CN114615988A

CN114615988A - 用黏液瘤病毒治疗癌症的新型溶瘤病毒平台

Info

Publication number: CN114615988A
Application number: CN202080076788.8A
Authority: CN
Inventors: 道格拉斯·格兰特·麦克法登; 穆罕默德·马斯姆杜尔·拉赫曼; 南希·维拉; 利诺·托里斯-多明戈斯; 利纳·弗兰科阿丘里; 莱斯利·林恩·夏普
Original assignee: Oncomix Treatment; Arizona Board of Regents of University of Arizona
Current assignee: Oncomix Treatment; Arizona Board of Regents of University of Arizona
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2022-06-10
Also published as: EP4025228A4; TW202122411A; WO2021046125A1; MX2022002547A; IL291009A; CA3152779A1; US20230025706A1; US20210324014A1; US20210061864A1; JP2022546539A; AU2020342510A1; EP4025228A1; KR20220112241A; US11117934B2

Abstract

在某些实施方案中，本文公开了重组黏液瘤病毒(MYXV)和编码所述重组MYXV的核酸构建体。在一些实施方案中，MYXV被工程化以灭活M153蛋白或者减弱M153蛋白的活性或表达水平。在一些实施方案中，所述MYXV被工程化以表达一个或多个转基因，诸如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素‑12(IL‑12)或饰胶蛋白聚糖。在某些实施方案中，本文还公开了使用所述MYXV的方法。一些实施方案包括将如本文所述的MYXV提供至有需要的对象。

Description

用黏液瘤病毒治疗癌症的新型溶瘤病毒平台

交叉引用

本申请要求于2019年9月2日提交的美国临时申请号62/894,925和于2019年12月5日提交的美国临时申请号62/944,233的权益，每个所述临时申请通过引用以其全文并入本文。

序列表

本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用以其全文并入的序列表。创建于2020年9月1日的所述ASCII副本被命名为42206-721_601_SL.txt，并且大小是72,925字节。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的P50 CA186781下由政府支持完成的。政府拥有本发明的一些权利。

技术领域

本文公开了重组黏液瘤病毒(MYXV)、编码重组MYXV的核酸构建体及其使用方法。

背景技术

用于治疗各种类型癌症的当前疗法倾向于通过使癌细胞中毒或将其杀死来起作用。但是，对癌细胞有毒的治疗通常也倾向于对健康细胞有毒。此外，肿瘤的异质性是癌症有效治疗难以实现的主要原因之一。当前主流疗法诸如化学疗法和放射疗法倾向于在狭窄的毒性治疗窗口内使用。这些类型的疗法由于肿瘤细胞的类型不同以及可以施用这些疗法的窗口有限而适用性有限。

发明内容

在一些方面，本文公开了具有增强的抗癌活性的黏液瘤病毒(MYXV)，其中所述黏液瘤病毒被基因工程化以减弱其M153蛋白的活性或表达水平。

在某些实施方案中，将所述M153蛋白的活性或表达水平减弱至少80％。可替代地和/或附加地，MYXV被工程化以在编码M153蛋白的核酸中引入突变，其中所述突变包括插入、缺失或置换突变。在一些实施方案中，所述突变相对于野生型M153蛋白增强细胞免疫应答活性。在某些实施方案中，MYXV基因组中编码所述M153蛋白的核酸的至少一部分被敲除。在一些实施方案中，所述MYXV包含靶向M153转录物的抑制性分子，从而减弱M153蛋白表达。在一些实施方案中，所述抑制性分子是抑制性RNA。在一些实施方案中，所述抑制性RNA包括dsRNA、siRNA、反义RNA或miRNA。在一些实施方案中，所述MYXV进一步包含编码非病毒分子的核酸。在一些实施方案中，所述非病毒分子是肿瘤坏死因子α(TNFα)。在一些实施方案中，所述TNFα是人TNFα。在一些实施方案中，所述TNFα是可溶性肽。在一些实施方案中，所述TNFα是膜结合肽或表面结合肽。在一些实施方案中，所述TNFα通过激活抗肿瘤免疫细胞或诱导癌细胞死亡进一步增强所述MYXV的抗癌活性。在一些实施方案中，所述非病毒分子是白介素-12(IL-12)。在一些实施方案中，所述IL-12是人IL 12。在一些实施方案中，所述IL-12是可溶性肽。在一些实施方案中，所述IL-12是膜结合肽或表面结合肽。在一些实施方案中，所述IL-12通过促进免疫细胞分化或引发免疫细胞细胞毒性进一步增强所述MYXV的抗癌活性。在一些实施方案中，所述IL-12包含IL-12α亚基和IL-12β亚基。在一些实施方案中，所述IL-12α亚基和所述IL-12β亚基通过多肽接头接合。在一些实施方案中，所述多肽接头是弹性蛋白接头。在一些实施方案中，所述非病毒分子是饰胶蛋白聚糖。在一些实施方案中，所述饰胶蛋白聚糖是人饰胶蛋白聚糖。在一些实施方案中，所述饰胶蛋白聚糖是可溶性肽。在一些实施方案中，所述饰胶蛋白聚糖是膜结合肽或表面结合肽。在一些实施方案中，所述饰胶蛋白聚糖通过阻断或降低TGF-β信号传导进一步增强所述MYXV的抗癌活性。在一些实施方案中，所述核酸编码选自TNFα、IL-12和饰胶蛋白聚糖的至少两种分子。在一些实施方案中，所述核酸编码TNFα、IL-12和饰胶蛋白聚糖。在一些实施方案中，所述MYXV来源于洛桑(Lausanne)毒株。

在一些方面，本文公开了组合物，其包含如以上实施方案中任一项所述的MYXV，和药学上可接受的载体或赋形剂。

在一些实施方案中，将所述组合物配制用于全身施用。在一些实施方案中，将所述组合物配制用于局部施用。在一些实施方案中，将所述组合物配制用于肠胃外施用。

在一些方面，本文公开了组合物，其包含通过如以上实施方案中任一项所述的MYXV离体处理的多种细胞，其中所述多种细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓(BM)细胞或其组合。

在一些方面，本文公开了在有需要的对象中抑制、减轻或预防癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用如以上实施方案中任一项所述的MYXV或组合物。

在一些实施方案中，所述对象患有癌症、疑似患有癌症或有患上癌症的风险，并且其中所述方法进一步包括选择所述对象。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述施用是全身施用。在一些实施方案中，所述施用降低癌细胞活力，或激活所述癌症中的免疫原性细胞死亡。在一些实施方案中，所述施用改善对象的存活。在一些实施方案中，所述癌症包括实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是骨肉瘤、三阴性乳腺癌或黑素瘤。在一些实施方案中，所述癌症已经转移至对象中的某一位置。在一些实施方案中，所述位置包括所述对象的肺、脑、肝脏和/或淋巴结。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述对象施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是免疫检查点调节剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂在施用所述组合物之前施用至所述对象。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂在施用所述组合物之后施用至所述对象。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂作为与所述组合物的组合施用至所述对象。在一些实施方案中，将包含所述多种细胞的所述组合物施用至所述对象，其中所述多种细胞包括对于所述对象为自体的细胞。在一些实施方案中，将包含所述多种细胞的所述组合物施用至所述对象，其中所述多种细胞包括对于所述对象为同种异体的细胞。

在一些方面，本文公开了重组核酸，其包含MYXV基因组的至少一部分，其中所述MYXV基因组被修饰以降低M153基因的表达。在一些实施方案中，所述重组核酸包括DNA。在一些实施方案中，MYXV基因组的所述部分被修饰以敲除MYXV基因组的所述部分中M153基因的至少一部分。在一些实施方案中，所述重组MYXV基因组包含编码TNFα的第一核酸。在一些实施方案中，所述TNFα是人TNFα。在一些实施方案中，所述第一核酸替换或邻接所述MYXV基因组的M135R基因。在一些实施方案中，将所述第一核酸插入在所述MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间。在一些实施方案中，所述第一核酸的表达由痘病毒合成早期/晚期(sE/L)启动子驱动。在一些实施方案中，所述重组MYXV基因组包含编码白介素-12亚基α(IL-12α)的第二核酸。在一些实施方案中，所述IL-12α是人IL-12α。在一些实施方案中，IL-12α的表达由内部核糖体进入位点(IRES)驱动。在一些实施方案中，所述第二核酸IL-12α破坏所述MYXV基因组的M153基因的表达。在一些实施方案中，所述重组MYXV基因组包含编码白介素-12亚基β(IL-12β)的第三核酸。在一些实施方案中，所述IL-12β是人IL-12β。在一些实施方案中，所述第三核酸的表达由sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，所述第三核酸破坏所述MYXV基因组的M153基因的表达。在一些实施方案中，所述重组MYXV基因组包含编码饰胶蛋白聚糖的第四核酸。

在一些实施方案中，所述饰胶蛋白聚糖是人饰胶蛋白聚糖。在一些实施方案中，所述第四核酸的表达由sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，所述第四核酸破坏所述MYXV基因组的M153基因的表达。在一些实施方案中，所述重组MYXV基因组进一步包含编码报告标签的第五核酸。在一些实施方案中，所述报告标签包括绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方案中，所述第五核酸的表达由sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，所述重组核酸进一步包含编码第二报告标签的第六核酸。在一些实施方案中，所述第二报告标签包括红色荧光蛋白(RFP)。在一些实施方案中，所述第六核酸的表达由痘病毒P11晚期启动子驱动。在一些实施方案中，所述重组核酸包含vMyx-hTNFa盒，任选地包含GFP。在一些实施方案中，所述重组核酸包含hDecorin-hIL-12盒，任选地包含dsRed。在一些实施方案中，所述重组核酸包含vMyx-hTNFa-hDecorin-hIL-12-M153KO(vMyx-三重)盒或由其组成，任选地包含dsRed和/或GFP。

在一些方面，本文公开了重组MYXV，其包含如以上实施方案中任一项所述的重组核酸。

在一些方面，本文公开了在有需要的对象中抑制、减轻或预防癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用如前述实施方案中任一项所述的重组核酸或重组MYXV。

在一些实施方案中，所述对象患有癌症、疑似患有癌症或有患上癌症的风险，并且其中所述方法进一步包括选择所述对象。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述施用是全身施用。在一些实施方案中，所述施用降低细胞活力，或激活所述癌症中的免疫原性细胞死亡。在一些实施方案中，所述施用以有效增加所述对象的PBMC中的至少两种细胞因子的表达的剂量和时间表进行。在一些实施方案中，所述施用以有效增加所述对象中的癌细胞中的至少两种细胞因子的表达的剂量和时间表进行。在一些实施方案中，所述至少两种细胞因子包括IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12或TNF-α。在一些实施方案中，所述施用以有效将所述癌症的体积减少至少10％的剂量和时间表进行。在一些实施方案中，其中所述施用以有效将所述癌症的生长减少至少10％的剂量和时间表进行。

在一些方面，本文公开了具有增强的抗癌活性的黏液瘤病毒(MYXV)，其中所述MYXV被基因工程化以减弱其M153蛋白的活性或表达水平。

在一些实施方案中，将所述M153蛋白的活性或表达水平减弱至少80％。在一些实施方案中，所述MYXV被工程化以在编码M153蛋白的核酸中引入突变，其中所述突变包括插入、缺失或置换突变。在一些实施方案中，MYXV基因组中编码所述M153蛋白的核酸的至少一部分被敲除。在一些实施方案中，所述MYXV包含靶向M153转录物的抑制性分子，从而减弱M153蛋白表达，其中所述抑制性分子包括dsRNA、siRNA、反义RNA或miRNA。在一些实施方案中，所述MYXV进一步被基因工程化以表达非病毒分子。在一些实施方案中，所述非病毒分子是细胞因子或细胞基质蛋白。在一些实施方案中，所述非病毒分子是肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-12亚基α(IL-12α)、白介素-12亚基β(IL-12β)或饰胶蛋白聚糖。在一些实施方案中，所述非病毒分子是人的蛋白质。在一些实施方案中，所述MYXV表达选自以下的至少两种非病毒分子：TNFα、IL 12α、IL-12β和饰胶蛋白聚糖。

在一些方面，本文公开了组合物，其包含通过MYXV离体处理的多种细胞，其中所述MYXV被基因工程化以减弱其M153蛋白的活性或表达水平，并且以表达非病毒分子。

在一些实施方案中，所述多种细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓(BM)细胞或其组合。

在一些方面，本文公开了重组核酸，其包含MYXV基因组的至少一部分，其中所述MYXV基因组的所述部分被修饰以降低M153基因的表达。

在一些实施方案中，MYXV基因组的所述部分被修饰以敲除MYXV基因组的所述部分中M153基因的至少一部分。在一些实施方案中，所述重组核酸包含编码非病毒分子的核酸。在一些实施方案中，所述非病毒分子是人TNFα、人IL-12α(hTNFα)、人IL-12β或人饰胶蛋白聚糖。在一些实施方案中，编码所述非病毒分子的所述核酸包含vMyx-hTNFα盒，并且编码所述非病毒分子的所述核酸替换或邻接所述MYXV基因组的M135R基因。在一些实施方案中，编码所述非病毒分子的所述核酸包含vMyx-hTNFα盒，并且将编码所述非病毒分子的所述核酸插入在所述MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间。在一些实施方案中，编码所述非病毒分子的所述核酸包含hDecorin-hIL-12盒，并且编码所述非病毒分子的所述核酸替换所述MYXV基因组的M153基因的至少一部分。在一些实施方案中，编码所述非病毒分子的所述核酸包含vMyx-hTNFα-hDecorin-hIL-12-M153KO(vMyx-三重)盒。

在一些方面，本文公开了在有需要的对象中抑制、减轻或预防癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用MYXV或经所述MYXV处理的多种细胞，其中所述MYXV被基因工程化以减弱其M153蛋白的活性或表达水平。

在一些实施方案中，所述MYXV进一步被基因工程化以表达非病毒分子。在一些实施方案中，所述非病毒分子是肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-12亚基α(IL-12α)、白介素-12亚基β(IL-12β)或饰胶蛋白聚糖。在一些实施方案中，所述MYXV或所述多种细胞通过全身施用来施用。在一些实施方案中，所述施用降低肿瘤细胞活力，或激活所述癌症中的免疫原性细胞死亡。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤、骨肉瘤、三阴性乳腺癌或黑素瘤。在一些实施方案中，所述癌症已经转移至所述对象中的肺、脑、肝脏或淋巴结。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述对象施用免疫检查点调节剂。在一些实施方案中，所述施用以有效增加所述对象的PBMC或癌细胞中的至少两种细胞因子的表达的剂量和时间表进行，其中所述至少两种细胞因子包括IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12或TNF-α。在一些实施方案中，所述施用以有效将所述癌症的体积减少至少10％的剂量和时间表进行。

在一些实施方案中，将所述M153蛋白的活性或表达水平减弱至少80％。在一些实施方案中，所述MYXV被工程化以在编码M153蛋白的核酸中引入突变，其中所述突变包括插入、缺失或置换突变。在一些实施方案中，MYXV基因组中编码所述M153蛋白的核酸的至少一部分被敲除。在一些实施方案中，所述MYXV包含靶向M153转录物的抑制性分子，从而减弱M153蛋白表达，其中所述抑制性分子包括dsRNA、siRNA、反义RNA或miRNA。在一些实施方案中，所述MYXV进一步包含编码非病毒分子的核酸。在一些实施方案中，所述非病毒分子是肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-12亚基α(IL-12α)、白介素-12亚基β(IL-12β)或饰胶蛋白聚糖。在一些实施方案中，所述非病毒分子是人的蛋白质。在一些实施方案中，所述核酸编码选自以下的至少两种非病毒分子：TNFα、IL 12α、IL-12β和饰胶蛋白聚糖。

在一些方面，本文公开了组合物，其包含通过MYXV离体处理的多种细胞，其中所述MYXV被基因工程化以减弱其M153蛋白的活性或表达水平，并且其中所述多种细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓(BM)细胞或其组合。

在一些实施方案中，所述组合物是用于在有需要的对象中抑制、减轻或预防癌症，其中所述多种细胞包括对所述对象为自体的细胞。在一些实施方案中，所述组合物是用于在有需要的对象中抑制、减轻或预防癌症，其中所述多种细胞包括对所述对象为同种异体的细胞。

在一些方面，本文公开了用于在有需要的对象中抑制、减轻或预防癌症的MYXV，其中所述MYXV被基因工程化以减弱其M153蛋白的活性或表达水平。

在一些实施方案中，将所述MYXV通过全身施用而施用至所述对象。在一些实施方案中，所述MYXV降低癌细胞活力，或激活所述癌症中的免疫原性细胞死亡。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤、骨肉瘤、三阴性乳腺癌或黑素瘤。在一些实施方案中，所述癌症已经转移至所述对象中的肺、脑、肝脏或淋巴结。在一些实施方案中，将MYXV与免疫检查点调节剂一起施用至所述对象。在一些实施方案中，所述MYXV以有效增加所述对象的PBMC或癌细胞中的至少两种细胞因子的表达的剂量和时间表施用，其中所述至少两种细胞因子包括IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12或TNF-α。在一些实施方案中，所述MYXV以有效将所述癌症的体积减少至少10％的剂量和时间表施用。

在一些方面，本文公开了重组核酸，其包含MYXV基因组的至少一部分，其中所述MYXV基因组的所述部分被修饰以降低M153的表达。

在一些实施方案中，MYXV基因组的所述部分被修饰以敲除MYXV基因组的所述部分中M153基因的至少一部分。在一些实施方案中，所述重组核酸包含编码非病毒分子的核酸。在一些实施方案中，所述非病毒分子是肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-12亚基α(IL-12α)、白介素-12亚基β(IL-12β)或饰胶蛋白聚糖。在一些实施方案中，所述非病毒分子是人的蛋白质。在一些实施方案中，将编码所述非病毒分子的所述核酸插入在所述MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间。在一些实施方案中，将编码所述非病毒分子的所述核酸插入以替换所述MYXV基因组的M153基因的至少一部分。在一些实施方案中，编码所述非病毒分子的所述核酸包含vMyx-hTNFα盒，任选地包含GFP，并且编码所述非病毒分子的所述核酸替换或邻接所述MYXV基因组的M135R基因。在一些实施方案中，编码所述非病毒分子的所述核酸包含vMyx-hTNFα盒，并且将编码所述非病毒分子的所述核酸插入在所述MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间。在一些实施方案中，编码所述非病毒分子的所述核酸包含hDecorin-hIL-12盒，任选地包含dsRed，并且编码所述非病毒分子的所述核酸替换所述MYXV基因组的M153基因的至少一部分。在一些实施方案中，编码所述非病毒分子的所述核酸包含vMyx-hTNFα-hDecorin-hIL-12-M153KO(vMyx-三重)盒，任选地包含dsRed。

附图说明

本发明的某些实施方案的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明的原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些附图中：

图1A是示出了可以用于产生本文公开的黏液瘤病毒(MYXV)的重组核酸的构建的示意图。顶部图像描绘了包含vMyx-hTNFa-GFP盒和M153基因座的重组核酸。重组核酸可以存在于本公开的MYXV，例如vMyx-hTNFa-GFP病毒的基因组中。中间图像示出了重组核酸，其包含hDecorin-hIL-12-dsRed盒和对应于侧接MYXV基因组中的M153基因的序列的侧接序列(M152和M154)。此重组核酸可以存在于重组质粒中，可以将所述重组质粒引入至MYXV中以产生经修饰的重组病毒。底部图像示出了经修饰的vMyx-三重重组核酸。重组核酸可以存在于本公开的MYXV的基因组中。例如，可以将中间图像中描绘的重组质粒引入至MYXV中(例如，通过用vMyx-hTNFa-GFP病毒感染RK13细胞，并且用重组质粒转染细胞)。可以发生重组以产生vMyx-三重重组核酸。可以基于选择标记物，例如dsRed，鉴定出并纯化包含vMyx-三重重组核酸的重组病毒。

图1B是重组核酸中M153基因座的示意图，所述基因座可以被修饰为具有突变或转基因插入。可以使用本文公开的方法将具有经修饰的M153基因座的重组核酸引入至MYXV基因组中。

图2A-图2D是示出了重组MYXV构建体的基因控制的琼脂糖凝胶的图像。图2A示出了来自vMyx-三重构建体克隆的基因组病毒DNA，使用引物以确认hDecorin-hIL-12的存在。图2B示出了hTNFa的存在。图2C示出了基因座M153处的修饰和vMyx-三重构建体的纯度。图2D示出了M153的不存在和重组vMyx-三重构建体的纯度。泳道1包括来自MYXV-Lau的DNA或针对hDec-Hil12和hTNF的表达质粒。MM表示已知大小的DNA梯。

图3A-图3C是蛋白质印迹的图像，其示出了vMyx-三重病毒中转基因的蛋白质表达。使用特异性抗体对来自vMyx-三重病毒感染细胞的细胞裂解液和上清液进行蛋白质印迹分析，以确认三个转基因hTNF(图3A)、hDecorin(图3B)和hIL-12(图3C)的蛋白质表达。

图4是示出了重组vMyx-三重病毒的单步生长分析的图。vMyx-三重病毒在RK13细胞的复制能力类似于亲本病毒vMyx-TNF-GFP。MOI＝1。

图5A和图5B是示出了细胞活力测定的结果的图。在两种不同的细胞系中测试vMyx-三重病毒的细胞杀伤能力：CT26(鼠结肠癌)和HELA(人宫颈癌)。将细胞以MOI＝10感染48小时，并且然后进行MTS测定。

图6是示出了通过用野生型MYXV或M153KO MYXV进行的病毒感染诱导的细胞死亡，并且示出了未处理的B16F10细胞(模拟)中的细胞死亡的图。

图7A和图7B是示出了在体外B16F10鼠细胞中通过M153KO MYXV诱导的免疫细胞死亡的图。图7A示出了在感染后(p.i.)不同小时处由多柔比星(阳性对照)、wt MYXV和M153KOMYXV引起的ATP释放。当不存在条(bar)时，ATP的水平低于测定的检测限。图7B示出了针对未处理细胞(模拟)、多柔比星处理的细胞(阳性对照)、M135KO MYXV感染细胞和M153KOMYXV感染细胞的钙网蛋白胞外表达的定量表示。数据基于处理后36小时拍摄的共聚焦图像定量了每个细胞的胞外表达，其中将信号针对表示每个细胞的核染色(DAPI)归一化。

图8是示出了当在以下情况下时转移性黑素瘤小鼠模型(B16F10)中的存活曲线的图：小鼠未治疗(对照；中间线)、用M153KO MYXV进行治疗(153KO；延伸至右侧的线)或用作为第二对照的M135KO MYXV进行治疗(M135KO；左侧线)。p.i.天数＝植入后的天数。

图9A-图9D示出了用本公开的MYXV感染的Vero细胞的上清液中细胞因子的浓度。图9A示出了TNF浓度。图9B示出了饰胶蛋白聚糖浓度。图9C示出了人IL-12浓度。图9D示出了鼠IL-12浓度。当不存在条柱时，分析物的水平低于测定的检测限。

图10A示出了在暴露于用本公开的MYXV感染的Vero细胞的上清液之后L929细胞的活力，这指示了TNF生物活性。

图10B示出了在将HEK Blue IL-12细胞暴露于用本公开的MYXV感染的Vero细胞的上清液之后报告基因的表达。当不存在条柱时，分析物的水平低于测定的检测限。

图11A示出了来自人急性髓性白血病患者的细胞在与vMyx-GFP一起孵育6天之后的活力。

图11B示出了来自人急性髓性白血病患者的细胞在与vMyx-三重一起孵育6天之后的活力。

图12A示出了在感染后4小时，用所指示的MYXV以10MOI感染的人PBMC的上清液中细胞因子的浓度。绘制了平均值+/-SD。当不存在条柱时，分析物的水平低于测定的检测限。

图12B示出了在感染后16小时，用所指示的MYXV以10MOI感染的人PBMC的上清液中细胞因子的浓度。绘制了平均值+/-SD。当不存在条柱时，分析物的水平低于测定的检测限。

图13A绘制了在用所指示剂量的vMyx-三重每周一次(QW)治疗的免疫缺陷小鼠中NCI-H1971(肺癌)异种移植肿瘤随时间的体积。

图13B绘制了在用所指示剂量的vMyx-三重每周一次(QW)、每4天一次(Q4D)或每2天一次(Q2D)治疗的免疫缺陷小鼠中A673(肉瘤)异种移植肿瘤随时间的体积。

图13C绘制了在用所指示剂量的vMyx-三重每周一次(QW)、每4天一次(Q4D)或每2天一次(Q2D)治疗的免疫缺陷小鼠中SJSA(肉瘤)异种移植肿瘤随时间的体积。

图14A示出了在来自带有SJSA-1肿瘤的免疫缺陷小鼠的血清和肿瘤组织中检测到的IL-12和TNF-α的浓度。将小鼠用vMyx-三重经由静脉内(IV)或肿瘤内(IT)途径进行治疗，并且在治疗后4小时(4H)或24小时(24H)收集样品。绘制了平均值±SD。当不存在条柱时，分析物的水平低于测定的检测限。

图14B示出了在来自带有A673肿瘤的免疫缺陷小鼠的血清和肿瘤组织中检测到的IL-12和TNF-α的浓度。将小鼠用vMyx三重经由静脉内(IV)或肿瘤内(IT)途径进行治疗，并且在治疗后4小时(4H)或24小时(24H)收集样品。绘制了平均值±SD。当不存在条柱时，分析物的水平低于测定的检测限。

图15绘制了针对C57BL/6小鼠的随时间的肿瘤体积，所述小鼠植入有B16-F10小鼠黑素瘤细胞，并且用敲除了M153和M135的TNF表达MYXV(TNF135/153KO)或具有两个基因的野生型拷贝的TNF表达MYXV(TNF135/153WT)进行治疗。

图16A和图16B绘制了针对植入有MC38小鼠结肠直肠癌细胞的C57BL/6小鼠的随时间的肿瘤体积和存活。将动物用所指示的黏液瘤病毒经由2x10⁷FFU/剂量的肿瘤内(IT)注射进行治疗，每4天一次，共四个剂量。小鼠三重(msTriple)低是指表达相对低水平的鼠IL-12而非人IL-12的vMyx-三重。小鼠三重高是指表达相对较高水平的鼠IL-12的vMyx-三重。小鼠三重病毒还表达人饰胶蛋白聚糖和TNF，并且敲除了M153基因。GFP是指vMyx-GFP，其不编码任一种所述细胞因子，并且含有完整M153基因。每周三次记录肿瘤体积测量，并且绘制在图16A中。存活绘制在图16B中。

图17A和图17B绘制了针对植入有B16-F10小鼠黑素瘤细胞的C57BL/6小鼠的随时间的肿瘤体积和存活。在第1天和第8天将动物用所指示的黏液瘤病毒经由2x10⁷FFU/剂量的肿瘤内注射进行治疗。小鼠三重低是指表达相对低水平的鼠IL-12而非人IL-12的vMyx-三重。小鼠三重高是指表达相对较高水平的鼠IL-12的vMyx-三重。小鼠三重病毒还表达人饰胶蛋白聚糖和TNF，并且敲除了M153基因。GFP是指vMyx-GFP，其不编码任一种所述细胞因子，并且含有完整M153基因。每周三次记录肿瘤体积测量，并且绘制在图17A中。存活绘制在图17B中。

图18A绘制了针对C57BL/6小鼠的随时间的肿瘤体积，所述小鼠植入有B16-F10小鼠黑素瘤细胞，并且用所指示剂量的小鼠三重高(即表达相对高水平的鼠IL-12、也表达人饰胶蛋白聚糖和人TNF并且敲除了M153基因的MYXV)进行治疗。将病毒肿瘤内(IT)或静脉内(IV)施用。

图18B绘制了针对Balb/c小鼠的随时间的肿瘤体积，所述小鼠植入有CT26小鼠结肠直肠癌细胞，并且用所指示剂量的小鼠三重高进行治疗。将病毒肿瘤内(IT)或静脉内(IV)施用。

图19展示了植入有K7M2肉瘤细胞的Balb/c小鼠的存活曲线。将各组小鼠经由向眶后窦中注射2x10⁷FFU/剂量的vMyx-小鼠三重(低IL-12)，和/或通过腹膜内注射10mg/kg的抗PD-1或抗PD-L1抗体进行治疗。

图20A绘制了植入有MC38小鼠结肠直肠癌细胞的C57BL/6小鼠的随时间的肿瘤体积。在随机化后第1天和第8天将各组的动物经由肿瘤内注射2x10⁷FFU/剂量的vMyx-小鼠三重(低IL-12)，和/或用10mg/kg的抗PD-1抗体进行治疗，每四天一次，共四个剂量。通过实体线连接的圆圈：媒介物治疗的；正方形：单独的vMyx-小鼠三重；带有虚线的圆圈：抗PD-1；三角形：vMyx-小鼠三重和抗PD-1的组合。

图20B描绘了图20A中各组的存活。

具体实施方式

本文描述了溶瘤病毒，尤其是溶瘤痘病毒诸如溶瘤黏液瘤病毒。黏液瘤病毒可以在本文中称为MYXV或vMyx。在一些实施方案中，MYXV被基因工程化以减弱活性或表达水平，被工程化以灭活、破坏或减弱M153基因或蛋白的表达，例如被基因工程化以减弱M153基因或蛋白的活性或表达水平。当与未经修饰的MYXV(含有完整野生型M153基因的MYXV)或具有另一基因座处的修饰的MYXV进行比较时，如本文所述的对黏液瘤病毒的修饰意料不到地改善了MYXV的溶瘤活性。除了M153基因座处的修饰之外，MYXV也可以包含编码非病毒分子诸如TNFα、IL-12和/或饰胶蛋白聚糖的一个或多个转基因以进一步增强溶瘤活性、增加抗肿瘤免疫应答或降低MYXV的不良副作用。

一些实施方案涉及装配有三重转基因的溶瘤病毒(诸如MYXV)及其用于治疗癌症(诸如转移性癌症)的方法。一些实施方案包括重组MYXV构建体，其表达3个人转基因：改善对转移至肺或身体的其他部位的癌症的治疗功效的人细胞因子(hTNF)、可以扩增抗肿瘤免疫应答的hIL-12和阻断肿瘤床内的TGF-β信号传导的人饰胶蛋白聚糖(hDecorin)。在一些实施方案中，在此所公开的病毒具有黏液瘤病毒M153基因或其至少一部分的敲除(例如，缺失或破坏)，这在一些实施方案中还改善采用这些病毒构建体的疗法后的抗肿瘤免疫应答。一些实施方案涉及编码MYXV的核酸构建体诸如病毒三重转基因构建体。在一些实施方案中，转基因和对MYXV的其他修饰改善癌症疗法的功效。

定义

本文使用的章节标题仅用于组织的目的，不应当解释为限制所描述的主题。

以下术语解释仅出于描述特定实施方案和实施例的目的而提供，并不旨在进行限制。

如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”旨在还包括复数形式。

如本文所用，术语“和/或”是指并涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代(“或”)解释时缺少的组合。

如本文所用，“一个或多个”或至少一个可表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多，最多为任何数目。

“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生期望效果的本发明化合物或组合物的量，该期望效果可以是治疗效果和/或有益效果。

“有需要的对象”或“需要......的对象”是已知或疑似患有疾病或病况(诸如癌症)的对象。

如本文所用，术语“抑制或治疗疾病”是指抑制疾病或病况的完全发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其体征或症状的治疗性干预。关于疾病或病理状况，术语“改善”是指任何可观察到的治疗的有益作用。可以通过例如在易受感染对象中疾病的临床症状发作延迟、疾病的一些或全部临床症状的严重程度降低、疾病的进展(诸如转移)较慢、对象整体健康或生活质量的改善或通过本领域公知的对特定疾病特异的其他参数来证明有益效果。“预防性”治疗是向不表现出疾病体征或仅表现出早期体征的对象施用的治疗，以降低发展成病理学例如转移性癌症的风险。

MYXV可以感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞。如本文所用，具有“先天性抗病毒应答缺陷”是指当暴露于病毒或被病毒侵袭时不诱导抗病毒防御机制的细胞，该机制可包括抑制病毒复制、干扰素产生、干扰素反应途径的诱导和凋亡。该术语包括与正常细胞(例如，未感染或非癌细胞)相比，在暴露于病毒或被病毒感染后具有降低的或有缺陷的先天性抗病毒应答的细胞，诸如癌细胞。这包括对干扰素无反应的细胞，以及凋亡反应或诱导的凋亡途径减少或有缺陷的细胞。该缺陷可能由多种原因引起，包括感染、遗传缺陷或环境应激。然而，将理解的是，当缺陷由预先存在的感染引起时，MYXV的过度感染可以被排除，并且技术人员可容易地识别出这种情况。本领域技术人员可以无需过多的实验容易地确定任何给定的细胞类型是否具有先天性抗病毒应答缺陷并且因此易受MYXV的感染。因此，在某些实施方案中，MYXV能够感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞。在某些实施方案中，细胞对干扰素无应答。在具体实施方案中，细胞是哺乳动物癌细胞。在某些实施方案中，细胞是人癌细胞，包括人实体瘤细胞。在某些实施方案中，具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞包括癌细胞。

工程化黏液瘤病毒

在某些实施方案中，本文公开了黏液瘤病毒(MYXV)。MYXV可以包括MYXV的野生型毒株或者它可以包括MYXV的经基因修饰的毒株。在一些实施方案中，MYXV包括洛桑毒株。在一些实施方案中，MYXV的洛桑毒株包括于2019年7月11日公开的GenBank登录号AF170726.2。

在一些情况下，MYXV包括在南美棉尾兔(Sylvilagus brasiliensis)中传播的南美MYXV毒株。在一些情况下，MYXV包括在丛毛棉尾兔(Sylvilagus bachmani)中传播的加利福尼亚MYXV毒株。在一些情况下，MYXV包括6918，即包含基因M009L、M036L、M135R和M148R中的修饰的减毒西班牙野生毒株(例如，于2019年7月11日公开的GenBank登录号EU552530)。在一些情况下，MYXV包括6918VP60-T2(于2019年7月11日公开的GenBank登录号EU552531)。在一些情况下，MYXV包含标准实验室毒株(SLS)。在一些实施方案中，MYXV包含如本文所述的核酸构建体或MYXV基因组。

在一些情况下，MYXV包含与以下文献中公开的序列的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，诸如在95％与98％、95％与99％之间(包括90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的核酸序列同一性：Cameron等人,“The complete DNA sequence of MyxomaVirus,”Virology 264:298-318(1999)，将该文献针对此类公开内容通过引用并入。在一些情况下，MYXV包含以下文献中公开的序列：Cameron等人,“The complete DNA sequence ofMyxoma Virus,”Virology 264:298-318(1999)。

在一些实施方案中，MYXV被工程化以灭活病毒基因或蛋白，或者减弱病毒基因或蛋白的活性或表达水平。在一些实施方案中，病毒基因或蛋白是M153。在一些实施方案中，相对于野生型MYXV、或相对于未灭活且未减弱病毒基因或蛋白的活性或表达水平的MYXV(例如，包含野生型M153基因和/或表达野生型M153蛋白的MYXV)，灭活病毒基因或蛋白或者减弱病毒基因或蛋白的活性或表达水平导致MYXV表现出增强的抗癌活性。在一些实施方案中，MYXV被工程化以灭活超过一种病毒基因或蛋白，或者减弱超过一种病毒基因或蛋白的活性或表达水平。

在一些实施方案中，MYXV包含编码非病毒分子的核酸，例如编码细胞因子的转基因。在一些实施方案中，MYXV包含转基因，诸如本文所述的转基因。在一些实施方案中，转基因编码肿瘤坏死因子(TNF，例如TNFα)、白介素-12(IL-12)或饰胶蛋白聚糖。在一些实施方案中，MYXV包含一个、两个、三个或更多个转基因。在一些实施方案中，将一个或多个转基因敲入至MYXV基因组中。在一些实施方案中，转基因破坏MYXV基因组中的基因，例如将转基因插入在MYXV基因组中的基因内或替换所述基因的一部分，从而破坏所述基因和/或它编码的蛋白质的表达。这种破坏可以称为敲除(KO)。

MYXV可以被修饰以产生增强MYXV的抗癌功效的任何非病毒分子(例如，被修饰以携带任何转基因)。这种非病毒分子可以参与触发细胞凋亡，或靶向用于免疫破坏的感染细胞，诸如刺激对干扰素的应答(例如，修复对干扰素的应答的缺乏)、或导致刺激抗体应答的细胞表面标记物(诸如病原体相关分子模式，例如细菌细胞表面抗原)的表达的非病毒分子。MYXV也可以被修饰以产生参与切断赘生细胞或癌细胞增殖和生长从而防止细胞分裂的非病毒分子。在一些实施方案中，MYXV被修饰以产生治疗性非病毒分子，诸如参与化学治疗剂的合成的分子，或者它可以被修饰以在待抑制或杀伤的细胞所衍生自的特定物种的细胞(例如，人细胞)中具有增加的复制水平。

在一些实施方案中，MYXV包含重组构建体，其编码或表达一种、两种或三种独立的非病毒分子，例如，人转基因(例如，人TNF、人饰胶蛋白聚糖和人IL-12)。在一些实施方案中，重组构建体进一步编码或表达一种或多种报告标签，例如，荧光蛋白诸如eGFP和dsRed。

在一些实施方案中，MYXV被基因工程化以减弱其M153基因或蛋白的活性或表达水平，例如，包含病毒M153基因的破坏(M153-敲除：M153KO)。在一些实施方案中，减弱M153的活性或表达水平改善针对病毒感染癌细胞的MHC依赖性抗肿瘤免疫应答。在一些实施方案中，MYXV包括用于在治疗癌症中使用的溶瘤病毒。一些实施方案将M153KO骨架与本文公开的转基因的免疫增强特性相组合以增强MYXV的溶瘤特性。

在一些实施方案中，MYXV编码TNF(例如，TNFα)转基因、IL-12转基因、饰胶蛋白聚糖转基因或这些中的两个或更多个的任何组合。在一些实施方案中，MYXV包含TNF(例如，TNFα)转基因、IL-12转基因和饰胶蛋白聚糖转基因。在一些此类实施方案中，在将这种MYXV施用至对象后，TNF激活并且起动抗肿瘤免疫系统的先天性和获得性臂，并且以旁观者旁分泌样方式促进癌细胞死亡。在一些实施方案中，IL-12扩增所得的抗癌先天性和适应性免疫应答。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖中断由TGF-β介导的局部免疫抑制作用，从而增强TNF和IL-12两者的作用并且促进抗癌免疫应答。在一些实施方案中，三个转基因的协同作用加上MYXV在肿瘤微环境(TME)中的效应增加了溶瘤MYXV载体的免疫治疗性潜力。在一些实施方案中，向MYXV基因组添加编码非病毒分子(hTNF、hIL-12和/或hDecorin)的人转基因改善了MYXV在肿瘤微环境(TME)中触发稳健的抗肿瘤免疫应答的能力。

在一些实施方案中，MYXV被修饰以增强检测感染状态的容易性。例如，MYXV可以被基因修饰以表达可以通过相位差显微术、荧光显微术或通过放射成像容易地检测到标记物。标记物可以是参与比色或放射标记反应的所表达的荧光蛋白或所表达的酶。在一些实施方案中，标记物包括中断或抑制测试细胞的特定功能的基因产物。

在一些实施方案中，工程化MYXV包含荧光蛋白。示例性荧光蛋白包括蓝色/UV蛋白诸如TagBFP、Azurite、Sirus或Sapphire；青色蛋白诸如ECFP、cerulean或mTurquoise；绿色蛋白诸如绿色荧光蛋白(GFP)、Emerald、mUKG、mWasabi或Clover；黄色蛋白诸如EYFP、citrine、venus或SYFP2；橙色蛋白诸如单体Kusabira-Orange、mKO2或mOrange；红色蛋白诸如dsRed、mRaspberrym mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、mApple或mRuby；光活化蛋白诸如PA-GFP、PAmCherry1或PATagRFP；以及光转换蛋白诸如Dropna。在一些实施方案中，MYXV包含超过一种荧光蛋白。在一些实施方案中，工程化MYXV不编码荧光蛋白。

在一些实施方案中，MYXV包含vMyx-hTNFa-GFP-hDecorin-hIL-12-dsRed-M153KO(vMyx-三重或vMyx-三重-红色)构建体，并且是vMyx-三重病毒。在一些实施方案中，MYXV包含vMyx-hTNFa-GFP-hDecorin-hIL-12-M153KO(vMyx-三重-白色)构建体，并且是vMyx-三重-白色病毒。

在一些实施方案中，MYXV包含在与兔细胞向性相关的一个或多个基因处或附近的修饰。在一些情况下，一个或多个与兔细胞向性相关的基因包括M11L、M063、M135R、M136R、M-T2、M-T4、M-T5或M-T7。在一些情况下，一个或多个与兔细胞向性相关的基因包括M135R、M136R或其组合。

可以使用本领域已知的标准技术制备MYXV。例如，病毒可以通过以下来制备：通过待使用的MYXV毒株感染培养的兔细胞或永生化的人类或灵长类动物允许细胞，从而允许感染进展，使得病毒在培养的细胞中复制，并且可通过本领域已知的破坏细胞表面的标准方法释放，从而释放病毒颗粒用于收获。一旦收获，病毒滴度可通过感染兔细胞的汇合菌苔并进行菌斑试验来确定。

M153修饰

M153基因产物是可以参与不同细胞受体和蛋白质的下调，例如人细胞中MHC I类和CD4的降解的E3-泛素连接酶。在一些实施方案中，本公开的MYXV具有M153蛋白的减弱的活性和/或表达水平。在一些实施方案中，M153蛋白的减弱的活性和/或表达水平可以增强免疫表位的呈递，例如病毒和/或癌症免疫肽的MHC依赖性呈递。被感染的癌细胞对免疫表位的增强呈递可以引发更强的免疫应答，包括抗癌T细胞应答，诸如抗癌CD8+ T细胞应答。在一些实施方案中，M153蛋白的减弱的活性和/或表达水平增加经由MHC-I的来自M153KO病毒感染肿瘤细胞的直接抗原呈递，并且增强由MYXV介导的免疫激活。

在一些实施方案中，MYXV包含M153基因的修饰。在一些情况下，修饰是减弱由M153基因编码的蛋白质的活性或表达水平(例如，损害由M153基因编码的蛋白质的功能)的突变。

在一些情况下，突变是缺失，例如减弱由M153基因编码的蛋白质的活性或表达水平的缺失。在一些实施方案中，突变是M153基因的核酸序列的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的缺失。在一些实施方案中，突变是整个M153基因的缺失。在一些情况下，修饰是M153基因的核酸序列的部分缺失，例如约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的缺失。在一些实施方案中，缺失是至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少7、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少100、至少200或至少300个核酸的缺失。在一些实施方案中，缺失破坏启动子(例如，驱动野生型MYXV中M153的表达的启动子)。在一些实施方案中，缺失将终止密码子引入至M153基因序列中，例如，防止全长M153转录物和/或蛋白的表达的提前终止密码子。

在一些情况下，突变是插入，例如，减弱由M153基因编码的蛋白质的活性或表达水平的插入。在一些实施方案中，插入包含编码非病毒分子的转基因，例如，编码TNF、饰胶蛋白聚糖、IL-12或其组合的转基因。在一些实施方案中，插入包含两个转基因。在一些实施方案中，插入包含三个转基因。转基因可以破坏(例如，中断)病毒M153基因并且减弱M153转录物和/或蛋白的活性或表达水平。在一些实施方案中，插入包含编码TNF的转基因。在一些实施方案中，插入包含编码IL-12的转基因。在一些实施方案中，插入包含编码饰胶蛋白聚糖的转基因。在一些实施方案中，插入包含编码TNF的转基因和编码IL-12的转基因。在一些实施方案中，插入包含编码TNF的转基因和编码饰胶蛋白聚糖的转基因。在一些实施方案中，插入包含编码IL-12的转基因和编码饰胶蛋白聚糖的转基因。在一些实施方案中，插入包含编码TNF的转基因、编码IL-12的转基因和编码饰胶蛋白聚糖的转基因。在一些实施方案中，插入包含一个或多个启动子。在一些实施方案中，插入会破坏启动子(例如，驱动野生型MYXV中M153的表达的启动子)。在一些实施方案中，将M153基因破坏与转基因表达相结合改善所得重组病毒的抗肿瘤特性。

在一些实施方案中，插入是至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少7、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1500或至少2000个核酸的插入。

在一些实施方案中，插入将终止密码子引入至M153基因序列中，例如，防止全长M153转录物和/或蛋白的表达的提前终止密码子。在一些实施方案中，插入改变M153基因序列的阅读框，从而破坏M153转录物和/或蛋白的表达。

在一些情况下，突变是置换，例如减弱由M153基因编码的蛋白质的活性或表达水平的置换。在一些实施方案中，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少7、至少10、至少20、至少30个核酸被置换。在一些实施方案中，置换将终止密码子引入至M153基因序列中，例如，防止全长M153转录物和/或蛋白的表达的提前终止密码子。在一些实施方案中，置换会破坏启动子(例如，驱动野生型MYXV中M153的表达的启动子)。

在一些实施方案中，相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的MYXV，本文公开的修饰或突变将M153基因和/或蛋白的活性水平减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％。

在一些实施方案中，相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的MYXV，本文公开的修饰或突变将M153基因和/或蛋白的表达水平减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％。

在一些实施方案中，相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的MYXV，本文公开MYXV的M153蛋白的活性水平减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％。

在一些实施方案中，相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的MYXV，本文公开MYXV的M153基因和/或蛋白的表达水平减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％。

TNF

在一些实施方案中，MYXV包含(例如，编码)非病毒分子，例如包含编码肿瘤坏死因子(TNF)蛋白的转基因。在一些实施方案中，TNF蛋白是TNFα蛋白。在一些实施方案中，TNFα蛋白是人TNFα蛋白。在一些实施方案中，TNFα蛋白是可溶的。在一些实施方案中，TNFα蛋白是膜或表面结合的。在一些实施方案中，TNFα蛋白通过激活抗肿瘤免疫细胞或诱导癌细胞死亡增强MYXV的抗癌活性。

在一些实施方案中，TNFα由替换或邻接MYXV基因组的M135R基因的基因编码。在一些实施方案中，将TNFα基因插入在MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间。在一些实施方案中，将TNFα基因插入在MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间的基因间区中。在一些实施方案中，TNFα由替换或破坏MYXV基因组的M153基因的基因编码。在一些实施方案中，TNFα基因替换或破坏MYXV基因组的M153基因。

在一些实施方案中，TNFα基因的表达由启动子诸如痘病毒合成早期/晚期(sE/L)启动子驱动。在一些实施方案中，TNFα基因的表达由内部核糖体进入位点(IRES)驱动。TNF是作为先天性炎症性免疫应答的一部分的细胞因子。在一些实施方案中，TNF参与扩增获得性(例如，适应性)免疫应答。TNF可以表达为细胞表面免疫配体并且当在表达转变性蛋白水解酶(诸如TACE)的特定细胞中产生时，它还可以分泌为裂解的可溶性三聚体细胞因子，所述转变性蛋白水解酶催化可溶性配体的裂解和释放，例如在髓样谱系的细胞中以高水平表达。一种TNF效应子途径是通过TNF受体-1(TNFR1)途径诱导细胞死亡。在一些实施方案中，通过TNF对TNFR1途径的诱导导致细胞凋亡或坏死。在一些实施方案中，TNF例如通过激活抗肿瘤CD8⁺ T细胞和NK细胞来激活先天性和适应性免疫应答。

尽管早期希望可溶性TNF的全身施用可以在人类中作为强效抗肿瘤药物起作用，但一些临床试验显示，分泌的细胞因子在用可溶性配体全身性治疗的患者中引起严重的全身性毒性。另外，全身性TNF治疗在临床前报告的患者中未诱导显著的抗肿瘤功效。TNF(例如，TNF的细胞表面膜形式)的病毒来源表达可以通过在肿瘤微环境中引发更大程度的旁观者细胞杀伤来增加局部癌细胞死亡，并且还刺激相同肿瘤床内存在的各种种类的免疫细胞，同时最小化全身性TNF介导的不良毒性作用。

在一些情况下，TNF蛋白包含与于2019年7月3日公开的UniProtKB-P01375中说明的序列(输入版本247)的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白包含与于2019年7月3日公开的UniProtKB-P01375中说明的序列(输入版本247)的在95％与98％或95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白包含与于2019年7月3日公开的UniProtKB-P01375中说明的序列(输入版本247)的约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性。在一些实施方案中，TNF蛋白包含于2019年7月3日公开的UniProtKB-P01375中说明的序列(输入版本247)。

在一些情况下，TNF蛋白包含与UniProtKB-P01375的残基77-233的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白包含与UniProtKB-P01375的残基77-233的在95％与98％或95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白包含与UniProtKB-P01375的残基77-233的约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性。在一些实施方案中，TNF蛋白包含UniProtKB-P01375的残基77-233。

在一些情况下，TNF蛋白由这样的基因编码，所述基因包含与SEQ ID NO:12或SEQID NO:24的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白由这样的基因编码，所述基因包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:24的在95％与98％或95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白由这样的基因编码，所述基因包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:24的约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性。在一些实施方案中，TNF蛋白由这样的基因编码，所述基因包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:24或由其组成。在一些实施方案中，TNF由包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:24的序列的基因编码。在一些实施方案中，编码TNF的基因包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:24的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或由前述百分比中任两者定义的百分比范围的同一性的序列。

在一些情况下，TNF蛋白包含与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:31的残基77-233的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白包含与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:31的残基77-233的在95％与98％或95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白包含与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:31的残基77-233的约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性。在一些实施方案中，TNF蛋白包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:31的残基77-233。

IL-12

在一些实施方案中，MYXV包含(例如，编码)非病毒分子，例如包含编码白介素-12(IL-12)蛋白的转基因。在一些实施方案中，IL-12蛋白是人IL-12蛋白。在一些实施方案中，IL-12蛋白是可溶的。在一些实施方案中，IL-12蛋白是膜或表面结合的。在一些实施方案中，IL-12蛋白通过促进免疫细胞分化或引发免疫细胞细胞毒性进一步增强MYXV的抗癌活性。

在一些实施方案中，IL-12包含IL12α亚基(p35亚基)。在一些实施方案中，IL-12α亚基由IL-12α基因编码。在一些实施方案中，IL-12α基因是人IL-12α基因。在一些实施方案中，IL-12α基因由IRES驱动。在一些实施方案中，IL-12α基因由启动子诸如sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，IL-12α基因替换或破坏M153基因。在一些实施方案中，将IL-12α基因插入在MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间的基因间区中。

在一些实施方案中，IL-12包含IL12β(p40)亚基。在一些实施方案中，IL-12β亚基由IL-12β基因编码。在一些实施方案中，IL-12β基因是人IL-12β基因。在一些实施方案中，IL-12β基因由IRES驱动。在一些实施方案中，IL-12β基因由启动子诸如sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，IL-12β基因替换或破坏MYXV M153基因。在一些实施方案中，将IL-12β基因插入在MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间的基因间区中。

在一些实施方案中，IL-12包含IL12α亚基和IL-12β亚基。在一些实施方案中，IL12α亚基和IL-12β亚基是共价连接的。在一些实施方案中，IL12α亚基和IL-12β亚基不是共价连接的。在一些实施方案中，IL12α亚基和IL-12β亚基表达为一种转录物。在一些实施方案中，IL12α亚基和IL-12β亚基表达为一种多肽，所述多肽例如具有接合两个亚基的肽接头。接头序列的长度可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸残基。接头的长度可以是至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个氨基酸残基。接头的长度可以是至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多15、至多20、至多25、至多30、至多40或至多50个氨基酸残基。柔性接头可以具有含有甘氨酸和丝氨酸残基的链段的序列。甘氨酸和丝氨酸残基的较小大小提供了灵活性，并且使得所连接的功能结构域有可移动性。丝氨酸或苏氨酸的掺入可以通过以下方式来保持接头在水性溶液中的稳定性：与水分子形成氢键，从而降低接头与蛋白质部分之间的不利相互作用。柔性接头还可以含有另外的氨基酸诸如苏氨酸和丙氨酸以保持灵活性，以及极性氨基酸诸如赖氨酸和谷氨酰胺以改善溶解度。刚性接头可以具有例如α螺旋结构。α-螺旋刚性接头可以充当蛋白质结构域之间的间隔子。接头可以包含SEQ ID NO:33-43的序列中的任一种或其重复序列。SEQ ID NO:33-38和43提供了示例性柔性接头序列。SEQ ID NO:39-42提供了刚性接头序列的实例。

在一些实施方案中，MYXV表达相对低水平的IL-12。IL-12的相对较低表达可以例如通过以下方式来实现：在编码IL-12亚基的序列之间使用IRES序列。在一些实施方案中，MYXV表达相对高水平的IL-12。IL-12的相对较高表达可以例如通过以下方式来实现：在单一多肽中使用接合IL-12的亚基的合适接头，例如，弹性蛋白接头，诸如SEQ ID NO:43的接头。

在一些实施方案中，IL-12表达的水平可以通过实施例6的测定来确定。例如，可以将vero细胞用本公开的MYXV以1MOI感染，可以在感染后24小时收获上清液，并且可以通过ELISA测量IL-12的量。在一些实施方案中，IL-12表达的低水平可以是小于50、小于40、小于30、小于20、小于10或小于5ng/mL的IL-12，如通过实施例6的测定确定的。在一些实施方案中，IL-12表达的高水平可以是超过20、超过30、超过40、超过50、超过60、超过70、超过80、超过90、超过100或超过150ng/mL的IL-12，如通过实施例6的测定确定的。在一些实施方案中，IL-12表达的高水平可以是超过20ng/mL的IL-12，并且IL-12表达的低水平可以是小于20ng/mL的IL-12。

在一些实施方案中，IL-12亚基中的一者或两者可以是截短的。具有截短亚基的IL-12的实例提供于SEQ ID NO:50中，其包含小鼠IL-12B(SEQ ID NO:51)、弹性蛋白接头(SEQ ID NO:43)和截短的小鼠IL-12A(SEQ ID NO:52)。

IL-12是细胞因子。在一些实施方案中，IL-12促进T辅助细胞类型1(Th1)分化，并且增强自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞毒性。在一些实施方案中，此IL-12的作用在具有先天性免疫力的元件与具有适应性免疫力的元件之间产生改进的相互连接，以促进抗癌免疫应答。在一些实施方案中，由于此桥接先天性和适应性免疫力，IL-12增强MYXV的抗肿瘤功效。在一些实施方案中，IL-12强效地刺激IFN-γ(调整抗癌防御的机制的细胞因子)的产生，从而增强MYXV的抗肿瘤功效。

重组IL-12细胞因子疗法的全身性递送的临床试验由于毒性事件、全身施用IL-12的短暂性质和肿瘤诱导的免疫抑制而尚未在癌症患者中诱导令人满意的结局。然而，在肿瘤微环境(TME)内局部表达IL-12的病毒可以导致强效的抗肿瘤功效。在一些实施方案中，来自溶瘤病毒的IL-12的表达(其限于肿瘤床，使得转基因在TME内局部表达)降低与此细胞因子的全身性递送相关联的毒性作用。因此，在一些实施方案中，IL-12的两个亚基的共表达改善了由经装配的MYXV针对不同类型的癌症诱导的抗肿瘤免疫力。

在一些情况下，IL12α亚基包含与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28的残基35-253或SEQ ID NO:28的残基57-253的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些情况下，IL12α亚基包含与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28的残基35-253或SEQ ID NO:28的残基57-253的在95％与98％或95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，IL12α亚基包含与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28的残基35-253或SEQ ID NO:28的残基57-253的约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性。在一些实施方案中，IL12α亚基包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28的残基35-253或SEQ ID NO:28的残基57-253。

在一些情况下，IL-12β亚基包含与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:29的残基23-328的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些情况下，IL-12β亚基包含与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:29的残基23-328的在95％与98％或95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，IL-12β亚基包含与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:29的残基23-328的约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性。在一些实施方案中，IL-12β亚基包含SEQ ID NO:29或SEQ IDNO:29的残基23-328。

饰胶蛋白聚糖

在一些实施方案中，MYXV包含(例如，编码)非病毒分子，例如包含编码饰胶蛋白聚糖的转基因。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖蛋白是人饰胶蛋白聚糖蛋白。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖蛋白是可溶的。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖蛋白是膜或表面结合的。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖蛋白通过阻断或降低TGF-β信号传导来增强MYXV的抗癌活性。

在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖蛋白由饰胶蛋白聚糖基因编码。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖基因是人饰胶蛋白聚糖基因。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖基因由IRES驱动。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖基因由启动子诸如sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖基因替换或破坏M153基因。在一些实施方案中，将饰胶蛋白聚糖基因插入在MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间的基因间区中。

饰胶蛋白聚糖是细胞外基质蛋白聚糖家族的成员，其在基质组织和上皮细胞内存在和起作用。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖通过直接或间接靶向参与细胞生长、存活、转移和/或血管生成的信号传导分子来影响不同类型癌症的生物学。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖阻断TGF-β诱导的信号传导。在一些实施方案中，TGF-β是有助于一些肿瘤微环境(TME)中的免疫抑制的细胞因子。在一些情况下，TGF-β将效应T细胞(其原本可以识别和攻击癌细胞)转化为调节性(抑制子)T细胞(这进而关闭识别和消除癌细胞所需的先天性炎症反应和获得性免疫途径。在多种类型的癌症中，TGF-β信号传导途径的部分发生突变，并且此细胞因子不再控制至少一些细胞靶标。这些癌细胞可以增殖并增加其TGF-β内源性产生，而TGF-β可能对周围的基质细胞、免疫细胞、内皮和平滑肌起作用，从而引起癌组织内的局部免疫抑制和肿瘤床血管生成，这使得癌症甚至更具侵入性。因此，在一些实施方案中，表达饰胶蛋白聚糖的溶瘤MYXV载体直接在TME内阻断TGF-β，从而诱导比不表达饰胶蛋白聚糖的MYXV更强的抗肿瘤免疫应答。

另外，饰胶蛋白聚糖可以抑制肿瘤细胞生长和增殖。饰胶蛋白聚糖向各种实体肿瘤中的病毒递送可以直接对抗肿瘤发生。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖用作受到TGF-β的局部过表达的保护的至少一些类型癌症的抗癌靶标。

在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖由包含SEQ ID NO:25的序列的基因编码。在一些实施方案中，编码饰胶蛋白聚糖的基因包含与SEQ ID NO:25的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或由前述百分比中任两者定义的百分比范围的同一性的序列。在一些情况下，饰胶蛋白聚糖由这样的基因编码，所述基因包含与SEQ ID NO:25的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些情况下，饰胶蛋白聚糖由这样的基因编码，所述基因包含与SEQ ID NO:25的在95％与98％或95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，饰胶蛋白聚糖由这样的基因编码，所述基因包含与SEQ ID NO:25的约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。

在一些情况下，饰胶蛋白聚糖蛋白包含与SEQ ID NO:14的残基31-359或SEQ IDNO:14-19中的任一个的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些情况下，饰胶蛋白聚糖蛋白包含与SEQ ID NO:14的残基31-359或SEQID NO:14-19中的任一个的在95％与98％或95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，饰胶蛋白聚糖蛋白包含与SEQ ID NO:14的残基31-359或SEQ ID NO:14-19中的任一个的约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖蛋白包含SEQ ID NO:14的31-359或SEQ ID NO:14-19中的任一个。

重组核酸

在某些实施方案中，本文公开了重组核酸。一些实施方案涉及重组核酸，其包含MYXV基因组的至少一部分。在一些实施方案中，重组核酸包括DNA。在一些实施方案中，MYXV基因组或MYXV基因组的一部分被修饰以降低M153基因的表达。在一些实施方案中，M153基因被修饰以敲除MYXV基因组中M153基因的至少一部分。

在一些实施方案中，重组核酸被工程化以将突变引入至M153基因。突变可以包括例如插入、缺失、置换或其组合。在一些实施方案中，重组核酸包含其中破坏M153基因的基因敲入。

在一些实施方案中，重组核酸包含编码非病毒分子的核酸。在一些实施方案中，重组核酸包含编码非病毒分子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核酸，例如编码蛋白质的转基因。

在一些实施方案中，重组核酸包含编码肿瘤坏死因子α(TNFα)的核酸。在一些实施方案中，TNFα是人TNFα。在一些实施方案中，编码TNFα的核酸替换或邻接MYXV基因组的M135R基因。在一些实施方案中，将编码TNFα的核酸插入在MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间。在一些实施方案中，TNFα的表达由痘病毒合成早期/晚期(sE/L)启动子驱动。在一些实施方案中，编码TNFα的核酸替换或邻接MYXV基因组的M153基因。

在一些实施方案中，重组核酸包含编码白介素-12亚基α(IL-12α)的核酸。在一些实施方案中，IL-12α是人IL-12α。在一些实施方案中，IL-12α的表达由内部核糖体进入位点(IRES)驱动。在一些实施方案中，编码IL-12α的核酸破坏MYXV基因组的M153基因的表达。

在一些实施方案中，重组核酸包含编码白介素-12亚基β(IL-12β)的核酸。在一些实施方案中，IL-12β是人IL-12β基因。在一些实施方案中，IL-12β的表达由sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，编码IL-12β的核酸破坏MYXV基因组的M153基因的表达。在一些实施方案中，编码IL-12β的核酸和编码IL-12α的核酸两者破坏MYXV基因组的M153基因的表达。

在一些实施方案中，重组核酸包含编码饰胶蛋白聚糖的核酸。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖是人饰胶蛋白聚糖。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖的表达由sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，重组核酸包含编码饰胶蛋白聚糖的核酸，所述核酸破坏MYXV基因组的M153基因的表达。

在一些实施方案中，重组核酸包含编码报告标签，例如荧光蛋白的核酸。在一些实施方案中，报告标签包括绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方案中，报告标签的表达由sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，重组核酸进一步包含编码第二报告标签的核酸。在一些实施方案中，第二报告标签包括红色荧光蛋白(RFP)，例如dsRed。在一些实施方案中，第二报告标签的表达由痘病毒P11晚期启动子驱动。在一些实施方案中，编码第二报告标签的核酸破坏MYXV基因组的M153基因的表达。

在一些实施方案中，重组核酸包含vMyx-hTNFa盒，任选地包含GFP。在一些实施方案中，重组核酸包含hDecorin-hIL-12盒，任选地包含dsRed。在一些实施方案中，重组核酸包含vMyx-hTNFa-hDecorin-hIL-12-M153KO(vMyx-三重)盒或由其组成，任选地包含GFP和/或dsRed。

组合物和施用

在某些实施方案中，本文公开了组合物，其包含如本文所述的MYXV。在一些实施方案中，组合物包括药物组合物。在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂。

在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括可注射流体诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。在一些实施方案中，组合物包括固体组合物，诸如粉末、丸剂、片剂或胶囊。在一些实施方案(诸如包括固体组合物的实施方案)中，药学上可接受的载体包括甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括生物学中性载体。在一些实施方案中，组合物包含润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

在一些实施方案中，药学上可接受的载体或赋形剂的身份或比例基于施用途径、与活病毒的相容性或标准药物实践确定。在一些实施方案中，药物组合物用不显著损害MYXV的生物特性的组分配制。药物组合物可通过已知的用于制备适于施用于对象的药学上可接受的组合物的方法来制备，使得有效量的一种或多种活性物质与药学上可接受的媒介物在混合物中结合。在一些实施方案中，组合物包括与一种或多种药学上可接受的赋形剂、媒介物或稀释剂结合并且包含在具有合适pH并且与生理流体等渗的缓冲溶液中的MYXV的溶液。

在一些实施方案中，将药物组合物配制用于施用至对象。如本领域技术人员将理解的，取决于所选择的施用途径，可以将药物组合物以多种形式施用于对象。在一些情况下，将药物组合物全身施用，或配制用于全身施用。在一些实施方案中，将药物组合物局部施用，或配制用于局部施用。

在一些实施方案中，将药物组合物肠胃外施用，或配制用于肠胃外施用。肠胃外施用的实例包括静脉内、肿瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、经上皮、鼻腔、肺内、鞘内、直肠和局部施用方式。肠胃外施用可以通过在选定的时间段内连续输注来进行。

在一些实施方案中，将药物组合物口服施用，或配制用于口服施用。药物组合物可以例如与惰性稀释剂或载体一起口服施用，或者可以将其封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可以将其压制成片剂。对于口服治疗性施用，MYXV可以与赋形剂掺和，并且以可摄入的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、晶片等形式使用。

MYXV溶液可以制备于生理上合适的缓冲液中。在一些实施方案中，在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长，但这将不使活病毒灭活。在一个实施方案中，所使用的药物组合物的剂量取决于所治疗的特定病况、病况的严重程度、个体对象参数(包括年龄、身体情况、大小和体重)、治疗持续时间、同时治疗(如果有的话)的性质、具体的施用途径和健康从业者的知识和专业技能范围内的其他类似因素。在某些实施方案中，可将治疗性病毒冷冻干燥以在室温下储存。

药物组合物可以另外包含另外的治疗剂，诸如另外的抗癌剂。在一个实施方案中，组合物包括化学治疗剂。化学治疗剂例如可以基本上是任何药剂，其表现出针对对象的癌细胞或赘生性细胞的溶瘤作用并且不抑制或不减弱MYXV的肿瘤杀伤作用。例如，化学治疗剂可以是但不限于蒽环类、烷基化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、氮芥、亚硝基脲、抗生素、抗代谢药、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素、含铂试剂或细胞因子。优选地，化学治疗剂是已知对癌性或赘生性的特定细胞类型有效的化学治疗剂。在一些情况下，另外的治疗剂包括免疫检查点调节剂。

在一些实施方案中，组合物包含通过如本文所述的MYXV离体处理的外周血单核细胞(PBMC)、骨髓(BM)细胞或其组合。在一些实施方案中，PBMC、BM细胞或其组合包括自体细胞。在一些实施方案中，PBMC、BM细胞或其组合获自同种异体的供体。在一些实施方案中，PBMC、BM细胞或其组合获自异源供体。

使用方法

在某些实施方案中，本文公开了在有需要的对象中抑制、减轻或预防癌症的方法，所述方法包括向对象施用如本文所述的组合物或药物组合物。在某些实施方案中，方法包括向对象(诸如人对象)施用如本文所述的MYXV，从而治疗和/或抑制有需要的对象中的癌症。

一些实施方案包括用MYXV进行预防性治疗。在一些实施方案中，对象患有癌症、疑似患有癌症或有患上癌症的风险。一些实施方案包括选择疑似患有的对象。一些实施方案包括选择有患上癌症的风险的对象。在一些实施方案中，对象患有癌症。在一些实施方案中，方法包括选择患有癌症的对象。

在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是患者。

在一些实施方案中，对象是动物或非人动物。非人动物的实例包括脊椎动物诸如哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的一些实例包括非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛和啮齿类动物诸如小鼠和大鼠。

在一些实施方案中，癌症是实体瘤。实体瘤的实例，诸如肉瘤和癌，包括但不限于纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(例如，神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅神经胶质瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。在一些实施方案中，癌症包括骨肉瘤、三阴性乳腺癌或黑色素瘤。

在一些实施方案中，癌症已经转移至对象中的某一位置。在一些实施方案中，所述位置包括对象的肺、脑、肝脏和/或淋巴结。

在一些实施方案中，癌症包括血液学癌症诸如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，血液学癌症包括B-细胞或T-细胞血液学癌症。

在一些实施方案中，组合物降低癌细胞活力，或激活癌症中的免疫原性细胞死亡。在一些实施方案中，在施用组合物后，癌症得以抑制、减轻或预防。在一些实施方案中，施用改善对象的存活。

可以使用标准施用方法将MYXV或包含MYXV的组合物施用至对象。在一些实施方案中，全身施用(例如，IV注射)病毒或包含病毒的组合物。在一些实施方案中，通过在疾病部位(例如，肿瘤内)注射来施用病毒或包含病毒的组合物。在一些实施方案中，病毒或包含病毒的组合物口服或肠胃外施用，或者通过本领域已知的任何标准方法施用。在某些实施方案中，在肿瘤和/或转移的部位施用MYXV或包含MYXV的组合物。

MYXV最初可以以合适的量施用，该量可以视需要根据对象的临床反应进行调整。病毒的有效量可凭经验确定，并且取决于可以安全施用的MYXV的最大量，以及产生期望结果的病毒的最小量。

待施用的病毒浓度将根据待施用的MYXV的特定毒株的毒力以及所靶向的细胞的性质而变化。在一个实施方案中，将小于约3x10¹⁰个转化灶形成单位(“ffu”)(也称为“感染单位”)的剂量施用于人对象，在各种实施方案中，可以单剂量施用约10²至约10⁹pfu、约10²至约10⁷pfu、约10³至约10⁶pfu或约10⁴至约10⁵pfu。

在一些实施方案中，将MYXV以有效增加对象中免疫细胞(例如，PBMC)的细胞因子的表达的剂量和时间表施用。可以使免疫细胞的细胞因子的表达增加例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍或至少约1000倍。在一些实施方案中，将MYXV以有效增加对象中免疫细胞的两种、三种、四种、五种、六种或更多种细胞因子的表达的剂量和时间表施用。在一些实施方案中，将MYXV以有效增加对象中免疫细胞的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多种细胞因子的表达的剂量和时间表施用。细胞因子可以包括例如IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α或其任何组合。在一些实施方案中，增加了TNF-α的表达。在一些实施方案中，增加了IL-12的表达。在一些实施方案中，增加了饰胶蛋白聚糖的表达。在一些实施方案中，增加了IFN-γ的表达。

在一些实施方案中，将MYXV以有效增加对象中癌细胞的细胞因子的表达的剂量和时间表施用。可以使癌细胞的细胞因子的表达增加例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍或至少约1000倍。在一些实施方案中，将MYXV以有效增加对象中癌细胞的两种、三种、四种、五种、六种或更多种细胞因子的表达的剂量和时间表施用。在一些实施方案中，将MYXV以有效增加对象中癌细胞的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多种细胞因子的表达的剂量和时间表施用。细胞因子可以包括例如IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α或其任何组合。在一些实施方案中，增加了TNF-α的表达。在一些实施方案中，增加了IL-12的表达。在一些实施方案中，增加了饰胶蛋白聚糖的表达。在一些实施方案中，增加了IFN-γ的表达。

在一些实施方案中，将MYXV以有效降低对象中肿瘤的体积的剂量和时间表施用。可以使肿瘤的体积减少例如至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。

在一些实施方案中，将MYXV以有效降低对象中肿瘤或癌细胞生长的速率的剂量和时间表施用。可以使肿瘤或癌细胞生长的速率降低例如至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。

MYXV可作为单独的疗法施用，或者可以与包括化学疗法、免疫疗法和/或放射疗法的其他疗法结合施用。例如，MYXV可以在原发性肿瘤手术切除之前或之后施用，或者在治疗诸如施用放射治疗或常规化学治疗药物之前、同时或之后施用。在一些实施方案中，可以在其他疗法之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1.5周、2周或3周施用MYXV。在一些实施方案中，可以在其他疗法之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1.5周、2周或3周施用MYXV。在一些实施方案中，可以在其他疗法的1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天内施用MYXV。在一些实施方案中，可以将MYXV与其他疗法同时施用。

一些实施方案进一步包括向对象施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是免疫检查点调节剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂在施用组合物之前施用至对象。在一些实施方案中，另外的治疗剂在施用组合物之后施用至对象。在一些实施方案中，另外的治疗剂作为与组合物的组合施用至对象。

在一些实施方案中，另外的治疗剂包括免疫调节剂，例如免疫检查点调节剂或抑制剂。示例性的免疫检查点调节剂包括但不限于PD-L1抑制剂，诸如来自AstraZeneca的德瓦鲁单抗(durvalumab)(Imfinzi)、来自Genentech的阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、来自EMD Serono/Pfizer的阿维鲁单抗(avelumab)、来自CytomXTherapeutics的CX-072、来自Novartis Pharmaceuticals的FAZ053、来自3D Medicine/Alphamab的KN035、来自Eli Lilly的LY3300054或来自EMD Serono的M7824(抗PD-L1/TGFβ阱)；PD-L2抑制剂，诸如GlaxoSmithKline的AMP-224(Amplimmune)和rHIgM12B7；PD-1抑制剂，诸如来自Bristol-Myers Squibb的纳武单抗(nivolumab)(Opdivo)、来自Merck的派姆单抗(pembrolizumab)(Keytruda)、来自Agenus的AGEN 2034、来自BeiGene的BGB-A317、来自Boehringer-Ingelheim Pharmaceutical的Bl-754091、来自CBT Pharmaceuticals的CBT-501(genolimzumab)、来自Incyte的INCSHR1210、来自Janssen Research&Development的JNJ-63723283、来自MedImmune的MEDI0680、来自MacroGenics的MGA 012、来自NovartisPharmaceuticals的PDR001、来自Pfizer的PF-06801591、来自RegeneronPharmaceuticals/Sanofi的REGN2810(SAR439684)或来自TESARO的TSR-042；CTLA-4抑制剂，诸如来自Bristol Meyers Squibb的伊匹木单抗(也称为

MDX-010、BMS-734016和MDX-101)、来自Pfizer的曲美木单抗(CP-675,206、ticilimumab)或来自Agenus的AGEN 1884；LAG3抑制剂，诸如来自Bristol-Myers Squibb的BMS-986016、来自NovartisPharmaceuticals的IMP701、来自Novartis Pharmaceuticals的LAG525或来自RegeneronPharmaceuticals的REGN3767；B7-H3抑制剂，诸如来自MacroGenics的恩波妥珠单抗(enoblituzumab)(MGA271)；KIR抑制剂，诸如来自Innate Pharma的Lirilumab(IPH2101；BMS-986015)；CD137抑制剂，诸如乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513、Bristol-MyersSquibb)、PF-05082566(抗4-1BB、PF-2566，Pfizer)或XmAb-5592(Xencor)；PS抑制剂，诸如巴维昔单抗(Bavituximab)；以及抑制剂，诸如其抗体或其片段(例如，单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、RNAi分子或TIM3、CD52、CD30、CD20、CD33、CD27、OX40、GITR、ICOS、BTLA(CD272)、CD160、2B4、LAIR1、TIGHT、LIGHT、DR3、CD226、CD2或SLAM的小分子。

进一步公开了一种递送策略，其中在输注至(诸如重新输回)癌症患者之前，将治疗性MYXV病毒首先离体吸附至来自骨髓或外周血单核细胞的混合白细胞。在这种策略中，MYXV可以通过预先被病毒离体感染的白细胞迁移而递送到转移性癌症部位。这种全身递送方法有时被称为“体外病毒疗法”或EVV(又名EV2)，因为在将病毒注入患者之前，病毒首先被递送至分离的白细胞中。MYXV构建体和该递送策略可以在有需要的对象中显著降低肿瘤负荷并且增加存活。在一些实施方案中，将BM或PBMC细胞离体吸附MYXV构建体一小时，然后将负载MYXV的白细胞注回接受者中。

在某些实施方案中，单核外周血细胞和/或骨髓细胞从对象获得，例如作为自体细胞。在一些实施方案中，单核外周血细胞和/或骨髓细胞从一名或多名同种异体供体获得，例如，与接受者针对至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8个HLA等位基因(诸如HLA-A、HLA-B、HLA-A和/或HLA-DR等位基因的一个或两个拷贝)匹配的供体。可以例如使用基于DNA的方法对HLA等位基因进行分型。在一些实施方案中，单核外周血细胞和/或骨髓细胞从一名或多名异源供体获得。

实施例

提供这些实施例仅仅是为了说明的目的而非限制本文提供的权利要求的范围。

实施例1–病毒构建

将重组质粒设计用于在具有或不具有dsRed核酸序列的情况下将hDecorin和hIL12核酸序列插入在黏液瘤病毒M153基因座处。将人饰胶蛋白聚糖基因从来自OHu16408(GenScript)的cDNA ORF克隆进行PCR扩增。人亚基IL-12p35和p40获自Journal ofVirology,2007年11月,P.12704–12708(将其公开内容通过引用并入本文)中描述的vMyx-huIL-12-GFP。将红色荧光蛋白(dsRed)基因紧邻hDecorin-hIL-12表达盒的下游插入，并且其表达由痘病毒P11晚期启动子驱动。此重组核酸称为vMyx-三重或vMyx-三重-红色。dsRed充当体外和体内MYXV复制的荧光标记物，因为MYXV感染可以通过dsRed表达的实时成像监测。制备了缺乏dsRed标记物的此重组核酸的第二形式(称为vMyx-三重-白色)。

图1A图解了vMyx-三重重组核酸的构建。顶部图像描绘了vMyx-hTNFa-GFP基因组和表达hDecorin-hIL-12-dsRed盒的插入位点(M153基因座)。中间图像示出了hDecorin-hIL-12-dsRed盒，并且底部图像示出了vMyx-三重构建体。hDecorin-hIL-12-dsRed盒中的饰胶蛋白聚糖和IL-12转基因在痘病毒合成早期/晚期启动子(sE/L)的控制下表达，而dsRed的表达通过痘病毒晚期启动子P11控制。vMyx-三重-白色构建体与vMyx-三重-红色相同，但缺乏dsRed盒。

为了产生vMyx-三重和vMyx-三重-白色病毒，首先使用Gateway系统(ThermoFisher Scientific)构建重组质粒。通过PCR扩增上游和下游杂交序列以通过Gateway BP重组，用适当的pDONR载体产生入门克隆。通过以顺序方式将三个入门克隆与目的载体重组来构建最终的重组质粒。通过以下方式将hDecorin-hIL12-dsRed表达盒插入至MYXV基因组中：用vMyx-hTNFa-GFP病毒感染RK13细胞并且然后用适当的重组质粒转染。使用荧光dsRed蛋白作为选择标记物，进行多轮灶纯化以获得重组病毒的纯储备液。使用针对hTNF、hDecorin和hIL-12的特异性引物通过PCR(图2A和图2B)来确认转基因的存在。这些图中示出的此PCR分析证实，转基因存在于各种vMyx-三重克隆中，并且图中示出的条带在预期大小处。表1包括用于产生构建体的引物序列。

使用适当的引物组通过PCR确认重组vMyx-三重和vMyx-三重-白色病毒的纯度和M153的缺乏(图2C和图2D)。图2C中示出的PCR分析证实，通过在135和136基因的侧接区域中使用引物，克隆中没有野生型病毒。蛋白质印迹确认三个转基因的蛋白质表达(图3A-图3C)。因此，产生了表达转基因人TNFα、饰胶蛋白聚糖和IL-12并且缺乏M153的重组MYXV(vMyx-三重)。用于检测转基因表达的抗体如下：人TNF-a：单克隆小鼠IgG1克隆#28401(MAB610-100，R&D Systems)；人饰胶蛋白聚糖：兔多克隆抗体(ab175404，Abcam)；人IL-12：针对IL-12p70的兔多克隆抗体(ab25105，Abcam)。

使用与用于表达人IL-12的病毒相同的Gateway系统(ThermoFisher Scientific)产生表达小鼠IL-12而非人IL-12的重组MYXV。使用合成早期/晚期启动子产生表达相对较低水平的小鼠IL-12的病毒(其中在IL-12的亚基之间具有IRES序列)(小鼠三重IL-12低)，并且使用合成早期/晚期启动子产生表达相对较高水平的小鼠IL-12的vMyxv-小鼠三重(其中小鼠IL-12含有在IL-12的亚基之间的弹性蛋白接头)(小鼠三重IL-12高)。

实施例2-重组MYXV的复制和细胞杀伤能力

在RK13细胞中测试了实施例1中制备的vMyx-三重病毒的复制能力。vMyx-三重病毒的复制能力与亲本vMyx-hTNFa-GFP病毒相似(图4)。因此，表达转基因人TNFα、饰胶蛋白聚糖和IL-12且缺乏M153的重组MYXV有效地在宿主细胞中复制。

接下来，在以下两种不同的细胞系中测试vMyx-三重病毒的细胞杀伤能力：CT26(结肠癌)和HELA(人宫颈癌)(图5A和图5B)。为了测量细胞活力(并且由此推断细胞毒性)，使用了CellTiter

AQueous One Solution细胞增殖测定(MTS)(Promega，USA)。将CT26和HELA细胞用不同的病毒以10感染复数(MOI)感染48小时。在48小时后，将四唑鎓底物(MTS)添加至CT26和HELA细胞，并且在孵育2小时之后使用微板读数器测量活细胞中产生的A490甲臜产物。将每个样品一式三份定量，并且共进行两个独立实验。与亲本病毒vMyx-hTNFa相比并且还与vMyx-GFP相比，vMyx-三重病毒在两种细胞系中诱导相似水平的细胞死亡。相比于其他病毒，存在通过vMyx-三重病毒杀伤的癌细胞增加的趋势。因此，表达转基因人TNFα、饰胶蛋白聚糖和IL-12且缺乏M153的重组MYXV对癌细胞具有细胞毒性。

实施例3-重组MYXV的复制和细胞杀伤能力

图1B图解了M153基因座，其可以在本公开的重组核酸和MYXV中被修饰。修饰可以包括在M153序列中的突变，例如插入、缺失、置换或其组合。修饰可以减弱M153的活性或表达水平。修饰可以包括缺失M153基因和/或用一个或多个转基因替换M153基因。替换基因可以选自有助于增强MYXV的溶瘤活性或减少不良副作用的hTNFa、hDecorin、IL-12或另一转基因。

为了产生vMyx构建体，首先可以使用Gateway系统(ThermoFisher Scientific)构建重组质粒。通过PCR扩增上游和下游杂交序列以通过Gateway BP重组用适当的pDONR载体产生入门克隆。通过以顺序方式将一种或多种入门克隆与目的载体重组来构建最终的重组质粒。通过以下方式将重组质粒插入至MYXV基因组中：用vMyx感染RK13细胞并且然后用适当的重组质粒转染。进行多轮灶纯化以获得重组病毒的纯储备液。可以使用选择标记物，诸如荧光蛋白，例如dsRed。可以通过PCR和/或测序确认转基因的存在。

可以以此方式构建M153敲除病毒。可以设计重组质粒以含有侧接M153基因序列的序列，而没有M153基因序列。任选地，可以包含荧光蛋白的表达盒。可以通过以下方式产生M153敲除：用MYXV感染RK13细胞，并且用重组质粒转染细胞。任选地使用荧光蛋白作为选择标记物，进行多轮灶纯化以获得M153KO病毒的纯储备液。使用合适的引物经由PCR分析来确认M153敲除和病毒的纯度。

可以在RK13细胞中测试经修饰的vMyx病毒的复制能力。经修饰的vMyx病毒的复制能力可以类似于亲本vMyx病毒。接下来，在两种不同的癌细胞系中测试经修饰的vMyx病毒的细胞杀伤能力。为了测量细胞活力(并且由此推断细胞毒性)，使用了CellTiter

AQueous One Solution细胞增殖测定(MTS)(Promega，USA)。将癌细胞用不同的病毒以MOI＝10感染48小时。在48小时后，将四唑鎓底物(MTS)添加至细胞，并且在孵育2小时之后使用微板读数器测量活细胞中产生的A490甲臜产物。将每个样品一式三份定量，并且共进行两个独立实验。与亲本病毒vMyx相比并且还与vMyx-GFP相比，经修饰的vMyx病毒在两种细胞系中诱导相似水平的细胞死亡，或更高水平的细胞死亡。

实施例4–采用M153KO MYXV的体外结果

可以将治疗性转基因在两种类型的基因组基因座处添加至MYXV：作为在蛋白质编码基因内的破坏构建体，使得重组病毒基因“敲除”该病毒基因；或者在预计不影响重组病毒的生物学或溶瘤潜力的“无害”基因间基因座处。当敲除内源病毒基因时，新敲除构建体可能会在其针对癌细胞的溶瘤能力方面不同于亲本病毒，这与哪种转基因插入至基因座中无关。

MYXV的M153基因编码来自E3-泛素连接酶家族的免疫调节蛋白，其参与不同细胞受体(包括MHC I类和CD4蛋白)的下调。不受理论的束缚，M153的灭活或敲低可以导致MHC-I依赖性免疫表位的增强表达，例如，增加病毒和/或肿瘤抗原的直接呈递，从而增加宿主T细胞对病毒感染细胞(例如，癌细胞)的识别。这允许具有灭活的M153基因的黏液瘤病毒用作溶瘤载体。此实施例和以下实施例中的数据表明，在免疫活性模型中，与具有完整M153基因的亲本MYXV相比，M153敲除黏液瘤病毒(M153KO MYXV)骨架表现出更高的体外和体内溶瘤活性。因此，与亲本MYXV或wt MYXV相比，没有转基因的M153KO MYXV表现出更大的溶瘤活性。此外，与亲本MYXV或wt MYXV相比，具有一个或多个转基因的M153KO MYXV也可以表现出增强的溶瘤活性。

在鼠黑素瘤细胞系B16F10细胞中，与含有完整野生型M153的野生型黏液瘤病毒(wt MYXV)相比，测试了M153KO MYXV对细胞杀伤的诱导。此M153KO MYXV不包含hTNFa、hDecorin、hIL-12A或hIL-12B转基因。在感染后的早期时间点，直到感染后大约36小时，与wt MYXV相比，M153KO MYXV在更大程度上降低B16F10细胞的细胞活力(图6)。这些结果表明，与野生型或没有M153灭活的MYXV相比，具有M153灭活或敲低的MYXV在更大程度上诱导细胞死亡。

基于此结果，评价M153KO病毒可以诱导特定类型的细胞死亡(称为免疫原性细胞死亡(ICD))的可能性以确定M153KO MYXV作为诱导癌细胞中的ICD的溶瘤载体的潜力。存在不同的可以指示ICD诱导的体外标志，其可以刺激免疫系统(例如，适应性免疫系统)。在这种情况下，两种信号是该研究的焦点：ATP向细胞外环境的释放，和钙网蛋白在细胞表面上的表达或胞外表达。

ATP从死亡细胞的释放可以指示ICD。在用wt MYXV感染之后观察到的ATP释放与阴性对照没有显著不同。另一方面，在用M153KO MYXV感染之后释放的ATP量高于未处理细胞，并且是由wt MYXV感染的细胞的至多约四倍(参见，图7A，例如，在感染后10小时的峰值)。来自M153KO MYXV感染的峰结果类似于在药物诱导的阳性对照(多柔比星)下获得的峰值，但在稍后时间处(图7A，参见在感染后6-10小时的结果)。因此，与wt MYXV相比或与没有M153灭活或敲低的MYXV相比，具有M153的灭活或敲低的MYXV具有优异的溶瘤特性。特别地，与没有M153灭活或敲低的MYXV或WT MYXV相比，具有M153灭活或敲低的MYXV在更大程度上诱导免疫原性细胞死亡。

钙网蛋白通常表达在内质网内，但在发生ICD的情况下，它可以表达于细胞表面上(胞外表达)。钙网蛋白的胞外表达使用共聚焦显微镜检查来评价并且使用观察到的钙网蛋白信号/代表每个细胞的核染色(DAPI)的信号比率定量。在这种情况下，将M135KO MYXV用作在不相关病毒基因(M135)中具有基因敲除损伤的未装配病毒的代表，所述未装配病毒不改变由亲本MYXV引起的细胞杀伤并且在这点上与wt MYXV有类似表现。在M153KO MYXV感染细胞中钙网蛋白的胞外表达的诱导高于M135KO MYXV感染细胞或多柔比星处理细胞(图7B)。

总体上，这些结果显示M153KO MYXV可以诱导体外B16F10细胞中ICD的标志，并且当在体内使用时可以诱导免疫系统(例如，适应性免疫系统)。因此，具有M153灭活或敲低的MYXV在黑素瘤或癌细胞中诱导ICD。具有M153灭活或敲低的MYXV也可以刺激免疫系统(例如，适应性免疫系统)。

实施例5–采用M153KO MYXV的体内结果

另外，用同基因转移性黑素瘤小鼠模型，使用如用于体外研究的相同鼠癌细胞系B16F10进行研究。在这种情况下，经由尾静脉中的静脉内注射向C57BL/6小鼠接种B16F10细胞以在肺中诱导分散的转移性黑素瘤病变。在植入黑素瘤细胞之后三天，将小鼠用2x10⁷个ffu的M153KO MYXV或盐水对照经由在眶后区域中的静脉内注射进行治疗。用一个剂量的M153KO病毒治疗的小鼠显示出较少征象的转移性疾病，并且比对照小鼠存活更久(图8)。M135KO MYXV含有在参与兔发病的不相关病毒基因中的基因敲除，并且在此用作对照以衡量在不存在M153KO下由病毒引起的任何溶瘤作用。在此模型中，M153KO病毒提供了与未治疗对照小鼠相比显著更长期的存活，但M135KO病毒并未如此。

这些结果显示，与具有完整M153基因的亲本MYXV相比或与wt MYXV相比，M153KOMYXV可以用作具有优异的抗癌作用的溶瘤载体平台。因此，具有M153灭活或敲低的MYXV延长患有癌症(例如，黑素瘤)的对象的存活。癌症或黑素瘤可以是转移性的。与对照组相比，用M153敲除治疗的小鼠显示出存活率和存活长度的显著改善。

实施例6-感染细胞的转基因表达

此实施例展示了用本公开的黏液瘤病毒感染的细胞分泌TNF、饰胶蛋白聚糖和IL-12，并且进一步展示分泌的TNF和IL-12具有生物活性。

将Vero细胞用vMyx-三重(人三重红色和人三重白色)、小鼠三重IL12低、小鼠三重IL-12高各自以1MOI感染。作为对照，将细胞用vMyx-GFP感染，所述vMyx-GFP不编码任一种细胞因子，并且含有完整M153基因。在24小时后，收获上清液并且进行ELISA测定以确定上清液中每一种细胞因子的浓度(图9A-图9D)。结果证明，用各种vMyx-三重病毒感染的细胞分泌TNF(图9A)、饰胶蛋白聚糖(图9B)和IL-12(图9C-人IL-12；图9D-鼠IL-12)。相比之下，在模拟感染细胞或用vMyx-GFP感染的细胞中未检测到这些细胞因子。与用小鼠三重IL-12低的感染相比，用小鼠三重IL-12高的感染显示出引发更高的小鼠IL-12的表达。

为了测试由感染细胞分泌的TNF是否是生物活性的，进行了利用L929细胞的测定，所述L929细胞是TNF敏感的，并且在充分暴露于生物活性TNF后丧失活力。将L292细胞暴露于来自已经用所指示的病毒感染的Vero细胞的上清液。如图10A中所示，用各种vMyx-三重病毒感染的细胞产生生物活性TNF，而用vMyx-GFP感染的细胞并非如此。这些结果显示，本公开的编码TNF的MYXV可以引发生物活性TNF的表达。

为了测试由感染细胞分泌的IL-12是否是生物活性的，进行HEK Blue IL-12报告测定。HEK Blue IL-12细胞响应于生物活性IL-12而表达报告基因，并且可以使用比色测定检测报告基因。如图10B中所示，来自用vMyx-三重病毒感染的Vero细胞的上清液引发报告基因表达，而包括来自用vMyx-GFP感染的细胞的上清液的对照并非如此。这些结果显示，本公开的编码IL-12的MYXV可以引发生物活性IL-12的表达。

实施例7-vMyx-三重对癌细胞系的生长的体外抑制

在体外评价vMyx-三重抑制多种癌细胞系的能力。将细胞以0.1、1或10个转化灶形成单位(FFU)/细胞的感染复数(MOI)感染。在孵育72小时之后，使用CellTiter-Glo细胞活力测定测试细胞活力，并且确定平均生长抑制。结果显示，vMyx-三重可以抑制来源于不同组织的一系列人和小鼠癌细胞系的生长。结果提供于表2中。

为了进一步表征vMyx-三重在体外抑制癌细胞系的生长的能力，将17种人肺癌细胞系以范围为0.01FFU/细胞至100FFU/细胞的9种不同的感染复数感染。在孵育72小时之后，使用CellTiter-Glo细胞活力测定评估细胞活力。将每种细胞系的EC₅₀计算为实现最大生长抑制的50％的MOI，如通过使用非线性回归分析经由GraphPad Prism软件进行曲线拟合确定的。vMyx-三重展示出对多种人肺癌肿瘤细胞系的抑制，其中EC50示出于表3中。

为了进一步表征vMyx-三重在体外抑制癌细胞系的生长的能力，将8种人肉瘤细胞系以范围为0.01FFU/细胞至100FFU/细胞的9种不同的感染复数感染。在孵育72小时之后，使用CellTiter-Glo细胞活力测定评估细胞活力。将每种细胞系的EC₅₀计算为实现最大生长抑制的50％的MOI，如通过使用非线性回归分析经由GraphPad Prism软件进行曲线拟合确定的。vMyx-三重展示出对多种人肉瘤细胞系的抑制，其中EC50示出于表4中。

实施例8-vMyx-三重对人急性髓性白血病样品的离体抑制

测试了vMyx-三重杀伤来自患者的人癌细胞的能力。将来自人患者的急性髓性白血病(AML)样品以范围为0.01FFU/细胞至100FFU/细胞的6种不同的感染复数(MOI)离体暴露于vMyx-三重或亲本病毒vMyx-GFP。在连续培养6天的孵育之后，使用CellTiter-Glo细胞活力测定测试细胞活力。将每个样品的IC₅₀计算为实现最大生长抑制的50％的MOI，如通过使用非线性回归分析经由GraphPad Prism软件进行曲线拟合确定的。

如图11A中所示，对于暴露于亲本病毒的三个样品中的两个未计算出IC₅₀，而对于另一样品计算出19660的IC₅₀。如图11B中所示，vMyx-三重表现出对人AML样品的优异抑制，其中IC₅₀计算为4.203、6.524和10.25。结果显示vMyx-三重可以抑制来自人癌症患者的癌细胞的生长，并且与缺乏TNF、饰胶蛋白聚糖和IL-12并且含有完整野生型M153基因的亲本病毒相比表现出优异的抗癌作用。

实施例9-经MYXV感染的PBMC的细胞因子产生

测试了vMyx-三重引发人外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子产生的能力。将人PBMC用MYXV各自以10MOI感染。所用的MYXV是vMyx-三重(“人三重”)、亲本病毒vMyx-GFP(“亲本MYXV”)、vMyx-hTNFa-GFP(“TNF单一”)和在细胞表面上表达TNF的MYXV(“膜结合TNF”)。在细胞表面上表达TNF的MYXV编码SEQ ID NO:45的TNFα，其含有将保持膜结合的改变的TNFα序列。

将未处理PBMC用作阴性对照，并且由抗CD3/抗CD28共刺激激活的PBMC用作阳性对照。在感染后4小时和16小时，收获上清液，并且使用MesoScale Discovery(MSD)U-Plex 6-测定96-孔SECTOR板分析其中IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-2、IL-4和TNFα的浓度。图12A说明了在感染后4小时的上清液中细胞因子的平均(+/-SD)浓度，而图12B说明了在感染后16小时的上清液中细胞因子的平均(+/-SD)浓度。当不存在条柱时，这指示细胞因子水平低于测定的检测限。

结果证明，vMyx-三重病毒引发人PBMC的细胞因子(包括IL-12和TNFα)的产生。响应于用vMyx-三重的感染而观察到的IL-12的水平高于对于其他病毒中的任一种观察到的水平。另外，响应于vMyx-三重病毒，特别是在感染后4小时观察到更高水平的IFN-γ。

实施例10-vMyx-三重在人异种移植肿瘤模型中的抗癌活性

在异种移植模型中测试vMYX三重在体内抑制人肿瘤生长的能力。将人癌细胞系NCI-H1971(肺癌)、A673(肉瘤)和SJSA-1(肉瘤)以500万个肿瘤细胞/小鼠皮下植入至免疫缺陷小鼠(针对NCI-H1975和SJSA-1为无胸腺裸小鼠，针对A673为CD17.SCID小鼠)的侧腹中。将荷瘤动物随机化至治疗组中，每组7-8只动物，平均肿瘤体积为100-150mm³。将动物用剂量为1x10⁷个转化灶灶形成单位(FFU)或2x10⁷FFU的vMyx-三重的肿瘤内注射进行治疗。将剂量每周一次(QW)、每4天一次(Q4D)或每两天一次(Q2D)施用。每周三次测量肿瘤体积和体重。

图13A绘制了NCI-H1971(肺癌)异种移植肿瘤随时间的体积，其显示vMYX三重的肿瘤内注射在此模型中以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长。

图13B绘制了A673(肉瘤)异种移植肿瘤随时间的体积，其显示施用vMYX三重在此模型中更频繁地导致对肿瘤生长的更大抑制。

图13C绘制了SJSA-1(肉瘤)异种移植肿瘤随时间的体积，其显示施用vMYX三重在此模型中更频繁地导致对肿瘤生长的更大抑制。

这些结果证明，vMYX-三重可以在体内抑制人肿瘤的生长，即使在免疫缺陷宿主的背景下。

实施例11-人异种移植肿瘤模型中的IL-12和TNFα产生

在异种移植模型中测试vMYX三重在体内引发IL-12和TNFα产生的能力。将人肉瘤癌细胞系SJSA-1和A673皮下植入至免疫缺陷小鼠(针对SJSA-1为无胸腺裸鼠，针对A673为CD17.SCID小鼠)的侧腹中。在植入后第1天将荷瘤动物经由2x10⁷FFU vMYX三重的肿瘤内(IT)或静脉内(IV)注射进行治疗(n＝3只动物/组)。在治疗后4和24小时收集血清样品。在治疗后24小时收集肿瘤并且将其处理用于细胞因子测量。使用MesoScale Discovery(MSD)U-Plex 6-测定96-孔SECTOR板进行细胞因子分析。

图14A示出了在携带SJSA-1肿瘤的动物中，在治疗后4和24小时的血清中和在治疗后24小时的肿瘤中检测的IL-12和TNFα的浓度。绘制了平均值±SD。当不存在条柱时，分析物的水平低于测定的检测限。

图14B示出了在携带A673肿瘤的动物中，在治疗后4和24小时的血清中和在治疗后24小时的肿瘤中检测的IL-12和TNFα的浓度。绘制了平均值±SD。当不存在条柱时，分析物的水平低于测定的检测限。

结果证明，用vMYX三重的静脉内和肿瘤内治疗可以引起肿瘤内的IL-12和TNFα产生，以及增加循环中细胞因子的水平。

实施例12-M153KO MYXV在体内的抗肿瘤功效

此实施例比较了由M153基因敲除的MYXV与表达野生型M153的MYXV实现的肿瘤生长抑制的程度。两种MYXV病毒含有用于表达TNF的转基因，其插入在M135与M136区域之间。

将B16-F10小鼠黑素瘤细胞植入至C57BL/6小鼠中。将荷瘤动物随机化至治疗组中，每组8只动物，平均肿瘤体积为75-100mm³。在随机化后第1天和第8天将动物经由2x10⁷FFU/剂量的所指示黏液瘤病毒的肿瘤内注射进行治疗。

图15绘制了随时间的肿瘤体积，并且显示与表达野生型M153的病毒相比，敲除M153的病毒在更大程度上抑制肿瘤生长。

实施例13-vMYX小鼠三重在MC38癌症模型中的抗肿瘤功效

在MC38小鼠模型中评价vMyx-三重的抗癌功效。向C57BL/6小鼠中植入MC38小鼠结肠直肠癌细胞。将荷瘤动物随机化至治疗组中，每组8只动物，平均肿瘤体积为75-100mm³。将动物用所指示的黏液瘤病毒经由2x10⁷FFU/剂量的肿瘤内(IT)注射进行治疗，每4天一次，共四个剂量。

小鼠三重低是指表达相对低水平的鼠IL-12而非人IL-12的vMyx-三重。小鼠三重高是指表达相对高水平的鼠IL-12而非人IL-12(作为具有接合IL-12亚基的弹性蛋白接头的单一多肽)的vMyx-三重。小鼠三重病毒还表达人饰胶蛋白聚糖和TNF，并且敲除了M153基因。GFP是指vMyx-GFP，其不编码任一种细胞因子，并且含有完整野生型M153基因。

每周三次记录肿瘤体积测量值，并且绘制在图16A中。存活绘制在图16B中。当肿瘤体积≥1500mm³(对于个体动物)时，或者当动物满足终末期处死的IACUC指南时，满足存活终点。

这些结果显示，在此模型中，MYXV可以抑制体内肿瘤生长，并且表达高水平的小鼠IL-12的MYXV表现出对肿瘤生长的更大抑制。

实施例14-vMYX小鼠三重在B16-F10癌症模型中的抗肿瘤功效

在B16-F10小鼠模型中评价表达小鼠IL-12的vMyx-三重的抗癌功效。向C57BL/6小鼠中植入B16-F10小鼠黑素瘤细胞。将荷瘤动物随机化至治疗组中，每组8只动物，平均肿瘤体积为75-100mm³。在第1天和第8天将动物用所指示的黏液瘤病毒经由2x10⁷FFU/剂量的肿瘤内注射进行治疗。

小鼠三重低是指表达相对低水平的鼠IL-12而非人IL-12的vMyx-三重。小鼠三重高是指表达相对高水平的鼠IL-12而非人IL-12(作为具有接合IL-12亚基的弹性蛋白接头的单一多肽)的vMyx-三重。小鼠三重病毒还表达人饰胶蛋白聚糖和TNF，并且敲除了M153基因。GFP是指vMyx-GFP，其不编码任一种细胞因子，并且含有完整M153基因。

每周三次记录肿瘤体积测量值，并且绘制在图17A中。存活绘制在图17B中。当肿瘤体积≥1500mm³(对于个体动物)时，或者当动物满足终末期处死的IACUC指南时，满足存活终点。

结果显示，MYXV可以抑制体内肿瘤生长并且增强存活。与其他两种黏液瘤病毒相比，表达高水平的小鼠IL-12的MYXV在此模型中表现出对肿瘤生长的更大抑制，并且带来更大的存活益处。

实施例15-作为癌症疗法的vMYX小鼠三重的静脉内施用途径与肿瘤内施用途径比较

在小鼠同基因癌症模型中评价vMyx小鼠三重的抗肿瘤功效，其中比较了静脉内与肿瘤内施用途径。向C57BL/6小鼠中皮下植入B16-F10黑素瘤细胞，并且向Balb/c小鼠中皮下植入CT26结肠直肠癌细胞。将荷瘤动物随机化至治疗组中，每组8只动物，平均肿瘤体积为75-100mm³。将动物经由肿瘤内(IT)或静脉内(IV)注射小鼠三重高(即表达相对高水平的鼠IL-12(作为具有接合IL-12亚基的弹性蛋白接头的单一多肽)的MYXV)进行治疗。小鼠三重高还表达人饰胶蛋白聚糖和TNF，并且敲除了M153基因。将四个剂量的2x10⁷个转化灶形成单位(FFU)或1x10⁸FFU施用至每只小鼠，其中每四天施用剂量。每周三次记录肿瘤体积测量值。

图18A示出了患有B16-F10肿瘤的C57BL/6小鼠的肿瘤体积。

图18B示出了患有CT26肿瘤的Balb/c小鼠的肿瘤体积。

与媒介物对照相比，小鼠三重高在测试的所有剂量和施用途径下抑制肿瘤生长。在B16-F10模型中，与1x10⁸或2x10⁷FFU/剂量下的静脉内施用相比，2x10⁷FFU/剂量的肿瘤内注射表现出肿瘤生长的更大抑制。

实施例16-vMYX小鼠三重加免疫检查点抑制剂的组合疗法

经由静脉内注射至尾静脉中向Balb/c小鼠中植入K7M2肉瘤细胞。在肿瘤接种后第3天开始，将动物(n＝10/组)经由向眶后窦中注射2x10⁷FFU/剂量的vMyx-小鼠三重(低IL-12)进行治疗。此黏液瘤病毒表达人饰胶蛋白聚糖、人TNF和相对低水平的小鼠IL-12。vMyx-小鼠三重(低IL-12)还敲除了M153基因。每四天一次施用病毒，共四个剂量。向一些组腹膜内注射10mg/kg的抗PD-1或抗PD-L1抗体，每四天一次，共四个剂量。

图19展示了各组的存活曲线。到植入后大约第80天，未治疗对照组中的所有动物死于感染。在植入后第130天，接受抗PD-1或抗PD-L1的动物的大约30％-40％仍然存活，用vMyx-小鼠三重(低IL-12)治疗的动物的超过50％仍然存活，并且用vMyx-小鼠三重(低IL-12)与抗PD-1或抗PD-L1中任一者的组合进行治疗的动物表现出最高的存活率，其中超过约80％活着。

这些数据显示，本公开的黏液瘤病毒可以改善患有癌症的对象的存活，并且与免疫检查点抑制剂的组合疗法仍可以进一步改善存活。

在单独实验中，在侧腹上向C57BL/6小鼠皮下植入MC38小鼠结肠直肠癌细胞。将荷瘤动物随机化至治疗组中，每组8只动物，平均肿瘤体积为75-100mm³。

在随机化后第1天和第8天将动物用vMyx-小鼠三重(低IL-12)经由2x10⁷FFU/剂量的肿瘤内注射进行治疗。向一些组腹膜内注射10mg/kg的抗PD-1抗体，每四天一次，共四个剂量。每周三次测量肿瘤体积和体重。

图20A绘制了随时间的肿瘤体积。媒介物治疗的对照小鼠的肿瘤体积示出为通过实体线连接的圆圈。与媒介物治疗的对照相比，用单独的vMyx-小鼠三重治疗的小鼠(正方形)表现出降低的肿瘤体积和延迟的肿瘤生长，用单独的抗PD-1治疗的小鼠(伴有虚线的圆圈)也是如此。在接受vMyx-小鼠三重和抗PD-1两者的组(三角形)中观察到肿瘤生长的最大抑制。

图20B示出了各组的存活曲线。与肿瘤体积相似，接受vMyx-小鼠三重和抗PD-1两者的组表现出最佳的存活概况。

这些数据显示，本公开的黏液瘤病毒可以抑制肿瘤生长并且增强患有癌症的对象的存活，并且与免疫检查点抑制剂的组合疗法可以具有协同效应。

另外的序列

表5中示出了与本文所述的组合物和方法相对应的示例性序列。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员容易理解的是，这样的实施方案只是以示例的方式提供的。本领域技术人员现将会在不偏离本发明的情况下想到许多更改、改变和替代。应当理解，本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。以下权利要求书旨在限定本发明的范围，并因此覆盖这些权利要求书范围内的方法和构造物及其等效项。

序列表

<110> 亚利桑那州立大学董事会

昂科米克斯治疗公司

<120> 用黏液瘤病毒治疗癌症的新型溶瘤病毒平台

<130> 42206-721.601

<140>

<141>

<150> 62/944,233

<151> 2019-12-05

<150> 62/894,925

<151> 2019-09-02

<160> 54

<170> PatentIn版本 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

引物

<400> 1

ggggacaact tttctataca aagttgccaa aaattgaaat tttatttttt ttttttggga 60

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

引物

<400> 2

ggggacacct ttattataca aagttgaggg caatgatccc aaagt 45

<210> 3

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

引物

<400> 3

gggacaactt ttctatacaa agttgccaaa attgaaattt tatttttttt ttttggaata 60

taaataatga aggccactat catcctcc 88

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

引物

<400> 4

ctggatctat caacaggagt ccaagcttac ttatagtttc cgagttg 47

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

引物

<400> 5

gcttggactc ctgttgatag atccagaaaa attgaaattt tatttttttt ttttggaata 60

taaataatgt gtcaccagca gttggtcatc 90

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

引物

<400> 6

ggggacaact ttattataca aagttgttta ggaagcattc agatagctca tc 52

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

引物

<400> 7

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc gtagacgcgg tgtttctatc c 51

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

引物

<400> 8

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta aacgtaacac cgtaactgcc 50

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

引物

<400> 9

atggctactg ttgtaaacat gg 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

引物

<400> 10

ctaagcgggt gactccacga cg 22

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

寡核苷酸

<400> 11

ttaaaaattg aaattttatt tttttttttt ggaatataaa ta 42

<210> 12

<211> 702

<212> DNA

<213> 智人

<400> 12

atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60

acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120

gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180

gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct 240

tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300

cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga 360

gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420

aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480

gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540

accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc 600

cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt 660

gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt ga 702

<210> 13

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多核苷酸

<400> 13

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 14

<211> 359

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala

1 5 10 15

Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu

20 25 30

Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro

35 40 45

Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val

50 55 60

Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro

65 70 75 80

Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile

85 90 95

Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu

100 105 110

Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu

115 120 125

Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu

130 135 140

Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn

145 150 155 160

Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met

165 170 175

Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu

180 185 190

Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala

195 200 205

Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr

210 215 220

Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser

225 230 235 240

Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser

245 250 255

Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg

260 265 270

Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu

275 280 285

Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile

290 295 300

Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys

305 310 315 320

Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr

325 330 335

Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala

340 345 350

Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys

355

<210> 15

<211> 250

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala

1 5 10 15

Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu

20 25 30

Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro

35 40 45

Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val

50 55 60

Val Gln Cys Ser Asp Leu Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser

65 70 75 80

Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile

85 90 95

Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro

100 105 110

Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp

115 120 125

Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser

130 135 140

Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro

145 150 155 160

His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro

165 170 175

Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn

180 185 190

Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His

195 200 205

Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro

210 215 220

Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val

225 230 235 240

Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys

245 250

<210> 16

<211> 212

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala

1 5 10 15

Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu

20 25 30

Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro

35 40 45

Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val

50 55 60

Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His

65 70 75 80

Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly

85 90 95

Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala

100 105 110

Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His

115 120 125

Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His

130 135 140

Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser

165 170 175

Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile

180 185 190

Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu

195 200 205

Gly Asn Tyr Lys

210

<210> 17

<211> 172

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala

1 5 10 15

Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu

20 25 30

Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro

35 40 45

Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val

50 55 60

Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro

65 70 75 80

Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile

85 90 95

Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Val Val Tyr Leu

100 105 110

His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro

115 120 125

Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser

130 135 140

Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val

145 150 155 160

Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys

165 170

<210> 18

<211> 75

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala

1 5 10 15

Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu

20 25 30

Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro

35 40 45

Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val

50 55 60

Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Cys Leu Pro Ser

65 70 75

<210> 19

<211> 354

<212> PRT

<213> 鼠属的种

<400> 19

Met Lys Ala Thr Leu Ile Phe Phe Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala

1 5 10 15

Gly Pro Phe Glu Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu

20 25 30

Ala Ser Gly Ile Ile Pro Tyr Asp Pro Asp Asn Pro Leu Ile Ser Met

35 40 45

Cys Pro Tyr Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp

50 55 60

Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Trp Asp Phe Pro Pro Asp Thr Thr Leu

65 70 75 80

Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys Glu Gly Ala Phe

85 90 95

Lys Asn Leu Lys Asp Leu His Thr Leu Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile

100 105 110

Ser Lys Ile Ser Pro Glu Ala Phe Lys Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg

115 120 125

Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro

130 135 140

Arg Thr Leu Gln Glu Leu Arg Val His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Leu

145 150 155 160

Arg Lys Ser Asp Phe Asn Gly Leu Asn Asn Val Leu Val Ile Glu Leu

165 170 175

Gly Gly Asn Pro Leu Lys Asn Ser Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln

180 185 190

Gly Leu Lys Ser Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ser Asp Thr Asn Ile Thr

195 200 205

Ala Ile Pro Gln Gly Leu Pro Thr Ser Leu Thr Glu Val His Leu Asp

210 215 220

Gly Asn Lys Ile Thr Lys Val Asp Ala Pro Ser Leu Lys Gly Leu Ile

225 230 235 240

Asn Leu Ser Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Thr Val Met Glu

245 250 255

Asn Gly Ser Leu Ala Asn Val Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp

260 265 270

Asn Asn Lys Leu Leu Arg Val Pro Ala Gly Leu Ala Gln His Lys Tyr

275 280 285

Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Ala Val Gly Gln

290 295 300

Asn Asp Phe Cys Arg Ala Gly His Pro Ser Arg Lys Ala Ser Tyr Ser

305 310 315 320

Ala Val Ser Leu Tyr Gly Asn Pro Val Arg Tyr Trp Glu Ile Phe Pro

325 330 335

Asn Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn

340 345 350

Tyr Lys

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

寡核苷酸

<400> 20

gaatttcatt ttgttttttt ctatgctata a 31

<210> 21

<211> 355

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多核苷酸

<400> 21

tatgctagta cgtctctcaa ggataagtaa gtaatattaa ggtacgggag gtattggaca 60

ggccgcaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg 120

atagtactaa catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag 180

gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct ggcctaactg gccggtacct 240

gagctctagt ttcactttcc ctagtttcac tttccctagt ttcactttcc ctagtttcac 300

tttccctagt ttcactttcc cctcgaggat atcaagatct ggcctcggcg gccag 355

<210> 22

<211> 762

<212> DNA

<213> 智人

<400> 22

atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60

catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120

ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180

gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240

gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300

gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360

ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420

aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480

atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540

atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600

atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660

gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720

gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aa 762

<210> 23

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多核苷酸

<400> 23

atggtgcgct cctccaagaa cgtcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag 60

ggcaccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 120

ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac 180

atcctgtccc cccagttcca gtacggctcc aaggtgtacg tgaagcaccc cgccgacatc 240

cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 300

gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg ctgcttcatc 360

tacaaggtga agttcatcgg cgtgaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag 420

accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc 480

gagatccaca aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagtcc 540

atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact actacgtgga ctccaagctg 600

gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc agtacgagcg caccgagggc 660

cgccaccacc tgttcctgta g 681

<210> 24

<211> 702

<212> DNA

<213> 智人

<400> 24

atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60

acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120

gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180

gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct 240

tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300

cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga 360

gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420

aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480

gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540

accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc 600

cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt 660

gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt ga 702

<210> 25

<211> 1080

<212> DNA

<213> 智人

<400> 25

atgaaggcca ctatcatcct ccttctgctt gcacaagttt cctgggctgg accgtttcaa 60

cagagaggct tatttgactt tatgctagaa gatgaggctt ctgggatagg cccagaagtt 120

cctgatgacc gcgacttcga gccctcccta ggcccagtgt gccccttccg ctgtcaatgc 180

catcttcgag tggtccagtg ttctgatttg ggtctggaca aagtgccaaa ggatcttccc 240

cctgacacaa ctctgctaga cctgcaaaac aacaaaataa ccgaaatcaa agatggagac 300

tttaagaacc tgaagaacct tcacgcattg attcttgtca acaataaaat tagcaaagtt 360

agtcctggag catttacacc tttggtgaag ttggaacgac tttatctgtc caagaatcag 420

ctgaaggaat tgccagaaaa aatgcccaaa actcttcagg agctgcgtgc ccatgagaat 480

gagatcacca aagtgcgaaa agttactttc aatggactga accagatgat tgtcatagaa 540

ctgggcacca atccgctgaa gagctcagga attgaaaatg gggctttcca gggaatgaag 600

aagctctcct acatccgcat tgctgatacc aatatcacca gcattcctca aggtcttcct 660

ccttccctta cggaattaca tcttgatggc aacaaaatca gcagagttga tgcagctagc 720

ctgaaaggac tgaataattt ggctaagttg ggattgagtt tcaacagcat ctctgctgtt 780

gacaatggct ctctggccaa cacgcctcat ctgagggagc ttcacttgga caacaacaag 840

cttaccagag tacctggtgg gctggcagag cataagtaca tccaggttgt ctaccttcat 900

aacaacaata tctctgtagt tggatcaagt gacttctgcc cacctggaca caacaccaaa 960

aaggcttctt attcgggtgt gagtcttttc agcaacccgg tccagtactg ggagatacag 1020

ccatccacct tcagatgtgt ctacgtgcgc tctgccattc aactcggaaa ctataagtaa 1080

<210> 26

<211> 3936

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多核苷酸

<400> 26

aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata atgaaggcca ctatcatcct 60

ccttctgctt gcacaagttt cctgggctgg accgtttcaa cagagaggct tatttgactt 120

tatgctagaa gatgaggctt ctgggatagg cccagaagtt cctgatgacc gcgacttcga 180

gccctcccta ggcccagtgt gccccttccg ctgtcaatgc catcttcgag tggtccagtg 240

ttctgatttg ggtctggaca aagtgccaaa ggatcttccc cctgacacaa ctctgctaga 300

cctgcaaaac aacaaaataa ccgaaatcaa agatggagac tttaagaacc tgaagaacct 360

tcacgcattg attcttgtca acaataaaat tagcaaagtt agtcctggag catttacacc 420

tttggtgaag ttggaacgac tttatctgtc caagaatcag ctgaaggaat tgccagaaaa 480

aatgcccaaa actcttcagg agctgcgtgc ccatgagaat gagatcacca aagtgcgaaa 540

agttactttc aatggactga accagatgat tgtcatagaa ctgggcacca atccgctgaa 600

gagctcagga attgaaaatg gggctttcca gggaatgaag aagctctcct acatccgcat 660

tgctgatacc aatatcacca gcattcctca aggtcttcct ccttccctta cggaattaca 720

tcttgatggc aacaaaatca gcagagttga tgcagctagc ctgaaaggac tgaataattt 780

ggctaagttg ggattgagtt tcaacagcat ctctgctgtt gacaatggct ctctggccaa 840

cacgcctcat ctgagggagc ttcacttgga caacaacaag cttaccagag tacctggtgg 900

gctggcagag cataagtaca tccaggttgt ctaccttcat aacaacaata tctctgtagt 960

tggatcaagt gacttctgcc cacctggaca caacaccaaa aaggcttctt attcgggtgt 1020

gagtcttttc agcaacccgg tccagtactg ggagatacag ccatccacct tcagatgtgt 1080

ctacgtgcgc tctgccattc aactcggaaa ctataagtaa atgtgtcacc agcagttggt 1140

catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc gtggccatat gggaactgaa 1200

gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat gcccctggag aaatggtggt 1260

cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg accttggacc agagcagtga 1320

ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa gagtttggag atgctggcca 1380

gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg ctcctgctgc ttcacaaaaa 1440

ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag aaagaaccca aaaataagac 1500

ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc acctgctggt ggctgacgac 1560

aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga ggctcttctg acccccaagg 1620

ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc agaggggaca acaaggagta 1680

tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca gctgctgagg agagtctgcc 1740

cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat gaaaactaca ccagcagctt 1800

cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac ttgcagctga agccattaaa 1860

gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac acctggagta ctccacattc 1920

ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag agcaagagag aaaagaaaga 1980

tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc cgcaaaaatg ccagcattag 2040

cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc gaatgggcat ctgtgccctg 2100

cagttagtat gctagtacgt ctctcaagga taagtaagta atattaaggt acgggaggta 2160

ttggacaggc cgcaataaaa tatctttatt ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg 2220

tgaatcgata gtactaacat acgctctcca tcaaaacaaa acgaaacaaa acaaactagc 2280

aaaataggct gtccccagtg caagtgcagg tgccagaaca tttctctggc ctaactggcc 2340

ggtacctgag ctctagtttc actttcccta gtttcacttt ccctagtttc actttcccta 2400

gtttcacttt ccctagtttc actttcccct cgaggatatc aagatctggc ctcggcggcc 2460

agatgtggcc ccctgggtca gcctcccagc caccgccctc acctgccgcg gccacaggtc 2520

tgcatccagc ggctcgccct gtgtccctgc agtgccggct cagcatgtgt ccagcgcgca 2580

gcctcctcct tgtggctacc ctggtcctcc tggaccacct cagtttggcc agaaacctcc 2640

ccgtggccac tccagaccca ggaatgttcc catgccttca ccactcccaa aacctgctga 2700

gggccgtcag caacatgctc cagaaggcca gacaaactct agaattttac ccttgcactt 2760

ctgaagagat tgatcatgaa gatatcacaa aagataaaac cagcacagtg gaggcctgtt 2820

taccattgga attaaccaag aatgagagtt gcctaaattc cagagagacc tctttcataa 2880

ctaatgggag ttgcctggcc tccagaaaga cctcttttat gatggccctg tgccttagta 2940

gtatttatga agacttgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat gcaaagcttc 3000

tgatggatcc taagaggcag atctttctag atcaaaacat gctggcagtt attgatgagc 3060

tgatgcaggc cctgaatttc aacagtgaga ctgtgccaca aaaatcctcc cttgaagaac 3120

cggattttta taaaactaaa atcaagctct gcatacttct tcatgctttc agaattcggg 3180

cagtgactat tgatagagtg atgagctatc tgaatgcttc ctaagaattt cattttgttt 3240

ttttctatgc tataaatggt gcgctcctcc aagaacgtca tcaaggagtt catgcgcttc 3300

aaggtgcgca tggagggcac cgtgaacggc cacgagttcg agatcgaggg cgagggcgag 3360

ggccgcccct acgagggcca caacaccgtg aagctgaagg tgaccaaggg cggccccctg 3420

cccttcgcct gggacatcct gtccccccag ttccagtacg gctccaaggt gtacgtgaag 3480

caccccgccg acatccccga ctacaagaag ctgtccttcc ccgagggctt caagtgggag 3540

cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gtgaccgtga cccaggactc ctccctgcag 3600

gacggctgct tcatctacaa ggtgaagttc atcggcgtga acttcccctc cgacggcccc 3660

gtaatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctccaccg agcgcctgta cccccgcgac 3720

ggcgtgctga agggcgagat ccacaaggcc ctgaagctga aggacggcgg ccactacctg 3780

gtggagttca agtccatcta catggccaag aagcccgtgc agctgcccgg ctactactac 3840

gtggactcca agctggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt ggagcagtac 3900

gagcgcaccg agggccgcca ccacctgttc ctgtag 3936

<210> 27

<211> 3224

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多核苷酸

<400> 27

aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata atgaaggcca ctatcatcct 60

ccttctgctt gcacaagttt cctgggctgg accgtttcaa cagagaggct tatttgactt 120

tatgctagaa gatgaggctt ctgggatagg cccagaagtt cctgatgacc gcgacttcga 180

gccctcccta ggcccagtgt gccccttccg ctgtcaatgc catcttcgag tggtccagtg 240

ttctgatttg ggtctggaca aagtgccaaa ggatcttccc cctgacacaa ctctgctaga 300

cctgcaaaac aacaaaataa ccgaaatcaa agatggagac tttaagaacc tgaagaacct 360

tcacgcattg attcttgtca acaataaaat tagcaaagtt agtcctggag catttacacc 420

tttggtgaag ttggaacgac tttatctgtc caagaatcag ctgaaggaat tgccagaaaa 480

aatgcccaaa actcttcagg agctgcgtgc ccatgagaat gagatcacca aagtgcgaaa 540

agttactttc aatggactga accagatgat tgtcatagaa ctgggcacca atccgctgaa 600

gagctcagga attgaaaatg gggctttcca gggaatgaag aagctctcct acatccgcat 660

tgctgatacc aatatcacca gcattcctca aggtcttcct ccttccctta cggaattaca 720

tcttgatggc aacaaaatca gcagagttga tgcagctagc ctgaaaggac tgaataattt 780

ggctaagttg ggattgagtt tcaacagcat ctctgctgtt gacaatggct ctctggccaa 840

cacgcctcat ctgagggagc ttcacttgga caacaacaag cttaccagag tacctggtgg 900

gctggcagag cataagtaca tccaggttgt ctaccttcat aacaacaata tctctgtagt 960

tggatcaagt gacttctgcc cacctggaca caacaccaaa aaggcttctt attcgggtgt 1020

gagtcttttc agcaacccgg tccagtactg ggagatacag ccatccacct tcagatgtgt 1080

ctacgtgcgc tctgccattc aactcggaaa ctataagtaa atgtgtcacc agcagttggt 1140

catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc gtggccatat gggaactgaa 1200

gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat gcccctggag aaatggtggt 1260

cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg accttggacc agagcagtga 1320

ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa gagtttggag atgctggcca 1380

gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg ctcctgctgc ttcacaaaaa 1440

ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag aaagaaccca aaaataagac 1500

ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc acctgctggt ggctgacgac 1560

aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga ggctcttctg acccccaagg 1620

ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc agaggggaca acaaggagta 1680

tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca gctgctgagg agagtctgcc 1740

cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat gaaaactaca ccagcagctt 1800

cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac ttgcagctga agccattaaa 1860

gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac acctggagta ctccacattc 1920

ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag agcaagagag aaaagaaaga 1980

tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc cgcaaaaatg ccagcattag 2040

cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc gaatgggcat ctgtgccctg 2100

cagttagtat gctagtacgt ctctcaagga taagtaagta atattaaggt acgggaggta 2160

ttggacaggc cgcaataaaa tatctttatt ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg 2220

tgaatcgata gtactaacat acgctctcca tcaaaacaaa acgaaacaaa acaaactagc 2280

aaaataggct gtccccagtg caagtgcagg tgccagaaca tttctctggc ctaactggcc 2340

ggtacctgag ctctagtttc actttcccta gtttcacttt ccctagtttc actttcccta 2400

gtttcacttt ccctagtttc actttcccct cgaggatatc aagatctggc ctcggcggcc 2460

agatgtggcc ccctgggtca gcctcccagc caccgccctc acctgccgcg gccacaggtc 2520

tgcatccagc ggctcgccct gtgtccctgc agtgccggct cagcatgtgt ccagcgcgca 2580

gcctcctcct tgtggctacc ctggtcctcc tggaccacct cagtttggcc agaaacctcc 2640

ccgtggccac tccagaccca ggaatgttcc catgccttca ccactcccaa aacctgctga 2700

gggccgtcag caacatgctc cagaaggcca gacaaactct agaattttac ccttgcactt 2760

ctgaagagat tgatcatgaa gatatcacaa aagataaaac cagcacagtg gaggcctgtt 2820

taccattgga attaaccaag aatgagagtt gcctaaattc cagagagacc tctttcataa 2880

ctaatgggag ttgcctggcc tccagaaaga cctcttttat gatggccctg tgccttagta 2940

gtatttatga agacttgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat gcaaagcttc 3000

tgatggatcc taagaggcag atctttctag atcaaaacat gctggcagtt attgatgagc 3060

tgatgcaggc cctgaatttc aacagtgaga ctgtgccaca aaaatcctcc cttgaagaac 3120

cggattttta taaaactaaa atcaagctct gcatacttct tcatgctttc agaattcggg 3180

cagtgactat tgatagagtg atgagctatc tgaatgcttc ctaa 3224

<210> 28

<211> 253

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala

1 5 10 15

Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg

20 25 30

Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val

35 40 45

Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro

50 55 60

Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg

65 70 75 80

Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr

85 90 95

Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys

100 105 110

Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu

115 120 125

Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys

130 135 140

Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser

145 150 155 160

Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn

165 170 175

Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn

180 185 190

Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser

195 200 205

Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys

210 215 220

Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala

225 230 235 240

Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser

245 250

<210> 29

<211> 328

<212> PRT

<213> 智人

<400> 29

Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu

1 5 10 15

Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val

20 25 30

Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu

35 40 45

Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln

50 55 60

Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys

65 70 75 80

Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val

85 90 95

Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp

100 105 110

Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe

115 120 125

Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp

130 135 140

Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser

165 170 175

Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu

180 185 190

Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile

195 200 205

Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr

210 215 220

Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn

225 230 235 240

Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp

245 250 255

Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr

260 265 270

Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg

275 280 285

Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala

290 295 300

Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser

305 310 315 320

Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser

325

<210> 30

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多肽

<400> 30

Met Val Arg Ser Ser Lys Asn Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys

1 5 10 15

Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys

35 40 45

Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro

50 55 60

Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile

65 70 75 80

Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg

85 90 95

Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser

100 105 110

Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val

115 120 125

Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp

130 135 140

Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly

145 150 155 160

Glu Ile His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val

165 170 175

Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly

180 185 190

Tyr Tyr Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp

195 200 205

Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu

210 215 220

Phe Leu

225

<210> 31

<211> 233

<212> PRT

<213> 智人

<400> 31

Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala

1 5 10 15

Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe

20 25 30

Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe

35 40 45

Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro

50 55 60

Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser

65 70 75 80

Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu

100 105 110

Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser

115 120 125

Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly

130 135 140

Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

145 150 155 160

Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro

165 170 175

Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu

180 185 190

Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu

195 200 205

Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly

210 215 220

Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

225 230

<210> 32

<211> 359

<212> PRT

<213> 智人

<400> 32

Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala

1 5 10 15

Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu

20 25 30

Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro

35 40 45

Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val

50 55 60

Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro

65 70 75 80

Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile

85 90 95

Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu

100 105 110

Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu

115 120 125

Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu

130 135 140

Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn

145 150 155 160

Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met

165 170 175

Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu

180 185 190

Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala

195 200 205

Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr

210 215 220

Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser

225 230 235 240

Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser

245 250 255

Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg

260 265 270

Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu

275 280 285

Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile

290 295 300

Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys

305 310 315 320

Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr

325 330 335

Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala

340 345 350

Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys

355

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

肽

<400> 33

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 34

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

肽

<400> 34

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 35

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

肽

<400> 35

Gly Gly

1

<210> 36

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

肽

<400> 36

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser

1 5 10 15

Leu Asp

<210> 37

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

肽

<400> 37

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr

1 5 10

<210> 38

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

肽

<400> 38

Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe

1 5 10

<210> 39

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

肽

<400> 39

Glu Ala Ala Ala Lys

1 5

<210> 40

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

肽

<400> 40

Glu Ala Ala Ala Arg

1 5

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

肽

<400> 41

Pro Ala Pro Ala Pro

1 5

<210> 42

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

肽

<400> 42

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

1 5 10

<210> 43

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

肽

<400> 43

Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly

1 5 10

<210> 44

<211> 987

<212> DNA

<213> 智人

<400> 44

atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60

gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120

gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180

accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240

gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300

ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360

aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420

acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480

ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540

agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600

gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660

gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720

ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780

acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840

agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900

cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960

gaatgggcat ctgtgccctg cagttag 987

<210> 45

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多肽

<400> 45

Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala

1 5 10 15

Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe

20 25 30

Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe

35 40 45

Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro

50 55 60

Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Asp Glu Pro Val

65 70 75 80

Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu

85 90 95

Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp

100 105 110

Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln

115 120 125

Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr

130 135 140

His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu

145 150 155 160

Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala

165 170 175

Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln

180 185 190

Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr

195 200 205

Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

210 215 220

<210> 46

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多核苷酸

<400> 46

atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60

acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120

gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180

gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcaga tgagcctgta 240

gcccatgttg tagcaaaccc tcaagctgag gggcagctcc agtggctgaa ccgccgggcc 300

aatgccctcc tggccaatgg cgtggagctg agagataacc agctggtggt gccatcagag 360

ggcctgtacc tcatctactc ccaggtcctc ttcaagggcc aaggctgccc ctccacccat 420

gtgctcctca cccacaccat cagccgcatc gccgtctcct accagaccaa ggtcaacctc 480

ctctctgcca tcaagagccc ctgccagagg gagaccccag agggggctga ggccaagccc 540

tggtatgagc ccatctatct gggaggggtc ttccagctgg agaagggtga ccgactcagc 600

gctgagatca atcggcccga ctatctcgac tttgccgagt ctgggcaggt ctactttggg 660

atcattgccc tgtag 675

<210> 47

<211> 2463

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多核苷酸

<400> 47

aaaattgaaa ttttattttt tttttttgga atataaataa tgaaggccac tatcatcctc 60

cttctgcttg cacaagtttc ctgggctgga ccgtttcaac agagaggctt atttgacttt 120

atgctagaag atgaggcttc tgggataggc ccagaagttc ctgatgaccg cgacttcgag 180

ccctccctag gcccagtgtg ccccttccgc tgtcaatgcc atcttcgagt ggtccagtgt 240

tctgatttgg gtctggacaa agtgccaaag gatcttcccc ctgacacaac tctgctagac 300

ctgcaaaaca acaaaataac cgaaatcaaa gatggagact ttaagaacct gaagaacctt 360

cacgcattga ttcttgtcaa caataaaatt agcaaagtta gtcctggagc atttacacct 420

ttggtgaagt tggaacgact ttatctgtcc aagaatcagc tgaaggaatt gccagaaaaa 480

atgcccaaaa ctcttcagga gctgcgtgcc catgagaatg agatcaccaa agtgcgaaaa 540

gttactttca atggactgaa ccagatgatt gtcatagaac tgggcaccaa tccgctgaag 600

agctcaggaa ttgaaaatgg ggctttccag ggaatgaaga agctctccta catccgcatt 660

gctgatacca atatcaccag cattcctcaa ggtcttcctc cttcccttac ggaattacat 720

cttgatggca acaaaatcag cagagttgat gcagctagcc tgaaaggact gaataatttg 780

gctaagttgg gattgagttt caacagcatc tctgctgttg acaatggctc tctggccaac 840

acgcctcatc tgagggagct tcacttggac aacaacaagc ttaccagagt acctggtggg 900

ctggcagagc ataagtacat ccaggttgtc taccttcata acaacaatat ctctgtagtt 960

ggatcaagtg acttctgccc acctggacac aacaccaaaa aggcttctta ttcgggtgtg 1020

agtcttttca gcaacccggt ccagtactgg gagatacagc catccacctt cagatgtgtc 1080

tacgtgcgct ctgccattca actcggaaac tataagtaaa aaattgaaat tttatttttt 1140

ttttttggaa tataaataat gtgtcctcag aagctaacca tctcctggtt tgccatcgtt 1200

ttgctggtgt ctccactcat ggccatgtgg gagctggaga aagacgttta tgttgtagag 1260

gtggactgga ctcccgatgc ccctggagaa acagtgaacc tcacctgtga cacgcctgaa 1320

gaagatgaca tcacctggac ctcagaccag agacatggag tcataggctc tggaaagacc 1380

ctgaccatca ctgtcaaaga gtttctagat gctggccagt acacctgcca caaaggaggc 1440

gagactctga gccactcaca tctgctgctc cacaagaagg aaaatggaat ttggtccact 1500

gaaattttaa aaaatttcaa aaacaagact ttcctgaagt gtgaagcacc aaattactcc 1560

ggacggttca cgtgctcatg gctggtgcaa agaaacatgg acttgaagtt caacatcaag 1620

agcagtagca gttcccctga ctctcgggca gtgacatgtg gaatggcgtc tctgtctgca 1680

gagaaggtca cactggacca aagggactat gagaagtatt cagtgtcctg ccaggaggat 1740

gtcacctgcc caactgccga ggagaccctg cccattgaac tggcgttgga agcacggcag 1800

cagaataaat atgagaacta cagcaccagc ttcttcatca gggacatcat caaaccagac 1860

ccgcccaaga acttgcagat gaagcctttg aagaactcac aggtggaggt cagctgggag 1920

taccctgact cctggagcac tccccattcc tacttctccc tcaagttctt tgttcgaatc 1980

cagcgcaaga aagaaaagat gaaggagaca gaggaggggt gtaaccagaa aggtgcgttc 2040

ctcgtagaga agacatctac cgaagtccaa tgcaaaggcg ggaatgtctg cgtgcaagct 2100

caggatcgct attacaattc ctcatgcagc aagtgggcat gtgttccctg cagggtccga 2160

tccgttcctg gagtaggggt acctggagtg ggcatggtca gcgttccaac agcctcaccc 2220

tcggcatcca gcagctcctc tcagtgccgg tccagcatgt gtcaatcacg ctacctcctc 2280

tttttggcca cccttgccct cctaaaccac ctcagtttgg ccagggtcat tccagtctct 2340

ggacctgcca ggtgtcttag ccagtcccga aacctgctga agaccacaga tgacatggtg 2400

aagacggcca gagaaaaact gaaacattat tcctgcactg ctgaagacat cgatcatgaa 2460

gac 2463

<210> 48

<211> 3994

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多核苷酸

<400> 48

aaaattgaaa ttttattttt tttttttgga atataaataa tgaaggccac tatcatcctc 60

cttctgcttg cacaagtttc ctgggctgga ccgtttcaac agagaggctt atttgacttt 120

atgctagaag atgaggcttc tgggataggc ccagaagttc ctgatgaccg cgacttcgag 180

ccctccctag gcccagtgtg ccccttccgc tgtcaatgcc atcttcgagt ggtccagtgt 240

tctgatttgg gtctggacaa agtgccaaag gatcttcccc ctgacacaac tctgctagac 300

ctgcaaaaca acaaaataac cgaaatcaaa gatggagact ttaagaacct gaagaacctt 360

cacgcattga ttcttgtcaa caataaaatt agcaaagtta gtcctggagc atttacacct 420

ttggtgaagt tggaacgact ttatctgtcc aagaatcagc tgaaggaatt gccagaaaaa 480

atgcccaaaa ctcttcagga gctgcgtgcc catgagaatg agatcaccaa agtgcgaaaa 540

gttactttca atggactgaa ccagatgatt gtcatagaac tgggcaccaa tccgctgaag 600

agctcaggaa ttgaaaatgg ggctttccag ggaatgaaga agctctccta catccgcatt 660

gctgatacca atatcaccag cattcctcaa ggtcttcctc cttcccttac ggaattacat 720

cttgatggca acaaaatcag cagagttgat gcagctagcc tgaaaggact gaataatttg 780

gctaagttgg gattgagttt caacagcatc tctgctgttg acaatggctc tctggccaac 840

acgcctcatc tgagggagct tcacttggac aacaacaagc ttaccagagt acctggtggg 900

ctggcagagc ataagtacat ccaggttgtc taccttcata acaacaatat ctctgtagtt 960

ggatcaagtg acttctgccc acctggacac aacaccaaaa aggcttctta ttcgggtgtg 1020

agtcttttca gcaacccggt ccagtactgg gagatacagc catccacctt cagatgtgtc 1080

tacgtgcgct ctgccattca actcggaaac tataagtaag cttggactcc tgttgataga 1140

tccagaaaat tgaaatttta tttttttttt ttggaatata aataatgtgt cctcagaagc 1200

taaccatctc ctggtttgcc atcgttttgc tggtgtctcc actcatggcc atgtgggagc 1260

tggagaaaga cgtttatgtt gtagaggtgg actggactcc cgatgcccct ggagaaacag 1320

tgaacctcac ctgtgacacg cctgaagaag atgacatcac ctggacctca gaccagagac 1380

atggagtcat aggctctgga aagaccctga ccatcactgt caaagagttt ctagatgctg 1440

gccagtacac ctgccacaaa ggaggcgaga ctctgagcca ctcacatctg ctgctccaca 1500

agaaggaaaa tggaatttgg tccactgaaa ttttaaaaaa tttcaaaaac aagactttcc 1560

tgaagtgtga agcaccaaat tactccggac ggttcacgtg ctcatggctg gtgcaaagaa 1620

acatggactt gaagttcaac atcaagagca gtagcagttc ccctgactct cgggcagtga 1680

catgtggaat ggcgtctctg tctgcagaga aggtcacact ggaccaaagg gactatgaga 1740

agtattcagt gtcctgccag gaggatgtca cctgcccaac tgccgaggag accctgccca 1800

ttgaactggc gttggaagca cggcagcaga ataaatatga gaactacagc accagcttct 1860

tcatcaggga catcatcaaa ccagacccgc ccaagaactt gcagatgaag cctttgaaga 1920

actcacaggt ggaggtcagc tgggagtacc ctgactcctg gagcactccc cattcctact 1980

tctccctcaa gttctttgtt cgaatccagc gcaagaaaga aaagatgaag gagacagagg 2040

aggggtgtaa ccagaaaggt gcgttcctcg tagagaagac atctaccgaa gtccaatgca 2100

aaggcgggaa tgtctgcgtg caagctcagg atcgctatta caattcctca tgcagcaagt 2160

gggcatgtgt tccctgcagg gtccgatcct agtatgctag tacgtctctc aaggataagt 2220

aagtaatatt aaggtacggg aggtattgga caggccgcaa taaaatatct ttattttcat 2280

tacatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaat cgatagtact aacatacgct ctccatcaaa 2340

acaaaacgaa acaaaacaaa ctagcaaaat aggctgtccc cagtgcaagt gcaggtgcca 2400

gaacatttct ctggcctaac tggccggtac ctgagctcta gtttcacttt ccctagtttc 2460

actttcccta gtttcacttt ccctagtttc actttcccta gtttcacttt cccctcgagg 2520

atatcaagat ctggcctcgg cggccagatg gtcagcgttc caacagcctc accctcggca 2580

tccagcagct cctctcagtg ccggtccagc atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg 2640

gccacccttg ccctcctaaa ccacctcagt ttggccaggg tcattccagt ctctggacct 2700

gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg 2760

gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acatcgatca tgaagacatc 2820

acacgggacc aaaccagcac attgaagacc tgtttaccac tggaactaca caagaacgag 2880

agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc acaacaagag ggagctgcct gcccccacag 2940

aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac 3000

cagacagagt tccaggccat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt 3060

ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc 3120

gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag 3180

ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc 3240

tatctgagct ccgcctgaac aactttgtat aataaagttg ctgaatttca ttttgttttt 3300

ttctatgcta taaatggtgc gctcctccaa gaacgtcatc aaggagttca tgcgcttcaa 3360

ggtgcgcatg gagggcaccg tgaacggcca cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg 3420

ccgcccctac gagggccaca acaccgtgaa gctgaaggtg accaagggcg gccccctgcc 3480

cttcgcctgg gacatcctgt ccccccagtt ccagtacggc tccaaggtgt acgtgaagca 3540

ccccgccgac atccccgact acaagaagct gtccttcccc gagggcttca agtgggagcg 3600

cgtgatgaac ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc caggactcct ccctgcagga 3660

cggctgcttc atctacaagg tgaagttcat cggcgtgaac ttcccctccg acggccccgt 3720

aatgcagaag aagaccatgg gctgggaggc ctccaccgag cgcctgtacc cccgcgacgg 3780

cgtgctgaag ggcgagatcc acaaggccct gaagctgaag gacggcggcc actacctggt 3840

ggagttcaag tccatctaca tggccaagaa gcccgtgcag ctgcccggct actactacgt 3900

ggactccaag ctggacatca cctcccacaa cgaggactac accatcgtgg agcagtacga 3960

gcgcaccgag ggccgccacc acctgttcct gtag 3994

<210> 49

<211> 1475

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多核苷酸

<400> 49

aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata atgagcactg aaagcatgat 60

ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag acaggggggc cccagggctc 120

caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc gtggcaggcg ccaccacgct 180

cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg gaagagttcc ccagggacct 240

ctctctaatc agccctctgg cccaggcaga tgagcctgta gcccatgttg tagcaaaccc 300

tcaagctgag gggcagctcc agtggctgaa ccgccgggcc aatgccctcc tggccaatgg 360

cgtggagctg agagataacc agctggtggt gccatcagag ggcctgtacc tcatctactc 420

ccaggtcctc ttcaagggcc aaggctgccc ctccacccat gtgctcctca cccacaccat 480

cagccgcatc gccgtctcct accagaccaa ggtcaacctc ctctctgcca tcaagagccc 540

ctgccagagg gagaccccag agggggctga ggccaagccc tggtatgagc ccatctatct 600

gggaggggtc ttccagctgg agaagggtga ccgactcagc gctgagatca atcggcccga 660

ctatctcgac tttgccgagt ctgggcaggt ctactttggg atcattgccc tgtagaaaaa 720

ttgaaatttt attttttttt tttggaatat aaataatggt gagcaagggc gaggagctgt 780

tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca 840

gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct 900

gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg 960

tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca 1020

tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga 1080

cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca 1140

tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc 1200

acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc 1260

gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca 1320

tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga 1380

gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg 1440

ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaa 1475

<210> 50

<211> 435

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

多肽

<400> 50

Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val

20 25 30

Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu

35 40 45

Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln

50 55 60

Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys

65 70 75 80

Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr

85 90 95

Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp

100 105 110

Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys

115 120 125

Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln

130 135 140

Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro

145 150 155 160

Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys

165 170 175

Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln

180 185 190

Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu

195 200 205

Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser

210 215 220

Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln

225 230 235 240

Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro

245 250 255

Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val

260 265 270

Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys

275 280 285

Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln

290 295 300

Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Val

325 330 335

Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Met Val Ser Val Pro Thr Ala

340 345 350

Ser Pro Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gln Cys Arg Ser Ser Met Cys

355 360 365

Gln Ser Arg Tyr Leu Leu Phe Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Asn His

370 375 380

Leu Ser Leu Ala Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu

385 390 395 400

Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val Lys Thr

405 410 415

Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp

420 425 430

His Glu Asp

435

<210> 51

<211> 335

<212> PRT

<213> 鼠属的种

<400> 51

Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val

20 25 30

Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu

35 40 45

Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln

50 55 60

Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys

65 70 75 80

Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr

85 90 95

Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp

100 105 110

Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys

115 120 125

Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln

130 135 140

Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro

145 150 155 160

Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys

165 170 175

Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln

180 185 190

Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu

195 200 205

Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser

210 215 220

Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln

225 230 235 240

Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro

245 250 255

Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val

260 265 270

Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys

275 280 285

Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln

290 295 300

Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser

325 330 335

<210> 52

<211> 90

<212> PRT

<213> 鼠属的种

<400> 52

Met Val Ser Val Pro Thr Ala Ser Pro Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

Gln Cys Arg Ser Ser Met Cys Gln Ser Arg Tyr Leu Leu Phe Leu Ala

20 25 30

Thr Leu Ala Leu Leu Asn His Leu Ser Leu Ala Arg Val Ile Pro Val

35 40 45

Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr

50 55 60

Thr Asp Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser

65 70 75 80

Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp

85 90

<210> 53

<211> 236

<212> PRT

<213> 鼠属的种

<400> 53

Met Val Ser Val Pro Thr Ala Ser Pro Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

Gln Cys Arg Ser Ser Met Cys Gln Ser Arg Tyr Leu Leu Phe Leu Ala

20 25 30

Thr Leu Ala Leu Leu Asn His Leu Ser Leu Ala Arg Val Ile Pro Val

35 40 45

Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr

50 55 60

Thr Asp Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser

65 70 75 80

Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr

85 90 95

Ser Thr Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser

100 105 110

Cys Leu Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu

115 120 125

Pro Pro Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile

130 135 140

Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gln Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met

165 170 175

Leu Val Ala Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu

180 185 190

Thr Leu Arg Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val

195 200 205

Lys Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val

210 215 220

Thr Ile Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala

225 230 235

<210> 54

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人工序列的描述：合成的

寡核苷酸

<400> 54

aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata 40

Claims

1.一种具有增强的抗癌活性的黏液瘤病毒(MYXV)，其中所述黏液瘤病毒被基因工程化以减弱其M153蛋白的活性或表达水平。

2.如权利要求1所述的MYXV，其中将所述M153蛋白的活性或表达水平减弱至少80％。

3.如权利要求1或权利要求2所述的MYXV，其中所述MYXV被工程化以在编码所述M153蛋白的核酸中引入突变，其中所述突变包括插入、缺失或置换突变。

4.如权利要求3所述的MYXV，其中所述突变相对于野生型M153蛋白增强了细胞免疫应答活性。

5.如权利要求1所述的MYXV，其中MYXV基因组中编码所述M153蛋白的核酸的至少一部分被敲除。

6.如权利要求1所述的MYXV，其中所述MYXV包含靶向M153转录物的抑制性分子，从而减弱所述M153蛋白的表达。

7.如权利要求6所述的MYXV，其中所述抑制性分子是抑制性RNA。

8.如权利要求7所述的MYXV，其中所述抑制性RNA包括dsRNA、siRNA、反义RNA或miRNA。

9.如权利要求1-8中任一项所述的MYXV，其进一步包含编码非病毒分子的核酸。

10.如权利要求9所述的MYXV，其中所述非病毒分子是肿瘤坏死因子α(TNFα)。

11.如权利要求10所述的MYXV，其中所述TNFα是人TNFα。

12.如权利要求10或11所述的MYXV，其中所述TNFα是可溶性肽。

13.如权利要求10-12中任一项所述的MYXV，其中所述TNFα是膜结合肽或表面结合肽。

14.如权利要求10-13中任一项所述的MYXV，其中所述TNFα通过激活抗肿瘤免疫细胞或诱导癌细胞死亡进一步增强所述MYXV的抗癌活性。

15.如权利要求9所述的MYXV，其中所述非病毒分子是白介素-12(IL-12)。

16.如权利要求15所述的MYXV，其中所述IL-12是人IL-12。

17.如权利要求15或权利要求16所述的MYXV，其中所述IL-12是可溶性肽。

18.如权利要求15-17中任一项所述的MYXV，其中所述IL-12是膜结合肽或表面结合肽。

19.如权利要求15-18中任一项所述的MYXV，其中所述IL-12通过促进免疫细胞分化或引发免疫细胞细胞毒性进一步增强所述MYXV的抗癌活性。

20.如权利要求9所述的MYXV，其中所述非病毒分子是饰胶蛋白聚糖。

21.如权利要求20所述的MYXV，其中所述饰胶蛋白聚糖是人饰胶蛋白聚糖。

22.如权利要求20或21所述的MYXV，其中所述饰胶蛋白聚糖是可溶性肽。

23.如权利要求20-22中任一项所述的MYXV，其中所述饰胶蛋白聚糖是膜结合肽或表面结合肽。

24.如权利要求20-23中任一项所述的MYXV，其中所述饰胶蛋白聚糖通过阻断或降低TGF-β信号传导进一步增强所述MYXV的抗癌活性。

25.如权利要求9所述的MYXV，其中所述核酸编码选自TNFα、IL-12和饰胶蛋白聚糖的至少两种分子。

26.如权利要求9所述的MYXV，其中所述核酸编码TNFα、IL-12和饰胶蛋白聚糖。

27.如权利要求1-24中任一项所述的MYXV，其中所述MYXV来源于洛桑毒株。

28.一种组合物，其包含如权利要求1-27中任一项所述的MYXV和药学上可接受的载体或赋形剂。

29.如权利要求28所述的组合物，其被配制用于全身施用。

30.如权利要求28所述的组合物，其被配制用于局部施用。

31.如权利要求28-30中任一项所述的组合物，其被配制用于肠胃外施用。

32.一种组合物，其包含通过如权利要求1-27中任一项所述的MYXV离体处理的多种细胞，其中所述多种细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓(BM)细胞或其组合。

33.一种在有需要的对象中抑制、减轻或预防癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用如权利要求1-27中任一项所述的MYXV或如权利要求28-32中任一项所述的组合物。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述对象患有所述癌症、疑似患有所述癌症或有患上所述癌症的风险，并且其中所述方法进一步包括选择所述对象。

35.如权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述对象是人。

36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述施用是全身施用。

37.如权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所述施用降低癌细胞活力，或激活所述癌症中的免疫原性细胞死亡。

38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述施用改善所述对象的存活。

39.如权利要求33-38中任一项所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。

40.如权利要求33-38中任一项所述的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、三阴性乳腺癌或黑素瘤。

41.如权利要求33-40中任一项所述的方法，其中所述癌症已经转移到所述对象中的位置。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述位置包括所述对象的肺、脑、肝和/或淋巴结。

43.如权利要求33-42中任一项所述的方法，其进一步包括向所述对象施用另外的治疗剂。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述另外的治疗剂是免疫检查点调节剂。

45.如权利要求43或44所述的方法，其中在施用所述组合物之前向所述对象施用所述另外的治疗剂。

46.如权利要求43或44所述的方法，其中在施用所述组合物之后向所述对象施用所述另外的治疗剂。

47.如权利要求43或44所述的方法，其中所述另外的治疗剂与所述组合物组合施用至所述对象。

48.如权利要求33-47中任一项所述的方法，其中将包含所述多种细胞的所述组合物施用至所述对象，其中所述多种细胞包括对于所述对象为自体的细胞。

49.如权利要求33-47中任一项所述的方法，其中将包含所述多种细胞的所述组合物施用至所述对象，其中所述多种细胞包括对于所述对象为同种异体的细胞。

50.一种重组核酸，其包含MYXV基因组的至少一部分，其中所述MYXV基因组被修饰以降低M153基因的表达。

51.如权利要求50所述的重组核酸，其中所述重组核酸包括DNA。

52.如权利要求50或权利要求51所述的重组核酸，其中MYXV基因组的所述部分被修饰以敲除MYXV基因组的所述部分中所述M153基因的至少一部分。

53.如权利要求50-52中任一项所述的重组核酸，其中所述重组MYXV基因组包含编码TNFα的第一核酸。

54.如权利要求53所述的重组核酸，其中所述TNFα是人TNFα。

55.如权利要求53或权利要求54所述的重组核酸，其中所述第一核酸替换或邻接所述MYXV基因组的M135R基因。

56.如权利要求53-55中任一项所述的重组核酸，其中将所述第一核酸插入在所述MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间。

57.如权利要求53-56中任一项所述的重组核酸，其中所述第一核酸的表达由痘病毒合成早期/晚期(sE/L)启动子驱动。

58.如权利要求50-57中任一项所述的重组核酸，其中所述重组MYXV基因组包含编码白介素-12亚基α(IL-12α)的第二核酸。

59.如权利要求58所述的重组核酸，其中所述IL-12α是人IL-12α。

60.如权利要求58或权利要求59所述的重组核酸，其中IL-12α的表达由内部核糖体进入位点(IRES)驱动。

61.如权利要求58-60中任一项所述的重组核酸，其中所述第二核酸IL-12α破坏所述MYXV基因组的所述M153基因的表达。

62.如权利要求50-61中任一项所述的重组核酸，其中所述重组MYXV基因组包含编码白介素-12亚基β(IL-12β)的第三核酸。

63.如权利要求62所述的重组核酸，其中所述IL-12β是人IL-12β。

64.如权利要求62或权利要求63所述的重组核酸，其中所述第三核酸的表达由sE/L启动子驱动。

65.如权利要求62-64中任一项所述的重组核酸，其中所述第三核酸破坏所述MYXV基因组的所述M153基因的表达。

66.如权利要求50-65中任一项所述的重组核酸，其中所述重组MYXV基因组包含编码饰胶蛋白聚糖的第四核酸。

67.如权利要求66所述的重组核酸，其中所述饰胶蛋白聚糖是人饰胶蛋白聚糖。

68.如权利要求66或权利要求67所述的重组核酸，其中第四核酸的表达由sE/L启动子驱动。

69.如权利要求66-68中任一项所述的重组核酸，其中所述第四核酸破坏所述MYXV基因组的所述M153基因的表达。

70.如权利要求50-69中任一项所述的重组核酸，其进一步包含编码报告标签的第五核酸。

71.如权利要求70所述的重组核酸，其中所述报告标签包括绿色荧光蛋白(GFP)。

72.如权利要求70或权利要求71所述的重组核酸，其中所述第五核酸的表达由sE/L启动子驱动。

73.如权利要求70所述的重组核酸，其进一步包含编码第二报告标签的第六核酸。

74.如权利要求73所述的重组核酸，其中所述第二报告标签包括红色荧光蛋白(RFP)。

75.如权利要求73或权利要求74所述的重组核酸，其中所述第六核酸的表达由痘病毒P11晚期启动子驱动。

76.如权利要求50-75中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含vMyx-hTNFa盒，任选地包含GFP。

77.如权利要求50-76中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含hDecorin-hIL-12盒，任选地包含dsRed。

78.如权利要求50-77中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含vMyx-hTNFa-hDecorin-hIL-12-M153KO(vMyx-三重)盒或由其组成，任选地包含dsRed和/或GFP。

79.一种重组MYXV，其包含如权利要求50-78中任一项所述的重组核酸。

80.一种在有需要的对象中抑制、减轻或预防癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用如权利要求50-79中任一项所述的重组核酸或如权利要求79所述的重组MYXV。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述对象患有所述癌症、疑似患有所述癌症或有患上所述癌症的风险，并且其中所述方法进一步包括选择所述对象。

82.如权利要求80或81所述的方法，其中所述对象是人。

83.如权利要求80-82中任一项所述的方法，其中所述施用是全身施用。

84.如权利要求80-83中任一项所述的方法，其中所述施用降低细胞活力，或激活所述癌症中的免疫原性细胞死亡。

85.如权利要求35-49中任一项或如权利要求80-84中任一项所述的方法，其中所述施用以有效增加所述对象的PBMC中至少两种细胞因子的表达的剂量和时间表施用。

86.如权利要求35-49中任一项或如权利要求80-84中任一项所述的方法，其中所述施用以有效增加所述对象中的癌细胞中至少两种细胞因子的表达的剂量和时间表进行。

87.如权利要求85或权利要求86所述的方法，其中所述至少两种细胞因子包括IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12或TNF-α。

88.如权利要求35-49中任一项或如权利要求80-87中任一项所述的方法，其中所述施用以有效将所述癌症的体积减少至少10％的剂量和时间表进行。

89.如权利要求35-49中任一项或如权利要求80-87中任一项所述的方法，其中所述施用以有效将所述癌症的生长减少至少10％的剂量和时间表进行。

90.如权利要求15所述的MYXV，其中所述IL-12包含IL-12α亚基和IL-12β亚基。

91.如权利要求90所述的MYXV，其中所述IL-12α亚基和所述IL-12β亚基通过多肽接头接合。

92.如权利要求91所述的MYXV，其中所述多肽接头是弹性蛋白接头。

93.如权利要求15所述的MYXV，其中所述MYXV表达低水平的所述IL-12。

94.如权利要求15所述的MYXV，其中所述MYXV表达高水平的所述IL-12。