KR102575787B1 - Hla-a2/wt1에 결합하는 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로, 예를 들어 T 세포 활성화를 위한 이중특이성 항원 결합 분자를 포함하는 HLA-A2/WT1에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체의 생성 방법, 및 질병의 치료에서 그의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

HLA-A2/WT1에 결합하는 항체
본 발명은 일반적으로, 예를 들어 T 세포 활성화를 위한 이중특이성 항원 결합 분자를 포함하는 HLA-A2/WT1에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체의 생성 방법, 및 질병의 치료에서 그의 사용 방법에 관한 것이다.
WT1(윌름스 종양(Wilms tumor) 1, 윌름스 종양 단백질)은 세포 증식, 분화, 세포자연사 및 기관 발생과 관련된 종양생성 전사 인자이고, 보통의 성체 조직에서 이의 발현은 드물다(문헌[Hinrichs and Restifo, Nat Biotechnol (2013) 31, 999-1008]). 그러나, WT1은 몇몇 유형의 혈액 악성종양 및 광범위한 고형종양에서 과발현되는 것으로 보고되었다(문헌[Van Driessche et al., Oncologist (2012) 17, 250-259]). WT1은 세포내에 위치하는 핵단백질이다. 세포내 단백질은 프로테아솜에서 분해되고, 주 조직적합성 복합체(MHC) I에 의해 세포 표면에 T 세포 에피토프로서 가공되고 제시되고, T 세포 수용체(TCR)에 의해 인식될 수 있다. 특히, WT1-유래 펩티드, 예컨대 WT1RMF(RMFPNAPYL) 및 WT1VLD(VLDFAPPGA)는 HLA-A2와 관련하여 세포 표면 상에 제시되고 T 세포 인식을 촉진한다.
WT1을 암 (면역)치료를 위한 표적으로서 이용하기 위한 몇몇 접근들이 이뤄져 왔고, WT1-유래 펩티드 및 양자(adoptive) T 세포 전달 또는 WT1-특이성 T 세포를 기반으로 한 암 백신의 개발이 이에 포함된다. 또한, HLA-A2/WT1RMF 복합체에 대항하는 TCR-유사 항체 및 이의 이중특이성 유도체가 제조된 바 있다(문헌[Dao et al., Sci Transl Med (2013) 5, 176ra33]; WO2012/135854; 문헌[Dao et al., Nat Biotechnol (2015) 33, 1079-1086]; WO 2015/070061; 및 WO 2017/060201).
표적 세포 상의 표면 항원 및 활성화 T 세포 항원, 예컨대 T 세포 상의 CD3에 결합하는 이중특이성 항체(본원에서 T 세포 이중특이성 항체 또는 "TCB"로도 지칭됨)는 다양한 암의 치료에 매우 유망하다. 표적 둘다에 대한 이러한 항체의 동시적인 결합은 표적 세포와 T 세포간의 일시적인 상호작용을 일으킴로써, T 세포 수용체의 가교결합, 후속으로 임의의 세포독성 T 세포의 활성화 및 후속으로 표적 세포의 용해를 야기한다. 표적 세포 사살에 대한 이의 효능에 기인하여, 표적의 선택 및 표적화 항체의 특이성은 정표적(on-target) 및 탈표적(off-target) 독성을 회피하기 위한 T 세포 이중특이성 항체에 있어서 매우 중요하다. 내세포 단백질, 예컨대 WT1은 매력적인 표적을 제시하지만, 세포 표면 상의 내세포 단백질로부터 유래되는 MHC 제시 펩티드 항원에 결합하는 TCR-유사 항체에만 접근가능하다. TCR-유사 항체의 내재적인 문제는 MHC 분자 자체와의 잠재적인 교차-반응성, 또는 목적하는 목적하는 것 외의 다른 펩티드를 제시하는 MHC 분자이고, 이는 기관 또는 조직 선택성을 초래할 수 있다.
본 발명은 HLA-A2/WT1에 결합하고 치료 목적에 대한 특히 바람직한 특성을 갖는 신규한 항체, 예컨대 이중특이성 항체를 제공한다. 본 발명자들은 HLA-A2/WT1에 결합하는 탁월한 향상된 효과를 갖는 신규한 항체를 개발하였다. 특히, 상기 항체는 HLA-A2/WT1에 우수한 친화도 및 뛰어난 특이성으로 결합한다. 또한, 본 발명자들은 신규한 HLA-A2/WT1 항체를 혼입하여 HLA-A2/WT1 및 활성화 T 세포 항원에 결합하고, 저독성 및 바람직한 약동학적 특성으로 우수한 효능 및 생산성이 조합된 이중특이성 항체를 개발하였다.
제1 양상에서, 본 발명은 HLA-A2/WT1에 결합하는 항체를 제공하되, 상기 항체는
(i) 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL);
(ii) 서열번호 9의 HCDR 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 12의 LCDR 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 17의 HCDR 1, 서열번호 18의 HCDR 2 및 서열번호 19의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 20의 LCDR 1, 서열번호 21의 LCDR 2 및 서열번호 22의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 25의 HCDR 1, 서열번호 26의 HCDR 2 및 서열번호 27의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28의 LCDR 1, 서열번호 29의 LCDR 2 및 서열번호 30의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 33의 HCDR 1, 서열번호 34의 HCDR 2 및 서열번호 35의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 36의 LCDR 1, 서열번호 37의 LCDR 2 및 서열번호 38의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 41의 HCDR 1, 서열번호 42의 HCDR 2 및 서열번호 43의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 44의 LCDR 1, 서열번호 45의 LCDR 2 및 서열번호 46의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 49의 HCDR 1, 서열번호 50의 HCDR 2 및 서열번호 51의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 52의 LCDR 1, 서열번호 53의 LCDR 2 및 서열번호 54의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 57의 HCDR 1, 서열번호 58의 HCDR 2 및 서열번호 59의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 60의 LCDR 1, 서열번호 61의 LCDR 2 및 서열번호 62의 LCDR 3을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 65의 HCDR 1, 서열번호 66의 HCDR 2 및 서열번호 67의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 68의 LCDR 1, 서열번호 69의 LCDR 2 및 서열번호 70의 LCDR 3을 포함하는 VL
을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 항체는
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 40의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 47의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 48의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL
을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 항체는 IgG, 특히 IgG1 항체이다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 전장(full-length) 항체이다. 또다른 양태에서, 항체는 Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자 및 F(ab')2 분자의 군으로부터 선택되는 항체 단편이다. 하나의 양태에서, 항체는 다중특이성 항체이다.
또한, 본 발명은
(a) HLA-A2/WT1인 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기로서,
(i) 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL);
(ii) 서열번호 9의 HCDR 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 12의 LCDR 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 17의 HCDR 1, 서열번호 18의 HCDR 2 및 서열번호 19의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 20의 LCDR 1, 서열번호 21의 LCDR 2 및 서열번호 22의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 25의 HCDR 1, 서열번호 26의 HCDR 2 및 서열번호 27의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28의 LCDR 1, 서열번호 29의 LCDR 2 및 서열번호 30의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 33의 HCDR 1, 서열번호 34의 HCDR 2 및 서열번호 35의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 36의 LCDR 1, 서열번호 37의 LCDR 2 및 서열번호 38의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 41의 HCDR 1, 서열번호 42의 HCDR 2 및 서열번호 43의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 44의 LCDR 1, 서열번호 45의 LCDR 2 및 서열번호 46의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 49의 HCDR 1, 서열번호 50의 HCDR 2 및 서열번호 51의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 52의 LCDR 1, 서열번호 53의 LCDR 2 및 서열번호 54의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 57의 HCDR 1, 서열번호 58의 HCDR 2 및 서열번호 59의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 60의 LCDR 1, 서열번호 61의 LCDR 2 및 서열번호 62의 LCDR 3을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 65의 HCDR 1, 서열번호 66의 HCDR 2 및 서열번호 67의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 68의 LCDR 1, 서열번호 69의 LCDR 2 및 서열번호 70의 LCDR 3을 포함하는 VL
을 포함하는 제1 항원 결합 잔기; 및
(b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 잔기
를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 40의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 47의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 48의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL
을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 제2 항원은 CD3, 특히 CD3ε이다. 하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 115의 HCDR 1, 서열번호 116의 HCDR 2 및 서열번호 117의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 118의 LCDR 1, 서열번호 119의 LCDR 2 및 서열번호 120의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기의 VH는 서열번호 121의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 잔기의 VL은 서열번호 122의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 제1 및/또는 제2 항원 결합 잔기는 Fab 분자이다. 하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1, 특히 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체된 Fab 분자이다. 하나의 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기는 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧(Kabat)에 따른 번호부여)에 의해 독립적으로 치환되고 123번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧에 따른 번호부여)에 의해 독립적으로 치환되며, 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)에 의해 독립적으로 치환되고 213번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)에 의해 독립적으로 치환된 Fab 분자이다. 하나의 양태에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 임의적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 하나의 양태에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 분자이고, (i) 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되거나, (ii) 상기 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 하나의 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 잔기를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 제3 항원 부분은 상기 제1 항원 결합 잔기와 동일하다. 하나의 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 서브유닛(subunit)으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 제1, 제2, 및 존재하는 경우, 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 분자이고; (i) 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고 상기 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되거나, (ii) 상기 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고; 상기 제3 항원 결합 잔기(존재하는 경우)는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 하나의 양태에서, 상기 Fc 도메인은 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 양태에서, 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 하나의 양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중의 아미노산 잔기는 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제2 서브유닛의 CH3 도메인내 공동에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인내 돌기를 생성하고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중의 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 상기 제1 서브유닛의 CH3 도메인내 돌기가 위치할 수 있는 상기 제2 서브유닛의 CH3 도메인내 공동을 생성한다. 하나의 양태에서, 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 또다른 양태에 따라, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터, 및 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물 세포, 특히 포유동물 세포이다.
또다른 양태에서, HLA-A2/WT1에 결합하는 항체의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 b) 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생성된, HLA-A2/WT1에 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체, 이중특이성 항원 결합 분자 및 약학 조성물의 사용 방법을 포함한다. 하나의 양태에서 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체, 이중특이성 항원 결합 분자 또는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 양태에서 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체, 이중특이성 항원 결합 분자 또는 약학 조성물을 제공한다. 특정 양태에서 상기 질병은 암이다.
또한, 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 용도뿐만 아니라, 개체에서 질병을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 개체에게 치료 효과량의 약학적으로 허용가능한 형태의 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다. 특정 양태에서 상기 질병은 암이다. 상기 양태 중 어느 하나에서 개체는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
도 1은 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 예시적인 배열이다. A 및 D는 "1+1 CrossMab" 분자를 도시한 것이다. B 및 E는 대체 순서의 Crossfab 및 Fab 성분("역전된")을 갖는 "2+1 IgG Crossfab" 분자를 도시한 것이다. C 및 F는 "2+1 IgG Crossfab" 분자를 도시한 것이다. G 및 K는 대체 순서의 Crossfab 및 Fab 성분("역전된")을 갖는 "1+1 IgG Crossfab" 분자를 도시한 것이다. H 및 L은 "1+1 IgG Crossfab" 분자를 도시한 것이다. I 및 M은 2개의 CrossFab를 갖는 "2+1 IgG Crossfab" 분자를 도시한 것이다. J 및 N은 2개의 Crossfab 및 대체 순서의 Crossfab 및 Fab 성분("역전된")을 갖는 "2+1 IgG Crossfab" 분자를 도시한 것이다. O 및 S는 "Fab-Crossfab" 분자를 도시한 것이다. P 및 T는 "Crossfab-Fab" 분자를 도시한 것이다. Q 및 U는 "(Fab)2-Crossfab" 분자를 도시하고, R 및 V는 "Crossfab-(Fab)2" 분자를 도시하고, W 및 Y는 "Fab-(Crossfab)2" 분자를 도시하고, (X,Z) "(Crossfab)2-Fab" 분자를 도시한 것이다. 흑색 점은 이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 중의 임의의 변형이다. ++ 및 --은 CH1 및 CL 도메인에 임의적으로 도입된 반대 전하의 아미노산이다. Crossfab 분자를 VH 및 VL 영역의 교환을 포함하는 것으로서 묘사하지만, CH1 및 CL 도메인에 전하 변형이 도입되지 않은 양태에서, CH1 및 CL 도메인의 교환을 선택적으로 포함할 수 있다.
도 2는 실시예에서 제조된 T 세포 이중특이성(TCB) 항체 분자를 도시한 것이다. 모든 시험된 TCB 항체 분자는 전하 변형과 함께 "역전된, 2+1 IgG CrossFab"로서 생성되었다(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, STEAP-1 결합제에서 전하 변형, EE = 147EE, 213E; RK = 123R, 124K).
도 3은 펩티드-부가된(pulsed) T2 세포에 대한 HLA-A2-WT1 IgG 항체의 결합을 도시한 것이다. (A) 11D06 IgG, (B) 33H09-IgG, (C) 11B09-IgG, (D) 13B04-IgG, (E) 5E11-IgG, (F) 5C01-IgG, (G) 11G06-IgG.
도 4는 펩티드-부가된 T2 세포에 대한 결합시 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB)에 의한 T 세포의 활성화를 도시한 것이다(NFAT 리포터 분석). (A) 11D06-TCB, (B) 33H09-TCB, (C) 11B09-TCB, (D) 13B04-TCB, (E) ESK1-TCB, (F) 5E11-TCB. (G) 5C01-TCB, (H) DP47GS-TCB.
도 5는 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB)에 의해 매개되는 펩티드-부가된 T2 세포의 사살을 도시한 것이다. (A) 11D06-TCB, (B) 33H09-TCB, (C) 13B04-TCB, (D) 11B09-TCB, (E) 33F05-TCB, (F) 5C01-TCB.
도 6은 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB)에 의해 매개되는 HLA-A2+WT1+ 종양 세포주의 사살을 도시한 것이다. (A) 세포주에 대한 개관. (B 내지 E) (B) 11D06-TCB, (C) 33H09-TCB, (D) 11B09-TCB 및 (E) 13B04-TCB에 의한 세포주의 사살. (F) 상이한 TCB에 의한 SKM-1 세포의 사살. (G) 상이한 TCB에 의한 BJAB 세포의 사살.
도 7은 HLA-A2+WT1+ 종양 세포주에 대한 결합시 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB)에 의한 T 세포의 활성화를 도시한 것이다. (A) SKM-1 세포, (B) BJAB 세포.
도 8은 선택된 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB)에 의한 표적외 펩티드 결합이 없음을 도시한 것이다. (A 내지 C) (A) 11D06-TCB, (B) 33H09-TCB 및 (C) ESK1-TCB에 의한 펩티드-부가된 T2 세포에 대한 결합. (D 및 E) (D) 11D06-TCB 및 (E) 33H09-TCB에 의한 펩티드 부가된 T2 세포에 대한 결합시 T 세포의 활성화. (F) 펩티드에 대한 개관.
도 9는 선택된 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB)에 의한 추가적인 표적회 펩티드에 대한 결합이 없음을 도시한 것이다. (A 및 B) (A) 11D06-TCB 및 (B) 33H09-TCB에 의한 펩티드-부가된 T2 세포에 대한 결합시 T 세포의 활성화. 6개의 제시된 표적외 펩티드를 RMF 펩티드와 함께 시험하였다. (C 내지 G) (C 및 E) 11D06-TCB, (D 및 F) 33H09-TCB 및 (G) ESK1-TCB에 의한 펩티드-부가된 T2 세포의 사살. 19개의 제시된 표적외 펩티드를 RMF 및 VLD 펩티드와 함께 시험하였다.
도 10은 선택된 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB)에 의한 정상적인 골수-유래 CD34+ 줄기 세포의 사살이 없음을 도시한 것이다. (A) 11D06-TCB, (B) 33H09-TCB.
도 11은 선택된 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB)에 대한 RMF 펩티드의 결합 잔기의 알라닌 스캔에 의한 동정을 도시한 것이다. (A) RMF 고유 펩티드, (B) RMF R1Y 펩티드, (C) RMF R1A 펩티드, (D) RMF M2A 펩티드, (E) RMF F3A 펩티드, (F) RMF P4A 펩티드, (G) RMF N5A 펩티드, (H) RMF A6G 펩티드, (I) RMF P7A 펩티드, (J) RMF Y8A 펩티드, (K) RMF L9A 펩티드. (L) 펩티드에 대한 개관. (M) RMF 고유 펩티드에 대한 EC50과 비교한 EC50의 배수 변화. (N) 중요 접촉 잔기.
도 12는 NSG 마우스(mouse)에서 단일 주사 후 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(11D06-TCB 및 33H09-TCB)의 약동학적 프로파일을 도시한 것이다.
도 13은 인간화된 마우스 내의 SKM-1 이종이식에서 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB)에 의한 효능 연구를 도시한 것이다. (A) 연구 설계. (B) 처리군. (C) 모든 처리군에서 (평균) 종양 성장 동력학. (D) 비히클(vehicle) 군에서 단일 종양 성장 동력학. (E) 11D06-TCB군에서 단일 종양 성장 동력학. (F) 33H09-TCB군에서 단일 종양 성장 동력학. (G) 통계. 38일간을 기준으로 한 계산(대조군으로서 비히클). 종양 성장 억제(TGI): TGI > 100 → 종양 퇴행, TGI = 100 → 종양 정체. 처리군 대 대조군 비(TCR): TCR = 1 → 효과 없음, TCR = 0 → 완전한 퇴행.
도 14는 HLA-A2/WT1 항체 - pMHC 복합체의 결정 구조에 대한 개관을 도시한 것이다. 항체(Fab 단편)를 상단에 나타내되, 중쇄는 짙은 회색으로 채색하고 경쇄는 옅은 회색으로 채색하였다. 결정화된 용매 원자는 나타내지 않았다. (A) HLA-A02/VLD pMHC와 복합된 5C01 Fab의 1.98 Å 해상도 결정 구조. Fab-pMHC 접촉 면적: 약 476 Å2, 펩티드 기여: 약 68 Å2. (B) HLA-A02/RMF pMHC와 복합된 11D06 Fab의 2.60 Å 해상도 결정 구조, Fab-pMHC 접촉 면적: 약 397 Å2, 펩티드 기여: 약 107 Å2. (C) HLA-A02/RMF pMHC와 복합된 ESK1 Fab의 2.60 Å 해상도 결정 구조(공개됨, PDB ID 4WUU), Fab-pMHC 접촉 면적: 약 505 Å2, 펩티드 기여: 약 60 Å2.
도 15는 5C01 Fab - HLA-A2/WT1VLD pMHC 결합 계면에 대한 확대도를 도시한 것이다. 바이오비아 디스커버리 스튜디오 4.5(BIOVIA Discovery Studio 4.5)에 의해 동정된 Fab와 pMHC간의 필수적인 화학적 상호작용을 강조표시하였다. 용매 원자는 나타내지 않았다.
도 16은 5C01 Fab 잔기(행)와 HLA-A2/WT1VLD pMHC 잔기(열)의 계면 및 상호작용 행렬을 도시한 것이다. N = 근접/인접, H = H-결합, Pi = Pi 상호작용, SB = 염다리. 계면 잔기를 상호작용 짝의 부재/존재하에 용매-접근가능 표면에서 변화를 겪는 잔기로서 정의하였다.
도 17은 11D06 Fab-HLA-A2/WT1RMF pMHC 결합 계면에 대한 확대도를 도시한 것이다. 바이오비아 디스커버리 스튜디오 4.5에 의해 동정된 Fab와 pMHC간의 필수적인 화학적 상호작용을 강조표시하였다. 용매 원자는 나타내지 않았다.
도 18은 11D06 Fab 잔기(행)와 HLA-A2/WT1RMF pMHC 잔기(열)의 계면 및 상호작용 행렬을 도시한 것이다. N = 근접/인접, H = H-결합, Pi = Pi 상호작용, SB = 염다리. 계면 잔기를 상호작용 짝의 부재/존재하에 용매-접근가능 표면에서 변화를 겪는 잔기로서 정의하였다.
도 19는 ESK1 Fab-HLA-A2/WT1RMF pMHC 결합 계면(PDB ID 4WUU)에 대한 확대도를 도시한 것이다. 바이오비아 디스커버리 스튜디오 4.5에 의해 동정된 Fab와 pMHC간의 필수적인 화학적 상호작용을 강조표시하였다. 용매 원자는 나타내지 않았다.
도 20은 ESK1 Fab 잔기(행)와 HLA-A2/WT1RMF pMHC 잔기(열)의 계면 및 상호작용 행렬을 도시한 것이다. N = 근접/인접, H = H-결합, Pi = Pi 상호작용, SB = 염다리. 계면 잔기를 상호작용 짝의 부재/존재하에 용매-접근가능 표면에서 변화를 겪는 잔기로서 정의하였다.
도 21은 상이한 CD3 결합제를 갖는 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체에 의해 매개된 HLA-A2+/WT1+ SKM-1 세포의 사살을 도시한 것이다.
도 22는 CD3 결합제를 갖는 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체에 의해 매개된 RMF 펩티드-부가된 T2 세포의 사살을 도시한 것이다.
도 23은 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB) (A) 알리(Aali)-TCB, (B) 다니엘(Daniel)-TCB, (C) ESK1-TCB 및 (D) 11D06-TCB에 의한 표적외 결합에 대한 평가를 도시한 것이다.
도 24는 NSG 마우스에서 단일 주사 후 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체 11D06-TCB(V9)의 약동학 프로파일을 도시한 것이다.
도 25는 인간화된 마우스 내의 SKM-1 이종이식에서 HLA-A2/WT1 x CD3 11D06-TCB(V9)에 의한 효능 연구를 도시한 것이다. (A) 모든 처리군에서 (평균) 종양 성장 동력학. (B) 비히클군에서 단일 종양 성장 동력학. (C) 11D06-TCB(V9)군에서 단일 종양 성장 동력학. (D) 통계. 48일간을 기준으로 한 계산(대조군으로서 비히클). 종양 성장 억제(TGI): TGI > 100 → 종양 퇴행, TGI = 100 → 종양 정체. 처리군 대 대조군 비(TCR): TCR = 1 → 효과 없음, TCR = 0 → 완전한 퇴행.
도 26은 HLA-A02/WT1RMF pMHC 복합체를 발현하는 CHO-K1 세포에 대한 결합시 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB)에 의한 T 세포의 활성화를 도시한 것이다(NFAT 리포터 분석). 실선: 11D06-TCB(V9)("2+1" 형식). 파선: "1+1 CrossMab" 형식에서의 유사 분자(11D06 및 V9 결합제).
정의
하기에 달리 정의되지 않는 한, 용어들은 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원 결합 분자"란 용어는 그의 가장 넓은 의미로, 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 그의 유도체, 예를 들어 단편이다.
"이중특이성"이란 용어는 항원 결합 분자가 적어도 2개의 별개의 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 이중특이성 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 이들은 각각 상이한 항원 결정인자에 특이적이다. 일부 양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정인자, 특히 2개의 별개의 세포상에서 발현된 2개의 항원 결정인자에 동시에 결합할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "결합가"란 용어는 항원 결합 분자 중의 명시된 수의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이와 같이, "항원에의 1가 결합"이란 용어는 항원 결합 분자 중의 항원에 특이적인 하나(및 하나 이하)의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다.
"항원 결합 부위"는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정부(CDR)로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본래의 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 가지며, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원 결합 잔기"란 용어는 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 하나의 양태에서, 항원 결합 잔기는 상기 부분이 부착된 개체(예를 들어 제2 항원 결합 잔기)가 표적 부위, 예를 들어 항원 결정인자를 갖는 특정 유형의 종양 세포로 향하게 할 수 있다. 또다른 양태에서 항원 결합 잔기는 그의 표적 항원, 예를 들어 T 세포 수용체 복합 항원을 통해 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 항원 결합 잔기는 본원에서 추가로 정의되는 바와 같은 항체 및 그의 단편을 포함한다. 특정한 항원 결합 잔기는 항체 중쇄 가변부 및 항체 경쇄 가변부를 포함하는, 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 항원 결합 잔기는 본원에 추가로 정의되고 당해 분야에 공지된 바와 같은 항체 불변부를 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변부는 5개의 아이소타입: α, δ, ε, γ, 또는 μ 중 어느 하나를 포함한다. 유용한 경쇄 불변부는 2개의 아이소타입: κ 및 λ 중 어느 하나를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원 결정인자" 또는 "항원"은 항원 결합 잔기가 결합하여 항원 결합 잔기-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 위치를 지칭한다. 유용한 항원 결정인자는 예를 들어 종양 세포의 표면상에서, 바이러스-감염된 세포의 표면상에서, 기타 질환 세포의 표면상에서, 면역 세포의 표면상에서, 혈청 및/또는 세포외 기질(ECM) 중에서 자유롭게 발견될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원 결합 잔기가 결합하는 항원 상의 단백 또는 비단백 위치를 나타낸다. 에피토프는 연접하는 아미노산 스트레치(stretch)(선형 에피토프)로부터 형성되거나 비연접 아미노산(입체구조 에피토프)(예컨대 항원의 접힘에 기인하여, 즉 단백 항원의 3차 접힘에 의해 공간상 근접성을 가짐)을 포함할 수 있다. 전형적으로, 선형 에피토프는 변성제에 단백 항원의 노출 후 항원 결합 잔기에 의해 여전히 결합되어 있는 반면, 전형적으로, 입체구조 에피토프는 변성제 처리시 파괴된다. 에피토프는 고유한 공간 입체구조 내에 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
"CD3"는 달리 제시되지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예컨대 포유동물, 예를 들어 영장류(예컨대 인간), 비인간 영장류(예컨대 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이) 및 설치류(예컨대 마우스 및 랫(rat))로부터의 임의의 고유 CD3을 지칭한다. 상기 용어는 미처리된 "전장" CD3 및 세포 내 처리로부터 생성되는 임의의 형태의 CD3을 포괄한다. 또한, 상기 용어는 CD3의 자연 발생 변이체, 예컨대 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 하나의 양태에서, CD3은 인간 CD3, 특히 인간 CD3의 입실론 서브유닛(CD3ε)이다. 인간 CD3ε의 아미노산 서열은 유니프로트(UniProt)(www.uniprot.org) 접근번호 P07766(버전 189), 또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1에 제시되어 있다. 또한, 서열번호 107을 참고한다. 사이노몰구스[마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)] CD3ε의 아미노산 서열은 NCBI 진뱅크(GenBank) 번호 BAB71849.1에 제시되어 있다. 또한, 서열번호 108을 참고한다.
"WT1"은 달리 제시되지 않는 한 "윌름스 종양 1" 또는 "윌름스 종양 단백질"로도 지칭되고, 임의의 척추동물 출처, 예컨대 포유동물, 예를 들어 영장류(예컨대 인간), 비인간 영장류(예컨대 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예컨대 마우스 및 랫)로부터의 임의의 고유 WT1을 지칭한다. 상기 용어는 미처리된 "전장" CD3 및 세포 내 처리로부터 생성되는 임의의 형태의 CD3을 포괄한다. 또한, 상기 용어는 WT1의 자연 발생 변이체, 예컨대 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 하나의 양태에서, WT1는 인간 WT1, 특히 서열번호 106의 단백질이다. 인간 WT1은 유니프로트(www.uniprot.org) 접근번호 P19544(엔트리 버전 215)에 기재되어 있고, 인간 WT1의 아미노산 서열은 서열번호 106에 제시되어 있다.
"VLD", "VLD 펩티드" 또는 "WT1VLD"는 아미노산 서열 VLDFAPPGA(서열번호 77; 서열번호 106의 WT1 단백질의 위치 37-45)를 갖는 WT1 유래 펩티드를 의미한다. "RMF", "RMF 펩티드" 또는 "WT1RMF"는 아미노산 서열 RMFRNAPYL(서열번호 78; 서열번호 106의 WT1 단백질의 위치 126-134)을 갖는 WT1 유래 펩티드를 의미한다.
"HLA-A2", "HLA-A*02", "HLA-A02" 또는 "HLA-A*2"(서로 대체가능하게 사용됨)는 HLA-A 혈청형 군 중 인간 백혈구 항원 혈청형을 지칭한다. HLA-A2 단백질(각각의 HLA 유전자에 의해 암호화됨)은 β2 마이크로글로불린 서브유닛을 추가로 포함하는 각각의 클래스 I MHC 단백질의 α 쇄를 구성한다. 특정한 HLA-A2 단백질은 HLA-A201(HLA-A0201, HLA-A02.01 또는 HLA-A*02:01로도 지칭됨)이다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 HLA-A2 단백질은 HLA-A201이다. "HLA-A2/WT1"은 HLA-A2 분자와 W11 유래 펩티드(본원에서 "WT1 펩티드"로도 지칭됨)의 복합체, 구체적으로는 RMF 또는 VLD 펩티드(각각 "HLA-A2/WT1RMF" 및 "HLA-A2/WT1VLD")를 지칭한다. 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD 복합체에 특이적으로 결합한다.
"특이적 결합"은 상기 결합이 항원에 대해 선택성이며 불필요하거나 비-특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정한 항원 결정인자에 결합하는 항원 결합 잔기의 능력은 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA) 또는 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 다른 기법, 예를 들어 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법(예를 들어 BIAcore 장비상에서 분석된다)(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]), 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])을 통해 측정될 수 있다. 본 발명의 항체 및 이중특이성 항원 결합 분자의 특이성을 측정하는데 적합한 분석은 예컨대 본원의 하기 실시예 4, 9 및 10에 기재되어 있다. 하나의 양태에서, 관련되지 않은 단백질에 대한 항원 결합 잔기의 결합 정도는 예를 들어 SPR에 의해 측정되는 바와 같이 항원에 대한 항원 결합 잔기의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 양태에서, 상기 항원에 결합하는 항원 결합 잔기, 또는 상기 항원 결합 잔기를 포함하는 항원 결합 분자는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"친화도"는 분자(예를 들어 수용체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 짝(예를 들어 리간드)간의 비-공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들어 항원 결합 잔기와 항원, 또는 수용체와 그의 리간드)간의 1:1 상호작용을 반영하는 본래의 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 짝 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)에 의해 나타낼 수 있으며, 상기 상수는 해리 및 결합속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비이다. 따라서, 균등한 친화도는 상기 속도 상수들의 비가 동일하게 남아있는 한 상이한 속도 상수를 포함할 수도 있다. 친화도를 본원에 기재된 것들을 포함하여 당해 분야에 공지된 잘 확립된 방법에 의해 측정할 수 있다. 친화도의 특정한 측정 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR)이다.
"감소된 결합", 예를 들어 Fc 수용체에의 감소된 결합은 예를 들어 SPR에 의해 측정된 바와 같이, 각 상호작용에 대한 친화도의 감소를 지칭한다. 명확성을 위해서, 상기 용어는 또한 0(또는 분석 방법의 검출 한계 미만), 즉 상호작용의 완전한 제거까지의 친화도의 감소를 포함한다. 환언하면, "증가된 결합"은 각 상호작용에 대한 결합 친화도의 증가를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "활성화 T 세포 항원"은 T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구(항원 결합 분자와 상호작용시 T 세포 활성화를 유도할 수 있다)의 표면상에서 발현되는 항원 결정인자를 지칭한다. 구체적으로, 항원 결합 분자와 활성화 T 세포 항원의 상호작용은 상기 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 촉발시킴으로써 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 특정 양태에서 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3의 입실론 서브유닛(인간 서열에 대해서 유니프로트 번호 P07766(버전 189), NCBI RefSeq no. NP_000724.1, 서열번호 107; 또는 사이노몰구스[마카카 파시쿨라리스] 서열에 대해서 유니프로트 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI GenBank no. BAB71849.1, 서열번호 108 참고)이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토킨 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현 중에서 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 지칭한다. T 세포 활성화 측정에 적합한 분석은 당해 분야에 공지되어 있으며 본원에 기재되어 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들어 암세포와 같은 종양 중의 세포 또는 종양 기질의 세포의 표면상에 존재하는 항원 결정인자를 지칭한다. 특정 양태에서, 상기 표적 세포 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 1HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD, 가장 특히 HLA-A2/WT1RMF이다. 본원에 사용되는 바와 같이, Fab 분자에 관하여 "제1", "제2" 또는 "제3" 등과 같은 용어는 하나 초과의 각 유형의 부분이 존재하는 경우 구분의 편이성을 위해 사용된다. 이들 용어의 사용은 명백히 서술되지 않는 한 이중특이성 항원 결합 분자의 특정한 순서 또는 배향을 부여하고자 하는 것이 아니다.
"융합된"은 성분(예를 들어 Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)이 펩티드 결합에 의해, 직접 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결됨을 의미한다.
"Fab 분자"는 면역글로불린의 중쇄("Fab 중쇄")의 VH 및 CH1 도메인 및 경쇄("Fab 경쇄")의 VL 및 CL 도메인으로 이루어진 단백질을 지칭한다.
"크로스오버" Fab 분자(또한 "Crossfab"라 칭한다)는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 또는 불변 도메인이 교환된(즉 서로에 의해 대체된) Fab 분자를 의미한다. 즉, 크로스오버 Fab 분자는 경쇄 가변 도메인 VL 및 중쇄 불변 도메인 1 CH1(VL-CH1, N-에서 C-말단 방향으로)로 구성된 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 도메인 VH 및 경쇄 불변 도메인 CL(VH-CL, N-에서 C-말단 방향으로)로 구성된 펩티드 쇄를 포함한다. 명확성을 위해서, 상기 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인들이 교환된 크로스오버 Fab 분자에서, 상기 중쇄 불변 도메인 1 CH1을 포함하는 펩티드 쇄를 본원에서 (크로스오버) Fab 분자의 "중쇄"로서 지칭한다. 환언하면, 상기 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 도메인들이 교환된 크로스오버 Fab 분자에서, 상기 중쇄 가변 도메인 VH를 포함하는 펩티드 쇄를 본원에서 (크로스오버) Fab 분자의 "중쇄"로서 지칭한다.
상기에 대조적으로, "통상적인" Fab 분자는 천연 포맷의, 즉 중쇄 가변 및 불변 도메인(VH-CH1, N-에서 C-말단 방향으로)으로 구성된 중쇄 및 경쇄 가변 및 불변 도메인(VL-CL, N-에서 C-말단 방향으로)으로 구성된 경쇄를 포함하는 Fab 분자를 의미한다.
"면역글로불린 분자"란 용어는 천연 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, IgG 부류의 면역글로불린은 다이설파이드-결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된, 약 150000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 도메인(VH)(또한 가변 중 도메인 또는 중쇄 가변부라 칭한다)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)(또한 중쇄 불변부라 칭한다)을 갖는다. 유사하게, N-에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 도메인(VL)(또한 가변 경 도메인 또는 경쇄 가변부라 칭한다)에 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인(또한 경쇄 불변부라 칭한다)을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)라 칭하는 5가지 유형 중 하나로 할당될 수 있으며, 이들 중 일부는 하위 유형, 예를 들어 γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄를 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로, 카파(κ) 및 람다(λ)라 칭하는 2가지 유형 중 하나로 할당할 수 있다. 면역글로불린은 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된, 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 필수적으로 이루어진다.
본원에서 "항체"란 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며 다양한 항체 구조, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 획득되는 항체를 지칭한다. 즉, 상기 집단 중에 포함된 개별적인 항체들은 동일하고/하거나, 상기 단클론 항체의 생성 중 발생할 수 있는 가능한 변이체(상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 상기 항원상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 따라서, "단클론"이라는 수식어구는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 획득된다는 항체의 특징을 가리키며, 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 생성을 요구하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체를 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 부분을 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법에 의해 제조할 수 있으며, 상기와 같은 방법 및 단클론 항체의 다른 예시적인 제조 방법들은 본 발명에 개시되어 있다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것, 즉 그의 자연 환경 중에 있지 않은 것이다. 특정 수준의 정제가 필요하지 않다. 예를 들어, 단리된 항체를 그의 본래 또는 자연 환경으로부터 제거할 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생성된 항체는 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분별되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 본래 또는 재조합 항체이므로 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 이와 같이, 본 발명의 항체 및 이중특이성 항원 결합 분자는 단리된다. 일부 양태에서, 항체를 예를 들어 전기영동(예를 들어 SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 측정된 바와 같은 95% 또는 99%를 초과하는 순도로 정제시킨다. 항체 순도의 평가를 위한 방법에 대한 리뷰를 위해, 예를 들어 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)] 참조.
"전장 항체", "온전한 항체" 및 "완전 항체"란 용어는 본원에서 본래의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위해 호환 가능하게 사용된다.
"항체 단편"은 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 완전 항체의 일부를 포함하는 상기 완전 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 다이아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자(예를 들어 scFv), 및 단일-도메인 항체를 포함한다. 몇몇 항체 단편의 리뷰를 위해서, 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)] 참조. scFv 단편의 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참고; 또한 WO 93/16185; 및 US 5,571,894 및 US 5,587,458 참고. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의에 대해서, US 5,869,046 참고. 다이아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)] 참조. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9, 129-134(2003)]에 개시되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 일부 양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(문헌[Domantis, Inc., Waltham, MA]; 예를 들어 US 6,248,516 B1 참고). 항체 단편을 본 발명에 개시된 바와 같은 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 완전 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이 또는 파지)에 의한 생산에 의해 제조할 수 있다.
"항원 결합 도메인"이란 용어는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이들에 상보성인 구역을 포함하는 항체의 부분을 지칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 항체 가변 도메인(또한 항체 가변부라 칭한다)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다.
"가변부" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항원에 대한 항체의 결합에 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 본래 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조들을 가지며, 이때 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 고가변부(HVR)를 포함한다. 예를 들어 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)] 참조. 단일의 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 가변부 서열과 관련하여 본원에 사용되는 바와 같이, "카밧 번호부여"는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 의해 제시된 번호부여 시스템을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변부 및 도메인의 아미노산 위치는 본원에서 "카밧에 따른 번호부여" 또는 "카밧 번호부여"라 지칭되는, 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재된 카밧 번호부여 시스템에 따라 번호부여된다. 구체적으로 상기 카밧 번호부여 시스템(문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 647-660 페이지 참고)은 카파 및 람다 아이소타입의 경쇄 불변 도메인 CL에 대해 사용되고, 카밧 EU 색인 번호부여 시스템(661-723 페이지 참고)은 중쇄 불변 도메인(CH1, 힌지, CH2 및 CH3)에 대해 사용되며, 이를 본원에서, 상기의 경우에 "카밧 EU 색인에 따른 번호부여"라 칭함으로써 더욱 명확히 한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "고가변부" 또는 "HVR"이란 용어는 서열이 고가변성이고("상보성 결정부" 또는 "CDR") 및/또는 구조적으로 한정된 고리("고가변 고리")를 형성하고 및/또는 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 중의 3개(H1, H2, H3), 및 VL 중의 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 HVR은
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101 (H3)에서 존재하는 고가변 고리(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]);
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에서 존재하는 CDR(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]);
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에서 존재하는 항원 접촉부(문헌[MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)를 포함하는, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합
을 포함한다.
달리 표시하지 않는 한, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어 FR 잔기)를 본원에서 상기 카밧 등에 따라 번호부여한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 고가변부(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 순서로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 지칭한다. 일부 양태에서, 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어 CDR)의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것들에 상응하며, 상기 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것들에 상응한다. 상기와 같은 가변 도메인을 본원에서 "인간화된 가변부"이라 칭한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변부의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 인간화된 항체 중의 일부 FR 잔기를 비-인간 항체(예를 들어 HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환시켜, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원시키거나 개선시킨다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 본 발명에 의해 포함되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는 불변부가 원래 항체의 경우로부터 추가로 변형되거나 변화되어, 특히 Clq 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관하여 본 발명에 따른 성질을 생성하는 것들이다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특별히 제외시킨다. 일부 양태에서, 인간 항체는 비-인간 트랜스제닉 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼로부터 유래된다. 일부 양태에서, 인간 항체는 하이브리도마 세포주로부터 유래된다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편을 또한 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주한다.
항체 또는 면역글로불린의 "부류"는 이들의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변부의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 하위부류(아이소타입)들, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다.
본원에서 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"이란 용어는 상기 불변부의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 변할 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대개 Cys226으로부터 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복시-말단까지 연장되는 것으로 한정된다. 그러나, 숙주 세포에 의해 생산된 항체는 상기 중쇄의 C-말단으로부터 하나 이상, 특히 하나 또는 2개의 아미노산의 번역-후 절단을 겪을 수도 있다. 따라서, 전장 중쇄를 암호화하는 특정한 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생산된 항체는 전장 중쇄를 포함하거나, 전장 중쇄의 절단된 변이체(또한 본원에서 "절단된 변형 중쇄"라 칭한다)를 포함할 수 있다. 이는 상기 중쇄의 최종 2개의 C-말단 아미노산이 글리신(G446) 및 리신(K447, 카밧 EU 색인에 따른 번호부여)인 경우일 수 있다. 따라서, 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447) 또는 C-말단 글리신(Gly446) 및 리신(K447)이 존재할 수도, 또는 존재하지 않을 수도 있다. Fc 도메인(또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛)을 포함하는 중쇄의 아미노산 서열을 본원에서 달리 나타내지 않는 한 C-말단 글리신-리신 다이펩티드 없이 나타낸다. 본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자에 포함된, 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함한 중쇄는 추가적인 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카밧의 EU 색인에 따른 번호부여)를 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자에 포함된, 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함한 중쇄는 추가적인 C-말단 글리신 잔기(G446, 카밧의 EU 색인에 따른 번호부여)를 포함한다. 본 발명의 조성물, 예를 들어 본원에 기재된 약학 조성물은 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 집단을 포함한다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 집단은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변형 중쇄를 갖는 분자를 포함할 수 있다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 집단은, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%가 절단된 변형 중쇄를 갖는, 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변형 중쇄를 갖는 분자의 혼합물로 이루어질 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 집단을 포함하는 조성물은 추가적인 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카밧의 EU 색인에 따른 번호부여)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 집단을 포함하는 조성물은 추가적인 C-말단 글리신 잔기(G446, 카밧의 EU 색인에 따른 번호부여)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기와 같은 조성물은 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 분자로 구성된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자; 추가적인 C-말단 글리신 잔기(G446, 카밧의 EU 색인에 따른 번호부여)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 분자; 및 추가적인 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카밧의 EU 색인에 따른 번호부여)와 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 분자의 집단을 포함한다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc 영역 또는 불변부 중의 아미노산 잔기의 번호부여는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 번호부여 시스템(또한 EU 색인라 칭한다)(또한 상기 참고)에 따른다. 본원에 사용되는 바와 같은 Fc 도메인의 "서브유닛"은 이량체성 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 즉 안정한 자기-회합이 가능한, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변부를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형"은 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드가 동일한 폴리펩티드와 회합하여 동종이량체를 형성하는 것을 감소시키거나 방지하는, 펩티드 주쇄의 조작 또는 Fc 도메인 서브유닛의 번역-후 변형이다. 본원에 사용되는 바와 같은 회합을 촉진하는 변형은 회합을 원하는 2개의 Fc 도메인 서브유닛(즉 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛) 각각에 대해 수행된 별도의 변형들을 포함하며, 여기에서 상기 변형들은 상기 두 Fc 도메인 서브유닛의 회합을 촉진하기 위해서 서로에 상보성이다. 예를 들어, 회합을 촉진하는 변형은, 상기 Fc 도메인 서브유닛의 회합을 각각 입체적으로 또는 정전기적으로 유리하게 만들도록 이들 서브유닛 중 하나 또는 둘 다의 구조 또는 전하를 변경시킬 수 있다. 따라서, (이종)이량체화는 제1 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드와 제2 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드 사이에서 일어나며, 이들은 각각의 서브유닛에 융합된 추가의 성분(예를 들어 항원 결합 잔기)이 동일하지 않다는 의미에서 동일하지 않을 수 있다. 일부 양태에서, 상기 회합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인 중의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 회합을 촉진하는 변형은 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에, 별도의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다.
"효과기 기능"이란 용어는, 항체 아이소타입에 따라 변하는 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성들을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적인 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체-의존적인 세포 식작용(ADCP), 사이토킨 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화.
본원에 사용되는 바와 같이, "조작하다, 조작된, 조작하는"이란 용어는 펩티드 주쇄의 임의의 조작 또는 천연 또는 재조합 폴리펩티드 또는 그의 단편의 번역-후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작은 아미노산 서열의, 글리코실화 패턴의, 또는 개별적인 아미노산의 측쇄 그룹의 변형뿐만 아니라 이들 접근법의 조합을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "아미노산 돌연변이"란 용어는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포함함을 의미한다. 최종 구조물이 목적하는 특성, 예를 들어 Fc 수용체에의 감소된 결합, 또는 또다른 펩티드와의 증가된 회합을 갖는 한, 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합을 수행하여 최종 생성물에 도달할 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들어 Fc 영역의 결합 특성을 변경시키기 위해서, 비-보존적 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산의, 상이한 구조 및/또는 화학적 성질을 갖는 또다른 아미노산에 의한 대체가 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비-천연 아미노산에 의한 또는 20개의 표준 아미노산의 천연 아미노산 유도체(예를 들어 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-하이드록시리신)에 의한 대체를 포함한다. 아미노산 돌연변이를 당해 분야에 주지된 유전학적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 유전학적 방법은 부위-지향된 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전자 조작 이외의 방법, 예를 들어 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 그룹을 변경시키는 방법이 또한 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 나타내기 위해 본원에서 다양한 명칭을 사용할 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인의 329번 위치의 프롤린으로부터 글리신으로의 치환을 329G, G329, G329, P329G, 또는 Pro329Gly로서 나타낼 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 관한 "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취하기 위해서, 및 상기 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 서열과 도입 틈을 정렬시킨 후에, 기준 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기들과 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기들의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, Clustal W, 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 서열들을 정렬시키기에 적합한 매개변수들, 예를 들어 비교하는 서열들의 전체길이에 대해 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치성% 값을 BLOSUM50 비교 행렬과 함께 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 또는 이후의 ggsearch 프로그램을 사용하여 생성한다. 상기 FASTA 프로그램 패키지는 문헌[W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448]; 문헌[W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227- 258]; 및 문헌[Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36]에 기재되어 있으며, http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml로부터 공개적으로 입수할 수 있다. 한편으로, http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 접근가능한 공개 서버를 사용하여 서열을 비교하고, ggsearch(전체 단백질:단백질) 프로그램 및 디폴트 옵션(BLOSUM50; 끊김: -10; 확장: -2; Ktup = 2)을 사용하여 국소적인 정렬보다는 전체적인 정렬을 수행하도록 한다. 아미노산 일치성 퍼센트를 출력 정렬 헤더에 제공한다.
"폴리뉴클레오타이드"란 용어는 단리된 핵산 분자 또는 구조물, 예를 들어 전령 RNA(mRNA), 바이러스-유래된 RNA, 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들어 아미드 결합, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 중에서 발견되는 결합)을 포함할 수 있다. "핵산 분자"란 용어는 폴리뉴클레오타이드 중에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 그의 본래 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해 단리된 벡터 중에 함유된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드가 고려된다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 추가의 예는 이종 숙주 세포 중에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 통상적으로 함유하는 세포 중에 함유된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 염색체외에 존재하거나 그의 자연적인 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물뿐만 아니라 양성 및 음성 가닥 형태, 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성적으로 생성된 상기와 같은 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자와 같은 조절 요소이거나 상기를 포함할 수 있다.
"[예를 들어 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자]를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드(또는 핵산)"는 단일 벡터 또는 별도의 벡터 중의 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드 분자, 및 숙주 세포 중의 하나 이상의 장소에 존재하는 상기와 같은 핵산 분자를 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 그의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자를 지칭한다.
"발현 카세트"란 용어는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 요소와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 재조합 발현 카세트를 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열들 중에서도 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 발현 카세트는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"란 용어는 특정한 유전자를 상기가 세포에서 작동적으로 관련되도록 도입시키고 그의 발현을 지시하는데 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈내에 통합된 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 허용한다. 일단 상기 발현 벡터가 세포내에 있으면, 상기 유전자에 의해 암호화되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 상기 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 생성된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 호환적으로 사용되며 상기와 같은 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이들은 계대의 수와 상관 없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일할 필요는 없으며, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손은 본 발명에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 생성하는데 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어 몇가지 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 예를 들어 HEK 세포, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함하나, 또한 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포를 포함한다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인에 의한 맞물림에 이어서 수용체-함유 세포를 자극하여 효과기 기능을 수행하는 신호전달 사건을 이끌어내는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), 및 FcαRI(CD89)를 포함한다.
항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)은 면역 효과기 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해에 이르는 면역 기전이다. 상기 표적 세포는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 그의 유도체가 일반적으로 상기 Fc 영역에 대해 N-말단인 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "감소된 ADCC"란 용어는 상기 정의된 ADCC의 기전에 의해 주어진 시간에, 표적 세포 주변의 배지 중에서 주어진 농도의 항체를 용해시키는 표적 세포수의 감소, 및/또는 ADCC의 기전에 의해 주어진 시간에 주어진 수의 표적 세포의 용해를 성취하는데 요구되는, 상기 표적 세포 주변의 배지 중 항체의 농도의 증가로서 정의된다. 상기 ADCC의 감소는 동일한 표준 생성, 정제, 제형화 및 보관 방법(당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다)을 사용하여, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성된, 그러나 조작되지는 않은 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 대한 것이다. 예를 들어 Fc 도메인 중에 ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 포함하는 항체에 의해 매개되는 ADCC의 감소는 상기 Fc 도메인 중에 상기 아미노산 치환이 없는 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 비례한다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 당해 분야에 주지되어 있다(예를 들어 PCT 공보 WO 2006/082515 또는 PCT 공보 WO 2012/130831 참고).
작용제의 "효과량"은 상기 작용제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 생성하기에 필요한 양을 지칭한다.
작용제, 예를 들어 약학 조성물의 "치료 효과량"은 필요한 투여량 및 기간 동안 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다. 작용제의 치료 효과량은 예를 들어 질병의 부작용을 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나, 방지한다.
"개체" 또는 "피실험자"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 특히, 상기 개체 또는 피실험자는 인간이다.
"약학 조성물"이란 용어는, 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태이고 조성물이 투여되는 피실험자에게 허용가능하지 않게 독성인 추가적인 성분은 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 외에, 피실험자에게 무독성인 약학 조성물 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 및 "치료하는"과 같은 그의 문법상 어미변화)는 치료 중인 개체에서 질병의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상적 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 늦춘다.
"패키지 삽입지"는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는, 상기와 같인 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하는데 사용된다.
양태의 상세한 설명
본 발명은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD, 가장 특히 HLA-A2/WT1RMF에 결합하고 치료 목적에 요구되는 우수한 친화도 및 특이성을 갖는 항체 및 이중특이성 항원 결합 분자를 제시한다. 또한, 상기 분자는 예컨대 효능 및/또는 안전성 및 생산성과 관련하여 치료 적용례에 기타 바람직한 특성을 갖는다.
HLA-A2/WT1 항체
본 발명자들은 특히 우수한 친화도 및 특이성으로 HLA-A2/WT1에 결합하는 신규한 항체를 개발했다. 예컨대, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 HLA-A2와 다른 구조적으로 유사한 펩티드의 복합체보다 HLA-A2/WT1(구체적으로 HLA-A2/WT1RMF)에 현저하게 선택성이 있는 항체를 개발했다.
따라서, 특정 양상에서, 본 발명은 HLA-A2/WT1에 결합하고 임의의 하기 특징을 갖는 항체를 제시한다.
하나의 양태에서, 항체는 약 100 nM 미만, 약 75 nM 미만 또는 약 50 nM 미만의 해리 상수(KD)로 HLA-A2/WT1에 1가 친화도를 갖는다. 하나의 양태에서, 항체는 약 1.5 nM 미만, 약 1 nM 미만 또는 약 0.75 nM 미만의 겉보기 해리 상수(KD)로 HLA-A2/WT1에 2가 친화도(결합도)를 갖는다. 하나의 양태에서, 항체의 2가 친화도(결합도)는 (겉보기) KD의 관점에서 항체의 1가 친화도의 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상 또는 100배 이상 높다.
하나의 양태에서, 친화도는 25℃에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정된다. 하나의 양태에서, 1가 친화도는 항체의 Fab 분자 형식으로 결정된다. 하나의 양태에서, 2가 친화도(결합도)는 항체의 IgG 분자 형식으로 측정된다.
구체적인 양태에서, 항체의 친화도는 하기와 같이 측정된다:
전개 완충액으로서 PBST(10 mM PBS, pH 7.4 및 0.005% (v/v) 트윈(Tween) 20)를 사용하여 25℃에서 실험을 수행하였다. GLC 및 GLM 센서 칩이 징착된 프로테온(ProteOn) XPR36 바이오센서 및 커플링 시약(10 mM 나트륨 아세테이트 pH 4.5, 설포-N-하이드록시숙신이미드[설포-NHS], 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드[EDC] 및 에탄올아민)(미국 캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오라드 인코포레이티드(BioRad Inc.))을 사용하였다. GLM 칩에서 30 μL/분으로 부동화를 수행하였다. pAb(염소) 항 인간 IgG, F(ab)2 특이성 항체(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))를 표준 아민-커플링 절차를 사용하여 수직 방향으로 커플링시켰다. 모든 6개의 리간드 채널을 EDC(200 mM)와 설포-NHS(50 mM)의 혼합물에 의해 5분 동안 활성화시켰다. 표면이 활성화된 직후, pAb(염소) 항 인간 IgG, F(ab)2 특이성 항체(50 μg/mL, 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 5)를 모든 6개의 채널에 5분 동안 주입하였다. 최종적으로, 채널을 1 M 에탄올아민-HCl(pH 8.5)의 5분 동안의 주입에 의해 차단하였다. 5분 동안 5개의 개별 수평 채널에 동시 주입(30 μL/분)에 의해 대장균 상청액으로부터 Fab 변이체를 포획하였다. 조건화된 배지를 6개의 채널에 주입하여 이중 참조를 목적으로 하는 인-라인(in-line) 대조군(blank)을 생성하였다. 수직 채널에 2분 동안 HLA-WT1(예컨대 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD)(100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 nM, 50 μL/분)의 연속 희석액의 주입에 의해 1회(one-shot) 동력학 측정을 수행하였다. 해리를 3분 동안 감시하였다. 동력학 데이터를 프로테온 매니저(ProteOn Manager) v. 2.1에서 분석하였다. 반응 지점 데이터의 처리에는 지점간-참조 및 인-라인 완충 대조군을 사용한 이중-참조를 사용하였다(문헌[Myszka, J Mol Recognit (1999) 12, 279-284]). 질량 이동 없이 반복 1회 주입으로부터 처리된 데이터를 단순 1:1 랭뮤어 맹검 모델에 근사하였다(문헌[O'Shannessy et al., Anal Biochem (1993) 212, 457-468]).
본 발명의 항체는 HLA-A2/WT1(즉 HLA-A2 분자와 WT1-유래 펩티드의 복합체)에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-A2/WT1RMF(즉 HLA-A2 분자와 WT1RMF 펩티드의 복합체)에 특이적으로 결합한다. 보다 특정 양태에서, 항체는 HLA-A201/WT1RMF(즉 HLA-A201 분자와 WT1RMF 펩티드의 복합체)에 특이적으로 결합한다. HLA-A2/WT1RMF에 결합하는 본 발명의 항체는 본원에 기재된 항체 11D06, 33H09 및 5E11을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-A2/WT1VLD(즉 HLA-A2 분자와 WT1VLD 펩티드의 복합체)에 특이적으로 결합한다. 보다 특정 양태에서, 항체는 HLA-A201/WT1VLD(즉 HLA-A201 분자와 WT1VLD 펩티드의 복합체)에 특이적으로 결합한다. HLA-A2/WT1VLD에 결합하는 본 발명의 항체는 본원에 기재된 항체 11B09, 13B04 및 5C01을 포함한다.
하나의 양태에서, 항체의 특이적 결합은 HLA-A2/펩티드(예컨대 WT1RMF 또는WT1VLD)-발현 세포, 특히 펩티드-부가된 T2 세포를 사용하여 유동 세포분석에 의해 측정된다.
특정 양태에서, 항체의 특이적 결합은 하기와 같이 측정된다:
10% FBS(기브코(Gibco), Cat No. 16140-071) + 1% 페니실린-스트렙토마이신(기브코, Cat No. 15070-063)으로 보충된 IMDM 배지(라이프테크놀로지스(Life Technologies)에 의한 기브코, Cat No. 31980-048)(완전 배지) 중 106 세포/mL의 세포 완충액으로서 T2 세포를 제조한다. 세포를 튜브에 10 mL의 총 부피로 유지하고, 10-2 M(펩티드의 최종 농도: 10-5 M)의 10 μL의 펩티드(예컨대 WT1 VLD 펩티드(서열번호 77), 또는 RMF 펩티드(서열번호 78))에 의해 37℃에서 5% CO2로 2시간 동안 항온배양한다. 세척 후, 세포를 차가운 PBS 중에 현탁시키고 4℃에서 1시간 동안 IgG 형태의 항체 적정 농도(예컨대 10 μg/mL 내지 0.00064 μg/mL)로 항온배양한 후, 2차 항 인간 IgG-Fc 피코에리트린(PE)-접합된 항체(잭슨 래버러토리스(Jackson Laboratories), Cat No. 109-116-098)로 30분 동안 항온배양한다. FACS LSR II(BD)에서 세포를 획득하고, 데이터는 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)에서 PE의 평균 형광 강도(MFI)로서 제시된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-A2 단독, 또는 WT1-유래 펩티드, 예컨대 WT1RMF 또는 WT1VLD 이외에 다른 펩티드를 갖는 HLA-2에 유의하게 결합하지 않는다.
하나의 양태에서, 항체는 WT1-유래 펩티드, 특히 WT1RMF 또는 WT1VLD의 부재하에 HLA-A2에 유의하게 결합하지 않는다. 하나의 양태에서, 항체는 WT1-유래 펩티드(구체적으로는 WT1RMF 또는 WT1VLD)의 부재하에 HLA-A2에 대한 결합의 EC50보다 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 50배 이상, 75배 이상 또는 100배 이상 낮은 EC50으로 HLA-A2/WT1(구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD)에 결합한다.
하나의 양태에서, 항체는 HLA-A2/WT1(구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD)에 결합하지만, 하기 표 5의 펩티드로부터 선택되는 펩티드(서열번호 79 내지 105의 펩티드)를 갖는 HLA-A2에는 유의하게 결합하지 않는다. 하나의 양태에서, 항체는 HLA-A2/WT1(구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD)에 결합하지만, 하기 표 5의 임의의 펩티드(서열번호 79 내지 105의 펩티드)를 갖는 HLA-A2에는 유의하게 결합하지 않는다.
하나의 양태에서, 항체는 하기 표 5의 펩티드로부터 선택되는 펩티드(서열번호 79 내지 105의 펩티드)를 갖는 HLA-A2에 대한 결합의 EC50보다 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 50배 이상, 75배 이상 또는 100배 이상 낮은 EC50으로 HLA-A2/WT1(구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD)에 결합한다. 하나의 양태에서, 항체는 하기 표 5의 임의의 펩티드(서열번호 79 내지 105의 펩티드)를 갖는 HLA-A2에 대한 결합의 EC50보다 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 50배 이상, 75배 이상 또는 100배 이상 낮은 EC50으로 HLA-A2/WT1(구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD)에 결합한다.
하나의 양태에서, EC50은 HLA-A2/펩티드(예컨대 WT1RMF 또는 WT1VLD 펩티드), 특히 펩티드-부가된 T2 세포를 사용하여 유동 세포분석에 의해 측정된다.
특정 양태에서, EC50은 하기와 같이 측정된다:
10% FBS(기브코, Cat No. 16140-071) + 1% 페니실린-스트렙토마이신(기브코, Cat No. 15070-063)으로 보충된 IMDM 배지(라이크 테크놀로지스에 의한 기브코, Cat No. 31980-048)(완전 배지) 중 106 세포/mL의 세포 완충액으로서 T2 세포(ATCC, Cat. No. CRL-1992)를 제조한다. 세포를 튜브에 10 mL의 총 부피로 유지하고, 10-2 M(펩티드의 최종 농도: 10-5 M)의 10 μL의 펩티드(예컨대 WT1 VLD 펩티드(서열번호 77), 또는 RMF 펩티드(서열번호 78))에 의해 37℃에서 5% CO2로 2시간 동안 항온배양한다. 세척 후, 세포를 차가운 PBS 중에 현탁시키고 4℃에서 1시간 동안 IgG 형태의 항체 적정 농도(예컨대 10 μg/mL 내지 0.00064 μg/mL)로 항온배양한 후, 2차 항 인간 IgG-Fc 피코에리트린(PE)-접합된 항체(잭슨 래버러토리스, Cat No. 109-116-098)로 30분 동안 항온배양한다. FACS LSR II(BD)에서 세포를 획득하고, 데이터는 그래프패드 프리즘에서 PE의 평균 형광 강도(MFI)로서 제시된다. XL핏(XLfit: 등록상표) 애드-온(영국 길드포드 소재의 ID 비지니스 솔루션스(ID Business Solutions))을 사용하여 마이크로소프트(등록상표) 엑셀에서 EC50 값을 계산한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열을 포함하는 항체와 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A201/WT1RMF에 대한 결합을 경쟁하는 항체를 제시한다. 경쟁 분석이 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열을 포함하는 항체(참조 항체)와 HLA-A2-WT1에 대한 결합을 경쟁하는 항체를 동정하는데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 경쟁 항체는 참조 항체에 의해 결합되는 것과 동일한 에피토프(예컨대 선형 또는 입체구조 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 매핑(mapping)에 대한 자세한 예시적 방법은 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제시되고, 본원의 실시예에도 상세히 기재되어 있다. 예시적인 경쟁 분석에서, 부동화된 HLA-A2/WT1을 HLA-A2/WT1에 결합하는 제1 표지된 항체(예컨대 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열을 포함하는 항체), 및 HLA-A2/WT1에 대한 결합에 대해 제1 항원과 경쟁하는 능력이 시험되는 제2 미표지된 항체를 포함하는 용액에서 항온배양한다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 부동화된 HLA-A2/WT1을 제1 표지된 항체는 포함하되 제2 미표지된 항체는 포함하지 않는 용액 중 항온배양한다. HLA-A2/WT1에 대한 제1 항체의 결합에 허용되는 조건하에 항온배양 후, 과량의 미결합 항체를 제고하고, 부동화된 HLA-A2/WT1과 회합된 표지의 양을 측정한다. 부동화된 HLA-A2/WT1과 회합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소한 경우, 이는 제2 항체가 HLA-A2/WT1에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁함을 나타낸다. 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]를 참고한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열을 포함하는 항체와 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
특정 에피토프에 결합하는 항체(즉 동일한 에피토프에 결합하는 항체)의 선별은 당업계의 통상적인 방법, 예컨대 비제한적으로 알라닌 스캐닝(scanning), 펩티드 블롯(문헌[Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463]) 참고), 에피토프 절개, 에피토프 추출, 항원의 화학적 변형(문헌[Prot. Sci. 9 (2000) 487-496) 참고), 및 교차-차단(cross-blocking)(문헌["Antibodies", Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)] 참고)을 사용하여 수행될 수 있다.
항원 구조-기반 항체 프로파일링(ASAP)은 변형-보조 프로파일링(MAP)으로도 공지되어 있고 각각의 항원의 결합 프로파일을 기반으로 HLA-A2/WT1에 특이적으로 결합하는 다수의 단클론 항체를 다수의 화학적 또는 효소적 변형된 항원 표면으로부터 분류할 수 있게 한다(예컨대 US 2004/0101920). 각각의 분류에서 항체는 또다른 분류에 의해 제시되는 에피토프와 명백히 상이하거나 이와 부분적으로 중첩되는 고유 에피토프일 수 있는 동일 에피토프에 결합할 수 있다.
또한, 경쟁 결합이 항체가 HLA-A2/WT1의 동일 에피토프에 결합하거나 참조 항 HLA-A2-WT1 항체와 결합을 경쟁하는지 여부를 용이하게 측정하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 참조 항체로서 "동일 에피토프에 결합하는 항체"는 항원 경쟁 분석에서 항원에 대한 참조 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 항체, 및 역으로, 경쟁 분석에서 항원에 대한 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 참조 항체를 지칭한다. 또한, 예컨대, 항체가 참조 항체로서 HLA-A2/WT1의 동일 에피토프에 결합하는지 여부를 측정하기 위해, 상기 참조 항체는 포화 조건하에 HLA-A2/WT2에 결합할 수 있다. 과량의 참조 항체의 제거 후, 논의되는 항 HLA-A2/WT1 항체의 HLA-A2/WT1에 결합하는 능력이 평가된다. 항체가 참조 항체의 포화 결합 후 HLA-A2/WT1에 결합할 수 있는 경우, 이는 논의되는 항체가 참조 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 결론지을 수 있다. 그러나, 논의되는 항체가 참조 항체의 포화 결합 후 HLA-A2/WT1에 결합할 수 있는 경우, 논의되는 항체는 참조 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 논의되는 항체가 동일 에피토프에 결합하는지 또는 입체적 이유에 의해 결합에 장애를 갖는지 여부를 확인하기 위해, 통상적인 실험(예컨대 펩티드 돌연변이, 및 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유동 세포분석 또는 당업계의 이용가능한 임의의 기타 정량적 또는 정성적 항체-결합 분석을 사용한 결합 분석들)이 사용될 수 있다. 이러한 분석은 2개의 셋업(set-up)으로, 즉 항체 둘다가 포화 항체임으로 수행되어야 한다. 셋업 둘다에서, 단지 제1 (포화) 항체가 HLA-A2/WT1에 결합할 수 있는 경우, 이는 논의되는 항 HLA-A2/WT1 항체 및 참조 항 HLA-A2-WT1 항체가 HLA-A2/WT1에 대한 결합에 대해 경쟁하는 것으로 결론지을 수 있다.
일부 양태에서, 경쟁 결합 분석에서 측정시, 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배의 과량의 항체가 또다른 것의 결합을 50% 이상, 75% 이상, 90% 이상 또는 99% 이상 억제하는 경우, 2개의 항체는 동일하거나 중첩하는 에피토프이다(예컨대 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502] 참고).
일부 양태에서, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 해제하는 항원에서의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합도 감소시키거나 해제하는 경우, 상기 2개의 항체는 "동일 에피토프"에 결합하는 것으로 본다. 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 해제하는 아미노산 돌연변이의 단지 부분집합이 다른 항체의 감소시키거나 해제하는 경우, 상기 2개의 항체는 "중첩 에피토프"를 갖는 것으로 본다.
하나의 양상에서, 본 발명은 HLA-A2/WT1에 결합하는 항체를 제시하고, 상기 항체는 항기 양태에 따라 HLA-A2/WT1의 에피토프, 특히 HLA-A2/WT1RMF의 에피토프에 결합한다. 에피토프는 특히 결정 구조 분석에 의해 측정될 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 WT1 펩티드, 특히 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 WT1 펩티드, 특히 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 4개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 WT1 펩티드, 특히 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 WT1 펩티드, 특히 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 6개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 WT1 펩티드의 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함하되, 상기 3개 이상의 아미노산 잔기는 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 아미노산 잔기 R1, M2, P4, N5, A6 및 Y8에 상응하는 아미노산 잔기로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 WT1 펩티드의 4개 이상의 아미노산 잔기를 포함하되, 상기 4개 이상의 아미노산 잔기는 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 아미노산 잔기 R1, M2, P4, N5, A6 및 Y8에 상응하는 아미노산 잔기로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 WT1 펩티드의 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함하되, 상기 5개 이상의 아미노산 잔기는 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 아미노산 잔기 R1, M2, P4, N5, A6 및 Y8에 상응하는 아미노산 잔기로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 WT1 펩티드의 6개 이상의 아미노산 잔기를 포함하되, 상기 6개 이상의 아미노산 잔기는 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 아미노산 잔기 R1, M2, P4, N5, A6 및 Y8에 상응하는 아미노산 잔기로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 아미노산 잔기 R1, N5 및 A6에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 아미노산 잔기 R1, M2, P4, N5, A6 및 Y8에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 서열번호 138에 제시된 HLA-A2 서열의 아미노산 잔기 E58, R65, K66 및 Q155에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 서열번호 138에 제시된 HLA-A2 서열의 아미노산 잔기 E58, R65, K66 및 Q155에 상응하는 아미노산 잔기, 및 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 아미노산 잔기 R1, N5 및 A6에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 서열번호 138에 제시된 HLA-A2 서열의 아미노산 잔기 E58, R65, K66, Q155 및 D61에 항응하는 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 에피토프는 서열번호 138에 제시된 HLA-A2 서열의 아미노산 잔기 E58, R65, K66, Q155 및 A69에 항응하는 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 에피토프는 서열번호 138에 제시된 HLA-A2 서열의 아미노산 잔기 E58, R65, K66, Q155 및 A150에 항응하는 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 서열번호 138에 제시된 HLA-A2 서열의 아미노산 잔기 E58, R65, K66, Q155, 및 D61, A69 및 A150 중 하나 이상에 상응하는 아미노산 잔기, 및 서열번호 78에 제시된 WT1RMF 펩티드의 아미노산 잔기 R1, M2, P4, N5, A6 및/또는 Y8에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 서열번호 138에 제시된 HLA-A2 서열의 아미노산 잔기 E58, D61, G62, R65, K66, A69, A150, Q155, A158, T163, E166, W167 및 R170에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 서열번호 138에 제시된 HLA-A2 서열의 아미노산 잔기 E58, D61, G62, R65, K66, A69, A150, Q155, A158, T163, E166, W167 및 R170에 상응하는 아미노산 잔기, 및 서열번호 78의 WT1RMF 펩티드의 아미노산 잔기 R1, M2, P4, N5, A6 및/또는 Y8에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 에피토프는 서열번호 138에 제시된 HLA-A2 서열의 아미노산 잔기 G56, D106, W107, R108, E161, G162 및/또는 R169에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
추가의 양상에서, 본 발명은 HLA-A2/WT1에 결합하는 항체를 제시하고, 상기 항체는
(i) 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL);
(ii) 서열번호 9의 HCDR 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 12의 LCDR 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 17의 HCDR 1, 서열번호 18의 HCDR 2 및 서열번호 19의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 20의 LCDR 1, 서열번호 21의 LCDR 2 및 서열번호 22의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 25의 HCDR 1, 서열번호 26의 HCDR 2 및 서열번호 27의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28의 LCDR 1, 서열번호 29의 LCDR 2 및 서열번호 30의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 33의 HCDR 1, 서열번호 34의 HCDR 2 및 서열번호 35의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 36의 LCDR 1, 서열번호 37의 LCDR 2 및 서열번호 38의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 41의 HCDR 1, 서열번호 42의 HCDR 2 및 서열번호 43의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 44의 LCDR 1, 서열번호 45의 LCDR 2 및 서열번호 46의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 49의 HCDR 1, 서열번호 50의 HCDR 2 및 서열번호 51의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 52의 LCDR 1, 서열번호 53의 LCDR 2 및 서열번호 54의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 57의 HCDR 1, 서열번호 58의 HCDR 2 및 서열번호 59의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 60의 LCDR 1, 서열번호 61의 LCDR 2 및 서열번호 62의 LCDR 3을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 65의 HCDR 1, 서열번호 66의 HCDR 2 및 서열번호 67의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 68의 LCDR 1, 서열번호 69의 LCDR 2 및 서열번호 70의 LCDR 3을 포함하는 VL
을 포함한다.
특정 양태에서, 항체는 서열번호 1의 HCDR 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 4의 LCDR 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 양태에서, 항체는 서열번호 9의 HCDR 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 12의 LCDR 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 양태에서, 항체는 서열번호 17의 HCDR 1, 서열번호 18의 HCDR 2 및 서열번호 19의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 20의 LCDR 1, 서열번호 21의 LCDR 2 및 서열번호 22의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 양태에서, 항체는 서열번호 25의 HCDR 1, 서열번호 26의 HCDR 2 및 서열번호 27의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28의 LCDR 1, 서열번호 29의 LCDR 2 및 서열번호 30의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 양태에서, 항체는 인간 항체이다. 하나의 양태에서, VH는 인간 VH 이고/거나 VL은 인간 VL이다. 하나의 양태에서, 항체는 임의의 상기 양태에서의 CDR을 포함하고, 인간 프레임워크, 예컨대 인간 면역글로불린 프레임워크를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 항체는
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 40의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 47의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 48의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL
을 포함한다.
특정 양태에서, 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 항체는 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 항체는
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(iii) 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(v) 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 40의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(vi) 서열번호 47의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 48의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(vii) 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(viii) 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL; 또는
(ix) 서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL
을 포함한다.
특정 양태에서, 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 항체는 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
특정 양태에서, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 또는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환(예컨대 보존적 치환), 삽입 또는 삭제를 갖되, 항체는 HLA-A2/WT1에 결합하는 능력을 보유하는 서열은 포함한다. 특정 양태에서, VH(서열번호 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63 또는 71)에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 삭제되고/거나 VL(서열번호 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 또는 72)에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 삭제된다. 특정 양태에서, HVR 외부(즉 FR 내)의 영역에서 치환, 삽입 또는 삭제가 발생한다. 임의적으로, 항체는 상기 제시된 VH 서열 및/또는 VL 서열, 및 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다.
하나의 양태에서, 항체는
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL
을 포함한다.
하나의 양태에서, 항체는
(i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열;
(ii) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열;
(iii) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열;
(iv) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열;
(v) 서열번호 39의 VH 서열 및 서열번호 40의 VL 서열;
(vi) 서열번호 47의 VH 서열 및 서열번호 48의 VL 서열;
(vii) 서열번호 55의 VH 서열 및 서열번호 56의 VL 서열;
(viii) 서열번호 63의 VH 서열 및 서열번호 64의 VL 서열; 또는
(ix) 서열번호 71의 VH 서열 및 서열번호 72의 VL 서열
을 포함한다.
특정 양태에서, 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 항체는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 양태에서, 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
또다른 양태에서, 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
추가의 양태에서, 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 항체는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 항체는 인간 불변부를 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 인간 불변부, 특히 인간 CH1, CH2, CH3 및/또는 CL 도메인을 포함하는 IgG 클래스 면역글로불린 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열은 서열번호 112 및 113(각각 인간 카파 및 람다 CL 도메인) 및 서열번호 114(인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3)에 제시되어 있다. 일부 양태에서, 항체는 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열, 특히 서열번호 112의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변부를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열번호 114의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변부를 포함한다. 특히, 중쇄 불변부는 본원에 기재된 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 항체는 단클론 항체이다.
하나의 양태에서, 항체는 IgG, 특히 IgG1 항체이다. 하나의 양태에서, 항체는 전장 항체이다.
하나의 양태에서, 항체는 Fc 도메인, 특히 IgG Fc 도메인, 보다 특히 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 항체의 Fc 도메인은 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인과 관련하여 본원에 기재된 단독 또는 조합된 임의의 특징들을 혼입할 수 있다.
또다른 양태에서, 항체는 Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자 및 F(ab')2 분자, 특히 Fab 분자의 군으로부터 선택되는 항체 단편이다. 또다른 양태에서, 항체 단편은 이중체(diabody), 삼중체(triabody) 또는 사중체(tetrabody)이다.
추가의 양상에서, 임의의 상기 양태에 따른 항체는 하기 부분에 기재된 단독 또는 조합된 임의의 특징들을 혼입할 수 있다.
글리코실화 변이체
일부 양태에서, 본 발명에 제공된 항체를 상기 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 감소하도록 변경시킨다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실을 편의상 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행할 수 있다.
상기 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기에 부착된 올리고사카라이드를 변경시킬 수도 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 이중촉각 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참고). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 이중촉각 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 부착된 퓨코스를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체에서 상기 올리고사카라이드의 변형을 몇몇 개선된 성질들을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 수행할 수도 있다.
하나의 양태에서, 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드, 즉 Fc 영역에 부착된(직접적으로 또는 간접적으로) 퓨코스가 없는 올리고사카라이드 구조를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 상기와 같은 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드(또한 "아퓨코실화된" 올리고사카라이드라 칭한다)는 특히 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 줄기 중 제1 GlcNAc에 부착된 퓨코스 잔기가 없는 N-결합된 올리고사카라이드이다. 하나의 양태에서, 본래 또는 모 항체에 비해 Fc 영역 중에 증가된 비율의 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 예를 들어, 상기 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드의 비율은 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%, 또는 심지어 약 100%(즉 퓨코실화된 올리고사카라이드가 존재하지 않는다)일 수 있다. 상기 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드의 백분율은 예를 들어 WO 2006/082515에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석에 의해 측정시 Asn297에 부착된 모든 올리고사카라이드(예를 들어 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조)의 합에 비해, 퓨코스 잔기가 없는 올리고사카라이드의 (평균) 양이다. Asn297은 Fc 영역 중의 약 297번 위치에 위치한 아스파라진 잔기를 지칭하지만(Fc 영역 잔기의 EU 번호부여); Asn297은 또한 항체 중의 작은 서열 변화로 인해, 297번 위치의 상류 또는 하류 약 ±3 아미노산, 즉 294 내지 300번 위치에 위치할 수 있다. 상기 Fc 영역 중에 증가된 비율의 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드를 갖는 상기와 같은 항체는 개선된 FcγRIIIa 수용체 결합 및/또는 개선된 효과기 기능, 특히 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어 US 2003/0157108; US 2004/0093621 참조.
감소된 퓨코실화를 갖는 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 퓨코실화 결함성 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; US 2003/0157108; 및 WO　2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004)]; 문헌[Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참고), 또는 GDP-퓨코스 합성 또는 수송 단백질의 활성이 감소되거나 제거된 세포(예를 들어 US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282 참고)를 포함한다.
추가의 양태에서, 양분된 올리고사카라이드, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 양분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 상술한 바와 같은 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체의 예는 예를 들어 문헌[Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)]; 문헌[Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)]; WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878에 기재되어 있다.
상기 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체를 또한 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 개시되어 있다.
시스테인 조작된 항체 변이체
일부 양태에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "thioMAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 상기 항체의 접근가능한 부위에 위치하며, 이를 사용하여 본원에 추가로 기재된 바와 같이 상기 항체를 다른 부분, 예를 들어 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 시스테인 조작된 항체를 예를 들어 US 7,521,541, US 8,30,930, US 7,855,275, US 9.000,130 또는 WO 2016/040856에 기재된 바와 같이 생성할 수 있다.
항체 유도체
일부 양태에서, 본원에 제공된 항체를, 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가적인 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 부분은 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수 중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 상기 항체에 부착된 중합체들의 수는 변할 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 부착되는 경우, 이들 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 상기 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형을 비제한적으로, 개선시키고자 하는 상기 항체의 특정한 성질 또는 기능, 상기 이중특이성 항체 유도체를 한정된 조건하에서 치료법에 사용할 것인지의 여부 등을 포함한 고려사항을 기준으로 결정할 수 있다.
또다른 양태에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 부분의 접합체를 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 비제한적으로 통상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 부분을, 상기 항체-비단백질성 부분에 근접한 세포를 죽이는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.
면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 치료제, 예를 들어 세포독성제, 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된(화학적으로 결합된) 본원에 기재된 바와 같은 항 HLA-A2/WT1 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
하나의 양태에서, 면역접합체는 항체가 상기 언급한 치료제 중 하나 이상에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다. 상기 항체를 전형적으로는 링커를 사용하여 상기 치료제 중 하나 이상에 연결시킨다. 치료제 및 약물 및 링커의 예를 포함한 ADC 기술의 개요는 문헌[Pharmacol Review 68:3-19 (2016)]에 제시되어 있다.
또다른 양태에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편, 예를 들어 비제한적으로 디프테리아-A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류라이테스 포르디이 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센에 접합된 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다.
또다른 양태에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들을 방사성접합체의 생성에 이용할 수 있다. 예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 상기 방사성접합체가 검출에 사용되는 경우 상기 접합체는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(또한 자기공명 영상화, mri로서 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체를 다양한 이중기능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이중작용성 유도체(예를 들어 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예를 들어 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098(1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(MX-DTPA)은 상기 항체에의 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026 참조. 상기 링커는 세포 중의 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari et al., Cancer Res. 52:127-131(1992)]; US 5,208,020)를 사용할 수 있다.
상기 면역접합체 또는 ADC는 가교결합제 시약, 예를 들어 비제한적으로 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-4-(비닐설폰)벤조에이트)(이들은 예를 들어 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 록빌 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다)로 제조된 상기와 같은 접합체가 본 발명에서 명백히 고려된다.
다중특이성 항체
일부 양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위, 즉 상이한 항원상의 상이한 에피토프 또는 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 일부 양태에서, 상기 다중특이성 항체는 3 또는 그 이상의 결합 특이성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 결합 특이성 중 하나는 HLA-A2/WT1에 대한 것이며 다른(2개 이상) 특이성은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 일부 양태에서, 이중특이성 항체는 HLA-A2/WT1의 2개(또는 그 이상)의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다중특이성(예를 들어 이중특이성) 항체를 또한, 세포독성제 또는 세포를 HLA-A2/WT1을 발현하는 세포로 국소화하는데 사용할 수 있다. 다중특이성 항체를 완전 길이 항체 또는 항체 단편으로부터 제조할 수 있다.
다중특이성 항체의 제조 기법은 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))] 참고), 및 "놉-홀" 공학(예를 들어 US 5,731,168 및 문헌[Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)] 참고)을 포함한다. 다중특이성 항체를 또한 항체 Fc-이종이량체성 분자의 제조를 위한 공학 정전기 스티어링 효과(예를 들어 WO 2009/089004 참고); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교-결합(예를 들어 US 4,676,980, 및 문헌[Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참고); 이중특이성 항체를 생성하기 위한 류신 지퍼의 사용(예를 들어 문헌[Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 및 WO 2011/034605 참고); 경쇄 잘못 짝짓기 문제를 우회하기 위한 공통적인 경쇄 기술의 사용(예를 들어 WO 98/50431 참고); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 "다이아바디" 기술의 사용(예를 들어 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참고); 및 단쇄 Fv(sFv) 이량체의 사용(예를 들어 문헌[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참고); 및 예를 들어 문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 3중특이성 항체의 제조에 의해 제조할 수 있다.
"옥토퍼스 항체" 또는 DVD-Ig를 포함하여, 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다(예를 들어 WO 2001/77342 및 WO 2008/024715 참고). 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이성 항체의 다른 예를 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO2010/145792, 및 WO 2013/026831에서 찾을 수 있다. 상기 이중특이성 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 HLA-A2/WT1뿐만 아니라 또다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위, 또는 HLA-A2/WT1의 2개의 상이한 에피토프를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어 US 2008/0069820 및 WO 2015/095539 참고).
다중-특이성 항체를 또한 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결합 가지 중에 도메인 크로스오버를 갖는 비대칭 형태로, 즉 VH/VL 도메인(예를 들어 WO 2009/080252 및 WO 2015/150447 참고), CH1/CL 도메인(예를 들어 WO 2009/080253 참고) 또는 완전한 Fab 가지(예를 들어 WO 2009/080251, WO 2016/016299, 또한 문헌[Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191], 및 문헌[Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20] 참고)를 교환함으로써 제공할 수 있다. 비대칭 Fab 가지를 또한, 하전된 또는 하전되지 않은 아미노산 돌연변이를 도메인 계면에 도입시켜 Fab 짝짓기를 유도함으로써 조작할 수 있다. 예를 들어 WO 2016/172485 참조.
다중특이성 항체에 대한 다양한 추가의 분자 포맷이 당해 분야에 공지되어 있으며 본원에 포함된다(예를 들어 문헌[Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106] 참고).
또한 본원에 포함된, 특정 유형의 다중특이성 항체는 T 세포를 재표적화하여 표적 세포를 사멸시키기 위해, 표적 세포, 예를 들어 종양 세포상의 표면 항원에, 및 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화, 불변 성분, 예를 들어 CD3에 동시에 결합하도록 설계된 이중특이성 항체이다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 특히 이중특이성 항체이며, 여기에서 상기 결합 특이성 중 하나는 HLA-A2/WT1에 대한 것이고, 다른 하나는 CD3에 대한 것이다.
상기 목적에 유용할 수 있는 이중특이성 항체 포맷의 예는 비제한적으로 소위 "BiTE"(이중특이성 T 세포 관여자) 분자(여기에서 2개의 scFv 분자가 가요성 링커에 의해 융합된다)(예를 들어 WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261, 및 WO2008/119567, 문헌[Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)] 참고); 다이아바디(문헌[Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)]) 및 그의 유도체, 예를 들어 탠덤 다이아바디("TandAb"; 문헌[Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)]); 다이아바디 포맷을 기본으로 하지만 추가적인 안정화를 위한 C-말단 다이설파이드 가교를 특징으로 하는 "DART"(이중 친화도 재표적화) 분자(문헌[Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)]), 및 소위 트라이오맵(완전 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자이다(문헌[Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)]에 리뷰되어 있다))를 포함한다. 본원에 포함된 특정한 T 세포 이중특이성 항체 포맷은 WO 2013/026833, WO2013/026839, WO 2016/020309; 문헌[Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498]에 기재되어 있다.
HLA-A2/WT1 및 제2 항원에 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자
본 발명은 또한 이중특이성 항원 결합 분자, 즉 2개의 별개의 항원 결정인자(제1 및 제2 항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 2개의 항원 결합 잔기를 포함하는 항원 결합 분자를 제공한다.
개발된 HLA-A2/WT1 항체를 기반으로, 본 발명자들은 HLA-A2/WT1 및 추가의 항원, 특히 활성화 T 세포 항원, 예컨대 CD3에 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자를 개발하였다.
하기 실시예에 제시된 바와 같이, 이중특이성 항원 결합 분자는 다수의 현저한 특성, 예컨대 우수한 효능 및 낮은 독성을 갖는다.
따라서, 특정 양상에서, 본 발명은 (a) 제1 항원(HLA-A2/WT1)에 결합하는 제1 항원 결합 잔기, 및 (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 잔기를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제시하고, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 임의의 하기 특징을 갖는다.
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A2/WT1(즉 HLA-A2 분자와 TW1-유래 펩티드의 복합체)을 발현하는 세포의 T 세포 매개된 사살을 특이적으로 유도한다. 일부 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A2/WT1RMF(HLA-A2 분자와 TW1RMF 펩티드의 복합체)를 발현하는 세포의 T 세포 매개된 사살을 특이적으로 유도한다. 보다 특정 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A201/WT1RMF(HLA-A201 분자와 TW1RMF 펩티드의 복합체)를 발현하는 세포의 T 세포 매개된 사살을 특이적으로 유도한다.
하나의 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자에 의한 T 세포 매개된 사살의 유도는 HLA-A2/펩티드(예컨대 WT1RMF 또는 WT1VLD 펩티드)-발현 세포, 특히 펩티드-부가된 T2 세포를 사용하고 T 세포의 존재하에 이중특이성 항원 결합 분자에 의한 항온배양 후 상기 세포로부터 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출을 측정함으로써 측정된다.
특정 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자에 의한 T 세포 매개 사살은 하기와 같이 측정된다:
10% FBS(기브코, Cat No. 16140-071) + 1% 페니실린-스트렙토마이신(기브코, Cat No. 15070-063)으로 보충된 IMDM 배지(라이크 테크놀로지스에 의한 기브코, Cat No. 31980-048)(완전 배지) 중 106 세포/mL의 세포 완충액으로서 T2 세포(ATCC, Cat. No. CRL-1992)를 제조한다. 세포를 튜브에 10 mL의 총 부피로 유지하고, 10-2 M(펩티드의 최종 농도: 10-5 M)의 10 μL의 펩티드(예컨대 WT1 VLD 펩티드(서열번호 77), 또는 RMF 펩티드(서열번호 78))에 의해 37℃에서 5% CO2로 2시간 동안 항온배양한다. pan CD3+ 세포를 피콜(Ficoll)(GE 헬스케어(GE Healthcare), Cat. No. 17-1440-03) 구배 원심분리에 의해 연막(buffy coat)으로부터 단리된 PBMC로부터 정제한다. 인간 pan T 세포 단리 키트(밀테나이 바이오텍(Miltenyi Biotec), Cat. No. 130-096-535)를 사용하여, 전체 CD3+ T 세포를 MACS(밀테나이 바이오텍)에 의해 정제한다. 세포 독성 분석을 하기와 같이 수행한다: 펩티드-부가된 세포(100 μL)를 96 웰 마이크로역가 둥근바닥 플레이트(3 x 105 세포/mL)에 파종하고, 37℃, 5% CO2로 18시간 동안 완전 배지에서, 50 μL의 T 세포(6 x 106 세포/mL) 및 50 μL의 적정된 이중특이성 항원 결합 분자(예컨대 40 μg/mL 내지 0.00004 μg/mL)와 함께 동반-배양한다. 이어서, 50 μL의 상청액을 새로운 백색 플레이트로 옮기고, 25 μL/웰로 사이토톡스-글로 루시퍼라제 에세이(CytoTox-Glo Luciferase Assay)(프로메가(Promega), Cat. No. G9291)를 첨가하여 실온(RT)에서 15분 동안 항온배양한다. 형광 신호(세포 사멸의 지표로서 LDH 방출의 측정을 위함)를 엔비전(EnVision)(퍼킨엘머(PerkinElmer))에 의해 판독한다. 데이터를 상대적 발광 단위(RLU)로서 제시한다.
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A2/WT1(즉 HLA-A2 분자와 WT1-유래 펩티드의 복합체)을 발현하는 세포의 존재하에 T 세포를 특이적으로 활성화시킨다. 일부 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A2/WT1RMF(즉 HLA-A2 분자와 WT1RMF 펩티드의 복합체)를 발현하는 세포의 존재하에 T 세포를 특이적으로 활성화시킨다. 보다 특정 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A201/WT1RMF(즉 HLA-A201 분자와 WT1RMF 펩티드의 복합체)를 발현하는 세포의 존재하에 T 세포를 특이적으로 활성화시킨다.
하나의 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자에 의한 T 세포의 활성화는 HLA-A2/펩티드(예컨대 WT1RMF 또는 WT1VLD 펩티드)-발현 세포, 특히 펩티드-부가된 T2 세포의 존재하에 이중특이성 항원 결합 분자에 의한 항온배양 후 T 세포에 의한 CD25 및/또는 CD69의 발현을 측정함으로써, 특히 유동 세포분석함으로써 측정된다.
특정 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자에 의한 T 세포의 활성화는 하기와 같이 측정된다:
10% FBS(기브코, Cat No. 16140-071) + 1% 페니실린-스트렙토마이신(기브코, Cat No. 15070-063)으로 보충된 IMDM 배지(라이크 테크놀로지스에 의한 기브코, Cat No. 31980-048)(완전 배지) 중 106 세포/mL의 세포 완충액으로서 T2 세포(ATCC, Cat. No. CRL-1992)를 제조한다. 세포를 튜브에 10 mL의 총 부피로 유지하고, 10-2 M(펩티드의 최종 농도: 10-5 M)의 10 μL의 펩티드(예컨대 WT1 VLD 펩티드(서열번호 77), 또는 RMF 펩티드(서열번호 78))에 의해 37℃에서 5% CO2로 2시간 동안 항온배양한다. pan CD3+ 세포를 피콜(GE 헬스케어, Cat. No. 17-1440-03) 구배 원심분리에 의해 연막으로부터 단리된 PBMC로부터 정제한다. 인간 pan T 세포 단리 키트(밀테나이 바이오텍, Cat. No. 130-096-535)를 사용하여, 전체 CD3+ T 세포를 MACS(밀테나이 바이오텍)에 의해 정제한다. 세포 독성 분석을 하기와 같이 수행한다: 펩티드-부가된 세포(100 μL)를 96 웰 마이크로역가 둥근바닥 플레이트(3 x 105 세포/mL)에 파종하고, 37℃, 5% CO2로 18시간 동안 완전 배지에서, 50 μL의 T 세포(6 x 106 세포/mL) 및 50 μL의 적정된 이중특이성 항원 결합 분자(예컨대 40 μg/mL 내지 0.00004 μg/mL)와 함께 동반-배양한다. 동반-항온배양 18시간 후, 세포를 수확하고 CD3에 대항하는 항체(바이오레전드(Biolegend), Cat. No. 300321), CD25에 대항하는 항체(바이오레전드, Cat. No. 302606) 및 CD69에 대항하는 항체(바이오레전드, Cat. No. 310914)로 염색하여 유동 세포분석에 의해 T 세포 활성화를 측정한다.
또다른 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자에 의한 T 세포의 활성화는 HLA-A2/펩티드(예컨대 WT1RMF 또는 WT1VLD 펩티드)-발현 세포, 특히 펩티드-부가된 T2 세포, 및 T 세포주, 특히 NFAT(활성화된 T 세포의 핵 인자) 응답 요소에 의해 구동된 루시퍼라제 리포터를 발현하는 Jurkat T 세포주를 사용하여 측정된다.
특정 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자에 의한 T 세포의 활성화는 하기와 같이 측정된다:
10% FBS(기브코, Cat No. 16140-071) + 1% 페니실린-스트렙토마이신(기브코, Cat No. 15070-063)으로 보충된 IMDM 배지(라이크 테크놀로지스에 의한 기브코, Cat No. 31980-048)(완전 배지) 중 106 세포/mL의 세포 완충액으로서 T2 세포(ATCC, Cat. No. CRL-1992)를 제조한다. 세포를 튜브에 10 mL의 총 부피로 유지하고, 10-2 M(펩티드의 최종 농도: 10-5 M)의 10 μL의 펩티드(예컨대 WT1 VLD 펩티드(서열번호 77), 또는 RMF 펩티드(서열번호 78))에 의해 37℃에서 5% CO2로 2시간 동안 항온배양한다. 세척 후, 2.2 x 105의 세포 현탁액 중 90 μL의 펩티드-부가된 세포를 96 웰 마이크로역가 둥근바닥 플레이트(20000 세포/웰, TPP, Cat. No. 92097)에 파종하고 NFAT의 촉진제하에 루시퍼라제를 발현하는 50 μL의 Jurkat 세포(Jurkat-NFAT, 프로메가, Cat. No. CS176501)(2 x 106 세포/mL의 세포 현탁액) 및 10 μL의 적정된 이중특이성 항원 결합 분자(예컨대 PBS 중 100 μg/mL 내지 0.0064 μg/mL)와 함께 37℃, 5% CO2로 16시간 동안 동반-배양한다. 이어서, 50 μL의 상청액을 제거하고 100 μL/웰의 브라이트-글로 루시퍼라제 에세이(Bright-Glo Luciferase Assay)(프로메가, Cat. No. E2620)로 대체하여 실온(RT)에서 항온배양한다. 5분 후, 180 μL의 상청액을 새로운 백색 플레이트로 옮겨 엔비전(퍼킨엘머)에 의해 발광 신호를 측정한다. 데이터는 상대적 발광 단위(RLU)로서 제시된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A2 단독(즉 펩티드를 갖지 않음) 또는 WT1-유래 펩티드, 예컨대 WT1RMF 또는 WT1VLD 이외의 펩티드를 갖는 HLA-A2를 발현하는 세포의 존재하에 유의하게 T 세포 매개 사살을 유도하거나 T 세포를 활성화시키지 않는다.
하나의 양태에서, 이중특이성 항원 결합은 WT1-유래 펩티드, 특히 WT1RMF 또는 WT1VLD의 부재하에 HLA-A2를 발현하는 세포의 존재하에 유의하게 T 세포 매개 사살을 유도하거나 T 세포를 활성화시키지 않는다. 하나의 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 WT1-유래 펩티드(구체적으로는 WT1RMF 또는 WT1VLD)의 부재하에 HLA-A2를 발현하는 세포의 존재하에 T 세포 매개 사살의 유도 또는 T 세포의 활성화에 대한 EC50보다 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 50배 이상, 75배 이상 또는 100배 이상 낮은 EC50을 갖는 HLA-A2/WT1(구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD)을 발현하는 세포의 존재하에 T 세포 매개 사살을 유도하고/거나 T 세포 활성화를 유도한다.
하나의 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A2/WT1(구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD)을 발현하는 세포의 존재하에 T 세포 매개 사살을 유도하고/거나 T 세포를 활성화시키지만, 하기 표 5의 펩티드로부터 선택되는 펩티드(서열번호 79 내지 105의 펩티드)를 갖는 HLA-A2를 발현하는 세포의 존재하에 유의하게 T 세포 사살을 유도하거나 T 세포를 활성화시키지 않는다. 하나의 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A2/WT1(구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD)을 발현하는 세포의 존재하에 T 세포 매개 사살을 유도하고/거나 T 세포를 활성화시키지만, 하기 표 5의 임의의 펩티드(서열번호 79 내지 105의 펩티드)를 갖는 HLA-A2를 발현하는 세포의 존재하에 유의하게 T 세포 사살을 유도하거나 T 세포를 활성화시키지 않는다.
하나의 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 하기 표 5의 펩티드로부터 선택되는 펩티드(서열번호 79 내지 105)를 갖는 HLA-A2를 발현하는 세포의 존재하에 T 세포 매개 사살의 유도 및/또는 T 세포의 활성화에 대한 EC50보다 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 50배 이상, 75배 이상 또는 100배 이상 낮은 EC50을 갖는 HLA-A2/WT1(구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD)을 발현하는 세포의 존재하에 T 세포 매개 사살을 유도하고/거나 T 세포를 활성화시킨다. 하나의 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 하기 표 5의 임의의 펩티드(서열번호 79 내지 105)를 갖는 HLA-A2를 발현하는 세포의 존재하에 T 세포 매개 사살의 유도 및/또는 T 세포의 활성화에 대한 EC50보다 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 50배 이상, 75배 이상 또는 100배 이상 낮은 EC50을 갖는 HLA-A2/WT1(구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD)을 발현하는 세포의 존재하에 T 세포 매개 사살을 유도하고/거나 T 세포를 활성화시킨다.
하나의 양태에서, T 세포 매개 사살의 유도 및/또는 T 세포의 활성화는 전술된 바와 같이 측정되고, EC50은 XL핏(등록상표) 애드-온(영국 길드포드 소재의 ID 비지니스 솔루션스)을 사용하여 마이크로소프트(등록상표) 엑셀에서 계산된다.
본 발명의 특정 양태에 따라, 상기 이중특이성 항원 결합 분자에 포함된 항원 결합 잔기는 Fab 분자(즉, 각각 가변 및 불변 도메인을 포함하는 중쇄 및 경쇄로 구성된 항원 결합 도메인)이다. 하나의 양태에서, 상기 제1 및/또는 제2 항원 결합 잔기는 Fab 분자이다. 하나의 양태에서, 상기 Fab 분자는 인간이다. 특정 양태에서, 상기 Fab 분자는 인간화된다. 더욱 또다른 양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
바람직하게, 상기 항원 결합 잔기 중 적어도 하나는 크로스오버 Fab 분자이다. 상기와 같은 변형은 상이한 Fab 분자로부터 중쇄 및 경쇄의 잘못 짝짓기를 감소시켜, 재조합체 생성에서 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선시킨다. 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자에 유용한 특정한 크로스오버 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인(각각 VL 및 VH)이 교환된다. 그러나 이러한 도메인 교환의 경우에조차, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 제조는 잘못짝지은 중쇄와 경쇄간의 소위 벤스 존스-유형 상호작용으로 인해 몇몇 부산물을 포함할 수 있다(문헌[Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191] 참고). 상이한 Fab 분자로부터 중쇄 및 경쇄의 잘못짝짓기를 추가로 감소시키고 따라서 목적하는 이중특이성 항원 결합 분자의 순도 및 수율을 증가시키기 위해서, 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산을 본원에 추가로 기재된 바와 같은, 제1 항원(HLA-A2/WT1)에 결합하는 Fab 분자 또는 제2 항원(예를 들어 활성화 T 세포 항원, 예를 들어 CD3)에 결합하는 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인 중의 특정한 아미노산 위치에 도입시킬 수 있다. 전하 변형은 이중 특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 통상적인 Fab 분자(예를 들어 도 1의 A 내지 C, 및 G 내지 J에 도시됨)에서, 또는 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 VH/VL 크로스오버 Fab 분자(예를 들어 도 1의 D 내지 F, 및 K 내지 N에 도시됨)에서 이루어 질 수 있다(그러나 둘다는 아님). 특정 양태에서, 상기 전하 변형은 이중특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 통상적인 Fab 분자(상기는 특정 양태에서 제1 항원, 즉 HLA-A2/WT1에 결합함)에서 이루어진다.
본 발명에 따른 특정 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 항원(즉 HLA-A2/WT1) 및 제2 항원(예를 들어 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3)에 동시에 결합할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 동시에 결합하는 HLA-A2/WT1 및 활성화 T 세포 항원에 의해 T 세포 및 표적 세포와 가교결합할 수 있다. 훨씬 더 특정 양태에서, 상기와 같은 동시적인 결합은 표적 세포, 특히 HLA-A2/WT1 발현 종양 세포의 용해를 생성한다. 하나의 양태에서, 상기와 같은 동시적인 결합은 T 세포의 활성화를 생성한다. 다른 양태에서, 상기와 같은 동시적인 결합은 증식, 분화, 사이토킨 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현의 군으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 생성한다. 하나의 양태에서, HLA-A2/WT1에의 동시적인 결합 없이, 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3에의 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 결합은 T 세포 활성화를 생성하지 않는다.
하나의 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포로 다시 향하게 할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 다시-향하는 것은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제공 및/또는 T 세포의 특이성과 관련이 없다. 특히, 본 발명의 양태 중 어느 하나에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 양태에서 상기 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
제1 항원 결합 잔기
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A2/WT1(제1 항원)에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 잔기, 특히 Fab 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A2/WT1에 결합하는 2개의 항원 결합 잔기, 특히 Fab 분자를 포함한다. 특정한 상기와 같은 양태에서, 각각의 이들 항원 결합 잔기는 동일한 항원 결정인자에 결합한다. 훨씬 더 특정 양태에서, 상기 항원 결합 잔기는 모두 동일하다. 즉, 이들은 본원에 기재된 바와 같은 CH1 및 CL 도메인 중에 동일한 아미노산 치환(존재하는 경우)을 포함하여 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 HLA-A2/WT1에 결합하는 2개 이하의 항원 결합 잔기, 특히 Fab 분자를 포함한다.
특정 양태에서, 상기 HLA-A2/WT1에 결합하는 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다. 상기와 같은 양태에서, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 잔기는 본원에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다.
또다른 양태에서, 상기 HLA-A2/WT1에 결합하는 항원 결합 잔기는 본원에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다. 상기와 같은 양태에서, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다.
상기 HLA-A2/WT1 결합 잔기는 상기 이중특이성 항원 결합 분자를 표적 부위로, 예를 들어 HLA-A2/WT1을 발현하는 특정 유형의 종양 세포로 향하게 할 수 있다.
상기 이중특이성 항원 결합 분자의 제1 항원 결합 잔기는 과학적으로 분명히 불합리하지 않거나 불가능하지 않은 한, HLA-A2/WT1에 결합하는 항체와 관련하여 본원에 기재된 특징 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은
(a) HLA-A2/WT1인 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기로서,
(i) 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL);
(ii) 서열번호 9의 HCDR 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 12의 LCDR 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 17의 HCDR 1, 서열번호 18의 HCDR 2 및 서열번호 19의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 20의 LCDR 1, 서열번호 21의 LCDR 2 및 서열번호 22의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 25의 HCDR 1, 서열번호 26의 HCDR 2 및 서열번호 27의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28의 LCDR 1, 서열번호 29의 LCDR 2 및 서열번호 30의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 33의 HCDR 1, 서열번호 34의 HCDR 2 및 서열번호 35의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 36의 LCDR 1, 서열번호 37의 LCDR 2 및 서열번호 38의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 41의 HCDR 1, 서열번호 42의 HCDR 2 및 서열번호 43의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 44의 LCDR 1, 서열번호 45의 LCDR 2 및 서열번호 46의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 49의 HCDR 1, 서열번호 50의 HCDR 2 및 서열번호 51의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 52의 LCDR 1, 서열번호 53의 LCDR 2 및 서열번호 54의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 57의 HCDR 1, 서열번호 58의 HCDR 2 및 서열번호 59의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 60의 LCDR 1, 서열번호 61의 LCDR 2 및 서열번호 62의 LCDR 3을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 65의 HCDR 1, 서열번호 66의 HCDR 2 및 서열번호 67의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 68의 LCDR 1, 서열번호 69의 LCDR 2 및 서열번호 70의 LCDR 3을 포함하는 VL
을 포함하는 항원 결합 잔기, 및
(b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기
를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제시한다.
특정 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 1의 HCDR 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 4의 LCDR 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 9의 HCDR 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 12의 LCDR 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 17의 HCDR 1, 서열번호 18의 HCDR 2 및 서열번호 19의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 20의 LCDR 1, 서열번호 21의 LCDR 2 및 서열번호 22의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 25의 HCDR 1, 서열번호 26의 HCDR 2 및 서열번호 27의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28의 LCDR 1, 서열번호 29의 LCDR 2 및 서열번호 30의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 인간 항체이다(인간 항체로부터 유래됨). 하나의 양태에서, VH는 인간 VH이고/거나 VL은 인간 VL이다. 하나의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 임의의 상기 양태에서와 같이 CHR을 포함하고, 인간 프레임워크, 예컨대 인간 면역글로불린 프레임워크를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 40의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 47의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 48의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL
을 포함한다.
특정 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(iii) 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(v) 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 40의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(vi) 서열번호 47의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 48의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(vii) 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(viii) 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL; 또는
(ix) 서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL
을 포함한다.
특정 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL
을 포함한다.
하나의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는
(i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열;
(ii) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열;
(iii) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열;
(iv) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열;
(v) 서열번호 39의 VH 서열 및 서열번호 40의 VL 서열;
(vi) 서열번호 47의 VH 서열 및 서열번호 48의 VL 서열;
(vii) 서열번호 55의 VH 서열 및 서열번호 56의 VL 서열;
(viii) 서열번호 63의 VH 서열 및 서열번호 64의 VL 서열; 또는
(ix) 서열번호 71의 VH 서열 및 서열번호 72의 VL 서열
을 포함한다.
특정 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
또다른 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
추가의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기는 인간 불변부를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기는 인간 불변부, 특히 인간 CH1 및/또는 CL 도메인을 포함하는 Fab 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열을 서열번호 112 및 113(각각 인간 카파 및 람다 CL 도메인) 및 서열번호 114(인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3)에 제공한다. 일부 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열, 특히 서열번호 112의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변부를 포함한다. 특히, 상기 경쇄 불변부는 "전하 변형" 하에 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함하고/하거나 크로스오버 Fab 분자 중에 있는 경우 하나 이상(특히 2개)의 N-말단 아미노산의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 114의 아미노산 서열 중에 포함된 CH1 도메인 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변부를 포함한다. 특히, 상기 중쇄 불변부(구체적으로 CH1 도메인)는 "전하 변형" 하에 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
제2 항원 결합 잔기
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 항원(HLA-A2/WT1과 상이한)에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 잔기, 특히 Fab 분자를 포함한다.
특정 양태에서, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 잔기는 본원에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다. 상기와 같은 양태에서, 상기 제1 항원(즉 HLA-A2/WT1)에 결합하는 항원 결합 잔기는 바람직하게는 통상적인 Fab 분자이다. 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 HLA-A2/WT1에 결합하는 하나 초과의 항원 결합 잔기, 특히 Fab 분자가 존재하는 양태에서, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 잔기는 바람직하게는 크로스오버 Fab 분자이며 상기 HLA-A2/WT1에 결합하는 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다.
또다른 양태에서, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다. 상기와 같은 양태에서, 상기 제1 항원(즉 HLA-A2/WT1)에 결합하는 항원 결합 잔기는 본원에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다. 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 제2 항원에 결합하는 하나 초과의 항원 결합 잔기, 특히 Fab 분자가 존재하는 양태에서, 상기 HLA-A2/WT1에 결합하는 항원 결합 잔기는 바람직하게는 크로스오버 Fab 분자이며 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다.
일부 양태에서, 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원(또한 본원에서 "활성화 T 세포 항원 결합 잔기, 또는 활성화 T 세포 항원 결합 Fab 분자"라 칭한다)이다. 특정 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 항원 결합 잔기를 포함한다. 하나의 양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 상기 활성화 T 세포 항원에 대해 1가 결합을 제공한다.
특정 양태에서, 상기 제2 항원은 CD3, 특히 인간 CD3(서열번호 107) 또는 사이노몰구스 CD3(서열번호 108), 가장 특히 인간 CD3이다. 하나의 양태에서 상기 제2 항원 결합 잔기는 인간 및 사이노몰구스 CD3에 대해 교차-반응성이다(즉 특이적으로 결합한다). 일부 양태에서, 상기 제2 항원은 CD3의 입실론 서브유닛(CD3 입실론)이다.
하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 115의 HCDR 1, 서열번호 116의 HCDR 2, 서열번호 117의 HCDR 3, 서열번호 118의 LCDR 1, 서열번호 119의 LCDR 2 및 서열번호 120의 LCDR 3을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 115의 HCDR 1, 서열번호 116의 HCDR 2 및 서열번호 117의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 118의 LCDR 1, 서열번호 119의 LCDR 2 및 서열번호 120의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 인간화된 항체(로부터 유래된)이다. 하나의 양태에서, 상기 VH는 인간화된 VH이고/이거나 상기 VL은 인간화된 VL이다. 하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 상기 양태 중 어느 하나에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 121의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 122의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 121의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 및 서열번호 122의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기의 VH는 서열번호 121의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 잔기의 VL은 서열번호 122의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열, 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 130의 HCDR 1, 서열번호 131의 HCDR 2, 서열번호 132의 HCDR 3, 서열번호 133의 LCDR 1, 서열번호 134의 LCDR 2 및 서열번호 135의 LCDR 3을 포함한다.
또다른 특정 양태에서, 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 130의 HCDR 1, 서열번호 131의 HCDR 2 및 서열번호 132의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 133의 LCDR 1, 서열번호 134의 LCDR 2 및 서열번호 135의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 항원 결합 잔기는 인간화된 항체이다(인간화된 항체로부터 유도됨). 하나의 양태에서, VH는 인간화된 VH이고/거나 VL은 인간화된 VL이다. 하나의 양태에서, 제2 항원 결합 잔기는 임의의 상기 양태와 같이 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예컨대 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 136의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 137의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 136의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 및 서열번호 137의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다.
또다른 특정 양태에서, 제2 항원 결합 잔기의 VH는 서열번호 136의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 잔기의 VL은 서열번호 137의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 하나의 양태에서, 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 136의 VH 서열 및 서열번호 137의 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 인간 불변부를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 인간 불변부, 특히 인간 CH1 및/또는 CL 도메인을 포함하는 Fab 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열을 서열번호 112 및 113(각각 인간 카파 및 람다 CL 도메인) 및 서열번호 114(인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3)에 제공한다. 일부 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열, 특히 서열번호 112의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변부를 포함한다. 특히, 상기 경쇄 불변부는 "전하 변형" 하에 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함하고/하거나 크로스오버 Fab 분자 중에 있는 경우 하나 이상(특히 2개)의 N-말단 아미노산의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 서열번호 114의 아미노산 서열 중에 포함된 CH1 도메인 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변부를 포함한다. 특히, 상기 중쇄 불변부(구체적으로 CH1 도메인)는 "전하 변형" 하에 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1, 특히 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체된 Fab 분자이다(즉 상기와 같은 양태에 따라, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환된 크로스오버 Fab 분자이다). 하나의 상기와 같은 양태에서, 제1(및 제3, 존재하는 경우) 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다.
하나의 양태에서, 제2 항원(예를 들어 활성화 T 세포 항원, 예를 들어 CD3)에 결합하는 하나 이하의 항원 결합 잔기가 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중에 존재한다(즉 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 항원에 대해 1가 결합을 제공한다).
전하 변형
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 비-합치 중쇄(벤스-존스-유형 부산물)와 경쇄의 잘못짝짓기[이는 이들의 결합 가지 중 하나(이상, 2개 초과의 항원-결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우에)에서 VH/VL 교환과 함께 Fab-기재 이중-/다중특이성 항원 결합 분자의 생성에서 발생할 수 있다]를 감소시키기에 특히 효율적인, 상기 분자 중에 포함된 Fab 분자의 아미노산 치환을 포함할 수 있다(또한 내용 전체가 본원에 참고로 인용된 PCT 공보 WO 2015/150447, 특히 상기 중의 실시예 참고). 바람직하지 못한 부산물, 특히 결합 가지 중 하나에서 VH/VL 도메인 교환과 함께 이중특이성 항원 결합 분자에서 발생하는 벤스 존스-유형 부산물에 대한 목적하는 이중특이성 항원 결합 분자의 비를, CH1 및 CL 도메인 중의 특정한 아미노산 위치에 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산을 도입시킴으로써 개선시킬 수 있다(때때로 본원에서 "전하 변형"이라 칭한다).
따라서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 제1 및 제2 항원 결합 잔기가 둘 다 Fab 분자인 일부 양태에서, 및 상기 항원 결합 잔기 중 하나(특히 제2 항원 결합 잔기)에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되며,
i) 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환되거나(카밧 EU 색인에 따른 번호부여);
ii) 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
상기 이중특이성 항원 결합 분자는 i) 및 ii)하에서 언급된 변형을 모두 포함하지는 않는다. 상기 VH/VL 교환을 갖는 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로에 의해 대체되지 않는다(즉 교환되지 않고 남아있는다).
보다 특정 양태에서,
i) 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환되거나(카밧 EU 색인에 따른 번호부여);
ii) 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
하나의 상기와 같은 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
추가의 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
특정 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되며(카밧에 따른 번호부여), 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
보다 특정 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되며(카밧에 따른 번호부여), 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
훨씬 더 특정 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 아르기닌(R)에 의해 치환되며(카밧에 따른 번호부여), 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
특정 양태에서, 상기 양태에 따른 아미노산 치환이 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 중에서 이루어진 경우, 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL은 카파 아이소타입의 것이다.
다르게는, 상기 양태에 따른 아미노산 치환은 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 대신에 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 이루어질 수 있다. 특정한 상기와 같은 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL은 카파 아이소타입의 것이다.
따라서, 하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
추가의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
더욱 또다른 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되며(카밧에 따른 번호부여), 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
하나의 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되며(카밧에 따른 번호부여), 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
또다른 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 아르기닌(R)에 의해 치환되며(카밧에 따른 번호부여), 상기 제2 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
특정 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는
(a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다], 및 (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다)를 포함하며, 여기에서
상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(특정 양태에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로), 123번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(특정 양태에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로), 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
또다른 특정 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는
(a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 구체적으로는 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 9의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 10의 HCDR 2, 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 12의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다], 및 (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다)를 포함하며, 여기에서
상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(특정 양태에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로), 123번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(특정 양태에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로), 상기 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
이중특이성 항원 결합 분자 포맷
본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 성분을 다양한 배열로 서로 융합시킬 수 있다. 예시적인 배열은 도 1에 도시되어 있다.
특정 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 항원 결합 잔기는 Fab 분자이다. 상기와 같은 양태에서, 제1, 제2, 제3 등의 항원 결합 잔기를 본원에서 각각 제1, 제2, 제3 등의 Fab 분자라 칭할 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 제1 및 제2 항원 결합 잔기를 임의적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합시킨다. 특정 양태에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 분자이다. 하나의 상기와 같은 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 또다른 상기와 같은 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. (i) 상기 제2 항원 결합 잔기가 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되거나, (ii) 상기 제1 항원 결합 잔기가 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된 양태에서, 추가로 상기 제1 항원 결합 잔기의 Fab 경쇄 및 상기 제2 항원 결합 잔기의 Fab 경쇄를 임의적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합시킬 수 있다.
표적 세포 항원, 예를 들어 HLA-A2/WT1에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항원 결합 잔기(예를 들어 Fab 분자)를 갖는 이중특이성 항원 결합 분자(예를 들어 도 1의 A, D, G, H, K 및 L에 도시됨)가, 특히 상기 표적 세포 항원의 내면화가 고친화도 항원 결합 잔기의 결합에 이어서 예상되는 경우에 유용하다. 상기와 같은 경우에, 표적 세포 항원에 특이적인 하나 초과의 항원 결합 잔기의 존재는 상기 표적 세포 항원의 내면화를 증대시킬 수 있으며, 이에 의해 그의 유용성이 감소될 수 있다. 그러나, 다른 경우에 표적 세포 항원에 특이적인 2개 이상의 항원 결합 잔기(예를 들어 Fab 분자)를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자(예를 들어 도 1의 B, C, E, F, I, J, M 및 N에 도시된 것 참고)는, 예를 들어 표적 부위에 대한 표적화를 최적화하거나 표적 세포 항원의 가교결합을 허용하는데 유리할 것이다.
따라서, 특정 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 제3 항원 결합 잔기는 제1 항원, 즉 HLA-A2/WT1에 결합한다. 하나의 양태에서, 상기 제3 항원 결합 잔기는 Fab 분자이다.
특정 양태에서, 상기 제3 항원 잔기는 제1 항원 결합 잔기와 동일하다.
상기 이중특이성 항원 결합 분자의 제3 항원 결합 잔기는 과학적으로 분명히 불합리하지 않거나 불가능하지 않은 한, HLA-A2/WT1에 결합하는 제1 항원 결합 잔기 및/또는 항체와 관련하여 본원에 기재된 특징 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 제3 항원 결합 잔기는
(i) 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL);
(ii) 서열번호 9의 HCDR 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 12의 LCDR 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 17의 HCDR 1, 서열번호 18의 HCDR 2 및 서열번호 19의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 20의 LCDR 1, 서열번호 21의 LCDR 2 및 서열번호 22의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 25의 HCDR 1, 서열번호 26의 HCDR 2 및 서열번호 27의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28의 LCDR 1, 서열번호 29의 LCDR 2 및 서열번호 30의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 33의 HCDR 1, 서열번호 34의 HCDR 2 및 서열번호 35의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 36의 LCDR 1, 서열번호 37의 LCDR 2 및 서열번호 38의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 41의 HCDR 1, 서열번호 42의 HCDR 2 및 서열번호 43의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 44의 LCDR 1, 서열번호 45의 LCDR 2 및 서열번호 46의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 49의 HCDR 1, 서열번호 50의 HCDR 2 및 서열번호 51의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 52의 LCDR 1, 서열번호 53의 LCDR 2 및 서열번호 54의 LCDR 3을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 57의 HCDR 1, 서열번호 58의 HCDR 2 및 서열번호 59의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 60의 LCDR 1, 서열번호 61의 LCDR 2 및 서열번호 62의 LCDR 3을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 65의 HCDR 1, 서열번호 66의 HCDR 2 및 서열번호 67의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 68의 LCDR 1, 서열번호 69의 LCDR 2 및 서열번호 70의 LCDR 3을 포함하는 VL
을 포함한다.
특정 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 1의 HCDR 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 4의 LCDR 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 9의 HCDR 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 12의 LCDR 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 17의 HCDR 1, 서열번호 18의 HCDR 2 및 서열번호 19의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 20의 LCDR 1, 서열번호 21의 LCDR 2 및 서열번호 22의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 항체는 서열번호 25의 HCDR 1, 서열번호 26의 HCDR 2 및 서열번호 27의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 28의 LCDR 1, 서열번호 29의 LCDR 2 및 서열번호 30의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 양태에서, 항체는 인간 항체이다. 하나의 양태에서, VH는 인간 VH 이고/거나 VL은 인간 VL이다. 하나의 양태에서, 항체는 임의의 상기 양태에서의 CDR을 포함하고, 인간 프레임워크, 예컨대 인간 면역글로불린 프레임워크를 추가로 포함한다.
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 40의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 47의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 48의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL
을 포함한다.
특정 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(iii) 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(v) 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 40의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(vi) 서열번호 47의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 48의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(vii) 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL;
(viii) 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL; 또는
(ix) 서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL
을 포함한다.
특정 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vi) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vii) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(ix) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL
을 포함한다.
하나의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는
(i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열;
(ii) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열;
(iii) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열;
(iv) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열;
(v) 서열번호 39의 VH 서열 및 서열번호 40의 VL 서열;
(vi) 서열번호 47의 VH 서열 및 서열번호 48의 VL 서열;
(vii) 서열번호 55의 VH 서열 및 서열번호 56의 VL 서열;
(viii) 서열번호 63의 VH 서열 및 서열번호 64의 VL 서열; 또는
(ix) 서열번호 71의 VH 서열 및 서열번호 72의 VL 서열
을 포함한다.
특정 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 7의 VH 및 서열번호 8의 VL을 포함한다.
또다른 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 15의 VH 및 서열번호 16의 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 23의 VH 및 서열번호 24의 VL을 포함한다.
더 추가의 양태에서, 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 31의 VH 및 서열번호 32의 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 제3 항원 결합 잔기는 인간 불변부를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 제3 항원 결합 잔기는 인간 불변부, 특히 인간 CH1 및/또는 CL 도메인을 포함하는 Fab 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열을 서열번호 112 및 113(각각 인간 카파 및 람다 CL 도메인) 및 서열번호 114(인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3)에 제공한다. 일부 양태에서, 상기 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열, 특히 서열번호 112의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변부를 포함한다. 특히, 상기 경쇄 불변부는 "전하 변형" 하에 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함하고/하거나 크로스오버 Fab 분자 중에 있는 경우 하나 이상(특히 2개)의 N-말단 아미노산의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 제3 항원 결합 잔기는 서열번호 114의 아미노산 서열 중에 포함된 CH1 도메인 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변부를 포함한다. 특히, 상기 중쇄 불변부(구체적으로 CH1 도메인)는 "전하 변형" 하에 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 제3 및 제1 항원 결합 잔기는 각각 Fab 분자이고 상기 제3 항원 결합 잔기는 상기 제1 항원 결합 잔기와 동일하다. 따라서, 이들 양태에서, 상기 제1 및 제3 항원 결합 잔기는 동일한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하며 도메인들의 동일한 배열(즉 통상적이거나 크로스오버)을 갖는다. 더욱 또한, 이들 양태에서, 상기 제3 항원 결합 잔기는 상기 제1 항원 결합 잔기와 동일한 아미노산 치환(존재하는 경우)을 포함한다. 예를 들어 본원에서 "전하 변형"으로서 기재된 아미노산 치환이 상기 각각의 제1 항원 결합 잔기 및 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 중에서 이루어질 것이다. 한편으로, 상기 아미노산 치환은 상기 제2 항원 결합 잔기(특정 양태에서 또한 Fab 분자이다)의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 이루어질 수 있으나, 상기 제1 항원 결합 잔기 및 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서는 이루어질 수 없다.
제1 항원 결합 잔기처럼, 제3 항원 결합 잔기는 특히 통상적인 Fab 분자이다. 그러나, 상기 제1 및 제3 항원 결합 잔기가 크로스오버 Fab 분자인(및 상기 제2 항원 결합 잔기가 통상적인 Fab 분자인) 양태가 또한 고려된다. 따라서, 특정 양태에서, 상기 제1 및 제3 항원 결합 잔기는 각각 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 본원에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다. 다른 양태에서, 상기 제1 및 제3 항원 결합 잔기는 각각 크로스오버 Fab 분자이고 상기 제2 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다.
제3 항원 결합 잔기가 존재하는 경우, 특정 양태에서 제1 및 제3 항원 부분은 HLA-A2/WT1에 결합하고 제2 항원 결합 잔기는 제2 항원, 특히 활성화 T 세포 항원, 보다 특히 CD3, 가장 특히 CD3 입실론에 결합한다.
특정 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛은 안정하게 회합할 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는 상이한 배열을 가질 수 있다. 즉, 제1, 제2(및 임의적으로 제3) 항원 결합 잔기가 서로 및 Fc 도메인에 상이한 방식으로 융합될 수 있다. 상기 성분들은 서로에 직접 또는 바람직하게는 하나 이상의 적합한 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. Fab 분자의 융합이 Fc 도메인의 서브유닛의 N-말단에 대한 경우, 이는 전형적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해서이다.
일부 양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 분자이고 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 또는 상기 Fc 도메인의 서브유닛 중 다른 하나의 N-말단에 융합될 수 있다. 특정한 상기와 같은 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 본원에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다. 다른 상기와 같은 양태에서, 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
하나의 양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되고, 상기 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1의 G 및 K에 도식적으로 묘사된다(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이다). 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
또다른 양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 분자이고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다. 특정 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 및 제2 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1의 A 및 D에 도식적으로 묘사된다(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다). 상기 제1 및 제2 Fab 분자는 상기 Fc 도메인에 직접 또는 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 특정 양태에서 상기 제1 및 제2 Fab 분자는 각각 상기 Fc 도메인에 면역글로불린 힌지 영역을 통해 융합된다. 특정 양태에서, 상기 면역글로불린 힌지 영역은, 특히 상기 Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인 경우, 인간 IgG1 힌지 영역이다.
일부 양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 분자이고, 상기 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 또는 (상술한 바와 같이) 상기 Fc 도메인의 서브유닛 중 다른 하나의 N-말단에 융합된다. 특정한 상기와 같은 양태에서, 상기 제1 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 본원에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다. 다른 상기와 같은 양태에서, 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
하나의 양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 분자이고, 상기 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1의 H 및 L에 도식적으로 묘사된다(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다). 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로에 융합될 수 있다.
일부 양태에서, 제3 항원 결합 잔기, 특히 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 특정한 상기와 같은 양태에서, 상기 제1 및 제3 Fab 분자는 각각 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 Fab 분자는 본원에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다. 다른 상기와 같은 양태에서, 상기 제1 및 제3 Fab 분자는 크로스오버 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
특정 양태에서, 제2 및 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되며, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1의 B 및 E(이들 예에서 제2 항원 결합 잔기는 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 및 제3 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다), 및 도 1의 J 및 N(이들 예에서 제2 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이고, 제1 및 제3 항원 결합 잔기는 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다. 상기 제2 및 제3 Fab 분자를 상기 Fc 도메인에 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 융합시킬 수 있다. 특정 양태에서, 상기 제2 및 제3 Fab 분자는 각각 Fc 도메인에 면역글로불린 힌지 영역을 통해 융합된다. 특정 양태에서, 상기 면역글로불린 힌지 영역은, 특히 상기 Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인 경우, 인간 IgG1 힌지 영역이다. 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로에 융합될 수 있다.
또다른 상기와 같은 양태에서, 제1 및 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되며, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1의 C 및 F(이들 예에서 제2 항원 결합 잔기는 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 및 제3 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다), 및 도 1의 I 및 M(이들 예에서 제2 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이고, 제1 및 제3 항원 결합 잔기는 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다. 상기 제1 및 제3 Fab 분자를 상기 Fc 도메인에 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 융합시킬 수 있다. 특정 양태에서, 상기 제1 및 제3 Fab 분자는 각각 Fc 도메인에 면역글로불린 힌지 영역을 통해 융합된다. 특정 양태에서, 상기 면역글로불린 힌지 영역은, 특히 상기 Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인 경우, 인간 IgG1 힌지 영역이다. 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로에 융합될 수 있다.
Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인의 각각의 서브유닛의 N-말단에 융합되는 이중특이성 항원 결합 분자의 배열에서, 2개의 Fab 분자, 힌지 영역 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자를 필수적으로 형성한다. 특정 양태에서 상기 면역글로불린 분자는 IgG 부류 면역글로불린이다. 훨씬 더 특정 양태에서 상기 면역글로불린은 IgG1 하위부류 면역글로불린이다. 또다른 양태에서 상기 면역글로불린은 IgG4 하위부류 면역글로불린이다. 추가의 특정 양태에서 상기 면역글로불린인 인간 면역글로불린이다. 다른 양태에서 상기 면역글로불린은 키메릭 면역글로불린 또는 인간화된 면역글로불린이다. 하나의 양태에서, 상기 면역글로불린은 인간 불변부, 특히 인간 Fc 영역을 포함한다.
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 중 일부에서, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 임의적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 상기 제1 및 제2 Fab 분자의 배열에 따라, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄는 그의 C-말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합되거나, 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 그의 C-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있다. 상기 제1 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 융합은 합치되지 않은 Fab 중쇄 및 경쇄의 잘못짝짓기를 추가로 감소시키며, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 중 일부의 발현에 필요한 플라스미드의 수를 또한 감소시킨다.
상기 항원 결합 잔기는 상기 Fc 도메인에 또는 서로에 직접적으로, 또는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로는 약 2 내지 20 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 당해 분야에 공지되어 있으며 본원에 기재되어 있다. 적합한, 비-면역원성 링커 펩티드는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n, 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커이며, 여기에서 "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다. 하나의 양태에서 상기 펩티드 링커는 적어도 5 아미노산의 길이, 하나의 양태에서 5 내지 100의 길이, 추가의 양태에서, 10 내지 50 아미노산의 길이를 갖는다. 하나의 양태에서 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm이며, 이때 G=글리신, S=세린, 및 (x=3, n=3, 4, 5 또는 6, 및 m=0, 1, 2 또는 3) 또는 (x=4, n=2, 3, 4 또는 5 및 m=0, 1, 2, 또는 3), 하나의 양태에서 x=4 및 n=2 또는 3, 추가의 양태에서 x=4 및 n=2이다. 하나의 양태에서 상기 펩티드 링커는 (G4S)2이다. 상기 제1 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄를 서로에 대해 융합시키기에 특히 적합한 펩티드 링커는 (G4S)2이다. 상기 제1 및 제2 Fab 단편의 Fab 중쇄를 연결시키기에 적합한 예시적인 펩티드 링커는 서열 (D)-(G4S)2를 포함한다(서열번호 110 및 111). 또다른 적합한 상기와 같은 링커는 서열 (G4S)4를 포함한다. 추가로, 링커들은 면역글로불린 힌지 영역(의 일부)을 포함할 수 있다. 특히 Fab 분자가 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단에 융합되는 경우, 상기를 면역글로불린 힌지 영역 또는 그의 일부를 통해, 추가의 펩티드 링커와 함께 또는 상기 링커 없이 융합시킬 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되고), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)), 및 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 이들 폴리펩티드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변부는 경쇄 불변부에 의해 대체되고), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)), 및 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 이들 폴리펩티드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다.
일부 양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는, 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드를 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되고), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 상기 양태 중 일부에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 크로스오버 Fab 경쇄 폴리펩티드(여기에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부는 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다)(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 이들 양태 중 다른 양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 적합한 경우, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1)), 또는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))를 추가로 포함한다.
상기 양태에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛의 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이들 폴리펩티드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다.
일부 양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는, 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변부는 경쇄 불변부에 의해 대체되고), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다.
상기 양태 중 일부에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 크로스오버 Fab 경쇄 폴리펩티드(여기에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부는 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다)(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 이들 양태 중 다른 양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 적합한 경우, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1)), 또는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))를 추가로 포함한다.
상기 양태에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛의 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이들 폴리펩티드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다.
일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 특정한 상기와 같은 양태에서, 제1, 및 존재하는 경우 제3 Fab 분자는 각각 통상적인 Fab 분자이고, 제2 Fab 분자는 본원에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다. 다른 상기와 같은 양태에서, 상기 제1, 및 존재하는 경우 제3 Fab 분자는 각각 크로스오버 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
하나의 상기와 같은 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 항원 결합 잔기, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 모두 Fab 분자이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1의 O 및 S(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다. 또다른 상기와 같은 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 항원 결합 잔기, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 모두 Fab 분자이고 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1의 P 및 T(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 항원 결합 잔기는 통상적인 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다.
일부 양태에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되며, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 잔기, 특히 제3 Fab 분자를 추가로 포함하고, 여기에서 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 몇몇 상기와 같은 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1의 Q 및 U(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 및 항원 결합 잔기는 각각 통상적인 Fab 분자이다), 또는 도 1의 X 및 Z(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 통상적인 Fab 분자이고, 제1 및 제3 항원 결합 잔기는 각각 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다.
일부 양태에서, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되며, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 잔기, 특히 제3 Fab 분자를 추가로 포함하고, 여기에서 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 N-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된다. 몇몇 상기와 같은 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 N-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1의 R 및 V(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 및 항원 결합 잔기는 각각 통상적인 Fab 분자이다), 또는 도 1의 W 및 Y(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 통상적인 Fab 분자이고, 제1 및 제3 항원 결합 잔기는 각각 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체된다) 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변부는 경쇄 불변부에 의해 대체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되고) 폴리펩티드(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변부는 경쇄 불변부에 의해 대체되고) 폴리펩티드(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변부는 경쇄 불변부에 의해 대체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되고), 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉 상기 제3 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되는) 폴리펩티드(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-VL(3)-CH1(3))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CL(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변부는 경쇄 불변부에 의해 대체되고), 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉 상기 제3 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변부는 경쇄 불변부에 의해 대체되는) 폴리펩티드(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-VH(3)-CL(3))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(1)-CH1(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(3)-CH1(3))를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제3 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변부는 경쇄 가변부에 의해 대체되고), 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(3)-CH1(3)-VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CL(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부가 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제3 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변부는 경쇄 불변부에 의해 대체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변부는 경쇄 불변부에 의해 대체되고), 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(3)-CL(3)-VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(1)-CH1(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변부가 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변부와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(3)-CH1(3))를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH) 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다); 및
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
(i) a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) b)하의 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
특정 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다);
c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 잔기와 동일한 제3 항원 결합 잔기; 및
d) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
(i) a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) b)하의 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
또다른 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다); 및
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
(i) a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 b)하의 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
하나의 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 9의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 12의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다); 및
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
(i) a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) b)하의 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
특정 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 9의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 12의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다);
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인; 및
d) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
(i) a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) b)하의 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
또다른 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 9의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 12의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다); 및
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
(i) a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 b)하의 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 모든 상이한 배열에서, 본원에 기재된 아미노산 치환(존재하는 경우)은 제1 및 (존재하는 경우) 제3 항원 결합 잔기/Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인 중에, 또는 제2 항원 결합 잔기/Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인 중에 존재할 수 있다. 바람직하게, 상기 치환은 제1 및 (존재하는 경우) 제3 항원 결합 잔기/Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인 중에 존재한다. 본 발명의 개념에 따라, 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 상기 제1(및 존재하는 경우 제3) 항원 결합 잔기/Fab 분자 중에서 이루어진 경우, 제2 항원 결합 잔기/Fab 분자에서는 상기와 같은 아미노산 치환이 이루어지지 않는다. 환언하면, 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 제2 항원 결합 잔기/Fab 분자에서 이루어진 경우, 제1(및 존재하는 경우 제3) 항원 결합 잔기/Fab 분자에서는 상기와 같은 아미노산 치환은 이루어지지 않는다. 아미노산 치환은 특히 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH1이 서로에 의해 대체되는 Fab 분자를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자 중에서 이루어진다.
본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 특정 양태에서, 특히 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 제1(및 존재하는 경우 제3) 항원 결합 잔기/Fab 분자에서 이루어진 양태에서, 상기 제1(및 존재하는 경우 제3) Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 아이소타입의 것이다. 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 다른 양태에서, 특히 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 제2 항원 결합 잔기/Fab 분자에서 이루어진 양태에서, 상기 제2 항원 결합 잔기/Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 아이소타입의 것이다. 일부 양태에서, 제1(및 존재하는 경우 제3) 항원 결합 잔기/Fab 분자 및 제2 항원 결합 잔기/Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 아이소타입의 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다); 및
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 색인에 따른 번호부여);
(i) a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) b)하의 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
특정 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다);
c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 잔기와 동일한 제3 항원 결합 잔기; 및
d) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1 에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 색인에 따른 번호부여);
(i) a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) b)하의 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
또다른 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다);
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 색인에 따른 번호부여);
a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 b)하의 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
하나의 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 9의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 12의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다); 및
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1 에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 색인에 따른 번호부여);
(i) a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) b)하의 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
특정 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 9의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 12의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다);
c) 제1 항원에 결합하고 제1 항원 결합 잔기와 동일한 제3 항원 결합 잔기; 및
d) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 색인에 따른 번호부여);
(i) a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) b)하의 제2 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 c)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
또다른 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, 특히 HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 항원 결합 잔기는 서열번호 9의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 10의 HCDR 2 및 서열번호 11의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 12의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 13의 LCDR 2 및 서열번호 14의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 잔기는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다); 및
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 색인에 따른 번호부여);
a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 b)하의 제2 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
상기 양태 중 어느 하나에 따라, 이중특이성 항원 결합 분자의 성분들(예를 들어 Fab 분자, Fc 도메인)은 직접적으로 또는 본원에 기재되거나 당해 분야에 공지된 다양한 링커, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로는 약 2 내지 20 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 적합한, 비-면역원성 펩티드 링커는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n, 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커이며, 여기에서 n은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다.
특정 양상에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 및 제3 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 각각 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는 (통상적인) Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 CD3이고 상기 제2 항원 결합 잔기는 (i) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부, 또는 (ii) 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 및 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(특히 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 및 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부)를 포함하는, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다); 및
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 및 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 및 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 색인에 따른 번호부여); 추가로
a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 잔기 및 a)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
추가의 양상에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 및 제3 항원 결합 잔기[여기에서 상기 제1 항원은 HLA-A2/WT1, HLA-A2/WT1RMF이고 상기 제1 및 제2 항원 결합 잔기는 각각 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는 (통상적인) Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기(여기에서 상기 제2 항원은 CD3이고 상기 제2 항원 결합 잔기는 (i) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부, 또는 (ii) 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 및 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(특히 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 및 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부)를 포함하는, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는 Fab 분자이다); 및
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 및 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 및 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 색인에 따른 번호부여); 추가로
a)하의 제1 항원 결합 잔기는 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 잔기 및 a)하의 제3 항원 결합 잔기는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
본 발명의 상기 양상에 따른 하나의 양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 366번 위치의 트레오닌 잔기는 트립토판 잔기(T366W)에 의해 대체되고, Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 407번 위치의 타이로신 잔기는 발린 잔기(Y407V)에 의해 대체되고, 임의적으로 366번 위치의 트레오닌 잔기는 세린 잔기(T366S)에 의해 대체되고, 368번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기(L368A)에 의해 대체된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
본 발명의 상기 양상에 따른 추가의 양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 354번 위치의 세린 잔기는 시스테인 잔기(S354C)에 의해 대체되거나 356번 위치의 글루탐산은 시스테인 잔기(E356C)에 의해 대체되고(특히 354번 위치의 세린 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체된다), Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 349번 위치의 타이로신 잔기는 시스테인 잔기(Y349C)에 의해 대체된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
본 발명의 상기 양상에 따른 더욱 추가의 양태에서, Fc 도메인의 각각의 제1 및 제2 서브유닛에서, 234번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기(L234A)에 의해 대체되고, 235번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기(L235A)에 의해 대체되고, 329번 위치의 프롤린 잔기는 글리신 잔기(P329G)에 의해 대체된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
본 발명의 상기 양상에 따른 더욱 추가의 양태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
특히 구체적인 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 123의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 125의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 139의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 140의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 특히 구체적인 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
또다른 구체적인 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 123의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 124의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 125의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 특정한 구체적인 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
또다른 구체적인 양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 126의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 127의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 구체적인 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
Fc 도메인
특정 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. 상기 이중특이성 항원 결합 분자와 관련하여 본원에 기재된 Fc 도메인의 특징을 본 발명의 항체 중에 포함된 Fc 도메인에 균등하게 적용할 수 있을 것으로 생각된다.
상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어진다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이며, 이들의 각 서브유닛은 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 서로 안정한 회합이 가능하다. 하나의 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 하나 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정 양태에서 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또다른 양태에서 상기 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 구체적인 양태에서, 상기 Fc 도메인은 S228번 위치(카밧 EU 색인 번호부여)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 상기 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 가지 교환을 감소시킨다(문헌[Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)] 참고). 추가의 특정 양태에서 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 훨씬 더 특정 양태에서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 인간 IgG1 Fc 영역의 예시적인 서열은 서열번호 109에 제시된다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합될 수 있는 상이한 항원 결합 잔기를 포함하며, 따라서 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛은 전형적으로 2개의 일치하지 않는 폴리펩티드 쇄에 포함된다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공-발현 및 후속의 이량체화는 상기 두 폴리펩티드의 다수의 가능한 조합들을 도출한다. 따라서, 재조합체 생산에서 이중특이성 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선시키기 위해서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 목적하는 폴리펩티드의 회합을 촉진하는 변형을 도입시키는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 서브유닛간의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다. 따라서, 하나의 양태에서 상기 변형은 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다.
이종이량체화를 수행하기 위한 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중의 변형에 대한 다수의 접근법들이 존재하며, 이들은 예를 들어 WO　96/27011, WO　98/050431, EP　1870459, WO　2007/110205, WO　2007/147901, WO　2009/089004, WO　2010/129304, WO　2011/90754, WO　2011/143545, WO　2012/058768, WO　2013/157954, WO　2013/096291에 충분히 기재되어 있다. 전형적으로, 모든 상기와 같은 접근법에서 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인과 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인을 모두, 각각의 CH3 도메인(또는 상기를 포함하는 중쇄)이 자신과 더 이상 동종이량체화할 수 없지만 상보적으로 조작된 다른 CH3 도메인과는 강제로 이종이량체화하도록(상기 제1 및 제2 CH3 도메인이 이종이량체화하고 상기 2개의 제1 또는 2개의 제2 CH3 도메인들간에는 동종이량체가 형성되지 않도록) 상보적인 방식으로 조작한다. 개선된 중쇄 이종이량체화를 위한 이러한 상이한 접근법은 중/경쇄 잘못짝짓기 및 벤스 존스-유형 부산물을 감소시키는 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중의 중-경쇄 변형(예를 들어 하나의 결합 가지에 VH 및 VL 교환/대체 및 CH1/CL 계면 중에 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 치환의 도입)과 함께 상이한 대안으로서 간주된다.
구체적인 양태에서 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 상기 변형은 소위 "놉-홀" 변형이며, 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나에서 "놉" 변형 및 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 다른 하나에서 "홀" 변형을 포함한다.
상기 놉-홀 기술은 예를 들어 US 5,731,168; US 7,695,936; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌기가 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하도록 공동내에 위치할 수 있게 상기 돌기("놉")를 제1 폴리펩티드의 접촉면에 도입시키고 상응하는 공동("홀")을 제2 폴리펩티드의 접촉면에 도입시킴을 수반한다. 돌기는 상기 제1 폴리펩티드의 접촉면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어 타이로신 또는 트립토판)로 대체시킴으로써 구성된다. 상기 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상 공동이, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들어 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체시킴으로써 상기 제2 폴리펩티드의 접촉면에 생성된다.
따라서, 특정 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 상기 제1 서브유닛의 CH3 도메인내에, 상기 제2 서브유닛의 CH3 도메인내의 공동에 위치할 수 있는 돌기를 생성하고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 상기 제2 서브유닛의 CH3 도메인내에, 상기 제1 서브유닛의 CH3 도메인내의 돌기가 위치할 수 있는 공동을 생성한다.
바람직하게 상기 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y) 및 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게 상기 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 돌기 및 공동을, 예를 들어 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해서 또는 펩티드 합성에 의해서, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 변경시킴으로써 만들 수 있다.
구체적인 양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛("놉" 서브유닛)의 CH3 도메인에서, 366번 위치의 트레오닌 잔기를 트립토판 잔기로 대체시키고(T366W), 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛("홀" 서브유닛)의 CH3 도메인에서 407번 위치의 타이로신 잔기를 발린 잔기로 대체시킨다(Y407V). 하나의 양태에서, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 366번 위치의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로 대체시키고(T366S), 368번 위치의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 대체시킨다(L368A)(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
더욱 추가의 양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 추가로 354번 위치의 세린 잔기를 시스테인 잔기로 대체시키거나(S354C), 356번 위치의 글루탐산 잔기를 시스테인 잔기로 대체시키고(E356C)(특히 354번 위치의 세린 잔기를 시스테인 잔기로 대체시키고), 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 349번 위치의 타이로신 잔기를 시스테인 잔기로 대체시킨다(Y349C)(카밧 EU 색인에 따른 번호부여). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 상기 Fc 영역의 2개 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교를 형성하고, 이는 상기 이량체를 더욱 안정화시킨다(문헌[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)]).
특정 양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)를 포함한다.
특정 양태에서 제2 항원(예를 들어 활성화 T 세포 항원)에 결합하는 항원 결합 잔기를 Fc 도메인의 제1 서브유닛("놉" 변형을 포함한다)에 융합시킨다(임의적으로, HLA-A2/WT1에 결합하는 제1 항원 결합 잔기, 및/또는 펩티드 링커를 통해). 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 Fc 도메인의 놉-함유 서브유닛에의, 제2 항원, 예를 들어 활성화 T 세포 항원에 결합하는 항원 결합 잔기의 융합은 활성화 T 세포 항원에 결합하는 2개의 항원 결합 잔기를 포함하는 항원 결합 분자의 생성(2개의 놉-함유 폴리펩티드의 입체 충돌)을 (더욱) 최소화할 것이다.
상기 이종이량체화를 실행하기 위한 CH3-변형의 다른 기법을 본 발명에 따른 대안으로서 고려하며, 이는 예를 들어 WO　96/27011, WO　98/050431, EP　1870459, WO　2007/110205, WO　2007/147901, WO　2009/089004, WO　2010/129304, WO　2011/90754, WO　2011/143545, WO　2012/058768, WO　2013/157954, WO　2013/096291에 기재되어 있다.
하나의 양태에서 EP 1870459에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다. 상기 접근법은 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛 사이의 CH3/CH3 도메인 계면에서 특정한 아미노산 위치에 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입을 기본으로 한다. 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자에 대한 하나의 바람직한 양태는 아미노산 돌연변이 R409D; 상기 2개의 CH3 도메인(Fc 도메인의) 중 하나에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중 다른 하나에서 E357K이다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
또다른 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 T366W 및 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 추가로 아미노산 돌연변이 R409D; 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중에 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중에 E357K를 포함한다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
또다른 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 S354C, T366W 및 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하거나, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 Y349C, T366W 및 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, 및 추가로 아미노산 돌연변이 R409D; 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중에 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중에 E357K를 포함한다(모두 카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
하나의 양태에서 WO 2013/157953에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다. 하나의 양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366K를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351D를 포함한다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여). 추가의 양태에서 상기 제1 CH3 도메인은 추가의 아미노산 돌연변이 L351K를 포함한다. 추가의 양태에서 상기 제2 CH3 도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E(바람직하게는 L368E) 중에서 선택된 추가의 아미노산 돌연변이를 포함한다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
하나의 양태에서 WO 2012/058768에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다. 하나의 양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 양태에서 상기 제2 CH3 도메인은 T411, D399, S400, F405, N390, 또는 K392번 위치에 추가의 아미노산 돌연변이, 예를 들어 a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 또는 T411W, b) D399R, D399W, D399Y 또는 D399K, c) S400E, S400D, S400R, 또는 S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 또는 F405W, e) N390R, N390K 또는 N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 또는 K392E(카밧 EU 색인에 따른 번호부여) 중에서 선택된 돌연변이를 포함한다. 추가의 양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366V, K409F를 포함한다. 추가의 양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 양태에서 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)을 추가로 포함한다.
하나의 양태에서 WO 2011/143545에 기재된 이종이량체화 접근법, 예를 들어 368 및 409번(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 아미노산 변형을 갖는 접근법이 대안으로 사용된다.
하나의 양태에서 상술한 놉-홀 기술을 또한 사용하는 WO 2011/090762에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다. 하나의 양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함한다. 하나의 양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T를 포함한다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
하나의 양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 Fc 도메인은 IgG2 하위부류의 것이며 WO 2010/129304에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다.
또다른 양태에서 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형은 예를 들어 PCT 공보 WO 2009/089004에 기재된 바와 같은 정전기적 조타 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 계면에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를, 동종이량체 형성은 정전기적으로 불리하게 되지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록 하전된 아미노산 잔기에 의해 대체시킴을 수반한다. 하나의 상기와 같은 양태에서 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 글루탐산(E), 또는 아스파트산(D), 바람직하게는 K392D 또는 N392D)에 의한 K392 또는 N392의 아미노산 치환을 포함하고 제2 CH3 도메인은 양으로 하전된 아미노산(예를 들어 리신(K) 또는 아르기닌(R), 바람직하게는 D399K, E356K, D356K, 또는 E357K, 보다 바람직하게는 D399K 및 E356K)에 의한 D399, E356, D356 또는 E357의 아미노산 치환을 포함한다. 추가의 양태에서 상기 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D), 바람직하게는 K409D 또는 R409D)에 의한 K409 또는 R409의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 추가의 양태에서 상기 제1 CH3 도메인은 추가로 또는 한편으로 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D))에 의한 K439 및/또는 K370의 아미노산 치환을 포함한다(모두 카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
더욱 추가의 양태에서 WO 2007/147901에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다. 하나의 양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K253E, D282K, 및 K322D를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K, 및 K292D를 포함한다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
더욱 또다른 양태에서 WO 2007/110205에 기재된 이종이량체화 접근법을 대안으로 사용할 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 K392D 및 K409D를 포함하고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 D356K 및 D399K를 포함한다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
상기 Fc 도메인은 상기 이중특이성 항원 결합 분자(또는 항체)에, 표적 조직 중의 양호한 축적 및 유리한 조직-혈액 분배비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 비롯하여 유리한 약동학적 성질을 부여한다. 그러나, 동시에 상기는 상기 이중특이성 항원 결합 분자(또는 항체)의, 바람직한 항원-함유 세포에 대해서보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대한 바람직하지 못한 표적화를 유도할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 공-활성화는 T 세포 활성화 성질(예를 들어 제2 항원 결합 잔기가 활성화 T 세포 항원에 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자의 양태에서) 및 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 긴 반감기와 함께, 전신 투여시 사이토킨 수용체의 과도한 활성화 및 심한 부작용을 생성하는 사이토킨 방출을 유도할 수 있다. T 세포 이외의 (Fc 수용체-함유) 면역세포의 활성화는 심지어, 예를 들어 NK 세포에 의한 T 세포의 잠재적인 파괴로 인해 상기 이중특이성 항원 결합 분자(특히 제2 항원 결합 잔기가 활성화 T 세포 항원에 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자)의 효능을 감소시킬 수도 있다.
따라서, 특정 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 고유의 IgG1 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 상기와 같은 양태에서 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)은 고유의 IgG1 Fc 도메인(또는 고유의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)에 비해, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도, 및/또는 고유의 IgG1 Fc 도메인 도메인(또는 고유의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)에 비해, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 양태에서, 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)은 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 추가의 양태에서 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 양태에서 상기 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 양태에서 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 양태에서 상기 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로는 인간 FcγRIIIa이다. 하나의 양태에서 상기 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP, 및 사이토킨 분비의 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 특정 양태에서 상기 효과기 기능은 ADCC이다. 하나의 양태에서 상기 Fc 도메인은 고유의 IgG1 Fc 도메인 도메인에 비해, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화도를 나타낸다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합은 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 고유의 IgG1 Fc 도메인(또는 고유의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)의 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 보다 특히 약 90% 초과의 결합 친화도를 나타낼 때 성취된다.
일부 양태에서 상기 Fc 도메인을, 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대해 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작한다. 특정 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에 존재한다. 하나의 양태에서, 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시킨다. 하나의 양태에서 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화도를 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배까지 감소시킨다. 상기 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 존재하는 양태에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화도를 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 심지어 적어도 50배까지 감소시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자와 비교하여 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 특정 양태에서 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 양태에서 상기 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 양태에서 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 양태에서 상기 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로는 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게, 이들 수용체 각각에 대한 결합이 감소된다. 일부 양태에서 보체 성분에 대한 결합 친화도, 구체적으로 C1q에 대한 결합 친화도가 또한 감소된다. 하나의 양태에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화도의 보존은 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인의 조작되지 않은 형태를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)의 조작되지 않은 형태의 약 70% 초과의 결합 친화도를 나타낼 때 성취된다. 상기 Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자는 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과의 상기와 같은 친화도를 나타낼 수 있다. 일부 양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인을, 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해, 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작한다. 상기 감소된 효과기 기능은 비제한적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 감소된 보체 의존적인 세포독성(CDC), 감소된 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체-의존적인 세포 식작용(ADCP), 감소된 사이토킨 분비, 항원-제공 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵세포에 대한 감소된 결합, 다형핵세포에 대한 감소된 결합, 감소된 직접적인 신호전달 유도 세포사멸, 표적-결합된 항체의 감소된 가교결합, 감소된 수지상세포 성숙화, 또는 감소된 T 세포 프라이밍. 하나의 양태에서 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP, 및 감소된 사이토킨 분비의 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 특정 양태에서 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 하나의 양태에서 상기 감소된 ADCC는 조작되지 않은 Fc 도메인(또는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
하나의 양태에서 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 하나의 양태에서 상기 Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)의 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 양태에서 상기 Fc 도메인은 L234, L235 및 P329(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)의 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 양태에서 상기 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)를 포함한다. 하나의 상기와 같은 양태에서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 양태에서 상기 Fc 도메인은 P329번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 양태에서 상기 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)이다. 하나의 양태에서 상기 Fc 도메인은 P329번 위치에서 아미노산 치환 및 E233, L234, L235, N297 및 P331(카밧 EU 색인에 따른 번호부여) 중에서 선택된 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 양태에서 상기 추가의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정 양태에서 상기 Fc 도메인은 P329, L234 및 L235(카밧 EU 색인에 따른 번호부여) 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정 양태에서 상기 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA", "PGLALA" 또는 "LALAPG")를 포함한다. 구체적으로, 특정 양태에서, 상기 Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)를 포함한다. 즉, 상기 Fc 도메인의 각각의 제1 및 제2 서브유닛에서 234번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기(L234A)로 대체되고, 235번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기(L235A)로 대체되고 329번 위치의 프롤린 잔기는 글리신 잔기(P329G)로 대체된다(카밧 EU 색인에 따른 번호부여).
하나의 상기와 같은 양태에서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 상기 아미노산 치환들의 "P329G LALA" 조합은 본원에 내용 전체가 참고로 인용된 PCT 공보 WO 2012/130831에 기재된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체(뿐만 아니라 보체) 결합을 거의 완전히 없앤다. WO 2012/130831은 또한 상기와 같은 돌연변이 Fc 도메인의 제조 방법 및 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능과 같은 그의 성질을 측정하는 방법을 기재한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 양태에서 상기 IgG4 Fc 도메인은 S228번 위치에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)를 포함한다. Fc 수용체에 대한 그의 결합 친화도 및/또는 그의 효과기 기능을 추가로 감소시키기 위해서, 하나의 양태에서 상기 IgG4 Fc 도메인은 L235번 위치에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)를 포함한다. 또다른 양태에서 상기 IgG4 Fc 도메인은 P329번 위치에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)를 포함한다. 특정 양태에서 상기 IgG4 Fc 도메인은 S228, L235 및 P329번 위치에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)를 포함한다. 상기와 같은 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 그의 Fcγ 수용체 결합 성질은 본원에 내용 전체가 참고로 인용된 PCT 공보 WO 2012/130831에 기재되어 있다.
특정 양태에서 고유의 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의적으로 P329G(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
일부 양태에서, 상기 Fc 도메인의 N-글리코실화가 제거되었다. 하나의 상기와 같은 양태에서, 상기 Fc 도메인은 N297번 위치에서 아미노산 돌연변이, 특히 알라닌에 의해(N297A) 또는 아스파트산에 의해(N297D)(카밧 EU 색인에 따른 번호부여) 아스파라진을 대체하는 아미노산 치환을 포함한다.
본원에서 상기에 및 PCT 공보 WO 2012/130831에 기재된 Fc 도메인 외에, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(US 6,737,056)(카밧 EU 색인에 따른 번호부여). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체(알라닌으로의 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함(US 7,332,581))를 포함한다.
돌연변이체 Fc 도메인을 당해 분야에 주지된 유전학적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조할 수 있다. 유전학적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함한다. 정확한 뉴클레오타이드 변화를 예를 들어 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
Fc 수용체에의 결합을 예를 들어 ELISA에 의해서 또는 BIAcore 장비(GE 헬쓰케어)와 같은 표준 장비를 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해서 쉽게 측정할 수 있으며 Fc 수용체 자체를 재조합 발현에 의해 수득할 수 있다. 한편으로, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자의 결합 친화도를 특정한 Fc 수용체, 예를 들어 인간 NK 세포 발현 FcγIIIa 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주를 사용하여 평가할 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자의 효과기 기능을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 예들은 US 5,500,362; 문헌[Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)] 및 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; US 5,821,337; 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기재되어 있다. 한편으로, 비-방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예를 들어 유식 세포측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.) 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참고). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
일부 양태에서, 보체 성분, 구체적으로 C1q에의 상기 Fc 도메인의 결합을 감소시킨다. 상응하게 상기 Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작하는 일부 양태에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석을 수행하여, 상기 Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자가 C1q에 결합할 수 있고 따라서 CDC 활성을 갖는지의 여부를 측정할 수 있다. 예를 들어 WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996)]; 문헌[Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)] 참고).
FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 결정을 또한 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)]; WO 2013/120929 참고).
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 상기 단편은 항원 결합 단편이다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전체 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오타이드로서 또는 공-발현되는 다수의(예를 들어 2개 이상의) 폴리뉴클레오타이드로서 발현시킬 수 있다. 공-발현되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩티드들은 예를 들어 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 회합하여 기능성 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 형성할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 경쇄 부분은 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 부분으로부터의 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다. 공-발현시, 상기 중쇄 폴리펩티드는 상기 경쇄 폴리펩티드와 회합하여 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 형성할 것이다. 또다른 예에서, 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 및 임의적으로 하나 이상의 Fab 분자(의 부분)를 포함하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 부분은 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 다른 하나 및 임의적으로 Fab 분자(의 부분)를 포함하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 부분으로부터의 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있었다. 공-발현시, 상기 Fc 도메인 서브유닛은 회합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다.
일부 양태에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 전체 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화한다. 다른 양태에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자에 포함된 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 양태에서 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 RNA, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA)의 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 예를 들어 고상 펩티드 합성(예를 들어 메리필드(Merrifield) 고상 합성) 또는 재조합 생성에 의해 수득할 수 있다. 제조합체 생성을 위해서 예를 들어 상술한 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 단리하고 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내에 삽입한다. 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드는 통상적인 과정을 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다. 당해 분야의 숙련가들에게 주지된 방법을 사용하여 적합한 전사/번역 조절 신호와 함께 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)]; 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)]에 기재된 기법들 참조. 상기 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분이거나 핵산 단편일 수 있다. 상기 발현 벡터는 발현 카세트를 포함하며, 상기 카세트 내로 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(단편)(즉 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 함께 작동가능하게 회합되어 클로닝된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 번역된 코돈들로 이루어진 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, (존재하는 경우) 암호화 영역의 부분인 것으로 간주될 수 있고, 임의의 인접 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론, 5' 및 3' 번역되지 않은 영역 등은 암호화 영역의 부분이 아니다. 2개 이상의 암호화 영역이 단일 폴리뉴클레오타이드 구조물 중에, 예를 들어 단일 벡터상에, 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 구조물 중에, 예를 들어 별도의(상이한) 벡터상에 존재할 수 있다. 더욱 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유하거나 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다, 예를 들어 본 발명의 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있으며, 이들은 단백질 분해 절단을 통해 최종 단백질로 번역-후 또는 번역과 함께 분리된다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오타이드, 또는 핵산은 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 그의 변이체 또는 유도체에 융합되거나 융합되지 않은 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 비제한적으로 전문화된 요소 또는 동기, 예를 들어 분비신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동성 회합은 유전자 산물의 암호화 영역, 예를 들어 폴리펩티드가, 상기 유전자 산물의 발현을 조절 서열의 영향 또는 통제하에 두는 방식으로 하나 이상의 조절 서열들과 회합하는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들어 폴리펩티드 암호화 영역 및 상기와 회합된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 생성하고 상기 두 DNA 단편간의 결합의 성질이 상기 유전자 산물의 발현을 지시하는 상기 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 상기 DNA 주형이 전사되는 능력을 방해하지 않는 경우 "작동적으로 회합된다". 따라서, 프로모터 영역은 상기 프로모터가 상기 핵산의 전사를 실행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 작동적으로 회합될 것이다. 상기 프로모터는 오직 예정된 세포에서만 상기 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포-특이성 프로모터일 수 있다. 프로모터 외에, 다른 전사 조절 요소들, 예를 들어 인헨서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호가 상기 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 회합되어 세포-특이성 전사를 지시할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역들을 본원에 개시한다. 다양한 전사 조절 영역들이 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예를 들어 비제한적으로 거대세포바이러스로부터의 프로모터 및 인헨서 분절(예를 들어 인트론-A와 함께, 전초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들어 초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예를 들어 라우스 육종 바이러스)를 포함한다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들, 예를 들어 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열들을 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 영역은 조직-특이성 프로모터 및 인헨서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들어 프로모터 유도성 테트라사이클린)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소들(특히 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES, 또한 CITE 서열로서 지칭됨)이 있다. 상기 발현 카세트는 또한 다른 특징들, 예를 들어 복제 기원, 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 또는 아데노-회합된 바이러스(AAV) 반전 말단 반복부(ITR)를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 암호화 영역을 분비 또는 신호 펩티드(본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 지시한다)를 암호화하는 추가적인 암호화 영역과 회합시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 분비를 원하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA를 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 둘 수 있다. 상기 신호 가설에 따라, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 일단 거친 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 쇄의 수출이 개시되었으면, 성숙한 단백질로부터 절단된 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당해 분야의 통상적인 숙련가들은 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 상기 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드(상기는 번역된 폴리펩티드로부터 절단되어 상기 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙한" 형태를 생성한다)를 가짐을 안다. 일부 양태에서, 본래의 신호 펩티드, 예를 들어 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 상기와 작동적으로 회합된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 유지하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 한편으로, 이종 포유동물 신호 펩티드, 또는 그의 기능성 유도체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 야생형 리더 서열을 인간 조직 플라스미노겐 활성제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환시킬 수 있다.
나중의 정제를 촉진하거나(예를 들어 히스티딘 태그) 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 표지화를 지원하는데 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA를, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(단편) 암호화 폴리뉴클레오타이드 내에 또는 상기의 단부에 포함시킬 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 및 벡터는 각각 폴리뉴클레오타이드 및 벡터와 관련하여 본원에 기재된 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 통합할 수 있다. 하나의 상기와 같은 양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함한다(예를 들어 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본원에 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"란 용어는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포주를 지칭한다. 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 복제하고 그의 발현을 지지하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 주지되어 있다. 상기와 같은 세포를 특정한 발현 벡터로 적합하게 형질감염시키거나 형질도입시킬 수 있으며 다량의 벡터 함유 세포를 대규모 발효기의 시딩을 위해 증식시켜 임상용으로 충분한 양의 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 수득할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 또는 다양한 진핵생물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드를, 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우, 세균 중에 생성할 수 있다. 발현 후에, 상기 폴리펩티드를 용액 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다. 원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모, 예를 들어 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드를 생산하는 진균 및 효모 균주가 폴리펩티드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)], 및 문헌[Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)] 참조.
(글리코실화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다. 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 US 5,959,177, US　6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US　6,417,429(트랜스제닉 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES: 상표명) 기술을 개시한다) 참조. 척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 현탁액에서 증식시키기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 아기 햄스터 신장세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들어 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(VERO-76), 인간 경부암종 세포(HELA), 개 신장세포(MDCK), 버팔로 래트 간세포(BRL 3A), 인간 폐세포(W138), 인간 간세포(Hep G2), 마우스 유방 종양세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들어 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은), MRC 5 세포, 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 dhfr- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예를 들어 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0를 포함한다. 단백질 생산에 적합한 몇몇 포유동물 숙주 세포주의 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)] 참조. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어 단지 몇 개를 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포뿐만 아니라, 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포들을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배신장(HEK) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
상기 시스템에서 외부 유전자를 발현하기 위한 표준 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 항체와 같은 항원 결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드를, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 모두 갖는 항체이도록 상기 항체쇄의 다른 하나를 또한 발현시키기 위해 조작할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 생성 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본원에 제공된 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 임의적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배지)로부터 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 회수함을 포함한다.
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자(또는 항체)의 성분을 유전자에 의해 서로 융합시킬 수 있다. 상기 이중특이성 항원 결합 분자를, 그의 성분이 서로 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계할 수 있다. 상기 링커의 조성 및 길이는 당해 분야에 주지된 방법에 따라 결정될 수 있으며 효능에 대해 시험될 수 있다. 이중특이성 항원 결합 분자의 상이한 성분들간의 링커 서열의 예를 본원에 제공한다. 추가의 서열을 또한 포함시켜, 목적하는 경우 상기 융합의 개별적인 성분, 예를 들어 엔도펩티다제 인식 서열을 분리시키는 절단 부위를 통합시킬 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자는 일반적으로 적어도 항원 결정인자에 결합할 수 있는 항체 가변부를 포함한다. 가변부는 천연 또는 비천연 항체 및 그의 단편의 부분을 형성하고 상기로부터 유래될 수 있다. 다클론 항체 및 단클론 항체의 생성 방법은 당해 분야에 주지되어 있다(예를 들어 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참고). 비천연 항체를 고상 펩티드 합성을 사용하여 구성하거나, 재조합적으로 생성하거나(예를 들어 US 4,186,567에 기재된 바와 같이), 예를 들어 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합적 라이브러리를 선별함으로써 수득할 수 있다(예를 들어 US 5,969,108(맥케퍼티(McCafferty)) 참고).
항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변부의 임의의 동물 종을 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자에 사용할 수 있다. 본 발명에 유용한 비제한적인 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변부는 쥐, 영장류, 또는 인간 기원일 수 있다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가 인간용인 경우, 항체의 키메릭 형태를 사용할 수 있으며, 여기에서 상기 항체의 불변부는 인간으로부터이다. 상기 항체의 인간화된 형태 또는 완전한 인간 형태를 또한 당해 분야에 주지된 방법에 따라 제조할 수 있다(예를 들어 US 5,565,332(윈터(Winter)) 참고). 인간화를 다양한 방법들, 예를 들어 비제한적으로 (a) 비-인간(예를 들어 공여 항체) CDR을 중요한 프레임워크 잔기(예를 들어 양호한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능의 유지에 중요한 것들)의 유지와 함께 또는 상기 유지 없이 인간(예를 들어 수용 항체) 프레임워크 및 불변부상에 접목시키거나, (b) 오직 비-인간 특이성-결정부(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)만을 인간 프레임워크 및 불변부상에 접목시키거나, (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 상기를 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 섹션으로 "은폐"시킴으로써 성취할 수 있다. 인간화된 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에 리뷰되어 있으며, 예를 들어 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321 및 US 7,087,409; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)](특이성 결정부(SDR) 이식을 기재한다); 문헌[Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)]("재표면화"를 기재한다)]; 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 기재한다)]; 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)] 및 문헌[Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)](FR 셔플링으로의 "유도된 선택" 접근을 개시함)에 추가로 기재되어 있다. 인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 "최적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Sims et al., J. Immunol. 151:2296(1993)] 참고); 경쇄 또는 중쇄 가변부의 특정한 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285(1992)]; 및 문헌[Presta et al., J. Immunol. 151:2623(1993)] 참고); 인간 성숙한(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포주열 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)] 참고); 및 선별 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684(1997)] 및 문헌[Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618(1996)] 참고)을 포함한다.
인간 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 기법들을 사용하여 생성할 수 있다. 인간 항체는 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)] 및 문헌[Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 일반적으로 기재되어 있다. 인간 항체를, 항원 공격에 응답하여 인간 가변부를 갖는 완전 항체 또는 완전한 인간 항체를 생산하도록 변형시킨 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 상기와 같은 동물은 전형적으로 인간 면역글로불린 유전자좌(상기는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나, 염색체외에 존재하거나, 동물의 염색체내로 무작위로 통합된다)의 전부 또는 일부를 함유한다. 상기와 같은 트랜스제닉 마우스에서, 상기 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법들에 대한 리뷰에 대해서, 문헌[Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)] 참조. 또한 예를 들어 US 6,075,181 및 US 6,150,584(제노마우스(XENOMOUSE: 상표명) 기술을 기재한다); US 5,770,429(HuMab(등록상표) 기술을 기재한다); US 7,041,870(K-M 마우스(K-M MOUSE: 등록상표) 기술을 기재한다) 및 US 2007/0061900(벨로시마우스(VelociMouse: 등록상표) 기술을 기재한다) 참조. 상기와 같은 동물에 의해 생성된 완전 항체로부터의 인간 가변부를 예를 들어 상이한 인간 불변부와 병용함으로써 추가로 변형시킬 수 있다.
인간 항체를 또한 하이브리도마-기재 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되었다(예를 들어 문헌[Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 문헌[Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참고). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가적인 방법들은 예를 들어 US 7,189,826(하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생산을 기재한다) 및 문헌[Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)](인간-인간 하이브리도마를 기재한다)에 기재된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트라이오마 기술)이 또한 문헌[Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)] 및 문헌[Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체를 또한 본원에 기재된 바와 같이, 인간 항체 라이브러리로부터 단리에 의해 생성할 수 있다.
본 발명에 유용한 항체를 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합적 라이브리러를 선별함으로써 단리시킬 수 있다. 조합적 라이브러리의 선별 방법이 예를 들어 문헌[Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 (2016)]에 리뷰되어 있다. 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리의 생성 및 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대한 상기와 같은 라이브러리의 선별에 대한 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 방법은 예를 들어 문헌[Frenzel et al. in mAbs 8:1177-1194 (2016)]; 문헌[Bazan et al. in Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012)] 및 문헌[Zhao et al. in Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)]뿐만 아니라 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)] 및 문헌[Marks and Bradbury in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]에 리뷰되어 있다.
몇몇 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리를 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝시키고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합시키며, 이어서 이를 문헌[Winter et al., Annual Review of Immunology, 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별할 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 나타낸다. 면역된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마의 구성 요구 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 한편으로, 미경험 레퍼토리를 문헌[Griffiths et al., EMBO Journal 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 클로닝시켜(예를 들어 인간으로부터) 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기-항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 미경험 라이브러리를 또한, 문헌[Hoogenboom and Winter, Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 조각을 클로닝시키고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고가변성 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 수행함으로써 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는 예를 들어 하기를 포함한다: US 5,750,373; US 7,985,840; US 7,785,903 및 US 8,679,490뿐만 아니라 US 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 및 2007/0292936을 포함한다. 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합적 라이브러리의 선별에 대해 당해 분야에 공지된 방법의 추가적인 예는 리보솜 및 mRNA 디스플레이뿐만 아니라, 세균, 포유동물 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포상에서의 항체 디스플레이 및 선택 방법을 포함한다. 효모 표면 디스플레이에 대한 방법은 예를 들어 문헌[Scholler et al. in Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012)] 및 문헌[Cherf et al. in Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015)]뿐만 아니라 문헌[Zhao et al. in Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)]에 리뷰되어 있다. 리보솜 디스플레이에 대한 방법은 예를 들어 문헌[He et al. in Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997)] 및 문헌[Hanes et al. in PNAS 94:4937-4942 (1997)]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 젤 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다. 특정 단백질의 정제에 사용되는 실제 조건은 부분적으로, 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 의존할 것이며, 이는 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 친화도 크로마토그래피 정제를 위해서 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 친화도 크로마토그래피 정제를 위해서, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 기질을 사용할 수 있다. 연속적인 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 필수적으로 실시예에 기재된 바와 같이 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 단리할 수 있다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 순도를 젤 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함한 임의의 다양한 주지된 분석 방법들에 의해 측정할 수 있다.
조성물, 제형화 및 투여 경로
추가의 양태에서, 본 발명은 예를 들어 하기의 치료 방법들 중 어느 하나에 사용하기 위한, 본원에 제공된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 중 어느 하나를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 중 어느 하나 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또다른 양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 중 어느 하나 및 예를 들어 하기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 생체내에서 투여에 적합한 형태로 생성하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 (a) 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 수득하고, (b) 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체와 제형화함을 포함하며, 이에 의해 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 제제를 생체내 투여를 위해 제형화한다.
본 발명의 약학 조성물은 치료 효과량의, 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되거나 분산된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함한다. "약학적으로 또는 약물학적으로 허용가능한"이란 어구는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉 적합한 대로 동물, 예를 들어 인간에게 투여시 불리하거나, 알러지성이거나 다른 부적합한 반응을 생성하지 않는 분자 존재 및 조성물을 지칭한다. 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 및 임의적으로 추가적인 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제제는 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 예시된 바와 같이, 본원에 비추어 당해 분야의 숙련가들에게 공지될 것이다. 더욱이, 동물(예를 들어 인간) 투여를 위해서, 제제는 FDA 생물 표준 관청 또는 다른 국가의 상응하는 당국에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지된 바와 같은 모든 용매, 완충제, 분산 배지, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들어 항균제, 항진균제), 등장성제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 산화방지제, 단백질, 약물, 약물 안정제, 중합체, 젤, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 상기와 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함한다(예를 들어 본원에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참고). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 상용성이지 않은 한을 제외하고, 상기 치료 또는 약학 조성물에서의 그의 용도가 고려된다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(및 임의의 추가적인 치료제)를 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 폐내, 및 비내에 의해, 및 경우에 따라 국소 치료, 병변내 투여를 위해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 부분적으로 투여가 짧은지 또는 만성적인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다.
비경구 조성물은 주사에 의해, 예를 들어 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의해 투여하기 위해 설계된 것들을 포함한다. 주사용으로, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충제, 예를 들어 행크 용액, 링거액, 또는 생리식염수 완충제 중에서 제형화할 수 있다. 상기 용액은 제형화제, 예를 들어 현탁, 안정화 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 한편으로, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자는 사용전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열성 물질 제거수로 조성되는 분말 형태 중에 존재할 수 있다. 멸균 주사액은 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 필요에 따라, 하기에 열거되는 다양한 다른 성분들과 함께 적합한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 배지 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액, 현탁액 또는 유화액의 제조에 사용하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균-여과된 액체 배지로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공하는 진공-건조 또는 동결-건조이다. 상기 액체 배지를 필요한 경우 적합하게 완충시켜야 하며 상기 액체 희석제를 주사전에 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성으로 만들어야 한다. 상기 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 안정해야 하며, 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염을, 예를 들어 0.5 ng/㎎ 단백질 미만의 안전 수준에서 최소로 유지시켜야 함을 알 것이다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 상기 현탁액의 점도를 개선시키는 화합물, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하도록 상기 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제를 함유할 수 있다. 추가로, 상기 활성 화합물의 현탁액을 적합한 대로 유성 주사 현탁액으로서 제조할 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어 에틸 클리에이트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다.
활성 성분을 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 거대유화액 중의 각각의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 서방성 제제를 제조할 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다. 특정 양태에서, 주사성 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합의 사용에 의해 발생될 수 있다.
앞서 기재된 조성물들 외에, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 또한 데포 제제로서 제형화할 수 있다. 상기와 같은 장기간 작용하는 제형은 이식(예를 들어 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들어 허용가능한 오일 중의 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지와, 또는 드물게 용해성인 유도체, 예를 들어 드물게 용해성인 염으로서 제형화할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포집 또는 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다. 약학 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 상기 단백질의, 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화할 수 있다. 적합한 제형화는 선택된 투여 경로에 따라 변한다.
상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 유리산 또는 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 상기 유리산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 유지시키는 염이다. 상기는 산 부가염, 예를 들어 단백질성 조성물의 유리 아미노기와 형성되거나 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산 또는 만델산과 같은 유기산과 형성되는 것들을 포함한다. 유리 카복실기와 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물; 또는 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매 중에서 더 용해성으로 되는 성향이 있다.
치료 방법 및 조성물
본 발명에 제공된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 중 어느 하나를 치료 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를, 예를 들어 암의 치료에 면역요법제로서 사용할 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 양호한 의학적 실행과 일관되는 방식으로 제형화하고, 복용시키고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개체 환자의 임상적 조건, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다.
하나의 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 추가의 양태에서, 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 일부 양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 질병이 있는 개체에게 치료 효과량의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 투여함을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 치료되는 질병은 증식성 질환이다. 특정 양태에서 상기 질병은 암이다. 일부 양태에서 상기 방법은 상기 개체에게 치료 효과량의 적어도 하나의 추가적인 치료제, 예를 들어 상기 치료되는 질병이 암인 경우 항암제를 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 효과량의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 투여하여 표적 세포의 용해를 유도함을 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에 사용하기 위한 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 상기 양태 중 어느 하나에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 조제에서 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 용도를 제공한다. 하나의 양태에서 상기 약제는 질병의 치료가 필요한 개체에서 상기 질병을 치료하기 위한 것이다. 추가의 양태에서, 상기 약제는 질병이 있는 개체에게 치료 효과량의 상기 약제를 투여함을 포함하는 상기 질병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 양태에서 상기 치료되는 질병은 증식성 질환이다. 특정 양태에서 상기 질병은 암이다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 개체에게 치료 효과량의 적어도 하나의 추가적인 치료제, 예를 들어 상기 치료되는 질병이 암인 경우 항암제를 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 양태에서, 상기 약제는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 것이다. 더욱 추가의 양태에서, 상기 약제는 개체에게 효과량의 상기 약제를 투여하여 표적 세포의 용해를 유도함을 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 양태 중 어느 하나에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 질병의 치료 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 상기와 같은 질병을 갖는 개체에게 치료 효과량의 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 투여함을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 약학적으로 허용가능한 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 일부 양태에서, 상기 치료되는 질병은 증식성 질환이다. 특정 양태에서 상기 질병은 암이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 개체에게 치료 효과량의 적어도 하나의 추가적인 치료제, 예를 들어 상기 치료되는 질병이 암인 경우 항암제를 투여함을 추가로 포함한다. 상기 양태 중 어느 하나에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서 상기 방법은 표적 세포를 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재하에서 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자와 접촉시킴을 포함한다. 추가의 양태에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 상기와 같은 양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 효과량의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 투여하여 표적 세포의 용해를 유도함을 포함한다. 하나의 양태에서, "개체"는 인간이다.
일부 양태에서, 상기 치료되는 질병은 증식성 질환, 특히 암이다. 암의 비제한적인 예는 혈액암, 예컨대 백혈병, 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 담관암, 갑상선암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 피부암, 편평상피세포 암종, 육종, 골암, 및 신장암을 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 사용하여 치료될 수 있는 다른 세포 증식 질환은 비제한적으로 복부, 골, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역 및 비뇨생식계 중에 위치한 종양을 포함한다. 또한 전암성 상태 또는 병변 및 암 전이가 포함된다. 일부 양태에서, 상기 암은 혈액암(예컨대 백혈병), 신장암, 방광암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암, 두경부암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 양태에서, 상기 암은 혈액암, 특히 백혈병, 가장 특히 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)이다. 당업자는 다수의 사례에서 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가 치유를 제공하는 것이 아니라 단지 부분적인 이점을 제공할 수 있음을 인지한다. 일부 양태에서, 일부 이점을 갖는 생리학적 변화도 또한 치료학적으로 이로운 것으로 간주된다. 따라서, 일부 양태에서, 생리학적 변화를 제공하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"으로 간주된다. 치료가 필요한 피실험자, 환자 또는 개체는 전형적으로 포유동물, 보다 특히 인간이다.
일부 양태에서, 효과량의 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 세포에 투여한다. 다른 양태에서, 치료 효과량의 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 질병의 치료를 위해 개체에게 투여한다.
질병의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 적합한 투여량(단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질병의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 유형, 상기 질병의 중증도 및 과정, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가 예방 또는 치료 목적으로 사용되는지의 여부, 선행 또는 동반 치료법, 환자의 임상 병력 및 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변할 것이다. 투여를 담당하는 의사는 어쨌든 조성물 중의 활성 성분의 농도 및 개체 피실험자에게 적합한 용량을 결정할 것이다. 비제한적으로 단일 또는 다양한 시점에 걸친 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여한다. 상기 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가, 예를 들어 1회 이상의 분리 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 간에, 상기 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 임의의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여를 위해서, 상기 조건에 따라, 상기 치료를 일반적으로는 질병 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속할 수 있다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.005 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 다른 비제한적인 예에서, 하나의 용량은 또한 약 1 μg/㎏ 체중, 약 5 μg/㎏ 체중, 약 10 μg/㎏ 체중, 약 50 μg/㎏ 체중, 약 100 μg/㎏ 체중, 약 200 μg/㎏ 체중, 약 350 μg/㎏ 체중, 약 500 μg/㎏ 체중, 약 1 mg/㎏ 체중, 약 5 mg/㎏ 체중, 약 10 mg/㎏ 체중, 약 50 mg/㎏ 체중, 약 100 mg/㎏ 체중, 약 200 mg/㎏ 체중, 약 350 mg/㎏ 체중, 약 500 mg/㎏ 체중, 내지 약 1000 ㎎/㎏ 체중 이상, 및 상기 중에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 나열된 숫자로부터 유도될 수 있는 범위의 비제한적인 예에서, 약 5 ㎎/㎏ 체중 내지 약 100 ㎎/㎏ 체중, 약 5 μg/㎏ 체중 내지 약 500 mg/㎏ 체중 등을 상술한 숫자를 근거로 투여할 수 있다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 5.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어 상기 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 수령하도록) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 투여량 섭생도 유용할 수 있다. 상기 치료법의 진행을 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터한다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 일반적으로는 의도하는 목적을 성취하기에 유효한 양으로 사용할 것이다. 질병 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위해서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자, 또는 그의 약학 조성물을 치료 효과량으로 투여하거나 적용시킨다. 치료 효과량의 측정은 특히 본원에 제공된 상세한 설명에 비추어 충분히 당해 분야의 숙련가들의 능력내에 있다.
전신 투여를 위해서, 치료 유효 용량을 초기에 시험관내 분석, 예를 들어 세포 배양 분석으로부터 추정할 수 있다. 이어서 1회 용량을 동물 모델에서 제형화하여 세포 배양물에서 측정된 바와 같은 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 성취할 수 있다. 상기와 같은 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 측정할 수 있다.
초기 투여량을 또한 생체내 데이터, 예를 들어 동물 모델로부터, 당해 분야에 주지된 기법을 사용하여 추정할 수 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 동물 데이터를 기준으로 인간에 대한 투여를 쉽게 최적화할 수 있다.
투여량 및 투여 간격을, 치료 효과를 유지시키기에 충분한 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 혈장 수준을 제공하도록 개별적으로 조절할 수 있다. 주사에 의한 투여에 유용한 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 ㎎/㎏/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 ㎎/㎏/일의 범위이다. 치료학적으로 유효한 혈장 수준은 매일 수회 용량의 투여에 의해 성취될 수 있다. 혈장 중 수준을 예를 들어 HPLC에 의해 측정할 수 있다.
국소 투여 또는 선택적인 흡수의 경우에, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련될 수 없다. 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험 없이 치료학적으로 유효한 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 치료 효과량은 일반적으로, 실질적인 독성을 유발시키지 않으면서 치료학적 이점을 제공할 것이다. 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 독성 및 치료 효능을 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 과정에 의해 측정할 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구를 사용하여 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)을 측정할 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량비는 치료 지수이며, 이를 LD50/ED50 비로서 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가 바람직하다. 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 획득된 데이터를 인간에 사용하기에 적합한 투여량 범위를 공식화하는데 사용할 수 있다. 상기 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위내에 있다. 상기 투여량은 다양한 인자들, 예를 들어 사용되는 투여형, 사용되는 투여 경로, 피실험자의 조건 등에 따라 상기 범위내에서 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 조건에 비추어 개별 의사가 선택할 수 있다(예를 들어 문헌[Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다) 참고).
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자로 치료되는 환자의 주치의는 독성, 기관 기능이상 등으로 인해 언제, 어떻게 투여를 종료, 중단 또는 조절해야 하는지를 알 것이다. 환언하면, 상기 주치의는 임상 반응이 적합하지 않은 경우 치료를 보다 높은 수준으로 조절해야 함을 또한 알 것이다(독성 제외). 관심 질환의 관리에서 투여되는 용량의 크기는 치료되는 상태의 중증도, 투여 경로 등에 따라 변할 것이다. 상기 상태의 중증도를 예를 들어 부분적으로 표준 예후 평가 방법에 의해 평가할 수 있다. 더욱이, 용량 및 추정상 용량 빈도가 또한 개별적인 환자의 연령, 체중, 및 응답에 따라 변할 것이다.
다른 작용제 및 치료
본 발명의 항체 및 이중특이성 항원 결합 분자를 치료법에서 하나 이상의 다른 작용제와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공-투여할 수 있다. "치료제"란 용어는 치료가 필요한 개체에서 증상 또는 질병을 치료하기 위해 투여될 수 있는 임의의 작용제를 포함한다. 상기와 같은 추가적인 치료제는 치료되는 특정한 적응증에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 추가적인 치료제는 면역조절제, 세포성장억제제, 세포 부착의 억제제, 세포독성제, 세포사멸의 활성제, 또는 세포사멸 유도제에 대한 세포의 감수성을 증가시키는 작용제이다. 특정 양태에서, 상기 추가적인 치료제는 항암제, 예를 들어 미세소관 붕괴제, 대사길항물질, 국소이성화효소 억제제, DNA 삽입제, 알킬화제, 호르몬요법, 키나제 억제제, 수용체 길항물질, 종양세포 세포사멸의 활성제, 또는 혈관형성방지제이다.
상기와 같은 다른 작용제들은 적합하게는 의도된 목적에 유효한 양으로 함께 존재한다. 상기와 같은 다른 작용제의 효과량은 사용되는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 양, 질환 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자들에 따라 다르다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 일반적으로는 동일한 투여량으로, 본원에 기재된 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 경험상/임상적으로 적합한 것으로 판정되는 임의의 경로에 의해 사용한다.
상기에 나타낸 상기와 같은 복합 요법은 병행 투여(2개 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 조성물 중에 포함되는 경우) 및 분리된 투여(이 경우 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 투여는 상기 추가적인 치료제 및/또는 보조제의 투여 전, 상기 투여와 동시에, 및/또는 상기 투여에 이어서 발생할 수 있다)를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 또한 방사선요법과 함께 사용할 수 있다.
제조 물품
본 발명의 또다른 양태에서, 상술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 상기 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또다른 조성물과 함께 유지하며 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자이다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택 상태의 치료에 사용됨을 가리킨다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 조성물이 함유된 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함한다); 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 양태에서 제조 물품은 상기 조성물을 사용하여 특정 상태를 치료할 수 있음을 가리키는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
일부 양태에서, 본원에 제공된 항 HLA-A2/WT1 항체 중 어느 하나는 생물학적 샘플 중 HLA-A2/WT1의 존재를 검출하기에 유용하다. 본원에 사용되는 바와 같은 "검출"이란 용어는 정량적인 또는 정성적인 검출을 포함한다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어 전립선 조직을 포함한다.
하나의 양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항 HLA-A2/WT1 항체를 제공한다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플 중의 HLA-A2/WT1의 존재의 검출 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항 HLA-A2/WT1 항체와, HLA-A2/WT1에 대한 상기 항 HLA-A2/WT1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 접촉시키고, 상기 항 HLA-A2/WT1 항체와 HLA-A2/WT1 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출함을 포함한다. 상기와 같은 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 양태에서, 항 HLA-A2/WT1 항체를 사용하여 항 HLA-A2/WT1 항체에 의한 치료법이 가능한(예를 들어 HLA-A2/WT1이 환자의 선택을 위한 생물마커인 경우) 환자를 선택한다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 질환은 암, 특히 전립선암을 포함한다.
일부 양태에서, 표지된 항 HLA-A2/WT1 항체를 제공한다. 표지는 비제한적으로 직접적으로 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어 형광, 발색성, 전자-밀도, 화학발광, 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 간접적으로, 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 부분, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함한다. 예시적인 표지는 비제한적으로 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예를 들어 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 세균 루시페라제(US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 과산화 수소를 사용하여 염료 전구체, 예를 들어 HRP를 산화시키는 효소와 결합된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로페녹시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제시된 일반적인 설명을 근거로 다양한 다른 양태들이 실시될 수 있음이 이해된다.
실시예 1. HLA-A2/WT1에 대한 Fab 결합제의 생성
항 HLA-A2/WT1 Fab의 선택 및 선별
항-HLA-A2/WT1 Fab를 VL 도메인(3개의 상이한 길이) 및 VH 도메인(6개의 상이한 길이)의 CDR3에서의 서열 다양성을 갖는 전체 인간 프레임워크를 기반으로 한 합성 Fab 라이브러리로부터 파지 디스플레이에 의해 선택하였다.
선택 회차들(rounds)(바이오패닝(biopanning))을 용액에서 하기 프로토콜에 따라 수행하였다:
1. 뉴크라비딘으로 코팅된 96 웰 플레이트(비관련 비오틴일화 HLA-A2/WT1VLD 복합체(500 nM)로 코팅됨) 상의 라이브러리 풀(pool)당 약 1012개의 파지미드 입자의 사전-클리어링(pre-clearing);
2. 800 μL의 총 부피로 0.5시간 동안, 100 nM 비오틴일화 HLA-A2/WT1RMF 복합체를 갖는 비-HLA-A2/WT1VLD-결합 파지미드 입자의 항온배양;
3. 진탕기 상에서 20분 동안, 80 μL의 스트렙타비딘으로 코팅된 자성 입자를 첨가함에 의한 비오틴일화 HLA-A2/WT1RMF 복합체 및 특이적으로 결합하는 파지의 포획;
4. 자성 입자 분리기를 사용하여 각각의 자성 입자를 PBS/트윈 20(1 mL)으로 5 내지 10회 및 PBS(1 mL)로 5 내지 10회 세척;
5. 5 내지 10분 동안 100 mM 트라이에틸아민(TEA)(1 mL)의 첨가에 의한 파지 입자의 용리 및 절반 부피의 1 M Tris/HCl pH 7.4의 첨가에 의한 중화;
6. 용리된 파지 입자에 의한 로그-상(log-phase) 대장균 TG1 세포의 재감염, 헬퍼파지 VCSM13에 의한 감염, 밤새 30℃에서 진탕기에서 항온배양에 이어서, 후속 선택 회차에 사용될 파지미드의 PEG/NaCl 침전.
100 nM의 일정한 항원 농도를 사용하여 3 내지 4회차에 걸쳐 선택을 수행하였다.
더 낮은 친화도를 갖는 항체를 선택하기 위해, 일정한 항원 농도에 의한 선택 작업 이외에도, 100 nM, 50 nM, 10 nM 및 5 nM로 항원 농도를 감소시켜 추가의 선택 작업을 수행하였다.
HLA-A2/WT1 결합 분석: 파지 디스플레이에 의해 수득된 Fab의 특성규명을 위한 샌드위치 ELISA
개별 클론을 96 웰 형식의 1 mL의 배양액으로서 박테리아 발현시키고, 상청액을 ELISA에 의한 선별을 위해 사용하였다. 특이적 결합제를 HLA-A2/WT1RMF에 대한 기준의 5배보다 높은 신호 및 HLA-A2/WT1VLD에 대한 기준의 3배보다 낮은 신호를 갖는 것으로서 정의하였다. 보다 정밀하게는, 뉴트라비딘 96웰 스트립 플레이트(서모 피셔(Thermo Fisher))를 10 nM HLA-A2/WT1RMF 또는 50 nM HLA-A2/WT1VLD로 37℃에서 30분 동안 코팅한 후, 2%(w/v) 밀크-포스페이트-완충된 염수(MPBS)(200 μL/웰)로 플레이트를 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 상기 플레이트를 PBS로 3회 세척한 후, Fab를 함유하는 박테리아 상청액을 첨가하고, 상기 판을 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. PBS에 의한 또다른 3개의 세척 단계 후, 항 FLAG-HRP 2차 항체(시그마(Sigma), Cat. No. A8592)(1:4000)를 첨가하고, 플레이트를 진탕기에서 1시간 동안 실온으로 항온배양하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고 100 μL/웰 BM 블루 POD(Blue POD)(로슈(Roche))를 첨가하여 진행시켰다. 효소 반응을 50 μL/웰 1 M H2SO4를 첨가함으로써 정지시켰다. OD를 OD450-650의 최종 판독에 대해 450 nm(650 nm에서 참고)에서 판독하였다. ELISA-양성 클론을 후술된 동력학 선별 실험에 사용하였다.
HLA-A2/WT1 결합 분석: 파지 디스플레이에 의해 수득된 Fab의 동력학적 특성규명을 위한 표면 플라즈몬 공명
특이적 결합제를 프로테온 XPR36 바이오센서(바이오라드)를 사용하여 Fab-함유 박테리아 배양액의 표면 플라즈몬 공명-선별에 의해 동정하였다. 요약하면, 로그-상 대장균 TG1 세포를 용리된 파지 입자로 감염시킨 후, 96-심형(deep) 웰 플레이트에서 단일 콜로니 형성 단위(cfu)를 플레이팅하고 1 mL의 발현 배양액의 접종을 위해 선발하였다.
모든 실험을 전개 완충액(10 mM PBS, pH 7.4 및 0.005%(v/v) 트윈 20)으로서 PBST를 사용하여 25℃에서 수행하였다. GLC 및 GLM 센서 칩이 장착된 프로테온 XPR36 바이오센서 및 커플링 시약(10 mM 나트륨 아세테이트 pH 4.5, 설포-N-하이드록시숙신이미드[설포-NHS], 1-에틸-3-(3-다이메틸아민프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드[EDC] 및 에탄올아민)(바이오라드 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 허큘리스)로부터 입수)을 사용하였다.
부동화를 GLM 칩 상에서 30 μL/분으로 수행하였다. p(Ab) 염소 항 인간 IgG, F(ab)2 이중특이성 항체(잭슨 이뮤노리서치)를 하기 표준적인 아민-커플링 절차를 사용하여 수직 방향으로 커플링시켰다: 모든 6개의 리간드 채널을 EDC(200 mM)와 설포-NHS(50 mM)의 혼합물에 의해 5분 동안 활성화시켰다. 표면 활성화 직후, p(Ab) 염소 항 인간 IgG, F(ab)2 이중특이성 항체(50 μg/mL, 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 5)를 모든 6개의 채널에 5분 동안 주입하였다. 최종적으로, 채널을 1 M 에탄올아민-HCl(pH 8.5)을 5분 동안 주입함에 의해 차단하였다. 최종 부동화 수준은 11000 내지 11500 RU로 모든 채널에서 동일하였다. 5개의 개별 수평 채널에 5분 동안 동시적 주입(30 μL/분)에 의해 Fab 변이체를 대장균 상청액으로부터 포획하고 상청액 중 Fab 농도에 따라 200 내지 900 RU 수준을 수득하였다. 조건화된 배지를 6개의 채널에 주입하여 이중 참조를 위한 '인-라인' 대조군을 생성하였다. 수직 채널에 2분 동안 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD(100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 nM, 50 μL/분)의 연속 희석액의 주입에 의해 1회 동력학 측정을 수행하였다. 해리를 3분 동안 감시하였다. 동력학 데이터를 프로테온 매니저 v. 2.1에서 분석하였다. 반응 지점 데이터의 처리에는 지점간-참조 및 인-라인 완충 대조군을 사용한 이중-참조를 사용하였다(문헌[Myszka, J Mol Recognit (1999) 12, 279-284]). 질량 이동 없이 반복 1회 주입으로부터 처리된 데이터를 단순 1:1 랭뮤어 맹검 모델에 근사하였다(문헌[O'Shannessy et al., Anal Biochem (1993) 212, 457-468]).
6 웰 형식의 HEK의 상청액으로부터 IgG의 측정을 위해, 5개의 개별 수평 채널에 5분 동안 동시적 주입(30 μL/분)에 의해 IgG 변이체를 HEK293 상청액으로부터 포획하고 200 내지 400 RU 수준을 수득하였다. 조건화된 배지를 6개의 채널에 주입하여 이중 참조를 위한 '인-라인' 대조군을 생성하였다. 수직 채널에 2분 동안 HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD(100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 nM, 50 μL/분)의 연속 희석액의 주입에 의해 1회 동력학 측정을 수행하였다. 해리를 5분 동안 감시하였다.
항원에 대한 결합 프로파일 및 측정된 특이성을 바탕으로, 결합제를 요약정리하고 세포 결합 분석으로 측정하였다.
모든 선택된 결합제 서열(11D06, 33H09, 13B04, 11B09, 33F05, 5E11, 13E08, 5C01 및 11G06)은 본원에 제시된 서열목록에 제공되고 하기 표 1에 요약되어 있다.
선택된 HLA-A2/WT1 결합체의 아미노산 서열
서열번호
결합제 HCDR1 HCDR2 HCDR3 VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 VL
11D06 1 2 3 7 4 5 6 8
33H09 9 10 11 15 12 13 14 16
13B04 17 18 19 23 20 21 22 24
11B09 25 26 27 31 28 29 30 32
33F05 33 34 35 39 36 37 38 40
5E11 41 42 43 47 44 45 46 48
13E08 49 50 51 55 52 53 54 56
5C01 57 58 59 63 60 61 62 64
11G06 65 66 67 71 68 69 70 72
실시예 2. HLA-A2/WT1 IgG 및 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체의 제조
클로닝
단백질을 암호화하는 cDNA를 통상적인(비-PCR 기반) 클로닝 기법을 사용하여 벡터 시스템(에비트리아(Evitria))에 클로닝하였다. 벡터 플라스미드를 유전자 합성하였다. 플라스미드 DNA를 음이온 교환 크로마토그래피를 기반으로 낮은 내독소 조건하에 제조하였다. DNA 농도를 260 nm의 파장에서의 흡수를 측정함으로써 측정하였다. 서열의 정확도를 생어 서열분석에 의해 확인하였다(cDNA의 크기에 따라 플라스미드당 2개 이하의 서열분석 반응).
제조
IgG 항체 및 이중특이성 항체를 HEK293 EBNA 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성하였다(익스셀(Excell) 배양 배지에서 현탁 혈청 없이 배양됨). 세포를 원심분리하고 사전-가온된 CD CHO 배지로 배지를 대체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 배지에서 혼합하고, 폴리에틸렌이민(PEI)을 첨가하고, 용액을 10분 동안 실온에서 와류 및 항온배양하였다. 이어서, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 진탕 플라스크로 옮기고 항온배양기에서 37℃, CO2 대기에서 3시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 보충제를 함유하는 익스셀 배지를 첨가하였다. 하루가 지난 후, 형질감염 보충제를 첨가하였다. 세포 상청액을 7일 후 수확하고, 표준적인 방법을 사용하여 정제하였다.
다르게는, 현탁액-적응된 CHO K1 세포(원래는 ATCC 유래이고, 현탁 배양액에서 혈청 없이 성장하도록 적응됨)를 제조에 사용하였다. 시드(seed)를 에비그로우(eviGrow) 배지(화학적으로 규정된 동물-성분 미함유, 혈청 미함유 배지)에서 성장시켰다. 세포를 에비펙트(eviFect) 형질감염 시약으로 형질감염시키고, 세포를 에미메이크2(eviMake2)(동물-성분 미함유, 혈청 미함유 배지)에서 형질감염시킨 후 성장시켰다. 상청액을 원심분리 및 후속의 여과(0.2 μm 필터)에 의해 수확하였다.
정제
표준 프로토콜을 참조하여 단백질을 여과된 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 요약하면, Fc를 함유하는 단백질을 프로틴 A(Protein A)(하이트랩(HiTrap) 프로틴 A HP 컬럼, GE 헬스케어)를 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 용리를 pH 3.0에서 성취한 직후, 샘플을 중화시켰다. 단백질을 농축하고, 응집된 단백질을 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드, pH 6.0에서 크기 배제 크로마토그래피(하이로드 슈퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 컬럼, GE 헬스케어)에 의해 단량체 단백질로부터 분리하였다.
분석
문헌[Pace et al. (Protein Science, 1995, 4, 2411-1423)]에 따른 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 정제된 단백질의 농도를 측정하였다. 단백질의 순도 및 분자량을 랩칩GXII(LabChipGXII) 시스템(칼리퍼 라이프사이언스(Caliper Lifescience))을 사용하여 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS에 의해 분석하였다. 응집 함유물의 측정을 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, pH 6.7 전개 완충액 중 평형화된 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(TSK젤 G3000 SW XL, 토소(Tosoh))을 사용하여 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행하였다.
CD3 이중특이성 항체는 본원에서 "T 세포 이중특이성 항체" 또는 "TCB"로도 지칭된다. 본 실시예에서 제조된 상기 이중특이성 항체의 계략도는 도 2에 도시되어 있다.
TCB의 예시적인 서열은 서열번호 123, 124, 125 및 129(11D06 TCB) 및 서열번호 126, 127, 128 및 129(33H09-TCB)에 제시되어 있다. 다른 TCB는 상응하는 HLA-A2/W1 결합제의 VH 및 VL 서열을 사용하여 유사한 방식으로 구축하였다.
대조군으로서, 항체 ESK1(문헌[Dao et al., Sci Transl Med (2013) 5, 176ra33]; WO2012/135854)(본원에서 "ESK1-TCB"로도 지칭됨(가변부 서열에 대해 서열번호 73 및 74 참고))과 유사한 결합제를 기반으로 한 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(TCB) 및 비표적화된 TCB(가변부 서열에 대해 서열번호 75 및 76 참고)를 제조하였다.
모든 분자를 동일한 방법에 따라 제조하고 정제하였다. 최종 품질은 CE-SDS 사응로 모든 분자에 대해 100% 단량체 함량 및 100% 순도로 매우 우수하였다.
실시예 3. HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체의 친화도 및 결합도의 생화학적 분석
HLA-A2/WT1RMF에 대한 HLA-A2/WT1 x CD3의 친화도를 측정하기 위해, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험을 25℃에서 전개 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 상청액 P20(GE 헬스케어))를 사용하여 비아코어(Biacore) T200에서 수행하였다. 항 인간 Fc-특이성 항체(GE 헬스케어, Cat. No. BR-1008-39)를 CM5 칩(GE 헬스케어)에서 아민 커플링에 의해 직접 부동화시켰다. 이중특이성 구축물을 5 nM로 30초 동안 포획하였다. HBS-EP(1.03 내지 250 nM) 중 HLA-A2/WT1RMF 복합체의 3배 연속 희석액을 30 μL/분으로 120초 동안 리간드로 이동시켜 회합 상을 기록하였다. 회합 상을 120초 동안 감시하고 샘플 용액을 HBS-EP로 전환함으로써 야기하였다. 매 주기 후, 칩 표면을 10 μL/분으로 30초 동안 3 M MgCl2의 주입을 사용하여 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이를 항 인간 Fc 항체를 함유하되 이에 포획된 이중특이성 구축물은 갖지 않는 참조 유동 세포에서 수득된 반응을 제함으로써 보정하였다. 비아에벌(BIAeval) 소프트웨어(GE 헬스케어)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 대해 근사시킴에 의해 친화도 상수를 동력학적 속도 상수로부터 유도하였다.
HLA-A2/WT1RMF에 대한 HLA-A2/WT1 x CD3의 결합도 및 특이성을 측정하기 위해, SPR 실험을 25℃에서 전개 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 상청액 P20(GE 헬스케어))를 사용하여 비아코어 T200에서 수행하였다. 항 His 항체(펜타(Penta) His, 퀴아젠(Qiagen), Cat. No. 34660)를 CM5 칩(GE 헬스케어)에서 아민 커플링에 의해 직접 부동화시켰다. HLA-A2/WT1RMF 또는 HLA-A2/WT1VLD를 5 또는 10 nM(각각 이중특이성 항체 또는 IgG 측정을 위함)로 10 μ/분으로 30초 동안 포획하였다. HBS-EP(1.23 내지 100 nM) 중 이중특이성 구축물의 3배 연속 희석액을 30 μ/L로 120초 동안 리간드로 이동시켜 회합 상을 기록하였다. 회합 상을 240초 동안 감시하고 샘플 용액을 HBS-EP로 전환함으로써 야기하였다. 매 주기 후, 칩 표면을 pH 2로 60초 동안 10 M 글리신의 주입을 사용하여 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이를 (항 His 항체를 함유하되 이에 포획된 HLA-A2/WT1RMF는 갖지 않는) 참조 유동 세포에서 수득된 반응을 제함으로써 보정하였다. 2:1의 상호작용(분석물이 2가임)이었지만, 비아에벌 소프트웨어(GE 헬스케어)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 대해 근사시킴에 의해 친화도 상수를 동력학적 속도 상수로부터 유도하였다. 이는 상기 상호작용의 결합도를 나타내는 겉보기 KD를 야기하였다.
실험의 결과를 하기 표 2에 요약하였다. 시험된 HLA-A2/WT1 항체 둘다는 두자릿수 나노몰(1가) 친화도/세자릿수 피코몰(2가) 친화도(결합도)로 HLA-A2/WT1RMF에 결합하였고 IgG로부터 이중특이성 형태로 전환될 때에도 동일한 친화도/결합도를 유지하였다. 2개의 시험된 항체의 친화도는 약 팩터(factor) 2의 차이가 있었지만, 분자 둘다의 결합도는 동일하였다.
HLA-A2/WT1VLD에 대해 시험된 HLA-A2/WT1의 결합은 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
CD3에 대한 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체의 친화도의 측정을 위해, SPR 실험을 25℃에서 전개 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 상청액 P20(GE 헬스케어))를 사용하여 비아코어 T200에서 수행하였다. 항 인간 Fab 특이성 항체(GE 헬스케어, Cat. No. 28-9583-25)를 CM5 칩(GE 헬스케어)에서 아민 커플링에 의해 직접 부동화시켰다. 상기 이중특이성 구축물을 5 nM로 40초 동안 포획하였다. HBS-EP(12.35 내지 3000 nM) 중 CD3εδ 융합 분자의 3배 연속 희석액을 30 μ/L로 240초 동안 리간드로 이동시켜 회합 상을 기록하였다. 회합 상을 240초 동안 감시하고 샘플 용액을 HBS-EP로 전환함으로써 야기하였다. 매 주기 후, 칩 표면을 pH 2.1로 30 μL/분으로 60초 동안 10 M 글리신-HCl의 이중 주입을 사용하여 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이를 (항 인간 Fab 항체를 함유하되 이에 포획된 이중특이성 구축물은 갖지 않는) 참조 유동 세포에서 수득된 반응을 제함으로써 보정하였다. 비아에벌 소프트웨어(GE 헬스케어)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 대해 근사시킴에 의해 친화도 상수를 동력학적 속도 상수로부터 유도하였다.
결과를 하기 표 3에 요약하였다. CD3 결합제는 시험된 이중특이성 분자 둘다에서 동일하였고, 예상했던 바대로 이들의 CD3에 대한 친화도는 본질적으로 동일하였다.
실시예 4. HLA-A2/WT1 펩티드 RMF 또는 VLD에 대한 이중특이성에 대한 IgG의 선택
먼저, 본 발명자들은 펩티드-부가된 T2 세포에서 유동 세포분석에 의해 파지 디스플레이로부터 생성된 IgG 결합제에 의해 결합 특이성을 분석하였다. 요약하면, 10% FBS(기브코, Cat No. 16140-071) + 1% 페니실린-스트렙토마이신(기브코, Cat No. 15070-063)으로 보충된 IMDM 배지(라이프테크놀로지스에 의한 기브코, Cat No. 31980-048)(완전 배지) 중 106 세포/mL의 세포 완충액으로서 T2 세포를 제조하였다. 세포를 튜브에 10 mL의 총 부피로 유지하고, 10-2 M(펩티드의 최종 농도: 10-5 M)의 10 μL의 펩티드(예컨대 WT1 VLD 펩티드(서열번호 77), 또는 RMF 펩티드(서열번호 78))에 의해 37℃에서 5% CO2로 2시간 동안 항온배양하였다. 세척 후, 세포를 차가운 PBS 중에 현탁시키고 4℃에서 1시간 동안 IgG 형태의 항체 적정 농도(예컨대 10 μg/mL 내지 0.00064 μg/mL)로 항온배양한 후, 2차 항 인간 IgG-Fc 피코에리트린(PE)-접합된 항체(잭슨 래버러토리스, Cat No. 109-116-098)로 30분 동안 항온배양하였다. FACS LSR II(BD)에서 세포를 획득하고, 데이터는 그래프패드 프리즘에서 PE의 평균 형광 강도(MFI)로서 제시된다.
도 3에 도시된 바와 같이, 11D06-IgG, 33H09-IgG 및 5E11-IgG 모두 RMF-펩티드 부가된 T2 세포에 결합하였지만 비부과된 또는 VLD 펩티드-부가된 T2 세포에는 결합하지 않았다. 대조적으로, 11B09-IgG, 13B04-IgG 및 5C01-IgG(11G06-IgG는 제외) 모두는 VLD 펩티드에는 특이적으로 결합하였지만 RMF 펩티드에는 특이적으로 결합하지 않았다. 상기 데이터를 근거로, CD3 이중특이성 항체(TCB)로의 전환을 위한 결합제를 선택하였다.
실시예 5. 펩티드-부가된 T2 세포에 대한 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB") 결합시 NFAT-Jurkat 리포터 분석에서 T 세포의 활성화
HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")의 특이성을 검증하기 위해, NFAT의 촉진제하에 루시퍼라제를 발현하는 리포터 세포주 Jurkat 세포(Jurkat-NFAT, 프로메가, Cat. No. CS176501)를 사용하여 TCB가 펩티드-부가된 T2 세포(ATCC, Cat. No. CRL-1992)에 결합시 T 세포의 활성화를 측정하였다. 요약하면, 10% FBS(기브코, Cat No. 16140-071) + 1% 페니실린-스트렙토마이신(기브코, Cat No. 15070-063)으로 보충된 IMDM 배지(라이크 테크놀로지스에 의한 기브코, Cat No. 31980-048)(완전 배지) 중 106 세포/mL의 세포 완충액으로서 T2 세포(ATCC, Cat. No. CRL-1992)를 제조하였다. 세포를 튜브에 10 mL의 총 부피로 유지하고, 10-2 M(펩티드의 최종 농도: 10-5 M)의 10 μL의 펩티드(WT1 p37-45 VLD 펩티드 또는 p126-134 RMF)에 의해 37℃에서 5% CO2로 2시간 동안 항온배양하였다. 세척 후, 2.2 x 105의 세포 현탁액 중 90 μL의 펩티드-부가된 세포를 96 웰 마이크로역가 둥근바닥 플레이트(20000 세포/웰, TPP, Cat. No. 92097)에 파종하고 50 μL의 Jurkat 세포(Jurkat-NFAT, 프로메가, Cat. No. CS176501)(2 x 106 세포/mL의 세포 현탁액) 및 10 μL의 적정된 이중특이성 항원 결합 분자(예컨대 PBS 중 100 μg/mL 내지 0.0064 μg/mL)와 함께 37℃, 5% CO2로 16시간 동안 동반-배양하였다. 이어서, 50 μL의 상청액을 제거하고 100 μL/웰의 브라이트-글로 루시퍼라제 에세이(프로메가, Cat. No. E2620)로 대체하여 실온(RT)에서 항온배양하였다. 5분 후, 180 μL의 상청액을 새로운 백색 플레이트로 옮겨 엔비전(퍼킨엘머)에 의해 발광 신호를 측정하였다. 데이터는 상대적 발광 단위(RLU)로서 제시된다.
도 4에 도시된 바와 같이, 11D06 및 33H09 결합제를 기반으로 하는 TCB(각각11D06-TCB 및 33H09-TCB)는 HLA-A2/WT1RMF 복합체를 특이적으로 인식하고 RMF 펩티드가 부가된 T2 세포의 존재하에서만 리포터 Jurkat 세포에서 NFAT를 활성화시킨다. 이와는 대조적으로, ESK1-유사 결합제(ESK1-TCB)를 기반으로 하는 대조군 TCB는 RMF 펩티드에 대한 특이성을 나타내지 않았다. 또한, 5E11 결합제(5E11-TCB)를 기반으로 하는 TCB는 RMF 및 VLD 펩티드-부가된 T2 세포 둘다의 존재하에 NFAT 리포터 T 세포의 활성화를 나타냈고, 이에 따라 상기 TCB는 후속 회차의 선별에서 제외하였다. 또한, 11B09 및 13B04 결합제를 기반으로 하는 것(각각 11B09-TCB 및 13B04-TCB)으로 동정된 일부 VLD 펩티드 특이성 TCB가 존재하였다. 음성 대조군으로서, 비표적화된 TCB(DP47GS-TCB)를 분석에 사용하였고, 이는 RMF 또는 VLD 펩티드-부가된 T2 세포의 존재하에 리포터 Jurkat 세포에서 NFAT를 활성화시키지 않았다. 5C01-TCB는 VLD 펩티드의 인식을 나타냈지만, RMF 펩티드와 더 높은 농도로 교차-반응하였다.
실시예 6. 펩티드-부가된 T2 세포에 대한 결합시 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")에 의해 매개되는 T 세포의 세포독성
후속으로, 본 발명자들은 TCB의 세포독성을 측정하였다. 표적 세포는 실시예 5에 기재된 바와 같은 펩티드-부가된 T2 세포였다. 효과기 세포는 피콜(GE 헬스케어, Cat. No. 17-1440-03) 구배 원심분리에 의해 연막으로부터 단리된 PBMC로부터 정제된 pan CD3+ 세포였다. 인간 pan T 세포 단리 키트(밀테나이 바이오텍, Cat. No. 130-096-535)를 사용하여, 전체 CD3+ T 세포를 MACS(밀테나이 바이오텍)에 의해 정제하였다. 세포독성 분석을 하기와 같이 수행하였다: 펩티드-부가된 세포(100 μL)를 96 웰 마이크로역가 둥근바닥 플레이트(3 x 105 세포/mL)에 파종하고, 37℃, 5% CO2로 18시간 동안 완전 배지에서, 50 μL의 T 세포(6 x 106 세포/mL) 및 50 μL의 적정된 이중특이성 항원 결합 분자(예컨대 40 μg/mL 내지 0.00004 μg/mL)와 함께 동반-배양한다. 이어서, 50 μL의 상청액을 새로운 백색 플레이트로 옮기고, 25 μL/웰로 사이토톡스-글로 루시퍼라제 에세이(프로메가, Cat. No. G9291)를 첨가하여 실온(RT)에서 15분 동안 항온배양한다. 형광 신호(세포 사멸의 지표로서 LDH 방출의 측정을 위함)를 엔비전(퍼킨엘머)에 의해 판독한다. 데이터를 상대적 발광 단위(RLU)로서 제시한다.
도 5는 TCB-매개된 RMF 또는 VLD 발현 표적 세포의 특이적 T 세포 사살을 도시한 것이다. 본 발명자들은 11D06-TCB 및 33H09-TCB 둘다가 RMF 펩티드-부가된 T2 세포에서 특이적 사살을 나타냄을 발견하였다. 33F05-TCB는 RMF 또는 VLD 펩티드-부가된 세포의 특이적 사살을 매개하지 않았다. 또한, 13B04-TCB 및 11B09-TCB는 VLD 펩티드-부가된 T2 세포에서 효능있는 사살을 매개하였다. 5C01-TCB는 VLD-부가된 T2 세포의 사살을 나타냈지만, 더 높은 농도로 RMF-부가된 세포의 사살도 나타냈고, 이는 NFAT 리포터 분석에서의 관찰과 일관되었다(도 4).
실시예 7. WT1 + 세포주에 대한 결합시 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")에 의해 매개되는 T 세포의 세포독성
TCB에 의한 특이적 사살을 확인하기 위해, 본 발명자들은 WT1+ 종양 세포주에서 세포독성 분석을 수행하였다. HLA-A2+WT1+ 세포주는 SKM-1 세포(DZMZ No. ACC 547), 및 HLA-A2/WT1RMF 복합체로 형질감염된 CHO 세포(CHO-WT1)(내수(in-house))였다. 음성 대조군은 HLA-A2+WT1- 세포: BJAB(DZMZ No. ACC 757), ARH-77(DZMZ No. ACC 512), 및 HLA-A2/MAGE-A4 복합체로 형질감염된 CHO 세포(CHO-MAGEA4)(내수), 및 HLA-A2-WT1+ 세포주: K562(ATCC No. CLL-243)였다(도 6의 A). 세포독성 분석을 실시예 6에 기재한 바와 같이 수행하였다. 11D06-TCB 및 33H09-TCB 둘다는 SKM-1 및 CHO-WT1 세포에서 효능있는 사살을 나타냈지만, 임의의 HLA-A2+WT1- 세포 및 HLA-A2-WT1+ 세포에서는 효능있는 사살을 나타내지 않았고, 이는 상기 2개의 TCB가 WT1 펩티드 RMF에 대한 특이성을 가짐을 나타낸다(도 6의 B 및 C). 이와는 대조적으로, VLD 펩티드 특이성 TCB는 HLA-A2+WT1+ 세포주에 대한 사살을 나타내지 않았고, WT1+ 세포주에 대해 높은 농도(10 μg/mL)로 낮은 효능의 사살을 나타내는 경우, 동일한 정도의 사살이 WT1- 세포주에서도 마찬가지로 관찰되었다(도 6의 D 및 E). 이러한 기능적 데이터를 근거로, 본 발명자들은 11D06-TCB 및 33H09-TCB를 추가의 평가를 위해 선택하였다.
또한, 본 발명자들은 종양 표적 세포에 대한 사살 활성에 대해 선택된 TCB와 ESK1-TCB를 비교하였다. 흥미롭게도, ESK1-TCB는 SKM-1 세포의 사살을 매개함에 있어서 11D06-TCB 및 33H09-TCB와 비교하여 유사한 효능을 성취하였지만, HLA-A2+WT-1- BJAB 세포의 사살도 유도함으로써, ESK1-TCB 결합이 HLA-A2/WT1RMF 복합체에 한정되어 있지 않음을 나타냈다(도 6F 및 6G).
본 발명자들은 HLA-A2+WT1+인 다수의 종양 세포주의 사살을 시험하였다. 사살에 대한 EC50 값의 측정을 기반으로, 세포주를 1 μM 미만의 EC50으로 사살하는 것(표 4에 "++"로 표시됨), 1 μM 초과의 EC50으로 사살하는 것(표 4에 "+"로 표시됨), 및 본직적으로 사살하지 않는 것(표 4에 "없음"으로 표시됨)으로 분류하였다.
종합하면, 선택된 TCB 11D06-TCB 및 33H09-TCB는 13개 HLA-A2+WT1+의 세포주 중 6개에서 T 세포 세포독성을 매개하였다. 다른 세포주에 대한 사살의 결여는 MHC에 의해 세포 표면에 제시되는 WT1의 낮은 발현에 기인할 가능성이 있다. 하기 표 4는 11D06-TCB에 대한 결과를 나타낸 것이다. 33H09-TCB에 대한 결과는 유사하였다(EC50 값은 11D06-TCB에 대해 약간 더 높음).
선택된 TCB에 의한 WT1+ 세포주의 사살
세포주 명칭 HLA-A2 WT1 조직 유래의 질환 11D06-TCB
에 의한
사살
(RMF 특이적)		 11D06-TCB
에 의한
생체 외
사살에서
EC50
(μM)		 K-Ras
돌연변이
SKM-1 + + 급성 골수성 백혈병 ++ 0.09
내지
0.35		 있음
T89G + + 교모세포종 ++ 0.8
내지
1.7		 없음
MDA-MB-231 + + 유방 선암종 ++ 0.5
내지
2.8		 있음
SW620 + + 결장직장 선암종 + 4.8 있음
SW480 + + 결장직장 선암종 + 2.9 있음
SET-2 + + 본태성 혈소판혈증 (+)
*데시타빈
으로 처리된
경우		 (0.05) 없음
CTV-1 + + 백혈병, 급성 골수성 없음 없음
BV173 + + 급성 백혈병, 만성 골수성 없음 없음
A-375 + + 악성 흑색종 없음 없음
LN-18 + + 교모세포종 없음 없음
U-266 + + 골수종 없음 없음
OVCAR3 + + 난소 암종 없음 없음
Nalm6 + + B 세포 전구체 백혈병 없음 없음
실시예 8. WT1 + 세포주에 대한 결합시 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")에 의한 T 세포 활성화
WT1+ 표적 세포에 대한 TCB-매개 세포독성의 선결요건은 T 세포가 활성화되어 효과기 기능을 획득하는 것이다. 본 발명자들은 실시예 7에 기재된 생체 외 사살 시험 동안, 2개의 선택된 TCB 33H09-TCB 및 11D06-TCB의 존재하에 T 세포, 및 HLA-A2+WT1- 세포 SKM-1 또는 HLA-A2+WT1- 세포 BJAB의 동반-배양에서 유동 세포분석에 의해 T 세포의 활성화 상태를 측정하였다. 세포를 공동-항온배양 18시간 후 수확하고 CD3에 대항하는 항체(바이오레전드, Cat. No. 300321), CD25에 대항하는 항체(바이오레전드, Cat. No. 302606) 및 CD69에 대항하는 항체(바이오레전드, Cat. No. 310914)로 염색하여 유동 세포분석에 의해 T 세포 활성화를 측정하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, TCB 둘다는 SKM-1 세포에 대한 결합시 CD3+ T 세포 상의 CD69 및 CD25의 상향조절을 유도하였지만, BJAB 세포에서는 유도하지 않았는데, 이는 SKM-1 세포에 의해 제시되는 HLA-A2/WT1RMF의 TCB에 의한 특이적 인식이 T 세포의 CD3-매개 활성화를 촉진하여 결과적으로 표적 세포의 특이적 용해를 야기함을 나타낸다.
실시예 9. 보고된 표적외 펩티드에 대한 선택된 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")의 결합의 부재
T 세포 수용체(TCR)-유사 항체의 개발에서의 주요한 잠재적 위험은 정상 조직에 의해 발현되는 단백질로부터 제시되는 단백질 동족체에 의한 항체의 교차 반응성이다. 문헌[Ataie et al. (J Mol Biol. (2016) 428:194-205)]에 의해, ESK 항체가 단백질 MED13L 및 PIGQ로부터 유래하는 서열-유사 펩티드에 결합함이 보고되어 있음에 기인하여, 본 발명자들은 상기 2개의 펩티드에 대한 본 발명자들의 TCB의 교차 반응성을 시험하였다. 상기 펩티드의 서열은 도 8의 F, 및 서열번호 79 및 80에 도시되어 있다. 결합 분석을 기반으로 하는 유동 세포분석에서(실시예 4에 기재되어 있음), 본 발명자들은 11D06-TCB 및 33H09-TCB 둘다가 PIGQ 펩티드에 결합하지 않음을 발견하였다. TCB 둘다에 의한 MED 13L에 대한 결합은 고유 WT1 RMF 펩티드에 대한 것과 비교하여 약 100배 더 작았다(도 8의 A 및 B). ESK1-TCB는 낮은 친화도로 RMF 펩티드에 결합하지만, 이는 PIGQ 펩티드에 유사하게 결합하고 MED13L에는 훨씬 더 강하게 결합하는데(도 8의 C), 이는 ESK1 IgG의 보고된 결합 활성과 일관된다(문헌[Ataie et al., J Mol Biol. (2016) 428:194-205]).
또한, 본 발명자들은 실시예 5에 기재된 NFAT-리포터 분석을 사용하여 교차 반응성을 시험하였다. 결합 데이터에 따르면, MED13L 및 PIGQ에 대한 결합시 Jurkat 세포에서 NFAT 활성화의 강도는 11D06-TCB 및 33H09-TCB에 의해 WT1 RMF에 결합시 활성화보다 100배 이상 약했다(도 8의 D 및 E).
실시예 10. 미동정된 표적외 펩티드에 대한 선택된 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")의 결합의 부재
정상 조직으로부터 유래된 동족체 펩티드(주요 인식 잔기를 공유함)에 대한 교차 반응성은 TCR-유사 항체 또는 TCR-기반 T 세포 치료에 의한 심각하고 예상하기 어려운 독성을 야기할 수 있다(문헌[Linette et al, Blood (2013) 122:863-71] 참고, 심장 조직에 의해 발현된 단백질에 대한 표적외 반응성에 기인하는 MAGE A3-TCR 치료의 치명적인 독성이 보고되어 있음). 상기 제제의 특이성이 따라서 매우 중요하다. 11D06의 결합에 관여하는 RMF 펩티드에서의 위치를 확인하는 결정 구조 데이터를 기반으로 본 발명자들의 항체를 전체적으로 규정하기 위해(실시예 15 참고), 본 발명자들은 펩티돔(peptidome) 데이터베이스(스위스프로트(Swissprot) 및 TrEMBL)에서 RxxPNxxYx을 차폐(masking)함으로써 WT1 RMF 펩티드(서열번호 78)와 유사한 아미노산 서열을 갖는 잠재적인 표적외 펩티드에 대한 본 발명자들의 탐색을 확대하였다. 본 발명자들은 모두 높은 가능성으로 예측된 HLA-A2에 대한 친화도를 갖는 상이한 단백질들로부터 유도된 25개의 추가적인 펩티드를 발견하였다(하기 표 5 참고). 이어서, 본 발명자들은 전술된 NFAT-리포터 분석(펩티드 1 내지 6) 또는 T 세포 세포독성 분석(펩티드 7 내지 25)을 사용하여 펩티드-부가된 T2 세포에서 선택된 TCB의 교차 반응성을 시험하였다.
처음 시험한 6개의 펩티드에 대해, 11D06-TCB에 의한 임의의 상기 6개의 펩티드에 대한 교차 반응성이 부재하였다. 33H09-TCB는 ARHGEF11에 대해 일부 인식을 나타냈지만, NFAT 활성화의 정도는 고유 RMF 펩티드에 비해 100배 초과로 낮았다(도 9의 A 및 B). 유사하게, 펩티드-부가된 T2 세포의 직접 T 세포 사살에 의해 측정시 다른 19개의 표적외 펩티드에 대한 교차 반응성은 고유 RMF 펩티드보다 100배 이상 낮았다(도 9의 C 및 D). 이러한 결과는 제2의 실험에서 확인되었고, 상기 실험에서 ESK1-TCB도 시험하였다(도 9의 E 내지 G).
종합하면, 본 발명자들은 11D06 및 33H09(ESK1-유사 결합제는 제외)가 WT1 RMF 펩티드에 특이성을 나타내지만, 펩티돔에서 검출되는 잠재적인 표적외 펩티드에는 특이성을 나타내지 않음을 확인하였다.
추가적인 신규 동정된 표적외 펩티드
펩티드 펩티드 서열 유전자 명칭 서열번호
1 RLFPNLPEL ARHGEF11 81
2 RMFPNKYSL PRDM16 82
3 AMDPNAAYV SERPINA6 83
4 RMGPNIYEL NIPSNAP1 84
5 NMPPNFPYI TAF3 85
6 YTIPNHPYL U4 86
7 RLFPNAKFL TPST1 87
8 RMVPRAVYL IGFBP5 88
9 KMVPSIPYL RALGPS1 89
10 RIFPSYSYL ZNF382 90
11 RLFPNSKFL TPST2 91
12 KMTPCIPYL RALGPS2 92
13 SMFPSLKYL TBCE 93
14 RLLPSAPTL KIFC2 94
15 RLRPHVPYL SLC16A8 95
16 RMNPNSPSI ERH 96
17 RVFNNRWYL ZBTB47 97
18 RLQLNNPYL MIOS 98
19 RMFFNGRYI ATP6V0A2 99
20 RLSPNRPPL PKD1 100
21 ETFPNSWYL NAALADL1 101
22 GLKPNAIYL ROBO1 102
23 RQFPNASLI RECQL 103
24 YIFPNCPFL SERPINA2 104
25 RLRINFPYL FAM220A 105
실시예 11. 선택된 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")에 의해 매개되는 CD34 + 줄기 세포에서 세포독성의 부재
CD34+ 조혈모세포는 WT1 양성임이 보고되어 있고(문헌[Ramani and Cowell, J. Path (1996) 179:162-8]), 이에 따라 TCB가 상기 세포에 결합하는 경우 잠재적으로 유해할 수 있다. CD34+ 세포가 RMF 펩티드를 내생적으로 제시하는지 연구하기 위해, 본 발명자들은 론자(Lonza)로부터 3명의 기증자의 HLA-A2+ 골수 유래 CD34+ 세포를 입수하고 실시예 7에 전술한 사살 분석에서 본 발명자들의 선택된 TCB로 시험하였다. 11D06-TCB 및 33H09-TCB는 SKM-1 세포에 유효한 사살을 매개하지만, CD34+ 줄기세포에는 사살 활성을 갖지 않는데, 이는 상기 줄기 세포가 HLA-A2의 맥락에서 RMF 펩티드를 제시하지 않음을 나타낸다(도 10).
실시예 12. 알라닌 스캔 분석에 의한 선택된 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")의 결합 잔기의 규정
본 발명자들의 TCB가 ESK1-TCB와 비교하여 RMF 펩티드에 대해 상이한 결합 및 기능적 활성을 갖는 것은 분명하다. TCB에 의한 RMF 펩티드의 잠재적 결합 모티프를 특성규명하기 위해, 본 발명자들은 각각의 아미노산을 알라닌으로 개별 대체함에 의해 고유 서열로부터 유래된 펩티드 배열(array)을 사용하여 알라닌 스캔 분석을 설정하고, 상기 펩티드로 부가된 T2 세포에 의한 NFAT-리포터 신호를 특정하였다(도 11의 A 내지 L). 데이터를 TCB의 농도 증가에 따른 RLU로서 제시하였다. 본 발명자들은 고유 펩티드의 EC50에 대한 EC50의 배수 변화를 기록하고 10 이상의 배수 변화를 유의한 것으로 간주하였는데, 이는 RMF 펩티드의 각각의 아미노산 잔기가 11D06-TCB 및 33H09-TCB에 의한 인식에 매우 중요할 수 있음을 의미한다(도 11의 M). 본 발명자들은 11D06-TCB 및 33H09-TCB 둘다가 잔기 R1, F3, N5 및 A6와 매우 중요한 접촉을 갖는 것으로 결론내렸고(도 11의 N), ESK1은 RMF 펩티드 R1, P4 및 N5에 밀접히 접촉하는 것으로 나타났다(문헌[Ataie et al., J Mol Biol. (2016) 428:194-205]).
실시예 13. NSG 마우스에서 단일 주사 후 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")의 약동학적 프로파일
단일 투약량의 0.5 mg/kg의 33H09-TCB 또는 11D06-TCB를 NSG 마우스에 주사하였다. 모든 마우스에 200 μL의 적절한 용액으로 정맥내 주사하였다. 200 μL당 화합물의 적절한 양을 얻기 위해, 원료 용액을 히스티딘 완충액으로 희석하였다. 시점당 3마리의 마우스의 혈액을 10분, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 6일, 8일, 10일 및 12일에 채혈하였다. 주사된 화합물을 ELISA에 의해 혈청 샘플에서 분석하였다. 비오틴일화 항 huCD3-CDR 항체(독일 펜쯔베르크 소재의 로슈 다이그노스틱스(Roche Diagnostics)), 시험 샘플, 디곡시게닌-표지 항 huFc 항체 및 항 디곡시게닌 검출 항체(퍼옥시다제(POD))를 96 웰 스트렙타비딘-코팅된 마이크로역가 플레이트에 적가하고 실온에서 1시간 동안 매 단계 후 항온배양하였다. 상기 플레이트를 각가의 단계 후 3회 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 최종적으로, 퍼옥시다제-결합 복합체를 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산) 기질 용액을 첨가하여 착색된 반응생성물을 형성함으로써 시각화하였다. 반응생성물 강도를 405 nm(참조 파장은 490 nm)에서 측광적으로 측정하였고, 이는 혈청 중 분석물의 농도에 비례한다. 결과(도 12)는 시험된 클론 둘다에 대해 안정한 PK-거동을 나타냈고, 이로써 후속의 효능 시험에 대해 주1회 스케줄이 권장되었다.
실시예 14. 인간화된 마우스에서 단일 주사 후 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")에 의한 효능 연구
HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체의 제1의 효능 연구의 목적은 충분히 인간화된 NSG 마우스에서 인간 급성 골수성 백혈병(AML) 이종이식(SKM-1; HLA-A2+, WT-1+)에서 2개의 상이한 WT1 결합제(11D06 및 33H09)를 효능의 관점에서 비교하는 것이었다. SKM-1 세포(인간 AML)를 원래 ATCC로부터 수득하고 로슈 글리카르트(Roche Glycart) 내부의 세포 은행에 보관하였다. 상기 세포를 5% CO2에서 물로 포화된 대기에서 RPMI + 10% FCS + 1% 글루타민 중에 배양하였다. 마트리겔(Matrigel)(1:1 비)로 98%의 생존도에 의해, 생체 외 경로 15를 설하 주사에 사용하였다.
실험 시작시 4 내지 5주령의 암컷 NSG 마우스(잭슨 래버러토리)를 제공된 가이드라인(GV-솔라스(GV-Solas); 펠라사(Felasa); 티에르슈지(TierschG))에 따라 12시간의 명/12시간의 암의 일일 주기로 특이적 병원균 부재 조건하에 유지시켰다. 지역 정부부처에 실험 연구 프로토콜을 검토 및 승인받았다. 도착 후, 새로운 환경에 적응하도록 하고 관찰을 위해, 동물을 1주 동안 유지시켰다. 연속적인 건강 감시를 규칙적으로 수행하였다.
암컷 NSG 마우스에 15 mg/kg의 부설판을 복강내 주사하고 1일 후 제대혈로부터 단리된 1 x 105의 인간 조혈모세포를 정맥내 주사하였다. 줄기 세포 주사 후 13 내지 16주에, 마우스의 혈액을 설하 채혈하고 성공적인 인간화에 대해 유동 세포분석에 의해 분석하였다. 유효하게 생착된 마우스를 이의 인간 T 세포 빈도에 따라 3개의 처리군으로 무작위화하였다. 이때, 도 13의 A에 도시된 바와 같이 마우스에 SKM-1 종양 세포를 피하 주사하고 종양 크기가 약 150 mm3에 도달했을 때(10일차), 화합물 또는 히스티딘 완충액(비히클)으로 주1회 처리하였다. 마우스에 200 μL의 적절한 용액을 정맥내 주사하였다. 200 μL당 적절한 양의 화합물을 얻기 위해, 원료 용액을 필요에 따라 히스티딘 완충액으로 희석하였다. 캘리퍼를 사용하여 종양 성장을 주3회 측정하고, 종양 부피를 하기 수학식 1에 의해 계산하였다.
[수학식 1]
Tv: (W2/2) x L (W: 너비, L: 길이)
종양 성장 억제(TGI) 및 종양 대 대조군 비율(TCR)을 하기 수학식 2 및 3에 의해 계산하였다.
[수학식 2]
[수학식 3]
도 13은 모든 처리군에서의 종양 성장 동력학(평균)(도 13의 C) 및 각각의 군에서 단일 종양 동력학(도 13의 D 내지 F)을 도시한 것이다. 도시한 바와 같이, TCB 둘다는 종양 성장 억제를 나타냈는데, 클론 11D06이 101.3의 TGI로 가장 강한 종양 성장 억제를 나타냈다(도 13의 G).
실시예 15. HLA-A2/WT1 항체/pMHC 복합체의 결정 구조
25℃에서 72시간 동안 50　mM 트리스 pH　8.0, 150　mM NaCl에서 mg당 1.05 U 플라스민(plasmin)(로슈 Cat. No. 602361)을 사용하여 항체를 항온배양함으로써 Fab 단편을 제조하였다. 50　mM Tris, 100　mM 글리신, 150　mM NaCl, pH　8.0으로 평형화된 캡쳐셀렉트(CaptureSelect) CH1 - 친화도 컬럼(affinity column)(BAC BV, Cat. No. 191.3120)을 사용하여 절단된 Fc를 Fab 단편으로부터 분리하였다. Fab 단편을 50　mM 트리스, 100　mM 글리신, 150　mM NaCl, pH 2.0에 의해 컬럼으로부터 용리시키고 0.5 M 나트륨 포스페이트 pH 8.0으로 중화시킨 후, 20　mM 트리스, 150　mM NaCl, pH　7.4로 평형화된 크기 배제 컬럼 S75(GE 헬스케어)에 로딩하였다. 분석적 크기 배제(컬럼 토소, TSK-Gel G3000SWXL, 어질런트(Agilent) HPLC 1200 시스템 상) 및 CE- SDS(캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII, 퍼킨엘머)를 환원성 및 환원된 조건하에 수행함으로써 품질 제어를 수행하였다. 정제된 Fab 단편을 액체 질소에서 냉동시키고 -80℃에서 저장하였다.
5C01 항체/pMHC 복합체의 결정화, 데이터 수집 및 구조 측정
결정화
5C01 결합제(Fab 5C01)를 기반으로 하는 1.2배 몰 과량의 HLA-A2/WT1 Fab 단편과 HLA-A2/WT1VLD 펩티드 복합체(HLA-A02/WT1VLD pMHC)를 혼합함으로써 항체/pMHC 복합체(Fab 5C01 HLA-A02/WT1VLD pMHC)를 제조하였다. 4℃에서 항온배양 1시간 후, 혼합물을 10 mg/mL로 농축하였다. 21℃에서 치적 증기 확산 셋업(sitting drop vapor diffusion setup)으로 초기 결정화 시험을 수행하였다. 결정 품질을 향상시키기 위해 결정 액적에 첨가된 0.2 M 나트륨 타르타레이트, 20% 폴리에틸렌글리콜(PEG) 3350 및 10% 2-메틸-2,4-펜타다이올(MPD)로부터 1일내에 결정이 나타났다. 추가의 최적화 단계 없이, 선별 플레이트로부터 결정을 직접 수확하였다.
데이터 수집 및 구조 측정
데이터 수집을 위해, 15% 글리세롤을 함유하는 침전 용액에서, 결정을 100K에서 급속 냉동하였다. 스위스 빌리겐 소재의 라이트 소스(Swiss Light Source)의 빔라인(beamline) X10SA에서 필라투스(PILATUS) 6M을 사용하여 1.0000 Å의 파장에서 회절 데이터를 수집하였다. 데이터를 XDS(문헌[Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010)])로 처리하고 SADABS(브루커(BRUKER))에 의해 규모조정하였다. 복합체의 결정은 a= 158.94 Å, b= 49.12 Å, c= 128.63 Å 셀 축을 갖는 공간군 P21212에 속하였고, 1.98 Å의 해상도로 회절하였다. 탐색 모형으로서 프로틴 데이터 뱅크(PDB) 엔트리 4NO5에 의한 결정 구조 및 내수 Fab 구조의 좌표를 사용하여, PHASER(문헌[McCoy, A.J, Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Storoni, L.C., and Read, R.J. J. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007)])에 의한 분자 치환에 의해 구조를 측정하였다. 전자 밀도차를 사용하여 펩티드를 위치시키고 실제 공간 정밀화에 의한 서열 차이에 따라 아미노산을 변경하였다. 구조를 CCP4 모음(suite)(문헌[Collaborative Computational Project, Number 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)]) 및 BUSTER(문헌[Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P., Sharff, A., Smart, O.S., Vonrhein, C., Womack, T.O. (2011). Buster version 2.9.5 Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd)])로부터의 프로그램에 의해 정밀화하였다. 수동적 재구축을 COOT(문헌[Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. and Cowtan, K. Acta Cryst D66, 486-501 (2010)])에 의해 수행하였다.
데이터 수집 및 정밀화 통계를 하기 표 6에 요약하였다.
Fab 5C01 HLA-A02/WT1VLD pMHC에 대한 데이터 수집 및 정밀화 통계
5C01-HLA-A02/ WT1VLD pMHC
데이터 수집
공간군 P21212
세포 치수
a, b, c(Å) 158.94, 49.12, 128.63
(°) 90, 90, 90
해상도(Å) 1.98
R sym 또는 R merge 0.11
I / σI 12.01 (0.53)
완정성(%) 99.9 (99.9)
중복성 6.61 (6.76)
정밀화
해상도(Å) 48.9 - 1.98
반사 개수 71103
R work / R free 19.12/24.01
원자 개수
단백질 6374
물 528
B-인자
단백질 66.32
물 59.27
제곱평균제곱근 편차
결합 길이(Å) 0.010
결합 각(°) 1.07
*괄호 안의 값은 최고 해상도 껍질(shell)에 대한 것임.
HLA-A02/WT1 VLD 를 갖는 복합체에서 Fab 5C01의 구조
VLD 펩티드와 Fab 5C01, 5C01의 결합 에피토프 및 파라토프와 HLA-A02의 상호작용의 상세내용을 특성규명하기 위해, 본 발명자들은 HLA-A02/WT1VLD pMHC를 갖는 5C01의 복합체의 결정 구조를 1.98 Å의 해상도로 측정하였다(도 14의 A). 상기 구조는 경쇄의 CDR1 및 CDR3의 주요 기여 및 중쇄의 모든 CDR에 의해 Fab 5C01이 pMHC에 결합함을 나타냈다. VLD 펩티드(서열번호 77)로부터, 잔기 Val1, Phe4 및 Pro7의 측쇄는 Fab에 직접 접촉하였다. 펩티드의 모든 다른 측쇄는 HLA-A02 분자를 향했다. 접촉 표면에 대한 펩티드의 기여는 약 68 Å2이었고, 약 476 Å2의 전체 Fab-pMHC 접촉 면적이 관찰되었다. Fab 5C01-pMHA 계면의 확대도를 도 15에 도시하였다.
프로그램 PISA(문헌[E. Krissinel and K. Henrick (2007), J. Mol. Biol. 372, 774-797])에 의한 결합 계면의 분석은 8개의 수소 결합, Pi-Pi 상호작용 및 반데르발스 접촉을 통한 Fab 5C01과 HLA-A02의 상호작용 패턴을 나타냈다. 측쇄 수소 결합은 중쇄 CDR3(Trp97) 및 CDR2(Ser52, Ser53)의 잔기와 HLA-A02의 Glu63 및 Glu166 사이에 형성된다. 추가의 수소 결합은 Tyr91, Ile93 및 Gln155의 경쇄 골격 원자에 의해 형성된다. 또한, 복합체는 경쇄 잔기 Trp32 및 Trp94와 HLA-A02 측쇄의 Gln155 및 His151의 상호작용의 형성을 통해 안정화된다. VLD 펩티드의 N-말단 발린은 골격 질소를 통해 HLA-A02의 Tyr171을 통해 수소 결합을 형성한다. 이의 측쇄는 HLA-A02의 Glu63 및 Trp167과 Fab 5C01의 중쇄의 Trp97에 의해 형성된 주머니를 향해 배향된다. 또한, 펩티드의 Phe4는 가장자리를 형성하여 중쇄의 Try100으로 상호작용한다. 접촉을 요약하는 대략적인 Fab 5C01-pMHC 상호작용 행렬을 도 16에 도시하였다.
11D06 항체/pMHC 복합체의 결정화, 데이터 수집 및 구조 측정
결정화
11D06 결합제(Fab 11D06)를 기반으로 하는 HLA-A2/WT1 Fab 단편과 HLA-A2/WT1RMF 펩티드 복합체(HLA-A02/WT1RMF pMHC)를 1:1 몰량으로 혼합함으로써 항체/pMHC 복합체(Fab 11D06 HLA-A02/WT1RMF pMHC)를 제조하였다. 21℃에서 항온배양 4시간 후, 혼합물을 20 mg/mL로 농축하였다. 21℃에서 치적 증기 확산 셋업으로 초기 결정화 시험을 수행하였다. 결정 품질을 향상시키기 위해 결정 액적에 첨가된 0.1 M 트리스 pH 8.0, 20% PEG 4000으로부터 1일내에 결정이 나타났다. 추가의 최적화 단계 없이, 선별 플레이트로부터 결정을 직접 수확하였다.
데이터 수집 및 구조 측정
데이터를 전술한 바와 같이 수집하고 처리하고 규모조정하였다. 복합체의 결정은 a= 54.11 Å, b= 67.00 Å, c= 139.36 Å 및 β = 90.57° 셀 축을 갖는 공간군 P21에 속하였고, 2.64 Å의 해상도로 회절하였다. 탐색 모형으로서 내수 Fab 및 MHC 복합체 구조의 좌표를 사용하여, PHASER에 의한 분자 치환에 의해 구조를 측정하였다. 전자 밀도차를 사용하여 펩티드를 위치시키고 실제 공간 정밀화에 의한 서열 차이에 따라 아미노산을 변경하였다. 구조 정밀화 및 수동적 재구축을 전술한 바와 같이 수행하였다.
데이터 수집 및 정밀화 통계를 하기 표 7에 요약하였다.
Fab 11D06 HLA-A02/WT1RMF pMHC에 대한 데이터 수집 및 정밀화 통계
11D06 HLA-A02/ WT1RMF pMHC
데이터 수집
공간군 P21
세포 치수
a, b, c(Å) 54.11, 67.00, 139.36
(°) 90, 90.57, 90
해상도(Å) 2.64
R sym or R merge 0.10
I / σI 13.10 (0.82)
완결성(%) 99.9 (99.8)
중복성 3.79 (3.85)
정밀화
해상도(Å) 48.3 - 2.64
반사 개수 29606
R work / R free 17.10/23.00
원자 개수
단백질 6395
물 250
B-인자
단백질 67.52
물 57.46
제곱형균제곱근 편차
결합 길이(Å) 0.010
결합 각(°) 1.20
*괄호 안의 값은 최고 해상도 껍질에 대한 것임.
HLA-A02/RMF pMHC를 갖는 복합체에서 Fab 11D06의 구조
본 발명자들은 HLA-A02/RMF pMHC를 갖는 11D06의 복합체의 결정 구조를 2.64 Å의 해상도로 측정하였다(도 14의 B). 구조는 모든 CDR에 의해 Fab 11D06이 pMHC에 결합함을 나타냈다. RMF 펩티드(서열번호 78)로부터, 잔기 Arg1, Met2, Pro4, Asn5, Ala6 및 Tyr8의 측쇄는 Fab의 경쇄 및 중쇄에 직접 접촉하였다. 펩티드의 나머지 측쇄는 HLA-A02 분자를 향했다. 접촉 표면에 대한 펩티드의 기여는 약 107 Å2이었다. 전체 Fab-pMHC 접촉 면적은 약 397 Å2에 상응하였다. Fab 11D06-pMHA 계면의 확대도를 도 17에 도시하였다.
프로그램 PISA에 의한 결합 계면의 분석은 4개의 수소 결합, 다수의 Pi-Pi 상호작용 및 반데르발스 접촉을 통한 Fab 11D06과 HLA-A02의 상호작용 패턴을 나타냈다. 수소 결합은 중쇄 CDR1(Ser30, Ser31) 및 CDR3(Gly100A)의 잔기와 HLA-A02의 Glu58 및 Arg65 사이에 형성된다. 추가의 수소 결합은 경쇄 잔기 Asp50과 HLA-A02의 Arg65에 의해 형성된다. 특히, 중쇄의 Trp100은 HLA-A02의 Arg65 및 Lys66, 및 RMF 펩티드의 Pro4에 반데르발스 및 Pi-Pi 접촉을 제공한다. RMF 펩티드의 N-말단 아르기닌은 이의 측쇄로 11D06의 중쇄의 Ser31, Glu97, 및 Ile96의 골격 카보닐에 의해 형성된 극성 주머니로 향한다. 11D06 및 HLA-A02에 대한 추가적인 극성 접촉은 RMF 펩티드 잔기 Asn5에 의해 형성되고, 이는 경쇄 CDR1의 Trp32, 경쇄 CDR3 및 HLA-A02의 Gln155에 대한 수소 결합의 일부이다. 접촉을 요약하는 대략적인 Fab 11D06-pMHC 상호작용 행렬을 도 18에 도시하였다.
공용 데이터베이스로부터 입수한 ESK1의 3D 구조
비교를 위해, HLA-A02/RMF pMHC에 결합하는 항체(Fab) ESK1의 공용으로 이용가능한 결정 구조(PDB ID 4WUU; http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=4WUU)를 이의 Fab-pMHC 접촉부에 대해 유사하게 분석하였다. 도 14의 C는 HLA-A02/VLD pMHC를 갖는 Fab 5C01 및 HLA-A02/RMF pMHC를 갖는 Fab 11D06의 결정 구조와 동일한 각(HLA-A02 부분상 정렬)으로부터의 HLA-A02/RMF pMHC 결정을 갖는 Fab ESK1을 도시한 것이다. Fab ESK1-pMHC 계면의 확대도를 도 19에 도시하고, 접촉을 요약하는 대략적인 Fab ESK1-pMHC 상호작용 행렬을 도 20에 도시하였다.
구조 비교는 5C01 및 특히 11D06이 ESK1보다는 각각의 WT1 펩티드의 더 큰 분획을 덮고 결합하고 RMF 펩티드의 N-말단 Arg와 배타적으로 특이적 접촉을 형성하고, 결합 계면의 나머지는 HLA-A02에 의해 제공됨을 나타냈다. 상기 관찰에 근거하여, 5C01 및 11D06이 노출된 위치에서 비VLD 및 비RMF-유사 측쇄에 의해 펩티드에 상당히 보다 큰 입체 장애를 생성하므로, 이들이 표적외 펩티드를 ESK1보다 덜 관용할 것임을 결론내릴 수 있다.
결정 구조의 모든 그래픽적 대표도를 다썰트 시스템스 바이오비아(Dassault Systemes BIOVIA)의 바이오비아 디스커버리 스튜디오 4.5에 의해 생성하였다.
에피토프 및 파라토프 잔기(5 Å 반경)
결합제 5C01, 11D06 및 ESK1에 대한 에피토프 및 파라토프의 요약을 하기 나타냈다. 에피토프 및 파라토프(5 Å 인접 반경을 기준으로 정의됨) 잔기를 굵은 이탤릭체로 강조하였다. CDR 잔기를 회색 배경색으로 강조하였다.
화학적 상호작용에 관련된 잔기
결합제 5C01, 11D06 및 ESK1에 대한 화학적 상호작용과 과련된 잔기의 요약을 하기 나타냈다. 특이적 화학적 상호작용과 관련된 잔기(도 16, 18 및 20 비교)를 굵은 이탤릭체로 강조하였다. CDR 잔기를 회색 배경색으로 강조하였다.
실시예 16. 상이한 CD3 결합제를 갖는 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")의 비교
본 발명자들은 전술한 분석(실시예 7)에서 SKM-1 세포를 사용하여 상이한 CD3 결합제를 갖는 11D06-TCB의 사살 활성의 효능을 비교하였다. CH2527은 선행 실험들에 사용된 TCB의 CD3 결합제이다(VH 및 VL 서열에 대해 서열목록 121 및 122 참고). V9은 문헌[Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl (1992) 7, 45-50], 및 WO 1992/22653(VH 및 VL 서열에 대해 서열번호 136 및 137 참고)에 기재된 CD3 결합제이고, 40G5C는 WO 2015/095392(VH 및 VL 서열에 대해 WO 2015/095392의 서열번호 184 및 185("hu40G5c") 참고)에 기재되어 있다.
CD3 결합제 CH2527, 40G5C 및 V9의 친화도를 하기 표 8에 나타냈다.
도 21에 도시한 바와 같이, 본 발명자들은 11D06-TCB(CH2527)가 HLA-A2+WT1+ SKM-1 세포주에 대한 T 세포-매개 사살에 있어서 11D06-TCB(V9)와 동일한 효능을 나타내고, 11D06-TCB(40G5C)는 강하게 감소된 사살 효능을 나타냄을 관찰하였다.
상기 실험에서 비교된 CD3 결합체의 친화도
CD3 클론 교차 반응성 친화도(K d )[nM]
CH2527 Hu-Cyno 85-130
40G5C Hu-Cyno 390-460
V9 Hu 단독 35-50
실시예 17. RMF 펩티드-부가된 T2 세포에 대한 결합시 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")에 의해 매개되는 T 세포 세포독성
11D06-TCB(V9)(전체 서열에 대해 서열번호 123, 125, 139 및 140)의 사살 활성을 상이한 HLA/WT1 결합제(알리 및 다니엘, WO 2017/060201 참고, 각각 서열번호 5(VH)와 6(VL), 및 서열번호 35(VH)와 36(VL))를 갖는 유사한 TCB와 비교하였다. ESK1-TCB 및 비표적화된 DP47-TCB도 대조군으로 포함시켰다. 실시예 6에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. RMF 펩티드-부가된 세포(100 μL, 2 x 105 세포/mL)를 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 50 μL의 T 세포(2 x 106 세포/mL) 및 50 μL의 TCB의 연속 희석액과 동반-배양하였다.
도 22는 RMF-발현 표적 세포의 TCB-매개 특이적 T 세포 사살을 도시한 것이다. 본 발명자들은 11D06-TCB 및 ESK1-TCB가 RMF 펩티드-부가된 T2 세포의 유효한 사살을 매개하였고, HLA/WT1 결합제 알리 및 다니엘을 기반으로 하는 TCB(알리-TCB 및 다니엘-TCB)는 최고 농도로만 RMF-부가된 세포의 약한 사살을 나타냈다.
실시예 18. 표적외 펩티드에 대한 선택된 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")의 결합의 부재
또한, 본 발명자들은 실시예 9 및 10에 기재된 표적외 펩티드를 갖는 11D06-TCB(V9), 알리-TCB, 다니엘-TCB 및 ESK1-TCB의 교차 반응성을 비교하였다.
본 실험을 위해, 항 PGLALA 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 Jurkat NFAT 리포터 세포를 사용하였다(CAR J 분석, EP17209201.7을 우선권 주장하는 PCT 출원(본원에 그 전체가 참조로 혼입됨) 참고). 항 PGLALA CAR는 TCB의 Fc 영역에서 P329G L234A L235A("PGLALA", EU 번호부여) 돌연변이를 인식한다. 전술한 펩티드-부가된 T2 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 분석의 원리는 Jurkat-NFAT 변형된 효과기와 표적 세포를 공동-배양하는 것이다. CAR(PGLALA 돌연변이를 통함) 및 표적 항원에 대한 TCB의 동시적 결합시에만, NFAT 촉진제가 활성화되고 Jurkat 효과기 세포에서 루시퍼라제 발현을 증가시킨다. 적절한 기질의 첨가시, 활성 반딧불이 루시퍼라제는 발광을 야기하고, 이는 CAR-매개 활성화의 신호로서 측정될 수 있다.
요약하면, 표적 세포를 수확하고 생존도를 측정하였다. 20000 표적 세포/웰을 100 μL 배지 중 둥근바닥 96 웰 플레이트(그레이너 바이오-원(Greiner bio-one), #650180)에 플레이팅하였다. 비부가된 T2 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 50 μL/웰의 희석 TCB를 표적 세포에 첨가하였다. 이어서, Jurkat-NFAT 리포터 세포를 수확하고 생존도를 평가하고 세포 배양 배지 중 재현탁시키고 100000 세포/웰로 종양 세포에 첨가하여 5:1의 최종 효과기 대 표적 비 및 200 μL/웰의 최종 부피를 수득하였다. 항온배양 시간의 종료시, 플레이트를 실온에 적응시켰다(약 15분). 125 μL의 배지/웰을 상단으로부터 제거하고 25 μL/웰의 원-글로 루시퍼라제(One-Glo Luciferase)(프로메가 #E6120)를 첨가하고 혼합하였다. 이어서, 100 μL/웰의 혼합물을 96 웰 편평바닥 플레이트(그레이너 바이오-원, #655098)로 옮기고, 플레이트를 15분 동안 암실에서 항온배양한 후, 엔비전(퍼킨엘머)를 사용하여 발광을 검출하였다.
도 23에 도시된 바와 같이, 알리-TCB(A), 다니엘-TCB(B) 및 ESK1-TCB(C)는 Jurkat NFAT 리포터 세포주의 더 약한 활성화를 야기하였고(도 22에 도시된 더 약한 사살에 상응함), 11D06-TCB(V9)(D)와 비교하여 RMF 펩티드와 기타 표적외 펩티드간 인식의 여지가 더 적었다.
실시예 19. NSG 마우스에서 단일 주사 후 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체(11D06-TCB(V9))의 약동학적 프로파일
단일 투약량의 1 mg/kg의 11D06-TCB(V9)를 인간화되고 종양을 보유하는 NSG 마우스에 주사하였다. 마우스에 히스티딘 완충액으로 희석된 200 μL의 TCB로 정맥내 주사하였다. 시점당 3마리의 마우스의 혈액을 10분, 6시간, 24시간, 72시간 및 7일에 채혈하였다. 실시예 13에 기재된 바와 같이, 주사된 화합물을 ELISA에 의해 혈청 샘플에서 분석하였다.
결과(도 24)는 시험된 TCB에 대해 안정한 PK-거동을 나타냈고, 이로써 후속의 효능 시험에 대해 주1회 스케줄이 권장되었다.
실시예 20. 인간화된 마우스에서 단일 주사 후 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")에 의한 효능 연구
본 효능 연구의 목적은 충분히 인간화된 NSG 마우스에서 인간 AML 이종이식(SKM-1)에서 11D06-TCB(V9)의 효능을 평가하는 것이었다. 실험을 실시예 14에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 25는 종양 성장 동력학(평균, 도 25의 A) 및 각각의 군에서의 단일 종양 성장 동력학(도 25의 B 및 C)을 도시한 것이다. 나타낸 바와 같이, TCB는 연구 48일차에 78의 TGI를 나타냈다(도 25의 D).
실시예 21. 상이한 분자 형식을 갖는 HLA-A2/WT1 x CD3 이중특이성 항체("TCB")의 비교
본 발명자들은 11D06-TCB(V9)와 "1+1 CrossMab" 형식(도 1의 A에 도시되어 있음)의 유사 분자의 활성을 비교하였다. 용량-의존성으로, 표적 세포의 존재하에 리포터 세포주(Jurkat NFAT)의 TCB-매개 활성화를 검출하는 세포-기반 기능적 분석을 사용하여 활성을 감시하였다. HLA-A02/WT1RMF pMHC를 발현하는 표적 세포 CHO-K1 세포를 사용하여 본질적으로는 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 분석을 수행하였다. 표적 세포의 HLA-A02/WT1RMF pMHC 복합체 및 리포터 세포의 TCR의 CD3ε 단위에 TCB의 동시적 결합시 리포터 세포 활성화가 나타났고, 이는 CD3의 초집적화를 야기하여 TCR을 활성화시킨다. 상응하는 세포내 신호전달 경로의 후속적 개시는 NFAT-유도 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 유도하는 전사 인자 NFAT의 활성화를 야기한다. 루시퍼라제 리포터의 활성은 기질의 첨가시 발광 판독에 의해 측정된다.
본 실험의 결과를 도 26에 도시하였다. 표적-의존적 리포터 세포 활성화를 반영하는 RLU를 항체 농도에 대해 정리하였다. 도 26에서 볼 수 있듯이, 본 분석에서 "1+1" 형식의 분자는 "2+1" 형식보다 낮은 활성을 나타냈다.
아미노산 서열
Figure 112020073430755-pct00010
Figure 112020073430755-pct00011
Figure 112020073430755-pct00012
Figure 112020073430755-pct00013
Figure 112020073430755-pct00014
Figure 112020073430755-pct00015
전술된 본 발명이 이해의 명료성을 목적으로 설명 및 예시로써 다소 상세히 기재되었지만, 이러한 설명 및 예시가 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 여겨져서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 특정 문헌의 개시는 그 전체가 본원에 참조로 혼입된다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> ANTIBODIES BINDING TO HLA-A2/WT1 <130> P34563 <140> PCT/EP2018/086055 <141> 2018-12-20 <150> EP17209205.8 <151> 2017-12-21 <160> 140 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11D06 HCDR1 <400> 1 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11D06 HCDR2 <400> 2 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11D06 HCDR3 <400> 3 Ser Ile Glu Leu Trp Trp Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11D06 LCDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11D06 LCDR2 <400> 5 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11D06 LCDR3 <400> 6 Gln Gln Tyr Glu Asp Tyr Thr Thr 1 5 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> 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Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Asp Tyr Thr Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 33H09 HCDR1 <400> 9 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 33H09 HCDR2 <400> 10 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 33H09 HCDR3 <400> 11 Gly Ser Tyr Asp Leu Phe Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 33H09 LCDR1 <400> 12 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 33H09 LCDR2 <400> 13 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 33H09 LCDR3 <400> 14 Gln Gln Tyr Tyr Asp Gly Ile Thr 1 5 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> 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Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Gly Ile Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13B04 HCDR1 <400> 17 Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13B04 HCDR2 <400> 18 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13B04 HCDR3 <400> 19 Val Ser Tyr Asn Gly Leu Asp Tyr 1 5 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13B04 LCDR1 <400> 20 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13B04 LCDR2 <400> 21 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13B04 LCDR3 <400> 22 Gln Gln Tyr Asn Met Trp Asn Pro Val Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 116 <212> PRT <213> 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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Met Trp Asn Pro 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B09 HCDR1 <400> 25 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B09 HCDR2 <400> 26 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B09 HCDR3 <400> 27 Val Pro Gly Arg Trp Tyr Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B09 LCDR1 <400> 28 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B09 LCDR2 <400> 29 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B09 LCDR3 <400> 30 Gln Gln Glu Asp Asp Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 31 <211> 120 <212> PRT 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Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Leu Phe Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 355 360 365 Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210> 127 <211> 672 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WT1 33H09 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc(knob, PGLALA) <400> 127 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Leu Phe Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu 225 230 235 240 Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly 245 250 255 Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln 260 265 270 Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys 275 280 285 Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly 290 295 300 Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu 305 310 315 320 Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly 325 330 335 Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 340 345 350 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 355 360 365 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 370 375 380 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 385 390 395 400 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 405 410 415 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 420 425 430 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 435 440 445 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 450 455 460 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 465 470 475 480 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 485 490 495 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 500 505 510 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 515 520 525 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 530 535 540 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 545 550 555 560 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 565 570 575 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 580 585 590 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 595 600 605 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 610 615 620 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 625 630 635 640 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 645 650 655 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 660 665 670 <210> 128 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WT1 33H09 VL-CL(RK) <400> 128 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Gly Ile Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 129 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 VH-CL <400> 129 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val 115 120 125 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 130 135 140 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 145 150 155 160 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 165 170 175 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 195 200 205 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 210 215 220 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 130 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 HCDR1 (V9) <400> 130 Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 <210> 131 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 HCDR2 (V9) <400> 131 Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 132 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 HCDR3 (V9) <400> 132 Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 133 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 LCDR1 (V9) <400> 133 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 134 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 LCDR2 (V9) <400> 134 Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 LCDR3 (V9) <400> 135 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 136 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 VH (V9) <400> 136 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 137 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 VL (V9) <400> 137 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 138 <211> 275 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr 50 55 60 Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr 65 70 75 80 Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln 85 90 95 Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu 115 120 125 Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys 130 135 140 His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His 180 185 190 Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 230 235 240 Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 260 265 270 Arg Trp Glu 275 <210> 139 <211> 671 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WT1 11D06 VH-CH1(EE)-CD3 (V9) VL-CH1-Fc(knob, PGLALA) <400> 139 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ile Glu Leu Trp Trp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 225 230 235 240 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 245 250 255 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 260 265 270 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu 275 280 285 Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 290 295 300 Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 305 310 315 320 Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 325 330 335 Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 340 345 350 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 355 360 365 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 370 375 380 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 385 390 395 400 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 405 410 415 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 420 425 430 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 435 440 445 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 450 455 460 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 465 470 475 480 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 485 490 495 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 500 505 510 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 515 520 525 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 530 535 540 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys 545 550 555 560 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 565 570 575 Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp 580 585 590 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 595 600 605 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 610 615 620 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 625 630 635 640 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 645 650 655 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 660 665 670 <210> 140 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 (V9) VH-CL <400> 140 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro 115 120 125 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 145 150 155 160 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 165 170 175 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 195 200 205 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 210 215 220 Asn Arg Gly Glu Cys 225

Claims (49)

  1. HLA-A2/WT1에 결합하는 항체로서,
    (i) 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL); 및/또는
    (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL
    을 포함하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    IgG 항체인 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    IgG1 항체인 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    전장(full-length) 항체인 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자 및 F(ab')2 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인 항체.
  6. 제1항에 있어서,
    다중특이성 항체인 항체.
  7. (a) HLA-A2/WT1인 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기로서,
    (i) 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정부(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변부(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정부(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변부(VL); 및/또는
    (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VR;
    을 포함하는 제1 항원 결합 잔기; 및
    (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 잔기로서,
    (I)(i) 서열번호 115의 HCDR 1, 서열번호 116의 HCDR 2 및 서열번호 117의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 118의 LCDR 1, 서열번호 119의 LCDR 2 및 서열번호 120의 LCDR 3을 포함하는 VL; 및/또는 (ii) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
    (II)(i) 서열번호 130의 HCDR 1, 서열번호 131의 HCDR 2 및 서열번호 132의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 133의 LCDR 1, 서열번호 134의 LCDR 2 및 서열번호 135의 LCDR 3을 포함하는 VL; 및/또는 (ii) 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
    제2 항원이 CD3인, 제2 항원 결합 잔기
    를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자.
  8. 제7항에 있어서,
    제2 항원이 CD3ε인, 이중특이성 항원 결합 분자.
  9. 제7항에 있어서,
    제1 항원 결합 잔기 및/또는 제2 항원 결합 잔기가 Fab 분자인, 이중특이성 항원 결합 분자.
  10. 제7항에 있어서,
    제2 항원 결합 잔기가, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH, 또는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 대체되는 Fab 분자인, 이중특이성 항원 결합 분자.
  11. 제10항에 있어서,
    Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는 것인, 이중특이성 항원 결합 분자.
  12. 제7항에 있어서,
    제1 항원 결합 잔기가
    불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧(Kabat)에 따른 번호부여)에 의해 독립적으로 치환되고 123번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧에 따른 번호부여)에 의해 독립적으로 치환되고;
    불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)에 의해 독립적으로 치환되고 213번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)에 의해 독립적으로 치환된
    Fab 분자인, 이중특이성 항원 결합 분자.
  13. 제7항에 있어서,
    제1 항원 결합 잔기 및 제2 항원 결합 잔기가 서로 융합되는, 임의적으로는 펩티드 링커(linker)를 통해 서로 융합되는, 이중특이성 항원 결합 분자.
  14. 제7항에 있어서,
    제1 항원 결합 잔기 및 제2 항원 결합 잔기가 각각 Fab 분자이고,
    (i) 상기 제2 항원 결합 잔기가 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되거나;
    (ii) 상기 제1 항원 결합 잔기가 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되는,
    이중특이성 항원 결합 분자.
  15. 제7항에 있어서,
    (i) 서열번호 1의 HCDR 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 4의 LCDR 1, 서열번호 5의 LCDR 2 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 VL; 및/또는
    (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL
    을 포함하는 제3 항원 결합 잔기
    를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자.
  16. 제15항에 있어서,
    제3 항원 결합 잔기가 제1 항원 결합 잔기와 동일한, 이중특이성 항원 결합 분자.
  17. 제7항에 있어서,
    제1 서브유닛(subunit) 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자.
  18. 제17항에 있어서,
    제1 항원 결합 잔기, 제2 항원 결합 잔기, 및 존재하는 경우, 제3 항원 결합 잔기가 각각 Fab 분자이고;
    (i) 상기 제2 항원 결합 잔기가 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제1 항원 결합 잔기가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되거나, (ii) 상기 제1 항원 결합 잔기가 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제2 항원 결합 잔기가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고; 존재하는 경우, 상기 제3 항원 결합 잔기가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되는,
    이중특이성 항원 결합 분자.
  19. 제17항에 있어서,
    Fc 도메인이 IgG Fc 도메인인, 이중특이성 항원 결합 분자.
  20. 제17항에 있어서,
    Fc 도메인이 인간 Fc 도메인인, 이중특이성 항원 결합 분자.
  21. 제17항에 있어서,
    Fc 도메인이 인간 IgG1 Fc 도메인인, 이중특이성 항원 결합 분자.
  22. 제17항에 있어서,
    Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중의 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기에 의해 대체되어, 제2 서브유닛의 CH3 도메인내 공동에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인내 돌기를 생성하고, Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중의 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기에 의해 대체되어, 제1 서브유닛의 CH3 도메인내 돌기가 위치할 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인내 공동을 생성하는, 이중특이성 항원 결합 분자.
  23. 제17항에 있어서,
    Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 366번 위치의 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기에 의해 대체되고(T366W), Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 407번 위치의 타이로신 잔기가 발린 잔기에 의해 대체되고(Y407V), 임의적으로 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 366번 위치의 트레오닌 잔기가 세린 잔기에 의해 대체되고(T366S), 368번 위치의 류신 잔기가 알라닌 잔기(L368A)에 의해 대체되는(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 이중특이성 항원 결합 분자.
  24. 제23항에 있어서,
    Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 추가로 354번 위치의 세린 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체되거나(S354C), 356번 위치의 글루탐산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체되고(E356C), Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 349번 위치의 타이로신 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체되는(Y349C)(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 이중특이성 항원 결합 분자.
  25. 제17항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 이중특이성 항원 결합 분자.
  26. 제25항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환이 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 존재하는, 이중특이성 항원 결합 분자.
  27. 제17항에 있어서,
    Fc 도메인의 각각의 서브유닛이 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)를 포함하는, 이중특이성 항원 결합 분자.
  28. 제7항에 있어서,
    a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 잔기 및 제3 항원 결합 잔기로서, 상기 제1 항원이 HLA-A2/WT1이고, 상기 제1 항원 결합 잔기 및 제3 항원 결합 잔기가 각각 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는 통상적인 Fab 분자인, 제1 항원 결합 잔기 및 제3 항원 결합 잔기;
    b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기로서, 상기 제2 항원이 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 잔기가 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 및 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는 Fab 분자이고, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 대체되는, 제2 항원 결합 잔기; 및
    c) 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 인간 IgG1 Fc 도메인
    을 포함하되,
    (i) a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), 123번 위치의 아미노산이 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 번호부여), a)하의 제1 항원 결합 잔기 및 제3 항원 결합 잔기의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산이 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여), 213번 위치의 아미노산이 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 색인에 따른 번호부여);
    (ii) a)하의 제1 항원 결합 잔기가 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 잔기 및 a)하의 제3 항원 결합 잔기가 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고;
    (iii) Fc 도메인의 제1 서브유닛이 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, Fc 도메인의 제2 서브유닛이 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고, Fc 도메인의 각각의 서브유닛이 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(카밧 EU 색인에 따른 번호부여)를 추가로 포함하는,
    이중특이성 항원 결합 분자.
  29. 제7항에 있어서,
    서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자.
  30. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제7항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드.
  31. 제30항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터.
  32. 제30항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 제30항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  33. HLA-A2/WT1에 결합하는 항체의 제조 방법으로서,
    (a) 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에 제32항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 임의적으로, 상기 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 제조 방법.
  34. 제33항에 따른 제조 방법에 의해 제조된, HLA-A2/WT1에 결합하는 항체.
  35. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제7항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항원 결합 분자, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학 조성물.
  36. 제35항에 있어서,
    암이 백혈병인, 약학 조성물.
  37. 제35항에 있어서,
    암이 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)인, 약학 조성물.
  38. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체.
  39. 질환의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체.
  40. 제39항에 있어서,
    질환이 암인, 항체.
  41. 제40항에 있어서,
    암이 혈액암인, 항체.
  42. 제40항에 있어서,
    암이 백혈병인, 항체.
  43. 제40항에 있어서,
    암이 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)인, 항체.
  44. 약제로서 사용하기 위한 제7항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항원 결합 분자.
  45. 질환의 치료에 사용하기 위한 제7항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항원 결합 분자.
  46. 제45항에 있어서,
    질환이 암인, 이중특이성 항원 결합 분자.
  47. 제46항에 있어서,
    암이 혈액암인, 이중특이성 항원 결합 분자.
  48. 제46항에 있어서,
    암이 백혈병인, 이중특이성 항원 결합 분자.
  49. 제46항에 있어서,
    암이 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)인, 이중특이성 항원 결합 분자.
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