BR112020011469A2

BR112020011469A2 - anticorpos, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, uso do anticorpo, método de tratamento de uma doença e invenção

Info

Publication number: BR112020011469A2
Application number: BR112020011469-3A
Authority: BR
Inventors: Joerg Benz; Christian Klein; Stefan Klostermann; Ekkehard Moessner; Johannes Sam; Pablo Umaña; Lydia Jasmin Hanisch; Alexander BUJOTZEK; Wei Xu
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-11-24
Also published as: EP3728317A2; CL2020001629A1; CO2020006600A2; TWI805665B; MX2020006119A; JP2021507698A; AU2018390881A1; RU2020123129A; TW201930356A; WO2019122052A3; IL275471A; PE20201149A1; WO2019122052A2; JP2021129561A; US20220411534A1; MA51302A; CN111527107A; KR102575787B1; JP6933778B2; PH12020550952A1

Abstract

A presente invenção refere-se de modo geral a anticorpos que se ligam ao HLA-A2/WT1, incluindo moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, por exemplo, para a ativação de células T. Além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam tais anticorpos, e vetores e células hospedeiras que compreendem tais polinucleotídeos. A invenção diz respeito ainda a métodos para produzir os anticorpos, e métodos de uso dos mesmos no tratamento de doenças.

Description

“ANTICORPOS, MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, UM OU MAIS POLINUCLEOTÍDEOS ISOLADOS, UM OU MAIS VETORES, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DO ANTICORPO, MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA DOENÇA E INVENÇÃO” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se de modo geral a anticorpos que se ligam ao HLA-A2/WT1, incluindo moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, por exemplo, para ativar células T. Além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam tais anticorpos, e vetores e células hospedeiras que compreendem tais polinucleotídeos. A invenção diz respeito ainda a métodos para produzir os anticorpos, e métodos de uso dos mesmos no tratamento de doenças.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O WT1 (tumor de Wilms 1, proteína do tumor de Wilms 1) é um fator de transcrição oncogênico envolvido na proliferação celular, diferenciação, apoptose e desenvolvimento de órgãos, cuja expressão no tecido adulto normal é rara (Hinrichs e Restifo, Nat Biotechnol (2013) 31 999- 1008). No entanto, é relatado que a WT1 está superexpressa em vários tipos de doenças hematológicas e em uma ampla gama de tumores sólidos (Van Driessche et al., Oncologist (2012) 17, 250-259). A WT1 é uma proteína nuclear, localizada intracelularmente. A proteína intracelular pode ser degradada no proteassoma, processada e apresentada na superfície celular pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC) | como epítopos de células T, e reconhecida pelos receptores de células T (TCR). Assim sendo, peptídeos derivados da WT1 tais como WT1iRmF (RMFPNAPYL) e WT1ivo (VLDFAPPGA) são apresentados no contexto de HLA-A2 na superfície celular e podem ativar o reconhecimento por células T.

[003] Diversas abordagens foram adotadas para explorar a WT1 como alvo para a (imuno)terapia do câncer, incluindo o desenvolvimento de vacinas contra o câncer baseadas no peptídeo derivado de WT1 e transferência de células T adotiva ou células T específicas para WT1. Também foram gerados anticorpos tipo TCR (TCR-like) contra o complexo HLA- A2/WT1Rwvr, incluindo seus derivados biespecíficos (Dao et al., Sci Transl Med (2013) 5 176ra33; WO2012/135854; Dao et al., Nat Biotechnol (2015) 33, 1079- 1086; WO 2015/070061; WO 2017/060201).

[004] Os anticorpos biespecíficos que se ligam a um antígeno de superfície nas células alvo e a um antígeno ativador de células T, tal como CD3 em células T (também são denominados na presente pedido como anticorpos biespecíficos de células T ou “TCBs”), são promissores para o tratamento de vários cânceres. A ligação simultânea de tal anticorpo aos seus alvos irá forçar uma interação temporária entre a célula alvo e a célula T, provocando a reticulação do receptor de célula T e a subsequente ativação de qualquer célula T citotóxica e a subsequente lise da célula alvo. Dada a sua potência na morte de células alvo, a escolha do alvo e a especificidade do anticorpo alvo são de extrema importância para os anticorpos biespecíficos de células T, para evitar toxicidades dentro e fora do alvo. As proteínas intracelulares, como a WT1, representam alvos atraentes, mas são acessíveis apenas a anticorpos do tipo receptor de células T (TCR) que se ligam ao Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC), apresentando antígenos peptídicos derivados da proteína intracelular na superfície celular. Uma questão inerente aos anticorpos do tipo TCR é a reatividade cruzada potencial com moléculas MHC per se, ou moléculas MHC que apresentam peptídeos diferentes do desejado, o que pode comprometer a seletividade de órgãos ou tecidos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção fornece novos anticorpos, incluindo anticorpos biespecíficos, que se ligam ao HLA-A2/WT1 e têm propriedades particularmente favoráveis para fins terapêuticos.

[006] Os presentes inventores desenvolveram novos anticorpos com propriedades inesperadas e melhoradas, que se ligam ao HLA-A2/WT1. Em particular, o anticorpo se liga ao HLA-A2/WT1 com boa afinidade e notável especificidade. Além disso, os inventores desenvolveram moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam ao HLA-A2/WT1 e a um antígeno ativador de célula T, incorporando o novo anticorpo HLA-A2/WT1 e combinam boa eficácia e capacidade de produção com baixa toxicidade e propriedades farmacocinéticas favoráveis.

[007] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê um anticorpo que se liga ao HLA-A2/WT1, em que o anticorpo compreende; (i); uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 6; (ii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14; (iii); uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 17, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 18, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 19, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID

NO: 20, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 21 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 22;

(iv) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 25, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 26, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 27, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 28, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 29 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 30;

(v) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 33, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 34, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 35, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 36, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 37 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 38;

(vi) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 41, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 42, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 43, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 44, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 45 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 46;

(vii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 49, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 50, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 51, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 52, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 53 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 54;

(vili) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 57, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 58, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 59, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 60, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 61 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 62; ou

(ix) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 65,

uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 66, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 67, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 68, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 69 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 70.

[008] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende; ()º uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (li) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (iv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;

(v) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40;

(vi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48;

(vii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56;

(viii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (ix) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.

[009] Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo IgG, particularmente I9G1. Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo completo (também referido como anticorpo “de comprimento total”). Em outro exemplo de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em uma molécula Fv, uma molécula scFv, uma molécula Fab e uma molécula F(ab'). Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico.

[010] A invenção também provê uma molécula de ligação a antígeno biespecífica, compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA - A2/WT1 e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende; () uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ

ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 6;

(ii): uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14;

(iii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 17, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 18, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 19, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 20, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 21 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 22;

(vi) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 41, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 42, e uma HCDR 3 de SEQ

ID NO: 43, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 44, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 45 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 46; (vil) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 49, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 50, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 51, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 52, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 53 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 54; (viii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 57, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 58, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 59, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 60, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 61 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 62; ou (ix) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 65, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 66, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 67, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 68, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 69 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 70; e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um segundo antígeno.

[011] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende; () uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 8;

(i)) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;

(ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;

(iv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;

(v) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 40;

(viii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou

(ix) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 72.

[012] Em um exemplo de realização, o anticorpo se liga especificamente ao CD3, particularmente ao CD3e. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 115, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 116, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 117, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 118, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 119 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 120. Em um exemplo de realização, a VH da segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; e a VL da segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; Em um exemplo de realização, a primeira e/ou segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si. Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que no domínio constante, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são fundidas uma à outra, opcionalmente através de um ligante peptídico.

Em um exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, moléculas Fab e (i) a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida pela porção C-terminal da cadeia pesada Fab à porção N- terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida pela porção C-terminal da cadeia pesada Fab à porção N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno.

Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende uma terceira porção de ligação ao antígeno.

Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno.

Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade.

Em um exemplo de realização, a primeira, a segunda e, quando presente, a terceira porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab, e (i) a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc; e a terceira porção de ligação ao antígeno, quando presente, é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc.

Em um exemplo de realização, o domínio Fc é de uma IgG, particularmente um domínio Fc de IgG1. Em um exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc humano. Em um exemplo de realização, um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc é substituído por um resíduo de aminoácido que tem um volume de cadeia lateral maior, gerando, assim, uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável dentro de uma cavidade no interior do domínio CH3 da segunda subunidade, e um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc é substituído por um resíduo aminoácido que tem um menor volume de cadeia lateral, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, dentro da qual a protuberância do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável. Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma ou mais substituição de um aminoácido que reduz a ligação a um receptor de Fc e/ou função efetora.

[013] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um ou mais polinucleotídeos isolados que codificam um anticorpo ou molécula de ligação a antígeno biespecífica da invenção. A invenção fornece ainda um ou mais vetores de expressão compreendendo os polinucleotídeos isolados da invenção e uma célula hospedeira compreendendo os polinucleotídeos isolados ou os vetores de expressão da invenção. Em alguns exemplos de realização a célula hospedeira é uma célula eucariótica, particularmente uma célula de mamífero.

[014] Em outro aspecto, é fornecido um método para produzir um anticorpo que se liga ao HLA-A2/WT1, compreendendo as etapas de a) cultura da célula hospedeira da invenção em condições adequadas para a expressão do anticorpo; e b) recuperação do anticorpo. A invenção também abrange um anticorpo que se liga ao HLA-A2/WT1 produzido pelo método da invenção.

[015] A invenção também provê uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[016] Também estão abrangidos pela invenção os métodos de uso do anticorpo, da molécula de ligação ao antígeno biespecífica e da composição farmacêutica da invenção. Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo, molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou uma composição farmacêutica da invenção para uso como um medicamento. Em um aspecto, é fornecido um anticorpo, molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso no tratamento de uma doença. Em um exemplo de realização específico a doença é o câncer.

[017] Também é fornecido o uso de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença, bem como um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, cujo método compreende a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção, em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em um exemplo de realização específico a doença é o câncer. Em qualquer um dos exemplos de realização anteriores o indivíduo é preferencialmente um mamífero, particularmente um humano.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[018] Figura 1. Configurações exemplificativas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção. (A, D) Ilustração da molécula “1+1 CrossMab”. (B, E) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab" com ordem alternativa dos componentes CrossFab e Fab (“invertida”). (C, F) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab”. (G, K) Ilustração da molécula “1+1 IgG CrossFab'” com ordem alternativa dos componentes CrossFab e Fab (“invertida”). (H, L) Ilustração da molécula “1+1 IgG crossFab”. (I, M) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab” com dois CrossFabs. (J, N) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab” com dois CrossFabs e com ordem alternativa dos componentes CrossFab e Fab (“invertido”). (O, S) Ilustração da molécula “Fab- CrossFab”. (P, T) Ilustração da molécula “CrossFab-Fab”. (Q, U) Ilustração da molécula (Fab)>-CrossFab”. (R, V) Ilustração da molécula “CrossFab-(Fab)2”. (W, Y) Ilustração da molécula “Fab- (CrossFab)2”. (X, Z) Ilustração da molécula “«(CrossFab)>-Fab”. Ponto Preto: modificação opcional no domínio Fc que promove a heterodimerização. ++, --: aminoácidos de cargas opostas, introduzidos opcionalmente nos domínios CH1 e CL. As moléculas CrossFab são representadas como compreendendo uma troca das regiões VH e VL, mas podem - em alguns exemplos de realização nos quais nenhuma modificação de carga é introduzida nos domínios CH1 e CL - compreender alternativamente uma troca dos domínios CH1 e CL.

[019] Figura 2. Ilustração dos anticorpos biespecíficos de células T (TCBs) preparados nos Exemplos. Todas as moléculas de anticorpo TCB testadas foram produzidas como “2+1 IgG CrossFab, invertidas' com modificações de carga (troca VH/VL no ligante de CD3, modificações de carga nos ligantes WT1, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K).

[020] Figura 3. Ligação de anticorpos IgG HLA-A2/WT1 em células T2 pulsadas com peptídeo. (A) 11D06 IgG, (B) 33H09-lgG, (C) 11B09- IgG, (D) 13B04-lgG, (E) 5E11-lgG, (F) 5C01-lgG, (G) 11G06-lgG.

[021] Figura 4. Ativação de células T por anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 (TCBs) após ligação a células T2 pulsadas com peptídeo (ensaio repórter NFAT). (A) 11D06-TCB, (B) 33H09-TCB, (C) 11B09-TCB, (D) 13B04-TCB, (E) ESK1I-TCB, (F) 5SE11-TCB. (G) 5C01-TCB, (H) DP47GS-TCB.

[022] Figura 5. Morte de células T2 pulsadas com peptídeo mediada por anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 (TCBs). (A) 11D06- TCB, (B) 33H09-TCB, (C) 13B04-TCB, (D) 11B09-TCB, (E) 33FO05-TCB, (F) 5CO01-TCB.

[023] Figura 6. Morte de linhagem de células tumorais HLA- A2*WT1* mediada por anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 (TCBs). (A) Visão geral das linhagens de células. (B-E) Morte das linhagens de células por (B) 11D06-TCB, (C) 33H09-TCB, (D) 11B09-TCB, (E) 13B04-TCB. (F) Morte de células SKM-1 por diferentes TCBs. (G) Morte de células BJAB por diferentes TCBs.

[024] Figura 7. Ativação de células T por anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 (TCBs) após ligação às células da linhagem de células tumorais HLA-A2*WT1*. (A) células SKM-1, (B) células BJAB.

[025] Figura 8. Ausência de ligação a peptídeos fora do alvo por anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 (TCBs) selecionados. (A-C) Ligação às células T2 pulsadas com peptídeo (A) 11D06-TCB, (B) 33H09-TCB, (C) ESK1I-TCB. (D-E) Ativação das células T após ligação às células T2 pulsadas com peptídeo (D) 11D06-TCB e (E) 33H09-TCB. (F) Visão geral dos peptídeos.

[026] Figura 9. Ausência de ligação a peptídeos fora do alvo pelos anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 (TCBs) selecionados. (A-B) Ativação das células T após ligação às células T2 pulsadas com peptídeo (A) 11D06-TCB e (B) 33H09-TCB. Os 6 peptídeos fora do alvo indicados foram testados juntamente com o peptídeo RMF. (C-G) Morte de células T2 pulsadas com peptídeo (C, E) 11D06-TCB, (D, F) 33H09-TCB e (G) ESK1I-TCB. Os 19 peptídeos fora do alvo indicados foram testados juntamente com os peptídeos RMF e VLD.

[027] Figura 10. Nenhuma morte de células-tronco CD34* derivadas da medula óssea normal mediada por anticorpos biespecíficos HLA- A2/WT1 x CD3 selecionados (TCBs). (A) 11D06-TCB, (B) 33H09-TCB.

[028] Figura 11. Identificação por varredura de alanina de resíduos de ligação no peptídeo RMF para anticorpos biespecíficos HLA-

A2/WT1 x CD3 selecionados (TCBs). (A) peptídeo nativo RMF, (B) peptídeo RMF R1Y, (C) peptídeo RMF R1A, (D) peptídeo RMF M2A, (E) peptídeo RMF F3A, (F) peptídeo RMF P4A, (G) peptídeo RMF N5A, (H) peptídeo RMF A6G, (1) peptídeo RMF P7A, (J) peptídeo RMF Y8A, (K) peptídeo RMF L9A. (L) Visão geral dos peptídeos. (M) Mudança em vezes do EC5o em relação ao valor EC5o para o peptídeo RMF nativo. (N) resíduos críticos de contato.

[029] Figura 12. Perfil farmacocinético dos anticorpos biespecíficos HLA-A2WT1 x CD3 (11D06-TCB e 33H09-TCB) após injeção única em camundongos NSG.

[030] Figura 13. Estudo de eficácia com anticorpos biespecíficos HLA-A2WT1 x CD3 (TCBs") no xenoenxerto SKM-1 em camundongos humanizados. (A) Desenho do estudo. (B) grupos de tratamento. (C) Cinética de crescimento tumoral (média) em todos os grupos de tratamento. (D) Cinética de crescimento de tumor único no grupo veículo. (E) Cinética de crescimento de tumor único no grupo 11D06-TCB. (F) Cinética de crescimento de tumor único no grupo 33D09-TCB. (G) Estatística. Cálculos com base no dia 38 (veículo como grupo controle). Inibição do crescimento tumoral (TGI): TGI > 100 — regressão tumoral, TGI = 100 — estase tumoral. Relação tratamento para controle (TOR): TOR = 1 — sem efeito, TOR = O — regressão completa.

[031] Figura 14. Visão geral das estruturas cristalinas dos complexos HLA-A2WT1 - pMHC. Os anticorpos (fragmentos Fab) são mostrados na parte superior, com a cadeia pesada em cinza escuro e a cadeia leve em cinza claro. Os átomos de solvente cristalizados não são mostrados. (A) estrutura cristalina da solução de 1,98 À do Fab 5CO01 em complexo com HLA-AO2/VLD pMHC. Área de contato Fab-pMHC: = 476 À?, contribuição do peptídeo: = 68 À?. (B) estrutura cristalina com resolução de 2,60 À do Fab 11DO06 em complexo com HLA-AO02/RMF pMHC. Área de contato Fab-pMHC: = 397 À?, contribuição do peptídeo: = 107 ÀÁ?. (C) estrutura cristalina com resolução de 3,05 À do Fab ESK1 em complexo com HLA-AO2/RMF pMHC (publicado, PDB ID 4WUU). Área de contato Fab-pMHC: = 505 À?, contribuição do peptídeo: = 60 À?.

[032] Figura 15. Vista aproximada na interface de ligação Fab 5C01 - HLA-A 2/WT1v.o pMHC. As interações químicas essenciais entre Fab e PMHC, conforme identificado pelo BIOVIA Discovery Studio 4.5, estão destacadas. Átomos de solvente não são mostrados.

[033] Figura 16. Interface e matriz de interação de resíduos do Fab 5C01 (linhas) com resíduos do HLA-A2/WT1vio pMHC (colunas). N = próximo/vizinho, ligação H=H, interações Pi=Pi, SB = ponte de sal. Os resíduos de interface definidos como resíduos que sofrem uma alteração na área superficial acessível ao solvente na ausência/presença do parceiro de interação.

[034] Figura 17. Vista aproximada na interface de ligação Fab 11D06 - HLA-A 2/WT1RmF pMHC. As interações químicas essenciais entre Fab e pMHC, conforme identificado pelo BIOVIA Discovery Studio 4.5, estão destacadas. Átomos de solvente não são mostrados.

[035] Figura 18. Interface e matriz de interação de resíduos do Fab 11D06 (linhas) com resíduos HLA-A2/WTiRmF pMHC (colunas). N = próximo/vizinho, ligação H=H, interações Pi=Pi, SB = ponte de sal. Os resíduos de interface definidos como resíduos que sofrem uma alteração na área superficial acessível ao solvente na ausência/presença do parceiro de interação.

[036] Figura 19. Vista aproximada na interface de ligação ESK1 Fab-HLA-A2/WTiRmF pMHC (PDB ID 4WUU). As interações químicas essenciais entre Fab e pMHC, conforme identificado pelo BIOVIA Discovery Studio 4.5, estão destacadas. Átomos de solvente não são mostrados.

[037] Figura 20. Interface e matriz de interação de resíduos do

Fab ESK1 (linhas) com resíduos do HLA-A2/WT1RmF pMHC (colunas). N = próximo/vizinho, ligação H=H, interações Pi=Pi, SB = ponte de sal. Os resíduos de interface definidos como resíduos que sofrem uma alteração na área superficial acessível ao solvente na ausência/presença do parceiro de interação.

[038] Figura 21. Morte de células HLA-A2+WT1+ SKM-1 mediadas por anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 com diferentes ligantes de CD3.

[039] Figura 22. Morte de células T2 pulsadas com peptídeo RMF mediada por anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 (TCBs).

[040] Figura 23. Avaliação da ligação a peptídeos fora do alvo por anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 (TCBs) Aali-TCB (A), Daniel- TCB (B), ESK1-TCB (C) e 11D06-TCB (D).

[041] Figura 24. Perfil farmacocinético do anticorpo biespecífico HLA-A2/WT1 x CD3 11D06-TCB (V9) após injeção única em camundongos NSG.

[042] Figura 25. Estudo de eficácia com o anticorpo biespecífico HLA-A2/WT1 x CD3 11D06-TCB (V9) em camundongos humanizados com xenoenxertos de SKM-1. (A) Cinética de crescimento tumoral (média) em todos os grupos de tratamento. (B) Cinética de crescimento de tumor único no grupo veículo. (C) Cinética de crescimento de tumor único no grupo 11D06-TCB (V9). (D) Estatística. Cálculos com base no dia 48 (veículo como grupo controle). Inibição do crescimento tumoral (TGI): TGI > 100 — regressão tumoral, TGI = 100 — estase tumoral. Relação tratamento para controle (TOR): TOR = 1— sem efeito, TOR = O — regressão completa.

[043] Figura 26. Ativação de células T por anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 (TCBs) após ligação a células CHO-K1 expressando o complexo HLA-AO2/WT1RvmF pMHC (ensaio repórter NFAT).

Linha sólida: 11D06-TCB (V9) (formato “2+1”). Linha tracejada: molécula análoga (ligantes 11DO6 e V9) no formato “1+1 CrossMab”.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[044] Os termos são utilizados na presente invenção da forma que geralmente são utilizados no estado da técnica, a menos que de outro modo definido conforme descrito a seguir.

[045] Conforme utilizado no presente, o termo “molécula de ligação ao antígeno” é utilizado no sentido mais amplo para se referir a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Exemplos de moléculas de ligação ao antígeno são imunoglobulinas e seus derivados, por exemplo, fragmentos das mesmas.

[046] O termo “biespecífico” significa que a molécula de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a, pelo menos, dois determinantes antigênicos distintos. Normalmente, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende dois sítios de ligação ao antígeno, cada um deles é específico para um determinante antigênico diferente. Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de se ligar, simultaneamente, a dois determinantes antigênicos, em particular dois determinantes antigênicos expressos em duas células distintas.

[047] O termo “valente”, usado no presente pedido denota a presença de um número especificado de sítios de ligação ao antígeno em uma molécula de ligação ao antígeno. Como tal, o termo “ligação monovalente a um antígeno” indica a presença de um (e não mais do que um) sítio de ligação ao antígeno específico para o antígeno na molécula de ligação ao antígeno.

[048] Um “sítio de ligação ao antígeno” refere-se ao sítio (local), ou seja, um ou mais resíduos de aminoácidos de uma molécula de ligação ao antígeno que provê a interação com o antígeno. Por exemplo, o sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende os resíduos de aminoácidos a partir das regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Uma molécula de imunoglobulina nativa geralmente possui dois sítios de ligação ao antígeno, de uma molécula Fab tipicamente tem apenas um único sítio de ligação ao antígeno.

[049] Conforme utilizado no presente, o termo “molécula de ligação ao antígeno” refere-se a uma molécula polipeptídica que se liga especificamente a um determinante antigênico. Em um exemplo de realização, uma porção de ligação ao antígeno é capaz de direcionar a entidade ao qual está ligada (por exemplo, uma segunda molécula de ligação a antígeno) para um local alvo, por exemplo, para um tipo específico de célula tumoral que carrega o determinante antigênico. Em outro exemplo de realização uma porção de ligação ao antígeno é capaz de ativar a sinalização através do seu antígeno alvo, por exemplo, um complexo de antígenos do receptor de células T. As moléculas de ligação ao antígeno incluem anticorpos e fragmentos destes, conforme adicionalmente definido na presente invenção. Moléculas de ligação ao antígeno específicas incluem um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada do anticorpo e uma região variável de cadeia leve do anticorpo. Em determinados exemplos de realização, as moléculas de ligação ao antígeno compreendem regiões constantes de anticorpo, conforme adicionalmente definido no presente pedido e conhecido no estado da técnica. As regiões constantes de cadeia pesada úteis incluem qualquer um dos cinco isotipos: a, 3, £e, y, ou u. As regiões constantes da cadeia leve úteis incluem qualquer um dos dois isotipos: Ke.

[050] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “determinante antigênico” ou “antígeno” refere-se a um local em uma macromolécula de polipeptídeo ao qual uma porção de ligação ao antígeno se liga, formando um complexo “porção de ligação ao antígeno - antígeno”. Os determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados, por exemplo, sobre as superfícies de células tumorais, sobre as superfícies de células infectadas por vírus, sobre as superfícies de outras células doentes, sobre as superfícies de células do sistema imunológico, livres no soro sanguíneo, e/ou na matriz extracelular (ECM).

[051] O termo “epítopo” indica o sítio em um antígeno, proteico ou não proteico, ao qual uma porção de ligação ao antígeno se liga. Os epítopos podem ser formados tanto a partir de trechos de aminoácidos contíguos (epítopo linear) ou podem compreender aminoácidos não contíguos (epítopo conformacional), por exemplo, chegando em proximidade espacial devido ao enovelamento/dobramento do antígeno, ou seja, pelo enovelamento terciário de um antígeno proteico. Os epítopos lineares ainda estão tipicamente ligados por uma porção de ligação ao antígeno após a exposição do antígeno proteináceo a agentes desnaturantes, enquanto os epítopos conformacionais são tipicamente destruídos após o tratamento com agentes desnaturantes. Um epítopo compreende pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única.

[052] O termo “CD3” refere-se a qualquer CD3 nativo a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo abrange as formas não processadas de CD3 “completo” ou “de comprimento total”, bem como qualquer forma de CD3 resultante da transformação/processamento na célula. O termo também abrange formas variantes de CD3 que ocorrem naturalmente, por exemplo, as variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas. Em um exemplo de realização, CD3 é CD3 humano, particularmente a subunidade épsilon do CD3 humano (CD3£). A sequência de aminoácidos do CD3e humano é mostrada no UniProt (www.uniprot.org). PO07766 (versão 189), ou NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP 000724.1. Veja também a SEQ ID NO:

107. A sequência de aminoácidos de cinomolgos [Macaca fascicularis] CD3e é mostrada no NCBI GenBank sob o nº BAB71849.1. Veja também a SEQ ID NO: 108.

[053] O termo “WT1”, também conhecido como “tumor de Wilms 1” ou “ proteína 1 do tumor de Wilms”, refere-se a qualquer WT1 nativa a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo abrange as formas não processadas de WT1 “completa” ou “de comprimento total”, bem como qualquer forma de WT1 resultante da transformação/processamento na célula. O termo também abrange formas variantes da WT1 que ocorrem naturalmente, por exemplo, as variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas. Em um exemplo de realização, a WT1 é a WT1 humana, particularmente a proteína de SEQ ID NO:

106. A WT1 humana está descrita no número de acesso UniProt (www.uniprot.org). P19544 (versão de entrada 215) e uma sequência de aminoácidos da WT1 humana também são mostradas na SEQ ID NO: 106.

[054] “VLD”, “peptídeo VLD" ou “WT1 VLD'" significa o peptídeo derivado de WT1 com a sequência de aminoácidos VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 77; posição 37-45 da proteína WT1 de SEQ ID NO: 106).

[055] “RMF”, “peptídeo RMF” ou “WT1RvmF" significa o peptídeo derivado de WT1 com a sequência de aminoácidos RMFRNAPYL (SEQ ID NO: 78; posição 126-134 da proteína WT1 de SEQ ID NO: 106 ).

[056] “HLA-A2”, “HLA-A*02”, “HLA-AO02”, ou “HLA-A*2” (utilizados intermutavelmente) referem-se a um sorotipo de antígeno de leucócitos humanos no grupo do sorotipo HLA-A. A proteína HLA-A2 (codificada pelo respectivo gene HLA) constitui a cadeia a da respectiva proteina MHC (complexo principal de histocompatibilidade) classe |, que compreende ainda uma subunidade B2 de microglobulina. Uma proteína HLA-A2 específica é a HLA-A201 (também conhecida como HLA-AO201, HLA-AO2.01 ou HLA- A*02:01). Em exemplos de realização específicos, a proteína HLA-A2 aqui descrita é a HLA-A201.

[057] “HLA-A2/WT1” refere-se a um complexo de uma molécula HLA-A2 e um peptídeo derivado da WT1 (também referido na presente invenção como “peptídeo WT1"”), especificamente o peptídeo RMF ou VLD ("HLA-A2/WT1RmF" e “HLA-A2WT1ivo”, respectivamente). O anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção se ligam especificamente a ambos os complexos, HLA-A2/WT1RrRmF ou HLA-A2/WT1v.o.

[058] O termo “se liga especificamente” ou “ligação específica” significa que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminada a partir de interações não desejadas ou não específicas. A capacidade da porção de ligação ao antígeno se ligar a um determinante antigênico específico pode ser mensurada por meio de um ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA) ou por outras técnicas familiares para um técnico hábil no assunto, por exemplo, a técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (analisada, por exemplo, em um instrumento BlAcore) (Liljeblad et al., Glico J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Os ensaios adequados para a determinação da especificidade do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção são descritos aqui, por exemplo, nos Exemplos 4, 9 e 10 a seguir. Em um exemplo de realização, o grau de ligação de um antígeno para a porção de ligação a uma proteína não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação da porção de ligação ao antígeno para o antígeno, conforme mensurado, por exemplo, por SPR. Em certos exemplos de realização, a porção de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno, ou a molécula de ligação ao antígeno compreendendo tal porção de ligação ao antígeno, tem uma constante de dissociação (Kb) € 1 UM, £ 100nM, £ 10nM, < 1 nM, € 0,1 nM, € 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 108 M ou menos, por exemplo, de 108 a 107º, por exemplo 10º a 10º M).

[059] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação único de uma molécula (por exemplo, anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um ligante). A expressão “afinidade de ligação” a menos que indicado de outro modo, refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do par de ligação (por exemplo, uma porção de ligação ao antígeno e um antígeno, ou um receptor e seu ligante). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Ko), que é a relação entre a velocidade de dissociação e de associação (kKor e kon, respectivamente). Deste modo, as afinidades equivalentes podem compreender diferentes constantes de velocidade, desde que a razão entre as constantes de velocidade continue a ser a mesma. À afinidade pode ser mensurada por meio de métodos bem estabelecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção. Um método particular para mensurar a afinidade é a ressonância plasmônica de superfície (SPR).

[060] A “ligação reduzida”, por exemplo, uma ligação a um receptor Fc reduzida, refere-se a uma diminuição da afinidade para a respectiva interação, tal como mensurado, por exemplo, pela SPR. Para maior clareza, o termo inclui também a redução da afinidade para zero (ou abaixo do limite de detecção do método analítico), ou seja, a abolição completa da interação. Por outro lado, “ligação aumentada” refere-se a um aumento na afinidade de ligação para a respectiva interação.

[061] Um “antígeno de ativação de célula T”, conforme utilizado na presente invenção refere-se a um determinante antigênico expresso na superfície de um linfócito T, particularmente, um linfócito T citotóxico, que é capaz de induzir a ativação de célula T mediante a interação com uma molécula de ligação ao antígeno. Especificamente, a interação de uma molécula de ligação ao antígeno com um antígeno de ativação de célula T pode induzir a ativação das células T, desencadeando a cascata de sinalização do complexo “receptor de células T'. Em um exemplo de realização específico o antígeno de ativação de célula T é o CD3, particularmente a subunidade épsilon de CD3 (veja UniProt nº. PO7766 (versão 189), NCBI RefSeg nº. NP 000724.1, SEQ ID NO: 107 para a sequência humana; ou UniProt nº. Q95LI5 (versão 49), NCBI GenBank nº. BAB71849.1; SEQ ID NO: 108 para a sequência de cinomolgo [Macaca fascicularis]).

[062] A expressão “ativação de célula T”, utilizada na presente invenção refere-se a uma ou mais resposta celular de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, selecionada a partir de: proliferação, diferenciação, secreção de citocina, liberação de molécula efetora citotóxica, atividade citotóxica, e expressão de marcadores de ativação. Os ensaios adequados para mensurar a ativação de célula T são conhecidos no estado da técnica e descritos na presente invenção.

[063] A expressão “antígeno da célula alvo”, utilizada na presente invenção, refere-se a um determinante antigênico apresentado sobre a superfície de uma célula-alvo, por exemplo, uma célula tumoral, tal como uma célula cancerosa ou célula do estroma do tumor. Em um exemplo de realização específico, o antígeno da célula alvo é o HLA-A2/WT1, particularmente o HLA- A2/WT1RwmF ou HLA-A2/WT 1v.o, mais particularmente o HLA-A2/WT1RwrF.

[064] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “primeiro”, “segundo” ou “terceiro” com relação às moléculas Fab e etc. são usados para de distinguir de modo conveniente quando existe mais do que uma porção de cada tipo. O uso desses termos não tem a intenção de conferir uma ordem ou orientação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, a menos que seja explicitamente declarado.

[065] “Fundido” significa-se que os componentes (por exemplo, uma molécula Fab e uma subunidade do domínio Fc) estão ligados por meio de ligações peptídicas, seja diretamente ou através de um ou mais ligantes peptídicos.

[066] Uma “molécula Fab” refere-se a uma proteína que consiste no domínio VH e CH1 da cadeia pesada (a “cadeia pesada Fab”) e o domínio VL e CL da cadeia leve (a “cadeia leve Fab”) de uma imunoglobulina.

[067] Por uma molécula Fab crossover (Fab cruzada) (também denominada “cross-Fab”) entende-se uma molécula Fab na qual tanto as regiões variáveis quanto as regiões constantes da cadeia pesada e leve do Fab estão trocadas (ou seja, substituídas entre si), isto é, a molécula Fab crossover compreende uma cadeia peptídica constituída pelo domínio variável de cadeia leve VL e o domínio constante de cadeia pesada 1 CH1 (VL-CH1, na direção N- para C-terminal), e uma cadeia peptídica constituída pelo domínio variável de cadeia pesada VH e o domínio constante de cadeia leve CL (VH-CL, na direção N- para C-terminal). Para maior clareza, uma molécula Fab crossover em que os domínios variáveis de cadeia leve Fab e de cadeia pesada Fab estão trocados, a cadeia peptídica que compreende o domínio constante de cadeia pesada 1 CH1 é referia no presente documento como “cadeia pesada” da molécula Fab (crossover). Por outro lado, uma molécula Fab crossover em que os domínios constantes de cadeia leve Fab e de cadeia pesada Fab estão trocados, a cadeia peptídica que compreende o domínio variável da cadeia pesada VH é referia no presente documento como “cadeia pesada” da molécula Fab (crossover).

[068] Em contrapartida, por uma molécula Fab “convencional” entende-se uma molécula Fab em seu formato natural, ou seja, compreendendo uma cadeia pesada composta pelos domínios variável e constante de cadeia pesada (VH-CH1, na direção N- para C-terminal) e uma cadeia leve composta pelos domínios variável e constante de cadeia leve (VL- CL, na direção N- para C-terminal).

[069] O termo “molécula de imunoglobulina” refere-se a uma proteína que tem a estrutura de um anticorpo que ocorre naturalmente. Por exemplo, imunoglobulinas da classe IgG nativas são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que são ligadas por ligações de bissulfeto. À partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia pesada tem um domínio variável (VH), também denominado de domínio pesado variável ou região variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), também denominados de região constante de cadeia pesada. Do mesmo modo, a partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia leve tem um domínio variável (VL), também denominado de domínio leve variável ou região variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante leve (CL), também denominado de região constante de cadeia leve. A cadeia pesada de uma imunoglobulina pode ser atribuída a um dentre cinco tipos, denominados de a (IgA), 5 (ID), e (IgE), y (IG), ou up (IgM), alguns dos quais podem ser ainda divididos em subtipos, por exemplo, y1 (I9G1), y2 (I9G2), va (I9G3), va (I9G4), a1 (IGA1) e a2 (I9A2). A cadeia leve de uma imunoglobulina pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (K) e lambda (A), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Uma imunoglobulina consiste essencialmente de duas moléculas

Fab e um domínio Fc, ligados pela região de dobradiça da imunoglobulina.

[070] O termo “anticorpo” na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange diferentes estruturas de anticorpo, incluindo, mas não se limitando, a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.

[071] O termo “anticorpo monoclonal” conforme utilizado no presente refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anticorpos individuais compreendidos em uma população são idênticos e/ou se ligam ao(s) mesmo(s) epíitopo(s), exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estão presentes em pequenas quantidades. Ao contrário das preparações com anticorpo policlonal, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre um antígeno. Portanto, o adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como uma necessidade de se produzir o anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando aos métodos de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo a totalidade ou parte dos /oci de imunoglobulinas humanas, e tais métodos e outros métodos exemplares para produzir anticorpos monoclionais descritos na presente divulgação.

[072] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi separado a partir de um componente de seu ambiente natural, ou seja, não está em seu meio natural. Não é necessário qualquer nível particular de purificação. Por exemplo, um anticorpo isolado pode ser removido do seu ambiente nativo ou natural. Os anticorpos produzidos de forma recombinante em células hospedeiras são considerados isolados para a finalidade da invenção, visto que são anticorpos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados, ou parcial ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada. Desse modo, os anticorpos e moléculas de ligação a antígeno biespecíficas da presente invenção são isolados. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo é purificado a mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por métodos eletroforéticos (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatográficos (por exemplo, cromatografia de troca iônica ou HPLC de fase inversa). Para uma revisão de métodos para a avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

[073] As expressões “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo inteiro”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são utilizadas no presente de forma alternada para se referirem a um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativa.

[074] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a Fv, Fab, Fab', Fab'- SH, F(ab')2, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos de domínio único. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, vide Hudson et a/. Nat. Med. 9:129-

134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, vide, por exemplo, Pluckthun, em The Pharmacology of Monocional Antibodies, vol. 113, Eds Rosenburg & Moore., (Springer-Verlag, Nova lorque), págs. 269-315 (1994); vide também o WO 93/16185; e as Patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Para uma discussão sobre os fragmentos Fab e F(ab')) compreendendo os resíduos do epítopo de ligação aos receptores de recuperação (salvage) e possuindo uma meia-vida in vivo aumentada, vide a Patente US 5.869.046. Os diacorpos (diabodies) são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, a Patente EP 404.097; o documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Triacorpos (triabodies) e tetracorpos (tetrabodies) também estão descritos em Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em determinados exemplos de realização, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA, vide, por exemplo, Patente US 6.248.516 B1). Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por diversas técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, Escherichia coli ou fagos), conforme descrito na presente invenção.

[075] O termo “domínio de ligação ao antígeno” refere-se à parte de uma molécula de ligação ao antígeno que compreende a área que se liga especificamente e é complementar a parte ou todo o antígeno. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (também denominado de regiões variáveis).

Particularmente, um domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo (VH).

[076] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões conservadas denominadas regiões estruturais ou arcabouços (frameworks - FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6º ed., W.H. Freeman & Co., página 91 (2007)). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Conforme utilizado na presente invenção em conexão com sequências de regiões variáveis, a expressão “numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

[077] Conforme utilizado no presente, as posições de aminoácidos de todas as regiões constantes e os domínios de cadeia pesada e leve são numerados de acordo com o sistema de numeração de Kabat descrito em Kabat, et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed,, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) e é referido na presente invenção como “numeração de acordo com Kabat” ou “numeração de Kabat”. Especificamente, o sistema de numeração de Kabat (vide as páginas 647-660 de Kabat, et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) é usado para o domínio constante de cadeia leve CL do isotipo capa e lambda e o sistema de numeração “índice EU' de Kabat

(vide as páginas 661-723) é usado para os domínios constantes de cadeia pesada (CH1, dobradiça, CH2 e CH3), que é adicionalmente clarificado no presente referindo-se a “numeração de acordo com índice EU de Kabat”, neste caso.

[078] O termo “região hipervariável” ou “HVR” conforme utilizado no presente refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que é hipervariável na sequência (“região determinante de complementaridade” ou “CDRs”) e/ou forma alças (loops) estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”) e/ou contém resíduos de contanto ao antígeno (“contato ao antígeno”). Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). HVRs exemplares na presente invenção incluem: (a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), e 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos ao antigênio que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), e 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996); e (d) combinações de (a), (b) e/ou (c), incluindo resíduos de aminoácidos HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) e 94-

102 (H3).

[079] Salvo quando indicado de outra forma, os resíduos HVR e outros resíduos do domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados na presente invenção de acordo com Kabat et al., Supra.

[080] “Região de arcabouço” ou “região estrutural” ou “FR” (de framework) referem-se aos resíduos de domínios variáveis que não sejam resíduos da região hipervariável (HVR) A FR de um domínio variável consiste geralmente em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Assim, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte ordem na VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)-FRA4.

[081] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado compreenderá de substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Tais domínios variáveis são referidos na presente invenção como “região variável humanizada”. Um anticorpo humanizado pode compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano. Em alguns exemplos de realização, alguns resíduos FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, anticorpo a partir do qual os resíduos da HVR são derivados), por exemplo, para restabelecer ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização. Outras formas de “anticorpos humanizados”

abrangidas pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi adicionalmente modificada ou alterada a partir do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação ao C1q e/ou ligação ao receptor de Fc (FcR).

[082] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde ao de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificantes de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno. Em determinados modalidades, um anticorpo humano é derivado de um mamífero não humano transgênico, por exemplo, um camundongo, rato ou coelho. Em determinados exemplos de realização, um anticorpo humano é derivado de uma linhagem de células de hibridoma. Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo isolados a partir de bibliotecas de anticorpos humanos também são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos na presente invenção.

[083] A “classe” de um anticorpo ou imunoglobulina refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante presente em sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, 1gG1, I9G2, 19G3, IgG4, IgA: e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de a, , £, y, e yu, respectivamente.

[084] O termo “domínio Fc” ou “região Fc” é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina contendo pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões de Fc de sequências nativas e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar levemente, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida como se estendendo a partir da Cis226, ou a partir da Pro230 até a região carboxi-terminal da cadeia pesada.

Entretanto, os anticorpos produzidos por células hospedeiras podem ser submetidos a clivagem pós-traducional de um ou mais, especialmente um ou dois, aminoácidos a partir da extremidade C-terminal da cadeia pesada.

Por esse motivo, um anticorpo produzido por uma célula hospedeira pela expressão de uma molécula de ácido nucleico específica que codifica uma cadeia pesada de comprimento total pode incluir a cadeia pesada de comprimento total, ou pode incluir uma variante clivada da cadeia pesada de comprimento total (também referida no presente como “cadeia pesada variante clivada”). Este pode ser o caso em que os dois aminoácidos C-terminais finais da cadeia pesada são glicina (G446) e lisina (K447, numeração de acordo com o Índice EU de Kabat). Portanto, a lisina C-terminal (Lis447), ou a glicina C- terminal (GIli446) e a lisina (K447) da região Fc, podem ou não estar presentes.

As sequências de aminoácidos das cadeias pesadas, incluindo os domínios Fc (ou uma subunidade de um domínio Fc, conforme definido na presente invenção) são indicadas no presente sem o dipeptídeo glicina-lisina C-terminal, se não indicado de outra forma.

Em um exemplo de realização da invenção, uma cadeia pesada que inclua uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, compreendida em um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção, compreende um dipeptídeo glicina-lisina C-terminal adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização da invenção, uma cadeia pesada que inclua uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, compreendida em um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção, compreende um resíduo glicina C-terminal adicional (G446,

numeração de acordo com o índice EU de Kabat). As composições da invenção, tais como as composições farmacêuticas descritas no presente, compreendem uma população de anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção.

A população de anticorpos ou de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas pode compreender moléculas possuindo uma cadeia pesada de comprimento total (completa) e moléculas com uma cadeia pesada variante clivada.

A população de anticorpos ou de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas pode consistir de uma mistura de moléculas possuindo uma cadeia pesada de comprimento total e moléculas possuindo uma cadeia pesada variante clivada, em que pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas têm uma cadeia pesada variante clivada.

Em um exemplo de realização da invenção, uma composição compreendendo uma população de anticorpos ou de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreende um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, com um dipeptídeo glicina-lisina C-terminal adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização da invenção, uma composição compreendendo uma população de anticorpos ou de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreende um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, com um resíduo de glicina C-terminal adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização da invenção, tal composição compreende uma população de anticorpos ou de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendida de moléculas que compreendem uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc conforme especificado no presente; moléculas compreendendo uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc conforme especificado no presente com um resíduo glicina C-terminal adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e moléculas compreendendo uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc conforme especificado no presente com um dipeptídeo glicina-lisina C-terminal adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). A menos que especificado de outra maneira, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado o índice EU, conforme descrito em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (veja também acima). Uma “subunidade” de um domínio Fc, conforme utilizado no presente, refere-se a um dos dois polipeptídeos que formam o domínio Fc dimérico, ou seja, um polipeptídeo compreendendo as regiões constantes C-terminais de uma cadeia pesada da imunoglobulina, capaz de realizar autoassociação estável. Por exemplo, uma subunidade de um domínio Fc de IgG compreende uma CH2 de IgG e um domínio constante CH3 de IgG.

[085] Uma “modificação que promove a associação da primeira e segunda subunidade do domínio Fc” é uma manipulação da estrutura peptídica ou modificações pós-traducionais de uma subunidade do domínio Fc que reduz ou evita a associação de um polipeptídeo que compreende a subunidade do domínio Fc com um polipeptídeo idêntico para formar um homodímero. Uma modificação que promove a associação, conforme utilizado no presente inclui, particularmente, as modificações feitas em cada uma das duas subunidades de domínio Fc separadamente (ou seja, a primeira e a segunda subunidade do domínio Fc), em que as modificações são complementares entre si, de modo a promover a associação das duas subunidades do domínio Fc. Por exemplo,

uma modificação que promove a associação pode alterar a estrutura ou a carga de uma ou ambas as subunidades do domínio Fc de modo a fazer a sua associação estéricamente ou eletrostaticamente favorável, respectivamente. Assim, a (hetero)dimerização ocorre entre um polipeptídeo que compreende a primeira subunidade do domínio Fc e um polipeptídeo que compreende a segunda subunidade do domínio Fc, que devem ser não idênticas no sentido de que outros componentes fundidos a cada uma das subunidades (por exemplo, porções de ligação ao antígeno) não sejam iguais. Em alguns exemplos de realização, a modificação que promove a associação compreende uma mutação de aminoácidos no domínio Fc, especificamente, uma substituição de aminoácidos. Em um exemplo de realização específico, a modificação que promove a associação compreende uma mutação de aminoácidos separada, especificamente uma substituição de aminoácidos em cada uma das duas subunidades do domínio Fc.

[086] O termo “funções efetoras' refere-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação de C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP); secreção de citocina; captação de antígeno mediada pelo complexo imune pelas células apresentadoras de antígeno; regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) e ativação de célula B.

[087] Tal como utilizado na presente invenção, os termos “desenvolvido, manipulado e modificado por engenharia genética” devem ser considerados para incluir qualquer tipo de manipulação da estrutura central do peptídeo ou as modificações pós-traducionais de um polipeptídeo de ocorrência natural ou recombinante ou fragmento deste. A manipulação ou modificação inclui modificações na sequência de aminoácidos, do padrão de glicosilação, ou do grupo de cadeia lateral dos aminoácidos individuais, bem como combinações destas abordagens.

[088] O termo “mutação de aminoácidos” tal como é utilizado na presente invenção pretende abranger substituições, deleções, inserções e modificações de aminoácidos. Qualquer combinação dentre substituição, deleção, inserção e modificação de aminoácidos pode ser feita para se chegar à construção final, desde que a construção final tenha as características desejadas, por exemplo, redução da ligação a um receptor Fc, ou aumento da associação com outro peptídeo. As deleções de sequências de aminoácidos e as inserções incluem deleções e inserções de aminoácidos amino- e/ou carboxi-terminal. Determinadas mutações de aminoácidos são substituições de aminoácidos. Para o propósito de alterar, por exemplo, as características de ligação de uma região Fc, substituições de aminoácidos não conservadoras, ou seja, a substituição de um aminoácido por outro aminoácido que possui propriedades estruturais e/ou químicas diferentes, são particularmente preferidas. As substituições de aminoácidos incluem a substituição por aminoácidos de ocorrência não natural ou por aminoácidos de ocorrência natural derivados dos vinte aminoácidos padrão (por exemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metil-histidina, ornitina, homo-serina, S5-hidroxilisina).). As mutações de aminoácidos podem ser geradas usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos no estado da técnica. Os métodos genéticos podem incluir a mutagênese sítio-dirigida, PCR, síntese de genes e técnicas similares. Está contemplado que os métodos de alteração do grupo da cadeia lateral de um aminoácido por outro que não seja por engenharia genética, tal como a modificação química, também pode ser útil. Várias designações podem ser utilizadas na presente invenção para indicar a mesma mutação de aminoácidos. Por exemplo, uma substituição de prolina na posição 329 do domínio Fc por glicina pode ser indicada como 329G, G329, G329, P329G, ou Pro329GIi.

[089] O “percentual (%) de identidade da sequência de aminoácidos” com relação a uma sequencia polipeptídica é definido no presente como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos (gaps), se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequências de aminoácidos pode ser obtido de diversas formas que estão dentro do conhecimento do estado da técnica, por exemplo, pelo uso de sofíwares de computador publicamente disponíveis, tais como os programas BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) ou o pacote de programas FASTA. Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Entretanto, para os fins aqui mencionados, os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa ggsearch do pacote FASTA versão 36.3.8c ou posterior com a matriz de comparação BLOSUMAB50. O pacote do programa FASTA é de autoria de W.R. Pearson e D.J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258; e Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36, e está disponível publicamente em http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta www2/fasta down.shtml. Alternativamente, um servidor público acessível em http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta www2/index.cgi pode ser usado para comparar sequências usando o programa ggsearch (global protein:protein) e as opções padrão (BLOSUMAB5O0; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) para garantir que um alinhamento global, e não local, seja realizado. A porcentagem de identidade de aminoácidos é fornecida no cabeçalho do alinhamento de saída.

[090] O termo “polinucleotídeo” refere-se a uma molécula isolada de ácido nucleico ou a construção, por exemplo, RNA mensageiro (mMRNA), RNA derivado de vírus, ou DNA plasmidial (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal como encontrado nos ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). O termo “molécula de ácido nucleico” refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, DNA ou fragmentos de RNA, presente em um polinucleotídeo.

[091] Pelo termo “isolado” na expressão “molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo isolado” entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA que foi removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes — mantidos em células hospedeiras heterólogas Ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo isolado inclui um polinucleotídeo contido em células que normalmente expressam o polinucleotídeo, mas o polinucleotídeo está presente extracromossomalmente ou em um local cromossômico que é diferente de sua localização cromossômica natural. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro da presente invenção, bem como formas de fita positiva e negativa, e as formas de dupla fita. Polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção incluem ainda estas moléculas produzidas de maneira sintética. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico que pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo, ou de terminador da transcrição.

[092] “Polinucleotídeo isolado (ou ácido nucleico) codificante” [por exemplo, de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção] refere-se a uma ou mais moléculas de polinucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos (ou fragmentos das mesmas), incluindo tais moléculas de polinucleotídeos em um único vetor ou em vetores separados, e a(s) referida(s) molécula(s) polinucleotídeo(s) estão presentes em pelo menos um ou mais local(ais) de uma célula hospedeira.

[093] O termo “cassete de expressão” referese a um polinucleotídeo gerado de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos especificados de ácido nucleico que permite a transcrição de um ácido nucleico específico em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA plastidial, vírus, ou fragmento de ácido nucleico. Normalmente, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em determinados exemplos de realização, o cassete de expressão da presente invenção compreende sequências de polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, ou fragmentos de ligação das mesmas.

[094] O termo “vetor” ou “vetor de expressão” refere-se a uma molécula de DNA que é usada para introduzir e direcionar a expressão de um gene específico que está operacionalmente ligado em uma célula alvo. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual ele foi introduzido. O vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão. Os vetores de expressão permitem a transcrição de grandes quantidades de mMRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula, a molécula de ácido ribonucleico ou proteína que é codificada pelo gene é produzida pela transcrição celular e/ou maquinário de tradução. Em um exemplo de realização, o vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão que compreende sequências de polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, ou fragmentos de ligação das mesmas.

[095] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de célula hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de maneira alternada e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e progênie dela derivada sem levar em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica quanto a conteúdo de ácido nucleico em relação à célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica, conforme triado ou selecionado na célula transformada inicial, é abrangida pela presente invenção. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser utilizada para gerar os anticorpos ou as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção. As células hospedeiras incluem células de cultura, por exemplo, células de mamíferos cultivadas, tais como células HEK, células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongos P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de inseto e células vegetais, para citar apenas algumas, como também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou tecido vegetal ou animal cultivado.

[096] Um “receptor Fc de ativação” é um receptor Fc que, após o acoplamento por uma região Fc de um anticorpo, desencadeia eventos de sinalização que estimulam as células que carregam o receptor a executarem funções efetoras. Os receptores Fc de ativação humanos incluem FecyRlilla (CD16a), FcyRI (CD64), FeyRlla (CD32), e FcaRI (CD89).

[097] A citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) é um mecanismo imune que conduz à lise de células-alvo revestidas com anticorpo pelas células efetoras do sistema imune. As células alvo são células às quais os anticorpos ou seus derivados, que compreendem uma região Fc se ligam especificamente, em geral, através da parte da proteína que é N-terminal com a região Fc. Conforme utilizado no presente, o termo “ADCC reduzida” é definido como qualquer uma redução no número de células-alvo que são lisadas em um determinado tempo, em uma dada concentração de anticorpo no meio que circunda as células-alvo por meio do mecanismo de ADCC definido acima, e/ou um aumento na concentração de anticorpo no meio que circunda as células-alvo necessário para atingir a lise de um determinado número de células-alvo em um dado momento pelo mecanismo de ADCC. A redução na ADCC é relativa à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, usando os mesmos métodos-padrão de produção, purificação, formulação e armazenamento (que são conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto), mas que não foram mas que não foram modificadas por engenharia genética. Por exemplo, a redução da ADCC mediada por um anticorpo que compreende no seu domínio Fc uma substituição de aminoácidos que reduz a ADCC, é relativo à ADCC mediada por um mesmo anticorpo sem esta substituição de aminoácidos no domínio Fc. Ensaios adequados para mensurar a ADCC são bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, a publicação PCT

WO 2006/082515 ou publicação WO 2012/130831).

[098] Uma “quantidade eficaz” de um agente refere-se à quantidade que é necessária para provocar uma alteração do estado fisiológico da célula ou do tecido ao qual é administrado.

[099] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente, por exemplo, uma composição farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado — profilático — ou terapêutico “desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, por exemplo, elimina, diminui, atrasa, minimiza ou evita os efeitos adversos de uma doença.

[100] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cachorros e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Particularmente, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.

[101] O termo “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo contida nela seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a composição deveria ser administrada.

[102] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma composição farmacêutica que não seja um ingrediente ativo e que não seja tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

[103] Conforme utilizado no presente, o termo “tratamento” (e variações gramaticais deste como “tratar” ou “tratando”) refere-se a intervenções clínicas em uma tentativa de alterar o curso natural de uma doença em um indivíduo que está sendo tratado, e pode ser realizado para profilaxia ou durante o desenvolvimento da patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquer consequência patológica direta ou indireta da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença, e remissão ou prognóstico melhorado. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença, ou retardar a progressão de uma doença.

[104] O termo “bula” da forma como é utilizado no presente refere-se a instruções habitualmente incluídas nos recipientes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, posologia, “administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas à utilização de tais produtos terapêuticos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO

[105] A invenção provê anticorpos e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam ao HLA-A2/WT1, particularmente HLA- A2/WTiRmwF ou HLA-A2/WTivwo, mais particularmente HLA-A2/WT1RMF, e possuem boa afinidade e especificidade, conforme necessário para fins terapêuticos. Além disso, as moléculas também têm outras propriedades favoráveis para aplicação terapêutica, por exemplo, no que diz respeito à eficácia e/ou segurança, bem como a produtibilidade.

ANTICORPO HLA-A2/WT1

[106] Os presentes inventores desenvolveram novos anticorpos que se ligam ao HLA-A2/WT1 com afinidade e especificidade particularmente boas. Por exemplo, conforme mostrado nos Exemplos, os inventores desenvolveram anticorpos que são notavelmente seletivos para HLA-A2/WT1 (especificamente HLA-A2/WT1RvmF) sobre complexos de HLA-A2 com outros peptídeos estruturalmente semelhantes.

[107] Assim, em certos aspectos, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao HLA-A2/WT1 e possui qualquer uma das seguintes características.

[108] Em um exemplo de realização, o anticorpo tem uma afinidade monovalente ao HLA-A2/WT1 com uma constante de dissociação (Kb) menor do que cerca de 100 nM, menor do que cerca de 75 nM, ou menor do que cerca de 50 nM. Em um exemplo de realização, o anticorpo tem uma afinidade bivalente ao HLA-A2/WT1 com uma Kp aparente menor do que cerca de 1,5 nM, menor do que cerca de 1 nM, ou menor do que cerca de 0,75 nM. Em um exemplo de realização, a afinidade bivalente (avidez) do anticorpo é 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes maior que a afinidade monovalente do anticorpo em termos de Kp (aparente).

[109] Em um exemplo de realização, a afinidade é determinada por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) a 25ºC. Em um exemplo de realização, a afinidade monovalente é determinada em um formato de molécula Fab do anticorpo. Em um exemplo de realização, a afinidade bivalente (avidez) é determinada em um formato de molécula de anticorpo IgG.

[110] Em um exemplo de realização específico, a afinidade do anticorpo é determinada da seguinte maneira.

[111] Os experimentos são realizados a 25ºC usando PBST como tampão de corrida (PBS 10 mM, pH 7,4 e 0,005% (v/v) Tween 20). Foi utilizado um biossensor ProteOn XPR36 equipado com chips para sensores GLC e GLM e reagentes de acoplamento (acetato de sódio 10 mM pH 4,5, sulfo-N-hidroxissuccinimida [sulfo-NHS], cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminpropil)-carbodi-imida [EDC] e etanolamina) da BioRad Inc.

(Hercules, CA). As imobilizações são realizadas a 30 uL/min em um chip GLM. O anticorpo específico F(ab)), pAb (cabra) anti-lgG humana (Jackson ImmunoResearch) é acoplado na direção vertical usando um procedimento padrão de acoplamento de amina: todos os seis canais de ligantes são ativados por 5 minutos com uma mistura de EDC (200 mM) e sulfo-NHS (50 mM). Imediatamente após a ativação das superfícies, o anticorpo específico para pAb (cabra) anti-lgG humano, F(ab)2 (50 pg/ml, acetato de sódio 10 mM, pH 5) é injetado nos seis canais por 5 minutos. Finalmente, os canais são bloqueados com uma injeção de 5 min de etanolamina-HCI 1M (pH 8,5). As formas variantes de Fab são capturadas a partir dos sobrenadantes de E.coli por injeção simultânea ao longo dos cinco canais horizontais separados (30 uL/min) por 5 minutos. O meio condicionado é injetado ao longo do sexto canal para fornecer um espaço em branco 'em linha' para fins de dupla referência. As medições cinéticas únicas (one-shot) são realizadas por injeção de uma série de diluições HLA-WT1 (por exemplo, HLA-A2/WTiRvmF ou HLA-A2/WT1vo) (100, 50, 25, 12,5, 6,25, O nM, 50 ulL/min) por 2 min ao longo dos canais verticais. A dissociação é monitorada por 3 min. Os dados cinéticos são analisados no ProteOn Manager v. 2.1. O processamento dos dados do ponto de reação envolve a aplicação de uma referência entre pontos (interspots) e uma etapa de referência dupla usando um espaço em branco do tampão em linha (Myszka, J Mol Recognit (1999) 12, 279-284). Os dados processados das injeções one-shot são ajustados para um modelo de ligação de Langmuir 1:1 simples, sem transporte de massa (O'Shannessy et al., Anal Biochem (1993) 212,457-468).

[112] O anticorpo da invenção se liga especificamente ao HLA- A2/WT1 (isto é, um complexo de uma molécula HLA-A2 e um peptídeo derivado de WT1). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo da invenção se liga especificamente ao HLA-A2/WT1Rvr (isto é, um complexo de uma molécula HLA-A2 e o peptídeo WT1RvF). Em um exemplo de realização mais específico, o anticorpo se liga especificamente ao HLA-A201/WT1Rwmr (isto é, um complexo de uma molécula de HLA-A201 e do peptídeo WT1iRvmF). Os anticorpos da invenção que se ligam ao HLA-A2/WT1Rwr incluem os anticorpos 11DO06, 33H09 e 5E11 descritos na presente invenção. Em outros exemplos de realização, o anticorpo da invenção se liga especificamente ao HLA-A2/WT1vio (ou seja, um complexo de uma molécula HLA-A2 e o peptídeo WT1v.o). Em um exemplo de realização mais específico, o anticorpo se liga especificamente ao HLA-A201/WT1vLo (ou seja, um complexo de uma molécula HLA-A201 e o peptídeo WT1v.o). Os anticorpos da invenção que se ligam ao HLA-A2/WT1vio incluem os anticorpos 11B09, 13B04 e 5C01 descritos na presente invenção.

[113] Em um exemplo de realização, a ligação específica do anticorpo é determinada por citometria de fluxo usando células que expressam HLA-A2/peptídeo (por exemplo, peptídeo WT1RmF ou WT1vwD), especialmente células T2 pulsadas com peptídeo.

[114] Em um exemplo de realização específico, a ligação específica do anticorpo é determinada da seguinte maneira.

[115] As células T2 são preparadas como uma suspensão celular a 10º células/ml em meio IMDM (Gibco by Life Technologies, Cat. Nº 31980- 048), suplementado com 10% de SBF (Gibco, Cat. Nº 16140-071) + 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Cat. Nº. 15070-063) (meio completo). As células são mantidas em um volume total de 10 mL em um tubo e incubadas com 10 uL de peptídeo (por exemplo, peptídeo WT ivo (SEQ ID NO: 77) ou peptídeo WT1RwmF (SEQ ID NO: 78)) a 102? M (concentração final do peptídeo: 10º M) por 2 horas a 37ºC com 5% de CO». Após a lavagem, as células são suspensas em PBS frio e incubadas com concentração titulada de anticorpo no formato IgG (por exemplo, 10 ug/mL a 0,00064 ug/mL) por 1 hora a 4ºC, seguido de incubação com um anticorpo secundário anti-Fc de IgG humana conjugado com fitoeritrina (PE) (Jackson Laboratories, Cat. Nº. 109-116-098) por 30 min. As células são adquiridas em um FACS LSR 1I (BD) e os dados são apresentados como intensidade média de fluorescência (MFI) de PE no Graphpad Prism.

[116] Em um exemplo de realização, o anticorpo da invenção não se liga significativamente ao HLA-A2 sozinho (ou seja, sem um peptídeo) ou ao HLA-A2 com um peptídeo que não seja um peptídeo derivado de WT1, como WT1RwmF ou WT ivo.

[117] Em um exemplo de realização, o anticorpo não se liga significativamente ao HLA-A2 na ausência de um peptídeo derivado de WT1, particularmente WT1RwmF ou WT ivo. Em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao HLA-A2WT1 (especificamente ao HLA-A2/WT1IRmF ou HLA- A2/WT1v.o) com uma ECs5o que é pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75 ou pelo menos 100 vezes menor que a ECso para ligação ao HLA-A2 na ausência de um peptídeo derivado de WT1 (especificamente WT1RwmF ou WT1v.o).

[118] Em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao HLA- A2/WT1 (especificamente ao HLA-A2/WT1RwmF ou HLA-A2/WT ivo), mas não se liga significativamente ao HLA-A2 com um peptídeo selecionado dentre os peptídeos na Tabela 5 (os peptídeos de SEQ ID NOs: 79-105). Em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao HLA-A2/WT1 (especificamente ao HLA- A2/WT1RwmF ou HLA-A2/WT1v.o), mas não se liga significativamente ao HLA-A2 com qualquer um dos peptídeos na Tabela 5 (os peptídeos de SEQ ID NOs 79- 105).

[119] Em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao HLA- A2/WT1 (especificamente ao HLA-A2WT1RmF ou HLA-A2/WT ivo) com uma ECs5o que é pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75 ou pelo menos 100 vezes menor que a ECso para ligação ao HLA-A2 com um peptídeo selecionado dentre os peptídeos da Tabela 5 (peptídeos de SEQ ID NOs 79-105). Em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao HLA-A2/WT1 (especificamente ao HLA- A2/WT1iRvmF ou HLA-A2/WT1ivio) com uma ECso que é pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75 ou pelo menos 100 vezes menor que a ECs5o para ligação ao HLA-A2 com qualquer um dos peptídeos na Tabela 5 (peptídeos de SEQ ID NOs 79- 105).

[120] Em um exemplo de realização, a EC5o é determinada por citometria de fluxo usando células que expressam HLA-A2/peptídeo (por exemplo, peptídeo WT1RwmF ou WT ivo), particularmente as células T2 pulsadas com peptídeo.

[121] Em um exemplo de realização específico, a EC5so é determinada da seguinte maneira.

[122] As células T2 (ATCC, Cat. Nº. CRL-1992) são preparadas como uma suspensão celular a 1086 células/ml em meio IMDM (Gibco by Life Technologies, Cat. Nº 31980-048), suplementado com 10% de SBF (Gibco, Cat. Nº 16140-071) + 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Cat. Nº. 15070- 063) (meio completo). As células são mantidas em um volume total de 10 mL em um tubo e incubadas com 10 ul de peptídeo (por exemplo, peptídeo WTiv.o (SEQ ID NO: 77) ou peptídeo WT1IRvmF (SEQ ID NO: 78)) a 10º M (concentração final do peptídeo: 10º M) por 2 horas a 37ºC com 5% de CO». Após a lavagem, as células são suspensas em PBS frio e incubadas com concentração titulada de anticorpo no formato IgG (por exemplo, 10 pg/ml a 0,00064 ug/mL) por 1 hora a 4ºC, seguido de incubação com um anticorpo secundário anti-Fc de IgG humana conjugado com fitoeritrina (PE) (Jackson Laboratories, Cat. Nº. 109-116-098) por 30 min. As células são adquiridas em um FACS LSR Il (BD) e os dados são apresentados como intensidade média de fluorescência (MFI) de PE no Graphpad Prism. Os valores da ECso são calculados no Microsoft? Excel usando o complemento XLFfitº (ID Business Solutions, Guildford, Reino Unido).

[123] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo que compete pela ligação ao HLA-A2/WT1, particularmente o HLA-A201/WT1Rwr, com um anticorpo compreendendo uma sequência da região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 7, e uma sequência da região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 8.

[124] Os ensaios de competição podem ser utilizados para identificar um anticorpo que compete com o anticorpo compreendendo a sequência VH de SEQ ID NO: 7 e a sequência VL de SEQ ID NO: 8 (o anticorpo de referência) para ligação ao HLA-A2/WT1. Em determinados exemplos de realização, tal anticorpo competidor se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, uma cadeia linear ou um epítopo conformacional) ao qual o anticorpo de referência se liga. Métodos exemplares detalhados para o mapeamento de um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” Em Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) e também descrito nos Exemplos na presente invenção. Em um ensaio de competição exemplar, o HLA-A2/WT1 imobilizado é incubado em uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga ao HLA-A2WT1 (por exemplo, o anticorpo compreendendo a sequência VH de SEQ ID NO: 7 e a sequência VL de SEQ ID NO: 8) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado quanto à sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo pela ligação ao HLA- A2/WT1. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, o HLA-A2/WT1 imobilizado é incubado com uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação sob condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo ao HLA-A2/WT1, o excesso de anticorpo não ligado é removido, e a quantidade de marcador associada com o HLA-A2/WT1 imobilizado é mensurada. Se a quantidade de marcador associado com o HLA- A2/WT1 imobilizado for substancialmente reduzida na amostra teste em relação à amostra controle, então isso indica que o segundo anticorpo compete com o primeiro anticorpo pela ligação ao HLA-A2/WT1. Vide Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

[125] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo do HLA-A2/WT1, particularmente do HLA-A201/WT1Rrwr, que um anticorpo compreendendo uma sequência da região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 7, e uma sequência da região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 8 se liga.

[126] A triagem de anticorpos que se ligam a um epítopo específico (ou seja, aqueles que se ligam ao mesmo epítopo) pode ser feita usando métodos rotineiros na técnica, como, por exemplo, sem limitação, a varredura de alanina, transferências de peptídeos (consulte Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463), análise de clivagem de peptídeos, excisão de epítopos, extração de epítopos, modificação química de antígenos (consulte Prot. Sci. 9 (2000) 487-496) e bloqueio cruzado (consulte “Antibodies”, Harlow & Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY).

[127] A determinação do perfil de anticorpo baseada na estrutura do antígeno (ASAP, do inglês Antigen Structure-based Antibody Profiling), também conhecido como perfil assistido por modificação (MAP, do inglês Modification-Assisted Profiling), permite agrupar em caixas (bins) uma infinidade de anticorpos monocionais que se ligam especificamente ao HLA- A2/WT1 com base no perfil de ligação de cada um dos anticorpos a partir da multitude de superfícies de antígeno quimicamente ou enzimaticamente modificados (consulte, por exemplo, a publicação US 2004/0101920). Os anticorpos em cada bin se ligam ao mesmo epítopo, que pode ser um epítopo único, distintamente diferente de ou parcialmente sobreposto com epítopo representado por outro bin.

[128] Além disso, a ligação competitiva pode ser usada para determinar facilmente se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo de HLA- A2/WT1 ou compete pela ligação com um anticorpo anti-HLA-A2/WT1 de referência. Por exemplo, um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo” como um anticorpo de referência refere-se a um anticorpo que bloqueia em 50% ou mais a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição, e inversamente, os anticorpos de referência bloqueiam a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais. Também, por exemplo, para determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo de HLA-A2/WT1 que um anticorpo de referência, é permitido que o anticorpo de referência se ligue ao HLA-A2/WT1 em condições de saturação. Após a remoção do excesso do anticorpo de referência, é avaliada a capacidade do anticorpo anti-HLA-A2/WT1 em questão se ligar ao HLA- A2/WT1. Se o anticorpo for capaz de se ligar ao HLA-A2/WT1 após a ligação de saturação do anticorpo de referência, pode-se concluir que o anticorpo em questão se liga a um epítopo diferente do anticorpo de referência. Mas, se o anticorpo em questão não for capaz de se ligar ao HLA-A2/WT1 após a ligação de saturação do anticorpo de referência, então o anticorpo em questão pode se ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo de referência. Para confirmar se o anticorpo em questão se liga ao mesmo epítopo ou está apenas impedido de se ligar por razões estéricas, é possível usar experimentos de rotina (por exemplo, análises de mutação e ligação de peptídeos usando ELISA, RIA, ressonância plasmônica de superfície, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação a anticorpos quantitativo ou quantitativo disponível no estado da técnica). Este ensaio deve ser realizado em duas configurações, ou seja, com os dois anticorpos sendo o anticorpo saturador. Se, em ambas as configurações, apenas o primeiro anticorpo (saturante) for capaz de se ligar ao HLA-A2/WT1, pode-se concluir que o anticorpo anti-HLA- A2/WT1 em questão e o anticorpo anti-HLA-A2/WT1 de referência compete pela ligação ao HLA-A2/WT1.

[129] Em alguns exemplos de realização, considera-se que dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo ou a um epítopo sobreposto se um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibe a ligação do outro em pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90% ou mesmo 99% ou mais, conforme medido em um ensaio de ligação competitiva (consulte, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502).

[130] Em alguns exemplos de realização, considera-se que dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo também reduzem ou eliminam a ligação do outro. Os dois anticorpos são considerados como tendo “epítopos sobrepostos" se apenas um subconjunto das mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.

[131] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo que se liga ao HLA-A2WT1, em que o anticorpo se liga a um epítopo do HLA-A2/WT1, particularmente do HLA-A2/WT1RwmF, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização a seguir. O epítopo pode ser particularmente determinado por análise da estrutura cristalina.

[132] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende pelo menos três resíduos de aminoácidos do peptídeo WT1, particularmente o peptídeo WT1RvmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[133] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende pelo menos quatro resíduos de aminoácidos do peptídeo WT1, particularmente o peptídeo WT1RmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[134] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende pelo menos cinco resíduos de aminoácidos do peptídeo WT1, particularmente o peptídeo WT1RmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[135] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende pelo menos seis resíduos de aminoácidos do peptídeo WT1, particularmente o peptídeo WT1RwmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[136] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende pelo menos três resíduos de aminoácidos do peptídeo WT1, em que os referidos pelo menos três resíduos de aminoácidos são selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos correspondentes aos resíduos de aminoácidos R1, M2, P4, N5, A6 e Y8 do peptídeo WT1RvmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[137] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende pelo menos quatro resíduos de aminoácidos do peptídeo WT1, em que os referidos pelo menos quatro resíduos de aminoácidos são selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos correspondentes aos resíduos de aminoácidos R1, M2, P4, N5, A6 e Y8 do peptídeo WT1RvmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[138] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende pelo menos cinco resíduos de aminoácidos do peptídeo WT1, em que os referidos pelo menos cinco resíduos de aminoácidos são selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos correspondentes aos resíduos de aminoácidos R1, M2, P4, N5, A6 e Y8 do peptídeo WT1RvmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[139] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende pelo menos seis resíduos de aminoácidos do peptídeo WT1, em que os referidos pelo menos seis resíduos de aminoácidos são selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos correspondentes aos resíduos de aminoácidos R1, M2, P4, N5, A6 e Y8 do peptídeo WT1RvmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[140] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos R1, N5 e A6 do peptídeo WT1RmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[141] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos R1, M2, P4, N5, A6 e Y8 do peptídeo WT1RvmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[142] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos E58, R65, K66 e Q155 da sequência HLA-A2 mostrada na SEQ ID NO: 138.

[143] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos E58, R65, K66 e Q155 da sequência HLA-A2 mostrada na SEQ ID NO: 138, e os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos R1, N5 e A6 do peptídeo WT1RmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[144] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos E58, R65, K66, Q155 e D61 da sequência HLA-A2 mostrada na SEQ ID NO: 138. Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos E58, R65, K66, Q155 e A69 da sequência HLA-A2 mostrada na SEQ ID NO: 138. Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos E58, R65, K66, Q155 e A150 da sequência HLA-A2 mostrada na SEQ ID NO: 138.

[145] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos E58, R65, K66 e Q155, e um ou mais dos resíduos D61, A69 e A150 da sequência HLA-A2 mostrada na SEQ ID NO: 138, e os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos R1, M2, P4, N5, A6 e/ou Y8 do peptídeo WT1RmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[146] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos E58, D61, G62, R65, K66, A69, A150, Q155, A158, T163, E166, W167 e R170 da sequência HLA-A2 mostrada na SEQ ID NO: 138.

[147] Em um exemplo de realização, o referido epítopo compreende resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos E58, D61, G62, R65, K66, A69, A150, Q155, A158, T163, E166, W167 e R170 da sequência HLA-A2 mostrada na SEQ ID NO: 138, e os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos R1, M2, P4, N5, A6 e/ou Y8 do peptídeo WT1RwmF mostrado na SEQ ID NO: 78.

[148] Em um exemplo de realização, o referido epítopo não compreende os resíduos de aminoácidos correspondentes aos resíduos de aminoácidos G56, D106, W107, R108, E161, G162 e/ou R169 da sequência HLA-A2 mostrada na SEQ ID NO: 138.

[149] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um anticorpo que se liga ao HLA-A2/WT1, em que o anticorpo compreende; (i)) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 6;

(ii), uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14;

(vi) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 41, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 42, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 43, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 44, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 45 e uma LCDR 3 de

SEQ ID NO: 46; (vii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 49, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 50, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 51, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 52, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 53 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 54; (viii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 57, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 58, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 59, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 60, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 61 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 62; ou (ix) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 65, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 66, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 67, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 68, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 69 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 70.

[150] Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6.

[151] Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14.

[152] Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 17, uma

HCDR 2 de SEQ ID NO: 18, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 19, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 20, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 21 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 22.

[153] Em outro exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 25, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 26, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 27, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 28, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 29 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 30.

[154] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é um anticorpo humano. Em alguns exemplos de realização, a VH é uma VH humana e/ou a VL é uma VL humana. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização acima, e compreende ainda uma região de arcabouço (framework) humana, por exemplo, um arcabouço de imunoglobulina humana.

[155] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende; ()! uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 16;

(li) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;

(vi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 48; (vii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (viii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (ix) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.

[156] Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[157] Em outro exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[158] Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[159] Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[160] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende; (). uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (ii) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%

idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;

(iii) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;

(iv) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;

(v) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40;

(vi) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48;

(vii) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56;

(viii) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (ix) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.

[161] Em um exemplo de realização específico, o anticorpos compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[162] Em outro exemplo de realização específico, o anticorpos compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[163] Em um exemplo de realização adicional, o anticorpos compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[164] Em outro exemplo de realização adicional, o anticorpos compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[165] Em determinados exemplos de realização, uma sequência VH ou VL possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo compreendendo tal sequência ainda mantém a capacidade de se ligar ao HLA-A2/WT1. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados no VH (SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63 ou 71) e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na VL (SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 ou 72). Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo compreende a sequência VH e/ou a sequência VL indicada acima, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência.

[166] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende; (i)! uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (i))) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (ili)) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (iv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (v) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (vi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (vii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (viii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (ix) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.

[167] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende; (i) a sequência VH de SEQ ID NO: 7, e a sequência VL de SEQ ID NO: 8; (ii) a sequência VH de SEQ ID NO: 15, e a sequência VL de SEQ ID NO: 16; (iii) a sequência VH de SEQ ID NO: 23, e a sequência VL de SEQ ID NO: 24; (iv) a sequência VH de SEQ ID NO: 31, e a sequência VL de SEQ ID NO: 32; (v) a sequência VH de SEQ ID NO: 39, e a sequência VL de SEQ ID NO: 40; (vi) a sequência VM de SEQ ID NO: 47, e a sequência VL de SEQ ID NO: 48; (vii) a sequência VM de SEQ ID NO: 55, e a sequência VL de SEQ ID NO: 56;

(viii) a sequência VH de SEQ ID NO: 63, e a sequência VL de SEQ ID NO: 64; (ix) a sequência VM de SEQ ID NO: 71, e a sequência VL de SEQ ID NO: 72.

[1688] Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

8.

[169] Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[170] Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[171] Em outro exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[172] Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8.

[173] Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende a sequência VH de SEQ ID NO: 15 e a sequência VL de SEQ ID NO: 16.

[174] Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24.

[175] Em outro exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32.

[176] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma região constante humana. Em um exemplo de realização, o anticorpo é uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma região constante humana, particularmente uma molécula de imunoglobulina da classe IgG compreendendo um domínio CH1, CH2, CH3 e/ou CL humano. Sequências exemplificativas de domínios constantes humanos são fornecidas nas SEQ ID NOs 112 e 113 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ ID NO: 114 (domínios constantes de cadeia pesada CH1-CH2-CH3 de I9G1 humana). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 ou SEQ ID NO: 113, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114. De modo específico, a região constante de cadeia pesada pode compreender mutações de aminoácidos no domínio Fc conforme descrito na presente invenção.

[177] Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[178] Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo IgG, particularmente IgG. Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo completo (também referido como anticorpo “de comprimento total”).

[179] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende um domínio Fc, particularmente um domínio Fc de IgG, mais particularmente um domínio Fc de IgG1. Em um exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc humano. O domínio Fc do anticorpo pode incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, descritas na presente invenção em relação ao domínio Fc da molécula de ligação a antígeno biespecífica da invenção.

[180] Em outro exemplo de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo de uma molécula Fv, uma molécula scFv, uma molécula Fab e uma molécula F(ab'); particularmente uma molécula Fab. Em outro exemplo de realização, o fragmento de anticorpo é um diabody (diacorpo), um triabody ou tetrabody.

[181] Em outro aspecto, o anticorpo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode incorporar qualquer uma das características, de forma isolada ou em combinação, conforme descrito nas seções abaixo.

VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO

[182] Em determinadas realizações, um anticorpo previsto na invenção é alterado para aumentar ou diminuir o grau em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação em um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de modo que um ou mais sítios de glicosilação é criado ou removido.

[183] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, os oligossacarídeos ligados a estes podem ser alterados. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos geralmente compreendem um oligossacarídeo ramificado, bianternário que geralmente está ligado por uma ligação N a um Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Os oligossacarídeos podem incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, Nr-acetilglicosamina (GIcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GIcNAc no

“tronco” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em alguns exemplos de realização, as modificações dos oligossacarídeos em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.

[184] Em um exemplo de realização, são fornecidos variantes de anticorpos possuindo um oligossacarídeo não fucosilado, ou seja, uma estrutura de oligossacarídeo que carece de fucose anexada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Tal oligossacarídeo não fucosilados (também referida como oligossacarídeo “afucosilado”) é particulammente um oligossacarídeo N-ligado que carece de um resíduo de fucose ligado ao primeiro GICNAc no tronco da estrutura biantenária do oligossacarídeo. Em um exemplo de realização, as variantes de anticorpo são fornecidas com uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc em comparação com um anticorpo nativo ou parental. Por exemplo, a proporção de oligossacarídeos não fucosilados pode ser de pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 80% ou mesmo cerca de 100% (ou seja, não há oligossacarídeos fucosilados). À porcentagem de oligossacarídeos não fucosilados é a quantidade (média) de oligossacarídeos sem resíduos de fucose, em relação à soma de todos os oligossacarídeos ligados ao Asn297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e com alto teor de manose), medida por espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito, por exemplo, na publicação WO 2006/082515. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado na posição 297 na região Fc (numeração EU dos resíduos da região Fc), no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de + 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a variações menores de sequência nos anticorpos. Tais anticorpos possuindo uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc podem ter ligação melhorada ao receptor de FcyRllla e/ou função efetora melhorada, em particular função ADCC melhorada. Consulte, por exemplo, as publicações US 2003/0157108; US 2004/0093621.

[185] Exemplos de linhagens de células capazes de produzir anticorpos com fucosilação reduzida incluem células CHO Lec13 deficientes da fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108; e documento WO 2004/056312, especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares nocauteadas (knockout), como células CHO nocautes para o gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8 (consulte, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94 (4): 680-688 (2006); e documento WO2003/085107), ou células com atividade reduzida ou abolida da síntese de GDP-fucose ou proteína — transportadora — (consulte, por exemplo, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282).

[186] Em um exemplo de realização adicional, variantes de anticorpo são fornecidos adicionalmente com oligossacarídeos birramificados, por exemplo, onde um oligossacarídeo bianternário anexado a região Fc do anticorpo é birramificado por GICNAc. Tais variantes de anticorpos podem possuir fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada, conforme descrito acima. Exemplos de tais variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, em Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006) WO 99/54342. WO 2004/065540, WO 2003/011878.

[187] Também são fornecidos variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Essas variantes de anticorpos podem ter a função CDC melhorada. Tais variantes de anticorpo estão descritos, por exemplo, no documento WO 1997/30087; WO 1998/58964; e WO 1999/22764.

ANTICORPOS VARIANTES MODIFICADOS COM CISTEÍNA

[188] Em determinados exemplos de realização, pode ser desejável a criação de anticorpos modificados com cisteína, por exemplo, “thioMAbS”, no qual um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em exemplos de realização específicos, os resíduos substituídos ocorrer em sítios acessíveis do anticorpo. Pela substituição de tais resíduos com cisteína, os grupos tióis reativos são assim posicionados em locais acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras moléculas, tais como moléculas de droga ou moléculas ligante-droga, para criar um imunoconjugado, conforme descrito na presente invenção.-Os anticorpos modificados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, nas Patentes US 7.521.541, US 8.30.930, US 7.855.275, US

9.000.130 ou na WO2016040856.

DERIVADOS DE ANTICORPOS

[189] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo da fornecido na presente invenção pode ser adicionalmente modificado para conter moléculas adicionais não proteináceas que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As moléculas adequadas para a derivatização do anticorpo incluem, mas não estão limitadas a polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não se limitando a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etileno-glicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, — poli-1,3,6-trioxano, — copolímero — etileno/maleico — anidrido, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli (n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co- polímeros de óxido de prolipropileno óxido de etileno, poliálcool polióis (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. O propionaldeído polietilenoglicol pode ter vantagens no processo de fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramiíficado. O número de polímeros acoplados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se anexo, os polímeros podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a ser melhorado, se o anticorpo derivado será utilizado em uma terapia sob condições definidas, etc.

[190] Em outro exemplo de realização, são fornecidos conjugados de anticorpo e porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecida por exposição à radiação. Em um exemplo de realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não se limita a, comprimento de ondas que não prejudicam células normais, mas que aquece a porção não proteinácea a uma temperatura no qual as células próximas ao conjugado anticorpo-porção não proteinácea são mortas.

IMUNOCONJUGADOS

[191] A invenção também provê imunoconjugados que compreendem um anticorpo anti-HLA-A2/WT1 conforme descrito na presente invenção conjugado (quimicamente ligado) com um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterápicos ou fármacos, agentes inibidores do crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimaticamente ativas de origem vegetal, bacteriana, fúngica ou animal, ou fragmentos destes), ou isótopos radioativos.

992] Em um exemplo de realização, um imunoconjugado é um conjugado anticorpo-droga (ADC) no qual um anticorpo é conjugado com um ou mais dos agentes terapêuticos mencionados acima. O anticorpo é tipicamente conectado a um ou mais dos agentes terapêuticos pelo uso de ligantes. Uma visão geral da tecnologia ADC, incluindo exemplos de agentes terapêuticos, drogas e ligantes, é apresentada em Pharmacol Review 68: 3-19 (2016).

[193] Em outro exemplo de realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo tal como descrito na presente invenção conjugado com uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento desta, incluindo, mas não se limitando a, cadeia A da toxina diftérica, fragmentos ativos não ligantes da toxina diftérica, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia À de rícina, cadeia A da abrina, cadeia A da modeccina, alfa-sarcina, proteínas da Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor da Sapaonaria officinalis geloninay mitogellina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

[194] Em outro exemplo de realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito na presente invenção conjugado a um átomo radioativo, para formar um radioconjugado. Uma série de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem 211At, 131), 125), %Y, 186Re, 188Re, 15Sm, 212Bi, 32P, 2!12Pb e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado for utilizado para diagnóstico, ela pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, º"Tc ou 1?31, ou um marcador de spin para formação de imagem através de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagem por ressonância magnética, MRI), tal como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

[195] Os conjugados de um anticorpo e agentes citotóxicos podem ser feitos pela utilização de uma série de agentes de acoplamento proteicos bifuncionais, tais com propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), — cicloexano-1-carboxilato — de — succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6- diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro- 2,4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, uma imunotoxina ricina, conforme descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). O ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Consulte o documento WOS94/11026. O ligante pode ser um “ligante clivável” que facilita a liberação de uma droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, um ligante ácido lábil, ligante sensível à peptidase, ligante fotolábel, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992); patente US 5.208.020).

[196] Os imunoconjugados ou ADCs da presente invenção contemplam expressamente, mas não se limitam a, conjugados preparados com reagentes de reticulação, incluindo, mas não se limitando a; BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que são comercialmente disponíveis (por exemplo, pela Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA).

ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS

[197] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo multiespecífico, por exemplo,

um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes, ou seja, epítopos diferentes em antígenos diferentes ou epítopos diferentes no mesmo antígeno. Em determinados exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico tem três ou mais especificidades de ligação. Em determinados exemplos de realização, uma das especificidades de ligação é para o HLA-A2/WT1 e a outra (duas ou mais) especificidades é para qualquer outro antígeno. Em certas realizações, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois (ou mais ) epítopos diferentes da proteína HLA-A2/WT1. Os anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) também podem ser utilizados para localizar agentes citotóxicas ou células nas células que expressam HLA-A2WT1. Os anticorpos multiespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo total ou fragmentos de anticorpo.

[198] As técnicas para produzir anticorpos multiespecífico incluem, mas não estão limitadas a, coexpressão recombinante de dois pares cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulihna possuindo diferentes especificidades (vide Milstein e Cuello, Nature 305:537(1983)), e a engenharia “knob-in-hole” (vide, por exemplo, a Patente US 5.731.168 e Atwell et al, J. Mol. Biol. 270:26 (1997)). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos; pela manipulação de efeitos de orientação eletrostática para a produção de moléculas heterodiméricas de Fc-anticorpo (consulte, por exemplo, o documento WO 2009/089004); pela reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, a Patente US 4.676.980, e Brennan et a/l., Science, 229: 81 (1985)); pelo uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992) e o documento WO 2011/034605); pelo uso da tecnologia comum da cadeia leve para contornar o problema de pareamento de cadeia leve (consulte, por exemplo, WO 98/50431); utilizando a tecnologia de “diabody' (diacorpo) para produzir fragmentos de anticorpo biespecíficos (consulte, por exemplo, Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90: 6444-6448 (1993)); e pelo uso de dímeros de Fv (sFv) de cadeia única (consulte, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)); e preparação de anticorpos triespecíficos como descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

[199] Os anticorpos manipulados com três ou mais sítios de ligação ao antígeno, incluindo, por exemplo, “Anticorpos polvo” (octopus antibodies) ou DVD-lg também estão incluídos no presente documento (consulte, por exemplo, os documentos WO 2001/77342 e WO 2008/024715). Outros exemplos de anticorpos multiespecíficos com três ou mais sítios de ligação ao antígeno podem ser encontrados nos documentos WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO2010/145792 e WO 2013/026831. O anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno também inclui um “FAb de ação dupla” ou “DAF” compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que se liga ao HLA-A2/WT1, bem como outro antígeno diferente ou dois epítopos diferentes do HLA-A2/WT1 (consulte, por exemplo, US 2008/0069820 e WO 2015/095539).

[200] Os anticorpos multiespecíficos também podem ser fornecidos em uma forma assimétrica com um cruzamento de domínio em um ou mais braços de ligação da mesma especificidade de antígeno, ou seja, trocando os domínios VH/VL (consulte, por exemplo, WO 2009/080252 e WO 2015/150447), os domínios CH1/CL (consulte, por exemplo, WO 2009/080253) ou os braços Fab completos (consulte, por exemplo, WO 2009/080251, WO 2016/016299, vide também Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, e Klein et al, MAbs 8 (2016) 1010-20). Os braços Fab assimétricos também podem ser projetados através da introdução de mutações de aminoácidos carregadas ou não carregadas em interfaces de domínio para direcionar o pareamento correto de Fab. Vide, por exemplo, o documento WO 2016/172485.

[201] Vários formatos moleculares adicionais para anticorpos multiespecíficos são conhecidos no estado da técnica e estão incluídos no presente documento (consulte, por exemplo, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).

[202] Um tipo particular de anticorpos multiespecíficos também incluídos na presente invenção são anticorpos biespecíficos projetados para se ligarem simultaneamente a um antígeno de superfície em uma célula alvo, por exemplo, uma célula tumoral e a um componente ativador e invariante do complexo receptor de célula T (TOR), como o CD3, para redirecionar as células T para matar as células alvo. Portanto, em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo multiespecífico, particularmente um anticorpo biespecífico, em que uma das especificidades de ligação é para HLA-A2/WT1 e a outra é para CD3.

[203] Exemplos de formatos de anticorpos biespecíficos que podem ser úteis para essa finalidade incluem, mas não se limitam, as moléculas chamadas “BiTE” (do inglês “bispecific T-cell engager'), em que duas moléculas scFv são fundidas por um ligante flexível (consulte, por exemplo, — WOZ2004/106381, WOZ2005/061547, WO2007/042261 e WO2008/119567, Nagorsen e Bâuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); diabodies (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) e seus derivados, tais como diabodies em tandem (“TandAb”; Kipriyanov et al., J. Mol Biol 293, 41-56 (1999)); Moléculas “DART” (redirecionamento de dupla afinidade) que são baseadas no formato de diabody, mas apresentam uma ponte de dissulfeto C- terminal para estabilização adicional (Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)) e os chamados triomabs, que são moléculas de IgG híbridas inteiras de camundongo/rato (revisadas em Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). Formatos específicos de anticorpos biespecíficos para células T incluídos na presente invenção são descritos nos documentos WO 2013/026833, —WOZ2013/026839, WO 2016/020309; Bacac et al, Oncoimmunology 5 (8) (2016) e1203498. MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICAS QuE SE LIGAM Ao HLA- A2/WT1 E A UM SEGUNDO ANTÍGENO

[204] A invenção também provê uma molécula de ligação ao antígeno biespeciífica, isto é, uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos duas porções de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente a dois determinantes antigênicos distintos (um primeiro e um segundo antígeno).

[205] Com base nos anticorpos HLA-A2/WT1 que eles desenvolveram, os presentes inventores desenvolveram moléculas de ligação a antígenos biespecíficos que se ligam ao HLA-A2/WT1 e um antígeno adicional, particularmente um antígeno de célula T de ativação, tal como o CD3.

[206] Como mostrado nos Exemplos, essas moléculas de ligação a antígenos biespecíficas têm várias propriedades notáveis, incluindo boa eficácia e baixa toxicidade.

[207] Assim, em determinados aspectos, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA-A2/WT1 e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica tem qualquer uma das seguintes características.

[208] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção induz especificamente a morte mediada por células T de células que expressam HLA-A2/WT1 (ou seja, um complexo de uma molécula de HLA-A2 e um peptídeo derivado de WT1). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção induz especificamente a morte mediada por células T de células que expressam HLA-A2/WT1RMF (ou seja, um complexo de uma molécula de HLA-A2 e um peptídeo WTiRvF). Em um exemplo de realização mais específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção induz especificamente a morte mediada por células T de células que expressam HLA-A2.01/WT1RwmF (ou seja, um complexo de uma molécula HLA-A201 e um peptídeo WT1RwmrF).

[209] Em um exemplo de realização, a indução da morte mediada por células T pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica é determinada usando células expressando HLA-A2/peptídeo (por exemplo, peptídeo WTIRmF ou WTivwo), particularmente células T2 pulsadas com peptídeo, e medindo a lactato desidrogenase (LDH) liberada a partir das referidas células após incubação com a molécula de ligação ao antígeno biespecífica na presença de células T.

[210] Em um exemplo de realização específico, a indução da morte mediada por células T pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica é determinada da seguinte maneira.

[211] As células T2 (ATCC, Cat. Nº. CRL-1992) são preparadas como uma suspensão celular a 10º células/ml. em meio IMDM (Gibco by Life Technologies, Cat. Nº 31980-048), suplementado com 10% de SBF (Gibco, Cat. Nº 16140-071) + 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Cat. Nº. 15070- 063) (meio completo). As células são mantidas em um volume total de 10 mL em um tubo e incubadas com 10 ul de peptídeo (por exemplo, peptídeo WT1v.o (SEQ ID NO: 77) ou peptídeo WT1IRmF (SEQ ID NO: 78)) a 10º M (concentração final do peptídeo: 10º M) por 2 horas a 37ºC com 5% de CO>. As células Pan CD3* são purificadas a partir de PBMCs isoladas da camada leuco-plaquetária por centrifugação em gradiente de Ficoll (GE Healthcare, Cat. Nº. 17- 1440-03). As células T CD3* totais são purificadas por MACS (Miltenyi Biotec) usando um Kit de Isolamento de células Pan T Humanas (Miltenyi Biotec, Cat. Nº. 130-096-535). O ensaio de citotoxicidade é realizado da seguinte forma: As células pulsadas com peptídeo (100 uL) são semeadas em uma placa de microtitulação de fundo redondo com 96 poços (3x105 células/mL), cocultivadas com 50 uL de células T (6x10º células/mL), e com 50 uL de molécula de ligação ao antígeno biespecífica titulada (por exemplo, a 40 vg/mL a 0,00004 po/mL) em meio completo durante 18 h a 37ºC com 5% de CO>2. Em seguida, 50 ul de sobrenadante são transferidos para uma nova placa branca e 25 ul. por poço do reagente de ensaio do kit CytoTox-Glo Luciferase Assay (Promega, Cat. G9291) são adicionados para incubação em temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos. A leitura do sinal luminescente (para medição da liberação de LDH como indicativo de morte celular) é feita pelo EnVision (PerkinElmer). Os dados são apresentados como Unidade de Luminescência Relativa (URL).

[212] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção ativa especificamente as células T na presença de células que expressam HLA-A2/WT1 (ou seja, um complexo de uma molécula de HLA-A2 e um peptídeo derivado de WT1). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção ativa especificamente as células T na presença de células que expressam HLA-A2/WT1RwmF (ou seja, um complexo de uma molécula de HLA-A2 e um peptídeo WTiRvmF). Em um exemplo de realização mais específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção ativa especificamente as células T na presença de células que expressam HLA-A201/WT1RwmF (ou seja, um complexo de uma molécula HLA-A201 e um peptídeo WT1Rwvr).

[213] Em um exemplo de realização, a ativação de células T pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica é determinada pela medição, particularmente por citometria de fluxo, da expressão de CD25 e/ou CD69 por células T após incubação com a molécula de ligação ao antígeno biespecífica na presença de células que expressam HLA-A2/peptídeo (por exemplo, WT1RwmF ou WT ivo), particularmente células T2 pulsadas com peptídeo.

[214] Em um exemplo de realização específico, a ativação de células T pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica é determinada da seguinte maneira.

[215] As células T2 (ATCC, Cat. Nº. CRL-1992) são preparadas como uma suspensão celular a 10º células/ml. em meio IMDM (Gibco by Life Technologies, Cat. Nº 31980-048), suplementado com 10% de SBF (Gibco, Cat. Nº 16140-071) + 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Cat. Nº. 15070- 063) (meio completo). As células são mantidas em um volume total de 10 mL em um tubo e incubadas com 10 ul de peptídeo (por exemplo, peptídeo WT1v.o (SEQ ID NO: 77) ou peptídeo WT1RmF (SEQ ID NO: 78)) a 10º M (concentração final do peptídeo: 10º M) por 2 horas a 37ºC com 5% de CO». As células Pan CD3* são purificadas a partir de PBMCs isoladas da camada leuco-plaquetária por centrifugação em gradiente de Ficoll (GE Healthcare, Cat. Nº. 17- 1440-03). As células T CD3* totais são purificadas por MACS (Miltenyi Biotec) usando um Kit de Isolamento de células Pan T Humanas (Miltenyi Biotec, Cat. Nº. 130-096-535). O ensaio de citotoxicidade é realizado da seguinte forma: As células pulsadas com peptídeo (100 yL) são semeadas em uma placa de microtitulação de fundo redondo com 96 poços (3x10º células/mL), cocultivadas com 50 uL de células T (6x10º células/mL), e com 50 uL de molécula de ligação ao antígeno biespecífica titulada (por exemplo, a 40 vg/mL a 0,00004 pg/mL) em meio completo durante 18 h a 37ºC com 5% de CO». As células são coletadas após 18 horas de coincubação e coradas com anticorpos contra CD3 (Biolegend Cat. Nº 300321), CD25 (Biolegend Cat. Nº 302606) e CD69 (Biolegend Cat. Nº 310914) para medir a ativação de células T por citometria de fluxo.

[216] Em outro exemplo de realização, a ativação de células T pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica é determinada usando células que expressam HLA-A2/peptídeo (por exemplo, peptídeo WT1RMF Ou WT1v.o), particularmente células T2 pulsadas com peptídeo e uma linhagem de células T repórter, particularmente uma linhagem de células T Jurkat que expressam a molécula repórter luciferase ativada por um elemento de resposta NFAT (fator nuclear de células T ativadas).

[217] Em um exemplo de realização específico, a ativação de células T pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica é determinada da seguinte maneira.

[218] As células T2 (ATCC, Cat. Nº. CRL-1992) são preparadas como uma suspensão celular a 106 células/ml em meio IMDM (Gibco by Life Technologies, Cat. Nº 31980-048), suplementado com 10% de SBF (Gibco, Cat. Nº 16140-071) + 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Cat. Nº. 15070- 063) (meio completo). As células são mantidas em um volume total de 10 mL em um tubo e incubadas com 10 ul de peptídeo (por exemplo, peptídeo WT1iv.o (SEQ ID NO: 77) ou peptídeo WT1IRvmF (SEQ ID NO: 78)) a 10º M (concentração final do peptídeo: 10º M) por 2 horas a 37ºC com 5% de CO». Após a lavagem, são semeados 90 uL de células pulsadas com peptídeo em uma suspensão celular de 2,2 x 105 células/mL em uma placa de microtitulação de fundo redondo de 96 poços (20.000 células/poço, TPP, Cat. Nº. 92097), cocultivadas com 50 ul de células Jurkat que expressam luciferase sob o promotor de NFAT (Jurkat-NFAT; Promega, Cat. Nº. CS176501) (suspensão de células de 2x10º células/mL), e com 10 ul de molécula de ligação ao antígeno biespecífica titulada (por exemplo, a 100 ug/ml de 0,0064 ug/ml em PBS)

durante 16 horas a 37ºC com 5% CO;». Posteriormente, 50 ul. de sobrenadante são removidos e substituídos por 100 ul por poço de ensaio Bright-Glo Luciferase (Promega, Cat. E2620) para incubação em temperatura ambiente (RT). Cinco minutos depois, 180 uL de sobrenadante são transferidos para uma nova placa branca para medir o sinal de luminescência por EnVision (PerkinElmer). Os dados são apresentados como Unidade de Luminescência Relativa (URL).

[219] Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção não induz significativamente a morte mediada por células T, ou ativa as células T na presença de células que expressam apenas HLA-A2 (ou seja, sem um peptídeo) ou HLA-A2 com um peptídeo diferente de um peptídeo derivado de WT1, tal como WT1RmF Ou WT1voo.

[220] Em um exemplo de realização, a ligação ao antígeno biespecífico não induz significativamente a morte mediada por células T, ou ativa as células T na presença de células que expressam HLA-A2 na ausência de um peptídeo derivado de WT1, particularmente WT1RmF ou WT ivo. Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica induz a morte mediada por células T e/ou ativa as células T na presença de células que expressam HLA-A2WT1 (especificamente HLA-A2WTIRwe ou HLA- A2/WT1v.o) com uma ECrso que é pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75 ou pelo menos 100 vezes menor que a ECso para indução de morte mediada por células T, ou ativação de células T na presença de células que expressam HLA-A2 na ausência de um peptídeo derivado de WT1 (especificamente WT1RwmF ou WT1vo).

[221] Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica induz a morte mediada por células T e/ou as ativa células

T na presença de células que expressam HLA-A2/WT1 (especificamente HLA- A2/WT1iRmF ou HLA-A2/WT1iwv.o), mas não induz significativamente a morte mediada por células T, ou ativa as células T na presença de células que expressam HLA-A2 com um peptídeo selecionado dentre os peptídeos da Tabela 5 (peptídeos de SEQ ID NOs 79-105). Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica induz a morte mediada por células T e/ou as ativa células T na presença de células que expressam HLA- A2/WT1 (especificamente HLA-A2/WT1RmF ou HLA-A2/WT ivo), mas não induz significativamente a morte mediada por células T, ou ativa as células T na presença de células que expressam HLA-A2 com qualquer um dos peptídeos da Tabela 5 (os peptídeos de SEQ ID NOs: 79-105).

[222] Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica induz a morte mediada por células T e/ou ativa as células T na presença de células que expressam HLA-A2/WT1 (especificamente HLA- A2WT1RmF ou HLA-A2/WT1iv.o) com uma ECso que é pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75 ou pelo menos 100 vezes menor que a ECso para indução de morte mediada por células T e/ou a ativação de células T na presença de células que expressam HLA-A2 com um peptídeo selecionado a partir dos peptídeos da Tabela 5 (peptídeos de SEQ ID NOs: 79-105). Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica induz a morte mediada por células T e/ou ativa as células T na presença de células que expressam HLA- A2/WT1 (especificamente HLA-A2/WT1RwmF ou HLA-A2/WT ivo) com uma ECso que é pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75 ou pelo menos 100 vezes menor que a EC5o para indução de morte mediada por células T e/ou a ativação de células T na presença de células que expressam HLA-A2 com qualquer um dos peptídeos na Tabela 5 (os peptídeos de SEQ ID NOs: 79-105).

[223] Em um exemplo de realização, a indução da morte mediada por células T e/ou ativação de células T é determinada conforme descrito acima, e a ECso é calculada no Microsoftº Excel usando o complemento XLFfitº (ID Business Solutions, Guildford, Reino Unido).

[224] De acordo com exemplos de realização específicos da invenção, as porções de ligação ao antígeno compreendidas na molécula de ligação ao antígeno biespecífica são moléculas Fab (ou seja, domínios de ligação ao antígeno composto de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, cada uma compreendendo um domínio variável e um domínio constante). Em um exemplo de realização, a primeira e/ou segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab. Em um exemplo de realização, a referida molécula Fab é humana. Em um exemplo de realização, a referida molécula Fab é humanizada. Em outro exemplo de realização adicional, a referida molécula Fab compreende domínios constantes de cadeia pesada e leve humana.

[225] De modo preferido, pelo menos uma das porções de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover (cruzada). Tais modificações reduzem o pareamento incorreto de cadeias leves e pesadas entre diferentes moléculas Fab, melhorando assim o rendimento e a pureza da molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção na produção recombinante. Em uma molécula Fab crossover particular útil para a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção, os domínios variáveis de cadeia leve Fab e de cadeia pesada Fab (VL e VH, respectivamente) são trocados. Entretanto, mesmo com essa troca de domínio a preparação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode compreender determinados subprodutos devido a uma interação do tipo Bence Jones entre cadeias pesadas e leves incorretamente pareadas (vide Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191). Para reduzir ainda mais o desalinhamento (pareamento incorreto) das cadeias pesadas e leves de diferentes moléculas Fab e, assim, aumentar a pureza e o rendimento da molécula de ligação ao antígeno biespecífica desejada, podem ser introduzidos aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos nos domínios CH1 e CL da(s) molécula(s) Fab que se ligam ao primeiro antígeno (HLA-A2/WT1), ou a molécula Fab que se liga ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de células T de ativação, tal como CD3) conforme descrito na presente invenção. As modificações de carga são feitas nas moléculas Fab convencionais compreendidas na molécula de ligação ao antígeno biespecífica (como mostrado, por exemplo, nas Figuras 1 A-C, G-J), ou nas moléculas Fab crossover VH/VL compreendidas na molécula de ligação ao antígeno biespecífica (como mostrado por exemplo, nas Figuras 1 D-F, K-N) (mas não em ambas). Em exemplos de realização específicos, as modificações de carga são feitas na(s) molécula(s) Fab convencional(is) compreendida(s) na molécula de ligação ao antígeno biespecífica (que em exemplos de realização específicos se ligam especificamente ao primeiro antígeno, ou seja, HLA- A2WT1).

[226] Em um exemplo de realização específica de acordo com a invenção, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de se ligar simultaneamente ao primeiro antígeno (ou seja, HLA-A2/WT1) e ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3). Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de reticular com uma célula T e uma célula alvo pela ligação simultânea ao HLA-A2/WT1 e a um antígeno de célula T de ativação. Em um exemplo de realização ainda mais específico, tal ligação simultânea resulta na lise da célula-alvo, particularmente uma célula tumoral expressando HLA-A2/WT1. Em um exemplo de realização, tal ligação simultânea resulta na ativação da célula T. Em outros exemplos de realização, essa ligação simultânea resulta em uma resposta celular de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, selecionado a partir do grupo de: proliferação, diferenciação, secreção de citocinas, liberação de moléculas efetoras citotóxicas, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. Em um exemplo de realização, a ligação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ao antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3, sem ligação simultânea ao HLA-A2/WT1 não resulta na ativação da célula T.

[227] Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de redirecionar a atividade citotóxica de uma célula T para uma célula alvo. Em um exemplo de realização específico, a referida reorientação é independente da apresentação de antígeno mediada por MHC pela célula-alvo e/ou da especificidade da célula T.

[228] Particularmente, uma célula T, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização da invenção, é uma célula T citotóxica. Em alguns exemplos de realização a célula T é uma célula T CD4* ou uma célula T CD8*, em particular é uma célula T CD8*.

PRIMEIRA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO

[229] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno, particularmente uma molécula Fab, que se liga ao HLA-A2/WT1 (primeiro antígeno). Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende duas porções de ligação ao antígeno, particularmente moléculas Fab, que se ligam ao HLA-A2/WT1. Em tal exemplo de realização específico, cada uma destas porções de ligação ao antígeno se liga ao mesmo determinante antigênico. Em um exemplo de realização ainda mais específico, todas estas porções de ligação ao antígeno são idênticas, ou seja, compreendem as mesmas sequências de aminoácidos, incluindo as mesmas substituições de aminoácidos no domínio CH1 e CL, conforme descrito na presente invenção (se houver). Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende mais do que duas porções de ligação ao antígeno, particularmente moléculas Fab, que se ligam ao HLA- A2/WT1.

[230] Em exemplos de realização particulares, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se ligaím) a um HLA-A2/WT1 é(são) uma molécula(s) Fab convencional(ais). Em tais exemplos de realização, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) a um segundo antígeno é(são) molécula(s) Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, molécula(s) Fab na(s) qual(quais) os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si.

[231] Em tais exemplos de realização alternativos, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) HLA-A2/WT1 é(são) uma molécula(s) Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si Em tais exemplos de realização, a(s) porção(ões) que se liga(m) a um segundo antígeno é(são) preferencialmente molécula(s) Fab convencional(ais).

[232] A porção de ligação ao HLA-A2/WT1 é capaz de direcionar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica para um sítio alvo, por exemplo, para um tipo específico de célula tumoral que expressa o HLA-A2/WT1.

[233] A primeira porção de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode incorporar qualquer um dos recursos, isoladamente ou em combinação, descritos na presente invenção em relação ao anticorpo que se liga ao HLA-A2/WT1, a menos que seja cientificamente claramente irracional ou impossível.

[234] Assim, em um aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;

(a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1 e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende:

()) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 6;

(ii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14;

(iii), uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 17, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 18, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 19, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 20, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 21 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 22;

(iv) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 25, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 26, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 27, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 28, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 29 e uma

LCDR 3 de SEQ ID NO: 30;

(vi). uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 41, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 42, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 43, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 44, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 45 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 46;

(viii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 57, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 58, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 59, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 60, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 61 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 62; ou

(ix) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 65, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 66, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 67, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 68, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 69 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 70, e

(b)º uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno.

[235] Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6.

[236] Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14.

[237] Em um exemplo de realização adicional, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 17, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 18, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 19, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 20, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 21 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 22.

[238] Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 25, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 26, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 27, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 28, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 29 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 30.

[239] Em alguns exemplos de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno é (derivada de) um anticorpo humano. Em alguns exemplos de realização, a VH é uma VH humana e/ou a VL é uma VL humana. Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização acima, e compreende ainda uma região de arcabouço (framework) humana, por exemplo, um arcabouço de imunoglobulina humana.

[240] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende;

())) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;

(ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;

(ii), uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;

(iv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 32;

(vili) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 64; ou (ix) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.

[241] Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[242] Em outro exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[243] Em um exemplo de realização adicional, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 24.

[244] Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende; ()) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (i))) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (iii), uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (iv) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%

idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (v) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (vi) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (vii) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (viii) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (ix) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.

[245] Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[246] Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

16.

[247] Em um exemplo de realização adicional, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[248] Em um exemplo de realização adicional, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[249] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende; (i) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (iii), uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (iv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (v) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (vi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (vii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (viii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (ix) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.

[250] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende; (i) a sequência VM de SEQ ID NO: 7, e a sequência VL de SEQ ID NO: 8; (ii) a sequência VM de SEQ ID NO: 15, e a sequência VL de

SEQ ID NO: 16; (iii) a sequência VH de SEQ ID NO: 23, e a sequência VL de SEQ ID NO: 24; (iv) a sequência VH de SEQ ID NO: 31, e a sequência VL de SEQ ID NO: 32; (v) a sequência VM de SEQ ID NO: 39, e a sequência VL de SEQ ID NO: 40; (vi) a sequência VH de SEQ ID NO: 47, e a sequência VL de SEQ ID NO: 48; (vii) a sequência VH de SEQ ID NO: 55, e a sequência VL de SEQ ID NO: 56; (viii) a sequência VH de SEQ ID NO: 63, e a sequência VL de SEQ ID NO: 64; ou (ix) a sequência VM de SEQ ID NO: 71, e a sequência VL de SEQ ID NO: 72.

[251] Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.

[252] Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[253] Em um exemplo de realização adicional, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24.

[254] Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32.

[255] Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8.

[256] Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16.

[257] Em um exemplo de realização adicional, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24.

[258] Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32.

[259] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante humana. Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região constante humana, particularmente um domínio CH1 e/ou CL humano. Sequências exemplares de domínios constantes humanos são fornecidas nas SEQ ID NOs: 112 e 113 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ ID NO: 114 (domínios constantes de cadeia pesada CH1-CH2-CH3 de IgG1 humana). Em alguns exemplos de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 ou SEQ ID NO: 113, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112.

Particularmente, a região constante de cadeia leve pode compreender mutações de aminoácidos tal como descrito na presente invenção na seção “modificações de carga” e/ou pode compreender deleção ou substituições de um ou mais (particularmente dois) aminoácidos N-terminais se presente em uma molécula Fab crossover. Em alguns exemplos de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de domínio CH1 compreendida em a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114. Particularmente, a região constante de cadeia pesada (especificamente domínio CH1) pode compreender mutações de aminoácidos conforme descrito na presente invenção em “modificações de carga”.

SEGUNDA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO

[260] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno, particularmente uma molécula Fab, que se liga a um segundo antígeno, (diferente do HLA- A2WT1).

[261] Em exemplos de realização específicos, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao segundo antígeno é(são) uma molécula(s) Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, molécula(s) Fab na(s) qual(quais) os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si Em tais exemplos de realização, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao primeiro antígeno (ou seja, HLA-A2/WT1) é(são) preferencialmente molécula(s) Fab convencional(ais). Em exemplos de realização em que há mais de uma porção de ligação ao antígeno, particularmente a molécula Fab, que se liga ao HLA- A2/WT1 compreendido na molécula de ligação ao antígeno biespecífica, a porção de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno é preferencialmente uma molécula de Fab crossover e as porções de ligação ao antígeno que se ligam ao HLA-A2/WT1 são moléculas Fab convencionais.

[262] Em exemplos de realização alternativos, a(s) porção(ões) que se liga(m) ao segundo antígeno é(são) preferencialmente uma molécula(s) Fab convencional(ais). Em tais exemplos de realização, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao primeiro antígeno (ou seja, HLA-A2/WT1) é(são) uma molécula(s) Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em exemplos de realização em que há mais de uma porção de ligação ao antígeno, particularmente a molécula Fab, que se liga ao segundo antígeno compreendido na molécula de ligação ao antígeno biespecífica, a porção de ligação ao antígeno que se liga ao ao HLA-A2/WT1 é preferencialmente uma molécula Fab crossover e as porções de ligação ao antígeno que se ligam ao segundo antígeno são moléculas Fab convencionais.

[263] Em alguns exemplos de realização, o segundo antígeno é um antígeno de célula T de ativação (também referido como uma “porção de ligação ao antígeno de célula T de ativação” ou “molécula Fab de ligação ao antígeno de célula T de ativação”). Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende não mais do que uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno ativador de célula T (antígeno de célula T de ativação). Em um exemplo de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica provê a ligação monovalente ao antígeno de ativação de célula T.

[264] Em exemplos de realização específicos, o segundo antígeno é o CD3, particularmente o CD3 humano (SEQ ID NO: 107) ou CD3 de cinomolgo (SEQ ID NO: 108), sendo mais particularmente o CD3 humano.

Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno reage cruzadamente (ou seja, se liga especificamente) com CD3 humano e CD3 de cinomolgo. Em alguns exemplos de realização, o segundo antígeno é a subunidade épsilon do CD3 (CD3 épsilon).

[265] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 115, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 116, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 117, e uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 118, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 119 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 120.

[266] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 115, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 116, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 117, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 118, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 119 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 120.

[267] Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é (derivada de) um anticorpo humanizado. Em alguns exemplos de realização, a VM é uma VH humanizada e/ou a VL é uma VL humanizada. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda uma região de arcabouço humana aceptora, por exemplo, um arcabouço (framework) de imunoglobulina humana ou arcabouço de consenso humano.

[268] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.

[269] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.

[270] Em um exemplo de realização, a VH da segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; e a VL da segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.

[271] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.

[272] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 121 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 122.

[273] Em um exemplo de realização específico, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 130, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 131, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 132, e uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 133, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 134 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 135.

[274] Em outro exemplo de realização específico, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma

HCDR 1 de SEQ ID NO: 130, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 131, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 132, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 133, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 134 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 135.

[275] Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é (derivada de) um anticorpo humanizado. Em alguns exemplos de realização, a VH é uma VH humanizada e/ou a VL é uma VL humanizada. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda uma região de arcabouço humana aceptora, por exemplo, um arcabouço (framework) de imunoglobulina humana ou arcabouço de consenso humano.

[276] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137.

[277] Em um exemplo de realização específico, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137.

[278] Em outro exemplo de realização, a VH da segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136; e a VL da segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137.

[279] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137.

[280] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 136 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 137.

[281] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante humana. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região constante humana, particularmente um domínio CH1 e/ou CL humano. Sequências exemplares de domínios constantes humanos são fornecidas nas SEQ ID NOs: 112 e 113 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ ID NO: 114 (domínios constantes de cadeia pesada CH1-CH2-CH3 de IgG1 humana). Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 ou SEQ ID NO: 113, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ I|D NO: 112. Particularmente, a região constante de cadeia leve pode compreender mutações de aminoácidos tal como descrito na presente invenção na seção “modificações de carga” e/ou pode compreender deleção ou substituições de um ou mais (particularmente dois) aminoácidos N-terminais se presente em uma molécula Fab crossover (cruzada). Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de domínio CH1 compreendida em a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

114. Particularmente, a região constante de cadeia pesada (especificamente domínio CH1) pode compreender mutações de aminoácidos conforme descrito na presente invenção em “modificações de carga”.

[282] Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si (ou seja, de acordo com tal exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover em que são trocados os domínios variáveis ou constantes da cadeia leve Fab e cadeia pesada Fab). Em um desses exemplos de realização, a primeira (e a terceira se houver) porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[283] Em um exemplo de realização, não mais de uma porção de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de célula T de ativação, como CD3) está presente na molécula de ligação ao antígeno biespecífica (ou seja, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica fornece ligação monovalente ao segundo antígeno).

MODIFICAÇÕES DE CARGA

[284] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem compreender substituições de aminoácidos nas moléculas Fab compreendidas nelas que são particularmente eficientes na redução do pareamento incorreto de cadeias leves com cadeias pesadas não correspondentes (subprodutos do tipo Bence - Jones), que pode ocorrer na produção de moléculas de ligação ao antígeno bi-/multiespecíficas baseadas em Fab com uma troca VH/VL em um (ou mais, no caso de moléculas que compreendem mais de duas moléculas Fab de ligação ao antígeno) de seus braços de ligação (veja também a Publicação PCT WO 2015/150447, particularmente os exemplos aí descritos, integralmente incorporada ao presente como referência). A proporção de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica desejada em comparação com subprodutos indesejados, em particular subprodutos do tipo Bence - Jones que ocorrem em moléculas de ligação ao antígeno biespecífica com uma troca de domínio VH/VL em um de seus braços de ligação, pode ser melhorada pela introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos nos domínios CH1 e CL (às vezes referidos como “modificações de carga”).

[285] Assim, em alguns exemplos de realização, quando a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno biespecífica são, ambas, moléculas Fab, e em uma das porções de ligação ao antígeno (particularmente a segunda porção de ligação ao antígeno) os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, i) no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por um aminoácido carregado positivamente (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído por um aminoácido carregado negativamente (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); ou ii) no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por um aminoácido carregado positivamente (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído por um aminoácido carregado negativamente (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[286] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica não compreende as duas modificações mencionadas em i) e ii). Os domínios constantes CL e CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno possuindo a troca VH/VL não são substituídos um pelo outro (ou seja, permanecem inalterados).

[287] Em um exemplo de realização mais específico, (i) no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); ou (ii) no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[288] Em tal exemplo de realização, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[289] Em um exemplo de realização adicional, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[290] Em um exemplo de realização específico, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[291] Em um exemplo de realização mais específico, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[292] Em outro exemplo de realização particular, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[293] Em exemplos de realização específicos, se as substituições de aminoácidos de acordo com os exemplos de realização acima forem feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno é do isotipo kappa.

[294] Alternativamente, as substituições de aminoácidos de acordo com os exemplos de realização acima podem ser feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno ao invés de serem feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno. Em tais exemplos de realização, o domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno é do isotipo kappa.

[295] Consequentemente, em um exemplo de realização, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[296] Em um exemplo de realização adicional, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[297] Em outro exemplo de realização, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[298] Em um exemplo de realização mais específico, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[299] Em outro exemplo de realização, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[300] Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, especificamente HLA-A2/WT1iRvF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO:6,e (b) uma segunda molécula de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab na qual os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si; em que, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)),) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização particular, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[301] Em outro exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, especificamente HLA-A2/WT1irwmF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH)

compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14, e (b) uma segunda molécula de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab na qual os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si; em que, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)),) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização particular, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

FORMATOS DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICAS

[3802] Os componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção, podem ser fundidos entre si em uma variedade de configurações. Configurações exemplares são apresentadas na Figura 1.

[303] Em exemplos de realização específicos, as porções de ligação ao antígeno compreendidas na molécula de ligação ao antígeno são moléculas Fab. Em tais exemplos de realização, a primeira, segunda, terceira etc. porção de ligação ao antígeno pode ser referida no presente como primeira, segunda, terceira etc. molécula Fab, respectivamente.

[304] Em um exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica estão fundidas uma à outra, opcionalmente através de um peptídeo ligante. Em exemplos de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, moléculas Fab. Em tal exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno. Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno. Em exemplos de realização em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C- terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno, adicionalmente, a cadeia leve do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno e a cadeia leve do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno podem estar fundidas entre si, opcionalmente por meio de um peptídeo ligante.

[305] Uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica com uma única porção de ligação ao antígeno (tal como uma molécula Fab) capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, como o HLA-A2/WT1 (por exemplo, conforme mostrado na Figura 1A, D, G, H, K, L) é útil, particularmente nos casos onde se espera a internalização do antígeno da célula alvo após a ligação de uma porção de ligação ao antígeno de alta afinidade. Em tais casos, a presença de mais do que uma porção de ligação ao antígeno específica para o antígeno de células-alvo pode aumentar a internalização do antígeno das células-alvo, reduzindo deste modo a sua disponibilidade.

[306] Entretanto, em outros casos será vantajoso dispor de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo duas ou mais porções de ligação ao antígeno (tal como moléculas Fab) específicas para um antígeno da célula alvo (veja os exemplos mostrados na Figura 1B, 1C, 1E, 1F, 11, 1J. 1M ou IN), por exemplo, para otimizar o direcionamento para o sítio alvo ou para permitir a reticulação de antígenos da célula alvo.

[307] Consequentemente, em exemplos de realização específicos, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende uma terceira porção de ligação ao antígeno.

[308] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno se liga ao primeiro antígeno, isto é, HLA-A2/WT1. Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab.

[309] Em exemplos de realização específicos, a terceira porção de ligação ao antígeno é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno.

[310] A terceira porção de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode incorporar qualquer um dos recursos, isoladamente ou em combinação, descritos na presente invenção em relação a primeira porção de ligação ao antígeno e/ou ao anticorpo que se liga ao HLA-

A2/WT1, a menos que cientificamente seja claramente irracional ou impossível.

[311] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende; (i)º uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 6; (ii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14; (iii), uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 17, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 18, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 19, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 20, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 21 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 22; (iv) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 25, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 26, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 27, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 28, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 29 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 30; (v) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 33, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 34, e uma HCDR 3 de SEQ ID

NO: 35, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 36, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 37 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 38; (vi) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 41, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 42, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 43, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 44, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 45 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 46; (vii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 49, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 50, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 51, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 52, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 53 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 54; (viii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 57, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 58, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 59, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 60, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 61 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 62; ou (ix) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 65, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 66, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 67, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 68, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 69 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 70.

[312] Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6.

[313] Em outro exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14.

[314] Em um exemplo de realização adicional, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 17, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 18, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 19, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 20, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 21 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 22.

[315] Em outro exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 25, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 26, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 27, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 28, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 29 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 30.

[316] Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é (derivada de) um anticorpo humano. Em alguns exemplos de realização, a VH é uma VH humana e/ou a VL é uma VL humana. Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização acima, e compreende ainda uma região de arcabouço (framework) humana, por exemplo, um arcabouço de imunoglobulina humana.

[317] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende; ()) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;

(vi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56;

(ix) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.

[318] Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[319] Em outro exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[320] Em um exemplo de realização adicional, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[321] Ainda em outro exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[322] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende; (). uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (ii) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (iii), uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (iv) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (v) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (vi) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (vii) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (viii) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (ix) uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.

[323] Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[324] Em outro exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

16.

[325] Em um exemplo de realização adicional, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[326] Em outro exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

32.

[327] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende; () uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (iii), uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (iv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (v) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (vi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (vii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (viii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (ix) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.

[328] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende; (i) a sequência VH de SEQ ID NO: 7, e a sequência VL de SEQ ID NO: 8; (ii) a sequência VH de SEQ ID NO: 15, e a sequência VL de SEQ ID NO: 16; (iii) a sequência VM de SEQ ID NO: 23, e a sequência VL de SEQ ID NO: 24; (iv) a sequência VH de SEQ ID NO: 31, e a sequência VL de

SEQ ID NO: 32; (v) a sequência VH de SEQ ID NO: 39, e a sequência VL de SEQ ID NO: 40; (vi) a sequência VH de SEQ ID NO: 47, e a sequência VL de SEQ ID NO: 48; (vii) a sequência VM de SEQ ID NO: 55, e a sequência VL de SEQ ID NO: 56; (viii) a sequência VH de SEQ ID NO: 63, e a sequência VL de SEQ ID NO: 64; ou (ix) a sequência VH de SEQ ID NO: 71, e a sequência VL de SEQ ID NO: 72.

[329] Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.

[330] Em outro exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[331] Em um exemplo de realização adicional, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24.

[332] Ainda em outro exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32.

[333] Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8.

[334] Em outro exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16.

[335] Em um exemplo de realização adicional, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24.

[336] Em outro exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32.

[337] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante humana. Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região constante humana, particularmente um domínio CH1 e/ou CL humano. Sequências exemplares de domínios constantes humanos são fornecidas nas SEQ ID NOs: 112 e 113 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ ID NO: 114 (domínios constantes de cadeia pesada CH1-CH2-CH3 de IgG1 humana). Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 ou SEQ ID NO: 113, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. Particularmente, a região constante de cadeia leve pode compreender mutações de aminoácidos tal como descrito na presente invenção na seção “modificações de carga” e/ou pode compreender deleção ou substituições de um ou mais (particularmente dois) aminoácidos N-terminais se presente em uma molécula Fab crossover (Fab cruzada) Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de domínio CH1 compreendida em a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114. Particularmente, a região constante de cadeia pesada (especificamente domínio CH1) pode compreender mutações de aminoácidos conforme descrito na presente invenção em “modificações de carga”.

[338] Em exemplos de realização específicos, a terceira e a primeira porção de ligação ao antígeno são uma molécula Fab e a terceira porção de ligação ao antígeno é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno. Assim, nestes exemplos de realização, a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno compreendem as mesmas sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve e têm o mesmo arranjo de domínios (isto é, convencional ou cruzado (crossover)). Além disso, nestes exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende as mesmas substituições de aminoácidos (se presentes), que a primeira porção de ligação ao antígeno. Por exemplo, as substituições de aminoácidos descritas na presente invenção como “modificações de carga” serão feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 de cada uma das primeiras porções de ligação ao antígeno e a terceira porção de ligação ao antígeno. Alternativamente, as referidas substituições de aminoácidos podem ser feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno (que em exemplos de realização específicos também é uma molécula Fab), mas não no domínio constante CL e no domínio constante CH1 de a primeira porção de ligação ao antígeno e terceira porção de ligação ao antígeno.

[339] Como a primeira porção de ligação ao antígeno, a terceira porção de ligação ao antígeno é particularmente uma molécula Fab convencional. Exemplos de realização em que a primeira e a terceira porções de ligação ao antígeno são moléculas Fab crossover (e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional) também são, no entanto, contempladas. Assim, em exemplos de realização específicos, a primeira e a terceira porções de ligação ao antígeno são uma molécula Fab convencional e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constante CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab são trocados/substituídos um pelo outro. Em outros exemplo de realização, a primeira e a terceira porções de ligação ao antígeno são, cada uma, moléculas Fab crossover, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[340] Se uma terceira porção de ligação ao antígeno estiver presente, em um exemplo de realização específico, a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno se ligam ao HLA-A2/WT1, e a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a um segundo antígeno, particularmente um antígeno ativador de célula T, mais particulaamente o CD3, mais particularmente o CD3 épsilon.

[341] Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade. A primeira e a segunda subunidade do domínio Fc são capazes de desempenhar associação estável.

[342] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção pode ter configurações diferentes, ou seja, a primeira, segunda (e opcionalmente terceira) porção de ligação ao antígeno pode ser fundida entre si e com o domínio Fc de diferentes maneiras. Os componentes podem ser fundidos entre si diretamente ou, preferencialmente, através de um ou mais ligantes peptídicos adequados. Quando a fusão de uma molécula Fab está na extremidade N-terminal de uma subunidade do domínio Fc, ela tipicamente é via região de dobradiça de imunoglobulina.

[343] Em alguns exemplos de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Em tais exemplos de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno pode ser fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno ou ao N- terminal da outra subunidade do domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, a referida primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em outros exemplos de realização, a referida primeira molécula Fab é uma molécula Fab crossover (cruzada) e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.

[344] Em um exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, moléculas Fab, a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc, e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada do Fab ao N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno. Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab é fundida no C-Terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e a segunda molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é representada esquematicamente nas Figuras 1G e 1K (com o segundo domínio de ligação ao antígeno nesses exemplos sendo uma molécula Fab crossover VH/VL). Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[345] Em outro exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são uma molécula Fab e a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc. Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira e a segunda molécula Fab são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc. Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1A e 1D (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional). À primeira e a segunda molécula Fab podem estar fundidas ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um exemplo de realização particular, a primeira e a segunda molécula Fab estão fundidas ao domínio Fc por uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG: humana, particularmente quando o domínio Fc é um domínio Fc de IgG.

[346] Em alguns exemplos de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Em tais exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno pode ser fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno ou (conforme descrito acima) ao N-terminal da outra subunidade do domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, a referida primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em outros exemplos de realização, a referida primeira molécula Fab é uma molécula Fab crossover (cruzada) e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.

[347] Em um exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, moléculas Fab, a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc, e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada do Fab ao N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno. Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e a primeira molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1H e 1L (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional). Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fabe a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[348] Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação, particularmente uma terceira molécula Fab, é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, as referidas primeira e terceira moléculas Fab são, cada uma, moléculas Fab convencional, e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocadas/substituídas entre si. Em outros exemplos de realização, as referidas primeira e terceira moléculas Fab são, cada uma, moléculas Fab crossover e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.

[349] Em um exemplo de realização específico, a segunda e a terceira porção de ligação ao antígeno são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc, e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab. Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab, no domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e a segunda molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, e em que a terceira molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura 1B e 1E (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 1J e 1N (nestes exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL). À segunda e a terceira molécula Fab podem ser fundidas ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um exemplo de realização particular, a segunda e a primeira molécula Fab estão fundidas ao domínio Fc por uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG: humana, particularmente quando o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[350] Em outro exemplo de realização, a primeira e terceira porção de ligação ao antígeno são cada uma fundida na extremidade C- terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc, e a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida com a extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno. Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab, no domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e a primeira molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, e em que a terceira molécula Fab é fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura 1C e 1F (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 1l e 1M (nestes exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL). A primeira e a terceira molécula Fab podem ser fundidas ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um exemplo de realização particular, a primeira e terceira molécula Fab estão fundidas ao domínio Fc por uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG: humana, particularmente quando o domínio Fc é um domínio Fc de IgG. Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[351] Em configurações da molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que uma molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de cada uma das subunidades do domínio Fc através de uma região de dobradiça de imunoglobulina, as duas moléculas Fab, as regiões de dobradiça e o domínio Fc formam essencialmente uma molécula de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a molécula de imunoglobulina é uma imunoglobulina da classe IgG. Em um exemplo de realização ainda mais específico, a imunoglobulina é um imunoglobulina da subclasse IgG. Em outro exemplo de realização, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG1. Em um exemplo de realização adicional, a imunoglobulina é uma imunoglobulina humana. Em outros exemplos de realização, a imunoglobulina é uma imunoglobulina quimérica ou uma imunoglobulina humanizada. Em um exemplo de realização, a imunoglobulina compreende uma região constante humana, particularmente uma região Fc humana.

[352] Em algumas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab estão fundidas entre si, opcionalmente através de um ligante peptídico. Dependendo da configuração da primeira e da segunda porção de ligação ao antígeno, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab pode estar fundida em sua extremidade C-terminal com a extremidade N-terminal da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, ou a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab pode estar fundida em sua extremidade C-terminal com a extremidade N-terminal da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab. A fusão das cadeias leves Fab da primeira e da segunda molécula Fab reduz ainda mais o pareamento errôneo de cadeias pesadas e leves Fab sem correspondência, e também reduz o número de plasmídeos necessários para a expressão das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção.

[353] As porções de ligação ao antígeno podem ser fundidas com o domínio Fc ou diretamente entre si ou através de um peptídeo ligante, que compreende um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2-20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos no estado da técnica e estão descritos na presente invenção. Os ligantes peptídicos adequados não imunogênicos incluem, por exemplo, os ligantes peptídicos (G4S)n, (SGa4)n, (GaS)h ou Ga(SGa)n. “Nº é geralmente um número inteiro de 1 a 10, normalmente de 2 a 4. Em um exemplo de realização, o referido ligante peptídico tem um comprimento de pelo menos 5 aminoácidos, em um exemplo de realização, um comprimento de 5 a 100, em outro exemplo de realização de a 50 aminoácidos. Em um exemplo de realização, o referido ligante peptídico é (GxS)n ou (GxS))Gm com G = glicina, S = serina; e (<= 3,n=3,4,5 ou 6,em=0,1,20uUu3)ou(x=4,n=2,3,40u5em=0,1,20uU3), em um exemplo de realização x = 4 e n= 2 0u 3, e em um exemplo de realização adicional x = 4, n = 2. Em um exemplo de realização, o ligante peptídico mencionado é (G4S)2. Um peptídeo de ligação particularmente adequado para a fusão das cadeias leve Fab entre a primeira e segunda molécula Fab é o (G4S)2. Um peptídeo de ligação exemplar apropriado para ligar as cadeias pesadas Fab do primeiro e segundo fragmentos Fab compreende a sequência (D)-(G1S)2 (SEQ ID NOs 110 e 111). Outro ligante adequado compreende a sequência (G1S)s. Além disso, os ligantes podem compreender (uma porção de) uma região de dobradiça de imunoglobulina. Particularmente quando uma molécula Fab está fundida com a porção N-terminal de uma subunidade do domínio Fc, ela pode ser fundida por uma região de dobradiça de imunoglobulina ou uma porção da mesma, com ou sem um peptídeo de ligação adicional.

[354] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com uma subunidade do domínio Fc (VL(2)--CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)) e um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VHa-CH111)-CH2-CH3(-CH4)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH6-CLr)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL6)-CLn)). Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos estão ligados de forma covalente, por exemplo, por uma ligação de bissulfeto.

[355] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(- CH4)) e um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VHa-CH11)-CH2-CH3(-CH4)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VLe-CH1i&) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL1)-CLm). Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos estão ligados de forma covalente, por exemplo, por uma ligação de bissulfeto.

[356] Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VL(2)- CH12)-VHa-CH11)-CH2-CH3(-CH4)). Em outros exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH1-CH11)-VL(2)-CH1(12)-CH2-CH3(-CH4)).

[357] Em alguns destes exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno compreende adicionalmente um polipeptídeo de cadeia leve Fab crossover da segunda molécula Fab em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VHr-CL(3) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL61)-CLn). Em outros destes exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VLa)-CL()) ou um polipeptídeo em que o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)), conforme apropriado.

[358] A molécula de ligação a antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção de acordo com estes exemplos de realização pode compreender ainda; (i) um polipeptídeo da subunidade do domínio Fc (CH2- CH3(-CH4)); ou (ii) um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha um ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(3-CH1(3-CH2-CH3(-CH4)) e o polipeptídeo de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL-CLe) Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos estão ligados de forma covalente, por exemplo, por uma ligação de bissulfeto.

[359] Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CL(2)-VH1)-CH14)- CH2-CH3(-CH4)). Em outros exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi- terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2y- CH2-CH3(-CH4)).

[360] Em alguns destes exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica compreende adicionalmente um polipeptídeo de cadeia leve Fab crossover da segunda molécula Fab em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL2-CH1(3)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL1)-CL61)). Em outros destes exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL(2-CH162-VL6)-CL6)) ou um polipeptídeo em que o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VLa-CLa)-VH)-CL), conforme apropriado.

[361] A molécula de ligação a antígeno biespecífica de acordo com estes exemplos de realização pode compreender ainda; (i) um polipeptídeo da subunidade do domínio Fc (CH2-CH3(-CH4)); ou (ii) um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha um ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(3)-CH1(3-CH2-CH3(-CH4)) e o polipeptídeo de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3-CL'). Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos estão ligados de forma covalente, por exemplo, por uma ligação de bissulfeto.

[362] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica não compreende um domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, as referidas primeira e (se presente) terceira moléculas Fab são, cada uma, moléculas Fab convencional, e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocadas/substituídas entre si. Em outros exemplos de realização, as referidas primeira e (se presente) terceira moléculas Fab são, cada uma,

moléculas Fab crossover e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.

[3863] Em uma destes exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira e na segunda porção de ligação ao antígeno, e opcionalmente um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 10 e 18 (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional).

[364] Em outro exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira e na segunda porção de ligação ao antígeno, e opcionalmente um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1P e 1T (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional).

[365] Em alguns exemplos de realização, a primeira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e a molécula de ligação ao antígeno compreende ainda uma terceira porção de ligação ao antígeno, particularmente uma terceira molécula Fab em que a referida terceira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab e, opcionalmente, em um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab e a terceira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura 1Q e 1U (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 1X e 12 (nestes exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL).

[366] Em alguns exemplos de realização, a segunda molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e a molécula de ligação ao antígeno compreende ainda uma terceira porção de ligação ao antígeno, particularmente uma terceira molécula Fab em que a referida terceira molécula Fab está fundida no N-terminal da cadeia pesada Fab ao C-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab e, opcionalmente, em um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab e a terceira molécula Fab está fundida no N-terminal da cadeia pesada

Fab ao C-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura 1R e 1V (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 1IW e 1Y (nestes exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL).

[367] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptíideo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (isto é, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VHn -CH16) -VLe- CH16)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH2)-CL(3)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL1)-CL6)).

[368] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL(2-CH16- VHa-CH16)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(23) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL1)-CL6)).

[369] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VHy- CL(2)-VHa-CH16)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL2-CH1(3) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VLa)-CL6)).

[370] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL(2)-CH16y VHa-CH16)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VLa1)-CL6)).

[371] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VH(3-CH1(3)-VH1-CH14y- VL-CH16). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH2)-CL(3)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL1-CLm)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda o polipeptídeo Fab da cadeia leve de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

[372] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve) (VH3-CH16-VHay CH11)-VHe-CL6). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL2-CH16)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL1-CLm). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda o polipeptídeo Fab da cadeia leve de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CLç3)).

[373] Em certos exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VL(2)-CH1(2)-VHa)-CH1(1)-VHa-CH163)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH6-CL') e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL1)-CLm). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda o polipeptídeo Fab da cadeia leve de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CLç3)).

[374] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica do terminal carboxi com a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VH6)-CH11)-VHey- CH16)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL)-CH1(3) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VLa1)-CL(1)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda o polipeptídeo Fab da cadeia leve de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

[375] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VHey CH12-VL1)-CH11)-VL6-CH16). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH-CLm) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da segunda molécula Fab (VL(2)-CL'). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-

terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VH)-CL(3)).

[376] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve) (VHoy- CH12)-VHa)-CLa1)-VHe6y-CL6)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL1-CH16)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VL3y- CH16).

[3877] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL3)-CH13- VL1-CH11)-VH-CH1,62)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VHay-CL(1)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da segunda molécula Fab (VL(2)--CL(2)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VHy CL).

[378] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VHç3)-CL(3)-VH6)-CLa)-VHe-CH1)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL1-CH16) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VL'3-CH1)).

[379] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1iRvF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6;

(b)º uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro;

(c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;

em que:

(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou (ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).

[380] Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1iRvF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6; (b)» uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro; (c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e (d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que: (i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou (ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d).

[381] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;

(a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1RwmF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6;

(b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro;

(c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;

em que:

(i) a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).

[382] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1RwmF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14; (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro; (c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que:

(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b)) e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou (i))) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).

[383] Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1RwmF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14;

(c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e

(d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;

em que:

(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou

(li), a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d).

[384] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1RwmF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14; (b)» uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro; (c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que: (i) a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).

[385] Em todas as diferentes configurações da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, as substituições de aminoácidos aqui descritas, se presentes, podem estar nos domínios CH1 e CL do primeiro e (se presente) do terceiro grupo de ligação ao antígeno/Molécula Fab, ou nos domínios CH1 e CL da segunda porção de ligação ao antígeno/molécula Fab. Preferencialmente, eles estão nos domínios CH1 e CL da primeira e (se presente) da terceira porção de ligação ao antígeno/molécula Fab. De acordo com o conceito da invenção, se as substituições de aminoácidos aqui descritas forem feitas na primeira (e, se presente, na terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, nenhuma substituição de aminoácidos será feita na segunda porção de ligação ao antígeno/Molécula Fab. Por outro lado, se as substituições de aminoácidos aqui descritas forem feitas na segunda porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, nenhuma substituição de aminoácidos será feita na primeira (e, se presente, na terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab. As substituições de aminoácidos são particularmente feitas em moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH1 da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro.

[386] Em exemplos de realização particulares da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, particularmente em que as substituições de aminoácidos aqui descritas são feitas na primeira (e, se presente, na terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, o domínio constante CL da primeira (e, se presente, da terceira) molécula Fab é do isotipo kappa. Em outros exemplos de realização da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, particularmente em que as substituições de aminoácidos aqui descritas são feitas na segunda porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, o domínio constante CL da segunda molécula Fab é do isotipo kappa. Em alguns exemplos de realização, o domínio constante CL da primeira (e, se presente, da terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab e o domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno/molécula Fab são do isotipo kappa.

[387] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1RwmF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6; (b)º uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;

(c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:

(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade Cr-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou (ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).

[388] Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1iRvF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6; (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;

(d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído pela lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)) e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:

(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou (i)) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d).

[389] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1RwmF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6; (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro; (c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).

[390] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1RwmF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH)

compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14; (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro; (c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:

(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou (i)) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).

[391] Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1RwmF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO:

12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14;

(b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de célula T de ativação, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;

(d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído pela lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:

(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b)) e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou (ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d).

[392] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1RwmF, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10 e uma HCDR 3 de

SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14;

(c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R))) e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).

[393] De acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima, os componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica (por exemplo, moléculas Fab, domínio Fc) podem ser fundidos diretamente, ou pelo uso de vários ligantes, em particular ligantes peptídicos compreendendo um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2-20 aminoácidos, que estão descritos na presente invenção ou são conhecidos no estado da técnica. Os ligantes peptídicos adequados não imunogênicos incluem, por exemplo, os ligantes peptídicos (G4S)n, ou Ga(SG4)n, em que n é geralmente um número inteiro de 1 a 10, tipicamente de 2 a 4.

[394] Em outro aspecto particular, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo; (a) uma primeira e uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno; em que o primeiro antígeno é HLA-A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT1RMrF, e em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são uma molécula Fab (convencional) compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b)» uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno; em que o segundo antígeno é CD3 e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é a molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, compreendendo (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122 ou (ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137 (particularmente uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137); (c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que: no domínio constante CL da primeira e da terceira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira e da terceira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que ainda (i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b)) e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (a) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (c).

[395] Em um aspecto adicional, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo; (a) uma primeira e uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno; em que o primeiro antígeno é HLA-A2/WT1, particularmente HLA-A2/WT11RMF, e em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são uma molécula Fab (convencional) compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno; em que o segundo antígeno é CD3 e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é a molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, compreendendo (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122 ou (ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137 (particularmente uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137); (c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que: no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira e da terceira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que, adicionalmente, (i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (a) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (c).

[396] Em um exemplo de realização de acordo com estes aspectos da invenção, na primeira subunidade do domínio Fc, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e na segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V) e, opcionalmente, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[397] Em um exemplo de realização de acordo com estes aspectos, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo ácido glutâmico na posição 356 é substituído por um resíduo cisteína (E356C) (particularmente o resíduo serina na posição 354 é substituído pelo resíduo de cisteína), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[398] Em um exemplo de realização adicional de acordo com estes aspectos da invenção, em cada uma da primeira e da segunda subunidades do domínio Fc, o resíduo leucina na posição 234 é substituído por um resíduo de alanina (L234A), o resíduo de leucina na posição 235 é substituído por um resíduo de alanina (L235A) e o resíduo de prolina na posição 329 é substituído por um resíduo de glicina (P329G) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[399] Ainda em outro exemplo de realização adicional de acordo com estes aspectos da invenção, o domínio de Fc é um domínio de Fc de IgG1 humana.

[400] Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 123, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 125, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 139 e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 140. Em outro exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 123, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 139 e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 140.

[401] Em outro exemplo de realização particular, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 123, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 124, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 125 e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 129. Em outro exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 123, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 124, um polipeptíideo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125 e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129.

[402] Em outro exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 126, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 127, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 128 e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 129. Em um exemplo de realização adicional, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126, um polipeptídeco compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129.

Domínio Fc

[403] Em exemplos de realização particulares, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade. Entende-se que as características do domínio Fc descritas na presente invenção em relação à molécula de ligação ao antígeno biespecífica podem se aplicar igualmente a um domínio Fc compreendido em um anticorpo da invenção.

[404] O domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste de um par de cadeias polipeptídicas que compreendem domínios de cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina. Por exemplo, o domínio de Fc de uma molécula de imunoglobulina G (IgG) é um dímero, e cada subunidade compreende domínios constantes de cadeia pesada de IgG - CH2 e CH3. As duas subunidades do domínio de Fc são capazes de realizar associação estável entre si. Em um exemplo de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreende não mais do que um domínio Fc.

[405] Em um exemplo de realização, o domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica é um domínio Fc de IgG. Em um exemplo de realização particular, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG. Em outro exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG... Em um exemplo de realização mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgGa que compreende uma substituição de aminoácido na posição S228 (numeração do índice EU de Kabat), particularmente a substituição de aminoácido S228P. Esta substituição de aminoácidos reduz in vivo a troca braço Fab de anticorpos IgG (vide Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). Em um exemplo de realização particular adicional, o domínio Fc é um domínio Fc humano. Em um exemplo de realização ainda mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG: humana. Uma sequência exemplar de uma região Fc de IgG: humana é fornecida na SEQ ID NO: 109.

MopDIFICAÇÕES No DOMÍNIO FC QUE PROMOVEM A HETERODIMERIZAÇÃO

[406] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas de acordo com a invenção compreendem diferentes porções de ligação ao antígeno, que podem estar fundidas a uma ou outra das duas subunidades do domínio Fc, assim, as duas subunidades do domínio Fc são tipicamente compostas por duas cadeias polipeptídicas não idênticas. A coexpressão recombinante desses polipeptídeos e a subsequente dimerização conduzem a várias combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para melhorar o rendimento e a pureza da molécula de ligação ao antígeno biespecífica na produção recombinante, será, portanto, vantajoso introduzir no domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica uma modificação que promova a associação dos polipeptídeos desejados.

[407] Consequentemente, em exemplos de realização específicos do domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, compreende uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. O sítio de interação proteína-proteína mais amplo entre as duas subunidades de um domínio Fc da IgG humana está no domínio CH3 do domínio Fc. Assim, em um exemplo de realização, a referida modificação é no domínio CH3 do domínio Fc.

[408] Existem diversas abordagens para modificações no domínio CH3 do domínio Fc com o intuito a impor a heterodimerização, que são bem descritas, por exemplo, nas publicações WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129,304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Tipicamente, em todas essas abordagens, o domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e o domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc são ambos modificados de uma maneira complementar, de modo que cada domínio CH3 (ou a cadeia pesada compreendendo tal domínio) não mais se homodimeriza consigo, mas é forçado a se heterodimerizar com o outro domínio CH3 complementarmente modificado (de modo que o primeiro e o segundo domínio CH3 se heterodimerizam e não são formados homodímeros entre os dois primeiros ou os dois segundos domínios CH3). Estas diferentes abordagens para melhorar a heterodimerização da cadeia pesada são contempladas como alternativas diferentes em combinação com as modificações da cadeia pesadas - leve (por exemplo, troca/substituição VH e VL em um braço de ligação e introdução de substituições de aminoácidos carregados com cargas opostas na interface CH1/CL) nas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, que reduzem o pareamento incorreto da cadeia leve/pesada e os subprodutos tipo Bence- Jones.

[409] Em um exemplo de realização específico, a referida modificação que promove a associação da primeira e segunda subunidade do domínio Fc é uma modificação do tipo “Knob-into-hole”, compreendendo uma modificação “Knob” (protuberância) em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação “hole” (cavidade) na outra subunidade do domínio Fc.

[410] A tecnologia knob-into-hole está descrita, por exemplo, nas Patentes US 5.731.168; US 7.695.936; e em Ridgway et al, Prot Eng. 9, 617- 621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De modo geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“knob”) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade/orifício (“hole”) correspondente na interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância pode ser posicionada na cavidade a fim de promover a formação de heterodímero e impedir a formação de homodímero. As protuberâncias são construídas pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais pequenas na interface do primeiro polipeptídeo por aminoácidos com cadeias laterais maiores (por exemplo, a tirosina ou triptofano). As “cavidades” (hole) compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao das protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais grandes por aminoácidos com cadeias laterais menores (por exemplo, alanina ou treonina).

[411] Consequentemente, em um exemplo de realização específico, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um resíduo aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido que possui um volume de cadeia lateral maior, gerando, assim, uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que pode ser posicionada dentro de uma cavidade no interior do domínio CH3 da segunda subunidade; e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido que possui um volume de cadeia lateral menor, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade pode ser posicionada.

[412] Preferencialmente o dito resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral de volume maior é selecionado a partir do grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W).

[413] Preferencialmente o dito resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral de volume menor é selecionada a partir do grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V).

[414] A protuberância e a cavidade podem ser feitas através da alteração de ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese sítio-específica, ou por síntese peptídica.

[415] Em um exemplo de realização específico, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc (a subunidade “knob”), o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (a subunidade “hole”), o resíduo tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V). Em um exemplo de realização, na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo treonina na posição 366 é substituído por um resíduo serina (T366S) e o resíduo leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[416] Em um exemplo de realização adicional, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo ácido glutâmico na posição 356 é substituído por um resíduo cisteína (E356C) (particularmente o resíduo serina na posição 356 é substituído pelo resíduo de cisteína), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). A introdução destes dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte de bissulfeto entre as duas subunidades do domínio Fc, estabilizando adicionalmente o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

[417] Em um exemplo de realização específico, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W, e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[418] Em um exemplo de realização específico, a porção de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de célula T de ativação) é fundida (opcionalmente através da primeira porção de ligação ao antígeno, que se liga ao HLA-A2/WT1 e/ou a um ligante peptídico) à primeira subunidade do domínio Fc (que compreende a modificação “knob”). Sem pretender ser limitar a teoria, a fusão da porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno, tal como um antígeno de célula T de ativação, na subunidade contendo a modificação knob do domínio Fc irá minimizar (ainda mais) a geração de moléculas de ligação ao antígeno compreendendo duas porções de ligação ao antígeno capazes de ligar a um antígeno de células T de ativação (choque estérico de dois polipeptídeos contendo a modificação knob).

[419] São contempladas outras técnicas como alternativas para a modificação de CH3 a fim de realizar a heterodimerização de acordo com a presente invenção que estão descritas, por exemplo, nas publicações WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

[420] Em um exemplo de realização, a abordagem para a heterodimerização descrita na EP 1870459 A1 é alternativamente utilizada. Esta abordagem se baseia na introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos na interface do domínio CH3/CH3 entre as duas subunidades do domínio Fc. Uma exemplo de realização preferido para a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção são as mutações de aminoácidos R409D; K370E em um dos dois domínios CH3 (do domínio Fc) e as mutações de aminoácidos D399K; E357K no outro domínio CH3 do domínio Fc (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[421] Em outro exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende a mutação de aminoácidos T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e as mutações de aminoácidos T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc e adicionalmente mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos D399K; E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[422] Em outro exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende as mutações de aminoácidos S354C, T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e as mutações de aminoácidos Y349C, T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, ou a referida molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende mutações de aminoácidos Y349C, T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos S354C, T366S, L368A, Y407V nos domínios CH3 da segunda subunidade do domínio Fc e adicionalmente mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos D399K; E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (todas as numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[423] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2013/157953 é alternativamente utilizada. Em um exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos T366K e o segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos L351D (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em outro exemplo de realização o primeiro domínio CH3 compreende ainda a mutação de aminoácido L351K. Em um exemplo de realização adicional o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente uma mutação de aminoácido selecionada a partir de Y349E, Y349D e L368E (preferencialmente L368E) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[424] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita no WO 2012/058768 é alternativamente utilizada. Em um exemplo de realização, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido L351Y, Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido T366A, K409F. Em outro exemplo de realização, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente uma mutação de aminoácidos na posição T411, D399, S400, F405, N390 ou K392, por exemplo, selecionada a partir de a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ou T411W, b) D399R, D399W, D399Y ou D399K, c) S400E, S400D, S400R, ou S400K, d) F405l, F405M, F405T, F405S, F405V ou F405W, e)

N390R, N390K ou N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ou K392E (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização adicional, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido L351Y, Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido T366V, K409F. Em um exemplo de realização adicional, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido T366A, K409F. Em um exemplo de realização adicional, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente as mutações de aminoácido K392E, T411E, D399R e S400R (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[425] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2011/143545 é alternativamente utilizada, por exemplo, com a modificação de aminoácido em uma posição selecionada a partir das posições 368 e 409 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[426] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2011/090762, que também usa a tecnologia knobs-into-holes descrita acima é alternativamente utilizada. Em um exemplo de realização, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido T366W e o segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido Y407A. Em um exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos T366Y e o segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos Y407T (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[427] Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou seu domínio Fc é da subclasse IgG2 e a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2010/129304 é alternativamente utilizada.

[428] Em um exemplo de realização alternativo, uma associação que promove a modificação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc compreende uma modificação que medeia efeitos de direcionamento eletrostático, por exemplo, conforme descrito na publicação PCT WO 2009/089004. Em geral, este método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas subunidades do domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados de modo que a formação de homodímeros se torna eletrostaticamente desfavorável mas a heterodimerização eletrostaticamente favorável. Em tal exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende a substituição do aminoácido K392 ou N392 por um aminoácido de carga negativa (por exemplo, ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), de preferência K392D ou N392D) e um segundo domínio CH3 compreende uma substituição de aminoácido D399, E356, D356, ou E357 por um aminoácido de carga positiva (por exemplo, lisina (K) ou arginina (R), de preferência, D399K, E3S56K, D356K, ou E357K e mais preferencialmente D399K e ES56K). Em outro exemplo de realização o primeiro domínio CH3 compreende ainda a substituição do aminoácido K409 ou R409 por um aminoácido negativamente carregado (por exemplo, ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), de preferência K409D ou R409D). Em outro exemplo de realização o primeiro domínio CH3 compreende adicionalmente ou alternativamente a substituição do aminoácido K439 e/ou K370 por um aminoácido de carga negativa (por exemplo, ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D)) (todas as numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[429] Em um exemplo de realização adicional, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2007/147901 é alternativamente utilizada. Em um exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido K253E, D282K, e K322D e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido D239K, E240K, e K292D

(numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[430] Em outro exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2007/110205 pode ser alternativamente utilizada.

[431] Em um exemplo de realização, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos K392D e K409D, e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos D356K e D399K (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

MopiFIcAÇÕES Do Domínio Fc QUE REDUZEM A LIGAÇÃO AO RECEPTOR Fc E/Ou

A FUNÇÃO EFETORA

[432] O domínio Fc confere propriedades farmacocinéticas favoráveis à molécula de ligação ao antígeno biespecífica (ou ao anticorpo), incluindo uma meia-vida sérica prolongada que contribui para a boa acumulação no tecido alvo e uma relação de distribuição tecido/sangue favorável. Ao mesmo tempo, ele pode, no entanto, levar ao direcionamento indesejável da molécula de ligação ao antígeno biespecífica (ou do anticorpo) para células que expressam receptores Fc ao invés de direcionar para as células contendo antígenos preferenciais. Além disso, a coativação das vias de sinalização do receptor Fc pode levar à liberação de citocinas que, em combinação com as propriedades de ativação das células T (por exemplo, nos exemplos de realização da molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a um antígeno de célula T de ativação) e a meia-vida prolongada da molécula de ligação ao antígeno biespecífica, resulta em ativação excessiva de receptores de citocinas e efeitos colaterais graves na administração sistêmica. A ativação de células imunes (portadoras de receptor Fc) que não são células T pode até reduzir a eficácia da molécula de ligação ao antígeno biespecífica (particularmente uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica em que a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a um antígeno da célula T de ativação) devido à destruição potencial de células T, por exemplo, células NK.

[433] Consequentemente, em exemplos de realização específicos, o domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas de ativação de célula T de acordo com a invenção exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou uma função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG: nativo. Em tal exemplo de realização, o domínio Fc (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo o referido domínio Fc) exibe menos do que 50%, de preferência menos do que 20%, mais preferivelmente menos do que 10% e mais preferivelmente ainda menos do que 5% da afinidade de ligação para um receptor Fc quando comparado com um domínio Fc de IgG: nativo (ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc de IgG1 nativo), e/ou menos do que 50%, de preferência menos do que 20%, mais preferencialmente menos do que 10% e mais preferivelmente menos do que 5% da função efetora, em comparação com a função efetora de um domínio Fc de IgG: nativo (ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc de IgG1 nativo). Em um exemplo de realização, o domínio Fc (ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica " compreendendo o referido domínio Fc) não se liga substancialmente a um receptor Fc e/ou induz a função efetora. Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fcy. Em um exemplo de realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em um exemplo de realização, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fey humano de ativação, mais especificamente FcyRllla, FcyRI ou FeyRlla humanos, mais especificamente FcyRlilla humano. Em um exemplo de realização, a função efetora é uma ou mais selecionada dentre o grupo de CDC, ADCC, ADCP, e secreção de citocina. Em um exemplo de realização particular, a função efetora é a ADCC. Em um exemplo de realização, o domínio Fc exibe uma afinidade de ligação substancialmente semelhante ao receptor Fc neonatal (FCRn), em comparação com um domínio Fc da IgG: nativa. Uma ligação substancialmente semelhante ao FcRn é alcançada quando o domínio Fc (ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70%, particularmente mais do que cerca de 80%, particularmente mais do que cerca de 90% da afinidade de ligação do domínio Fc da IgG nativa (ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc de IgG: nativa) para o FcRn.

[434] Em determinados exemplos de realização, o domínio Fc é projetado para ter uma afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio de Fc não modificado. Em exemplos de realização específicos, o domínio de Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor de Fc e/ou a função efetora. Normalmente, a mesma uma ou mais mutações de aminoácidos está presente em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em um exemplo de realização, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor de Fc. Em um exemplo de realização, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes. Em exemplos de realização em que há mais do que uma mutação de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio de Fc ao receptor Fc, a combinação destas mutações de aminoácidos pode reduzir a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos vezes, pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 50 vezes. Em um exemplo de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc modificado exibe menos do que 20%, particularmente menos do que 10%, e mais particularmente menos do que 5% da afinidade de ligação para um receptor Fc em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende um domínio Fc não modificado.

Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fcy.

Em alguns exemplos de realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano.

Em alguns exemplos de realização, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação.

Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fey humano de ativação, mais especificamente FcyRllla, FcyRI ou FeyRlla humanos, mais especificamente FceyRllla humano.

Preferencialmente, a ligação a cada um destes receptores é reduzida.

Em alguns exemplos de realização, a afinidade de ligação a um componente do complemento, especificamente a afinidade de ligação ao C1iq, também está reduzida.

Em um exemplo de realização, a afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FCRn) não está reduzida.

Uma ligação substancialmente similar ao FcRn, ou seja, a manutenção da afinidade de ligação do domínio Fc para o referido receptor, é obtida quando o domínio Fc (ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70% de afinidade de ligação de uma forma não modificada do domínio Fc (ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo a referida forma não modificada do domínio Fc ) para o FcRn.

O domínio Fc, ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção compreendendo o referido domínio de ligação ao Fc, pode apresentar mais do que cerca de 80% e mesmo mais do que cerca de 90% de tal afinidade.

Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é modificada para ter uma redução da função efetora em comparação com um domínio Fc não modificado.

A função efetora reduzida pode incluir, mas não está limitada a, uma ou mais das seguintes: redução da citotoxicidade dependente de complemento (CDC), redução da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), redução da fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP), redução da secreção de citocinas, redução da captação de antígeno mediada por complexo imune pelas células apresentadoras de antígeno, redução da ligação de células NK, redução da ligação aos macrófagos, redução da ligação aos monócitos, redução da ligação as células polimorfonucleares, redução do sinal de indução de apoptose direta, redução da reticulação aos anticorpos ligados ao alvo, redução da maturação de células dendríticas, ou redução do priming de células T. Em um exemplo de realização, a função efetora reduzida é uma ou mais selecionada de entre o grupo de redução da CDC, redução da ADCC, redução da ADCP, e redução da secreção de citocinas. Em um exemplo de realização específico, a função efetora reduzida é a ADCC. Em um exemplo de realização, a ADCC reduzida é inferior a 20% da ADCC induzida por um domínio Fc não modificado (ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc não modificado).

[435] Em um exemplo de realização, a mutação de aminoácidos, que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ou a função efetora é uma substituição de aminoácidos. Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de um aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de E233, L234, L235, N297, P331 e P329 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização mais específico, o domínio Fc compreende uma substituição de um aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de L234, L235 e P329 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em alguns exemplos de realização, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em tal exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG: humana. Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição P329. Em um exemplo de realização mais específico, a substituição de aminoácido é a P329A ou P329G, particularmente a P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329 e adicionalmente uma substituição de aminoácidos na posição selecionada dentre E233, L234, L235, N297 e P331 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização mais específico, a outra substituição de aminoácidos é a E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S. Em exemplos de realização específicos, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos nas posições P329, L234 e L235 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em exemplos de realização específicos, o domínio Fc compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“P329G LALA”, “PGLALA” ou “LALAPG”). Especificamente, em exemplos de realização específicos, cada subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração pelo índice EU de Kabat), ou seja, em cada uma das primeira e segunda subunidades do domínio Fc, o resíduo de leucina na posição 234 é substituído por um resíduo de alanina (L234A), o resíduo de leucina na posição 235 é substituído por um resíduo de alanina (L235A) e o resíduo de prolina na posição 329 é substituído por um resíduo de glicina (P329G) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[436] Em tal exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG: humana. O combinação “P329G LALA" de substituições de aminoácidos elimina quase completamente a ligação ao receptor Fcy (bem como ao complemento) de um domínio Fc de IgG: humana, tal como descrito na publicação PCT WO 2012/130831, que é integralmente incorporada ao presente pela referência. A publicação WO

2012/130831 também descreve métodos de preparação de tais domínios Fc mutantes e métodos para a determinação de suas propriedades, tal como funções de ligação aos receptores Fc ou funções efetoras.

[437] Anticorpos IgGa« exibem afinidade de ligação aos receptores Fc reduzida e funções efetoras reduzidas, em comparação com os anticorpos IgG1. Assim, em alguns exemplos de realização o domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção é um domínio Fc de 1gGa, particularmente um domínio Fc de IgGa humana. Em um exemplo de realização, o domínio Fc de IgG4a compreende as substituições de aminoácidos na posição S228, especialmente a substituição de aminoácido S228P (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Para reduzir ainda mais a sua afinidade de ligação a um receptor Fc e/ou a sua função efetora, em um exemplo de realização o domínio Fc da IgG14 compreende uma substituição de aminoácido na posição L235, especificamente a substituição de aminoácido L235E (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em outro exemplo de realização, o domínio Fc da IgGs compreende uma substituição de aminoácido na posição P329, especificamente a substituição de aminoácido P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização particular, o domínio Fc da IgGa compreende as substituições de aminoácidos nas posições S228, L235 e P329, especificamente as substituições de aminoácidos S228P, L235E e P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Tal domínio Fc de IgGa mutante e suas propriedades de ligação aos receptores Fcy encontram-se descritos na publicação de Patente PCT WO 2012/130831, integralmente incorporada ao presente pela referência.

[438] Em um exemplo de realização particular, o domínio Fc que exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativa, é um domínio Fc de IgG1 humana compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e opcionalmente P329G, ou um domínio Fc de IgG4 humana compreendendo as substituições de aminoácidos S228P, L235E e opcionalmente P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[439] Em determinados exemplos de realização, a N-glicosilação do domínio Fc foi eliminada. Em tal exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma mutação de aminoácidos na posição N297, particularmente uma substituição de aminoácido que substitui a asparagina por alanina (N297A) ou por ácido aspártico (N297D) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[440] Além dos domínios Fc descritos acima e na Publicação PCT WO 2012/130831, os domínios Fc com ligação reduzida para o receptor Fc e/ou com função efetora reduzida incluem também aqueles com substituição de um ou mais resíduos do domínio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US 6.737.056) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Tais Fc mutantes incluem Fc mutantes com substituições em duas ou mais das seguintes posições de aminoácidos: 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o Fc mutante então denominado de “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US 7.332.581).

[441] Os domínios Fc mutantes podem ser preparados por deleção, substituição, inserção ou modificação de aminoácidos usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos no estado da técnica. Os métodos genéticos podem incluir a mutagênese sítio-especifica da sequência de DNA codificante, PCR, síntese gênica, e similares. As alterações de nucleotídeos — corretas podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento.

[442] A ligação aos receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA, ou por ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando instrumentos convencionais, tais como um instrumento BlAcore (GE Healthcare), e os receptores Fc podem ser obtidos por expressão recombinante. Alternativamente, a afinidade de ligação dos domínios Fc ou das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo um domínio Fc aos receptores Fc pode ser avaliada utilizando linhagens de células que expressam receptores Fc específicos, tais como as células NK humanas que expressam o receptor Fcyllla.

[443] A função efetora de um domínio Fc, ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc, pode ser mensurada por métodos conhecidos no estado da técnica. Exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse encontram-se descritos na Patente US 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Nat Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) e Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); Patente US 5.821.337; Bruggemann et al., J Expo Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativamente, podem ser utilizados métodos de ensaios não radioativos (vide, por exemplo, o ensaio de citotoxicidade não radioativo ACTIº para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA), e o ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96º (Promega, Madison, WI)). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (Natural Killer ou NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como divulgado em Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

[444] Em alguns exemplos de realização, a ligação do domínio Fc a um componente do sistema complemento, especificamente a ligação ao C1g, é reduzida. Assim, em alguns exemplos de realização, quando o domínio Fc é projetado para ter função efetora reduzida, a referida função efetora reduzida inclui redução da CDC. Ensaios de ligação de Ciq podem ser realizados para determinar se o domínio Fc, ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo o domínio Fc, é capaz de se ligar ao C1q e, portanto, ter atividade CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação ao C1qg e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC pode ser executado (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al, J Immunol Methods 202, 163 (1996), Cragg et al, Blood 101, 1045-1052 (2003); e Cragg e Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

[445] A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Intl. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929).

POLINUCLEOTÍDEOS

[446] A invenção fornece ainda polinucleotídeos isolados que codificam um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespeciífica, tal como descrito na presente invenção ou um fragmento da mesma. Em alguns exemplos de realização, o referido fragmento é um fragmento de ligação ao antígeno.

[447] Os polinucleotídeos que codificam anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecífica da invenção podem ser expressos como um polinucleotídeo único que codifica todo o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou na forma de múltiplos polinucleotídeos (por exemplo, dois ou mais) que são coexpressos. Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são coexpressos podem associar-se por meio de, por exemplo, pontes de bissulfeto ou outros meios para formar um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica funcional. Por exemplo, a porção da cadeia leve de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ser codificada por um polinucleotídeo separado a partir da porção do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo a cadeia pesada do anticorpo ou da molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Quando coexpressos, os polipeptídeos de cadeia pesada irão se associar com os polipeptídeos de cadeia leve de modo a formar o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Em outro exemplo, a porção do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende uma das duas subunidades de domínio Fc e, opcionalmente, (parte de) uma ou mais moléculas Fab, pode ser codificada por um polinucleotídeo separado a partir da porção do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende a molécula as outras duas subunidades de domínio Fc e, opcionalmente, (parte de) uma molécula Fab. Quando coexpressas, as subunidades do domínio Fc irão se associar para formar o domínio Fc.

[448] Em alguns exemplos de realização, o polinucleotídeo isolado codifica todo o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção conforme descrito na presente invenção. Em outros exemplos de realização, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo compreendido no anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção conforme descrito na presente invenção.

[449] Em determinados exemplos de realização, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. Em outros exemplos de realização, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, sob a forma de RNA mensageiro (mMRNA). O RNA da presente invenção pode ser de fita simples ou de fita dupla.

MÉTODOS RECOMBINANTES

[450] Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser obtidos, por exemplo, pela síntese peptídica em estado sólido (por exemplo, pela síntese em fase sólida de Merrifield) ou pela produção recombinante.

Para a produção recombinante um ou mais polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou a molécula de ligação ao antígeno biespeciífica (fragmento), por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem adicional e/ou para a expressão em uma célula hospedeira.

Tal polinucleotídeo pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais.

Em um exemplo de realização é fornecido um vetor, de preferência um vetor de expressão, que compreende um ou mais polinucleotídeos da invenção.

Os métodos que são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto podem ser usados para construir vetores de expressão contendo a sequência codificante do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica (fragmento) juntamente com os sinais de controle transcricional/traducional apropriados.

Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação in vivo/recombinação genética.

Vide, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY. (1989) e Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY (1989). O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus, ou pode ser um fragmento de ácido nucleico.

O vetor de expressão inclui um cassete de expressão em que o polinucleotídeo codificante do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica (fragmento) (ou seja, a região codificante) é clonado em associação operativa com um promotor e/ou outros elementos de controle da transcrição ou da tradução.

Conforme utilizado na presente invenção, uma “região codificante” ou “região de codificação” é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons que são traduzidos em aminoácidos.

Embora um “códon de parada” ou “códon de terminação” (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região codificante, se presente, mas quaisquer sequências flanqueadoras, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores da transcrição, íntrons, regiões 5' e 3' não traduzidas, e similares, não são parte de uma “região codificante.

Duas ou mais regiões codificantes podem estar presentes em uma única construção de polinucleotídeos, por exemplo, em um único vetor, ou em construções polinucleotídicas separadas, por exemplo, em (diferentes) vetores separados.

Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região codificante, ou pode compreender duas ou mais regiões codificantes, por exemplo, um vetor da presente invenção pode codificar um ou mais polipeptídeos, que são pós- ou cotraducionalmente separados nas proteínas finais pela clivagem proteolítica.

Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões codificantes heterólogas, fundidas ou não fundidas com um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica (fragmento), ou uma forma variante ou um derivado do mesmo.

As regiões codificantes heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados tal como um peptídeo sinal de secreção ou um domínio funcional heterólogo.

Uma associação operável é quando uma região codificante de um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo, é associado a uma ou mais sequências reguladoras, de tal maneira que coloca a expressão do produto do gene sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (tal como uma região codificante do polipeptídeo e um promotor associado a esta) estão “operacionalmente associados”, se a indução da função promotora resulta na transcrição de mMRNA que codifica o produto do gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras de expressão no controle da expressão do produto do gene, ou não interfere com a capacidade do DNA molde de ser transcrito.

Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição do referido ácido nucleico.

O promotor pode ser um promotor “célula-específico', que controla a transcrição substancial do DNA apenas em células pré-determinadas.

Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, facilitadores (enhancers), operadores, repressores, e sinais de terminação da transcrição, podem estar operacionalmente associados com o polinucleotídeo para controlar a transcrição célula-específica.

Os promotores adequados e outras regiões de controle da transcrição são divulgados na presente invenção.

Diversas regiões de controle da transcrição são conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto.

Dentre estas podemos citar, sem se limitar, as regiões de controle da transcrição que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não se limitando a, promotor e segmentos enhancers de citomegalovírus (por exemplo, o promotor precoce imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (por exemplo, o promotor precoce), e retrovírus (por exemplo, vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle da transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados como a actina, proteína de choque térmico, hormônio do crescimento bovino e B-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão de genes em células eucarióticas.

Regiões de controle da transcrição adequadas adicionais incluem promotores e facilitadores tecido-específicos, bem como promotores indutíveis (por exemplo, promotores indutíveis por tetraciclinas). De forma similar, uma variedade de elementos de controle da tradução é conhecida pelos técnicos hábeis no assunto.

Estes incluem, mas não se limitam a, sítios de ligação ao ribossomo e de início da tradução, códons de terminação e elementos derivados de sistemas virais (em particular, um sítio interno de entrada de ribossomo, ou

IRES, também referido como sequência CITE). O cassete de expressão também pode incluir outros recursos, como uma origem de replicação, e/ou elementos de integração cromossômica, tal como as repetições terminais longas retrovirais (LTRs) ou repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV).

[451] O polinucleotídeo e as regiões codificantes de ácido nucleico da presente invenção podem ser associados com regiões codificantes adicionais que codificam peptídeos de secreção ou de sinal, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, se é desejada a secreção do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, o DNA que codifica uma sequência sinal pode ser colocado a montante do ácido nucleico codificante do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção ou de um fragmento de ligação da mesma. De acordo com a hipótese do sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou sequência de comando de secreção, que é clivada a partir da proteína madura, quando a exportação da cadeia de proteína em crescimento através do retículo endoplasmático rugoso é iniciada. Os técnicos hábeis estão cientes de que polipeptídeos secretados por células de vertebrados têm, em geral, um peptídeo de sinal fundido com a extremidade N- terminal do polipeptídeo, e que é clivado a partir do polipeptídeo traduzido para produzir uma forma secretada ou “madura” do polipeptídeo. Em determinados exemplos de realização, o peptídeo de sinal nativo, por exemplo, um peptídeo de sinal da cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina é utilizado, ou um derivado funcional desta sequência que retenha a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo ao qual está operacionalmente associada. Alternativamente, um peptídeo sinal heterólogo de mamífero, ou um derivado funcional do mesmo, pode ser utilizado. Por exemplo, a sequência líder tipo-selvagem pode ser substituída pela sequência líder do ativador de plasminogênio tecidual humano (TPA) ou o B-glucuronidase de camundongo.

[452] O DNA codificante de uma sequência de proteína curta que pode ser utilizado para facilitar a posterior purificação (por exemplo, um marcador histidina) ou auxiliar na marcação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, pode ser incluído dentro ou nas extremidades do polinucleotídeo codificante do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica (fragmento).

[453] Em um exemplo de realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais polinucleotídeos da invenção. Em determinados exemplos de realização, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores da invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, descritas na presente invenção em relação aos polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Em tal exemplo de realização uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada ou transfectada com) um ou mais vetores compreendendo um ou mias polinucleotídeos codificantes de (parte de) um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção. Conforme utilizado no presente, o termo “célula hospedeira” refere-se a qualquer tipo de sistema celular que pode ser manipulada para gerar o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção ou fragmentos dos mesmos. As células hospedeiras adequadas para a replicação e para suportar a expressão dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são bem conhecidas no estado da técnica. Tais células podem ser transfectadas ou transduzidas, conforme apropriado, com o vetor de expressão particular, e grandes quantidades de células contendo vetor podem ser cultivadas em fermentadores de larga escala para se obter quantidades suficientes do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica para aplicações clínicas.

As células hospedeiras adequadas incluem micro-organismos procarióticos, como E. coli, ou várias células eucarióticas, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de insetos, ou similares.

Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias, em particular, quando a glicosilação não é necessária.

Após a expressão, o polipeptídeo pode ser isolado a partir da pasta celular de bactérias em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.

Além dos procariotos, os micróbios eucariotos como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vetores codificantes de polipeptídeos, incluindo as cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um polipeptídeo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano.

Vide, Gerngross, Nat.

Biotech. 22:1409-1414 (2004), e Li et al., Nat.

Biotech. 24:210-215 (2006). Células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos (glicosilados) podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados) Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos.

Foram identificadas numerosas cepas de baculovírus que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células Spodoptera frugiperda.

Culturas de células vegetais podem também ser utilizadas como hospedeiros.

Consulte, por exemplo, as Patentes US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429 (que descrevem a tecnologia PLANTIBODIESº para produção de anticorpos em plantas transgênicas). As células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros.

Por exemplo, a linhagem de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão pode ser útil.

Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são; linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7); linhagem de rim embriônico humano (293 ou células 293 conforme descrito em Graham et a/., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células rim de hamster neonato (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod 23:243- 251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células humanas de carcinoma cervical (HeLa); células de rim de cão (MDCK); células do fígado de rato búfalo (BRL 3A); células pulmonares humanas (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562);. células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al, Annals NY Acad.Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem a célula de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR-" (Urlaub et al, Proc Acad Nat. Sci USA 77:4216 (1980)) e linhagem de células de mieloma, como a NSO e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de proteína, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, Ed., Humana Press, Fairfield, NJ, págs 255-268 (2003). As células hospedeiras incluem células de cultura, por exemplo, células de mamíferos cultivadas, células de leveduras, células de insetos, células bacterianas e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, ou planta transgênica ou cultura ou tecido de planta ou animal. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, de preferência uma célula de mamífero, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), célula de rim embrionário humano (HEK) ou célula linfoide (por exemplo, célula YO, NSO, SP20).

[454] As tecnologias-padrão para expressar genes exógenos em tais sistemas são conhecidas no estado da técnica. As células que expressam um polipeptídeo compreendendo a pesada ou cadeia leve de um domínio de ligação ao antígeno tal como um anticorpo, podem ser manipuladas de modo a expressarem também a outra cadeia de anticorpo de tal modo que o produto expresso é um anticorpo que tem tanto a cadeia pesado quanto a cadeia leve.

[455] Em um exemplo de realização, é fornecido um método de produção de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, em que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme fornecido no presente, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica a partir da célula hospedeira (ou a partir do meio de cultura da célula hospedeira).

[456] Os componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica (ou o anticorpo) da invenção podem ser fundidos geneticamente entre si. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ser concebida de tal forma que os seus componentes estejam fundidos diretamente entre si ou indiretamente por meio de uma sequência ligante. A composição e o comprimento do ligante podem ser determinados de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica e a eficácia do mesmo pode ser testada. Exemplos de sequências ligantes entre os diferentes componentes de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são fornecidos na presente invenção. Sequências adicionais podem também ser incluídas para incorporar um sítio de clivagem para separar os componentes individuais da fusão, se desejado, por exemplo, uma sequência de reconhecimento de endopeptidase.

[457] O anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção geralmente compreende pelo menos uma região variável de anticorpo capaz de se ligar a um determinante antigênico. As regiões variáveis podem formar parte de, e serem derivadas de anticorpos de ocorrência natural ou de anticorpos que não ocorrem naturalmente e fragmentos dos mesmos. Os métodos para produzir anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais são bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Harlow e Lane, “Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Os anticorpos de ocorrência não natural podem ser construídos utilizando a síntese de peptídeo em fase-sólida, podem ser produzidos de forma recombinante (por exemplo, conforme descrito na Patente US 4.186.567) ou podem ser obtidos, por exemplo, por rastreio de bibliotecas combinatórias que compreendem cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis (vide, por exemplo, a Patente US 5.969.108 de McCafferty).

[458] Qualquer espécie animal de anticorpo, fragmento de anticorpo, domínio de ligação ao antígeno ou região variável pode ser usada no anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção. Os anticorpos, fragmentos de anticorpos, domínios de ligação ao antígeno ou regiões variáveis não limitantes úteis na presente invenção podem ser de origem murina, primata, ou de origem humana. Se o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica é pretendido para uso humano, uma forma quimérica do anticorpo pode ser utilizada onde as regiões constantes do anticorpo são humanas. A forma humanizada ou totalmente humana de anticorpo também pode ser preparada de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, a Patente US 5.565.332 — de Winter). A humanização pode ser obtida por meio de vários métodos, incluindo, mas não se limitando a: (a) enxertar CDRs não humanas (por exemplo, anticorpo doador) na região de arcabouço (framework) humana (por exemplo, anticorpo receptor) e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos da estrutura central críticos (por exemplo, aqueles que são importantes para manter boa afinidade de ligação ao antígeno ou funções do anticorpo), (b) enxertar apenas as regiões determinantes de especificidade não humanas (SDRs ou a-CDRs, os resíduos críticos para a interação anticorpo- antígeno) na região do arcabouço (framework) humana e regiões constantes, ou (c) transplantando os domínios variáveis não humanos inteiros, mas “camuflando” eles com uma seção semelhante à humana pela substituição de resíduos de superfície.

Os anticorpos humanizados e métodos para produzi-los são revistos, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front.

Biosci. 13:1619- 1633 (2008), e são adicionalmente descritos, por exemplo, em Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); Queen et al, Proc.

Nat.

Acad.

Sci.

USA 86:10029-10033 (1989); Patentes US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321 e US 7.087.409; Kashmiri et al, Methods 36:25-34 (2005) (descrevendo o enxerto da região determinante de especificidade (SDR)).; Padlan, Mol.

Immunol. 28:489-498 (1991) (descrevendo o “resurfacing”); Dall'Acqua et al, Métodos 36:43-60 (2005) (descrevendo o “shuffling de FR”); e Osbourn et al, Methods 36:61-68 (2005) e Klimka et al., Br.

J.

Cancer, 83:252-260 (2000) (que descrevem a abordagem de “seleção guiada” para o shufflihg de FR). Os arcabouços (ou regiões estruturais - framework) humanos que podem ser utilizados para a humanização incluem, mas não estão limitados a: regiões de arcabouço (framework) selecionadas usando o método de “melhor ajuste” (best-fit) (vide, por exemplo, Sims et al.

J.

Immunol 151:2296 (1993));. regiões estruturais derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al.

Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 89:4285 (1992); e Presta et al.J.

Immunol, 151:2623 (1993)); regiões estruturais maduras humanas (somaticamente mutadas) ou regiões estruturais humanas da linhagem germinativa (vide, por exemplo, Almagro e Fransson, Front.

Biosci. 13:1619- 1633 (2008)), e regiões estruturais derivadas a partir da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca et al, J.

Biol..Chem. 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al., J.

Biol.Chem. 271:22611-22618 (1996)).

[459] Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica. Anticorpos humanos estão descritos de modo geral em van Dijk e van Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008). Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração de um imunógeno a um animal transgênico, que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. Tais animais contêm tipicamente a totalidade ou uma porção dos loci de imunoglobulinas humanas, que substituem os /oci de imunoglobulinas endógenas, ou que estão presentes extracromossomicamente ou integrados aleatoriamente nos cromossomos do animal. Em tais camundongos transgênicos, os /oci de imunoglobulinas endógenas geralmente foram inativados. Para uma revisão dos métodos para a obtenção de anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, vide Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Vide também, por exemplo, as Patentes US 6.075.181 e US 6.150.584 que descrevem a tecnologia XENOMOUSES,; a Patente US 5.770.429 que descreve a tecnologia HUMABº; a Patente US 7.041.870 que descreve a tecnologia K-M MOUSES, e o Pedido de Patente US 2007/0061900, que descreve a tecnologia VELOCIMOUSES). As regiões variáveis humanas a partir de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ser ainda modificadas, por exemplo, por combinação com uma região constante humana diferente.

[460] Os anticorpos humanos podem ser preparados por métodos baseados em hibridoma. Linhagens de células de mieloma humano e heteromieloma — humano-camundongo para a produção de anticorpos monoclonais humanos também foram descritas. (Consulte, por exemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc.,

Nova lorque, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). Os anticorpos humanos gerados pela tecnologia de hibridoma de células B humanas são também descritos em Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Métodos adicionais incluem os descritos, por exemplo, na Patente US 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM monoclonais humanos a partir de linhagem de células de hibridoma) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que descreve hibridomas humano- humano). A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia de Trioma) também é descrita em Vollmers e, Brandlein Histology and Histopathology, 20 (3):927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

[461] Os anticorpos humanos também podem ser gerados por isolamento de bibliotecas de anticorpos humanos, como descrito na presente invenção.

[462] Os anticorpos úteis da presente invenção podem ser isolados pela triagem de bibliotecas combinatórias para selecionar anticorpos com a atividade ou as atividades desejada(s). Os métodos para rastrear bibliotecas combinatórias são revisados, por exemplo, em Lerner et al. em Nature Reviews 16: 498-508 (2016). Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida no estado arte para a produção de bibliotecas de exibição por fago e a seleção tais bibliotecas para anticorpos que possuam as características de ligação desejadas. Tais métodos são revisados, por exemplo, em Frenzel et al. em mAbs 8: 1177-1194 (2016); Bazan et al. em Human Vaccines and Immunotherapeutics 8: 1817-1828 (2012) e Zhao et al. em Critical Reviews in Biotechnology 36: 276-289 (2016), bem como em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e em Marks e Bradbury em Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed. Human Press, Totowa, NJ, 2003).

[463] Em determinados métodos de exibição em fagos, os repertórios de genes VH e VL são separadamente clonados por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados de forma aleatória em bibliotecas de fagos, que podem ser triados em busca de clones que se ligam ao antígeno, conforme descrito em Winter et al, em Annual Review of Immunology. 12: 433-455 (1994). O fago normalmente exibe fragmentos de anticorpo, como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab. As bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno, sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório inicial (naíve) pode ser clonado (por exemplo, a partir de humano) para fornecer uma única fonte de anticorpos humanos, para uma ampla faixa de antígenos não próprios (non-self) e também próprios (self), sem qualquer imunização, conforme descrito por Griffiths et al., EMBO Journal, 12: 725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas iniciais (naíives) podem também ser produzidas sinteticamente por meio de clonagem dos segmentos de genes V não rearranjados a partir de células-tronco, e utilizando primers de PCR que contém sequências aleatórias para codificar as regiõêês CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom e Winter, em Journal of Molecular Biology., 227: 381-388 (1992). As Publicações de patentes que descrevem bibliotecas fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: as patentes US 5.750.373; US 7.985.840; US

7.785.903 e US 8.679.490 bem como as publicações US 2005/0079574, US 2007/0117126, US 2007/0237764 e 2007/0292936. Outros exemplos de métodos conhecidos no estado da técnica para rastrear bibliotecas combinatórias para anticorpos com uma atividade ou atividades desejadas incluem exibição em ribossomo e mRNA, bem como métodos para exibição e seleção de anticorpos em bactérias, células de mamíferos, células de insetos ou células de levedura. Os métodos para exibição na superfície de levedura são revisados, por exemplo, em Scholler et al. em Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) e em Cherf et al. em Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015), bem como em Zhao et al. em Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012). Os métodos para exibição de ribossomos são descritos, por exemplo, em He et al. em Nucleic Acids Research 25: 5132-5134 (1997) e em Hanes et al. em PNAS 94:4937-4942 (1997).

[464] Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritos na presente invenção podem ser purificados por técnicas conhecidas pelos especialistas no assunto, tal como a cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão por tamanho, e técnicas similares. As condições reais utilizadas para purificar uma proteína particular dependerão, em parte, de fatores como a carga líquida, a hidrofobicidade, a hidrofilicidade, e etc, e serão evidentes para os especialistas no assunto. Para a purificação usando a cromatografia de afinidade, pode ser usado um anticorpo, ligante, receptor ou antígeno ao qual o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica se liga. Por exemplo, para a purificação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de ativação de célula T da invenção por cromatografia de afinidade, uma matriz com a proteína A ou proteína G pode ser usada. A cromatografia de afinidade em Proteína A ou G sequencial e a cromatografia de exclusão por tamanho podem ser usadas para isolar um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno essencialmente conforme descrito nos Exemplos. A pureza dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas pode ser determinada por qualquer um dentre uma variedade de métodos bem conhecidos, incluindo a análise por eletroforese em gel, cromatografia líquida de alta pressão, e similares.

CoMPOSIÇÕES, FORMULAÇÕES E VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

[465] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidos no presente, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos descritos abaixo. Em um exemplo de realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidos na presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outro exemplo de realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidos na presente invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo.

[466] Adicionalmente, é fornecido um método de produção de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção em uma forma adequada para administração in vivo, compreendendo o referido método: (a) a obtenção de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, e (b) a formulação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável, em que uma preparação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica é formulada para administração in vivo.

[467] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica dissolvido ou disperso em um excipiente farmaceuticamente aceitável. As frases “farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitáveis” refere-se a entidades moleculares e composições que são geralmente atóxicas para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas, ou seja, não produzem uma reação adversa nociva, alérgica ou outra quando administrada a um animal, por exemplo, um humano, quando apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém pelo menos um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica e, opcionalmente, um ingrediente ativo adicional será do conhecimento dos técnicos hábeis no assunto à luz da presente divulgação, conforme exemplificado em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado ao presente pela referência. Além disso, para a administração animal (por exemplo, humana), deve-se entender que as preparações devem cumprir as normas de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza conforme exigido pelas diretrizes do Escritório de Padrões Biológicos da FDA ou autoridades correspondentes em outros países. As composições preferidas são formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Tal como utilizado no presente, “veículo farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer e todos os solventes, tampões, meios de dispersão, revestimentos, agentes tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de retardamento da absorção, sais, conservantes, antioxidantes, proteínas, drogas, estabilizantes de drogas, polímeros, géis, ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, corantes, tais como os materiais e combinações dos mesmos, como seria do conhecimento de um técnico hábil no assunto (vide, por exemplo, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18º ed. Mack Printing Company, 1990, págs 1289- 1329, incorporado ao presente pela referência). Exceto na medida em que qualquer veículo convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, a sua utilização nas composições terapêuticas ou farmacêuticas é contemplada.

[468] Um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer via apropriada, que inclui a via parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular,

intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A administração pode ser feita por qualquer via de administração adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica.

[469] As composições parenterais incluem aquelas que foram concebidas para a administração por injeção, por exemplo, por via subcutânea, intradérmica, intralesional, administração intravenosa, intramuscular, intra- arterial, intratecal ou intraperitoneal. Para injeção, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser formulados em soluções — aquosas, preferenciamente em tampões fisiologicamente compatíveis, tal como a solução de Hanks, solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes de formulação, tais como suspensões, —estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, os anticorpos/moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas podem estar na forma de pó para a constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirogênicos, antes da utilização. As soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno da invenção na quantidade requerida em solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados a seguir, conforme necessário. À esterilização pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio da filtragem através de membranas de filtração estéreis. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação dos diversos ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ou outros ingredientes. No caso de pó estéril para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsões, os métodos preferidos de preparação são secagem à vácuo ou técnicas de liofiização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de um meio líquido previamente esterilizado por filtração. O meio líquido deve ser adequadamente tamponado se necessário e o diluente líquido de primeiro ser tornado isotônico antes da injeção com solução salina ou glicose suficiente.

À composição deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento, e protegida contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos.

Será apreciado que a contaminação com endotoxinas deve ser mantida minimamente a um nível seguro, por exemplo, menos que 0,5 ng/mg de proteína.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a: tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, ácool butílico ou benzilico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açucares tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (tal como, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como polietileno glicol (PEG). As suspensões para injeção aquosas podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão, como a carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, dextrano, ou outros compostos similares.

Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas de modo adequado.

Além disso, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas.

Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tal como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como cleats de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas.

[470] Os ingredientes ativos podem ser retidos (encapsulados) em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de coacervação ou por meio de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, (18º Edição, Mack Printing Company 1990). Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o polipeptídeo, que se encontram na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Em exemplos de realização específicos, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser provocada pela utilização de agentes que atrasam a absorção nas composições, tais como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos.

[471] Além das composições descritas anteriormente, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas também podem ser formulados como uma preparação de depósito (depot). Tais formulações de ação prolongada podem ser administradas pela implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou pela injeção intramuscular. Assim, por exemplo, o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ser formulado com materiais poliméricos apropriados ou materiais hidrofóbicos (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.

[472] As composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser produzidas por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, emulsão, encapsulação, aprisionamento ou liofiização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo convencional usando um ou mais veículos, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitem o processamento das proteínas em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada é dependente da via de administração escolhida.

[473] Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas de ativação de célula T podem ser formuladas em uma composição livre de ácido ou base, neutra ou na forma de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que retêm substancialmente a atividade biológica do ácido ou base livre. Estes incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como o ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Os sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, ou de bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidiha ou procaína. Os sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e solventes próticos do que as formas de base livre correspondentes.

ComMPOSIÇÕES E MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[474] Qualquer um dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidos na presente invenção podem ser usados nos métodos terapêuticos. Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser usados como agentes imunoterapêuticos, por exemplo, no tratamento de cânceres.

[475] Para o uso em métodos terapêuticos, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas de ativação de célula T da invenção podem ser formulados, dosados, e administrados de um modo consistente com a boa prática médica. Os fatores que devem ser considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos.

[476] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção para uso como um medicamento. Em aspectos adicionais, são fornecidos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção para uso no tratamento de uma doença. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção são para uso em um método de tratamento. Em um exemplo de realização, a invenção fornece um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica conforme descrito na presente invenção para o uso no tratamento de uma doença em um indivíduo com necessidade de tal tratamento. Em determinados exemplos de realização, a invenção provê um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica para o uso em um método de tratamento de um indivíduo que tem uma doença, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica ao indivíduo. Em certos exemplos de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em um exemplo de realização específico da doença é o câncer. Em certos exemplos de realização, o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, ao indivíduo se a doença a ser tratada é o câncer. Em outros exemplos de realização, a invenção provê um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespeciífica tal como descrito na presente invenção para uso na indução de lise de uma célula-alvo, em particular uma célula tumoral. Em determinados exemplos de realização, a invenção provê um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica para uso em um método de induzir a lise de uma célula-alvo, em particular uma célula tumoral, em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica para induzir a lise de uma célula-alvo. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima é um mamífero, e preferencialmente um ser humano.

[477] Em um aspecto adicional, a invenção provê o uso de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica na fabricação ou preparação de um medicamento. Em um exemplo de realização o medicamento é para o tratamento de uma doença em um indivíduo que necessite de tal medicamento. Em um exemplo de realização adicional, o medicamento é para uso em um método de tratamento de uma doença, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do medicamento a um indivíduo possuindo a doença. Em certos exemplos de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em um exemplo de realização específico da doença é o câncer. Em um exemplo de realização, o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, ao indivíduo se a doença a ser tratada é o câncer. Em outro exemplo de realização, o medicamento é para induzir a lise de uma célula-alvo, em particular uma célula tumoral. Em outro exemplo de realização, o medicamento é para uso em um método de induzir a lise de uma célula-alvo, em particular uma célula tumoral, em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do medicamento para induzir a lise da célula-alvo. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode ser um mamífero, preferencialmente um ser humano.

[478] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para o tratamento de uma doença. Em um exemplo de realização, o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica a um indivíduo possuindo tal doença. Em um exemplo de realização, é administrada uma composição ao referido indivíduo, que compreende o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em certos exemplos de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em um exemplo de realização específico da doença é o câncer. Em certos exemplos de realização, o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, ao indivíduo se a doença a ser tratada é o câncer. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode ser um mamífero, preferencialmente um ser humano.

[479] Em um aspecto adicional, a invenção provê um método para induzir a lise de uma célula-alvo, particularmente uma célula tumoral. Em um exemplo de realização, o método compreende o contato de uma célula-alvo com um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção na presença de uma célula T, particularmente uma célula T citotóxica. Em um aspecto adicional, é fornecido um método para induzir a lise de uma célula- alvo, em particular uma célula tumoral, em um indivíduo. Em tal exemplo de realização, o método compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica a um indivíduo para induzir a lise da célula alvo. Em um exemplo de realização, um “indivíduo” é um humano.

[480] Em certos exemplos de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo, particularmente o câncer. Exemplos não limitantes de cânceres incluem câncer hematológico, como leucemia, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, câncer biliar, câncer de tireoide, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, câncer cervical, câncer endometrial, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer retal, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer de pele, carcinoma espinocelular, sarcoma, câncer ósseo e câncer de rim. Outros distúrbios da proliferação celular que podem ser tratados utilizando um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção incluem, mas não estão limitados a neoplasias localizadas no: abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas (adrenal, paratireoide, hipófise, testículos, ovários, timo, tireoide), olho, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pelve, pele, tecidos moles, baço, região torácica e sistema urogenital. Também estão incluídas as condições ou lesões pré-cancerosas e metástases de cânceres. Em determinados exemplos de realização o câncer é escolhido a partir do grupo que consiste em câncer hematológico (como leucemia), câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de pele, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer cerebral, câncer de cabeça e pescoço e câncer de próstata. Em um exemplo de realização, o câncer é um câncer hematológico, particularmente leucemia, mais particularmente leucemia linfoblástica aguda (ALL) ou leucemia mieloide aguda (AML). Um técnico hábil no assunto reconhece facilmente que, em muitos casos, o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode não proporcionar uma cura, mas pode proporcionar um benefício parcial. Em alguns exemplos de realização, uma alteração fisiológica possuindo algum benefício também é considerada terapeuticamente benéfica. Assim, em alguns exemplos de realização, uma quantidade de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que fornece uma alteração fisiológica é considerada uma “quantidade eficaz" ou uma “quantidade terapeuticamente eficaz”. O sujeito, paciente ou indivíduo que necessita de tratamento é tipicamente um mamífero, mais especificamente um ser humano.

[481] Em alguns exemplos de realização, uma quantidade eficaz de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada a uma célula. Em outros exemplos de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção é administrada a um indivíduo para o tratamento da doença.

[482] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção (quando utilizada isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) irá depender do tipo de doença a ser tratada, da via de administração, da massa corporal do paciente, do tipo de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, da gravidade e curso da doença, se o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, se houve intervenções terapêuticas anteriores ou concomitantes, do histórico clínico do paciente e a resposta ao anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, e o critério do médico atendente. O médico responsável pela administração irá, em qualquer evento, determinar a concentração de ingrediente(s) ativo(s) em uma composição e a(s) dose(s) apropriada(s) para o sujeito individual. Vários esquemas de dosagem, incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas ao longo do tempo, em vários pontos de tempo, administração em bolus, e infusão pulsada são contempladas pela presente invenção.

[483] O anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífico é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 ug/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg — 10 mg/kg) do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma possível dose candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderá variar em cerca de 1 ug/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode ser mantido até que ocorra supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespeciífica estaria no intervalo de cerca de 0,005 mg/kg a cerca de mg/kg. Em outros exemplos não limitativos, uma dose pode também compreender de cerca de 1 micrograma/kg de peso corporal, cerca de 5 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 10 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 50 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 100 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 200 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 350 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 500 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 1 miligrama/kg de peso corporal, cerca de 5 miligrama/kg de peso corporal, cerca de 10 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 50 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 100 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 200 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 350 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 500 miligramas/kg de peso corporal, a cerca de 1000 mg/kg de peso corporal ou mais por administração, e qualquer intervalo de valores derivável destes. Em exemplos não limitativos de um intervalo derivável a partir dos números indicados na presente invenção, um intervalo de cerca de 5 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 5 microgramas/kg de peso corporal a cerca de 500 miligramas/kg de peso corporal, etc, pode ser administrado com base nos números descritos acima. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação destas dosagens) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica). Pode ser administrada uma dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. Entretanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais.

[484] Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção serão utilizados, em geral, em uma quantidade eficaz para atingir o objetivo pretendido. Para uso no tratamento ou prevenção de uma doença, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, ou composições farmacêuticas dos mesmos, são administrados ou aplicados em uma quantidade terapeuticamente eficaz. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro das capacidades dos especialistas no assunto, especialmente à luz da divulgação detalhada fornecida no presente.

[485] Para a administração sistêmica, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios in vitro, tais como os ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração na circulação que inclui a ICso conforme determinado na cultura celular. Tal informação pode ser utilizada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos.

[486] As doses iniciais podem também ser estimadas a partir de dados in vivo, por exemplo, modelos de animais, utilizando técnicas que são bem conhecidas no estado da técnica. Um perito no estado da técnica pode prontamente otimizar a administração para seres humanos com base nos dados obtidos em animais.

[487] A quantidade da dosagem e o intervalo podem ser ajustados individualmente para proporcionar níveis plasmáticos de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que são suficientes para manter o efeito terapêutico. As dosagens habituais nos pacientes para a administração por injeção variam de cerca de 0,1 a 50 mg/kg/dia, normalmente de cerca de 0,5 a 1 mg/kg/dia. Os níveis plasmáticos terapeuticamente eficazes podem ser alcançados pela administração de doses múltiplas todos os dias. Os níveis no plasma podem ser mensurados, por exemplo, por HPLC.

[488] Nos casos da administração local ou absorção seletiva, a concentração local eficaz dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas pode não estar relacionada com a concentração plasmática. Um especialista hábil na técnica será capaz de otimizar dosagens locais terapeuticamente eficazes sem experimentação indevida.

[489] Uma dose terapeuticamente eficaz dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas aqui descrita geralmente proporcionará benefícios terapêuticos sem causar toxicidade substancial. À toxicidade e a eficácia terapêutica de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou em animais experimentais. Os ensaios com cultura celular e estudos em animais podem ser utilizados para determinar a

LDso (dose letal para 50% da população) e a EDso (dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico que pode ser expresso como a relação LDso/EDso. Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que exibem grandes índices terapêuticos. Em um exemplo de realização, o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção apresenta um elevado índice terapêutico. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem adequado para a utilização em seres humanos. A dosagem situa-se preferencialmente dentro de um intervalo de concentrações que inclui a EDso com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo, dependendo de uma variedade de fatores como, por exemplo, a forma de dosagem utilizada, a via de administração utilizada, a condição do sujeito, e assim por diante. À formulação, a via de administração e a dosagem exata podem ser escolhidas pelo médico, tendo em vista a condição do paciente (vide, por exemplo, Fingi et al, 1975, em: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Capítulo 1, p 1, integralmente incorporado ao presente pela referência).

[490] O médico que atende os pacientes tratados com os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas saberia como e quando terminar, interromper ou ajustar a administração devido à toxicidade, à disfunção de órgão, e etc. Inversamente, o médico também saberia como ajustar o tratamento para níveis mais elevados, se a resposta clinica não fosse adequada (impedindo a toxicidade). A magnitude de uma dose administrada no controle do distúrbio de interesse variará com a gravidade da condição a ser tratada, com a via de administração, e outros fatores semelhantes. A gravidade da condição pode, por exemplo, ser avaliada, em parte, por métodos de avaliação de prognóstico padrão. Além disso, a dose e talvez a frequência da dose, também variarão de acordo com a idade, peso corporal, e resposta do paciente individual.

OUTROS AGENTES E TRATAMENTOS

[491] Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser administrados em combinação com um ou mais agente(s) adicional(ais) na terapia. Por exemplo, um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de ativação de célula T da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. O termo “agente terapêutico” compreende qualquer agente administrado para tratar um sintoma ou doença em um indivíduo que necessite de tal tratamento. Tal agente terapêutico adicional pode compreender quaisquer ingredientes ativos adequados para a indicação particular a ser tratada, de preferência aqueles que têm atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Em determinados exemplos de realização, um agente terapêutico adicional é um agente imunomodulador, um agente citostático, um inibidor de adesão celular, um agente citotóxico, um ativador da apoptose celular, ou um agente que aumenta a sensibilidade das células para indutores apoptóticos. Em um exemplo de realização específico, o agente terapêutico adicional é um agente anticâncer, por exemplo, um desestabilizador de microtúbulos, um antimetabolito, um inibidor da topoisomerase, um intercalante de DNA, um agente alquilante, uma terapia hormonal, um inibidor da quinase, um antagonista de receptor, uma ativador da apoptose de células tumorais, ou um agente antiangiogênico.

[492] Tais outros agentes estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. À quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica usado, do tipo de distúrbio ou tratamento, e de outros fatores discutidos anteriormente. Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.

[493] Tais terapias combinadas referidas acima abrangem a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma composição ou em composições distintas), e a administração separada, nesse caso a administração do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção, pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção também podem ser usados em combinação com a radioterapia.

ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[494] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de manufatura que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos anteriormente. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou associado a ele. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de soluções para administração |.V. e etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda uma composição que é por si só, ou em combinação com outra composição, eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou uma ampola que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição de escolha. Além disso, o artigo de manufatura pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição ali contida, em que a composição compreende um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção, e (b) um segundo recipiente com uma segunda composição ali contida, em que a segunda composição compreende um agente citotóxico adicional ou outro agente terapêutico. O artigo de manufatura neste exemplo de realização pode compreender ainda uma bula indicando que a composição pode ser usada para tratar uma condição específica. Alternativamente ou adicionalmente, o artigo de manufatura pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA DIAGNÓSTICO E DETECÇÃO

[495] Em alguns exemplos de realização, qualquer um dos anticorpos anti-HLA-A2/WT1 fornecidos na presente invenção são úteis para detectar a presença de HLA-A2WT1 em uma amostra biológica. O termo “detecção”, conforme utilizado no presente abrange a detecção quantitativa ou qualitativa. Em certos exemplos de realização, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, tais como tecido prostático.

[496] Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo anti-HLA-A2/WT1 para uso em um método diagnóstico ou de detecção. Em outro aspecto, é fornecido um método para detectar a presença de HLA- A2/WT1 em uma amostra biológica. Em certos exemplos de realização, o método compreende o contato da amostra biológica com um anticorpo anti-

HLA-A2/WT1 descrito na presente invenção sob condições permissivas para a ligação do anticorpo anti-HLA-A2/WT1 ao HLA-A2/WT1, e detectar se é formado um complexo entre o anticorpo anti-HLA-A2/WT1 e HLA-A2/WT1. Tal método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-HLA-A2/WT1 é utilizado para selecionar indivíduos elegíveis para a terapia com um anticorpo anti-HLA-A2/WT1, por exemplo, onde o HLA- A2/WT1 é um biomarcador para a seleção dos pacientes.

[497] Distúrbios exemplares que podem ser diagnosticados utilizando um anticorpo da invenção inclui o câncer, particularmente o câncer de próstata.

[498] Em certos exemplos de realização, são fornecidos anticorpos anti-HLA-A2/WT1 marcados. Os marcadores incluem, mas não estão limitados a, marcadores ou moléculas que são detectados diretamente (tais como marcadores fluorescentes, cromóforos, eletrodensos, quimioluminescentes e radioativos), bem como moléculas, tais como enzimas ou ligantes, que são detectadas indiretamente, por exemplo, por meio de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcadores exemplares incluem, mas não se limitam a, radioisótopos 3ºP, 3?S, 14C, 1251, 3H, e 1, fluoróforos tais como quelatos terrosos raros ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, a luciferase do vaga-lume e luciferase bacteriana (Patente US 4.737.456), luciferina, 2,3- dihidroftalazinadionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, B-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo-oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas como uricase e xantina-oxidase, acoplados com uma enzima que emprega o peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante, tal como a HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, mercadores de bacteriófagos, radicais livres estáveis, e similares.

EXEMPLOS

[499] A seguir são fornecidos exemplos de métodos e composições da presente invenção. Entende-se que diversas outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.

EXEMPLO 1 GERAÇÃO DE LIGANTES FAB PARA HLA-A2/WT1 Seleção e triagem de Fabs anti-HLA-A2/WT1

[500] Os Fabs anti-HLA-A2/WT1 foram selecionados por exibição em fagos de bibliotecas Fab sintéticas com base em estruturas inteiramente humanas com diversidade de sequências em CDR3 de domínios VL (3 comprimentos diferentes) e VH (6 comprimentos diferentes).

[501] As rodadas de seleção (seleção de fagos ou biopanning) foram realizadas em solução de acordo com o seguinte protocolo: 1. pré- apuramento de — 10º? partículas de fagomídeo por pool da biblioteca em placas de 96 poços revestidas com NeutrAvidin e revestidas com 500 nM de um complexo HLA-A2/WT1iwv.o não relacionado - biotinilado, 2. incubação das partículas de fagomídeo que não ligam ao complexo HLA-A2/WT1v.o com 100 nM de HLA-A2/WT1 biotinilado por 0,5 h em um volume total de 800 uL, 3. captura de HLA-A2WT1RwmF biotinilado e ligando especificamente o fago adicionando 80 uL de partículas magnéticas revestidas com estreptavidina por min em um agitador, 4. lavagem das respectivas partículas magnéticas 5- 10x com 1 mL de PBS/Tween 20 e 5-10x com 1 mL de PBS usando um separador de partículas magnético, 5. eluição de partículas de fago pela adição de 1 mL de trietilamina 100 mM (TEA) por 5-10 minutos e neutralização por adição de 1/2 volume de Tris/HCI 1 M pH 7,4, 6. reinfecção de células de E. coli TG1 em fase logarítmica com as partículas do fago eluídas, infecção com helperphage VCSM13, incubação em um agitador a 30ºC durante a noite e a precipitação subsequente de partículas de fagomoides em PEG/NaCl para serem utilizadas na próxima rodada de seleção.

[502] Seleções foram realizadas mais de 3 a 4 rodadas, usando concentrações de antígeno constantes a 100 nM.

[503] Além de campanhas de seleção com concentrações constantes de antígeno, outras campanhas de seleção foram realizadas com concentrações decrescentes de antígeno em 100 nM, 50 nM, 10 NM e 5 NM, a fim de selecionar anticorpos com afinidades mais baixas.

Ensaios de ligação ao HLA-A2/WT1: ELISA em sanduíche para caracterização de Fabs obtidos por exibição em fagos

[504] Os clones individuais foram expressos como culturas de 1 mL no formato de 96 poços e os sobrenadantes foram submetidos a uma triagem por ELISA. Os ligantes específicos foram definidos como tendo sinais superiores a 5 x o valor de fundo para HLA-A2/WT1RwvF e os sinais inferiores a 3 x o fundo para HLA-A2/WTlv.o. Mais precisamente, placas de tiras de 96 poços com neutravidina (Thermo Fisher) foram revestidas com 10 nM de HLA- A2/WT1RwmF ou 50 nM de HLA-A2/WT1iv.o a 37ºC durante 30 minutos, seguida pelo bloqueio da placa com 2% (p/v) de solução salina tamponada com fosfato - leite (MPBS) (200 ul/poço) por 1 h em temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 vezes com PBS, depois foram adicionados Fab sobrenadantes bacterianos e a placa foi incubada à temperatura ambiente por 1 h. Depois de mais 3 etapas de lavagem com PBS, o anticorpo secundário anti-FLAG-HRP ((Sigma, Cat. Nº. A8592.) (1:4000) foi adicionado e a placa foi incubada em um agitador durante 1 h à temperatura ambiente. A placa foi lavada por 3 vezes com PBS e reveladas pela adição de 100 ul/poço BM Blue POD (Roche). À reação enzimática foi parada adicionando 50 ul/poço de 1 M de H2SO4. A OD foi lida a 450 nm (referência a 650 nm) para uma leitura final de ODa50-650. OS clones positivos para ELISA foram submetidos à experimentos de triagem cinética descrita abaixo.

Ensaios de ligação ao HLA-A2/WT1: ressonância plasmônica de superfície para caracterização cinética de Fabs obtidos por exibição em fagos

[505] Os ligantes específicos foram identificados pelo rastreio utilizando a ressonância plasmônica de superfície nos sobrenadantes de cultura bacteriana contendo Fab utilizando o biossensor ProteOn XPR36 da BioRad. Em resumo, após a infecção de células E. coli TG1 em fase logarítmica de crescimento com as partículas de fago eluídas, uma única unidade formadora de colônia (cfu) foi plaqueada e coletada para inoculação de 1 mL de culturas de expressão em placas de 96 poços profundos.

[506] Todos os experimentos foram realizados a 25ºC usando PBST como tampão de corrida (PBS 10 mM, pH 7,4 e 0,005% (v/v) Tween 20). Foi utilizado um biossensor ProteOn XPR36 equipado com chips para sensores GLC e GLM e reagentes de acoplamento (acetato de sódio 10 MM pH 4,5, sulfo-N-hidroxissuccinimida [sulfo-NHS], cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminpropil)-carbodi-imida [EDC] e etanolamina) da BioRad Inc. (Hercules, CA).

[507] As imobilizações foram realizadas a 30 uL/min em um chip GLM. O anticorpo específico F(ab)2 pAb (cabra) anti-lgG humana (Jackson ImmunoResearch) foi acoplado na direção vertical usando um procedimento padrão de acoplamento de amina: todos os seis canais de ligantes foram ativados por 5 minutos com uma mistura de EDC (200 mM) e sulfo-NHS (50 mM). Imediatamente após a ativação das superfícies, o anticorpo específico pAb (cabra) anti-lgG humano, F(ab)2 (50 pg/ml, acetato de sódio 10 mM, pH 5) foi injetado nos seis canais por 5 minutos. Finalmente, os canais foram bloqueados com uma injeção de 5 min de etanolamina-HCI 1M (pH 8,5). Os níveis finais de imobilização foram semelhantes em todos os canais, variando de 11000 a 11500 RU. As variantes de Fab foram capturadas dos sobrenadantes de E. coli por injeção simultânea ao longo de cinco dos canais horizontais separados (30 ul/min) por 5 minutos e resultaram em níveis variantes de 200 a 900 RU, dependendo da concentração de Fab no sobrenadante. O meio condicionado foi injetado ao longo do sexto canal para fornecer um espaço em branco 'em linha' para fins de dupla referência. As medições cinéticas únicas (one-shot) foram realizadas por injeção de uma série de diluições HLA-WT1 (por exemplo, HLA-A2/WT1iRvmF ou HLA-A2/WT1vo) (100, 50, 25, 12,5, 6,25, O nM, 50 uL/min) por 2 min ao longo dos canais verticais. A dissociação foi monitorada por 3 min. Os dados cinéticos foram analisados no ProteOn Manager v. 2.1. O processamento dos dados do ponto de reação envolveu a aplicação de uma referência entre pontos (interspots) e uma etapa de referência dupla usando um espaço em branco do tampão em linha (Myszka, J Mo! Recognit (1999) 12, 279-284). Os dados processados das injeções one-shot foram ajustados para um modelo de ligação de Langmuir 1:1 simples, sem transporte de massa (O'Shannessy et al., Anal Biochem (1993) 212,457-468).

[508] Para medições de IgG de sobrenadantes de produções HEK em formato de 6 poços, as variantes de IgG foram capturadas dos sobrenadantes de HEK293 por injeção simultânea ao longo de cinco canais horizontais separados (30 ul/min) por 5 minutos e resultaram em níveis variando de 200 a 400 RU. O meio condicionado foi injetado ao longo do sexto canal para fornecer um espaço em branco 'em linha' para fins de dupla referência. As medições cinéticas únicas (one-shot) foram realizadas por injeção de uma série de diluições de HLA-WT1RwmF ou HLA-A2/WT1v.p (100, 50, 25, 12,5, 6,25, O nM, 50 yul/min) por 3 min ao longo dos canais verticais. À dissociação foi monitorada por 5 min. Os dados cinéticos foram analisados conforme descrito acima.

[509] Com base no perfil de ligação e na especificidade medida para se ligar ao antígeno, os ligantes foram pré-selecionados e medidos em ensaios de ligação celular.

[510] As sequências de todos os ligantes selecionados (11D06, 33H09, 13B04, 11B09, 33FO5, 5E11, 13E08, 5C01, 11G06) são fornecidas na lista de sequências incluída no presente e resumida na Tabela 1 abaixo.

TABELA 1 SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE LIGANTES HLA-A2/WT1 SELECIONADOS. Ligante HCDR1 | HcDR2 [11Dos | a da [3 7 4 | 5 | 6 j| amos | 9 | 3 1800 | 25 | > 19608 ao | so seot | 57 | 68 [11606 | 65 | 66 | 67 [7 68 | 6 | 70 | 72 | EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 IGG E HLA-A2/WT1 x CcD3 Clonagem

[511] Os cDNAs que codificam as proteínas foram clonados em um sistema vetor (Evitria) usando técnicas convencionais de clonagem (não baseadas em PCR). Os vetores plasmidiais foram sintetizados por genes. O DNA do plasmídeo foi preparado sob condições de baixa endotoxina, com base na cromatografia de troca aniônica. A concentração de DNA foi determinada medindo a absorção no comprimento de onda de 260 nm. A correção das sequências foi verificada com o sequenciamento de Sanger (com até duas reações de sequenciamento por plasmídeo, dependendo do tamanho do cDNA). Produção

[512] Os anticorpos IgG e anticorpos biespecíficos foram gerados por transfecção transitória de células HEK293 EBNA (cultivadas em suspensão isenta de soro em meio de cultura Excell). As células foram centrifugadas e o meio substituído por meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em meio CD CHO, foi adicionada polietilenoimina (PEI), e a solução foi submetida à vortex e incubada durante 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida as células foram misturadas com a solução DNA/PEI, transferidas para um frasco de agitação e incubadas durante 3 horas a 37ºC em uma incubadora com atmosfera de CO? a 5%. Após a incubação, foi adicionado meio Excell com suplementos. Um dia após a transfecção, foram adicionados suplementos. Os sobrenadantes celulares foram coletados após 7 dias e purificados por métodos padrão.

[513] Alternativamente, para a produção foram utilizadas células CHO K1 adaptadas à utilização (originalmente da ATCC e adaptadas ao crescimento sem soro em cultura em suspensão). A semeadura foi cultivada em meio eviGrow, um meio quimicamente definido, isento de componentes animais e isento de soro. As células foram transfectadas com o reagente de transfecção eviFect e as células foram cultivadas após a transfecção em eviMake2, um meio isento de componentes animais e sem soro. O sobrenadante foi coletado por centrifugação e subsequente filtração (filtro de 0,2 um).

Purificação

[514] As proteínas foram purificadas a partir dos sobrenadantes de cultura celulares de acordo com protocolos estabelecidos. Resumidamente, as proteínas contendo Fc foram purificadas a partir dos sobrenadantes de cultura celular por cromatografia de afinidade utilizando proteína A (coluna HiTrap ProteinA HP, GE Healthcare). A eluição foi conseguida em pH 3,0 seguido pela neutralização imediata da amostra. A proteína foi concentrada e a proteína agregada foi separada da proteína monomérica por cromatografia de exclusão (coluna HiLoad Superdex 200, GE Healthcare) por tamanho em histidina 20 mM, cloreto de sódio 140 mM, pH 6,0.

Análise

[515] A concentração de proteínas purificadas foi determinada pela medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos de acordo com Pace et al. (Protein Science, 1995, 4, 2411-1423). A pureza e o peso molecular das proteínas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor utilizando um sistema LabChipGXlII (Caliper Lifescience). A determinação do teor de agregado foi realizada por cromatografia HPLC, utilizando uma coluna de exclusão por tamanho analítica (TSKgel G3000 SW XL, Tosoh) equilibrada em 25 mM de K2 PO4, 125 mM de NaCl, 200 mM de monocloridrato de L-arginina, tampão de execução em pH 6,7 a 25ºC.

[516] Os anticorpos biespecíficos CD3 também são referidos na presente invenção como “anticorpos biespecíficos de células T" ou “TCBs”. Uma ilustração esquemática dos anticorpos biespecíficos preparados neste exemplo é fornecida na Figura 2.

[517] Sequências exemplares de TCBs são dadas nas SEQ ID NOs 123, 124, 125 e 129 (11D06 TCB) e SEQ ID NOs 126, 127, 128 e 129 (33H09-TCB). Outros TCBs foram construídos de maneira análoga, usando as sequências VH e VL dos ligantes HLA-A2/WT1 correspondentes.

[518] Como controles, foi preparado um anticorpo biespecífico

HLA-A2/WT1 x CD3 (TCB) com base em um aglutinante semelhante ao anticorpo ESK1 (Dao et al, Sci Transl Med (2013) 5, 176ra33; WO?2012/135854) - referido neste documento como “ESK1 -TCB” (consulte a SEQ ID NOs 73 e 74 para as sequências da região variável) - bem como um TCB não direcionado (vide as SEQ ID NOs 75 e 76 para as sequências da região variável).

[519] Todas as moléculas foram produzidas e purificadas seguindo o mesmo método. A qualidade final foi muito boa para todas as moléculas com quase 100% de conteúdo na forma de monômero e 100% de pureza por CE-SDS.

EXEMPLO 3 ANÁLISE BIOQUÍMICA DE AFINIDADE E AvIDEZ DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA- A2/WT1 x CD3

[520] Para a determinação da afinidade dos anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 para o HLA-A2/WT1Rwmr, foram realizados experimentos de ressonância plasmônica de superfície (SPR) a 25ºC em um instrumento Biacore T200 com HBS-EP como tampão de corrida (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,005% de surfactante P20 (GE Healthcare)). O anticorpo específico anti-=-Fc humano (GE Healthcare, Cat. Nº. BR-1008-39) foi imobilizado diretamente por acoplamento de amina em um chip CM5 (GE Healthcare). As construções biespecíficas foram capturadas por 30 s a 5 nM. Uma diluição seriada de três vezes do complexo HLA-A2/WT1RmF em HBS-EP (1,03 a 25 O nM) foi passada sobre o ligante a 30 uL/min durante 120 segundos para gravar a fase de associação. A fase de dissociação foi monitorada durante 120 s e ativada pela mudança da solução de amostra para HBS-EP. A superfície do chip foi regenerada depois de cada ciclo utilizando uma injeção de MgCl2 3M a 10 uL/min durante 30 seg. As diferenças índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida na célula de fluxo de referência que contém o anticorpo antid-Fc humano, mas sem a construção biespecífica capturada nela. As constantes de afinidade foram derivadas a partir das constantes de velocidade cinética pelo ajustamento a uma ligação Langmuir de 1:1 utilizando o software Bia Evaluation (GE Healthcare).

[521] Para a determinação da avidez e especificidade dos anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 para o HLA-A2/WT1RwmrF, foram realizados experimentos de SPR a 25ºC em um instrumento Biacore T200 com HBS-EP como tampão de corrida (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,005% de surfactante P20 (GE Healthceare)). O anticorpo anti-His (Penta His, Qiagen Cat. Nº 34660) foi imobilizado diretamente por acoplamento de amina em um chip CM5 (GE Healtheare)). O HLA-A2/WTIRmwF ou HLA-A2/WT1vo foi capturado por 30 segundos e 10 ul/min a 5 ou 10 nM (para a medição biespecífica de anticorpos ou IgG, respectivamente). Diluições seriadas de 3 vezes das construções biespecíficas em HBS-EP (1,23 a 100 nM) foram passados sobre o ligante a 30 uL/min durante 120 segundos para gravar a fase de associação. A fase de dissociação foi monitorada durante 240 seg e ativada pela mudança da solução de amostra para HBS-EP. A superfície do chip foi regenerada depois de cada ciclo utilizando uma injeção de glicina a 10 mM, pH 2 durante 60 seg. As diferenças índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida na célula de fluxo de referência que contém o anticorpo anti-=Fc humano, mas sem o HLA-A2/WT1RwmF capturado sobre a célula. Embora seja uma interação 2:1 (o analito é bivalente), as constantes de afinidade foram derivadas a partir das constantes de velocidade cinética pelo ajustamento a uma ligação Langmuir de 1:1 utilizando o software Bia Evaluation (GE Healthcare). Isso resulta em uma Kp aparente representando a avidez da interação.

[522] Os resultados deste experimento estão resumidos na Tabela 2 abaixo. Ambos os anticorpos HLA-A2/WT1 testados se ligam ao HLA-

A2/WT1RwmF com afinidade nanomolar de dois dígitos (monovalente)/afinidade picomolar de três dígitos (bivalente) (avidez) e mantêm a mesma afinidade/avidez quando convertidos de IgG para formato biespecífico. Embora a afinidade dos dois anticorpos testados difira em cerca de um fator dois, a avidez de ambas as moléculas está no mesmo intervalo.

[523] Não foi detectada ligação dos anticorpos HLA-A2/WT1 testados ao HLA-A2/WT1v.po (dados não mostrados). TABELA 2 Resumo Dos DADOS DE AFINIDADE E AVIDEZ, CONFORME DETERMINADO POR SPR PARA ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 IGG E HLA-A2/WT1 x CD3 (“TCBS”) PARA HLA-A2/WT1Rrwmr. Afinidade Avidez Apparent ka (1/M: kd (11: Analito Ligante a UNS) ds KD(pM) ka (1/Ms) | kd (1/s) KD z = desv. padrão padrão drão méd. méd. pad méd. 33H09-hulgG] 1,67 10º [1,1610] |70nM| 474106 | 3,57 10-3 750 1,8 10º [1,24107 /69nNM| 657104 | 23510 50 33H09-TCB | RMF | 2,6710º [1,85107 |70nM| 3,310” | 1,8110? 540 2,32 10º |1,61 10º |69nM]| 58510º | 6,4510º 110 11D06-hulgG1 | RMF | 1,08106º |3,78102/35nM| 2,9710º | 1,81 10º 610 1,04 10º |3,57 102 |34nM | 1,01105 | 1,28 10 20 11DO06-TCB | RMF | 1,07106 |3,85102/36nM| 7,0510º | 4,98 10º 710 1,1210º |3,82102 |[34nM]| 1,8710º | 1i3910º 80

[524] Para a determinação da afinidade dos anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 para o CD3, foram realizados experimentos de ressonância plasmônica de superfície (SPR) a 25ºC em um instrumento Biacore T200 com HBS-EP como tampão de corrida (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,005% de surfactante P20 (GE Healthcare)). O anticorpo específico anti-Fab humano (GE Healthcare, Cat. Nº. 28-9583-25) foi imobilizado diretamente por acoplamento de amina em um chip CM5 (GE Healthcare). As construções biespecíficas foram capturadas por 40 s a 5 nM. Uma diluição seriada de três vezes do complexo CD3e5-Fc em HBS-EP (12,35 a 3000 nM) foi passada sobre os anticorpos biespecíficos a 30 uL/min durante 240 segundos para gravar a fase de associação. A fase de dissociação foi monitorada durante 240 s e ativada pela mudança da solução de amostra para HBS-EP. A superfície do chip foi regenerada após cada ciclo utilizando uma dupla injeção de 10 mM de Glicina-HCI pH 2,1 a 30 ul/min durante 60 segundos. As diferenças índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida na célula de fluxo de referência (que contém o anticorpo anti-=-Fab humano, mas sem a construção biespecífica capturada nela). As constantes de afinidade foram derivadas a partir das constantes de velocidade cinética pelo ajustamento a uma ligação Langmuir de 1:1 utilizando o software Bia Evaluation (GE Healthcare).

[525] Os resultados estão resumidos na Tabela 3. Como o ligante de CD3 é idêntico em ambas moléculas biespecíficas testadas, tal como esperado, sua afinidade com CD3 é essencialmente a mesma.

TABELA3 Resumo Dos DADOS DE AFINIDADE, CONFORME DETERMINADO POR SPR, PARA ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 X CD3 SELECIONADOS (“TCBS”) PARA CD3. Analito Ligante mm ana 1] DDD 33H09-TCB | huCD3-Fc 2,6610? 2,77 10º 100 nM aa E DD 11D06-TCB | huCD3-Fc 2,53 10º 2,82 10º 110 nM EXEMPLO 4 SELEÇÃO DE LIGANTES IGG PARA ESPECIFICIDADE PARA O PEPTÍDEO HLA-A2/WT1 RMF ou VLD.

[526] Primeiro, medimos a especificidade de ligação em células

T2 pulsadas com peptídeo pelas IgG ligantes geradas a partir da exibição de fagos por citometria de fluxo. Resumidamente, as células T2 foram preparadas como uma suspensão celular a 10º células/ml em meio IMDM (Gibco by Life Technologies, Cat. Nº 31980-048), suplementado com 10% de SBF (Gibco, Cat. Nº 16140-071) + 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Cat. Nº. 15070- 063) (meio completo). As células foram mantidas em um volume total de 10 mL em um tubo e incubadas com 10 ul de peptídeo (WT1 peptídeo p37-45 VLD (SEQ ID NO: 77) ou peptídeo p126-134 RMF (SEQ ID NO: 78)) a 10º M (concentração final do peptídeo: 105 M) por 2 horas a 37ºC com 5% de CO». Após a lavagem, as células foram suspensas em PBS frio e incubadas com concentração titulada de IgG ligantes (10 ug/mL a 0,00064 pug/mL) por 1 hora a 4ºC, seguido de incubação com um anticorpo secundário anti-Fc de IgG humana conjugado com fitoeritrina (PE) (Jackson Laboratories, Cat. Nº, 109- 116-098) por 30 min. As células foram adquiridas em um FACS LSR Il (BD) e os dados são apresentados como intensidade média de fluorescência (MFI) de PE no Graphpad Prism.

[527] Como mostrado na Figura 3, 11D06 - IgG, 33H09 - IgG e 5E11 - IgG se ligam ás células T2 pulsadas com peptídeo RMF, mas não às células T2 não pulsadas ou pulsadas com peptídeo VLD. Em contrapartida, 11B09 - IgG, 13B04 - IgG e 5C01 - IgG (mas não 11GO06-l9G) se ligam especificamente ao peptídeo VLD, mas não ao peptídeo RMF. Com base nesses dados, foram selecionados ligantes para conversão em anticorpos biespecíficos CD3 (TCBs).

EXEMPLO 5 ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T Em UM ENSAIO REPÓRTER COM CÉLULAS NFAT-JURKAT APÓS A LIGAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 x CD3 (“TCBs”) Às CÉLULAS T2 PULSADAS COM PEPTÍDEO

[528] Para verificar a especificidade dos anticorpos biespecíficos

HLA-A2/WT1 x CD3 (“TCBs”), uma linhagem de células repórter, células Jurkat que expressam luciferase sob o promotor NFAT (Jurkat-NFAT; Promega Cat. CS176501), foi usado para medir a ativação de células T quando TCBs se ligam a células T2 pulsadas com peptídeo (ATCC, Cat. Nº. CRL-1992). Resumidamente, as células T2 foram preparadas como uma suspensão celular a 10º células/ml. em meio IMDM (Gibco by Life Technologies, Cat. Nº 31980- 048), suplementado com 10% de SBF (Gibco, Cat. Nº 16140-071) + 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Cat. Nº. 15070-063) (meio completo). As células foram mantidas em um volume total de 10 mL em um tubo e incubadas com 10 ul de peptídeo (WT1 peptídeo p37-45 VLD ou peptídeo p126-134 RMF) a 10? M (concentração final do peptídeo: 10 - 5 M) por 2 horas a 37ºC com 5% de CO». Após a lavagem, 90 uL de células pulsadas com peptídeo em uma suspensão celular de 2,2 x 105 células/mL foram semeadas em uma placa de microtitulação de fundo redondo de 96 poços (20.000 células/poço, TPP, Cat. Nº. 92097), cocultivadas com 50 ul de células Jurkat-NFAT (suspensão de células de 2x10º células/mL), e com 10 ul de TCB titulada (a 100 ug/mL de 0,0064 ug/mL em PBS) durante 16 horas a 37ºC com 5% CO». Posteriormente, 50 uL de sobrenadante foram removidos e substituídos por 100 uL por poço de ensaio Bright-Glo Luciferase (Promega, Cat. E2620) para incubação em temperatura ambiente (RT). Cinco minutos depois, 180 ul de sobrenadante foram transferidos para uma nova placa branca para medir o sinal de luminescência por EnVision (PerkinElmer). Os dados são apresentados como Unidade de Luminescência Relativa (URL).

[529] Como mostrado na Figura 4, os TCBs baseados no aglutinante 11D06 e 33H09 (11D06-TCB e 33H09-TCB, respectivamente) reconhecem especificamente o complexo HLA-A2/WT1RwmrF e ativam NFAT nas células repórter Jurkat apenas na presença de células T2 pulsadas com o peptídeo RMF. Em contraste a isso, o TCB controle baseados no ligante na

ESK1-like (ESK1I-TCB) não apresentou especificidade para o peptídeo RMF. Além disso, o TCB baseado no ligante 5SE11 (SE11-TCB) mostrou ativação de células T repórter NFAT na presença de células T2 pulsadas com peptídeo RMF e VLD, portanto esse TCB foi eliminado para a próxima rodada de triagem. Também foram identificados alguns TCBs específicos para peptídeos VLD, tal como os baseados no ligante 11B09 e 13B04 (11B09-TCB e 13B04- TCB, respectivamente). Como controle negativo, foi utilizado no ensaio um TCB não direcionado (DP47GS-TCB), que não ativou NFAT nas células repórter Jurkat na presença de células T2 pulsadas com peptídeo RMF ou VLD. O 5C01-TCB mostrou reconhecimento do peptídeo VLD, mas reagiu de maneira cruzada com o peptídeo RMF em concentrações mais altas. EXEMPLO 6 CITOTOXICIDADE DE CÉLULAS T MEDIADA POR ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA- A2MWT1 x CD3 (“TCBs”) APÓS LIGAÇÃO A CÉLULAS T2 PULSADAS COM

PEPTÍDEO

[530] Em seguida, medimos a citotoxicidade dos TCBs. As células alvo foram células T2 pulsadas com peptídeo como descrito no Exemplo 5. As células efetoras eram células Pan CD3* purificadas a partir de PBMCs isoladas da camada leuco-plaquetária por centrifugação em gradiente de Ficoll (GE Healthcare, Cat. Nº. 17- 1440-03). As células T CD3* totais foram purificadas por MACS (Miltenyi Biotec) usando um Kit de Isolamento de células Pan T Humanas (Miltenyi Biotec, Cat. Nº. 130-096-535). O ensaio de citotoxicidade foi realizado da seguinte forma: As células pulsadas com peptídeo (100 uL) foram semeadas em uma placa de microtitulação de fundo redondo com 96 poços (3x105º células/mL), cocultivadas com 50 uL de células T (6x10º células/mL), e com 50 ul de TCB titulado (por exemplo, a 40 ug/mL a 0,00004 pg/mL) em meio completo durante 18 h a 37ºC com 5% de CO2. Em seguida, 50 ul de sobrenadante foram transferidos para uma nova placa branca e 25 uL por poço do reagente de ensaio do kit CytoTox-Glo Luciferase Assay (Promega, Cat. G9291) foram adicionados para incubação em temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos. A leitura do sinal luminescente (para medição da liberação de LDH como indicativo de morte celular) foi feita pelo EnVision (PerkinElmer). Os dados são apresentados como Unidade de Luminescência Relativa (URL).

[531] A Figura 5 mostra a morte de células alvo que expressam RMF ou VLD por células T específicas mediada por TCB. Descobrimos que tanto o 11D06-TCB quanto o 33H09-TCB mostraram morte específica em células T2 pulsadas com peptídeo RMF. 33FO5-TCB não mediou a morte específica de células pulsadas por peptídeo RMF ou VLD. Além disso, 13B04- TCB e 11B09-TCB mediaram a morte potente em células T2 pulsadas com peptídeo de VLD. 5C01-TCB mostrou morte de células T2 pulsadas com VLD, mas também de células pulsadas com RMF em concentração mais alta, consistente com as observações no ensaio com células repórter NFAT (Figura 4).

EXEMPLO 7 CITOTOXICIDADE DE CÉLULAS T MEDIADA POR ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA- A2/WT1 x CD3 (“TCBs”) APÓS LIGAÇÃO EM LINHAGENS DE CÉLULAS WT1*

[532] Para confirmar a morte específica pelos TCBs, realizamos o ensaio de citotoxicidade em linhagens de células tumorais WT1*. As HLA-A2 + WT1 + linhagens de células eram células SKM-1 (DZMZ No. ACC 547), e células CHO transfectadas com o complexo HLA-A2/WT1iRmF (CHO-WT1) (interna). Os controles negativos eram células HLA-A2*WT1-: células BJAB (DZMZ ACC 757), ARH-77 (DZMZ ACC 512) e células CHO transfectadas com complexo HLA-A2/MAGE-A4 (CHO-MAGEA4) (interna) bem como uma linhagem de células HLA-A2WT1*: K562 (ATCC CLL-243) (Figura 6A). O ensaio de citotoxicidade foi realizado conforme descrito no Exemplo 6. Tanto o

11D06-TCB quanto o 33H09-TCB mostraram potente destruição de células SKM-1 e CHO-WT1, mas não nas células HLA-A2'WT1" e HLA-A2WT1*, indicando que esses dois TCBs têm especificidade para o peptídeo WT1RmF (Figura 6 B, C). Em contraste, nenhum dos TCBs específicos para peptídeos de VLD mostrou morte nas linhagens de células HLA-A2*WT1* e, se exibiram morte, exibiram baixa potência em alta concentração (10 ug/mL) nas linhagens de células WT1*, no mesmo grau destruição observado nas linhagens de células WT1", bem como (Figura 6 D, E). Com base nesses dados funcionais, selecionamos 11D06-TCB e 33H09-TCB para avaliação adicional.

[533] Também comparamos nossos TCBs selecionados com ESK1-TCB por sua atividade de matar células alvo tumorais. Curiosamente, embora ESK1-TCB tenha atingido uma potência semelhante na mediação da morte de células SKM-1 em comparação com 11D06-TCB e 33H09-TCB, ele também induziu a morte em células HLA-A2*WT-1" BJAB, indicando que a ligação ESK1I-TCB não está restrita ao complexo HLA-A2/WT1RrwmF (Figura 6F, G).

[534] Nós testamos a morte de diversas linhagens de células tumorais que são HLA-A2*'WT1*. Com base no valor de EC50o para a morte, as linhagens de células foram categorizadas naquelas que foram mortas com uma EC5o0 < 1 uM (marcadas na Tabela 4 com “++”), e aquelas que foram mortas com uma ECs5o > 1 uM e < 5 uM (marcadas na Tabela 4 com “+”) e aquelas que não foram essencialmente mortas (marcadas na Tabela 4 com “não”).

[535] Em conjunto, os TCBs selecionados 11D06-TCB e 33H09- TCB medeiam a citotoxicidade de células T em 6 das 13 linhagens de células HLA-A2*WT1*+. A falta de morte nas outras linhagens de células foi provavelmente devido à baixa expressão de WT1 apresentada na superfície celular pelo MHC |. A Tabela 4 mostra os resultados para 11D06-TCB. Os resultados para 33H09-TCB foram semelhantes (com valores ECrso ligeiramente superiores aos do 11D06-TCB). TABELA 4 MORTE DE CÉLULAS DAS LINHAGENS WT1* POR TCBs SELECIONADOS. Nomeada Morte por ECs5o (UM) : 2 Doença de origem | 11D06-TCB | morte in vitro | mutação K- iiohagem de HLA-A2 WT! ftecidual (RMF- por 11D06- Ras específico) TCB aguda T98G + |+ — |Glioblastoma 0,8—-1,7 não MDA-MB- R + Adenocarcinoma ++ 0,5-2,8 Em 231 de mama SW620 + + Adenocarcinoma + 4,8 Sm colorretal SWA480 + + Adenocarcinoma + 2,9 sim colorretal HAM: (+)* se tratado SET-2 + + Tiompocitêmia com (0,005) não Decitabina aguda Leucemia mieloide = = ass kb LN-18 + |+ — |Glioblastoma | não | não ua66 o jmieloma | não | | não | ovário Leucemia Nalm6 + + precursora das não não células B EXEMPLO 8 ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T MEDIADA POR ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 X CD3 (“TcBs”) APÓS LiGAÇÃO Às LINHAGENS DE CÉLULAS WT1*

[536] Um pré-requisito da citotoxicidade mediada por TCB nas células alvo WT1* é que as células T sejam ativadas para adquirir a função efetora. Medimos o status de ativação das células T por citometria de fluxo na cocultura de células T e células SKM-1 HLA-A2*WT15, ou células BJAB HLA- A2*WT1' na presença dos dois TCBs selecionados, 33H09-TCB e 11D06-TCB, durante o ensaio de morte in vitro, como descrito no Exemplo 7. As células são coletadas após 18 horas de coincubação e coradas com anticorpos contra CD3 (Biolegend Cat. Nº 300321), CD25 (Biolegend Cat. Nº 302606) e CD69 (Biolegend Cat. Nº 310914) para medir a ativação de células T por citometria de fluxo.

[537] Como mostrado na Figura 7, ambos os TCBs induziram a regulação positiva de CD69 e CD25 nas células T CD3* após a ligação às células SKM-1, mas não às células BJAB, indicando que o reconhecimento específico pelos TOBs do complexo HLA-A2/WT1RwmF apresentado pelas células SKM-1 desencadeia a ativação de células T mediada por CD3, levando à lise específica das células-alvo.

EXEMPLO 9

AUSÊNCIA DE LIGAÇÃO A PEPTÍDEOS FORA DO ALVO POR ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 X CD3 (TcBs) SELECIONADOS.

[538] Um importante risco potencial no desenvolvimento de anticorpos do tipo receptor de células T (TCR) é a reatividade cruzada do anticorpo com peptídeos homólogos apresentados a partir de proteínas expressas pelo tecido normal. Conforme relatado por Ataie et al. (J Mol Biol. (2016) 428: 194-205) que o anticorpo ESK1 se liga a peptídeos semelhantes à sequência derivadas da proteína MED13L e PIGQ, testamos nossos TCBs quanto à sua reatividade cruzada com esses dois peptídeos. As sequências desses peptídeos são mostradas na Figura 8F e nas SEQ ID NOs 79 e 80. Em um ensaio de ligação baseado em citometria de fluxo, conforme descrito no Exemplo 4, descobrimos que 11D06-TCB e 33H09-TCB não se ligam ao peptídeo PIGQ. A ligação ao peptídeo MED13L por ambos os TCBs é quase 100 vezes menor quando comparada ao peptídeo WT1RwrF nativo (Figura 8 A, B). Embora o ESK1I-TCB se ligue ao peptídeo RMF com uma baixa afinidade, ele se liga ao peptídeo PIGQ de maneira semelhante e ainda mais fortemente ao MED13L (Figura 8C), o que é consistente com a atividade de ligação relatada da ESK1 IgG (Ataie et al., J Mol Biol. (2016) 428: 194-205).

[539] Nós também testamos a reatividade cruzada usando o ensaio NFAT-repórter, conforme descrito no Exemplo 5. De acordo com os dados de ligação, a força da ativação de NFAT nas células Jurkat após a ligação ao MED13L e PIGQ é pelo menos 100 vezes mais fraca que a ativação após a ligação ao peptídeo WT1IRmF pelos TCBs 11D06-TCB e 33H09-TCB (Figura 8 D, E).

EXEMPLO 10 AUSÊNCIA DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 X CD3 (“TCBs”) A PEPTÍDEOS NÃO ALVO NÃO IDENTIFICADOS”

[540] A reatividade cruzada contra peptídeos homólogos (compartilhando resíduos-chave de reconhecimento) derivados de tecido normal pode causar toxicidades sérias e não prontamente previsíveis pelo anticorpo TCR-like ou terapia com células T baseada em TCR (vide, por exemplo, Linette et al, Blood (2013) 122: 863 -71; relatando toxicidade fatal da terapia MAGE A3-TCR devido à reatividade fora do alvo contra uma proteína expressa pelo tecido cardíaco). A especificidade desses agentes é, portanto, crítica. Para definir minuciosamente a especificidade de nossos anticorpos, com base nos dados da estrutura cristalina que confirma as posições no peptídeo RMF envolvido na ligação de 11DO06 (vide o Exemplo 15), estendemos nossa busca por possíveis peptídeos fora do alvo com sequência de aminoácidos semelhante ao do WT1 Peptídeo RMF (SEQ ID NO: 78) mascarando RxxPNxxYx nos bancos de dados de peptídeos (Swissprot e TrEMBL). Encontramos 25 peptídeos adicionais derivados de proteínas diferentes, todos com alta afinidade prevista para o HLA-A2 (Tabela 5). Em seguida, nós testamos a reatividade cruzada de nossos TCBs selecionados nas células T2 pulsadas com peptídeo usando o ensaio NFAT-repórter (peptídeo 1-6) ou ensaio de citotoxicidade de células T (peptídeo 7-25), como descrito acima.

[541] Para os 6 primeiros peptídeos testados, não houve reatividade cruzada com nenhum dos 6 peptídeos pelo 11D06-TCB. O 33H09- TCB mostrou algum reconhecimento para ARHGEF11, mas o grau de ativação de NFAT foi > 100 vezes menor em comparação com o peptídeo RMF nativo (Figura 9A, B). De forma similar, a reatividade cruzada com os outros 19 peptídeos fora do alvo foi pelo menos 100 vezes menor que com o peptídeo RMF nativo, conforme medido pela morte direcionada por células T das células T2 pulsadas com peptídeo (Figura 9 C, D). Este resultado foi confirmado em um segundo experimento, no qual também foi testado o ESK1I-TCB (Figura 9 E-G).

[542] Em conjunto, confirmamos que 11D06 e 33H09 (mas não o ligante tipo ESK1) mostram especificidade para o peptídeo WT1 RMF, e não mostram especificidade para os possíveis peptídeos fora do alvo detectados no peptidoma.

TABELA5 PEPTÍDEOS FORA DO ALVO ADICIONAIS, RECENTEMENTE IDENTIFICADOS. Peptídeo Sequência Peptídica Nome do gene SEQ ID NO 1 RLFPNLPEL ARHGEF11 81 2 RMFPNKYSL PRDM16 82 3 AMDPNAAYV SERPINA6 83 4 RMGPNIYEL NIPSNAP1 84 NMPPNFPYI TAF3 85 6 YTIPNHPYL Uua4 86 7 RLFPNAKFL TPST1 87 8 RMVPRAVYL IGFBP5 88 9 KMVPSIPYL RALGPS1 89 RIFPSYSYL ZNF382 90

Peptídeo Sequência Peptídica Nome do gene SEQ ID NO 1 RLFPNSKFL TPST2 91 12 KMTPCIPYL RALGPS2 92 13 SMFPSLKYL TBCE o3 14 RLLPSAPTL KIFC2 94 RLRPHVPYL SLC16A8 95 16 RMNPNSPSI ERH 96 17 RVFNNRWYL ZBTBA47 97 18 RLQLNNPYL MIOS o8 19 RMFFNGRY| ATP6VOA2 99 RLSPNRPPL PKD1 100 21 ETFPNSWYL NAALADL1 101 22 GLKPNAIYL ROBO1 102 23 RQFPNASLI RECOL 103 24 YIFPNCPFL SERPINA2 104 RLRINFPYL FAM220A 105 EXEMPLO 11 AUSÊNCIA DE CITOTOXICIDADE EM CÉLULAS-TRONCO CD34* MEDIADA POR ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 x CD3 SELECIONADOS (“TCBs”)

[543] Foi divulgado que as células-tronco hematopoiéticas CD34* são positivas para WT1 (Ramani e Covwell, J. Path (1996) 179: 162-8), portanto, pode ser potencialmente prejudicial se os TCBs se ligarem a elas. Para estudar se as células CD34* apresentam endogenamente o peptídeo RMF, obtivemos células CD34* derivadas da medula óssea HLA-A2* de 3 doadores da Lonza e testamos nossos TCBs selecionados em um ensaio de morte, conforme descrito acima no Exemplo 7. Enquanto 11D06-TCB e 33H09-TCB mediam a morte de maneira potente em células SKM-1, eles não tiveram atividade de morte nas células-tronco CD34*, indicando que essas células-tronco podem não apresentar o peptídeo RMF no contexto de HLA-A2 (Figura 10).

EXEMPLO 12 DEFINIÇÃO DE RESÍDUOS DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA- A2/WT1 X CD3 SELECIONADOS (“TCBs”) POR ENSAIO DE VARREDURA DE

ALANINA

[544] É evidente que nossos TCBs têm ligação diferente ao peptídeo RMF e atividade funcional em comparação com ESK1-TCB. Para caracterizar os potenciais motivos de ligação do peptídeo RMF pelos TCBs, montamos um ensaio de varredura de alanina usando matrizes peptídicas derivadas de sequências nativas, substituindo individualmente cada aminoácido por uma alanina e medimos o sinal repórter NFAT pelas células T2 pulsadas com esses peptídeos (Figura 11 A-L). Os dados são apresentados como RLU em concentrações crescentes de TCB. Nós representamos graficamente a alteração em vezes da ECs5o em relação à EC5o para o peptídeo nativo e consideramos uma alteração em vezes igual ou superior a 10, significando que o respectivo resíduo de aminoácido do peptídeo RMF pode ser crítico para o reconhecimento pelo 11D06-TCB e 33H09-TCB (Figura 11M). Concluímos que 11D06-TCB e 33H09-TCB têm contato crítico com os resíduos R1, F3, N5 e A6 (Figura 11N), enquanto o ESK1 demonstrou ter contato próximo com o peptídeo RM1; R1, P4 e N5 (Ataie et al., J. Mol Biol. (2016) 428: 194-205).

EXEMPLO 13 PERFIL FARMACOCINÉTICO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 X CD3 (TCBs) APÓS INJEÇÃO ÚNICA EM CAMUNDONGOS NSG.

[545] Uma dose única de 0,5 mg/kg de 33H09-TCB ou 11D06- TCB foi injetada em camundongos NSG. Todos os camundongos receberam injeções i.v. de 200 ul da solução apropriada. Para se obter a quantidade adequada de compostos por 200 uL, as soluções estoque foram diluídas com tampão histidina. Três camundongos por ponto de tempo foram sangrados aos min, 1 hora, 3 horas, 6 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 6 dias, 8 dias, 10 dias e 12 dias. O composto injetado foi analisado em amostras de soro por ELISA. Anticorpo anti-huCD3-CDR biotinilado (Roche Diagnostics, Penzberg, Alemanha), amostra de teste, anticorpo anti-huFc marcado com digoxigenina e anticorpo de detecção anti-digoxigenina (peroxidase (POD)) foram adicionados passo a passo a uma placa de microtitulação revestida com estreptavidina de 96 poços e a placa foi incubada após cada etapa por 1 h em temperatura ambiente. A placa foi lavada três vezes após cada etapa para remover as substâncias não ligadas. Finalmente, o complexo ligado com peroxidase é visualizado pela adição de solução de substrato ABTS (ácido 2,2- azino-bis(3-etilbenztiazolina-6-sulfônico) para formar um produto de reação colorido. A intensidade do produto de reação que foi determinada fotometricamente a 405 nm (com o comprimento de onda de referência em 490 nm) é proporcional à concentração do analito no soro. O resultado (Figura 12) mostrou um comportamento PK estável para ambos os clones testados, o que sugeriu um esquema de administração semanal para os estudos de eficácia subsequentes. EXEMPLO 14 EsTUDO DE EFICÁCIA COM ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 x CD3 (“TCBs”) No XENOENXERTO DE SKM-1 EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS.

[546] O primeiro estudo de eficácia dos anticorpos biespecíficos HLA-A2/WT1 x CD3 teve como objetivo comparar dois ligantes WT1 diferentes (11D06 e 33H09) em termos de eficácia em um xenoenxerto de leucemia mieloide aguda humana (AML) (SKM-1; HLA-A2*, WT-1*) em camundongos NSG totalmente humanizados.

[547] As células SKM-1 (AML humana) foram originalmente obtidas da ATCC e depositadas no banco de células interno da Roche Glycart. As células foram cultivadas em RPMI + 10% de SBF + glutamina a 1% em uma atmosfera saturada de água com 5% de CO>2. A passagem in vitro 15 foi utilizada para a injeção subcutânea, a uma viabilidade de 98% com Matrigel (proporção 1:1).

[548] Camundongos NSG fêmeas, com 4-5 semanas de idade no início do experimento (Jackson Laboratory) foram mantidos sob condições livres de patógenos-específicos com ciclos diários de 12 h luz/12 h escuro de acordo com as diretrizes compromissadas (GV-Solas ; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi analisado e aprovado pelo governo local. Após a chegada os animais foram mantidos por uma semana para se habituarem ao novo ambiente e para a observação. Foi realizado o monitoramento contínuo da saúde regularmente.

[549] Os camundongos NSG fêmeas receberam injeções i.p. com 15 mg/kg de busulfano seguido um dia mais tarde por uma injeção i.v. de 1x105º células-tronco hematopoiéticas humanas isoladas a partir de sangue do cordão umbilical. Na semana 14-16 após a injeção das células-tronco, os camundongos foram sangrados pelo vaso sublingual e o sangue foi analisado por citometria de fluxo para humanização bem-sucedida. Os camundongos enxertados com eficiência foram randomizados de acordo com suas frequências de células T humanas nos diferentes grupos de tratamento. Nesse momento, os camundongos receberam injeções s.c. de células tumorais SKM-1 como ilustrado na Figura 13A e foram tratados uma vez por semana com os compostos ou tampão histidina (veículo), quando o tamanho do tumor atingiu aproximadamente 150 milímetros? (dia 10). Todos os camundongos receberam injeções i.v. de 200 ul da solução apropriada. Para se obter a quantidade adequada de compostos por 200 yuL, as soluções de estoque foram diluídas com tampão histidina quando necessário. O crescimento tumoral foi medido três vezes por semana utilizando um paquímetro e o volume tumoral foi calculado da seguinte forma:

Tv (L2/2) x C (L: Largura, C: Comprimento)

[550] A inibição do crescimento tumoral (TGI), bem como a relação tumor/controle (TCR) foram calculadas da seguinte forma: 6h 100 — Av(F tratamento! — Liratamento [basal] x 100 Av (T veículolita xl T veículo [basal] TCR: Cria

[551] A Figura 13 mostra a cinética de crescimento tumoral (média) em todos os grupos de tratamento (Figura 13C), bem como a cinética de crescimento de tumor único em cada grupo (Figura 13 D-F). Como mostrado, ambos os TCBs exibem inibição do crescimento tumoral, com o clone 11D06 mostrando a inibição mais forte do crescimento tumoral com uma TGI de 101,3 (Figura 13G).

EXEMPLO 15 ESTRUTURAS CRISTALINAS DO COMPLEXOS ANTICORPO HLA-A2/WT1/PMHC.

[552] Os fragmentos Fab foram preparados por incubação de anticorpos por 72 horas a 25ºC em Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM com 1,05 U de plasmina (Roche, Cat. Nº 602361) por mg. O Fc clivado foi separado dos fragmentos Fab utilizando uma coluna de afinidade CaptureSelect CH1 de 4,5 mL (BAC BV, Cat. 191.3120) equilibrada com Tris a 50 mM, glicina a 100 mM, NaCl a 150 mM, pH 8,0. Os fragmentos Fab foram eluídos da coluna com Tris 50 mM, glicina 100 mM, NaCl 150 mM, pH 2,0 e neutralizados com fosfato de sódio 0,5M, pH8,0, antes de serem carregados em uma coluna de exclusão de tamanho S75 (GE Healthcare) equilibrada com Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. O controle de qualidade foi realizado com exclusão de tamanho analítico (coluna Tosoh, TSK-Gel G3000SWXL, em um sistema Agilent HPLC 1200) e CE-SDS (Caliper LabChip GXII, Perkin Elmer) sob condições não redutoras e redutoras. Os fragmentos Fab purificados foram congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80ºC.

[553] Cristalização, coleta de dados e determinação da estrutura do complexo anticorpo 5C01 / pMHC.

[554] Cristalização. O complexo anticorpo/ pMHC (Fab 5CO01 HLA-AO02/WT1v.o pMHC) foi preparado misturando um excesso molar de 1,2 vezes o fragmento Fab HLA-A2/WT1 baseado no ligante 5C01 (Fab 5C01) com o complexo peptídico HLA-A2/WT ivo (HLA-AO02/WT1vio pMHC). Após 1 hora de incubação a 4ºC, a mistura foi concentrada para 10 mg/mL. Os ensaios de cristalização iniciais foram realizados em configurações de difusão de vapor po “sitting drop” (gota sentada) a 21ºC. Os cristais apareceram em 1 dia de tartarato de sódio 0,2 M, polietilenoglicol a 20% (PEG) 3350 com 2-metil-2,4- pentanodiol a 10% (MPD) adicionado à gota de cristalização para melhorar a qualidade do cristal. Os cristais foram coletados diretamente da placa de peneiramento sem mais nenhuma etapa de otimização.

[555] Coleta de dados e determinação da estrutura. Para a coleta de dados, os cristais foram congelados a 100K em solução precipitante contendo 15% de glicerol. Os dados de difração foram coletados no comprimento de onda de 1.0000 À, usando um detector PILATUS 6M no feixe de luz X10SA da Swiss Light Source (Villigen, Suíça). Os dados foram processados com XDS (Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010)) e redimensionados com SADABS (BRUKER). Os cristais do complexo pertencem ao grupo espacial P2:212 com eixos celulares de a = 158,94 À, b=49,12À,c= 128,63 À e difratam até uma resolução de 1,98 À. A estrutura foi determinada por substituição molecular com PHASER (McCoy, AJ, Grosse-Kunstleve, RW, Adams, PD, Storoni, LC e Read, RJ. J. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007)) usando o método coordenadas da estrutura cristalina com a entrada 4NO5 do Protein Data Bank (PDB) e uma estrutura Fab interna como modelos de pesquisa. À densidade de elétrons das diferenças foi usada para colocar o peptídeo e alterar os aminoácidos de acordo com as diferenças de sequência por refinamento do espaço real. As estruturas foram refinadas com os programas da suíte CCP4 (Collaborative Computational Project, Número 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)) e BUSTER (Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P., Sharff, A., Smart, O.S., Vonrhein, C., Womack, T.O . (2011). versão Buster 2.9.5 Cambridge, Reino Unido: global Phasing Ltd). Manual rebuilding was done with COOT (Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG e Cowtan, K. Acta Cryst D66, 486-501 (2010)).

[556] A coleta de dados e refinamento estatístico estão resumidos na Tabela 6. TABELA 6 COLETA DE DADOS E REFINAMENTO ESTATÍSTICO PARA FAB 5C01 HLA- AO2/WT1v.o P MHC. 5CO1-HLA-A02/ WT1vwo pMHC Coleção de dados Grupo de espaço P21212 Dimensões da célula a, b, c(À) 158,94, 49,12, 128,63 C) 90, 90, 90 Resolução (À) 1,98 Rsym ou Rmerge 0,11 ol 12,01 (0,53) Completude (%) 99,9 (99,9) Redundância 6,61 (6,76) Refinamento Resolução (À) 48,9 — 1,98 Nº. reflexões 71103 Rwork | Ríree 19,12/24,01 Nº. átomos Proteína 6374 Água 528 Fatores-B Proteína 66,32 Água 59,27 Desvios R.m.s. Comp. das ligações (À) 0,010 ângulo das ligações(*) 1,07 * Os valores entre parênteses são para shell de alta resolução.

[557] Estrutura do Fab 5CO01 em complexo com HLA- AO02WT1wvLD.

[558] A fim de caracterizar os detalhes de interação do peptídeo VLD com Fab 5C01, o parátopo e epítopo de ligação de 5C01 com o HLA-AO?2, nós determinamos a estrutura cristalina do complexo de 5C01 com o HLA- AO2MWT1vto pMHC com uma resolução de 1,98 À (Figura 14A). A estrutura revela que o Fab 5C01 se liga ao pMHC principalmente pelas contribuições do CDR1 e CDR3 de cadeia leve e por todas as CDRs de cadeia pesada. A partir do peptídeo VLD (SEQ ID NO: 77), as cadeias laterais dos resíduos Val1, Phe4 e Pro7 estão em contato direto com o Fab. Todas as outras cadeias laterais do peptídeo apontam para a molécula HLA-AO2. A contribuição do peptídeo para a área da superfície de contato é de — 68 À?, enquanto é observada uma área total de contato Fab-pMHC de — 476 À?. Uma aproximação da interface Fab 5CO01-pMHC é mostrado na Figura 15.

[559] A análise da interface de ligação com o programa PISA (E. Krissinel e K. Henrick (2007), J. Mol. Biol. 372, 774-797) revela um padrão de interação do Fab 5C01 com o HLA-AO2 feito através de 8 ligações de hidrogênio, interações Pi-Pi e contatos de van der Waals. As ligações de hidrogênio da cadeia lateral são formadas entre os resíduos da cadeia pesada CDR3 (Trp97) e CDR2 (Ser52, Ser53) com Glu63 e Glu166 de HLA-AO2. Outras ligações de hidrogênio são estabelecidas por átomos da estrutura principal da cadeia de Tyr91 e lle93 com GIn155. Além disso, o complexo é estabilizado através da formação de interações Pi-Pi dos resíduos da cadeia leve Trp32 e Trp94 com as cadeias laterais HLA-AO02 de GIn155 e His151. À valina N-terminal do peptídeo VLD mantém ligações de hidrogênio através do nitrogênio do esqueleto até Tyr171 de HLA-AO2. Sua cadeia lateral é orientada em direção a uma bolsa formada por Glu63 e Trp167 do HLA-AO2 e Trp97 da cadeia pesada do Fab 5CO01. Além disso, Phe4 do peptídeo faz interações de ponta a ponta com Tyr100 da cadeia pesada. Uma matriz de interação esquemática do Fab 5C01 - pMHC resumindo os contatos é mostrada na Figura 16.

[560] Cristalização, coleta de dados e determinação da estrutura do complexo anticorpo 11DO06 / pMHC.

[561] Cristalização. O complexo anticorpo/ pMHC (Fab 11D06 HLA-AO02/WT1RmF pMHC) foi preparado misturando uma quantidade molar 1:1 de fragmento Fab HLA-A2/WT1 baseado no ligante 11DO06 (Fab 11D06) com o complexo peptídico HLA-A2/WT1RmF (HLA-AO2/WT1RmF pMHC). Após 4 horas de incubação a 21ºC, a mistura foi concentrada para 20 mg/mL. Os ensaios de cristalização iniciais foram realizados em configurações de difusão de vapor po “sitting drop” (gota sentada) a 21ºC. Os cristais apareceram dentro de 4 dias em Tris 0,1 M, pH 8,0, PEG 4000 a 20%. Os cristais foram coletados diretamente da placa de peneiramento sem mais nenhuma etapa de otimização.

[562] Coleta de dados e determinação da estrutura. Os dados foram coletados, processados e escalonados conforme descrito acima. Os cristais do complexo pertencem ao grupo espacial P21 com eixos celulares de a = 54,11 À, b = 67,00 À, c = 139,36 À com B = 90,57º e difratam até uma resolução de 2,64 À. A estrutura foi determinada por substituição molecular com PHASER usando as coordenadas de uma estrutura produzida internamente de complexo Fab e MHC como modelo de pesquisa. A densidade de elétrons das diferenças foi usada para colocar o peptídeo e alterar os aminoácidos de acordo com as diferenças de sequência por refinamento do espaço real. O refinamento da estrutura e a reconstrução manual foram feitos conforme descrito acima.

[563] A coleta de dados e refinamento estatístico estão resumidos na Tabela 7.

TABELA 7 COLETA DE DADOS E REFINAMENTO EsTATÍsTICO PARA 11D06 HLA-AO02/WT1RrmF P MHC. 11D06 HLA-AO2/ WT1rRmF pMHC Coleção de dados Grupo de espaço P21 Dimensões da célula a, b, c(À) 54,11, 67,00, 139,36 O) 90, 90,57, 90 Resolução (À) 2,64 Reym OU Rmerge 0,10 Ilol 13,10 (0,82) Completude (%) 99,9 (99,8) Redundância 3,79 (3,85) Refinamento Resolução (À) 48,3 — 2,64 Nº. reflexões 29606 Rwork | Rireo 17,10/23,00 Nº. átomos Proteína 6395 Água 250 Fatores-B Proteína 67,52 Água 57,46 Desvios R.m.s. Comp. das ligações (À) 0,010 ângulo das ligações(º) 1,20 * Os valores entre parênteses são para shell de alta resolução.

[564] Estrutura do Fab 11DO6 em complexo com HLA-A02/RMF PMHC.

[565] Determinamos a estrutura cristalina do complexo de Fab 11DO06 com HLA-AO2/RMF pMHC a uma resolução de 2,64 À (Figura 14B). À estrutura mostra que o Fab 11D06 se liga ao pMHC por contribuições de todas as CDRs. As cadeias laterais do peptídeo RMF (SEQ ID NO: 78) de resíduos Arg1, Met2, Pro4, Asn5, Ala6 e Tyrê estão em contato direto com a cadeia leve e pesada do Fab. As cadeias laterais restantes do peptídeo apontam para a molécula HLA-AO2. A contribuição do peptídeo para a área de superfície de contato é de — 107 À?. A área total de contato Fab-pMHC corresponde a — 397 Á?. Uma aproximação da interface Fab 11DO06-pMHC é mostrada na Figura 17. A análise da interface de ligação com o programa PISA revela um padrão de interação do Fab 11D06 com HLA-AO2 através de 4 ligações de hidrogênio, numerosas interações Pi-Pi e contactos van der Waals. São observadas ligações de hidrogênio entre resíduos de cadeias pesadas CDR1 (Ser30, Ser31) e CDR3 (GIy100A) com Glu58 e Arg65 do HLA-AO2. Outras ligações de hidrogênio são estabelecidas por resíduos da cadeia leve Asp50 com HLA-AO02 Arg65. Além de outros, o Trp100 da cadeia pesada fornece contatos van der Waals e Pi-Pi aos resíduos Arg65 e Lys66 do HLA-AO2 e ao resíduo Pro4 do peptídeo RMF. A arginina N-terminal do peptídeo RMF aponta com a sua cadeia lateral para uma bolsa polar formada por Ser31, Glu97 e a estrutura principal carbonila de Ile96 da cadeia pesada de 11D06. Os contactos polares adicionais ao 11D06 e ao HLA-AO2 são entretidos pelo resíduo Asn5 do peptídeo RMF que faz parte de uma rede de ligação de hidrogênio ao Trp32 da cadeia leve CDR1, Glu92 da cadeia leve CDR3 juntamente com GIn155 do HLA-AO2. A Figura 18 mostra uma matriz esquemática de interação Fab 11D06-pMHC que resume os contatos.

[566] Estrutura 3D do ESK1 recuperada a partir de banco de dados público.

[567] Para comparação, a estrutura cristalina publicamente disponível da ligação do anticorpo (Fab) ESK1 ao pMHC HLA-A02/RMF (PDB ID 4WUU; http://www.resb.org/pdb/explore/explore.do?structureld=4WUU) foi analisada analogamente em relação aos seus contatos Fab-pMHC. A Figura 14C mostra a estrutura cristaliha Fab ESK1 com HLA-AO02/RMF pMHC do mesmo ângulo (alinhada na parte HLA-A02) que as estruturas cristalinas Fab 5CO01 com pLAH HLA-AO2/VLD pMHC e Fab 11D06 com HLA-AO2/RMF pMHC (Figuras 14 A e B). Uma aproximação da interface Fab ESK1I-pMHC é mostrada na Figura 19 e uma matriz de interação esquemática Fab ESK1- PMHC resumindo os contatos é mostrada na Figura 20.

[568] A comparação estrutural revela que 5C01 e particularmente 11DO06 cobrem e se ligam a uma fração maior do respectivo peptídeo WT1 em comparação com o ESK1, que forma contatos específicos exclusivamente com a Arg N-terminal do peptídeo RMF, enquanto o restante da interface de ligação é fornecido pelo HLA -A02. Com base nessas observações, pode-se concluir que as moléculas de ligação 5C01 e 11D06 devem ser menos propensas a tolerar peptídeos fora do alvo do que o ESK1, pois elas criam um obstáculo significativamente mais estérico para peptídeos com cadeias laterais não-VLD ou não-RMF nas posições expostas.

[569] Todas as representações gráficas das estruturas cristalinas foram criadas utilizando o BIOVIA Discovery Studio 4.5, Dassault Systêmes BIOVIA.

[570] Resíduos de epítopo e parátopo (raio de 5 À).

[571] Um resumo de epítopos e parátopos para os ligantes 5C01, 11DO6 e ESK1 é mostrado abaixo. Os resíduos de epítopo e parátopo (definição com base no raio de vizinhança de 5 À) são destacados em negrito e itálico. Os resíduos CDR estão destacados com fundo cinza.

HLA-A02 5C01

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPW

IEQEGPEYW 11D06

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTAQFVRFDSDAASQRMEPRAPW

IEQEGPEYW ESK1

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPW

IEQEGPEYW 1-60 5C01

DGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFL

RGYHQYAYDG 11DO06

DGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQORMYGCDVGSDWRFL

RGYHQYAYDG ESK1

DGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVORMYGCDVGSDWRFL

RGYHQYAYDG 61-120 5C01

KDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRY

LENGKETLQ 11DO06

KDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAE QLRAYLEGTCVEWLRRY

LENGKETLQ ESK1

KDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAE QLRAYLEGTCVEWLRRYL

ENGKETLO 121-180 5C01

RTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQOTQDTELVE

TRPAGDGT 11D06

RTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWOQRDGEDQTQDTELVE TRPAGDGT

ESK1

RTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVE

TRPAGDGT 181-240 5C01 FOKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE 11D06 FOKWAAVVVYPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE ESK1 FOKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE 241-275 Peptídeo 5C01 VLDFAPPGA 11D06 RMFPNAP YL ESK1 RMFPNAPYL 1-9 Cadeia Pesada Fab 5C01 EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA|

SGSGGSTYY 11D06

QVQALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGI

IPIFGTANY ESK1

QMQLVOASGAEVKEPGESLRISCKGSGYSFTNFWISWVRQMPGKGLEWMGR

VDPGYSYSTY 1-60 5C01 ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSWY

SYAFDYWGQGTLVTVS 11D06 AQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIELW

WGGFDYWGQGTTVTVS

ESK1

SPSFQGHVTISADKSTSTAYLQWNSLKASDTAMYYCARVQYSGYYDWFDPW

GQGTLVTVS 61-120 5C01

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLOS 11D06

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLOS ESK1

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLOS 121-180 5C01 SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 11D06 SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC ESK1 SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKRVEPKS 181-224 Cadeia Leve Fab 5C01 DIQMTQOSPSTLSASVGDRVTITCRAS Q SIS

SWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLES 11D06 DIQMTQASPSTLSASVGDRVTITCRAS Q SIS

SWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLES ESK1 QAVVTQP PSASGTPGQRVTISCSG SSSNIGSN

TVNWYQQVPGTAPKLLIYSNNQRPS 1-60 5C01 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSI

WFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPS

11D06 GVPSRFSGSGSGTEFTLTIGSLQPDDFATYYCQQYE

DYTTFGQGTKVEIKRTVAAPS ESK1

GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLOSEDEADYYCAAWDDSLNGWVFGGGTKLT

VLGQPKANP 61-120 5C01

VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALOSGNSQESVTEQ

DSKDSTYS 11D06

VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALOSGNSQESVTEQ

DSKDSTYS ESK1

TVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSK

QSNNKYA 121-180 5C01 LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC 11D06 LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ESK1 ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 181-220 Resíduos envolvidos nas interações químicas

[5672] Um resumo dos resíduos envolvidos em interações químicas para os ligantes 5C01, 11D06 e ESK1 é mostrado abaixo. Os resíduos envolvidos em interações químicas específicas (compare as figuras 16, 18 e 20) estão destacados em negrito e itálico. Os resíduos CDR estão destacados com fundo cinza. HLA-A02 5C01

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQAQFVRFDSDAASQRMEPRAPW

IEQEGPEYW 11DO06

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPW

IEQEGPEYW ESK1

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPW

IEQEGPEYW 1-60 5C01

DGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVORMYGCDVGSDWRFL

RGYHQYAYDG 11D06

DGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNOSEAGSHTVAORMYGCDVGSDWRFL

RGYHQYAYDG ESK1

DGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFL

RGYHQYAYDG 61-120 5C01

KDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAE QLRAYLEGTCVEWLRRYL

ENGKETLOQ 11DO06

KDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYL

ENGKETLOQ ESK1

KDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAE QLRAYLEGTCVEWLRRYL ENGKETLQ

121-180 5C01

RTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVE

TRPAGDGT 11D06

RTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVE

TRPAGDGT ESK1

RTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWOQRDGEDOQTQDTELVE

TRPAGDGT 181-240 5C01 FOKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE 11D06 FOKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE ESK1 FOKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE 241-275 Peptídeo 5C01 VLDFAPPGA 11D06 RMFPNAPYL ESK1 RMFPNAPYL 1-9 Cadeia Pesada Fab 5C01 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS YAMSWVRQAPGKGLEWVSAI|

SGSGGSTYY 11D06

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGI

IPIFGTANY ESK1

QMQLVOSGAEVKEPGESLRISCKGSGYSFTNFWISWVRQMPGKGLEWMGR

VDPGYSYSTY 1-60 5C01 ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSWYV

SYAFDYWGQGTLVTVS 11D06 AQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIELW

WGGFDYWGQGTTVTVS ESK1

SPSFQOGHVTISADKSTSTAYLQWNSLKASDTAMYYCARVQYSGYYDWFDPW

GQGTLVTVS 61-120 5C01

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLOS 11D06

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLOS ESK1

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLOS 121-180 5C01 SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 11D06 SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC ESK1 SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVWVNHKPSNTKVDKRVEPKS 181-224 Cadeia Leve Fab 5C01 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRAS Q SIS

SWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLES

11DO06 DIQMTOSPSTLSASVGDRVTITCRAS Q SIS

SWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLES ESK1 QAVVTQP PSASGTPGQRVTISCSG SSSNIGSN

TVNWYQQVPGTAPKLLIYSNNQRPS 1-60 5C01 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSI

WFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPS 11D06 GVPSRFSGSGSGTEFTLTIGSLQPDDFATYYCQQYE

DYTTFGQGTKVEIKRTVAAPS ESK1

GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLOSEDEADYYCAAWDDSLNGWVFGGGTKLT

VLGQPKANP 61-120 5C01

VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ

DSKDSTYS 11DO06

VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ

DSKDSTYS ESK1

TVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSK

QSNNKYA 121-180 5C01 LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC 11D06 LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC ESK1 ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 181-220 EXEMPLO 16

COMPARAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 x CD3 (“TCBs”) Com DIFERENTES LIGANTES DE CD3

[573] Comparamos a potência das atividades de morte do 11D06-TCB com diferentes ligantes de CD3, usando células SKM-1 em um ensaio conforme descrito acima (Exemplo 7). CH2527 é o ligante CD3 dos TCBs usados em experimentos anteriores (vide as SEQ ID NOs 121 e 122 para as sequências VH e VL). V9 é um ligante CD3 descrito em Rodrigues et al., Int J Cancer Supp!l (1992) 7, 45-50 e WO 1992/22653 (consulte as SEQ ID NOs 136 e 137 para as sequências VH e VL) e 40G5C é descrito na WO 2015/095392 (consulte as SEQ ID NOs 184 e 185 (“ hu40G5c “) de WO 2015/095392 para as sequências VH e VL).

[574] A afinidade dos ligantes CD3 CH2527, 40G5C e V9 é mostrada na Tabela 8.

[575] Conforme mostrado na Figura 21, observamos que 11D06- TCB (CH2527) mostrou a mesma potência de morte mediada por células T sobre as linhagens de células SKM-1 (HLA-A2*WT1*) que o 11D06-TCB (V9), enquanto o 11D06-TCB (40G5C) mostrou potência de morte fortemente reduzida.

TABELA 8 AFINIDADES DOS LIGANTES DE CD3 COMPARADAS NESTE EXPERIMENTO. CD3 clone Reatividade Afinidade (Kd) Cruzada [NM] cH2527 Hu-Cyno 85-130 40G5C Hu-Cyno 390-460 vo apenas Hu 35-50

EXEMPLO 17 CITOTOXICIDADE DE CÉLULAS T MEDIADA POR ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA- A2/WT1 x CD3 (“TCBs”) APÓS LIGAÇÃO A CÉLULAS T2 PULSADAS COM

PEPTÍDEO RMF

[576] A atividade de morte do 11D06-TCB (V9) (consulte as SEQ ID NOs 123, 125, 139, 140 para sequências completas) foi comparada aos TCBs análogos com diferentes ligantes HLA/WT1 (“Aali” e “Daniel”, consulte na WO 2017/060201 as SEQ ID NOs 5 (VH) e 6 (VL) e SEQ ID NOs 35 (VH) e 36 (VL), respectivamente). O ESK1I-TCB e o DP47-TCB não direcionado também foram incluídos como controles. O experimento foi realizado como descrito no Exemplo 6. As células pulsadas com peptídeo RMF (100 uL, 2x105º células/mL) foram cocultivadas com 50 uL de células T (2x108 células/mL), e com diluições seriadas de TCB (50 uL) durante 24 horas a 37ºC com 5% de CO».

[577] A Figura 22 mostra a morte de células alvo que expressam RMF por células T específicas mediada por TCB. Descobrimos que o 11D06- TCB e ESK1I-TCB medeiam uma potente destruição (morte) de células T2 pulsadas com peptídeo RMF, enquanto os TCBs baseados nos ligantes HLA/WT1 “Aalir e “Daniel” (AalicTCB e Daniel-TCB) mostraram fraca capacidade de matar células pulsadas com RMF e apenas em altas concentrações.

EXEMPLO 18

AUSÊNCIA DE LIGAÇÃO AOS PEPTÍDEOS FORA DO ALVO POR ANTICORPOS BiIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 X CD3 (TcBs) SELECIONADOS

[578] Também comparamos a reatividade cruzada do 11D06- TCB (V9), Aali-TCB, Daniel-TCB e ESK1I-TCB com peptídeos fora do alvo descritos nos Exemplos 9 e 10.

[579] Para este experimento, foram utilizadas células repórter Jurkat-NFAT que expressam um receptor de antígeno quimérico anti-PGLALA

(CAR) (ensaio CAR J, consulte o pedido PCT reivindicando prioridade no pedido de patente europeu EP17209201.7, integralmente incorporado ao presente por referência). O antic-PGLALA CAR reconhece as mutações P329G L234A L235A (“PGLALA”, numeração EU) na região Fc dos TCBs. As células T2 pulsadas com peptídeo como descrito acima foram usadas como células alvo. O princípio do ensaio é cocultivar as células efetoras geneticamente manipuladas Jurkat-NFAT com as células alvo. Somente após ligação simultânea dos TCBs ao CAR (via mutação PGLALA) e ao antígeno alvo, o promotor NFAT é ativado e leva ao aumento da expressão de luciferase nas células efetoras Jurkat. Após a adição de um substrato adequado, a luciferase de vagalume ativa leva à emissão de luminescência, que pode ser medida como um sinal de ativação mediada por CAR.

[580] Resumidamente, as células alvo foram coletadas e a viabilidade foi determinada. 20.000 células alvo/poço foram semeadas em uma placa de 96 poços de fundos redondos (Greiner bio-one, té 650180) em 100 ul de meio. As células T2 não pulsadas foram usadas como controle negativo. 50 ulL/poço de TCB diluído foram adicionados às células alvo. Posteriormente, as células repórteres Jurkat-NFAT foram coletadas e avaliadas quanto à viabilidade, em seguida, foram ressuspensas em meio de cultura de células e adicionadas às células tumorais a uma densidade de 100.000 células/poço (50 uL/poço) para obter uma relação efetor-alvo final (E:T) de 5:1 e um volume final de 200 uL por poço. As células foram incubadas durante 20 h a 37ºC em uma incubadora umidificada. Ao final da incubação, as placas foram adaptadas para a temperatura ambiente (cerca de 15 min). 125 ul de meio/poço foram removidos a partir da parte superior do poço e 25 ul/poço de One-Glo de Luciferase (Promega % E6120) foram adicionados, e misturados. Transferiu-se então 100 ul/poço da mistura para a placa de 96 poços de fundos planos (Greiner bio-one, % 655098) e a placa foi incubada por 15 min no escuro antes da luminescência ser detectada usando um instrumento Perkin Elmer.

[581] Conforme mostrado na Figura 23, Aali-TCB (A), Daniel- TCB (B) e ESK1I-TCB (C) resultaram em uma ativação mais fraca da linhagem de células repórter Jurkat NFAT (correspondendo a morte mais fraca mostrada na Figura 22) e, além disso, um janela menor entre o reconhecimento do peptídeo RMF e outros peptídeos fora do alvo em comparação com o 11D06- TCB (V9) (D).

EXEMPLO 19 PERFIL FARMACOCINÉTICO DO ANTICORPO BIESPECÍFICO HLA-A2/WT1 x CD3 (11D06-TCB (V9)) APÓs INJEÇÃO ÚNICA EM CAMUNDONGOS NSG.

[582] Uma dose única de 1 mg/kg de 11D06 -TCB (V9) foi injetada em camundongos NSG humanizados e portadores de tumor. Os camundongos receberam injeções i.v. com 200 ul de TCB, diluído com tampão histidina. Três camundongos por ponto de tempo foram sangrados aos 10 min, 6 h, 24 h, 72 hs e 7 dias. O composto injetado foi analisado em amostras de soro por ELISA como descrito no Exemplo 13.

[583] O resultado (Figura 24) mostrou um comportamento PK estável para ambos os TCBs testados, o que sugeriu um esquema de administração semanal para os estudos de eficácia subsequentes.

EXEMPLO 20 EsTUDO DE EFICÁCIA COM O ANTICORPO BIESPECÍFICO HLA-A2/WT1 x CD3 (11D06-TCB (V9)) EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS COM XENOENXERTOS DE SKM-1.

[584] Este estudo de eficácia teve como objetivo avaliar a eficácia do 11D06-TCB (V9) em um xenoenxerto de AML humana (células SKM-1) em camundongos NSG totalmente humanizados. O experimento foi realizado como descrito no Exemplo 14.

[585] A Figura 25 mostra a cinética de crescimento tumoral

(média, Figura 25A), assim como a cinética do crescimento tumoral individual em cada grupo (Figura 25 B e C). Como mostrado, o TCB exibe inibição do crescimento tumoral com uma TGI de 78 no dia 48 do estudo (Figura 25D). EXEMPLO 21 COMPARAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS HLA-A2/WT1 x CD3 (“TCBs”) Com DIFERENTES FORMATOS MOLECULARES

[586] Nós comparamos a atividade do 11D06-TCB (V9) com uma molécula análoga em um formato “1+1 CrossMab” (tal como ilustrado na Figura 1A). A atividade foi monitorada utilizando um ensaio funcional com base em células, que detecta a ativação mediada por TCB de uma linhagem de células repórter (Jurkat NFAT) na presença de células alvo de uma forma dose- dependente. O ensaio foi realizado essencialmente como descrito no Exemplo acima, utilizando como células alvo as células CHO-K1 que expressam um complexo HLA-A02/WT1RmF pMHC. A ativação das células repórteres ocorre após a ligação simultânea do TCB ao complexo HLA-AO02/WT1RmF pMHC sobre as células-alvo e à unidade CD3 e do receptor de células T (TCR) sobre as células repórteres, o que leva ao hiperagrupamento de CD3 e, desse modo, a ativação de TCR. O inicio subsequente das vias de sinalização intracelular correspondentes resulta na ativação do fator de transcrição NFAT que induz a expressão de um gene repórter da luciferase controlado por NFAT. A atividade repórter da luciferase é mensurada após a adição de substrato pela leitura da luminescência.

[587] O resultado deste experimento é apresentado na Figura 26. As unidades de luz relativa (RLU) que refletem a ativação das células repórteres alvo-dependente são representadas graficamente contra a concentração de anticorpos. Como pode ser observado na Figura 26, a molécula no formato “1+1” mostrou uma atividade menor que no formato “2+1” neste ensaio.

QVQLVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPG 11D0O8VH — [AGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLR| — 7

SEDTAVYYCARSIELWWGGFDYWGQGTTVTVSS

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKA 11D06 VL PKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTIGSLQPDDFATYYC

QVQLVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPG 33H09 VH — [AGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFOGRVTITADKSTSTAYMELSSLR| — 15

SEDTAVYYCARGSYDLFSLDYWGQGTTVTVSS

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKA 33H09 VL PKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC 16

EVOLLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKG 13B04 VH — |LEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD 23

TAVYYCARVSYNGLDYWGQGTLVTVSS

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKA 13B04 VL PKLLIVDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC 24

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPG 11B09VH — [AGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLR| 31

SEDTAVYYCARVPGRWYGAMDYWGQGTTVTVSS 11B09 VL DIQMTOSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKA

[Lena ssawno|

PKLLIVYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC

QQEDDYPLTFGQGTKVEIK 33FO05 HCDR1 |sYYws 33FO5 HCDR2 |[YIYYSGSTNYNPSLKS 33FO5 HCDR3 |SYYEAFDY 33FO05 LCDR1 |AQGDSLRSYYAS 33FO5 LCDR2 33FO5 LCDR3 [NSPDMNGNAV

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGK 33FO05 VH GLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAA 39

DTAVYYCARSYYEAFDYWGQGTLVTVSS

SSELTQDPAVSVALGQTVRITCAGDSLRSYYASWYQQKPGQAP 33FO5 VL VLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYC 40

QVQLVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPG 5E11 VH QGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFOGRVTITADKSTSTAYMELSSLR| — 47

SEDTAVYYCARSSYDLYSFDYWGQGTTVTVSS

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKA 5E11 VL PKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC 48

EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG 13E08 VH KGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL| — 55

RAEDTAVYYCAKTYPYTGSFDYWGQGTLVTVSS

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKA 13E08 VL PKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC 56

EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG 5C01 VH KGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL| — 63

RAEDTAVYYCAKGSWVSYAFDYWGQGTLVTVSS

LL Seguêneia O [seaiNo|

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKA 5C01 VL PKLLIVYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC 64

QVQLVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPG 11G08VH — [AGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLR| = 71

SEDTAVYYCARTGPYYGAFDYWGQGTTVTVSS

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKA 11G06 VL PKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC 72

QQGFRGYTFGAGTKVEIK

QMQLVASGAEVKEPGESLRISCKGSGYSFTNFWISWVRQMPG ESK1 VH KGLEWMGRVDPGYSYSTYSPSFQGHVTISADKSTSTAYLQWNS| — 73

LKASDTAMYYCARVQYSGYYDWFDPWGQGTLVTVSS

QAWTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQVPGT ESK1 VL APKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQOSEDEADY 74

YCAAWDDSLNGWVFGGGTKLTVL VH não EVOLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG direcionado — |KGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL| — 75 (sem alvo) — |RAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSS VL não EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPEQ direcionado — |APRLLIVGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY 76 (sem alvo) CQAQYGSSPLTFGQAGTKVEIK peptídeo VLD VLDFAPPGA peptídeo RMF [RMFPNAPYL MED13L RMFPTPPSL PIGQ RMFPGEVAL | so | ARHGEF11 — |RLFPNLPEL PRDM16 RMFPNKYSL SERPINAS — [AMDPNAAYV NIPSNAP1 RMGPNIYEL TAF3 NMPPNFPYI ja vnPNHPYL [86 [rPsT1 |RLFPNAKFL IGFBP5 RMVPRAVYL RALGPS1 KMVPSIPYL —- 8 | ZNF382 RIFPSYSYL | so | TPST2 RLFPNSKFL RALGPS2 — |KMTPCIPYL

RECQL RQFPNASLI SERPINA2 — [VIFPNCPFL FAM220A RLRINFPYL

MGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAP PGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHE EQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARM FPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQF

PNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYYGCHTPTDSCTGSQ WT1 humano — |ALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSS| — 106

SVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQD VRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQM HSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQ CKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFAR SDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITATPYKVSISG

TTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEF CD3 humano — |(SELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMS 107

VATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVYTRGAGAGGRQORG QNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI

MQSGTRWRVLGLCLLSIGVWGQDGNEEMGSITATPYQVSISGT CD3 de TVILTESQHLGSEAQWQHNGKNKEDSGDRLFLPEFSEMEQSGY cincmelgo — YVCYPRGSNPEDASHHLYLKARVCENCMEMDVMAVATIVIVDIC| — 108 9 ITLGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPP

VPNPDYEPIRKGQQDLYSGLNQRRI DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV

DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT região Fe de — VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL | | 19% hige1 PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT

PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSP ligante GEGESECEEGES ligante DEGEGSEGEGS Domínio cu — |RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVD KenDa humano INALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC 112 a EVTHOGLSSPVTKSFNRGEC Domínio CL — [QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKAD lambda SSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQ| — 113 humano VTHEGSTVEKTVAPTECS

IASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS Região GALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH constante de — |<PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK cadeia pesada |DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP 114 de 19G1 REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT humana (CH1- |[ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE cH2-CH3) — |WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV

FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP o sequência O JseaiDNno| CD3 HCDR1 [TYAMN CD3 LCDR3 — jJALWYSNLWV

EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPG cD3 vá KGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMN| — 121

SLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPG CcD3 vL QAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEA 122

EYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPG QGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLR

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YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTOKSLSLSP QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPG QGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLR SEDTAVYYCARSIELWWGGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDE WT1 11Dos — KVEPKSCDGGGGSGEGESAAVVTAEPSLTVSPGGTVTLTCGS VH-CH1(EB)- |STGAVTTSNYANWVQEKPGOAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGS cD3 vL.cH1. |LLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLS 124 Fe(knob SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN PGLALA) SGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN

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CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPG

QGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLR Wwr1 33H09 — ISEDTAVYYCARGSYDLFSLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPL VH-CH1(EB)- APSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP Fe(hole AVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKV 126 PGLALA) EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV

TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR WVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPE

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NNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSP QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPG QGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLR SEDTAVYYCARGSYDLFSLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

AVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKV Wr1 33H09 — [EPKSCDGGGGSGEGESAAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSST VicHaceB). GAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLL Ce |GGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSA| * ,,, Felinos STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG Plata) — JALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK

PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP

DIQMTASPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKA Wr1 33H09 — |PKLLIVDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC Veio — RQYYDGITFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVC| — 128

LLNNFYPREAKVQWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPG

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EVOLVESGGGLVAPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPG cD3 vH(V9) KGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSL | — 136

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FPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDE WT1 11D06 KVEPKSCDGGGGSGGGGSDIQMTASPSSLSASVGDRVTITCRA VH-CH1(EE) SQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGT cp3 (Vo) vL DYTLTISSLAPEDFATYYCAQGNTLPWTFGQGTKVEIKSSASTK 139 CH1-Fe(knob, GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT PGLALA) * |SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN

TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTOQKSLSLSP EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPG

KGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSL CD3 (V9) VH-- |RAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASVAAP 140 CcL SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOQWKVDNALOS

GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC

[588] Embora a invenção divulgada acima tenha sido descrita em detalhes por meio de ilustrações e exemplos com o intuito de elucidar seu entendimento, as descrições e os exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção. As divulgações de todas as patentes e literaturas científicas citadas são expressamente e integralmente incorporadas ao presente pela referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES 1 ANTICORPO que se liga ao HLA-A2/WT1, caracterizado por se ligar a um epítopo do complexo HLA-A2/WT1, particularmente o HLA- A2/WT1iRmF, compreendendo pelo menos três resíduos de aminoácidos do peptídeo WT1 em HLA-A2/WT1, particularmente o peptídeo WT1RwrF.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo pelos referidos pelo menos três resíduos de aminoácidos serem selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos correspondentes aos resíduos de aminoácidos R1, M2, P4, N5, A6 e Y8 do peptídeo WT1RwvF.
3. ANTICORPO que se liga ao HLA-A2/WT1, caracterizado por compreender; (i)) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 6; (ii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14; (iii), uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 17, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 18, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 19, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 20, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 21 e uma LCDR 3 de

SEQ ID NO: 22;

(iv) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 25, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 26, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 27, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 28, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 29 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 30;

(v) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 33, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 34, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 35, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 36, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 37 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 38;

(vi) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 41, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 42, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 43, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 44, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 45 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 46;

(vil) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 49, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 50, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 51, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 52, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 53 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 54;

(viii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 57, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 58, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 59, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 60, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 61 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 62; ou

(ix) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 65, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 66, e uma HCDR 3 de SEQ ID

NO: 67, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 68, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 69 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 70.
4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender: ())! uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (ili)) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (iv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;

(v) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40;

(vi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48;

(vii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56;

(viii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (ix) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.
5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo anticorpo ser uma |1gG, particularmente uma IgG+1.
6. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo completo (de comprimento total).
7. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo anticorpo ser um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em uma molécula Fv, uma molécula scFv, uma molécula Fab e uma molécula F(ab')2.
8. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo multiespecífico.
9. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, caracterizada por compreender; (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA- A2WT1 e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende;

() uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 6;

(ii), uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 9, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 10, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 11, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 12, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 13 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 14;

(iii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 17, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 18, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 19, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 20, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 21 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 22;

(iv) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 25, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 26, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 27, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 28, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 29 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 30;

(v) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 33,

uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 34, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 35, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 36, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 37 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 38; (vi) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 41, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 42, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 43, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 44, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 45 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 46; (vii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 49, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 50, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 51, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 52, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 53 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 54; (vili) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 57, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 58, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 59, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 60, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 61 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 62; ou (ix) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 65, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 66, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 67, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 68, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 69 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 70, e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um segundo antígeno.
10. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pela primeira porção de ligação ao antígeno compreender;

())) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;

(ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;

(ii), uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;

(iv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 32;

(v) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40;

(vi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48;

(vii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56;

(vili) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 64; ou (ix) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.
11. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo segundo antígeno ser CD3, particularmente CD3e£.
12. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela segunda porção de ligação ao antígeno compreender; ()º uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 115, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 116, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 117, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 118, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 119 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 120; ou (ii) uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 130, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 131, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 132, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 133, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 134 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 135.
13. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pela segunda porção de ligação ao antígeno compreender; ())) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou (ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137.
14. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 13, caracterizada pela primeira e/ou segunda porção de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab.
15. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 14, caracterizada pela segunda porção de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CHI1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab estão substituídos entre si.
16. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 14, caracterizada pela primeira porção de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab, na qual no domínio constante o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
17. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 16, caracterizada pela primeira e segunda porção de ligação ao antígeno estarem fundidas entre si, opcionalmente por um peptídeo ligante.
18. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 17, caracterizada pela primeira e segunda porção de ligação ao antígeno serem moléculas Fab; em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno.
19. - MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 18, caracterizada por compreender uma terceira porção de ligação ao antígeno.
20. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pela terceira porção de antígeno ser idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno.
21. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 20, caracterizada por compreender um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade.
22. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pela primeira, segunda e, quando presente, terceira porção de ligação ao antígeno serem, cada uma, moléculas Fab; e em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc; e em que, a terceira porção de ligação ao antígeno (quando presente) está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc.
23. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo domínio Fc ser de uma IgG, particularmente um domínio Fc de IgG+1.
24. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 23, caracterizada pelo domínio de Fc ser um domínio Fc humano.
25. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 24, caracterizada por um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc ser substituído por um resíduo de aminoácido que tem um volume de cadeia lateral maior, gerando, assim, uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável dentro de uma cavidade no interior do domínio CH3 da segunda subunidade; e um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc ser substituído por um resíduo aminoácido que tem um menor volume de cadeia lateral, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, dentro da qual a protuberância do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.
26. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 25, caracterizada pelo domínio Fc compreender uma ou mais substituição de aminoácidos que reduz a ligação a um receptor de Fc e/ou uma função efetora.
27. UM OU MAIS POLINUCLEOTÍDEOS ISOLADOS, caracterizados por codificarem o anticorpo ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer uma das reivindicações de 1 a 26.
28. UM OU MAIS VETORES, particularmente vetores de expressão, caracterizados por compreenderem o(s) polinucleotídeo(s) da reivindicação 27.
29. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender o(s) polinucleotídeo(s) de acordo com a reivindicação 27 ou o(s) vetor(es) de acordo com a reivindicação 28.
30. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO que se liga ao HLA-A2/WT1, caracterizado por compreender as etapas de a) cultivo da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 29 em condições adequadas para a expressão do anticorpo; e b) recuperação do anticorpo.
31. — ANTICORPO que se liga ao HLA-A2/WT1, caracterizado por ser produzido pelo método da reivindicação 30.
32. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 26 ou 31 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
33. ANTICORPO ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26 ou 31, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo uso como um medicamento.
34. ANTICORPO ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26 ou 31, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo uso no tratamento de uma doença.
35. —ANTICORPO ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 26 ou 31 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela doença ser câncer.
36. USO DO ANTICORPO ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 26 ou 31 caracterizado pela fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença.
37. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA DOENÇA em um indivíduo, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 26 ou 31 ao referido indivíduo, em uma forma farmaceuticamente aceitável.
38. — USO, de acordo com a reivindicação 36 ou o MÉTODO de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pela referida doença ser câncer.
39. — A INVENÇÃO caracterizada por, conforme descrita acima.