JPH06504188A - 嚢胞性線維症のための遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 嚢胞性線維症のための遺伝子治療 支援 本発明に関する研究は、国立衛生研究所（米）によって審査の上与えられた助成 金ＤＫ４２７１８、及びＤＫ３９６９０の下に嚢胞性線維症財団、及び合衆国政 府によって支援された。

関連出願 本出願は、表題が“嚢胞性線維症遺伝子”であり、１９８９年８月２２日に出願 され、今では放棄された米国出願一連番号Ｎｏ、３９６．８９４の部分的継続で あり、表題が“嚢胞性線維症遺伝子”であり、１９８９年８月２４日に出願され 、今では放棄された米国出願一連番号Ｎｏ、３９９．９４５の一部の継続である 表題が“嚢胞性線維症遺伝子”であり、１９８９年８月３１日に出願された米国 出願一連番号Ｎｏ、４０１，６０９の一部の継続であり、表題か“嚢胞性線維症 のための遺伝子治療”である１９９０年９月１８日に出願された米国出願一連番 号Ｎｏ、５８４．２７５の恩典を請求する国際出願である。

これらすべての出願は本出願に引用によって明確に組み込まれている。

発明の分野 本発明は一般的には、嚢胞性線維症（ＣＦ）のための遺伝子治療に関し、さらに 詳細には嚢胞性線維症患者における上皮細胞のＣ１−チャンネルの欠陥を補正す るため、嚢胞性線維症の膜横断伝導レギュレーター（ＣＦＴＲ）の遺伝子のトラ ンスファーに関する。

発明の背景 嚢胞性線維症（ＣＦ）は、膵臓、及び肺臓の不全につながる水と電解質の輸送に おける異常を特徴とする常染色体性劣性障害である。Ｔａｕｓｓｉｇ　、　ＬＭ 、編“嚢胞性線維症”におけるＴａｕｓｓｉｇ　、　ＬＭ　の“概要”　（Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　：Ｔｈｉｅｍｅ−Ｓｔｒａｌｔｏｎ　）　、ｌ−９（１９８４） 　、ＣＦはキャリヤー　フリーケンシイ−が５％であり、北米において２５００ 人の出産児のうちほぼ１人が罹患する最もありふれた重篤な常染色体劣性障害の １っである。

ＣＦの欠陥の機能的表現は、表皮細胞のＣＩ！−イオンの透過性か減少すること である。Ｑｕｉｎｔｏｎ　、　Ｐ、Ｍ、。

ＦＡＳＥＢＪ、４：２７０−２７１７　（１９９０）。気道、汗腺、膵臓、及び 他の組織における上皮細胞が、ｃＡＭＰ媒介のアゴニストに応答してＣＩ−を分 泌する能力か失われるか、著しく減少する。ｃＡＭＰ依存性プロティンキナーゼ （ＰＫＡ）による先端膜Ｃｌ−チャンネルの活性化は傷害を受けるが、正常な伝 導特性をもったチャンネルは、その効果か細胞Ｃａ−の増加によって媒介される アゴニストを含めて他の手段によって活性化することかてきる。Ｆｒ１ｚｚｅ１ １．、　Ｒ，Ａ、ら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ。

１０　：１９０−１９３　（１９８７）　：Ｗｅｌｓｈ、Ｍ、Ｊ、。

ＦＡＳＥＢＪ、４：２７１８−２７２５　（１９９０）。これらの知見から、Ｃ Ｆにおいては、ＣＡ’−チャンネル自体には欠陥はなく、欠陥は、プロティンキ ナーゼの活性化の効果を変換する調節性蛋白質に存在するのかもしれないことが 示唆される。ＣＦ細胞における上皮Ｎａ＋ａｌにおける異常の存在により、他の 細胞機能に影響する調節欠陥という考え方がさらに支持される。Ｂｏｕｃｈｅｒ 、　Ｒ，Ｃ。

ら、、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７８　：１２４５−１２５２　（１９８ ６）。

前出の関連出願において詳細に述べられたようにＣＦに対する遺伝子の単離によ り、本疾患の分子レベルの基礎へのさらなる洞察が与えられた。Ｒｏｍｍｅｎｓ 、　Ｊ、Ｍ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４５　：　１０５９−１０６５　（１９８ ９）　；Ｒｉｏｒｄａｎ、　Ｊ、　Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４５　；　１０ ６６−１０７３　（１９８９）　；　Ｋｅｒｅｍ、Ｂ、Ｓ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ 　２４５　；　１０７３−１０８０　（１９８９）も参照のこと。ＣＦの原因で ある遺伝子は、そのゲノム内の位置に基いて、ゲノムＤＮＡの２５０．　００　 ｏｂ、ｐ、に局在していた。この遺伝子は、嚢胞性線維症膜横断レギュレーター （ＣＦＴＲ）と呼ばれる１４８０のアミノ酸からなる蛋白質をコードしている。

Ｒｉｏｒｄｏｎら、上述。

ＣＦの病因におけるＣＦＴＲの役割を裏付けるこれまでに得られている最も説得 力のある証拠は、遺伝学的解析によって提供された。Ｋｅｒｅｍら、上述（１９ ８９）。

ＣＦの染色体のＣＦＴＲ遺伝子の配列の解析によって、ナンセンス変異やフレー ムシフト変異をはじめとする様様な突然変異か明らかとなった。Ｃｕｔｔｉｎｇ 、　Ｇ、Ｒ，ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４６　；　３６６−３６９　（１９９０）　 ；Ｗｈｉｔｅ。

Ｍ、　Ｂ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４４　：　６５５−６７７　（１９９０）；Ｄ ｅａｎ、　Ｍ　ら、Ｃｅ１ｌ　６１：８６３−８７０　（１９９０）：Ｋｅｒｅ ｍ、　Ｂ、Ｓ、　ら、嚢胞性線維症の遺伝子の２つの推定上のヌクレオチド（Ａ ＴＰ）のパインディング　フォールドに相当する領域における変異の同定ＰＮＡ Ｓ　（ＵＳＡ）（１９９０）（印刷中）。しかし、広い人口集団の研究により、 最も普通なＣＦ変異は、フェニルアラニン５０８（ΔＦ、。、）をコードする３ つのヌクレオチドの欠失であることが示された。この欠失はＣＦの染色体すべて の７０％上に存在するが、正常な染色体上には存在しない。Ｋｅｒｅｍら、、上 述（１９８９）　；　ＣｙｓｔｉｃＦｉｂｒｏｓｉｓＧｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌ ｙｓｉｓ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ　（１９９０）　。

生理学的、及び分子クローニング研究の双方からの結果からＣＦＴＲはＣＩ！− チャンネルである可能性か生じた。ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ ）によるＣｌ−チャンネルの活性化における欠陥は、無細胞膜片において単一チ ャンネルレベルで存在し、ＣＦ遺伝子から予知された蛋白質の構造から、膜上に またがる１２の領域を持った膜に絶対に必要な構成蛋白質であることか示唆され ている。Ｓｃｈｏｕｍａｃｈｅｒ、　Ｒ，Ａ、らＮａｔｕｒｅ３３０　：１５２ −７５４　（１９８７）；Ｌｉ、Ｍ、ら、　、　Ｎａｔｕｒｅ３３１　：３５８ −３６０　（１９８８）　；Ｒｉｏｒｄａｎら、、上述。

ａｍｉ　Ｉｏｒｉｄｅ−感受性Ｎａ″″輸送やｍｕｃｉｎの硫酸化のような他の 細胞のプロセスにおけるＣＦ−と結びついた変更の確認は、ＣＦＴＲか、いくつ かの細胞のプロセスを調節している可能性かあるという見解を支持している。

Ｂｏｕｃｈｅｒら、、上述：　Ｂｏａｔ、　Ｆ、Ｔ、ら；　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、１７７　：　９５−１０４　（１９７６）。

ＣＦＴＲがＣＡ−輸送に演じている特定の役割は今後決定されなければならない が、ＣＦＴＲ蛋白質は、２つのヌクレオチドのパインディング　フォールドすな わちリン酸化のための可能性のある多くの部位を有する調節領域、及び細胞膜と 恐らく相互作用するであろう２つの疎水性領域を含むいくつかの興味深い機能領 域を含んでいる。ＣＦＴＲは、原核細胞のペリプラズムの結合蛋白質、及びより 高等な真核細胞における多剤耐性と結びついたＰ−糖蛋白質を含む蛋白質の“Ａ ＴＰ結合カセット“（ＡＢＣ）スーパーファミリーのいくつかのナンバーと構造 的類似性を示している。Ｒｉｏｒｄａｎら、上述；Ｈｙｄｅ、Ｓ、Ｃ，ら、Ｎａ ｔｕｒｅ３４６：３１２−３６５　（１９９０）。

ＣＦの遺伝学的、及び機能的基礎についての我々の理解の最近の進歩によりその 分子レベルの病理学をより良く明確にすること、ならびにツマティック　ジーン 　トランスファーに基いた新しい治療を開発するための基礎が提供された。

発明の要約 嚢胞性線維症（ＣＦ）のための遺伝子治療は、嚢胞性線維症の機能的膜横断伝導 レギュレーター（ＣＦＴＲ）のための遺伝子を罹患した上皮細胞に配送すること から成る。ＣＦのような劣性な形質について期待されるように正常なＣＦＴＲ遺 伝子の単一コピーの配送と発現によってＣＦ細胞中に存在するＣＩ！−チャンネ ルの調節欠陥か軽減される。機能的ＣＦＴＲの欠損、またはＣＦＴＲ遺伝子にお ける欠陥から生ずる生理学的に容認できるレベルより低いＣＦＴＲ機能の存在に よって起るＣＦは、このように本発明の原理にしたがって治療することができる 。

本発明の“正常なＣＦＴＲ遺伝子は、単に機能性ＣＦＴＲをコードする核酸配列 のすへてである。したがって機能性ＣＦＴＲが発現できることを条件として、本 遺伝子の実際の配列における変動は、思容され得る。例えば、遺伝子のクローニ ングを安定化させるためにサイレント突然変異を導入することができる。本発明 の実際において使用されるＣＦＴＲ遺伝子は、ＤＮＡクローニング、人工的構築 、もしくは他の手段のような常法によって得ることかできる。具体例において利 用された４゜６ｋｂｃＤＮＡは、ＣＡＭＰによって刺戟されたＣＺ−の電流の分 析によって測定されるごとく、機能性ＣＦＴＲ蛋白質をコードするのに必要な配 列すべてを持っている。

・　本発明によるＣＦＴＲ遺伝子のトランスファーは、カルシウム　ホスフェー ト共沈澱を用いるトランスフェクション、標的細胞と、ＣＦＴＲ遺伝子を担って いるリポソーム、赤血球ゴースト、またはスフェロプラストの融合、プラスミド 及びウィルスのベクター媒介トランスファー、及びＤＮＡ蛋白複合体媒介シーン トランスファーを含む多くの手段によって達成することかできる。

現在では、選択された配送車はヒト上皮細胞に感染することができる組換え体レ トロウィルスである。これは、ＣＦＴＲ遺伝子が比較的大きいことを考慮すると 、幾分驚くべきことである。本発明のレトロウィルスベクターは、一般的に、少 くとも、感染に必要なレトロウィルスの部分のＤＮＡとそれに対して有効に結合 された正常なＣＦＴＲ遺伝子を含んている。その上、ベクターの構築において使 用されるレトロウィルスのゲノムの部分は、標的細胞上のウィルス複製の存寄作 用を除くため複製欠陥とすることができる。

膵臓や汗腺細胞のようなＣＦ−罹患上皮細胞はすべて本発明のシーントランスフ ァ法とベクターで標的とすることができるが、ＣＦの最も重篤な併発症は通常原 性なので、気道上皮細胞は本発明の遺伝子治療にとって最も好ましい標的である 。さらに、気道上皮細胞は組換え体レトロウィルスによって容易に感染されるこ とが分ったという事実を考慮すると、本発明によるこれらの細胞に対するシーン トランスファーは、極めて実現可能である。

キャリヤーの診断とスクリーニングもＣＦＴＲ欠陥細胞と細胞系のトランスダク ションによって達成することかできる。例えば、本発明の相補性スキームを用い て他の推定上のＣＦ変異の有効性を決定することができ、また位置特異的な突然 変異生成、またはこの大きなＡＢＣ遺伝子ファミリーの他のメンバーとのドメイ ン交換によってＣＦＴＲの機能を研究する道具として有用である。

したかって本発明は、ＣＦ患者に対して機能的ＣＦＴＲ遺伝子の配送と発現を通 じての嚢胞性線維症のための遺伝子治療にむけられている。組換え体レトロウィ ルスベクター、ならびに他のＣＦＴＲシーントランスファースキームを本発明の 実際において使用することができる。本発明は、その原理にしたがってその中に トランスデユースされたか、トランスファーされた正常なＣＦＴＲ遺伝子を担っ ているＣＦ上皮細胞と細胞系の両者をさらに包含する。他の推定上のＣＦ突然変 異のためのスクリーニング及び相補性検定も、本発明の範囲に入れて考えられる 。

図面の簡単な説明 ［ＮＩＡには、本発明の組換え体レトロウィルスベクターＰＬＪ−ＣＦＴＲのプ ロウィルス成分か描かれている。

図ＩＢには、制限酵素ＫｐｎＩで処理したＤＮＡのＮｅｏ特異性プローブを使用 してのゲルプロットハイブリッド形成（上図）とＨｉｎｄｌＩＩて消化したＤＮ Ａのエキラン１３ＣＦＴＲ特異的プローブを使用してのゲルプロットバイブリド 形成（下図）の結果か示されている。

図２は、ＣＦＰＡＣクローン中のレトロウィルスでトランスデユースされたＣＦ ＴＲ遺伝子の発現のＣＦＴＲエキソン１３プローブを使用したＲＮＡプロット分 析である。

図３Ａは、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎのＰＬＪとＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンにおける　 ｕｓ　■の流出に対する継時効果を図解しているグラフである。

図３Ｂは、ＰＬＪとＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンにおける　１２５　■流出に対す るｆｏｒｓｋｏｌｉｎの効果を、　１２Ｓ■ノ基礎流出と比較して図解している グラフである。

図４Ａは、ＰＬＪ−ＣＦＴＲクローン１におけるｆｏｒｓｋｏｌｉｎによる内方 への電流の刺戟作用の全細胞のボルテージクランプレコードである。

図４Ｂは、ＰＬＪクローン６細胞においてはｃＡＭＰまたはｆｏｒｓｋｏｌｉｎ が膜電流を刺戟することが出来ないことを図解している。

図４ＣはＮａＣ１、低ＣＺ−及びＮａ３を含まない水浴中におけるｆｏｒｓｋｏ ｌｉｎ−誘発電流についての電流−電圧の即時的関係を描くグラフである。

図５は、論理的に推理されたアミノ酸配列とともにＣＦＴＲをコードしているｃ ＤＮＡのヌクレオチド配列である。

図６はＣＦＴＲ構築物のための安定化スキームを描いている。

図７は、本発明の実際において使用されるプラスミドに基くベクターの制限酵素 地図である。

本発明のより好ましい態様の詳細な記述機能的ＣＦＴＲの不在、または生理学的 に容認し得るレベルにないＣＦＴＲ遺伝子の欠陥から生ずるＣＦＴＲの機能か、 正常なＣＦＴＲ遺伝子をＣＦＴＲ欠陥細胞にトランスファーすることによって治 療される。

“ＣＦＴＲＩ能の生理学的に容認できるレベルと細胞集団、または患者に”、正 常な量のＣＦＴＲの存在か認められ正常な生理学的効果を示すということである 。

ＣＦＴＲｔｌ能不全の例には、嚢胞性線維症において示されたような上皮細胞に おけるＣＩ！−チャンネルの調節異常か含まれるが、これに限られるわけではな い。

本発明の組換え体ウィルスベクターは、少くとも標的細胞に感染することができ るレトロウィルスのゲノムの部分とそれに有効に連結された正常なＣＦＴＲ遺伝 子から成っている。感染とは、一般的には、ウィルスがその宿主、または標的細 胞へ遺伝子物質をトランスファーする過程のことである。本発明のベクターの構 築において使用されるしトロウィルスはまた、望ましくは、標的細胞上のウィル スの複製の効果を除去するために複製欠陥にされる。この様な場合には、複製欠 陥ウィルスゲノムは、在来技術にしたがってヘルパーウィルスと組み合せてパッ ケージすることかできる。一般に、感染性とＣＦＴＲ遺伝子のトランスファーの 能力の上記の基準を満たすレトロウィルスは、すべて、本発明の実際において使 用することかできる。本発明の実施のための適切なレトロウィルスには例えば、 この分野の技術に熟達している人々にとって良く知られているＰＬＪ、ｐＺｉｐ 。

ｐ　Ｗ　ｅ　、及びｐＥＭかある。複製−欠陥レトロウィルスのための適切なパ ッケージングウィルス系には、例えば、ＩＦＣｒ　ｉｐ、ＷＣｒｅ及びＷ２、な らびに曹Ａｍかある。

ＣＦＴＲ）ランスファーにウィルスベクタースキームが用いられるとき、毒性が 減弱されたか、または無毒性のウィルスがやはり望ましいことは評価される。発 明の実際において適用可能な場合においては、ＣＦＴＲ遺伝子の増幅も、正常Ｃ ＦＴＲの発現のレベルを増強するために利用することができる。

レトロウィルスと組換えを行うべき、または本発明の他の方法によってトランス ファーされるへき、遺伝物質は、在来のクローニング法、すなわちｃＤＮＡ、オ ーバーラッピングオリゴヌクレオチド配列による、または望ましい配列が得られ る他の適切な方法すべてによって提供されることがより好ましい。診断的、また はスクリーニング検定に使用されるときは、遺伝物質は、通常、患者のＤＮＡの クローニングによって、または、代替法として患者のゲノムＤＮＡの使用によっ て提供される。既に述べた如く、正常ＣＦＴＲ遺伝子とは、機能性ＣＦＴＲをコ ードする核酸配列のすへてのことである。

本発明にしたかうトランスダクション、またはシーントランスファーのための標 的となる細胞はＣＦＴＲの配送か望ましいすへての細胞を含む。一般的に言って 、この細胞は、ＣＦ細胞のようなＣＦＴＲ遺伝子の欠陥を持った細胞である。Ｃ Ｆの場合では、標的とされる細胞は、膵臓、汗腺、肝臓、小腸、腎臓そして肺の 細胞のような、もっと好ましくさえある上皮気道細胞を含む、上皮細胞であるこ とがより好ましい。

ましくは生物学的に適合性の溶液、または医薬的に受容できる配送車において、 摂取、注射、吸入、もしくは他のいかなる方法によっても患者に投与することが できる。

投薬量は患者によって異なり、危険、あるいは存寄な副作用とバランスをとった ＣＦＴＲ機能の強化のレベルによって決定される。トランスダクションのレベル 、ＣＦＴＲの発現、及びまたは正常ＣＦＴＲの存在、またはレベルをモニターす ると、投薬量を選択し、調節するのに役立つ。ｉｎ　ｖｌｔｒｏ　ｈランスダク ションも本発明中に考察されている。欠陥ＣＦＴＲ遺伝子を有する細胞集団は患 者から取除くことかできる。または、本発明の原理にしたかって正常なＣＦＴＲ 遺伝子でトランスデユースし、次に患者に導入することかできる。

形質転換を受けたＣＦ細胞系のようなＣＦＴＲ欠陥細胞系も本発明にしたかって トランスデユースすることかできる。このような細胞系は、例えば、ＣＦ突然変 異を評価してＣＦを診断し、キャリヤーをスクリーニングするための相補性検定 に役立つ。例えば患者のＣＦＴＲｃＤＮＡをＣＦ細胞にトランスファーすること がてき、その細胞を相補性について、すなわちＣＦＴＲ機能についてスクリーニ ングし、ＣＦ、または、ＣＦＴＲ遺伝子欠陥を確認、もしくは除外することかで きる。

以下に続く具体例の最初のセットにおいては、レトロウィルス媒介の遺伝子トラ ンスファーを用いてＣＦ患者の上皮細胞でのＣ１７−の調節における嚢胞性線維 症（ＣＦ）欠陥を補った。両種指向性レトロウィルスを使用して、嚢胞性線維症 機能性膜横断伝導レギュレーター（ＣＦＴＲ）のｃＤＮＡをＣＦの患者起源の膵 臓腺癌細胞系へトランスデユースした。この細胞系は、ＣＦ欠陥の特徴である電 解質輸送における異常、すなわちｃ　Ａ　Ｍ　Ｐによって刺戟されたＣ１−輸送 が欠けているという異常を安定して発現した。ＣＦＰＡＣ−１細胞を対照ウィル スに（ＰＬＪ）とＣＦＴＲ−発現ウィルス（ＰＬＪ−ＣＦＴＲ）に暴露した。ウ ィルスでトランスデユースされたクローンを単離し、分子解析と生理学的解析に かけた。アガロースゲルプロット分析によってＩＯこのＰＬＪクローンのうち１ ０こにおいて転位していないプロウィルス配列か明らかになった。ＲＮＡ分析に よりＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンのすへてにおいてウィルス起源のＣＦＴＲ転写物 か検出された。ＲＮＡ分析により転位していないプロウィルス排列を含んていた ＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンのすへてにおいてウィルス起源のＣＦＴＲ転位物か検 出された。

ＰＬＪとＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンをｃＡＭＰ、及びカルシウムによって刺戟さ れる陰イオン輸送について検へるために陰イオン（＋２Ｊ）の流出を用いた、細 胞内ｃＡＭＰを増加する作用体はＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンにおいて＋２６　■ 流出を刺戟したがＰＬＪては刺戟しなかった。２この応答性のクローンについて 行われた全細胞パッチ−クランプによって陰イオン流出応答はＣＩ！−伝導のｃ ＡＭＰによる促進のためであることが示された。

カルシウムのイオノフすアは、すへてのＰＬＪとＰＬＪ−ＣＦＴＲのクローンに おいて１１５Ｉ流出とＣｌ−の流れを増加した。これらの知見から、正常なＣＦ 　ＴＲ１！伝子の発現は、ＣＦ上皮細胞にｃＡＭＰ−依存性のＣＩ！−チャンネ ルの調節を付与することか示唆される。

具体例の２番目のセットには、気道上皮細胞ならびに膵臓細胞へのシーントラン スファー、ＣＦＴＲ遺伝子治療の実行、及びリポフェクション及びＤＮＡ−蛋白 複合体媒介ジーントランスファーを含む代替法としてのシーントランスファー配 送システムか記述されている。

組換え体レトロウィルス オーバーラッピングクローンからＣＦＴＲｃＤＮＡの全長を再構成する初期の試 みは不成功であった。これらの困難は今後明確にしなければならないか、我々の データは、ＣＦＴＲｃＤＮＡの内部配列からの原核細胞性の転写の結果、バクテ リアに対して毒性がある蛋白質の発現か起る可能性を示していた。エキソン６ｂ にまたがっているＣＦＴＲの制限酵素断片への３つのサイレントミューチージョ ン（９３０におけるＣに対するＴ、９３３におけるＧに対するＡ１及び９３６に おけるＣに対するＴ）の導入は、可能性として隠れた原核細胞性プロモーターを 妨害することによってこの毒性効果を完全に除去し、連続したＣＦＴＲｃＤＮＡ 排列の４．６ｋｂの再構築を可能にした。この再構築されたｃＤＮＡのヌクレオ チド配列は再び決定され、上に記した３つのサイレントミューチージョンを例外 として以前に発表された配列と同一であった。上記のＲｉｏｒｄａｎらを参照の こと。

請求項の前に提示された配列のリストはＣＦ膜横断伝導レギュレーターをコード するヌクレオチド配列を、それから推定したアミノ酸配列とともに図示している 。

ＤＮＡの配列決定は、３５Ｓ−標識ヌクレオチドについてのディデオキシチェイ ンターミネーション法によるか、Ｄｕｐｏｎｔ　Ｇｅｎｅｓｉｓ２０００自動Ｄ ＮＡシークエンサーによって行われた。図５のカラムの右の数字は塩基の位置を 示す。最初の塩基の位置は、ＴＢ２−７よりも１ヌクレオチドだけ大きい５′− 拡張クローンＰＡ３−５の最初の位置に相当する。３′末端とノンコープインク 配列も図中に示されている（ヌクレオチド４５６１から６１２９＋ポリ（Ａ）＋ テール）。示されている矢印はブライマーエクステンション分析による転写開始 部位の位置を示している。図に簡略化されて示されているように、ヌクレオチド ６１２９にポリ（Ａ）トラクトが続いている。

エキノンの接合部は以下の塩基の位置の間である＝１８５−１８６＋２９６−２ ９７＋４０５−４０６；６２１−６２２．７１１−７１２．１００１−１００２ ：１２４８−１２４９；１３４１−１３４２；１５２３−１５２４；１７１６− １７１７：１８１１−１８１２；１８９８−１８９９；２６２１−２６２２；２ ７８９−２７９０：３０４０−３０４１　；３１２０−３１２１；３４９９−３ ５００：３５９９−３６００；３８４９−３８５０＋４００５−４００６；４０ ９５−４０９６；４２６８−４２６９．及び４３７４−４３７５゜ポテンシャル な膜にまたがる部分は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｔら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１ ７９　：　ｌ　２５　（１９８４）のアルゴリズムの使用で確められ、図中のア ミノ酸の略号の下にアンダーラインか引かれている。推定上のＡＴＰ−パインデ ィングフォールドは図中のアミノ酸の略号のＦにアンダーラインか引かれている 。プロティンキナーゼＡ、またはＣによるリン酸化の可能な位置は、ｏ、！−” によってそれぞれ示されており、＋はグルコシル化の位置を示している。白の三 角は、ＣＦにおいて３ｂｐが欠失している位置を示す。図５に使用されるアミノ 酸残基に対する略号はＡ、Ａｌａ　；Ｃ，Ｃｙｓ　；Ｄ、Ａｓｐ：Ｅ、Ｇｌｕ　 ；Ｆ、Ｐｈｅ；Ｇ、Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；ｌｉｅ；に、Ｌｙｓ　；　Ｌ、Ｌｅｕ 　；Ｍ、Ｍｅ　ｔ　；Ｎ、Ａｓｎ　；　Ｐ。

Ｐｒｏ；Ｑ、Ｇｉｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ、Ｓｅｒ　；Ｔ。

Ｔｈｒ　；Ｖ、　Ｖａ　１　；Ｗ、　Ｔｒｐ　；そしてＹ、Ｔｒｙである。

修飾されたＣＦＴＲｃＤＮＡは、Ｋｏｒｍａｎ、　Ａ、Ｊ、ら、ＰＮＡＳ（ＵＳ Ａ）８４：２１５０−２１５４　（１９８７）によって以前に記述されたレトロ ウィルスベクターにクローニングされた。ＰＬＪ−ＣＦＴＲと呼ばれるこの組換 え体のプロウィルスは図ＩＡに描かれている。図において説明されているこのベ クターの重要な構造成分は、ロングターミナルリピート配列（ＬＴＲ）、ＣＦＴ ＲｃＤＮＡＳＳＶ４０に由来する配列、０４１８（Ｎｅｏ）及びｐＢＲ３２２（ ｐＢＲ）のための複製の起点が含まれている。５’　ＬＴＲからの転写は、ウィ ルスの継代とＣＦＴＲの発現の原因である８、５ｋｂゲノム転写物を造り出す。

ＳＶ４０配列からの転写は、Ｎｅ。

セレクタブルマーカーを発現する２番目の転写単位の生成に導かれる。転写開始 部位は、図ＩＡに示されてあり、５’ＬＴＲとインターナルＳＶ４０配列に矢印 かつけである。制限酵素エンドヌレアーゼＫｐｎＩとＨｉｎｄｌ［［の認識部位 も示されている。ＤＮＡとＲＮＡプロット分析において使用されたＣＦＴＲ遺伝 子（エキノン１３）とＮｅｏ遺伝子はベクターの下に示されている。

ＰＬＪとＰＬＪ−ＣＦＴＲのベクターのウィルスパッケージング細胞系曹Ｃｒ１ ｐへのトランスフェクションは、複製欠陥ウィルスの一過性の産生へと導かれた 。ウィルスストックの限界希釈法を用いてＣＦＰＡＣ−１細胞に感染させ、トラ ンスデユースしたクローンを選択するために０４１８の存在下てその後培養した 。一過性に産生されたＰＬＪ−ＣＦＴＲウィルスストックは、ＰＬＪベクターで 産生されたものよりタイターが低かった（５０−１００倍）。細胞のＩＯこの個 々のクローンか各種のウィルス（ＰＬＪクローンＩからＩＯまで、及びＰＬＪ− ＣＦＴＲクローンｌから１０まてと名ずけられた）で感染させ、感染体を単離し 、分子分析と生理学的分析にかけた。

トランスデユースされたクローンはレトロウィルスのＣＦＴＲ配列を発現する。

ＣＦＰＡＣ−１のレトロウィルスでトランスデユースされたクローンをプロウィ ルス配列についてＷｉｌｓｏｎ、　Ｊ。

Ｍ、ら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）８５．４４２１〜４４２５（１９８８）、及びＷ ｉｌｓｏｎ、Ｊ、Ｍ、ら、　、５ｃｉｅｎｃｅ　２４　Ｂ　：１４１３−１４１ ６　（１９９０）によって他の細胞種について記述されたように分析された。Ｃ ＦＰＡＣ−１細胞をＰＬＪ、またはＰＬＪ−ＣＦＴＲて感染させ、各クローンを 単離するために０４１８の存在下で選抜を行った。高分子量のＤＮＡを各クロー ンから単離し、図ＩＢに示されているようにゲルプロットハイブリッド法で分析 した。図ＩＢの上のパネルにおいて、ＤＮＡをＫｐｎＩて消化し、フィルターを Ｎｅｏ特異性プローブによってハイブリッド形成させた。一方下のパネルにおい ては、ＤＮＡはＨｉｎｄＩ［［で消化し、フィルターをエキラン１３ＣＦＴＲ特 異的プローブに対しハイブリッド形成を行わせた。すべてのレーンにおける４、 ３ｋｂバンドは、内性ＣＦＴＲ遺伝子から生ずる。試料には、ＣＦＰＡＣ−Ｉ　 ＤＮＡ（１０μｇ）：レーン“ｌコピー”ＣＦＰＡＣ−Ｉ　ＤＮＡ（１０μｇ） 、及びＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンＩからＩＯまでからのレーンズ“ＰＬＪ−ＣＦ ＴＲｌから１０”　−ＤＮＡ　（１０μｇ）が含まれる、図の右の境にそって、 分子の大きさのキロベースでの標準が示されている。

ベクターＬＴＲｓにおいてユニークな部位を育する高分子量のＤＮＡを制限酵素 Ｋｐｎｌで消化するとＰＬＪ−ＣＦＴＲプロウィルスの必須構成系のすへてを共 通な８．５ｋｂ断片として放出した。図ＩＢの上のパネルにおいて示されるよう に、ＫｐｎＩ制限酵素分野を受けたＤＮＡのゲルプロットハイブリッド形成によ り、転位していないプロウィルス配列が、１０／１０のＰＬＪクローン、及び９ ／ｌＯのＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンにおいて、期待された細胞あたり１コピーの 存在量で明らかとなった。フィルターをＮｅｏ−特異的プローブでのハイブリッ ト形成によりＰＬＪ−ＣＦＴＲクローン２において著しく転位したプロウィルス が検出された。このウィルスは明らかにＣＦＴＲｃＤＮＡの主要な部分を欠失し ていた（データは示されていない）。

各推定上のＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンの複雑性と、ユニークさを研究するための ゲルプロット分析の結果は図ＩＢの下のパネル中に示されている。高分子量のＤ ＮＡを単離してＰＬＪ−ＣＦＴＲにおいて２つの内部の部位を持つ制限酵素であ るＨｉｎｄｌ［Ｉて消化し、エキラン１３ＣＦＴＲ特異的プローブで分析した。

図ＩＢのパネルにおいて図解されているように、この分析により９／１０のＰＬ Ｊ−ＣＦＴＲクローンにおいて単一でユニークな統合部位が証明された。ＣＦＴ Ｒ特異的プローブは、ＰＬＪ−ＣＦＴＲクローン２からのＤＮＡにおいては上述 の明らかな欠失のためにプロウィルスを検出てきなかった。

レトロウィルスでトランスデユースされたＣＦＴＲ遺伝子の発現は、ＣＦＴＲエ キソン１３プローブを使用するＣＦＰＡＣ−１クローンのＲＮＡプロット分析に よって研究され、図２に示されている。レトロウィルスでトランスデユースされ たＣＦＰＡＣ−１細胞のクローンか単離されＣＦＴＲの転写物の存在について分 析した。全細胞性ＲＮＡを個々のクローンから収穫し、図２の上のパネル中に示 されるようにエキソン１３ｃＦＴＲを使用してフィルターとハイブリッド形成を 行いＲＮＡプロット分析にかけた。図２の下のパネルには、フィルターをはがし 、試料のローディングの変動についてコントロールするためにヒトチーアクチン ｃＤＮＡから由来したプローブで再度ハイブリッド形成を行なった。ＲＮＡの試 料（１０μｇ）は以下の細胞由来であった：レーンズ“Ｔａ２”−結腸腫瘍細胞 系Ｔ８４からの２重の試料；レーン“ＣＦＰＡＣ−１”−トランスデユースされ ていないＣＦＰＡＣ−１細胞：レーン“ＰＬＪ６”−ＰＬＪ感染からのＣＦＰＡ Ｃ−１クローン＃６；及びレーンズ“ＰＬＪ−ＣＦＴＲｌから１０”−ＰＬＪ− ＣＦＴＲ感染からのＣＦＰＡＣ−１クローンの＃１から＃ｌＯまで。

図の左側の境に沿って、分子の大きさのキロベースでの基準が示されている。

図２において図解されているように、前に記述されたヒト結腸腫瘍細胞系Ｔ８４ からの全細胞性ＲＮＡは内生ＣＦＴＲ転写物の高いレベルを示した。まがいの感 染をしたＣＦＰＡＣ−１細胞におけるノーザン分析によってＣＦＴＲ転写物は検 出されなかった。もしくはＰＬＪクローンズ１からＩＯまでのＣＦＴＲＲＮＡは 、ＲＮＡ−ＰＣＲによってＣＦＰＡＣ−１中に検出することができる。ウィルス によって指向された期待された大きさくすなわち、８．５キロベース）のＣＦＴ Ｒの転写物は９／ｌＯのＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンにおいて検出された。

ＣＦＴＲプローブは、欠失したプロウィルス（ＰＬＪ−ＣＦＴＲクローン２）を 含むクローンからのＲＮＡにおいて転写物を検出できなかった（ＰＬＪ−ＣＦＴ ＲクロＰＬＪとＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンズを、ｃＡＭＰとＣａ−促進陰イオン 輸送についてスクリーニングを行うためにアイソトープ陰イオン（１ｓｉ）の流 出を測定した。Ｖｅｎｇｌａｒｉｐ　Ｃ，Ｊ、ら、Ａｍ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏ ｌ、２５９　：　Ｃ３５８−Ｃ３６４，（１９９０）によって記述された流出検 定により、Ｃｌ−チャンネル遮断薬の阻害効果と１２５■流出に対する脱分極膜 電位から判断されるようにＣｌ−分泌上皮細胞におけるアゴニストで刺戟された Ｃｌ−電導経路の定量的推定か与えられる。図３Ａには、ＰＬＪ　６とＰＬＪ− ＣＦＴＲ６の２つのクローンにおいてアデニレートシクラーゼを活性化する薬剤 であるｆｏｒｓｋｏｌｉｎを添加した場合と添加しない場合の１２５■流出速度 定数（ｒ）の経時変化が示されている。ＩＯμＭのｆｏｒｓｋｏｌｉｎは図３Ａ に示された時間に加えられた。アゴニストの不在の基礎流出期間の後（示されて いない）、ｆｏｒｓｋｏＩｉｎは、ＰＬＪ−ＣＦＴＲクローン６からの１２５１ 流出速度を０．３２から０．　７０　ｍ１ｎ−’へと増加した：ＰＬＪ６は応答 しなかった。ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ添加の前と、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ応答のピーク を通じて得られたｒの値から、　１２５１流出（すなわちｒ　＋ａ＋ｉｋ　／　 ｒｂａｓａｌ　）の相対的促進の推定値か得られる。応答性のＰＬＪ−ＣＦＴＲ クローンにおいては、陰イオン流出に対するｆｏｒｓｋｏｌｉｎのピーク効果は 、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ添加の後の最初の３つの流束期間を通じて観測された（１ ５−４５ｓｅｃ　）　ｎ＝７であったＰＬＪ５を除き、平均±ＳＥＭは、すべて のクローンに対してｎ＝９であった。

２０のクローンから誘導されたデータは、図３Ｂ中に図解されている。ｒの値は ｆｏｒｓｋｏｌｉｎの添加の前後に得られた。ＰＬＪ−ＣＦＴＲクローン２につ いては、！、０゜未満では同じ度盛か適用される。値は平均±ＳＥＭであり；ｎ ＝７であったＰＬＪ５を除きすべてのクローンについてｎ＝９であった。図３Ｂ に図解されているようにｉｏのＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンのうち７がｆｏｒｓｋ ｏｌｉｎに応答して１２６１流出において有意な増加を示したが、対照ＰＬＪク ローンのいずれもが（０／１０）ｆｏｒｓｋｏｌｉｎに応答しなかった。親細胞 系であるＣＦＰＡＣ−１も、Ｓｃｈｏｕｍａｃｈｅｒ、Ｒ，Ａら、ＰＮＡＳ（Ｕ ＳＡ）８７：４０１２−４０１６　（１９９０）によって記述された如＜　ｆｏ ｒｓｋｏｌｉｎまたはｃＡＭＰ類縁体に対して応答を示さない。ＰＬＪ−ＣＦＴ Ｒは、図ＩＢにおいて示された如くゲル　プロット　／％イブリ・ソド形成によ ってそのＣＦＴＲｃＤＮＡにおいて大きな欠失を示し、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎが１ ２５１流出を促進できなかったことを説明した。７つの応答性のＰＬＪ−ＣＦＴ Ｒクローンにおいては、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎによる陰イオン流出の相対的促進は １．８から２，８倍の範囲であった。これは、Ｖｅｎｇｌａｒｉｋ　、上述、に よって結腸腫瘍細胞系Ｔ８４について最近報告された流出の３．５倍の促進と同 等である。

我々ノ結果は、ＣＦＴＲｃＤＮＡの発現は、ＣＦＰＡＣ−１細胞に、ｃＡＭＰ一 応答性の陰イオン流出を付与することを示している。

ＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンのｆｏｒｓｋｏｌｉｎ応答性とそのＣＦＴＲｍＲＮＡ レヘルの間の相レベ、図２と３Ｂの比較によって説明されるようにあまり著しく はなかった。

流出検定における最善の応答者の３つは高いｍＲＮＡレヘルレベルわち、ＰＬＪ −ＣＦＴＲクローンｌ、６．及びｌＯを示した。しかし、その他の場合ては相関 はそれ程良くなかった。例えば、クローン７と８は、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎに対し て約２倍の応答を示したが比較的低いｍ　ＲＮ　Ａレベルを有し、クローン３と ９は、容易に検出できるＣＦＴＲｍＲＮＡの存在にもがかわらず低いｆｏｒｓｋ ｏｌｉｎ応答を示した。

Ｃａ−イオノフオアであるｉｏｎｏｍｙｃｉｎの添加により、すへての対照とＣ ＦＴＲクローンズにおいて１２５１流出か増加した。イ才）／ベーサルの値は各 群においてＰＬＪては平均１４＋２、ＰＬＪ−ＣＦＴＲ（ｎ＝２０）ては１４± ｌてあった：個々のクローンの間では官憲な差は検出されなかった。ｉｏｎｏｍ ｙｃｉｎに対するＰＬＪクローンズの応答の程度は、Ｓｃｈｏｕｍａｃｈｅｒら 、上述（１９９０）によって野生型のＣＦＰＡＣ−１において前に観測されたの と類似しており、Ｖｅｎｇｌａｒｉｋら上記によって観測されたＴ８４細胞の応 答の約３倍である。Ｃａ＋＋イオノフオアとＣａ−媒介アゴニストか（１−分泌 を促進できる能力は、健常者とＣＦ患者の両者に由来する気道と汗腺細胞につい て報告されている。５ａｔｏ、　Ｋ、ら、Ｊ。

Ｃ１１ｎ、　［ｎｖｅｓｔ、７３　：１７６３−１７７１　（１９８４）；　Ｆ ｒ１ｚｚａｌｌら、上記、（１９８６）　；　Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ　、　Ｎ、Ｊ 。

ら、、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、２５６　；Ｃ２２６−Ｃ２３３（１９８９） も参照のこと。ＣＦ細胞にこの応答があることは、ＣＦＴＲは、Ｃａ−媒介Ｃ１ −輸送促進にとって必要ではないことか示唆される。ＰＬＪとＰＬＪ−ＣＦＴＲ クローンズにおけるｃａ　（−ゝにょる促進の程度において有意差か欠けている ことからＣＦＴＲは、ｃ１分泌を支配しているＣａ＋＋−媒介調節経路の活性を 調節していないことが示唆される。

図３のＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンにおける陰イオン流出のｃＡＭＰ誘発増加が、 Ｃ１１ｆｆ、　Ｗ、Ｈ，ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８７：４９５６−４９６０　（ １９９０）＋１ｍよって記述されたＣＩ！−伝導経路の促進のためであったがど うかを決定するために全細胞パス−クランプの記録が使用された。ＰＬＪ−ＣＦ ＴＲクローン１の典形的な応答は図４Ａに示されており、５μＭのｆｏｒｓｋｏ ｌｉｎによる内方への電流の促進を図解されている。膜電位は、−１０＋ｎＶに 保持され、０と一８４ｍＶにパルス修正した。記録中ノキャップは、ｆｏｒｓｋ ｏｌｉｎ−誘発電流のイオン選択性を決定するために浴溶液置換か行われた時間 （６分）を表している。Ｉ−Ｖｌ！Ｉｆ、％を決定するためのパルスプロトコー ルは、図に示された時間において行われた。Ｃ１−電流は、−８４ｍＶへの電圧 パルスによって作られた内方への電流として測定された。内方への電流の同様な 増加は、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ　（５１ｔ　Ｍ）　、またはｃＡＭＰ（２００から ８００ＢＭ）の添加か、応答性細胞において内方向への電流を２００＋６８ＰＡ から１６９０±４９５　ＰＡｆ：増加したＰＬＪ−ＣＦＴＲクローン１．６及び １ｏがらの１３の細胞のうち１１において観測された。この応答の大きさはＣ１ １ｆｆら、上記、にょってＴ８４細胞において観測されたものと比較して優位で ある。図４Ｂにおいて示されているように、ｃＡＭＰ　（４００ＢＭ）、または ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ　（５μＭ）は、対照クローン、ＰＬＪ６（ｎ＝６）からの 細胞の膜電位を促進することはできなかった。膜電位は一２０ｍＶに保たれ、Ｏ ｍＶと一８４ｍＶヘパルスした。同様な結果がＰＬＪクローンの６細胞のうち５ 細胞で得られた。　１′Ｉ流出がらｗ１測されたようにｉｏｎｏｍｙｃｉｎ　（ ２μＭ）は、ＰＬＪ　（ｎ＝４）とＰＬＪ−ＣＦＴＲ（ｎ−３）のクローンの双 方において内方向への電流を増加させた。

図４０において示されたように、ＮａＣ１浴、低Ｃ１−浴、及びＮａ”を含まな い浴におけるｆｏｒｓｋｏｌｉｎ誘発電流の即塵電流−電圧（１−Ｖ）関係がＰ ＬＪ−ＣＦＴＲクローンｌから得られた。Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ−誘発電流は、刺 戟の前後における電流のディジタルな引き算によって得られた。図４０に示され ている値は、電圧パルス開始の６　ｍ５ｅｃ後に記録された。これらのデータは 、６分のレコーディングギャップの間に図４Ａに示されているＰＬＪ−ＣＦＴＲ クローン６の細胞の記録から得られた。

図４０において図解されている如く、Ｃ１１ｆｆら、上記、によってＴ８４細胞 において観測されたように、促進された電流のｒ−’ｖ５！Ｉ係は直線のようで あった。電流は、同じ浴とピペットを使用して決定された。Ｃ１−濃度はＯｍＶ のＣ１平衡電位の近くて逆転された。浴のＣｆ−を６ｍＭ（グルタメート置換） に減少させると、外方への電流を減少させ、電流のための逆転電位を＋６６ｍＶ へとシフトさせた。この値は、この外方に向けられたＣＩ！−グレーディエンド についてのＣ１−平衡電位（＋８０ｍＶ）に近い値であった。浴のＮａ”のＮ− メチル−〇−グルカミン（ＮＭＤＧ）による置換はＩ−Ｖ関係を官憲に変化させ なかった。これらの知見により、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ−刺戟電流はＣ１−選択性 であり、ＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンにおける陰イオン流出の促進はＣＩ！−伝導 経路の活性化のためであるということか示唆される。

実験操作手順 以下の実験操作手順か、上に明らかにされた具体例において使用された。： ＣＦＰＡＣ−１の細胞は、Ｓｃｈｏｕｍａｃｈｅｒら、上記、（１９９０）によ って以前に記述されている如く培養において維持された。、レトロウィルス感染 のために使用された細胞は７２回の継代てあった。ＣＦＰＡＣ−１細胞の感染集 団を、個々のクローンを単離するためにＧ４１８（１■／ｒｌＬｌ）を含む培地 において選択した。トランスデユースされたＣＦＰＡＣ−１の細胞は、選抜を行 い、やがてクローンとして拡大した。これは、プロウィルス配列、またはプロウ ィルス発現の明かな喪失と結びつかなかった。両種指向性パッケージング細胞系 曹Ｃｒ１ｐは、Ｄａｎｏｓ、　０．　ら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）８５　：５４６ ０−６４６４　（１９８８）によって記述されている如く１０％の修生血清とペ ニシリン／ストレプトマイシンを補添した０ｕｌｂｅｃｃｏｓの改変Ｅａｇｌｅ の培地中に維持された。

ＣＦＴＲｃＤＮＡの構築 ｃＤＮＡは、Ｒｉｏｒｄａｎら、上記、によって記述されたようにオーバーラッ ピングクローン、１０−１．Ｔ１６−１およびＴ１６−４．５を結合することに よって構築された。１０−１と７１６−１は、エキソン４におけるユニークなＮ ｒｕＩの部位において結合され、エキソンｌから１３までにまたかるその結果生 した構築物を７１６−４．５に結合させた。これは、エキソン１３がらエキソン ２４と広かっているＴ１６−４．５のＳａｃ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ部分消化生成物を ５’１３−１キソン構築物のそれぞれの部位に挿入することによって行われた。

これらの操作は、Ｒｉｏｒｄａｎら、上述、によって以前に記述されたように全 コーディング配列を含む４５キロヘースのクローンを生成した。これらの構築の 企てから生じた大抵のクローンでは、転位か大いに起きていた。明らかに無傷の 構築物の配列の決定にあたり、５７ｂｐの欠失が、１３ｂｐデイレクトリピート の２つのコピーの間にあるエキソン６ｂにおいて同定された。吟味したところ、 この間隔は、コンセンサス原核細胞性プロモーター配列を含むことか認められた 。このリピートを破壊する企てにおいて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで突然変異生成によ って、３つの単一ヌクレオチドの変更か行われた。

ＣＦＴＲ翻訳生成物に変化を与えず、その結果安定な構築物を生ずる導入された 変化には、位置９３０におけるＴに対するＣ１９３３におけるＡに対するＧ、及 び９３６におけるＴに対するＣの置換か含まれる。改変された再構築ＣＦＴＲプ ラスミドはＣＦＴＲ４，６と呼ばれる。

上述した変化は、９３３におけるＧ及び９３６におけるＣの存在を除き、正常配 列に対応するオリゴヌクレオチドの合成によって生成した。ＣＦＴＲｃＤＮＡの 切片のアンチセンスストランドを１本鎖Ｍ１３ファージにクローニングを行い、 Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍ、、　（１９８９）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅ、Ｇｅｎｅｔ、　１９ 　：　４２３　（１９８５）　；　５ａｎｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、ら：Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　 ２ｎｄ　ｅｄ、。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、１５　、　５１−１５　 、　８０（１９８９）によって記述された標準技術を使用してオリゴヌクレオチ ドで突然変異を誘発させた。図６に示されている結果として得られたクローンの 配列を決定し、９３０の位置に追加の予期されない塩基の変化か起きていること か見出された。その変化もコートされた蛋白質に変化を与えないサイレントヌク レオチドの位置にある。

本発明の実際においては、ＣＦＴＲｃＤＮＡの全長を安定化させる他の方法を使 用することかできることも考慮の価値かある。図６に示されている工牛ソン６ｂ における思いかけないＥ、ｃｏｌｉプロモーターにおける、ＣＦＴＲのための正 しいアミノ酸配列を保持する一方、そのプロモーターを機能不全にする改変はす へて同じゴールに到達する。例えば、図６においてアンダーラインを引いたＣＡ ＴＡＣＴ配列の突然変異生成は、アミノ酸配列（例えばＣＧＴＡＴＴ）を変化さ せないが原核細胞性プロモーターとしての配列を不活性化し、通常のクローニン グベクターにおいて安定にするいくつかの方法において達成することができる。

レトロウィルスベクターと組換え体レトロウィルス改変ＣＦＴＲプラスミドを５ ａｃＩで消化すると、４．６ｋｂの制限断片上の改変ＣＦＴＲｃＤＮＡか放出さ れる。５ａｃＩの部位をＢｃｆＩ部位にオリゴヌクレオチドで変換し、リンカ− か結合した断片を、Ｋｏｒｍａｎら、上記、によって前に記述されたレトロウィ ルスベクターのＰＬＪのＢａｍ１部位にクローニングした。ＰＬＪ−ＣＦＴＲと 呼ばれる組換え体ベクターは図ＩＡに提示されている。レトロウィルスベクター ＰＬＪとＰＬＪ−ＣＦＴＲは、両種指向性ウィルスパッケージング細胞系ＷＣｒ ｉｐへ記述されているようにトランスファーされた。一過性に産生された両種指 向性ウィルスを収穫するために２４時間後にトランスフェクトされたパッケージ ングを含むプレートから組織培養の培地を取り除いた。

１０ａｎ２のプレート上にＩ：５に継代されたＣＦＰＡＣ−１細胞を、ポリブレ ン（４μｇ／ｒｎｌ）を補添したウィルスの上清に１２から１６時間さらした。

細胞か集密状態に達したとき、細胞は０４１８（１■／ｍｌ）を含む培地に１： １０て継代した。細胞のクローンが、単離され、拡大され、低温保存された。

ＣＦＰＡＣ−１クローンのＤＮＡとＲＮＡ分析高分子量ＤＮＡを記述されたよう にＣＦＰＡＣ−１細胞から単離し、Ｗｉｌｓｏｎら、上記（１９８８）、によっ て記述されたようにゲルプロットハイブリッド形成によって分析した。全細胞性 ＲＮＡを精製し、Ｗｉ　１ｓｏｎら、上記（１９８８）、のＲＮＡプロット分析 にかけた。フィルターは、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、　Ａ、　Ｐ、ら、Ａｎａｌ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　ｌ　３２　：６−１３　（１９８３）のランダムブライミング 法を使用して、高比活性まで標識された様々なりＮＡプローブでハイブリット形 成を行った。これらのプローブには：ｌ）このエキソン（ＮＴ　Ｉ　９００から ２６１１）の境界に横に接しているオリゴヌクレオチドを使用したクローニング を行ったｃＤＮＡのＰＣＲ増幅の後単離された（：ＦＴＲのエキソンＩ　３　； ２）ｐＳＶ２ＮｅｏのＨｉｎｄ■からＮｃｏＩ断片の９６０塩基対−ｈのＮｅｏ −特異的配列、及び３）ヒ］−γアクチンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　。

陰イオン排出の測定 放射同位元素性陰イオン排出は、上記のＶｅｎｇｌａｒｉｋらによっＣ記述され たように定量した１３手短かに述へれは、細胞の単層は、　＋２５　ｉで３０分 間プレロードした：２回洗浄した後、流出は、試料−置換操作を使用して１５秒 間隔においてモニターした。実験の終りに、細胞の単層に残っているトレーサー を０．ｌＮＨＰＯ３で抽出した。

各サンプリング間隔についての流出速度定数（ｒ）は、以下の如く計算された。

： ｒ＝　（Ｉｎ　（Ｒ＋　）　Ｉｎ　（Ｒｚ））／　（ｔ＋　ｔｚ）、但し、Ｒ３ とＲ２は時間（ｔ）１と２において単層中に残っているロートされた１２５　■ の百分率である。

Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ　、またはｉｏｎｏｍｙｃｉｎは、５番目の１５秒のサンプ リング間隔の後に添加された。アゴニストによる促進の程度はｒ　ａｚｏｎ＋ａ ＋　／　ｒ　ｂａｓａｌ　として表現される。但し、ｒａｇ。１．１は、アゴニ ストの存在において観測された最大値てあり、ｒ　ｂａｓａｌは、アゴニスト添 加直前の流れ間隔からとられる。

細胞核＋２Ｊの大半の洗い出しは、上記のＶｅｎｇｌａｒｉｋらによって明らか にされたように最初の６０秒のサンプリングを通じて起り、この期間は、速度定 数の計算において無視された。しかし、細胞外隔室の洗出しは、細胞内隔室より も速いので、６０秒後の細胞外空間からの小さい残存流出は、アゴニスト応答の 過少評価に・つながる。

したかって、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎに対する流出応答かないときは、ｆｏｒｓｋｏ ｌｉｎの添加直後に決定されたｒはｆａｒｓｋｏｌ　ｉｎが添加される前に測定 されたよりも僅かに小さい。このことは、ｒ　Ｉｏ＋ｂｋ　／　ｒ　ｂａＡｌｌ Ｉが図３Ｂにおいて示されているＰＬＪクローンにおいて０．９と１．０の間に あるという知見の説明になる。

全細胞電流記録 巨視的電流は、上記のＣ１１ｆｆらによって前に記述された方法によって全細胞 バッチ−クランプを通じて記録された。記録は３７°Ｃて以下の溶液について行 われた（ｍＭ）　；浴：　１１５ＮａＣＩ！、４ＯＮ−メチル−Ｄ−グルカミン （ＮＭＤＧ）−グルタメート、５に一グルターメート、２　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２　 、　ｌ　Ｃａ　Ｃｌ　２　、ｌ０ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，２）；　ピペット：　ｌ 　１５ＫＣ１１３５ＮＭＤＧ−グルタメート、０．２５ＥＧＴＡ、０．０９Ｃａ ＣＡ’ｔ　（１００ｎＭ遊離Ｃａ”）　、２ＭｇＣ１ｔ、２Ｎａ、ＡＴＰ、０． ２ＯＮａｚ　ＧＴＰ、ｌ　０ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，２）。膜電位は３つの電圧 において５００ｍ５ｅｃの間交互にクランプした。そのうち２つは、ＣＩ！（Ｏ ｍＶ）、及び（８４ｍＶ）のための平衡電位に等しくなるように選ばれた。これ によって上記のＣ１１ｆｆらによって記述されたように、アゴニスト応答の間に ｃｌ−とＫ“電流がモニターできるようになる。図４０に示されているように、 ±１００ｍＶの間でクランプ電圧を２０ｍＶの増加においてステツピングを行う ことによって電流−電圧の関係を決定するためにパルシングが中断された。

例−■ 膵臓及び柿上皮細胞のレトロウィルス媒介トランスダクション 種々の上皮細胞へのレトロウィルス媒介ジーントランスダクションは、Ｅ、ｃｏ ｌｉ　ｌからのβ−ガラクトシダーゼを発現する複製欠陥レトロウィルスを使用 して最適化された。ウィルス指令β−ガラクトシダーゼの発現は、トランスデユ ースされた細胞を青色に染色する組織化学的反応を使用してｉｎ　５ｉｔｕで検 出できるので、これか使用された。前に記述されている、β−ガラクトシダーゼ 発現ＢＡＧから作られた両種指向性ウィルスプロデューサー細胞系かウィルスの 源として使用された。このウィルス産生細胞系はＢＡＧ５と呼ばれる。ＢＡＧ５ 細胞の集密プレート上の上清を収穫し、濾過して、以下に述べるように種々の上 皮細胞を感染させるのに使用した。

膵臓上皮細胞系 ＣＦＰＡＣ−１は、ＣＦの欠陥細胞的特徴（すなわち、ｃＡＭＰアゴニストの存 在においてＣＩ！−チャンネルは活性化されない）を発現するＣＦ患者の腺癌に 由来した細胞系である。ＣＦＰＡＣ−１細胞を種々の希釈（１：２、■、５．１ ：１０１及び１：２０）に分け、２４時間後にポリブレン（４μｇ／ｍｌ）を補 添した新鮮なウィルスの上清にさらした。１２時間後にウィルスを新鮮培地で置 換した。集密状態になったとき、細胞は、記述されているようにウィルス指令β −ガラクトシダーゼの発現について分析した。最適の感染効率は、感染の前日に １＝５に分けたＣＦＰＡＣ−１細胞で得られた。最適条件下では、ウィルスに対 する１回の暴露によってβ−ガラクシダーゼ遺伝子の細胞の３０−４０％での安 定なトランスダクションへと導かれた。β−ガラクトシダーゼの発現は培養細胞 において２か月にわたって安定であった。翌日以降の日々にＣＦＰＡＣ−１細胞 を再感染させる試みは、感染効率の増大には、はとんとっながらなか前に述べら れているようにＣＦの肺の合併症は、通常、その主要な疾患であり、生命に関わ るので、気道上皮細胞はシーントランスファーのための最も望ましい標的である 。Ｔａｕｓｓｉｇ　、上記（１９８４）、気道上皮細胞は、組換え体レトロウィ ルスで容易に感染されるので、先の及び以下の例において記述されたシーントラ ンスファーの試みも、肺の場合のような気道上皮細胞に向けられた遺伝子治療に とって有用である。

ＣＦ患者の気道に由来する上皮細胞が、レトロウィルス−媒介シーントランスフ ァーの育力な標的として使用された。これらの細胞は以前に記述されており、Ｔ ４３細胞と呼ばれた。収穫された新鮮なりＡＧ５ウィルスにポリブレンを補添し 、２４時間前に１５に分けておいたＴ４３細胞にさらした。細胞をウィルスに１ ２−１８時間さらし、集密状態まで培養してから前に述へた生化学的検定を使用 したウィルス指令のβ−ガラクトシダーセの発現について分析した。最適条件下 ては、ＣＦＰＡＣ細胞の２５％以上か、ウィルスに１回暴露した後、β−ガラク トシダーゼ遺伝子で安定にトランスデユースさ組換え体しＩ・ロウイルスの使用 とＣＦの治療への１つの試みは、気道へレトロウィルスを直接配送することによ って、機能性ＣＦＴＲ遺伝子をｉｎ　ｖｉｖｏにおける上皮細胞へ導入すること である。レトロウィルスの直接配送のためにいくつかのアプローチをとることが できる。より載皿的なアプローチは、患者の気道に挿管し、ＣＦＴＲを発現する レトロウィルスの濃縮溶液で気道を洗浄することである。安定なレトロウィルス の発現には、プロウィルスか染色体のＤＮＡに組込まれることか必要である。こ れは、受容細胞か分裂しつつあるならば、最も効率的に起る。ウィルスにさらし た後、上皮細胞の再生をφり戟することか必要となると思われる。これは、気道 の機械的、または化学的刺戟で達成できるであろう。

より手軽なアプローチは、気道上皮細胞へｉｎ　ｖｉｖｏで吸入することかでき る噴霧用製剤によって正常ＣＦＴＲ遺伝子を配送することであろう。多くの異る 薬理学的薬剤は、噴霧剤処理によって、広い気道表面に効率的に配送される。こ の方法によって達成される有益な作用は一過性である可能性かある。したがって 、薬剤を繰返し投与することか必要であると思われる。直接遺伝子導入に使用さ れる遺伝子配送システムはウィルスに基ずかなくても良いと思われる。ＤＮＡ蛋 白質複合体、またはリポソーム中のＤＮＡ発現ベクターの直接的吸入は、レトロ ウィルスよりも安全で、効果的遺伝子配送のシステムであると思われる。

遺伝学的に改変した気道上皮細胞の移植ＣＦの体性遺伝子へのアプローチは、骨 髄指向性遺伝子治療に概念において類似している。我々は、ＣＦ患者から気道上 皮細胞を単離し、細胞における欠陥を正し、気道をそれらの細胞で再び満たすこ とかできるように遺伝学的に改変した細胞を患者に移植することを提案する。

気道において、遺伝子学的に改変した細胞による効率的なりポピユレーションを 達成するためには、機械的、及び化学的刺戟によって内生上皮細胞の打ち内の統 合性を乱すことが必要であると思われる。

代替遺伝子トランスファー配送システムＣＦ欠損の遺伝学的訂正のための他の遺 伝子の配送システムも、本発明の範囲内に入る。これらの実験のためには、プラ スミドに基いたベクターか使用される。このようなベクターの１例は、図７に指 示されているＢＡ−ＣＦＴＲＢＱである。これは、転写かアクチンフランキング システムから開始され、異質３′ボリアデニレ一ソヨンβ配列から停止された単 純な７７６２ｂｐｌ−ランスフゴクンヨンに基いたベクターである。

本発明ベクターは以下の様に構築された。パックホーンはＰＣｌ３からの配列（ ヌクレオチド６９２８から４５５３）、チキンβアクチン遺伝子の５′フランキ ング領域（ヌクレオチド６９２８から７７５４）及びウシ生長ホルモンポリアゾ ニレ−ジョンシグナルの３′フランキング配列（ヌクレオチド４８２７から４５ ５３）を含んていた。全コーディング領域にまたがり、前に論議された３つのヌ クレオチドの変化を含む全長のＣＦＴＲ配列か５ａｃＩから５ａｉｌ断片上のベ クターＣＦＴＲから除去され、上に記述したベクターバックボーンへとクローニ ングした。

このベクターは、いくつかの配送システムにおいて使用されるであろうことは、 この分野の技術に熟達した大人によって評価される。

リボフェクション 前に記述した手順操作はＤＮＡリポソームのエンキャブシデーションに基いてい る。細胞か、リポソームとともにインキュベートされると、それらはＤＮＡを取 り込み、それを発現する。我々は発現ベクターのＤＮＡとリビッド（ＤＯＴＭＡ ）をＨｅｐｅｓ緩衝化食塩水中１．５−へ希釈し、これらの成分を混合してリビ ドーＤＮＡ複合・　物を形成することを提案した。それからそのリポソームを使 用し、挿管した患者を溶液を含むリポソームで洗浄するか、吸入によってリポソ ームを投与することにより標的を定めた遺伝子配送への代替アプローチは、ＤＮ Ａ蛋白質複合体の生成による。この型のシーントランスファー基質は以下のよう に構築された。呼吸上皮細胞上の受容体のためのポリペプチドリガンドを、記述 されたようにエチリデンジアミノカルボジイミドでポリリジンに結合させる。こ の蛋白質結合物を、等しい質量の蛋白質結合体と０．２５Ｍ食塩溶液中のＤＮＡ を混合することによってトランスフェクションベクターのＤＮＡと複合体形成を 行わせる。本ＤＮＡ／蛋白質複合体は、呼吸系気道細胞によって取込まれ、その 遺伝子が発現される。

これは、リポソームに関して記述されたアプローチを使用して、ＣＦＴＲ遺伝子 をｉｎ　ｖｉｖｏで気道上皮細胞へ直接配送するのに使用することが出来るであ ろう。

本発明の多くの改変と変形を、その精神と範囲を逸脱することなく行うことがで きることは明らかである。本出願において記述された具体的態様は、例を示すた めだけに与えられており、発明は、添えられた特許請求の範囲によってのみ制限 される。

配列リス；・ ＡＧＣＧＧＣＡＧＧ　ＣＡＣＣＣＡ　ＧＡＧ　ＴＡＧ　ＴＡＧ　ＧＴＣｍ　ＧＧ ＣＡＴｒ　ＡＧＧ　ＡＧＣＴｒＧ　９０ＧＣＣＣ，、ＣｍＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣ ＴＣＣＡＧＧＴＡＧＡＧＧＧ丁ＧＴＧＴＡＡＧＴＡＧＡ　５４９０ＴＡＧＧＣＪ 丁ＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＴＧＡＡＧＴＣご入＾（ｓＣ ＡＴＴ　５５３５ＣＡＴｒｒＧＴＧ工 浄書（内容に変更なし） Ｈｉｒｗｌ　／／／　Ｈｉｎｄ　／／／に／Ｉｆｆ　／　ｘ、　を 区画Ｎ面図　−悶−■タッ プローブ　エキリハ３　陶・ トランスデユースされたＣＦＰＡＣ−１クローンのプロウィルス配列の分析 図ＩＡ レトロウィルス　ベクターＰＬＪ−ＣＦＴＲ，このベクターの重要な構造成分は ロングターミナル　リピート配列（ＬＴＲ）、ＣＦＴＲｃＤＮＡ、ＳＶ４０に由 来する配列、Ｇ４１８　（Ｎｅｏ）に対する耐性を付与する遺伝子、およびｐＢ Ｒ３２２（ｐＢＲ）のための複製の起点を含んでいる。転写開始の部位は５−　 ＬＴＲおよびインターナルＳＶ４０配列の箇所で矢印で示されている。制限エン ドヌクレアーゼＫｐｎ　Ｉ　およびＨｉｎｄＩＩＩの認識部位が示されている。

ＤＮＡとＲＮＡプロット分析において使用されたＣＦＴＲ遺伝子（エキソン１３ ）とＮｅｏ遺伝子に特異性のプローブはベクターの下に示されている。

（１２１１Ｉ３ 図　ＩＢ（！Ｉｔ二〕 ＣＦＰＡ−１細胞をＰＬＪまたはＰＬＪ−ＣＦＴＲウィルスで感染させ、各クロ ーンを単離するために、６４１８の存在下で選抜した。

高分子量のＤＮＡを各クローンから単離し、ゲルプロット　／１イブリッド形成 法で分析した。一番上のパネルにおいて、ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、フィルタ ーをＮｅｏ特異性プローブに対してハイブリッド形成させた。一方、一番下のノ くネル（こお−＼てｉｔ、ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フィルターをエキ ラン１３０ＦＴＲ特異性プローブに対して／＼イブリッド形成を行った。全ての レーンにおける４、３　ｋｂバンドは、内性ＣＦＴＲ遺伝子から生じる。

試料には、ＣＦＰＡＣ−Ｉ　ＤＮＡ（１０μｇ）　；７．５　ｐｇ　ＰＬＪ−Ｃ ＦＴＲプラスミドＤＮＡにより補足された、レーン“１コピー”−ＣＦＰＡＣ− Ｉ　ＤＮＡ（１０μｇ）；レーン“ＣＦＰＡＣ−ドーＣＦＰＡＣ−ＩＤＮＡ　（ １０μｇ）およびＰＬＪ−ＣＦＴＲクローン１−１０からのレーンズＰＬＪ−Ｃ ＦＴＲ１−１０−−ＤＮＡ（１０μｇ）を含む。分子の大きさの標準は、キロベ ースで、右の端に沿って示されている。

図　２ 図２Ｃ車先立） ＣＦＰＡＣ−１クローンのＲＮＡプロット分析。レトロウィルスでトランスデユ ースされたＣＦＰＡＣ−１細胞クローンを単離し、ＣＦＴＲの転写物の存在につ いて分析した。全細胞性ＲＮＡを個々のクローンから収穫し、エキラン１３ＣＦ ＴＲプローブを使用して、ＲＮＡプロット分析に付し、フィルターとハイブリッ ド形成した（一番上のパネル）。フィルターを剥がし、試料の負荷の変動につい てコントロールするために、ヒトチーアクチンｃＤＮＡに由来したプローブで再 度ハイブリッド形成した（一番下のパネル）。ＲＮＡの試料（１０μｇ）は以下 の細胞由来であった：レーンズＴ８４°−結腸腫瘍細胞系Ｔ８４からの２重の試 料：レーン“ＣＦＰＡＣ−１”−トランスデユースされていないＣＦＰＡＣ−１ 細胞：レーン“ＰＬＪ６”−ＰＬＪ感染からのＣＦＰＡＣ−１クローン＃６：お よびレーンズＰＬＪ−ＣＦＴＲＩ−１０”−ＰＬＪ−ＣＦＴＲ感染からのＣＦＰ ＡＣ−１クローンの：：１−＃１０゜分子の大きさの基準は、キロベースで、左 の端に沿って示されている。

時間（秒） 図　３Ａ ＰＬＪクローンおよびＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンにおける１２！１１流出に対す るｆｏｒｓｋｏｌｉｎの経時変化クローン６における流出速度定数の経時変化。

ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（１０μＭ）を指示時点で添加した。初めの６０秒の流出物 は細胞外１２５　■の流出を許し、図示されていない（下記の実験プロトコール 参照）。平均＋／　−Ｓ　Ｅ　Ｍ　：　ｎ　−７であるＰＬＪ５を除いて、全て のクローンでｎ＝９゜ 図　３Ｂ ＰＬＪクローンおよびＰＬＪ−ＣＦＴＲクローン１−１０における基礎・２５１ 流出に対するｆｏｒｓｋｏｌ　ｉｎ刺激比。γ値はｆｏｒｓｋｏｌｉｎの添加の 前と後に測定した。ＰＬＪ−ＣＦＴＲクローン２の場合に、同一の尺度で１０以 下に相当する。これらの数値は平均＋／−３ＥＭであり、ｎ＝７であるＰＬＪ５ を除（１て、全てのクローンでｎ＝９である。

図４Ａ ｃＡｋ４Ｐ　Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ　洗浄図４Ｂ ＰＬＪクローン６細胞における要電流の刺激に対するｆｏｒｓｋ。

ｔｉｎ（５μＭ）のｃＡＭＰ　（４００μＭ）の無効性。誤電圧は、−２０ｍＶ に保持し、ＯｍＶと一８４ｍＶにパルス修正した。同様の結果が５のＰＬＪクロ ーン６細胞において得られた。

図　４Ｃ（欣さ） ＮａＣ１浴、低Ｃ１浴およびＮａを含まない浴におけるｆｏｒｓｋｏＬｉｎ誘発 電流の即座電流−電圧関係。ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ誘発電流は、刺激の前と後との 電流のデヂタルの引き算１；よって得た：示されている数値は、電圧パルスの開 始後の５ｍｓ　ｅ　ｃｌこ記録した。

これらのデータは、６分の記録ギャブの間に図４Ａζこ示されてし＼るＰＬＪ− ＣＦＴＲクローン６細胞記録から得た。

ＡＧＣＧＧＣＡＧＧ　ＣＡＣＣＣＡ　１．ＡＧ　ＴＡ、Ｇ　ＴＡＧ　ＧＴＣｍ　 ＧＧＣＡＴｒ　ＡＧＧ　ＡＧＣＴｒＧ　９０ＬＥＬＳＤＩＹＱＩＰＳＶＤＳＡ ＤＮＬＳＥＫＬＥＲＥＷＤＲＥＬ Ａｓ　に　に　ＮＰＫＬＩＮＡＬＲＲＣＧＣＴ　ＴＣＣＴＡＴ　ＧＡＣＣＣＧ　 ＧＡＴ　ＭＣＭＧ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＣＧＣ，ｉ升キゴ４９５ＡＳＹＤＰＤＮＫ ＥＥＲ ＱＣＡＣＣＣＡ　ＧＣＣＡＴｒ　ｍ　、ＧＧＣＣＴｒ　ＣＡＴ　ＣＡＣＡＴＴ　 ＧＧＡ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　５８５ＨＰＡＩＦＧＬＨＨＩＧＭＱ 国　テ　（季剋テノ ！土士当””””％’　、　Ｔ　〒Ｔ：　ＴＴ　Ａ　１３１０ｆＡｃＴ　電Ｇ　 Ｃ１：　ＴＶ　Ｃ：ＣＴＡＧ　Ｇｒ、Ｔ　ＧＴ、Ａ　ＣＳＡ　ＡＣＡ　丁ＡＧ　 １２１５国　５　（絖１） 画　ダ　（！ｒ、先さ） ＡＡＴ　ＧＧＣＡＴＣＱＡＡ　ＱＡＧ　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＱＡＴ　ｒ、ＡＧ　Ｃ ＣＴ　ＴｒＡ　ＧＡＧ＾鎮＾ＧＧＣＴＧ２３４ＯＮＧＩＥＥＤＳＤＥＰＬＥＲＲ Ｌ ＡＴＣＡＧＣＧＴＧ　ＡＴＣＡＧＣＡＣＴ　ＧＧＣＣＣＣＡＣＧ　ＣＴＴ　ＣＡ Ｇ　ＧＣＡ　ＣｆａＡ＾ＧＧＡＧＧ　２４３０ＪＳＶＩＳＴＧＰＴＬＱＡＲＲＲ ＧＣＣＣＣＴ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＡＡＣｎＧ　ＡＣＴ：ＧＡＡ　ＣＴＧ　（、Ａ Ｔ　ＡＴＡ　ＴＡＴ　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＡＧＧ　２５６５ＡＰＱＡＮＬ置ＤＩＹ ＳＲＲ ＧＭ　ＧＡＣｎＡ　ＭＧ　ＧＡＧ　ＴＧＣＣＴＴ　ｍ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＡＴＧ 　ＧＡＧ　ＡＧＣＡＴＡ　ＣＣＡ　２６５５ＥＤＬＫＥＣＬＦＤＣＩＭＥＳＩＰ ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＴＧＧ　ＭＣＡＣＡ　ＴＡＣＣＴＴ　ＣＧＡ ＴＡＴ＾°口’　ＡＣＴ　ＧＴＣＣＡＣ２７００ＡＶＴＴｋｌＮＴＹＬＲＹＩＴ ＶＨ ＡＣＴ　ＣＣ′ＴＣＴｒ　ＣＡＡ　ＧＡＣＡＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡＴ　ＡＧＴ　Ａ ＣＴ　ＣＡＴ　ＡＧＴ　ＡＧＡ　ＡＡＴ　ＡＡＣ２８３５ＴＰＬＱＤＫＧＮＳＴ Ｈ５ＲＮＮ 図　５　（糸先り モ＾ＦＧ：Ｔ　Ｃ′ＬＡ　Ｃ；　ＣＴＧ　ＧＡＧ　％Ｔ　Ａ、Ｔ　ＣＴＡ＾Ｈｃ ＾ｙＧＴＧＴＡＧ　？　２９７０ＴＣＣＡＡＡ　ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＧＣＡ　ＡＴ Ｔ　ＴｒＧ　ＧＡＴ　ＧＡＣＣＴＴ　ＣＴＧ　ＣＵＴ　ＣＴｒ＾ＣＣＡＴＡ　３ １０５ｓ　Ｋｏ　ｒ　Ａ　ｒ　Ｌ　ＯＯＬ　ｔ　Ｐ　Ｌ　ｒｑロ　ヮ（統り ロ　テ　い尭さ） 、　ＡＧＡＧＴｒＴＡＧＣ７ＧＧＡＡＡＡＧＴＡＴＧＴＴＡＧＴＧＣＡＡＡＴＴ ＧＴＣＡＣＡＧＧＡＣＡ　５４４５ＧＣＣＣＴＴＣＴＴｒＣＣＡＣＡＱＡＡＧＣ ＴＣＣＡＧＧＴＡＱＡＧＧＧＴＧＴＧＴＡＡＧＴＡＧＡ５４９０手続補正書防式 ） 平成５年１２月１６日

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）正常なＣＦＴＲ遺伝子を提供し；そして（ｂ）トランスファーと相補 に有利な条件下で、正常なＣＦＴＲ遺伝子を細胞内ヘトランスファーする、工程 から成る 標的細胞におけるＣＦＴＲについての遺伝子の欠陥の治療の方法。
2. ２．トランスファーの工程がさらにウイルスベクター媒介シーントランスフアー の工程を含む請求の範囲１の方法。
3. ３．トランスファーの工程がさらにプラスミドベクター媒介シーントランスフア ーの工程を含む請求の範囲１の方法。
4. ４．トランスファーの工程がさらにリポフェクションの工種を含む請求の範囲１ の方法。
5. ５．トランスファーの工程がさらにＤＮＡ蛋白質複合体−媒介シーントランスフ アーの工程を含む請求の範囲２の方法。
6. ６．標的細胞が上皮細胞である請求の範囲１の方法。
7. ７．ウイルス媒介シーントランスフアーの工程のウイルスがレトロウイルスから 成る請求の範囲２の方法。
8. ８．上皮細胞が気道上皮細胞である請求の範囲６の方法。
9. ９．上皮細胞が膵臓細胞である請求の範囲６の方法。
10. １０．上皮細胞が汗腺、小腸、肝臓及び腎臓の細胞からなるグループから選ばれ る請求の範囲６の方法。
11. １１．レトロウイルスが複製欠陥である請求の範囲７の方法。
12. １２．ベクターが （ａ）その部分が標的細胞を感染することができる少くともウイルスのゲノムの １部のＤＮＡ；及び、（ｂ）ウイルスのゲノムのＤＮＡ部分に有効に結合し、ｉ ｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで標的細胞において発現ができる正常なＣＦＴ Ｒ遺伝子を、 含む、標的細胞のＣＦＴＲのための遺伝子における欠陥を治療するための組換え 体ウイルスベクター。
13. １３．ウイルスがレトロウイルスである請求の範囲１２の組換え体ベクター。
14. １４．レトロウイルスゲノムが複製欠陥である請求の範囲１３の組換え体ベクタ ー。
15. １５．さらにＰＬＪを含む請求の範囲１３の組換え体ベクター。
16. １６．ベクターのプロウイルスが実質的に図１Ａに示されている如くである請求 の範囲１５の組換え体ベクター。
17. １７．治療されている欠陥が嚢胞性線維症の原因である請求の範囲１３の組換え 体ベクター。
18. １８．標的細胞が上皮細胞である請求の範囲１２の組換え体ベクター。
19. １９．上皮細胞が膵臓の細胞である請求の範囲１７の組換え体ベクター。
20. ２０．上皮細胞が気道上皮細胞である請求の範囲１７の組換え体ベクター。
21. ２１．上皮細胞が、汗腺、小腸、肝臓、及び腎臓の細胞からなるグループから選 ばれる細胞である請求の範囲１７の組換え体ベクター。
22. ２２．更にＰＬＪを含む請求の範囲１８の組換え体ベクター。
23. ２３．更にＰＬＪを含む請求の範囲１９の組換え体ベクター。
24. ２４．正常ＣＦＴＲ遺伝子が、発現を安定化するサイレント突然変異を含む請求 の範囲１５の組換え体ベクター。
25. ２５．（ａ）その部分が、上皮細胞を感染することができるレトロウイルスのゲ ノムの少くとも１部のＤＮＡと、それに有効に結合され、標的細胞において発現 することができる正常なＣＦＴＲを含む組換え体ウイルスベクターを提供し；そ して （ｂ）患者の上皮細胞集団に、トランスダクションに有利な条件下で、接触され た細胞集団の少くとも１部においてトランスダクションが起るに足る時間接触さ せる、ステップから成る患者の嚢胞性線維症を治療する方法。
26. ２６．接触がｉｎｖｉｖｏで行われる請求の範囲２５の方法。
27. ２７．組換え体ウイルスベクターが複製欠陥である請求の範囲２５の方法。
28. ２８．細胞集団が膵臓細胞からなる請求の範囲２５の方法。
29. ２９．細胞集団が気道上皮細胞から成る請求の範囲２５の方法。
30. ３０．細胞集団が汗腺細胞、小腸細胞、肝臓細胞、及び腎臓細胞からなるグルー プから選ばれた細胞集団からなる請求の範囲２５の方法。
31. ３１．Ｉｎｖｉｔｒｏで細胞集団が接触を受け、そして少くともその１部がトラ ンスダクション後に患者に再導入される請求の範囲２５の方法。
32. ３２．組換え体レトロウイルスベクターがＰＬＪを含む請求の範囲２７の方法。
33. ３３．その中にレトロウイルストランスダクションを通じて導入された正常ＣＦ ＴＲ遺伝子を発現するＣＦ細胞。
34. ３４．細胞がＰＬＪ−ＣＦＴＲクローン１、及び３から２０までからなるグルー プから選ばれたＰＬＪ−ＣＦＴＲクローンに由来する請求の範囲２３の細胞。
35. ３５．推定上の欠陥性ＣＦＴＲを含む核酸配列のための相補検定法であって、 （ａ）ＣＦＴＲ欠陥細胞集団； （ｂ）ＣＦＴＲ欠陥細胞集団に感染し、ＣＦＴＲ遺伝子をトランスファーするこ とができ、検定される核酸配列を担っている組換え体ベクター； （ｃ）組換え体ベクターによる感染後、細胞におけるＣＦＴＲの存在、および／ またはＣＦＴＲ機能レベルについてのスクリーニングのための手段、からなる方 法。
36. ３６．核酸配列中の推定上のＣＦ突然変異について検定する方法であって、 （ａ）その核酸配列を組込んだベクターを提供する；（ｂ）ＣＦＴＲ欠陥細胞集 団を提供する；（ｃ）ＣＦＴＲ欠陥細胞集団をトランスダクションに都合のよい 条件で、トランスダクションが起るに足るだけの時間、組換えたベクターで感染 させる；そして（ｄ）感染後、トランスデュースされた細胞集団においてＣＦＴ Ｒ機能の相補についてスクリーニングする、工程からなる方法。