公知であり、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Heim et al. 1994, 1996）、ＣＦＰとして知られる青緑色蛍光変異体（Heim et al. 1996; Tsien 1998）；ＹＦＰとして知られる黄色蛍光変異体（Ormo et al. 1996; Wachter et al. 1998）；サファイアとして知られる紫色で励起可能な緑色蛍光変異体（Tsien 1998; Zapata-Hommer et al. 2003）；高感度緑色蛍光タンパク質又はＥＧＦＰとして知られる青緑色で励起可能な緑色蛍光変異体（Yang et al. 1996）であり、例えば、生細胞イメージング（例えば、インキュサイト）又は蛍光分光光度法によって測定することができる。
例えば「Ｆｃ受容体への結合の低下」などの「結合の低下」は、例えばＳＰＲによって測定される、それぞれの相互作用に対する親和性の低下を指す。明確にするために、この用語には、親和性をゼロ（又は分析方法の検出限界未満）に下げること、すなわち相互作用の完全な消失も含まれる。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を意味する。
用語「調節配列」は、それらが連結されているコード配列の発現をもたらすために必要なＤＮＡ配列を指す。このような制御配列の性質は生物によって異なる。原核生物では、制御配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターが含まれる。真核生物では、一般に、制御配列には、プロモーター、ターミネーターが含まれ、場合によっては、エンハンサー、トランスアクチベーター又は転写因子が含まれる。用語「制御配列」は、少なくとも、その存在が発現に必要である全ての成分を含むことを意図しており、また、付加的な有利な成分も含み得る。
本明細書中で使用される「レポーター遺伝子」は、その発現がアッセイされ得る遺伝子を意味する。１つの好ましい実施態様において、「レポーター遺伝子」は、その産生及び検出が、試験される抗体又はリガンドの活性を間接的に検出するための代替物として使用されるタンパク質をコードする遺伝子である。レポータータンパク質は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質である。好ましくは、レポーター遺伝子は、その触媒活性が簡単なアッセイ法によって検出できる酵素、又は最小限の試料調製を必要とする簡単で迅速なアッセイでレポーター遺伝子の発現を検出できるように固有の蛍光若しくは発光などの特性を有するタンパク質をコードする。触媒活性を検出できる酵素の非限定的な例は、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼである。ルシフェラーゼは、分子量（ＭＷ）６１ｋＤａの単量体酵素である。それは触媒として機能し、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びＭｇ２＋の存在下でＤ－ルシフェリンをルシフェリルアデニル酸に変換することができる。さらに、副産物としてピロリン酸（ＰＰｉ）とアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）が生成される。次いで中間体のルシフェリルアデニル酸は酸化されてオキシルシフェリン、二酸化炭素（ＣＯ２）及び光になる。オキシルシフェリンは生物発光産物であり、反応から放出される光によってルミノメーターで定量的に測定できる。ルシフェラーゼレポーターアッセイは市販されており、当該技術分野で公知である（例えば、ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム及びＯＮＥ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム）。
「応答エレメント」とは、特定の転写因子結合エレメント、又は特定の転写因子の結合時に活性化又は発現停止され得るシス作用エレメントを指す。一実施態様において、応答エレメントは、転写因子結合時にレポーター遺伝子の発現を駆動する、最小プロモーター（例えば、ＴＡＴＡボックスプロモーター）の上流に位置するシス作用エンハンサーエレメントである。
本明細書で使用される用語「単鎖」は、ペプチド結合によって直線的に連結されたアミノ酸単量体を含む分子を指す。特定の実施態様において、抗原結合部分の１つは、ｓｃＦｖ断片、すなわち、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨドメインとＶＬドメインである。特定の実施態様において、抗原結合部分の１つは、単鎖Ｆａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖がペプチドリンカーによって連結されて単一のペプチド鎖を形成するＦａｂ分子である。特定のこのような実施態様において、単鎖Ｆａｂ分子において、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に連結されている。
本明細書中で使用される用語「ＳＳＤ」は、刺激シグナル伝達ドメインを指す。
本明細書で用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。
本明細書中で使用される用語「標的抗原決定基」は、「標的抗原」、「標的エピトープ」及び「標的細胞抗原」と同義であり、抗体が結合し、抗原結合部分－抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位（例えば、連続するひと続きのアミノ酸又は不連続アミノ酸の異なる領域から形成される立体構造配置）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見いだすことができる。本明細書で抗原と呼ばれるタンパク質（例えば、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＦＡＰ、ＴＮＣ）は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）のような哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施態様において、標的抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定の標的タンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理の標的タンパク質、並びに標的細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態の標的タンパク質を包含する。この用語は、標的タンパク質の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。抗原として有用な例示的なヒト標的タンパク質は、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＦＡＰ、ＴＮＣ、ＭＳＬＮ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２を含むが、これらに限定されない。
変異Ｆｃドメインを含む抗体は、１、２、３又はそれ以上の結合ドメインを有し、単一特異性、二重特異性又は多重特異性であり得る。抗体は、単一種からの完全長であっても、キメラ化又はヒト化されていてもよい。２つ以上の抗原結合ドメインを有する抗体の場合、いくつかの結合ドメインは同一であり、かつ／又は同じ特異性を有することができる。
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」とは、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つ又は複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、本明細書中に記載される技術分野において公知である。
本発明によれば、用語「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は、当該技術分野で一般的に公知である。特に、本明細書では、用語「Ｔ細胞受容体」は、以下の３つの基準が満たされていることを条件として、任意のＴ細胞受容体を指す：（ｉ）腫瘍特異性、（ｉｉ）（ほとんどの）腫瘍細胞の認識（これは、抗原又は標的が（ほとんどの）腫瘍細胞において発現していなければならないことを意味する）、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲが治療される対象のＨＬＡ型に一致すること。この文脈において、上記の３つの基準を満たす適切なＴ細胞受容体は、ＮＹ－ＥＳＯ－１を認識する受容体（配列情報については、例えば、ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９２４を参照のこと）及び／又はＨＥＲ２ｎｅｕ（配列情報については、ＷＯ－Ａ１ ２０１１／０２８０８９４を参照のこと）など、当該技術分野において公知である。主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子は、内因性抗原からＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞にペプチドを提示するため、ＭＨＣペプチド複合体は免疫療法アプローチの適切な標的である。ＭＨＣペプチド複合体は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって標的化することができる。しかしながら、ほとんどのＴＣＲは、免疫療法には親和性が低すぎる可能性があるが、一方、ＴＣＲ特異的な高親和性結合部分は有益であろう。この目的に向かって、例えば、ファージディスプレイライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）を生成し、本明細書にさらに記載されるように、このようなライブラリーをスクリーニングすることによって、ＴＣＲ様特異性を有する高親和性可溶性抗体分子を生成することができる。本明細書においてＴＣＲ様特異性を有するこれらの可溶性抗原結合部分、例えばｓｃＦｖ又はＦａｂは、「Ｔ細胞受容体様抗原結合部分」又は「ＴＣＲＬ抗原結合部分」と呼ばれる。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、必要な投与量及び期間において、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、減少させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現構築物」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。いったん発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様において、本発明の発現ベクターは、本発明の抗原結合受容体又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
この文脈において、特に標的細胞に接触したときのレポーター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化に関連して、その特異性に応じたさらなる開発のために、新規抗原結合部分を選択するための方法、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ法が本明細書に提供される。本明細書に記載の方法及びアッセイにおいて、抗原結合部分は、標的細胞、特にがん細胞とレポーター細胞、特にＴ細胞との間の接触を媒介する。この文脈において、本明細書に記載の方法は、優れた特異性を有する候補抗原結合部分（ＣＡＢＭ）を選択するために有用である。したがって、一実施態様において、以下の工程：
ａ）抗原結合ドメイン及び認識ドメインを含む抗原結合分子を提供する工程、ここで、抗原結合ドメインは抗原結合部分を含み、抗原結合部分は標的抗原に特異的である；
ｂ）抗原結合分子を、表面上に標的抗原を含む標的細胞、特に標的細胞ががん細胞である標的細胞と接触させる工程；
ｃ）抗原結合分子を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞と接触させる工程、ここで、レポーターＣＡＲ－Ｔ細胞は、
ｉ）認識ドメインに特異的に結合することができるＣＡＲであって、抗原結合部分が応答エレメントに作動可能に連結されているＣＡＲ；
ｉｉ）応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子
を含む；及び
ｄ）抗原結合部分の特異性を確立するためにレポーター遺伝子の発現を決定することによってＴ細胞活性化を決定する工程
を含む、抗原結合部分の特異性を評価するための方法が提供される。
この文脈において、本明細書に記載の方法についてさらに記載され、使用されるのは、候補抗原結合部分を含むＡＢＭの認識ドメインに特異的に結合することができる抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）である。認識ドメインは、抗原結合部分によって認識され得るタンパク質ドメインへの安定した折りたたみが可能な任意のポリペプチドドメインであり得る。特定の実施態様において、認識ドメインは免疫グロブリンドメインである。免疫グロブリンは、典型的には、安定した折りたたみが可能な可変ドメイン及び定常ドメインを含み、ここで可変ドメインは、標的抗原に対する免疫グロブリン分子の特異性を付与する。したがって、可変ドメインは、最高度の配列変動を有する、免疫グロブリンの一部である。一方、定常ドメインは、同じクラスの免疫グロブリン間の最小変動の部分であり、したがって、本発明の文脈において、本発明のアッセイ形式のための認識ドメインとして使用することができる。
本発明はさらに、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞及び不死化細胞株、例えばＪｕｒｋａｔ細胞の、本明細書に記載のＣＡＲによる形質導入及び使用、並びに、認識ドメイン、好ましくはＦｃドメイン、例えば本明細書に記載の変異Ｆｃドメインを含む、抗原結合分子、例えば候補治療用抗体によるそれらの標的化動員を記載する。一実施態様において、抗体は、腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に特異的に結合することができる。
本明細書に記載のＴ細胞ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、理論に拘束されることなく、例えばＴ細胞に結合する治療用抗体（例えば、Ｔ細胞二重特異性抗体）が遭遇するか又はそれらと遭遇するｉｎ ｖｉｖｏの状況によりよく似ているため、本発明のアプローチは従来の結合アッセイよりも大きな利点を有する。
したがって、本発明は、抗体、特に抗原結合部分を含むＩｇＧタイプの抗体を使用して、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）のためのガイダンスとして標的細胞（例えば、腫瘍細胞）をマークする（ｍａｒｋ）又は標識する（ｌａｂｅｌ）ことができ、特に、Ｔ細胞が、抗原結合部分を含む抗体によって腫瘍細胞に特異的に標的化される、汎用性のあるスクリーニングプラットフォームを提供する。ＣＡＲが認識ドメインに結合し、抗原結合部分を含む抗原結合部分が腫瘍細胞の表面上の標的抗原に結合した後、レポーターＴ細胞が活性化され、そこで活性化が、例えば蛍光シグナル又は発光シグナルの読み出しによって測定され得る。プラットホームは、多様な新たに開発された抗原結合部分の使用、又は異なる抗原特異性を有するが同一の認識ドメインを含む複数の抗体の同時適用を可能にすることにより、柔軟かつ特異的である。
本発明によれば、ＡＢＭは、抗原結合ドメイン及び認識ドメインを含む。認識ドメインは、認識ドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分によって特異的に認識することができる。好ましい実施態様において、認識ドメインは断片結晶化可能（Ｆｃ）領域である。特定の実施態様において、認識ドメインはＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一実施態様において、認識ドメインはヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。さらなる実施態様において、認識ドメインは、例えば、ＥＵ番号付けに従ってＬ２３４、Ｌ２３５、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｐ３３１、Ｐ３２９及びＨ４３５からなる群から選択される位置に変異を含む、変異Ｆｃドメインである。そのような実施態様では、本明細書で提供される抗原結合部分は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるが、親の非変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができず、それにより、変異Ｆｃドメインと非変異Ｆｃドメインを識別することができる。
本発明の文脈において、ＣＡＲは、Ｔ細胞内又はＴ細胞上に天然に存在しない細胞外ドメインを含む。したがって、ＣＡＲは、認識ドメイン、例えば、本発明によるスクリーニングに使用される治療用抗体フォーマットのＦｃドメインに適合した結合特異性を提供することができる。ＣＡＲで形質導入され、本発明に従って使用される細胞、例えばＴ細胞は、認識ドメインに特異的に結合することができるようになる。認識ドメインに対する特異性は、ＣＡＲの細胞外ドメインの抗原結合部分によってもたらされる。
したがって、本発明はまた、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲの使用に関し、ここで、少なくとも１つの抗原結合部分は、親の非変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができない。このような実施態様において、ＣＡＲは、抗原結合分子、例えば抗体の変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる。好ましい実施態様において、変異Ｆｃドメインは、非変異親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様において、変異ＦｃドメインによるＦｃ受容体結合は、非変異ＦｃドメインによるＦｃ受容体結合と比較して減少する。
したがって、ＣＡＲは、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるが、非変異親Ｆｃドメインに特異的に結合することはできず、ここで、変異Ｆｃドメインは、非変異親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
認識ドメイン、例えば、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分は、例えば、哺乳動物の免疫系の免疫化により生成され得る。このような方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Methods in Molecular Biology 295:1-12 (2005)に記載されている。あるいは、所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、所望の活性の抗原結合部分を単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする方法は、例えば、Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 (2016)に概説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗原結合部分についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法が、当該技術分野で公知である。このような方法は、例えば、Frenzel et al. in mAbs 8:1177-1194 (2016)； Bazan et al. in Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012)及びZhao et al. in Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)、並びにHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に概説されており、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554； Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)； Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)及びMarks and Bradbury in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003).；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが別々にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングされ、ファージライブラリー中でランダムに再結合され、その後、Winter et al. in Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)に記載されているように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片として、抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性抗原結合部分を提供する。あるいは、Griffiths et al. in EMBO Journal 12: 725-734 (1993)により記述されるように、ナイーブなレパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）、免疫化なしで広範囲の非自己及び自己抗原に対する抗原結合部分の単一起源を提供することができる。最後に、Hoogenboom and Winter in Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)に記載されるように、ナイーブライブラリーは、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して非常に可変性の高いＣＤＲ３領域をコード化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再配列を達成することによって、合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、例えば、米国特許第５７５０３７３号；７９８５８４０号；７７８５９０３号及び８６７９４９０号、並びに米国特許公開番号第２００５／００７９５７４号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０２３７７６４号及び第２００７／０２９２９３６号、及び第２００９／０００２３６０号が挙げられる。所望の活性を有する抗原結合部分についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当該技術分野で公知の方法のさらなる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞における抗体ディスプレイ及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイの方法については、例えば、Scholler et al. in Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012)及びCherf et al. in Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015)並びにZhao et al. in Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)に概説されている。リボソームディスプレイの方法は、例えば、He et al. in Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997)及びHanes et al. in PNAS 94:4937-4942 (1997)に記載されている。
本発明の一態様において、本明細書で提供されるのは、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含むＣＡＲの使用である。そのようなＣＡＲを発現する形質導入細胞、例えば、Ｔ細胞は、抗原結合分子の、すなわち、治療用抗体の変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる。Ｆｃドメインは、抗原結合分子、例えば治療用抗体に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期及び良好な組織－血液分布比を含む好ましい薬物動態特性を付与する。しかし同時に、それは、好適な抗原保有細胞よりもむしろ、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する治療用抗体の望ましくない標的化を導く可能性がある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化は、サイトカイン放出を導き、それはサイトカイン受容体の過剰な活性化及び治療用抗体の全身投与に対する重度の副作用をもたらす可能性がある。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体を有する）免疫細胞の活性化は、免疫細胞の潜在的破壊による治療用抗体の効力を低下させることさえある。したがって、当該技術分野で公知の抗体フォーマットを、例えば天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示すように操作又は変異させることができる。本発明は、とりわけ、治療的に意味のある抗原結合分子フォーマットにおける新規抗原結合部分の特異性を評価するための簡単なスクリーニングプラットフォームを提供した。本発明による方法は、ハイスループットアッセイ形式において、既知又は潜在的なエフェクター細胞の活性化カスケードの関連する細胞成分及び分子成分を統合する。
本発明の例示的な実施態様において、概念の証明として、アミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲ、及び前記ＣＡＲを発現するレポーター細胞（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞）の使用が提供される。Ｐ３２９Ｇ変異は、Ｆｃγ受容体への結合及び関連するエフェクター機能を低下させる。したがって、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインは、非変異Ｆｃドメインと比較して親和性が低下又は消失した状態でＦｃγ受容体に結合する。
しかしながら、変異Ｆｃドメインを含み、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）への結合及び／又はエフェクター機能が低減し、改良され、又は減少している抗体は、当該技術分野で広く使用されている。したがって、本明細書に記載されるのは、変異Ｆｃドメインを含む抗体に特異的に結合することができるＣＡＲであり、このような抗体は、本明細書では標的抗体とも呼ばれる。したがって、一実施態様において、本発明で使用されるＣＡＲは、Ｆｃ受容体への低減した結合親和性及び／又は低減したエフェクター機能を有する変異Ｆｃドメインを含む標的抗体に対して特異的に結合することができる。低減したエフェクター機能を有する標的抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ又は複数の変異を有するものが挙げられる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの変異を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含めた、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上において変異を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。特定の実施態様において、ＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸変異、例えばＦｃ領域の２９８位、３３３位、及び／又は３３４位での変異（ＥＵの残基番号付け）を有するＦｃ領域を含む抗体変異体に対して特異的に結合することができるＣＡＲが提供される。特定の実施態様において、標的抗体変異体は、ＦｃＲｎ結合を低減又は減少させる１つ又は複数のアミノ酸変異、例えばＦｃ領域の２５３位、及び／又は３１０位、及び／又は４３５位の変異（ＥＵの残基番号付け）を有するＦｃ領域を含む。特定の実施態様において、標的抗体変異体は、２５３、３１０及び４３５位にアミノ酸変異を有するＦｃ領域を含む。一実施態様において、変異は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域におけるＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａである。例えば、Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508を参照のこと。
特定の実施態様において、ＦｃＲｎ結合を低減又は減少させる、１つ又は複数のアミノ酸変異、例えば、Ｆｃ領域の３１０位及び／又は４３３位及び／又は４３６位の１つにおける変異（ＥＵの残基番号付け）を有するＦｃ領域を含む抗体変異体に対して特異的に結合することができるＣＡＲが使用される。特定の実施態様において、標的抗体変異体は、３１０、４３３及び４３６位にアミノ酸変異を有するＦｃ領域を含む。一実施態様において、変異は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域におけるＨ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａである。特定の実施態様において、標的抗体変異体は、ＦｃＲｎ結合を増加させる１つ又は複数のアミノ酸変異、例えばＦｃ領域の２５２位、及び／又は２５４位、及び／又は２５６位の変異（ＥＵの残基番号付け）を有するＦｃ領域を含む。特定の実施態様において、標的抗体変異体は、２５２、２５４及び２５６位にアミノ酸変異を有するＦｃ領域を含む。一実施態様において、変異は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域におけるＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅである。特定の実施態様において、ＦｃγＲ結合を減少させるアミノ酸変異、例えばＦｃ領域の２３４位、２３５位及び３２９位での変異（ＥＵの残基番号付け）を有するＦｃ領域を含む抗体変異体に対して特異的に結合することができるＣＡＲが使用される。一実施態様において、変異は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。特定の実施態様において、標的抗体変異体は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域においてＤ２６５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇをさらに含む。一実施態様において、変異は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域におけるＰ３２９Ｇ（「ＰＧ」）である。別の実施態様において、変異は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域におけるＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（「ＡＡＡ」）である。
一実施態様において、ＣＡＲは、安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなる変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる。一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ４、Ｆｃドメインである。一実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。一実施態様において、変異Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示す。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。
１つの好ましい実施態様において、１つ又は複数のアミノ酸変異は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ番号付け）の群から選択される１つ又は複数の位置にある。特定の一実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能への結合を低減させる３つのアミノ酸変異を含み、前記アミノ酸変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである。一つの特定の実施態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様において、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
特定の実施態様において、ＣＡＲは、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含み、ここで、少なくとも１つの抗原結合部分は、親の非変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができず、ここで、変異Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｐ３３１、Ｐ３２９及びＨ４３５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸の置換を含み、特に、アミノ酸変異は、非変異親Ｆｃドメインと比較して、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｐ３２９Ｇ及び／又はＨ４３５Ａである。一実施態様において、変異ＦｃドメインによるＦｃ受容体結合は、非変異ＦｃドメインによるＦｃ受容体結合と比較して低減する。１つの好ましい実施態様において、アミノ酸変異はＰ３２９Ｇであり、２５℃でのＳＰＲによって測定すると、Ｆｃγ受容体への結合が低減している。さらなる実施態様において、アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａであり、ここで、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合は、２５℃でのＳＰＲによって測定すると低減している。
特定の実施態様において、変異Ｆｃドメインは、Ｐ３２９Ｇ変異を含む。Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインは、非変異Ｆｃドメインと比較して低減又は消失した親和性でＦｃγ受容体に結合する。
一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４、配列番号５及び配列番号６の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに配列番号４、配列番号５及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲを含む。
１つの好ましい実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、
（ａ）ＲＹＷＭＮの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号１）；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤのＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列（配列番号２）；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳのＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列（配列番号３）
を含む重鎖可変領域；
及び、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮの軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号４）；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰのＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列（配列番号５）；
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶのＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列（配列番号６）
を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号８及び配列番号３２から選択されるアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９及び配列番号３３から選択されるアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号８及び配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９及び配列番号３３から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
１つの好ましい実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一実施態様において、少なくとも１つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ又はｓｃＦａｂ断片である。一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。好ましい実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号４０の重鎖及び配列番号４１の軽鎖を含むＦａｂ断片を含む。
一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦｖ断片を含み、ここで、前記可変ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に以下の立体配置：ａ）ＶＨリンカー－ＶＬ又はｂ）ＶＬリンカー－ＶＨのうちの１つを有する。好ましい実施態様において、ｓｃＦｖ断片は、立体配置ＶＨ－リンカー－ＶＬを有する。
好ましい実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を含む。
代替の特定の実施態様において、変異Ｆｃドメインは、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（「ＡＡＡ」）変異を含む。ＡＡＡ変異は新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を低減させる。したがって、ＡＡＡ変異を含む変異Ｆｃドメインは、非変異Ｆｃドメインと比較して、低減又は消失した親和性でＦｃＲｎに結合する。
一実施態様において、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに配列番号５６、配列番号５７及び配列番号５８の軽鎖ＣＤＲを含む。
好ましい実施態様において、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、
（ａ）ＳＹＧＭＳの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号５３）；
（ｂ）ＳＳＧＧＳＹのＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列（配列番号５４）；
（ｃ）ＬＧＭＩＴＴＧＹＡＭＤＹのＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列（配列番号５５）
を含む重鎖可変領域；及び
（ｄ）ＲＳＳＱＴＩＶＨＳＴＧＨＴＹＬＥの軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号５６）；
（ｅ）ＫＶＳＮＲＦＳのＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列（配列番号５７）；及び
（ｆ）ＦＱＧＳＨＶＰＹＴのＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列（配列番号５８）
を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施態様において、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一実施態様において、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一実施態様において、少なくとも１つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ又はｓｃＦａｂ断片である。一実施態様において、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。特定の実施態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、ここで、Ｆａｂ断片は、配列番号６４の重鎖及び配列番号６５の軽鎖を含む。
一実施態様において、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、ｓｃＦｖ断片を含む。特定の実施態様において、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
本発明によるさらなる実施態様において、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は、単鎖Ｆａｂ断片又はｓｃＦａｂである。
Ｆａｂ及びｓｃＦａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。本明細書に記載のＦａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ、ｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ断片などの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に鎖間ジスルフィド架橋を導入することによってさらに安定化され得る。したがって、一実施態様において、本発明の抗原結合受容体に含まれるＦａｂ断片、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片及び／又はｓｃＦａｂ断片は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔの番号付けに従い可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化され得る。このような安定化された抗原結合部分は、添付の実施例及び図面内で用語「ｄｓ」によって参照される。
本発明の例示的な実施態様において、概念の証明として、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが提供され、ここで、少なくとも１つの抗原結合部分は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるが、非変異親Ｆｃドメインに特異的に結合することができず、ここで、変異Ｆｃドメインは、非変異親Ｆｃと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施態様において、抗原結合部分の少なくとも１つは、従来のＦａｂ断片、すなわち、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖からなるＦａｂ分子である。この抗原結合受容体フォーマットの特定の利点は、フォーマットを変えることなく、ライブラリー由来の抗原結合部分を直接統合できることであり、例えば、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングに由来するＦａｂ抗原バインダーは、本明細書に記載されるように、Ｆａｂ及び／又はｃｒｏｓｓＦａｂフォーマットに含めることができる。したがって、フォーマットを、例えば、ライブラリー由来のバインダーの結合特性に負に影響を及ぼし得るｓｃＦｖフォーマットに変更することなく、Ｆａｂディスプレイファージライブラリーに由来する抗原結合部分を本発明の抗原結合受容体に含めることができる。好ましい実施態様において、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、特にファージディスプレイライブラリースクリーニングに由来するＦａｂ断片である。
さらなる実施態様において、抗原結合部分の少なくとも１つは、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片、すなわち、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖からなるＦａｂ分子であり、ここで、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換される。
さらなる実施態様において、抗原結合部分の少なくとも１つは、ｓｃＦｖ断片である。特定のこのような実施態様において、ｓｃＦｖ分子において、可変重鎖（ＶＨ）のＣ末端は、任意でペプチドリンカーを介して、可変軽鎖（ＶＬ）のＮ末端に連結される。
特定の実施態様において、本明細書で使用されるＣＡＲは、認識ドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内シグナル伝達及び／又は少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲのアンカー膜貫通ドメインは、哺乳動物プロテアーゼに対する切断部位を持たないことによって特徴づけられ得る。プロテアーゼとは、プロテアーゼの切断部位を含む膜貫通ドメインのアミノ酸配列を加水分解することができるタンパク質分解酵素を指す。プロテアーゼという用語には、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方が含まれる。本発明の文脈において、特にＣＤ命名法によって定められる膜貫通タンパク質の任意のアンカー膜貫通ドメインを、認識ドメイン、例えば、本明細書中に定義されるような変異Ｆｃドメインに結合するとＴ細胞を活性化する、本発明に適切なＣＡＲを生成するために使用することができる。
したがって、本発明の文脈において、アンカー膜貫通ドメインは、ネズミ／マウス又は好ましくはヒト膜貫通ドメインの一部を含み得る。このようなアンカー膜貫通ドメインの例は、例えば、配列番号１１（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）において本明細書中に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ２８の膜貫通ドメインである。本発明の文脈において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）を含む／からなることができる。
本発明の例示的な実施態様において、概念の証明として、配列番号１０のアミノ酸配列（配列番号２２に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）を含む抗原結合部分、及び、本明細書に配列番号７１（配列番号７０に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）として示される、ＣＤ２８の断片／ポリペプチド部分（ヒトＣＤ２８のＵｎｉｐｒｏｔエントリー番号はＰ１０７４７（バージョン番号１７３及び配列のバージョン１）である）を含むＣＡＲが使用される。あるいは、特にＣＤ命名法によって提供されるように、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質が、本発明の抗原結合受容体タンパク質のアンカー膜貫通ドメインとして使用され得る。上述のように、本明細書に記載の抗原結合受容体は、配列番号７１（配列番号７０に示されるｃＤＮＡによってコードされる）に示すように、ヒト完全長ＣＤ２８タンパク質のアミノ酸１５３～１７９、１５４～１７９、１５５～１７９、１５６～１７９、１５７～１７９、１５８～１７９、１５９～１７９、１６０～１７９、１６１～１７９、１６２～１７９、１６３～１７９、１６４～１７９、１６５～１７９、１６６～１７９、１６７～１７９、１６８～１７９、１６９～１７９、１７０～１７９、１７１～１７９、１７２～１７９、１７３～１７９、１７４～１７９、１７５～１７９、１７６～１７９、１７７～１７９又は１７８～１７９に位置するＣＤ２８のアンカー膜貫通ドメインを含み得る。したがって、本発明の文脈において、アンカー膜貫通ドメインは、配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか、又はそれからなってもよい。
本明細書中に記載されるように、本発明に従って使用されるＣＡＲは、少なくとも１つの刺激シグナル伝達及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインを含む。刺激シグナル伝達及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインは、抗原結合部分を含む抗原結合分子の結合を、レポーターＣＡＲ－Ｔ細胞における細胞内シグナルに変換する。従って、本明細書に記載のＣＡＲは、好ましくは、Ｔ細胞活性化を提供する刺激シグナル伝達ドメインを含む。好ましい実施態様において、抗原結合部分の標的抗原への結合及びレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原結合部分を含む抗原結合分子への結合は、細胞内シグナル伝達及び／又は共シグナル伝達ドメインの活性化をもたらす。特定の実施態様において、本明細書に記載されたＣＡＲは、ネズミ／マウス又はヒトＣＤ３ｚ（ヒトＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０９６３（バージョン番号１７７、配列番号２；ネズミ／マウスＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２４１６１（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ９Ｄ３Ｇ３（二次引用可能アクセッション番号）、バージョン番号１４３、配列番号１））、Ｆｃｇｒ３Ａ（ヒトＦＣＧＲ３ＡのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ０８６３７（バージョン番号１７８、配列番号２））、又はＮＫＧ２Ｄ（ヒトＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６７１８（バージョン番号１５１、配列番号１））；ネズミ／マウスＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ５４７０９（バージョン番号１３２、配列番号２）である））の断片／ポリペプチド部分である刺激シグナル伝達ドメインを含む。したがって、本明細書に記載のＣＡＲに含まれる刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ、Ｆｃｇｒ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄの完全長の断片／ポリペプチド部分であり得る。ＣＤ３ｚのネズミ／マウス完全長のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号６８（配列番号６９に示されるＤＮＡ配列によってコードされるネズミ／マウス）として示されている。ヒト完全長ＣＤ３ｚのアミノ酸配列は、本明細書に配列番号６６（配列番号６７に示されるＤＮＡ配列によってコードされるヒト）として示されている。本発明に従って使用されるＣＡＲは、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれるという条件で、刺激ドメインとしてＣＤ３ｚ、Ｆｃｇｒ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄの断片を含むことができる。特に、ＣＤ３ｚ、Ｆｃｇｒ３Ａ、又はＮＫＧ２Ｄの任意の部分／断片は、少なくとも１つのシグナル伝達モチーフが含まれる限り、刺激ドメインとして適している。しかしながら、より好ましくは、ＣＡＲは、ヒト起源に由来するポリペプチドを含む。好ましくは、ＣＡＲは、本明細書に配列番号６６（ＣＤ３ｚ）として示されるアミノ酸配列（配列番号６７（ＣＤ３ｚ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされるヒト）を含む。例えば、本発明に従って使用されるＣＡＲに含まれ得るヒトＣＤ３ｚの断片／ポリペプチド部分は、配列番号７に示されるアミノ酸配列（配列番号１９に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）を含み得るか又はそれからなり得る。したがって、一実施態様において、ＣＡＲは、配列番号７に示される配列；又は配列番号７と比較して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の置換、欠失、又は挿入を有し、かつ刺激シグナル伝達活性を有することを特徴とする配列を含む。刺激シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの特定の構成が、本明細書において以下及び実施例及び図面において提供される。刺激シグナル伝達活性は、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定されるサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）放出の増強、増殖活性の増強（細胞数の増加によって測定される）、又はＬＤＨ放出アッセイによって測定される溶解活性の増強によって決定することができる。
本明細書に記載のＣＡＲは、好ましくは、レポーターＣＡＲ－Ｔ細胞に追加の活性を提供する少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書に記載のＣＡＲは、ネズミ／マウス又はヒトの以下：ＣＤ２８（ヒトＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ１０７４７（バージョン番号１７３、配列番号１）であり；ネズミ／マウスＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ３１０４１（バージョン番号１３４、配列番号２）である）、ＣＤ１３７（ヒトＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ０７０１１（バージョン番号１４５、配列番号１）であり；ネズミ／マウスＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０３３４（バージョン番号１３９、配列番号１である））、ＯＸ４０（ヒトＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２３５１０（バージョン番号１３８、配列番号１）であり；ネズミ／マウスＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ４３４８８（バージョン番号１１９、配列番号１）である）、ＩＣＯＳ（ヒトＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９Ｙ６Ｗ８（バージョン番号１２６、配列番号１）である）；ネズミ／マウスＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｑ９ＷＶ４０（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ９ＪＬ１７（二次引用可能アクセッション番号）であり、バージョン番号１０２、配列バージョンは２である））、ＣＤ２７（ヒトＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６８４２（バージョン番号１６０、配列番号２）であり；ネズミ／マウスＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ４１２７２（バージョン番号１３７、配列バージョン１）である）、４－１－ＢＢ（ネズミ／マウス４－１－ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０３３４（バージョン番号１４０、配列バージョン１）であり；ヒト４－１－ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ０７０１１（バージョン番号１４６、配列バージョン）である）、ＤＡＰ１０（ヒトＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＵＢＪ５（バージョン番号２５、配列番号１）であり；ネズミ／マウスＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＱＵＪ０（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ９Ｒ１Ｅ７（二次引用可能アクセッション番号）であり、バージョン番号１０１及び配列番号１である）又はＤＡＰ１２（ヒトＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ４３９１４（バージョン番号１４６及び配列番号１）であり）；ネズミ／マウスのＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ０５４８８５（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ９Ｒ１Ｅ７（二次引用可能アクセッション番号）であり、バージョン番号１２３及び配列番号１である）の断片／ポリペプチド部分である共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができる。本発明の特定の実施態様において、本発明に従って使用されるＣＡＲは、本明細書で定義される共刺激シグナル伝達ドメインのうちの１つ又は複数、すなわち１、２、３、４、５、６又は７つを含み得る。したがって、本発明の文脈において、ＣＡＲは、ネズミ／マウス、又は好ましくはヒトＣＤ２８の断片／ポリペプチド部分を第１の共刺激シグナル伝達ドメインとして含み、第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、ネズミ／マウス、又は好ましくはヒトＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２、又はそれらの断片からなる群から選択される。好ましくは、ＣＡＲは、ヒト起源に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。したがって、より好ましくは、本発明に従って使用されるＣＡＲに含まれる共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列（配列番号２５に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）を含み得るか又はそれからなり得る。
したがって、本明細書に記載されたＣＡＲに任意に含まれ得る共刺激シグナル伝達ドメインは、完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。ネズミ／マウス完全長ＣＤ２８のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号７３（配列番号７２に示されるＤＮＡ配列によってコードされるネズミ／マウス）として示されている。しかしながら、本発明の文脈ではヒト配列が最も好ましいので、本明細書に記載されたＣＡＲタンパク質に任意に含まれ得る共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒト完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。ヒト完全長ＣＤ２８のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号７１（配列番号７０に示されるＤＮＡ配列によってコードされるヒト）として示されている。
１つの好ましい実施態様において、ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８又はその断片を含む。本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ２８の少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれるという条件で、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８の断片を含み得る。特に、ＣＤ２８のシグナル伝達モチーフの少なくとも１つが含まれている限り、ＣＤ２８の任意の部分／断片は、本明細書に記載されているＣＡＲに適している。例えば、本発明に従って使用されるＣＡＲに含まれるＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列（配列番号２５に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）を含み得るか又はそれからなり得る。本発明において、共刺激シグナル伝達ドメインとして機能するＣＤ２８の細胞内ドメインは、配列ＹＭＮＭ（配列番号７４）及び／又は ＰＹＡＰ（配列番号７５）を有するＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含み得る。好ましくは、ＣＡＲは、ヒト起源に由来するポリペプチドを含む。例えば、ＣＡＲに含まれ得るヒトＣＤ２８の断片／ポリペプチド部分は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列（配列番号２５に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）を含み得るか又はそれからなり得る。したがって、一実施態様において、ＣＡＲは、配列番号１２に示される配列；又は配列番号１２と比較して、最大で、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、欠失、又は挿入を有し、かつ共刺激シグナル伝達活性を有することを特徴とする配列を含む。共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）を含むＣＡＲの特定の構成が、本明細書において以下及び実施例及び図面において提供される。共刺激シグナル伝達活性は、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定されるサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）放出の増強、増殖活性の増強（細胞数の増加によって測定される）、又はＬＤＨ放出アッセイによって測定される溶解活性の増強によって決定することができる。
上述のように、本発明の実施態様において、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号：Ｐ１０７４７（アクセッション番号、エントリーバージョン１７３及び配列のバージョン１））に由来することができ、形質導入Ｔ細胞のような、本明細書に記載された形質導入細胞のサイトカイン産生、増殖及び溶解活性として定義されるＣＤ２８活性を提供する。ＣＤ２８活性は、ＥＬＩＳＡによるサイトカインの放出、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）又はインターロイキン２（ＩＬ－２）などのサイトカインのフローサイトメトリー、例えば、ｋｉ６７測定により測定されるＴ細胞の増殖、フローサイトメトリーによる細胞定量、又は標的細胞のリアルタイムインピーダンス測定により評価される溶解活性（例えば、Thakur et al., Biosens Bioelectron. 35(1) (2012), 503-506； Krutzik et al., Methods Mol Biol. 699 (2011), 179-202； Ekkens et al., Infect Immun. 75(5) (2007), 2291-2296； Ge et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 99(5) (2002), 2983-2988； Duwell et al., Cell Death Differ. 21(12) (2014), 1825-1837, Erratum in: Cell Death Differ. 21(12) (2014), 161などに記載されているようにＩＣＥＬＬｌｉｇｅｎｃｅ計器などを使用ことによる）によって測定することができる。共刺激シグナル伝達ドメインＰＹＡＰ及びＹＭＮＭは、ＣＤ２８ポリペプチドの機能及び上記に挙げた機能的効果にとって有益である。ＹＭＮＭドメインのアミノ酸配列を配列番号７４に、ＰＹＡＰドメインのアミノ酸配列を配列番号７５に示す。したがって、本発明の抗原結合受容体において、ＣＤ２８ポリペプチドは、好ましくは、配列ＹＭＮＭ（配列番号７４）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号７５）を有するＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含む。これらのシグナル伝達のモチーフは、記載されたＣＡＲの細胞内ドメイン内の任意の部位に存在し得る。
さらに、本明細書に記載のＣＡＲは、少なくとも１つのリンカー（又は「スペーサー」）を含み得る。リンカーは通常、最大２０アミノ酸の長さを有するペプチドである。したがって、本発明の文脈において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸の長さを有し得る。例えば、本明細書に記載のＣＡＲは、認識ドメインへの特異的結合が可能な少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメインの間に、リンカーを含み得る。このようなリンカーは、ＣＡＲの異なるポリペプチド（すなわち、認識ドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメイン）が独立して折りたたまれ、予想通りに挙動する確率を増大させるという利点を有する。したがって、本発明の文脈において、認識ドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、哺乳動物プロテアーゼの切断部位を持たないアンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメインが、単鎖多機能ポリペプチドに含まれ得る。単鎖融合構築物は、例えば、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドからなり得る。別の実施態様において、ＣＡＲは、単鎖融合構築物ではない抗原結合部分を含み、すなわち、抗原結合部分はＦａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片である。このような実施態様において、ＣＡＲは、１つのポリペプチド鎖のみを含む単鎖融合構築物ではない。好ましくは、そのような構築物は、本明細書に記載されるような免疫グロブリン軽鎖と組み合わされた単鎖重鎖融合ポリペプチドを含むであろう。例えば、重鎖融合ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメインを含み、免疫グロブリン軽鎖と組み合わされる。したがって、抗原結合部分、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、及び刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載されるように、１つ又は複数の同一又は異なるペプチドリンカーによって連結され得る。
例えば、本明細書に記載のＣＡＲにおいて、認識ドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとアンカー膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１７に示されるアミノ酸及びアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり得る。したがって、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激ドメインは、ペプチドリンカーによって、あるいはドメインの直接融合によって、互いに連結され得る。
いくつかの実施態様において、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、これは１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された、抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ）との融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンに富み、溶解性のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結することができ、その逆も可能である。例えば、本明細書に記載のＣＡＲにおいて、リンカーは、配列番号１６に示されるアミノ酸及びアミノ酸配列を有し得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。
いくつかの実施態様において、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドである、単鎖Ｆａｂ断片又はｓｃＦａｂであり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し；ここで前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化される。
いくつかの実施態様において、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドである、クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片であり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及びｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し；ここでＶＨ及びＶＬは、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、前記リンカーは少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。
本明細書に記載のＣＡＲ又はその一部は、シグナルペプチドを含み得る。そのようなシグナルペプチドは、タンパク質をＴ細胞膜の表面に導くこととなる。例えば、本明細書に記載の抗原結合受容体において、シグナルペプチドは、配列７６に示されるようなアミノ酸及びアミノ酸配列（配列番号７７に示されるＤＮＡ配列によってコードされるもの）を有し得る。
本明細書に記載のＣＡＲの構成要素は、様々な構成で互いに融合されて、Ｔ細胞活性化ＣＡＲを生成することができる。
いくつかの実施態様において、ＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とアンカー膜貫通ドメインに連結された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とで構成される細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＶＨドメインは、Ｃ末端において、ＶＬドメインのＮ末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。他の実施態様において、ＣＡＲはさらに、刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインを含む。特定のそのような実施態様において、ＣＡＲは、本質的に、１つ又は複数のペプチドリンカーによって連結された、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、及び任意で刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端において、ＶＬドメインのＮ末端に融合され、ＶＬドメインは、Ｃ末端において、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合され、ここで、アンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端において、刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合される。任意で、ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。そのような特定の実施態様の１つにおいて、抗原結合受容体は、本質的に、１つ又は複数のペプチドリンカーで連結された、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、刺激シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端において、ＶＬドメインのＮ末端に融合され、ＶＬドメインは、Ｃ末端において、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合され、アンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端において、刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合され、刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端において、共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合される。別の実施態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、刺激シグナル伝達ドメインの代わりに、アンカー膜貫通ドメインに連結される。好ましい実施態様において、ＣＡＲは、本質的に、１つ又は複数のペプチドリンカーで連結された、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端において、ＶＬドメインのＮ末端に融合され、ＶＬドメインは、Ｃ末端において、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合され、アンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端において、共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合され、共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端において、刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合される。
好ましい実施態様において、結合部分の１つは、Ｆａｂ断片又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片である。１つの好ましい実施態様において、抗原結合部分は、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ重鎖のＣ末端で、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。別の実施態様において、抗原結合部分は、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ軽鎖のＣ末端で、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。他の実施態様において、ＣＡＲはさらに、刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインを含む。特定のそのような実施態様において、ＣＡＲは、本質的に、１つ又は複数のペプチドリンカーで連結された、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片、アンカー膜貫通ドメイン、及び任意で刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片は重鎖又は軽鎖のＣ末端において、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合され、アンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端において、刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合される。好ましくは、ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。そのような実施態様の１つにおいて、ＣＡＲは、本質的に、１つ又は複数のペプチドリンカーで連結された、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片、アンカー膜貫通ドメイン、刺激シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片は重鎖又は軽鎖のＣ末端において、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合され、刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端において、共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合される。好ましい実施態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、刺激シグナル伝達ドメインの代わりに、アンカー膜貫通ドメインに連結される。最も好ましい実施態様において、ＣＡＲは、本質的に、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、重鎖のＣ末端において、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端にペプチドリンカーを介して融合され、アンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端において、共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合され、共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端において、刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合される。
抗原結合部分、アンカー膜貫通ドメイン及び刺激シグナル伝達及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインは、直接的に、又は１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２～２０アミノ酸を含む、１つ又は複数のペプチドリンカーを介して、互いに融合され得る。ペプチドリンカーは当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられ、ここで、「ｎ」は一般的に１～１０、典型的には２～４の間の数である。抗原結合部分とアンカー膜貫通部分を連結するための好ましいペプチドリンカーは、配列番号１７によるＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）である。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）を連結するのに適した例示的なペプチドリンカーは、配列番号１６によるＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）４である。
加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特に、抗原結合部分が、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合される場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーあり又はなしで、融合され得る。
本明細書中に記載されるように、本発明に従って使用されるＣＡＲは、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。認識ドメインに対して特異的に結合することができる単一の抗原結合部分を有するＣＡＲは有用であり、特に、抗原結合受容体の高発現が必要とされる場合には好ましい。このような場合、標的細胞抗原に特異的な複数の抗原結合部分の存在は、抗原結合受容体の発現効率を制限し得る。しかしながら、他の場合には、例えば、標的部位への標的化を最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分を含むＣＡＲであることが有利であろう。
特定の実施態様において、ＣＡＲは、抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が、抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含み（すなわち、抗原結合部分は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置換されているｃｒｏｓｓＦａｂ重鎖を含む）、このポリペプチドは、次に、アンカー膜貫通ドメインとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＡＴＤ）。いくつかの実施態様において、ＣＡＲは、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。特定の実施態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合している。代替の実施態様において、ＣＡＲは、抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が、抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含み（すなわち、抗原結合部分は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置換されているｃｒｏｓｓＦａｂ重鎖を含む）、このポリペプチドは、次に、アンカー膜貫通ドメインとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＡＴＤ）。いくつかの実施態様において、ＣＡＲは、抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が、抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））をさらに含む特定の実施態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合している。
本発明による方法の文脈において、ＡＢＭを、表面上に標的抗原を含む標的細胞と接触させること、及びＡＢＭを、認識ドメインへの特異的結合が可能な抗原結合部分を含むＣＡＲと接触させることにより、本明細書に記載のレポーター遺伝子の発現をもたらす。したがって、一実施態様において、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達及び／又は共シグナル伝達ドメインの活性化は、本明細書に記載される応答エレメントの活性化をもたらす。好ましい実施態様において、応答エレメントは、レポーター遺伝子の発現を制御する。一実施態様において、抗原結合部分の標的抗原への結合時又は結合後に、ＣＡＲは、認識ドメイン、例えば変異Ｆｃドメインに結合し、応答エレメントは、本明細書に記載されるようにレポーター遺伝子の発現を活性化する。好ましい実施態様において、応答エレメントの活性化は、レポーター遺伝子の発現をもたらす。したがって、レポーター細胞（例えば、レポーターＣＡＲ－Ｔ細胞）中のレポーター遺伝子は、抗原結合部分が標的抗原に結合し、ＣＡＲが候補抗原結合部分を含む抗体の認識ドメインに結合すると発現される。一実施態様において、レポーター遺伝子の発現は、抗原結合部分の標的抗原への結合を示している。この文脈において、抗体のＣＡＲへの結合は、直接又は細胞シグナル伝達のカスケードを介してのいずれかで、応答エレメントの活性の調節をもたらす細胞応答を誘発する。応答エレメントは、転写因子等によりサイレンシング又は活性化され得るＤＮＡエレメントである。応答エレメントは、当該技術分野で公知であり、例えばレポーターベクターなどで市販されている。通常、応答エレメントはＤＮＡ反復エレメントを含み、転写因子の結合時にレポーター遺伝子の発現を駆動する最小プロモーターの上流に位置するシス作用エンハンサーエレメントである。
ＣＡＲが、認識ドメイン、例えば変異Ｆｃドメインに結合すると、応答エレメントが活性化される。一実施態様において、応答エレメントは、細胞の核に位置する核応答エレメントである。別の実施態様において、前記応答エレメントは、レポーター細胞内のプラスミド上に位置する。一実施態様において、アッセイは、レポーター細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞を、応答エレメントの制御下でレポーター遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターでトランスフェクションする予備的工程を含む。さらに、レポーター細胞は、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターでトランスフェクトすることができる。レポーター細胞は、シグナル伝達カスケードの全ての要素を含む発現ベクター、又は異なる成分を個別に発現する異なるベクターでトランスフェクトすることができる。一実施態様において、レポーター細胞は、応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子をコードするＤＮＡ配列、及び抗原結合受容体をコードするＤＮＡ配列を含む。
したがって、本明細書に記載されるように、ＣＡＲは応答エレメントに機能的に連結されている。一実施態様において、応答エレメントは、レポーター遺伝子の発現を制御する。一実施態様において、ＮＦＡＴ経路の一部、ＮＦ－κＢ経路又はＡＰ－１経路、好ましくはＮＦＡＴ経路。
一実施態様において、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子又は触媒活性を検出することができる酵素をコードする遺伝子から選択される。一実施態様において、レポーター遺伝子は、発光タンパク質、特に蛍光タンパク質をコードしている。一実施態様において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はルシフェラーゼをコードしている。さらなる実施態様において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Heim et al. 1994, 1996）、ＣＦＰとして知られる青緑色蛍光変異体（Heim et al. 1996; Tsien 1998）；ＹＦＰとして知られる黄色蛍光変異体（Ormo et al. 1996; Wachter et al. 1998）；サファイアとして知られる紫色で励起可能な緑色蛍光変異体（Tsien 1998； Zapata-Hommer et al. 2003）；高感度緑色蛍光タンパク質又はＥＧＦＰとして知られる青緑色で励起可能な緑色蛍光変異体（Yang et al. 1996）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）であり、例えば、生細胞イメージング（例えば、インキュサイト）又は蛍光分光光度法によって測定することができる。一実施態様において、触媒活性を検出することができる酵素は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼからなる群から選択される。一実施態様において、レポーター遺伝子はＧＦＰをコードしている。好ましい実施態様において、レポーター遺伝子はルシフェラーゼをコードしている。ルシフェラーゼの活性は、市販のアッセイ、例えばルシフェラーゼ１０００アッセイシステム（又はＯＮＥ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム（両方ともＰｒｏｍｅｇａ））により検出することができる。ルシフェラーゼ１０００アッセイシステムは、基質としてルシフェリンの他に補酵素Ａ（ＣｏＡ）を含み、少なくとも１分間持続する強い光強度を生じる。細胞内ルシフェラーゼをアッセイするためには、検出前に細胞を溶解することが必要である。反応の副産物として生成される光は、全可視スペクトルからルミノメーターによって収集される。本明細書に示した例では、シグナルは生成されたルシフェラーゼの量に比例し、したがって、ＮＦＡＴプロモーターの活性化の強さに比例していた。別の実施態様において、ルシフェラーゼアッセイが用いられ、ここでルシフェラーゼは細胞から分泌される。したがって、このアッセイは、細胞を溶解することなく実施することができる。
本明細書に記載されているように、レポーター遺伝子の発現は、試験されるべき抗原結合部分の結合、及びその結果として生じるＴ細胞、例えばレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化と直接相関し得る。例えば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子又はルシフェラーゼをコードする遺伝子をレポーター遺伝子として用いる場合、細胞から検出される光の量は、試験される抗原結合部分の標的抗原結合及び特異性と直接相関する。一実施態様において、抗原結合部分を含む抗原結合分子を異なる濃度で適用し、レポーター遺伝子活性化の半最大有効濃度（ＥＣ５０）を決定する。ＥＣ５０は、指定された曝露時間後のベースラインと最大値の間の中間で、抗体又はリガンドがレポーター遺伝子を活性化又は阻害する抗体又はリガンドの濃度を指す。したがって、用量反応曲線のＥＣ５０は、標的抗原に対するその最大活性化又は阻害作用の５０％が観察される抗原結合部分の濃度を表す。
一実施態様において、標的抗原は細胞表面受容体である。一実施態様において、標的抗原は、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＴＹＲＰ、ＥＧＦＲ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＷＴ１及びＦｏｌＲ１からなる群から選択される。しかしながら、標的抗原は、細胞表面上に位置するタンパク質に限定されず、一時的又は永続的に細胞内に位置するポリペプチド又はタンパク質に由来する場合もある。このような場合、細胞内ポリペプチド又はタンパク質に由来する標的抗原は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の１つ又は複数の分子によって細胞表面上に提示され得る。一実施態様において、標的抗原は、ＭＨＣの分子に結合したペプチドである。一実施態様において、ＭＨＣはヒトＭＨＣである。一実施態様において、ＭＨＣの分子に結合したペプチドは、８～１００、好ましくは８～３０、より好ましくは８～１６アミノ酸の全長を有する。一実施態様において、標的抗原は、腫瘍組織において排他的に又は主に発現されるタンパク質に由来する。一実施態様において、タンパク質は細胞内タンパク質であり、ペプチドはＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩ経路によって生成され、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ複合体によって提示される。一実施態様において、ペプチドはＭＨＣ－Ｉ経路によって生成され、ＭＨＣクラスＩ複合体によって提示される。一実施態様において、抗原結合部分は、Ｔ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である。ＴＣＲＬ抗原結合部分は、腫瘍組織において排他的又は主に発現されるペプチド抗原に特異的に結合することができ、ペプチド抗原は、細胞、特にがん細胞の表面上に位置するＭＨＣの分子に結合される。この文脈において、本発明の方法は、確立された又は新規のＴＣＲＬ抗原結合部分の特異性をハイスループットアッセイ形式で評価するのに適している。
抗原結合部分の標的抗原への結合は、質的又は定性的に、すなわち、レポーター遺伝子の発現の有無によって決定することができる；蛍光又は発光がない場合は、結合がないことを示すものである。結合及び活性化の定量的測定のために、レポーター遺伝子活性化の量を参照と比較することができる。したがって、本明細書に記載の方法は、レポーター遺伝子の発現レベルを参照と比較する工程をさらに含み得る。適切な参照は、通常、アッセイ又は方法の１つの必須構成要素を省略している、参照されたアッセイと実質的に同一である陰性対照を含む。本発明の方法では、省略された構成要素は、例えば、ＡＢＭの添加の省略、又は標的細胞の省略であり得る。代わりに、ＡＢＭの認識ドメインに結合することができない抗原結合部分を含むレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞を使用することができる。好ましい実施態様において、参照は、標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現である。特定の実施態様において、レポーター遺伝子の発現は、標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、又は１００００倍高い。
あるいは、レポーター遺伝子発現の欠如は、ある特定の閾値によって、すなわちバックグラウンドシグナルを差し引いた後に定義することができる。バックグラウンドシグナルは、通常、試験されるＡＢＭを除く全ての試薬を用いて、又は標的細胞の非存在下でアッセイを実行することによって決定される。新規抗原結合部分は、例えば、本発明の方法に従って、レポーター遺伝子発現のベースライン活性化の閾値を定義し、標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現と比較した、標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の発現レベルが所定の閾値よりも高い場合に、新規抗原結合部分を選択することによって選択することができる。したがって、本明細書に記載の方法は、標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現と比較して、標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルが所定の閾値よりも高い場合、新規抗原結合部分を選択する工程を追加的に含み得る。特定の実施態様において、閾値は、２、３、４、５、１０、１００、１０００、又は１００００である。
本明細書に記載の新規アッセイは、ロバストであり、ハイスループット形式での使用に適しており、アッセイを達成するために必要な実践的時間の観点から効率的である。さらに、本発明のアッセイは、分析される試料中の死細胞の存在を許容する。これは、抗体の結合性及び機能性が、細胞生存率又は細胞死を測定することによって決定される細胞アッセイ、例えば死滅アッセイとは対照的である。
本明細書に記載の新しいアッセイの１つのさらなる利点は、洗浄工程が必要とされないことである。試験される抗体及びレポーター細胞は、標的細胞、例えば腫瘍細胞に、いずれかの順序で又は同時に加えることができる。一実施態様において、抗体は細胞培養培地で希釈され、腫瘍試料は、適切な細胞培養フォーマット、例えば、２４ウェルプレートのウェル中又は９６ウェルプレートのウェル中で、希釈された抗体を含む細胞培養培地に加えられる。好ましくは、試験培地は、細胞が４８時間まで生存可能であるための条件を提供する培地である。好適な培地は、例に概説されているように、例えばＪｕｒｋａｔ培地である。一実施態様において、アッセイはマイクロタイタープレート中で実施される。一実施態様において、マイクロタイタープレートは、ハイスループットスクリーニングに適している。本発明のアッセイは、複数の反応の迅速な調製、処理、及び分析を可能にする任意の形式で実施することができる。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、２４ウェル、９６ウェル又は３８６ウェル）であり得る。種々の薬剤のためのストック溶液は、手動又はロボットで作製することができ、それに続く全てのピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、培養、試料の読み出し、データ収集、及び分析は、市販の分析ソフトウェア、ロボット工学、並びに蛍光シグナル及び／又は発光シグナルを検出できる検出機器を使用して、ロボットで行うことができる。
一実施態様において、２４ウェルプレートのウェルあたり約１０００００～約１００００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞が、工程ｃ）において提供される。好ましい実施態様において、２４ウェルプレートのウェルあたり約３０００００～約７０００００個の細胞又は約４０００００～約６０００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞が提供される。一実施態様において、２４ウェルプレートのウェルあたり約５０００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞が、工程ｃ）において提供される。一実施態様において、９６ウェルプレートのウェルあたり約１００００～約１０００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔが、工程ｃ）において提供される。好ましい実施態様において、９６ウェルプレートのウェルあたり約３００００～約７００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔ、又は約４００００～約６００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔが提供される。一実施態様において、９６ウェルプレートのウェルあたり約５００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔが工程ｃ）において提供される。一実施態様において、３８４ウェルプレートのウェルあたり約３０００～約３００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞が、工程ｃ）において提供される。好ましい実施態様において、３８４ウェルプレートのウェルあたり約５０００～約１５０００個の細胞又は約８０００～約１２０００個のレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞が提供される。一実施態様において、３８４ウェルプレートのウェルあたり約１００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞が、工程ｃ）において提供される。一実施態様において、細胞培養培地１ｍｌあたり約２０００００～約２００００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔが、工程ｃ）において提供される。好ましい実施態様において、細胞培養培地１ｍｌあたり約６０００００～約１４０００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔ、又は約８０００００～約１２０００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔが提供される。一実施態様において、細胞培養培地１ｍｌあたり約１００００００個のレポーターＣＡＲ－Ｔが工程ｃ）において提供される。
一実施態様において、ＡＢＭは、約０．００１μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌの最終濃度を達成するために、工程ｂ）において提供される。さらなる実施態様において、ＡＢＭは、約０．０５μｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌ又は約０．１μｇ／ｍｌ～約μ１ｇ／ｍｌの最終濃度を達成するために、工程ｂ）において提供される。さらなる実施態様において、ＡＢＭは、約０．５μｇ／ｍｌの最終濃度を達成するために、工程ｂ）において提供される。一実施態様において、ＡＢＭは、約１ｎＭ～約１０００ｎＭの最終濃度を達成するために、工程ｂ）において提供される。さらなる実施態様において、ＡＢＭは、約５ｎＭ～約２００ｎＭ又は約１０ｎＭ～約１００ｎＭの最終濃度を達成するために、工程ｂ）において提供される。さらなる実施態様において、ＡＢＭは、約５０ｎＭの最終濃度を達成するために、工程ｂ）において提供される。ＡＢＭは、細胞培養培地、例えば、実施例の項に記載されているようにＪｕｒｋａｔ培地中で希釈することができる。本明細書に記載される最終濃度に希釈されたＡＢＭは、レポーター細胞を加える前又は後に腫瘍試料に加えられる。一実施態様において、本明細書に記載される最終濃度に希釈されたＡＢＭは、レポーター細胞を加える前に腫瘍試料に加えられる。一実施態様において、腫瘍試料は、細胞培養インサート中に提供される。一実施態様において、腫瘍試料はマトリゲルに包埋される。
特定の実施態様において、本発明の方法を使用して、Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）フォーマットに含まれる新規抗原結合部分の特異性を評価することができる。本発明による方法は、本発明の方法がＴ細胞活性化を測定するため、ＴＣＢの新規抗原結合部分を評価し、選択するのに特に適している。測定された親和性がＴＣＢフォーマットにおける特異性を必ずしも反映しないことは、当該技術分野で公知であるアッセイ（例えば、結合アッセイ）の欠点である。ＴＣＢは、マイクロモル範囲の結合親和性を介して、すでにＴ細胞の活性化と死滅を媒介することができる非常に強力な分子である。したがって、新規標的抗原結合部分を含むＴＣＢは、非特異的反応性、例えば標的細胞の死滅又はアロ反応性を回避するために高度に選択的である必要がある。本発明に記載される方法は、アッセイが、Ｔ細胞活性化及び同等の作用機序に基づくものであるため、このようなフォーマットの高い要求を満たす。したがって、標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の高レベルの発現及び標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の低レベルの発現が、特に、抗原結合部分がＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体フォーマットに移される場合に、抗原結合部分の高特異性を示す、本明細書に記載の方法が提供される。さらに、ＴＣＢ抗体を生成するための方法であって、ＴＣＢ抗体フォーマットが、標的抗原に特異的な第１の抗原結合部分及びＴ細胞活性化受容体に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分を含み、ここで、第１の抗原結合部分が本明細書に記載の方法に従って選択され、すなわち、第１の抗原結合部分が本発明の方法においてアッセイされ、候補抗原結合部分として選択される、方法が提供される。好ましい実施態様において、Ｔ細胞活性化受容体は、ＣＤ３である。
このような一実施態様において、ＴＣＢ抗体は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含む。
１つの特定の実施態様において、ＴＣＢ抗体は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、かつ、配列番号１０４、配列番号１０５及び配列番号１０６の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲを含む、第２の抗原結合部分
を含む。
標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分を有するＴＣＢ抗体は、特に、高親和性抗原結合部分の結合後に標的細胞抗原の内部移行が予想される場合に有用である。そのような場合、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を増強し、それにより、その利用可能性を低下させ得る。
しかしながら、他の多くの場合、例えば標的部位への標的化を最適化するために、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分を含む二重特異性抗体を有することが有利であろう。
したがって、特定の実施態様において、ＴＣＢ抗体は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第３の抗原結合部分を含む。さらなる実施態様において、第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子、又はＦａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されるクロスオーバーＦａｂ分子である。一実施態様において、第３の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分と同じ標的細胞抗原に特異的に結合することができる。特定の実施態様において、第２の抗原結合部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができ、第１及び第３の抗原結合部分は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる。特定の実施態様において、第１及び第３の抗原結合部分は同一であり（すなわち、それらは同一のアミノ酸配列を含む）、本明細書に記載の方法に従って選択される。
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載のＣＡＲを発現することができる形質導入Ｔ細胞、すなわちレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞である。ＣＡＲは、Ｔ細胞内及び／又は表面上に本来含まれておらず、正常（非形質導入）Ｔ細胞内又は該細胞上に（内因的に）発現されていない分子に関する。したがって、本明細書に記載される、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上のＣＡＲは、Ｔ細胞に人工的に導入される。したがって、人工的に導入され、続いて、前記Ｔ細胞、例えばレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞内及び／又はその表面上に提示される本明細書に記載のＣＡＲは、（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで）（Ｉｇ由来の）免疫グロブリン、好ましくは抗体、特に抗体のＦｃドメインにアクセス可能な１つ又は複数の抗原結合部位を含むドメインを含む。本発明の文脈において、これらの人工的に導入された分子は、以下に本明細書に記載されるように、形質導入後に前記Ｔ細胞内及び／又は表面上に提示される。したがって、形質導入後、本開示によるＴ細胞は、免疫グロブリン、好ましくは、本明細書に記載されるようなＦｃドメインの特異的変異を含む（治療用）抗体によって活性化され得る。
また、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸分子によってコードされるＣＡＲを発現する形質導入Ｔ細胞にも関連する。したがって、本発明の文脈において、形質導入細胞は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸分子を含み得る。
本発明の文脈において、用語「形質導入Ｔ細胞」は、遺伝子改変されたＴ細胞（すなわち、核酸分子が意図的に導入されたＴ細胞）に関する。特に、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸分子は、レトロウイルス又はレンチウイルス形質導入を用いることにより、Ｔ細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる。ＣＡＲのこの細胞外ドメインは、本明細書に記載の抗原結合部分の完全な細胞外ドメインを含み得るが、その一部も含み得る。必要な最小サイズは、ＣＡＲにおける抗原結合部分の抗原結合部位である。ＣＡＲの細胞外部分（すなわち、抗原結合受容体の細胞外ドメイン）は細胞表面上で検出可能であり、一方、細胞内部分（すなわち、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメイン）は細胞表面上で検出不可能である。ＣＡＲの細胞外ドメインの検出は、この細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を使用することによって、又は細胞外ドメインが結合することができる認識ドメイン、例えば変異Ｆｃドメインによって行うことができる。細胞外ドメインは、フローサイトメトリー又は顕微鏡により、これらの抗体又は認識ドメインを用いて検出することができる。
形質導入細胞は、任意の免疫細胞であってもよい。これらには、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、自然リンパ球系細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、又は好中球及びそれらの不死化細胞株が含まれるが、これらに限定されない。優先的には、前記免疫細胞は、リンパ球、優先的にはＮＫ又はＴ細胞であろう。前記Ｔ細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞を含む。白血球の表面上のＣＡＲのトリガーは、細胞が由来した系統に関係なく、認識ドメイン、例えば、変異Ｆｃドメインを含む抗体、例えば、治療用抗体と組み合わせて、細胞を標的細胞に対して応答性にするであろう。活性化は、ＣＡＲのために選択された刺激シグナル伝達ドメイン又は共刺激シグナル伝達ドメインに関係なく起こり得、追加のサイトカインの外因性供給に依存しない。
形質導入細胞は、さらなる核酸分子と、例えば、本明細書に記載の応答エレメントをコードする核酸分子と同時形質導入され得る。
具体的には、本開示は、１つ又は複数のＣＡＲ及び１つ又は複数の応答エレメント及びレポーター遺伝子を発現するレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の作製方法に関し、本明細書に記載の１つ又はいくつかのベクターでＴ細胞を形質導入し、前記形質導入細胞内又は細胞上で抗原結合受容体の発現を可能にする条件下で、形質導入Ｔ細胞を培養する工程を含む。
形質導入細胞（例えば、Ｔ細胞）のための方法は、当該技術分野で公知であり、限定されるものではないが、核酸又は組換え核酸が形質導入される場合、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質法又はリポソーム法を含む。形質導入される核酸は、市販のトランスフェクション試薬、例えば、リポフェクタミン（インビトロジェン社製、カタログ番号：１１６６８０２７）を使用することにより、従来通り、効率よく形質導入することができる。ベクターが使用される場合、ベクターがプラスミドベクター（すなわち、ウイルスベクターではないベクター）である限り、ベクターは上記の核酸と同様の方法で形質導入することができる。
形質導入Ｔ細胞は、それらの自然環境の外で、制御された条件下で増殖させることが好ましい。特に、用語「培養する」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏである細胞（例えば、形質導入細胞）を意味する。細胞の培養は、元の組織源から分離された細胞を生きた状態に保つ実験室技術である。ここで、本発明に従って使用される形質導入細胞は、形質導入細胞内又は細胞上でＣＡＲの発現を可能にする条件下で培養される。（ＣＡＲ及び／又はレポーター遺伝子の）発現又は導入遺伝子を可能にする条件は、当該技術分野で一般的に公知である。
本開示のさらなる態様は、本発明に従って使用される１つ又はいくつかのＣＡＲをコードする核酸及びベクターである。核酸分子は調節配列の制御下にあってもよい。例えば、ＣＡＲの誘導された発現を可能にするプロモーター、転写エンハンサー及び／又は配列が使用され得る。本発明の文脈において、核酸分子は、構成的又は誘導可能なプロモーターの制御下で発現される。適切なプロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＵＢＣプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＰＧＫ（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＥＦ１Ａプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＣＡＧＧプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＳＶ４０プロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＣＯＰＩＡプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＡＣＴ５Ｃプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＴＲＥプロモーター（Qin et al., PLoS One. 5(5) (2010), e10611）、Ｏｃｔ３／４プロモーター（Chang et al., Molecular Therapy 9 (2004), S367-S367 (doi: 10.1016/j.ymthe.2004.06.904））、又はＮａｎｏｇプロモーター（Wu et al., Cell Res. 15(5) (2005), 317-24）である。本明細書において、ベクターという用語は、それが導入された細胞（すなわち、形質導入細胞）において自律的に複製することができる環状又は線状の核酸分子に関する。多くの適切なベクターが、分子生物学の当業者に公知であり、その選択は所望される機能に依存し、遺伝子工学において従来使用されているプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及び他のベクターが含まれる。当業者に周知の方法を用いて、様々なプラスミド及びベクターを構築することができる；例えば、Sambrook et al. (loc cit.) and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994)に記載された技術を参照のこと。あるいは、本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞への送達のためにリポソーム中に再構成され得る。以下でさらに詳細に議論するように、クローニングベクターを使用して、ＤＮＡの個々の配列を単離した。関連する配列を、特定のポリペプチドの発現が必要とされる発現ベクターに移入することができる。典型的なクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＡ１８及びｐＧＢＴ９が含まれる。典型的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが含まれる。
本発明の文脈において、ベクターはポリシストロニックであり得る。このような調節配列（制御エレメント）は、当業者に公知であり、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、翻訳、及びベクターに挿入物を導入するための挿入部位を含み得る。本発明の文脈において、前記核酸分子は、真核細胞又は原核細胞における発現を可能にする前記発現制御配列に作動可能に連結されている。前記ベクターは、本明細書で定義されるＣＡＲをコードする核酸分子を含む発現ベクターであることが想定される。作動可能に連結されているとは、そのように記載された構成要素が、それらが意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好適に使用されることは当業者にとって明らかである。
本発明の文脈において、列挙されたベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、選択された細胞を形質転換するために使用することができ、選択された細胞におけるコード配列の発現を提供する構築物である。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクター又は組み込みベクターであり得る。発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核生物及び／又は真核細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。真核細胞の場合、それらは通常、転写の開始を確実にするプロモーター、及び任意で転写の終結及び転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。原核宿主細胞における発現を可能にする可能性のある調節エレメントは、例えば、大腸菌におけるＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母におけるＡＯＸ１又はＧＡＬ１プロモーター、又は哺乳動物及び他の動物細胞におけるＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー若しくはグロビンイントロンである。
転写の開始を担う要素の他に、このような調節要素は、ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ４０－ポリ－Ａ部位又はｔｋ－ポリ－Ａ部位などの転写終結シグナルも含み得る。さらに、使用する発現系に応じて、ポリペプチドを細胞コンパートメントに誘導するか、又はそれを培地に分泌することができるシグナルペプチドをコードするリーダー配列を、列挙された核酸配列のコード配列に加えてもよく、それらは当該技術分野で周知である；例えば、添付の実施例も参照のこと。
リーダー配列は、適切な段階で、翻訳、開始及び終結配列、並びに好ましくは細胞周辺腔又は細胞外培地への、翻訳されたタンパク質又はその一部の分泌を指示することができるリーダー配列とともに組み立てられる。任意で、異種配列は、発現した組換え産物の安定化や精製の簡素化など、望ましい特性を付与するＮ末端同定ペプチドを含むＣＡＲをコードすることができる；上記を参照のこと。この文脈において、適切な発現ベクターは、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ又はｐＥＦ－ｎｅｏ（Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141-150）又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）である。
Ｔ細胞又はその前駆細胞に導入される、記載された核酸分子又はベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、又は染色体外に維持され得る。
例示的な実施態様
１．以下の工程；
ａ）抗原結合ドメイン及び認識ドメインを含む抗原結合分子を提供する工程、ここで、抗原結合ドメインは抗原結合部分を含み、抗原結合部分は標的抗原に特異的である；
ｂ）抗原結合分子を、表面上に標的抗原を含む標的細胞、特に標的細胞ががん細胞である標的細胞と接触させる工程；
ｃ）抗原結合分子を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞と接触させる工程、ここで、レポーターＣＡＲ－Ｔ細胞は、
ｉ．認識ドメインに特異的に結合することができるＣＡＲであって、ここでＣＡＲが応答エレメントに作動可能に連結されているＣＡＲ；
ｉｉ．応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子
を含む；及び
ｄ）抗原結合部分の特異性を確立するためにレポーター遺伝子の発現を決定することによってＴ細胞活性化を決定する工程
を含む、抗原結合部分の特異性を評価するための方法。
２．認識ドメインが免疫グロブリンドメインである、実施態様１に記載の方法。
３．認識ドメインがＦｃドメインである、実施態様１又は２のいずれか一項に記載の方法。
４．Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、実施態様３に記載の方法。
５．Ｆｃドメインが変異Ｆｃドメインであり、ここで、変異Ｆｃドメインが、非変異親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、ＣＡＲは、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるが、非変異親Ｆｃドメインに特異的に結合することができない、実施態様３又は４のいずれか一項に記載の方法。
６．変異Ｆｃドメインが、ＥＵ番号付けによるＬ２３４、Ｌ２３５、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｐ３３１、Ｐ３２９及びＨ４３５からなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、特に、アミノ酸変異がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｐ３２９Ｇ及び／又はＨ４３５Ａである、実施態様５に記載の方法。
７．変異Ｆｃドメインが、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む、実施態様５又は６のいずれか一項に記載の方法。
８．変異Ｆｃドメインが、ＥＵ番号付けによるＩ２５３、Ｈ３１０、及びＨ４３５からなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸変異、特にアミノ酸変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（「ＡＡＡ」）を含む、実施態様５から７のいずれか一項に記載の方法。
９．抗原結合部分が、Ｆａｂ断片、特にファージディスプレイライブラリースクリーニングに由来するＦａｂ断片である、実施態様１から８のいずれか一項に記載の方法。
１０．ＣＡＲが、少なくとも１つの細胞内刺激シグナル伝達及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインを含む、実施態様１から９のいずれか一項に記載の方法。
１１．抗原結合部分の標的抗原への結合及びレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原結合部分を含む抗原結合分子への結合が、細胞内シグナル伝達及び／又は共シグナル伝達ドメインの活性化をもたらす、実施態様１０に記載の方法。
１２．細胞内シグナル伝達及び／又は共シグナル伝達ドメインの活性化が、応答エレメントの活性化をもたらす、実施態様１０又は１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．応答エレメントが、レポーター遺伝子の発現を制御する、実施態様１から１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．応答エレメントの活性化が、レポーター遺伝子の発現をもたらす、実施態様１から１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．応答エレメントが、ＮＦＡＴ経路、ＮＦ－κＢ経路又はＡＰ－１経路の一部である、実施態様１から１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．レポーター遺伝子が、発光タンパク質、特に蛍光タンパク質をコードしている、実施態様１から１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はルシフェラーゼをコードしている、実施態様１から１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．標的抗原が細胞表面受容体である、実施態様１から１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．標的抗原が、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＴＹＲＰ、ＥＧＦＲ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＷＴ１、及びＦｏｌＲ１、又はそれらの断片からなる群から選択される、実施態様１から１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．標的抗原が、ヒト主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドである、実施態様１から１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．抗原結合部分が、Ｔ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である、実施態様２０に記載の方法。
２２．追加的に以下の工程：
ｅ）レポーター遺伝子の発現を参照と比較する工程
を含む、実施態様１から２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．参照が、標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現である、実施態様２２に記載の方法。
２４．標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の発現が、標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、又は１００００倍高い、実施態様２３に記載の方法。
２５．追加的に以下の工程：
ｆ）標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現と比較して、標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の発現が所定の閾値よりも高い場合、抗原結合部分を選択する工程
を含む、実施態様２２に記載の方法。
２６．閾値が、２、３、４、５、１０、１００、１０００、又は１００００である、実施態様２５に記載の方法。
２７．標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の高レベルの発現及び標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の低レベルの発現が、抗原結合部分の高特異性を示す、実施態様１から２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の高レベルの発現及び標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の低レベルの発現が、抗原結合部分を含むＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の高特異性を示す、実施態様１から２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．方法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法である、実施態様１から２８のいずれか一項に記載の方法。
３０．ＴＣＢ抗体を生成するための方法であって、ＴＣＢ抗体が、標的抗原に特異的な第１の抗原結合部分と、Ｔ細胞活性化受容体に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分とを含み、ここで、第１の抗原結合部分が、実施態様１から２９のいずれか一項に記載の方法に従って選択される、方法。
３１．Ｔ細胞活性化受容体がＣＤ３である、実施態様３０に記載の方法。
３２．上に記載される方法。
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を用いたＰＣＲによって生成されるか、又は自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって合成された。特異的制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクターにクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にするために適切な制限部位を用いて設計された。全ての構築物は、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
タンパク質の精製
標準プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体を、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出は、ｐＨ２．８で達成され、続いて試料を直ちに中和した。凝集したタンパク質を、ＰＢＳにおける、又は２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０における、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、（必要に応じて）例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し、凍結して－２０℃又は－８０℃で保存した。試料の一部は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による後続のタンパク質分析及び分析特性評価のために提供された。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用した。特に、１０％又は４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビス－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の測定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムで、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５の中のＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに適用するか、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣシステムで、２ｘＰＢＳの中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出したタンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄゲル濾過標準１５１－１９０１を標準とした。
抗体産生
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。したがって、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（「ＡＡＡ」）変異が、ＦｃＲｎへの結合を抑止するために定常領域に導入された。それぞれの抗体は、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより産生された。細胞に、重鎖用及び軽鎖用の対応する発現ベクターを１：１の比でトランスフェクトした。
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
レンチウイルスベクターを作製するために、抗原結合受容体の正しい組み立てのためのそれぞれのＤＮＡ配列を、恒常的に活性なヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）の下でレンチウイルスポリヌクレオチドベクターにインフレームでクローニングした。レトロウイルスベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）エレメント、ｐＵＣ複製起点、及び細菌における増殖と選択を促進する抗生物質耐性をコードする遺伝子を含んでいた。
機能性ウイルス粒子を生成するために、６０～７０％コンフルエントＨｅｋ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ３２１６）、及びＣＡＲ含有ベクター並びにｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ：ｐＲＳＶ－ＲＥＶ：ｐＣｇｐＶトランスファーベクターを３：１：１：１の比で使用して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸＴＭベースのトランスフェクションを行った。４８時間後、上清を収集し、２５０ｇで５分間遠心分離して細胞片を除去し、０．４５又は０．２２μｍのポリエーテルスルホンフィルターを通してろ過した。濃縮されたウイルス粒子（Ｌｅｎｔｉ－ｘ－ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｔａｋａｒａ）を使用して、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ）を形質導入した。ＦＡＣＳ－ＡＲＩＡソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、陽性形質導入細胞をプールとして又は単一クローンとして選別した。適切な密度への細胞増殖後、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞を実験に使用した。
実施例１
本明細書に記載されるのは、標的細胞として、ＣＤ２０発現ＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を使用し、レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプール（図６Ａ）又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞のプール（図６Ｂ）を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイである。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＧＡ１０１ ＩｇＧをＩｇＧとして使用し、これは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方では形質導入されたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される。陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、カタログ番号６５５１８５）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）で、４℃で一晩又は３７℃で少なくとも１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最終洗浄工程の後、ＰＢＳを完全に除去した。レポーター細胞又はＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓを使用してそれらの生存率をチェックした。細胞数を１×１０６個の生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを室温（ＲＴ）で２１０ｇで５分間ペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ－１６０＋１０％のＦＣＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁した。目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、その生存率についてもチェックした。細胞数を、レポーター細胞について記載されているように、増殖培地中で１×１０６生存細胞／ｍｌに調整した。標的細胞及びレポーター細胞を５：１又は１：１のＥ：Ｔ比（合計でウェルあたり１１０．０００個の細胞）で、９６ウェルの懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ ｏｎｅ）に３重に播種した。次の工程として、目的の抗原を標的とする、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＧＡ１０１の段階希釈物を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を使用して増殖培地中で調製した。ウェルあたり２００ｕｌの最終容量で１μｇ／ｍｌから０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈の５０μｌのアリコートをそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇ及びＲＴで２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２の湿度雰囲気中でインキュベートした。２０時間のインキュベーション後、各ウェルの内容物を、マルチチャンネルピペットを使用して１０回上下にピペッティングすることにより混合した。１００μｌの細胞懸濁液を新しい白色平坦透明底の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ）に移し、１００ｕｌのＯＮＥ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。暗所で、ロータリーシェーカー上で、３００ｒｐｍ、室温で１５分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを使用して、検出時間を１秒／ウェルとして発光を測定した。
標的細胞とレポーター細胞を５：１（ドット）又は１：１（四角形）の比で２０時間共培養した場合、グラフは、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＧＡ１０１ ＩｇＧを抗体として使用した場合、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞及び抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の用量依存的活性化を示す（図６Ａ及びＢ、黒で表示）。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異のないＧＡ１０１ ＩｇＧ（図６Ａ及びＢ、灰色で表示）を使用した場合、形質導入されたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化は検出できなかった。各ポイントは、それぞれ技術的重複として行われた生物学的重複の平均値を表す。全ての値は、ベースライン補正値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
実施例２
本明細書に記載されるのは、標的細胞として、ＣＤ２０発現ＳＵＤＨＤＬ４（図７Ｃ及び７Ｄ）腫瘍細胞又はＷＳＵＤＬＣＬ２（図７Ａ及び７Ｂ）腫瘍細胞を使用し、レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤを発現する単一クローンＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞を使用する、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイである。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＧＡ１０１ ＩｇＧをＩｇＧとして使用し、これは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方ではＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される。レポーター細胞又はＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓを使用してそれらの生存率をチェックした。細胞数を１×１０６個の生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを室温（ＲＴ）で２１０ｇで５分間ペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ－１６０＋１０％のＦＣＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁した。目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、その生存率についてもチェックした。細胞数を、レポーター細胞について記載されているように、増殖培地中で１×１０６生存細胞／ｍｌに調整した。標的細胞及びレポーター細胞を１０：１、５：１又は１：１のＥ：Ｔ比（合計でウェルあたり１１０．０００個の細胞）で、９６ウェルの懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ ｏｎｅ）に３重に播種した。次の工程として、目的の抗原を標的とする、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＧＡ１０１の段階希釈物を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を使用して増殖培地中で調製した。ウェルあたり２００ｕｌの最終容量で１μｇ／ｍｌから０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈の５０μｌのアリコートをそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇ及びＲＴで２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２の湿度雰囲気中でインキュベートした。２０時間のインキュベーション後、各ウェルの内容物を、マルチチャンネルピペットを使用して１０回上下にピペッティングすることにより混合した。１００μｌの細胞懸濁液を新しい白色平坦透明底の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ）に移し、１００ｕｌのＯＮＥ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。暗所で、ロータリーシェーカー上で、３００ｒｐｍ、室温で１５分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを使用して、検出時間を１秒／ウェルとして発光を測定した。
標的細胞とレポーター細胞を１０：１（ドット）、５：１（四角形）、又は１：１（三角形）の比で２０時間共培養した場合、グラフは、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡを有するＧＡ１０１ ＩｇＧの用量に依存的な、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を示す（図７Ａ－Ｄ、黒で表示）。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異のないＧＡ１０１ ＩｇＧ（図７ＡーＤ、灰色で表示）を使用した場合、形質導入されたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化は、１μｇ／ｍｌの最高抗体濃度でほとんど検出できなかった。各点は技術的重複の平均値を表す。全ての値は、ベースライン補正値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
実施例３
本明細書に記載されるのは、標的細胞として付着性ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ ｃ１１９腫瘍細胞を使用して行われたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図８Ａ）又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図８Ｃ）の選別されたプールを使用した。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＦＡＰ ４Ｂ９ ＩｇＧをＩｇＧとして使用し、これは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方ではＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識される。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３をアイソタイプ対照として含めた。陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、カタログ番号６５５１８５）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）で、３７℃で少なくとも１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最終洗浄工程の後、ＰＢＳを完全に除去した。付着性ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ ｃｌ １９標的細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシンを使用して剥離した。剥離した細胞をＤＭＥＭ＋４．５ｇのＬＤ－グルコース＋Ｌ－グルタミン＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１０％のＦＣＳ及び１％のＧｌｕｔａｍａｘに再懸濁した。レポーター細胞又はＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ野生型Ｔ細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓを使用してそれらの生存率をチェックした。細胞数を１×１０６個の生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを室温（ＲＴ）で２１０ｇで５分間ペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ－１６０＋１０％のＦＣＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁した。目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、その生存率についてもチェックした。細胞数を、レポーター細胞について記載されているように、増殖培地中で１×１０６生存細胞／ｍｌに調整した。標的細胞及びレポーター細胞を５：１のＥ：Ｔ比（合計でウェルあたり１１０．０００個の細胞）で、９６ウェルの懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ ｏｎｅ）に３重に播種した。次の工程として、目的の抗原を標的とするＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する抗体の段階希釈物を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を使用して増殖培地中で調製した。ウェルあたり２００ｕｌの最終容量で１μｇ／ｍｌから０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈の５０μｌのアリコートをそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇ及びＲＴで２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２の湿度雰囲気中でインキュベートした。２０時間のインキュベーション後、各ウェルの内容物を、マルチチャンネルピペットを使用して１０回上下にピペッティングすることにより混合した。１００μｌの細胞懸濁液を新しい白色平坦透明底の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ）に移し、１００ｕｌのＯＮＥ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。暗所で、ロータリーシェーカー上で、３００ｒｐｍ、室温で１５分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを使用して、検出時間を１秒／ウェルとして発光を測定した。
図８Ｂ及び８Ｄは、どちらも標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＦＡＰ ４Ｂ９抗体と共培養された、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図８Ｄ）又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図８Ｂ）のデータを、異なる対照条件と比較して示している。
１μｇ／ｍｌのＦＡＰ ４Ｂ９ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡとのインキュベーション時に、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図８Ｂ及び８Ｄ、黒い三角形）と、標的細胞のみ（図８Ｂ及び８Ｄ、黒い逆三角形）は、検出可能な発光シグナルを示さない。
また、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞と１μｇ／ｍｌのＦＡＰ ４Ｂ９抗体との共培養時に、発光シグナルを示さない（図８Ｂ及び図８Ｄ、黒い菱形）。一方、標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＦＡＰ ４Ｂ９抗体と共培養されたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞のＣＤ３依存的活性化は、検出可能な発光シグナルを通じてそれらの機能性を証明している（白いドット）。
標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＦＡＰ ４Ｂ９抗体と共培養された、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図８Ｂ、白い四角形）のＣＤ３依存的活性化及び抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図８Ｄ、白い四角形で表示）のＣＤ３依存的活性化は、ＣＡＲ媒介活性化とＣＤ３媒介活性化を組み合わせるため、全ての中で最も高い発光シグナルを示す。ＣＤ３媒介発光シグナルは、ＣＡＲを標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＤＰ４７／ｖｋ３抗体と共にインキュベートした場合にも見られる（図８Ｂ及び図８Ｄ、白い逆三角形）。各ポイントは、技術的な三つ組の平均値を表す。全ての値は、ベースライン補正値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
実施例４
本明細書に記載されるのは、標的細胞として付着性ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図９Ａ）又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図９Ｃ）の選別されたプールを使用した。両方ともＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＣＥＡ Ａ５Ｂ７ ＩｇＧ又はＣＥＡ Ｔ８４ ＬＣＨＡ ＩｇＧのいずれかを使用した。さらに、アイソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。
陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、カタログ番号６５５１８５）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）で、３７℃で１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最終洗浄工程の後、ＰＢＳを完全に除去した。
付着性ＭＫＮ４５標的細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシンを使用して剥離した。剥離した細胞をＤＭＥＭ＋４．５ｇのＬＤ－グルコース＋Ｌ－グルタミン＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１０％のＦＣＳ及び１％のＧｌｕｔａｍａｘに再懸濁した。
レポーター細胞又はＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓを使用してそれらの生存率をチェックした。細胞数を１×１０６個の生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを室温（ＲＴ）で２１０ｇで５分間ペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ－１６０＋１０％のＦＣＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁した。
目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、その生存率についてもチェックした。細胞数を、レポーター細胞について記載されているように、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＣＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ中で１×１０６生存細胞／ｍｌに調整した。
標的細胞及びレポーター細胞を５：１のＥ：Ｔ比（合計でウェルあたり１１０．０００個の細胞）で、９６ウェルの懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ ｏｎｅ）に３重に播種した。
次の工程として、目的の抗原を標的とするＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する抗体の段階希釈物を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を使用して増殖培地中で調製した。ウェルあたり２００ｕｌの最終容量で１μｇ／ｍｌから０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈の５０μｌのアリコートをそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇ及びＲＴで２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２の湿度雰囲気中でインキュベートした。
２０時間のインキュベーション後、各ウェルの内容物を、マルチチャンネルピペットを使用して１０回上下にピペッティングすることにより混合した。１００μｌの細胞懸濁液を新しい白色平坦透明底の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ）に移し、１００ｕｌのＯＮＥ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。暗所で、ロータリーシェーカー上で、３００ｒｐｍ、室温で１５分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを使用して、検出時間を１秒／ウェルとして発光を測定した。
標的細胞とレポーター細胞を５：１の比で（図９Ａ及びＣ、ドット）２０時間共培養すると、グラフは、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＣＥＡ Ａ５Ｂ７を抗体として使用した場合、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞及び抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の用量依存的活性化を示す（図９Ａ及びＣ、灰色のドット）。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＣＥＡ Ｔ８４ ＬＣＨＡの使用は、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞に対してのみ用量依存的活性化を示した（図９Ａ、黒いドット）。一方、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する抗体を使用した場合、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化は、１μｇ／ｍｌの最高抗体濃度でのみ検出可能であった。
Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する対照抗体ＤＰ４７／ｖｋ３ ＩｇＧ（図９Ａ及びＣ、黒い三角形）を使用した場合、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化は検出できなかった。各ポイントは、技術的な三つ組の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
図９Ｂ及び９Ｄは、どちらも標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＣＥＡ Ｔ８ ＬＣＨＡ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ又はＣＥＡ Ａ５Ｂ７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体と共培養された、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図９Ｂ）又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図９Ｄ）のデータを、異なる対照条件と比較して示している。
１μｇ／ｍｌのＣＥＡ Ｔ８ ＬＣＨＡ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡとのインキュベーション時に、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＣＡＲ Ｔ細胞のみ（図９Ｂ及び９Ｄ、黒い菱形）と、標的細胞のみ（図９Ｂ及び９Ｄ、白い丸）は、検出可能な発光シグナルを示さない。
また、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＩｇＧとの共培養時に検出可能な発光シグナルを示さない（図９Ｂ及び図９Ｄ、白い四角形及び白い菱形）。一方、標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＩｇＧと共培養されたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ３依存的活性化は、検出可能な発光シグナルを通じてそれらの機能性を証明している（図９Ｂ及びＤ、灰色の×印）。
標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＩｇＧと共培養された、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図９Ｂ、黒い星及び灰色の星）のＣＤ３依存的活性化及び抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞（図９Ｄ、黒い星及び灰色の星）のＣＤ３依存的活性化は、ＣＡＲ媒介活性化とＣＤ３媒介活性化が組み合わされるため、全ての中で最も高い発光シグナルを示す。ＣＤ３媒介発光シグナルは、ＣＡＲを標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＤＰ４７／ｖｋ３抗体と共にインキュベートした場合にも見られる（図９Ｂ及び図９Ｄ、灰色の＋印）。各ポイントは、技術的な三つ組の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
実施例５
本明細書に記載されるのは、標的細胞として付着性ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞レポーターである。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞（図１０Ｃ）又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図１０Ａ）の選別されたプールを使用した。両方ともＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＣＨ１Ａ１Ａ ９８ ９９又はＣＥＡ ｈＭＮ１４ ＩｇＧのいずれかを使用した。さらに、アイソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。
陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、カタログ番号６５５１８５）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）で、３７℃で１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最終洗浄工程の後、ＰＢＳを完全に除去した。
付着性ＭＫＮ４５標的細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシンを使用して剥離した。剥離した細胞をＤＭＥＭ＋４．５ｇのＬＤ－グルコース＋Ｌ－グルタミン＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１０％のＦＣＳ及び１％のＧｌｕｔａｍａｘに再懸濁した。
レポーター細胞又はＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓを使用してそれらの生存率をチェックした。細胞数を１×１０６個の生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを室温（ＲＴ）で２１０ｇで５分間ペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ－１６０ １０％のＦＣＳ １％のＧｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁した。
目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、その生存率についてもチェックした。細胞数を、レポーター細胞について記載されているように、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＣＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ中で１×１０６生存細胞／ｍｌに調整した。
標的細胞及びレポーター細胞を５：１のＥ：Ｔ比（合計でウェルあたり１１０．０００個の細胞）で、９６ウェルの懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ ｏｎｅ）に３重に播種した。
次の工程として、目的の抗原を標的とするＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する抗体の段階希釈物を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を使用して増殖培地中で調製した。ウェルあたり２００ｕｌの最終容量で１μｇ／ｍｌから０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈の５０μｌのアリコートをそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇ及びＲＴで２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２の湿度雰囲気中でインキュベートした。
２０時間のインキュベーション後、各ウェルの内容物を、マルチチャンネルピペットを使用して１０回上下にピペッティングすることにより混合した。１００μｌの細胞懸濁液を新しい白色平坦透明底の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ）に移し、１００ｕｌのＯＮＥ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。暗所で、ロータリーシェーカー上で、３００ｒｐｍ、室温で１５分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを使用して、検出時間を１秒／ウェルとして発光を測定した。
標的細胞と抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞とを５：１の比率で２０時間共培養すると（図１０Ａ、黒及び灰色のドット）、ＣＥＡ ｈＭＮ１４抗体又はＣＨ１Ａ１Ａ ９８ ９９抗体を使用した場合、活性化は検出できなかった（図９Ａ及びＢ、灰色のドット）。抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞は、０．１μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌのＣＥＡ ｈＭＮ１４抗体又はＣＨ１Ａ１Ａ ９８ ９９抗体の両方においてほとんど活性化を示さない（図１０Ｃ、黒及び灰色のドット）。
Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する対照抗体ＤＰ４７／ｖｋ３ ＩｇＧ（図１０Ａ及びＣ、黒い三角形）を使用した場合、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞のどちらの活性化も検出できなかった。各ポイントは、技術的な三つ組の平均値を表す。全ての値は、ベースライン補正値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
図１０Ｂ及び１０Ｄは、標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＣＥＡ ｈＭＮ１４抗体又はＣＨ１Ａ１Ａ ９８ ９９抗体と共培養された、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図Ｄ）又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現ＮＦＡＴ Ｔ細胞（図９Ｄ）のデータを、異なる対照条件と比較して示している。
実施された全ての対照実験は、活性化刺激としてＣＤ３が使用されたものを除いて、いずれも検出可能な発光シグナルを示さない。各ポイントは、技術的な三つ組の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
実施例６
本明細書に記載されるのは、標的細胞として付着性ＴＮＣ発現ＣＴ２６ＴＮＣ ｃ１１９腫瘍細胞を使用する Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図１１Ｃ）又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図１１Ａ）の選別されたプールを使用した。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＴＮＣＡ２Ｂ１０をＩｇＧとして使用した。さらに、アイソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。
陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、カタログ番号６５５１８５）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）で、３７℃で１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最終洗浄工程の後、ＰＢＳを完全に除去した。
付着性ＣＴ２６ＴＮＣ ｃｌ １９標的細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシンを使用して剥離した。剥離した細胞をＲＰＭＩ－１６３０＋１０％のＦＣＳ及び１％のＧｌｕｔａｍａｘ＋１５μｇ／ｍｌのピューロマイシンに再懸濁した。
レポーター細胞又はＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ野生型Ｔ細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓを使用してそれらの生存率をチェックした。細胞数を１×１０６個の生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを室温（ＲＴ）で２１０ｇで５分間ペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ－１６０＋１０％のＦＣＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁した。
目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、その生存率についてもチェックした。細胞数を、レポーター細胞について記載されているように、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＣＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ中で１×１０６生存細胞／ｍｌに調整した。
標的細胞及びレポーター細胞を５：１のＥ：Ｔ比（合計でウェルあたり１１０．０００個の細胞）で、９６ウェルの懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ ｏｎｅ）に３重に播種した。
次の工程として、目的の抗原を標的とするＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する抗体の段階希釈物を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を使用して増殖培地中で調製した。ウェルあたり２００ｕｌの最終容量で１μｇ／ｍｌから０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈の５０μｌのアリコートをそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇ及びＲＴで２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２の湿度雰囲気中でインキュベートした。
２０時間のインキュベーション後、各ウェルの内容物を、マルチチャンネルピペットを使用して１０回上下にピペッティングすることにより混合した。１００μｌの細胞懸濁液を新しい白色平坦透明底の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ）に移し、１００ｕｌのＯＮＥ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。暗所で、ロータリーシェーカー上で、３００ｒｐｍ、室温で１５分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを使用して、検出時間を１秒／ウェルとして発光を測定した。
標的細胞とレポーター細胞を５：１の比で（図１１Ａ及びＣ、黒いドット）２０時間共培養すると、グラフは、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＴＮＣ Ａ２Ｂ１０を抗体として使用した場合、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞及び抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の用量依存的活性化を示す。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する対照抗体ＤＰ４７／ｖｋ３ ＩｇＧ（図１１Ａ及びＣ、黒いドット）を使用した場合、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞のどちらの活性化も検出できなかった。各ポイントは、技術的な三つ組の平均値を表す。全ての値は、ベースライン補正値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
図１１Ｂ及び１１Ｄは、どちらも標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＴＮＣ Ａ２Ｂ１０と共培養された、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図１１Ｄ）又は抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図１１Ｂ）のデータを、異なる対照条件と比較して示している。
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＩｇＧとの共培養時にいかなる検出可能な発光シグナルも示さない（図１１Ｂ及び図１１Ｄ、白い三角形）。一方、標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＩｇＧと共培養された Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ 細胞のＣＤ３依存的活性化は、検出可能な発光シグナルを通じてそれらの機能性を証明している（図１１Ｂ及び図１１Ｄ、白い四角形）。
標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＩｇＧと共培養された、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図１１Ｂ、白い丸）のＣＤ３依存的活性化及び抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図１１Ｄ、白い丸）のＣＤ３依存的活性化は、ＣＡＲ媒介活性化とＣＤ３媒介活性化が組み合わされるため、全ての中で最も高い発光シグナルを示す。ＣＤ３媒介発光シグナルは、ＣＡＲを標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＤＰ４７／ｖｋ３抗体と共にインキュベートした場合にも見られる（図１１Ｂ及び図１１Ｄ、黒い菱形）。各ポイントは、技術的な三つ組の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
実施例７
本明細書に記載されるのは、標的細胞として付着性ＴＮＣ発現ＣＴ２６ＴＮＣ ｃ１１９腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞として、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞を発現する抗Ｐ３２９Ｇ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤの選別されたプールを使用した（図１２Ａ）。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＴＮＣＡ２Ｂ１０をＩｇＧとして使用した。さらに、アイソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。
陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、カタログ番号６５５１８５）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）で、３７℃で１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最終洗浄工程の後、ＰＢＳを完全に除去した。
付着性ＣＴ２６ＴＮＣ ｃｌ １９標的細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシンを使用して剥離した。剥離した細胞をＲＰＭＩ－１６３０＋１０％のＦＣＳ及び１％のＧｌｕｔａｍａｘ＋１５μｇ／ｍｌのピューロマイシンに再懸濁した。
レポーター細胞又はＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓを使用してそれらの生存率をチェックした。細胞数を１×１０６個の生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを室温（ＲＴ）で２１０ｇで５分間ペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ－１６０＋１０％のＦＣＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁した。
目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、その生存率についてもチェックした。細胞数を、レポーター細胞について記載されているように、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＣＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ中で１×１０６生存細胞／ｍｌに調整した。
標的細胞及びレポーター細胞を５：１のＥ：Ｔ比（合計でウェルあたり１１０．０００個の細胞）で、９６ウェルの懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ ｏｎｅ）に３重に播種した。
次の工程として、目的の抗原を標的とするＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する抗体の段階希釈物を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を使用して増殖培地中で調製した。ウェルあたり２００ｕｌの最終容量で１μｇ／ｍｌから０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈の５０μｌのアリコートをそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇ及びＲＴで２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２の湿度雰囲気中でインキュベートした。
２０時間のインキュベーション後、各ウェルの内容物を、マルチチャンネルピペットを使用して１０回上下にピペッティングすることにより混合した。１００μｌの細胞懸濁液を新しい白色平坦透明底の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ）に移し、１００ｕｌのＯＮＥ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。暗所で、ロータリーシェーカー上で、３００ｒｐｍ、室温で１５分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを使用して、検出時間を１秒／ウェルとして発光を測定した。
標的細胞とレポーター細胞を５：１の比で（図１２Ａ、黒いドット）２０時間共培養すると、グラフは、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＴＮＣ Ａ２Ｂ１０を０．０１μｇ／ｍｌで始まる抗Ｐ３２９Ｇ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の用量依存的活性化を示している。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有する対照抗体ＤＰ４７／ｖｋ３ ＩｇＧ（図１２Ａ及びＣ、灰色のドット）を使用した場合、抗Ｐ３２９Ｇ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化は検出できなかった。各ポイントは、技術的な三つ組の平均値を表す。全ての値は、ベースライン補正値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
図１２Ｂは、標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＴＮＣ Ａ２Ｂ１０抗体と共培養された、抗Ｐ３２９Ｇ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞のデータを、異なる対照条件と比較して示している。
抗体なしで標的細胞と共にインキュベートされた抗Ｐ３２９Ｇ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（図１２Ｂ、黒い四角形）と、標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＴＮＣ Ａ２Ｂ１０抗体と共にインキュベートされたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞（図１２Ｂ、白いドット）は、検出可能な発光シグナルを示さない。一方、ＣＤ３コーティングされたウェルに播種された標的細胞及び１μｇ／ｍｌのＴＮＣ Ａ２Ｂ１０と共培養されたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞は、明瞭な発光シグナルを示す。
さらに、ＣＤ３コーティングされたウェル中で標的細胞と１μｇ／ｍｌのＴＮＣ Ａ２Ｂ１０又は１μｇ／ｍｌ ＤＰ４７／ｖｋ３抗体のいずれか一方と共にインキュベートされた抗Ｐ３２９Ｇ－－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ Ｆａｂ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞は、高い発光シグナルを示す。各ポイントは、技術的な三つ組の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
実施例８
本明細書に記載されるのは、ＲＭＦペプチド又はＶＬＤペプチドでパルスされたＴ２細胞を用いたフローサイトメトリーによる、ＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ペプチドバインダー５Ｅ１１（配列番号１０２及び１０３）並びに３３Ｈ０９（配列番号１００及び１０１）の特異性の評価である。ＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ペプチド結合抗体とのインキュベーションの前に、Ｔ２細胞にそれぞれのペプチドを１０－５Ｍで３７℃で２時間パルスするか、又はパルスせずに放置した。１０００００細胞の細胞アリコートへのそれぞれのＩｇＧの結合を、それぞれ、問題の抗体の異なる濃度で氷上で１時間許容し、続いてＰＢＳで２回洗浄し、Ｆｏｒｔｅｓｓａアナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のフローサイトメトリーにおいて９０ｎＭの濃度で、抗ｈｕＦｃ検出（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈからの抗ヒトＦ（ａｂ）２＿ＡＦ６４７）を介して評価した。バインダー５Ｅ１１と３３Ｈ０９は両方とも、ＲＭＦペプチドパルスでは明確な濃度依存性結合シグナルを与えるが、ＶＬＤペプチドパルスＴ２細胞では示さない（図１３Ａ及びＢ）。このフローサイトメトリーに基づく評価によれば、両抗体候補はＲＭＦペプチドパルスＴ２細胞に特異的に結合するが、ＶＬＤペプチドパルスＴ２細胞には結合しないようである。
実施例９
本明細書に記載されるのは、ＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ペプチドバインダー３３Ｆ０５（配列番号９６及び９７）、１１Ｄ０６（配列番号９８及び９９）、３３Ｈ０９（配列番号１００及び１０１）及び５Ｅ１１（配列番号１０２及び１０３）の特異性を評価するためにペプチドパルスＴ２細胞を標的細胞として使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールを使用した。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ペプチドバインダーをＩｇＧとして使用した。ＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ペプチド結合抗体及びレポーター細胞とのインキュベーションの前に、Ｔ２細胞にそれぞれのペプチドを１０－５Ｍで３７℃で２時間パルスするか、又はパルスせずに放置した。標的細胞及びレポーター細胞を５：１のＥ：Ｔ比（１ウェルあたり２０００個の標的細胞あたり１００００個のエフェクター細胞）で、３８４ウェルの白色平坦透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ）に３重に播種した。次の段階として、当該ＩｇＧの段階希釈物を増殖培地中で調製した。レポーター細胞、Ｔ２細胞及びＩｇＧを３７℃で１６時間インキュベートし、続いて１ウェルあたり６μｌのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、ＴＥＣＡＮインフィニットＭ１０００Ｐｒｏプレートリーダーを使用して発光を直接測定した。
得られたグラフ（図１４Ａ～図１４Ｄ）は、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の用量依存的活性化を示す。重要なことに、この活性化は、ＲＭＦペプチドパルスＴ２細胞においては、バインダー１１０６及び３３Ｈ０９に対してのみ選択的に現れるが、ＲＭＦ及びＶＬＤペプチドパルスＴ２細胞においては、バインダー３３Ｆ０５及び５Ｅ１１に対して非特異的に現れ、これらの後者の２つの抗体に対するＴ細胞活性化の非選択的な性質を示している。
実施例１０
本明細書に記載されるのは、ＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ペプチドバインダー１１Ｄ０６／Ｄ４３の変異体の特異性を評価するために、標的細胞としてペプチドパルスＴ２細胞を使用するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールを使用した。Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ペプチドバインダーをＩｇＧとして使用した。ＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ペプチド結合抗体及びレポーター細胞とのインキュベーションの前に、Ｔ２細胞にＲＭＦペプチドを１０－５Ｍで３７℃で２時間パルスするか、又はパルスせずに放置した。標的細胞及びレポーター細胞を５：１のＥ：Ｔ比（１ウェルあたり２０００個の標的細胞あたり１００００個のエフェクター細胞）で、３８４ウェルの白色平坦透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ）に３重に播種した。次の段階として、問題のＩｇＧの段階希釈物を増殖培地で調製した。レポーター細胞、Ｔ２細胞及びＩｇＧを３７℃で１６時間インキュベートし、続いて１ウェルあたり６μｌのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、ＴＥＣＡＮインフィニットＭ１０００Ｐｒｏプレートリーダーを使用して発光を直接測定した。
得られたグラフ（図１５Ａ～図１５Ｆ）は、抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞の用量依存的活性化を示す。全ての抗体変異体は、ＲＭＦパルスＴ２細胞において、非パルスＴ２細胞における活性化を上回る明確な特異性及び活性化を示すが、いずれの抗体変異体も親バインダー１１Ｄ０６／Ｄ４３よりも優れていない。
実施例１１
本明細書に記載されるのは、レポーター細胞として抗Ｐ３２９Ｇ－ｄｓ－Ｆａｂ－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞の選別されたプールを用いたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ レポーターＣＡＲ－Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞は、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ形式のＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ペプチドバインダーに結合し、次いで、試験されたＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ペプチド（それぞれ、ＲＭＦ又はＶＬＤ）を異なる程度で認識する。
問題の４つの異なる抗体（それぞれ、３３Ｆ０５（配列番号９６及び９７）、１１Ｄ０６（配列番号９８及び９９）、３３Ｈ０９（配列番号１００及び１０１）及び５Ｅ１１（配列番号１０２及び１０３））は、１０ｎＭで存在した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞及びＩｇＧとの共インキュベーションの前に、Ｔ２細胞を、実施例９に記載のように、それぞれＲＭＦ又はＶＬＤペプチドでパルスしたか、又はペプチドなしで放置した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞及び標的細胞を、３８４ウェルプレート（白色平坦透明底３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ））のウェルあたり２０μｌ中１００００～２０００個の細胞を含みＥ：Ｔ比５：１で、及び１０ｎＭのＩｇＧ濃度で、３７℃で６時間共培養し、続いて、ウェルあたり６μｌのＯＮＥ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、ＴＥＣＡＮインフィニットＭ１０００Ｐｒｏプレートリーダーを使用して発光を直接測定した。それぞれの実験設定の３重測定からのＣＡＲ－ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化は、標準偏差を示すエラーバー付きの棒グラフ（図１６）として表される。ＲＭＦペプチド（標的）のシグナル対ＶＬＤペプチド（標的外）のシグナルの比較は、それぞれのバインダーの活性化の特異性を評価するのに役立つ。ペプチドなしのＴ２細胞におけるシグナル強度は、候補バインダー３５Ｆ０５及び０５Ｅ１１の非特異的結合を示す。候補バインダー３３Ｈ０９及び１１Ｄ０６は、特に評価されたバックグラウンドに関して、標的外ペプチドＶＬＤのシグナルが低いため、ＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ペプチドＲＭＦのみに特異的かつ選択的であることを証明する（「Ｔ２、ペプチドなし」、エフェクター細胞「Ｔ２なし」及びエフェクターと標的細胞の共インキュベーション「ＩｇＧなし」）。
例示的な配列
表2: 抗P329G-ds-scFvアミノ酸配列:
Figure 0007394058000002
表3:抗P329G-ds- scFv DNA配列:
Figure 0007394058000003
Figure 0007394058000004
Figure 0007394058000005
Figure 0007394058000006
表4: 抗P329G-scFvアミノ酸配列:
Figure 0007394058000007
表5: 抗P329G- scFv DNA配列:
Figure 0007394058000008
Figure 0007394058000009
Figure 0007394058000010
表6: 抗P329G-ds- Fabアミノ酸配列
Figure 0007394058000011
表7: 抗P329G-ds-Fab DNA配列:
Figure 0007394058000012
Figure 0007394058000013
Figure 0007394058000014
Figure 0007394058000015
表8: 抗P329G-Fabアミノ酸配列:
Figure 0007394058000016
表9: 抗P329G-Fab DNA配列:
Figure 0007394058000017
Figure 0007394058000018
Figure 0007394058000019
表10: 抗AAA- scFvアミノ酸配列
Figure 0007394058000020
表11: 抗AAA-Fabアミノ酸配列
Figure 0007394058000021
表12
Figure 0007394058000022
Figure 0007394058000023
Figure 0007394058000024
Figure 0007394058000025
Figure 0007394058000026
Figure 0007394058000027

Claims (16)

  1. 以下の工程；
    ａ）抗原結合ドメイン及び認識ドメインを含む抗原結合分子を提供する工程、ここで、抗原結合ドメインは抗原結合部分を含み、抗原結合部分は標的抗原に特異的である；
    ｂ）抗原結合分子を、表面上に標的抗原を含む標的細胞と接触させる工程；
    ｃ）抗原結合分子を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞と接触させる工程、ここで、レポーターＣＡＲ－Ｔ細胞は、
    ｉ．認識ドメインに特異的に結合することができるＣＡＲであって、ここでＣＡＲが応答エレメントに作動可能に連結されているＣＡＲ；
    ｉｉ．応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子
    を含む；及び
    ｄ）抗原結合部分の特異性を確立するためにレポーター遺伝子の発現を決定することによってＴ細胞活性化を決定する工程
    を含む、抗原結合部分の特異性を評価するための方法。
  2. 標的細胞ががん細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 認識ドメインが免疫グロブリンドメインである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 認識ドメインがＦｃドメインである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. Ｆｃドメインが変異Ｆｃドメインであり、ここで、変異Ｆｃドメインが、非変異親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、ＣＡＲは、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるが、非変異親Ｆｃドメインに特異的に結合することができない、請求項４に記載の方法。
  6. 変異Ｆｃドメインが、ＥＵ番号付けによるＬ２３４、Ｌ２３５、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｐ３３１、Ｐ３２９及びＨ４３５からなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、特に、アミノ酸変異がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｐ３２９Ｇ及び／又はＨ４３５Ａである、請求項５に記載の方法。
  7. 変異Ｆｃドメインが、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む、請求項５又は６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 抗原結合部分が、Ｆａｂ断片、特にファージディスプレイライブラリースクリーニングに由来するＦａｂ断片である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 応答エレメントの活性化が、レポーター遺伝子の発現をもたらす、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はルシフェラーゼをコードしている、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 標的抗原が、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＴＹＲＰ、ＥＧＦＲ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＷＴ１、及びＦｏｌＲ１、又はそれらの断片からなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 標的抗原が、ヒト主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 抗原結合部分が、Ｔ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である、請求項１２に記載の方法。
  14. 標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の高レベルの発現及び標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の低レベルの発現が、抗原結合部分の高特異性を示す、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 抗原結合部分が、Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体に含まれ、標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の高レベルの発現及び標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の低レベルの発現が、ＴＣＢ抗体の高特異性を示す、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ＴＣＢ抗体を生成するための方法であって、ＴＣＢ抗体が、標的抗原に特異的な第１の抗原結合部分と、Ｔ細胞活性化受容体に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分とを含み、ここで、第１の抗原結合部分が、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法に従って選択される、方法。
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