TW202122411A

TW202122411A - 以黏液瘤(myxoma)病毒治療癌症之新穎溶瘤病毒平臺

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Publication number: TW202122411A
Application number: TW109130086A
Authority: TW
Inventors: 道格拉斯葛蘭麥可法登; 默漢瑪斯目德萊門; 南西維拉; 多明戈斯里諾托瑞斯; 李娜法藍蔻雅秋禮; 萊斯里林恩夏普
Original assignee: 美國亞利桑那州立大學亞利桑那州評議委員會; 美商昂科美醫藥公司
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2021-06-16
Also published as: EP4025228A1; US11117934B2; MX2022002547A; WO2021046125A1; KR20220112241A; AU2020342510A1; EP4025228A4; CN114615988A; JP2022546539A; CA3152779A1; US20210061864A1; US20210324014A1; US20230025706A1; IL291009A

Abstract

本文在某些實施例中揭示重組黏液瘤病毒(myxoma virus；MYXV)及編碼重組MYXV之核酸構築體。在一些實施例中，MYXV係經基因改造以鈍化或減弱M153蛋白之活性或表現程度。在一些實施例中，該MYXV係經基因改造以表現一或多種轉基因，諸如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor；TNF)、介白素-12 (interleukin-12；IL-12)或核心蛋白聚糖(decorin)。本文在某些實施例中亦揭示使用MYXV之方法。一些實施例包括對有需要個體提供如本文所述的MYXV。

Description

以黏液瘤(MYXOMA)病毒治療癌症之新穎溶瘤病毒平臺

本文揭示重組黏液瘤(myxoma)病毒(MYXV)、編碼重組MYXV之核酸構築體及其使用方法。

用於治療各種類型之癌症之當前治療法傾向於藉由毒化或殺死癌細胞來起作用，但對癌細胞具有毒性之治療通常傾向於對健康細胞亦具有毒性。此外，腫瘤之異質性係有效治療癌症仍然難以捉摸的主要原因之一。當前主流療法(諸如化學療法及放射療法)傾向於在狹窄毒性治療窗口內使用。此等類型之療法由於腫瘤細胞之類型不同及可投與此等療法之窗口有限而具有有限適用性。

本文在一些態樣中揭示具有增強之抗癌活性之黏液瘤病毒(MYXV)，其中該黏液瘤病毒係經基因改造以減弱其M153蛋白之活性或表現程度。

在某些實施例中，M153蛋白之活性或表現程度係經減弱至少80%。替代地及/或另外地，MYXV係經基因改造以在編碼M153蛋白之核酸中引入突變，其中該突變包含插入、缺失或取代突變。在一些實施例中，該突變相對於野生型M153蛋白增強細胞免疫反應活性。在某些實施例中，敲除MYXV基因組中編碼M153蛋白之核酸之至少一部分。在一些實施例中，MYXV包含靶向M153轉錄本由此減弱M153蛋白表現之抑制分子。在一些實施例中，抑制分子為抑制RNA。在一些實施例中，抑制RNA包含dsRNA、siRNA、反義RNA或miRNA。在一些實施例中，MYXV進一步包含編碼非病毒分子之核酸。在一些實施例中，非病毒分子為腫瘤壞死因子α (TNFα)。在一些實施例中，TNFα為人類TNFα。在一些實施例中，TNFα為可溶性肽。在一些實施例中，TNFα為膜結合肽或表面結合肽。在一些實施例中，TNFα藉由活化抗腫瘤免疫細胞或誘導癌細胞死亡來進一步增強MYXV之抗癌活性。在一些實施例中，非病毒分子為介白素-12 (IL-12)。在一些實施例中，IL-12為人類IL 12。在一些實施例中，IL-12為可溶性肽。在一些實施例中，IL-12為膜結合肽或表面結合肽。在一些實施例中，IL-12藉由促進免疫細胞分化或誘發免疫細胞細胞毒性進一步增強MYXV之抗癌活性。在一些實施例中，IL-12包含IL-12α次單元及IL-12β次單元。在一些實施例中，IL-12α次單元及IL-12β次單元係經多肽連接子接合。在一些實施例中，多肽連接子為彈性蛋白連接子。在一些實施例中，非病毒分子為核心蛋白聚糖(decorin)。在一些實施例中，核心蛋白聚糖為人類核心蛋白聚糖。在一些實施例中，核心蛋白聚糖為可溶性肽。在一些實施例中，核心蛋白聚糖為膜結合肽或表面結合肽。在一些實施例中，核心蛋白聚糖藉由阻斷或減少TGF-β信號傳導進一步增強MYXV之抗癌活性。在一些實施例中，核酸編碼至少兩個選自由TNFα、IL-12及核心蛋白聚糖組成之群之分子。在一些實施例中，核酸編碼TNFα、IL-12及核心蛋白聚糖。在一些實施例中，MYXV係衍生自洛桑(Lausanne)品系。

本文在一些態樣中揭示一種組合物，其包含以上實施例中任一實施例之MYXV及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。

在一些實施例中，組合物係經調配以用於全身性投與。在一些實施例中，組合物係經調配以用於局部投與。在一些實施例中，組合物係經調配以用於非經腸投與。

本文在一些態樣中揭示一種組合物，其包含經以上實施例中任一實施例之MYXV離體處理之複數個細胞，其中該複數個細胞包含周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓(BM)細胞或其組合。

本文在一些態樣中揭示一種抑制、減輕或預防有需要個體之癌症之方法，該方法包括對該個體投與以上實施例中任一實施例之MYXV或組合物。

在一些實施例中，個體患有癌症，懷疑患有癌症，或處在罹患癌症風險中，且其中該方法進一步包含選擇該個體。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，投與係全身性投與。在一些實施例中，投與降低癌細胞存活率，或活化癌症中之免疫原性細胞死亡。在一些實施例中，投與改良個體的存活率。在一些實施例中，癌症包含實體腫瘤。在一些實施例中，癌症為骨肉瘤、三陰性乳癌或黑色素瘤。在一些實施例中，癌症已轉移至個體中某一位置。在一些實施例中，位置包含個體之肺、腦、肝臟及/或淋巴結。在一些實施例中，方法進一步包括對個體投與一種另外治療劑。在一些實施例中，該另外治療劑為免疫檢查點調節劑。在一些實施例中，該另外治療劑係在投與組合物之前投與個體。在一些實施例中，該另外治療劑係在投與組合物之後投與個體。在一些實施例中，該另外治療劑係以與組合物組合投與個體。在一些實施例中，將包含複數個細胞之組合物投與個體，其中該複數個細胞包含對於個體自體之細胞。在一些實施例中，將包含複數個細胞之組合物投與個體，其中該複數個細胞包含對於個體異體之細胞。

本文在一些態樣中揭示包含MYXV基因組之至少一部分之重組核酸，其中該MYXV基因組係經修飾以減少M153基因之表現。在一些實施例中，重組核酸包含DNA。在一些實施例中，MYXV基因組之該部分係經修飾以敲除MYXV基因組之該部分中的M153基因之至少一部分。在一些實施例中，重組MYXV基因組包含編碼TNFα之第一核酸。在一些實施例中，TNFα為人類TNFα。在一些實施例中，第一核酸替代或鄰近MYXV基因組之M135R基因。在一些實施例中，第一核酸係插入於MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間。在一些實施例中，第一種核酸之表現係藉由痘病毒合成早期/晚期(sE/L)啟動子驅動。在一些實施例中，重組MYXV基因組包含編碼介白素12次單元α (IL-12α)之第二核酸。在一些實施例中，IL-12α為人類IL-12α。在一些實施例中，IL-12α之表現係藉由內部核糖體進入位點(IRES)驅動。在一些實施例中，第二核酸IL-12α破壞MYXV基因組之M153基因之表現。在一些實施例中，重組MYXV基因組包含編碼介白素-12次單元β (IL-12β)之第三核酸。在一些實施例中，IL-12β為人類IL-12β。在一些實施例中，第三核酸之表現係藉由sE/L啟動子驅動。在一些實施例中，第三核酸破壞MYXV基因組之M153基因之表現。在一些實施例中，重組MYXV基因組包含編碼核心蛋白聚糖之第四核酸。在一些實施例中，核心蛋白聚糖為人類核心蛋白聚糖。在一些實施例中，第四核酸之表現係藉由sE/L啟動子驅動。在一些實施例中，第四核酸破壞MYXV基因組之M153基因之表現。在一些實施例中，重組MYXV基因組進一步包含編碼報導子標籤之第五核酸。在一些實施例中，報導子標籤包含綠色螢光蛋白(GFP)。在一些實施例中，第五核酸之表現係藉由sE/L啟動子驅動。在一些實施例中，重組核酸進一步包含編碼第二報導子標籤之第六核酸。在一些實施例中，第二報導子標籤包含紅色螢光蛋白(RFP)。在一些實施例中，第六核酸之表現係藉由痘病毒P11晚期啟動子驅動。在一些實施例中，重組核酸包含視需要包含GFP之vMyx-hTNFa盒。在一些實施例中，重組核酸包含視需要包含dsRed之人類核心蛋白聚糖(hDecorin)-hIL-12盒。在一些實施例中，重組核酸包含視需要包含dsRed及/或GFP之vMyx-hTNFa-人類核心蛋白聚糖-hIL-12-M153KO (vMyx-Triple)盒或由其組成。

本文在一些態樣中揭示包含以上實施例中任一實施例之重組核酸之重組MYXV。

本文在一些態樣中揭示一種抑制、減輕或預防有需要個體之癌症之方法，該方法包括對個體投與前述實施例中任一實施例之重組核酸或重組MYXV。

在一些實施例中，個體患有癌症，懷疑患有癌症，或處在罹患癌症風險中，且其中該方法進一步包含選擇該個體。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，投與係全身性投與。在一些實施例中，投與降低細胞存活率，或活化癌症中之免疫原性細胞死亡。在一些實施例中，投與係以可有效增加個體之PBMCs中之至少兩種細胞介素之表現之劑量及時間表進行。在一些實施例中，投與係以可有效增加個體癌細胞中之至少兩種細胞介素之表現之劑量及時間表進行。在一些實施例中，至少兩種細胞介素包含IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12或TNF-α。在一些實施例中，投與係以可有效減少癌症體積至少10%之劑量及時間表進行。在一些實施例中，其中投與係以可有效減少癌症生長至少10%之劑量及時間表進行。

本文在一些態樣中揭示具有增強之抗癌活性之黏液瘤病毒(MYXV)，其中該MYXV係經基因改造以減弱其M153蛋白之活性或表現程度。

在一些實施例中，M153蛋白之活性或表現程度係經減弱至少80%。在一些實施例中，MYXV係經基因改造以在編碼M153蛋白之核酸中引入突變，其中該突變包含插入、缺失或取代突變。在一些實施例中，敲除MYXV基因組中編碼M153蛋白之核酸之至少一部分。在一些實施例中，MYXV包含靶向M153轉錄本由此減弱M153蛋白表現之抑制分子，其中該抑制分子包含dsRNA、siRNA、反義RNA或miRNA。在一些實施例中，MYXV係經進一步基因改造以表現非病毒分子。在一些實施例中，非病毒分子為細胞介素或細胞基質蛋白。在一些實施例中，非病毒分子為腫瘤壞死因子α (TNFα)、介白素-12次單元α (Il-12α)、介白素-12次單元β (IL-12β)或核心蛋白聚糖。在一些實施例中，非病毒分子為人類蛋白質。在一些實施例中，MYXV表現至少兩種選自由TNFα、IL 12α、IL-12β及核心蛋白聚糖組成之群之非病毒分子。

本文在一些態樣中揭示一種組合物，其包含經MYXV離體處理之複數個細胞，其中該MYXV係經基因改造以減弱其M153蛋白之活性或表現程度，且表現非病毒分子。

在一些實施例中，複數個細胞包含周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓(BM)細胞或其組合。

本文在一些態樣中揭示包含MYXV基因組之至少一部分之重組核酸，其中該MYXV基因組之該部分係經修飾以減少M153基因之表現。

在一些實施例中，MYXV基因組之該部分係經修飾以敲除MYXV基因組之該部分中的M153基因之至少一部分。在一些實施例中，重組核酸包含編碼非病毒分子之核酸。在一些實施例中，非病毒分子為人類TNFα、人類IL-12α (hTNFα)、人類IL-12β或人類核心蛋白聚糖。在一些實施例中，編碼非病毒分子之核酸包含vMyx-hTNFα盒，及該編碼非病毒分子之核酸替代或鄰近MYXV基因組之M135R基因。在一些實施例中，編碼非病毒分子之核酸包含vMyx-hTNFα盒，及該編碼非病毒分子之核酸係插入於MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間。在一些實施例中，編碼非病毒分子之核酸包含人類核心蛋白聚糖-hIL-12盒，及該編碼非病毒分子之核酸替代MYXV基因組之M153基因之至少一部分。在一些實施例中，編碼非病毒分子之核酸包含vMyx-hTNFα-人類核心蛋白聚糖-hIL-12-M153KO (vMyx-Triple)盒。

本文在一些態樣中揭示一種抑制、減輕或預防有需要個體之癌症之方法，該方法包括對個體投與MYXV或經MYXV處理之複數個細胞，其中該MYXV係經基因改造以減弱其M153蛋白之活性或表現程度。

在一些實施例中，MYXV係經進一步基因改造以表現非病毒分子。在一些實施例中，非病毒分子為腫瘤壞死因子α (TNFα)、介白素-12次單元α (Il-12α)、介白素-12次單元β (IL-12β)或核心蛋白聚糖。在一些實施例中，MYXV或複數個細胞係藉由全身性投與來投與。在一些實施例中，投與降低腫瘤細胞存活率，或活化癌症中之免疫原性細胞死亡。在一些實施例中，癌症為實體腫瘤、骨肉瘤、三陰性乳癌或黑色素瘤。在一些實施例中，癌症已轉移至個體之肺、腦、肝臟或淋巴結。在一些實施例中，方法進一步包括對個體投與免疫檢查點調節劑。在一些實施例中，投與係以可有效增加個體之PBMC或癌細胞中之至少兩種細胞介素之表現之劑量及時間表進行，其中該至少兩種細胞介素包含IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12或TNF-α。在一些實施例中，投與係以可有效減少癌症體積至少10%之劑量及時間表進行。

在一些實施例中，M153蛋白之活性或表現程度係經減弱至少80%。在一些實施例中，MYXV係經基因改造以在編碼M153蛋白之核酸中引入突變，其中該突變包含插入、缺失或取代突變。在一些實施例中，敲除MYXV基因組中編碼M153蛋白之核酸之至少一部分。在一些實施例中，MYXV包含靶向M153轉錄本由此減弱M153蛋白表現之抑制分子，其中該抑制分子包含dsRNA、siRNA、反義RNA或miRNA。在一些實施例中，MYXV進一步包含編碼非病毒分子之核酸。在一些實施例中，非病毒分子為腫瘤壞死因子α (TNFα)、介白素-12次單元α (Il-12α)、介白素-12次單元β (IL-12β)或核心蛋白聚糖。在一些實施例中，非病毒分子為人類蛋白質。在一些實施例中，核酸編碼至少兩種選自由TNFα、IL 12α、IL-12β及核心蛋白聚糖組成之群之非病毒分子。

本文在一些態樣中揭示一種組合物，其包含經MYXV離體處理之複數個細胞，其中該MYXV係經基因改造以減弱其M153蛋白之活性或表現程度，及其中該複數個細胞包含周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓(BM)細胞或其組合。

在一些實施例中，該組合物係用於抑制、減輕或預防有需要個體之癌症，其中該複數個細胞包含對於個體自體之細胞。在一些實施例中，組合物係用於抑制、減輕或預防有需要個體之癌症，其中該複數個細胞包含對於個體異體之細胞。

本文在一些態樣中揭示用於抑制、減輕或預防有需要個體之癌症之MYXV，其中該MYXV係經基因改造以減弱其M153蛋白之活性或表現程度。

在一些實施例中，MYXV係藉由全身性投與來投與個體。在一些實施例中，MYXV降低癌細胞存活率，或活化癌症中之免疫原性細胞死亡。在一些實施例中，癌症為實體腫瘤、骨肉瘤、三陰性乳癌或黑色素瘤。在一些實施例中，癌症已轉移至個體之肺、腦、肝臟或淋巴結。在一些實施例中，MYXV係與免疫檢查點調節劑一起投與個體。在一些實施例中，MYXV係以可有效增加個體之PBMC或癌細胞中之至少兩種細胞介素之表現之劑量及時間表投與，其中該至少兩種細胞介素包含IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12或TNF-α。在一些實施例中，MYXV係以可有效減少癌症體積至少10%之劑量及時間表投與。

本文在一些態樣中揭示包含MYXV基因組之至少一部分之重組核酸，其中該MYXV基因組之該部分係經修飾以減少M153之表現。

在一些實施例中，MYXV基因組之該部分係經修飾以敲除MYXV基因組之該部分中的M153基因之至少一部分。在一些實施例中，重組核酸包含編碼非病毒分子之核酸。在一些實施例中，非病毒分子為腫瘤壞死因子α (TNFα)、介白素-12次單元α (Il-12α)、介白素-12次單元β (IL-12β)或核心蛋白聚糖。在一些實施例中，非病毒分子為人類蛋白質。在一些實施例中，編碼非病毒分子之核酸係插入於MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間。在一些實施例中，編碼非病毒分子之核酸係經插入以替代MYXV基因組之M153基因之至少一部分。在一些實施例中，編碼非病毒分子之核酸包含視需要包含GFP之vMyx-hTNFα盒，及該編碼非病毒分子之核酸替代或鄰近MYXV基因組之M135R基因。在一些實施例中，編碼非病毒分子之核酸包含vMyx-hTNFα盒，及該編碼非病毒分子之核酸係插入於MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間。在一些實施例中，編碼非病毒分子之核酸包含視需要包含dsRed之人類核心蛋白聚糖-hIL-12盒，及該編碼非病毒分子之核酸替代MYXV基因組之M153基因之至少一部分。在一些實施例中，編碼非病毒分子之核酸包含視需要包含dsRed之vMyx-hTNFα-人類核心蛋白聚糖-hIL-12-M153KO (vMyx-Triple)盒。

交叉參考

本申請案主張2019年9月2日申請之美國臨時申請案第62/894,925號及2019年12月5日申請之美國臨時申請案第62/944,233號之權益，該等案之各者係以全文引用之方式併入本文中。關於聯邦資助科研之聲明

本發明係由政府支持在美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予的P50 CA186781下進行。政府對本發明具有某些權利。

本文描述溶瘤病毒，特別是溶瘤痘病毒諸如溶瘤黏液瘤病毒。黏液瘤病毒在本文中可稱為MYXV或vMyx。在一些實施例中，MYXV係經基因改造以減弱活性或表現程度，經基因改造以滅活、破壞或減弱M153基因或蛋白質之表現，例如經基因改造以減弱M153基因或蛋白質之活性或表現程度。與未經修飾之MYXV、含有完整野生型M153基因之MYXV或在另一基因座具有修飾之MYXV相比，如本文所述的黏液瘤病毒之修飾出人意料地改良MYXV之溶瘤活性。除了在M153基因座之修飾外，MYXV亦可包括一或多個編碼非病毒分子(諸如TNFα、IL-12及/或核心蛋白聚糖)之轉基因以進一步增強溶瘤活性，增加抗腫瘤免疫反應，或減少MYXV之不良副作用。

一些實施例係關於三重轉基因武裝之溶瘤病毒諸如MYXV，及其用於治療癌症(諸如轉移性癌症)之方法。一些實施例包括表現3種人類轉基因之重組MYXV構築體：改良轉移至肺或身體其他部分之癌症之治療療效之人類細胞介素(hTNF)、可放大抗腫瘤免疫反應之hIL-12、及阻斷腫瘤床內TGF-β信號傳導之人類核心蛋白聚糖(human Decorin/hDecorin)。在一些實施例中，本文所揭示的病毒敲除(例如缺失或破壞)黏液瘤病毒M153基因或其至少一部分，其在一些實施例中亦改良於此等病毒構築體療法後之抗腫瘤免疫反應。一些實施例係關於核酸構築體諸如編碼MYXV之病毒三重轉基因構築體。在一些實施例中，MYXV之轉基因及其他修飾改良癌症療法療效。定義

本文所使用的章節標題僅用於組織目的而不應解釋為限制所述的標的。

提供術語之以下解釋僅出於描述特定實施例及實例之目的且並無意受限制。

如本文所用，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一」、「一個」及「該」意欲亦包括複數形式。

如本文所用，術語「及/或」係指且涵蓋一或多個所列相關項目之任何及所有可能組合，以及當以替代性(「或」)解釋時缺乏組合。

如本文所用，「一或多個」或至少一個可意指一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個直至任何數目。

「有效量」或「治療有效量」係指足以產生所需效應之本發明化合物或組合物的量，該所需效應可為治療效應及/或有益效應。

「有需要個體」或「需要…之個體」係已知患有或懷疑患有疾病或病況(諸如癌症)之個體。

如本文所用，術語「抑制」或「治療」疾病係指抑制疾病或病狀之完全發展。「治療」係指在疾病或病理病狀開始發展後改善其徵象或症狀之治療性干預。關於疾病或病理病狀之術語「改善」係指治療之任何可觀測之有益效應。有益效應可例如藉由易感個體中疾病之臨床症狀延遲發作，疾病之一些或全部臨床症狀之嚴重度降低，疾病進展較慢(諸如轉移)，個體整體健康或福祉(well-being)之改良，或藉由此項技術中熟知的特定於特定疾病之其他參數獲得證實。「預防性」治療係出於降低發展病理(例如轉移性癌症)風險之目的投與不展現疾病徵象或僅展現早期徵象的個體之治療。

MYXV可感染具有缺陷型先天性抗病毒反應之細胞。如本文所用「缺陷型先天性抗病毒反應」係指暴露於病毒時或被病毒侵襲時不誘導抗病毒防禦機制之細胞，該機制可包括病毒複製之抑制、干擾素之產生、干擾素反應途徑之誘導，及凋亡。該術語包括與正常細胞(例如未感染細胞或非癌細胞)相比在暴露於病毒或受病毒感染後具有減少之或缺陷型先天性抗病毒反應之細胞，諸如癌細胞。此包括對干擾素無反應之細胞及具有減少之或缺陷型凋亡反應或凋亡途徑之誘導之細胞。缺陷可由於各種原因(包括感染、遺傳缺陷或環境壓力)所致。然而，應明瞭，當缺陷由預先存在之感染引起時，可不包括MYXV之重複感染及熟練技術者可容易地識別此類情況。熟練技術者可在無需過度實驗下容易地確定任何給定細胞類型是否均具有缺陷型先天性抗病毒反應且因此容易感染MYXV。因此，在某些實施例中，MYXV能夠感染具有缺陷型先天性抗病毒反應之細胞。在某些實施例中，細胞對干擾素無反應。在特定實施例中，細胞為哺乳動物癌細胞。在某些實施例中，細胞為包括人類實體腫瘤細胞之人類癌細胞。在某些實施例中，具有缺陷型先天性抗病毒反應之細胞包含癌細胞。經基因改造黏液瘤病毒

本文在某些實施例中揭示黏液瘤病毒(MYXV)。MYXV可包含MYXV之野生型品系或其可包含MYXV之基因修飾之菌株。在一些實施例中，MYXV包含洛桑品系。在一些實施例中，MYXV之洛桑品系包含GenBank寄存編號AF170726.2，於2019年7月11日公開。

在一些情況下，MYXV包含在南美森林兔(Sylvilagus brasiliensis )中循環之南美MYXV品系。在一些情況下，MYXV包含在叢毛棉尾兔(Sylvilagus bachmani )中循環之加州MYXV品系。在一些情況下，MYXV包含6918，一種減毒西班牙域品系，其包含基因M009L、M036L、M135R及M148R (例如，GenBank寄存編號EU552530，於2019年7月11日公開)之修飾。在一些情況下，MYXV包含6918VP60-T2 (GenBank寄存編號EU552531，於2019年7月11日公開)。在一些情況下，MYXV包含標準實驗室品系(SLS)。在一些實施例中，MYXV包含如本文所述的核酸構築體或MYXV基因組。

在一些情況下，MYXV包含與揭示於Cameron等人，「The complete DNA sequence of Myxoma Virus」，Virology 264:298-318 (1999) (其針對此揭示內容以引用之方式併入)中之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%，諸如介於95%與98%之間、95%與99%之間，包括90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%核酸序列一致性。在一些情況下，MYXV包含揭示於Cameron等人，「The complete DNA sequence of Myxoma Virus」，Virology 264:298-318 (1999)中之序列。

在一些實施例中，MYXV係經基因改造以滅活或減弱病毒基因或蛋白質之活性或表現程度。在一些實施例中，病毒基因或蛋白質為M153。在一些實施例中，病毒基因或蛋白質之滅活或減毒活性或表現程度導致MYXV相對於野生型MYXV或相對於不具有病毒基因或蛋白質之滅活或減毒活性或表現程度之MYXV (例如包含野生型M153基因及/或表現野生型M153蛋白之MYXV)展現增強之抗癌活性。在一些實施例中，MYXV係經基因改造以滅活或減弱超過一種病毒基因或蛋白質之活性或表現程度。

在一些實施例中，MYXV包含編碼非病毒分子之核酸，例如編碼細胞介素之轉基因。在一些實施例中，MYXV包括轉基因，諸如本文所述的轉基因。在一些實施例中，轉基因編碼腫瘤壞死因子(TNF，例如TNFα)、介白素12 (IL-12)或核心蛋白聚糖。在一些實施例中，MYXV包括一個、兩個、三個或更多個轉基因。在一些實施例中，將一或多個轉基因敲入MYXV基因組中。在一些實施例中，轉基因破壞MYXV基因組中之基因，例如轉基因經插入或替代MYXV基因組中之基因之部分，由此破壞基因及/或其編碼的蛋白質之表現。此種破壞可稱為敲除(KO)。

MYXV可經修飾以產生增強MYXV之抗癌效應之任何非病毒分子(例如經修飾以攜帶任何轉基因)。此種非病毒分子可參與觸發凋亡或靶向受感染之細胞以進行免疫破壞，諸如刺激對干擾素反應(例如修復對干擾素反應之缺乏)之非病毒分子，或導致刺激抗體反應之細胞表面標記(諸如病原體相關分子模式，例如細菌細胞表面抗原)之表現之非病毒分子。MYXV亦可經修飾以產生非病毒分子，其參與關閉贅生性或癌細胞的增殖及生長，由此防止細胞分裂。在一些實施例中，MYXV係經修飾以產生治療性非病毒分子，諸如參與化學治療劑之合成之分子，或其可經修飾以在特定物種之細胞中具有增加之複製程度，自該等特定物種之細胞衍生意欲受抑制或被殺死之細胞，例如人類細胞。

在一些實施例中，MYXV包括編碼或表現一種、兩種或三種單獨非病毒分子，例如人類轉基因(例如人類TNF、人類核心蛋白聚糖及人類IL-12)之重組構築體。在一些實施例中，重組構築體進一步編碼或表現一或多種報導子標籤，例如螢光蛋白，諸如eGFP及dsRed。

在一些實施例中，MYXV係經基因改造以減弱其M153基因或蛋白質之活性或表現程度，例如，包含病毒M153基因之破壞(M153敲除：M153KO)。在一些實施例中，減弱M153之活性或表現程度改良對病毒感染之癌細胞之MHC依賴性抗腫瘤免疫反應。在一些實施例中，MYXV包含用於治療癌症之溶瘤病毒。一些實施例將M153KO主鏈與本文所揭示的轉基因之免疫增強性質結合以增強MYXV之溶瘤性質。

在一些實施例中，MYXV編碼TNF(例如TNFα)轉基因、IL-12轉基因、核心蛋白聚糖轉基因或彼等中之兩者或更多者之任何組合。在一些實施例中，MYXV包括TNF(例如TNFα)轉基因、IL-12轉基因及核心蛋白聚糖轉基因。在一些此類實施例中，在對個體投與此種MYXV後，TNF活化且跳躍啟動抗腫瘤免疫系統之先天性及獲得性臂及以旁觀者旁分泌樣方式促進癌細胞死亡。在一些實施例中，IL-12擴增所得抗癌先天性及適應性免疫反應。在一些實施例中，核心蛋白聚糖中斷由TGF-β介導之局部免疫抑制作用，因此增強TNF及IL-12二者之作用且促進抗癌免疫反應。在一些實施例中，三個轉基因之協同作用加MYXV在腫瘤微環境(TME)中之效應增加溶瘤性MYXV載體之免疫治療潛力。在一些實施例中，添加編碼非病毒分子(hTNF、hIL-12及/或人類核心蛋白聚糖)之人類轉基因至MYXV基因組改良MYXV的觸發腫瘤微環境(TME)中穩健抗腫瘤免疫反應之能力。

在一些實施例中，MYXV係經修飾以增強偵測感染狀態之容易性。例如，MYXV可經基因修飾以表現可藉由相對比顯微術、螢光顯微術或放射成像容易偵測之標記。標記可為參與比色或放射性標記反應之經表現之螢光蛋白或經表現之酵素。在一些實施例中，標記包括中斷或抑制所測試的細胞之特定功能之基因產物。

在一些實施例中，經基因改造之MYXV包含螢光蛋白。例示性螢光蛋白包括藍色/UV蛋白諸如TagBFP、Azurite、Sirus或Sapphire；青色蛋白諸如ECFP、cerulean或mTurquoise；綠色蛋白諸如綠色螢光蛋白(GFP)、Emerald、mUKG、mWasabi或Clover；黃色蛋白諸如EYFP、citrine、venus或SYFP2；橙色蛋白諸如單體Kusabira-Orange、mKO2或mOrange；紅色蛋白諸如dsRed、mRaspberrym mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、mApple或mRuby；光可活化蛋白諸如PA-GFP、PAmCherry1或PATagRFP；及光可轉換蛋白諸如Dropna。在一些實施例中，MYXV包括超過一種螢光蛋白。在一些實施例中，經基因改造之MYXV不編碼螢光蛋白。

在一些實施例中，MYXV包含vMyx-hTNFa-GFP-人類核心蛋白聚糖-hIL-12-dsRed-M153KO (vMyx-Triple或vMyx-Triple-紅色)構築體，且為vMyx-Triple病毒。在一些實施例中，MYXV包含vMyx-hTNFa-GFP-人類核心蛋白聚糖-hIL-12-M153KO (vMyx-Triple-白色)構築體，且為vMyx-Triple-白色病毒。

在一些實施例中，MYXV包含在與兔細胞向性相關之一或多個基因處或附近之修飾。在一些情況下，與兔細胞向性相關之一或多個基因包含M11L、M063、M135R、M136R、M-T2、M-T4、M-T5或M-T7。在一些情況下，與兔細胞向性相關之一或多個基因包含M135R、M136R或其組合。

MYXV可使用此項技術中已知的標準技術製備。例如，病毒可藉由以待使用之MYXV品系感染經培養兔細胞或永生化容許人類或靈長類細胞來製備，使感染進展使得病毒在經培養細胞中複製且可藉由此項技術中已知之用於破壞細胞表面且由此釋放病毒顆粒以供收穫之標準方法釋放。收穫後，可藉由感染兔細胞之匯合菌苔且進行溶菌斑檢定來測定病毒效價。M153 修飾

M153基因產物為E3-泛素連接酶，其可參與多種細胞受體及蛋白質之下調，例如人類細胞中I類MHC及CD4之降解。在一些實施例中，本揭示內容之MYXV具有M153蛋白之經減弱之活性及/或表現程度。在一些實施例中，M153蛋白之經減弱之活性及/或表現程度可增強免疫抗原決定基之呈現，例如病毒及/或癌症免疫肽之MHC依賴性呈現。受感染之癌細胞之增強之免疫抗原決定基呈現可誘發更強之免疫反應，包括抗癌T細胞反應，諸如抗癌CD8+ T細胞反應。在一些實施例中，M153蛋白之經減弱之活性及/或表現程度增加MHC-1自M153KO病毒感染之腫瘤細胞直接抗原呈現，且增強由MYXV介導之免疫活化。

在一些實施例中，MYXV包含M153基因之修飾。在一些情況下，修飾係減弱由M153基因編碼之蛋白質之活性或表現程度(例如損害由M153基因編碼之蛋白質之功能)之突變。

在一些情況下，突變係缺失，例如，減弱由M153基因編碼之蛋白質之活性或表現程度之缺失。在一些實施例中，突變係M153基因之核酸序列的至少約1%、至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之缺失。在一些實施例中，突變係整個M153基因之缺失。在一些情況下，修飾係部分缺失，例如M153基因之核酸序列的約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約95%之缺失。在一些實施例中，缺失係至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少7個、至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少100個、至少200個或至少300個核酸之缺失。在一些實施例中，缺失破壞啟動子(例如驅動M153在野生型MYXV中之表現之啟動子)。在一些實施例中，缺失將終止密碼子引入M153基因序列中，例如阻止全長M153轉錄本及/或蛋白質之表現之過早終止密碼子。

在一些情況下，突變係插入，例如，減弱由M153基因編碼之蛋白質之活性或表現程度之插入。在一些實施例中，插入包含編碼非病毒分子之轉基因，例如編碼TNF、核心蛋白聚糖、IL-12或其組合之轉基因。在一些實施例中，插入包含兩個轉基因。在一些實施例中，插入包含三個轉基因。轉基因可破壞(例如中斷)病毒M153基因且減弱M153轉錄本及/或蛋白質之活性或表現程度。在一些實施例中，插入包含編碼TNF之轉基因。在一些實施例中，插入包含編碼IL-12之轉基因。在一些實施例中，插入包含編碼核心蛋白聚糖之轉基因。在一些實施例中，插入包含編碼TNF之轉基因及編碼IL-12之轉基因。在一些實施例中，插入包含編碼TNF之轉基因及編碼核心蛋白聚糖之轉基因。在一些實施例中，插入包含編碼IL-12之轉基因及編碼核心蛋白聚糖之轉基因。在一些實施例中，插入包含編碼TNF之轉基因、編碼IL-12之轉基因及編碼核心蛋白聚糖之轉基因。在一些實施例中，插入包含一或多個啟動子。在一些實施例中，插入破壞啟動子(例如驅動M153在野生型MYXV中之表現之啟動子)。在一些實施例中，M153基因破壞與轉基因表現之組合改良所得重組病毒之抗腫瘤性質。

在一些實施例中，插入係至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少7個、至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少100個、至少200個、至少300個、至少400個、至少500個、至少600個、至少700個、至少800個、至少900個、至少1000個、至少1500個或至少2000個核酸之插入。

在一些實施例中，插入將終止密碼子引入M153基因序列中，例如阻止全長M153轉錄本及/或蛋白質之表現之過早終止密碼子。在一些實施例中，插入改變M153基因序列之閱讀框架，由此破壞M153轉錄本及/或蛋白質之表現。

在一些情況下，突變係取代，例如，減弱由M153基因編碼之蛋白質之活性或表現程度之取代。在一些實施例中，至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少7個、至少10個、至少20個、至少30個核酸係經取代。在一些實施例中，取代將終止密碼子引入M153基因序列中，例如阻止全長M153轉錄本及/或蛋白質之表現之過早終止密碼子。在一些實施例中，取代破壞啟動子(例如驅動M153在野生型MYXV中之表現之啟動子)。

在一些實施例中，相對於野生型MYXV或編碼功能性野生型M153之MYXV，本文所揭示的修飾或突變減弱M153基因及/或蛋白質之活性程度至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%。

在一些實施例中，相對於野生型MYXV或編碼功能性野生型M153之MYXV，本文所揭示的修飾或突變減弱M153基因及/或蛋白質之表現程度至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%。

在一些實施例中，相對於野生型MYXV或編碼功能性野生型M153之MYXV，本文所揭示的MYXV具有減弱至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之M153基因及/或蛋白質之活性程度。

在一些實施例中，相對於野生型MYXV或編碼功能性野生型M153之MYXV，本文所揭示的MYXV具有減弱至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之M153基因及/或蛋白質之表現程度。TNF

在一些實施例中，MYXV包含(例如編碼)非病毒分子，例如包含編碼腫瘤壞死因子(TNF)蛋白之轉基因。在一些實施例中，TNF蛋白為TNFα蛋白。在一些實施例中，TNFα蛋白為人類TNFα蛋白。在一些實施例中，TNFα蛋白係可溶的。在一些實施例中，TNFα蛋白係膜結合的或表面結合的。在一些實施例中，TNFα蛋白藉由活化抗腫瘤免疫細胞或誘導癌細胞死亡來增強MYXV之抗癌活性。

在一些實施例中，TNFα係由替代或鄰近MYXV基因組之M135R基因之基因編碼。在一些實施例中，TNFα基因係插入在介於MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間。在一些實施例中，TNFα基因係插入在介於MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間的基因間區域中。在一些實施例中，TNFα係由替代或破壞MYXV基因組之M153基因之基因編碼。在一些實施例中，TNFα基因替代或破壞MYXV基因組之M153基因。

在一些實施例中，TNFα基因之表現係藉由啟動子諸如痘病毒合成早期/晚期(sE/L)啟動子驅動。在一些實施例中，TNFα基因之表現係藉由內部核糖體進入位點(IRES)驅動。TNF係一種細胞介素，其係先天性發炎免疫反應之部分。在一些實施例中，TNF參與擴增獲得性(例如適應性)免疫反應。TNF可表現為細胞表面免疫配位體，且當在表現轉化蛋白水解酵素(諸如TACE)之特定細胞中產生時，其亦可分泌為經裂解可溶性三聚體細胞介素，該等細胞可表現催化裂解及釋放出該可溶性配位體之轉化蛋白水解酵素，例如該等轉化蛋白水解酵素在骨髓譜系之細胞中係以高程度表現。一種TNF效應子途徑係藉由TNF受體-1 (TNFR1)途徑誘導細胞死亡。在一些實施例中，藉由TNF誘導TNFR1途徑導致凋亡或壞死。在一些實施例中，TNF例如藉由活化抗腫瘤CD8⁺ T細胞及NK細胞來活化先天性及適應性免疫反應。

儘管早期希望全身性投與可溶性TNF可作為有效抗腫瘤藥物在人類中發揮作用，但一些臨床試驗顯示分泌的細胞介素會引起經可溶性配位體全身性治療之患者之嚴重全身毒性。另外，臨床前報導全身性TNF治療並未引起患者之顯著抗腫瘤效應。一種以病毒所衍生之TNF之表現(例如TNF之細胞表面膜形式)可藉由在腫瘤微環境中誘發更大程度之旁觀者細胞殺死來促進局部癌細胞死亡，及亦刺激駐留在相同腫瘤床中之各類免疫細胞，同時將全身性TNF介導之不良毒性效應降至最低。

在一些情況下，TNF蛋白包含與說明於UniProtKB-P01375，於2019年7月3日公開(輸入版本247)中之序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。在一些情況下，TNF蛋白包含與說明於UniProtKB-P01375，於2019年7月3日公開(輸入版本247)中之序列介於95%與98%之間或95%與99%之間的序列一致性。在一些情況下，TNF蛋白包含與說明於UniProtKB-P01375，於2019年7月3日公開(輸入版本247)中之序列約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的序列一致性。在一些實施例中，TNF蛋白包含說明於UniProtKB-P01375，於2019年7月3日公開(輸入版本247)中之序列。

在一些情況下，TNF蛋白包含與UniProtKB-P01375之殘基77至233至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。在一些情況下，TNF蛋白包含與UniProtKB-P01375之殘基77至233介於95%與98%之間或95%與99%之間的序列一致性。在一些情況下，TNF蛋白包含與UniProtKB-P01375之殘基77至233約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的序列一致性。在一些實施例中，TNF蛋白包含UniProtKB-P01375之殘基77至233。

在一些情況下，TNF蛋白係由包含與SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 24至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性之基因編碼。在一些情況下，TNF蛋白係由包含與SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 24介於95%與98%之間或95%與99%之間的序列一致性之基因編碼。在一些情況下，TNF蛋白係由包含與SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 24約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的序列一致性之基因編碼。在一些實施例中，TNF蛋白係由包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO: 24或由其組成之基因編碼。在一些實施例中，TNF係由包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 24之序列之基因編碼。在一些實施例中，編碼TNF之基因包含與SEQ ID NO:12或SEQ ID NO: 24之序列具有70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或由任何兩個前述百分比限定的百分比範圍的一致性之序列。

在一些情況下，TNF蛋白包含與SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 31之殘基77至233至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。在一些情況下，TNF蛋白包含與SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 31之殘基77至233介於95%與98%之間或95%與99%之間的序列一致性。在一些情況下，TNF蛋白包含與SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 31之殘基77至233約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的序列一致性。在一些實施例中，TNF蛋白包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO: 31之殘基77至233。IL-12

在一些實施例中，MYXV包含(例如編碼)非病毒分子，例如包含編碼介白素-12 (IL-12)蛋白之轉基因。在一些實施例中，IL-12蛋白為人類IL-12蛋白。在一些實施例中，IL-12蛋白係可溶的。在一些實施例中，IL-12蛋白係膜結合的或表面結合的。在一些實施例中，IL-12蛋白藉由促進免疫細胞分化或誘發免疫細胞細胞毒性進一步增強MYXV之抗癌活性。

在一些實施例中，IL-12包含IL12α次單元(p35次單元)。在一些實施例中，IL-12α次單元係由IL-12α基因編碼。在一些實施例中，IL-12α基因為人類IL-12α基因。在一些實施例中，IL-12α基因係藉由IRES驅動。在一些實施例中，IL-12α基因係藉由啟動子(諸如sE/L啟動子)驅動。在一些實施例中，IL-12α基因替代或破壞M153基因。在一些實施例中，IL-12α基因係插入介於MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間的基因間區域中。

在一些實施例中，IL-12包含IL12β (p40)次單元。在一些實施例中，IL-12β次單元係由IL-12β基因編碼。在一些實施例中，IL-12β基因為人類IL-12β基因。在一些實施例中，IL-12β基因係藉由IRES驅動。在一些實施例中，IL-12β基因係藉由啟動子諸如sE/L啟動子驅動。在一些實施例中，IL-12β基因替代或破壞MYXV M153基因。在一些實施例中，IL-12β基因係插入介於MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間的基因間區域中。

在一些實施例中，IL-12包含IL12α次單元及IL-12β次單元。在一些實施例中，IL12α次單元及IL-12β次單元係經共價連接。在一些實施例中，IL12α次單元及IL-12β次單元未經共價連接。在一些實施例中，IL12α次單元及IL-12β次單元係表現為一個轉錄本。在一些實施例中，IL12α次單元及IL-12β次單元係表現為例如具有將該兩個次單元接合之肽連接子之一個多肽。連接子序列之長度可為例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個或50個胺基酸殘基。連接子之長度可為至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個胺基酸殘基。連接子之長度可為至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多15個、至多20個、至多25個、至多30個、至多40個或至多50個胺基酸殘基。撓性連接子可具有含有甘胺酸及絲胺酸殘基之延伸物之序列。甘胺酸及絲胺酸殘基之小尺寸提供撓性，且允許經連接之功能域之遷移。絲胺酸或蘇胺酸之併入可藉由與水分子形成氫鍵來維持連接子在水溶液中之穩定性，由此減少連接子與蛋白質部分之間之不利相互作用。撓性連接子亦可包含另外胺基酸諸如蘇胺酸及丙胺酸以維持撓性，以及包含極性胺基酸諸如離胺酸及麩酰胺酸以提高溶解度。剛性連接子可具有例如α螺旋結構。α-螺旋剛性連接子可用作蛋白質域之間的間隔子。連接子可包含SEQ ID NO: 33至43之序列中之任何者或其重複體。SEQ ID NO: 33至38及43提供撓性連接子序列之實例。SEQ ID NO: 39至42提供剛性連接子序列之實例。

在一些實施例中，MYXV表現相對低程度之IL-12。IL-12之相對較低表現可例如藉由在編碼IL-12次單元之序列之間使用IRES序列達成。在一些實施例中，MYXV表現相對高程度之IL-12。IL-12之相對較高表現可例如藉由使用接合單個多肽中IL-12之次單元之適宜連接子，例如彈性蛋白連接子，諸如SEQ ID NO: 43之連接子達成。

在一些實施例中，IL-12表現程度可藉由實例6之檢定來測定。例如，可以本揭示內容之MYXV (MOI為1)感染vero細胞，可在感染後24小時收穫上清液，及可藉由ELISA測定IL-12的量。在一些實施例中，如藉由實例6之檢定測定，低IL-12表現程度可為小於50 ng/mL、小於40 ng/mL、小於30 ng/mL、小於20 ng/mL、小於10 ng/mL或小於5 ng/mL IL-12。在一些實施例中，如藉由實例6之檢定測定，高IL-12表現程度可為大於20 ng/mL、大於30 ng/mL、大於40 ng/mL、大於50 ng/mL、大於60 ng/mL、大於70 ng/mL、大於80 ng/mL、大於90 ng/mL、大於100 ng/mL或大於150 ng/mL IL-12。在一些實施例中，高IL-12表現程度可為大於20 ng/mL IL-12，及低IL-12表現程度可為小於20 ng/mL IL-12。

在一些實施例中，IL-12次單元中之一者或兩者可經截短。具有經截短次單元之IL-12之一個實例以SEQ ID NO: 50提供，其包含小鼠IL-12 B (SEQ ID NO: 51)、彈性蛋白連接子(SEQ ID NO: 43)及經截短小鼠IL-12 A (SEQ ID NO: 52)。

IL-12係細胞介素。在一些實施例中，IL-12促進T輔助1型(Th1)分化，且增強天然殺手(NK)細胞及細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)之細胞毒性。在一些實施例中，此IL-12之作用在先天性及適應性免疫之要素之間建立改良之互連以促進抗癌免疫反應。在一些實施例中，由於該先天性及適應性免疫之橋接，IL-12增強MYXV之抗腫瘤效應。在一些實施例中，IL-112有效刺激IFN-γ (協調抗癌防禦機制之細胞介素)之產生，由此增強MYXV之抗腫瘤效應。

由於毒性事件、全身性投與IL-12之短暫性，及腫瘤誘導之免疫抑制，全身性遞送重組IL-12細胞介素療法之臨床試驗並未誘導癌症患者中令人滿意的結果。然而，在腫瘤微環境(TME)內局部表現IL-12之病毒可產生有效抗腫瘤療效。在一些實施例中，來自溶瘤病毒之IL-12之表現受限於腫瘤床，使得轉基因在TME內局部表現，降低與該細胞介素之全身性遞送相關之毒性效應。因此，在一些實施例中，IL-12之兩個次單元之共表現改良由經武裝之MYXV誘導的抗不同類型癌症之抗腫瘤免疫。

在一些實施例中，IL12α次單元包含與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 28之殘基35至253或SEQ ID NO: 28之殘基57至253至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。在一些情況下，IL12α次單元包含與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 28之殘基35至253或SEQ ID NO: 28之殘基57至253介於95%與98%之間或95%與99%之間的序列一致性。在一些情況下，IL12α次單元包含與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 28之殘基35至253或SEQ ID NO: 28之殘基57至253約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的序列一致性。在一些實施例中，IL12α次單元包含SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 28之殘基35至253或SEQ ID NO: 28之殘基57至253。

在一些情況下，IL-12β次單元包含與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 29之殘基23至328至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。在一些情況下，IL-12β次單元包含與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 29之殘基23至328介於95%與98%之間或95%與99%之間的序列一致性。在一些情況下，IL-12β次單元包含與SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 29之殘基23至328約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的序列一致性。在一些實施例中，IL-12β次單元包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 29之殘基23至328。核心蛋白聚糖

在一些實施例中，MYXV包含(例如編碼)非病毒分子，例如包含編碼核心蛋白聚糖之轉基因。在一些實施例中，核心蛋白聚糖蛋白為人類核心蛋白聚糖蛋白。在一些實施例中，核心蛋白聚糖蛋白係可溶的。在一些實施例中，核心蛋白聚糖蛋白係膜結合的或表面結合的。在一些實施例中，核心蛋白聚糖蛋白藉由阻斷或減少TGF-β信號傳導進一步增強MYXV之抗癌活性。

在一些實施例中，核心蛋白聚糖蛋白係由核心蛋白聚糖基因編碼。在一些實施例中，核心蛋白聚糖基因為人類核心蛋白聚糖基因。在一些實施例中，核心蛋白聚糖基因係藉由IRES驅動。在一些實施例中，核心蛋白聚糖基因係藉由啟動子諸如sE/L啟動子驅動。在一些實施例中，核心蛋白聚糖基因替代或破壞M153基因。在一些實施例中，核心蛋白聚糖基因係插入介於MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間的基因間區域中。

核心蛋白聚糖係細胞外基質蛋白多糖家族之成員，其存在於基質組織及上皮細胞中且在其中起作用。在一些實施例中，核心蛋白聚糖藉由直接或間接靶向參與細胞生長、存活、轉移及/或血管生成之信號傳導分子而影響不同類型癌症之生物學。在一些實施例中，核心蛋白聚糖阻斷TGF-β誘導之信號傳導。在一些實施例中，TGF-β係有助於一些腫瘤微環境(TME)中免疫抑制之細胞介素。在一些情況下，TGF-β將可以其他方式識別且攻擊癌細胞之效應T細胞轉化為調節(抑制)T細胞，此相反關閉識別及消除癌細胞所需的先天性發炎反應及獲得性免疫途徑。在多種類型之癌症中，TGF-β信號傳導途徑之部分經突變，及該細胞介素不再控制至少有些細胞靶標。此等癌細胞可增殖且增加其TGF-β之內源性產生，該TGF-β可作用於周圍基質細胞、免疫細胞、內皮及平滑肌，導致癌組織內局部免疫抑制及腫瘤床血管生成，此使得癌症甚至更具侵入性。因此，在一些實施例中，表現核心蛋白聚糖之溶瘤性MYXV載體直接阻斷TGF-β於TME內且由此比不表現核心蛋白聚糖之MYXV誘導更強之抗腫瘤免疫反應。

另外，核心蛋白聚糖可抑制腫瘤細胞生長及增殖。病毒遞送核心蛋白聚糖於各種實體腫瘤中可直接抵消腫瘤發生。在一些實施例中，核心蛋白聚糖係用作藉由TGF-β之局部過表現保護之至少有些類型之癌症之抗癌標靶。

在一些實施例中，核心蛋白聚糖係由包含SEQ ID NO: 25之序列之基因編碼。在一些實施例中，編碼核心蛋白聚糖之基因包含與SEQ ID NO: 25之序列具有70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或由任何兩個前述百分比限定的百分比範圍的一致性之序列。在一些情況下，核心蛋白聚糖係由包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性之基因編碼。在一些情況下，核心蛋白聚糖係由包含與SEQ ID NO: 25具有介於95%與98%之間或95%與99%之間的序列一致性之基因編碼。在一些情況下，核心蛋白聚糖係由包含與SEQ ID NO: 25具有約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的序列一致性之基因編碼。

在一些情況下，核心蛋白聚糖蛋白包含與SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 14至19中之任何一者之殘基31至359至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。在一些情況下，核心蛋白聚糖蛋白包含與SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 14至19中之任何一者之殘基31至359介於95%與98%之間或95%與99%之間的序列一致性。在一些情況下，核心蛋白聚糖蛋白包含與SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 14至19中之任何一者之殘基31至359約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的序列一致性。在一些實施例中，核心蛋白聚糖蛋白包含SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 14至19中任何一者之殘基31至359。重組核酸

本文在某些實施例中揭示重組核酸。一些實施例係關於包含MYXV基因組之至少一部分之重組核酸。在一些實施例中，重組核酸包含DNA。在一些實施例中，MYXV基因組或MYXV基因組之部分係經修飾以減少M153基因之表現。在一些實施例中，M153基因係經修飾以敲除MYXV基因組中的M153基因之至少一部分。

在一些實施例中，重組核酸係經基因改造以引入突變於M153基因。突變可包含例如插入、缺失、變位或其組合。在一些實施例中，重組核酸包含其中M153基因被破壞之基因敲入。

在一些實施例中，重組核酸包含編碼非病毒分子之核酸。在一些實施例中，重組核酸包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個編碼非病毒分子之核酸，例如編碼蛋白質之轉基因。

在一些實施例中，重組核酸包含編碼腫瘤壞死因子α (TNFα)之核酸。在一些實施例中，TNFα為人類TNFα。在一些實施例中，編碼TNFα之核酸替代或鄰近MYXV基因組之M135R基因。在一些實施例中，編碼TNFα之核酸係插入於MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間。在一些實施例中，TNFα之表現係藉由痘病毒合成早期/晚期(sE/L)啟動子驅動。在一些實施例中，編碼TNFα之核酸替代或鄰近MYXV基因組之M153基因。

在一些實施例中，重組核酸包含編碼介白素-12次單元α (IL-12α)之核酸。在一些實施例中，IL-12α為人類IL-12α。在一些實施例中，IL-12α之表現係藉由內部核糖體進入位點(IRES)驅動。在一些實施例中，編碼IL-12α之核酸破壞MYXV基因組之M153基因之表現。

在一些實施例中，重組核酸包含編碼介白素-12次單元β (IL-12β)之核酸。在一些實施例中，IL-12β為人類IL-12β基因。在一些實施例中，IL-12β之表現係藉由sE/L啟動子驅動。在一些實施例中，編碼IL-12β之核酸破壞MYXV基因組之M153基因之表現。在一些實施例中，編碼IL-12β之核酸及編碼IL-12α之核酸均破壞MYXV基因組之M153基因之表現。

在一些實施例中，重組核酸包含編碼核心蛋白聚糖之核酸。在一些實施例中，核心蛋白聚糖為人類核心蛋白聚糖。在一些實施例中，核心蛋白聚糖之表現係藉由sE/L啟動子表現。在一些實施例中，重組核酸包含編碼核心蛋白聚糖之破壞MYXV基因組之M153基因之核酸之表現。

在一些實施例中，重組核酸包含編碼報導子標籤(例如螢光蛋白)之核酸。在一些實施例中，報導子標籤包含綠色螢光蛋白(GFP)。在一些實施例中，報導子標籤之表現係藉由sE/L啟動子驅動。在一些實施例中，重組核酸進一步包含編碼第二報導子標籤之核酸。在一些實施例中，第二報導子標籤包含紅色螢光蛋白(RFP)，例如dsRed。在一些實施例中，第二報導子標籤之表現係藉由痘病毒P11晚期啟動子驅動。在一些實施例中，編碼第二報導子標籤之核酸破壞MYXV基因組之M153基因之表現。

在一些實施例中，重組核酸包含視需要包含GFP之vMyx-hTNFa盒。在一些實施例中，重組核酸包含視需要包含dsRed之人類核心蛋白聚糖-hIL-12盒。在一些實施例中，重組核酸包含視需要包含GFP及/或dsRed之vMyx-hTNFa-人類核心蛋白聚糖-hIL-12-M153KO (vMyx-Triple)盒或由其組成。組合物及投與

本文在某些實施例中揭示包含如本文所述的MYXV之組合物。在一些實施例中，組合物包含醫藥組合物。在一些實施例中，組合物包含醫藥上可接受之載劑或賦形劑。

在一些實施例中，醫藥上可接受之載劑包含可注射之流體諸如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、右旋糖水溶液、甘油或類似者。在一些實施例中，組合物包含固體組合物諸如粉末、丸劑、錠劑或膠囊。在一些實施例諸如彼等包括固體組合物之實施例中，醫藥上可接受之載劑包含甘露醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。在一些實施例中，醫藥上可接受之載劑包含生物中性載劑。在一些實施例中，組合物包含潤濕劑或乳化劑、防腐劑及pH緩沖劑及類似者，例如乙酸鈉或山梨糖醇酐單月桂酸酯。

在一些實施例中，醫藥上可接受之載劑或賦形劑之標識或比例係基於投與途徑、與活病毒之相容性或標準醫藥實踐來確定。在一些實施例中，醫藥組合物係用不顯著損害MYXV之生物性質之組分調配。醫藥組合物可藉由用於製備適於投與個體之醫藥上可接受之組合物之已知方法製備，使得有效量之一或多種活性物質與醫藥上可接受之媒劑組合成混合物。在一些實施例中，組合物包括MYXV與一或多種醫藥上可接受之賦形劑、媒劑或稀釋劑結合之溶液，且含於具有適宜pH及與生理學流體等滲透性之緩衝溶液中。

在一些實施例中，醫藥組合物係經調配以用於投與個體。如熟習此項技術者應理解，醫藥組合物可視所選投與途徑而定以多種形式投與個體。在一些情況下，醫藥組合物係經全身性投與，或經調配以用於全身性投與。在一些實施例中，醫藥組合物係經局部投與，或經調配以用於局部投與。

在一些實施例中，醫藥組合物係經非經腸投與，或經調配以用於非經腸投與。非經腸投與之實例包括靜脈內、瘤內、腹膜內、皮下、肌肉內、經上皮、鼻、肺內、鞘內、直腸及局部投與模式。非經腸投與可藉由在所選期間內連續輸注。

在一些實施例中，醫藥組合物係經口投與，或經調配以用於經口投與。醫藥組合物可例如與惰性稀釋劑一起或與載劑一起經口投與，或其可封閉於硬殼或軟殼明膠膠囊中，或可壓製成錠劑。對於經口治療性投與， MYXV可與賦形劑合併且以可攝取之錠劑、頰錠劑、片劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、粉片(wafers)及類似者之形式使用。

MYXV之溶液可在生理學上適宜之緩衝液中製備。在一些實施例中，在儲存及使用之尋常條件下，此等製劑含有防腐劑以防止微生物之生長，但不會滅活活病毒。在一些實施例中，待使用之醫藥組合物之劑量視治療之特定病狀、病狀之嚴重度、個別個體參數(包括年齡、身體狀況、體型及體重)、治療持續時間、並行療法(若存在)之性質、特定投與途徑及在保健從業者之知識及專長範圍內之其他類似因素而定。在某些實施例中，可冷凍乾燥治療性病毒以在室溫下儲存。

醫藥組合物可另外含有另外治療劑，諸如另外抗癌劑。在一些實施例中，組合物包括化學治療劑。化學治療劑例如可為實質上展現抗個體之癌細胞或贅瘤細胞之溶瘤效應且不抑制或減少MYXV之腫瘤殺死效應之任何藥劑。例如，化學治療劑可為(但不限於)蒽環黴素、烷基化劑、烷基磺酸鹽、氮丙啶、伸乙基亞胺、甲基三聚氰胺、氮芥、亞硝基脲、抗生素、抗代謝物、葉酸類似物、嘌呤類似物、嘧啶類似物、酵素、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、含鉑劑或細胞介素。較佳地，化學治療劑為已知針對癌症或贅瘤之特定細胞類型有效之化學治療劑。在一些情況下，該另外治療劑包含免疫檢查點調節劑。

在一些實施例中，組合物包含經如本文所述的MYXV離體處理之周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓(BM)細胞或其組合。在一些實施例中，PBMC、BM細胞或其組合包含自體細胞。在一些實施例中，PBMC、BM細胞或其組合係自同種異體供體獲得。在一些實施例中，PBMC、BM細胞或其組合係自異種供體獲得。使用方法

本文在某些實施例中揭示抑制、減輕或預防有需要個體之癌症之方法，該等方法包括對個體投與如本文所述的組合物或醫藥組合物。在某些實施例中，該方法包括對個體(諸如人類個體)投與如本文所述的MYXV，由此治療及/或抑制有需要個體之癌症。

一些實施例包括MYXV之預防性治療。在一些實施例中，個體患有癌症，懷疑患有癌症，或處在患有癌症風險中。一些實施例包括選擇懷疑患有的個體。一些實施例包括選擇處在患有癌症風險中之個體。在一些實施例中，個體患有癌症。在一些實施例中，該等方法包括選擇患有癌症之個體。

在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體為患者。在一些實施例中，個體為動物或非人類動物。非人類動物之實例包括脊椎動物諸如哺乳動物及非哺乳動物。哺乳動物之一些實例包括非人類的靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛及囓齒動物(諸如小鼠及大鼠)。

在一些實施例中，癌症為實體腫瘤。實體腫瘤諸如肉瘤及癌之實例包括(但不限於)纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、骨原性肉瘤及其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴惡性病、胰臟癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓質癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、威爾姆斯瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、膀胱癌及CNS腫瘤(諸如神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果腺瘤(pinealoma)、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠質瘤、腦膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤)。在一些實施例中，癌症包含骨肉瘤、三陰性乳癌或黑色素瘤。

在一些實施例中，癌症已轉移至個體中某一位置。在一些實施例中，位置包含個體之肺、腦、肝臟及/或淋巴結。

在一些實施例中，癌症包含血液癌諸如霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)或非霍奇金淋巴瘤。在一些實施例中，血液癌包括B細胞或T細胞血液癌。

在一些實施例中，組合物降低癌細胞存活率，或活化癌症中之免疫原性細胞死亡。在一些實施例中，在投與組合物後，癌症得以抑制、減輕或預防。在一些實施例中，投與改良個體存活率。

MYXV或包含MYXV之組合物可使用標準投與方法投與個體。在一些實施例中，病毒或包含病毒之組合物係全身性投與(例如IV注射)。在一些實施例中，病毒或包含病毒之組合物係藉由在疾病部位(例如腫瘤內)注射來投與。在一些實施例中，病毒或包含病毒之組合物係經口或非經腸投與，或藉由此項技術中已知的任何標準方法投與。在某些實施例中，MYXV或包含MYXV之組合物係在腫瘤及/或轉移之部位投與。

MYXV最初可以適宜量投與，該量可視個體之臨床反應而定按需要進行調整。病毒之有效量可憑經驗確定且視可安全投與的MYXV之最大量及產生所需結果之病毒之最小量而定。

待投與的病毒之濃度可視待投與之MYXV之特定品系之毒力及視所靶向的細胞之性質而變化。在一個實施例中，將小於約3 x 10¹⁰ 個病灶形成單位(focus forming units，「ffu」(亦稱為「感染單位」))之劑量投與人類個體，在各種實施例中，可投與約10² 至約10⁹ pfu之間，約10² 至約10⁷ pfu之間，約10³ 至約10⁶ pfu之間，或約10⁴ 至約10⁵ pfu之間的單次劑量。

在一些實施例中，MYXV係以可有效增加個體中免疫細胞(例如PBMCs)表現細胞介素之劑量及時間表投與。免疫細胞表現細胞介素可增加例如至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約1000倍或至少約1000倍。在一些實施例中，MYXV係以可有效增加個體中免疫細胞表現兩種、三種、四種、五種、六種或更多種細胞介素之劑量及時間表投與。在一些實施例中，MYXV係以可有效增加個體中免疫細胞表現至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種或更多種細胞介素之劑量及時間表投與。細胞介素可包含例如IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α或其任何組合。在一些實施例中，TNF-α之表現增加。在一些實施例中，IL-12之表現增加。在一些實施例中，核心蛋白聚糖之表現增加。在一些實施例中，IFN-γ之表現增加。

在一些實施例，MYXV係以可有效增加個體中癌細胞表現細胞介素之劑量及時間表投與。癌細胞表現細胞介素可增加例如至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約1000倍或至少約1000倍。在一些實施例中，MYXV係以可有效增加個體中癌細胞表現兩種、三種、四種、五種、六種或更多種細胞介素之劑量及時間表投與。在一些實施例中，MYXV係以可有效增加個體中癌細胞表現至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種或更多種細胞介素之劑量及時間表投與。細胞介素可包含例如IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α或其任何組合。在一些實施例中，TNF-α之表現增加。在一些實施例中，IL-12之表現增加。在一些實施例中，核心蛋白聚糖之表現增加。在一些實施例中，IFN-γ之表現增加。

在一些實施例中，MYXV係以可有效減少個體中腫瘤體積之劑量及時間表投與。腫瘤體積可例如減少至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。

在一些實施例中，MYXV係以可有效減小個體中腫瘤或癌細胞生長速率之劑量及時間表投與。腫瘤或癌細胞生長速率可例如減少至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。

MYXV可以單獨療法或可與其他療法(包括化學療法、免疫療法及/或放射療法)組合投與。例如，MYXV可在手術移除原發性腫瘤之前或之後或在治療(諸如放射療法或習知化學治療藥物之投與)之前，同時或之後投與。在一些實施例中，MYXV可在另一療法之前的至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1.5週、2週或3週投與。在一些實施例中，MYXV可在另一療法之後的至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1.5週、2週或3週投與。在一些實施例中，MYXV可在另一療法的1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之內投與。在一些實施例中，MYXV可與另一療法同時投與。

一些實施例進一步包括對個體投與一種另外治療劑。在一些實施例中，該另外治療劑為免疫檢查點調節劑。在一些實施例中，該另外治療劑係在投與組合物之前投與個體。在一些實施例中，該另外治療劑係在投與組合物之後投與個體。在一些實施例中，該另外治療劑係與組合物組合投與個體。

在一些實施例中，該另外治療劑包含免疫調節劑，例如免疫檢查點調節劑或抑制劑。例示性免疫檢查點調節劑包括(但不限於) PD-L1抑制劑，諸如來自AstraZeneca之度伐魯單抗(durvalumab) (Imfinzi)、來自Genentech之阿特珠單抗(atezolizumab) (MPDL3280A)、來自EMD Serono/Pfizer之阿維單抗(avelumab)、來自CytomX Therapeutics之CX-072、來自Novartis Pharmaceuticals之FAZ053、來自3D Medicine/Alphamab之KN035、來自Eli Lilly之LY3300054或來自EMD Serono之M7824 (抗PD-L1/TGFβ阱)；PD-L2抑制劑，諸如GlaxoSmithKline’s AMP-224 (Amplimmune)及rHIgM12B7；PD-1抑制劑，諸如來自Bristol-Myers Squibb之納武單抗(nivolumab) (Opdivo)、來自Merck之帕姆單抗(pembrolizumab) (Keytruda)、來自Agenus之AGEN 2034、來自BeiGene之BGB-A317、來自Boehringer-Ingelheim Pharmaceuticals之Bl-754091、來自CBT Pharmaceuticals之CBT-501 (傑諾珠單抗(genolimzumab))、來自Incyte之INCSHR1210、來自Janssen Research & Development之JNJ-63723283、來自MedImmune之MEDI0680、來自MacroGenics之MGA 012、來自Novartis Pharmaceuticals之PDR001、來自Pfizer之PF-06801591、來自Regeneron Pharmaceuticals/Sanofi之REGN2810 (SAR439684)或來自TESARO之TSR-042；CTLA-4抑制劑，諸如來自Bristol Meyers Squibb之易普利單抗(ipilimumab) (亦稱為Yervoy®、MDX-010、BMS-734016及MDX-101)、來自Pfizer之曲美目單抗(tremelimumab) (CP-675,206，替西木單抗(ticilimumab))或來自Agenus之AGEN 1884；LAG3抑制劑，諸如來自Bristol-Myers Squibb之BMS-986016、來自Novartis Pharmaceuticals之IMP701、來自Novartis Pharmaceuticals之LAG525或來自Regeneron Pharmaceuticals之REGN3767；B7-H3抑制劑，諸如來自MacroGenics之諾利珠單抗(enoblituzumab) (MGA271)；KIR抑制劑，諸如來自Innate Pharma之利麗單抗(Lirilumab) (IPH2101；BMS-986015)；CD137抑制劑，諸如烏瑞魯單抗(urelumab) (BMS-663513，Bristol-Myers Squibb)、PF-05082566 (抗4-1BB、PF-2566、Pfizer)或XmAb-5592 (Xencor)；PS抑制劑，諸如巴維昔單抗(Bavituximab)；及抑制劑，諸如其抗體或片段(例如單株抗體、人類、人類化或嵌合抗體)、RNAi分子，或TIM3、CD52、CD30、CD20、CD33、CD27、OX40、GITR、ICOS、BTLA (CD272)、CD160、2B4、LAIR1、TIGHT、LIGHT、DR3、CD226、CD2或SLAM的小分子。

進一步揭示一種遞送策略，其中治療性MYXV病毒在輸注(例如再輸注回)於癌症患者中之前首先自骨髓或周邊血液單核細胞離體吸附至混合白血球。在該策略中，MYXV可經由以病毒離體預感染之白血球之遷移遞送至轉移性癌症部位。該全身性遞送方法有時稱為「離體病毒療法」或EVV(亦稱為EV2)，因為病毒在輸注於患者中之前首先被遞送至分離之白血球。MYXV構築體及該遞送策略可顯著減少腫瘤負荷且增加有需要個體之存活率。在一些實施例中，以MYXV構築體離體吸附BM或PBMC細胞一小時，且然後將負載MYXV之白血球輸注回接受者中。

在某些實施例中，單核周邊血液細胞及/或骨髓細胞係自個體例如以自體細胞獲得。在一些實施例中，單核周邊血液細胞及/或骨髓細胞係自一或多個同種異體供體，例如與接受者匹配至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個或至少8個HLA對偶基因(諸如HLA-A、HLA-B、HLA-A及/或HLA-DR對偶基因之一個或兩個複本)之供體獲得。HLA對偶基因可為多種類型，例如，使用基於DNA之方法。在一些實施例中，單核周邊血液細胞及/或骨髓細胞係自一或多個異種供體獲得。實例

提供此等實例僅出於說明目的而不限制本文所提供申請專利範圍之範疇。實例 1– 病毒構築

設計重組質體以在具有或不具有dsRed核酸序列之黏液瘤病毒M153基因座處插入人類核心蛋白聚糖及hIL12核酸序列。自來自OHu16408 (GenScript)之cDNA ORF純系PCR擴增人類核心蛋白聚糖基因。人類次單元IL-12 p35及p40係獲自描述於Journal of Virology，2007年11月，P. 12704–12708中的vMyx-huIL-12-GFP，該案之揭示內容係以引用之方式併入本文中。將紅色螢光蛋白(dsRed)基因緊接於人類核心蛋白聚糖-hIL-12表現盒下游插入，及其表現係藉由痘病毒P11晚期啟動子驅動。該重組核酸稱為vMyx-Triple或vMyx-Triple-紅色。dsRed用作體外及體內MYXV複製之螢光標記，因為MYXV感染可藉由dsRed表現之實時成像(live imaging)來監測。製備該重組核酸之缺乏dsRed標記之第二形式(稱為vMyx-Triple-白色)。

圖1A圖示vMyx-Triple重組核酸之構造。上部影像描繪vMyx-hTNFa-GFP基因組及表現人類核心蛋白聚糖-hIL-12-dsRed盒之插入位點(M153基因座)。中間影像顯示人類核心蛋白聚糖-hIL-12-dsRed盒，及下部影像顯示vMyx-Triple構築體。人類核心蛋白聚糖-hIL-12-dsRed盒中之核心蛋白聚糖及IL-12轉基因在痘病毒合成早期/晚期啟動子(sE/L)之控制下表現，而dsRed之表現係藉由痘病毒晚期啟動子P11控制。vMyx-Triple-白色構築體與vMyx-Triple-紅色相同但缺乏dsRed盒。

為產生vMyx-Triple及vMyx-Triple-白色病毒，首先使用閘道器系統(ThermoFisher Scientific)構築重組質體。上游及下游雜交序列係藉由PCR擴增以藉由與適宜pDONR載體之閘道器BP重組來產生進入純系。最終重組質體係藉由以連續方式將三個進入純系與目標載體重組來構築。藉由以vMyx-hTNFa-GFP病毒感染RK13細胞且然後以適宜重組質體轉染將人類核心蛋白聚糖-hIL12-dsRed表現盒插入MYXV基因組中。使用螢光dsRed蛋白作為選擇標記，實施多輪foci純化以獲得純重組病毒原種。使用針對hTNF、人類核心蛋白聚糖及hIL-12之特異性引子藉由PCR證實轉基因之存在(圖2A及2B)。顯示於此等圖中之該PCR分析驗證轉基因存在於各種vMyx-Triple純系中，及顯示於該等圖中之條帶處於預期大小。表1包括用於產生構築體之引子序列。

表 1
SEQ ID NO	名稱	引子序列
1	hTNF_F	GGGGACAACTTTTCTATACAAAGTTGCCAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGGA
2	hTNF_R	GGGGACACCTTTATTATACAAAGTTGAGGGCAATGATCCCAAAGT
3	AttB4r_hDCN_F	GGGACAACTTTTCTATACAAAGTTGCCAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAATGAAGGCCACTATCATCCTCC
4	hDCN_R_Over	CTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCTTACTTATAGTTTCCGAGTTG
5	hIL12_F_Over	GCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATC
6	AttB3r_hIL12_R	GGGGACAACTTTATTATACAAAGTTGTTTAGGAAGCATTCAGATAGCTCATC
7	attB1_M152_F	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGTAGACGCGGTGTTTCTATCC
8	M154-attB2-R	GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAAACGTAACACCGTAACTGCC
9	M153-F	ATGGCTACTGTTGTAAACATGG
10	M153-Rev	CTAAGCGGGTGACTCCACGACG

重組vMyx-Triple及vMyx-Triple-白色病毒之純度及M153之缺乏係使用適宜引子組藉由PCR來證實(圖2C及2D)。顯示於圖2C中之PCR分析藉由在135個及136個基因之側接區域中使用引子驗證該等純系是純野生型病毒。西方墨點法證實此三個轉基因之蛋白表現(圖3A至3C)。因此，產生表現轉基因人類TNFα、核心蛋白聚糖及IL-12而缺乏M153之重組MYXV (vMyx-Triple)。用於偵測轉基因表現之抗體如下：人類TNF-a：單株小鼠IgG1純系# 28401 (MAB610-100，R&D Systems)；人類核心蛋白聚糖：兔多株抗體(ab175404，Abcam)；人類IL-12：兔多株抗IL-12 p70抗體(ab25105，Abcam)。

使用與針對表現人類IL-12之病毒所使用相同的閘道器系統(ThermoFisher Scientific)產生表現小鼠IL-12而不是人類IL-12之重組MYXV。使用在IL-12之次單元之間具有IRES序列之合成早期/晚期啟動子(低msTriple IL-12)產生表現相對較低程度之小鼠IL-12之病毒，及使用具有在IL-12之次單元之間含有彈性蛋白連接子之小鼠IL-12之合成早期/晚期啟動子(高msTriple IL-12)產生表現相對較高程度之小鼠IL-12之vMyxv-msTriple。實例 2– 重組 MYXV 之複製及細胞殺死能力

在RK13細胞中測試在實例1中製備的vMyx-Triple病毒之複製能力。vMyx-Triple病毒之複製能力類似於親本vMyx-hTNFa-GFP病毒(圖4)。因此，表現轉基因人類TNFα、核心蛋白聚糖及IL-12且缺乏M153之重組MYXV在宿主細胞中有效複製。

接下來，在兩種不同細胞系中測試vMyx-Triple病毒之細胞殺死能力：CT26 (結腸癌)及HELA (人類子宮頸癌 (圖5A及5B)。為測定細胞存活率(且由此推斷細胞毒性)，使用CellTiter 96® AQueous One Solution細胞增殖檢定(MTS) (Promega，USA)。以10之感染倍率(MOI)以不同病毒感染CT26及HELA細胞48小時。48小時後，添加四唑鎓受質(MTS)至CT26及HELA細胞且在培養2小時後使用微板讀取器測定產生於活細胞中之A490甲臢產物。每個樣本一式三份定量且進行總共兩個獨立實驗。與親本病毒vMyx-hTNFa相比及亦與vMyx-GFP相比，vMyx-Triple病毒在兩種細胞系中誘導相似程度之細胞死亡。與其他病毒相比，存在vMyx-Triple病毒之增加之癌細胞殺死之傾向。因此，表現轉基因人類TNFα、核心蛋白聚糖及IL-12且缺乏M153之重組MYXV對癌細胞具有細胞毒性。實例 3– 重組 MYXV 之複製及細胞殺死能力

圖1B圖示M153基因座，其可在本揭示內容之重組核酸及MYXV中進行修飾。修飾可包括M153序列中之突變，例如插入、缺失、取代或其組合。修飾可減弱M153之活性或表現程度。修飾可包括缺失M153基因及/或以一或多個轉基因替代M153基因。替代基因可選自hTNFa、人類核心蛋白聚糖、IL-12或有助於增強溶瘤活性或減少MYXV之不良副作用之另一轉基因。

為建立vMyx構築體，可首先使用閘道器系統(ThermoFisher Scientific)構築重組質體。上游及下游雜交序列係藉由PCR擴增以藉由與適宜pDONR載體之閘道器BP重組來產生進入純系。最終重組質體係藉由以連續方式將一或多個進入純系與目標載體重組來構築。藉由以vMyx感染RK13細胞且然後用適宜重組質體轉染將重組質體插入MYXV基因組中。實施多輪foci純化以獲得純重組病毒原種。可使用選擇標記，諸如螢光蛋白，例如dsRed。可藉由PCR及/或定序證實轉基因之存在。

M153敲除病毒可依此方式構築。重組質體可經設計為含有側接M153基因之序列之序列，而不包含M153基因序列。視需要，可包括用於螢光蛋白之表現盒。M153敲除可藉由以MYXV感染RK13細胞，且以重組質體轉染細胞來產生。實施多輪foci純化以獲得純M153KO病毒原種，視需要使用螢光蛋白作為選擇標記。病毒之M153敲除及純度係使用適宜引子經由PCR分析來證實。

經修飾之vMyx病毒之複製能力可在RK13細胞中測試。經修飾之vMyx病毒之複製能力可類似於親本vMyx病毒。接下來，在兩種不同癌細胞系中測試經修飾之vMyx病毒之細胞殺死能力。為測定細胞存活率(且由此推斷細胞毒性)，使用CellTiter 96® AQueous One Solution細胞增殖檢定(MTS) (Promega，USA)。以MOI=10以不同病毒感染癌細胞48小時。48小時後，添加四唑鎓受質(MTS)至細胞且在培養2小時後使用微板讀取器測定產生於活細胞中之A490甲臢產物。每個樣本一式三份定量且進行總共兩個獨立實驗。與親本病毒vMyx相比及亦與vMyx-GFP相比，經修飾之vMyx病毒可在兩種細胞系中誘導相似程度之細胞死亡，或更高程度之細胞死亡。實例 4–M153KO MYXV 之體外結果

可將治療性轉基因在兩種類型之基因組基因座處添加至MYXV：作為蛋白質編碼基因內的破壞構築體，使得重組病毒為該病毒基因之基因「敲除」，抑或在預計不會影響重組病毒之生物學或溶瘤潛力之「無害」基因間基因座處。當內源性病毒基因經敲除時，新穎敲除構築體可在就其針對癌細胞之溶瘤能力方面不同於親本病毒，而與將哪種轉基因插入基因座中無關。

MYXV之M153基因編碼來自E3-泛素連接酶家族之免疫調節蛋白，該蛋白參與多種細胞受體(包括MHC I類及CD4蛋白)之下調。在不希望受理論約束下，M153之滅活或敲低可導致MHC-1依賴性免疫抗原決定基之表現增強，例如病毒及/或腫瘤抗原之直接呈現增加，由此增加宿主T細胞識別病毒感染之細胞(例如癌細胞)。此使得具有滅活M153基因之黏液瘤病毒用作溶瘤載體。該實例及以下實例中之資料指示，在免疫活性模型中，M153敲除黏液瘤病毒(M153KO MYXV)主鏈在體外及體內比具有完整M153基因之親本MYXV展現更高溶瘤活性。因此，不含轉基因之M153KO MYXV展現比親本MYXV或wt MYXV更大之溶瘤活性。此外，與親本MYXV或wt MYXV相比，具有一或多個轉基因之M153KO MYXV亦可展現增強之溶瘤活性。

在B16F10細胞(鼠類黑色素瘤細胞系)中，與含有完整野生型M153 (wt MYXV)之野生型黏液瘤病毒相比，測試M153KO MYXV之細胞殺死之誘導。該M153KO MYXV不包括hTNFa、人類核心蛋白聚糖、hIL-12A或hIL-12B轉基因。在感染後的早期時間點直至感染後約36小時，M153KO MYXV比wt MYXV在更大程度上降低B16F10細胞中之細胞存活率(圖6)。此等結果表明，具有M153滅活或敲低之MYXV比沒有M153滅活之野生型或MYXV在更大程度上誘導細胞死亡。

基於該結果，評估M153KO病毒可誘導特定類型之細胞死亡(稱為免疫原性細胞死亡(ICD))之可能性以確定M153KO MYXV作為溶瘤載體在癌細胞中誘導ICD之潛力。不同印記可指示ICD之誘導，ICD可刺激免疫系統(例如適應性免疫系統)。在該情況下，本研究之焦點係兩個信號：釋放ATP至細胞外環境，及細胞之表面上鈣網蛋白之表現或胞外表現。

ATP自垂死細胞之釋放可指示ICD。感染wt MYXV後所觀測到的ATP釋放與陰性對照無顯著差異。另一方面，感染M153KO MYXV後釋放之ATP的量比在未處理之細胞中高，且比感染wt MYXV之細胞高多達約四倍(參見圖7A，例如感染後10小時之峰值)。M153KO MYXV感染之峰值結果與利用藥物誘導之陽性對照(多柔比星)所獲得的峰值相似，但係在稍後時間(圖7A，參見感染後6至10小時時的結果)。因此，與wt MYXV相比或與不含M153滅活或敲除之MYXV相比，具有M153之滅活或敲除之MYXV具有優異溶瘤性質。特別地，具有M153滅活或敲低之MYXV比不含M153滅活或敲低之MYXV或WT MYXV在更大程度上誘導免疫原性細胞死亡。

鈣網蛋白通常表現於內質網內，但發生ICD之處，其可在細胞表面上表現(胞外表現)。鈣網蛋白之胞外表現係使用共聚焦顯微術評估且使用代表每個細胞之核染劑(DAPI)之每個信號所觀測到的鈣網蛋白信號之比率進行定量。在該情況下，M135KO MYXV被用作為不相關病毒基因(M135)中具有基因敲除病灶之非武裝病毒的代表，該基因不會改變由親本MYXV引起之細胞殺死，且就此方面而言表現與wt MYXV類似。經M153KO MYXV感染之細胞中鈣網蛋白之胞外表現之誘導比在M135KO MYXV感染之細胞或經多柔比星處理之細胞中高(圖7B)。

總體而言，此等結果顯示，M153KO MYXV可體外誘導B16F10細胞中ICD之印記，且在體內使用時可誘導免疫系統(例如適應性免疫系統)。因此，具有M153滅活或敲低之MYXV在黑色素瘤或癌細胞中可誘導ICD。具有M153滅活或敲低之MYXV亦可刺激免疫系統(例如適應性免疫系統)。實例 5–M153KO MYXV 之體內結果

另外，利用同基因轉移性黑色素瘤小鼠模型進行研究，使用與體外研究所用相同的鼠類癌細胞系B16F10。在該情況下，C57BL/6小鼠經由在尾靜脈中靜脈內注射B16F10細胞接種以誘導肺中經分散之轉移性黑色素瘤病灶。植入黑色素瘤細胞三天後，小鼠以2x10⁷ ffu M153KO MYXV或鹽水對照經由在眶後區域中靜脈內注射處理。經一劑M153KO病毒處理之小鼠顯示較少轉移性疾病徵象，且存活時間長於對照小鼠(圖8)。M135KO MYXV在涉及兔發病機轉之不相關病毒基因中含有基因敲除，且在此用作對照以測定在不存在M153KO下由病毒引起之任何溶瘤效應。在該模型中，與未處理之對照小鼠相比，M153KO病毒具有顯著更長之長期存活期，但M135KO病毒沒有。

此等結果顯示，與具有完整M153基因之親本MYXV相比或與wt MYXV相比，M153KO MYXV可用作具有優異抗癌效應之溶瘤載體平臺。因此，具有M153滅活或敲低之MYXV可延長患有癌症(例如黑色素瘤)的個體之存活期。癌症或黑色素瘤可為轉移性的。與對照組相比，經M153敲除處理之小鼠顯示存活率及存活時間顯著改良。實例 6– 受感染細胞之轉基因表現

該實例證實感染本揭示內容之黏液瘤病毒之細胞可分泌TNF、核心蛋白聚糖及IL-12，且進一步證實所分泌的TNF及IL-12具有生物活性。

Vero細胞經感染vMyx-Triple (huTriple紅色及huTriple白色)、低msTriple IL12、高msTriple IL-12，各者之MOI均為1。作為對照，細胞經感染不編碼任何細胞介素，且含有完整M153基因之vMyx-GFP。24小時後，收穫上清液且實施ELISA檢定以測定上清液中每種細胞介素之濃度(圖9A至9D)。結果證實感染多種vMyx-Triple病毒之細胞分泌TNF(圖9A)、核心蛋白聚糖(圖9B)及IL-12(圖9C–人類IL-12；圖9D–鼠類IL-12)。相反地，在模擬物感染之細胞或感染vMyx-GFP之細胞中未偵測到細胞介素。顯示與感染低msTriple IL-12相比，感染高msTriple IL-12誘發小鼠IL-12之更高表現。

為測試受感染之細胞所分泌的TNF是否具有生物活性，利用L929細胞實施檢定，該等L929細胞係敏感TNF，且在充分暴露於生物活性TNF後喪失成活力。將L292細胞暴露於已感染指示病毒之Vero細胞之上清液。如圖10A中所顯示，感染多種vMyx-Triple病毒之細胞產生生物活性TNF，而感染vMyx-GFP之細胞則不會。此等結果顯示本揭示內容之編碼TNF之MYXV可誘發生物活性TNF之表現。

為測試由受感染細胞分泌的IL-12是否具有生物活性，實施HEK Blue IL-12報導子檢定。HEK Blue IL-12細胞應生物活性IL-12表現報導子基因，及可使用比色檢定偵測報導子基因。如圖10B中所顯示，感染vMyx-Triple病毒之Vero細胞之上清液誘發報導子基因表現，而對照組(包括感染vMyx-GFP之細胞之上清液)則沒有報導子基因表現。此等結果顯示本揭示內容之編碼IL-12之MYXV可誘發生物活性IL-12之表現。實例 7– 藉由 vMyx-Triple 體外抑制癌細胞系之生長

體外評估vMyx-Triple抑制多種癌細胞系生長之能力。以每個細胞0.1、1或10個病灶形成單位(FFU)之感染倍率(MOI)感染細胞。培養72小時後，使用CellTiter-Glo細胞存活率檢定測試細胞存活率，且確定平均生長抑制。結果顯示vMyx-Triple可抑制衍生自不同組織之一系列人類及小鼠癌細胞系之生長。結果提供於表 2 中。

表2
細胞系	組織類型	平均生長抑制(%)
vMyx-Triple
0.1 ffu/ 細胞	1 ffu/ 細胞	10 ffu/ 細胞
MDA-MB-231	人類乳房	0.40	4.65	47.95
MDA-MB-468	人類乳房	2.35	1.60	45.90
HCT-116	人類結腸	0.80	2.20	5.80
COLO 205	人類結腸	2.95	12.45	71.30
RPMI-8226	人類骨髓瘤	0.00	13.30	87.35
CCRF-CEM	人類白血病	24.85	25.35	39.35
SK-MEL-28	人類黑色素瘤	0.65	4.20	56.90
A375	人類黑色素瘤	0.00	8.70	62.60
A549	人類NSCLC	4.35	11.10	66.15
H460	人類NSCLC	3.55	4.90	21.50
OVCAR-3	人類卵巢	5.30	0.70	1.75
SKOV-3	人類卵巢	6.20	23.15	71.75
ASPC-1	人類胰臟	16.55	18.75	48.70
Capan-1	人類胰臟	1.30	1.05	3.25
PC-3	人類前列腺	0.30	2.15	33.15
DU-145	人類前列腺	4.35	5.60	43.00
786-0	人類腎臟	1.45	2.00	69.05
RXF-393	人類腎臟	1.30	4.95	29.15
Hep3B	人類肝臟	2.40	3.55	12.00
Hep-G2	人類肝臟	4.70	8.45	63.60
MBT-2	鼠類膀胱	16.25	32.30	57.90
4T-1	鼠類乳房	0.05	0.35	10.75
CT-26	鼠類結腸	6.30	25.40	39.75
C-1498	鼠類AML	1.50	1.20	1.30
B16-F10	鼠類黑色素瘤	2.15	9.55	18.20
TC-1	鼠類肺	0.95	4.35	41.30
LL/2	鼠類肺	0.95	2.05	6.75
Pan02	鼠類胰臟	0.00	0.00	25.50
Hepa 1-6	鼠類肝臟	0.85	1.60	46.75
RENCA	鼠類腎臟細胞	1.60	0.20	75.55
MC38	鼠類結腸	3.85	20.25	81.85

為進一步表徵vMyx-Triple體外抑制癌細胞系生長之能力，以在0.01 FFU/細胞至100 FFU/細胞範圍內的9種不同感染倍率感染17種人類肺癌細胞系。培養72小時後，使用CellTiter-Glo細胞存活率檢定評估細胞存活率。計算每個細胞系之EC₅₀ ，因為MOI達成最大生長抑制之50%，如藉由經由GraphPad Prism軟體使用非線性回歸分析之曲線擬合確定。vMyx-Triple證實對多種人類肺癌腫瘤細胞系之抑制，EC50s顯示於表 3 中。

表3
細胞系	組織類型	平均EC₅₀ (ffu/ 細胞)
H1650	人類NSCLC	17.20
H1975	人類NSCLC	4.73
H358	人類NSCLC	11.18
H441	人類NSCLC	33.37
HCC827	人類NSCLC	＞ 100*
LK-2	人類鱗狀細胞肺	19.94
NCI-H226	人類鱗狀細胞肺	10.14
SK-MES-1	人類鱗狀細胞肺	5.59
H720	人類肺癌	＞ 100*
H820	人類肺腺癌	5.61
A427	人類肺癌	8.13
H209	人類SCLC	＞ 100*
H69	人類SCLC	12.54
SHP-77	人類SCLC	＞ 100*
H1963	人類SCLC	94.88^
A549	人類NSCLC	5.60
H2228	人類NSCLC	53.76
*對於兩種試驗結果，值使用＞ 100 ffu/細胞值進行平均。
^對於一種試驗結果，值使用＞100 ffu/細胞值進行平均。

為進一步表徵vMyx-Triple體外抑制癌細胞系生長之能力，以在0.01 FFU/細胞至100 FFU/細胞範圍內的9種不同感染倍率感染8種人類肉瘤細胞系。培養72小時後，使用CellTiter-Glo細胞存活率檢定評估細胞存活率。計算每個細胞系之EC₅₀ ，因為MOI達成最大生長抑制之50%，如藉由經由GraphPad Prism軟體使用非線性回歸分析之曲線擬合確定。vMyx-Triple證實對多種人類肉瘤細胞系之抑制，EC50s顯示於表 4 中。

表4
細胞系	組織類型	平均EC₅₀ (ffu/ 細胞)
143B	人類骨肉瘤	17.76
A204	人類橫紋肌肉瘤	1.51
A673	人類尤文氏肉瘤	7.26
HS822T	人類尤文氏肉瘤	＞100*
HT-1080	人類纖維肉瘤	20.93
KHOS/NP	人類骨肉瘤	30.48
SJSA-1	人類骨肉瘤	5.41
SK-ES-1	人類肉瘤	14.40
*對於兩種試驗結果，值使用＞ 100 ffu/細胞值進行平均。

實例 8–vMyx-Triple 離體抑制人類急性骨髓性白血病樣本

測試vMyx-Triple殺死患者人類癌細胞之能力。將人類患者之急性骨髓性白血病(AML)樣本以在0.01 FFU/細胞至100 FFU/細胞範圍內的6種不同感染倍率(MOI)離體暴露於vMyx-Triple或親本病毒vMyx-GFP。在連續培養6天之培養後，使用CellTiter-Glo細胞存活率檢定測試細胞存活率。計算每個樣本之IC₅₀ ，因為MOI達成最大生長抑制之50%，如藉由經由GraphPad Prism軟體使用非線性回歸分析之曲線擬合確定。

如圖 11A 中所顯示，對於暴露於親本病毒之三個樣本中之兩個樣本，無法計算得IC₅₀ ，而對於另一個樣本，計算得19660之IC₅₀ 。如圖 11B 中所顯示，vMyx-Triple展現人類AML樣本之優異抑制，且IC₅₀ s計算值為4.203、6.524及10.25。結果顯示與缺乏TNF、核心蛋白聚糖及IL-12且含有完整野生型M153基因之親本病毒相比，vMyx-Triple可抑制人類癌症患者之癌細胞之生長，且展現優異抗癌效應。實例 9–MYXV 感染之 PBMC 之細胞介素產生

測試vMyx-Triple誘發人類周邊血液單核細胞(PBMC)之細胞介素產生之能力。人類PBMCs經感染MYXV，各者之MOI均為10。所使用的MYXV為vMyx-Triple (「人類triple」)、親本病毒vMyx-GFP (「親本MYXV」)、vMyx-hTNFa-GFP (「單個TNF」)及表現細胞表面上之TNF (「膜結合之TNF」)之MYXV。表現細胞表面上之TNF之MYXV編碼SEQ ID NO:45之TNFα，其含有改變之TNFα序列，其將保持膜結合。

未處理之PBMCs用作陰性對照，及藉由抗CD3/抗CD28共刺激活化之PBMCs用作陽性對照。在感染後4小時及16小時，收穫上清液，且使用MesoScale Discovery (MSD) U-Plex 6檢定96孔SECTOR板分析IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-2、IL-4及TNFα之濃度。圖 12A 說明感染後4小時上清液中細胞介素之平均(+/-SD)濃度，而圖 12B 說明感染後16小時上清液中細胞介素之平均(+/-SD)濃度。在沒有條形之情況下，此指示細胞介素濃度低於檢定偵測極限。

結果證實vMyx-Triple病毒誘發人類PBMCs產生細胞介素，包括IL-12及TNFα。應感染vMyx-Triple所觀測到的IL-12濃度高於對於任何其他病毒而言所觀測到的濃度。另外，應vMyx-Triple病毒觀測到更高IFN-γ濃度，特別是在感染後4小時。實例 10–vMyx-Triple 在人類異種移植腫瘤模型中之抗癌活性

在異種移植模型中測試vMYX Triple體內抑制人類腫瘤生長之能力。將人類癌細胞系NCI-H1971(肺癌)、A673(肉瘤)及SJSA-1(肉瘤)以每隻小鼠5百萬個腫瘤細胞皮下植入免疫缺陷小鼠(對於NCI-H1975及SJSA-1是無胸腺裸鼠，對於A673是CD17.SCID小鼠)之側腹中。將帶有腫瘤之動物隨機分為每組7至8隻動物之治療組，且平均腫瘤體積為100 mm³ 至150 mm³ 。藉由以1x10⁷ 個病灶形成單位(FFU)或2x10⁷ FFU之劑量瘤內注射vMyx-Triple來處理動物。劑量係每週一次(QW)、每4天一次(Q4D)或每兩天一次(Q2D)投與。每週三次測定腫瘤體積及體重。

圖13A繪製NCI-H1971(肺癌)異種移植腫瘤隨時間之體積，顯示在該模型中瘤內注射MYX Triple以劑量依賴方式抑制腫瘤生長。

圖13B繪製A673 (肉瘤)異種移植腫瘤隨時間之體積，顯示在該模型中更頻繁地投與vMYX Triple導致更大之腫瘤生長抑制。

圖13C繪製SJSA-1 (肉瘤)異種移植腫瘤隨時間之體積，顯示在該模型中更頻繁地投與vMYX Triple導致更大之腫瘤生長抑制。

此等結果證實甚至在免疫缺陷宿主之情況下，vMYX-Triple可體內抑制人類腫瘤生長。實例 11– 人類異種移植腫瘤模型中之 IL-12 及 TNFα 之產生

在異種移植模型中測試vMYX Triple誘發體內IL-12及TNFα產生之能力。將人類肉瘤癌細胞系SJSA-1及A673皮下植入免疫缺陷小鼠(對於SJSA-1為無胸腺裸鼠，對於A673為CD17.SCID小鼠)之側腹。在植入後的第1天，經由瘤內(IT)或靜脈內(IV)注射2x10⁷ FFU vMYX Triple來處理帶有腫瘤之動物(每組n=3隻動物)。治療後4小時及24小時收集血清樣本。在治療後24小時收集腫瘤且進行細胞介素測量。使用MesoScale Discovery (MSD) U-Plex 6檢定96孔SECTOR板進行細胞介素分析。

圖14A顯示在帶有SJSA-1腫瘤之動物中，在治療後4小時及24小時在血清中及在治療後24小時在腫瘤中偵測到的IL-12及TNFα之濃度。繪製平均值±SD。當不存在條形時，分析物之濃度低於該檢定之偵測極限。

圖14B顯示在帶有A673腫瘤之動物中，在治療後4小時及24小時在血清中及在治療後24小時在腫瘤中偵測到的IL-12及TNFα之濃度。繪製平均值±SD。當不存在條形時，分析物之濃度低於該檢定之偵測極限。

結果證實vMYX Triple之靜脈內及瘤內治療可誘發腫瘤內之IL-12及TNFα產生，以及循環中細胞介素濃度之增加。實例 12–M153KO MYXV 之體內抗腫瘤療效

該實例比較利用敲除M153基因之MYXV與表現野生型M153之MYXV達成的腫瘤生長抑制程度。兩種MYXV病毒均含有用於表現插入於M135與M136區域之間的TNF之轉基因。

將B16-F10小鼠黑色素瘤細胞植入C57BL/6小鼠中。將帶有腫瘤之動物隨機分為每組8隻動物之治療組，且平均腫瘤體積為75 mm³ 至100 mm³ 。在隨機分組後的第1天及第8天，動物以2x10⁷ FFU/劑量經由瘤內注射指示黏液瘤病毒處理。

圖15繪製隨時間之腫瘤體積，且顯示敲除M153之病毒比表現野生型M153之病毒在更大程度上抑制腫瘤生長。實例 13–vM YX 小鼠 Triple 在 MC38 癌症模型中之抗腫瘤療效

在MC38小鼠模型中評估vMyx-Triple之抗癌療效。C57BL/6小鼠經植入MC38小鼠結腸直腸癌細胞。將帶有腫瘤之動物隨機分為每組8隻動物之治療組，且平均腫瘤體積為75 mm³ 至100 mm³ 。動物每4天一次經由瘤內(IT)注射2x10⁷ FFU/劑量之指示黏液瘤病毒共四劑處理。

低msTriple係指以相對低程度表現鼠類而不是人類IL-12之vMyx-Triple。高msTriple係指以相對較高程度表現鼠類而不是人類IL-12之vMyx-Triple(作為具有接合IL-12次單元之彈性蛋白連接子之單個多肽)。msTriple病毒亦表現人類核心蛋白聚糖及TNF，且敲除M153基因。GFP係指vMyx-GFP，其不編碼任何細胞介素，且含有完整野生型M153基因。

每週三次記錄腫瘤體積測量，且繪製於圖16A中。存活率繪製於圖16B中。當腫瘤體積為≥ 1500mm³ (對於單個動物)時或當動物滿足IACUC最終犧牲指南時，滿足存活率終點。

此等結果顯示MYXV可體內抑制腫瘤生長，及在該模型中表現更高程度之小鼠IL-12之MYXV展現更大腫瘤生長抑制。實例 14–vM YX 小鼠 Triple 在 B16-F10 癌症模型中之抗腫瘤療效

在B16-F10小鼠模型中評估表現小鼠IL-12之vMyx-Triple之抗癌療效。對C57BL/6小鼠植入B16-F10小鼠黑色素瘤細胞。將帶有腫瘤之動物隨機分為每組8隻動物之治療組，且平均腫瘤體積為75 mm³ 至100 mm³ 。動物在第1天及第8天經由瘤內注射2x10⁷ FFU/劑量之指示黏液瘤病毒處理。

低msTriple係指以相對低程度表現鼠類而不是人類IL-12之vMyx-Triple。高msTriple係指以相對較高程度表現鼠類而不是人類IL-12之vMyx-Triple(作為具有接合IL-12次單元之彈性蛋白連接子之單個多肽)。msTriple病毒亦表現人類核心蛋白聚糖及TNF，且敲除M153基因。GFP係指vMyx-GFP，其不編碼任何細胞介素，且含有完整M153基因。

每週三次記錄腫瘤體積測量，且繪製於圖17A中。存活率繪製於圖17B中。當腫瘤體積為≥ 1500 mm³ (對於單個動物)時或當動物滿足IACUC最終犧牲指南時，滿足存活率終點。

結果顯示MYXV可體內抑制腫瘤生長且提高存活率。與其他兩種黏液瘤病毒相比，表現更高程度之小鼠IL-12之MYXV在該模型中展現更大腫瘤生長抑制，且賦予更大存活率效益。實例 15–vM YX 小鼠 Triple 藉由靜脈內投與途徑與瘤內投與途徑作為癌症療法

在小鼠同基因癌症模型中評估vMyx小鼠Triple之抗腫瘤療效，且比較靜脈內投與途徑與瘤內投與途徑。對C57BL/6小鼠皮下植入B16-F10黑色素瘤細胞，及對Balb/c小鼠皮下植入CT26結腸直腸癌細胞。將帶有腫瘤之動物隨機分為每組8隻動物之治療組，且平均腫瘤體積為75 mm³ 至100 mm³ 。動物經由腫瘤內(IT)或靜脈內(IV)注射高msTriple (一種表現相對高程度之鼠類IL-12(作為具有接合IL-12次單元之彈性蛋白連接子之單一多肽)之MYXV)處理。高msTriple亦表現人類核心蛋白聚糖及TNF，且敲除M153基因。對每隻小鼠投與四劑2x10⁷ 個病灶形成單位(FFU)或1x10⁸ FFU，且該四劑係每四天投與的。每週三次記錄腫瘤體積測量。

圖18A顯示具有B16-F10腫瘤之C57BL/6小鼠之腫瘤體積。

圖18B顯示具有CT26腫瘤之Balb/c小鼠之腫瘤體積。

與媒劑對照相比，高msTriple在所測試的所有劑量及投與途徑下均抑制腫瘤生長。在B16-F10模型中，瘤內注射每劑2 x 10⁷ FFU比每劑1 x 10⁸ 或2 x 10⁷ FFU之靜脈內投與展現更大腫瘤生長抑制。實例 16–vMYX 小鼠 Triple 加免疫檢查點抑制劑組合療法

Balb/c小鼠經由靜脈內注射於尾靜脈中植入K7M2肉瘤細胞。從腫瘤接種後的第3天開始，動物(每組n=10隻)經由注射2x10⁷ FFU/劑量之vMyx-小鼠Triple (低IL-12)於眶後竇中處理。該黏液瘤病毒表現人類核心蛋白聚糖、人類TNF及相對低程度之小鼠IL-12。vMyx-小鼠Triple (低IL-12)亦敲除M153基因。該病毒經每四天一次共四劑投與。一些組每四天一次共四劑經腹膜內注射10 mg/kg之抗PD-1或抗PD-L1抗體。

圖19展現顯示各組之存活率曲線。未處理之對照組中的所有動物到植入後約第80天均死於感染。植入後的第130天，約30%至40%之接受抗PD-1或抗PD-L1之動物已存活，超過50%之經vMyx-小鼠Triple (低IL-12)處理之動物已存活，及經vMyx-小鼠Triple (低IL-12)與抗-PD-1或抗-PD-L1之組合處理之動物展現最高存活率，且超過約80%為活的。

此等資料顯示本揭示內容之黏液瘤病毒可改良患有癌症的個體之存活率，及與免疫檢查點抑制劑之組合療法可又進一步改良存活率。

在一個單獨實驗中，對C57BL/6小鼠之側腹經皮下植入MC38小鼠結腸直腸癌細胞。將帶有腫瘤之動物隨機分為每組8隻動物之治療組，且平均腫瘤體積為75 mm³ 至100mm³ 。

在隨機分組後的第1天及第8天經由瘤內注射2x10⁷ FFU/劑量之vMyx-小鼠Triple (低IL-12)處理動物。一些組每四天一次共四劑經腹膜內注射10 mg/kg之抗PD-1抗體。每週三次測定腫瘤體積及體重。

圖20A繪製隨時間之腫瘤體積。以實線連接的圓圈顯示經媒劑處理之對照小鼠之腫瘤體積。與經媒劑處理之對照組相比，單獨經vMyx-小鼠Triple處理之小鼠(正方形)展現減小之腫瘤體積及延遲之腫瘤生長，單獨經抗PD-1處理之小鼠(虛線圓圈)亦如此。在同時接受vMyx-小鼠Triple及抗-PD-1 (三角形)之組中觀測到最大腫瘤生長抑制。

圖20B顯示各組之存活率曲線。與腫瘤體積相似，同時接受vMyx-小鼠Triple及抗-PD-1之組展現最佳存活率概況。

此等資料顯示本揭示內容之黏液瘤病毒可抑制腫瘤生長且增強患有癌症的個體之存活率，及與免疫檢查點抑制劑之組合療法可具有協同效應。其他序列

對應於本文所述的組合物及方法之例示性序列顯示於表5中。

表 5
SEQ ID NO	名稱	序列
11	合成早期/晚期啟動子	TTAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA
54	合成早期/晚期啟動子	AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA
12	hTNFa	ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGA
13	GFP	ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
14	人類核心蛋白聚糖，同功型A	MKATIILLLLAQVSWAGPFQQRGLFDFMLEDEASGIGPEVPDDRDFEPSLGPVCPFRCQCHLRVVQCSDLGLDKVPKDLPPDTTLLDLQNNKITEIKDGDFKNLKNLHALILVNNKISKVSPGAFTPLVKLERLYLSKNQLKELPEKMPKTLQELRAHENEITKVRKVTFNGLNQMIVIELGTNPLKSSGIENGAFQGMKKLSYIRIADTNITSIPQGLPPSLTELHLDGNKISRVDAASLKGLNNLAKLGLSFNSISAVDNGSLANTPHLRELHLDNNKLTRVPGGLAEHKYIQVVYLHNNNISVVGSSDFCPPGHNTKKASYSGVSLFSNPVQYWEIQPSTFRCVYVRSAIQLGNYK
15	人類核心蛋白聚糖，同功型B	MKATIILLLLAQVSWAGPFQQRGLFDFMLEDEASGIGPEVPDDRDFEPSLGPVCPFRCQCHLRVVQCSDLELGTNPLKSSGIENGAFQGMKKLSYIRIADTNITSIPQGLPPSLTELHLDGNKISRVDAASLKGLNNLAKLGLSFNSISAVDNGSLANTPHLRELHLDNNKLTRVPGGLAEHKYIQVVYLHNNNISVVGSSDFCPPGHNTKKASYSGVSLFSNPVQYWEIQPSTFRCVYVRSAIQLGNYK
16	人類核心蛋白聚糖，同功型C	MKATIILLLLAQVSWAGPFQQRGLFDFMLEDEASGIGPEVPDDRDFEPSLGPVCPFRCQCHLRVVQCSDLGLPPSLTELHLDGNKISRVDAASLKGLNNLAKLGLSFNSISAVDNGSLANTPHLRELHLDNNKLTRVPGGLAEHKYIQVVYLHNNNISVVGSSDFCPPGHNTKKASYSGVSLFSNPVQYWEIQPSTFRCVYVRSAIQLGNYK
17	人類核心蛋白聚糖，同功型D	MKATIILLLLAQVSWAGPFQQRGLFDFMLEDEASGIGPEVPDDRDFEPSLGPVCPFRCQCHLRVVQCSDLGLDKVPKDLPPDTTLLDLQNNKITEIKDGDFKNLKNLHVVYLHNNNISVVGSSDFCPPGHNTKKASYSGVSLFSNPVQYWEIQPSTFRCVYVRSAIQLGNYK
18	人類核心蛋白聚糖，同功型E	MKATIILLLLAQVSWAGPFQQRGLFDFMLEDEASGIGPEVPDDRDFEPSLGPVCPFRCQCHLRVVQCSDLGCLPS
19	小鼠核心蛋白聚糖	MKATLIFFLLAQVSWAGPFEQRGLFDFMLEDEASGIIPYDPDNPLISMCPYRCQCHLRVVQCSDLGLDKVPWDFPPDTTLLDLQNNKITEIKEGAFKNLKDLHTLILVNNKISKISPEAFKPLVKLERLYLSKNQLKELPEKMPRTLQELRVHENEITKLRKSDFNGLNNVLVIELGGNPLKNSGIENGAFQGLKSLSYIRISDTNITAIPQGLPTSLTEVHLDGNKITKVDAPSLKGLINLSKLGLSFNSITVMENGSLANVPHLRELHLDNNKLLRVPAGLAQHKYIQVVYLHNNNISAVGQNDFCRAGHPSRKASYSAVSLYGNPVRYWEIFPNTFRCVYVRSAIQLGNYK
20	P11 (啟動子)	GAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAA
21	IRES (ECMV)	TATGCTAGTACGTCTCTCAAGGATAAGTAAGTAATATTAAGGTACGGGAGGTATTGGACAGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGTACTAACATACGCTCTCCATCAAAACAAAACGAAACAAAACAAACTAGCAAAATAGGCTGTCCCCAGTGCAAGTGCAGGTGCCAGAACATTTCTCTGGCCTAACTGGCCGGTACCTGAGCTCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCCTCGAGGATATCAAGATCTGGCCTCGGCGGCCAG
22	hu IL-12 A (p35)	ATGTGGCCCCCTGGGTCAGCCTCCCAGCCACCGCCCTCACCTGCCGCGGCCACAGGTCTGCATCCAGCGGCTCGCCCTGTGTCCCTGCAGTGCCGGCTCAGCATGTGTCCAGCGCGCAGCCTCCTCCTTGTGGCTACCCTGGTCCTCCTGGACCACCTCAGTTTGGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTTCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATGCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA
23	dsRed	ATGGTGCGCTCCTCCAAGAACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCACCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCCACAACACCGTGAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTGCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTAG
24	Hu TNF-a	ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGA
25	人類核心蛋白聚糖	ATGAAGGCCACTATCATCCTCCTTCTGCTTGCACAAGTTTCCTGGGCTGGACCGTTTCAACAGAGAGGCTTATTTGACTTTATGCTAGAAGATGAGGCTTCTGGGATAGGCCCAGAAGTTCCTGATGACCGCGACTTCGAGCCCTCCCTAGGCCCAGTGTGCCCCTTCCGCTGTCAATGCCATCTTCGAGTGGTCCAGTGTTCTGATTTGGGTCTGGACAAAGTGCCAAAGGATCTTCCCCCTGACACAACTCTGCTAGACCTGCAAAACAACAAAATAACCGAAATCAAAGATGGAGACTTTAAGAACCTGAAGAACCTTCACGCATTGATTCTTGTCAACAATAAAATTAGCAAAGTTAGTCCTGGAGCATTTACACCTTTGGTGAAGTTGGAACGACTTTATCTGTCCAAGAATCAGCTGAAGGAATTGCCAGAAAAAATGCCCAAAACTCTTCAGGAGCTGCGTGCCCATGAGAATGAGATCACCAAAGTGCGAAAAGTTACTTTCAATGGACTGAACCAGATGATTGTCATAGAACTGGGCACCAATCCGCTGAAGAGCTCAGGAATTGAAAATGGGGCTTTCCAGGGAATGAAGAAGCTCTCCTACATCCGCATTGCTGATACCAATATCACCAGCATTCCTCAAGGTCTTCCTCCTTCCCTTACGGAATTACATCTTGATGGCAACAAAATCAGCAGAGTTGATGCAGCTAGCCTGAAAGGACTGAATAATTTGGCTAAGTTGGGATTGAGTTTCAACAGCATCTCTGCTGTTGACAATGGCTCTCTGGCCAACACGCCTCATCTGAGGGAGCTTCACTTGGACAACAACAAGCTTACCAGAGTACCTGGTGGGCTGGCAGAGCATAAGTACATCCAGGTTGTCTACCTTCATAACAACAATATCTCTGTAGTTGGATCAAGTGACTTCTGCCCACCTGGACACAACACCAAAAAGGCTTCTTATTCGGGTGTGAGTCTTTTCAGCAACCCGGTCCAGTACTGGGAGATACAGCCATCCACCTTCAGATGTGTCTACGTGCGCTCTGCCATTCAACTCGGAAACTATAAGTAA
26	插入vMyx-Triple紅色 (人類核心蛋白聚糖-hu Il-12-dsRed)	AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAATGAAGGCCACTATCATCCTCCTTCTGCTTGCACAAGTTTCCTGGGCTGGACCGTTTCAACAGAGAGGCTTATTTGACTTTATGCTAGAAGATGAGGCTTCTGGGATAGGCCCAGAAGTTCCTGATGACCGCGACTTCGAGCCCTCCCTAGGCCCAGTGTGCCCCTTCCGCTGTCAATGCCATCTTCGAGTGGTCCAGTGTTCTGATTTGGGTCTGGACAAAGTGCCAAAGGATCTTCCCCCTGACACAACTCTGCTAGACCTGCAAAACAACAAAATAACCGAAATCAAAGATGGAGACTTTAAGAACCTGAAGAACCTTCACGCATTGATTCTTGTCAACAATAAAATTAGCAAAGTTAGTCCTGGAGCATTTACACCTTTGGTGAAGTTGGAACGACTTTATCTGTCCAAGAATCAGCTGAAGGAATTGCCAGAAAAAATGCCCAAAACTCTTCAGGAGCTGCGTGCCCATGAGAATGAGATCACCAAAGTGCGAAAAGTTACTTTCAATGGACTGAACCAGATGATTGTCATAGAACTGGGCACCAATCCGCTGAAGAGCTCAGGAATTGAAAATGGGGCTTTCCAGGGAATGAAGAAGCTCTCCTACATCCGCATTGCTGATACC AATATCACCAGCATTCCTCAAGGTCTTCCTCCTTCCCTTACGGAATTACATCTTGATGGCAACAAAATCAGCAGAGTTGATGCAGCTAGCCTGAAAGGACTGAATAATTTGGCTAAGTTGGGATTGAGTTTCAACAGCATCTCTGCTGTTGACAATGGCTCTCTGGCCAACACGCCTCATCTGAGGGAGCTTCACTTGGACAACAACAAGCTTACCAGAGTACCTGGTGGGCTGGCAGAGCATAAGTACATCCAGGTTGTCTACCTTCATAACAACAATATCTCTGTAGTTGGATCAAGTGACTTCTGCCCACCTGGACACAACACCAAAAAGGCTTCTTATTCGGGTGTGAGTCTTTTCAGCAACCCGGTCCAGTACTGGGAGATACAGCCATCCACCTTCAGATGTGTCTACGTGCGCTCTGCCATTCAACTCGGAAACTATAAGTAAATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTC ATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTTAGTATGCTAGTACGTCTCTCAAGGATAAGTAAGTAATATTAAGGTACGGGAGGTATTGGACAGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGTACTAACATACGCTCTCCATCAAAACAAAACGAAACAAAACAAACTAGCAAAATAGGCTGTCCCCAGTGCAAGTGCAGGTGCCAGAACATTTCTCTGGCCTAACTGGCCGGTACCTGAGCTCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCCTCGAGGATATCAAGATCTGGCCTCGGCGGCCAGATGTGGCCCCCTGGGTCAGCCTCCCAGCCACCGCCCTCACCTGCCGCGGCCACAGGTCTGCATCCAGCGGCTCGCCCTGTGTCCCTGCAGTGCCGGCTCAGCATGTGTCCAGCGCGCAGCCTCCTCCTTGTGGCTACCCTGGTCCTCCTGGACCACCTCAGTTTGGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCAC TCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTTCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATGCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAAGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATGGTGCGCTCCTCCAAGAACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCACCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCCACAACACCGTGAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTGCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTAG
27	插入vMyx-Triple白色 (人類核心蛋白聚糖-hu Il-12)	AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAATGAAGGCCACTATCATCCTCCTTCTGCTTGCACAAGTTTCCTGGGCTGGACCGTTTCAACAGAGAGGCTTATTTGACTTTATGCTAGAAGATGAGGCTTCTGGGATAGGCCCAGAAGTTCCTGATGACCGCGACTTCGAGCCCTCCCTAGGCCCAGTGTGCCCCTTCCGCTGTCAATGCCATCTTCGAGTGGTCCAGTGTTCTGATTTGGGTCTGGACAAAGTGCCAAAGGATCTTCCCCCTGACACAACTCTGCTAGACCTGCAAAACAACAAAATAACCGAAATCAAAGATGGAGACTTTAAGAACCTGAAGAACCTTCACGCATTGATTCTTGTCAACAATAAAATTAGCAAAGTTAGTCCTGGAGCATTTACACCTTTGGTGAAGTTGGAACGACTTTATCTGTCCAAGAATCAGCTGAAGGAATTGCCAGAAAAAATGCCCAAAACTCTTCAGGAGCTGCGTGCCCATGAGAATGAGATCACCAAAGTGCGAAAAGTTACTTTCAATGGACTGAACCAGATGATTGTCATAGAACTGGGCACCAATCCGCTGAAGAGCTCAGGAATTGAAAATGGGGCTTTCCAGGGAATGAAGAAGCTCTCCTACATCCGCATTGCTGATACCAATATCACCAGCATTCCTCAAGGTCTTCCTCCTTCCCTTACGGAATTACATCTTGATGGCAACAAAATCAGCAGAGTTGATGCAGCTAGCCTGAAAGGACTGAATAATTTGGCTAAGTTGGGATTGAGTTTCAACAGCATCTCTGCTGTTGACAATGGCTCTCTGGCCAACACGCCTCATCTGAGGGAGCTTCACTTGGACAACAACAAGCTTACCAGAGTACCTGGTGGGCTGGCAGAGCATAAGTACATCCAGGTTGTCTACCTTCATAACAACAATATCTCTGTAGTTGGATCAAGTGACTTCTGCCCACCTGGACACAACACCAAAAAGGCTTCTTATTCGGGTGTGAGTCTTTTCAGCAACCCGGTCCAGTACTGGGAGATACAGCCATCCACCTTCAGATGTGTCTACGTGCGCTCTGCCATTCAACTCGGAAACTATAAGTAAATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTTAGTATGCTAGTACGTCTCTCAAGGATAAGTAAGTAATATTAAGGTACGGGAGGTATTGGACAGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGTACTAACATACGCTCTCCATCAAAACAAAACGAAACAAAACAAACTAGCAAAATAGGCTGTCCCCAGTGCAAGTGCAGGTGCCAGAACATTTCTCTGGCCTAACTGGCCGGTACCTGAGCTCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCCTCGAGGATATCAAGATCTGGCCTCGGCGGCCAGATGTGGCCCCCTGGGTCAGCCTCCCAGCCACCGCCCTCACCTGCCGCGGCCACAGGTCTGCATCCAGCGGCTCGCCCTGTGTCCCTGCAGTGCCGGCTCAGCATGTGTCCAGCGCGCAGCCTCCTCCTTGTGGCTACCCTGGTCCTCCTGGACCACCTCAGTTTGGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTTCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATGCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA
28	hu IL-12 A (p40)	MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS*
29	hu IL-12 B (p35)	MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS*
30	dsRed	MVRSSKNVIKEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGCFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGEIHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAKKPVQLPGYYYVDSKLDITSHNEDYTIVEQYERTEGRHHLFL
31	hu TNF-a	MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
32	人類核心蛋白聚糖	MKATIILLLLAQVSWAGPFQQRGLFDFMLEDEASGIGPEVPDDRDFEPSLGPVCPFRCQCHLRVVQCSDLGLDKVPKDLPPDTTLLDLQNNKITEIKDGDFKNLKNLHALILVNNKISKVSPGAFTPLVKLERLYLSKNQLKELPEKMPKTLQELRAHENEITKVRKVTFNGLNQMIVIELGTNPLKSSGIENGAFQGMKKLSYIRIADTNITSIPQGLPPSLTELHLDGNKISRVDAASLKGLNNLAKLGLSFNSISAVDNGSLANTPHLRELHLDNNKLTRVPGGLAEHKYIQVVYLHNNNISVVGSSDFCPPGHNTKKASYSGVSLFSNPVQYWEIQPSTFRCVYVRSAIQLGNYK*
33	連接子	GGGGS
34	連接子	GGGS
35	連接子	GG
36	連接子	KESGSVSSEQLAQFRSLD
37	連接子	EGKSSGSGSESKST
38	連接子	GSAGSAAGSGEF
39	連接子	EAAAK
40	連接子	EAAAR
41	連接子	PAPAP
42	連接子	AEAAAKEAAAKA
43	連接子	VPGVGVPGVG
44	hu IL-12 B (p40)	ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTTAG
45	膜結合之hu TNF-a	MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQADEPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
46	膜結合之hu TNF-a	ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGATGAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTAG
47	插入高vMyx-Triple IL-12 (人類核心蛋白聚糖-mo IL-12-dsRed)	AAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAATGAAGGCCACTATCATCCTCCTTCTGCTTGCACAAGTTTCCTGGGCTGG ACCGTTTCAACAGAGAGGCTTATTTGACTTTATGCTAGAAGATGAGGCTTCTGGGATAGGCCCAGAAGTTCCTGATGACCGCGACTTCGAGCCCTCCCTAGGCCCAGTGTGCCCCTTCCGCTGTCAATGCCATCTTCGAGTGGTCCAGTGTTCTGATTTGGGTCTGGACAAAGTGCCAAAGGATCTTCCCCCTGACACAACTCTGCTAGACCTGCAAAACAACAAAATAACCGAAATCAAAGATGGAGACTTTAAGAACCTGAAGAACCTTCACGCATTGATTCTTGTCAACAATAAAATTAGCAAAGTTAGTCCTGGAGCATTTACACCTTTGGTGAAGTTGGAACGACTTTATCTGTCCAAGAATCAGCTGAAGGAATTGCCAGAAAAAATGCCCAAAACTCTTCAGGAGCTGCGTGCCCATGAGAATGAGATCACCAAAGTGCGAAAAGTTACTTTCAATGGACTGAACCAGATGATTGTCATAGAACTGGGCACCAATCCGCTGAAGAGCTCAGGAATTGAAAATGGGGCTTTCCAGGGAATGAAGAAGCTCTCCTACATCCGCATTGCTGATACCAATATCACCAGCATTCCTCAAGGTCTTCCTCCTTCCCTTACGGAATTACATCTTGATGGCAACAAAATCAGCAGAGTTGATGCAGCTAGCCTGAAAGGACTGAATAATTTGGCTAAGTTGGGATTGAGTTTCAACAGCATCTCTGCTGTTGACAATGGCTCTCTGGCCAACACGCCTCATCTGAGGGAGCTTCACTTGGACAACAACAAGCTTACCAGAGTACCTGGTGGGCTGGCAGAGCATAAGTACATCCAGGTTGTCTACCTTCATAACAACAATATCTCTGTAGTTGGATCAAGTGACTTCTGCCCACCTGGACACAACACCAAAAAGGCTTCTTATTCGGGTGTGAGTCTTTTCAGCAACCCGGTCCAGTACTGGGAGATACAGCCATCCACCTTCAGATGTGTCTACGTGCGCTCTGCCATTCAACTCGGAAACTATAAGTAAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAATGTGTCCTCAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTGCCATCGTTTTGCTGGTGTCTCCACTCATGGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGACTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCACACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCACCTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTCAAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGAGGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCAATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCATGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGAGTGGGCATGGTCAGCGTTCCAACAGCCTCACCCTCGGCATCCAGCAGCTCCTCTCAGTGCCGGTCCAGCATGTGTCAATCACGCTACCTCCTCTTTTTGGCCACCCTTGCCCTCCTAAACCACCTCAGTTTGGCCAGGGTCATTCCAGTCTCTGGACCTGCCAGGTGTCTTAGCCAGTCCCGAAACCTGCTGAAGACCACAGATGACATGGTGAAGACGGCCAGAGAAAAACTGAAACATTATTCCTGCACTGCTGAAGACATCGATCATGAAGAC
48	插入低vMyx-Triple IL-12 (人類核心蛋白聚糖-mo Il-12-dsRed)	AAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAATGAAGGCCACTATCATCCTCCTTCTGCTTGCACAAGTTTCCTGGGCTGGACCGTTTCAACAGAGAGGCTTATTTGACTTTATGCTAGAAGATGAGGCTTCTGGGATAGGCCCAGAAGTTCCTGATGACCGCGACTTCGAGCCCTCCCTAGGCCCAGTGTGCCCCTTCCGCTGTCAATGCCATCTTCGAGTGGTCCAGTGTTCTGATTTGGGTCTGGACAAAGTGCCAAAGGATCTTCCCCCTGACACAACTCTGCTAGACCTGCAAAACAACAAAATAACCGAAATCAAAGATGGAGACTTTAAGAACCTGAAGAACCTTCACGCATTGATTCTTGTCAACAATAAAATTAGCAAAGTTAGTCCTGGAGCATTTACACCTTTGGTGAAGTTGGAACGACTTTATCTGTCCAAGAATCAGCTGAAGGAATTGCCAGAAAAAATGCCCAAAACTCTTCAGGAGCTGCGTGCCCATGAGAATGAGATCACCAAAGTGCGAAAAGTTACTTTCAATGGACTGAACCAGATGATTGTCATAGAACTGGGCACCAATCCGCTGAAGAGCTCAGGAATTGAAAATGGGGCTTTCCAGGGAATGAAGAAGCTCTCCTACATCCGCATTGCTGATACCAATATCACCAGCATTCCTCAAGGTCTTCCTCCTTCCCTTACGGAATTACATCTTGATGGCAACAAAATCAGCAGAGTTGATGCAGCTAGCCTGAAAGGACTGAATAATTTGGCTAAGTTGGGATTGAGTTTCAACAGCATCTCTGCTGTTGACAATGGCTCTCTGGCCAACACGCCTCATCTGAGGGAGCTTCACTTGGACAACAACAAGCTTACCAGAGTACCTGGTGGGCTGGCAGAGCATAAGTACATCCAGGTTGTCTACCTTCATAACAACAATATCTCTGTAGTTGGATCAAGTGACTTCTGCCCACCTGGACACAACACCAAAAAGGCTTCTTATTCGGGTGTGAGTCTTTTCAGCAACCCGGTCCAGTACTGGGAGATACAGCCATCCACCTTCAGATGTGTCTACGTGCGCTCTGCCATTCAACTCGGAAACTATAAGTAAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAATGTGTCCTCAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTGCCATCGTTTTGCTGGTGTCTCCACTCATGGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGACTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCACACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCACCTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTCAAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGAGGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCAATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCATGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCTAGTATGCTAGTACGTCTCTCAAGGATAAGTAAGTAATATTAAGGTACGGGAGGTATTGGACAGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGTACTAACATACGCTCTCCATCAAAACAAAACGAAACAAAACAAACTAGCAAAATAGGCTGTCCCCAGTGCAAGTGCAGGTGCCAGAACATTTCTCTGGCCTAACTGGCCGGTACCTGAGCTCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCTAGTTTCACTTTCCCCTCGAGGATATCAAGATCTGGCCTCGGCGGCCAGATGGTCAGCGTTCCAACAGCCTCACCCTCGGCATCCAGCAGCTCCTCTCAGTGCCGGTCCAGCATGTGTCAATCACGCTACCTCCTCTTTTTGGCCACCCTTGCCCTCCTAAACCACCTCAGTTTGGCCAGGGTCATTCCAGTCTCTGGACCTGCCAGGTGTCTTAGCCAGTCCCGAAACCTGCTGAAGACCACAGATGACATGGTGAAGACGGCCAGAGAAAAACTGAAACATTATTCCTGCACTGCTGAAGACATCGATCATGAAGACATCACACGGGACCAAACCAGCACATTGAAGACCTGTTTACCACTGGAACTACACAAGAACGAGAGTTGCCTGGCTACTAGAGAGACTTCTTCCACAACAAGAGGGAGCTGCCTGCCCCCACAGAAGACGTCTTTGATGATGACCCTGTGCCTTGGTAGCATCTATGAGGACTTGAAGATGTACCAGACAGAGTTCCAGGCCATCAACGCAGCACTTCAGAATCACAACCATCAGCAGATCATTCTAGACAAGGGCATGCTGGTGGCCATCGATGAGCTGATGCAGTCTCTGAATCATAATGGCGAGACTCTGCGCCAGAAACCTCCTGTGGGAGAAGCAGACCCTTACAGAGTGAAAATGAAGCTCTGCATCCTGCTTCACGCCTTCAGCACCCGCGTCGTGACCATCAACAGGGTGATGGGCTATCTGAGCTCCGCCTGAACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATGGTGCGCTCCTCCAAGAACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCACCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCCACAACACCGTGAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTGCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTAG
49	插入vMYX-膜結合之TNF-eGFP	AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGATGAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTAGAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
50	小鼠IL-12單多肽	MCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSVPGVGVPGVGMVSVPTASPSASSSSSQCRSSMCQSRYLLFLATLALLNHLSLARVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHED
51	小鼠IL-12 B (p40)	MCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS
52	截短之小鼠IL-12 A (p35)	MVSVPTASPSASSSSSQCRSSMCQSRYLLFLATLALLNHLSLARVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHED
53	小鼠IL-12A (p35)	MVSVPTASPSASSSSSQCRSSMCQSRYLLFLATLALLNHLSLARVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSA

雖然本文已顯示及描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者應明白，此等實施例僅藉助於實例提供。熟習此項技術者現將在不脫離本發明下想到許多變化、改變及取代。應理解，可使用本文所述的本發明之實施例之各種替代方案實踐本發明。以下申請專利範圍意欲限定本發明之範疇且由此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。

本發明之某些實施例之新穎特徵具體闡述於隨附申請專利範圍中。藉由參考以下闡述說明性實施例(其中利用本發明之原理)之實施方式及附圖，可更好地理解本發明之特徵及優點，其中：

圖1A係顯示可用於產生本文所揭示的黏液瘤病毒(MYXV)之重組核酸之構造的示意圖。上部影像描繪包含vMyx-hTNFa-GFP盒及M153基因座之重組核酸。重組核酸可存在於本揭示內容之MYXV (例如vMyx-hTNFa-GFP病毒)之基因組中。中間影像顯示包含側接序列對應於MYXV基因組中側接M153基因之序列(M152及M154)之人類核心蛋白聚糖-hIL-12-dsRed盒之重組核酸。該重組核酸可存在於重組質體中，該重組質體可經引入MYXV中以產生經修飾之重組病毒。底部影像顯示經修飾之vMyx-Triple重組核酸。重組核酸可存在於本揭示內容之MYXV之基因組中。例如，可將描繪於中間影像中之重組質體引入MYXV中(例如藉由以vMyx-hTNFa-GFP病毒感染RK13細胞，且以重組質體轉染細胞)。重組可發生以產生vMyx-Triple重組核酸。包含vMyx-Triple重組核酸之重組病毒可基於選擇標記(例如dsRed)識別及純化。

圖1B係M153基因座在重組核酸中的示意圖，其可以突變或轉基因插入進行修飾。具有經修飾之M153基因座之重組核酸可使用本文所揭示的方法引入MYXV基因組中。

圖2A至2D係瓊脂糖凝膠之顯示重組MYXV構築體之遺傳控制的影像。圖2A顯示來自vMyx-Triple構築體純系的使用引子證實存在人類核心蛋白聚糖-hIL-12之基因組病毒DNA。圖2B顯示存在hTNFa。圖2C顯示在基因座M153處之修飾及vMyx-Triple構築體之純度。圖2D顯示不存在M153及重組vMyx-Triple構築體之純度。泳道1包括來自MYXV-Lau之DNA或hDec-Hil12及hTNF之表現質體。MM表示已知大小的DNA階梯。

圖3A至3C係西方墨點法(western blots)的影像，其顯示轉基因在vMyx-Triple病毒中之蛋白表現。使用特異性抗體對來自vMyx-Triple病毒感染細胞之細胞裂解物及上清液進行西方墨點分析以證實三種轉基因hTNF (圖3A)、人類核心蛋白聚糖(圖3B)及hIL-12 (圖3C)之蛋白質表現。

圖4係顯示重組vMyx-Triple病毒之單步生長分析的圖表。vMyx-Triple病毒之在RK13細胞中之複製能力類似於親本病毒vMyx-TNF-GFP。MOI = 1。

圖5A及5B係顯示細胞存活率檢定之結果的圖。在兩種不同細胞系中測試vMyx-Triple病毒之細胞殺死能力：CT26 (鼠類結腸癌)及HELA (人類子宮頸癌)。細胞以MOI=10感染48小時，且然後進行MTS檢定。

圖6係顯示藉由野生型MYXV或M153KO MYXV之病毒感染誘導之細胞死亡，且顯示未處理之B16F10細胞(模擬物)中之細胞死亡的圖表。

圖7A及7B係顯示體外藉由B16F10鼠類細胞中M153KO MYXV誘導之免疫原性細胞死亡的圖。圖7A顯示藉由多柔比星(Doxorubicin)(陽性對照)、wt MYXV及M153KO MYXV在感染(p.i.)後不同小時引起之ATP釋放。當不存在條形時，ATP之濃度低於該檢定之偵測極限。圖7B顯示未處理之細胞(模擬物)、經多柔比星處理之細胞(陽性對照)、感染M135KO MYXV之細胞及感染M153KO MYXV之細胞之鈣網蛋白胞外表現的定量表示。該資料基於處理後36小時拍攝的共聚焦影像定量每個細胞之胞外表現，其中信號經標準化為代表每個細胞之核染劑(DAPI)。

圖8係顯示轉移性黑色素瘤小鼠模型(B16F10)中當小鼠未處理(對照；中線)、經M153KO MYXV處理(153KO；延伸至右側之線)或經M135KO MYXV處理作為第二對照組(M135KO；左線)時之存活曲線的圖表。天數p.i.=植入後的天數。

圖9A至9D顯示感染本揭示內容之MYXV之Vero細胞之上清液中細胞介素之濃度。圖9A顯示TNF濃度。圖9B顯示核心蛋白聚糖濃度。圖9C顯示人類IL-12濃度。圖9D顯示鼠類IL-12濃度。當不存在條形時，分析物之濃度低於該檢定之偵測極限。

圖10A顯示L929細胞在暴露於本揭示內容之感染MYXV之胞之上清液後之存活率，其指示TNF生物活性。

圖10B顯示在將HEK Blue IL-12細胞暴露於本揭示內容之感染MYXV之Vero細胞之上清液後報導子基因之表現。當不存在條形時，分析物之濃度低於該檢定之偵測極限。

圖11A顯示來自人類急性骨髓性白血病患者之細胞在與vMyx-GFP一起培養6天後之存活率。

圖11B顯示來自人類急性骨髓性白血病患者之細胞在與vMyx-Triple一起培養6天後之存活率。

圖12A顯示感染後4小時的感染指示MYXV (MOI為10)之人類PBMC之上清液中細胞介素之濃度。繪製平均值+/-SD。當不存在條形時，分析物之濃度低於該檢定之偵測極限。

圖12B顯示感染後16小時的感染指示MYXV (MOI為10)之人類PBMC之上清液中細胞介素之濃度。繪製平均值+/-SD。當不存在條形時，分析物之濃度低於該檢定之偵測極限。

圖13A繪製每週一次(QW)經指示劑量之vMyx-Triple處理之免疫缺陷小鼠中NCI-H1971(肺癌)異種移植腫瘤隨時間之體積。

圖13B繪製每週一次(QW)、每4天(Q4D)或每2天(Q2D)經指示劑量之vMyx-Triple處理之免疫缺陷小鼠中A673(肉瘤)異種移植腫瘤隨時間之體積。

圖13C繪製每週一次(QW)、每4天(Q4D)或每2天(Q2D)經指示劑量之vMyx-Triple處理之免疫缺陷小鼠中SJSA(肉瘤)異種移植腫瘤隨時間之體積。

圖14A顯示來自具有SJSA-1腫瘤之免疫缺陷小鼠之血清及腫瘤組織中所偵測到的IL-12及TNF-α之濃度。小鼠用vMyx-Triple經由靜脈內(IV)或腫瘤內(IT)途徑治療，且在治療後4小時(4H)或24小時(24H)收集樣本。繪製平均值±SD。當不存在條形時，分析物之濃度低於該檢定之偵測極限。

圖14B顯示來自具有A673腫瘤之免疫缺陷小鼠之血清及腫瘤組織中所偵測到的IL-12及TNF-α之濃度。小鼠用vMyx Triple經由靜脈內(IV)或腫瘤內(IT)途徑治療，且在治療後4小時(4H)或24小時(24H)收集樣本。繪製平均值±SD。當不存在條形時，分析物之濃度低於該檢定之偵測極限。

圖15繪製植入B16-F10小鼠黑色素瘤細胞且經敲除M153及M135之TNF表現MYXV(TNF135/153 KO)或具有兩種基因之野生型複本之TNF表現MYXV (TNF135/153 WT)處理之C57BL/6小鼠隨時間之腫瘤體積。

圖16A及圖16B繪製植入MC38小鼠結腸直腸癌細胞之C57BL/6小鼠隨時間之腫瘤體積及存活率。動物每4天一次以指示黏液瘤病毒經由瘤內(IT)注射2x10⁷ FFU/劑量四劑處理。低msTriple係指以相對較低程度表現鼠類而不是人類IL-12之vMyx-Triple。高msTriple係指以相對較高程度表現鼠類IL-12之vMyx-Triple。msTriple病毒亦表現人類核心蛋白聚糖及TNF，且敲除M153基因。GFP係指vMyx-GFP，其不編碼任何細胞介素，且含有完整M153基因。每週三次記錄腫瘤體積測量，且繪製於圖16A中。存活率繪製於圖16B中。

圖17A及圖17B繪製植入B16-F10小鼠黑色素瘤細胞之C57BL/6小鼠隨時間之腫瘤體積及存活率。動物在第1天及第8天以指示黏液瘤病毒經由瘤內注射2x10⁷ FFU/劑量處理。低msTriple係指以相對較低程度表現鼠類而不是人類IL-12之vMyx-Triple。高msTriple係指以相對較高程度表現鼠類IL-12之vMyx-Triple。msTriple病毒亦表現人類核心蛋白聚糖及TNF，且敲除M153基因。GFP係指vMyx-GFP，其不編碼任何細胞介素，且含有完整M153基因。每週三次記錄腫瘤體積測量，且繪製於圖17A中。存活率繪製於圖17B中。

圖18A繪製植入B16-F10小鼠黑色素瘤細胞且經指示劑量之高msTriple (表現相對較高程度之鼠類IL-12，亦表現人類核心蛋白聚糖及人類TNF，且敲除M153基因之MYXV)處理之C57BL/6小鼠隨時間之腫瘤體積。該病毒係經腫瘤內(IT)或經靜脈內(IV)投與。

圖18B繪製植入CT26小鼠結腸直腸癌細胞且經指示劑量之高msTriple處理之Balb/c小鼠隨時間之腫瘤體積。該病毒係經腫瘤內(IT)或經靜脈內(IV)投與。

圖19展現植入K7M2肉瘤細胞之Balb/c小鼠之存活曲線。各組小鼠經由將2x10⁷ FFU/劑量之vMyx-小鼠Triple (低IL-12)注射於後眼窩竇中及/或以腹膜內注射10 mg/kg之抗PD-1或抗PD-L1抗體處理。

圖20A繪製植入MC38小鼠結腸直腸癌細胞之C57BL/6小鼠隨時間之腫瘤體積。各組小鼠在隨機化後的第1天及第8天經由瘤內注射2x10⁷ FFU/劑量之vMyx-小鼠Triple (低IL-12)，及/或每四天一次共四劑以10 mg/kg之抗PD-1抗體處理。以實線連接之圓圈：經媒劑處理；正方形：單獨vMyx-小鼠Triple；虛線圓圈：抗PD-1；三角形：vMyx-小鼠Triple與抗PD-1之組合。

圖20B繪製圖20A各組之存活率。

Claims

一種具有增強之抗癌活性之黏液瘤病毒(myxoma virus；MYXV)，其中該黏液瘤病毒係經基因改造以減弱其M153蛋白之活性或表現程度。
如請求項1之MYXV，其中該M153蛋白之活性或表現程度減弱至少80%。
如請求項1之MYXV，其中該MYXV係經改造以在編碼該M153蛋白之核酸中引入突變，其中該突變包含插入、缺失或取代突變。
如請求項1之MYXV，其中MYXV基因組中編碼該M153蛋白之核酸之至少一部分係經敲除。
如請求項1之MYXV，其中該MYXV包含靶向M153轉錄本藉此減弱該M153蛋白表現之抑制分子，其中該抑制分子包含dsRNA、siRNA、反義RNA或miRNA。
如請求項1之MYXV，其進一步包含編碼非病毒分子之核酸。
如請求項6之MYXV，其中該非病毒分子為腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor alpha；TNFα)、介白素-12次單元α (Il-12α)、介白素-12次單元β (IL-12β)或核心蛋白聚糖(decorin)。
如請求項7之MYXV，其中該非病毒分子為人類蛋白質。
如請求項6之MYXV，其中該核酸編碼至少兩個選自由TNFα、IL-12α、IL-12β及核心蛋白聚糖組成之群之非病毒分子。
一種包含藉由MYXV以離體方式處理之複數個細胞之組合物，該組合物係用於抑制、減輕或預防有需要個體之癌症，其中該MYXV係經基因改造以減弱其M153蛋白之活性或表現程度，且其中該複數個細胞包含周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)、骨髓(bone marrow；BM)細胞或其組合。
如請求項10之組合物，其中該複數個細胞包含對該個體為自體之細胞。
如請求項10之組合物，其中該複數個細胞包含對該個體為異體之細胞。
一種MYXV，其係用於抑制、減輕或預防有需要個體之癌症，其中該MYXV係經基因改造以減弱其M153蛋白之活性或表現程度。
如請求項13之MYXV，其中該MYXV係藉由全身投與投與該個體。
如請求項13之MYXV，其中該MYXV降低癌細胞存活率，或活化癌症中之免疫原性細胞死亡。
如請求項13之MYXV，其中該癌症為實體腫瘤、骨肉瘤、三陰性乳癌或黑色素瘤。
如請求項13之MYXV，其中該癌症已轉移至該個體之肺、腦、肝臟或淋巴結。
如請求項13之MYXV，其中該MYXV係與免疫檢查點調節劑投與該個體。
如請求項13之MYXV，其中該MYXV係以可有效增加該個體之PBMC或癌細胞中至少兩種細胞介素之表現之劑量及時間表投與，其中該至少兩種細胞介素包含IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12或TNF-α。
如請求項13之MYXV，其中該MYXV係以可有效減少該癌症體積至少10%之劑量及時間表投與。
一種重組核酸，其包含MYXV基因組之至少一部分，其中該MYXV基因組之該部分係經修飾以減少M153之表現。
如請求項21之重組核酸，其中MYXV基因組之該部分係經修飾以敲除MYXV基因組之該部分中該M153基因之至少一部分。
如請求項21之重組核酸，其包含編碼非病毒分子之核酸。
如請求項23之重組核酸，其中該非病毒分子為腫瘤壞死因子α (TNFα)、介白素-12次單元α (Il-12α)、介白素-12次單元β (IL-12β)或核心蛋白聚糖。
如請求項24之重組核酸，其中該非病毒分子為人類蛋白質。
如請求項25之重組核酸，其中該編碼該非病毒分子之核酸係插入在介於該MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間。
如請求項23之重組核酸，其中該編碼該非病毒分子之核酸係經插入以替代該MYXV基因組之該M153基因之至少一部分。
如請求項23之重組核酸，其中該編碼該非病毒分子之核酸包含vMyx-hTNFα盒(視需要包含GFP)，且該編碼該非病毒分子之核酸替代或鄰近該MYXV基因組之M135R基因。
如請求項23之重組核酸，其中該編碼該非病毒分子之核酸包含vMyx-hTNFα盒，及該編碼該非病毒分子之核酸係插入在介於該MYXV基因組之M135R基因與M136R基因之間。
如請求項23之重組核酸，其中該編碼該非病毒分子之核酸包含人類核心蛋白聚糖-hIL-12盒(視需要包含dsRed)，且該編碼該非病毒分子之核酸替代該MYXV基因組之該M153基因之至少一部分。
如請求項23之重組核酸，其中該編碼該非病毒分子之核酸包含vMyx-hTNFα-人類核心蛋白聚糖-hIL-12-M153KO (vMyx-Triple)盒(視需要包含dsRed)。