BR112020024285A2

BR112020024285A2 - polinucleotídeos e polipeptídeos de adenovírus

Info

Publication number: BR112020024285A2
Application number: BR112020024285-3A
Authority: BR
Inventors: Virginia Ammendola; Stefania CAPONE; Stefano Colloca; Antonella Folgori; Rosella MERONE
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date: 2018-06-12
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2021-03-02
Also published as: EP3807298A1; CA3102224A1; US20210246468A1; WO2019239311A1; US11702674B2; CN112638936A; MX2020013553A; JP2021526831A

Abstract

''POLINUCLEOTÍDEOS E POLIPEPTÍDEOS DE ADENOVÍRUS.'' A presente invenção refere-se a sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo isoladas derivadas de novo adenovírus ChAd157 de chimpanzé, bem como a polinucleotídeos recombinantes, vetores, adenovírus, células e composições compreendendo ditas sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLI- NUCLEOTÍDEOS E POLIPEPTÍDEOS DE ADENOVÍRUS".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a sequências de polinucleo- tídeo e polipeptídeo isoladas derivadas do novo adenovírus ChAd157 de chimpanzé, bem como a polinucleotídeos recombinantes, vetores, adenovírus, células e composições compreendendo as ditas sequên- cias de polinucleotídeo e polipeptídeo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O adenovírus tem sido amplamente utilizado para aplica- ções de transferência de genes devido à sua capacidade de atingir uma transferência de genes altamente eficiente em uma variedade de tecidos alvo e grande capacidade de transgene. Convencionalmente, os genes E1 de adenovírus são removidos e substituídos por um cas- sete de transgene que consiste no promotor de seleção, sequência de CDNA do gene de interesse e um sinal poli A, resultando em um vírus recombinante de replicação defeituosa.

[0003] Os adenovírus recombinantes são úteis em terapia genética e como vacinas. Os vetores virais baseados em adenovírus de chim- panzé representam uma alternativa ao uso de vetores de adenovírus derivados de seres humanos para o desenvolvimento de vacinas ge- néticas. Os adenovírus isolados de chimpanzés estão intimamente re- lacionados aos adenovírus isolados de seres humanos, conforme de- monstrado por sua propagação eficiente nas células de origem huma- na. No entanto, uma vez que os adenovírus humanos e de chimpan- zés são parentes próximos, a reatividade sorológica cruzada entre as duas espécies de vírus é possível.

[0004] Existe uma demanda com relação aos vetores que efetiva- mente liberam moléculas a um alvo e minimizam o efeito da imunidade pré-existente a sorotipos de adenovírus selecionados na população.

Um aspecto da imunidade pré-existente observada em seres humanos é a imunidade humoral, que pode resultar na produção e persistência de anticorpos que são específicos para proteínas adenovirais. A res- posta humoral induzida pelo adenovírus é direcionada principalmente contra as três principais proteínas estruturais do capsídeo: fibra, pen- ton e hexon.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[0005] É fornecido um polinucleotídeo isolado, em que o polinucle- otídeo codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1; e (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[0006] Também é fornecido um polinucleotídeo recombinante compreendendo um polinucleotídeo selecionado do grupo que consis- te em: (a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1; e (b) um polinucleotídeo que codifica um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[0007] Também é fornecido um vetor recombinante compreenden- do um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1; e

(b) um polinucleotídeo que codifica um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[0008] Também é fornecido um adenovírus recombinante compre- endendo pelo menos um polinucleotídeo ou polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1; (b) um polinucleotídeo que codifica um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (c) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1; e (d) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[0009] Também se fornece uma composição que compreende pelo menos um dos seguintes: (a) um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1; (b) um polinucleotídeo isolado que codifica um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre to-

do o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (c) um polipeptídeo isolado tendo a sequência de aminoáci- dos de acordo com a SEQ ID NO: 1; (d) um derivado funcional isolado de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (e) um vetor compreendendo um polinucleotídeo como des- crito em (a) ou (b) acima; e (f) um adenovírus recombinante compreendendo um poli- nucleotídeo como descrito em (a) ou (b) acima, e um excipiente farma- ceuticamente aceitável.

[0010] Também é fornecida uma célula que compreende pelo me- nos um dos seguintes: (a) um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, (b) um polinucleotídeo isolado que codifica um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre to- do o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (c) um vetor compreendendo um polinucleotídeo conforme descrito em (a) ou (b) acima, e (d) um adenovírus recombinante compreendendo um poli- nucleotídeo como descrito em (a) ou (b) acima.

[0011] Também se fornece um polipeptídeo adenoviral isolado se- lecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1; e

(b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figuras 1A a 1D - Alinhamento das sequências de proteína fibra dos adenovírus símios indicados. ChAd157 (SEQ ID NO: 1) ChAd3 (SEQ ID NO: 27) PanAd3 (SEQ ID NO: 28) ChAd17 (SEQ ID NO: 29) ChAd19 (SEQ ID NO: 30) ChAd24 (SEQ ID NO: 31) ChAd155 (SEQ ID NO: 7) ChAd11 (SEQ ID NO: 32) ChAd20 (SEQ ID NO: 33) ChAd31 (SEQ ID NO: 34) PanAd1 (SEQ ID NO: 35) PanAd2 (SEQ ID NO: 36) Figura 2 - Representação esquemática do Transporte do Subgrupo C BAC Figura 3 - Representação esquemática do Transporte do Subgrupo C Plasmídeo Figura 4 - representação esquemática do vetor pChAd157 AEI/TetO hoMV GAG Figura 5 - representação esquemática do transporte de pARS SpeciesC Ad5orf6-2 Figura 6 - plasmídeo que carrega a representação esque- mática ChAd157 RG

Figura 7 - Expressão do transgene por ChAd157/GAG, ChAd19/GAG e ChAd155/GAG Figura 8 - Análise de Western Blot de lisados de células He- la infectadas com ChAd155/RG e ChAd157/RG Figura 9 - Potência imunológica de ChAd157/GAG, ChAd155/GAG e ChAd19g9 GAG em camundongos BALB/c Figura 10 - Potência imunológica de ChAd157/RG e ChAd155/RG em camundongos BALB/c Figura 11 - Títulos de neutralização após pré-imunização de camundongos com diferentes vetores ChAd Figura 12 - IFN-y ELISpot após a vacinação de camundon- gos com ChAd157/GAG após vários regimes de pré-imunização

DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 - Sequência de polipeptídeo de fibra ChAd157 SEQ ID NO: 2 - Sequência de polinucleotídeo que codifica a fibra ChAd1I57 SEQ ID NO: 3 - Sequência de polipeptídeo de penton ChAd157 SEQ ID NO: 4 - Sequência de polinucleotídeo que codifica o penton ChAd157 SEQ ID NO: 5 - Sequência de polipeptídeo do hexon ChAd157 SEQ ID NO: 6 - sequência de polinucleotídeo que codifica o hexon ChAd157 SEQ ID NO: 7 - Sequência de polipeptídeo de fibra ChAd155 SEQ ID NO: 8 - Sequência de polinucleotídeo que codifica a fibra ChAd155 SEQ ID NO: 9 - Sequência de polipeptídeo do penton

ChAd155

SEQ ID NO: 10 - Sequência de polinucleotídeo que codifica o penton ChAd155

SEQ ID NO: 11 - Sequência de polipeptídeo do hexon ChAd155

SEQ ID NO: 12 - sequência de polinucleotídeo que codifica o hexon ChAd155

SEQ ID NO: 13 - Sequência de polinucleotídeo que codifica ChAd155 do tipo amplo

SEQ ID NO: 14 - Sequência de polinucleotídeo do Trans- porte do Subgrupo C BAC (* 1365)

SEQ ID NO: 15 - Sequência de polinucleotídeo de PpChAd1570E1 TetO hoMV RpsL- Kanatt1551

SEQ ID NO: 16 - sequência de polinucleotídeo do HIV Gag

SEQ ID NO: 17 - Sequência de polinucleotídeo de PpChAd157 AEI/TetO hoMV GAGH1557

SEQ ID NO: 18 - sequência de polinucleotídeo do iniciador 1 Ad5orf6

SEQ ID NO: 19 - sequência de polinucleotídeo do iniciador 2 Ad5orf6

SEQ ID NO: 20 - sequência de polinucleotídeo do iniciador 1 da Fibra-E4 poliA

SEQ ID NO: 21 - sequência de polinucleotídeo do iniciador 2 da Fibra-E4 poliA

SEQ ID NO: 22 - Sequência de polinucleotídeo de ChAd157 AEIE4 Ad5E40rf6/TetO hoMV RpsL-Kanatt1594

SEQ ID NO: 23 - Sequência de polinucleotídeo da glicopro- teína da raiva

SEQ ID NO: 24 - Sequência de polinucleotídeo de PpChAd157 AEIE4 Ad5E40rf6/Teto hoMV RGH1559

SEQ ID NO: 25 - Sequência de polinucleotídeo iniciadora CMVfor

SEQ ID NO: 26 - Sequência de polinucleotídeo iniciadora CMVrev

SEQ ID NO: 27 - Sequência de aminoácidos para a proteí- na fibra de ChAd3

SEQ ID NO: 28 - Sequência de aminoácidos para a proteí- na fibra de PanAd3

SEQ ID NO: 29 - Sequência de aminoácidos para a proteí- na fibra de ChAd17

SEQ ID NO: 30 - Sequência de aminoácidos para a proteí- na fibra de ChAd19

SEQ ID NO: 31 - Sequência de aminoácidos para a proteí- na fibra de ChAd24

SEQ ID NO: 32 - Sequência de aminoácidos para a proteí- na fibra de ChAd11

SEQ ID NO: 33 - Sequência de aminoácidos para a proteí- na fibra de ChAd20

SEQ ID NO: 34 - Sequência de aminoácidos para a proteí- na fibra de ChAd31

SEQ ID NO: 35 - Sequência de aminoácidos para a proteí- na fibra de PanAd1

SEQ ID NO: 36 - Sequência de aminoácidos para a proteí- na fibra de PanAd2

SEQ ID NO: 37 - Sequência de polinucleotídeo de hoMV(tetO)

SEQ ID NO: 38 - Sequência de polinucleotídeo do transpor- te do Subgrupo C Plasmídeott1376

SEQ ID NO: 39 - Sequência de polinucleotídeo de BGH po- IliA

SEQ ID NO: 40 - Sequência de polinucleotídeo de pARS SpeciesC Ad5orf6-2 SEQ ID NO: 41 - Sequência de polinucleotídeo da sonda CMVFAM-TAMRA SEQ ID NO: 42 - Sequência de polinucleotídeo que codifica o promotor hoMV aprimorado

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0012] Os vetores, composições e métodos da presente invenção podem ter uma ou mais das seguintes características melhoradas em relação à técnica anterior, incluindo, mas não limitado a maior produti- vidade, imunogenicidade melhorada, expressão aumentada do trans- gene ou um perfil de reatividade cruzada sorológica distinta.

[0013] Os vetores, composições e métodos da presente invenção podem demonstrar uma combinação de propriedades, tais como pro- dutividade, imunogenicidade, expressão do transgene e/ou reatividade sorológica cruzada, o que significa que eles fornecem uma alternativa valiosa às abordagens conhecidas. Adenovírus

[0014] Os adenovírus possuem uma morfologia característica com um capsídeo icosaédrico compreendendo três proteínas principais, hexon (II), penton base (Ill) e uma fibra nodosa (IV), junto de várias outras proteínas menores, VI, VIII, IX, llia e IVa2 . O genoma do vírus é um DNA linear de fita dupla. O DNA do vírus está intimamente asso- ciado com a proteína VII altamente básica e a um pequeno peptídeo pX (anteriormente denominado mu). Outra proteína, V, é acondiciona- da com este complexo DNA-proteína e fornece uma ligação estrutural ao capsídeo através da proteína VI. O vírus também contém uma pro- tease codificada por vírus, que é necessária para o processamento de algumas das proteínas estruturais para produzir vírus infecciosos ma- duros.

[0015] O genoma adenoviral está bem caracterizado. Existe uma conservação geral na organização geral do genoma adenoviral no que diz respeito a estruturas específicas de leitura aberta sendo posiciona- das de forma semelhante, por exemplo, a localização dos genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 e L5 de cada vírus. Cada ex- tremidade do genoma adenoviral compreende uma sequência conhe- cida como uma repetição terminal invertida (ITR), que é necessária para a replicação viral. O vírus também compreende uma protease co- dificada por vírus, que é necessária para o processamento de algumas das proteínas estruturais necessárias para produzir vírions infecciosos. A estrutura do genoma adenoviral é descrita com base na ordem em que os genes virais são expressos após a transdução da célula hos- pedeira. Mais especificamente, os genes virais são referidos como ge- nes precoces (E) ou tardios (L) de acordo com se a transcrição ocorre antes ou após o início da replicação do DNA. Na fase precoce da transdução, os genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3 e E4 do adenovírus são expressos para preparar a célula hospedeira para a replicação vi- ral. Durante a fase tardia da infecção, a expressão dos genes tardios L1-L5, que codificam os componentes estruturais das partículas virais, é ativada.

[0016] Os adenovírus são sorotipos específicos e diferentes da espécie, isto é, tipos de vírus que não são neutralizados de forma cru- zada por anticorpos, foram isolados de uma variedade de espécies de mamífero. Por exemplo, mais de 50 sorotipos foram isolados de seres humanos, que são divididos em seis subgrupos (A-F; B é subdividido em B1 e B2) com base na homologia de sequência e na sua capaci- dade de aglutinar glóbulos vermelhos (Tatsis and Ertl Molecular The- rapy (2004) 10:616-629). Numerosos adenovírus foram isolados de símios não humanos tais como chimpanzés, bonobos, macacos resos e gorilas, e eles são classificados nos mesmos grupos humanos com base em conexões filogenéticas baseadas em sequências de hexon ou fibra (Colloca et al. (2012) Science Translational Medicine 4:1-9; Roy et al. (2004) Virology 324 : 361-372; Roy et al. (2010) Journal of Gene Medicine 13:17-25).

[0017] A WO02005071093 divulga adenovírus de chimpanzé inclu- indo ChAd19. A WO2016198621 (PCT/EP2016/063329) divulga os adenovírus de chimpanzé ChAd155, que é aqui incorporada por refe- rência com o propósito de definir vetores derivados de ChAd155. Proteínas da Cápside de Adenovírus Incluindo a Proteína Fibra e Polinucleotídeos que codificam essas Proteínas

[0018] Conforme delineado acima, a cápside adenoviral compre- ende três proteínas principais, hexon, penton e fibra. O hexon é res- ponsável pela maioria dos componentes estruturais da cápside, que consiste em 240 capsômeros de hexon triméricos e 12 bases de pen- ton. O hexon possui três barris duplos conservados, enquanto que a parte superior possui três torres, cada torre contendo uma alça de ca- da subunidade que forma a maior parte do capsídeo. A base de hexon é altamente conservada entre os sorotipos adenovirais, enquanto que as alças de superfície são variáveis (Tatsis and Ertl Molecular Therapy (2004) 10:616-629).

[0019] Penton é outra proteína adenoviral do capsídeo que forma uma base pentamérica à qual a fibra se liga. A proteína fibra trimérica projeta-se da base do penton em cada um dos 12 vértices do capsídeo e é uma estrutura na forma de bastão nodoso. Uma diferença notável na superfície das capsídeos de adenovírus em comparação com aque- la da maioria dos outros vírus icosaédricos é a presença da proteína fibra longa e fina. O papel principal da proteína fibra é amarrar o cap- sídeo viral à superfície da célula por meio de sua interação com um receptor celular.

[0020] As proteínas fibra de muitos sorotipos de adenovírus com-

partilham uma arquitetura comum: uma cauda N-terminal, um eixo central feito de sequências repetidas e um domínio de botão globular C-terminal (ou “cabeça”). O domínio do eixo central consiste em um número variável de repetições beta. As repetições beta se conectam para formar uma estrutura alongada de três filamentos em espiral en- trelaçados que são altamente rígidos e estáveis. O eixo conecta a cauda N-terminal com a estrutura do botão globular, que é responsável pela interação com o receptor celular alvo. A natureza globular do do- mínio de botão de adenovírus apresenta grandes superfícies para ligar o receptor lateral e apicalmente. O efeito dessa arquitetura é projetar o local de ligação do receptor longe do capsídeo do vírus, liberando as- sim o vírus das restrições estéricas apresentadas pela superfície rela- tivamente plana do capsídeo.

[0021] Embora as fibras de muitos sorotipos de adenovírus te- nham a mesma arquitetura geral, elas possuem sequências de amino- ácido variáveis que influenciam sua função e estrutura. Por exemplo, várias regiões expostas na superfície do botão de fibra apresentam um sítio de ligação ao receptor facilmente adaptável. A forma globular do botão de fibra permite que os receptores se liguem nas laterais do bo- tão ou na parte superior do botão de fibra. Esses sítios de ligação tipi- camente se encontram em alças expostas à superfície conectando fi- tas beta que são mal conservadas entre os adenovírus humanos. As cadeias laterais expostas nessas alças fornecem ao botão uma varie- dade de características de superfície, enquanto preserva a estrutura terciária e quaternária. Por exemplo, o potencial eletrostático e as dis- tribuições de carga nas superfícies do botão podem variar devido à ampla faixa de pontos isoelétricos nas sequências do botão de fibra, de pl aproximadamente 9 para Ad 8, Ad 19 e Ad 37 a aproximadamen- te 5 para adenovírus do subgrupo B. Como um ligante de vírus estrutu- ralmente complexo, a proteína fibra permite a apresentação de uma variedade de superfícies de ligação (botão) em várias orientações e distâncias (eixo) do capsídeo viral.

[0022] Uma das variações mais óbvias entre alguns sorotipos é o comprimento da fibra. Estudos têm mostrado que o comprimento do eixo da fibra influencia fortemente a interação do botão e do vírus com seus receptores alvo. Além disso, as proteínas fibra entre os sorotipos também podem variar em sua capacidade de dobrar. Embora as repe- tições beta no eixo formem uma estrutura altamente estável e regular, estudos de microscopia eletrônica (EM) mostraram dobradiças distin- tas na fibra. A análise da sequência da proteína de várias fibras de so- rotipo de adenovírus aponta uma interrupção nas sequências de repe- tição do eixo na terceira repetição beta da cauda N-terminal, que se correlaciona fortemente com uma das dobradiças no eixo, conforme visto por EM. As dobradiças na fibra permitem que o botão adote uma variedade de orientações em relação ao capsídeo do vírus, o que pode contornar os impedimentos estéricos ao envolvimento do receptor, o que requer a apresentação correta do sítio de ligação ao receptor no botão. Por exemplo, as fibras rígidas do subgrupo D Ads requerem, portanto, um receptor flexível ou um pré-posicionado para a fixação do vírus, uma vez que são incapazes de se dobrar. (Nicklin et al Molecu- lar Therapy 2005 12:384-393).

[0023] A identificação de receptores celulares específicos para di- ferentes sorotipos de Ad e o conhecimento de como eles contribuem para o tropismo tecidual foram alcançados por meio do uso de tecno- logia de pseudotipagem de fibras. Embora as Ads de alguns subgru- pos utilizem CAR como receptor primário, está se tornando claro que muitas Ads utilizam receptores primários alternativos, levando a um tropismo muito diferente in vitro e in vivo. As fibras desses sorotipos mostram diferenças claras em suas estruturas primárias e terciárias, tais como a rigidez do eixo da fibra, o comprimento do eixo da fibra e a falta de um sítio de ligação ao CAR e/ou o motivo de ligação HSPG putativo, juntamente com as diferenças na carga líquida dentro do bo- tão de fibra. A pseudotipagem de 5 partículas Ad com um eixo de fibra alternativo e botão, portanto, fornece uma oportunidade para remover domínios de ligação de células importantes e, além disso, pode permi- tir a liberação de transgene mais eficiente (e potencialmente mais sele- tiva para células) para os tipos de células definidos em comparação com aquela alcançada com Ad 5. A neutralização de partículas de Ad com pseudotipagem de fibra também pode ser reduzida se as fibras utilizadas forem de Ads com menor soroprevalência em seres huma- nos ou modelos experimentais, uma situação que favorece a adminis- tração bem-sucedida do vetor (Nicklin et al Molecular Therapy (2005) 12:384-393). Além disso, a fibra de comprimento total, assim como re- giões de botão de fibra isoladas, mas não hexon ou penton isolada- mente, são capazes de induzir a maturação de células dendríticas e estão associadas à indução de uma resposta de células T CD8+ po- tente (Molinier-Frenkel et al. J. Biol. Chem. (2003) 278:37175-37182). Tomadas em conjunto, a fibra adenoviral desempenha um papel im- portante pelo menos na ligação ao receptor e na imunogenicidade dos vetores adenovirais.

[0024] Ilustrando as diferenças entre as proteínas fibra de adeno- vírus símios do Grupo C está o alinhamento fornecido na Figura 1. Uma característica marcante é que as sequências de fibra desses adenovírus podem ser amplamente agrupadas em uma fibra curta, tal como ChAd157, ou fibra longa, tal como ChAd155. Este diferencial de comprimento é devido a uma supressão de 36 aminoácidos aproxima- damente na posição 321 na fibra curta em relação à fibra longa. Além disso, existem várias substituições de aminoácido que diferem entre o subgrupo de fibras curtas versus longas, embora sejam consistentes dentro de cada subgrupo. Embora a função exata dessas diferenças ainda não tenha sido elucidada, dada a função e a imunogenicidade da fibra, é provável que sejam significativas. Foi demonstrado que um dos determinantes do tropismo viral é o comprimento do eixo da fibra. Foi demonstrado que um vetor Ad5 com um eixo mais curto possui uma menor eficiência de ligação ao receptor CAR e uma infecciosida- de menor (Ambriovic-Ristov A. et al .: Virology. (2003) 312(2):425-33): Especulou-se que esta deficiência é o resultado de um aumento da rigidez da fibra mais curta levando a uma ligação menos eficiente ao receptor celular (Wu, E et al .: J Virol. (2003) 77(13): 7225-7235).

[0025] Em um aspecto da invenção, é fornecido um polipeptídeo de fibra isolado de adenovírus de chimpanzé ChAd157 e polinucleotí- deos isolados que codificam o polipeptídeo de fibra de adenovírus de chimpanzé ChAd157.

[0026] Espera-se que a proteína fibra contribua para a baixa soro- prevalência e possa, portanto, ser utilizada independentemente dos polipeptídeos hexon e penton de ChAd157 ou em combinação (com um ou ambos hexon e penton) para suprimir a afinidade de um adeno- vírus com os anticorpos neutralizantes preexistentes, por exemplo, pa- ra a fabricação de um adenovírus recombinante com uma soropreva- lência reduzida. Um tal adenovírus recombinante pode ser um adeno- vírus quimérico com proteínas da cápside de diferentes sorotipos com pelo menos uma proteína fibra de ChAd157.

[0027] A sequência de polipeptídeo da fibra ChAd157 é fornecida na SEQ ID NO: 1.

[0028] A sequência do polipeptídeo penton ChAd157 é fornecida na SEQ ID NO: 3.

[0029] A sequência do polipeptídeo hexon ChAd157 é fornecida na SEQ ID NO: 5.

Polipeptídeos, Adenovírus Recombinantes, Composições ou Célu- las compreendendo Sequências de Polipeptídeo de Fibra ChAd157 ou um Derivado Funcional das Mesmas

[0030] Adequadamente, o polipeptídeo isolado, adenovírus re- combinante, composição ou célula da invenção compreende um poli- peptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[0031] O polipeptídeo, adenovírus recombinante, composição ou célula da invenção pode compreender um polipeptídeo que é um deri- vado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica so- bre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[0032] Alternativamente, o derivado funcional não possui mais do que uma adição, supressão ou substituição em comparação com a SEQ ID NO: 1, tal como uma substituição em comparação com a SEQ ID NO: 1.

[0033] Adequadamente, o polipeptídeo, adenovírus recombinante, composição ou célula de acordo com a invenção ainda compreende: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3; ou (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 3, e/ou (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5; ou

(b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

[0034] Adequadamente, o derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, tal como pelo menos 80%, especialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 95% ou pelo menos 98%.

[0035] Adequadamente, o derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5 possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, tal como pelo menos 80%, especialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 95% ou pelo menos 98%.

[0036] Em particular, o polipeptídeo, adenovírus recombinante, composição ou célula de acordo com a invenção ainda compreende: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3; e/ou (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5.

[0037] Alternativamente, o polipeptídeo, adenovírus recombinante, composição ou célula da invenção pode compreender um polipeptídeo que é um derivado funcional da SEQ ID NO: 1, em que o derivado fun- cional consiste em (i) um polipeptídeo tendo uma sequência de amino- ácidos que é pelo menos 99,8% idêntico sobre todo o seu comprimen- to aos resíduos 19 a 561 da SEQ ID NO: 1 e (ii) um ou mais resíduos de aminoácido diretamente N-terminal do derivado funcional. Em uma modalidade, um derivado funcional consiste em (i) um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idênti- ca sobre todo o seu comprimento aos resíduos 19 a 561 da SEQ ID NO: 1 e (ii) 1 a 18 resíduos de aminoácido diretamente N-terminal ao derivado funcional. Em uma dessas modalidades, um derivado funcio- nal consiste em (i) um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoáci- dos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento aos resíduos 19 a 561 da SEQ ID NO: 1 e (ii) um aminoácido resíduo diretamente N-terminal ao derivado funcional.

[0038] Alternativamente, o polipeptídeo, adenovírus recombinante, composição ou célula da invenção pode compreender um polipeptídeo que é um derivado funcional da SEQ ID NO: 1, em que o derivado fun- cional consiste em (i) um polipeptídeo tendo uma sequência de amino- ácidos que é pelo menos 99,8% idêntico ao longo de todo o seu com- primento aos resíduos 19 a 561 da SEQ ID NO: 1 e (ii) uma sequência de dezoito resíduos de aminoácidos diretamente N-terminal ao deriva- do funcional, em que a sequência de dezoito resíduos de aminoácido é pelo menos 50%, mais adequadamente pelo menos 55%, mais ade- quadamente pelo menos 60%, mais adequadamente pelo menos 65%, mais adequadamente pelo menos 70%, mais adequadamente pelo me- nos 75%, mais adequadamente pelo menos 80%, mais adequadamente pelo menos 85%, mais adequadamente pelo menos 90% idêntico sobre todo o seu comprimento aos resíduos 1 a 18 da SEQ ID NO: 1.

[0039] Alternativamente, o polipeptídeo, adenovírus recombinante, composição ou célula da invenção pode compreender um polipeptídeo que é um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado fun- cional não possui mais de 19 supressões em comparação com a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o derivado funcional pode ter não mais do que 18 supressões em comparação com a SEQ ID NO: 1, por exemplo, não mais do que 17, não mais do que 16, não mais do que 15, não mais do que 14, não mais do que 13, não mais do que 12 ou não mais do que 11 supressões. Em uma modalidade, o derivado fun- cional pode ter não mais do que 10 supressões em comparação com a SEQ ID NO: 1, por exemplo, não mais do que 9, não mais do que 8, não mais do que 7, não mais do que 6, não mais do que 5, não mais do que 4, não mais do que 3, não mais do que 2 ou apenas uma única supressão. Polinucleotídeos Isolados, Vetores, Adenovírus Recombinantes, Composições ou Células compreendendo Polinucleotídeos que codificam a Fibra ChAd157 ou um derivado funcional da mesma

[0040] Adequadamente, o polinucleotídeo isolado, vetor, adenoví- rus recombinante, composição ou célula da invenção compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1. Adequadamente, o poli- nucleotídeo possui uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 2.

[0041] Quando o polinucleotídeo isolado, vetor, adenovírus re- combinante, composição ou célula da invenção compreende um poli- nucleotídeo que codifica um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntico sobre todo o seu comprimento à se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, adequadamente o polinu- cleotídeo possui uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 2 em que um códon foi adicionado, suprimido ou alterado para codificar um aminoácido diferente.

[0042] Adequadamente, o polinucleotídeo, vetor, adenovírus re- combinante, composição ou célula da invenção ainda compreende um polinucleotídeo que codifica: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3; ou (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, e/ou (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5; ou (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

[0043] Adequadamente, o derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, tal como pelo menos 80%, especialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 95% ou pelo menos 98%.

[0044] Adequadamente, o derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5 possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, tal como pelo menos 80%, especialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 95% ou pelo menos 98%.

[0045] Em particular, o polinucleotídeo, vetor, adenovírus recombi- nante, composição ou célula da invenção ainda compreende um poli- nucleotídeo que codifica: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3; e/ou (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5.

[0046] O polinucleotídeo, vetor, adenovírus recombinante, compo- sição ou célula da invenção pode ainda compreender: (a) um polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO: 4; e/ou (b) um polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO: 6. Cadeias Principais de ChAd157

[0047] A invenção fornece sequências de polinucleotídeo isoladas de adenovírus de chimpanzé ChAd157, incluindo aquele do tipo selva- gem, ChAd157 não modificado e construções de cadeia principal mo- dificada de ChAd157. Essas construções de cadeia principal modifica- dos incluem aquelas aqui exemplificadas, tais como pChAd157AE1 Teto hoMV RpsL-Kanat1551 (SEQ ID NO: 15) e ChAdi57 AEIE4 Ad5E40rfe/TetO hoMV RpsL-Kanatt1594 (SEQ ID NO: 22). As cadeias principais de ChAd157 podem ser utilizadas na construção de adenovírus recombinantes competentes para a replicação ou incompe- tentes para a replicação, por exemplo, para a liberação de transgenes.

[0048] A anotação da sequência de pChAd157 AE1/TetO hoMV GAG (SEQ ID NO: 17) é fornecida abaixo. Anotações ChAd157DE1 TetohocMV GAG IX 3187..3651 IVa2 Complemento (37 10..5045,5325..5337) Pol Complemento (4816..8397, 13762..13770) VARNAI 10230..10391 pTP Complemento (8196..10199, 13762..13770) 48K 10652..11914 plila 11938..13714 UM 13807..15588 pvIl 15603..16199 V 16275..17390 px 17415..17660 pv! 17750..18508 Hexon 18623..21499 Protease — 21529..22158 DBP Complemento (22274..23926) 92K 23976..26447 22K 26164 ..26739 33K Ligação (26164..26473, 26679..27061) promotor E2e — Complemento (27027 ..27274) pVII 27136..27819 E3 12K 27820..28137 E3 CR1-alfapo 28635..28835 E3 gp18K 28838..29329 ESA1IK 30776.31072 E3 RID alfa 31084..31356 E3 RID beta31359..31757 E3 15K 31750..32136 U éxon Complemento (32167 ..32331) Fibra 32288..33973 E4 ORF6/7 Complemento (34181..34456, 35168..35341) E4 ORF6 Complemento (34457..35341) E4 ORF4 Complemento (35241..35606) E4 ORF3 Complemento (35622..35969) E4 ORF2 “Complemento (35966..36358) E4 ORF1 Complemento (36411..36797)

[0049] Em uma modalidade, fragmentos das sequências da SEQ ID NO: 15, 22 e seus filamentos complementares, cDNA e RNA com- plementares às mesmas são fornecidos. Adequadamente, os fragmen-

tos são de pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento, mais ade- quadamente 30 nucleotídeos de comprimento, mais adequadamente 60 nucleotídeos de comprimento, mais adequadamente 120 nucleotí- deos de comprimento, mais adequadamente 240, mais adequadamen- te 480 nucleotídeos de comprimento e abrangem fragmentos funcio- nais, isto é, fragmentos que são de interesse biológico. Por exemplo, um fragmento funcional pode expressar um produto adenoviral dese- jado ou pode ser útil na produção de vetores virais recombinantes. Es- ses fragmentos incluem as sequências de gene listadas acima. Em certas modalidades, sequências isoladas da SEQ ID NO: 15, 22 e seus filamentos complementares, cDNA e RNA complementares às mesmas são fornecidos.

[0050] Produtos gênicos do adenovírus ChAd157, tais como prote- Ínas, enzimas e fragmentos dos mesmos, que são codificados pelos ácidos nucleicos adenovirais, e os seus fragmentos anteriormente mencionados, descritos nesta invenção, são fornecidos. Essas proteí- nas incluem aquelas codificadas pelas estruturas de leitura aberta identificadas acima e as proteínas codificadas pelos polinucleotídeos fornecidos na Listagem de Sequências. Polinucleotídeos e Polipeptídeos de ChAd157 adicionais

[0051] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo da invenção compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de fibra; um polipeptídeo de hexon e um polipeptídeo de fibra; polipeptídeo de penton e polipeptídeo de fibra; ou polipeptídeo de hexon, polipeptídeo de penton e polipeptídeo de fibra da invenção; e pode ainda compre- ender polinucleotídeos adenovirais adicionais, adequadamente polinu- cleotídeos de ChAd157. Assim, adequadamente, o polinucleotídeo de acordo com a invenção compreende um ou mais dos seguintes: (a) uma repetição terminal invertida (ITR) adenoviral 5'; (b) uma região adenoviral E1A, ou um fragmento desta se-

lecionada dentre as regiões EIA 280R e E1 A 243R;

(c) uma região adenoviral E1B ou IX, ou um fragmento des- ta selecionada dentre o grupo que consiste nas regiões E1 B 19K, E1IB 55K e IX;

(d) uma região adenoviral E2B; ou um fragmento desta se- lecionada dentre o grupo que consiste nas regiões E2B pTP, E2B polimerase e E2B |IVa?2;

(e) uma região adenoviral L1, ou um fragmento desta, dito fragmento codificando uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L1 13.6K, L1 52KeL1 pllla;

(f) uma região adenoviral L2 ou uma região L2 compreen- dendo um polinucleotídeo que codifica a proteína penton da invenção, ou um fragmento da mesma, dito fragmento que codifica uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L2 penton, na proteína L2 pVIl, na Proteína L2 V e na proteína L2 pX;

(9) uma região adenoviral L3 ou uma região L3 compreen- dendo um polinucleotídeo que codifica a proteína hexon da invenção, ou um fragmento da mesma, dito fragmento que codifica uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L3 pVl, na proteína L3 hexon e na proteína L3 protease;

(h) uma região adenoviral E2A;

(i) uma região adenoviral L4, ou um fragmento da mesma, dito fragmento que codifica uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L4 100K, na proteína L4 33K, na pro- teína L4 22K e na proteína L4 VIII;

(]) uma região adenoviral E3, ou um fragmento da mesma selecionada do grupo que consiste em

E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8 e E3 ORF9;

(k) uma região adenoviral LS5 ou uma região L5 compreen-

dendo um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da fibra L5. ibra da invenção (1) uma região adenoviral E4 (tal como Ad5), ou um frag- mento desta selecionada do grupo que consiste em E4 ORF7, E4 ORFS6, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2 e E4 ORF1; em particular ORF6 da dita região E4; (m) uma 3'-ITR adenoviral; e/ou (n) uma região adenoviral VAI ou VAII RNA, de preferência uma região adenoviral VAI ou VAII RNA de um adenovírus diferente de ChAd157, mais preferivelmente de Ad5. Definições

[0052] Adequadamente, os polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção são isolados. Um polinucleotídeo "isolado" é aquele que é removido de seu ambiente original. Por exemplo, um polinucleotídeo de ocorrência natural é isolado se for separado de alguns ou de todos os materiais coexistentes no sistema natural. Um polinucleotídeo é considerado de ser isolado se, por exemplo, for clonado em um vetor que não faz parte do seu ambiente natural ou se estiver compreendido no cDNA.

[0053] Adequadamente, os polinucleotídeos da invenção são re- combinantes. Recombinante significa que o polinucleotídeo é o produ- to de pelo menos uma das etapas de clonagem, restrição ou ligação, ou outros procedimentos que resultam em um polinucleotídeo que é distinto de um polinucleotídeo encontrado na natureza. Um adenovírus recombinante é um adenovírus compreendendo um polinucleotídeo recombinante. Um vetor recombinante é um vetor que compreende um polinucleotídeo recombinante. "Um vírus recombinante" inclui a progê- nie do vírus recombinante original. 'Um vetor recombinante' inclui répli- cas do vetor recombinante original. “Um polinucleotídeo recombinante inclui réplicas do polinucleotídeo recombinante original.

[0054] Adequadamente, a sequência de polipeptídeo da presente invenção contém pelo menos uma alteração em relação a uma se- quência nativa. Adequadamente, as sequências de polinucleotídeo da presente invenção contêm pelo menos uma alteração em relação a uma sequência nativa. Por exemplo, um polinucleotídeo introduzido por técnicas de engenharia genética em um plasmídeo ou vetor deri- vado de uma espécie diferente (e frequentemente um gênero, subfa- mília ou família diferente) é um polinucleotídeo heterólogo. Um promo- tor removido da sua sequência de codificação nativa e ligado de ma- neira operável a uma sequência de codificação com a qual não se en- contra naturalmente ligado é um promotor heterólogo. Um sítio de re- combinação específico que foi clonado em um genoma de um vírus ou vetor viral, em que o genoma do vírus não o contém naturalmente, é um sítio de recombinação heterólogo. Uma sequência de ácido nuclei- co heteróloga também inclui uma sequência encontrada naturalmente em um genoma adenoviral, mas localizada em uma posição não nativa dentro do vetor adenoviral.

[0055] Tipicamente, "heterólogo" significa derivado de uma entida- de genotipicamente distinta daquela do resto da entidade com a qual está sendo comparada. Uma sequência de ácido nucleico heteróloga refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico que não é isolada, derivada de ou baseada em uma sequência de ácido nucleico de ocor- rência natural do vetor adenoviral. Uma sequência de proteína heteró- loga refere-se a qualquer sequência de proteína que não é isolada, derivada ou baseada em uma sequência de proteína de ocorrência natural do vetor adenoviral. "Ocorrência natural" significa uma sequên- cia encontrada na natureza e não preparada ou modificada sintetica- mente. Uma sequência é "derivada" de uma fonte quando é isolada de uma fonte, mas modificada (por exemplo, por supressão, substituição (mutação), inserção ou outra modificação), adequadamente de modo a não interromper a função normal do gene de origem.

[0056] Um "derivado funcional" de um polipeptídeo adequadamen- te refere-se a uma versão modificada de um polipeptídeo, por exem- plo, em que um ou mais aminoácidos do polipeptídeo podem ser su- primidos, inseridos, modificados e/ou substituídos. Um derivado de uma proteína da cápside adenoviral não modificada é considerado funcional se, por exemplo: (a) um adenovírus compreendendo a proteína de capsídeo derivada dentro de seu capsídeo retiver substancialmente a mesma ou uma seroprevalência inferior em comparação com um adenovírus compreendendo a proteína de capsídeo não modificada e/ou (b) um adenovírus compreendendo a proteína de capsídeo derivada dentro de seu capsídeo retiver substancialmente a mesma ou uma infecciosidade de célula hospedeira superior em comparação com um adenovírus compreendendo a proteína de capsídeo não modifica- da e/ou (c) um adenovírus compreendendo a proteína de capsídeo derivada dentro de sua cápside retiver substancialmente a mesma ou uma imunogenicidade superior em comparação com um adenovírus compreendendo a proteína de capsídeo não modificada e/ou (d) um adenovírus compreendendo a proteína do capsídeo derivada em seu capsídeo retiver substancialmente o mesmo ou um nível mais elevado de produtividade do transgene em comparação com um adenovírus compreendendo a proteína do capsídeo não modi- ficada.

[0057] As propriedades (a) a (d) acima podem ser adequadamente medidas utilizando os métodos descritos na seção de Exemplos abai- xo.

[0058] Adequadamente, o polipeptídeo, vetor ou adenovírus re- combinante possui uma soroprevalência baixa em uma população hu-

mana. "Baixa soroprevalência" pode significar ter um nível reduzido de anticorpos neutralizantes pré-existentes em comparação com o ade- novírus humano 5 (Ad5). Da mesma forma ou alternativamente, "baixa soroprevalência" pode significar menos do que cerca de 20% de soro- prevalência, menos do que cerca de 15% de soroprevalência, menos do que cerca de 10% de soroprevalência, menos do que cerca de 5% de seroprevalência, menos do que cerca de 4% de soroprevalência, menos do que cerca de 3% de soroprevalência, menos do que cerca de 2% de soroprevalência, menos do que cerca de 1% de soropreva- lência ou nenhuma soroprevalência detectável. A soroprevalência po- de ser medida como a porcentagem de indivíduos tendo um título de neutralização clinicamente relevante (definido como um título de neu- tralização a 50% > 200) utilizando métodos conforme descrito em As- te-Amézaga et al., Hum. Gene Ther. (2004) 15(3):293-304.

[0059] Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são utilizados de modo trocável nessa invenção.

[0060] O termo "símio" é tipicamente proposto para abranger pri- matas não humanos, por exemplo, macacos do Velho Mundo, maca- cos do Novo Mundo, macacos e gibões. Em particular, símio pode se referir a macacos não humanos tais como chimpanzés (Pan troglo- dyte), bonobos (Pan paniscus) e gorilas (gênero Gorilla). Símios não macacos podem incluir macacos resos (Macaca mulatta). Comparação de Sequências

[0061] Para os propósitos de comparação de duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo intimamente relacionadas, a "% de identidade" entre uma primeira sequência e uma segunda sequência po- de ser calculada utilizando um programa de alinhamento, tal como BLASTO (disponível em blast.ncbi.nlm.nih.gov, último acesso em 09 de março de 2015) utilizando configurações padrão. A % de identidade é o número de resíduos idênticos dividido pelo número de resíduos na se-

quência de referência, multiplicado por 100. Os dígitos de % de identida- de referidos ao acima e nas reivindicações são porcentagens calculadas por esta metodologia. Uma definição alternativa de % de identidade é o número de resíduos idênticos dividido pelo número de resíduos alinha- dos, multiplicado por 100. Métodos alternativos incluem o uso de um mé- todo intervalado no qual os intervalos no alinhamento, por exemplo, su- pressões em uma sequência em relação à outra sequência, são contabi- lizados em uma pontuação de intervalos ou um custo de intervalos no parâmetro de pontuação. Para obter mais informações, ver a ficha técni- ca BLASTO disponível em ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/ How- To BLASTGuide.pdf, último acesso em 09 de março de 2015.

[0062] As sequências que preservam a funcionalidade do polinu- cleotídeo ou de um polipeptídeo codificado desse modo são provavel- mente mais intimamente idênticas. As sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo são ditas de serem iguais ou idênticas a outras se- quências de polipeptídeo ou polinucleotídeo, se elas compartilharem 100% de identidade de sequência sobre todo o seu comprimento.

[0063] Uma "diferença" entre as sequências refere-se a uma in- serção, supressão ou substituição de um único resíduo de aminoácido em uma posição da segunda sequência, em comparação com a pri- meira sequência. Duas sequências de polipeptídeo podem conter uma, duas ou mais dessas diferenças de aminoácido. As inserções, supres- sões ou substituições em uma segunda sequência que é de outra for- ma idêntica (100% de identidade de sequência) a uma primeira se- quência resultam em uma identidade de sequência de porcentagem reduzida. Por exemplo, se as sequências idênticas forem de 9 resí- duos de aminoácido de comprimento, uma substituição na segunda sequência resulta em uma identidade de sequência de 88,9%. Se as sequências idênticas forem de 17 resíduos de aminoácido, duas subs- tituições na segunda sequência resultam em uma identidade de se-

quência de 88,2%. Se as sequências idênticas forem de 7 resíduos de aminoácido de comprimento, três substituições na segunda sequência resultam em uma identidade de sequência de 57,1%. Se a primeira e a segunda sequências de polipeptídeo forem de 9 resíduos de aminoá- cido de comprimento e compartilham 6 resíduos idênticos, a primeira e a segunda sequências de polipeptídeo compartilham mais de 66% de identidade (a primeira e a segunda sequências de polipeptídeo com- partilham 66,7% de identidade). Se a primeira e a segunda sequências de polipeptídeo forem de 17 resíduos de aminoácidos de comprimento e compartilham 16 resíduos idênticos, a primeira e a segunda sequên- cias de polipeptídeo compartilham mais de 94% de identidade (a pri- meira e a segunda sequências de polipeptídeo compartilham 94,1% de identidade). Se a primeira e a segunda sequências de polipeptídeo fo- rem de 7 resíduos de aminoácido de comprimento e compartilham 3 resíduos idênticos, a primeira e a segunda sequências de polipeptídeo compartilham mais de 42% de identidade (a primeira e a segunda se- quências de polipeptídeo compartilham 42,9% de identidade).

[0064] Alternativamente, para os propósitos de comparação de uma primeira sequência de polipeptídeo de referência com uma se- gunda sequência de polipeptídeo de comparação, o número de adi- ções, substituições e/ou supressões feitas à primeira sequência para produzir a segunda sequência pode ser determinado. Uma adição é a adição de um resíduo de aminoácido à sequência do primeiro polipep- tídeo (incluindo a adição em cada terminal do primeiro polipeptídeo). Uma substituição é a substituição de um resíduo de aminoácido na sequência do primeiro polipeptídeo por um resíduo de aminoácido dife- rente. Uma supressão é a supressão de um resíduo de aminoácido da sequência do primeiro polipeptídeo (incluindo a supressão em cada terminal do primeiro polipeptídeo).

[0065] Para os propósitos de comparação de uma primeira se-

quência de polinucleotídeo de referência com uma segunda sequência de polinucleotídeo de comparação, o número de adições, substituições e/ou supressões feitas na primeira sequência para produzir a segunda sequência pode ser determinado. Uma adição é a adição de um resí- duo de nucleotídeo na sequência do primeiro polinucleotídeo (incluindo a adição em cada terminal do primeiro polinucleotídeo). Uma substitui- ção é a substituição de um resíduo de nucleotídeo na sequência do primeiro polinucleotídeo por um resíduo de nucleotídeo diferente. Uma supressão é a supressão de um resíduo de nucleotídeo da sequência do primeiro polinucleotídeo (incluindo a supressão em cada terminal do primeiro polinucleotídeo).

[0066] As substituições adequadas nas sequências da presente invenção podem ser substituições conservativas. Uma substituição conservativa compreende a substituição de um aminoácido por outro aminoácido tendo uma propriedade química semelhante ao aminoáci- do que é substituído (ver, por exemplo, Stryer et al, Biochemistry, 5" Edition 2002, pages 44-49). De preferência, a substituição conservati- va é uma substituição selecionada do grupo que consiste em: (i) uma substituição de um aminoácido básico por outro aminoácido básico diferente; (ii) uma substituição de um aminoácido ácido por outro ami- noácido acídico diferente; (iii) uma substituição de um aminoácido aromático por outro aminoácido aromático diferente; (iv) uma substitui- ção de um aminoácido alifático não polar por outro aminoácido alifático não polar diferente; e (v) uma substituição de um aminoácido polar não carregado por outro aminoácido polar não carregado diferente. Um aminoácido básico é preferivelmente selecionado do grupo que consis- te em arginina, histidina e lisina. Um aminoácido acídico é de prefe- rência aspartato ou glutamato. Um aminoácido aromático é de prefe- rência selecionado do grupo que consiste em fenilalanina, tirosina e triptofano. Um aminoácido alifático não polar é preferivelmente seleci-

onado do grupo que consiste em glicina, alanina, valina, leucina, meti- onina e isoleucina. Um aminoácido polar não carregado é preferivel- mente selecionado do grupo que consiste em serina, treonina, cisteí- na, prolina, asparagina e glutamina. Em contraste com uma substitui- ção de aminoácido conservadora, uma substituição de aminoácido não conservadora é a troca de um aminoácido com qualquer aminoácido que não se enquadre nas substituições conservativas delineadas aci- ma (i) até (v). Vetores e Adenovírus Recombinante

[0067] As sequências de ChAd157 da invenção são úteis como agentes terapêuticos e na construção de uma variedade de sistemas de vetores, adenovírus recombinantes e células hospedeiras. Adequa- damente, o termo "vetor" refere-se a um ácido nucleico que foi subs- tancialmente alterado (por exemplo, um gene ou região funcional que foi suprimido e/ou inativado) em relação a uma sequência do tipo sel- vagem e/ou incorpora uma sequência heteróloga, isto é, nucleica ácido obtido de uma fonte diferente (também chamado de "inserção"), e re- plicação e/ou expressão da sequência de polinucleotídeo inserida, quando introduzida em uma célula (por exemplo, uma célula hospedei- ra). Por exemplo, a inserção pode ser a totalidade ou parte das se- quências de ChAd157 aqui descritas. Além disso, ou alternativamente, um vetor de ChAd157 pode ser um adenovírus ChAd157 compreen- dendo uma ou mais supressões ou inativações de genes virais, tais como E1 ou outro gene viral ou região funcional aqui descrito. Tal ChAd157, que pode ou não compreender uma sequência heteróloga, é frequentemente chamado de "cadeia principal" e pode ser utilizado como está ou como um ponto de partida para modificações adicionais do vetor.

[0068] Um vetor pode ser qualquer molécula de ácido nucleico adequada incluindo DNA exposto, um plasmídeo, um vírus, um cosmí-

deo, vetor de fago tal como o vetor lambda, um cromossomo artificial tal como um BAC (cromossomo bacteriano artificial) ou um epissoma. Alternativamente, um vetor pode ser uma unidade de transcrição e/ou expressão para transcrição ou expressão in vitro sem células, tal como um sistema compatível com T7. Os vetores podem ser utilizados isola- damente ou em combinação com outras sequências ou fragmentos adenovirais, ou em combinação com elementos de sequências não adenovirais. As sequências de ChAd157 também são úteis em vetores de liberação antissenso, vetores de terapia genética ou vetores de va- cina. Assim, são ainda fornecidos vetores de liberação de genes e cé- lulas hospedeiras que contêm as sequências de ChAd157.

[0069] O termo adenovírus "competente para replicação" refere-se a um adenovírus que pode se replicar em uma célula hospedeira na ausência de quaisquer proteínas auxiliares recombinantes compreen- didas na célula. Adequadamente, um adenovírus "competente para replicação" compreende os seguintes genes precoces essenciais in- tactos ou funcionais: E1A, E1B, E2A, E2B, E3 e E4. Os adenovírus do tipo selvagem isolados de um determinado animal serão competentes para a replicação nesse animal.

[0070] O termo adenovírus "incompetente para replicação" ou "de- ficiente para replicação" refere-se a um adenovírus que é incapaz de replicação porque foi projetado para compreender pelo menos uma supressão funcional (ou mutação de "perda de função"), isto é, uma supressão ou mutação que prejudica a função de um gene sem remo- vê-lo inteiramente, por exemplo, introdução de códons de parada artifi- ciais, supressão ou mutação de sítios ativos ou domínios de interação, mutação ou supressão de uma sequência reguladora de um gene, etc., ou uma remoção completa de um gene que codifica um produto gênico que é essencial para a replicação viral, tal como um ou mais dos genes adenovirais selecionados de E1A, E1 B, E2A, E2B, ES e E4

(tais como E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8, E3 ORF9, E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORFA4, E4 ORF3, E4 ORF2 e/ou E4 ORF1). Particularmente adequado E1 e opcionalmente E3 e/ou E4 são excluídos. Se suprimida, a região do gene suprimida anteriormente mencionada não será adequadamente considerada no alinhamento quando se determina a % de identidade em relação à outra sequência.

[0071] A presente invenção fornece vetores tais como adenovírus recombinantes que liberam uma proteína, adequadamente uma prote- ína heteróloga, às células, seja para propósitos terapêuticos ou de va- cina. Um vetor pode incluir qualquer elemento genético incluindo DNA exposto, um fago, transpóson, cosmídeo, epissoma, plasmídeo ou um vírus. Esses vetores contêm DNA de ChAd157 como aqui divulgado e um minigene. Por "minigene" (ou "cassete de expressão") entende-se a combinação de um gene heterólogo selecionado (transgene) e os outros elementos reguladores necessários para conduzir a translação, transcrição e/ou expressão do produto gênico em uma célula hospe- deira.

[0072] Tipicamente, um vetor adenoviral derivado de ChAd157 é projetado de tal modo que o minigene esteja localizado em uma molé- cula de ácido nucleico que contém outras sequências adenovirais na região nativa de um gene adenoviral selecionado. O minigene pode ser inserido em uma região de gene existente para interromper a fun- ção dessa região, se desejável. Alternativamente, o minigene pode ser inserido no sítio de um gene adenoviral parcial ou totalmente suprimi- do. Por exemplo, o minigene pode estar localizado no sítio de uma mu- tação, inserção ou supressão que torna não funcional pelo menos um gene de uma região genômica selecionada do grupo que consiste em E1A, E1 B, E2A, E2B, E3 e E4. O termo "torna não funcional" significa que uma quantidade suficiente da região do gene é removida ou de outra forma interrompida, de modo que a região do gene não seja mais capaz de produzir produtos funcionais da expressão do gene. Se de- sejável, toda a região do gene pode ser removida (e adequadamente substituída pelo minigene).

[0073] Por exemplo, para um vetor de produção útil para a gera- ção de um vírus recombinante, o vetor pode conter o minigene e a ex- tremidade 5' do genoma adenoviral ou a extremidade 3' do genoma adenoviral, ou ambas as extremidades 5' e 3' do genoma adenoviral. À extremidade 5' do genoma adenoviral contém os elementos cis 5' ne- cessários para o acondicionamento e replicação; isto é, as sequências de ITR 5' (que funcionam como origens de replicação) e os domínios intensificadores de acondicionamento 5' nativos (que contêm as se- quências necessárias para o acondicionamento de genomas Ad linea- res e elementos intensificadores para o promotor E1). A extremidade 3' do genoma adenoviral inclui os elementos cis 3' (incluindo as ITRs) necessários para o acondicionamento e o cerco por capsídeo. Ade- quadamente, um adenovírus recombinante contém elementos cis ade- novirais tanto 5' quanto 3' e o minigene (adequadamente contendo um transgene) está localizado entre as sequências adenovirais 5' e 3. Um vetor adenoviral baseado em ChAd157 também pode conter sequên- cias adenovirais adicionais.

[0074] Adequadamente, os vetores baseados em ChAd157 con- têm um ou mais elementos adenovirais derivados do genoma adenovi- ral ChAd157 da invenção. Em uma modalidade, os vetores contêm ITRs adenovirais de ChAd157 e sequências adenovirais adicionais do mesmo sorotipo adenoviral. Em outra modalidade, os vetores contêm sequências adenovirais que são derivadas de um sorotipo adenoviral diferente daquele que fornece as ITRs.

[0075] Como aqui definido, um adenovírus pseudotipado refere-se a um adenovírus no qual as proteínas do capsídeo do adenovírus são de um adenovírus diferente do adenovírus que fornece as ITRs.

[0076] Além disso, os adenovírus quiméricos ou híbridos podem ser construídos utilizando os adenovírus aqui descritos utilizando téc- nicas conhecidas daqueles de habilidade na técnica (por exemplo, US

7.291.498).

[0077] As ITRs e quaisquer outras sequências adenovirais presen- tes no vetor da presente invenção podem ser obtidas de muitas fontes. Uma variedade de cepas de adenovírus estão disponíveis da Ameri- can Type Culture Collection, Manassas, Virginia, ou disponíveis medi- ante solicitação em uma variedade de fontes comerciais e institucio- nais. Além disso, as sequências de muitas dessas cepas estão dispo- níveis a partir de uma variedade de bancos de dados, incluindo, por exemplo, PubMed e GenBank. Os vetores de adenovírus homólogos preparados de outro chimpanzé ou de adenovírus humanos são des- critos na literatura publicada (por exemplo, US 5.240.846). As sequên- cias de DNA de vários tipos de adenovírus estão disponíveis no Gen- Bank, incluindo o tipo Ad5 (número de acesso do GenBank M73370). As sequências de adenovírus podem ser obtidas a partir de qualquer sorotipo de adenovírus conhecido, tal como os serotipos 2, 3, 4, 7, 12 e 40, e ainda incluindo qualquer um dos tipos humanos atualmente identificados. Da mesma forma, os adenovírus conhecidos por infectar animais não humanos (por exemplo, símios) também podem ser em- pregados nas construções de vetor desta invenção (por exemplo, US

6.083.716). As sequências virais, vírus auxiliares (se necessário) e partículas virais recombinantes e outros componentes e sequências do vetor empregadas na construção dos vetores aqui descritos podem ser obtidos conforme descrito abaixo. Produção de Sequência, Vetor e Adenovírus

[0078] As sequências da invenção podem ser produzidas por qualquer meio adequado, incluindo produção recombinante, síntese química ou outros meios sintéticos. As técnicas de produção adequa- das são bem conhecidas daqueles de habilidade na técnica. Alternati- vamente, os peptídeos também podem ser sintetizados por métodos bem conhecidos da síntese de peptídeo em fase sólida.

[0079] Os plasmídeos adenovirais (ou outros vetores) podem ser utilizados para produzir vetores adenovirais. Em uma modalidade, os vetores adenovirais são partículas adenovirais que são incompetentes para replicação. Em uma modalidade, as partículas adenovirais se tor- nam incompetentes para replicação através de supressões nos genes E1A e/ou E1B, em particular no E1A e E1B. Alternativamente, os ade- novírus se tornam incompetentes para replicação por outro meio, opci- onalmente enquanto retêm os genes E1A e/ou E1B. De forma seme- lhante, em algumas modalidades, a redução de uma resposta imune ao vetor pode ser executada por supressões nos genes E2B e/ou DNA polimerase. Os vetores adenovirais também podem conter outras mu- tações no genoma adenoviral, por exemplo, mutações ou supressões sensíveis à temperatura em outros genes. Em outras modalidades, é desejável reter uma região E1A e/ou E1B intacta nos vetores adenovi- rais. Uma tal região E1 intacta pode estar localizada em sua localiza- ção nativa no genoma adenoviral ou colocada no sítio de uma deleção no genoma adenoviral nativo (por exemplo, na região E3).

[0080] Na construção de vetores de adenovírus para liberação de um gene a uma célula de mamífero (tal como humana), uma faixa de sequências de ácido nucleico de adenovírus modificadas pode ser empregada nos vetores. Por exemplo, todo ou uma parte do gene pre- coce E3 retardado de adenovírus pode ser eliminado da sequência de adenovírus que forma uma parte do vírus recombinante. Acredita-se que a função de E3 seja irrelevante para a função e produção da partí- cula de vírus recombinante. Os vetores de adenovírus também podem ser construídos com uma supressão de pelo menos a região ORF6 do gene E4 e, mais desejavelmente, por causa da redundância na função desta região, toda a região E4. Ainda outro vetor da invenção contém uma supressão no gene inicial retardado E2A. As supressões também podem ser feitas em qualquer um dos genes tardios L1 a L5 do geno- ma do adenovírus. Da mesma forma, as supressões nos genes inter- mediários IX e IVa2 podem ser úteis para alguns propósitos. Outras supressões podem ser efetuadas em outros genes de adenovírus es- truturais ou não estruturais. As supressões examinadas acima podem ser utilizadas individualmente, isto é, uma sequência de adenovírus para uso como aqui descrito pode conter supressões em apenas uma única região. Alternativamente, as supressões de genes inteiros ou suas partes eficazes para destruir sua atividade biológica podem ser utilizadas em qualquer combinação. Por exemplo, em um vetor exem- plar, a sequência de adenovírus pode ter supressões dos genes E1 e do gene E4, ou dos genes E1, E2A e E3, ou dos genes E1 e E3, ou dos genes E1, E2A e E4, com ou sem supressão de E3, e assim por diante. Qualquer um ou mais dos genes E podem ser adequadamente substituídos por um gene E (ou uma ou mais estruturas de leitura aberta do gene E) que se origina de uma cepa diferente de adenoví- rus. De forma particularmente adequada, os genes ChAd157 E1 e E3 são suprimidos e o gene ChAd157E4 é substituído por E4Ad5orf6. Como examinad acima, tais supressões e/ou substituições podem ser utilizadas em combinação com outras mutações, tais como mutações sensíveis à temperatura, para alcançar um resultado desejado.

[0081] Um vetor adenoviral que carece de uma ou mais sequên- cias adenovirais essenciais (por exemplo, E1A, E1B, E2A, E2B, E4 ORFS6, L1, L2, L3, L4 e L5) pode ser cultivado na presença dos produ- tos genéticos adenovirais ausentes que são necessário para a infecti- vidade viral e propagação de uma partícula adenoviral. Estas funções auxiliares podem ser fornecidas através do cultivo do vetor adenoviral na presença de uma ou mais construções auxiliares (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) ou uma célula hospedeira de acondicionamento. Complementação de Vetores Incompetentes para Replicação

[0082] Para gerar adenovírus recombinantes suprimidos em qual- quer um dos genes descritos acima, a função da região do gene su- primido, se essencial para a replicação e infectividade do vírus, deve ser fornecida ao vírus recombinante por um vírus auxiliar ou linhagem celular, isto é, uma linhagem celular de complementação ou acondici- onamento. Vírus Auxiliares

[0083] Dependendo do teor do gene de adenovírus dos vetores virais empregados para transportar o minigene, um adenovírus auxiliar ou fragmento de vírus não replicante pode ser utilizado para fornecer sequências de genes de adenovírus suficientes necessárias para pro- duzir uma partícula viral recombinante infecciosa contendo o minigene. Os vírus auxiliares úteis contêm sequências de genes de adenovírus selecionadas não presentes na construção do vetor de adenovírus e/ou não expressos pela linhagem celular de acondicionamento em que o vetor é transfectado. Em uma modalidade, o vírus auxiliar é defi- ciente para replicação e contém genes de adenovírus além, adequa- damente, de uma ou mais das sequências aqui descritas. Um tal vírus auxiliar é adequadamente utilizado em combinação com uma linhagem celular de expressão de E1 (e opcionalmente expressa E3 adicional- mente).

[0084] Um vírus auxiliar pode conter opcionalmente um gene re- pórter. Vários desses genes repórter são conhecidos na técnica, assim como aqui descritos. A presença de um gene repórter no vírus auxiliar que é diferente do transgene no vetor de adenovírus permite que o ve- tor adenoviral e o vírus auxiliar sejam monitorados independentemen- te. Este repórter é utilizado para permitir a separação entre o vírus re-

combinante resultante e o vírus auxiliar após a purificação. Linhagens Celulares de Complementação

[0085] Em muitas circunstâncias, uma linhagem celular que ex- pressa um ou mais genes ausentes que são essenciais para a replica- ção e infectividade do vírus, tal como E1 humano, pode ser utilizada para transcomplementar um vetor adenoviral de chimpanzé. Isto é par- ticularmente vantajoso porque, devido à diversidade entre as sequên- cias de adenovírus de chimpanzé da invenção e as sequências de adenovírus de ser humano encontradas em células de acondiciona- mento atualmente disponíveis, o uso das células humanas atuais con- tendo E1 evita a geração de adenovírus competentes para replicação durante o processo de replicação e produção.

[0086] Alternativamente, se desejável, podem-se utilizar as se- quências fornecidas nesta invenção para gerar uma célula de acondi- cionamento ou linhagem celular que expressa, no mínimo, o gene E1 de ChAd157 ou de outro adenovírus (tal como adenovírus humano, por exemplo, hAd5 E1, ou outro ChAd E1 ) sob o controle transcricio- nal de um promotor para expressão em uma linhagem celular precur- sora selecionada. Promotores induzíveis ou constitutivos podem ser empregados para este propósito. Exemplos de tais promotores são descritos com detalhes em outras partes desta invenção. Uma célula precursora é selecionada para a geração de uma nova linhagem celu- lar que expressa qualquer gene ChAd157 desejado. Sem limitação, tal linhagem celular precursora pode ser células HeLa [No. de Acesso ATCC CCL 2], A549 [No. de Acesso ATCC CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [por exemplo, Detroit 510, CCL 72] e WI-38 [CCL 75], entre outras. Estas linhagens celulares estão disponíveis da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgi- nia 20110-2209.

[0087] Tais linhagens celulares de expressão de E1 são úteis na geração de vetores suprimidos de adenovírus recombinante E1. Adici- onalmente, ou alternativamente, as linhagens celulares que expressam um ou mais produtos gênicos adenovirais, por exemplo, E1A, E1B, E2A, E3 e/ou E4, podem ser construídas utilizando essencialmente os mesmos procedimentos como utilizados na geração de vetores virais recombinantes. Tais linhagens celulares podem ser utilizadas para transcomplementar vetores de adenovírus suprimidos nos genes es- senciais que codificam esses produtos, ou para fornecer funções auxi- liares necessárias para o acondicionamento de um vírus dependente de auxiliar (por exemplo, vírus adeno-associado). A preparação de uma célula hospedeira envolve técnicas tais como a montagem de se- quências de DNA selecionadas.

[0088] Em outra alternativa, os produtos de genes adenovirais es- senciais são fornecidos em trans pelo vetor adenoviral e/ou vírus auxi- liar. Em um tal caso, uma célula hospedeira adequada pode ser sele- cionada a partir de qualquer organismo biológico, incluindo células procarióticas (por exemplo, bacterianas) e células eucarióticas, inclu- indo células de inseto, células de levedura e células de mamífero.

[0089] As células hospedeiras podem ser selecionadas de qual- quer espécie de mamífero, incluindo, sem limitação, células tais como AS49, WEHI, 313, 1011/2, células HEK 293 ou Per.C6 (ambas das quais expressam E1 adenoviral funcional) [Fallaux, FJ et al, (1998), Hum Gene Ther, 9:1909-1917], Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG?2 e células de fibroblastos primários, hepatócitos e mioblastos derivadas de mamíferos, incluindo seres humanos, macaco, camun- dongo, rato, coelho e hamster.

[0090] Uma linhagem celular de complementação particularmente adequada é a linhagem celular Procell92. A linhagem celular Procell92 é baseada em células HEK 293 que expressam genes E1 adenovirais, transfectados com o repressor Tet sob o controle do promotor de fosfo-

glicerato cinase-1 (PGK) humano e o gene de resistência G418 (Vitelli et al. PLOS One (2013 ) 8(e55435):1-9). Procell92.S é adaptado para cres- cimento em condições de suspensão e é útil para a produção de vetores adenovirais que expressam proteínas tóxicas (www.okairos.com/ e/ in- ners. php?m=00084, último acesso em 13 de abril de 2015). Montagem de uma Partícula Viral e Transfecção de uma Linhagem Celular

[0091] Geralmente, quando se libera o vetor compreendendo o minigene por transfecção, o vetor é liberado em uma quantidade de cerca de 5 ug a cerca de 100 ug de DNA e, de preferência, cerca de a cerca de 50 ug de DNA a cerca de 1 x 10º células a cerca de 1 x 10? células, e de preferência ao redor de 10º células. No entanto, as quantidades relativas de DNA de vetor para células hospedeiras po- dem ser ajustadas, levando em consideração tais fatores como o vetor selecionado, o método de liberação e as células hospedeiras selecio- nadas.

[0092] A introdução do vetor na célula hospedeira pode ser conse- guida por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo transfecção e infecção. Um ou mais dos genes adenovirais podem ser integrados de forma estável no genoma da célula hospedeira, expressos de forma estável como epissomas ou expressos transitoriamente. Os produtos do gene podem todos ser expressos transitoriamente, em um episso- ma ou integrados de forma estável, ou alguns dos produtos do gene podem ser expressos de forma estável enquanto outros são expressos transitoriamente.

[0093] A introdução de vetores na célula hospedeira também pode ser executada utilizando técnicas conhecidas da pessoa versada. Adequadamente, técnicas de transfecção padrão são utilizadas, por exemplo, transfecção de CaPC ou eletroporação.

[0094] A montagem das sequências de DNA selecionadas do ade-

novírus (assim como o transgene e outros elementos do vetor) em vá- rios plasmídeos intermediários e o uso dos plasmídeos e vetores para produzir uma partícula viral recombinante são todos obtidos utilizando técnicas convencionais. Tais técnicas incluem técnicas convencionais de clonagem de cDNA, uso de sequências de oligonucleotídeos so- brepostas dos genomas de adenovírus, reação em cadeia da polime- rase, e qualquer método adequado que forneça a sequência de nucle- otídeos desejada. Técnicas de transfecção e cotransfecção padrão são empregadas, por exemplo, técnicas de precipitação CaPC. Outros métodos convencionais empregados incluem recombinação homóloga dos genomas virais, plaqueamento de vírus em sobreposição de ágar, métodos de medição da geração de sinal, e semelhantes.

[0095] Por exemplo, após a construção e montagem do vetor viral contendo o minigene desejado, o vetor é transfectado in vitro na pre- sença de um vírus auxiliar na linhagem celular de acondicionamento. À recombinação homóloga ocorre entre as sequências auxiliares e de vetor, o que permite que as sequências do transgene de adenovírus no vetor sejam replicadas e acondicionadas em capsídeos de vírion, resultando nas partículas do vetor viral recombinante. Os adenovírus recombinantes resultantes são úteis na transferência de um transgene selecionado para uma célula selecionada. Em experiências in vivo com o vírus recombinante cultivado nas linhagens celulares de acondicio- namento, os vetores adenovirais recombinantes suprimidos de E1 da invenção demonstram utilidade na transferência de um transgene para um mamífero não símio, de preferência uma célula humana. Transgenes

[0096] O transgene é uma sequência de ácido nucleico, heteróloga às sequências do vetor que flanqueiam o transgene, que codifica uma proteína de interesse. A sequência de codificação de ácido nucleico está ligada de maneira operável a componentes reguladores de uma maneira que permite a transcrição, translação e/ou expressão do transgene em uma célula hospedeira.

[0097] A composição da sequência de transgene dependerá da utilização que será dada ao vetor resultante. Por exemplo, o transgene pode ser um transgene terapêutico ou um transgene imunogênico. Al- ternativamente, uma sequência de transgene pode incluir uma se- quência repórter, que após a expressão produz um sinal detectável. Essas sequências repórter incluem, sem limitação, sequências de DNA que codificam B-lactamase, B-galactosidase (LacZ), fosfatase al- calina, timidina cinase, proteína verde fluorescente (GFP), cloranfeni- col acetiltransferase (CAT), luciferase, proteínas ligadas à membrana incluindo, por exemplo, CD2, CD4, CD8, a proteína hemaglutinina da gripe e outras bem conhecidas na técnica, para as quais existem anti- corpos de alta afinidade direcionados às mesmas ou podem ser pro- duzidos por meios convencionais, e proteínas de fusão compreenden- do uma proteína ligada à membrana apropriadamente fundida a um domínio marcador de antígeno de, entre outros, hemaglutinina ou Myc. Essas sequências de codificação, quando associadas a elementos re- guladores que conduzem sua expressão, fornecem sinais detectáveis por meios convencionais, incluindo ensaios enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescência ou outros espectrográficos, ensaios de seleção de células de ativação fluorescente e ensaios imunológicos, incluindo ensaio imunoenzimático (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e imunoistoquímica.

[0098] Em uma modalidade, o transgene é uma sequência não marcadora que codifica um produto que é útil em biologia e medicina, tal como um transgene terapêutico ou um transgene imunogênico tal como proteínas, RNA, enzimas ou RNAs catalíticos. As moléculas de RNA desejáveis incluem tRNA, dsRNA, RNA ribossômico, RNAs cata- líticos e RNAs antissenso. Um exemplo de uma sequência de RNA útil é uma sequência que extingue a expressão de uma sequência de áci- do nucleico direcionada no animal tratado.

[0099] O transgene pode ser utilizado para o tratamento, por exemplo, de deficiências genéticas, como um agente terapêutico ou vacina contra o câncer, para a indução de uma resposta imune e/ou para propósitos de vacina profilática. Como aqui utilizado, a indução de uma resposta imune refere-se à capacidade de uma proteína para induzir uma célula T e/ou uma resposta imune humoral à proteína.

[00100] O termo profilaxia significa o fornecimento de um medica- mento com antecedência, isto pode ser antes da exposição a um pa- tógeno (profilaxia pré-exposição) ou antes do desenvolvimento dos sintomas da doença (profilaxia pós-exposição). Os termos tratamento e terapia são usados de modo trocável nessa invenção e significam a administração de medicamento durante a doença.

[00101] Pelo termo doença entende-se um distúrbio de estrutura ou função em um indivíduo, especialmente aquele que produz sintomas específicos ou que afeta um local específico e não é simplesmente um resultado direto de lesão física. Elementos Reguladores

[00102] Além do transgene, o vetor também inclui elementos de controle convencionais que estão de maneira operável ligados ao transgene de uma maneira que permite sua transcrição, translação e/ou expressão em uma célula transfectada com o vetor plasmídeo ou infectada com o vírus produzido pela invenção. Como aqui utilizado, sequências "ligadas de maneira operável" incluem sequências de con- trole de expressão que são contíguas com o gene de interesse e se- quências de controle de expressão que atuam em trans ou a distância para controlar o gene de interesse.

[00103] As sequências de controle de expressão incluem as se- quências apropriadas de iniciação, terminação, promotor e intensifica-

dor da transcrição; sinais de processamento de RNA eficientes, tais como sinais de recomposição e poliadenilação (poli A), incluindo beta- globina poliA de coelho; sequências que estabilizam o mMRNA cito- plasmático; sequências que aumentam a eficiência da translação (por exemplo, sequência de consenso Kozak); sequências que aumentam a estabilidade da proteína; e quando desejável, sequências que au- mentam a secreção do produto codificado. Entre outras sequências, íntrons quiméricos podem ser utilizados.

[00104] Em algumas modalidades, o Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE) (Zuffrey et al. (1999) J Virol, 73(4):2886-9) pode estar ligado de maneira operável ao transge- ne. Um WPRE exemplar é fornecido na SEQ ID NO: 26.

[00105] Um "promotor" é uma sequência de nucleotídeo que permi- te a ligação da RNA polimerase e direciona a transcrição de um gene. Tipicamente, um promotor está localizado na região de não codifica- ção 5' de um gene, próximo ao local de início da transcrição do gene. Os elementos da sequência dentro de promotores que funcionam na iniciação da transcrição são frequentemente caracterizados por se- quências de nucleotídeo de consenso. Exemplos de promotores inclu- em, mas não são limitados a estes, promotores de bactérias, levedu- ras, plantas, vírus e mamíferos (incluindo seres humanos). Um grande número de sequências de controle de expressão, incluindo promotores que são internos, nativos, constitutivos, induzíveis e/ou específicos de tecido, é conhecido na técnica e podem ser utilizados.

[00106] Exemplos de promotores constitutivos incluem, sem limita- ção, o promotor TBG, o promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (opcionalmente com o intensificador), o promotor do citome- galovírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador de CMV, ver, por exemplo, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)), o promotor CASI, o promotor SV40, o promotor de di-hidrofolato redutase, o promotor de

B-actina, o promotor da fosfoglicerol cinase (PGK) e o promotor EF1a (Invitrogen).

[00107] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor CASI (ver, por exemplo, WO2012/115980). O promotor CASI é um promotor sintético que contém uma parte do intensificador de CMV, uma parte do promotor de beta-actina de frango e uma parte do intensificador de UBC. Em algumas modalidades, o promotor CASI pode incluir uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12. Em algumas moda- lidades, o promotor compreende ou consiste em uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12.

[00108] Os promotores induzíveis permitem a regulação da expres- são gênica e podem ser regulados por compostos fornecidos exoge- namente, fatores ambientais tais como temperatura ou a presença de um estado fisiológico específico, por exemplo, fase aguda, um estado de diferenciação particular da célula ou apenas em células em replica- ção. Os promotores induzíveis e os sistemas induzíveis estão disponí- veis a partir de uma variedade de fontes comerciais, incluindo, sem limitação, Invitrogen, Clontech e Ariad. Muitos outros sistemas foram descritos e podem ser facilmente selecionados por uma pessoa de ha- bilidade na técnica. Por exemplo, os promotores induzíveis incluem o promotor da metalotionina de ovelha induzível por zinco (MT) e o pro- motor do vírus do tumor mamário de camundongo induzível por dexa- metasona (Dex) (MMTV). Outros sistemas induzíveis incluem o siste- ma de promotor da polimerase T7 (WO 98/10088); o promotor de ecdi- sona de inseto (No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), o sistema repressível de tetraciclina (Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), o sistema induzível por tetraci-

clina (Gossen et al, Science, 378:1766-1769 (1995), ver também Har- vey et al, Curr. Opin. Chem. Biol, 2:512-518 ( 1998)). Outros sistemas incluem o dímero FK506, VP16 ou p65 usando castradiol, difenol muri- slerona, o sistema induzível por RU486 (Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) e Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)) e o sistema induzível por rapamicina (Magari et al, J. Clin. Invest, 100:2865-2872 (1997)). A eficácia de alguns promotores induzíveis aumenta com o tempo. Em tais casos, pode-se aumentar a eficácia de tais sistemas através da inserção de vários repressores em tandem, por exemplo, TetR ligado a um TetR por um IRES.

[00109] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de hCMV aprimorado, tal como fornecido na SEQ ID NO: 42.

[00110] Em outra modalidade, o promotor nativo para o transgene será utilizado. O promotor nativo pode ser preferido quando se deseja que a expressão do transgene imite a expressão nativa. O promotor nativo pode ser utilizado quando a expressão do transgene deve ser regulada temporalmente ou no desenvolvimento, ou de uma maneira específica de tecido, ou em resposta a estímulos transcricionais espe- cíficos. Em uma outra modalidade, outros elementos de controle de expressão nativa, tais como elementos intensificadores, sítios de poli- adenilação ou sequências de consenso Kozak também podem ser uti- lizados para imitar a expressão nativa.

[00111] O transgene pode estar ligado de maneira operável a um promotor específico de tecido. Por exemplo, se a expressão no múscu- lo esquelético for desejada, um promotor ativo no músculo deve ser utilizado. Estes incluem os promotores de genes que codificam B- actina esquelética, cadeia leve de miosina 2A, distrofina, creatina ci- nase muscular, assim como promotores musculares sintéticos com atividades superiores aos promotores de ocorrência natural (ver Li et al, Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)). Exemplos de promotores que são específicos do tecido são conhecidos para o fígado (albumina, Mi- yatake et al, J. Virol, 71:5124-32 (1997); promotor do núcleo do vírus da hepatite B, Sandig et al, Gene Ther., 3:1002-9 (1996); alfa- fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), osteocalcina óssea (Stein et al, Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); sialoproteína óssea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654- 64 (1996)), linfócitos (CD2, Hansal et al, J. Immunol, 161:1063-8 (1998); cadeia pesada de imunoglobulina; cadeia do receptor de célu- las T), neuronal, tal como promotor de enolase específica de neurônio (NSE) (Andersen et al, Cell. Mol. Neurobiol, 13:503-15 (1993)), gene de cadeia leve de neurofilamento (Piccioli et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), e o gene vgf específico de neurônio (Piccioli et al, Neuron, 15:373-84 (1995)), entre outros.

[00112] —Opcionalmente, os vetores que transportam transgenes que codificam produtos terapeuticamente úteis ou imunogênicos também podem incluir marcadores selecionáveis ou genes repórter que podem incluir sequências que codificam a resistência à geneticina, higromici- na ou puromicina, entre outros. Esses repórteres selecionáveis ou ge- nes marcadores (de preferência localizados fora do genoma viral a se- rem acondicionados em uma partícula viral) podem ser utilizados para sinalizar a presença dos plasmídeos em células bacterianas, tais como resistência à ampicilina. Outros componentes do vetor podem incluir uma origem de replicação.

[00113] Esses vetores são gerados utilizando as técnicas e se- quências fornecidas nesta invenção, em conjunto com as técnicas co- nhecidas daqueles de habilidade na técnica. Tais técnicas incluem técnicas convencionais de clonagem de cDNA, tais como aquelas des- critas em textos, uso de sequências de oligonucleotídeo sobrepostas dos genomas de adenovírus, reação em cadeia da polimerase e qual- quer método adequado que forneça a sequência de nucleotídeo dese-

jada. Terapêutica e Profilaxia

[00114] Os vetoresbaseados em ChAd157 recombinantes são úteis para transferência de genes para um mamífero humano ou não símio in vitro, ex vivo e in vivo.

[00115] Os vetores de adenovírus recombinantes aqui descritos po- dem ser utilizados como vetores de expressão para a produção dos produtos codificados pelos transgenes heterólogos in vitro. Por exem- plo, o adenovírus incompetente para replicação recombinante conten- do um transgene pode ser transfectado para uma linhagem celular de complementação como descrito acima.

[00116] Um vetor adenoviral recombinante derivado de ChAd157 fornece um veículo de transferência de gene eficiente que pode liberar um transgene selecionado a uma célula hospedeira selecionada in vi- vo ou ex vivo, mesmo quando o organismo tiver anticorpos neutrali- zantes para um ou mais sorotipos de adenovírus. Em uma modalida- de, o vetor e as células são misturados ex vivo; as células infectadas são cultivadas utilizando metodologias convencionais; e as células transferidas são reinfundidas no paciente. Estas técnicas são particu- larmente adequadas para liberação de gene para propósitos terapêuti- cos e para imunização, incluindo a indução de imunidade protetora. Transgenes Imunogênicos

[00117] Os vetores ChAd1i57 recombinantes também podem ser administrados em composições imunogênicas. Uma composição imu- nogênica como aqui descrito é uma composição que compreende um ou mais vetores ChAd157 recombinantes capazes de induzir uma res- posta imune, por exemplo, uma resposta humoral (por exemplo, anti- corpo) e/ou mediada por células (por exemplo, uma célula T citotóxi- ca), contra uma produto transgene liberado pelo vetor após a liberação a um mamífero, adequadamente um ser humano. Um adenovírus re-

combinante pode compreender (adequadamente em qualquer uma de suas supressões de gene) um gene que codifica um imunógeno dese- jado e pode, portanto, ser utilizado em uma vacina. Os adenovírus re- combinantes podem ser utilizados como vacinas profiláticas ou tera- pêuticas contra qualquer patógeno para o qual os antígenos cruciais para a indução de uma resposta imune e capaz de limitar a propaga- ção do patógeno foram identificados e para o qual o cDNA está dispo- nível.

[00118] Pelo termo imunógeno significa um polipeptídeo que é ca- paz de induzir uma resposta imune. Adequadamente, o imunógeno é um antígeno que compreende pelo menos um epítopo de célula B ou T. A resposta imune induzida pode ser uma resposta de célula B es- pecífica do antígeno, que produz anticorpos neutralizantes. A resposta imune induzida pode ser uma resposta de célula T específica para o antígeno, que pode ser uma resposta sistêmica e/ou local. A resposta de células T específica do antígeno pode compreender uma resposta de células T CD4+, tal como uma resposta envolvendo células T CD4+ que expressam uma pluralidade de citocinas, e. IFNgama, TNFalfa e/ou IL2. Alternativamente, ou adicionalmente, a resposta de célula T específica do antígeno compreende uma resposta de célula T CD8+, tal como uma resposta envolvendo células T CD8+ que expressam uma pluralidade de citocinas, por exemplo, IFNgama, TNFalfa e/ou IL2.

[00119] O termo imunizar, portanto, significa a administração de um imunógeno (ou polinucleotídeo que codifica o imunógeno conforme apropriado para o contexto), para induzir uma resposta imune.

[00120] Talvacina ou outras composições imunogênicas podem ser formuladas em um veículo de liberação adequado. Geralmente, as do- ses para as composições imunogênicas estão na faixa definida abaixo em "Métodos de Liberação e Dosagem". Os níveis de imunidade do gene selecionado podem ser monitorados para determinar a necessi- dade, se houver, de reforçadores. Após uma avaliação dos títulos de anticorpos no soro, imunizações de reforço opcionais podem ser dese- jadas.

[00121] —Opcionalmente, uma vacina ou composição imunogênica da invenção pode ser formulada para conter outros componentes, in- cluindo, por exemplo, adjuvantes, estabilizantes, ajustadores de pH, conservantes e semelhantes. Exemplos de adjuvantes adequados são fornecidos abaixo em "Adjuvantes". Esse adjuvante pode ser adminis- trado com uma vacina de DNA de carga que codifica um antígeno para aumentar a resposta imune específica do antígeno em comparação com a resposta imune gerada após a pré-ativação com uma vacina de DNA que codifica apenas o antígeno. Alternativamente, um tal adju- vante pode ser administrado com um antígeno polipeptídico que é ad- ministrado em um regime de administração envolvendo os vetores de ChAd157 da invenção (conforme descrito abaixo em "Regimes de Ad- ministração".

[00122] Os adenovírus recombinantes são administrados em uma quantidade imunogênica, isto é, uma quantidade de adenovírus re- combinante que é eficaz em uma via de administração para transfectar as células alvo desejadas e fornecer níveis suficientes de expressão do gene selecionado para induzir uma resposta imune. Onde a imuni- dade protetora é fornecida, os adenovírus recombinantes são conside- rados composições de vacina úteis na prevenção de infecção e/ou do- ença recorrente.

[00123] Espera-se que os vetores recombinantes aqui descritos se- jam altamente eficazes na indução de células T citolíticas e anticorpos direcionados à proteína antigênica heteróloga inserida expressa pelo vetor.

[00124] Os imunógenos expressos pelos vetores inventivos que são úteis para imunizar um animal humano ou não humano contra outros patógenos incluem, por exemplo, bactérias, fungos, microorganismos parasíticos ou parasitas multicelulares que infectam vertebrados hu- manos e não humanos, ou de uma célula cancerosa ou célula tumoral. Por exemplo, os imunógenos podem ser selecionados a partir de uma variedade de famílias virais. Exemplos de famílias virais contra as quais uma resposta imune seria desejável incluem Lyssaviruses tais como vírus da raiva, vírus respiratórios tais como vírus sincicial respi- ratório (RSV) e outros paramixovírus tais como metapneumovírus hu- mano, hMPV e vírus da parainfluenza (PIV).

[00125] Os antígenos da raiva adequados que são úteis como imunógenos para imunizar um animal humano ou não humano podem ser selecionados da glicoproteína viral da raiva (G), RNA polimerase (L), proteína da matriz (M), nucleoproteína (N) e fosfoproteína (P). O termo "proteína G" ou "glicoproteína" ou "polipeptídeo de proteína G" ou "polipeptídeo de glicoproteína" refere-se a um polipeptídeo ou pro- teína tendo toda ou parte de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de glicoproteína da raiva. O termo "proteína L" ou "proteí- na de RNA polimerase" ou "polipeptídeo de proteína L" ou "polipeptí- deo de proteína de RNA polimerase" refere-se a um polipeptídeo ou proteína tendo toda ou parte de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de proteína de RNA polimerase da raiva. O termo "proteí- na M" ou "proteína de matriz" ou "polipeptídeo de proteína M" ou "poli- peptídeo de proteína de matriz" refere-se a um polipeptídeo ou proteí- na tendo toda ou parte de uma sequência de aminoácidos de um poli- peptídeo de proteína de matriz da raiva. O termo "proteína N" ou "nu- cleoproteína" ou "polipeptídeo de proteína N" ou "polipeptídeo de nu- cleoproteína" refere-se a um polipeptídeo ou proteína tendo toda ou parte de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de nucle- oproteína da raiva. O termo "proteína P" ou "fosfoproteína" ou "poli-

peptídeo de proteína P" ou "polipeptídeo de fosfoproteína" refere-se a um polipeptídeo ou proteína tendo toda ou parte de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de fosfoproteína da raiva.

[00126] Os antígenos adequados de RSV que são úteis como imunógenos para imunizar um animal humano ou não humano podem ser selecionados da: proteína de fusão (F), proteína de fixação (G), proteína da matriz (M2) e nucleoproteína (N). O termo "proteína F" ou "proteína de fusão" ou "polipeptídeo de proteína F" ou "polipeptídeo de proteína de fusão" refere-se a um polipeptídeo ou proteína tendo toda ou parte de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de proteína de fusão de RSV. Da mesma forma, o termo "proteína G" ou "polipeptídeo de proteína G" refere-se a um polipeptídeo ou proteína tendo toda ou parte de uma sequência de aminoácidos de um polipep- tídeo de proteína de fixação de RSV. O termo "proteína M" ou "proteí- na de matriz" ou "polipeptídeo de proteína M" refere-se a um polipeptí- deo ou proteína tendo toda ou parte de uma sequência de aminoáci- dos de uma proteína de matriz de RSV e pode incluir cada um ou am- bos dos produtos gênicos M2-1 (que pode ser escrito aqui como M2.1) e M2-2. Da mesma forma, o termo "proteína N" ou "proteína Nucleo- capsídeo" ou "polipeptídeo de proteína N" refere-se a um polipeptídeo ou proteína tendo toda ou parte de uma sequência de aminoácidos de uma Nucleoproteína de RSV.

[00127] Dois grupos de cepas de RSV humano foram descritos, os grupos A e B, com base principalmente nas diferenças na antigenici- dade da glicoproteína G. Numerosas cepas de RSV foram isoladas até o momento, qualquer uma das quais é adequada no contexto dos an- tígenos das combinações imunogênicas aqui divulgadas. Cepas exemplares indicadas pelo GenBank e/ou número de acesso EMBL podem ser encontradas no pedido publicado US número 2010/0203071 (WO02008114149), que é aqui incorporado por referên-

cia para o propósito de divulgar o ácido nucleico e as sequências de polipeptídeo das proteínas RSV F e G adequadas para uso na presen- te invenção. Em uma modalidade, a proteína de RSV F pode ser um ectodomínio de uma Proteína de RSV F (FATM).

[00128] Ácidos nucleicos de proteínas M e N exemplares e sequên- cias de proteínas podem ser encontrados, por exemplo, no pedido pu- blicado US número 2014/0141042 (WO2012/089833), que é aqui in- corporado para o propósito de divulgar as sequências de ácido nuclei- co e polipeptídeo de proteínas de RSV M e N adequadas para uso na presente invenção.

[00129] —Adequadamente, para uso com a presente invenção, um ácido nucleico codifica um antígeno RSV F e antígenos RSV, Me N. Mais especificamente, o ácido nucleico codifica um antígeno RSV FATM e antígenos RSV M2-1 e N, em que um sítio de autoclivagem está incluído entre o antígeno de RSV FATM e o RSV M2-1 e um li- gante flexível está incluído entre os antígenos de RSV M2-1 e N. Em uma modalidade, um ácido nucleico adequado codifica o polipeptídeo representado por SEQ ID NO: 37.

[00130] Em uma modalidade, o imunógeno pode ser de um retroví- rus, por exemplo, um lentivírus, tal como o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Em uma tal modalidade, os imunógenos podem ser derivados de HIV-1 ou HIV-2.

[00131] O genoma do HIV codifica várias proteínas diferentes, cada uma das quais pode ser imunogênica em sua totalidade ou como um fragmento quando expressa por vetores da presente invenção. As pro- teínas do envoltório incluem gp120, gp41 e o precursor Env gp160, por exemplo. As proteínas não do envoltório do HIV incluem, por exemplo, proteínas estruturais internas, tais como os produtos dos genes gag e pol e outras proteínas não estruturais, tais como Rev, Nef, Vif e Tat. Em uma modalidade, o vetor da invenção codifica um ou mais polipep-

tídeos compreendendo HIV Gag.

[00132] O gene Gag é trasladado como uma poliproteína precurso- ra que é clivada pela protease para produzir produtos que incluem a proteína da matriz (p17), o capsídeo (p24), o nucleocapsídeo (p9), p6 e dois peptídeos espaciais, p2 e p1, todos dos quais são exemplos de fragmentos de Gag.

[00133] O gene Gag dá origem à proteína precursora Gag de 55 quilodaltons (kD), também chamada de p55, que é expressa a partir do MRNA viral não dividido. Durante a translação, o N-terminal de p55 é submetido a miristoíla, acionando sua associação com o aspecto cito- plasmático das membranas celulares. A poliproteína Gag associada à membrana recruta duas cópias do RNA genômico viral junto de outras proteínas virais e celulares que acionam o florescimento da partícula viral da superfície de uma célula infectada. Após o florescimento, a p55 é clivada pela protease codificada por vírus (um produto do gene pol) durante o processo de maturação viral em quatro proteínas meno- res designadas MA (matriz [D17]), CA (capsídeo [p24]), NC (nucleoca- psídeo [p9]) e p6, todos os quais são exemplos de fragmentos de Gag. Em uma modalidade, os vetores da presente invenção compreendem um polipeptídeo Gag da SEQ ID NO: 16. Adjuvantes

[00134] Um "adjuvante", conforme utilizado nesta invenção, refere- se a uma composição que aumenta a resposta imune em um imunó- geno. Exemplos de tais adjuvantes incluem, mas não são limitados a estes, adjuvantes inorgânicos (por exemplo, sais de metal inorgânico tais como fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio), adjuvantes orgânicos (por exemplo, saponinas, tais como QS21 ou esqualeno), adjuvantes à base de óleo (por exemplo, adjuvante completo de Freund e Adjuvante incompleto de Freund), citocinas (por exemplo, IL- 16, I1L-2, IL-7, 11-12, 11-18, GM-CFS e INF-y), adjuvantes particulados

(por exemplo, complexos imunoestimuladores (ISCOMS) , lipossomas ou microesferas biodegradáveis), virossomas, adjuvantes bacterianos (por exemplo, monofosforil lipídeo A, tal como monofosforil lipídeo A 3- des-O-acilado (3D-MPL), ou peptídeos de muramila), adjuvantes sinté- ticos (por exemplo, copolímeros de bloco não iônicos, análogos de peptídeo de muramilo ou lipídeo A) sintético, adjuvantes de polinucleo- tídeo sintéticos (por exemplo, poliarginina ou polilisina) e oligonucleotí- deos imunoestimuladores contendo dinucleotídeos CpG não metilados ("CpG").

[00135] Um adjuvante adequado é monofosforil lipídeo A (MPL), em particular monofosforil-lipídeo A 3-des-O-acilado (3D-MPL). Quimica- mente, é muitas vezes fornecido como uma mistura de monofosforil lipídeo A 3-des-O-acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Pode ser purificado e preparado pelos métodos ensinados na GB 2122204B, cuja referência também divulga a preparação de difosforil lipídeo A e suas variantes 3-O-desaciladas. Outros lipopolissacarídeos purificados e sintéticos foram descritos (Pat. U.S. No. 6.005.099 e EP 0 729 473 B1; Hilgers et al., 1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141-6; e EP O 549 074 B1I).

[00136] As saponinas também são adjuvantes adequados (ver La- caille-Dubois, M and Wagner H, A review of the biological and pharma- cological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386 (1996)). Por exemplo, a saponina Quil A (derivada da casca da árvore sul-americana Quillaja Saponaria Molina), e suas frações, são descri- tas na Pat. U.S. No. 5.057.540 e Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12:1-55; e EP O 362 279 B1. As frações purificadas de Quil A também são conhecidas como imunoestimulantes, tais como QS21 e QS17; métodos de sua produção são divulgados na Pat. U.S. No. 5.057.540 e EP O 362 279 B1. Também descrito nessas referên- cias é QS7 (uma fração não hemolítica de Quil-A). O uso de QS21 é ainda descrito em Kensil et al. (1991, J. Imnmunology, 146: 431-437). As combinações de QS21 e polissorbato ou ciclodextrina também são conhecidas (WO 99/10008). Sistemas adjuvantes particulados com- preendendo frações de QuilA, tais como QS21 e QS7 são descritos nas WO 96/33739 e WO 96/11711.

[00137] Outro adjuvante é um oligonucleotídeo imunoestimulador contendo dinucleotídeos CpG não metilados ("CpG") (Krieg, Nature 374:546 (1995)). CpG é uma abreviação para motivos protéicos de di- nucleotídeo citosina-guanosina presentes no DNA. CpG é conhecido como um adjuvante quando administrado pelas vias tanto sistêmicas quanto mucosais (WO 96/02555, EP 468520, Davis et al, J. Immunol, 1998, 160:870-876; McCluskie and Davis, J. Immunol., 1998, 161: 4463-6). CpG, quando formulado em vacinas, pode ser administrado em solução livre juntamente com antígeno livre (WO 96/02555) ou co- valentemente conjugado a um antígeno (WO 98/16247), ou formulado com um veículo tal como hidróxido de alumínio (Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 1998, 95:15553-8).

[00138] Os adjuvantes tais como aqueles descritos acima, podem ser formulados juntamente com veículos, tais como lipossomas, emul- sões de óleo em água e/ou sais metálicos (incluindo sais de alumínio tais como hidróxido de alumínio). Por exemplo, 3D-MPL pode ser for- mulado com hidróxido de alumínio (EP O 689 454) ou emulsões de óleo em água (WO 95/17210); QS21 pode ser formulado com liposso- mas contendo colesterol (WO 96/33739), emulsões de óleo em água (WO 95/17210) ou alume (WO 98/15287); O CpG pode ser formulado com alume (Brazolot-Millan, supra) ou com outros veículos catiônicos.

[00139] As combinações de adjuvantes podem ser utilizadas na presente invenção, em particular uma combinação de um monofosforil lipídeo A e um derivado de saponina (ver, por exemplo, WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO

99/11241), mais particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgado na WO 94/00153, ou uma composição onde o QS21 é extinto em lipossomas contendo colesterol (DQ) como divulgado na WO 96/33739. Alternativamente, uma combinação de CpG acrescido de uma saponina, tal como QS21, é um adjuvante adequado para uso na presente invenção. Uma formulação adjuvante potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo em água é descri- ta na WO 95/17210 e é outra formulação para uso na presente inven- ção. Os adjuvantes de saponina podem ser formulados em um lipos- soma e combinados com um oligonucleotídeo imunoestimulador. As- sim, os sistemas adjuvantes adequados incluem, por exemplo, uma combinação de monofosforil lipídeo A, de preferência 3D-MPL, junta- mente com um sal de alumínio (por exemplo, conforme descrito na VWOO00/23105). Um outro adjuvante exemplar compreende QS21 e/ou MPL e/ou CpG. QS21 pode ser extinto em lipossomas contendo coles- terol como divulgado na WO 96/33739.

[00140] Outros adjuvantes adequados incluem fosfatos de alquil glucosaminida (AGP's), tais como aqueles divulgados na WO9850399 ou Pat. U.S. No. 6.303.347 (processos para a preparação de AGPs também são divulgados), ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs como divulgado na Pat. U.S. No. 6.764.840. Alguns AGPs são agonistas de TLR4 e alguns são antagonistas de TLR4. Ambos são considerados úteis como adjuvantes.

[00141] Observou-se (WO 2007/062656, publicado como US 2011/0293704 e é incorporado por referência com o propósito de di- vulgar sequências de cadeia invariante) que a fusão da cadeia invari- ante a um antígeno que é composto por um sistema de expressão uti- lizado para vacinação aumenta a resposta imunológica contra dito an- tígeno, se for administrado com um adenovírus. Consequentemente, em uma modalidade da invenção, o transgene imunogênico pode ser coexpresso com a cadeia invariante em um vetor viral ChAd157 re- combinante.

[00142] Em outra modalidade, a invenção fornece o uso do capsí- deo de ChAd157 (opcionalmente uma partícula viral intacta ou recom- binante ou um capsídeo vazio é utilizado) para induzir uma resposta de efeito imunomodulador ou para aumentar ou auxiliar uma resposta de células T citotóxicas a outro agente ativo mediante a liberação de um capsídeo de ChAd157 a um indivíduo. O capsídeo de ChAd157 pode ser liberado isoladamente ou em um regime de combinação com um agente ativo para aumentar a resposta imune ao mesmo. Vantajo- samente, o efeito desejado pode ser alcançado sem infectar o hospe- deiro com um adenovírus. Regimes de Administração

[00143] Comumente, os vetores adenovirais recombinantes de ChAd157 serão utilizados para liberação de moléculas terapêuticas ou imunogênicas (tais como proteínas). Será facilmente compreendido para ambas as aplicações, que os vetores adenovirais recombinantes da invenção são particularmente bem adequados para uso em regimes envolvendo a liberação repetida de vetores adenovirais recombinan- tes. Esses regimes tipicamente envolvem a liberação de uma série de vetores virais nos quais os capsídeos virais são alternados. Os capsí- deos virais podem ser alterados para cada administração subsequen- te, ou após um número pré-selecionado de administrações de um cap- sídeo de sorotipo particular (por exemplo, um, dois, três, quatro ou mais). Assim, um regime pode envolver a liberação de um adenovírus recombinante com um primeiro capsídeo, liberação com um adenoví- rus recombinante com um segundo capsídeo e liberação com um ade- novírus recombinante com um terceiro capsídeo. Uma variedade de outros regimes que utilizam os capsídeos de adenovírus da invenção isoladamente, em combinação entre si, ou em combinação com outros adenovírus (que são de preferência imunologicamente não reativos cruzados) será evidente para aqueles de habilidade na técnica. Opcio- nalmente, um tal regime pode envolver a administração de adenovírus recombinante com capsídeos de outros adenovírus primatas não hu- manos, adenovírus humanos ou sequências artificiais, tais como são aqui descritos.

[00144] Os vetores adenovirais da invenção são particularmente bem adequados para regimes terapêuticos nos quais múltiplas libera- ções mediadas por adenovirais de transgenes são desejadas, por exemplo, em regimes envolvendo a reliberação do mesmo transgene ou em regimes de combinação envolvendo a liberação de outros transgenes. Tais regimes podem envolver a administração de um vetor adenoviral ChAd157, seguido pela readministração com um vetor do mesmo sorotipo de adenovírus. Regimes particularmente desejáveis envolvem a administração de um vetor adenoviral ChAd157, no qual a fonte das sequências de capsídeo adenoviral do vetor liberado na pri- meira administração difere da fonte das sequências de capsídeo ade- noviral do vetor viral utilizado em uma ou mais das administrações subsequentes. Por exemplo, um regime terapêutico envolve a adminis- tração de um vetor de ChAd157 e a administração repetida com um ou mais vetores adenovirais do mesmo ou de sorotipos diferentes.

[00145] Em outro exemplo, um regime terapêutico envolve a admi- nistração de um vetor adenoviral seguido pela administração repetida com um vetor de ChAd157 que possui um capsídeo que difere da fon- te do capsídeo no primeiro vetor adenoviral liberado e, opcionalmente, administração adicional com outro vetor que é o mesmo ou, de prefe- rência, difere da fonte do capsídeo adenoviral do vetor nas etapas de administração anteriores. Esses regimes não estão limitados à libera- ção de vetores adenovirais construídos utilizando as sequências de ChAd157. Em vez disso, esses regimes podem facilmente utilizar ou-

tras sequências adenovirais, incluindo, sem limitação, outras sequên- cias adenovirais incluindo outras sequências adenovirais de primatas não humanos ou sequências adenovirais humanas, em combinação com os vetores de ChAd157.

[00146] Em um outro exemplo, um regime terapêutico pode envol- ver a liberação simultânea (tal como a coadministração) ou sequencial (tal como um reforço inicial) de (i) um ou mais vetores adenovirais ChAd157 e (ii) um componente adicional tal como vetores não adeno- virais, vetores não virais e/ou uma variedade de outros compostos ou moléculas terapeuticamente úteis tais como proteínas antigênicas, op- cionalmente administradas de forma simultânea com adjuvante. Exemplos de coadministração incluem a coadministração homolateral e a coadministração contralateral (descrito abaixo em "Métodos de Li- beração e Dosagem").

[00147] Os vetores não adenovirais adequados para uso na libera- ção simultânea ou particularmente sequencial (tal como o reforço inici- al) com um ou mais vetores adenovirais ChAd157 incluem um ou mais vetores poxvirais. Adequadamente, o vetor poxviral pertence à subfa- mília chordopoxvirinae, mais adequadamente a um gênero na referida subfamília selecionada do grupo que consiste em orthopox, parapox, yatapox, avipox (adequadamente canarypox (ALVAC) ou fowlpox (FPV)) e molluscipox. Ainda mais adequadamente, o vetor poxviral pertence ao orthopox e é selecionado do grupo que consiste no vírus vacínia, NYVAC (derivado da cepa Copenhagen de vacínia), Modified Vaccinia Ankara (MVA), cowpoxvirus e monkeypox virus. Mais apro- priadamente, o vetor poxviral é MVA.

[00148] A administração "simultânea" refere-se adequadamente à mesma resposta imune em andamento. De preferência, ambos os componentes são administrados ao mesmo tempo (tal como a admi- nistração simultânea tanto de DNA quanto de proteína), no entanto,

um componente pode ser administrado dentro de alguns minutos (por exemplo, na mesma consulta médica ou visita do médico), dentro de algumas horas. Essa administração também é referida como coadmi- nistração. Em algumas modalidades, a coadministração pode se referir à administração de um vetor adenoviral, um adjuvante e um compo- nente de proteína. Em outras modalidades, a coadministração se refe- re à administração de um vetor adenoviral e outro vetor viral, por exemplo, um segundo vetor adenoviral ou um poxvirus tal como MVA. Em outras modalidades, a coadministração se refere à administração de um vetor adenoviral e um componente de proteína, que é opcio- nalmente adjuvante.

[00149] Um regime de reforço inicial pode ser utilizado. O reforço inicial refere-se a duas respostas imunes separadas: (i) uma pré- ativação inicial do sistema imunológico seguido por (ii) uma ativação secundária ou reforço do sistema imunológico muitas semanas ou me- ses após a resposta imune primária ter sido estabelecida.

[00150] Um tal regime pode envolver a administração de um vetor de ChAd157 recombinante para pré-ativar o sistema imunológico para uma segunda administração de reforço com um antígeno tradicional, tal como uma proteína (opcionalmente coadministrada com adjuvante), ou um vírus recombinante que transporta as sequências que codificam um tal antígeno (por exemplo, WO 00/11140). Alternativamente, um regime de imunização pode envolver a administração de um vetor de ChAd157 recombinante para reforçar a resposta imune em um vetor (viral ou baseado em DNA) que codifica um antígeno. Em outra alter- nativa, um regime de imunização envolve a administração de uma pro- teína seguida de reforço com um vetor de ChAd157 recombinante que codifica o antígeno. Em um exemplo, o regime de reforço inicial pode fornecer uma resposta imune protetora ao vírus, bactéria ou outro or- ganismo do qual o antígeno é derivado. Em outra modalidade, o regi-

me de reforço inicial fornece um efeito terapêutico que pode ser medi- do utilizando ensaios convencionais para detecção da presença da condição para a qual a terapia está sendo administrada.

[00151] De preferência, uma composição de reforço é administrada cerca de 2 a cerca de 27 semanas após a administração da composi- ção de iniciação ao indivíduo. A administração da composição de re- forço é executada utilizando uma quantidade eficaz de uma composi- ção de reforço contendo ou capaz de liberar o mesmo antígeno ou um antígeno diferente conforme administrado pela vacina de iniciação. À composição de reforço pode ser composta por um vetor viral recombi- nante derivado da mesma fonte viral ou de outra fonte. Alternativamen- te, a composição de reforço pode ser uma composição contendo o mesmo antígeno como codificado na vacina de iniciação, mas na for- ma de uma proteína, cuja composição induz uma resposta imune no hospedeiro. Os requisitos primários da composição de reforço são que o antígeno da composição seja o mesmo antígeno, ou um antígeno de reatividade cruzada, como aquele codificado pela composição de pré- ativação.

[00152] Uma baixa reatividade cruzada entre anticorpos neutrali- zantes para ChAd157 e certos outros vetores adenovirais, tais como ChAd155, é benéfica em contextos onde são necessárias múltiplas administrações de vetores. Múltiplas administrações podem ser para o propósito de liberação separada de diferentes transgenes (por exem- plo, codificação de imunógenos associados a diferentes indicações médicas) ou liberação dos mesmos transgenes ou semelhantes (por exemplo, em um regime de reforço inicial para aumentar a resposta imune para uma indicação médica particular).

[00153] Consequentemente é fornecido um vetor adenoviral recom- binante da invenção que codifica um transgene, para administração a um indivíduo que foi anteriormente exposto a um vetor adenoviral re-

combinante que não compreende uma fibra de ChAd157, ou seu deri- vado funcional, como aqui descrito (por exemplo, não compreende uma fibra de ChAd157, hexon ou penton como aqui descrito, tal como um vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra de ChAd155, hexon e/ou penton, especialmente um vetor adenoviral re- combinante compreendendo uma fibra de ChAd155, hexon e penton). Em particular, é fornecido um vetor adenoviral recombinante da inven- ção que codifica um transgene para administração a um indivíduo que foi anteriormente administrado com um vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fibra de ChAd157, ou seu derivado funcio- nal, como aqui descrito (por exemplo, não compreende uma fibra de ChAd157, hexon ou penton como aqui descrito, tal como um vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra de ChAd155, he- xon e/ou penton, especialmente um vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra de ChAd155, hexon e penton). Adequada- mente, o vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fi- bra de ChAd157 é aquele que possui baixa reatividade cruzada com ChAd157. Em uma modalidade, o vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fibra de ChAd157 codifica um transgene direci- onado a uma indicação médica diferente ou indicações como o vetor adenoviral recombinante do transgene da invenção. Em outra modali- dade, o vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fibra de ChAd157 codifica um transgene direcionado à mesma indicação ou indicações médicas como o vetor adenoviral recombinante do transge- ne da invenção (por exemplo, tal como o mesmo transgene).

[00154] Também é fornecido um vetor adenoviral recombinante da invenção que codifica um transgene para administração a um indivíduo que pode (isto é, pretende-se ou espera-se que seja) subsequente- mente exposto a um vetor adenoviral recombinante que não compre- ende uma fibra de ChAd157, ou seu derivado funcional, como aqui descrito (por exemplo, não compreende uma fibra de ChAd157, hexon ou penton como aqui descrito, tal como um vetor adenoviral recombi- nante compreendendo uma fibra de ChAd155, hexon e/ou penton, es- pecialmente um vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra de ChAd155, hexon e penton). Em particular, é fornecido um ve- tor adenoviral recombinante da invenção que codifica um transgene para administração a um indivíduo que pode ser subsequentemente administrado com um vetor adenoviral recombinante que não compre- ende uma fibra de ChAd157, ou seu derivado funcional, conforme des- crito nesta invenção (por exemplo, não compreende uma fibra de ChAd157, hexon ou penton como aqui descrito, tal como um vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra de ChAd155, he- xon e/ou penton, especialmente um vetor adenoviral recombinante que compreende uma fibra de ChAd155, hexon e penton). Adequadamen- te, o vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fibra de ChAd157 é aquele que possui baixa reatividade cruzada com ChAd157. Em uma modalidade, o vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fibra de ChAd157 codifica um transgene direci- onado a uma indicação ou indicações médicas diferentes como o vetor adenoviral recombinante do transgene da invenção. Em outra modali- dade, o vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fibra de ChAd157 codifica um transgene direcionado na mesma indicação ou indicações médicas que o vetor adenoviral recombinante do trans- gene da invenção (por exemplo, tal como o mesmo transgene).

[00155] A presente invenção, portanto, fornece um método para ex- trair uma resposta imune em um indivíduo, dito método compreenden- do: (a) administrar ao indivíduo um vetor adenoviral recombinante da in- venção que codifica um primeiro transgene; e (b) administrar ao indivíduo um vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fibra de ChAd157, ou seu derivado funcional como aqui descrito, o vetor que codifica um segundo transgene; em que as etapas (a) e (b) podem ser empreendidas em qualquer or- dem e o primeiro e o segundo transgenes podem ser iguais ou diferen- tes.

[00156] O primeiro e o segundo transgenes tipicamente irão codifi- car os imunógenos que são úteis para imunizar um animal humano ou não humano contra um patógeno, tal como bactérias, fungos, micror- ganismos parasitas ou parasitas multicelulares que infectam vertebra- dos humanos e não humanos, ou contra uma célula cancerosa ou cé- lula tumoral. O primeiro e o segundo transgenes podem codificar o mesmo ou diferentes imunógenos. Quando codificam diferentes imunógenos, estes podem ser direcionados ao mesmo ou a diferentes patógenos ou células cancerosas ou tumorais.

[00157] —Consequentemente, também é fornecido um método para a profilaxia ou tratamento de um indivíduo, dito método compreendendo: (a) administrar ao indivíduo um vetor adenoviral recombinante da in- venção que codifica um primeiro transgene que codifica um imunóge- no que é útil para imunizar um animal humano ou não humano contra um patógeno, tal como bactérias, fungos, microrganismos parasitas ou parasitas multicelulares que infectam vertebrados humanos e não hu- manos, ou contra uma célula cancerosa ou célula tumoral; e (b) administrar ao indivíduo um vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fibra de ChAd157, ou seu derivado funcional como aqui descrito, o vetor que codifica um segundo transgene que codifica um imunógeno que é útil para imunizar um animal humano ou não humano contra um patógeno diferente, tal como bactérias, fungos, mi- croorganismos parasitas ou parasitas multicelulares que infectam ver- tebrados humanos e não humanos, ou contra uma célula cancerosa ou célula tumoral;

em que as etapas (a) e (b) podem ser empreendidas em qualquer or- dem.

[00158] O vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fibra de ChAd157, ou seu derivado funcional como aqui descrito, ade- quadamente não compreende uma fibra de ChAd157, hexon de ChAd157 ou fibra de ChAd157, tal como não compreende uma fibra de ChAd157, hexon de ChAd157 ou fibra de ChAd157 ou seus derivados funcionais tendo pelo menos 98% de identidade com os mesmos.

[00159] O vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fibra de ChAd157, ou seu derivado funcional como aqui descrito, pode ser um vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra de ChAd155, hexon e/ou penton, especialmente um vetor adenoviral re- combinante compreendendo uma fibra de ChAd155, hexon e penton.

[00160] Como mencionado, um vetor adenoviral recombinante da invenção pode ser utilizado para liberação de moléculas terapêuticas ou imunogênicas em conjunto com um vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra de ChAd155, hexon e/ou penton. O vetor adenoviral recombinante que compreende uma fibra de ChAd155, he- xon e/ou penton compreenderá uma fibra, penton e/ou hexon de acor- do com as SEQ ID NOs: 7, 9 e 11, em particular uma fibra, penton e hexon de acordo com as SEQ ID NOs : 7, 96 11.

[00161] Pelo termo reatividade cruzada baixa entende-se que a imunização com um primeiro vetor não produz uma resposta de anti- corpo neutralizante notável a um segundo vetor, isto é, não impactan- do significativamente a potência imunológica do segundo vetor. As respostas de anticorpos neutralizantes podem ser determinadas com métodos análogos ao Exemplo 7 nessa invenção. Desejavelmente, a imunização com um primeiro vetor duas vezes provoca um título de neutralização que é em média menor do que 50% do nível que surge da imunização com o segundo vetor, tal como menor do que 75%,

adequadamente menor do que 90%.

[00162] Pelo termo "indivíduo" entende-se qualquer animal, ade- quadamente um mamífero e, em particular, um ser humano. Métodos de Liberação e Dosagem

[00163] O vetor pode ser preparado para administração sendo colo- cado em suspensão ou dissolvido em um veículo farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável, tal como solução salina isotônica; solu- ção de sais isotônicos ou outras formulações que serão evidentes para aqueles versados na técnica. O veículo apropriado será evidente para aqueles versados na técnica e dependerá em grande parte da via de administração. As composições aqui descritas podem ser administra- das a um mamífero em uma formulação de liberação prolongada utili- zando um polímero biocompatível biodegradável, ou através da libera- ção no local utilizando micelas, géis e lipossomas.

[00164] Em algumas modalidades, o adenovírus recombinante da invenção é administrado a um indivíduo através de injeção intramuscu- lar, administração intravaginal, injeção intravenosa, injeção intraperito- neal, injeção subcutânea, administração epicutânea, administração intradérmica, administração nasal, administração retal ou administra- ção oral. A administração sublingual também pode ser de interesse.

[00165] Seo regime terapêutico envolve a coadministração de um ou mais vetores adenovirais ChAd157 e um outro componente, cada um formulado em composições diferentes, eles são favoravelmente administrados colocalmente no ou próximo do mesmo local. Por exemplo, os componentes podem ser administrados (por exemplo, através de uma via de administração selecionada de intramuscular, transdérmica, intradérmica, subcutânea) no mesmo lado ou extremi- dade (administração "colateral") ou em lados ou extremidades opostas ("administração contralateral”).

[00166] As dosagens do vetor viral dependerão principalmente de fatores como a condição a ser tratada, a idade, o peso e a saúde do paciente e, portanto, podem variar entre os pacientes. Por exemplo, uma dosagem humana ou veterinária adulta terapeuticamente eficaz do vetor viral geralmente contém 1 x 10º a 1 x 105 partículas virais, tal como de 1 x 10º a 1 x 10º? (por exemplo, 1 x 108º, 2,5 x 108, 5x 108, 1 x 10º, 1,5 x 10º, 2,5 x 10%, 5 x 10º, 1 x 107º, 1,5 x 107º, 2,5 x 107º, 5 x 10%, 1 x 107, 1,5 x 1011, 2,5 x 107, 5 x 10), 1 x 10? partículas). Al- ternativamente, um vetor viral pode ser administrado em uma dose que é tipicamente de 1 x 10º a 1 x 10ºº unidades formadoras de placa (PFU), tal como 1 x 10º PFU, 2,5 x 105 PFU, 5 x 105 PFU, 1 x 106º PFU, 2,5 x 106 PFU, 5 x 106 PFU, 1 x 107 PFU, 2,5 x 107 PFU, 5 x 107 PFU, 1x 108 PFU, 2,5 x 108º PFU, 5 x 10º PFU, 1 x 10º PFU, 2,5 x 10º PFU, x 10º PFU ou 1 x 107º PFU. As dosagens irão variar dependendo do tamanho do animal e da via de administração. Por exemplo, uma do- sagem humana ou veterinária adequada (para cerca de um animal de 80 kg) para injeção intramuscular está na faixa de cerca de 1 x 10º a cerca de 5 x 10º? partículas por ml, para um único local. Opcionalmen- te, vários locais de administração podem ser utilizados. Em outro exemplo, uma dosagem humana ou veterinária adequada pode estar na faixa de cerca de 1 x 10" a cerca de 1 x 10º partículas para uma formulação oral.

[00167] O vetor viral pode ser quantificado por Análise Quantitativa de PCR (Q-PCR), por exemplo, com iniciadores e sonda projetada na região do promotor de CMV utilizando como curva padrão a diluição em série do DNA de plasmídeo contendo o genoma do vetor com cas- sete de expressão incluindo o promotor de HCMV. O número de có- pias na amostra de teste é determinado pelo método de análise de |i- nha paralela. Métodos alternativos para quantificação de partículas de vetor podem ser a HPLC analítica ou o método espectrofotométrico baseado em Az6o NM.

[00168] Uma quantidade imunologicamente eficaz de um ácido nu- cleico pode estar adequadamente entre 1 ng e 100 mg. Por exemplo, uma quantidade adequada pode ser de 1 ug a 100 mg. Uma quantida- de apropriada do ácido nucleico particular (por exemplo, vetor) pode ser facilmente determinada por aqueles versados na técnica. Quanti- dades eficazes exemplares de um componente de ácido nucleico po- dem estar entre 1 ng e 100 ug, tal como entre 1 ng e 1 ug (por exem- plo, 100 ng a 1 ug), ou entre 1 ug e 100 ug, tal como 10 ng, 50 ng, 100 ng, 150 ng, 200 ng, 250 ng, 500 ng, 750 ng ou 1 ug. Quantidades efi- cazes de um ácido nucleico também podem incluir de 1 ug a 500 ug, tal como entre 1 ug e 200 ug, tal como entre 10 e 100 ug, por exemplo 1 ug, 2 ug, 5 ug, 10 ug, 20 ug, 50 ug, 75 ug, 100 ug, 150 ug ou 200 ug. Alternativamente, uma quantidade eficaz exemplar de um ácido nucleico pode estar entre 100 ug e 1 mg, tal como de 100 ug a 500 ug, por exemplo, 100 ug, 150 ug, 200 ug, 250 ug, 300 ug, 400 ug, 500 ug, 600 ug, 700 ug, 800 ug, 900 ug ou 1 mg.

[00169] Geralmente, uma dose humana terá um volume entre 0,1 ml e 2 ml. Assim, a composição aqui descrita pode ser formulada em um volume de, por exemplo, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 1,5 ou 2,0 ml de dose humana por indivíduo ou componentes imunogênicos combina- dos.

[00170] Uma pessoa versada na técnica pode ajustar essas doses, dependendo da via de administração e da aplicação terapêutica ou de vacina para a qual o vetor recombinante é empregado. Os níveis de expressão do transgene, ou para um adjuvante, o nível de anticorpo circulante, podem ser monitorados para determinar a frequência de administração da dosagem.

[00171] Seuma ou mais etapas de iniciação e/ou reforço forem uti- lizadas, esta etapa pode incluir uma dose única que é administrada de hora em hora, diariamente, semanalmente ou mensalmente ou anual-

mente. Como um exemplo, os mamíferos podem receber uma ou duas doses contendo entre cerca de 10 ug a cerca de 50 ug de plasmídeo no veículo. A quantidade ou local de liberação é desejavelmente sele- cionado com base na identidade e condição do mamífero.

[00172] Os níveis terapêuticos ou o nível de resposta imune contra a proteína codificada pelo transgene selecionado podem ser monitora- dos para determinar a necessidade, se houver, de reforços. Após uma avaliação da resposta de células T CD8+, ou opcionalmente, títulos de anticorpos, no soro, imunizações de reforço opcionais podem ser de- sejadas. Opcionalmente, os vetores de ChAd157 recombinantes po- dem ser liberados em uma única administração ou em vários regimes de combinação, por exemplo, em combinação com um regime ou cur- so de tratamento envolvendo outros ingredientes ativos ou em um re- gime de reforço inicial.

[00173] Apresente invenção será agora descrita adicionalmente por meio dos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS Exemplo 1: Isolamento de ChAd157 e Construção de Vetor

[00174] 29 diferentes adenovírus de chimpanzés do tipo selvagem foram isolados de chimpanzés jovens saudáveis alojados em diferen- tes instalações européias utilizando procedimentos padrão conforme descrito em Colloca et al. Sci Trans! Med. 2012 Jan 4;4(1 15):115ra2 e na WO2010/086189, que são aqui incorporados por referência com o propósito de descrever o isolamento adenoviral e técnicas de caracte- rização.

[00175] Os 29 vírus do tipo selvagem foram subsequentemente agrupados; o genoma viral do “pool” foi clonado pela recombinação homóloga em células BJ5183 de E. coli utilizando um vetor de trans- porte BAC, para criar uma minibiblioteca de vetores que transportam a supressão da região E1. A minibiblioteca de vetores DE1 foi transfec-

tada na linhagem celular Procell 92; os vetores resgatados foram pas- sados em série por 16 passagens de infecção. Na passagem 16, o DNA viral foi preparado a partir do vetor amplificado e clonado pela recombinação homóloga em células de BJ5183 de E. coli utilizando um vetor de transporte de plasmídeo. A espécie de vetor prevalente foi identificada como vetor ChAd157AE1 e subsequentemente modificada para incluir as seguintes modificações adicionais da cadeia principal do vetor: a) supressão da região E4 (de pb 34413 a pb 37127) do vírus AE1; b) inserção do E4orf6 derivado de Ad5 humano.

1.1: geração da minibiblioteca de AE1

[00176] O “pool” de 29 vírus do tipo selvagem foi utilizado para ob- ter um genoma viral agrupado. O genoma viral agrupado foi clonado em um vetor BAC através da recombinação homóloga na cepa de E. coli BJS183 cotransformada com DNA viral agrupado e Vetor de Transporte BAC do Subgrupo C (*%1365) (SEQ ID NO: 14). Conforme mostrado no esquema da Figura 2, o Vetor de Transporte do Subgrupo C é um vetor BAC dedicado à clonagem de ChAd pertencente à espé- cie C e, portanto, contém o gene plX e fragmentos de DNA derivados das extremidades direita e esquerda (incluindo as ITRs direita e es- querda) de vírus da espécie C ChAd.

[00177] O Vetor de Transporte da Espécie C BAC também contém um cassete RpsL-Kana inserido entre a extremidade esquerda e o ge- ne plX. Além disso, uma cassete de seleção Amp-LacZ-SacB, flan- queada por sítios de restrição IScel, está presente entre o gene plX e a extremidade direita do genoma viral. Em particular, o Vetor de Transporte BAC compreende as seguintes características: Left ITR: bp 27 a 139, cassete hoMV(tetO) RpsL-Kana: bp 493 a 3396, gene plX: bp 3508 a 3972, sítios de restrição IScel: bp 3990 e 7481, cassete de seleção Amp-LacZ-SacB: bp 4000 a 7471, ITR direita: bp 7805 a 7917.

hoMV(tetO) é fornecido na SEQ ID NO: 37.

[00178] As células BJ5183 foram cotransformadas por eletropora- ção com o “pool” de DNAs virais purificados e com o Vetor de Trans- porte BAC do Subgrupo C digerido com a enzima de restrição I|Scel e, em seguida, purificado do gel. A recombinação homóloga que ocorre entre as sequências do gene plX e de ITR direita (presentes nas ex- tremidades do DNA linearizado do Vetor de Transporte BAC da Espé- cie C) e as sequências homólogas presentes no DNA viral agrupado levam à inserção do DNA genômico viral diferente no vetor de trans- porte BAC. Ao mesmo tempo, as regiões E1 virais foram suprimidas e substituídas pelo cassete RpsL-Kana, gerando BAC/MinibibliotecaAE1/ TetO hoMV RpsL-Kana.

1.2: Amplificação da minibiblioteca AE1 na linhagem celular Pro- cell 92 e clonagem do vetor ChAd157AE1.

[00179] A minibiblioteca AE1 foi digerida com Pmel e utilizada para transfectar a linhagem celular de acondicionamento Procell 92, a fim de resgatar a biblioteca de diferentes vírus em massa. 10 dias após a transfecção, as células foram colhidas e o lisado celular foi submetido a três ciclos de congelamento (-70 ºC) e descongelamento (+37 ºC), clarificado por centrifugação em 2000 rpm e utilizado para infectar as células novas. 16 passagens em série de amplificação de vírus foram executadas, a fim de selecionar as espécies virais para eficiência de propagação em células Procell92. Os vírus na passagem 16 foram pu- rificados por duas centrifugações em gradiente de CsCI e o DNA viral foi extraído e clonado por recombinação homóloga nas células de E. coli BJ5183 utilizando um vetor de transporte plasmídeo. Em detalhes, as células BJ5183 foram cotransformadas com DNA viral purificado e Vetor de Transporte Plasmídeo do Subgrupo C (SEQ ID NO: 38). Co- mo mostrado no diagrama da Figura 3, o Vetor de Transporte Plasmí- deo do Subgrupo C é um vetor de plasmídeo dedicado à clonagem de

ChAd pertencente à espécie C e, portanto, contém os fragmentos de DNA derivados das extremidades direita e esquerda (incluindo ITRs direita e esquerda) dos vírus ChAd da espécie C.

[00180] “Recombinação homóloga entre as sequências de DNA de ITR direita e esquerda presentes nas extremidades do Vetor de Trans- porte Plasmídeo do Subgrupo C linearizado (digerido com PsbAl/ Ndei/Xbal) e DNAs genômicos virais permitiram sua inserção no vetor de plasmídeo. 30 clones diferentes foram amplificados e analisados por análise de restrição e 9 espécies diferentes foram identificadas. 19/30 clones apresentaram os mesmos padrões de restrição e repre- sentaram as espécies predominantes; um destes clones foi seleciona- do e identificado como pChAd157AE1 TetO hoMV RpsL-Kanat1551 (SEQ ID NO: 15).

1.3: Construção de ChAd157 AE1/TetO hocMV GAGH1557

[00181] O cassete GAG (sequência de polinucleotídeo GAG SEQ ID NO: 16) foi clonado em um vetor aceitante pré-adeno linearizado por meio da recombinação homóloga em E. coli mediante a exploração da homologia existente entre o promotor de HCMV e as sequências BGH poliA (SEQ ID NO: 39).

[00182] O plasmídeo pARS CV32TetohCMV GAG foi clivado com Spel e Sphl para extirpar o fragmento de 2,44 Kb contendo o promotor de HCMV com a sequência tetO, HIV-GAG e BGH poliA.

[00183] O fragmento HIV-GAG 2,44Kb foi clonado através da re- combinação homóloga no vetor aceitante pChAd157 AE1 /TetO hoMV RpsL-Kana (f1551) (Snabl digerido) carregando o cassete de seleção RpsL-Kana sob o controle de HCMV e BGHpA. A construção resultan- te foi o vetor pChAd157 AEI/TetO hoMV GAG+H1557 (SEQ ID NO: 17).

[00184] A estrutura do plasmídeo que transporta o ChAd157 GAG é relatada na Figura 4.

1.4: Construção de ChAd157 AE1IE4 Ad5E4orf6/TetO hcMV RpsL- Kanatt1594.

[00185] O vetor ChAd1i570E1 foi subsequentemente modificado para transportar as seguintes modificações na cadeia principal: a) supressão da região E4 (de pb 34413 a pb 37127) do vírus AE1; b) inserção de E4orf6 derivado de Ad5 humano.

[00186] Uma supressão da região E4 que abrange a partir do nu- cleotídeo 34413 a 37127 (coordenadas da sequência do vetor AE1) foi introduzida na cadeia principal do vetor mediante a substituição da re- gião E4 nativa pela sequência de codificação Ad5 E4orf6 utilizando uma estratégia que envolve várias etapas de clonagem e recombina- ção homóloga em E. coli. A região de codificação E4 foi completamen- te suprimida enquanto que o promotor nativo E4 e o sinal de poliadeni- lação foram conservados. Para este fim, um vetor de transporte foi construído para permitir a inserção de Ad5orf6 através da substituição da região E4 nativa de ChAd157 pela recombinação homóloga em BJ5183 de E. coli conforme detalhado abaixo. - Construção de pARS EspécieC Ad5E4orf6-1:

[00187] O fragmento de DNA contendo Ad5orf6 foi obtido por POR utilizando DNA de Ad5 como modelo, com os oligonucleotídeos: 5"- ATACGGACTAGTGGAGAAGTACTCGCCTACATG-3' (SEQ ID NO: 18) e S-ATACGGAAGATCTAAGACTTCAGGAAATATGACTAC-3' (SEQ ID NO: 19). O fragmento de PCR foi digerido com Bglll e Spel e clonado no vetor de transporte pARS SubGrupoC RLD-EGFP digerido com Baqalll e Spel, gerando o plasmídeo pARS Espécie C Ad5orf6-1. - Construção de pARS EspécieC Ad5E4orf6-2:

[00188] Um fragmento de DNA de 144 pb contendo Fibra-E4 poliA (de pb 34269 a pb 34412 do vetor ChAd157AE1) foi amplificado por PCR utilizando como modelo o plasmídeo pChAd157 AE1 /TetO hoMV RpsL-

Kana (tH1551) com os seguintes oligonucleotídeos: 5-ATTCAGTGTA CAGGCGCGCCAAAGCATGACACTGATGTTCATTTC-3' (SEQ ID NO: 20) e S-ACTAGGACTAGTTATAAGCTAGAATGGGGCTTTGC-3' (SEQ ID NO: 21). O fragmento de PCR foi digerido com BsrGI e Spel e clo- nado em pARS SubGrupoC Ad5orf6-1 digerido com BsrGl e Spel, ge- rando o plasmídeo pARS EspécieC Ad5orf6-2 (SEQ ID NO: 40).

[00189] O plasmídeo resultante pARS EspécieC Ad5orf6-2 foi então utilizado para substituir o E4 por Ad5orf6 na cadeia principal de ChAd157. Para este fim, o plasmídeo pChAd157AE1 TetO hoMV RpsL-Kanatt1551 foi digerido com Pacl e cotransformado em células BJ5183 com o plasmídeo pARS EspécieC Ad5orf6-2 BamHlI/Ascl dige- rido, para obter o plasmídeo pré-adeno pChAd157 AE1IE4 Ad5E4orf6e/ TetO hovM RpsL-Kana (*1594) (SEQ ID NO: 22).

1.5: Construção de ChAd1i57 AEIE4 Ad5E4ort6/Teto hCcMV RGH1559.

[00190] O cassete de expressão da glicoproteína viral da raiva (RG) (sequência de polinucleotídeo da glicoproteína da raiva SEQ ID NO: 23) foi clonado em um vetor pré-adeno aceitador linearizado por meio da recombinação homóloga em E. coli, através da exploração da ho- mologia existente entre o promotor de HCMV e as sequências BGH poliA.

[00191] O plasmídeo pviTetohoMV-bghpoliA RG foi clivado com Spel e AsiS| para extirpar o fragmento de 2,59 Kb contendo o promotor de HCMV com a sequência tetO, RG e BGHpoliA.

[00192] O fragmento de RG 2,59 Kb resultante foi clonado pela re- combinação homóloga no vetor aceitante pChAd157 AE1IE4 Ad5 E4orf6/TetO hoMV RpsL-Kana (f1594) carregando o cassete de sele- ção RpsL-Kana sob controle de HCMV e BGHpA. O plasmídeo acei- tante preAd foi linearizado com a endonuclease de restrição SnaBl. A construção resultante foi o vetor pChAd157 AEIE4 Ad5E4orf6/TetO hCoMV RG*1559 (SEQ ID NO: 24).

[00193] A estrutura do plasmídeo que transporta a RG de ChAd157 é relatada na Figura 6. Exemplo 2: Produção de vetores

[00194] A produtividade de ChAd157 foi avaliada em comparação com ChAd19 e ChAd155 na linhagem celular Procell 92.

2.1: Produção de vetores compreendendo um transgene HIV Gag

[00195] —“ChAd157/GAG, ChAd19/GAG, ChAd155/GAG (vetores de ChAd157, ChAd19 e ChAd155 que expressam um transgene HIV Gag) foram resgatados e amplificados em Procell 92; os lisados foram utili- zados para infectar 1 frasco T25 de Procell 92 cultivado em monoca- mada com cada vetor. Uma multiplicidade de infecção (MOI) de 300 vp/célula foi utilizada e as infecções foram executadas na presença de tetraciclina porque ChAd19/GAG carecia do controle transcricional mediado pela inserção do operador TetO no promotor hCMV. As célu- las infectadas foram colhidas quando o efeito citopático completo foi evidente (48 horas pós-infecção para ChAd157/GAG e ChAd155/GAG e 5 dias pós-infecções para ChAd19/GAG); os vírus foram liberados das células infectadas em 3 ciclos de congelamento/descongelamento (-70 º a 37 ºC) e depois o lisado foi clarificado por centrifugação. Os lisados clarificados foram quantificados pela Análise Quantitativa de PCR com iniciadores e sonda complementares à região do promotor de CMV. As sequências de oligonucleotídeo são as seguintes: CMVfor 5-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3 '(SEQ ID NO: 25), CMVrev 5-GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3' (SEQ ID NO: 26), son- da CMVFAM-TAMRA 5-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3' (SEQ ID NO: 41) (QPCRs foram operadas no detector de sequência ABI Prism 7900 - Applied Biosystem).

[00196] Os títulos volumétricos resultantes (vp/ml) medidos em lisa- dos clarificados e a produtividade específica expressa em partículas de vírus por célula (vp/célula) são fornecidos na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Produtividade do vetor GAG. (vp/ml) de células (vp/célula)

2.2: Produção de vetores compreendendo um transgene RG

[00197] Um conjunto diferente de experimentos foi executado para avaliar a produtividade de vetores de vacina de RG em Procell 92 cul- tivada em suspensão. A experiência comparou ChAd157/RG e ChAd155/RG em paralelo através da infecção de Procell 92 em uma densidade celular de 5 x 10º células/ml. Uma multiplicidade de infec- ção (MOI) de 300 vp/célula foi utilizada. As células infectadas foram colhidas 4 dias após a infecção; o vírus foi liberado das células infec- tadas em 3 ciclos de congelamento/descongelamento e o lisado foi clarificado por centrifugação. Os lisados clarificados foram então quan- tificados por QPCR conforme relatado acima.

[00198] A produtividade volumétrica e a produtividade específica da célula são fornecidas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Produtividade do vetor RG. métrica (vp/ml) de células (vp/célula) Exemplo 3: Níveis de Expressão do Transgene

3.1: Nível de expressão do transgene HIV Gag

[00199] Os níveis de expressão foram comparados em experiências paralelas através da infecção de células HeLa com vetores ChAd19, ChAd155 e ChAd157 compreendendo um transgene HIV Gag.

[00200] As células HeLa foram semeadas em placas de 35 mm e infectadas com vírus purificados ChAd19/GAG, ChAd157/GAG e ChAd155/GAG utilizando uma MOI = 250 vp/célula. Os sobrenadantes das células HeLa infectadas foram colhidos 48 horas após a infecção, e a produção da proteína de HIV GAG secretada foi quantificada utilizando um kit ELISA comercial (kit ELISA de HIV-1 p24, PerkinElmer Life Scien- ce). A quantificação foi executada de acordo com as instruções do fabri- cante através do uso de uma curva padrão do antígeno HIV-1 p24.

[00201] Os resultados, expressos em pg/ml de proteína GAG, são ilustrados na Figura 7.

3.2: Nível de expressão do transgene RG

[00202] Uma análise de western blot também foi executada para avaliar a expressão da glicoproteína da raiva fornecida pelo vetor de ChAd157/RG em comparação com o vetor de ChAd155/RG. Para este fim, células HeLa foram semeadas em placas de 35 mm e infectadas com vírus purificados ChAd157/RG e ChAd155/RG utilizando uma MOI = 250 vp/célula. Os lisados celulares foram colhidos 48 horas após a infecção e o nível de expressão do transgene foi avaliado atra- vés da redução de SDS-PAGE seguido por análise de Western Blot.

[00203] “Quantidades equivalentes de extratos de proteína foram carregadas em gel de SDS redutor; após a separação por eletroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose para serem sondadas com um anti-GP policlonal de coelho (Cat. No. RBVGP11-S aDiagnostic, diluído 1:1000). Após a incubação com o anticorpo primário, a membrana foi lavada e depois incubada com an- ticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) anticoelho. Finalmente, o ensaio foi desenvolvido por quimiolu- minescência utilizando reagentes de detecção de quimioluminescência intensificada (ECL) (W3252282 PIERCE). Os resultados de Western Blot são mostrados na Figura 8.

[00204] “Uma faixa de cerca de 57 kD indicada pela seta foi revelada pelo anticorpo policlonal anti-GP, que corresponde ao peso esperado da glicoproteína da raiva.

[00205] O resultado demonstrou que o nível de expressão do vetor de ChAd157 parece comparável àquele fornecido pelo ChAd155. Exemplo 4: Avaliação da potência imunológica por experimentos de imunização em camundongos

4.1: Imunogenicidade de vetores compreendendo o transgene HIV Gag

[00206] O vetor de ChAd157/GAG de imunogenicidade foi avaliado em paralelo com ChAd155/GAG e ChAd19/GAG em camundongos BALB/c (6 por grupo). O experimento foi executado através da injeção de 10” partículas virais por via intramuscular. A resposta das células T foi medida 3 semanas após a imunização através de ponto imune ab- sorvente ligado à enzima (ELISpot) de interferon-y (IFN-y) utilizando um epítopo de células T GAG CD8+ mapeado em camundongos BALB/c. Os resultados obtidos são relatados na Figura 9, expressos como Células Formadoras de Pontos de IFNy (SFC) por milhão de es- plenócitos.

[00207] Cada ponto representa a resposta em um único camundon- go, e a linha corresponde à média geométrica para cada grupo de do- se. A frequência de camundongos positivos para o peptídeo imunodo- minante CD8 é mostrada no eixo x.

4.2 Imunogenicidade de vetores compreendendo o transgene RG

[00208] A potência imunológica dos vetores de ChAd157/RG e ChAd155/RG foi avaliada em camundongos BALB/c. Ambos os veto- res foram injetados por via intramuscular com doses de 107 e 10º vp. Os esplenócitos de camundongos imunizados foram isolados sete se- manas após a vacinação e analisados por ELISpot de IFNy (Figura 10), utilizando "pools” de peptídeo de RG como antígeno.

[00209] Os níveis de resposta imune foram reduzidos de acordo com a diminuição da dosagem, como esperado. Além disso, o vetor de ChAd155RG induziu maior resposta de células T do que ChAd157 RG, embora eles não fossem significativamente diferentes (Figura 10). Exemplo 5: Avaliação da possibilidade de infecção

5.1 Possibilidade de infecção de vetores compreendendo o trans- gene HIV Gag

[00210] A possibilidade de infecção de vírus purificados foi avaliada em células Procell 92 aderentes utilizando um anticorpo contra a prote- Ína hexon de adenovírus para visualizar as células infectadas através da coloração por imunocitoquímica. O anticorpo contra a proteína he- xon reconhece todos os sorotipos de adenovírus. Para este fim, as cé- lulas Procell92 foram semeadas em placa de 24 cavidades em uma densidade celular de 2 x 10º células viáveis/ml e infectadas em dupli- cata com vetores de ChAd157/GAG e ChAd155/GAG e ChAd19/GAG utilizando uma MOI = 1 vp/célula, 0,5 vp/célula e 0,25 vp/célula. 48 ho- ras após a infecção, as células infectadas foram fixadas com metanol frio e depois marcadas com o anticorpo anti-hexon. O excesso de anti- corpos é removido. As células marcadas são então incubadas com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre e a detecção é executada através do uso de um kit comercial VECTOR NOVARED Substrate Kit (SK-4800). A detecção é executada quando o marcador da enzima peroxidase de rábano silvestre reage com o subs- trato DAB resultando em um produto marrom escuro. As células mar- rons escuras marcadas foram então quantificadas por microscopia óp- tica e o título infeccioso calculado. Os resultados são mostrados na tabela abaixo.

[00211] O resultado demonstrou que a possibilidade de infecção dos vírus ChAd155 e ChAd157 é comparável e maior do que ChAd19.

5.2 Possibilidade de infecção de vetores compreendendo o trans- gene RG

[00212] A possibilidade de infecção de vírus purificados ChAd157/ RG e ChAd155/RG foi avaliada em células Procell 92 aderentes atra- vés da imunocoloração Hexon como relatado acima. Os resultados são mostrados na tabela abaixo.

[00213] O resultado demonstrou que a possibilidade de infecção dos vírus ChAd155 e ChAd157 é comparável. Exemplo 6: Avaliação da neutralização cruzada entre os vetores de ChAd155 e ChAd157

6.1 Teste in vivo se os vetores de ChAd155 e ChAd157 forem so- rotipos diferentes

[00214] A neutralização cruzada entre os vetores de ChAd155 e ChAd157 foi avaliada em camundongos BALB/c (6 por grupo). Os ca- mundongos foram pré-imunizados duas vezes na semana O e na se- mana 3 com 10º vp de ChAd155 ou ChAd157 expressando RG ou fo- ram vacinados por simulação com tampão de salina.

[00215] Três semanas depois, todos os camundongos foram então imunizados uma vez com 10º vp de ChAd157 que codifica HIV gag. OE E asas eee ro Jana [E eles 1 Jomar 10

[00216] Os títulos de neutralização para os vetores de pré-imuni- zação foram medidos em soros na semana 5 (2 semanas após a se-

gunda injeção) através do ensaio de neutralização in vitro (Figura 11). Finalmente, a resposta das células T contra gag foi testada em esplenó- citos 3 semanas após a imunização por ELISpot de IFN-y, utilizando um epítopo de células T GAG CD8+ mapeado em camundongos BALB/c (Figura 12). As doses de vetores utilizadas para a pré-imunização fo- ram capazes de produzir boas atividades de neutralização contra os dois vetores Ad, embora com alguma variabilidade. Os anticorpos neu- tralizantes anti-ChAd155 não apresentam reação cruzada contra ChAd157 e vice-versa (Figura 11). Além do mais, a resposta das célu- las T de ChAd157-Gag não foi afetada pela pré-imunidade anti- ChAd155, confirmando que a neutralização cruzada não foi observada (Figura 12).

[00217] Tomados em conjunto, esses dados sugerem que os vírus ChAd155 e ChAd157 são sorotipos de adenovírus distintos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQIDNO: 1,e (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado fun- cional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

2. Polinucleotídeo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo selecionado do grupo que consis- te em: (a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, e (b) um polinucleotídeo que codifica um derivado funcional de um poli- peptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoá- cidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

3. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que com- preende um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, e (b) um polinucleotídeo que codifica um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

4. Adenovírus recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polinucleotídeo ou polipeptídeo selecio- nado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, (b) um polinucleotídeo que codifica um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (c) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, e (d) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes: (a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, (b) um polinucleotídeo que codifica um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (c) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, (d) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (e) um vetor, como definido na reivindicação 3, e (f) um adenovírus recombinante, como definido na reivindi- cação 4, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

6. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes: (a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, (b) um polinucleotídeo que codifica um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (c) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, (d) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (e) um vetor, como definido na reivindicação 3, e (f) um adenovírus recombinante, como definido na reivindi- cação 4.

7. Polipeptídeo adenoviral isolado, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, e (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se-

quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

8. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99,8% idêntica sobre todo o seu com- primento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

9. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1.

10. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo possui uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 2.

11. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracteri- zado pelo fato de que ainda compreende um polinucleotídeo que codi- fica: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3; ou (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, ou (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5; ou (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

12. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um polinucleotídeo que codifica: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3; ou (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, ou (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5; ou (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

13. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracteri- zado pelo fato de que ainda compreende um polinucleotídeo que codi- fica: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3; ou (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se-

quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, e (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5; ou (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

14. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um polinucleotídeo que codifica: (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3; ou (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, e (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5; ou (b) um derivado funcional de um polipeptídeo tendo a se- quência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5, em que o derivado funcional possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica sobre todo o seu comprimento à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

15. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracteri-

zado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 4.

16. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 6.

17. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende pelo menos um dos seguintes: (a) uma extremidade 5' adenoviral, de preferência uma re- petição terminal invertida 5' adenoviral; (b) uma região EIA adenoviral, ou um fragmento da mesma selecionada dentre as regiões EIA 280R e EIA 243R; (c) uma região adenoviral EIB ou IX, ou um fragmento da mesma selecionado dentre o grupo que consiste nas regiões E1B 19K, EIB 55K ou IX; (d) uma região E2b adenoviral; ou um fragmento da mesma selecionado dentre o grupo que consiste nas regiões E2B pTP, E2B Polimerase e E2B |IVa2; (e) uma região L1 adenoviral, ou um fragmento da mesma, dito fragmento codificando uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L1 13.6k, proteína L1 52k e L1 llla; (f) uma região L2 adenoviral, ou um fragmento da mesma, dito fragmento codificando uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L2 penton de acordo com a reivindica- ção 3, proteína L2 pVIl, L2 V e proteína L2 pX; (9) uma região L3 adenoviral, ou um fragmento da mesma, dito fragmento codificando uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L3 pVI, proteína L3 hexon, de acordo com a reivindicação 2 e L3 protease; (h) uma região E2A adenoviral; (i) uma região L4 adenoviral, ou um fragmento da mesma, dito fragmento que codifica uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L4 100k, na proteína L4 33k e na pro- teína L4 VIII; (]) uma região E3 adenoviral, ou um fragmento da mesma selecionado do grupo que consiste em E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8 e E3 ORF9; (k) uma região L5 adenoviral, ou um fragmento da mesma, dito fragmento codificando a proteína fibra L5 fibra, de acordo com a reivindicação 1; (1) uma região E4 adenoviral, ou um fragmento da mesma selecionado do grupo que consiste em E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORFA4, E4 ORF3, E4 ORF2 e E4 ORF1; (m) uma extremidade 3' adenoviral, de preferência uma re- petição terminal invertida 3' adenoviral; e/ou (n) uma região de RNA adenoviral VAI ou VAII, de prefe- rência uma região de RNA adenoviral VAI ou VAII de um adenovírus diferente de ChAd157, mais preferivelmente de Ad5.

18. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende pelo menos um dos seguintes: (a) uma extremidade 5' adenoviral, de preferência uma re- petição terminal invertida 5' adenoviral; (e) uma região L1 adenoviral, ou um fragmento da mesma, dito fragmento codificando uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L1 13.6k, proteína L1 52k e L1 llla; (f) uma região L2 adenoviral, ou um fragmento da mesma, dito fragmento codificando uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L2 penton, de acordo com a reivindi- cação 3, proteína L2 pVIl, L2 V e proteína L2 pX; (9) uma região L3 adenoviral, ou um fragmento da mesma, dito fragmento que codifica uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L3 pVI, proteína hexon L3 hexon, de acordo com a reivindicação 2 e L3 protease; (i) uma região L4 adenoviral, ou um fragmento da mesma, dito fragmento que codifica uma proteína adenoviral selecionada do grupo que consiste na proteína L4 100k, na proteína L4 33k e na pro- teína L4 VIII; (k) uma região L5 adenoviral, ou um fragmento da mesma, dito fragmento codificando a proteína fibra L5 fibra de acordo com a reivindicação 1; (m) uma extremidade 3' adenoviral, de preferência uma re- petição terminal invertida 3' adenoviral.

19. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma região de RNA adenoviral VAI ou VAII.

20. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a região de RNA VAI ou VAI! é de um adenovírus diferente de ChAd157.

21 Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a região de RNA VAI ou VAII é de Ad5.

22. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende ou consiste em um polinucleotídeo que é pelo menos 95% idêntico sobre todo o seu comprimento a uma sequência de referência que consiste essencial-

mente em SEQ ID NO: 15 ou 22.

23. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende ou consiste em um polinucleotídeo que é pelo menos 99% idêntico sobre todo o seu comprimento à sequência de referência.

24. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende ou consiste em um polinucleotídeo que é pelo menos 99,5% idêntico sobre todo o seu comprimento à sequência de referência.

25. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende ou consiste em um polinucleotídeo que é idêntico sobre todo o seu comprimento à se- quência de referência.

26. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a sequência de referência é SEQ ID NO: 15.

27. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a sequência de referência é SEQ ID NO: 22.

28. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma mutação ou supressão que torna não funcional pelo menos um gene de uma regi- ão genômica selecionada a partir do grupo que consiste em EIA , E1B, E2A, E2B, E3 e E4.

29. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo carece de pelo menos um gene de uma região genô- mica selecionada a partir do grupo que consiste em E1A, E1B, E2A, E2B, E3 e/ou E4.

30. Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que as regiões genômicas são E1A e/ou E1B.

31 Polinucleotídeo, vetor, adenovírus, composição ou célu- la, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma supressão da região genômica E1.

32. Adenovírus, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 4 e 8 a 31, caracterizado pelo fato de que o adenovírus recom- binante é competente para replicação.

33. Adenovírus, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 4 e 8 a 32, caracterizado pelo fato de que o adenovírus recom- binante é incompetente para replicação.

34. Adenovírus, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 4 e 8 a 33, caracterizado pelo fato de que o adenovírus recom- binante compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína, em que a sequência de ácido nucleico está ligada de maneira operável a uma ou mais sequências que direcionam a ex- pressão de dita proteína em uma célula hospedeira.

35. Adenovírus, de acordo com a reivindicação 34, caracte- rizado pelo fato de que a proteína é uma proteína antigênica ou um fragmento da mesma.

36. Adenovírus, de acordo com a reivindicação 35, caracte- rizado pelo fato de que a proteína é uma proteína heteróloga ou frag- mento da mesma.

37. Adenovírus, de acordo com a reivindicação 36, caracte- rizado pelo fato de que a proteína é derivada de um vírus.

38. Adenovírus, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 34 a 37, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais se- quências que direcionam a expressão de dito produto em uma célula hospedeira incluem uma sequência selecionada de um ou mais do grupo que consiste em: início da transcrição, término da transcrição, promotor e sequências intensificadoras.

39. Adenovírus, de acordo com a reivindicação 38, caracte- rizado pelo fato de que a uma ou mais sequências que direcionam a expressão de dito produto em uma célula hospedeira incluem uma se- quência promotora.

40. Adenovírus, de acordo com a reivindicação 39, caracte- rizado pelo fato de que a sequência promotora é selecionada do grupo que consiste em um promotor interno, um promotor nativo, promotor RSV LTR, promotor CMV, promotor SV40, promotor de di-hidrofolato redutase, promotor de B-actina, promotor PGK, promotor EF1a e pro- motor CAS|.

41 Adenovírus, de acordo com a reivindicação 39, caracte- rizado pelo fato de que a sequência do promotor é um promotor de hCMV intensificado, tal como fornecido na SEQ ID NO: 42.

42. Adenovírus, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 4 e 8 a 41, caracterizado pelo fato de que o adenovírus possui uma soroprevalência menor do que 10% em seres humanos e, de pre- ferência, nenhuma soroprevalência em seres humanos.

43. Adenovírus, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 4 e 8 a 42, caracterizado pelo fato de que o adenovírus é ca- paz de infectar uma célula de mamífero.

44. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 5 e 8 a 43, caracterizada pelo fato de que compreende um ad- juvante selecionado da lista que consiste em: adjuvantes inorgânicos (por exemplo, sais de metal inorgânico, tais como fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio), adjuvantes orgânicos (por exemplo, saponi- nas, tais como QS21 ou esqualeno), adjuvantes à base de óleo (por exemplo, adjuvante completo de Freund e adjuvante incompleto de Freund), citocinas (por exemplo, IL-16, IL-2, IL-7, 11-12, 11-18, GM- CFS e INF-y), adjuvantes particulados (por exemplo, complexos imu- noestimuladores (ISCOMS), lipossomas ou microesferas biodegradá- veis), virossomas, adjuvantes bacterianos (por exemplo, lipídeo A de monofosforila, tal como lipídeo A de monofosforila 3-des-O-acilado (SD-MPL) ou peptídeos de muramila), adjuvantes sintéticos (por exemplo, copolímeros de bloco não iônicos, análogos de peptídeo de muramila ou lipídeo A sintético), polinucleotídeos adjuvantes sintéticos (por exemplo, poliarginina ou polilisina) e oligonucleotídeos imunoes- timuladores contendo dinucleotídeos não metilados CpG ("CpG").

45. Composição, de acordo com a reivindicação 44, carac- terizada pelo fato de que o adjuvante é um 3D-MPL e/ou QS21.

46. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 e 8 a 31, caracterizada pelo fato de que é uma célula hospedeira que expressa pelo menos um gene adenoviral selecionado do grupo que consiste em E1A, E1B, E2A, E2B, E3 E4, L1 , L2, L3, L4 e LB.

47. Célula, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é cultivada em suspensão.

48. Polinucleotídeo, polipeptídeo, vetor, adenovírus, com- posição ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

49. Polinucleotídeo, polipeptídeo, vetor, adenovírus, com- posição ou célula, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que é para uso como uma vacina.

50. Uso do polinucleotídeo, polipeptídeo, vetor, adenovírus, composição ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 47, caracterizado pelo fato de que é para a terapia ou profila-

xia de uma doença.

51. Método de indução de uma resposta imune em um indi- víduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do polinucleotídeo, polipeptídeo, vetor, adenovírus, composição ou célula, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 47, ao indiví- duo.

52. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste na sequência de acordo com a SEQ ID NO:

2.

53. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 e 8 a 43, caracterizado pelo fato de que co- difica um transgene para administração a um indivíduo que foi anteri- ormente exposto a um vetor adenoviral recombinante que não com- preende uma fibra de ChAd157, ou seu derivado funcional, como aqui descrito.

54. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivin- dicação 53, caracterizado pelo fato de que o indivíduo que foi anteri- ormente exposto a um vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra, hexon e/ou penton de ChAd155.

55. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivin- dicação 54, caracterizado pelo fato de que o indivíduo que foi anteri- ormente exposto a um vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra, hexon e penton de ChAd155.

56. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivin- dicação 54 ou 55, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra, hexon e/ou penton de ChAd155 codifica um transgene direcionado a uma indicação ou indi- cações médicas diferentes para o vetor adenoviral recombinante, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 4 e 8 a 43, que codi- fica um transgene.

57. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivin- dicação 54 ou 55, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra, hexon e/ou penton de ChAd155 codifica um transgene direcionado na mesma indicação ou indicações médicas para o vetor adenoviral recombinante, como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 4 e 8 a 43 que codifica um transgene.

58. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivin- dicação 54 ou 55, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra, hexon e/ou penton de ChAd155 codifica o mesmo transgene como para o vetor adenoviral recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 e 8 a 43, que codifica um transgene.

59. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 58, caracterizado pelo fato de que os transgenes codificam um imunógeno que é útil para imunizar um ani- mal humano ou não humano contra um patógeno, tal como bactérias, fungos, microrganismos parasitas ou parasitas multicelulares que in- fectam vertebrados humanos e não humanos ou contra uma célula cancerosa ou célula tumoral.

60. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 e 8 a 43, caracterizado pelo fato de que co- difica um transgene para administração a um indivíduo que pode ser subsequentemente exposto a um vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fibra de ChAd157, ou seu derivado funcional, conforme aqui descrito.

61. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivin- dicação 60, caracterizado pelo fato de que o indivíduo pode subse- quentemente ser exposto a um vetor adenoviral recombinante com- preendendo uma fibra, hexon e/ou penton de ChAd155.

62. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivin- dicação 61, caracterizado pelo fato de que o indivíduo pode ser sub- sequentemente exposto a um vetor adenoviral recombinante compre- endendo uma fibra, hexon e penton de ChAd155.

63. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivin- dicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra, hexon e/ou penton de ChAd155 codifica um transgene direcionado a uma indicação ou indi- cações médicas diferentes para o vetor adenoviral recombinante, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 4 e 8 a 43, que codi- fica um transgene.

64. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivin- dicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra, hexon e/ou penton de ChAd155 codifica um transgene direcionado à mesma indicação ou indicações médicas para o vetor adenoviral recombinante, como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 4 e 8 a 43, que codifica um transgene.

65. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivin- dicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante compreendendo uma fibra, hexon e/ou penton de ChAd155 codifica o mesmo transgene que o vetor adenoviral recombi- nante, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 e 8 a 43, que codifica um transgene.

66. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 65, caracterizado pelo fato de que os transgenes codificam um imunógeno que é útil para imunizar um ani- mal humano ou não humano contra um patógeno, tal como bactérias, fungos, microrganismos parasitas ou parasitas multicelulares que in- fectam vertebrados humanos e não humanos, ou contra uma célula cancerosa ou célula tumoral.

67. Método para produzir uma resposta imune em um indi- víduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) administrar ao indivíduo um vetor adenoviral recombi- nante, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 e 8 a 43, que codifica um primeiro transgene; e (b) administrar ao indivíduo um vetor adenoviral recombi- nante que não compreende uma fibra de ChAd157, o vetor que codifi- ca um segundo transgene; em que as etapas (a) e (b) podem ser empreendidas em qualquer ordem e o primeiro e o segundo transgenes podem ser iguais ou diferentes.

68. Método para a profilaxia ou tratamento de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) administrar ao indivíduo um vetor adenoviral recombi- nante, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 e 8 a 43, que codifica um primeiro transgene que codifica um imunógeno que é útil para imunizar um animal humano ou não humano contra um pató- geno tal como bactérias, fungos, microrganismos parasitas ou parasi- tas multicelulares que infectam vertebrados humanos e não humanos, ou contra uma célula cancerosa ou célula tumoral; e (b) administrar ao indivíduo um vetor adenoviral recombi- nante que não compreende uma fibra de ChAd157, ou seu derivado funcional como aqui descrito, o vetor que codifica o segundo transgene que codifica um imunógeno que é útil para imunizar um animal huma- no ou não humano contra um patógeno tal como bactérias, fungos, microrganismos parasitas ou parasitas multicelulares que infectam ver- tebrados humanos e não humanos, ou contra uma célula cancerosa ou célula tumoral; em que as etapas (a) e (b) podem ser empreendidas em qualquer ordem.

69. Vetor adenoviral recombinante ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 68, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fi- bra de ChAd157, ou seu derivado funcional, conforme descrito nesta invenção, possui uma baixa reatividade cruzada com o vetor adenovi- ral recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 ou 8 a43.

70. Vetor adenoviral recombinante ou método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a imunização com um primeiro vetor extrai um título de neutralização que é em mé- dia menor do que 50% do nível que surge da imunização com o se- gundo vetor.

71. Vetor adenoviral recombinante ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 70, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral recombinante que não compreende uma fi- bra de ChAd157 não compreende uma fibra de ChAd157, hexon de ChAd157 ou fibra de ChAd157 ou seus derivados funcionais tendo também pelo menos 98% de identidade.

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