ES2922236T3

ES2922236T3 - Entidades de afinidad que comprenden un dominio de unión a anticuerpo similar a TCR con gran afinidad y buena especificidad y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2922236T3
Application number: ES16739266T
Authority: ES
Inventors: Kamar Mira Peled; Galit Denkberg; Yoram Reiter; Ilan Beer; Keren Sinik; Teboul, (Elbaz) Yael; Shperber, (Sery) Yael; Segal Reut Erel; Ravit Oren; Dror Shmuel Alishekevitz
Original assignee: Adicet Bio Inc
Current assignee: Adicet Bio Inc
Priority date: 2015-06-08
Filing date: 2016-06-08
Publication date: 2022-09-12
Anticipated expiration: 2036-06-08
Also published as: IL256177A; WO2016199140A1; US20180171024A1; AU2016276555A1; WO2016199141A3; EP4039270A1; AU2016276556C1; JP7013243B2; CN114605547A; CN108025045A; CA3220475A1; IL256178B1; EP4039270A9; CA2988270A1; WO2016199141A2; MX2017015801A; EP3302537A1; WO2016199140A8; JP6912392B2; CN114437217A

Abstract

Se proporcionan entidades de unión de afinidad que tienen un dominio de unión a TCRL y métodos de su uso. Más específicamente, estas composiciones se unen a HLA-A2/WT1+, HLA-A2/Mage-A4, HLA-A2/Mage-A9, HLA-A2/PAP o HLA-A2/Tyr D+ y, como tal, se puede usar en diagnósticos y terapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Entidades de afinidad que comprenden un dominio de unión a anticuerpo similar a TCR con gran afinidad y buena especificidad y usos de las mismas

CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a entidades de afinidad que comprenden un dominio de unión a anticuerpo similar a TCR con gran afinidad y buena especificidad y usos de las mismas.

[0002] Las células tumorales e infectadas con virus se reconocen por células T citotóxicas CD8+ que, en respuesta, se activan para eliminar estas células. Para activarse, el receptor clonotípico de células T (TCR) necesita encontrar un antígeno de péptido específico presentado por la molécula de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en superficie de membrana. Las células que han experimentado transformación maligna o infección vírica muestran péptidos derivados de antígenos asociados a tumor o proteínas víricas en sus moléculas MHC de clase I. Por consiguiente, los complejos de MHC-péptido específicos de enfermedad son dianas deseables para enfoques inmunoterapéuticos. Un tal enfoque transforma la especificidad buena única, pero baja afinidad intrínseca de TCRs en complejos de MHC-péptido en moléculas de anticuerpos solubles con afinidad alta dotados con una especificidad similar a TCR con relación a epítopos tumorales o víricos. Estos anticuerpos, denominados anticuerpos similares a TCR, se están desarrollando como una clase nueva de inmunoterapéuticos que pueden dirigirse hacia células tumorales o infectadas con virus y mediar su eliminación específica. Además de sus capacidades terapéuticas, los anticuerpos similares a TCR se están desarrollando como reactivos de diagnóstico para cáncer y enfermedades infecciosas y sirven como valiosas herramientas de investigación para estudiar la manifestación de antígeno MHC de clase I.

[0003] Hillig et al. (J Mol Biol. 310(5): 1167-76 (2001)) da a conocer una estructura de cristalografía de rayos X de HLA-A*0201 en un conjunto con un péptido antigénico específico de tumor codificado por el gen MAGE-A4.

[0004] WO 2012/091563 da a conocer moléculas proteicas que comprenden como mínimo un dominio que comprende una secuencia de aminoácidos que se une de manera específica a un complejo MHC-péptido en una célula aberrante, unida de manera funcional con una sustancia que induce apoptosis en células aberrantes, pero no en células normales.

[0005] WO 2007/143104 da a conocer una metodología de producción de anticuerpos que reconoce péptidos asociados con un estado tumorigénico o de enfermedad, en el que los péptidos se exponen en el contexto de moléculas HLA.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0006] La presente invención se define en las reivindicaciones independientes y las características determinadas opcionales de las mismas se definen en las reivindicaciones dependientes. En lo que respecta a los términos «invención», «ejemplo» y «realización» utilizados en el presente documento, se interpretarán de tal forma que la única protección solicitada es para la invención tal como se reivindica.

[0007] La presente invención proporciona una entidad de unión por afinidad que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende:

(i) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de:

QVQLQQSGGEVMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWIKQRPGHGLEWIGEILPGSGGTN YNEKFKGK ATFT AHT S SNT AYMQLS SLTTED S AI YY C ARD SN SFT YW GQGTL VT V S S; y

(ii) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de:

QIVLT Q SP AIMS ASPGEK VTIT C S VS S S VD Y1HWFQQKPGTSPKF WIY ST SIL ASGVP ARF S GSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPPTFGSGTKLEIK;

donde dicha entidad de unión por afinidad es capaz de unirse a HLA-A2/ MAGE-A4230-239 de una manera restringida por MHC.

[0008] Por otra parte, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la entidad de unión por afinidad tal como se define en las reivindicaciones adjuntas; y una célula que comprende el vector de expresión.

[0009] La presente invención proporciona también un procedimiento in vitro de detección de una célula cancerígena, que comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, bajo las condiciones que permiten la formación de inmunocomplejo, en el que la presencia de dicho inmunocomplejo o el nivel del mismo es indicativo de la célula cancerígena.

[0010] Por otra parte, la presente invención proporciona un procedimiento de diagnóstico de cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende poner en contacto una célula del sujeto con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, bajo las condiciones ex vivo que permiten la formación de inmunocomplejo, en el cual la presencia de dicho inmunocomplejo o el nivel del mismo es indicativo del cáncer.

[0011] Además, la presente invención proporciona una entidad de unión por afinidad, un vector o una célula tal como se define en las reivindicaciones adjuntas para su uso en el tratamiento de cáncer. La presente invención proporciona también una entidad de unión por afinidad, el vector o la célula tal como se define en las reivindicaciones adjuntas para su uso como un medicamento.

[0012] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la entidad de unión por afinidad se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un CAR y un TCR.

[0013] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la entidad de unión por afinidad es un anticuerpo.

[0014] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la entidad de unión por afinidad es un TCR.

[0015] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la entidad de unión por afinidad es un CAR.

[0016] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la entidad de unión por afinidad es una entidad soluble.

[0017] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la entidad de unión por afinidad es un anticuerpo humanizado.

[0018] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la entidad de unión por afinidad comprende un porción terapéutica.

[0019] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la entidad de unión por afinidad comprende una porción detectable.

[0020] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el anticuerpo es un Fv(scFv) de cadena única, un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo de longitud completa.

[0021] De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente divulgación, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la entidad de unión por afinidad.

[0022] De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido unido de manera operable a un elemento regulador que actúa en cis.

[0023] De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una célula que comprende el vector de expresión.

[0024] De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente divulgación, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la entidad de unión por afinidad, el vector o la célula.

[0025] De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención se proporciona un procedimiento in vitro de detección de una célula cancerígena, que comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo, bajo las condiciones que permiten la formación de inmunocomplejo, en el que la presencia del inmunocomplejo o el nivel del mismo es indicativo de la célula cancerígena.

[0026] Solamente con fines de ilustración, se proporciona un procedimiento de diagnóstico y tratamiento de cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende:

(a) detectar la presencia de células cancerígenas en el sujeto de acuerdo con el procedimiento;

(b) diagnosticar al sujeto como el que padece cáncer, cuando se detectan las células cancerígenas; (c) tratar al sujeto con una terapia anticáncer.

[0027] De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención se proporciona un procedimiento de diagnóstico de cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende poner en contacto una célula del sujeto con el anticuerpo, bajo las condiciones ex vivo que permiten la formación de inmunocomplejo, en el que la presencia del inmunocomplejo o el nivel del mismo es indicativo del cáncer.

[0028] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula es una célula de piel.

[0029] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, cuando la entidad de unión por afinidad es para MAGE-A4 el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovarios, leucemia/linfoma de células T (por ejemplo, ATLL), cáncer testicular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga y cáncer de esófago.

[0030] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y/o científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o prueba de las realizaciones de la invención, a continuación se describen los procedimientos y/o los materiales de ejemplo. En caso de conflicto, la especificación de la patente, que incluye las definiciones, servirá como control. Es más, los materiales, los procedimientos y los ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitativos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE VARIAS VISTAS DEL DIBUJO O DIBUJOS

[0031] En el presente documento se describen algunas realizaciones de la invención o la divulgación, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos que las acompañan. Con una referencia específica a continuación a los dibujos en detalle, se destaca que las particularidades mostradas sirven a modo de ejemplo y con fines de análisis ilustrativo de realizaciones de la invención o la divulgación. A este respecto, la descripción conjuntamente con los dibujos demuestra a los expertos en la técnica como las realizaciones de la invención o la divulgación pueden realizarse.

[0032] En los dibujos:

Figura 1: La determinación de afinidad de unión aparente de anticuerpos similares a TCR que se dirigen a complejos de HLA-A2/Tirosinasa. IgGs purificadas se inmovilizaron de manera indirecta con el chip de sensor SPR con IgG de anti-ratón o humana. El analito se purificó con los complejos de HLA-A2/Tirosinasa de cadena única generados por replegado in vitro de E.coli expresada en complejos ^scH^lA-A2.

Figura 2: La determinación de especificidad de epítopo de anticuerpos similares a TCR utilizando análisis de Alanina. La secuencia de péptido de Tirosinasa se sustituyó con Alanina en posiciones 1,2,3,4,5,6,7 y 8. Los péptidos mutados de Ala se sintetizaron y se cargaron en APCs de células T2 a una concentración de 10'4-10'5M durante 12 horas a 37°C. La unión de anticuerpos similares a TCR a una concentración de 10 pg/ml se evaluó utilizando citometría de flujo e intensidad de unión tal como se medió utilizando intensidad de fluorescencia media se medió y se comparó con la intensidad de unión al péptido de Tirosinasa nativo de WT. El efecto relativo de sustitución de Ala en cada posición se evaluó como el porcentaje de la unión con el péptido WT.

Figura 3: La unión de anticuerpos similares a t Cr de D11 y D7 a APCs de T2 cargados con péptido de tirosinasa y péptidos limitados a HLA-A2 de control. Las células T2 se cargaron con péptido de Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10'4-10'5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para supervisar la expresión de HLA-A2. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 4: La unión de anticuerpos similares a TCR de D11 y D7 a APCs de T2 cargados con péptido de tirosinasa y péptidos limitados a HLA-A2 de control. Las células T2 se cargaron con péptido de Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10'4-10'5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para supervisar la expresión de HLA-A2. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 5: La unión de anticuerpos similares a TCR de D11 a APCs de T2 cargados con péptido de tirosinasa y péptidos limitados a HLA-A2 de control. Las células T2 se cargaron con péptido Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10'4-10'5M durante 12 horas a 37 °C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para controlar la expresión de HLA-A2. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 6: La unión de anticuerpos similares a TCR de D7 a APCs de T2 cargados con péptido de tirosinasa y péptidos limitados a HLA-A2 de control. Las células T2 se cargaron con péptido Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10'4-10'5M durante 12 horas a 37 °C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para controlar la expresión de HLA-A2. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 7: La unión de anticuerpos similares a TCR de MC1 a APCs de T2 cargados con péptido de tirosinasa y péptidos limitados a HLA-A2 de control. Las células T2 se cargaron con péptido de Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10'4-10'5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para controlar la expresión de HLA-A2. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 8: La unión de anticuerpo similar a TCR de MC1 con células de melanoma que expresan HLA-A2 y Tirosinasa. Las células de melanoma se controlaron utilizando citometría de flujo para unión de anticuerpo MC1 similar a TCR utilizando IgG anti-humana marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para controlar la expresión de HLA-A2.

Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 9: La unión de anticuerpo similar a TCR de MC1 a células positivas o negativas de antígeno HLA-A2+ y Tirosinasa Las células tumorales que expresan HLA-A2 y son positivas o negativas para Tirosinasa se controlaron utilizando citometría de flujo para unión de anticuerpo MC1 similar a TCR utilizando IgG anti-humana marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para controlar la expresión de HLA-A2. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 10: La unión de anticuerpos similares a TCR de D11 y D7 a células positivas o negativas de antígeno HLA-A2+ y Tirosinasa. Las células tumorales que expresan HLA-A2 y son positivas o negativas para Tirosinasa se controlaron utilizando citometría de flujo para unión de anticuerpo MC1 similar a TCR utilizando IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para controlar la expresión de HLA-A2. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 11: La unión de anticuerpos similares a TCR de D11 y D7 a células negativas de HLA-A2+ y Tirosinasa. Las células tumorales que expresan HLA-A2 y son negativas para Tirosinasa se controlaron utilizando citometría de flujo para unión de anticuerpo MC1 similar a TCR utilizando IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para controlar la expresión de HLA-A2. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 12: La unión comparativa de anticuerpos similares a TCR de D11, D7 y MC1 a células positivas o negativas de HLA-A2+ y Tirosinasa. Las células tumorales que expresan HLA-A2 y son positivas o negativas para Tirosinasa se controlaron utilizando citometría de flujo para unión de anticuerpo D11, D7, MC1 similar a TCR utilizando IgG anti ratón marcada con PE secundaria.

Figura 13: La unión de anticuerpo similar a TCR de D11 a células primarias normales negativas de HLA-A2+ / Tirosinasa. Las células normales primarias de origen histológico tal como se indicó que expresan HLA-A2 y son negativas para Tirosinasa se controlaron utilizando citometría de flujo para unión de anticuerpo D11 similar a TCR utilizando IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para controlar la expresión de HLA-A2. Figura 14: La unión de anticuerpo similar a TCR de D11 a células primarias normales negativas de HLA-A2+ / Tirosinasa. Las células normales primarias de origen histológico tal como se indicó que expresan HLA-A2 y son negativas para Tirosinasa se controlaron utilizando citometría de flujo para unión de anticuerpo D11 similar a TCR utilizando IgG anti-ratón marcada con PE secundaria.

Figura 15: La unión de anticuerpo similar a TCR de D7 con células primarias normales negativas de HLA-A2+ / Tirosinasa. Las células normales primarias de origen histológico tal como se indicó que expresan HLA-A2 y son negativas para Tirosinasa se supervisaron utilizando citometría de flujo para unión de anticuerpo D7 similar a TCR utilizando IgG anti-ratón con etiqueta PE secundaria.

Figura 16: La unión de BB7.2 con células primarias normales. Las células normales primarias de origen histológico se supervisaron utilizando citometría de flujo para expresión de HLA-A2 utilizando IgG anti-ratón con etiqueta MAb BB7.2 y PE secundaria.

Figura 17: La unión de anticuerpos similares a TCR de MC1, D11 y D7 con PBMCs normales. PBMCs se caracterizaron por homo o heterocigosidad de HLA- A2 mediante PCR. La unión de anticuerpos similares a TCR se supervisó utilizando IgG anti-ratón con etiqueta PE secundaria.

Figura 18: Resumen de selectividad de anticuerpos similares a TCR de D11. La unión de anticuerpos similares a TCR de D11 a células positivas y negativas de antígeno HLA-A2+ se controló utilizando IgG anti-ratón marcada con PE. /-indica expresión genética de ARNm de tirosinasa tal como se midió utilizando PCR. La expresión de HLA-A2 se controló con MAb BB7.2.

Figura 19: Resumen de selectividad de anticuerpos similares a TCR de D7. La unión de anticuerpos similares a TCR de D7 con células positivas y negativas de antígeno HLA-A2+ se supervisó utilizando IgG anti-raton con etiqueta PE. /- indica expresión genética de ARNm de tirosinasa tal como se midió utilizando PCR. La expresión de HLA-A2 se controló con MAb BB7.2.

Figura 20: La unión de anticuerpos similares a TCR de MC1, D11 y D7 a APCs de T2 cargados con péptido de tirosinasa y péptidos limitados a HLA-A2 similares a tirosinasa. Las células T2 se cargaron con péptido de Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10'4M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón marcada con PE secundaria.

Figura 21: La unión de anticuerpos similares a TCR de D11 a APCs de T2 cargados con péptido de tirosinasa similar a péptidos limitados a HLA-A2. Las células T2 se cargaron con péptido de Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10'5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti ratón marcada con PE secundaria. La unión de MAb BB7.2 aseguró la medición de eficacia de carga de péptidos. Figura 22: La unión de anticuerpos similares a TCR de D11 con APCs de T2 cargados con péptido de tirosinasa similar a péptidos que limitan HLA-A2. Las células T2 se cargaron con péptido de Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10'5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti ratón marcada con PE secundaria. La unión de MAb BB7.2 aseguró la medición de eficacia de carga de péptidos. Figura 23: La unión de anticuerpos similares a TCR de D11 a APCs de T2 cargados con péptido de tirosinasa similar a péptidos limitados a HLA-A2. Las células T2 se cargaron con péptido de Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10'5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti ratón marcada con PE secundaria. La unión de MAb BB7.2 aseguró la medición de eficacia de carga de péptidos. Figura 24: La unión de anticuerpos similares a TCR de D11 a APCs de T2 cargados con péptidos limitados a HLA-A2 similares a tirosinasa. Las células T2 se cargaron con péptido Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de -10'5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. La unión de MAb BB7.2 aseguró la medición de eficacia de carga de péptidos.

Figura 25: La unión de anticuerpos similares a TCR de D7 a APCs de T2 cargados con péptidos limitados a HLA-A2 similares a tirosinasa. Las células T2 se cargaron con péptido Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10-5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. La unión de MAb BB7.2 aseguró la medición de eficacia de carga de péptidos.

Figura 26: La unión de anticuerpos similares a TCR de D7 a APCs de T2 cargados con péptidos limitados a HLA-A2 similares a tirosinasa. Las células T2 se cargaron con péptido de Tirosinasa y péptidos indicados con una concentración de 10-5M durante 12 horas a 37°C. La unión se supervisó utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón con etiqueta PE secundaria. La unión de MAb BB7.2 aseguró la medición de eficacia de carga de péptidos. Figura 27: La unión de anticuerpos similares a TCR de D7 a APCs de T2 cargados con péptidos limitados a HLA-A2 similares a tirosinasa. Las células T2 se cargaron con péptido de Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10-5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. La unión de MAb BB7.2 aseguró la medición de eficacia de carga de péptidos.

Figura 28: La unión de anticuerpos similares a TCR de D7 a APCs de T2 cargados con péptidos limitados a HLA-A2 similares a tirosinasa identificada después de análisis de alanina. Las células T2 se cargaron con péptido de Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de 10-5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. La unión de MAb BB7.2 aseguró la medición de eficacia de carga de péptidos.

Figura 29: La determinación de afinidad de unión aparente de anticuerpo B47B6 similar a TCR que se dirigen a complejos de HLA-A2/WT1. IgGs purificadas se inmovilizaron de manera indirecta con el chip de sensor SPR con anti ratón. El analito se purificó con los complejos de HLA-A2/WT1 de cadena única recombinantes generados por replegado in vitro de E.coli expresada en complejos scHLA-A2.

Figura 30: La unión de anticuerpos similares a TCR de B47 y ESK1 a APCs de T2 cargados con péptido que limita HLA-A2 de WT1. Las células t 2 se cargaron con WT1 a una concentración de 10'4-10'5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón (para B47) o IgG humana (para ESK1) marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para controlar la expresión de HLA-A2. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 31: La unión de anticuerpos similares a TCR de B47 y ESK1 a APCs de T2 cargados con péptido de WT1 y péptidos limitados a HLA-A2 de control. Las células T2 se cargaron con péptido WT1 y péptidos indicados a una concentración de -10'4M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón (para B47) o IgG humana (para ESK1) marcada con PE secundaria. Se utilizó MAb BB7.2 para controlar la expresión de HLA-A2. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 32: La unión de anticuerpos similares a TCR de B47 y ESK1 a APCs de T2 cargados con péptidos limitados a HLA-A2 similares a WT1. Las células T2 se cargaron con péptido WT1 y péptidos indicados a una concentración de -10'4-10'5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón (para B47) o IgG humana (para ESK1) marcada con PE secundaria. La unión de MAb BB7.2 aseguró la medición de eficacia de carga de péptidos.

Figura 33: La unión de anticuerpo similar a TCR de B47 a APCs de T2 cargados con péptido de WT1 y péptidos limitados a HLA-A2 de control. Las células T2 se cargaron con péptido de WT1 y péptidos indicados a una concentración de 10'4M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti ratón marcada con PE secundaria. La unión de MAb BB7.2 aseguró la medición de eficacia de carga de péptidos. Figura 34: La unión de anticuerpo similar a TCR de B47 a APCs de T2 cargados con péptidos limitados a HLA-A2 similares a WT1. Las células T2 se cargaron con péptido de WT1 y péptidos indicados a una concentración de 10'4-10'5M durante 12 horas a 37°C. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón marcada con PE secundaria. La unión de MAb BB7.2 aseguró la medición de eficacia de carga de péptidos.

Figura 35: La unión de anticuerpos similares a TCR de B47 y ESK1 a células positivas HLA-A2 que expresan o no expresan WT1. La unión se controló utilizando citometría de flujo que utiliza IgG anti-ratón (para B47) o IgG humana (para ESK1) marcada con PE secundaria. Se evaluó la expresión de HLA-A2 con MAb BB7.2.

Figura 36: Resumen de selectividad de anticuerpo similar a TCR de B47. La unión de anticuerpos similares a TCR de B47 a células positivas y negativas de antígeno HLA-A2+ se controló utilizando IgG anti-ratón marcada con PE. /- indica expresión genética de ARNm de WT1 tal como se midió utilizando PCR. La expresión de HLA-A2 se controló con MAb BB7.2.

Figura 37: La determinación de especificidad de epítopo de anticuerpos similares a TCR utilizando análisis de Alanina. La secuencia de péptido de WT1 se sustituyó con Alanina en posiciones 1, 3, 4, 5, 7 y 8. Los péptidos mutados de Ala se sintetizaron y se cargaron con APCs. La unión de anticuerpo ESK1 similar a TCR se evaluó utilizando citometría de flujo e intensidad de unión tal como se midió utilizando intensidad de fluorescencia media se midió y se comparó con la intensidad de unió a péptido WT1 nativo de WT. El efecto relativo de sustitución de Ala en cada posición se evaluó como el porcentaje de la unión con el péptido WT. Datos de Dao et al. Sci Transl Med 5, 176ra33 (2013). Figura 38: La unión de D11, D7 y MC1 biotinilado a APCs de T2 cargados con péptido de Tirosinasa y péptidos limitados a HLA-A2 similares a Tirosinasa. S17-S23 son péptidos similares a los con base de Alanina. Las células de T2 se cargaron con Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de -10'5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpos TCRL a una concentración de 10 pg/ml seguido de anticuerpo estreptavidina/anti-ratón marcado con PE secundario y se analizaron utilizando citometría de flujo. Se indica la Intensidad de Fluorescencia Media (MFI).

Figura 39: La unión de anticuerpos similares a TCR de D11, D7 y MC1 a APCs de T2 cargados con péptido de Tirosinasa y péptidos limitados a HLA-A2 similares a Tirosinasa. KIAA0355, S7, S17-S23 son péptidos similares a los con base de Alanina. Las células de T2 se cargaron con Tirosinasa y péptidos indicados a una concentración de -10' 5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpos TCRL a una concentración de 10 pg/ml seguido de anticuerpo estreptavidina/anti-ratón marcado con PE secundario y se analizaron utilizando citometría de flujo. Se indica la Intensidad de Fluorescencia Media (MFI).

Figuras 40A-C: La unión de anticuerpos similares a TCR de D11 (Figura 40A), D7 (Figura 40B) y MC1 biotinilado (Figura 40C) a células positivas o negativas de antígeno HLA-A2+, Tirosinasa. Las células primarias tumorales y normales que expresan HLA-A2 se pusieron a prueba utilizando qPCR para expresión de ARNm de Tirosinasa. Las células tumorales se mancharon con los anticuerpos similares a TCR indicados a una concentración de 10 pg/ml seguido de anticuerpo estreptavidina/anti-ratón marcado con PE y se analizo utilizando citometría de flujo. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 41: La eliminación de líneas celulares de HLA-A2+/Tirosinasa+ (positiva) y HLA-A2+/Tirosinasa- (negativa) utilizando TCRL biespecífico (BS) que tiene una sección anti CD-3 y una sección D11, calificada Tyr D11 BS TCRL. Tyr D11 BS TCRL se incubó con células de HLA-A2+/Tirosinasa+ de melanoma y células tumorales de control que son HLA-A2+/Tirosinasa-. Las células se incubaron durante 24 horas con el Tyr D11 BS TCRL y con PBMCs nativos aislados de individuos sanos a una proporción de E:T de 10:1 (proporción de efector:diana de 10:1). La citotoxicidad se determinó utilizando el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).

Figura 42: La eliminación de células primarias normales de HLA-A2+/Tirosinasa- utilizando Tyr D11. BS D11 se incubó con células HLA-A2+/Tirosinasa+ de melanoma como células primarias de control y normales que son HLA-A2+/Tirosinasa-. Las células se incubaron durante 24 horas con el D11 BS TCRL y con PBMCs nativos aislados de individuos sanos a una proporción de E:T de 10:1.

Figura 43: La eliminación de líneas celulares de HLA-A2+/Tirosinasa+ y HLA-A2+/Tirosinasa- utilizando Tyr D7 BS TCRL. D7 BS se incubó con células HLA-A2+/Tirosinasa+ de melanoma y células tumorales de control que son HLA-A2+/Tirosinasa-. Las células se incubaron durante 24 horas con el D7 BS y con PBMCs nativos aislados de individuos sanos a una proporción de E:T de 10:1.

Figura 44: La eliminación de células primarias normales de HLA-A2+/Tirosinasa- utilizando D7 BS. D7 BS se incubó con células HLA-A2+/Tirosinasa+ de melanoma como células primarias de control y normales que son HLA-A2+/Tirosinasa-. Las células se incubaron durante 24 horas con el D7 BS y con PBMCs nativos aislados de individuos sanos a una proporción de E:T de 10:1.

Figura 45 Eficacia in vivo de D7 BS en la prevención de una formación tumoral de melanoma de S.C. 501A en ratones NOD/SCID.

Figura 46: La unión de anticuerpos similares a TCR de ESK1 y B47B6 biotinilados a APCs de T2 cargados con péptido de WT1 y otros péptidos limitados a HLA-A2. Las células de T2 se cargaron con péptido de WT1 y péptidos indicados a una concentración de -10'5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpos TCRL de ESK1 o B47B6 a una concentración de 10 pg/ml seguido de anticuerpo estreptavidina/anti-ratón marcado con PE secundario y se analizaron utilizando citometría de flujo. Se indica la Intensidad de Fluorescencia Media (MFI).

Figura 47: La unión de anticuerpos similares a TCR de ESK1 y B47B6 a APCs de T2 cargados con péptido de WT1 y péptidos limitados a HLA-A2 similares a WT1. S2, S6 y S7 son péptidos similares a los con base de Alanina. S11 es un péptido heteroclítico. Las células de T2 se cargaron con péptido de WT1 y péptidos indicados a una concentración de -10-5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpos TCRL de ESK1 o B47B6 a una concentración de 10 pg/ml seguido de anticuerpo estreptavidina/anti-ratón marcado con PE secundario y se analizaron utilizando citometría de flujo. Se indica la Intensidad de Fluorescencia Media (MFI).

Figura 48: Afinidad utilizando SPR - La determinación de afinidad de unión aparente de anticuerpos similares a TCR de ESK1 y B47B6 que se dirigen a complejos de HLA-A2/WT1. El complejo de HLA-A2/WT1 de cadena única biotinilado recombinante purificado generado utilizando replegado in vitro de E.coli expresada en complejos de scHLA-A2, se inmovilizó de manera indirecta con el chip de sensor SPR con Neu- trAvidin. Fabs de TCRL de ESK1 y B47B6 purificados sirvieron como analitos.

Figura 49: La determinación de especificidad de epítopo utilizando mutagénesis de escaneo de Alanina. Los péptidos de WT1 mutante con sustituciones de Alanina en posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 y 9 se sintetizaron y se cargaron en APCs de células T2 a una concentración de 10'5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpo similares a TCR de B47B6 a una concentración de 10 pg/ml y se analizaron utilizando citometría de flujo. El efecto relativo de sustitución Ala en cada posición se expresó como porcentaje de la unión a péptido de tipo salvaje.

Figura 50: La unión de anticuerpos similares a TCR de ESK1 y B47B6 a células positivas o negativas de ARNm de HLA-A2+ y WT1. Las células tumorales que expresan HLA-A2 se pusieron a prueba utilizando qPCR para expresión de ARNm de WT1. Las células tumorales se mancharon con anticuerpos de TCRL de ESK1 y B47B6 biotinilados a 10 pg/ml seguido de estreptavidina marcada con PE secundario. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI). Se muestran también los datos de expresión de ARNm y eliminación celular con las formas bioespecíficas (con anti-CD3) de los anticuerpos, tal como se describe en el presente documento.

Figura 51A: Eliminación de células primarias normales de HLA-A2+/WT1 y HLA-A2+/WT1- utilizando B47B6 BS frente a ESK1 BS. B47B6 BS y ESK1 BS se incubaron con células primarias normales que son HLA-A2+/WT1+ o HLA-A2+/WT1-. Las células se incubaron durante 24 horas con el B47B6 BS o ESK1 BS y con PBMCs nativos aislados de individuos sanos a una proporción de E:T de 10:1. La citotoxicidad se determinó mediante el ensayo de liberación de LDH.

Figura 51B: Eliminación de líneas celulares de HLA-A2+/WT1+ y HLA-A2+/WT1- utilizando B47B6 BS frente a ESK1 BS. B47B6 BS y ESK1 BS se incubaron con células tumorales que son HLA-A2+/WT1+ o HLA-A2+/WT1-. Las células se incubaron durante 24 horas con el B47B6 BS o ESK1 BS y con PBMCs nativos aislados de individuos sanos a una concentración de E:T de 10:1 (#F3- Formato - en el cual el fragmento scFv anti-CD3 se fusionó con el VLCL del Fab). Figura 52: La unión de anticuerpo similar a TCR de C106B9 a APCs de T2 cargados con péptido MAGE-A4230-239 (también denominado como péptido MAGE-A4) y otros péptidos limitados a HLA-A2. Las células de T2 se cargaron con MAGE-A4 y péptidos indicados a una concentración de -10-5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpo TCRL de C106B9 a 10 |jg/ml seguido de anticuerpo anti-ratón marcado con PE secundario y se analizaron utilizando citometría de flujo. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 53: La unión de anticuerpo similar a TCR de C106B9 a APCs de T2 cargados con péptido de MAGE-A4 y péptidos limitados a HLA-A2 similares a MAGE-A4. Las células de T2 se cargaron con MAGE-A4 y péptidos indicados a una concentración de -10'5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpo TCRL de C106B9 a 10 jg/m l seguido de anticuerpo anti-ratón marcado con PE secundario y se analizaron utilizando citometría de flujo. Figura 54: Afinidad utilizando SPR - La determinación de afinidad de unión aparente de anticuerpo similar a TCR de C106B9 que se dirigen a complejos de HLA- A2/MAGE-A4. El complejo de HLA-A2/MAGE-A4 de cadena única biotinilado recombinante purificado generado utilizando replegado in vitro de E.coli expresada en complejos de scHLA-A2, se inmovilizó de manera indirecta con el chip de sensor SPR con NeutrAvidin. Fab de TCRL de C106B9 se utilizó como el analito.

Figura 55: La determinación de especificidad de epítopo utilizando mutagénesis de escaneo de Alanina. Se sintetizaron los péptidos mutantes de MAGE-A4 con sustituciones de alanina en posiciones 1,2,3,4,5,6,7,8 y 9. Las posibles posiciones de anclaje se muestran con una estrella gris. Los péptidos de MAGE-A4 nativos y mutantes se cargaron en APCs de células T2 a una concentración de 10'5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpo similar a TCR de C106B9 a una concentración de 10 jg/m l y se analizaron utilizando citometría de flujo. Se compararon los valores de MFI para las células cargadas con péptidos mutantes y de tipo salvaje. El efecto relativo de cada sustitución Ala se expresó como porcentaje de la unión a péptido de tipo salvaje nativo.

Figura 56: La unión de anticuerpo similar a TCR de C106B9 a células positivas o negativas de antígeno HLA-A2+ y MAGE-A4. La expresión de ARNm de MAGE-A4 en las células se confirmó mediante qPCR. Las células tumorales se mancharon con C106B9 a 10 jg/m l seguido de anticuerpo anti-ratón marcado con PE y se analizo utilizando citometría de flujo. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI). Se muestran también los datos de expresión de ARNm y eliminación celular con las formas bioespecíficas (con anti-CD3) de los anticuerpos, tal como se describe en el presente documento.

Figura 57: Eliminación de líneas celulares de HLA-A2+/MAGE-A4+ y HLA-A2+/MAGE-A4- utilizando C106B9 BS. C106B9 BS se incubó con células tumorales que son células HLA-A2+/MAGE-A4+ y células tumorales de control que son HLA-A2+/MAGE-A4-. Las células se incubaron durante 24 horas con el C106B9 BS y con PBMCs nativos aislados de individuos sanos a una proporción de E:T de 10:1.

Figura 58: La eliminación de células primarias normales de HLA-A2+/MAGE-A4- utilizando C106B9 BS. C106B9 BS se incubó con células primarias normales que son HLA-A2+/MAGE-A4-. Las células se incubaron durante 24 horas con el C106B9 BS y con PBMCs nativos aislados de individuos sanos a una proporción de E:T de 10:1.

Figura 59: La eficacia in vivo de MAGE-A4 BS C106B9 BS en la prevención de formación tumoral de melanoma S.C. en ratones NOD/SCID.

Figura 60: La unión de anticuerpo similar a TCR de F184C7 a APCs de T2 cargados con péptido MAGE-A9223-231 (también denominado como péptido MAGE-A9) y otros péptidos limitados a HLA-A2. Las células de T2 se cargaron con péptido de MAGE-A9 y péptidos indicados a una concentración de -10'5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpo TCRL de F184C7 a 10 jg/m l seguido de anticuerpo anti-ratón marcado con PE secundario y se analizaron utilizando citometría de flujo. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 61: La unión de anticuerpos similares a TCR de F184C7 a APCs de T2 cargados con péptido de MAGE-A9 y péptidos limitados a HLA-A2 similares a MAGE-A9. S8 es un péptido similar al con base de Alanina. Las células de ^t2 se cargaron con péptido de MAGE-A9 y péptidos indicados a una concentración de -10'5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpo TCRL de F184C7 a 10 jg/m l seguido de anticuerpo anti-ratón marcado con PE secundario y se analizaron utilizando citometría de flujo.

Figura 62: La determinación de especificidad de epítopo utilizando mutagénesis de escaneo de Alanina. Se sintetizaron los péptidos mutantes de MAGE-A9 con sustituciones de alanina en posiciones 2,3,4,5,6,7,8 y 9. Los péptidos mutantes y nativos de Ala se cargaron en APCs de células T2 a una concentración de 10'5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpo similar a TCR de F184C7 a una concentración de 10 jg/m l y se analizaron utilizando citometría de flujo. Se compararon los valores de MFI para las células cargadas con péptidos mutantes y de tipo salvaje. El efecto relativo de cada sustitución Ala se expresó como porcentaje de la unión a péptido nativo.

Figura 63: La unión de anticuerpo similar a TCR de F184C7 a células primarias normales de HLA-A2+. Las células primarias normales se mancharon con anticuerpo de TCRL de F184C7 a 10 jg/m l seguido de anticuerpo anti-ratón marcado con PE secundario. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 64: La unión de anticuerpo similar a TCR de D10A3 a APCs de T2 cargados con péptido PAP 112-120 (también denominado como péptido PAP) y otros péptidos limitados a HLA-A2. Las células de T2 se cargaron con PAP y péptidos indicados a una concentración de -10'5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpo TCRL de D10A3 a 10 jg/m l seguido de anticuerpo anti-ratón marcado con PE secundario. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 65: La unión de anticuerpos similares a TCR de D10A3 a APCs de T2 cargados con péptido de PAP y péptidos limitados a HLA-A2 similares a PAP. Las células de T2 se cargaron con PAP y péptidos indicados a una concentración de -10'5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpo TCRL de D10A3 a 10 jg/m l seguido de anticuerpo anti-ratón marcado con PE secundario. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 66: La determinación de especificidad de epítopo utilizando mutagénesis de escaneo de Alanina. Los péptidos mutantes de PAP con sustituciones de Alanina en posiciones 1,3,4,6,7,8 y 9 se sintetizaron y se cargaron en APCs de células T2 a una concentración de 10'5 M durante 12 horas a 37 °C. Las células se mancharon con anticuerpo similar a TCR de D10A3 a una concentración de 10 |jg/ml. Se compararon los valores de MFI para las células cargadas con péptidos mutantes y de tipo salvaje. El efecto relativo de cada sustitución Ala se expresó como porcentaje de la unión a péptido WT.

Figura 67: La unión de anticuerpo similar a TCR de D10A3 a células primarias normales de HLA-A2+. Las células primarias normales se mancharon con anticuerpo de TCRL de D10A3 a 10 jg/m l seguido de anticuerpo anti-ratón marcado con PE secundario. Se indica la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Figura 68: Aminoácidos y ácidos nucleicos de anticuerpo D11 (SEQ ID NOs: 280-295).

Figura 69: Aminoácidos y ácidos nucleicos de anticuerpo D7 (SEQ ID NOs: 296-311).

Figura 70: Aminoácidos y ácidos nucleicos de anticuerpo B47B6 (SEQ ID NOs: 312-327).

Figura 71: Aminoácidos y ácidos nucleicos de anticuerpo C106B9 (SEQ ID NOs: 328-343).

Figura 72: Aminoácidos y ácidos nucleicos de anticuerpo F184C7 (SEQ ID NOs: 344-359).

Figura 73: Aminoácidos y ácidos nucleicos de anticuerpo D10A3 (SEQ ID NOs: 360-375).

DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ESPECÍFICAS DE LA INVENCIÓN

[0033] La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a entidades de afinidad que comprenden un dominio de unión a anticuerpo similar a TCR con afinidad y buena especificidad y usos de las mismas.

[0034] Los anticuerpos (TCRL) similares a Receptor de Células T (TCR) están provistos con una especificidad similar a TCR con relación a epítopos tumorales. A diferencia de TCRs que muestran afinidad baja hacia el complejo de antígenos de MHC-péptido, los TCRLs se caracterizan por afinidad incluso en su forma soluble. Los TCRLs se están desarrollando como una nueva clase terapéutica para el direccionamiento de las células tumorales y la mediación de su eliminación específica. Además, estos anticuerpos son valiosos reactivos de investigación que facilitan el estudio de presentación de ligando péptido-MHC de clase I humano e interacciones de TCR-péptido-MHC.

[0035] Los inventores actuales actualmente han identificado utilizando un cribado complicado y TCRLs innovadores de experimentación que muestran especificidad buena sin precedentes con relación a TyrD-HLA-A2 (D7 y D11), WT1-HLA-A2 (B47), MAGE-A4-HLA-A2 (C106B9), MAGE-A9-HLA-A2 (F184C7) y PAP (D10A3). Las CDRs de estos anticuerpos pueden implantarse en cualquier entidad de unión por afinidad tal como la que tiene una actividad efectora, por ejemplo, un CAR y TCR.

[0036] La presente invención proporciona una entidad de unión por afinidad que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende:

Q V QLQQ S GGE VMKPGA S VKL S CK AT GYTF T GYWIEWKQRPGHGLEWIGEILPGS GGT NYNEKFKGK ATF T AHT S SNT A YMQL S SLTTED S AI Y Y C ARD SN SF T YW GQGTL VT V S S;

y

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSVSSSVDY1HWFQQKPGTSPKFWIYSTSILASGVPARFS GSGSGT S Y SLTISRMEAED AAT YYCQQRS S YPPTF GSGTKLEIK;

[0037] Tal como se utiliza en el presente documento un «anticuerpo similar a Receptor de Células T» o «TCRL» hace referencia a un anticuerpo que une un MHC que se encuentra en complejo con un antígeno de péptido limitado a HLA. La unión del TCRL a su diana se encuentra dentro de una especificidad limitada a MHC. El anticuerpo TCRL no une dicho MHC en ausencia de dicho péptido en complejo, y el anticuerpo no une dicho péptido en ausencia de dicho MHC.

[0038] Tal como se utiliza en el presente documento «que une» o «se une» hace referencia a una forma de unión de anticuerpo-antígeno, que generalmente se encuentra, en el caso de TCRLs clínicamente relevantes, en el rango de K^dinferior a 20 nM, tal como se determina utilizando el ensayo de Resonancia por Plasmones Superficiales (SPR).

[0039] La afinidad del dominio de unión a antígeno con su antígeno se determina utilizando la forma soluble del anticuerpo a partir del cual se derivan las CDRs del dominio de unión a antígeno del anticuerpo. Para evaluar la afinidad, se utiliza el antígeno en su forma soluble, por ejemplo, como un complejo de MHC-péptido de cadena única tal como se describe con más detalles a continuación en el presente documento.

[0040] Tal como se utiliza en el presente documento el término «KD» hace referencia a la constante de disociación de equilibrio entre el dominio de unión a antígeno y su antígeno respectivo.

[0041] Se apreciará que la afinidad de la entidad de unión por afinidad se determina utilizando las CDRs. Sin embargo, se puede mejorar la afinidad utilizando los procedimientos conocidos en la técnica, tal como maduración de afinidad.

[0042] Tal como se utiliza en el presente documento «entidad de unión por afinidad» hace referencia a una fracción de unión que se une a un antígeno específico con una afinidad mayor que a un antígeno no específico y se dota con una afinidad de como mínimo 10-6 M, tal como se determina en los ensayos que se conocen bien en la técnica, que incluyen SPR.

[0043] De acuerdo con una realización específica, la afinidad es de 500 nM- 0,5 nM, 100 nM-1 nM, 50 nM-1 nM, 20 nM-1 nM, 10 nM-1 nM.

[0044] La fracción de afinidad puede seleccionarse entre el grupo que consiste en TCR, CAR-T y un anticuerpo.

[0045] De acuerdo con una realización, la entidad de unión por afinidad es un anticuerpo. Aunque la referencia a anticuerpos se hace con más detalles cuando se compara con otras entidades de unión por afinidad, la descripción de esta realización no debería interpretarse como limitante y la presente invención está equitativamente relacionada con entidades tal como se describen en el presente documento, especialmente, en el sentido de terapia celular tal como se describe con más detalle en el presente documento a continuación.

[0046] El término «anticuerpo» tal como se utiliza en esta invención incluye moléculas intactas así como también fragmentos funcionales de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, dsFv, o moléculas de dominio único, tales como VH y VL que son capaces de unirse a un epítopo de un antígeno de un modo limitado a MHC. Como una afirmación más general el término «anticuerpo» aspira abarcar cualquier entidad de unión por afinidad que une una molécula presente en superficie celular a una especificidad limitada a MHC. Por lo tanto, las CDRs de los anticuerpos de algunas realizaciones de la presente invención pueden implantarse en moléculas artificiales, tales como receptores de células T o CARs tal como se describe con más detalle en el presente documento a continuación.

[0047] Los fragmentos de anticuerpo adecuados para el ensayo de algunas realizaciones de la invención incluyen una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena ligera de inmunoglobulina (denominada en el presente documento como «cadena ligera»), una región determinante de la complementariedad de una cadena pesada de inmunoglobulina (denominada en el presente documento como «cadena pesada»), una región variable de una cadena ligera, una región variable de una cadena pesada, una cadena ligera, una cadena pesada, un fragmento Fd y fragmentos de anticuerpos que comprenden esencialmente regiones variables enteras de ambas cadenas ligera y pesada, tales como un Fv, un Fv Fv de cadena única (scFv), un Fv estabilizado con disulfuro (dsFv), un Fab, un Fab' y un F(ab')2.

[0048] Tal como se utiliza en el presente documento, los términos «región determinante de la complementariedad» o « c Dr » se utilizan de manera intercambiable con referencia a las regiones de unión a antígeno que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Generalmente, los anticuerpos comprenden tres CDRs en cada una de la VH (CDR HI o HI; CDR H2 o H2; y CDR H3 o H3) y tres en cada una de la VL (CDR LI o LI; CDR L2 o L2; y CDR L3 o L3). Los ejemplos de tales secuencias de CDR se proporcionan para TCRLs de D7 y D11 se produce de acuerdo con el Ejemplo I a continuación. Los ejemplos adicionales incluyen WT1 B47B6, MAGE-A4 C106B9, MAGE-A9 F184C7, PAP D10A3 (se muestran en las Figuras 68-73).

[0049] La identidad de los residuos de aminoácidos en un anticuerpo particular que constituye una región variable o una CDR puede determinarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica e incluir procedimientos tales como variabilidad de secuencia, tal como se define en Kabat et al. (Véanse, por ejemplo, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, NIH, Washington D.C.), localización de las regiones de bucle estructural tal como se define en Chothia et al. (véanse, por ejemplo, Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989.), un compromiso entre Kabat y Chothia utilizando software de modelación de anticuerpos AbM Moleculares de Oxford (actualmente Accelrys®, véanse, Martin et al., 1989, Proc. Natl Acad Sci EE. UU. 86:9268; y página web www.bioinf-org.uk/abs), estructuras de cristal de complejo disponible tal como se define en la definición de contacto (véanse, MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745, 1996), la «definición conformacional» (véanse, por ejemplo, Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008) y IMGT [Lefranc MP, et al. (2003) numeración única IMGT para dominios variables de inmunoglobulina y receptor de células T y dominios similares a superfamilias V de Ig. Dev Comp Immunol 27: 55-77].

[0050] Tal como se utiliza en el presente documento, las «regiones variables» y «CDRs» pueden hacer referencia a regiones variables y CDRs definidas utilizando cualquier enfoque conocido en la técnica, que incluye combinaciones de enfoques. De acuerdo con una realización específica, las CDRs se determinan según Kabat et al. (supra).

[0051] Los fragmentos de anticuerpos funcionales que comprenden regiones variables enteras o esencialmente enteras de ambas cadenas ligera y pesada se definen tal como sigue:

(i) Fv, definido como un fragmento modificado genéticamente que consiste en la región variable de la cadena ligera (VL) y la región variable de la cadena pesada (VH) expresada como dos cadenas;

(ii) Fv de cadena única ("scFv"), una molécula de cadena única modificada genéticamente que incluye la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, unida por un enlazador de polipéptido adecuado como una molécula de cadena única fusionada genéticamente;

(iii) Fv estabilizado con disulfuro ("dsFv"), un anticuerpo modificado genéticamente que incluye la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, unidas por un enlace de disulfuro modificado genéticamente;

(iv) Fab, un fragmento de una molécula de anticuerpo que contiene una parte de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo que puede obtenerse tratando el anticuerpo entero con la enzima de papaína para producir la cadena ligera intacta y el fragmento Fd de la cadena pesada que consiste en los dominios variable y CH1 de la misma;

(v) Fab', un fragmento de una molécula de anticuerpo que contiene una parte de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo que puede obtenerse tratando el anticuerpo entero con la enzima de pepsina, seguido de reducción (se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo);

(vi) F(ab')2, un fragmento de una molécula de anticuerpo que contiene una parte de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo que puede obtenerse tratando el anticuerpo entero con la enzima de pepsina (es decir, un dímero de fragmentos Fab' mantenidos unidos mediante dos enlaces de disulfuro); y

(vii) Anticuerpos o nanocuerpos de cadena única se componen de dominios VH o VL únicos que muestran suficiente afinidad al antígeno.

[0052] Los procedimientos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales así como también fragmentos de los mismos se conocen en la técnica (Véanse, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York,1988).

[0053] Los procedimientos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales así como también fragmentos de los mismos se conocen en la técnica (Véanse, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988).

[0054] Los fragmentos de anticuerpo de acuerdo con algunas realizaciones de la invención pueden prepararse utilizando hidrólisis proteolítica del anticuerpo o utilizando expresión en células de E. coli o de mamífero (por ejemplo, cultivo de células de ovarios de hámster chino u otros sistemas de expresión de proteína) de ADN que codifica el fragmento. Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse utilizando digestión de pepsina o papaína de anticuerpos enteros empleando procedimientos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse utilizando escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denotado F(ab')2. Este fragmento puede dividirse adicionalmente utilizando un agente reductor de tiol, y, opcionalmente, un grupo de bloqueo para los grupos de sulfhidrilo derivados de la escisión de enlaces de disulfuro, para producir fragmentos monovalentes de 3,5S Fab'. Alternativamente, una escisión enzimática que utiliza pepsina produce directamente dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fc. Estos procedimientos se describen, por ejemplo, en Goldenberg, Patentes de EE. UU. Números 4.036.945 y 4.331.647 y las referencias que se incluyen en las mismas. Véanse también Porter, R. R. [Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]. Pueden utilizarse otros procedimientos de escisión de anticuerpos, tales como separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, escisión adicional de fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre y cuando los fragmentos se unen al antígeno que se reconoce por el anticuerpo intacto.

[0055] Los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas VH y VL. Esta asociación puede ser no covalente, tal como se describe en Inbar et al. [Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU. 69:2659-62 (19720]. Alternativamente, las cadenas variables pueden unirse utilizando un enlace de disulfuro intermolecular o entrecruzarse utilizando productos químicos, tales como glutaraldehído. Preferiblemente, los fragmentos Fv comprenden cadenas VH y VL conectadas por un enlazador de péptido. Estas proteínas de unión a antígeno de cadena única (sFv) se preparan utilizando construcción de un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL conectados por un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión, que se introduce posteriormente en una célula huésped, tal como E. coli. Las células huésped recombinantes sintetizan una cadena única de polipéptido con un enlazador de péptido que une los dos dominios V. Los procedimientos para producir sFvs se describen, por ejemplo, en [Whitlow y Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993); y Patente de EE. UU. Número 4.946.778.

[0056] Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una única región determinante de la complementariedad (CDR). Los péptidos de CDR («unidades de reconocimiento mínimo») pueden obtenerse utilizando construcción de genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de polimerasa para sintetizar la región variable de ARN de células productoras de anticuerpos. Véanse, por ejemplo, Larrick y Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)].

[0057] Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son moléculas quiméricas de inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab'). sub.2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos forman una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por los residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como el ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del marco de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden comprender también los residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o marco importadas. De manera general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de como mínimo uno, y, típicamente, dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. De manera óptima, el anticuerpo humanizado comprenderá también como mínimo una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

[0058] Los procedimientos para anticuerpos no humanos humanizados se conocen bien en la técnica. De manera general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos colocados en él de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se refieren como residuos importados, que típicamente se obtienen de un dominio variable importado. La humanización se puede llevar a cabo de manera esencial siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], sustituyendo a secuencias de CDRs o CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (Patente de EE. UU. Número 4.816.567), en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

[0059] Los anticuerpos humanos pueden producirse también utilizando diferentes procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo bibliotecas de visualización de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Del mismo modo, los anticuerpos humanos pueden producirse utilizando la introducción de loci de inmunoglobulina humano en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena han sido parcialmente o completamente desactivados. Como un desafío, se observa la producción de anticuerpos humanos, que parece mucho a aquella observada en humanos en todos los aspectos, incluyendo reorganización genética, conjunto y repertorio de anticuerpo. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE. UU. Números 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Tech- nology 10: 779 783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); y Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).

[0060] En una realización en la que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo puede incluir como mínimo una y preferiblemente dos, cadenas pesadas completas, y como mínimo una o dos cadenas ligeras completas) o puede incluir una parte de unión a antígeno (un Fab, F(ab').sub.2, Fv o un fragmento Fv de cadena única ("scFv")). En otras realizaciones, la región constante de cadena pesada de anticuerpo se selecciona entre, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD y IgE. En algunas realizaciones, el isotipo de inmunoglobulina se selecciona entre IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4, más particularmente, IgG1 (por ejemplo, IgG1 humana) o IgG4 (por ejemplo, IgG4 humana). La elección de tipo de anticuerpo dependerá de la función efectora inmune que el anticuerpo está concebido a provocar.

[0061] En el presente documento se contemplan también las configuraciones biespecíficas. Un anticuerpo monoclonal biespecífico (BsMAb, BsAb) ies una proteína artificial que se compone de fragmentos de dos anticuerpos monoclonales diferentes y se une posteriormente a dos tipos diferentes de antígeno. De acuerdo con una realización específica, el BsMAb se modifica para unirse de manera simultánea a una célula citotóxica (por ejemplo, utilizando un receptor similar a CD3) y una diana similar a una célula tumoral a destruir (descrita con más detalle en el presente documento a continuación).

[0062] Tal como se utiliza en el presente documento la frase «receptor de antígeno quimérico (CAR)» hace referencia a una molécula recombinante o sintética que combina especificidad basada en anticuerpo para un antígeno deseado con un dominio intracelular que activa receptor de células T para generar una proteína quimérica que muestra actividad inmune celular para el antígeno específico.

[0063] Tal como se utiliza en el presente documento la frase «Receptor de Células T» o «TCR» hace referencia a formas solubles y no solubles de receptor de células T recombinante.

[0064] Tal como se utiliza en el presente documento la frase «péptido limitado a MHC (o HLA)» hace referencia a un péptido que está potencialmente presente sobre una molécula MHC. Tales péptidos pueden identificarse utilizando procedimientos «húmedos» de laboratorio tales como Espectrometría de Masas o mediante el análisis in-silico. Un péptido presente sobre MHC (o HLA) hace referencia a un péptido que se confirma in vitro o in vivo como el que está presentado por una molécula MHC.

[0065] De acuerdo con una realización específica, el péptido limitado a MHC es de MAGE-A4 y la entidad de unión por afinidad comprende las CDRs de C106B9.

[0066] Las CDRs de entidades de unión por afinidad dadas a conocer en el presente documento se describen en las Figuras 68-73.

[0067] También se contemplan las secuencias homólogas, por ejemplo, como mínimo 90 % de homología, 95 % de homología o incluso como mínimo 99 % de homología siempre y cuando la afinidad de unión a la diana correspondiente y, opcionalmente, la especificidad se mantienen o incluso se mejoran.

[0068] De acuerdo con un aspecto de la divulgación, se proporciona también un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la entidad de unión por afinidad tal como se describe en el presente documento.

[0069] También se proporciona un vector de expresión, que comprende el polinucleótido unido de manera operable a un elemento regulador que actúa en cis.

[0070] La construcción de ácido nucleico (denominada también en el presente documento como un «vector de expresión») de algunas realizaciones de la invención incluye secuencias adicionales que representan este vector adecuado para la reproducción y la integración en procariotas, eucariotas o, preferiblemente, ambos (por ejemplo, vectores lanzaderas). Adicionalmente, los vectores de clonación típicos pueden contener una secuencia de iniciación de transcripción y traducción, un exterminador de transcripción y traducción y una señal de poliadenilación. A modo de ejemplo, tales construcciones incluirán de manera típica un 5' LTR, un sitio de unión a ARNt, una señal de embalaje, un origen de síntesis de ADN de doble cadena y un 3' LTR o una parte de los mismos.

[0071] Las construcciones de ácido nucleico de algunas realizaciones de la invención incluyen típicamente una secuencia de señal para la secreción o la presentación de la entidad de unión por afinidad de una célula huésped en la que se coloca. Preferiblemente, la secuencia de señal con este fin es una secuencia de señal de mamífero.

[0072] Los promotores en eucariotas típicamente contienen dos tipos de secuencias de reconocimiento, la caja TATA y los elementos promotores en dirección 5'. La caja TATA, colocada en la dirección 5' de los pares de base 25-30 del sitio de inicio de transcripción, se cree que está involucrada en direccionamiento de polimerasa de ARN para empezar la síntesis de ARN. Los otros elementos promotores en la dirección 5' determinan la velocidad con la que se empieza la transcripción.

[0073] Preferiblemente, el promotor utilizado por la construcción de ácido nucleico de algunas realizaciones de la invención es activo en la población de células específica transformada. Los ejemplos de promotores específicos de tipo y/o específicos de tejido celulares incluyen promotores tales como albumina que es específica de hígado [Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277], promotores específicos linfáticos [Calame et al., (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]; en promotores particulares de receptores de células T [Winoto et al., (1989) Em BO J. 8:729-733] e inmunoglobulinas; [Banerji et al. (1983) Cell 33729-740], promotores específicos de neuronas tales como el promotor de neurofilamento [Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. u U. 86:5473-5477], promotores específicos de páncreas [Edlunch et al. (1985) Science 230:912-916] o promotores específicos de glándulas mamarias tales como promotor de proteína de leche (Patente de EE. UU. Número 4.873.316 y Publicación de Solicitud Europea Número 264.166).

[0074] Los elementos potenciadores pueden estimular la transcripción hasta 1.000 veces desde promotores homólogos o heterólogos. Los potenciadores son activos cuando se colocan en la dirección 3' o en la dirección 5' a partir del sitio de inicio de transcripción. Muchos elementos potenciadores derivados de virus tienen una variedad de huéspedes amplia y son activos en una variedad de tejidos. Por ejemplo, el potenciador del primer gen de SV40 es adecuado para muchos tipos de células. Otras combinaciones de potenciador/promotor que son adecuadas para algunas realizaciones de la invención incluyen aquellas derivadas de virus polioma, citomegalovirus humano o murino (CMV), la repetición a largo plazo de diferentes retrovirus tales como virus de leucemia murina, virus de sarcoma murino o de Rous y VIH. Véanse, Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1983.

[0075] En la construcción del vector de expresión, el promotor se posiciona preferiblemente aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de transcripción heteróloga así como del sitio de inicio de transcripción en su entorno natural. Tal como se conoce en la técnica, algunas variaciones en esta distancia pueden adaptarse sin la pérdida de la función promotora.

[0076] Las secuencias de poliadenilación pueden añadirse al vector de expresión para aumentar la eficiencia de traducción de ARN m de TCRL. Se necesitan dos elementos diferentes de secuencia para poliadenilación precisa y eficiente: Las secuencias ricas en GU o U situadas en la dirección 3' del sitio de poliadenilación y una secuencia altamente conservada de seis nucleótidos, AAUAAA, situada en la dirección 5' de nucleótidos 11-30. Las señales de terminación y poliadenilación que son adecuadas para algunas realizaciones de la invención incluyen aquellas derivadas de SV40.

[0077] Además de los elementos que ya se describieron, el vector de expresión de algunas realizaciones de la invención puede contener típicamente otros elementos especializados previstos para el aumento del nivel de expresión de ácidos nucleicos clonados o para facilitar la identificación de células que llevan el ADN recombinante. Por ejemplo, un número de virus de animales contienen secuencias de ADN que promueven la replicación cromosómica extra del genoma viral en tipos de células permisivas. Los plásmidos que contienen estos replicones virales se replican de manera episomal siempre y cuando los factores apropiados se proporcionan por los genes que se llevan sobre el plásmido o con el genoma de la célula huésped.

[0078] El vector puede o no puede incluir un replicón eucariota. Si está presente un replicón eucariota, entonces, el vector es amplificable en células eucariotas utilizando el marcador seleccionable apropiado. Si el vector no comprende un replicón eucariota, no es posible ninguna amplificación episomal. En cambio, el ADN recombinante se integra en el genoma de la célula modificada, en la que el promotor dirige la expresión del ácido nucleico deseado.

[0079] También se proporcionan las células que comprenden los vectores de polinucleótidos/expresión tal como se describen en el presente documento.

[0080] Tales células se seleccionan típicamente para expresión alta de proteínas recombinantes (por ejemplo, células bacterianas, de plantas o eucariotas, por ejemplo, células CHO, HEK-293), pero pueden ser también células huésped que poseen actividad efectora inmune específica (por ejemplo, células T o células NK), cuando, por ejemplo, se implantan las CDRs del TCRL en un Receptor de Células T o transducido con CAR en dichas células, las que se utilizan en terapia celular adaptativa tal como se describe en más detalle a continuación en el presente documento.

[0081] La especificidad alta de la entidad de unión por afinidad representa sus particularmente útiles aplicaciones de diagnóstico y terapia.

[0082] Por consiguiente, de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, se da a conocer un procedimiento de detección de una célula que muestra un antígeno de péptido limitado a HLA de interés. El procedimiento comprende poner en contacto la célula con la entidad de unión por afinidad (por ejemplo, anticuerpo) de la presente divulgación que tiene especificidad para el antígeno de péptido limitado a HLA de interés. La puesta en contacto se realiza bajo las condiciones que permiten la formación de inmunocomplejo, en el que la presencia del inmunocomplejo o el nivel del mismo es indicativo de la célula que muestra el antígeno de péptido limitado a HLA de interés.

[0083] El término «detección», tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia al acto de detección, percepción, descubrimiento, exposición, visualización o identificación de una célula. El procedimiento exacto de detección depende de la fracción detectable (también denominada en el presente documento como fracción identificable) a la que se acopla el anticuerpo tal como se describe con más detalle en el presente documento a continuación.

[0084] Las células únicas pueden utilizarse de acuerdo con las instrucciones de la presente divulgación así como también una pluralidad de células. Por ejemplo, las células pueden ser de cualquier muestra biológica, tal como muestras de líneas celulares, primarias (por ejemplo, cultivos tumorales) y celulares, por ejemplo, biopsias quirúrgicas que incluyen biopsia incisional o escisional, aspiraciones con aguja fina y similares. Los procedimientos de extracción de biopsia se conocen bien en la técnica.

[0085] El procedimiento de detección mencionado anteriormente puede utilizarse para el diagnóstico de enfermedades que se caracterizan por la presentación superior a la normal o distribución diferente de tejidos del complejo HLA-péptido.

[0086] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «diagnóstico» hace referencia a la clasificación de una enfermedad, determinación de gravedad de una enfermedad (grado o etapa), progreso de control, previsión de un resultado de la enfermedad y/o posibilidades de recuperación.

[0087] El sujeto puede ser un sujeto sano (por ejemplo, humano) que se somete a un control de bienestar rutinario. Alternativamente, el sujeto puede padecer el riesgo de la enfermedad. Sin embargo alternativamente, el procedimiento puede utilizarse para controlar la eficacia del tratamiento.

[0088] El TCRL puede comprender, por ejemplo, sujeción a una fracción identificable. Alternativamente o adicionalmente, el TCRL (o un complejo que comprende lo mismo) puede identificarse de manera indirecta tal como mediante la utilización de un anticuerpo secundario.

[0089] La puesta en contacto puede realizarse in vitro (es decir, en una línea celular, células primarias), ex vivo o in vivo.

[0090] Tal como se menciona, el procedimiento de la presente divulgación se realiza bajo las condiciones suficientes para formar un inmunocomplejo (por ejemplo, un complejo entre los anticuerpos de la presente divulgación y el péptido en complejo con MHC, típicamente cuando las células no están rotas); tales condiciones (por ejemplo, concentraciones apropiadas, tampones, temperaturas, tiempos de reacción) así como también los procedimientos para optimizar tales condiciones se conocen por los expertos en la técnica, y los ejemplos se dan a conocer en el presente documento.

[0091] Las entidades de unión por afinidad de la invención (por ejemplo, anticuerpos) son especialmente útiles en el tratamiento de cáncer.

[0092] El término «cáncer» tal como se utiliza en el presente documento se define como enfermedad que se caracteriza por el crecimiento rápido e incontrolado de células anormales. Las células cancerosas pueden diseminarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo.

[0093] El cáncer puede ser una neoplasia hematológica, un tumor sólido, un tumor primario o metastatizante. Los ejemplos de varios cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, Leucemia Linfocítica Crónica (CLL), leucemia, cáncer de pulmón y similares. Los ejemplos no limitativos adicionales de cánceres que pueden tratarse utilizando el procedimiento de algunas realizaciones de la invención se proporcionan en la Tabla 1 anteriormente.

[0094] Los cánceres pueden tratarse incluyendo tumores que no se vascularizan, o no se han vascularizado todavía, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Los tipos de cánceres a tratar con los Anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma y sarcoma, y determinadas neoplasias leucémicas o linfáticas, tumores benignos y malignos y neoplasias, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. Los tumores/cánceres en adultos y los tumores/cánceres en niños también se incluyen.

[0095] Los cánceres hematológicos son cánceres de la sangre y médula ósea. Los ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) incluyen leucemias, que incluyen leucemias agudas (tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (tales como leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, síndrome mielodisplásico, leucemia de células peludas y mielodisplasia.

[0096] Los tumores sólidos y masas anormales de tejidos que normalmente no contienen quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los diferentes tipos de tumores sólidos se nombran según el tipo de células que los forman (como sarcomas, carcinomas y linfomas). Los ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, neoplasia linfoide, cáncer pancreático, cáncer de pecho, cánceres de pulmón, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de tiroides medular, carcinoma de tiroides papilar, feocromocitomas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de tubo biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma y tumores de CNS (tales como un glioma (tal como glioma de tronco encefálico y gliomas mixtos), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme) astrocitoma, linfoma de ^cN^s, germinoma, meduloblastoma, craneofaringioma de Schwannoma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebral).

[0097] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la patología es un tumor sólido.

[0098] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la entidad de unión por afinidad tiene un efecto antitumoral.

[0099] El término "efecto antitumoral", tal como se utiliza en este documento, se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por una disminución en el volumen de tumor, una disminución en el número de células tumorales, una disminución en el número de metástasis, un aumento en la esperanza de vida, o una mejoría de varios síntomas fisiológicos asociados con la condición cancerosa. Un «efecto antitumoral» también puede manifestarse con la habilidad del medicamento de la invención en la prevención de la aparición de tumor en primer lugar.

[0100] Solamente con fines de ilustración, cuando la entidad de unión por afinidad es para Tirosinasa (TyrD) el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en melanoma y glioblastoma.

[0101] Solamente con fines de ilustración, cuando la entidad de unión por afinidad es para WT1 el cáncer se selecciona entre:

Tabla 1

[0102] De acuerdo con una realización específica, cuando dicha entintad de unión por afinidad es para MAGE-A4 tales cánceres se seleccionan entre:

Tabla 2

[0103] Solamente con fines de ilustración, cuando tal entidad de unión por afinidad es para MAGE-A9 dicho cáncer se selecciona entre:

Tabla 3

[0104] Solamente con fines de ilustración, cuando tal entidad de unión por afinidad es para PAP dicho cáncer es cáncer de próstata.

[0105] Solamente con fines de ilustración, las clasificaciones anteriores son relevantes tanto para el diagnóstico como el tratamiento.

[0106] La determinación de presencia o nivel del inmunocomplejo de la presente invención depende de la fracción detectable a la que se acopla el anticuerpo.

[0107] Los ejemplos de fracciones detectables que pueden utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, isotopos radioactivos, productos químicos fosforescentes, productos químicos quimioluminiscentes, productos químicos fluorescentes, enzimas, polipéptidos fluorescentes y etiquetas de epítopos. La fracción detectable puede ser un miembro de un par de unión, que es identificable por su interacción con un miembro adicional del par de unión y una etiqueta que se visualiza directamente. En un ejemplo, el miembro del par de unión es un antígeno que se identifica por un anticuerpo correspondiente etiquetado. En un ejemplo, la etiqueta es una proteína o una enzima fluorescente que produce una reacción colorimétrica.

[0108] Los ejemplos adicionales de fracciones detectables, incluyen aquellos detectables utilizando Tomografía por Emisión de Positrones (PET) e Imagen por Resonancia Magnética (MRI), todos de los cuales se conocen bien por los expertos en la técnica.

[0109] Cuando la fracción detectable es un polipéptido, la inmunoetiqueta (es decir, el anticuerpo conjugado con la fracción detectable) puede producirse utilizando procedimientos recombinantes o puede sintetizarse químicamente utilizando, por ejemplo, la adición gradual de uno o más residuos de aminoácidos en orden definido utilizando técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida. Los ejemplos de fracciones detectables de polipéptidos que pueden unirse a los anticuerpos de la presente invención utilizando tecnología de ADN recombinante (en la que el polinucleótido que codifica el TCRL se fusiona de manera translativa con la fracción detectable) incluyen polipéptidos fluorescentes, polipéptidos fosforescentes, etiquetas de enzimas.

[0110] Alternativamente, el acoplamiento químico de una fracción detectable a los anticuerpos de la presente invención puede llevarse a cabo utilizando cualquier enlace químico adecuado, directo o indirecto, como a través de un enlace de péptido (cuando la fracción detectable es un polipéptido), o a través de una unión covalente a un elemento enlazador intermedio, tal como un enlazador de péptido u otra fracción química, tal como un polímero orgánico. Tales péptidos quiméricos pueden unirse a través de la unión en el extremo carboxi (C) o amino (N) terminal de los péptidos o a través de la unión a grupos químicos, tales como cadenas laterales lineal, ramificada o cíclica, átomos internos de carbono o nitrógeno y similares. Tales péptidos modificados pueden identificarse y prepararse fácilmente por un experto en la técnica, utilizando procedimientos conocidos de síntesis de péptidos y/o acoplamiento covalente de péptidos. Se proporciona la descripción de marcaje fluorescente de anticuerpos con más detalle en las Patentes de EE. UU. Números 3.940.475, 4.289.747 y 4.376.110.

[0111] Los procedimientos de ejemplo para conjugar dos fracciones de péptidos se describen en el presente documento a continuación:

Conjugación de SPDP:

[0112] Se puede utilizar cualquier procedimiento de conjugación de SPDP se conocido por el experto. Por ejemplo, en una realización con fines de ilustración, se utiliza una modificación del procedimiento de Cumber et al. (1985, Methods of Enzymology 112: 207-224) tal como se describe a continuación.

[0113] Un péptido, tal como una fracción identificable o terapéutica, (1.7 mg/ml) se mezcla con un exceso de 10 veces de SPDP (50 mM en etanol) y el anticuerpo se mezcla con un exceso de 25 veces de SPDP en 20 mM de fosfato de sodio, 0,10 M de NaCl con pH 7,2 y cada una de las reacciones se incubó, por ejemplo, durante 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, las reacciones se realizaron con diálisis contra PBS.

[0114] El péptido se reduce, por ejemplo, con 50 mM de DTT durante 1 hora a temperatura ambiente. El péptido reducido se desala mediante equilibrio de columna G-25 (hasta 5 % del volumen de muestra/columna) con 50 mM de KH2PO4 con pH 6,5. El péptido reducido se combina con el anticuerpo SPDP a una proporción molar de 1:10 anticuerpo:péptido y se incuba a 4 °C durante la noche para formar un conjugado de péptido-anticuerpo.

Conjugación de glutaraldehído:

[0115] La conjugación de un péptido (por ejemplo, una fracción identificable o terapéutica) con un anticuerpo puede llevarse a cabo utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica que utilizan glutaraldehído. Por ejemplo, en una realización con fines de ilustración, se utiliza el procedimiento de conjugación de G.T.Hermanson (1996, "Antibody Modification and Conjugation, en Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego) tal como se describe a continuación.

[0116] El anticuerpo y el péptido (1,1 mg/ml) se mezcla a un exceso de 10 veces con 0,05 % de glutaraldehído en 0,1 M de fosfato, 0,15 M de NaCl con pH 6,8, y se dejan reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Se puede añadir 0,01 M de lisina para bloquear los sitios de exceso. Después de la reacción, se elimina el exceso de glutaraldehído utilizando una columna de G-25 equilibrada con PBS (10 % de v/v de los volúmenes de muestra/columna).

Conjugación de carbodiimida:

[0117] La conjugación de un péptido con un anticuerpo puede llevarse a cabo utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica que utilizan un agente deshidratante tal como una carbodiimida. Más preferiblemente la carbodiimida se utiliza en presencia de 4-dimetil aminopiridina. Como se sabe bien por los expertos en la técnica, se puede utilizar la conjugación de carbodiimida para formar un enlace covalente entre un grupo carboxilo de péptido y un grupo hidroxilo de un anticuerpo (que da lugar a la formación de un enlace éster) o un grupo amino de un anticuerpo (que da lugar a la formación de un enlace amida) o un grupo sulfhidrilo de un anticuerpo (que da lugar a la formación de un enlace tioéster).

[0118] Del mismo modo, se puede utilizar el acoplamiento de carbodiimida para formar enlaces covalentes similares entre un grupo carbono de un anticuerpo y un grupo hidroxilo, amino o sulfhidrilo del péptido. Véanse, en términos generales, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reaction's, Mechanism, and Structure, páginas 349-50 & 372-74 (3a edición), 1985. Con fines de ilustración, y no limitación, el péptido se conjuga con un anticuerpo a través de un enlace covalente que utiliza una carbodiimida, tal como diciclohexilcarbodiimida. Véanse en términos generales, los procedimientos de conjugación de B. Neises et al. (1978, Angew Chem., Int. Ed. Engl. 17:522; A. Hassner et al. (1978, Tetrahedron Lett. 4475); E.P. Boden et al. (1986, J. Org. Chem. 50:2394) y L.J. Mathias (1979, Synthesis 561). Se puede comparar el nivel de inmunocomplejo con una muestra de control de un sujeto no enfermo, en el que una sobrerregulación de formación de inmunocomplejo es indicativa de melanoma. Preferiblemente, el sujeto es de la misma especie, por ejemplo, humano, preferiblemente que corresponde a la misma edad, peso, sexo, etc. Se apreciará que la muestra de control puede ser también del mismo sujeto de un tejido sano, anterior al progreso de enfermedad o seguida de remisión de enfermedad.

[0119] De acuerdo con una realización específica, la detección se realiza mediante FACS.

[0120] Tal como se menciona los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse también en la terapéutica, cuando la entidad de unión por afinidad, por ejemplo, un anticuerpo comprende una fracción terapéutica.

[0121] La fracción terapéutica puede ser una parte integral del anticuerpo, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo completo, el dominio Fc, que activa citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC). ADCC es un mecanismo de defensa inmune mediado por células en el que una célula efectora del sistema inmune se lisa con una célula diana, cuyos antígenos de la superficie membrana se han unido a anticuerpos específicos. Es uno de los mecanismos a través del cual los anticuerpos, como una parte de la respuesta inmune humoral, pueden actuar para limitar y contener la infección. El ADCC clásico se media por células asesinas naturales (NK); macrófagos, neutrófilos y eosinófilos pueden mediar ADCC también. Por ejemplo, los eosinófilos pueden eliminar ciertas lombrices parasitarias conocidas como helmintos a través de ADCC mediado por IgE. ADCC forma parte de la respuesta inmune adaptativa debido a su dependencia de una respuesta anterior de anticuerpo.

[0122] Alternativamente o adicionalmente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico en el que la fracción terapéutica es un enganchador de células T, por ejemplo, tal como un anticuerpo anti CD3 o un anti CD16a, alternativamente, la fracción terapéutica puede ser una molécula de control anti inmune (anti PD-1).

[0123] Alternativamente o adicionalmente el anticuerpo puede acoplarse a una fracción terapéutica heteróloga (los procedimientos de conjugación se describen a continuación en el presente documento). La fracción terapéutica puede ser, por ejemplo, una fracción citotóxica, una fracción tóxica, una fracción de citocina, un fármaco.

[0124] El anticuerpo puede existir en una forma soluble o insoluble.

[0125] Las formas insolubles pueden ser aquellas en las que una molécula que comprende los CDRs de anticuerpo se acopla a o se expresa por una célula o una partícula (la última puede utilizarse con fines terapéuticos, así como también diagnósticos).

[0126] Los ejemplos de tales células incluyen células inmunes, células T, células B, células dendríticas, CIK, NKT, células NK (autólogas, alogénicas, xenogénicas).

[0127] De acuerdo con una realización específica, el anticuerpo (o en realidad los CDRs del mismo) forman un CAR (tal como se explica anteriormente) o un Receptor de Células T artificial. Por lo tanto, un polinucleótido que codifica para tal molécula se convierte en una célula de interés.

[0128] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula es una célula T, una célula asesina natural, una célula que ejerce un efecto represivo sobre células T efectoras, una célula modificada con una función de eliminación efectora o una célula modificada con una función represiva.

[0129] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula es una célula T o célula ap T, o célula y§ T.

[0130] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula es una célula asesina natural (NK).

[0131] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula asesina natural se utiliza para atacar cáncer.

[0132] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula T es una célula T citotóxica (célula T efectora).

[0133] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula T citotóxica (célula T efectora) se utiliza para atacar antígenos de cáncer.

[0134] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula T citotóxica se utiliza para tratar una patología causada por o asociada a cáncer.

[0135] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula T comprende una Treg (célula T reguladora).

[0136] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula T comprende una célula T de CD3.

[0137] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula T comprende una célula T de CD4.

[0138] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula T comprende una célula T de CD8.

[0139] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el domino de unión a antígeno comprende una molécula Fv de cadena única (scFv).

[0140] El dominio citoplasmático (denominado también como «dominio de señalización intracelular) de la molécula CAR de la invención es responsable de la activación de como mínimo una de las funciones efectoras normales de la célula inmune en la que se ha depositado CAR.

[0141] El término «función efectora» hace referencia a una función especializada de una célula. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar que incluye secreción de citocinas. Por consiguiente, el término «dominio de señalización intracelular» hace referencia a la parte de una proteína que transduce la señal de función efectora y dirige la célula para realizar una función especializada. Mientras que normalmente se puede utilizar el dominio entero de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario para utilizar para la cadena entera. En la medida en que se utiliza una parte truncada del dominio de señalización intracelular, dicha parte reducida puede utilizarse en vez de la cadena intacta siempre y cuando transduce la señal de función efectora. Por lo tanto, el término dominio de señalización intracelular pretende incluir cualquier parte reducida del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.

[0142] Los ejemplos de dominios de señalización intracelular para su uso en la molécula CAR de la invención incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR) y co-receptores que actúan de manera conjunta para iniciar la transducción de señal después de implicación de receptor de antígenos, así como también cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que posee la misma capacidad funcional.

[0143] Se conoce que las señales generadas a través del TCR solo son suficientes para la activación completa de la célula T y que se necesita también una señal secundaria o coestimuladora. De este modo, la activación de células T puede mediarse utilizando dos clases diferentes de secuencia de señalización citoplasmática: aquellas que inician la activación primaria dependiente de antígenos a través del TCR (secuencias primarias de señalización citoplasmática) y aquellas que actúan de un modo dependiente de antígenos para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias secundarias de señalización citoplasmática).

[0144] Las secuencias primarias de señalización citoplasmática regulan activación primaria del complejo TCR o de un modo estimulador o de un modo inhibidor. Las secuencias primarias de señalización citoplasmática que actúan de forma estimulante pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAMs).

[0145] Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias primarias de señalización citoplasmática que son de uso particular en la invención incluyen aquellos derivados de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, Cd79b y CD66d. Se prefiere particularmente que la molécula de señalización citoplasmática en el CAR de la invención comprenda una secuencia de señalización citoplasmática derivada de CD3 zeta.

[0146] En una realización preferida, el dominio citoplasmático del CAR puede diseñarse para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta por si solo o en combinación con cualquier dominio(s) citoplasmático(s) deseado(s) útil(es) en el contexto del CAR de la invención. Por ejemplo, el dominio citoplasmático del CAR puede comprender una parte de cadena de CD3 zeta y una región de señalización coestimuladora. La región de señalización coestimuladora hace referencia a una parte del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de superficie celular diferente de un receptor de antígenos u otros ligandos que se necesita para una respuesta eficaz de linfocitos a un antígeno. Los ejemplos de tales moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), O^x40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LiGh T, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente a CD83, y similares. De este modo, mientras que la invención sirve principalmente como ejemplo con 4-1BB como el elemento de señalización coestimulador, otros elementos coestimuladores se encuentran dentro del ámbito de la invención.

[0147] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el dominio intracelular comprende una región de señalización coestimuladora y una parte de cadena zeta. La región de señalización coestimuladora hace referencia a una parte de la molécula CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de superficie celular diferentes de receptores de antígenos o sus ligandos que se necesitan para una respuesta eficaz de linfocitos a antígeno.

[0148] «Ligando coestimulador» tal como se utiliza el término en el presente documento, incluye una molécula sobre una célula presentadora de antígeno [por ejemplo, una aAPC (célula presentadora de antígeno artificial), célula dendrítica, célula B y similares] que se unen de manera específica a una molécula coestimuladora análoga sobre una célula T, proporcionando de este modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, por ejemplo, unión a un complejo de TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con péptido, media una respuesta de célula T, que incluye, pero no se limita a, proliferación, activación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero no limitarse a, CD7, ^b7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-^l2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intracelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, un agonista o anticuerpo que une el receptor del ligando Toll y un ligando que se une de manera específica a B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une de manera específica a una molécula coestimuladora presente sobre una célula T tal como, pero no se limita a, CD27, CD28, 4-1Bb , OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado a función de linfocito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une de manera específica a CD83.

[0149] Una «molécula coestimuladora» hace referencia a una célula T que se une de manera específica a un ligando coestimulador, mediando, de este modo, una respuesta coestimuladora por la célula T, tal como, pero no se limita a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a una molécula de MHC de clase 1, BTLA y un receptor de ligando Toll.

[0150] Una «señal coestimuladora», tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a una señal, que en combinación con una señal primaria, tal como una ligadura de TCR/CD3, provoca proliferación de células T y/o regulación positiva o regulación negativa de moléculas claves.

[0151] Por el término «estimulación», se entiende una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora con su ligando análogo mediando, de este modo, un evento de transducción de señales, tal como, pero no limitado a, la transducción de señales a través del complejo de TCR/CD3. La estimulación puede mediar la expresión alterada de ciertas moléculas, tal como regulación negativa de TGF-p, y/o reorganización de estructuras citoesqueléticas, y similares.

[0152] Una «molécula estimuladora», como el término que se utiliza en el presente documento, significa una molécula sobre una célula T que se une de manera específica con un ligando estimulador análogo presente sobre una célula presentadora de antígeno.

[0153] Un «ligando estimulador», tal como se utiliza en el presente documento, significa un ligando que cuando está presente sobre una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una aAPC, una célula dendrítica, una célula B y similares) puede unirse de manera específica a un miembro de unión análogo (denominado en el presente documento como una «molécula estimuladora») sobre una célula T, mediando, de este modo, una respuesta primaria por la célula T, que incluye, pero no se limita a, activación, iniciación de una respuesta inmune, proliferación y similares. Los ligandos estimuladores se conocen bien en la técnica y abarcan, entre otros, una molécula de MHC de Clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti- CD28 superagonista y un anticuerpo anti-CD2 superagonista.

[0154] Con referencia al dominio citoplasmático, la molécula CAR de algunas realizaciones de la invención puede diseñarse para comprender el dominio de señalización de CD28 y/o 4-1BB por si solo o en combinación con cualquier otro dominio(s) citoplasmático(s) deseado(s) útil(es) en el conteXto de la molécula CAR de algunas realizaciones de la invención. En una realización, el dominio citoplasmático del CAR puede diseñarse para comprender adicionalmente el dominio de señalización de CD3-zeta. Por ejemplo, el dominio citoplasmático del CAR puede incluir, pero no limitarse a módulos de señalización de CD3-zeta, 4-1B^by CD28 y combinaciones de los mismos.

[0155] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el dominio intracelular comprende como mínimo uno, por ejemplo, como mínimo dos, como mínimo tres, como mínimo cuatro, como mínimo cinco, por ejemplo, como mínimo seis de los polipéptidos seleccionados entre el grupo que consiste en: CD3^ü (CD247, CD3z), CD28, 41BB, ICOS, OX40 y CD137.

[0156] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el dominio intracelular comprende la cadena de Cd3Z[molécula[molécula CD247 también conocida como «CD3-ZETA» y «CD3z»; Números de Adhesión de GenBank NP_000725.1 yNP_932170.1], que es el transmisor primario de señales de TCRs endógenos.

[0157] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el dominio intracelular comprende diferentes receptores de proteína coestimuladora con la cola citoplasmática del CAR para proporcionar señales adicionales a la célula T (CAR de segunda generación). Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, CD28 [por ejemplo, Números de Adhesión a GenBank. NP_001230006.1, NP_00l230007.1, ⁿP_006130.1], 4-1BB [superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 9 (TNFRSF9), también conocido como "CD137", por ejemplo, Número de Adhesión a GenBank NP_001552.2], e ICOS [coestimulador de células T inducible, por ejemplo, Número de Adhesión a GenBank NP_036224.1]. Los estudios preclínicos han indicado que la segunda generación de diseños de CAR mejora la actividad antitumoral de células T.

[0158] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el dominio intracelular comprende dominios de señalización múltiples, tales como CD3z-CD28-41BB o CD3z-CD28-OX40, para aumentar adicionalmente la potencia. El término «OX40» hace referencia a superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 4 (TNFRSF4), por ejemplo, Número de Adhesión a GenBank NP_003318.1 (CARs de «tercera generación»).

[0159] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el dominio intracelular comprende CD28-CD3z, CD3z, CD28- CD137-CD3z. El término «CD137» hace referencia a superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 9 (TNFRSF9), por ejemplo, Número de Adhesión a GenBank NP_001552.2 de «tercera generación»).

[0160] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, cuando se diseña la molécula CAR para una célula asesina natural, entonces, el dominio de señalización puede ser CD28 y/o CD3Z. El dominio transmembrana puede derivarse de una fuente natural o de una sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivarse de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Las regiones transmembrana de uso particular en esta invención pueden derivarse de (es decir, comprenden como mínimo la(s) región(es) transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativamente el dominio transmembrana puede ser sintético, en cuyo caso comprenderá predominantemente residuos hidrofóbicos, tales como leucina y valina. Preferiblemente se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. Opcionalmente, un enlazador corto de oligopéptido o polipéptido, preferiblemente entre 2 y 10 aminoácidos de longitud puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplasmático del CAR. Un doblete de glicinaserina proporciona un enlazador particularmente adecuado.

[0161] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el dominio transmembrana comprendido en la molécula CAR de algunas realizaciones de la invención es un dominio transmembrana que se asocia de manera natural con uno de los dominios en el CAR. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse utilizando sustitución de aminoácido para evitar la unión de tales dominios a los dominios transmembrana de proteínas de la misma o diferente superficie para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

[0162] De acuerdo con algunas realizaciones, entre el dominio extracelular y el dominio transmembrana de la molécula CAR o entre el dominio citoplasmático y el dominio transmembrana de la molécula CAR, se puede incorporar un dominio separador. Tal como se utiliza en el presente documento, por lo general, el término «dominio separador» significa cualquier oligopéptido o polipéptido que sirve para unir el dominio transmembrana a, tanto el dominio extracelular o el dominio citoplasmático en la cadena de polipéptidos. Un dominio separador puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferiblemente desde 10 hasta 100 aminoácidos y más preferiblemente desde 25 hasta 50 aminoácidos.

[0163] De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una entidad de unión por afinidad tal como se define en el presente documento para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto la entidad de unión por afinidad, tratando de este modo el cáncer en el sujeto.

[0164] Por supuesto, la selección del TCRL dependerá de su presentación en la patología. Los TCRLs de ejemplo y su asociación con patologías se proporcionan en las Tablas del mismo documento anteriormente.

[0165] El término «tratamiento» hace referencia a inhibición, prevención o detención del desarrollo de una patología (enfermedad, trastorno o condición) y/o causa la reducción, remisión o regresión de una patología. Los expertos en la técnica entenderán que se pueden utilizar diferentes metodologías y ensayos para evaluar el desarrollo de una patología, y, de manera similar, se puede utilizar diferentes metodologías y ensayos para evaluar la reducción, remisión o regresión de una patología.

[0166] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «sujeto» incluye mamíferos, preferiblemente seres humanos de cualquier edad que padecen la patología.

[0167] Los anticuerpos de algunas realizaciones de la invención pueden administrarse a un organismo de por sí o en una composición farmacéutica en la que se mezclan con portadores y excipientes adecuados.

[0168] Tal como se utiliza en el presente documento una «composición farmacéutica» hace referencia a una preparación de uno o más principios activos descritos en el presente documento con otros componentes químicos componentes, tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar administración de un compuesto a un organismo.

[0169] En el presente documento el término «principio activo» hace referencia al anticuerpo responsable del efecto biológico.

[0170] En adelante, las frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable", que pueden utilizarse indistintamente hacen referencia a un portador o un diluyente, que no causa irritación significativa a un organismo y que no deroga la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Un adyuvante se incluye en estas frases.

[0171] En el presente documento, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aun más la administración de un ingrediente activo. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diferentes azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

[0172] Se puede encontrar las técnicas de formulación y administración de fármacos en "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, la última edición.

[0173] Las vías de administración pueden incluir, por ejemplo, administración oral, rectal, transmucosal, especialmente transnasal, intestinal o parenteral, que incluyen inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como también inyecciones intratecales, directas intraventriculares, intracardíacas, por ejemplo en la cavidad ventricular derecha o izquierda, en la arteria coronaria común, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.

[0174] Los enfoques convencionales de administración de fármacos al sistema central nervioso (CNS) incluyen: estrategias neuroquirúrgicas (por ejemplo, inyección intracerebral o infusión intracerebroventricular); manipulación molecular del agente (por ejemplo, producción de una proteína de fusión que comprende un péptido transportador que tiene una afinidad con una molécula de superficie celular endotelial en combinación con u agente que en sí es incapaz de atravesar el BBB) en un intento de aprovechar una de las vías endógenas de transporte del BBB; estrategias farmacológicas diseñadas para aumentar la solubilidad lipídica de un agente (por ejemplo, conjugación de agentes solubles en agua con portadores de lípidos o colesterol); y la interrupción transitoria de la integridad del BBB por el trastorno hiperosmótico (provocado por la infusión de una solución de manitol en la arteria carótida o el uso de un agente biológicamente activo, tal como un péptido de angiotensina). Sin embargo, cada una de estas estrategias tiene limitaciones, tales como los riesgos inherentes asociados a un procedimiento quirúrgico invasivo, una limitación de tamaño impuesta por una limitación inherente en los sistemas endógenas de transporte, efectos secundarios biológicos potencialmente no deseables asociados a la administración sistémica de una molécula quimérica que comprende un motivo de portador que podría ser activo fuera del CNS y el posible riesgo de daño cerebral dentro de las regiones del cerebro donde se interrumpe el BBB, que representa un procedimiento de administración deficiente.

[0175] Alternativamente, se puede administrar la composición farmacéutica de un modo local en lugar de sistémico, por ejemplo, a través de una inyección de la composición farmacéutica directamente en una región de tejido de un paciente.

[0176] El término «tejido» hace referencia a una parte de un organismo que consiste en células diseñadas para llevar a cabo una función o funciones. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tejido cerebral, retina, tejido cutáneo, tejido hepático, tejido pancreático, huso, cartílago, tejido conectivo, tejido sanguíneo, tejido muscular, tejido cardíaco, tejido cerebral, tejido vascular, tejido renal, tejido pulmonar, tejido gonadal, tejido hematopoyético.

[0177] Las composiciones farmacéuticas de algunas realizaciones de la divulgación puede elaborarse utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando procedimientos de mezclado, disolución, granulación, fabricación de peladillas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o procesos de liofilización convencionales.

[0178] Por consiguiente, las condiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación pueden formularse de manera convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y ayudantes, que facilitan el procesamiento de los principios activos en preparaciones que pueden utilizarse farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración escogida.

[0179] Para la inyección, los principios activos de la composición farmacéutica pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones compatibles fisiológicamente, tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salado fisiológico. Para la administración transmucosal, se utilizan en la formulación los penetrantes adecuados para la barrera para penetrar. Normalmente tales penetrantes se conocen bien en la técnica.

[0180] Para la administración oral, la composición farmacéutica puede formularse fácilmente utilizando combinación del principio activo con portadores farmacéuticamente adecuados bien conocidos en la técnica. Tales portadores permiten que la composición farmacéutica se formule como comprimidos, píldoras, peladillas, cápsulas, líquidos, geles, siropes, suspensiones y similares para la ingesta oral por un paciente. Las preparaciones para el uso oral pueden fabricarse utilizando un excipiente sólido, opcionalmente, moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir ayudantes adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de caramelos. Los excipientes adecuados son, de manera particular, rellenos, tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa sódica; y/o polímeros fisiológicamente aceptables, tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se puede añadir agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio.

[0181] Los núcleos de peladillas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Con este fin, pueden utilizarse las soluciones concentradas de azúcar que, opcionalmente, pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes o mezclas de disolventes orgánicos adecuados. Se puede añadir los colorantes o los pigmentos a los recubrimientos de comprimidos o peladillas para la identificación o la caracterización de diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.

[0182] Las composiciones farmacéuticas que pueden utilizarse por la vía oral, incluyen cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, así como también cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los principios activos mezclados con relleno, tal como lactosa, aglutinantes, tales como almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los principios activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como ácidos grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Adicionalmente, se puede añadir estabilizadores. Todas las formulaciones para la administración oral deberían estar en dosis adecuadas para la vía de administración escogida.

[0183] Para la administración bucal, las composiciones pueden estar en forma de comprimidos o tabletas formulados de una manera convencional.

[0184] Para la administración por inhalación nasal, los principios activos para su uso de acuerdo con algunas realizaciones de la invención se administran de manera conveniente en forma de una presentación de espray en aerosol en un envase o un nebulizador presurizado con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En caso de un aerosol presurizado, se pueden determinar la unidad de dosis proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y los cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un dispensador pueden formularse con contenido de una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuado, tal como lactosa o almidón.

[0185] La composición farmacéutica descrita en el presente documento puede formularse para la administración parenteral, por ejemplo, utilizando inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para la inyección pueden existir en forma de unidad de toma, por ejemplo, en ampollas o en recipientes con múltiples dosis con, opcionalmente, un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos grasos o acuosos y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

[0186] Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los principios activos pueden prepararse como suspensiones apropiadas de inyección basadas en aceite o agua. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias, que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener, también, estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los principios activos para permitir la preparación de soluciones de alta concentración.

[0187] Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, solución a base de agua libre de pirógenos, estéril, antes de su uso.

[0188] La composición farmacéutica de algunas realizaciones de la divulgación puede formularse, también, como composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, utilizando, por ejemplo, bases de supositorios convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

[0189] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de algunas realizaciones de la divulgación incluyen composiciones en las que los principios activos se contienen en una cantidad eficaz para alcanzar la finalidad prevista. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de principios activos (TCRL-anticuerpo) eficaz para prevenir, mitigar o mejorar los síntomas de un trastorno (por ejemplo, cáncer) o alargar la supervivencia del sujeto al que se está tratando.

[0190] La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente según la descripción detallada proporcionada en el presente documento.

[0191] Para cualquier preparación utilizada en los procedimientos de la divulgación, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz puede calcularse inicialmente a partir de los ensayos in vitro y de cultivo celular. Por ejemplo, una dosis puede formularse en los modelos de animales para conseguir una concentración o un título deseado. Tal información puede utilizarse para determinar de manera más precisa dosis útiles en humanos.

[0192] La toxicidad y la eficacia terapéutica de los principios activos descritos en el presente documento pueden determinarse utilizando procedimientos farmacéuticos estándares in vitro, en cultivos celulares o animales de laboratorio. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos in vitro y de cultivos celulares y estudios de animales pueden utilizarse en la formulación de una variedad de dosis para su uso en humanos. La dosis puede variar dependiendo de la forma de administración utilizada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosis pueden escogerse por cada médico en consideración de la condición del paciente. (Véanse, por ejemplo, Fingl, et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Capitulo 1 página 1).

[0193] La cantidad e intervalo de dosis puede ajustarse de manera individual para proporcionar los niveles de TCRL (el tejido TCRL) del principio activo son suficiente para inducir o suprimir el efecto biológico (contratinción mínima eficaz, CME). La c Me variará para cada preparación, pero puede calcularse a partir de los datos in vitro. La dosificación necesaria para lograr la CME dependerá de las características individuales y la vía de administración. Se puede utilizar los ensayos de detección para determinar las concentraciones de plasma.

[0194] Dependiendo de la gravedad y la capacidad de respuesta de la condición a tratar, la dosis puede ser una única administración o una pluralidad de administraciones, con el curso de tratamiento que dura desde varias días hasta varias semanas o hasta que la cura sea eficaz o se alcance la disminución del estado de enfermedad.

[0195] La cantidad de una composición a administrar dependerá naturalmente del sujeto al que se trata, la gravedad de la aflicción, la vía de administración, el juicio del médico quien la prescribe, etc.

[0196] Las composiciones de algunas realizaciones de la divulgación pueden, si se desea, presentarse en un lote o un dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por el FDA (de diagnóstico o terapéutico), que puede contener una o más formas de unidades de toma que contienen el principio activo. El lote puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o plástica, tal como un envase blíster. El lote o el dispositivo dispensador pueden incluir las instrucciones de administración. El lote o el dispensador puede incluir también una notificación asociada al recipiente en una forma estipulada por una agencia gubernamental que regula la producción, el uso o la venta de fármacos, cuya notificación es la refección de la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones o la administración humana o veterinaria. Tal notificación, por ejemplo, puede ser el etiquetado aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. u U. para los fármacos de prescripción o un prospecto del producto aprobado. Las composiciones que comprenden una preparación de la divulgación formulada en un portador farmacéuticamente compatible puede prepararse también, colocada en un envase apropiado, y etiquetado para el tratamiento de una condición indicada, tal como se detalla con más precisión anteriormente.

[0197] Se espera que durante la vida de un paciente que se cura a partir de esta aplicación se desarrollarán muchos TCRLs relevantes y el ámbito del término TCRLs pretende incluir a priori todas tales nuevas tecnologías.

[0198] Tal como se utiliza en el presente documento el término «aproximadamente» hace referencia a ± 10 %.

[0199] Los términos «comprende», «que comprende», «incluye», «que incluye», «que tiene» y sus conjugaciones significan «que incluyen, pero no están limitados a».

[0200] El término «que consiste en» significa «que incluye y está limitado a».

[0201] El término «que consiste esencialmente en» significa que la composición, el procedimiento y la estructura pueden incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solamente, si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran sustancialmente las características básicas e innovadoras de la composición, el procedimiento y la estructura reivindicados.

[0202] Tal como se utiliza en el presente documento, la forma singular de «un», «una» y «el/la» incluye las referencias en plural a menos que el contexto claramente indique lo contrario.. Por ejemplo, el término «un compuesto» o «como mínimo un compuesto» puede incluir una pluralidad de compuestos, que incluyen mezclas de los mismos.

[0203] A lo largo de esta solicitud, se pueden presentar varias realizaciones de esta invención o divulgación en un formato de oscilación. Debe entenderse que la descripción en formato de oscilación es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención o la divulgación. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un rango ha revelado específicamente todos los subrangos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de aquel rango. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un rango tal como desde 1 hasta 6 tiene subrangos específicamente divulgados tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese rango, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango.

[0204] Siempre que un rango numérico se indica en el presente documento, significa que incluye cualquier número (fraccional o entero) dentro del rango indicado. Las frases «que oscila/oscila entre» un primer número indicado y un segundo número indicado y «que oscila/oscila desde» un primer número indicado «hasta» un segundo número indicado se utilizan en el presente documento indistintamente y pretenden incluir el primer y el segundo número indicado y todos los números fraccionales y enteros entre ellos.

[0205] Tal como se utiliza en el presente documento el término «procedimiento» hace referencia a modos, medios, técnicas y procedimientos de cumplimiento de una tarea dada que incluyen, pero no se limitan a, aquellos modos, medios, técnicas y procedimientos conocidos o fácilmente desarrollables a partir de modos, medios, técnicas y procedimientos por profesionales en materias químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.

[0206] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «tratar» incluye derogar, sustancialmente inhibir, ralentizar o revertir la evolución de una condición, mejorar sustancialmente síntomas clínicos o estéticos de una condición o sustancialmente prevenir la apariencia de síntomas clínicos o estéticos de una condición.

[0207] Cuando se hace una referencia a listas de secuencias particulares, tal referencia se interpreta como la que abarca también las secuencias que corresponden sustancialmente a su secuencia complementaria tal como que incluye variaciones de secuencias menores, que son producto de, por ejemplo, errores de secuenciación, errores de clonación u otras alteraciones que dan lugar a sustitución de base, destrucción de base o adición de base, a condición de que la frecuencia de tales variaciones es inferior a 1 en 50 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 100 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 200 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 500 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 1000 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 5.000 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 10.000 nucleótidos.

[0208] Se aprecia que determinadas características de la divulgación, que están, para la claridad, descritas en el contexto de realizaciones separadas, pueden proporcionarse también en combinación con una realización única. Por otro lado, diferentes características de la divulgación, que se describen, para la brevedad, en el contexto de una única realización, pueden proporcionarse también por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como es apropiado en cualquier otra realización descrita de la divulgación. Determinadas características descritas en el contexto de varias realizaciones, no deberían considerarse características esenciales de aquellas realizaciones, a menos que la realización es ineficaz sin aquellos elementos.

[0209] Diferentes realizaciones y aspectos de la presente invención o divulgación tal como se definen en el presente documento anteriormente y tal como se reivindican en el apartado de reivindicaciones a continuación obtienen apoyo en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

[0210] A continuación se hace la referencia a los siguiente ejemplos, que conjuntamente con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de un modo no limitativo.

[0211] Normalmente, la nomenclatura que se utiliza en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican minuciosamente en la literatura. Véanse, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., edición (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías tal como se exponen en las Patentes de EE. UU. Números 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., edición (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Tercera Edición; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I III Coligan J. E., edición (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la literatura de patentes y científica, véanse, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. Números 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., edición (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., ediciones (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., ediciones (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., edición (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Volumen 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Se proporcionan otras referencias generales a lo largo de este documento. Se cree que los procedimientos en el documento se conocen bien en la técnica y se proporcionan para la comodidad del lector.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS GENERALES

Producción de complejos de MHC-péptido de cadena única biotinilados

[0212] Los complejos de MHC (scMHC)3-péptido de cadena única se crearon utilizando replegado in vitro de cuerpos de inclusión producidos en Escherichia coli durante la introducción de isopropil Dp-D-tiogalactósido (IPTG). En resumen, un scMHC, que contiene la p2-microglobulina y los dominios extracelulares del gen HLA-A2 que se conectan uno con el otro a través de un enlazador flexible, se modificó para contener la secuencia de reconocimiento BirA para la biotinilación específica de sitio en el extremo C terminal (scMHC-BirA). Se llevó a cabo el replegado in vitro en presencia de péptidos tal como se describe. Los complejos de MHC-péptido plegados correctamente se aislaron y se purificaron utilizando cromatografía Q-Sepharose de intercambio de aniones (GE Healthcare Life Sciences), seguido de biotinilación específica de sitio que utiliza enzima BirA (Avidity). Una descripción más detallada para la producción de complejos MHC-péptido de cadena única se proporciona en Denkberg, et al. (2002) PNAS. 99:9421-9426.

Citometría de flu jo

[0213] Las células T2 híbridas de T-B se lavaron con medio RPMI 1640 libre de suero y se incubaron durante la noche con el medio que contenía 10'4-10'5M de tirosinasa369-377YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 1)/ WT1-I26-134 (RMFPNAPYL, SEQ ID NO: 141) péptido/ MAGE-A4230-239 SEQ ID NO: 176/MAGE-A9223-231 203/PAP112-120 SEQ ID NO: 230 péptido o péptidos de control relevantes (enumerados en la Tabla 15 a continuación). La eficiencia de carga de péptidos se verificó utilizando el rango entre MFI de HLA-A2-anticuerpo de unión BB7.2 sobre las células T2 cargadas con péptidos y MFI de células T2 descargadas (>1) los datos no se muestran.

[0214] Las células T2 o primarias o líneas celulares (106) se incubaron con 10 pg/ml de Ab específico (con o sin biotinilación) durante 1 hora a 4 °C, seguido de incubación con Ab de anti-ratón/humano/estreptavidina marcado con PE durante 45 minutos a 4 °C. Se apreciará que el trabajo con el anticuerpo secundario anti ratón o con estreptavidina proporciona resultados similares para D11 y B47B6. Finalmente las células se lavaron y se analizaron utilizando:

FACS 1:

Máquina: BD FACS calibur

Software de análisis: CELLQuest

FACS 2:

Máquina: Coulter NAVIOS

Software de análisis Beckman: Kaluza versión 1.3

Producción de anticuerpos similares a TCR para HLA-A2/tirosinasa369-377/ WT1^126-134/MAGE-A4^230-239/MAGE-A9^223-231/PAP^112-120utilizando la técnica de hibridoma

[0215] Los ratones HHD se inmunizaron a través de 5-6 inyecciones del complejo HLA-A2-péptido de 50 pg/ratón. Se administraron 2-3 inyecciones subcutáneamente con la adición de adyuvante QuilA. Los clones de hibridoma se generaron utilizando esplenocitos aislados de ratones inmunizados con el complejo mencionado anteriormente (tal como se describió previamente, por ejemplo, Weidanz et al. 2011 Int. Rev. Immunol. 30:328-340) con células de mieloma NSO y se cribaron y aislaron utilizando el análisis ELISA diferencial, tal como se describe a continuación. Por ejemplo, para la selección de TCRLs de Tirosinasa los complejos de HLA-A2 de péptido de TyrD369-377 se utilizaron y se compararon con los complejos HLA-A2 (SEQ ID NO: 2 Y^lL^pAIVHI) de péptido de control p68-DDX5 no relevante. Se utilizó ELISA con complejos HLA-A2-Tyr purificados así como también con complejos HLA-A2 de control que muestran otros péptidos limitados a HLA-A2 (Tabla 15) para seleccionar clones específicos. Se subclonaron y se secuenciaron clones de hibridoma aislados. Se caracterizaron los dos clones 906-11-D11 (denominado D11, Figura 68) y 905-2-D7 (denominado D7, Figura 69).

[0216] Se recogieron los hibridomas se crecieron hasta >80% de confluencia en un medio HAT DMEM o DCCM2 libre de suero y sobrenadante. Se aisló la IgG purificada del sobrenadante de cultivo utilizando cromatografía por afinidad que utiliza columna de Proteína A. El análisis SDS-PAGE de proteína purifica mostró IgG homogénea, pura con la masa molecular esperada de ~ 150 kDa.

Construcción de Ab IgG entero

[0217] Los genes H y L de Fab (solamente para MC1) se clonaron para la expresión como IgG1 ^kAb humana en los vectores de expresión eucariotas los vectores de expresión eucariotas pOptivEc y pcDNA3,3-TOPO respectivamente. Cada vector lanzadera de expresión lleva una parte diferente de gen (para pOptiVEC el DHFR/HT- y para pcDNA3,3 Geneticina). La expresión se facilitó mediante la co-transfección de las dos construcciones en las células DG44 derivadas de ovario de hámster chino (CHO), deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) en un cultivo de suspensión utilizando el reactivo FreeStyle MAX (Invitrogen). Después de la co-transfección, las células se cultivaron en un medio selectivo. Los clones que reaccionaron específicamente con células JY T2 pulsadas con péptido 369-377 de tirosinasa se adaptaron al crecimiento en suero de 0,5 % y se purificaron adicionalmente utilizando cromatografía por afinidad con proteína A. El análisis SDS-PAGE de proteína purifica mostró IgG homogénea, pura con la masa molecular esperada de ~ 150 kDa.

ELISA con sobrenadante o Abs purificados

[0218] Las especificidades de unión de sobrenadantes individuales o anticuerpos TCRL purificados se determinaron utilizando complejos scMHC-péptido biotinilados. La bandeja de ELISA con 96 pocillos de máxi sorp (Nunc #442404) se cubrieron con BSA-biotina (1 pg/pocillo) durante la noche. Después del lavado, las bandejas se incubaron (1 hora, TA) con estreptavidina (1 pg/pocillo), lavadas exclusivamente, e incubadas adicionalmente (1 hora, TA) con 0,25 pg de complejos MHC/péptido. Las bandejas se bloquearon durante 30 minutos a TA con PBS/2% de leche desnatada y posteriormente se incubaron durante 1 hora a ^tA con 1 pg/pocillo de sobrenadante o anticuerpos TCRL purificados. Después del lavado, las bandejas de se incubaron con Ab HRP-conjugado/anti-humano o de ratón. La detección se llevó a cabo utilizando reactivo de tetrametilbencidina de TMB (DAKO, S1599). Los péptidos limitados a HLA-A2 se utilizaron para los estudios de especificidad del sobrenadante purificado o los anticuerpos TCRL purificados.

Análisis de unión de resonancia por plasmones superficiales (SPR) de Proteon XPR36

[0219] La inmovilización de anticuerpo similar a TCR de IgG TCR sobre un chip de GLM (Medio de Capa General) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) a 25°C en la orientación vertical y el tampón de migración continua era PBST (10 mM de Na-fosfato, 150 mM de NaCl, y 0,005% de Tween 20, pH 7.4). Se activaron los cinco canales con 50 pl de una mezcla de 0,04 M de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y 0,01 M de sulfo-N-hidroxisuccinimida (Sulfo-NHS) a una velocidad de flujo de 30 pl/min. La IgG/NeutrAvidina anti-ratón o humana se diluyó en 10 mM de tampón de acetato de sodio con pH 4.5 hasta una concentración final de 25 pg/ml y 150 pl se inyectaron seguido de una inyección de 150 pl de 1 M de etanolamina-HCl con pH 8.5. El ligando de complejo HLA-A2/Tirosinasa/WT1/MAGE- A4/MAGE-A9/PAP recombinante de cadena única biotinilado de IgG de anticuerpo TCRL/ purificada se diluyó en PBST hasta 5-10 pg/ml y se inyectaron 90 pl en la orientación vertical con una velocidad de flujo de 30 pl/minuto. El sexto canal permaneció vacío para servir como referencia. El anticuerpo TCRL de HLA-A2/Tirosinasa/WT1/MAGE-A4/MAGE-A9/PAP complejo/Fab se inyectó (75 pl a 50 pl/minuto) en la orientación horizontal del ProteOn utilizando cinco concentraciones diferentes (1000, 500, 250, 125 y 62,5 nM). El tampón de migración se inyectó de manera simultánea en el sexto canal para la doble referencia para corregir la pérdida de los anticuerpos capturados de la superficie del sensor de chip durante el experimento. Se recogieron, se procesaron y se analizaron todos los sensogramas de unión utilizando el software integrado de ProteOn Manager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, EE. UU.) Las curvas de unión se ajustaron utilizando el modelo Langmuir que describe estequiometría de unión 1:1 o con el modelo de Langmuir y de limitación de transferencia de masas.

Ensayos funcionales

Ensayo de liberación de LDH

[0220] Se midió la eliminación de células diana redirigidas a TCRL biespecífico en un ensayo de citotoxicidad no radioactiva utilizando CytoTox96® (Promega). Este ensayo midió cuantitativamente lactato deshidrogenasa (LDH), una enzima que se libera durante la lisis celular. La LDH liberada en sobrenadantes de cultivos se mide con un ensayo enzimático combinado de 10 minutos, que da lugar a la conversión de una sal de tetrazolio (INT) en un producto de fromazano rojo. La cantidad de color producido es proporcional al número de células lisadas.

[0221] Específicamente, las células diana y células efectoras se lavaron, se contaron y volvieron a suspender en un medio de cRPMI (1% de FBS) sin fenol rojo. Las células diana se ajustaron a una densidad celular de 2,5 x 105 de células por ml y las células efectoras a una densidad celular de 2,5 x 106de células por ml. 40 pl (1 x 104 de células) de células diana se cultivaron en una bandeja con forma de V de 96 pocillos. Se preparó una reserva con concentración de 5 veces del reactivo de prueba TCRL biespecífico con la concentración de prueba más alta, que se diluyó en serie de 1 en 10 en un medio sin rojo de fenol en una bandeja separada para producir otras concentraciones de prueba. A continuación se añadió el TCRL biespecífico a las células diana en la bandeja de ensayo a 20 |jl por pocilio para producir las cantidades de valor final indicado. La bandeja de ensayo que contenía las células diana que se mezcló con el TCRL biespecífico se incubó a continuación durante 20 minutos a 37 °C/5 % CO2. Después de la incubación, se añadieron 40 j l de células efectoras (1 x 105 de células) a cada pocillo dando lugar a una proporción de efector diana (E:T) de 10:1. Se establecieron los pocillos de control con células efectoras solamente para calcular la liberación espontánea efectora, células diana solamente para calcular liberación espontanea de diana con 80 jg/m l de digitonina final para calcular la liberación máxima. Cada condición se puso a prueba en triplicados a un volumen final de 100 jl. La bandeja se incubó a 37 °C/5 % de CO2 durante 24 horas. Después del periodo de incubación, la bandeja se centrifugó a 700 x g durante 5 minutos y 50 j l se transfirieron de cada pocillo al pocillo correspondiente en una bandeja Maxisorb con fondo plano de 96 pocillos (Nunc). La mezcla de sustrato CytoTox96® se reconstruyó utilizando un tampón de ensayo CytoTox96®, según instrucciones de fabricante, y se añadieron 50 j l a cada pocillo de la bandeja. La bandeja se cubrió con papel de aluminio y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación se registró la absorción a 490 nm en un lector de placas. A continuación se calculó un porcentaje de citotoxicidad utilizando la siguiente ecuación: Lisis específica = [(Experimental - Espontánea de Efector - Espontánea de Diana)/(Máximo de Diana - Espontáneo de Diana)] x 100. Se aislaron los PBMCs para los ensayos de eliminación de voluntarios sanos y con todas las aprobaciones legislativas de IRBs y permisos escritos. Se aislaron los PBMCs efectores utilizando el procedimiento de Lymphoprep.

Líneas celulares tumorales y células primarias normales

[0222] Las líneas celulares A375 (melanoma), U2OS (osteosarcoma), TCCSUP (carcinoma de vejiga) y Fib (fibroblastos) se cultivaron en DMEM completo suplementado con 10 % de FBS (todos suministrados por GlBcO).

501A, SKMel5, Mewo y 1938 (melanoma), Saos2 (osteosarcoma), Panel (carcinoma pancreático), J82 y UMUC3 (vejiga), H1703 (adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas), JVM2 (linfoma de células de manto), IM9 (mieloma múltiple), U266 (mieloma) y SW620 (adenocarcinoma colorrectal) se cultivaron en RPMI completo suplementado con 10 % de FBS (todos suministrados por GIBCO). Malme3m (melanoma), JEKO1 (linfoma de células de manto), SET2 (trombocitemia esencial) y BV173 (leucemia precursora de células B) eran cultivos en RPMI completo suplementado con 20 % de FBS (todos suministrados por GlBCO). THP-1 (AML) se cultivaron en RPMI completo suplementado con 10 % de FBS (todos suministrados por GIBCO) y 0,05mM beta-mercaptoetanol (suministrados por Thermo-fisher). OVCAR-3 (adenocarcinoma de ovarios) se cultivaron en RPMI completo suplementado con 20 % de FBS (todos suministrados por GIBCO) y 0,01 mg/ml de insulina bovina (suministrados por Sigma). Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada de 7,5 % de CO2 y se compraron en American Type Culture Collection.

[0223] Los Hepatocitos primarios normales, miocitos cardíacos, osteoblastos, astrocitos, células epiteliales bronquiales, células de musculo liso de colon, células uroteliales y células epiteliales renales se obtuvieron de Sciencell y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada de 7,5 % de CO2.

La expresión y la purificación de Fab Abs recombinante soluble en sistema Expi293

[0224] Los genes VH-CH1 y VL-CL de Tyr D11 y D7, MAGE-A4 C106B9, WT1 B47B6 y ESK1 IgGs se clonaron para la expresión como Fab en el vector pcDNA3.4 de expresión eucariota. La etiqueta His se conectó con el extremo C-terminal de la región CH1.

[0225] La expresión se facilitó mediante la co transfección de las dos construcciones (cadenas pesada y ligera) en las células humanas Expi293F en el medio de expresión Expi293 (ambos son componentes del sistema de expresión Expi293) mediante el reactivo de transfección Fectamina (Life technologies). Después de la co-transfección, las células se cultivaron durante 6 días. Después de 6 días las células se centrifugaron a 700 x g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante que contenía el D11, D7, C106B9, B47B6 o ESK1 Fab se eliminó de las células y se filtró a través de un filtro de 0,22j. A continuación, el sobrenadante se dializó durante la noche contra PBS.

[0226] La proteína recombinante de D11, D7, C106B9, B47B6 o ESK1 Fab se purificó utilizando columna por afinidad metálica (Talon) y se dializó durante la noche contra PBS. Los D11, D7, C106B9, B47B6 o ESK1 Fab se analizaron en SDS-PAGE reducido y no reducido.

Construcción, Expresión y Purificación de TCRLs Biespecíficos en sistema Expi293

[0227] Los genes VH-CH1 y VL-CL de Tyr D11 y D7, WT1 B47B6 y ESK1 y MAGE-A4 C106B9, IgGs se clonaron para la expresión como biespecíficos (BS) en el vector pcDNA3.4 de expresión eucariota (las secuencias se muestran en las Figuras 68-70, secuencias de ESK1 están disponibles en WO 2015/070061). Para el vector de cadena ligera de Tyr D11, WT1 B47B6 y ESK1 y MAGE-A4 C106B9, anti CD3 (clon UCHT1) scFv se conectaron con el extremo N-terminal de la región V^l(formato BS 3, #F3). Para el vector de cadena pesada, la etiqueta His se conectó con el extremo C-terminal de la región CH1. Para Tyr D7, anti 40 CD3 (clon UCHT1) scFv se conectó con el extremo N-terminal de la región VH de la cadena pesada (formato BS 1, #F1) y la región His se conectó con el extremo C-terminal de la región CH1.

[0228] La expresión se facilitó mediante la co transfección de las dos construcciones en las células humanas Expi293F en el medio de expresión Expi293 (ambos son componentes del sistema de expresión Expi293) mediante el reactivo de transfección Fectamina (Life technologies). Después de la co-transfección, las células se cultivaron durante 6 días. Después de 6 días las células se centrifugaron a 700 x g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante que contenía los anticuerpos biespecíficos de TCRL se eliminó de las células y se filtró a través de un filtro de 0,22|j. A continuación, el sobrenadante se dializó durante la noche contra PBS.

[0229] Las proteínas recombinantes BS-TCRLs se purificaron utilizando dos etapas de afinidad metálica (Talon) y cromatografía por exclusión de tamaño (Superdex 200 10/300 GL GE). Los BS-TCRLs purificados se analizaron en SDS-PAGE.

Ensayos in vivo

Para línea celular de melanoma 501A (ATCC, Manassas VA, EE. UU.)

[0230] Las células se cultivaron en un medio de crecimiento RPMI1640 (GIBCO, Waltham MA, EE. UU.) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (GIBCO, Waltham MA, EE. UU.). Se prepararon las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de donantes sanos utilizando tubos SepMateTM-50 (Stemcell).

[0231] En el día 0, los ratones NOD/SCID de ocho a diez semanas de edad (Envigo, Israel; n=6-8) se inocularon de manera simultánea (subcutáneamente) en un costado 5x106 de células de melanoma 501A /- 25x106 de PBMCs (proporción de Efector:Células Tumorales 5:1) a un volumen final de 0,25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS); TCRL biespecífico de D7 (0,1mg/kg) o vehículo (PBS) se administraron por la vía intravenosa a un volumen final de 0,2 ml, con 4 dosis adicionales administradas cada 24 horas.

Para línea celular de melanoma A375 (ATCC, Manassas VA, EE. UU.)

[0232] Las células se cultivaron en un medio de crecimiento RPMI1640 (GIBCO, Waltham MA, EE. UU.) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (GIBCO, Waltham MA, EE. UU.). Las células T CD8 activadas se prepararon con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) utilizando un protocolo de expansión rápida (REP). Las PBMCs se crearon a partir de sangre periférica de donante sano utilizando tubos SepMateTM-50 (Stemcell), seguido de enriquecimiento de células T CD8 utilizando un conjunto de Células T CD8 Humanas Dynabeads® Untouched™ (Invitrogen). Se llevó a cabo la activación de las células T CD8 en matraces prerecubiertos con anticuerpos monoclonales frente a CD3 (OKT3) y CD28 durante 72 horas en un medio suplementado con 10% de FBS y 100 IU/mL de IL-2 humana. Las células activadas se expandieron durante el periodo de 14 días en un medio suplementado con 10% de FBS, 3000 IU/ml de IL-2, 30ng/ml de OKT3 y 2x108 de PBMCs irradiadas.

[0233] En el día 0, los ratones NOD/SCID hembras desde ocho hasta diez semanas de edad (Envigo, Israel; n=6-8) se inocularon por la vía subcutánea (s.c.) en un costado 5x106 de células de melanoma A375 /- 10x106 de células T CD 8 REP (proporción de Efector: Célula tumoral de 2:1) con un volumen final de 0,25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS);TCRL biespecífico C106B9 MAGE-A4 (0,1mg/kg), TCRL biespecífico B47B6 WT1 (0,1mg/kg) o vehículo (PBS) se administraron por la vía intravenosa una hora después de la inoculación por la vía subcutánea en un volumen final de 0,2ml, con 4 dosis adicionales administradas cada 24 horas.

[0234] En ambos casos los tumores (501A y A375) se midieron dos veces por semana con calibradores en dos dimensiones perpendiculares y se calcularon los volúmenes de tumores con la siguiente fórmula:

Otros anticuerpos TCRL utilizados en el presente estudio

[0235] La generación de MC1 se describe en WO2008/120202.

[0236] La generación de ESK1 (Dao T, Yan S, Veomett N, Pankov D, Zhou L, Korontsvit T, Scott A, Whitten J, Maslak P, Casey E, Tan T, Liu H, Zakhaleva V, Curcio M, Doubrovina E, O'Reilly RJ, Liu C, Scheinberg DA. Targeting the intracellular WT1 oncogene product with a therapeutic human antibody. Sci Transl Med. 13 de marzo de 2013; 5(176):176ra33). Por consiguiente, ESK1 se generó utilizando la síntesis de genes sintéticos de acuerdo con la secuencia publicada WO 2015/070061 ESK1 VH completo - SEQ ID NO:128 y ESK1 VL completo - SEQ ID NO: 130 en el listado de secuencia de WO 2015/070061. El anticuerpo se produjo en las células HEK293 tal como IgG que utiliza el sistema Expi293 tal como se describió anteriormente y se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo utilizando cromatografía por afinidad a proteína A.

Extracción de ácidos nucleicos

[0237] El ARN total se extrajo de células cultivadas con células 1*D106- 5*D106 con RNeasy Plus Mini (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Síntesis de ADNc

[0238] ADNc se sintetizó a partir de 1-5 |jg de ARN, utilizando una combinación de oligo dT y hexámero aleatorio (1:1) con SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. F o PCR cuantitativa, ADNc se diluyó a 1:5 con H2O.

PCR convencional (PCR)

[0239] Las condiciones de ciclo de PCR eran 95 °C durante 2 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95 °C durante 20 segundos, 60 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto. La PCR se terminó con una extensión final de 72 °C durante 10 minutos. Las reacciones se realizaron con equipo KAPA HiFi PCR (Kapa Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0240] Se utilizaron los siguientes cebadores:

TYR_S: TTAGCAAAGCATACCATCA (SEQ ID NO: 3) y TYR_AS: CCAGACAAAGAGGTCATAA (SEQ ID NO: 4) para expresión de tirosinasa (tamaño esperado de producto: 117bp) y WT1_S: AGGCTGCAATAAGAGATA (SEQ ⁱD NO: 5) y WT1_AS: AGGCTGCAATAAGAGATA (SEQ ID NO: 6) para la expresión de WT1 (tamaño esperado de producto: 188bp).

[0241] Para visualizar los productos amplificados, se mezclaron 10 jL de muestras con 2 jL de tampón cargado 6x (New England Biolabs) y se sometieron a electroforesis en geles de agarosa de 1,5 % manchados con bromuro de etidio con marcadores de ADN (New England Biolabs). La presencia y la intensidad de grupos de producto de PCR se determino en ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences).

PCR cuantitativa (qPCR)

[0242] PCR cuantitativa se realizó utilizando TaqMan Gene Expression Master Mix en un equipo ABI 7300 (Applied Biosystems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las condiciones de ciclo para la PCR en tiempo real eran 95°C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 min. Las pruebas para la PCR en tiempo real se compraron en Applied Biosystems; en el extremo 5', se conjugaron con el FAM de fluorocromo. Se utilizaron los siguientes ensayos (cebadores y sondas): para TYR (cat# Hs00165976), para MAGE A4 (cat# Hs00751150), y para WT1 (cat# Hs01103751). Se utilizó beta-actina como un gen constitutivo para la normalización (cat# Hs99999903).

P i iliz n l r n i

EJEMPLO I:

ANTICUERPOS SIMILARES A TCR PARA HLA-A2/Tirosinasa Aislam iento de Abs con especificidad s im ila r a TCR para HLA- A2ltirosinasa369-377

[0243] Generación de complejo MHC-TyrD369-377- Los estudios anteriores realizados por los presentes inventores han mostrado la generación de anticuerpos recombinantes con especificidad específica de péptido, limitada a HLA-A2 hacia tumor y epítopos de células T víricas utilizando bibliotecas de fagos de anticuerpos largos. Estas moléculas se denominan anticuerpos similares a TCR. Para generar los anticuerpos con una especificidad hacia el complejo HLA-A2/TyrD369-377, se generaron los complejos péptido recombinante-HLA-A2 que presentan el péptido Tirosinasa (tirosinasa369-377YMDGTMSQV, SEQ ID NO: 1) utilizando una construcción MHC de cadena única. Los ratones HHD se inmunizaron a través de 5-6 inyecciones del complejo HLA-A2-péptido de 50 pg/ratón. Se administraron 2-3 inyecciones subcutáneamente con la adición de adyuvante QuilA. Se generaron los clones de hibridoma utilizando fusión de esplenocitos aislados de ratones inmunizados (tal como se describe anteriormente, por ejemplo, Weidanz et al. 2011 Int. Rev. Immunol. 30:328-340) con células de mieloma NSO y se cribaron y se aislaron utilizando ensayos de ELISA diferenciales tal como se describe anteriormente utilizando complejos de péptido TyrD369-377 y HLA-A2 plegados con el péptido de control p68-DDX5. Se utilizó ELISA con complejos HLA-A2-Tyr purificados así como también con complejos HLA-A2 de control que muestran otros péptidos limitados a HLA-A2 para seleccionar clones específicos. Se subclonaron y se secuenciaron clones de hibridoma aislados. Se caracterizaron los dos clones 906-11-D11 (denominado D11, Figura 69) y 905-2-D7 (denominado D7, Figura 68).

Caracterización de anticuerpos sim ilares a TCR con especificidad hacia HLA A2/tirosinasa 369-377

[0244] Para determinar la afinidad aparente de anticuerpos similares a TCR aislados, se utilizó el análisis de unión de resonancia por plasmones superficiales (SPR) en el que el anticuerpo similar a TCR de IgG purificada aislada se inmovilizó con el chip del sensor de SPR utilizando IgG anti-ratón para inmovilizar indirectamente los anticuerpos similares a TCR sobre la superficie del chip. El analito es el complejo HLA-A2/Tirosinasa recombinante de cadena única purificado utilizado a diferentes concentraciones. Tal como se muestra en la Figura 1, los sensorgramas de análisis de SPR revelaron afinidad similar para los clones MC1, D11 y D7 de anticuerpos similares a TCR específicos de HLA-A2/Tirosinasa con afinidad correspondiente de 4,1 nM para MC1 y D11 y 3,8 nM para D7. Estos resultados indican que todos tres clones de anticuerpos similares a TCR mostraron alta afinidad similar de 4nM hacia complejo HLA-A2/péptido específico.

[0245] Para investigar la especificidad de epítopo de péptido fino de los anticuerpos similares a TCR con relación a la alanina de péptido Tirosinasa 369-377 se llevó a cabo un escaneo en el que los residuos específicos en el péptido se mutaron a alanina y se puso a prueba la unión de los anticuerpos similares a TCR con péptido mutados a Ala utilizando su carga en las células presentadoras de antígeno T2. La unión se controló utilizando citometría de flujo y se comparó el grado de unión de anticuerpos similares a TCR con los péptidos presentes mutados tal como se midió utilizando intensidad de fluorescencia media (MFI) en comparación con los APCs T2 cargados con el péptido Tirosinasa no mutado nativo. La carga adecuada de diferentes péptidos mutados Ala (descritos en la Figura 2) se controló utilizando citometría de flujo que utiliza BB7.2 un anticuerpo monoclonal para HLA-A2.

[0246] Los péptidos mutados All Ala se cargaron eficazmente en las células T2 en comparación con el péptido Tirosinasa no mutado nativo (datos no se muestran). La eficiencia de carga de péptidos se verificó utilizando el rango entre MFI de Ab BB7.2 de unión a HLA-A2 sobre las células T2 cargadas con péptidos y MFI de células T2 no cargadas (>1).). Tal como se muestra en la Figura 2, todos tres anticuerpos similares a t Cr mostraron unión de dependencia a péptido dado que las mutaciones específicas afectaron la unión e indujeron una disminución en la intensidad de unión del anticuerpo similar a TCR al introducir Ala en posiciones específicas de péptido. Estos resultados indican que todos tres anticuerpos similares a TCR mostraron unión específica y limitada a péptido en el contexto de HLA-A2 cargado con diferentes péptidos Tirosinasa mutados a Ala, indicando que estos anticuerpos son similares a TCR en sus propiedades de unión, por lo tanto, se unen al complejo MHC-péptido de un modo limitado a MHC y específico de péptido.

[0247] Sin embargo, los anticuerpos similares a TCR se difieren en su especificidad fina y reactividad dependiente de péptidos con el número de posiciones en el péptido que eran sensibles a mutación de Ala y afectaron la sensibilidad de unión. Tal como MC1 mostró una disminución marcada de 90% en la unión de un péptido mutado a Ala único en una posición # 6, D11 y D7 mostraron una disminución de >90% en dos posiciones # 3, 6 para D11 y una disminución de >90% para D7 que se une en cuatro posiciones # 3, 4, 6, 7. Una disminución mas leve, pero altamente importante de > 70% en tres posiciones # 1, 3, 6 se comprobó adicionalmente para la unión de MC1 a péptidos mutados Ala mientras que D11 y D7 mostraron disminución importante en la unión de >70% cuando 5 residuos de péptidos se mutaron a Ala (posiciones # 1, 2, 3, 4, 6 para D11 y posiciones # 2, 3, 4, 6, 7 para D7).

[0248] En general, el análisis de escaneo de Alanina reveló que D11 y D7 están más afectados y sensibles a mutaciones Ala en comparación con MC1 tal como se observó utilizando la habilidad de diferentes péptidos Tyr mutados a Ala de unirse de manera apropiada a los anticuerpos similares a TCR específicos de Tyr. De acuerdo con los datos mostrados en la Figura 2, D11 y D7 están más limitados a péptidos y sensibles en sus propiedades de unión en comparación con MC1; son sensibles (no incluyendo posiciones de ancla) a mutaciones a Ala en 4 de 9 residuos de péptidos mientras que MC1 solamente en 3 posiciones. D11 y D7 son uniformemente sensibles en sus propiedades de unión en la 5a posición 7, y 5, respectivamente. Específicamente, D11 disminuye la unión en 68% en la posición #7, 67% en la posición #5, 59% en la posición #8; D7 disminuye la unión en 66% en la posición #5, 63% en la posición #1,63% en la posición #8.

[0249] Se concluye que se puede utilizar el escaneo de Ala como una medida para determinar la selectividad y la especificidad fina de anticuerpos similares a TCR. Dado que se muestra más sensibilidad hacia mutaciones Ala, se observará la unión más específica y dependiente de péptido. Esta estrategia se puede utilizar para filtrar y seleccionar los anticuerpos similares a TCR óptimos que mostraron la selectividad y propiedades de especificidad más altas y optimizadas como aglutinantes específicos de péptido limitados a MHC.

Selectividad de unión y especificidad de anticuerpos similares a TCR con relación a HLA-A2/Tirosinasa

[0250] Para caracterizar la especificidad de unión de los anticuerpos similares a TCR aislados, se evaluaron la reactividad y la especificidad de IgGs purificadas utilizando citometría de flujo. APCs T2 se cargaron con péptidos específicos y de control y se incubaron con el Ab, seguido de la incubación con anti-humano o ratón marcado con PE. Ab. Tal como se muestra en las Figuras 3-7, las IgGs MC1 (Figura 7), D11, y D7 (Figuras 3-6) se unieron a las células T2 cargadas con el péptido tirosinasa, pero no se unieron de manera significativa a las células cargadas con los péptidos de control (Tabla 15). Se observó la unión de fondo muy baja en los péptidos de control con la proporción de MFI de 3-7 para MC1 (Figura 7) mientras que D11 y D7 no mostraron ninguna unión de fondo (Figura 3-6). El alcance de presentación de péptido cargado se controló utilizando la unión de MAb BB7.2 que une todos los complejos HLA-A2. Estos resultados indican que todos tres anticuerpos similares a TCR mostraron la unión específica de péptido limitado a HLA-A2 dado que se unieron solamente a células que mostraban la Tirosinasa pero no otros péptidos limitados a HLA-A2.

[0251] Para estudiar si los Abs similares a TCR de HLA-A2/tirosinasa son capaces de unirse a complejos de MHC-tirosinasa derivados de manera endógena en la superficie de células tumorales, se realizó el análisis de citometría de flujo sobre las líneas derivadas de pacientes con melanoma. Las células se incubaron con anticuerpos Ab similares a TCR de anti-tirosinasa 369-377/HLA-A2 seguido de la incubación con Ab anti-humano o anti-ratón marcado con PE. Tal como se muestra en las Figuras 8-12 los anticuerpos similares a TCR reconocen las células tirosinasa- positivas y HLA-A2-positivas con una intensidad muy alta. Tal como se muestra esto indica que los números grandes de complejos HLA-A2-tirosinasa se encuentran sobre la superficie de las células de melanoma. La tinción con los anticuerpos similares a TCR era homogénea; la tinción intracelular de estas células de melanoma (por ejemplo, 624.38 y 501A) con Ab frente a la proteína tirosinasa mostró que ~95% de las células en cada línea puesta a prueba expresan la proteína tirosinasa (datas no se muestran). No se detectó ninguna reactividad con las células tirosinasa negativas o HLA-A2-negativas. La especificidad de los Abs similares a TCR de anti-tirosinasa/HLA- A2 se verificó utilizando el análisis extensivo de citometría de flujo de múltiples líneas celulares de diferentes orígenes histológicos que son HLA-A2 positivos y Ag (tirosinasa) negativos. Este análisis se muestra en las Figuras 10-12. La reactividad de D11 y D7 se puso a prueba sobre un panel de células primarias normales que incluyen células endoteliales, fibroblastos, astrocitos, hepatocitos, células renales, miocitos cardíacos, músculo de colon y PBMCs (Figuras 13-17). No se observó ninguna unión de estas células primarias normales de HLA-A2+ y Tyr- mientras que se observó la unión en el segundo plano cunado se puso a prueba MC1 en PBMCs (Figura 17). El resumen del análisis de reactividad de D11 y D7 con células de melanoma HLA-A2+/Tirosinasa+ así como también panel extenso de células de HLA-A2+/Tirosinasa de diferentes orígenes histológicos que incluyen las células primarias normales se muestra en las Figuras 18-19. La reactividad de anticuerpos similares a TCR de D11 y D7 parece extremadamente específica solamente en las células de melanoma que expresan HLA-A2 y el antígeno tirosinasa.

[0252] La conclusión general a partir de estos estudios es aquella que los Abs similares a TCR son específicos y reconocen solamente al complejo específico péptido-MHC presente en la superficie celular mientras que exista la combinación adecuada de alelo HLA y Ag. Sin embargo, la evaluación minuciosa de los datos de citometría de flujo mostró los resultados que demuestran la selectividad diferencial de MC1 en comparación con D11 y D7. Por ejemplo, el análisis de unión de MC1 a líneas celulares HepG2, SW620 y Loucy de HLA-A2+ y Tyr tal como se muestra en la Figura 9 revela la unión en segundo plano tal como se midió utilizando MFI, sin embargo, el análisis similar de D11 y D7 en estas células no reveló ninguna unión (Figura 10 y 12). La comparación conjunta de los tres anticuerpos similares a TCR en estas células y adicionales (Figura 12) reveló que MC1 mostró unión importante a células de melanoma HLA-A2+/Tyr+ pero no tuvo unión en segundo plano en una variedad de células HLA-A2+/Tyr+ (SW620, Colo205, HepG2, Panel, RPMI, DG75, Jeko1 y Loucy) mientras que D11 y D7 no mostraron ninguna unión en segundo plano a estas células.

[0253] Por lo tanto puede concluirse que D11 y D7 son más específicos y selectivos en comparación con MC1 y que los estudios de citometría de flujo integrales que utilizan un panel grande de células de orígenes histológicos diferentes que expresan el alelo apropiado HLA y son positivos o negativos para el antígeno son instrumentos útiles para evaluar la selectividad de anticuerpos similares a ^tC^r.

[0254] Para evaluar adicionalmente la especificidad fina de los anticuerpos similares a TCR específicos para Tirosinasa, se evaluó su reactividad con péptidos que muestran similitud secuencial con tirosinasa nativa (Tabla 5).

[0255] Por consiguiente, se realiza otra serie de selección de péptidos similares cuando están disponibles los datos de escaneo de Alanina/Glicina, tal como se describió anteriormente para un anticuerpo particular similar a TCR. Basándose en el escaneo de alanina, se midió y se evaluó la contribución de cada residuo de aminoácido en el antígeno de péptido con la unión a TCRL. Los péptidos similares que conservan las posiciones críticas se identifican utilizando instrumentos descritos anteriormente y se les asigna alta prioridad. Estos péptidos se sintetizan y se utilizan para la evaluación de especificidad fina tal como se describen anteriormente.

[0256] La estrategia descrita en el presente documento combina el análisis in silico de similitud secuencial de péptidos en combinación con el análisis de espectroscopia de masas de péptidos HLA eluidos, bases de datos de péptidos y escaneo de alanina proporciona una caja de herramientas para controlar completamente los parámetros de búsqueda de péptidos, más que cualquier otro instrumento tal como lo proporciona BLAST o ScanProsite. Se utilizan los parámetros adicionales que incluyen el rango de longitudes permitidas de péptidos, el número máximo permitido o diferencias en secuencia y el requisito para valorar la unión a HLA. El instrumento también aplica la necesidad de definir ciertos aminoácidos como equivalentes.Lo más importante es la habilidad de señalar los péptidos que se hayan encontrado utilizando espectrometría de masas o bases de datos de péptidos.

[0257] Utilizando los instrumentos descritos anteriormente, se evaluó la especificidad fina de los tres anticuerpos similares a TCR sintetizando un panel grande de péptidos similares que se han seleccionado para la evaluación de acuerdo con los criterios descritos en el presente documento (Tabla 5). Estos péptidos similares se han cargado en ATPc T2 APCs y se puso a prueba la reactividad de los anticuerpos similares a TCR. Tal como se muestra en la Figura 20, cuando se puso a prueba MC1 sobre un panel de péptidos similares en comparación con la unión a péptidos de tirosinasa nativa, se observó que mostraba unión en segundo plano a péptidos con la similitud secuencial a Tirosinasa, tal como KIAA0335 y KPNA1. Sin embargo, tal como se muestra en las Figuras 21-28, los anticuerpos similares a TCR de D11y D7 TCR no se unen a ningún péptido similar de un panel grande de tales que se analizaron utilizando la carga de péptidos que no incluyen ningún reconocimiento de los péptidos KIAA0335 y KPNA1 que mostraron unión en segundo plano a MC1. Estos datos demostraron la selectividad superior y la especificidad fina de D11 y D7 en comparación con MC1 y demuestra la utilidad del enfoque de péptidos similares e instrumentos desarrollados tal como se describe anteriormente como instrumentos importantes para evaluar la hierarquía de selectividad y especificidad fina, cuando se evalúa un panel de anticuerpos similares a TCR para el mejor y el óptimo candidato para evaluación adicional.

[0258] Sin embargo, después del escaneo de alanina de anticuerpos similares a TCR, se han seleccionado y se han puesto a prueba los péptidos similares adicionales. Dado que cada aminoácido dentro de la secuencia de péptido TyrD no parece contribuir de manera igual a la unión de Tyr TCRL, se definieron los residuos de péptidos críticos para el reconocimiento utilizando el Tyr TCRL. Se creó un conjunto de péptidos sintéticos en el que cada aminoácido del TyrD 9-mer se reemplazo de manera secuencial por alanina. La habilidad de Tyr TCRL de unirse a las células pulsadas con cada uno de estos péptidos sustituidos con alanina se determinó utilizando el análisis de FACS y se compararon los resultados de unión con aquellos obtenidos con los péptidos no mutados. El residuo en la posición en la que la sustitución de alanina da lugar a un aumento grande en la unión en comparación con el péptido no mutado, se consideró crítico. Se llevo a cabo una búsqueda in silico dirigida para identificar las secuencias de proteínas que contienen solamente el diseño de posiciones críticas. Estos péptidos se utilizaron también para la evaluación de especificidad de Tyr TCRLs (Tabla S17-S23). Estos péptidos similares derivados del análisis de escaneo de alanina se sintetizaron y se cargaron en células de APCs t 2 y se puso a prueba la reactividad de D11 y D7. Tal como se muestra en la Figura 28, no se observó ninguna unión a estos péptidos, de este modo, confirmado y fortaleciendo adicionalmente la especificidad fina y la selectividad de estos anticuerpos similares a TCR.

EJEMPLO IA

LA CARACTERIZACIÓN DE LOS ANTICUERPOS SIMILARES A TCR PARA HLA-A2/Tirosinasa

La comparación de la especificidad fina de Abs con la especificidad s im ila r a TCR con HLA-A2ltirosinasa369-377

[0259] Para caracterizar la especificidad de unión de los anticuerpos similares a TCR aislados, se evaluaron la reactividad y la especificidad de IgGs purificadas (con o sin biotinilación) utilizando citometría de flujo. APCs T2 se cargaron con péptido Tirosinasa o péptidos de control (Tabla 15) y se incubaron con el Ab (D7, D11 o MC1), seguido de la incubación con estreptavidina marcada con PE o Abs anti-ratón marcado con PE. Tal como se muestra en la Figura 38, TCRLs de D11 y D7 se unieron a las células T2 cargadas con el péptido tirosinasa, pero no muestran ninguna unión a las células cargadas con los péptidos de control. Por el contrario, MC1 TCRL mostró unión a las células T2 cargadas tanto con el péptido Tirosinasa como con el péptido irrelevante utilizado como control.

[0260] Para evaluar adicionalmente la especificidad de los anticuerpos similares a TCR de D7 y D11, se evaluó su reactividad con los péptidos que muestran similitud secuencial con el péptido tirosinasa. Los péptidos se muestran en la Tabla 5.

[0261] Tal como se muestra en la Figura 39 MC1 TCRL muestra unión fácilmente detectable a diferentes péptidos con similitud secuencial al péptido Tirosinasa tal como KIAA0335 y KPNA1 (Tabla 14) así como también a los péptidos marcados como S2, ^s4, S5, S9, S11, S13, S18, (S19, S22 y S23). Los anticuerpos similares a TCR de D11 y D7 no se unen a ninguno de los péptidos de este mismo panel de los péptidos similares. Estos datos demuestran la selectividad y la especificidad fina superiores de TCRLs D11 y D7 TCRLs en comparación con MC1 TCRL y demuestra la utilidad del enfoque de péptidos similares e instrumentos desarrollados tal como se describe anteriormente para evaluar la hierarquía de selectividad y especificidad fina de TCRLs.

[0262] Los inventores actuales exploraron la especificad de unión del Abs similar a TCR para HLA-A2/tirosinasa con los complejos de péptido MHC-tirosinasa mostrada de manera endógena sobre la superficie de líneas celulares de melanoma. Las células se incubaron con anticuerpos Ab similares a TCR de anti-tirosinasa 369-377/HLA-A2 (con o sin biotinilación) seguido de la incubación con estreptavidina marcada con PE o Abs anti-ratón. Se utilizó un panel de células tumorales y células primarias normales que se han caracterizado para la expresión HLA- A2 (positiva) y Tirosinasa (positiva o negativa) para comparar la unión de los anticuerpos similares a TCR. Tal como se muestra en las Figura 40A-C, los anticuerpos similares a TCR reconocieron las células tirosinasa- positivas y HLA-A2-positivas. Los anticuerpos similares a TCR se pusieron a prueba en múltiples líneas celulares HLA-A2-positivas de orígenes diferentes que no muestran la expresión Tyr ^aRⁿ(Tyr-negativo). Tal como se muestra en las Figuras 40A-B, los TCRLs D11 y D7 no se unieron a ninguna de estas células mientras que MC1 tintó fácilmente varias células HLA-A2+/Tyr-. Los TCRLs D7 y D11 TCRLs no mostraron ninguna unión a células primarias normales, mientras que MC1 mostró unión detectable a algunas de ellas (Figura 40C).

[0263] En general, los TCRLs D7 y D11 TCRLs demostraron la especificidad y la selectividad superiores reconociendo al péptido tirosinasa representado por superior HLA-A2 en comparación con MC1 TCRL.

[0264] Se utilizaron los ensayos funcionales para caracterizar adicionalmente los anticuerpos similares a TCR de D7 y D11. Las regiones variables de TCRLs se fusionaron con un anti-CD3 scFv que puede redirigir células T efectoras para eliminar células diana tumorales en un formato biespecífico. Tal como se muestra en las Figuras 41-44, las construcciones de anticuerpo similar a TCR biespecífico de D7 y D11 CD3 mostraron citotoxicidad resistente frente a células 501A de melanoma in vitro en presencia de PBMCs humanos. La línea celular Panc-1, Tirosinasa negativa sirvió como control negativo y no demostró ninguna citotoxicidad. No se detectó ninguna citotoxicidad frente a un panel de células primarias humanas normales HLA-A2+/Tyr- con TCRLs de D7 y D11 TCRLs que confirmaban su selectividad.

EJEMPLO IB:

Eficacia in vivo de D7 BS TCRL en modelo de formación de tum or de melanoma 501A subcutáneo en ratones NOD/SCID

[0265] La Figura 45 muestra eficacia in vivo en D7 BS TCRL en S.C. El modelo de formación tumoral de melanoma 501A en ratones NOD/SCID. Evidentemente, la administración del anticuerpo biespecífico inhibió completamente la formación de tumor en un periodo de 65 días del experimento, tal como se demostró con el volumen de tumor. Los resultados apoyan el uso de secuencias variables de los TCRLs descritos en el presente documento en entornos clínicos.

EJEMPLO II

ANTICUERPOS SIMILARES A TCR PARA HLA-A2/WT1

Aislamiento y caracterización de Abs con especificidad similar a TCR para HLA-A2/WT1

[0266] Para general tales anticuerpos con una especificidad para el complejo HLA-A2/WT1, se generaron los complejos péptido-HLA-A2 que muestran el péptido WT1 (RMFPNAPYL, SEQ ID NO: 151) que utiliza una construcción MHC de cadena única. La generación de anticuerpos era tal como se describió en los materiales y procedimientos generales así como también en el Ejemplo I anteriormente. Se aisló y se caracterizó un clon específico similar a TCR denominado B47 (también denominado como B47B6) (Figura 70).

[0267] Como una comparación para selectividad de unión a anticuerpo similar a TCR, un anticuerpo similar a TCR se denominó ESK1 Dao T, Yan S, Veomett N, Pankov D, Zhou L, Korontsvit T, Scott A, Whitten J, Maslak P, Casey E, Tan T, Liu H, Zakhaleva V, Curcio M, Doubrovina E, O'Reilly RJ, Liu C, Scheinberg DA.

[0268] La afinidad por unión de B47 se evaluó utilizando el análisis de unión de resonancia por plasmones superficiales (SPR) en el que el anticuerpo similar a TCR de IgG purificada se inmovilizó con el chip del sensor de SPR utilizando IgG anti-ratón para inmovilizar indirectamente los anticuerpos similares a TCR sobre la superficie del chip. El analito es el complejo HLA-A2/WT1 recombinante de cadena única purificado utilizado a diferentes concentraciones. Tal como se muestra en la Figura 29, los sensogramas del análisis ^sP^rmostraron una afinidad para el clon B47 del anticuerpo similar a TCR específico para HLA-A2/WT1 de 4,4nM.

[0269] Para caracterizar la especificidad de unión de los anticuerpos similares a TCR aislados, se evaluaron la reactividad y la especificidad de IgGs purificadas utilizando citometría de flujo. APCs T2 se cargaron con péptidos específicos o de control (Tabla 15) y se incubaron con el Ab, seguido de la incubación con Ab anti-humano o ratón marcado con PE. Tal como se muestra en las Figuras 30 y 31, B47 y ESK1 se unieron a las células T2 cargadas con el péptido WT1 (Figura 30) pero no se unieron a las células cargadas con los péptidos de control (Figura 31). La intensidad de unión observada para B47 y ESK1 era de diferencia significante. Mientras que B47 se unió de manera intensa a las células T2 cargadas con 10‘4-10‘5M de péptido, ESK1 se unió de manera más débil a las células T2 cargadas con 10-4M de péptido WT1 (MFI 18 para ESK1 en comparación con 474 para B47). Una concentración de péptido de 10-5 M de b47 todavía se unía de manera significativa (MFI 88) mientras que la unión de ESK1 era casi indetectable o muy baja (Figura 30). Estos resultados indican las diferencias marcadas en la afinidad y la sensibilidad de unión de B47 en comparación con ESK1 con fuerte disminución en la intensidad de unión de ESK1 en comparación con B47 con disminuciones de 10 x en la concentración de péptido. B47 y ESK1 no se unen a APCs T2 cargados con péptidos limitados a HLA-A2 de control (Figura 31). Estos resultados indican que ambos anticuerpos similares a TCR mostraron la unión específica a péptido limitado a HLA-A2 dado que se unieron solamente a células que mostraban el WT1 pero no otros péptidos limitados a HLA-A2.

[0270] Para estudiar adicionalmente los anticuerpos similares a TCR de WT1 se realizó la evaluación de especificidad fina de unión a péptidos similares identificados in silico con la estrategia descrita anteriormente. Tal como se muestra en las Figuras 32 y 33, B47 no se unió a ningún péptido similar de un panel modificado (Tabla 6). Sin embargo, tal como se muestra en la Figura 32, ESK1 mostró unión baja en segundo plano a dos péptidos similares. Se evaluó B47 en péptidos de control y péptidos similares adicionales (Figura 34). Los análisis adicionales de estos anticuerpos similares a TCR se realizaron utilizando la citometría de flujo que utiliza células tumorales que son HLA-A2 y expresan o no el antígeno WT1. Tal como se muestra en la Figura 35, el anticuerpo similar a TCR de ESK1 WT1 se unió de manera intensa a células HLA- A2+/WT+ BV173 y SET2, sin embargo, B47 no mostró ninguna unión a estas células con el nivel de sensibilidad de citometría de flujo. Para estudiar la especificidad se evaluó la reactividad de ESK1 y B47 en células que son HLA-A2 pero no expresan el gen WT1 tal como se evalúa utilizando PCR. Tal como se muestra B47 no mostró unión a ninguna de estas células mientras que ESK1 se unió a células 501, A498 y SKMEL que parecían ser WT1 negativas. Otras células negativas de WT1 no se unieron mediante ESK1. El nivel de la expresión de HLA-A2 se controló con MAb BB7.2 que reconoce todas las moléculas HLA-A2/péptido sobre la superficie celular. Un resumen de datos de unión para el anticuerpo similar a TCR específico de WT B47 se muestra en la Figura 36.

[0271] Para estudiar adicionalmente los datos de conflicto de la unción de ESK1 y B47 a células HLA-A2+/WT1 BV173 y SET2 es decir, la unión podría detectarse de manera significativa utilizando ESK1 pero no B47 empleamos medios bioquímicos directos para evaluar la presentación actual de WT1 sobre estas células. Utilizamos las estrategias de elución de péptido HLA de diferentes tejidos así como también células BV173 y SET2 seguido de análisis MS de péptidos eluidos. Los datos de estos experimentos indican que el péptido WT1 no se ha detectado en ninguna de las pruebas MS de tejidos clínicos o líneas celulares. El análisis profundo de las líneas celulares BV173 o SET-2 (ARNm WT1-positivo) no consiguió detectar el péptido (Instrumentos MS Orbitrap o Q Exactive). El péptido WT1 se detectó utilizando MS OrbiTrap seguido de elución directa a partir de las células cargadas con péptido ^t2. Estas células T2 se cargaron con diferentes concentraciones de péptido WT1 de 10‘5, 10‘7, 10‘9 M y se detectó el péptido utilizando MS en eluciones a partir de APCs T2 cargados con concentración de péptido de 10‘5y 10‘7M. La detección del péptido a partir de las células T2 cargadas con 10‘7M de péptido utilizando la MS corresponde a la presentación actual de ~250 sitios/célula (utilizando la MS Orbitrap).

[0272] Estos datos sirven como ejemplo de la utilidad de los instrumentos de unión descritos con relación a células cargadas con péptidos que muestran péptidos y células de diferentes orígenes histológicos similares para evaluar la especificidad y la selectividad de los anticuerpos similares a TCR.

[0273] Para estudiar adicionalmente la especificidad de epítopo, escaneo de alanina se realizo mutagénesis en la secuencia de péptido WT1. Tal como se muestra en la Figura 37 que demuestra que solamente la mutación en la posición 1 del péptido WT1 influenció la intensidad de unión de ESK1 indicando que la selectividad de unión y la especificidad fina de ESK1 se limita en comparación con B47 tal como se observa también para el modelo de especificidad tal como se observa para péptidos similares y para las células que son HLA-A2+/WT1-/ Estos datos sugieren que la selectividad y la especificidad fina de B47 es superior en comparación con ESK1 y que la caja de herramientas presentada en el presente documento es un instrumento valioso para evaluar la selectividad y la especificidad fina de los anticuerpos similares a TCR en el proceso de su selección, caracterización y desarrollo preclínico.

EJEMPLO IIA

ANTICUERPOS SIMILARES A TCR PARA HLA-A2/WT1

Comparación de especificidad fina de Abs con especificidad similar a TCR para HLA-A2/WT1

[0274] Se comparó la selectividad de anticuerpos similares a TCR de B47 y ESK1, ambos reconociendo al péptido WT1 (Dao et al. Sci Transl Med. 13 de marzo de 2013; 5(176):176ra33)

[0275] APCs T2 se cargaron con péptidos específicos (WT1, SEQ ID NO: 141) o de control (Tabla 15) y se incubaron con anticuerpos B47 y ESK1, seguido de la incubación con estreptavidina marcada con PE o Abs anti-ratón. Tanto TCRLs B47 como ESK1 se unieron a células T2 cargadas con el péptido WT1 pero no se unieron a las células cargadas con los péptidos de control (Figura 46). Un panel de péptidos similares (Tabla 6) se sintetizó para caracterizar adicionalmente la especificidad de los TCRLs WT1. Los TCRL B47 no se unieron a ninguno de los péptidos similares cargados en las células T2 mientras que ESK1 mostró unión detectable a varios péptidos similares (Figura 47). Los TCRL ESK1 mostraron unión a un péptido similar derivado de HDAC2 (Histona deacetilasa 2, Tabla 14) que está presente de manera ubicua en muchas células normales. WT1-S10 (SEQ ID NO: 151) está presente en tejidos normales tal como se demuestra utilizando espectrometría de masas en cerebro, córtex cerebral, corazón, riñón, hígado, pulmón y otros tejidos normales (Tabla 14).

[0276] La caracterización adicional de unión de TCRLs de B47 y ESK1 utilizando SPR que mostró que la afinidad de B47 (5 nM) es más fuerte que aquella de ESK1 (200 nM) principalmente debido a la tasa de disociación más rápida de complejos de péptido ESK1 y MHC-WT1 (Figura 48). La mutagénesis adicional de escaneo de alanina del péptido WT1 se llevó a cabo para perfeccionar la especificidad de epítopo de anticuerpos similares a TCR de B47 (Figura 49). Los péptidos mutantes se cargaron en las células T2 y se llevó a cabo un ensayo de unión tal como se describe anteriormente. La carga de diferentes mutantes Ala se controló utilizando citometría de flujo que utiliza un anticuerpo monoclonal BB7.2 frente a HLA-A2.

[0277] Tal como se muestra en la Figura 49, las sustituciones de Ala en algunas posiciones afectaron de manera significativa la unión de B47 a péptidos mutados. El TCRL B47 mostró sensibilidad mayor a las sustituciones posicionales (cuando se compara con ESK1, Figura 37). El anticuerpo similar a TCR B47 perdió >73% de su unión a péptido presentado cuando 4 residuos en el péptido se mutaron a Alanina (posiciones 1, 3, 4 y 7). Una 5a posición de sensibilidad se puede atribuir a la posición número 5. La posición 2 de TCRLs tanto de B47 como de ESK1 era crítica dado que se espera que sirva como una posición ancla para los péptidos en el hueco de unión de péptido HLA-A2.

[0278] La caracterización y la comparación adicionales de TCRLs de B47 y ESK1 se realizó sobre las líneas celulares tumorales y las células primarias de diferentes orígenes. Tal como se muestra en la Figura 50, B47 no se unió a un panel de células que eran todas células HLA-A2 positivas y WT1 ARNm positivas o negativas. En cambio, TCRL de ESK1 se unió a un número de células primarias tanto tumorales como normales (todas HLA-A2+). Por ejemplo, JVM2 y IM9 (tanto HLA-A2 positivo y WT1 negativa) así como también astrocitos primarios normales mostraron unión. Los ensayos de citotoxicidad que utilizan construcciones biespecíficas de TCRL-aCD3 y PBMCs humanos mostraron que B47 TCRL no provoca la muerte de las células HLA-A2+/WT1+ or HLA-A2+/WT1- mientras que ESK1 TCRL-aCD3 era citotóxico para un número de células que incluyen WT-1 negativo. Por consiguiente, TCRL B47 demuestra la especificidad mayor tanto en la unión como en la actividad funcional en el formato biespecífico en comparación con ESK1 al que se une y los redirige las células T CD3 hacia algunas células, que incluyen células primarias normales, independientemente de la expresión de WT-1.

EJEMPLO III

Anticuerpos similares a TCR con especificidad hacia HLA-A2/MAGE-A4

EJEMPLO IIIA

Aislam iento y caracterización de TCRL con especificidad para HLA-A2/MAGE-A4

[0279] Para caracterizar la especificidad de unión de los anticuerpos similares a TCR aislados, se evaluaron la reactividad y la especificidad de IgGs purificadas utilizando citometría de flujo. APCs T2 se cargaron con péptido MAGE-A4 o péptidos de control (Tabla 15) y se incubaron con el TCRL Ab C106B, seguido de la incubación con estreptavidina marcada con PE o Abs anti-ratón marcados con PE. Tal como se muestra en la Figura 52, C106B9 se unieron a las células T2 cargadas con el péptido MAGE-A4, pero no mostraron ninguna unión a las células cargadas con los péptidos de control.

[0280] Para evaluar adicionalmente la especificidad del anticuerpo similar a TCR de C106B9, se evaluó su reactividad con péptidos que muestran similitud secuencial con el péptido MAGE-A4. Los péptidos se muestran en la Tabla 8.

[0281] Tal como se muestra en la Figura 53, TCRL C106B9 no se unió a ninguno de los péptidos de este panel de péptidos similares. Estos datos demuestran la selectividad alta y la especificidad fina de C106B9 y demuestra la utilidad del enfoque de péptidos similares e instrumentos desarrollados tal como se describe anteriormente para evaluar la selectividad y la especificidad fina de TCRLs.

[0282] Para determinar la afinidad aparente del anticuerpo similar a TCR aislado, se utilizó el análisis de unión de resonancia por plasmones superficiales (SPR) en el que el anticuerpo similar a TCR de IgG purificada aislada se inmovilizó con el chip del sensor de SPR utilizando IgG anti-ratón para inmovilizar indirectamente los anticuerpos similares a TCR sobre la superficie del chip. El analito es el complejo HLA-A2/MAGE-A4 recombinante de cadena única purificado utilizado a diferentes concentraciones. Tal como se muestra en la Figura 54, los sensogramas del análisis SPR mostraron afinidad para el clon C106B9 del anticuerpo similar a TCR específico para HLA-A2/MAGE-A4 con afinidad correspondiente de 8,8nM.

[0283] Para investigar la especificidad de epítopo de péptido fino de los anticuerpos similares a TCR aislados con relación a alanina de péptido MAGE-A4 se llevó a cabo un escaneo en el que los residuos específicos en el péptido se mutaron a alanina y se puso a prueba la unión del anticuerpo similar a t Cr a péptidos mutados a Ala utilizando su carga en las células presentadoras de antígeno T2 (Tabla 9). La unión se controló utilizando citometría de flujo y se comparó el grado de unión de anticuerpos similares a TCR con los péptidos presentes mutados tal como se midió utilizando intensidad de fluorescencia media (MFI) en comparación con los APCs T2 cargados con el péptido MAGE-A4 no mutado nativo. La carga adecuada de diferentes péptidos mutados Ala (descritos en la Figura 2) se controló utilizando citometría de flujo que utiliza BB7.2 un anticuerpo monoclonal para HLA-A2.

[0284] Todos los péptidos mutados Ala se cargaron eficazmente en las células T2 en comparación con el péptido MAGE-A4 no mutado nativo (datos no se muestran). Tal como se muestra en la Figura 55, el anticuerpo similar a TCR mostró unión de dependencia a péptido dado que las mutaciones específicas afectaron la unión e indujeron una disminución en la intensidad de unión del anticuerpo similar a TCR al introducir Ala en posiciones específicas de péptido. Estos resultados indican que el anticuerpo similar a TCR mostró unión específica y limitada a péptido en el contexto de HLA-A2 cargado con diferentes péptidos MAGE-A4 mutados a Ala, indicando que este anticuerpo es similar a TCR en sus propiedades de unión, por lo tanto, se une al complejo MHC-péptido de un modo limitado a MHC y específico de péptido.

[0285] El anticuerpo C106B9 similar a TCR mostró una disminución marcada de 90 % en la unión a péptido mutado a Ala en cuatro posiciones # 4, 5, 6 y 7. Una 5a posición de sensibilidad se puede atribuir a la posición número 2 (disminución de 33%).

[0286] En general, el análisis de escaneo de Alanina revela que el escaneo de Ala puede utilizarse como una medida para determinar la selectividad y la especificidad fina de anticuerpos similares a TCR. Dado que se muestra más sensibilidad hacia mutaciones Ala, se observará la unión más específica y dependiente de péptido. Esta estrategia se puede utilizar para filtrar y seleccionar los anticuerpos similares a TCR óptimos que mostraron la selectividad y propiedades de especificidad más altas y optimizadas como aglutinantes específicos de péptido limitados a MHC .

[0287] Los inventores actuales exploraron la especificad de unión del Ab similar a TCR para HLA-A2/ MAGE-A4 a complejos de péptido MHC- MAGE-A4 mostrados de manera endógena sobre la superficie de líneas celulares tumorales. Las células se incubaron con anticuerpos Ab similares a TCR de anti-MAGE- A4- HLA-A2 seguido de la incubación con estreptavidina marcada con PE o Abs anti-ratón. Se utilizó un panel de células tumorales y células primarias normales que se han caracterizado para la expresión HLA-A2 (positiva) y MAGE-A4 (positiva o negativa) para comparar la unión de los anticuerpos similares a TCR. Tal como se muestra en la Figura 56, el anticuerpo similar a TCR se reconoció por las células MAGE-A4- positivas y HLA-A2-positivas con intensidad baja. Los anticuerpos similares a TCR se pusieron a prueba en múltiples líneas celulares HLA-A2-positivas de orígenes diferentes que no muestran la expresión MAGE-A4 ARN (MAGE-A4-negativa), la actividad de eliminación de estas células con una construcción biespecífica de TCRL de MAGE-A4/HLA-A2 también se puso a prueba. Tal como se muestra en las Figuras 56, TCRL C106B9 no se unió a ninguna de estas células.

[0288] Se utilizaron los ensayos funcionales para caracterizar adicionalmente el anticuerpo similar a TCR de C106B9. Las regiones variables de TCRLs se fusionaron con un anti-CD3 scFv que puede redirigir células T efectoras para eliminar células diana tumorales en un formato biespecífico. Tal como se muestra en las Figuras 57, las construcciones de anticuerpos similares a TCR biespecíficos C106B9 mostraron citotoxicidad resistente frente a células positivas MAGE-A4 in vitro en presencia de PBMCs humanos. La línea celular TCCSUP y OVCAR, MAGE-A4 negativa sirvió como control negativo y no demostró ninguna citotoxicidad. Tal como se muestra a continuación en la Figura 58, no se detectó ninguna citotoxicidad frente a un panel de células primarias humanas normales HLA-A2+/ MAGE-A4- con TCRLs de C106B9 que confirmaban su selectividad.

EJEMPLO IIIB

Eficacia in vivo de MAGE-A4 C106B9 BS TCRL en modelo de formación de tum or de melanoma A375 subcutáneo en ratones NOD/SCID

[0289] La Figura 59 muestra la eficacia in vivo de C106B9 BS TCRL en un modelo de formación de tumor de melanoma A375 subcutáneo en ratones NOD/SCID. Evidentemente, la administración del anticuerpo biespecífico inhibió completamente la formación de tumor en un periodo de 35 días del experimento, tal como se demostró con el volumen de tumor. Los resultados apoyan el uso de secuencias variables de los TCRLs descritos en el presente documento en entornos clínicos.

EJEMPLO IV

Anticuerpos similares a TCR con especificidad hacia HLA-A2/MAGE-A9

Aislam iento y caracterización de TCRL con especificidad para HLA-A2/MAGE-A9

[0290] Para caracterizar la especificidad de unión de los anticuerpos similares a TCR aislados, se evaluaron la reactividad y la especificidad de IgGs purificadas utilizando citometría de flujo. APCs T2 se cargaron con péptido MAGE-A9 o péptidos de control y se incubaron con el TCRL Ab F184C7, seguido de la incubación con estreptavidina marcada con PE o Abs anti-ratón marcados con PE. Tal como se muestra en la Figura 60, F184C7 se unió a las células T2 cargadas con el péptido MAGE-A9, pero no mostró ninguna unión a las células cargadas con los péptidos de control.

[0291] Para evaluar adicionalmente la especificidad del anticuerpo similar a TCR de F184C7, se evaluó su reactividad con péptidos que muestran similitud secuencial con el péptido MAGE-A9. Los péptidos se muestran en la Tabla 10.

[0292] Tal como se muestra en la Figura 61, TCRL F184C7 no se unió a ninguno de los péptidos de este panel de péptidos similares. Estos datos demuestran la selectividad alta y la especificidad fina de F184C7 y demuestra la utilidad del enfoque de péptidos similares e instrumentos desarrollados tal como se describe anteriormente para evaluar la selectividad y la especificidad fina de TCRLs.

[0293] Para investigar la especificidad fina de epítopo de péptido de los anticuerpos similares a TCR aislados con relación a alanina de péptido MAGE-A9 se llevó a cabo un escaneo en el que los residuos específicos en el péptido se mutaron a alanina y se puso a prueba la unión del anticuerpo similar a ^tC^ra péptidos mutados a Ala utilizando su carga en las células presentadoras de antígeno T2 (Tabla 11). La unión se controló utilizando citometría de flujo y se comparó el grado de unión de anticuerpos similares a TCR con los péptidos presentes mutados tal como se midió utilizando intensidad de fluorescencia media (MFI) en comparación con los APCs T2 cargados con el péptido MAGE-A9 no mutado nativo. La carga adecuada de diferentes péptidos mutados Ala (descritos en la Figura 2) se controló utilizando citometría de flujo que utiliza BB7.2 un anticuerpo monoclonal para HLA-A2.

[0294] Todos los péptidos mutados Ala se cargaron eficazmente en las células T2 en comparación con el péptido MAGE-A9 no mutado nativo (datos no se muestran). Tal como se muestra en la Figura 62, el anticuerpo similar a TCR mostró unión de dependencia a péptido dado que las mutaciones específicas afectaron la unión e indujeron una disminución en la intensidad de unión del anticuerpo similar a TCR al introducir Ala en posiciones específicas de péptido. Estos resultados indican que el anticuerpo similar a TCR MAGE-A9 mostró unión específica y limitada a péptido en el contexto de HLA-A2 cargado con diferentes péptidos MAGE-A9 mutados a Ala, indicando que este anticuerpo es similar a TCR en sus propiedades de unión, por lo tanto, se une al complejo MHC-péptido de un modo limitado a MHC y específico de péptido.

[0295] El anticuerpo F184C7 similar a TCR mostró una disminución marcada de 90 % en la unión a péptido mutado a cinco Ala en cinco posiciones # 3, 5, 6 y 8.

[0296] En general, el análisis de escaneo de Alanina revela que el escaneo de Ala puede utilizarse como una medida para determinar la selectividad y la especificidad fina de anticuerpos similares a TCR. Dado que se muestra más sensibilidad hacia mutaciones Ala, se observará la unión más específica y dependiente de péptido. Esta estrategia se puede utilizar para filtrar y seleccionar los anticuerpos similares a TCR óptimos que mostraron la selectividad y propiedades de especificidad más altas y optimizadas como aglutinantes específicos de péptido limitados a MHC.

[0297] Los inventores actuales investigaron la especificidad de unión del Ab similar a TCR para HLA-A2/MAGE-A9 a un panel de células primarias normales de diferentes orígenes que no muestran expresión ARN MAGE-A9. Tal como se muestra en las Figuras 63, TCRL F184C7 no se unió a ninguna de estas células. El control positivo eran las células T2 cargadas con el péptido MAGE-A9 al que se unió F184C7 de manera intensa.

E J E M P L O V

Claims

REIVINDICACIONES

1. Entidad de unión por afinidad que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende:

QVQLQQSGGEVMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWIKQRPGHGLEWIGEILPGSGGT NYNEKFKGKATFTAHTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARDSNSFTYWGQGTLVTVSS; y

(¡i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de:

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSVSSSVDYIHWFQQKPGTSPKFWIYSTSILASGVPARFS GSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPPTFGSGTKLEIK.

donde dicha entidad de unión por afinidad capaz de unirse a HLA-A2/MAGE-A4230-239 de manera restringida por MHC.

2. Entidad de unión por afinidad de la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo y un CAR.

3. Entidad de unión por afinidad de la reivindicación 2, que comprende un resto terapéutico.

4. Entidad de unión por afinidad de cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en la que dicho anticuerpo es un Fv monocatenario (scFv), un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo de longitud completa.

5. Vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la entidad de unión por afinidad de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, unida operativamente a un elemento regulador que actúa en cis.

6. Célula que comprende el vector de expresión de la reivindicación 5.

7. Procedimiento in vitro para detectar una célula cancerosa, que comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en condiciones que permiten la formación de inmunocomplejos, en el que la presencia de dicho inmunocomplejo o el nivel del mismo es indicativo de la célula cancerosa. .

8. Procedimiento para diagnosticar cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprende poner en contacto una célula del sujeto con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en condiciones ex vivo que permiten la formación de inmunocomplejos, en el que la presencia de dicho inmunocomplejo o el nivel del mismo es indicativo del cáncer.

9. Entidad de unión por afinidad de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el vector de la reivindicación 5 o la célula de la reivindicación 6, para usar en el tratamiento del cáncer.

10. Entidad de unión por afinidad de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el vector de la reivindicación 5 o la célula de la reivindicación 6, para usar como medicamento.