JP3253073B2 - 嚢胞性線維症のための遺伝子治療 - Google Patents

嚢胞性線維症のための遺伝子治療

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Description

【発明の詳細な説明】 支援 本発明に関する研究は、国立衛生研究所（米）によっ
て審査の上与えられた助成金DK42718、及びDK39690の下
に嚢胞性線維症財団、及び合衆国政府によって支援され
た。
関連出願 本出願は、表題が“嚢胞性線維症遺伝子”であり、19
89年８月22日に出願され、今では放棄された米国出願一
連番号No.396,894の部分的継続であり、表題が“嚢胞性
線維症遺伝子”であり、1989年８月24日に出願され、今
では放棄された米国出願一連番号No.399,945の一部の継
続である表題が“嚢胞性線維症遺伝子”であり、1989年
８月31日に出願された米国出願一連番号No.401,609の一
部の継続であり、表題が“嚢胞性線維症のための遺伝子
治療”である1990年９月18日に出願された米国出願一連
番号No.584,275の恩典を請求する国際出願である。
これらすべての出願は本出願に引用によって明確に組
み込まれている。
発明の分野 本発明は一般的には、嚢胞性線維症（CF）のための遺
伝子治療に関し、さらに詳細には嚢胞性線維症患者にお
ける上皮細胞のCl-チャンネルの欠陥を補正するため、
嚢胞性線維症の膜横断伝導レギュレーター（CFTR）の遺
伝子のトランスファーに関する。
発明の背景 嚢胞性線維症（CF）は、膵臓、及び肺臓の不全につな
がる水と電解質の輸送における異常を特徴とする常染色
体性劣性障害である。Taussig,LM、編“嚢胞性線維症”
におけるTaussig,LMの“概要”（New York:Thieme−Str
alton）,1−９（1984）,CFはキャリヤー フリーケンシ
ィーが５％であり、北米において2500人の出産児のうち
ほぼ１人が罹患する最もありふれた重篤な常染色体劣性
障害の１つである。
CFの欠陥の機能的表現は、表皮細胞のCl-イオンの透
過性が減少することである。Quinton,P.M.,FASEB J.4:2
70−2717（1990）。気道、汗腺、膵臓、及び他の組織に
おける上皮細胞が、cAMP媒介のアゴニストに応答してCl
-を分泌する能力が失われるか、著しく減少する。cAMP
依存性プロテインキナーゼ（PKA）による先端膜Cl-チャ
ンネルの活性化は傷害を受けるが、正常な伝導特性をも
ったチャンネルは、その効果が細胞Ca++の増加によって
媒介されるアゴニストを含めて他の手段によって活性化
することができる。Frizzell.,R.A.ら、Trends Neurosc
i,10:190−193（1987）;Welsh,M.J.,FASEB J.4:2718−2
725（1990）。これらの知見から、CFにおいては、Cl-チ
ャンネル自体には欠陥はなく、欠陥は、プロテインキナ
ーゼの活性化の効果を変換する調節性蛋白質に存在する
のかもしれないことが示唆される。CF細胞における上皮
Na+輸送における異常の存在により、他の細胞機能に影
響する調節欠陥という考え方がさらに支持される。Bouc
her,R.C.ら.,J.Clin.Invest.78:1245−1252（1986）。
前出の関連出願において詳細に述べられたようにCFに
対する遺伝子の単離により、本疾患の分子レベルの基礎
へのさらなる洞察が与えられた。Rommens,J.M.ら、Scie
nce245:1059−1065（1989）;Riordan,J.R.ら、Science2
45:1066−1073（1989）;Kerem,B.S.ら、Science245;107
3−1080（1989）も参照のこと。CFの原因である遺伝子
は、そのゲノム内の位置に基いて、ゲノムDNAの250,000
b.p.に局在していた。この遺伝子は、嚢胞性線維症膜横
断レギュレーター（CFTR）と呼ばれる1480のアミノ酸か
らなる蛋白質をコードしている。Riordonら、上述。
CFの病因におけるCFTRの役割を裏付けるこれまでに得
られている最も説得力のある証拠は、遺伝学的解析によ
って提供された。Keremら、上述（1989）。CFの染色体
のCFTR遺伝子の配列の解析によって、ナンセンス変異や
フレームシフト変異をはじめとする様様な突然変異が明
らかとなった。Cutting,G.R.ら、Nature 346;366−369
（1990）;White,M.B.ら、Nature 344:655−677（199
0）;Dean.Mら、Cell 61:863−870（1990）;Kerem,B.S.
ら、嚢胞性線維症の遺伝子の２つの推定上のヌクレオチ
ド（ATP）のバインディング フォールドに相当する領
域における変異の同定PNAS（USA）（1990）（印刷
中）。しかし、広い人口集団の研究により、最も普通な
CF変異は、フェニルアラニン508（△F508）をコードす
る３つのヌクレオチドの欠失であることが示された。こ
の欠失はCFの染色体すべての70％上に存在するが、正常
な染色体上には存在しない。Keremら.,上述（1989）;Cy
sticFibrosis Genetic Analysis Consortium（1990）。
生理学的、及び分子クローニング研究の双方からの結
果からCFTRはCl-チャンネルである可能性が生じた。cAM
P依存性プロテインキナーゼ（PKA）によるCl-チャンネ
ルの活性化における欠陥は、無細胞膜片において単一チ
ャンネルレベルで存在し、CF遺伝子から予知された蛋白
質の構造から、膜上にまたがる12の領域を持った膜に絶
対に必要な構成蛋白質であることが示唆されている。Sc
houmacher,R.A.らNature330:152−754（1987）;Li,M.
ら.,Nature331;358−360（1988）;Riordanら.,上述。am
iloride−感受性Na+輸送やmucinの硫酸化のような他の
細胞のプロセスにおけるCF−と結びついて変更の確認
は、CFTRが、いくつかの細胞のプロセスを調節している
可能性があるという見解を支持している。Boucherら.,
上述:Boat,F.T.ら;Arch.Biochem.Biophys.177:95−104
（1976）。
CFTRがCl-輸送に演じている特定の役割は今後決定さ
れなければならないが、CFTR蛋白質は、２つのヌクレオ
チドのバインディング フォールドすなわちリン酸化の
ための可能性のある多くの部位を有する調節領域、及び
細胞膜と恐らく相互作用するであろう２つの疎水性領域
を含むいくつかの興味深い機能領域を含んでいる。CFTR
は、原核細胞のペリプラズムの結合蛋白質、及びより高
等な真核細胞における多剤耐性と結びついたＰ−糖蛋白
質を含む蛋白質の“ATP結合カセット”（ABC）スーパー
ファミリーのいくつかのナンバーと構造的類似性を示し
ている。Riordanら、上述;Hyde,S.C.ら、Nature346:312
−365（1990）。
CFの遺伝学的、及び機能的基礎についての我々の理解
の最近の進歩によりその分子レベルの病理学をより良く
明確にすること、ならびにソマティック ジーン トラ
ンスファーに基いた新しい治療を開発するための基礎が
提供された。
発明の要約 嚢胞性線維症（CF）のための遺伝子治療は、嚢胞性線
維症の機能的膜横断伝導レギュレーター（CFTR）のため
の遺伝子を罹患した上皮細胞に配送することから成る。
CFのような劣性な形質について期待されるように正常な
CFTR遺伝子の単一コピーの配送と発現によってCF細胞中
に存在するCl-チャンネルの調節欠陥が軽減される。機
能的CFTRの欠損、またはCFTR遺伝子における欠陥から生
ずる生理学的に容認できるレベルより低いCFTR機能の存
在によって起るCFは、このように本発明の原理にしたが
って治療することができる。
本発明の“正常なCFTR遺伝子は、単に機能性CFTRをコ
ードする核酸配列のすべてである。したがって機能性CF
TRが発現できることを条件として、本遺伝子の実際の配
列における変動は、思容され得る。例えば、遺伝子のク
ローニングを安定化させるためにサイレント突然変異を
導入することができる。本発明の実際において使用され
るCFTR遺伝子は、DNAクローニング、人工的構築、もし
くは他の手段のような常法によって得ることができる。
具体例において利用された4.6kb cDNAは、CAMPによって
刺戟されたCl-の電流の分析によって測定されるごと
く、機能性CFTR蛋白質をコードするのに必要な配列すべ
てを持っている。
本発明によるCFTR遺伝子のトランスファーは、カルシ
ウム ホスフェート共沈澱を用いるトランスフェクショ
ン、標的細胞と、CFTR遺伝子を担っているリポソーム、
赤血球ゴースト、またはスフェロプラストの融合、プラ
スミド及びウィルスのベクター媒介トランスファー、及
びDNA蛋白複合体媒介ジーントランスファーを含む多く
の手段によって達成することができる。
現在では、望ましい配送ベヒクルはヒト上皮細胞に感
染することができる組換え体レトロウイルスである。こ
れは、CFTR遺伝子が比較的大きいことを考慮すると、幾
分驚くべきことである。本発明のレトロウイルスベクタ
ーは、一般的に、少くとも、感染に必要なレトロウイル
スの部分のDNAとそれに対して有効に結合された正常なC
FTR遺伝子を含んでいる。その上、ベクターの構築にお
いて使用されるレトロウイルスのゲノムの部分は、標的
細胞上のウイルス複製の有害作用を除くため複製欠陥と
することができる。
膵臓や汗腺細胞のようなCF−罹患上皮細胞はすべて本
発明のジーントランスファ法とベクターで標的とするこ
とができるが、CFの最も重篤な併発症は通常肺性なの
で、気道上皮細胞は本発明の遺伝子治療にとって最も好
ましい標的である。さらに、気道上皮細胞は組換え体レ
トロウイルスによって容易に感染されることが分ったと
いう事実を考慮すると、本発明によるこれらの細胞に対
するジーントランスファーは、極めて実現可能である。
キャリヤーの診断とスクリーニングもCFTR欠陥細胞と
細胞系のトランスダクションによって達成することがで
きる。例えば、本発明の相補性スキームを用いて他の推
定上のCF変異の有効性を決定することができ、また位置
特異的な突然変異生成、またはこの大きなABC遺伝子フ
ァミリーの他のメンバーとのドメイン交換によってCFTR
の機能を研究する道具として有用である。
したがって本発明は、CF患者に対して機能的CFTR遺伝
子の配送と発現を通じての嚢胞性線維症のための遺伝子
治療にむけられている。組換え体レトロウイルスベクタ
ー、ならびに他のCFTRジーントランスファースキームを
本発明の実際において使用することができる。本発明
は、その原理にしたがってその中にトランスデュースさ
れたか、トランスファーされた正常なCFTR遺伝子を担っ
ているCF上皮細胞と細胞系の両者をさらに包含する。他
の推定上のCF突然変異のためのスクリーニング及び相補
性検定も、本発明の範囲に入れて考えられる。
図の簡単な説明 図1Aには、本発明の組換え体レトロウイルスベクター
PLJ−CFTRのプロウイルス成分が描かれている。
図1Bには、制限酵素Kpn Iで処理したDNAのNeo特異性
プローブを使用してのゲルブロットハイブリッド形成
（上図）とHind IIIで消化したDNAのエキソン13CFTR特
異的プローブを使用してのゲルブロットハイブリド形成
（下図）の結果が示されている。
図２は、CFPACクローン中のレトロウイルスでトラン
スデュースされたCFTR遺伝子の発現のCFTRエキソン13プ
ローブを使用したRNAブロット分析である。
図3Aは、forskolinのPLJとPLJ−CFTRクローンにおけ
る125Iの流出に対する継時効果を図解しているグラフで
ある。
図3Bは、PLJとPLJ−CFTRクローンにおける125I流出に
対するforskolinの効果を、125Iの基礎流出と比較して
図解しているグラフである。
図4Aは、PLJ−CFTRクローンＩにおけるforskolinによ
る内方への電流の刺戟作用の全細胞のボルテージクラン
プレコードである。
図4Bは、PLJクローン６細胞においてはcAMPまたはfor
skolinが膜電流を刺戟することが出来ないことを図解し
ている。
図4CはNaCl、低Cl-及びNa+を含まない水浴中における
forskolin−誘発電流についての電流−電圧の即時的関
係を描くグラフである。
図５（配列のリスト）は、論理的に推理されたアミノ
酸配列とともにCFTRをコードしているcDNAのヌクレオチ
ド配列である。
図６はCFTR構築物のための安定化スキームを描いてい
る。
図７は、本発明の実際において使用されるプラスミド
に基くベクターの制限酵素地図である。
本発明のより好ましい態様の詳細な記述 機能的CFTRの不在、または生理学的に容認し得るレベ
ルにないCFTR遺伝子の欠陥から生ずるCFTRの機能が、正
常なCFTR遺伝子をCFTR欠陥細胞にトランスファーするこ
とによって治療される。“CFTR機能の生理学的に容認で
きるレベルと細胞集団、または患者に”、正常な量のCF
TRの存在が認められ正常な生理学的効果を示すというこ
とである。CFTR機能不全の例には、嚢胞性線維症におい
て示されたような上皮細胞におけるCl-チャンネルの調
節異常が含まれるが、これに限られるわけではない。
本発明の組換え体ウイルスベクターは、少くとも標的
細胞に感染することができるレトロウイルスのゲノムの
部分とそれに有効に連結された正常なCFTR遺伝子から成
っている。感染とは、一般的には、ウイルスがその宿
主、または標的細胞へ遺伝子物質をトランスファーする
過程のことである。本発明のベクターの構築において使
用されるレトロウイルスはまた、望ましくは、標的細胞
上のウイルスの複製の効果を除去するために複製欠陥に
される。この様な場合には、複製欠陥ウイルスゲノム
は、在来技術にしたがってヘルパーウイルスと組み合せ
てパッケージすることができる。一般に、感染性とCFTR
遺伝子のトランスファーの能力の上記の基準を満たすレ
トロウイルスは、すべて、本発明の実際において使用す
ることができる。本発明の実施のための適切なレトロウ
イルスには例えば、この分野の技術に熟達している人々
にとって良く知られているPLJ,pZip,pWe,及びpEMがあ
る。複製−欠陥レトロウイルスのための適切なパッケー
ジングウイルス系には、例えば、ΨCrip,ΨCre及びΨ
２、ならびにΨAmがある。
CFTRトランスファーにウイルスベクタースキームが用
いられるとき、毒性が減弱されたか、または無毒性のウ
イルスがやはり望ましいことは評価される。発明の実際
において適用可能な場合においては、CFTR遺伝子の増幅
も、正常CFTRの発現のレベルを増強するために利用する
ことができる。
レトロウイルスと組換えを行うべき、または本発明の
他の方法によってトランスファーされるべき、遺伝物質
は、在来のクローニング法、すなわちcDNA、オーバーラ
ッピングオリゴヌクレオチド配列による、または望まし
い配列が得られる他の適切な方法すべてによって提供さ
れることがより好ましい。診断的、またはスクリーニン
グ検定に使用されるときは、遺伝物質は、通常、患者の
DNAのクローニングによって、または、代替法として患
者のゲノムDNAの使用によって提供される。既に述べた
如く、正常CFTR遺伝子とは、機能性CFTRをコードする核
酸配列のすべてのことである。
本発明にしたがうトランスダクション、またはジーン
トランスファーのための標的となる細胞はCFTRの配送が
望ましいすべての細胞を含む。一般的に言って、この細
胞は、CF細胞のようなCFTR遺伝子の欠陥を持った細胞で
ある。CFの場合では、標的とされる細胞は、膵臓、汗
腺、肝臓、小腸、腎臓そして肺の細胞のような、もっと
好ましくさえある上皮気道細胞を含む、上皮細胞である
ことがより好ましい。
細胞または細胞集団は、本発明にしたがってiv vivo
またはin vitroで治療することができる。例えば、in v
ivo治療においては、本発明のCFTRベクターは、好まし
くは生物学的に適合性の溶液、または医薬的に受容でき
る配送車において、摂取、注射、吸入、もしくは他のい
かなる方法によっても患者に投与することができる。投
薬量は患者によって異なり、危険、あるいは有害な副作
用とバランスをとったCFTR機能の強化のレベルによって
決定される。トランスダクションのレベル、CFTRの発
現、及びまたは正常CFTRの存在、またはレベルをモニタ
ーすると、投薬量を選択し、調節するのに役立つ。in
vitroトランスダクションも本発明中に考察されてい
る。欠陥CFTR遺伝子を有する細胞集団は患者から取除く
ことができる。または、本発明の原理にしたがって正常
なCFTR遺伝子でトランスデュースし、次に患者に導入す
ることができる。
形質転換を受けたCF細胞系のようなCFTR欠陥細胞系も
本発明にしたがってトランスデュースすることができ
る。このような細胞系は、例えば、CF突然変異を評価し
てCFを診断し、キャリヤーをスクリーニングするための
相補性検定に役立つ。例えば患者のCFTRcDNAをCF細胞に
トランスファーすることができ、その細胞を相補性につ
いて、すなわちCFTR機能についてスクリーニングし、C
F、または、CFTR遺伝子欠陥を確認、もしくは除外する
ことができる。
以下に続く具体例の最初のセットにおいては、レトロ
ウイルス媒介の遺伝子トランスファーを用いてCF患者の
上皮細胞でのCl-の調節における嚢胞性線維症（CF）欠
陥を補った。両種指向性レトロウイルスを使用して、嚢
胞性線維症機能性膜横断伝導レギュレーター（CFTR）の
cDNAをCFの患者起源の膵臓腺癌細胞系へトランスデュー
スした。この細胞系は、CF欠陥の特徴である電解質輸送
における異常、すなわちcAMPによって刺戟されたCl-輸
送が欠けているという異常を安定して発現した。CFPAC
−１細胞を対照ウイルスに（PLJ）とCFTR−発現ウイル
ス（PLJ−CFTR）に暴露した。ウイルスでトランスデュ
ースされたクローンを単離し、分子解析と生理学的解析
にかけた。アガロースゲルブロット分析によって10この
PLJクローンのうち10こにおいて転位していないプロウ
ィルス配列が明らかになった。RNA分析によりPLJ−CFTR
クローンのすべてにおいてウイルス起源のCFTR転写物が
検出された。RNA分析により転位していないプロウイル
ス排列を含んでいたPLJ−CFTRクローンのすべてにおい
てウイルス起源のCFTR転位物が検出された。
PLJとPLJ−CFTRクローンをcAMP、及びカルシウムによ
って刺戟される陰イオン輸送について検べるために陰イ
オン（125I）の流出を用いた、細胞内cAMPを増加する作
用体はPLJ−CFTRクローンにおいて125I流出を刺戟した
がPLJでは刺戟しなかった。２この応答性のクローンに
ついて行われた全細胞パッチ−クランプによって陰イオ
ン流出応答はCl-伝導のcAMPによる促進のためであるこ
とが示された。カルシウムのイオノフォアは、すべての
PLJとPLJ−CFTRのクローンにおいて125I流出とCl-の流
れを増加した。これらの知見から、正常なCFTR遺伝子の
発現は、CF上皮細胞にcAMP−依存性のCl-チャンネルの
調節を付与することが示唆される。
具体例の２番目のセットには、気道上皮細胞ならびに
膵臓細胞へのジーントランスファー、CFTR遺伝子治療の
実行、及びリポフェクション及びDNA−蛋白複合体媒介
ジーントランスファーを含む代替法としてのジーントラ
ンスファー配送システムが記述されている。
例−Ｉ 組換え体レトロウイルス オーバーラッピングクローンからCFTRcDNAの全長を再
構成する初期の試みは不成功であった。これらの困難は
今後明確にしなければならないが、我々のデータは、CF
TRcDNAの内部配列からの原核細胞性の転写の結果、バク
テリアに対して毒性がある蛋白質の発現が起る可能性を
示している。エキソン6bにまたがっているCFTRの制限酵
素断片への３つのサイレントミューテーション（930に
おけるＣに対するＴ、933におけるＧに対するＡ、及び9
36におけるＣに対するＴ）の導入は、可能性として隠れ
た原核細胞性プロモーターを妨害することによってこの
毒性効果を完全に除去し、連続したCFTRcDNA排列の4.6k
bの再構築を可能にした。この再構築されたcDNAのヌク
レオチド配列は再び決定され、上に記した３つのサイレ
ントミューテーションを例外として以前に発表された配
列と同一であった。上記のRiordanらを参照のこと。
請求項の前に提示された配列のリストはCF膜横断伝導
レギュレーターをコードするヌクレオチド配列を、それ
から推定したアミノ酸配列とともに図示している。DNA
の配列決定は、35S−標識ヌクレオチドについてのディ
デオキシチェインターミネーション法によるか、Dupont
Genesis2000自動DNAシークェンサーによって行われ
た。図５（配列のリスト）のカラムの右の数字は塩基の
位置を示す。最初の塩基の位置は、TB2−７よりも１ヌ
クレオチドだけ大きい５′−拡張クローンPA3−５の最
初の位置に相当する。３′末端とノンコーディンク配列
も図中に示されている（ヌクレオチド4561から6129＋ポ
リ（Ａ）＋テール）。示されている矢印はプライマーエ
クステンション分析による転写開始部位の位置を示して
いる。図に簡略化されて示されているように、ヌクレオ
チド6129にポリ（Ａ）トラクトが続いている。エキソン
の接合部は以下の塩基の位置の間である:185−186;296
−297;405−406;621−622;711−712;1001−1002;1248−
1249;1341−1342;1523−1524;1716−1717;1811−1812;1
898−1899;2621−2622;2789−2790;3040−3041;3120−3
121;3499−3500;3599−3600;3849−3850;4005−4006;40
95−4096;4268−4269;及び4374−4375。
ポテンシャルな膜にまたがる部分は、Eisenbertら、
J.Mol.Biol.179;125（1984）のアルゴリズムの使用で確
められ、図中の核酸記号の下に線で囲んである。推定上
のATP−バインディングフォールドは図中のアミノ酸の
略号のＦにアンダーラインが引かれている。プロティン
キナーゼＡ、またはＣによるリン酸化の可能な位置は、
ｏと＊によってそれぞれ示されており、＋はグルコシル
化の位置を示している。白の三角は、CFにおいて3bpが
欠失している位置を示す。図５に使用されるアミノ酸残
基に対する略号はＡ、Ala;C,Cys;D,Asp;E,Glu;F,Phe;G,
Gly;H,His;Ile;K.Lys;L,Leu;M.Met;N,Asn;P,Pro;Q,Gin;
R,Arg;S,Ser;T,Thr;V,Val;W,Trp;そしてY,Tryである。
修飾されたCFTRcDNAは、Korman,A.J.ら、PNAS（USA）
84:2150−2154（1987）によって以前に記述されたレト
ロウイルスベクターにクローニングされた。PLJ−CFTR
と呼ばれるこの組換え体のプロウイルスは図1Aに描かれ
ている。図において説明されているこのベクターの重要
な構造成分は、ロングターミナルリピート配列（LT
R）、CFTRcDNA、SV40に由来する配列、G418（Neo）及び
pBR322（pBR）のための複製の起点が含まれている。
５′LTRからの転写は、ウイルスの継代とCFTRの発現の
原因である8.5kbゲノム転写物を造り出す。SV40配列か
らの転写は、Neoセレクタブルマーカーを発現する２番
目の転写単位の生成に導かれる。転写開始部位は、図1A
に示されてあり、５′LTRとインターナルSV40配列に矢
印がつけてある。制限酵素エンドヌレアーゼKpn IとHin
d IIIの認識部位も示されている。DNAとRNAブロット分
析において使用されたCFTR遺伝子（エキソン13）とNeo
遺伝子はベクターの下に示されている。
PLJとPLJ−CFTRのベクターのウイルスパッケージング
細胞系ΨCripへのトランスフェクションは、複製欠陥ウ
イルスの一過性の産生へと導かれた。ウイルスストック
の限界希釈法を用いてCFPAC−１細胞に感染させ、トラ
ンスデュースしたクローンを選択するためにG418の存在
下でその後培養した。一過性に産生されたPLJ−CFTRウ
イルスストックは、PLJベクターで産生されたものより
タイターが低かった（50−100倍）。細胞の10この個々
のクローンが各種のウイルス（PLJクローン１から10ま
で、及びPLJ−CFTRクローン１から10までと名ずけられ
た）で感染させ、感染体を単離し、分子分析と生理学的
分析にかけた。
トランスデュースされたクローンはレトロウイルスのCF
TR配列を発現する。
CFPAC−１のレトロウイルスでトランスデュースされ
たクローンをプロウイルス配列についてWilson,J.M.ら,
PNAS（USA）85;4421〜4425（1988）、及びWilson,J.M.
ら.,Science24B:1413−1416（1990）によって他の細胞
種について記述されたように分析された。CFPAC−１細
胞をPLJ、またはPLJ−CFTRで感染させ、各クローンを単
離するためにG418の存在下で選抜を行った。高分子量の
DNAを各クローンから単離し、図1Bに示されているよう
にゲルブロットハイブリッド法で分析した。図1Bの上の
パネルにおいて、DNAをKpn Iで消化し、フィルターをNe
o特異性プローブによつてハイブリッド形成させた。一
方下のパネルにおいては、DNAはHind IIIで消化し、フ
ィルターをエキソン13CFTR特異的プローブに対しハイブ
リッド形成を行わせた。すべてのレーンにおける4.3kb
バンドは、内性CFTR遺伝子から生ずる。試料には、CFPA
C−１ DNA（10μｇ）;7.5pg PLJ−CFTRプラスミドDNA
を補足したレーン“１コピー"CFPAC−１ DNA（10μ
ｇ）；レーン“CFPAC−1"−CFPAC−１ DNA（10μ
ｇ）、及びPLJ−CFTRクローン１から10までからのレー
ンズ“PLJ−CFTR1から10″−DNA（10μｇ）が含まれ
る、図の右の境にそって、分子の大きさのキロベースで
の標準が示されている。
ベクターLTRsにおいてユニークな部位を有する高分子
量のDNAを制限酵素Kpn Iで消化するとPLJ−CFTRプロウ
イルスの必須構成系のすべてを共通な8.5kb断片として
放出した。図1Bの上のパネルにおいて示されるように、
Kpn I制限酵素分野を受けたDNAのゲルブロットハイブリ
ッド形成により、転位していないプロウイルス配列が、
10/10のPLJクローン、及び9/10のPLJ−CFTRクローンに
おいて、期待された細胞あたり１コピーの存在量で明ら
かとなった。フィルターをNeo−特異的プローブでのハ
イブリッド形成によりPLJ−CFTRクローン２において著
しく転位したプロウイルスが検出された。このウイルス
は明らかにCFTRcDNAの主要な部分を欠失していた（デー
タは示されていない）。
各推定上のPLJ−CFTRクローンの複雑性と、ユニーク
さを研究するためのゲルブロット分析の結果は図1Bの下
のパネル中に示されている。高分子量のDNAを単離してP
LJ−CFTRにおいて２つの内部の部位を持つ制限酵素であ
るHind IIIで消化し、エキソン13CFTR特異的プローブで
分析した。図1Bのパネルにおいて図解されているよう
に、この分析により9/10のPLJ−CFTRクローンにおいて
単一でユニークな統合部位が証明された。CFTR特異的プ
ローブは、PLJ−CFTRクローン２からのDNAにおいては上
述の明らかな欠失のためにプロウイルスを検出できなか
った。
レトロウイルスでトランスデュースされたCFTR遺伝子
の発現は、CFTRエキソン13プローブを使用するCFPAC−
１クローンのRNAブロット分析によって研究され、図２
に示されている。レトロウイルスでトランスデュースさ
れたCFPAC−１細胞のクローンが単離されCFTRの転写物
の存在について分析した。全細胞性RNAを個々のクロー
ンから収穫し、図２の上のパネル中に示されるようにエ
キソン13CFTRを使用してフィルターとハイブリッド形成
を行いRNAブロット分析にかけた。図２の下のパネルに
は、フィルターをはがし、試料のローディングの変動に
ついてコントロールするためにヒトγ−アクチンcDNAか
ら由来したプローブで再度ハイブリッド形成を行なっ
た。RNAの試料（10μｇ）は以下の細胞由来であった：
レーンズ“T84"−結腸腫瘍細胞系T84からの２重の試
料；レーン“CFPAC−1"−トランスデュースされていな
いCFPAC−１細胞；レーン“PLJ6"−PLJ感染からのCFPAC
−１クローン＃6;及びレーンズ“PLJ−CFTR1から10"−P
LJ−CFTR感染からのCFPAC−１クローンの＃１から＃10
まで。図の左側の境に沿って、分子の大きさのキロベー
スでの基準が示されている。
図２において図解されているように、前に記述された
ヒト結腸腫瘍細胞系T84からの全細胞性RNAは内生CFTR転
写物の高いレベルを示した。まがいの感染をしたCFPAC
−１細胞におけるノーザン分析によってCFTR転写物は検
出されなかった。もしくはPLJクローンズ１から10まで
のCFTRRNAは、RNA−PCRによってCFPAC−１中に検出する
ことができる。ウイルスによって指向された期待された
大きさ（すなわち、8.5キロベース）のCFTRの転写物は9
/10のPLJ−CFTRクローンにおいて検出された。CFTRプロ
ーブは、欠失したプロウイルス（PLJ−CFTRクローン
２）を含むクローンからのRNAにおいて転写物を検出で
きなかった（PLJ−CFTRクローン２）。
トランスデュースされたクローンはforskolinによる陰
イオン輸送の促進を示す PLJとPLJ−CFTRクローンズを、cAMPとCa−促進陰イオ
ン輸送についてスクリーニングを行うためにアイソトー
プ陰イオン（125I）の流出を測定した。Venglarip C.J.
ら、Am.J.Physiol.259:C358−C364,（1990）によって記
述された流出検定により、Cl-チャンネル遮断薬の阻害
効果と125I流出に対する脱分極膜電位から判断されるよ
うにCl-分泌上皮細胞におけるアゴニストで刺戟されたC
l-電導経路の定量的推定が与えられる。図3Aには、PLJ6
とPLJ−CFTR6の２つのクローンにおいてアデニレートシ
クラーゼを活性化する薬剤であるforskolinを添加した
場合と添加しない場合の125I流出速度定数（ｒ）の経時
変化が示されている。10μＭのforskolinは図3Aに示さ
れた時間に加えられた。初めの60秒の流出物は細胞外
125Iの流出を許し、図示されていない（下記の実験プロ
トコール参照）。アゴニストの不在の基礎流出期間の後
（示されていない）、forskolinは、PLJ−CFTRクローン
６からの125I流出速度を0.32から0.70min-1へと増加し
た;PLJ6は応答しなかった。forskolin添加の前と、fors
kolin応答のピークを通じて得られたｒの値から、125I
流出（すなわちrforsk/rbasal）の相対的促進の推定値
が得られる。応答生のPLJ−CFTRクローンにおいては、
陰イオン流出に対するforskolinのピーク効果は、forsk
olin添加の後の最初の３つの流束期間を通じて観測され
た（15−45sec）ｎ＝７であったPLJ5を除き、平均±SEM
は、すべてのクローンに対してｎ＝９であった。
20のクローンから誘導されたデータは、図3B中に図解
されている。PLJおよびPLJ−CFTRクローン１−10におけ
る基礎125I流出に対するforskolin刺激比。ｒの値はfor
skolinの添加の前後に得られた。PLJ−CFTRクローン２
については、I.O.未満では同じ度盛が適用された。値は
平均±SEMであり;n＝７であったPLJ5を除きすべてのク
ローンについてｎ＝９であった。図3Bに図解されている
ように10のPLJ−CFTRクローンのうち７がforskolinに応
答して125I流出において有意な増加を示したが、対照PL
Jクローンのいずれもが（0/10）forskolinに応答しなか
った。親細胞系であるCFPAC−１も、Schoumacher,R.A
ら、PNAS（USA）87:4012−4016（1990）によって記述さ
れた如くforskolinまたはcAMP類縁体に対して応答を示
さない。PLJ−CFTRは、図1Bにおいて示された如くゲル
ブロット ハイブリッド形成によってそのCFTRcDNAに
おいて大きな欠失を示し、forskolinが125I流出を促進
できなかったことを説明した。７つの応答性のPLJ−CFT
Rクローンにおいては、forskolinによる陰イオン流出の
相対的促進は1.8から2.8倍の範囲であった。これは、Ve
nglarik、上述、によって結腸腫瘍細胞系T84について最
近報告された流出の3.5倍の促進と同等である。我々の
結果は、CFTRcDNAの発現は、CFPAC−１細胞に、cAMP−
応答性の陰イオン流出を付与することを示している。
PLJ−CFTRクローンのforskolin応答性とそのCFTRmRNA
レベルの間の相関は、図２と3Bの比較によって説明され
るようにあまり著しくはなかった。流出検定における最
善の応答者の３つは高いmRNAレベル（すなわち、PLJ−C
FTRクローン1,6,及び10を示した。しかし、その他の場
合では相関はそれ程良くなかった。例えば、クローン７
と８は、forskolinに対して約２倍の応答を示したが比
較的低いmRNAレベルを有し、クローン３と９は、容易に
検出できるCFTRmRNAの存在にもかかわらず低いforskoli
n応答を示した。
Ca++イオノフォアであるionomycinの添加により、す
べての対照とCFTRクローンズにおいて125I流出か増加し
た。イオノ／ベーサルの値は各群においてPLJでは平均1
4±２、PLJ−CFTR（ｎ＝20）では14±１であった；個々
のクローンの間では有意な差は検出されなかった。iono
mycinに対するPLJクローンズの応答の程度は、Schoumac
herら、上述（1990）によって野生型のCFPAC−１におい
て前に観測されたのと類似しており、Venglarikら上記
によって観測されたT84細胞の応答の約３倍である。Ca
++イオンフォアとCa−媒介アゴニストがCl-分泌を促進
できる能力は、健常者とCF患者の両者に由来する気道と
汗腺細胞について報告されている。Sato,K.ら,J.Clin.I
nvest.73:1763−1771（1984）;Frizzallら、上記、（19
86）;Willumsen,N.J.ら.,Am.J.Physiol.256;C226−C233
（1989）も参照のこと。CF細胞にこの応力があること
は、CFTRは、Ca−媒介Cl-輸送促進にとって必要ではな
いことが示唆される。PLJとPLJ−CFTRクローンズにおけ
るCa++による促進の程度において有意差が欠けているこ
とからCFTRは、Cl分泌を支配しているCa++−媒介調節経
路の活性を調節していないことが示唆される。
CFTRレトロウイルスでトランスデュースされたクローン
はCAMP−誘発Cl電流を示す。
図３のPLJ−CFTRクローンにおける陰イオン流出のcAM
P誘発増加が、Cliff,W.H.ら、PNAS（USA）87:4956−496
0（1990）によって記述されたCl-伝導経路の促進のため
であったかどうかを決定するために全細胞パス−クラン
プの記録が使用された。PLJ−CFTRクローン１の典形的
な応答は図4Aに示されており、５μＭのforskolinによ
る内方への電流の促進を図解されている。膜電位は、−
10mVに保持され、０と−84mVにパルス修正した。記録中
のギャップは、forskolin−誘発電流のイオン選択性を
決定するために浴溶液置換が行われた時間（６分）を表
している。Ｉ−Ｖ関係を決定するためのパルスプロトコ
ールは、図に示された時間において行われた。Cl-電流
は、−84mVへの電圧パルスによって作られた内方への電
流として測定された。内方への電流の同様な増加は、fo
rskolin（５μＭ）、またはcAMP（200から800μＭ）の
添加が、応答性細胞において内方向への電流を200±68P
Aから1690±495PAに増加したPLJ−CFTRクローン1,6及び
10からの13の細胞のうち11において観測された。この応
答の大きさはCliffら、上記、によってT84細胞において
観測されたものと比較して優位である。図4Bにおいて示
されているように、cAMP（400μＭ）、またはforskolin
（５μＭ）は、対照クローン、PLJ6（ｎ＝６）からの細
胞の膜電位を促進することはできなかった。膜電位は−
20mVに保たれ、0mVと−84mVへパルスした。同様な結果
がPLJクローンの６細胞のうち５細胞で得られた。125I
流出から観測されたようにionomycin（２μＭ）は、PLJ
（ｎ＝４）とPLJ−CFTR（ｎ＝３）のクローンの双方に
おいて内方向への電流を増加させた。
図4Cにおいて示されたように、NaCl浴、低Cl-浴、及
びNa+を含まない浴におけるforskolin誘発電流の即座電
流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係がPLJ−CFTRクローン１から得
られた。Forskolin−誘発電流は、刺戟の前後における
電流のディジタルな引き算によって得られた。図4Cに示
されている値は、電圧パルス開始の6msec後に記録され
た。これらのデータは、６分のレコーディングギャップ
の間に図4Aに示されているPLJ−CFTRクローン６の細胞
の記録から得られた。
図4Cにおいて図解されている如く、Cliffら、上記、
によってT84細胞において観測されたように、促進され
た電流のＩ−Ｖ関係は直線のようであった。電流は、同
じ浴とピペットを使用して決定された。Cl-濃度は0mVの
Cl平衡電位の近くで逆転された。浴のCl-を66mM（グル
タメート置換）に減少させると、外方への電流を減少さ
せ、電流のための逆転電位を＋6mVへとシフトさせた。
この値は、この外方に向けられたCl-グレーディエント
についてのCl-平衡電位（＋80mV）に近い値であった。
浴のNa+のＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（NMDG）による
置換はＩ−Ｖ関係を有意に変化させなかった。これらの
知見により、forskolin−刺戟電流はCl-選択性であり、
PLJ−CFTRクローンにおける陰イオン流出の促進はCl-伝
導経路の活性化のためであるということが示唆される。
実験操作手順 以下の実験操作手順が、上に明らかにされた具体例に
おいて使用された。： CFPAC−１の細胞は、Schoumacherら、上記、（1990）
によって以前に記述されている如く培養において維持さ
れた。；レトロウイルス感染のために使用された細胞は
72回の継代であった。CFPAC−１細胞の感染集団を、個
々のクローンを単離するためにG418（1mg/m）を含む
培地において選択した。トランスデュースされたCFPAC
−１の細胞は、選抜を行い、やがてクローンとして拡大
した。これは、プロウイルス配列、またはプロウイルス
発現の明かな喪失と結びつかなかった。両種指向性パッ
ケージング細胞系ΨCripは、Danos,O.ら、PNAS（USA）8
5:5460−6464（1988）によって記述されている如く10％
の仔牛血清とペニシリン／ストレプトマイシンを補添し
たOulbeccosの改変Eagleの培地中に維持された。
CFTRcDNAの構築 cDNAは、Riordanら、上記、によって記述されたよう
にオーバーラッピングクローン、10−１、T16−１およ
びT16−4.5を結合することによって構築された。10−１
とT16−１は、エキソン４におけるユニークなNru Ｉの
部位において結合され、エキソン１から13までにまたが
るその結果生じた構築物をT16−4.5に結合させた。これ
は、エキソン13からエキソン24と広がっているT16−4.5
のSac I−EcoR I部分消化生成物を５′13−エキソン構
築物のそれぞれの部位に挿入することによって行われ
た。これらの操作は、Riordanら、上述、によって以前
に記述されたように全コーディング配列を含む4.5キロ
ベースのクローンを生成した。これらの構築の企てから
生じた大抵のクローンでは、転位が大いに起きていた。
明らかに無傷の構築物の配列の決定にあたり、57bpの欠
失が、13bpディレクトリピートの２つのコピーの間にあ
るエキソン6bにおいて同定された。吟味したところ、こ
の間隔は、コンセンサス原核細胞性プロモーター配列を
含むことが認められた。このリピートを破壊する企てに
おいて、in vitroで突然変異生成によって、３つの単
一ヌクレオチドの変更が行われた。CFTR翻訳生成物に変
化を与えず、その結果安定な構築物を生ずる導入された
変化には、位置930におけるＴに対するＣ、933における
Ａに対するＧ、及び936におけるＴに対するＣの置換が
含まれる。改変された再構築CFTRプラスミドはCFTR4.6
と呼ばれる。
上述した変化は、933におけるＧ及び936におけるＣの
存在を除き、正常配列に対応するオリゴヌクレオチドの
合成によって生成した。CFTRcDNAの切片のアンチセンス
ストランドを１本鎖M13ファージにクローニングを行
い、Smith,M.,（1989）Annu.Re.Genet.19:423（1985）;
Sanbrook,J.,ら:Molecular cloning.A Laboratory Manu
al.2nd ed.,Cold Spring Harbor Press,15.51−15.80
（1989）によって記述された標準技術を使用してオリゴ
ヌクレオチドで突然変異を誘発させた。図６に示されて
いる結果として得られたクローンの配列を決定し、930
の位置に追加の予期されない塩基の変化が起きているこ
とが見出された。その変化もコードされた蛋白質に変化
を与えないサイレントヌクレオチドの位置にある。
本発明の実際においては、CFTRcDNAの全長を安定化さ
せる他の方法を使用することができることも考慮の価値
がある。図６に示されているエキソン6bにおける思いが
けないE.coliプロモーターにおける、CFTRのための正し
いアミノ酸配列を保持する一方、そのプロモーターを機
能不全にする改変はすべて同じゴールに到達する。例え
ば、図６においてアンダーラインを引いたCATACT配列の
突然変異生成は、アミノ酸配列（例えばCGTATT）を変化
させないが原核細胞性プロモーターとしての配列を不活
性化し、通常のクローニングベクターにおいて安定にす
るいくつかの方法において達成することができる。
レトロウイルスベクターと組換え体レトロウイルス 改変CFTRプラスミドをSac Iで消化すると、4.6kbの制
限断片上の改変CFTRcDNAが放出される。Sac Iの部位をB
cl I部位にオリゴヌクレオチドで変換し、リンカーが結
合した断片を、Kormanら、上記、によって前に記述され
たレトロウイルスベクターのPLJのBam I部位にクローニ
ングした。PLJ−CFTRと呼ばれる組換え体ベクターは図1
Aに提示されている。レトロウイルスベクターPLJとPLJ
−CFTRは、両種指向性ウイルスパッケージング細胞系Ψ
Cripへ記述されているようにトランスファーされた。一
過性に産生された両種指向性ウイルスを収穫するために
24時間後にトランスフェクトされたパッケージングを含
むプレートから組織培養の培地を取り除いた。
10cm2のプレート上に1:5に継代されたCFPAC−１細胞
を、ポリブレン（４μg/m）を補添したウイルスの上
清に12から16時間さらした。細胞が集密状態に達したと
き、細胞はG418（1mg/m）を含む培地に1:10で継代し
た。細胞のクローンが、単離され、拡大され、低温保存
された。
CFPAC−１クローンのDNAとRNA分析 高分子量DNAを記述されたようにCFPAC−１細胞から単
離し、Wilsonら、上記（1988）、によって記述されたよ
うにゲルブロットハイブリッド形成によって分析した。
全細胞性RNAを精製し、Wilsonら、上記（1988）、のRNA
ブロット分析にかけた。フィルターは、Feinberg,A.P.
ら、Anal.Biochem.132:6−13（1983）のランダムプライ
ミング法を使用して、高比活性まで標識された様々なDN
Aプローブでハイブリッド形成を行った。これらのプロ
ーブには:1）このエキソン（NT1900から2611）の境界に
横に接しているオリゴヌクレオチドを使用したクローニ
ングを行ったcDNAのPCR増幅の後単離されたCFTRのエキ
ソン13;2）pSV2NeOのHind IIIからNco I断片の960塩基
対上のNeo−特異的配列、及び３）ヒトγアクチンcDN
A。
陰イオン排出の測定 放射同位元素性陰イオン排出は、上記のVenglarikら
によって記述されたように定量した。手短かに述べれ
ば、細胞の単層は、125Iで30分間プレロードした;2回洗
浄した後、流出は、試料−置換操作を使用して15秒間隔
においてモニターした。実験の終りに、細胞の単層に残
っているトレーサーを0.1NHPO3で抽出した。各サンプリ
ング間隔についての流出速度定数（ｒ）は、以下の如く
計算された。:r＝〔1n（R1）−ln（R2）〕／（t1−
t2）、但し、R1とR2は時間（ｔ）１と２において単層中
に残っているロードされた125Iの百分率である。Forsko
lin、またはionomycinは、５番目の15秒のサンプリング
間隔の後に添加された。アゴニストによる促進の程度は
ragonist/rbasalとして表現される。但し、r
agonistは、アゴニストの存在において観測された最大
値であり、rbasalは、アゴニスト添加直前の流れ間隔か
らとられる。
細胞該125Iの大半の洗い出しは、上記のVenglarikら
によって明らかにされたように最初の60秒のサンプリン
グを通じて起り、この期間は、速度定数の計算において
無視された。しかし、細胞外隔室の洗出しは、細胞内隔
室よりも速いので、60秒後の細胞外空間からの小さい残
存流出は、アゴニスト応答の過少評価につながる。した
がって、forskolinに対する流出応答がないときは、for
skolinの添加直後に決定されたｒはforskolinが添加さ
れる前に測定されたよりも僅かに小さい。このことは、
rforbk/rbasalが図3Bにおいて示されているPLJクローン
において0.9と1.0の間にあるという知見の説明になる。
全細胞電流記録 巨視的電流は、上記のCliffらによって前に記述され
た方法によって全細胞パッチ−クランプを通じて記録さ
れた。記録は37℃で以下の溶液について行われた（m
M）；浴:115NaCl、40N−メチル−Ｄ−グルカミン（NMD
G）−グルタメート、5K−グルターメート、2MgCl2、1Ca
Cl2、10HEPES（pH7.2）；ピペット:115KCl、35NMDG−グ
ルタメート、0.25EGTA、0.09CaCl2（100nM遊離Ca++）、
2MgCl2、2Na2ATP、0.20Na2GTP、10HEPES（pH7.2）。膜
電位は３つの電圧において500msecの間交互にクランプ
した。そのうち２つは、Cl（0mV）、及び（84mV）のた
めの平衡電位に等しくなるように選ばれた。これによっ
て上記のCliffらによって記述されたように、アゴニス
ト応答の間にCl-とK+電流がモニターできるようにな
る。図4Cに示されているように、±100mVの間でクラン
プ電圧を20mVの増加においてステッピングを行うことに
よって電流−電圧の関係を決定するためにパルシングが
中断された。
例−II 膵臓及び肺上皮細胞のレトロウイルス媒介トランスダク
ション 種々の上皮細胞へのレトロウイルス媒介ジーントラン
スダクションは、E.coli1からのβ−ガラクトシダーゼ
を発現する複製欠陥レトロウイルスを使用して最適化さ
れた。ウイルス指令β−ガラクトシダーゼの発現は、ト
ランスデュースされた細胞を青色に染色する組織化学的
反応を使用してin situで検出できるので、これが使用
された。前に記述されている、β−ガラクトシダーゼ発
現BAGから作られた両種指向性ウイルスプロデューサー
細胞系がウイルスの源として使用された。このウイルス
産生細胞系はBAG5と呼ばれる。BAG5細胞の集密プレート
上の上清を収穫し、濾過して、以下に述べるように種々
の上皮細胞を感染させるのに使用した。
膵臓上皮細胞系 CFPAC−１は、CFの欠陥細胞的特徴（すなわち、cAMP
アゴニストの存在においてCl-チャンネルは活性化され
ない）を発現するCF患者の腺癌に由来した細胞系であ
る。CFPAC−１細胞を種々の希釈（1:2、1:5、1:10、及
び1:20）に分け、24時間後にポリブレン（４μg/m）
を補添した新鮮なウイルスの上清にさらした。12時間後
にウイルスを新鮮培地で置換した。集密状態になったと
き、細胞は、記述されているようにウイルス指令β−ガ
ラクトシダーゼの発現について分析した。最適の感染効
率は、感染の前日に1:5に分けたCFPAC−１細胞で得られ
た。最適条件下では、ウイルスに対する１回の暴露によ
ってβ−ガラクシダーゼ遺伝子の細胞の30−40％での安
定なトランスダクションへと導かれた。β−ガラクトシ
ダーゼの発現は培養細胞において２か月にわたって安定
であった。翌日以降の日々にCFPAC−１細胞を再感染さ
せる試みは、感染効率の増大には、ほとんどつながらな
かった。
気道上皮細胞 前に述べられているようにCFの肺の合併症は、通常、
その主要な疾患であり、生命に関わるので、気道上皮細
胞はジーントランスファーのための最も望ましい標的で
ある。Taussig、上記（1984）。気道上皮細胞は、組換
え体レトロウイルスで容易に感染されるので、先の及び
以下の例において記述されたジーントランスファーの試
みも、肺の場合のような気道上皮細胞に向けられた遺伝
子治療にとって有用である。
CF患者の気道に由来する上皮細胞が、レトロウイルス
−媒介ジーントランスファーの有力な標的として使用さ
れた。これらの細胞は以前に記述されており、T43細胞
と呼ばれた。収穫された新鮮なBAG5ウイルスにポリブレ
ンを補添し、24時間前に1:5に分けておいたT43細胞にさ
らした。細胞をウイルスに12−18時間さらし、集密状態
まで培養してから前に述べた生化学的検定を使用したウ
イルス指令のβ−ガラクトシダーゼの発現について分析
した。最適条件下では、CFPAC細胞の25％以上が、ウイ
ルスに１回暴露した後、β−ガラクトシダーゼ遺伝子で
安定にトランスデュースされた。
CFTR発現ベクターの気道上皮細胞への直接的配送 組換え体レトロウイルスの使用とCFの治療への１つの
試みは、気道へレトロウイルスを直接配送することによ
って、機能性CFTR遺伝子をin vivoにおける上皮細胞へ
導入することである。レトロウイルスの直接配送のため
にいくつかのアプローチをとることができる。より観血
的なアプローチは、患者の気道に挿管し、CFTRを発現す
るレトロウイルスの濃縮溶液で気道を洗浄することであ
る。安定なレトロウイルスの発現には、プロウイルスが
染色体のDNAに組込まれることが必要である。これは、
受容細胞が分裂しつつあるならば、最も効率的に起る。
ウイルスにさらした後、上皮細胞の再生を刺戟すること
が必要となると思われる。これは、気道の機械的、また
は化学的刺戟で達成できるであろう。
より手軽なアプローチは、気道上皮細胞へin vivoで
吸入することができる噴霧用製剤によって正常CFTR遺伝
子を配送することであろう。多くの異る薬理学的薬剤
は、噴霧剤処理によって、広い気道表面に効率的に配送
される。この方法によって達成される有益な作用は一過
性である可能性がある。したがって、薬剤を繰返し投与
することが必要であると思われる。直接遺伝子導入に使
用される遺伝子配送システムはウイルスに基ずかなくて
も良いと思われる。DNA蛋白質複合体、またはリポソー
ム中のDNA発現ベクターの直接的吸入は、レトロウイル
スよりも安全で、効果的遺伝子配送のシステムであると
思われる。
遺伝学的に改変した気道上皮細胞の移植 CFの体性遺伝子へのアプローチは、骨髄指向性遺伝子
治療に概念において類似している。我々は、CF患者から
気道上皮細胞を単離し、細胞における欠陥を正し、気道
をそれらの細胞で再び満たすことができるように遺伝学
的に改変した細胞を患者に移植することを提案する。気
道において、遺伝子学的に改変した細胞による効率的な
リポピュレーションを達成するためには、機械的、及び
化学的刺戟によって内生上皮細胞の打ち内の統合性を乱
すことが必要であると思われる。
代替遺伝子トランスファー配送システム CF欠損の遺伝学的訂正のための他の遺伝子の配送シス
テムも、本発明の範囲内に入る。これらの実験のために
は、プラスミドに基いたベクターが使用される。このよ
うなベクターの１例は、図７に指示されているBA−CFTR
BQである。これは、転写がアクチンフランキングシス
テムから開始され、異質３′ポリアデニレーションβ配
列から停止された単純な7762bpトランスファクションに
基いたベクターである。
本発明ベクターは以下の様に構築された。バックボー
ンはPC18からの配列（ヌクレオチド6928から4553）、チ
キンβアクチン遺伝子の５′フランキング領域（ヌクレ
オチド6928から7754）及びウシ生長ホルモンポリアデニ
レーションシグナルの３′フランキング配列（ヌクレオ
チド4827から4553）を含んでいた。全コーディング領域
にまたがり、前に論議された３つのヌクレオチドの変化
を含む全長のCFTR配列がSac IからSal1断片上のベクタ
ーCFTRから除去され、上に記述したベクターバックボー
ンへとクローニングした。
このベクターは、いくつかの配送システムにおいて使
用されるであろうことは、この分野の技術に熟達した人
人によって評価される。
リポフェクション 前に記述した手順操作はDNAリポソームのエンキャプ
シデーションに基いている。細胞が、リポソームととも
にインキュベートされると、それらはDNAを取り込み、
それを発現する。我々は発現ベクターのDNAとリピッド
（DOTMA）をHepes緩衝化食塩水中1.5mへ希釈し、これ
らの成分を混合してリピドーDNA複合物を形成すること
を提案した。それからそのリポソームを使用し、挿管し
た患者を溶液を含むリポソームで洗浄するか、吸入によ
ってリポソームを投与することによってin vivoで気道
細胞をトランスフェクトできた。
DNA−蛋白質複合体 標的を定めた遺伝子配送への代替アプローチは、DNA
蛋白質複合体の生成による。この型のジーントランスフ
ァー基質は以下のように構築された。呼吸上皮細胞上の
受容体のためのポリペプチドリガンドを、記述されたよ
うにエチリデンジアミノカルボジイミドでポリリジンに
結合させる。この蛋白質結合物を、等しい質量の蛋白質
結合体と0.25M食塩溶液中のDNAを混合することによって
トランスフェクションベクターのDNAと複合体形成を行
わせる。本DNA/蛋白質複合体は、呼吸系気道細胞によっ
て取込まれ、その遺伝子が発現される。これは、リポソ
ームに関して記述されたアプローチを使用して、CFTR遺
伝子をin vivoで気道上皮細胞へ直接配送するのに使用
することが出来るであろう。
本発明の多くの改変と変形を、その精神と範囲を逸脱
することなく行うことができることは明らかである。本
出願において記述された具体的態様は、例を示すためだ
けに与えられており、発明は、添えられた特許請求の範
囲によってのみ制限される。
フロントページの続き (72)発明者 ウィルソン，ジェームズ，エム. アメリカ合衆国19035 ペンシルヴァニ ア州オラドウィン，エヌ． アヴィニョ ン ドライブ 1350 (72)発明者 ツィ，ラプ−チィー カナダ国 オンタリオ州トロント，パー ク マナー ドライブ 19 (72)発明者 ロメンス，ヨハンナ，エム カナダ国 オンタリオ州トロント，ベイ ストリート 717，アパートメント 1501 (72)発明者 ドラム，ミッチェル，エル. アメリカ合衆国44141 オハイオ州ブレ ックスビル，ボックスエルダー ドライ ブ 4046 (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ，245（1989）ｐ. 1066−1073 Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，38［２］（1990 Ｍａｙ）ｐ．444Ａ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，84（1987）ｐ．1055−1059 ＦＥＳＥＢ Ｊ．，４［10］（1990 Ａｕｇ）ｐ．2769−2717

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】上皮細胞におけるクロリドイオン輸送を増
    大させるための組換え体ウイルスベクターであって、同
    ベクターは （ａ）その部分が上記細胞に感染することができるウイ
    ルスのゲノムの少なくとも１部のDNAまたは少なくとも
    １部に対応するDNA;及び、 （ｂ）同DNAに有効に結合し、in vivoまたはin vitro
    で同細胞において発現ができる正常なアミノ酸配列をコ
    ードし、原核細胞性プロモーターとはならないようにサ
    イレント突然変異された嚢胞性線維症の膜横断レギュレ
    ーター（CFTR）遺伝子を、含む、組換え体ウイルスベク
    ター。
  2. 【請求項２】ウイルスがレトロウイルスである請求の範
    囲第１項の組換え体ベクター。
  3. 【請求項３】レトロウイルスゲノムが複製欠陥である請
    求の範囲第２項の組換え体ベクター。
  4. 【請求項４】さらにpLJを含む請求の範囲第２項の組換
    え体ベクター。
  5. 【請求項５】ベクターのプロウイルスが実質的に図1Aに
    示されている如くである請求の範囲第４項の組換え体ベ
    クター。
  6. 【請求項６】上皮細胞が膵臓の細胞である請求の範囲第
    １項の組換え体ベクター。
  7. 【請求項７】上皮細胞が気道上皮細胞である請求の範囲
    第１項の組換え体ベクター。
  8. 【請求項８】上皮細胞が、汗腺、腸、肝臓、及び腎臓の
    細胞からなるグループから選ばれる請求の範囲第１項の
    組換え体ベクター。
  9. 【請求項９】サイレント突然変異が、CFTR cDNA配列の
    ヌクレオチド位930におけるシトシン、CFTR cDNA配列
    のヌクレオチド位933におけるグアニンおよびCFTR cDN
    A配列のヌクレオチド位936におけるシトシンの存在から
    なる請求の範囲第１項の組換え体ベクター。
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