JP2009528985A - ｔｒｋＢアゴニストを投与することにより望まれない体重減少または摂食障害を治療する方法 - Google Patents

ｔｒｋＢアゴニストを投与することにより望まれない体重減少または摂食障害を治療する方法

Info

Publication number
JP2009528985A
JP2009528985A JP2008552918A JP2008552918A JP2009528985A JP 2009528985 A JP2009528985 A JP 2009528985A JP 2008552918 A JP2008552918 A JP 2008552918A JP 2008552918 A JP2008552918 A JP 2008552918A JP 2009528985 A JP2009528985 A JP 2009528985A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
trkb
antibody
human
bdnf
agonist
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2008552918A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2009528985A5 (ja
Inventor
チア−ヤング リン ジョン
ローゼンタール アーノン
レネエ ストラットン ジェニファー
Original Assignee
ライナット ニューロサイエンス コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ライナット ニューロサイエンス コーポレイション filed Critical ライナット ニューロサイエンス コーポレイション
Publication of JP2009528985A publication Critical patent/JP2009528985A/ja
Publication of JP2009528985A5 publication Critical patent/JP2009528985A5/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本発明は、ｔｒｋＢアゴニストの末梢投与により、望まれない体重減少（悪液質および加齢に伴うものなど）、摂食障害（神経性食欲不振など）、またはオピオイド誘導性嘔吐症を治療する方法に関する。本発明は、ｔｒｋＢアゴニストを含む組成物およびキットにもまた関する。
【図１】

Description

本発明は、望まれない体重減少、摂食障害、またはオピオイド誘導性嘔吐症の治療および／または予防におけるｔｒｋＢアゴニストの使用に関する。
ニューロトロフィンは、小型ホモ二量体タンパク質のファミリーであり、このタンパク質は、神経系の発生および維持に重要な役割を果たす。ニューロトロフィンファミリーのメンバーには、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）、ニューロトロフィン６（ＮＴ−６）、およびニューロトロフィン７（ＮＴ−７）が含まれる。ニューロトロフィンは、他のポリペプチド性成長因子に類似して、細胞表面受容体と相互作用することによりその標的細胞に影響する。現在分かっていることによると、２種類の膜貫通糖タンパク質が、ニューロトロフィンに対する受容体として作用する。ニューロトロフィン応答性神経細胞は、２×１０−９ＭのＫＤでＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５と結合する、ｐ７５ＮＴＲまたはｐ７５としても公知である共通の低分子量（６５〜８０ｋＤａ）低親和性受容体（ＬＮＧＦＲ）と、ｔｒｋファミリーの受容体型チロシンキナーゼのメンバーである、高分子量（１３０〜１５０ｋＤａ）高親和性（１０−１１Ｍ範囲のＫＤ）受容体とをもつ。Ｔｒｋ受容体ファミリーの同定されたメンバーは、ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、およびｔｒｋＣである。
ＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５は、両方共に類似の親和性でｔｒｋＢおよびｐ７５ＮＴＲ受容体に結合する。しかし、ＮＴ−４／５突然変異マウスおよびＢＤＮＦ突然変異マウスは、極めて対照的な表現型を示す。ＮＴ−４／５−／−マウスは生存可能で、繁殖性であり、軽度の感覚欠損を有するだけであるが、ＢＤＮＦ−／−マウスは、重症の神経細胞欠損および行動症状を有して、出生初期に死亡する。Ｆａｎら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３（４）：３５０〜７、２０００；Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ ３７５：２３８〜２４１、１９９５；Ｃｏｎｏｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３７５：２３５〜２３８、１９９５；Ｅｒｎｆｏｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：１４７〜１５０、１９９４；Ｊｏｎｅｓら、Ｃｅｌｌ ７６：９８９〜９９９、１９９４。いくつかの刊行物は、ＮＴ−４／５およびＢＤＮＦが、ｉｎ ｖｉｖｏで別個の生物学的活性を有すると報告し、この別個の活性が、ＮＴ−４／５およびＢＤＮＦによるｔｒｋＢ受容体およびその下流のシグナル伝達経路の差次的活性化に部分的に起因するおそれがあると示唆している。Ｆａｎら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３（４）：３５０〜７、２０００；Ｍｉｎｉｃｈｉｅｌｌｏら、Ｎｅｕｒｏｎ．２１：３３５〜４５、１９９８；Ｗｉｒｔｈら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１３０（２３）：５８２７〜３８、２００３；Ｌｏｐｅｚら、発表番号３８．６、２００３年要旨集、Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ。
ＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５は、Ｃ５７ｄｂ／ｄｂマウスなどのＩＩ型糖尿病モデル動物において血中グルコースおよび血中脂質の制御活性ならびに抗肥満活性を有することが示された。米国特許第６，３９１，３１２号；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ４９：１２９〜３３（２０００）；米国特許出願公開第２００５／０２０９１４８号；ＷＯ２００５／０８２４０１。ＢＤＮＦは、高脂肪食を給餌されたマウスにおいて抗肥満活性およびレプチン抵抗性の回復活性を有することもまた示された。米国特許出願公開第２００３／００３６５１２号。Ｋｅｒｎｉｅらは、ＢＤＮＦ遺伝子の発現が低減したヘテロ接合性ＢＤＮＦノックアウトマウスにおいて、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４／５が摂食行動および肥満を一時的に後退させることができたと報告した。Ｋｅｒｎｉｅら、ＥＭＢＯ Ｊ．１９（６）：１２９０〜３００、２０００。ヒトｔｒｋＢに対するＹ７２２Ｃ置換というｄｅ ｎｏｖｏミスセンス突然変異が、受容体のリン酸化およびＭＡＰキナーゼへのシグナル伝達の障害を招くこと、ならびにこの突然変異が過食性肥満という独特なヒト症状を招くと思われることが報告された。Ｙｅｏら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：１１８７〜１１８９（２００４）。
肥満を有する人々および神経性食欲不振を有する患者におけるＢＤＮＦの循環レベルが研究された。Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら、Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍａｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６６：７４４〜７４８、２００４；Ｎａｋａｚａｔｏら、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ５４：４８５〜４９０、２００３。マウスにおけるＢＤＮＦ産生障害は摂食増加、エネルギー消費の低減、および体重増加と関連したという研究成果に基づく推測とは反対に、循環ＢＤＮＦは、神経性食欲不振の患者では有意に低減し、非肥満健常対照に比べて肥満対象で有意に増加する。神経性食欲不振では、ＢＤＮＦ低減は、摂食を促進することにより、負のバランスを導く患者の行動変更を相殺しようとし、肥満では、ＢＤＮＦのレベル増加は、エネルギー消費を刺激し、食物摂取を減少させることにより、正のエネルギー不均衡状態に対抗する適応メカニズムとなりうると仮定されている。Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら、Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍａｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６６：７４４〜７４８、２００４。
本明細書に引用するすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個別に、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれていることが示されたかの如く、それと同程度に、そのようにこれによって参照により組み込まれている。
本発明は、ｔｒｋＢ選択的アゴニストを含めたｔｒｋＢアゴニストの末梢投与により、体重および／または摂食を増加させる方法を提供する。これらの方法は、望まれない体重減少（悪液質または加齢に伴うものなど）、摂食障害（神経性食欲不振など）、およびオピオイド誘導性嘔吐症を治療または予防するために用いることができる。
一態様では、本発明は、霊長類における体重を増加させる方法を提供し、その方法は、その霊長類に有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む。
別の態様では、本発明は、霊長類における摂食を増加させる方法を提供し、その方法は、その霊長類に有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む。
別の態様では、本発明は、霊長類における悪液質を治療または予防する方法を提供し、その方法は、その霊長類に有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む。
別の態様では、本発明は、霊長類における悪液質を回復させるか、その発生率を低減するか、またはその発生もしくは進行を遅延させる方法を提供し、その方法は、その霊長類に有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む。
別の態様では、本発明は、霊長類における望まれない体重減少を治療する方法を提供し、その方法は、その霊長類に有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む。
別の態様では、本発明は、霊長類における望まれない体重減少を回復させるか、その発生率を低減するか、またはその発生もしくは進行を遅延させる方法を提供し、その方法は、その霊長類に有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む。
別の態様では、本発明は、霊長類における神経性食欲不振を治療または予防する方法を提供し、その方法は、その霊長類に有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む。
別の態様では、本発明は、霊長類における神経性食欲不振を回復させるか、その発生率を低減するか、またはその発生もしくは進行を遅延させる方法を提供し、その方法は、その霊長類に有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む。
別の態様では、本発明は、個体におけるオピオイド誘導性嘔吐症を治療または予防する方法を提供し、その方法は、その個体に有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む。
別の態様では、本発明は、個体におけるオピオイド誘導性嘔吐症を回復させるか、その発生率を低減するか、またはその発生もしくは進行を遅延させる方法を提供し、その方法は、その個体に有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む。
ｔｒｋＢアゴニストは末梢投与される。例えば、ｔｒｋＢアゴニストは、以下の手段、すなわち静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腸管外、吸入経由、動脈内、心臓内、脳室内、および経皮的のうちの１つにより投与することができる。
いくつかの実施形態では、その個体は霊長類である。いくつかの実施形態では、その霊長類はヒトである。
本明細書に記載する方法に使用することができるｔｒｋＢアゴニストには、非限定的に、ＢＤＮＦポリペプチド、ＮＴ−４／５ポリペプチド、および抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、ｔｒｋＢアゴニストはヒトＮＴ−４／５である。いくつかの実施形態では、ｔｒｋＢアゴニストはヒトＢＤＮＦである。他の実施形態では、ｔｒｋＢアゴニストは、ｔｒｋＢ選択的な抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体を含めた抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、抗ｔｒｋＢ抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。
別の態様では、本発明は、ｔｒｋＢ選択的アゴニストを含めた有効量のｔｒｋＢアゴニストと、薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、本明細書に記載する任意の疾患を治療または予防するために使用することができる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載する任意の方法に使用するためのｔｒｋＢアゴニストを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、容器と、薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせた有効量のｔｒｋＢアゴニストを含む組成物と、本明細書に記載する任意の方法にその組成物を使用するための説明書とを含む。
別の態様では、本発明は、受容体と特異的に結合してその受容体を活性化するアゴニストモノクローナル抗体を作製する方法もまた提供し、その方法は、（ａ）その受容体の細胞外ドメインを含む免疫原性分子を宿主哺乳動物に約１５日以内に少なくとも２回注射することにより、その哺乳動物を免疫処置するステップを含む。この方法は、免疫処置した哺乳動物由来のリンパ球を不死化細胞系と融合させて、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生させるステップ、モノクローナル抗体を分泌させる条件でハイブリドーマを培養するステップ、および受容体と結合してそれを活性化させるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを選択するステップをさらに含むことがある。いくつかの実施形態では、受容体は、活性化のために二量体化を必要とする受容体である。
本発明は、望まれない体重減少（悪液質または加齢に関連するものなど）、摂食障害（神経性食欲不振など）、およびオピオイド誘導性嘔吐症を治療または予防する方法を提供し、その方法は、個体または対象にｔｒｋＢアゴニストを投与することを含む。
Ｉ．一般的な技術
本発明の実施は、特に示さない限り、当技術分野の技術の範囲内に入る分子生物学（組換え技術を含める）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を使用する。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などの文献に十分に説明されている。
ＩＩ．定義
本明細書に使用する「治療」は、有益な、または所望の臨床的結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益な、または所望の臨床的結果には、非限定的に、以下、すなわち疾患に関連する１つまたは複数の症状の改善、重症度の軽減、緩和のうちの１つまたは複数が含まれる。例えば、悪液質および／または望まれない体重減少の治療について、有益な、または所望の臨床的結果には、非限定的に以下、すなわち体重減少、脂肪分解、筋肉および内臓タンパク質の減少、食欲不振（食欲減退）、摂食／カロリー摂取の低減、慢性嘔気、疲労、および脱力のうちの任意の１つまたは複数の任意の改善、重症度の軽減、および／または緩和が含まれる。神経性食欲不振の治療のために、有益な、または所望の臨床的結果には、非限定的に、以下、すなわち食欲の改善、食物に対する恨みの減弱、体重増、正常な栄養状態、水分および電解質バランスの維持、年齢および身長に対して正常な体重の維持、入院の回数および期間の低減、ならびに死亡リスクの低減のうちの任意の１つまたは複数が含まれる。オピオイド誘導性嘔吐症の治療のために、有益または所望の臨床的結果には、非限定的に、悪心および／または嘔吐の重症度の軽減および／または期間の短縮によって、オピオイドに誘導される鎮痛の完全な臨床的利益を可能にすることが含まれる。
疾患またはその疾患の１つもしくは複数の症状を「回復させること」とは、ｔｒｋＢアゴニストを投与しないことに比べて疾患に関連する１つまたは複数の症状を軽減または改善することを意味する。「回復させること」には、症状の期間の短縮または低減もまた含まれる。
疾患の「発生率を低減すること」は、重症度の低減（この状態のために一般に使用される他の薬物および／または治療法（への例えば曝露）の必要性および／または量の低減が含まれることがある）、期間の低減、および／または回数低減（例えば個体における次の偶発性発作までの時間の遅延または増加を含める）のうちの任意のものを意味する。当業者に理解されるように、個体は、治療に対するその応答に関して変動することがあり、それとして、例えば個体における疾患の発生率を低減する方法は、ｔｒｋＢアゴニストの投与が、特定の個体における発生率のそのような低減を引き起こす見込みがありうるという合理的な期待に基づいてｔｒｋＢアゴニストを投与することを反映している。
本明細書に使用する、疾患の発生を「遅延させること」は、疾患の進行を、延期、妨害、減速、遅滞、安定化、および／または延期することを意味する。この遅延は、その疾患の履歴および／または治療されている個体に応じて様々な時間でありうる。当業者に明らかなように、十分または有意な遅延は、その個体が疾患（例えば、悪液質、神経性食欲不振、およびオピオイド誘導性嘔吐症）を発生しない点で事実上予防を包含することがある。症状の発生を「遅延させる」方法は、この方法を使用しないことに比べた場合に、所与の時間枠で症状の発生の確率を低減し、かつ／または所与の時間枠で症状の程度を低減する方法である。そのような比較は、典型的には、統計的に有意な数の対象を使用した臨床試験に基づく。
疾患の「発生」または「進行」は、障害の最初の出現および／またはその後の進行を意味する。疾患の発生は、検出可能なことがあり、そのため当技術分野で十分に公知の標準的な臨床技術を用いて評定されることがある。しかし、発生は、検出不能でありうる進行もまた表す。本発明の目的のために、発生または進行は、症状の生物学的経過を表す。「発生」には、出現、再発、および発症が含まれる。本明細書に使用する、疾患の「発症」または「出現」には、最初の発症および／または再発が含まれる。
本明細書に使用する、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、有益な、または所望の結果をもたらすために十分な量である。予防的使用に関して、有益な、または所望の結果には、疾患の生化学的、組織学的、および／または行動的症状、その合併症、ならびに疾患の発生時に現れる中間の病理学的表現型を含めた疾患のリスクを排除もしくは低減すること、重症度を軽減すること、または始まりを遅延させることなどの結果が含まれる。治療的使用に関して、有益な、または所望の結果には、疾患の攻撃の強度、期間、もしくは回数を低減すること、ならびに疾患の合併症および疾患の発生時に現れる中間の病理学的表現型を含めた（生化学的、組織学的、および／または行動的）疾患に起因する１つもしくは複数の症状を減少させること、その疾患を患っている者の生活の質を上げること、その疾患を治療するために必要な他の薬物療法の用量を減少させること、別の薬物療法の効果を高めること、および／または患者の疾患の進行を遅延させることなどの臨床結果が含まれる。有効投与量は、１回または複数回の投与で施すことができる。本発明の目的のために、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、直接的または間接的のいずれかで予防または治療的処置を達成するために十分な量である。臨床的状況で理解されているように、有効投与量の薬物、化合物、または医薬組成物は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と共に達成されることもあるし、達成されないこともある。したがって、「有効投与量」は、１つまたは複数の治療剤を投与する状況で考慮することができ、１種または複数の他の薬剤と共に、所望の結果が達成できるか、または達成されるならば、単一の薬剤を、有効量で与えることを考慮することができる。
「個体」または「対象」は、哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。哺乳動物には、非限定的に、農用動物、スポーツ用の動物、霊長類（ヒトを含める）、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットもまた含まれる。
「ｔｒｋＢアゴニスト」は、ｔｒｋＢ受容体および／またはｔｒｋＢシグナル伝達機能により仲介される下流の経路に結合し、それを活性化することができる薬剤を表す。例えばアゴニストは、ｔｒｋＢ受容体の細胞外ドメインに結合することがあり、それによって受容体の二量体化を引き起こし、細胞内触媒性キナーゼドメインの活性化を招くことがある。その結果、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで受容体を発現している細胞の生育および／または分化の刺激を招くことがある。いくつかの実施形態では、ｔｒｋＢアゴニストは、ｔｒｋＢに結合してｔｒｋＢの生物学的活性を活性化する。
本発明のｔｒｋＢアゴニストと共に使用する場合の「生物学的活性」は、概してｔｒｋＢ受容体および／またはｔｒｋＢシグナル伝達機能により仲介される下流の経路に結合し、それを活性化する能力を有することを表す。本明細書に使用する「生物学的活性」は、ｔｒｋＢの天然由来のリガンドであるＮＴ−４／５および／またはＢＤＮＦがｔｒｋＢ発現細胞に及ぼす作用により誘導されるエフェクター機能と共通する１つまたは複数のエフェクター機能を包含する。限定することなく、生物学的活性には、以下、すなわちｔｒｋＢに結合し、それを活性化する能力、ｔｒｋＢ受容体の二量体化を促進する能力、細胞（損傷した細胞を含める）、特に末梢（交感、感覚、運動、および腸管）神経細胞、および中枢（脳および脊髄）神経細胞を含めたｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ神経細胞、ならびに非神経細胞、例えば末梢血白血球、内皮細胞、および血管平滑筋細胞の発生、生存、機能、維持、および／または再生を促進する能力のうちの任意の１つまたは複数が含まれる。特に好ましい生物学的活性は、末梢に投与した場合に、霊長類における体重および／もしくは摂食を増加させる能力、霊長類における悪液質および神経性食欲不振の１つもしくは複数の症状を治療（予防を含める）する能力、ならびに／または哺乳動物におけるオピオイド誘導性嘔吐症の１つもしくは複数の症状を治療（予防を含める）する能力である。
「アゴニスト抗ｔｒｋＢ抗体」（相互交換可能に「抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体」と称される）は、ｔｒｋＢ受容体および／またはｔｒｋＢシグナル伝達機能により仲介される下流の経路に結合し、それを活性化することができる抗体を表す。例えば、アゴニスト抗体は、ｔｒｋＢ受容体の細胞外ドメインに結合することによって、その受容体の二量体化を引き起こし、細胞内触媒性キナーゼドメインの活性化を招くことができる。その結果、これは、受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで発現している細胞の生育および／または分化の刺激を招くことができる。いくつかの実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＢ抗体は、ｔｒｋＢに結合し、ｔｒｋＢの生物学的活性を活性化する。
本明細書に使用する「末梢投与」または「末梢に投与される」は、中枢神経系（ＣＮＳ）または血液脳関門（ＢＢＢ）の外側から対象に薬剤を導入することを表す。末梢投与は、脊椎または脳への直接投与以外の任意の投与経路を包含する。末梢投与は局所または全身性でありうる。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に局在する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書に使用するとき、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を包含するだけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体の部分を含む融合タンパク質（ドメイン抗体など）、および抗原認識部位を含む、免疫グロブリン分子の他の任意の修正された立体配置もまた包含する。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体が含まれ、その抗体は任意の特定のクラスである必要はない。抗体重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り付けることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。これらの異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニットの構造および三次元立体配置は、十分に公知である。
本明細書に使用する「モノクローナル抗体」は、実質的に相同な抗体集団から得られた抗体を表し、すなわち、その集団を構成する個別の抗体は、少量存在しうる、可能な、天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対しており、高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体が典型的には含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する。修飾語「ポリクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法により抗体を産生することを必要とするとみなしてはならない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法により作ることができるし、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたような組換えＤＮＡ法により作ることもできる。モノクローナル抗体は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４に記載された技術を使用して作製されたファージライブラリーから単離することもまたできる。
本明細書に使用する「ヒト化」抗体は、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列を含有するその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である非ヒト（例えばマウス）抗体の形態を表す。通例、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および生物学的活性を有する、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にもみられないが、抗体の性能をさらに洗練および最適化するために含められた残基を含むことがある。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的にすべてを含むものである。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリンの定常領域または定常ドメイン（Ｆｃ）の、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域または定常ドメイン（Ｆｃ）の少なくとも部分もまた含むものである。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されているように修飾されたＦｃ領域を有することがある。他の形態のヒト化抗体は、本来の抗体に関して変更されている１つまたは複数（１、２、３、４、５、および６つ）のＣＤＲを有し、そのＣＤＲは、本来の抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲ「から誘導された」１つまたは複数のＣＤＲとも称される。
本明細書に使用する、「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、かつ／または当技術分野で公知であるか、もしくは本明細書に開示するヒト抗体を作るための任意の技術を使用して作られた抗体を意味する。このヒト抗体の定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。そのような一例は、マウス軽鎖ポリペプチドおよびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。一実施形態では、ヒト抗体は、ファージライブラリーがヒト抗体を発現する場合には、そのファージライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０９〜３１４；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、ＰＮＡＳ、（ＵＳＡ）９５：６１５７〜６１６２；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１）。ヒト抗体は、トランスジェニック動物に、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによってもまた作ることができる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、および第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生する不死化ヒトＢリンパ球により調製することができる（そのようなＢリンパ球は、個体から回収することもできるし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫処置されていることもある）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を、単独または組合せのいずれかで表す。重鎖および軽鎖の可変領域は、超可変領域としても公知の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からそれぞれなる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して繋がり合って、もう一方の鎖由来のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するために、（１）種相互の配列変動性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、（第５版、１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセスダ））、および（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜９４８））の少なくとも２つの技術がある。本明細書に使用するＣＤＲは、一方のアプローチまたは両方のアプローチの組合せのいずれかによって規定されるＣＤＲを表すことがある。
抗体の「定常領域」は、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を、単独または組合せのいずれかで表す。
抗体またはポリペプチドに「優先的に結合する」か、または「特異的に結合する」（本明細書において相互交換可能に使用される）エピトープは、当技術分野で十分に理解された用語であり、そのような特異的または優先的結合を決定する方法もまた、当技術分野で十分に公知である。分子が代替の細胞または物質と反応または関連するよりも、高頻度に、迅速に、長い継続時間で、かつ／または大きな親和性で、その分子が特定の細胞または物質と反応または関連するならば、その分子は、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体が他の物質に結合するよりも、大きな親和性、アビディティーで、より容易に、かつ／またはより長い継続時間で、その抗体が結合するならば、その抗体は、標的に「特異的に」結合または「優先的に」結合または「選択的に」結合する。例えば、ｔｒｋＢエピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、それが他のｔｒｋＢエピトープまたは非ｔｒｋＢエピトープに結合するよりも、大きな親和性、アビディティーで、より容易に、かつ／またはより長い継続時間で、このエピトープと結合する抗体である。この定義を読むことによって、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的または優先的に結合することもあるし、結合しないこともあることもまた理解されている。それとして、ｔｒｋＢへの抗体の「特異的」結合または「優先的」結合または「選択的」結合は、必ずしも排他的結合を必要としない（がそれを含むこともある）。必然的ではなく概して、選択的ｔｒｋＢ結合の言及は、優先的結合（例えば、他の受容体に比べてｔｒｋＢに対して少なくとも３分の１、５分の１、または好ましくは少なくとも１０分の１もしくは１００分の１の濃度のＩＣ５０を有する結合）を意味する。
用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然由来配列のＦｃ領域または変異Ｆｃ領域のことがある。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動するおそれがあるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸びると定義される。Ｆｃ領域の残基の付番は、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの付番である。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセスダ、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に２つの定常ドメインであるＣＨ２およびＣＨ３を含む。
本明細書に使用する「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するものである。好ましいＦｃＲは、天然由来配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲ（γ受容体）であり、それには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶサブクラスの受容体が、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングされた形態を含めて含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体」）が含まれ、これらの受容体は、その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４；ｄｅ Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら、２００５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：２〜４に総説されている。「ＦｃＲ」には、胎児への母体ＩｇＧの輸送を担う新生児型受容体であるＦｃＲｎもまた含まれる。（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７；およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。
「補体依存性細胞傷害作用」および「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを表す。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）に補体系第１成分（Ｃ１ｑ）が結合することによって開始する。補体活性化を評定するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６）に記載されているＣＤＣアッセイを行うことができる。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然由来配列のＦｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能をもつ。「エフェクター機能」の例には、Ｃ１ｑの結合、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体の結合、抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体（ＢＣＲ））のダウンレギュレーションなどが含まれる。そのようなエフェクター機能は、一般にＦｃ領域が結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と結合していることが必要であり、そのような抗体エフェクター機能を評価するために当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評定することができる。
「天然由来配列のＦｃ領域」は、自然界でみられるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然由来配列のＦｃ領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含むが、天然由来配列のＦｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能をなお保持する。好ましくは、変異Ｆｃ領域は、天然由来配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域に比べて、天然由来配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１個から約１０個のアミノ酸置換、および好ましくは約１個から約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書における変異Ｆｃ領域は、天然由来配列のＦｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくはそれと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性をもつ。
本明細書に使用する「抗体依存性細胞性細胞傷害作用」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現している非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在性反応を表す。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているアッセイのようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを用いて評定することができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞が含まれる。あるいはまたは追加的に、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓら、１９９８、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９５：６５２〜６５６に開示されているモデルのような動物モデルでｉｎ ｖｉｖｏ評定することができる。
本明細書に使用する「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」には、活性成分と組み合わせた場合に、その成分に生物学的活性を保持させ、対象の免疫系と反応しない任意の物質が含まれる。例には、非限定的に、リン酸緩衝溶液、水、油／水型乳剤などの乳剤、および様々な種類の湿潤剤などの任意の標準的な医薬担体が含まれる。エアロゾルまたは腸管外投与用の好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液または普通の（０．９％）生理食塩水である。そのような担体を含む組成物は、十分に公知の従来法により製剤される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルベニア州イーストン、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００参照）。
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において相互交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸ポリマーを表す。このポリマーは、直鎖または分岐であってよく、修飾アミノ酸を含んでよく、非アミノ酸により分断されてもよい。この用語は、天然に修飾された、または介入により、例えばジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成要素とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾により修飾されたアミノ酸ポリマーもまた包含する。同様にこの定義に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば非天然アミノ酸などを含める）を含有するポリペプチド、および当技術分野で公知の他の修飾である。本発明のポリペプチドが抗体に基づくことから、そのポリペプチドは、一本鎖または関連した鎖として存在することがあることが理解されている。
本明細書において相互交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを表し、これには、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、あるいはＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーに組み込むことができる任意の基質でありうる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそのアナログなどの修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。存在するならば、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの集合前または集合後に加えられてよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素により分断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素とのコンジュゲーションによるなどのポリマー化後にさらに修飾することができる。他の種類の修飾には、例えば、「キャップ」、１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドのアナログへの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結を有するもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電連結を有するものなど（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分を含有するもの、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）など、介入物を有するもの（例えばアクリジン、ソラーレンなど）、キレート剤を含有するもの（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属など）、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結を有するものなど（例えばα−アノマー核酸など）、および未修飾形態のポリヌクレオチドが含まれる。さらに、糖に通例存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホネート基、ホスフェート基に置き換えるか、標準的な保護基により保護するか、または活性化して追加のヌクレオチドへの追加の連結を調製することができるし、固体支持体にコンジュゲートすることもできる。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化することもできるし、アミンまたは１から２０個の炭素原子の有機キャップ基部分と置換することができる。他のヒドロキシルもまた標準的な保護基に誘導体化することができる。ポリヌクレオチドは、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、または２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、□−アノマー糖、アラビノース、キシロース、またはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシドアナログを含めた、当技術分野で一般に公知の、アナログ形態のリボースまたはデオキシリボース糖もまた含有することがある。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替連結基に置き換えることができる。これらの代替連結基には、非限定的に、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）に置き換えられる実施形態が含まれ、式中、各ＲまたはＲ’は、独立してＨであるか、またはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含有してもよい置換または未置換アルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めた本明細書に言及するすべてのポリヌクレオチドにあてはまる。
本明細書に使用する「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋な（すなわち混入物を有さない）、さらに好ましくは少なくとも９０％純粋な、さらに好ましくは少なくとも９５％純粋な、さらに好ましくは少なくとも９８％純粋な、さらに好ましくは少なくとも９９％純粋な物質を表す。
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物の組み込み用のベクターについてのレシピエントでありうるか、またはレシピエントであった個別の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれ、その子孫は、自然突然変異、偶発的突然変異、または計画的突然変異が原因で、本来の親細胞と（形態またはゲノムＤＮＡ相補体が）必ずしも完全には同一ではないことがある。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
本明細書に使用する「ベクター」は、宿主細胞に関心対象の１つまたは複数の遺伝子または配列を送達し、好ましくは発現させることができる構築物を意味する。ベクターの例には、非限定的に、ウイルスベクター、裸のＤＮＡ発現ベクターまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン凝縮剤と関連したＤＮＡ発現ベクターまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ発現ベクターまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などのある種の真核細胞が含まれる。
本明細書に使用する「発現制御配列」は、核酸の転写を指令する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成性もしくは誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーでありうる。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結している。
本明細書に使用する用語「ｋｏｎ」は、抗原への抗体の会合についての速度定数を表すことを意図する。
本明細書に使用する用語「ｋｏｆｆ」は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての速度定数を表すことを意図する。
本明細書に使用する用語「ＫＤ」は、抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を表すことを意図する。
本明細書に使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、別に示さない限り複数の参照が含まれる。
ＩＩＩ．本発明の方法
本発明は、ｔｒｋＢアゴニストの末梢投与により体重および／または摂食を増加させる方法を包含する。これらの方法は、霊長類における望まれない体重減少（悪液質など）および摂食障害（神経性食欲不振など）、ならびに哺乳動物におけるオピオイド誘導性嘔吐症を治療または予防するために用いることができる。本発明は、有効量の１つまたは複数のｔｒｋＢアゴニストを、それを必要とする個体に末梢投与することを伴う（様々な表示および態様は本明細書に記載する）。
本明細書に記載するすべての方法に関して、ｔｒｋＢアゴニストの参照には、１つまたは複数のこれらの薬剤を含む組成物もまた含まれる。これらの組成物は、当技術分野で十分に公知の緩衝液を含めた、薬学的に許容できる賦形剤などの適切な賦形剤をさらに含むことがある。本発明は、単独で、または他の従来の治療方法と組み合わせて使用することができる。
本明細書に記載する方法により治療および／または予防することができる悪液質は、以下、すなわち慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、慢性心不全（ＣＨＦ）、加齢、癌、およびＡＩＤＳのうちの１つまたは複数によって引き起こされ、かつ／またはそれに関連することがある。
いくつかの実施形態では、悪液質を治療されたか、または望まれない体重減少を治療されたヒト患者は、約２５．０ｋｇ／ｍ２、約２４．０ｋｇ／ｍ２、約２３．０ｋｇ／ｍ２、約２２．０ｋｇ／ｍ２、約２１．０ｋｇ／ｍ２、約２０．０ｋｇ／ｍ２、約１９．０ｋｇ／ｍ２、および約１８．５ｋｇ／ｍ２のいずれか未満のボディーマスインデックス（ＢＭＩ、メートル単位の身長の二乗あたりの体重（ｋｇ／ｍ２）として計算される）を有する。いくつかの実施形態では、悪液質を治療されたか、または望まれない体重減少を治療されたヒト患者は、標準推奨１日摂取レベルまたは発病前レベルの約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、または約１０％未満の１日摂食量を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法により神経性食欲不振を治療されるヒト患者は、約１８．５ｋｇ／ｍ２、約１７．５ｋｇ／ｍ２、および約１６．５ｋｇ／ｍ２のいずれか未満のＢＭＩを有する。いくつかの実施形態では、神経性食欲不振を治療されたヒト患者は、標準推奨１日摂食レベルまたは発病前レベルの約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、または約１０％未満の１日摂食量を有する。
ｔｒｋＢアゴニストは末梢投与される。たとえ薬剤が末梢投与されても、わずかな率の薬剤は血液脳関門を通過して、薬剤の性質に応じて中枢神経系への送達を招くおそれがあることが理解されている。いくつかの実施形態では、末梢投与されたｔｒｋＢアゴニスト（例えばｔｒｋＢアゴニスト抗体）の約１％、約０．５％、約０．２５％、および約０．１％のいずれか未満が、ＣＮＳにアクセスする。
ｔｒｋＢアゴニストは、任意の適切な末梢経路により個体に投与することができる。本明細書に記載する実施例が、利用できる技術の限定ではなく例示を意図することは、当業者に明らかなはずである。したがって、いくつかの実施形態では、ｔｒｋＢアゴニストは、例えばボーラスまたは一定時間にわたる連続点滴のような静脈内投与、筋肉内、腹腔内、皮下、関節内、舌下、滑膜内、吹入経由、経口、吸入、または局所経路によるものなどの公知の方法により個体に投与される。投与は、全身的（例えば静脈内投与）または局所的でありうる。ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含めた、液体製剤用の市販のネブライザーが投与に有用である。液体製剤を直接噴霧することもできるし、凍結乾燥粉末を再構成後に噴霧することもできる。あるいは、ｔｒｋＢアゴニストは、フッ化炭素製剤および定量吸入器を使用してエアロゾル化することができるし、凍結乾燥して粉砕した粉末として吸入することができる。
ｔｒｋＢアゴニストは、ＣＮＳまたは血液脳関門の外側に部位特異的または標的化局所送達技術により投与することができる。部位特異的または標的化局所送達技術の例には、ｔｒｋＢアゴニストの様々な植込み可能なデポー供給源、または点滴カテーテル、留置カテーテル、もしくはニードルカテーテルなどの局所送達カテーテル、合成移植片、外膜ラップ（ａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ ｗｒａｐｓ）、シャントおよびステントもしくは他の埋込み可能な装置、部位特異的担体、直接注射、または直接適用が含まれる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／５３２１１および米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
ｔｒｋＢアゴニストの様々な製剤は、投与のために使用することができる。いくつかの実施形態では、ｔｒｋＢアゴニストは、混ぜ物なしに（ｎｅａｔ）投与することができる。他の実施形態では、ｔｒｋＢアゴニストおよび薬学的に許容できる賦形剤が投与され、それらは様々な製剤のことがある。薬学的に許容できる賦形剤は、当技術分野において公知であり、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする相対的に不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態またはコンシステンシーを与えることができるし、希釈剤として作用することもできる。適切な賦形剤には、非限定的に、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変動させるための塩、封入剤、緩衝剤、ならびに皮膚透過促進剤が含まれる。腸管外および非腸管外薬物送達のための賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に述べられている。概して、これらの薬剤は、注射による投与（例えば腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）のために製剤されるが、他の形態（例えば経口、粘膜、経皮、吸入など）の投与を使用することもまたできる。
特定の投薬方式、すなわち用量、タイミング、および繰り返しは、特定の個体ならびにその個体の病歴、治療する特定の疾患（例えば、悪液質、望まれない体重減少、神経性食欲不振、およびオピオイド誘導性嘔吐症）、および特定のｔｒｋＢアゴニストに依存するものである。概して、以下の任意の用量のｔｒｋＢアゴニスト（例えば、ＮＴ−４／５、ＢＤＮＦ、および抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体）を使用することができ、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０ｕｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｕｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、またはそれを超える用量が投与される。半減期などの経験的考察は、一般に投与量の決定に寄与するものである。数日間以上にわたる繰り返し投与について、治療は、疾患の症状の所望の抑制が起こるか、または十分な治療レベルが達成されるまで、状態に応じて継続される。例えば、１週間に１から５回の投薬が考えられている。他の投薬方式には、１日に最大１回、１週間に１から５回、またはそれよりも回数の少ない方式が含まれる。いくつかの実施形態では、ｔｒｋＢアゴニストは、１週間に約１回、１カ月に約１から４回投与される。段階投与量を用いた、２日から最大７日、または１４日までもの間隔の間欠投薬方式を用いることができる。いくつかの実施形態では、治療は、毎日投薬で開始して、その後毎週または毎月までもの投薬に変えることができる。この治療法の進行は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニターされる。
一部の個体では、１回を超える投与が必要なことがある。投与回数は、治療クールにわたり決定および調整することができる。例えば、投与回数は、治療する疾患の種類および重症度、その薬剤が予防目的それとも治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の臨床歴およびその薬剤に対する応答、ならびに担当医師の判断に基づき決定または調整することができる。典型的には、臨床家は、所望の結果を達成する投与量に達するまでｔｒｋＢアゴニストを投与するものである。場合によっては、ｔｒｋＢアゴニストの持続性連続放出製剤が適切なことがある。持続性放出を達成するための様々な製剤および装置が、当技術分野で公知である。例えば、ｔｒｋＢアゴニストは、機械的ポンプにより投与することができるし、持続放出または低速放出用のマトリックス床に包埋することができる。
一実施形態では、１回または複数回の投与を与えられた個体におけるｔｒｋＢアゴニストについての投与量は、経験的に決定することができる。個体に漸増する投与量のｔｒｋＢアゴニストを与える。ｔｒｋＢアゴニストの有効性を評定するために、病状のマーカーをモニターすることができる。個体、疾患（悪液質、神経性食欲不振、およびオピオイド誘導性嘔吐症など）の段階、ならびに過去の治療および使用中の同時治療に応じて投与量が変動するものであることは、当業者に明らかなものである。
本発明の方法によるｔｒｋＢアゴニストの投与は、例えばレシピエントの生理的状態、投与の目的が治療であるかそれとも予防であるか、および当業者に公知の他の要因に応じて連続的または間欠的でありうる。ｔｒｋＢアゴニストの投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的なこともあるし、間隔を空けた一連の投与のこともある。
他の製剤には、非限定的にリポソームなどの担体を含めた、当技術分野で公知の適切な送達形態が含まれる。例えば、Ｍａｈａｔｏら（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３〜８５９を参照されたい。リポソーム製剤には、非限定的に、サイトフェクチン、多重膜小胞、および単膜小胞が含まれる。
疾患の評定は、当技術分野で公知の標準法を用いて、例えば、適切なマーカーをモニターすることによって行われる。例えば悪液質については、以下のマーカー、すなわち体重、血漿アルブミン、体脂肪、ボディーリーンマス（ｂｏｄｙ ｌｅａｎ ｍａｓｓ）、疲労、虚弱、および食欲をモニターすることができる。神経性食欲不振については、以下のマーカー、すなわち体重、食欲、および体重増のおそれをモニターすることができる。オピオイド誘導性嘔吐症について、以下のマーカー、すなわち悪心、嘔吐、食欲、体重、および他の関連する医学的合併症をモニターすることができる。
ＩＶ．組成物および組成物を作製する方法
本発明の方法はｔｒｋＢアゴニストを使用し、ｔｒｋＢアゴニストは、天然由来のｔｒｋＢ受容体および／またはｔｒｋＢシグナル伝達機能に仲介される下流の経路と結合し、それを活性化する任意の分子を表す。ｔｒｋＢアゴニストには、ＮＴ−４／５およびＢＤＮＦなどの、ｔｒｋＢ受容体の任意の天然由来リガンドが含まれる。ｔｒｋＢアゴニストには、天然由来ｔｒｋＢ受容体に結合し、それを活性化することによって、その受容体の天然由来リガンドの生物学的活性を模倣している、ｔｒｋＢ受容体の非天然由来リガンド（例えばポリペプチド、ペプチド由来化合物、環状ペプチド由来または非ペプチド由来分子）もまた含まれる。ｔｒｋＢ受容体の非天然由来リガンドの一例は、抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体である。ｔｒｋＢアゴニストには、小分子またはペプチド模倣体（例えばＢＤＮＦのペプチド模倣体）もまた含まれる。例えば、Ｏ’Ｌｅａｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２５７３８〜４４、２００３を参照されたい。いくつかの実施形態では、小分子ｔｒｋＢアゴニストは、末梢投与した場合に、血液脳関門を有意に通過しない。
ｔｒｋＢアゴニストは、任意の１つまたは複数の以下の特徴を示すはずである：（ａ）ｔｒｋＢ受容体に結合する、（ｂ）ｔｒｋＢ受容体に結合し、ｔｒｋＢの生物学的活性および／またはｔｒｋＢシグナル伝達機能により仲介される１つもしくは複数の下流の経路を活性化する、（ｃ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、体重および／または摂食を増加させる、（ｄ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、悪液質または望まれない体重減少の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｅ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、神経性食欲不振の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｆ）末梢投与した場合に、哺乳動物においてｔｒｋＢ受容体に結合し、オピオイド誘導性嘔吐症の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｇ）ｔｒｋＢ受容体の二量体化および活性化を促進する、ならびに（ｈ）ｔｒｋＢ受容体依存性の神経細胞の生存および／または神経突起の成長を増加させる。いくつかの実施形態では、ｔｒｋＢアゴニストは、ｔｒｋＢ受容体と結合し、それを活性化するが、ｔｒｋＡおよび／またはｔｒｋＣなどの１つまたは複数の他のｔｒｋ受容体を有意にも優先的にも活性化しない。
ｔｒｋＢアゴニストは、本明細書に記載する任意の方法に使用するための組成物の形態でありうる。本発明の方法に使用する組成物は、有効量のｔｒｋＢアゴニストを含む。組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤をさらに含むことがある（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、その投与量および濃度でレシピエントに無毒であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール、またはベンジルアルコール、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含めた単糖、二糖、および他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン系界面活性剤を含むことがある。薬学的に許容できる賦形剤を本明細書にさらに記載する。
本明細書に記載するｔｒｋＢアゴニストは、持続放出用に製剤することができる。持続放出調製物の適切な例には、ｔｒｋＢアゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、造型品の形態、例えばフィルムまたはマイクロカプセルである。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−ビニル酢酸、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、スクロースアセテートイソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。使用することができる持続放出薬物送達システムの別の例は、Ａｔｒｉｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓが作るＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）である。例えば、米国特許第６，５６５，８７４号を参照されたい。ＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）薬物送達システムは、生物分解性縫合糸に使用されるポリマーに類似した生物分解性ポリマーを生物適合性担体に溶解したものからなる。ｔｒｋＢアゴニストは、製造時にこの液体送達系に混合することができるし、製品に応じて、後で使用時に医師が添加することもできる。液体製品をゲージの小さい針を通して皮下または筋肉内に注射するか、またはカニューレを通してアクセス可能な組織部位に置く場合には、担体と組織液中の水との置き換えにより、ポリマーが沈殿し、固体フィルムまたは植込剤が形成する。その植込剤に封入されたｔｒｋＢアゴニストは、次にポリマーマトリックスが経時的に生物分解するときに制御された方式で放出される。患者の医学的必要性に応じて、Ａｔｒｉｇｅｌシステムは、数日から数カ月までの期間にわたりタンパク質を送達することができる。Ａｌｋｅｒｍｅｓが製造するＰｒｏＬｅａｓｅ（登録商標）、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ（登録商標）などの注射用持続放出システムもまた使用することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、医薬としての使用の状況であろうと、かつ／または医薬の製造のための使用の状況であろうと、本明細書に記載する任意の方法に使用するための組成物（本明細書に記載）を提供する。
ＮＴ−４／５ポリペプチド
本発明の方法に用いるｔｒｋＢアゴニストにはＮＴ−４／５ポリペプチドが含まれる。本明細書に使用する「ＮＴ−４／５ポリペプチド」には、天然に存在する成熟タンパク質（相互交換可能に「ＮＴ−４／５」と名付ける）（例えば、下記表１および米国特許出願公開２００５／０２０９１４８およびＰＣＴ ＷＯ２００５／０８２４０および米国特許出願公開２００３０２０３３８３の図１に示す成熟ヒトＮＴ−４／５など）およびＮＴ−４／５の天然に存在するアミノ酸配列変異体と、ＮＴ−４／５のアミノ酸配列変異体と、成熟ＮＴ−４／５（ヒトなど）およびアミノ酸配列変異体のペプチド断片と、成熟ＮＴ−４／５および前記アミノ酸配列変異体およびペプチド断片の修飾された形態（ここで、ポリペプチドまたはペプチドは、天然に存在するアミノ酸以外の部分との置換により共有結合的に修飾されている）が含まれるが、ただし、そのアミノ酸配列変異体、ペプチド断片、およびその修飾された形態は、ｔｒｋＢアゴニストおよび／または天然成熟ＮＴ−４／５タンパク質の１つまたは複数の生物学的活性を示す。ｔｒｋＢアゴニストには、本明細書に記載するＮＴ−４／５ポリペプチドの任意の実施形態を含む融合タンパク質およびコンジュゲート、例えばＰＥＧ、ＩｇＧ Ｆｃ領域、アルブミン、またはペプチドなどの半減期延長部分にコンジュゲートまたは融合したＮＴ−４／５ポリペプチドもまた含まれる。考慮中のアミノ酸配列変異体、ペプチド断片（変異体の断片を含める）、またはその修飾された形態には、任意の動物種のＮＧＦ、ＢＤＮＦ、またはＮＴ−３は含まれない。天然に存在するＮＴ−４／５の変異体、ペプチド断片、および修飾された形態は、米国特許出願公開第２００３／０２０３３８３号；第２００２／００４５５７６号；第２００５／０２０９１４８号；米国特許第５，７０２，９０６号；第６，５０６，７２８号；第６，５６６，０９１号；第５，８３０，８５８号に記載されている。ＮＴ−４／５ポリペプチドには、本明細書に記載する任意の１つまたは複数の実施形態が含まれる。例えば、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有する天然に存在する配列を含む。
Figure 2009528985
いくつかの実施形態では、ＮＴ−４／５ポリペプチドは哺乳動物ＮＴ−４／５ポリペプチドであり、このポリペプチドは、天然に存在する哺乳動物ＮＴ−４／５、または天然に存在する哺乳動物ＮＴ−４／５から誘導されたＮＴ−４／５ポリペプチドであって、天然に存在する非哺乳動物ＮＴ−４／５のどの部分とも合致しない配列を有するＮＴ−４／５ポリペプチドのことがある。いくつかの実施形態では、ＮＴ−４／５ポリペプチドはヒトＮＴ−４／５ポリペプチドであり、このポリペプチドは、天然に存在するヒトＮＴ−４／５または天然に存在するヒトＮＴ−４／５から誘導されたＮＴ−４／５ポリペプチドであって、天然に存在する非ヒトＮＴ−４／５のどの部分とも合致しない配列を有するＮＴ−４／５ポリペプチドのことがある。
変異体、ペプチド断片、修飾された形態のＮＴ−４／５ポリペプチド（天然に存在するＮＴ−４／５を含める）、本発明の融合タンパク質およびコンジュゲートを含めたＮＴ−４／５ポリペプチドは、以下の任意の（１つまたは複数の）性質を特徴とする：（ａ）ｔｒｋＢ受容体に結合する、（ｂ）ｔｒｋＢ受容体に結合し、ｔｒｋＢの生物学的活性および／またはｔｒｋＢシグナル伝達機能により仲介される１つもしくは複数の下流の経路を活性化する、（ｃ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、体重および／または摂食を増加させる、（ｄ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、悪液質の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｅ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、神経性食欲不振の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｆ）末梢投与した場合に、哺乳動物においてｔｒｋＢ受容体に結合し、オピオイド誘導性嘔吐症の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｇ）ｔｒｋＢ受容体の二量体化および活性化を促進する、ならびに（ｈ）ｔｒｋＢ受容体依存性の神経細胞の生存および／または神経突起の成長を増加させる。したがって、すべてのＮＴ−４／５ポリペプチド（変異体、断片、および修飾された形態を含める）は、上記のように機能的である。
変異体の生物学的活性は、当技術分野で公知の方法および本明細書に記載する方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。抗ｔｒｋＢアゴニストを同定するための本明細書に記載する方法もまた用いることができる。ＮＴ−４／５ポリペプチドは、天然に存在するＮＴ−４／５タンパク質に比べて高まった活性または低減した活性を有することがある。いくつかの実施形態では、機能的に等価な変異体は、上記の（または当技術分野で公知の）１つまたは複数の生物学的アッセイに関して、ＮＴ−４／５ポリペプチドが誘導された天然由来のＮＴ４／５タンパク質に比べて少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の任意の活性を有する。いくつかの実施形態では、機能的に等価の変異体は、ＴｒｋＢ受容体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化（例えば、実施例６ならびにＵＳ２００５／０２０９１４８およびＰＣＴ ＷＯ２００５／０８２４０１に記載されているアッセイ）において約０．０１ｎＭ、約０．１ｎＭ、約１ｎＭ、約１０ｎＭ、または約１００ｎＭのいずれか未満のＥＣ５０（最大有効濃度の半値）を有する。
ＮＴ−４／５のアミノ酸配列変異体には、天然に存在するＮＴ−４／５（例えば表１に示す成熟ヒトＮＴ−４）の配列内の１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、および／または置換によって、天然に存在するＮＴ−４／５とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。アミノ酸配列変異体は、概して、任意の天然に存在するＮＴ−４／５（配列番号１に示す成熟ヒトＮＴ−４／５など）と少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一なものである。いくつかの実施形態では、この変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である。いくつかの実施形態では、この変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一である。いくつかの実施形態では、この変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、この変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一である。
ＮＴ−４／５のアミノ酸配列変異体は、以前に単離されたＮＴ−４／５ ＤＮＡに所定の突然変異を加えることにより作製することができる。アミノ酸変異体は、ＮＴ−４／５およびＴｒｋＢ受容体の結晶構造に基づき設計および作製することができる。Ｂａｎｆｉｅｌｄら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９：１１９１〜９（２００１）。例えば、ＮＴ−４／５の単量体同士の間およびＮＴ−４／５とＴｒｋＢ受容体との間の相互作用に直接関与しないアミノ酸を、例えばＰＥＧ付着部位を導入するために突然変異させることができる。当技術分野で公知の方法を使用して、天然に存在するＮＴ−４／５タンパク質に比べて高まっているか、または低減した１つまたは複数の生物学的活性を有するＮＴ−４／５ポリペプチド変異体を設計することができる。
そのような所定の突然変異を加える際に考慮すべき２つの主要な変数、すなわち突然変異部位の場所および突然変異の本質がある。一般に、概して選択される突然変異の場所および本質は、修飾されるＮＴ−４／５の特徴に依存する。例えば、候補ＮＴ−４／５アンタゴニストまたはスーパーアゴニストは、最初にＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４の間で同一または高度に保存されたアミノ酸残基の場所を決定することにより選択することができる。次に、例えば（１）最初に保存的選択と、次に達成した結果に応じてより過激な選択と置換すること、（２）標的残基を欠失させること、もしくは（３）場所を決定した部位に隣接して同一または異なるクラスの残基を挿入すること、または選択肢１〜３の組合せにより、それらの残基を連続して修飾することができる。
役立つ一技術は「ａｌａスキャニング」と呼ばれる。ここで、アミノ酸残基または標的残基の群を同定し、アラニンまたはポリアラニンに置換する。次に、アラニン置換に機能的感受性を示しているドメインは、アラニン置換部位で、またはその部位に代わってさらなる変異体または他の変異体を導入することにより洗練させる。
明らかに、例えば、ＮＴ−４／５をＮＧＦ、ＢＤＮＦ、またはＮＴ−３に変換するような変異は、本発明の範囲内に含まれない。したがって、アミノ酸配列の変異を導入するための部位が所定であっても、突然変異の本質自体は所定である必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を最適化するために、標的コドンまたは標的領域でａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発が行われ、発現したＮＴ−４／５変異体が、最適な所望の活性についてスクリーニングされる。
アミノ酸配列の欠失は、概して約１から３０残基、より好ましくは約１から１０残基の範囲であり、そして典型的には連続している。欠失は、ＮＴ−４／５の活性を修飾するために、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５の間で相同性が低い領域に導入することができる。ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＧＦと実質的に相同な区域でのＮＴ−４／５からの欠失は、ＮＴ−４／５の生物学的活性をより有意に修飾する見込みがさらに高いことがある。連続的な欠失の数は、影響を受けたドメインにおけるＮＴ−４／５の三次構造（例えば、β−プリーツシートまたはαらせん）を保存するように選択することができる。
アミノ酸配列の挿入には、１残基から、１０００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶ、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入（すなわち成熟ＮＴ−４／５配列内の挿入）は、概して、約１から１０残基、より好ましくは、１から５残基、最も好ましくは、１から３残基の範囲のことがある。末端挿入の例には、組換え宿主からの成熟ＮＴ−４／５の分泌を容易にするために、ＮＴ−４／５分子のＮ末端に異種Ｎ末端シグナル配列を融合することが含まれる。そのようなシグナルは、概して、意図される宿主細胞と同種であり、それらには、大腸菌についてのＳＴＩＩもしくはｌｐｐ、酵母についてのα因子、および哺乳動物細胞についてのヘルペスｇＤなどのウイルスシグナルが含まれる。他の挿入には、ＮＴ−４／５のＮ末端またはＣ末端へのポリペプチドの融合が含まれる。
変異体の別の群には、ＮＴ−４／５の少なくとも１つ（好ましくは１つだけ）のアミノ酸残基が除去されて、異なる残基がその場所に挿入されているものが含まれる。一例は、アルギニンおよびリシンを他のアミノ酸に置き換えて、ＮＴ−４／５をセリンプロテアーゼによるタンパク質分解に抵抗性にすることによって、より安定なＮＴ−４／５変異体を創出することである。置換突然変異誘発のための最大の関心対象の部位には、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４にみられるアミノ酸が、側鎖のかさ高さ、電荷、または疎水性に関して実質的に異なる部位であるが、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＢＤＮＦの種々の動物アナログの中で（例えば、すべての動物ＮＧＦ、すべての動物ＮＴ−３、およびすべてのＢＤＮＦの間で）選択された部位に高度の相同性もまたある部位が含まれる。この分析は、栄養因子の活性の区別に関与しうる残基を強調するものであることから、これらの部位での変異体は、そのような活性に影響を及ぼすことがある。成熟ヒトＮＴ−４／５でのそのような部位をＮ末端から番号付けしたもの、および例示的な置換の例には、それぞれ、配列番号１のＮＴ−４／５のＧ７７からＫ、Ｈ、Ｑ、またはＲへ、およびＲ８４からＥ、Ｆ、Ｐ、Ｙ、またはＷへの置換が含まれる。関心対象の他の部位は、残基がすべての動物種のＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５の間で同一な部位であり、このコンフォメーションの程度は、全４つの因子に共通する生物学的活性を達成することの重要性を示唆している。
例えば、１つまたは複数のアミノ酸の置換には、保存的置換が含まれる。保存的置換を行う方法は、当技術分野で公知である。例えば、ａｌａ（Ａ）は、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅと、好ましくは、ｖａｌと置換することができ、ａｒｇ（Ｒ）は、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｓｎと、好ましくは、ｌｙｓと置換することができ、ａｓｎ（Ｎ）は、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇと、好ましくは、ｇｌｎと置換することができ、ａｓｐ（Ｄ）は、ｇｌｕと置換することができ、ｃｙｓ（Ｃ）は、ｓｅｒと置換することができ、ｇｌｎ（Ｑ）は、ａｓｎと置換することができ、ｇｌｕ（Ｅ）は、ａｓｐと置換することができ、ｇｌｙ（Ｇ）は、ｐｒｏと置換することができ、ｈｉｓ（Ｈ）は、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇと、好ましくは、ａｒｇと置換することができ、ｉｌｅ（Ｉ）は、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ノルロイシンと、好ましくは、ｌｅｕと置換することができ、ｌｅｕ（Ｌ）は、ノルロイシン、ｉｌｅ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅと、好ましくは、ｉｌｅと置換することができ、ｌｙｓ（Ｋ）は、ａｒｇ、ｇｌｎ、ａｓｎと、好ましくは、ａｒｇと置換することができ、ｍｅｔ（Ｍ）は、ｌｅｕ、ｐｈｅ、ｉｌｅと、好ましくは、ｌｅｕと置換することができ、ｐｈｅ（Ｆ）は、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａと、好ましくは、ｌｅｕと置換することができ、ｐｒｏ（Ｐ）は、ｇｌｙと置換することができ、ｓｅｒ（Ｓ）は、ｔｈｒと置換することができ、ｔｈｒ（Ｔ）は、ｓｅｒと置換することができ、ｔｒｐ（Ｗ）は、ｔｙｒと置換することができ、ｔｙｒ（Ｙ）は、ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒと、好ましくは、ｐｈｅと置換することができ、ｖａｌ（Ｖ）は、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａ、ノルロイシンと、好ましくは、ｌｅｕと置換することができる。
保存的置換に特に適した部位には、成熟ヒトＮＴ−４（配列番号１）のＮ末端から付番して、Ｒ１１、Ｇ１２、Ｅ１３、Ｖ１６、Ｄ１８、Ｗ２３、Ｖ２４、Ｄ２６、Ｖ４０、Ｌ４１、Ｑ５４、Ｙ５５、Ｆ５６、Ｅ５８、Ｔ５９、Ｇ７７、Ｒ７９、Ｇ８０、Ｈ８５、Ｗ８６、Ａ９９、Ｌ１００、Ｔ１０１、Ｗ１１０、Ｒ１１１、Ｗ１１２、Ｉ１１３、Ｒ１１４、Ｉ１１５、Ｄ１１６、およびＡ１１８が含まれる。ＮＴ−４／５の適正なコンフォメーションを維持することに関与しないシステイン残基もまた、その分子の酸化的安定性を高め、異常な架橋形成を防止するために、概してセリンで置換することができる。この節に示す部位以外の部位は、一般に上記の欠失研究または挿入研究に適する。
機能の実質的な修飾は、（ａ）置換の区域における、例えば、シートまたはらせんコンフォメーションとしてのポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さを維持することに及ぼす置換の効果が有意に異なる置換を選択することによって達成することができる。天然に存在する残基は、共通する側鎖の性質に基づいて群分けされる（残基の一部は、いくつかの機能群に入ることがある）：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のメンバーと交換することを伴うものである。
ＮＴ−４変異体の例には、Ｅ６７からＳまたはＴへの突然変異を有する配列番号１のポリペプチド（これは、Ｎ結合型グリコシル化部位を付加する）；配列番号１のアミノ酸残基Ｒ８３からＱ９４まで、Ｇ１からＣ６１まで、Ｇ１からＣ１７まで、Ｃ１７からＣ６１まで、Ｃ１７からＣ７８まで、Ｃ１７からＣ９０まで、Ｃ１７からＣ１１９まで、Ｃ１７からＣ１２１まで、Ｒ１１からＲ２７まで、Ｒ１１からＲ３４まで、Ｒ３４からＲ５３まで、Ｃ６１からＣ７８まで、Ｒ５３からＣ６１まで、Ｃ６１からＣ１１９まで、Ｃ６１からＣ７８まで、Ｃ７８からＣ１１９まで、Ｃ６１からＣ９０まで、Ｒ６０からＣ７８まで、Ｋ６２からＣ１１９まで、Ｋ６２からＫ９１まで、Ｒ７９からＲ９８まで、Ｒ８３からＫ９３まで、Ｔ１０１からＲ１１１まで、Ｇ１からＣ１２１までのポリペプチド；配列番号１のＶ４０〜Ｃ１２１を含むポリペプチド（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端で、あるポリペプチドに融合した配列番号１のＶ４０〜Ｃ１２１）；Ｃ７８、Ｃ６１、Ｑ５４〜Ｔ５９、Ｒ６０〜Ｄ８２、Ｈ８５〜Ｓ８８、Ｗ８６〜Ｔ１０１が欠失した（表示する残基範囲（両端を含む）が欠失した）配列番号１を含むポリペプチド；Ｒ５３からＨへ、Ｋ９１からＨへ、Ｖ１０８からＦへ、Ｒ８４からＱ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、ＹまたはＷへ、およびＤ１１６からＥ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、ＳまたはＴへの突然変異を有する配列番号１が含まれる。位置７０がＧ、Ｅ、ＤもしくはＰ以外のアミノ酸残基で置換され、位置７１がＡ、ＰもしくはＭ以外の残基で置換され、かつ／または位置８３がＲ、Ｄ、ＳもしくはＫ以外の残基で置換されたＮＴ−４／５（配列番号１）、および環化ＮＴ−４断片もまた含まれる。
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、その２つの配列中のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、下記のように最大の一致で整列された場合に同じならば、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列が類似した局所領域を同定および比較するために、比較ウィンドウにわたり配列を比較することによって行われる。本明細書に使用する「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個、通常は３０から約７５個、４０から約５０個の連続する位置のセグメントを表し、そのセグメントで、ある配列を同数の連続する位置の参照配列と、それら２つの配列を最適に整列させた後で、比較することができる。
比較のための配列の最適な整列は、デフォルトのパラメーターを使用して、生物情報学ソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して行うことができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されているいくつかの整列スキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントンＤＣ、第５巻、補遺３巻、３４５〜３５８頁より；Ｈｅｉｎ Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１〜１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６〜４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンフランシスコ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６〜７３０。
好ましくは、「配列同一率」は、少なくとも２０個の位置の比較ウィンドウにわたり、２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、その比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、その２つの配列の最適な整列に関する（付加も欠失も含まない）参照配列と比較して、２０％以下、通常は５から１５％、または１０から１２％の付加もしくは欠失（すなわちギャップ）を含むことがある。この率は、両方の配列に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、合致した位置数を得、その合致した位置数を、参照配列における位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００をかけて、配列同一率を得ることによって計算される。
ＮＴ−４／５のアミノ酸配列変異体は、天然に存在することもあるし、以前に単離したＮＴ−４／５ ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することにより、または所望の変異ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成によるなどして、合成的に調製することができる。上記のように、そのような変異体は、成熟ＮＴ−４／５のアミノ酸配列（例えば表１に示す配列）内に１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、または挿入もしくは置換を含むことがある。欠失、挿入および置換の任意の組合せは、結果として生じる変異ポリペプチドが、所望の特徴をもつならば、ＮＴ−４／５のアミノ酸配列変異体に到達するように加えられる。そのアミノ酸変化は、組換え宿主に発現した際に、例えばグリコシル化部位を導入もしくは移動するか、または膜アンカー配列を導入して、ＮＴ−４／５のさらなる修飾を招くこともまたある（例えばＰＣＴ ＷＯ８９／０１０４１参照）。
いくつかの実施形態では、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、成熟ヒトＮＴ−４／５をコードしている核酸配列（例えば配列番号２）にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含む。
同様に、またはその代わりに、変異ポリヌクレオチドは、天然由来の遺伝子またはその部分もしくは相補体に実質的に相同なことがある。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中程度にストリンジェントな条件で、そのポリペプチドをコードしている天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）にハイブリダイズすることができる。
適切な「中程度にストリンジェントな条件」には、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ、一晩でのハイブリダイズ；続いて０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣの各々での、６５℃で２０分間の２回洗浄が含まれる。
本明細書に使用する「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために、低イオン強度および高温（例えば、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）を使用する条件、（２）ハイブリダイゼーションの間に、ホルムアミドなどの変性剤（例えば４２℃で７５０ｍＭ 塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を有する５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド）を使用する条件；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃、および５０％ホルムアミド中で５５℃での洗浄に続いて、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる、５５℃での高ストリンジェンシー洗浄を使用する条件である。別のストリンジェントな条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、２×デンハルト溶液、および１０％硫酸デキストラン中で、４２℃でのハイブリダイゼーションに続いて、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で４２℃での洗浄である。当業者は、プローブ長などの要因に適合させるために必要な温度、イオン強度などをどのように調整するかを認識しているものである。
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載するポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列があることは、当業者に認識されているものである。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然由来遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を担う。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差異が原因で変動するポリヌクレオチドが、本発明によって具体的に考えられている。さらに、本明細書に提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内に属する。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つまたは複数の突然変異の結果として変更された内因性遺伝子である。結果として生じたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有することもあるが、有する必要はない。対立遺伝子は、標準的技術（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を用いて同定することができる。
本発明の方法に使用するｔｒｋＢアゴニストには、ＮＴ−４／５（例えば表１に示すヒトＮＴ−４／５）またはその機能的ペプチド断片のアミノ酸配列を含む融合タンパク質もまた含まれる。生物学的に活性なＮＴ−４／５ポリペプチドは、配列、例えば、免疫学的反応性を高める配列、支持体もしくは担体へのポリペプチドの結合形成を容易にする配列、または再フォールディングおよび／もしくは精製を容易にする配列（例えば、Ｍｙｃ、インフルエンザウイルスヘマグルチニンから誘導されたＨＡ、Ｈｉｓ−６、ＦＬＡＧなどのエピトープをコードしている配列）と融合することができる。これらの配列は、Ｎ末端またはＣ末端で、ＮＴ−４／５ポリペプチドに融合することができる。加えて、このタンパク質またはポリヌクレオチドは、その機能を増加させるか、または細胞中のその局在化を特定する、分泌配列などの他のものまたはポリペプチドに融合することができる。上記の組換え融合タンパク質を産生する方法は、当技術分野で公知である。この組換え融合タンパク質は、当技術分野で十分に公知の方法によって、産生、再フォールディング、および単離することができる。
本明細書に記載するＮＴ−４／５ポリペプチドは、個体におけるそのポリペプチドの半減期を増加させるために修飾することができる。例えば、ＮＴ−４／５ポリペプチドは、生物学的活性の最小限の損失で、全身クリアランスを低減するために、ＰＥＧ化することができる。本発明は、ＰＥＧ分子に連結したＮＴ−４／５ポリペプチドを含む組成物（医薬組成物を含める）もまた提供する。いくつかの実施形態では、このＰＥＧ分子は、可逆的連結を介してＮＴ−４／５ポリペプチドに連結している。ＰＥＧ化ＮＴ−４／５ポリペプチドの半減期は、非ＰＥＧ化ＮＴ−４／５ポリペプチドの半減期の約２倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、および約３０倍のいずれかを超えるだけ延長することができる。
ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）は、当技術分野で公知の方法を用いて、ＮＴ−４／５ポリペプチドの種々の官能基に連結することができる。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９〜４７６（２００２）；Ｓａｋａｎｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：１０８５〜９１（１９９７）を参照されたい。ＰＥＧは、このポリペプチドの以下の官能基、すなわちアミノ基、カルボキシル基、修飾または天然Ｎ末端、アミン基、およびチオール基に連結することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の表面アミノ酸残基が、ＰＥＧ分子で修飾される。ＰＥＧ分子は、種々の大きさ（例えば、約２から４０ＫＤａの範囲）のことがある。ＮＴ−４／５ポリペプチドに連結したＰＥＧ分子は、約２０００Ｄａ、約１００００Ｄａ、約１５０００Ｄａ、約２００００Ｄａ、約２５０００Ｄａ、約３００００Ｄａ、約３５０００Ｄａ、約４００００Ｄａの任意の分子量を有することがある。ＰＥＧ分子は、一本鎖または分岐鎖のことがある。ＰＥＧをＮＴ−４／５ポリペプチドに連結するために、一方または両方の末端に官能基を有するＰＥＧの誘導体を使用することができる。その官能基は、ＮＴ−４／５ポリペプチド上の利用可能な反応性基の種類に基づいて選択される。ポリペプチドに誘導体を連結する方法は、当技術分野で公知である。Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９〜４７６（２００２）。ＮＴ−４／５ポリペプチドとＰＥＧとの間の連結は、個体において切断または自然分解することができ、半減期を改善するが活性の損失を最小限に抑えることができる連結（可逆的連結または分解可能な連結）のこともまたある。ＮＴ−４／５ポリペプチド上のＰＥＧ連結部位は、表面の残基を、ＰＥＧ反応性の基を有するシステインなどのアミノ酸残基に突然変異させることによって創出することもまたできる。例えば、ヒトＮＴ−４／５（配列番号１）の以下のアミノ酸は、ＰＥＧの付着のために突然変異させることができる：Ｇ１、Ｖ２、Ｓ３、Ｅ４、Ｔ５、Ｓ９、Ｒ１０、Ｔ２５、Ｄ２６、Ｒ２８、Ｔ２９、Ｖ３１、Ｅ３７、Ｅ３９、Ｌ４１、Ｅ４３、Ａ４６、Ａ４７、Ｇ４８、Ｇ４９、Ｓ５０、Ｒ５３、Ｄ６４、Ｎ６５、Ａ６６、Ｅ６７、Ｅ６８、Ｇ６９、Ｄ８２、Ｒ８３、Ｒ８４、Ｈ８５、Ａ１０４、Ｑ１０５、Ｇ１０６、Ｒ１０７、Ｖ１０８、Ｓ１２５、およびＴ１２７。これらは、他の種における対応する残基に適用することができる。
いくつかのＰＥＧ化ＮＴ−４／５が作製され、米国特許出願公開第２００５／０２０９１４８号およびＰＣＴ ＷＯ２００５／０８２４０１の実施例６および７に示されている。成熟ヒトＮＴ−４／５の位置５０でのセリン残基は、システインに変化させてＮＴ４−Ｓ５０Ｃを作製し、次に、それをＰＥＧ化することができ、ここで、ＰＥＧは、位置５０でシステインに連結している。ＰＥＧに対するＮ末端特異的付着の一例は、位置１の残基をセリンまたはスレオニンに突然変異させ、次にＰＥＧ化することであり、ここで、ＰＥＧは、位置１のセリンに連結している。
ＮＴ−４／５ポリペプチドは、組換え手段によって、すなわち、ＮＴ−４／５ポリペプチドをコードしている核酸の発現によって産生することができる。組換え細胞培養、および場合により、例えば、変異体の活性のバイオアッセイによるか、またはウサギ抗ＮＴ−４／５ポリクローナル抗体（天然由来のＮＴ−４／５中にも存在する、その変異体の少なくとも１つの免疫エピトープに結合する）を含む免疫アフィニティーカラムへの吸着による細胞培養物からの変異ポリペプチドの精製において。４０残基以下のオーダーの小さなペプチド断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法により好都合に作られる。
ＮＴ−４／５ポリペプチドをコードしているＤＮＡは、宿主細胞においてタンパク質を発現させるために発現ベクターにクローニングすることができる。ＮＴ−４／５ポリペプチドをコードしている核酸の例は、米国特許出願公開第２００３／０２０３３８３号に記載されている。ＮＴ−４／５ポリペプチドをその成熟形態でコードしているＤＮＡは、そのアミノ末端で分泌シグナルに連結することができる。この分泌シグナルは、好ましくは、ヒト細胞からのＮＴ−４／５のｉｎ ｖｉｖｏ分泌を普通は指令するＮＴ−４／５プレ配列である。しかし、適切な分泌シグナルには、他の動物ＮＴ−４／５由来のシグナル、ＮＧＦ、ＮＴ−２、もしくはＮＴ−３由来のシグナル、ウイルスシグナル、または同種もしくは関係する種の分泌ポリペプチドに由来するシグナルもまた含まれる。任意の宿主細胞（大腸菌など）は、そのタンパク質またはポリペプチドを発現させるために使用することができる。
発現したＮＴ−４／５ポリペプチドは、精製することができる。ＮＴ−４／５ポリペプチドは、培地から分泌タンパク質として回収することができるが、分泌シグナルなしに直接発現した場合には、このポリペプチドは、宿主細胞溶解物からもまた回収することができる。当技術分野で公知のタンパク質精製法を用いることができる。ＮＴ−４／５ポリペプチドを産生する方法および発現したＮＴ−４／５ポリペプチドを精製する方法は、米国特許出願公開第２００３／０２０３３８３号および米国特許第６，１８４，３６０号に記載されている。ＮＴ−４／５ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法により、大腸菌に発現させ、再フォールディングさせることができる。成熟ヒトＮＴ−４／５は、（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）、およびＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（カリフォルニア州テメキュラ）から商業的に得ることもまたできる。
抗ｔｒｋＢアゴニストポリペプチドおよび抗体
本発明の方法に使用されるｔｒｋＢアゴニストには、抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体を含めた抗ｔｒｋＢアゴニストポリペプチドもまた含まれる。抗ｔｒｋＢアゴニストポリペプチド（例えば抗体）は、以下の特徴のうちの任意の１つまたは複数を示すはずである：（ａ）ｔｒｋＢ受容体に結合する、（ｂ）ｔｒｋＢ受容体に結合し、ｔｒｋＢの生物学的活性および／またはｔｒｋＢシグナル伝達機能により仲介される１つもしくは複数の下流の経路を活性化する、（ｃ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、体重および／または摂食を増加させる、（ｄ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、悪液質の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｅ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、神経性食欲不振の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｆ）末梢投与した場合に、哺乳動物においてｔｒｋＢ受容体に結合し、オピオイド誘導性嘔吐症の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｇ）ｔｒｋＢ受容体の二量体化および活性化を促進する、ならびに（ｈ）ｔｒｋＢ受容体依存性の神経細胞の生存および／または神経突起の成長を増加させる。
いくつかの実施形態では、抗ｔｒｋＢアゴニストポリペプチド（例えば抗体）は多価であり、ｔｒｋＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ｔｒｋファミリーのニューロトロフィン受容体と結合および架橋し、またはそれを二量体化することができる免疫グロブリンは、これらの受容体を活性化し、ニューロトロフィンへの曝露に類似した帰結を神経細胞に生むことが示された。米国特許第６，６５６，４６５号およびＰＣＴ ＷＯ０１／９８３６１を参照されたい。
ｔｒｋＢアゴニスト抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体の部分を含む融合タンパク質、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体配置を包含しうる。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または（ヒト化抗体を含めて）他の任意の起源でありうる。
いくつかの実施形態では、（抗体を含めて）ポリペプチドはｔｒｋＢと結合し、他のニューロトロフィン受容体（関係するニューロトロフィン受容体であるｔｒｋＡおよび／またはｔｒｋＣなど）とは有意には交差反応（結合）しない。アゴニスト抗ｔｒｋＢポリペプチドは、ヒトｔｒｋＢと結合することがある。アゴニスト抗ｔｒｋＢポリペプチドは、ヒトおよびげっ歯動物ｔｒｋＢともまた結合することがある。いくつかの実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＢポリペプチドは、ヒトおよびラットｔｒｋＢと結合することがある。いくつかの実施形態では、抗ｔｒｋＢポリペプチドは、ヒトおよびマウスｔｒｋＢと結合することがある。一実施形態では、ポリペプチドは、ヒトｔｒｋＢ細胞外ドメイン上の１つまたは複数のエピトープを認識する。別の実施形態では、抗体は、ヒトｔｒｋＢ細胞外ドメイン上の１つまたは複数のエピトープを認識するマウスまたはラット抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはヒトｔｒｋＢと結合し、別の哺乳動物種（いくつかの実施形態では脊椎動物種）由来のｔｒｋＢと有意には結合しない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ヒトｔｒｋＢおよび別の哺乳動物種（いくつかの実施形態では脊椎動物種）由来の１つまたは複数のｔｒｋＢと結合する。別の実施形態では、ポリペプチドは、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシのうちの１つまたは複数から選択されるｔｒｋＢ上の１つまたは複数のエピトープを認識する。
いくつかの実施形態では、抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体は、ＴｒｋＢ受容体（例えばヒトｔｒｋＢ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化に、約０．０１ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約１ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５０ｎＭ、または約１００ｎＭのいずれか未満のＥＣ５０（最大有効濃度の半値）を有する（例えば、実施例６ならびにＵＳ２００５／０２０９１４８およびＰＣＴ ＷＯ２００５／０８２４０１に記載されているアッセイ）。
ｔｒｋＢに対する抗ｔｒｋＢアゴニストポリペプチド（例えば抗体）の結合親和性は、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのいずれかから、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかまででありうる。いくつかの実施形態では、結合親和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、もしくは約５０ｐＭ、または約５０ｐＭ未満のいずれかである。いくつかの実施形態では、結合親和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのいずれか未満である。なお他の実施形態では、結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭ、または約４０ｐＭ超である。当技術分野で十分に公知のように、結合親和性は、ＫＤ、すなわち解離定数として表現することができ、結合親和性の増加はＫＤの減少に対応する。
ｔｒｋＢへの抗体の結合親和性を決定する一方法は、抗体の単官能性Ｆａｂ断片の結合親和性を測定することによる。単官能性Ｆａｂ断片を得るために、抗体（例えばＩｇＧ）をパパインで切断するか、組換え発現させることができる。抗体の抗ｔｒｋＢ Ｆａｂ断片の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）により決定することができる。ＣＭ５チップは、供給業者の説明書にしたがってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化することができる。ヒトｔｒｋＢ−Ｆｃ融合タンパク質（「ｈｔｒｋＢ」）（またはラットｔｒｋＢなどの他の任意のｔｒｋＢ）は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中で希釈し、活性化したチップの上に０．０００５ｍｇ／ｍＬ濃度でインジェクトすることができる。個別のチップチャンネルを通過する可変流動時間を使用して、２つの範囲の抗原密度、すなわち詳細な動力学的研究には２００〜４００応答単位（ＲＵ）およびスクリーニングアッセイには５００〜１０００ＲＵを達成することができる。チップは、エタノールアミンでブロックすることができる。再生の研究から、２００回を超えるインジェクションの間、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、イリノイ州ロックフォード）および４Ｍ ＮａＣｌ（２：１）の混合物は、結合したＦａｂを効果的に除去するが、チップ上のｈｔｒｋＢの活性を保つことが示された。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２９）は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイのための運転緩衝液として使用する。精製Ｆａｂ試料の系列希釈（０．１〜１０×推定ＫＤ）は、１００μＬ／ｍｉｎで１分間インジェクトし、最長２時間の解離時間を見込む。Ｆａｂタンパク質の濃度は、標準として（アミノ酸分析により決定した）公知の濃度のＦａｂを使用したＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により決定する。動力学的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）（一般に２５℃で測定される）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いて１：１ラングミュア結合モデルにデータをあてはめることによって同時に得られる（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．、Ｒｏｏｓ，Ｈ．、Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．、Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６：９９〜１１０）。平衡解離定数（ＫＤ）の値は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。
いくつかの実施形態では、抗ｔｒｋＢアゴニストポリペプチド（抗体を含める）は、エフェクター機能障害を有する。本明細書に使用する「エフェクター機能障害」（用語「免疫学的に不活性」と相互交換可能に使用される）を有する抗体またはポリペプチドは、エフェクター機能をまったく有さないか、または（未修飾または天然に存在する定常領域を有する抗体またはポリペプチドに比べて）低減した活性のエフェクター機能を有する抗体またはポリペプチドを表し、その抗体またはポリペプチドは、例えば、以下の任意の１つまたは複数に活性を有さないか、または低減した活性を有する：ａ）補体介在性溶解をトリガーすること、ｂ）抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を刺激すること、およびｃ）ミクログリアを活性化すること。エフェクター機能の活性は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、および約１００％のいずれかだけ低減していることがある。いくつかの実施形態では、抗体は、有意な補体依存性溶解または標的の細胞介在性破壊をトリガーせずにｔｒｋＢ受容体に結合する。例えば、定常領域上のＦｃ受容体結合部位は、修飾または突然変異させて、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、および／またはＦｃγＲＩＶなどのある種のＦｃ受容体に対する結合親和性を除去または低減することができる。簡潔にするために、実施形態がポリペプチドにもまたあてはまることを理解して、抗体を参照する。ＥＵ付番システム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ；第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈｙ、メリーランド州ベセスダ、１９９１）を使用して、（例えばＩｇＧ抗体の）定常領域のどのアミノ酸残基が変更または突然変異されたかを表示することができる。類似の変化を複数の種類の抗体および種にわたり加えることができることを理解して、この付番を特定の種類の抗体（例えばＩｇＧ１）または種（例えばヒト）に使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｔｒｋＢ受容体に特異的に結合するポリペプチド（抗体を含める）は、エフェクター機能障害を有する重鎖定常領域を含む。この重鎖定常領域は、天然に存在する配列を有することがあるか、または変異体である。いくつかの実施形態では、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸配列は、例えばアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失により突然変異させることによって、定常領域のエフェクター機能に障害が起こる。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域のＦｃ領域のＮ−グリコシル化もまた変化させることができ、例えば完全または部分的に除去することができ、それによって定常領域のエフェクター機能に障害が起こる。
いくつかの実施形態では、（例えばＩｇＧのＣＨ２ドメイン中の）Ｆｃ領域のＮ−グリコシル化を除去することにより、エフェクター機能に障害が起こる。いくつかの実施形態では、グリコシル化アミノ酸残基または定常領域中のグリコシル化認識配列の部分である隣接残基を突然変異させることにより、Ｆｃ領域のＮ−グリコシル化を除去する。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン（Ｎ−Ｘ−Ｓ）、アスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｎ−Ｘ−Ｔ）、およびアスパラギン−Ｘ−システイン（Ｎ−Ｘ−Ｃ）（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、Ｎ−グリコシル化のためのアスパラギン側鎖に糖質部分が酵素的に付着するための認識配列である。定常領域のトリペプチド配列中の任意のアミノ酸を突然変異させることにより、無グリコシル化ＩｇＧを得る。例えば、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３のＮ−グリコシル化部位Ｎ２９７は、Ａ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異させることができる。Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５〜２６０１（１９８９）およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３：５９〜７６（１９９８）を参照されたい。Ａｓｎ−２９７のＧｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓへの置換を有するヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトＦｃγＲＩに結合せず、補体を活性化せず、ＩｇＧ１に対するＣ１ｑ結合能が完全に失われ、ＩｇＧ３に対しては劇的に減少することが報告された。いくつかの実施形態では、トリペプチド配列中のアミノ酸Ｎは、アミノ酸Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙのいずれか１つに突然変異される。いくつかの実施形態では、トリペプチド配列中のアミノ酸Ｎは、保存的置換残基に突然変異される。いくつかの実施形態では、トリペプチド配列中のアミノ酸Ｘは、プロリンに突然変異される。いくつかの実施形態では、トリペプチド配列中のアミノ酸Ｓは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙに突然変異される。いくつかの実施形態では、トリペプチド配列中のアミノ酸Ｔは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙに突然変異される。いくつかの実施形態では、トリペプチド配列中のアミノ酸Ｃは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙに突然変異される。いくつかの実施形態では、トリペプチドに続くアミノ酸は、Ｐに突然変異される。いくつかの実施形態では、定常領域でのＮ−グリコシル化は、酵素的に（Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３、およびエングリコシダーゼＨ（ｅｎｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｈ）などで）除去される。Ｎ−グリコシル化の除去は、Ｎ−グリコシル化に欠損を有する細胞系で抗体を産生することによってもまた達成することができる。Ｗｒｉｇｈｔら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３３９３〜４０２（１９９８）。
いくつかの実施形態では、定常領域のＮ−グリコシル化部位に付着したオリゴ糖と相互作用しているアミノ酸残基を突然変異させて、ＦｃγＲＩに対する結合親和性を低減する。例えば、ヒトＩｇＧ３のＦ２４１、Ｖ２６４、Ｄ２６５を突然変異させることができる。Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５７：４９６３〜４９６９（１９９６）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ＰＣＴ ＷＯ９９／５８５７２およびＡｒｍｏｕｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：５８５〜５９３（２００３）；Ｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：１９２５〜１９３３（２０００）に記載されているように、エフェクター機能は、ヒトＩｇＧの２３３〜２３６、２９７、および／または３２７〜３３１などの領域を修飾することにより障害を起こす。ＰＣＴ ＷＯ９９／５８５７２およびＡｒｍｏｕｒらに記載されている抗体は、標的分子に対する結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域のすべてまたは一部に実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、有意な補体依存性溶解または標的の細胞介在性破壊をトリガーせずに標的分子と結合することができる。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩに対して低減した親和性を有する。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂと特異的に結合することができる。これらは、典型的には２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインから誘導されたキメラドメインに基づく。このように修飾された抗体は、従来の抗体療法に対する炎症反応および他の有害反応を回避するための慢性抗体療法への使用に特に適する。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖定常領域は、以下の任意の突然変異を有するヒト重鎖ＩｇＧ１である：１）Ａ３２７Ａ３３０Ｐ３３１からＧ３２７Ｓ３３０Ｓ３３１；２）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５Ｇ２３６からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５、Ｇ２３６欠失；３）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５；４）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５Ｇ２３６Ａ３２７Ａ３３０Ｐ３３１からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５Ｇ３２７Ｓ３３０Ｓ３３１、Ｇ２３６欠失；５）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５Ａ３２７Ａ３３０Ｐ３３１からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５Ｇ３２７Ｓ３３０Ｓ３３１；および６）Ｎ２９７からＡ２９７またはＮ以外の任意の他のアミノ酸。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖定常領域は、以下の突然変異を有するヒト重鎖ＩｇＧ２である：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖定常領域は、以下の任意の突然変異を有するヒト重鎖ＩｇＧ４である：Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５Ｇ２３６からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５、Ｇ２３６欠失；Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５；およびＳ２２８Ｌ２３５からＰ２２８Ｅ２３５。
定常領域もまた修飾して、補体活性化に障害を起こすことができる。例えば、補体Ｃ１成分の結合後のＩｇＧ抗体の補体活性化は、Ｃ１結合モチーフ（例えばＣ１ｑ結合モチーフ）中の定常領域のアミノ酸残基を突然変異させることにより低減することができる。ヒトＩｇＧ１のＤ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１のそれぞれに関するＡｌａ突然変異は、抗体がＣ１ｑに結合して補体を活性化する能力を有意に低減することが報告された。マウスＩｇＧ２ｂについては、残基Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２がＣ１ｑ結合モチーフを構成する。Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：４１７８〜４１８４（２０００）；Ｄｕｎｃａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８〜７４０（１９８８）。
マウスＩｇＧ２ｂについて同定されたＣ１ｑ結合モチーフＥ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２は、他の抗体アイソタイプと共通すると考えられる。Ｄｕｎｃａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８〜７４０（１９８８）。ＩｇＧ２ｂについてのＣ１ｑ結合活性は、３つの特定の残基の任意の１つを、その側鎖に不適切な官能基を有する残基と置き換えることによって撤廃することができる。Ｃ１ｑの結合を撤廃するために、イオン系残基のみをＡｌａに置き換えることは不必要である。Ｃ１ｑの結合を撤廃するために３つの残基のうちの任意の１つの代わりにＧｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、もしくはＶａｌなどの他のアルキル置換非イオン系残基、またはＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、およびＰｒｏなどの芳香族無極性残基を使用することもまた可能である。加えて、Ｃ１ｑの結合活性を撤廃するために、残基３１８ではなく３２０および３２２の代わりにＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔなどの極性非イオン系残基を使用することもまた可能である。
本発明は、エフェクター機能障害を有する抗体もまた提供し、ここで、その抗体は修飾されたヒンジ領域を有する。ヒトＩｇＧのＦｃ受容体に対するヒトＩｇＧの結合親和性は、ヒンジ領域を修飾することにより調節することができる。Ｃａｎｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３〜１４９１（１９９１）；Ｈｅｚａｒｅｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２１６１〜１２１６８（２００１）；Ｒｅｄｐａｔｈら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５９：７２０〜７２７（１９９８）。特異的アミノ酸残基は、突然変異または欠失させることができる。修飾されたヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインとは異なる抗体クラスまたはサブクラスの抗体から誘導された完全なヒンジ領域を含むことがある。例えば、ＩｇＧクラスの抗体の定常ドメイン（ＣＨ１）は、ＩｇＧ４クラスの抗体のヒンジ領域に付着していることがある。あるいは、新しいヒンジ領域は、天然ヒンジの一部、または繰り返しの中の各ユニットが天然ヒンジ領域から誘導された繰り返しユニットの一部を含むことがある。いくつかの実施形態では、天然ヒンジ領域は、１つもしくは複数のシステイン残基を、アラニンなどの中性残基に変換することによって、または適切に配置された残基をシステイン残基に変換することによって変更される。例えば、米国特許第５，６７７，４２５号を参照されたい。そのような改変は、当技術分野で認識されているタンパク質化学および好ましくは遺伝子工学技術を用いて、ならびに本明細書に記載するように実施される。
ｔｒｋＢ受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、エフェクター機能障害を有する重鎖定常領域に融合したポリペプチドもまた本明細書に記載する方法に使用することができる。そのような融合ポリペプチドの一例はイムノアドヘシンである。例えば、米国特許第６，１５３，１８９号を参照されたい。
当技術分野で公知の、エフェクター機能障害を有する抗体を製造する他の方法もまた用いることができる。
修飾された定常領域を有する抗体およびポリペプチドは、１つまたは複数のアッセイで試験して、生物学的活性におけるエフェクター機能低減のレベルを出発抗体に比べて評価することができる。例えば、変更されたＦｃ領域または変更されたヒンジ領域を有する抗体またはポリペプチドが補体またはＦｃ受容体（例えばミクログリア上のＦｃ受容体）と結合する能力は、本明細書に開示するアッセイおよび当技術分野で認められている任意のアッセイを使用して評定することができる。ＰＣＴ ＷＯ９９／５８５７２；Ａｒｍｏｕｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：５８５〜５９３（２００３）；Ｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：１９２５〜１９３３（２０００）；Ｓｏｎｇら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７０：５１７７〜５１８４（２００２）。
抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体は、ｔｒｋＢの１つまたは複数の細胞外ドメインを発現する免疫原を使用することによって作ることができる。免疫原の一例は、ｔｒｋＢを高く発現する細胞であり、その細胞は、本明細書に記載するように得ることができる。使用することができる免疫原の別の例は、ｔｒｋＢ受容体の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの部分を含有する可溶性タンパク質（ｔｒｋＢイムノアドヘシンなど）である。
宿主動物の免疫処置の経路およびスケジュールは、概して、本明細書にさらに記載する抗体の刺激および産生のための確立された技術および従来技術に沿う。ヒトおよびマウス抗体を産生するための一般技術は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
ヒトを含めた任意の哺乳動物対象またはそれに由来する抗体産生細胞は、ヒトを含めた哺乳動物のハイブリドーマ細胞系の産生のための基礎として役立つように操作することができることが考えられている。典型的には、宿主動物は、本明細書に記載するものを含めたある量の免疫原を腹腔内接種される。
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７の、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら（１９８２）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７〜３８１により修正された一般体細胞ハイブリダイゼーション技術を用いて、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製することができる。非限定的にＸ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、米国カリフォルニア州サンディエゴからの骨髄腫細胞系を含めた入手できる骨髄腫細胞系を、ハイブリダイゼーションに使用することができる。一般に、その技術は、ポリエチレングリコールなどの融合源を使用して、または当業者に十分に公知の電気的手段により、骨髄腫細胞およびリンパ系細胞を融合させることを伴う。融合後に、融合用培地から細胞を分離し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択生育培地中で生育させ、ハイブリダイズしてない親細胞を排除する。本明細書に記載する、血清を補充されたか、または補充されていない任意の培地は、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用することができる。細胞融合技術の別の代替として、ＥＢＶで不死化したＢ細胞を使用して、主題発明の抗ｔｒｋＢモノクローナル抗体を産生させることができる。ハイブリドーマを所望により増大させてサブクローニングし、従来のイムノアッセイ（例えばラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、または蛍光イムノアッセイ）の手順により、抗免疫源活性について上清がアッセイされる。
抗体の起源として使用することができるハイブリドーマは、ｔｒｋＢに特異的なモノクローナル抗体またはその部分を産生する親ハイブリドーマのすべての誘導体、子孫細胞を包含する。
そのような抗体を産生するハイブリドーマは、公知の手順を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで生育させることができる。モノクローナル抗体は、所望により硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などの従来の免疫グロブリン精製手順によって培地または体液から単離することができる。望まれない活性がもしも存在すれば、固相に付着した免疫原からできた吸着剤の上に調製物を流し、その免疫原から所望の抗体を溶出または放出させることによってそれを除去することができる。ヒトもしくは他の種のｔｒｋＢ受容体、またはヒトもしくは他の種のｔｒｋＢ受容体の断片、または二官能性薬剤もしくは誘導化剤（例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である））を使用し、免疫処置される種に免疫原性のタンパク質（例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤）にコンジュゲートした標的アミノ酸配列を含有するヒトもしくは他の種のｔｒｋＢ受容体もしくは断片を用いた宿主動物の免疫処置は、抗体（例えばモノクローナル抗体）集団を得ることができる。免疫原の別の例は、ｔｒｋＢを高く発現する細胞であり、その細胞は、組換え手段により、または天然起源から高レベルのｔｒｋＢを発現する細胞を単離もしくは富化することにより得ることができる。これらの細胞は、ヒトのものでも、他の動物起源であってもよく、直接単離された免疫原として使用することもできるし、免疫原性が増加または（ｔｒｋＢの断片の）ｔｒｋＢの発現が増加もしくは富化するように加工することもできる。そのような加工には、非限定的に、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノール、アセトン、および／または様々な酸などの、細胞またはその断片の安定性または免疫原性を増加するように設計された薬剤を用いて、その細胞またはその断片を処理することが含まれる。さらに、そのような処理の前または後のいずれかで、細胞は、所望の免疫原について、この場合はｔｒｋＢまたはその断片について富化するために、加工することができる。これらの加工ステップには、当技術分野で十分に公知の膜分画技術が含まれることがある。
所望であれば、関心対象の抗ｔｒｋＢ抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）は配列決定することができ、次に、ポリヌクレオチド配列は、発現または伝播のために、ベクターにクローニングすることができる。関心対象の抗体をコードしている配列は、宿主細胞のベクター中に維持することができ、次に、宿主細胞は、将来に使用するために規模拡大および凍結することができる。その代わりとして、ポリヌクレオチド配列は、抗体を「ヒト化」するために、または抗体の親和性もしくは他の性質を改善するために、遺伝子操作に使用することができる。例えば、その抗体をヒトにおける臨床試験および治療に使用するならば、定常領域をヒト定常領域にさらに類似するように操作して、免疫応答を回避することができる。抗体配列を遺伝子操作して、ｔｒｋＢ受容体に対してさらに大きな親和性を、およびｔｒｋＢ受容体の活性化にさらに大きな効力を得ることが理想的なことがある。１つまたは複数のポリヌクレオチド変化を抗ｔｒｋＢ抗体に加えても、ｔｒｋＢ細胞外ドメインまたはｔｒｋＢのエピトープに対する結合能をなお維持することができることは、当業者に明らかであろう。
モノクローナル抗体をヒト化するためには４つの一般的ステップがある。これらは、（１）出発抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計するステップ、すなわちヒト化工程の間にどの抗体のフレームワーク領域を使用すべきかを判断するステップ、（３）実際のヒト化方法論／技術、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，８０７，７１５号；第５，８６６，６９２号；第６，３３１，４１５号；第５，５３０，１０１号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，５８５，０８９号；第６，１８０，３７０号；および第６，５４８，６４０号を参照されたい。例えば、その抗体をヒトにおける臨床試験および治療に使用するならば、定常領域をヒト定常領域にさらに類似するように操作して、免疫応答を回避することができる。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および第５，８６６，６９２号を参照されたい。
げっ歯動物Ｖ領域または修飾げっ歯動物Ｖ領域、およびそれらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト定常ドメインに融合したものを有するキメラ抗体を含めた、非ヒト免疫グロブリンから誘導された抗原結合部位を含むいくつかの「ヒト化」抗体分子が記載されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３〜２９９（１９９１）、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４２２０〜４２２４（１９８９）、Ｓｈａｗら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４〜４５３８（１９８７）、およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３５７７〜３５８３（１９８７）を参照されたい。他の参考文献は、ヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にげっ歯動物ＣＤＲをグラフト化してから、適切なヒト抗体定常ドメインと融合させることを記載している。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）、およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５（１９８６）を参照されたい。別の参考文献は、組換え上張り（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯動物フレームワーク領域により支持されるげっ歯動物ＣＤＲについて記載している。例えば、欧州特許公報第５１９，５９６号を参照されたい。これらの「ヒト化」分子は、げっ歯動物抗ヒト抗体分子に対する望まれない免疫応答であって、ヒトレシピエントにおけるそれらの部分の治療適用の期間および有効性を制限する免疫応答を最小化するように設計される。抗体定常領域は、それが免疫学的に不活性なように、例えばそれが補体介在性溶解をトリガーせず、抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を刺激しないように、操作することができる。他の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３〜２６２４；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／またはＵＫ特許出願第９８０９９５１．８号に記載されているように修飾される。
例えばＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；ＵＫ特許出願第９８０９９５１．８号を参照されたい。同様に利用することができる、抗体をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２４７１〜２４７６（１９９１）および米国特許第６，１８０，３７７号；第６，０５４，２９７号；第５，９９７，８６７号；第５，８６６，６９２号；第６，２１０，６７１号；第６，３５０，８６１号；およびＰＣＴ出願ＷＯ０１／２７１６０に開示されている。
なお別の代替では、完全ヒト抗体は、特異的ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用することにより得ることができる。より理想的な（例えば完全ヒト抗体の）免疫応答またはより強い免疫応答を産生するように設計されたトランスジェニック動物もまた、ヒト化またはヒト抗体の作製に使用することができる。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フリーモント）からのＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州プリンストン）からのＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
代替では、抗体は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して組換え製造および発現させることができる。別の代替では、抗体は、ファージディスプレイ技術により組換え製造することができる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，５８０，７１７号、第５，７３３，７４３号、および第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜４５５（１９９４）を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５３（１９９０））を用いて、非免疫処置ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生させることができる。この技術によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの、繊維状バクテリオファージの主または副コートタンパク質遺伝子のいずれかにフレーム内でクローニングして、ファージ粒子表面に機能的抗体断片として表出させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有することから、抗体の機能的性質に基づく選択は、それらの性質を示す抗体をコードしている遺伝子の選択もまた招く。したがって、ファージは、Ｂ細胞の性質の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で行うことができ、総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３、５６４〜５７１（１９９３）を参照されたい。いくつかの起源のＶ遺伝子セグメントは、ファージディスプレイのために使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８（１９９１））は、免疫処置されたマウスの脾臓から誘導されたＶ遺伝子の小規模ランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。本質的にＭａｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５〜７３４（１９９３）に記載されている技法通りに、免疫処置されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子レパートリーを構築することができ、多様なアレイの抗原（自己抗原を含める）に対する抗体を単離することができる。自然免疫応答では、抗体遺伝子は、高い率で突然変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入される変化の一部は、高い親和性を付与するものであり、その後の抗原攻撃の間に、高親和性表面免疫グロブリンを表出しているＢ細胞が優先的に複製および分化する。この自然工程は、「鎖シャフリング」として公知の技術を使用することにより模倣することができる。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９〜７８３（１９９２））。この方法では、ファージディスプレイにより得られた「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、免疫処置されていないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異体のレパートリー（レパートリー）に連続的に置き換えることによって改善することができる。この技術は、ｐＭ〜ｎＭ範囲の親和性を有する抗体および抗体断片を産生させる。非常に大規模なファージ抗体レパートリー（「究極の（ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ）ライブラリー」としても公知である）を作るための戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５〜２２６６（１９９３）に記載されている。遺伝子シャフリングを用いて、げっ歯動物抗体からヒト抗体を誘導することもまたでき、ここで、そのヒト抗体は、出発げっ歯動物抗体と類似の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によると、ファージディスプレイ技術により得られるげっ歯動物抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えられ、げっ歯動物−ヒトキメラを創出する。抗原上での選択は、機能的抗原結合部位を復旧することができるヒト可変領域の単離を招く、すなわちエピトープがパートナーの選択を支配する（インプリントする）。残りのげっ歯動物Ｖドメインを置き換えるためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９３／０６２１３参照）。ＣＤＲグラフト化によるげっ歯動物抗体の伝統的ヒト化とは異なり、この技術は、げっ歯動物起源のフレームワークもＣＤＲ残基も有さない完全なヒト抗体を提供する。上記論考はヒト化抗体に関するが、論じた一般原理は、例えばイヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシに使用するための抗体をあつらえるために適用できることは明らかである。
抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体である二重特異性抗体のことがあり、それは、本明細書に開示する抗体を使用して調製することができる。二重特異性抗体を作るための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０参照）。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対と、異なる特異性を有する２つの重鎖との同時発現に基づいた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ ３０５、５３７〜５３９）。
二重特異性抗体を作る一アプローチによると、所望の結合特異性（抗体−抗原組合せ部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。軽鎖の結合に必要な部位を含有する第１重鎖定常領域（ＣＨ１）が融合体の少なくとも１つに存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望により免疫グロブリン軽鎖とをコードしているＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に共トランスフェクトされる。これは、構築物に使用される等しくない比の３つのポリペプチド鎖が最適の収率をもたらす実施形態において、この３つのポリペプチド断片の相互比率の調整に大きな柔軟性を与える。しかし、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率を招く場合またはその比が特に重要ではない場合には、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖に関するコード配列を、１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
一アプローチでは、二重特異性抗体は、一方のアームにおける第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、もう一方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を与える）とから構成される。二重特異性分子の半分だけに免疫グロブリン軽鎖を有するこの非対称構造は、望まれない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物を分離することを容易にする。このアプローチは、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０４６９０に記載されている。
２つの共有結合した抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内に属する。そのような抗体は、望まれない細胞に免疫系細胞を標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の治療のために（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／２００３７３、ならびにＥＰ０３０８９）使用されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作ることができる。適切な架橋剤および技術は、当技術分野で十分に公知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
抗体は、宿主動物から作った抗体を最初に単離し、遺伝子配列を得、その遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）に抗体を組換え発現させることにより、組換え的に作ることができる。使用することができる別の方法は、植物（例えばタバコ）、トランスジェニック乳、または他の生物に抗体配列を発現させることである。植物または乳に抗体を組換え発現させる方法が開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２７５６；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．ｌｍｍｕｎｏｌ １３：６５；ならびにＰｏｌｌｏｃｋら（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７を参照されたい。例えばヒト化抗体、単鎖抗体などの抗体誘導体を作る方法は、当技術分野で公知である。
キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤を伴う方法を含めた合成タンパク質化学の公知の方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することもまたできる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成させることによって、免疫毒素を構築することができる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート（ｍｅｔｈｙｌ−４−ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙｒｉｍｉｄａｔｅ）が含まれる。
Ｉｌｉａｄｅｓら、１９９７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４０９：４３７〜４４１に記載されているような単鎖Ｆｖ断片もまた産生させることができる。様々なリンカーを使用したそのような単鎖断片の結合形成は、Ｋｏｒｔｔら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０：４２３〜４３３に記載されている。抗体の組換え産生および操作のための様々な技術は、当技術分野で十分に公知である。
抗体は、１９９９年１１月１８日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２に記載されているように修飾することができる。これらの抗体は、標的分子に対する結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインのすべてまたは一部に実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の有意な補体依存性溶解も細胞介在性破壊もトリガーせずに、標的分子と結合することができる。好ましくは、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂと特異的に結合することができる。これらは、典型的には２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインから誘導されたキメラドメインに基づく。このように修飾された抗体は、従来の抗体療法に対する炎症および他の有害反応を回避するための慢性抗体療法に使用するために好ましい。
宿主動物の免疫処置または組換えのいずれかで作られた抗体は、本明細書に記載する任意の１つまたは複数のｔｒｋＢアゴニスト活性を示すはずである。
イムノアッセイおよび蛍光標識細胞選別（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー選別技術を使用して、ｔｒｋＢに特異的な抗体を単離することもまたできる。
抗体は、多数の異なる担体に結合させることができる。担体は、活性および／または不活性でありうる。十分に公知の担体の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が含まれる。担体の本質は、本発明の目的のために可溶性または不溶性のいずれかでありうる。当業者は、抗体を結合させるための他の適切な担体を知っているものであるし、日常的な実験を用いてそれを確かめることができるものである。
アゴニスト抗ｔｒｋＢ抗体をコードしているＤＮＡは、当技術分野で公知のように配列決定することができる。一般に、モノクローナル抗体は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなｃＤＮＡの好ましい入手源として役立つ。いったん単離したＤＮＡは、発現ベクター（ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２に開示されている発現ベクターなど）に配置することができ、その発現ベクターは、次に大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞にモノクローナル抗体の合成を得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２を参照されたい。ＤＮＡは、例えば相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコード配列に置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてもしくは一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合形成させることによってもまた修飾することができる。そのようにして、本明細書の抗ｔｒｋＢモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。アゴニスト抗ｔｒｋＢ抗体（その抗原結合断片など）をコードしているＤＮＡもまた、本明細書に記載する所望の細胞にアゴニスト抗ｔｒｋＢ抗体を送達および発現させるために使用することができる。ＤＮＡ送達技術は、本明細書にさらに記載する。
抗ｔｒｋＢ抗体は、当技術分野で十分に公知の方法を用いて特徴付けすることができる。例えば、一方法は、抗体−抗原複合体の結晶構造を解明すること、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイを含めて、それが結合するエピトープを同定することであり、それは、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９９９の第１１章に記載されている。追加の例では、エピトープマッピングを使用して、抗ｔｒｋＢ抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、様々な入手源、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ １５、８２１９ ＰＨ Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）から市販されている。エピトープは、線状エピトープ、すなわち単一ストレッチのアミノ酸に含有されることもあるし、必ずしも単一ストレッチに含有されないことがある、アミノ酸の三次元相互作用により形成されるコンフォメーションエピトープのことがある。様々な長さのペプチド（例えば少なくとも４〜６アミノ酸長）を単離または（例えば組換え）合成して、抗ｔｒｋＢ抗体を用いた結合アッセイに使用することができる。別の例では、抗ｔｒｋＢ抗体が結合するエピトープは、ｔｒｋＢ細胞外配列から誘導された重複するペプチドを使用し、抗ｔｒｋＢ抗体による結合を決定することによる系統スクリーニングで決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによると、ｔｒｋＢをコードしているオープンリーディングフレームは、ランダムに、または特異的遺伝子構築物によるかのいずれかで断片化され、発現したｔｒｋＢの断片と、被験抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えばＰＣＲにより産生し、次にｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、放射性アミノ酸の存在下でタンパク質に翻訳することができる。次に、放射性標識したｔｒｋＢ断片への抗体の結合は、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定される。ある種のエピトープは、ファージ粒子の表面に表出されたランダムなペプチド配列の大規模ライブラリー（ファージライブラリー）を使用することによってもまた同定することができる。
抗ｔｒｋＢ抗体を特徴付けるために使用することができるなお別の方法は、同じ抗原に、すなわちｔｒｋＢ細胞外ドメインに結合することが公知の他の抗体を用いた競合アッセイを使用して、抗ｔｒｋＢ抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを判定することである。競合アッセイは、当業者に十分に公知である。競合アッセイに有用な抗体の例には、以下のものが含まれる：抗体６．１．２、６．４．１、２３４５、２３４９、２．５．１、２３４４、２２４８、２２５０、２２５３、および２２５６。ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９８３６１を参照されたい。
エピトープマッピングは、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９８３６１に記載されているドメインスワップ突然変異体を使用してもまた行うことができる。概して、このアプローチは、ｔｒｋＡまたはｔｒｋＣと有意に交差反応しない抗ｔｒｋＢ抗体に有用である。ｔｒｋＢのドメインスワップ突然変異体は、ｔｒｋＢの細胞外ドメインをｔｒｋＣまたはｔｒｋＡ由来の対応するドメインに置き換えることにより作ることができる。様々なドメインスワップ突然変異体への各アゴニスト抗ｔｒｋＢ抗体の結合は、ＥＬＩＳＡまたは当技術分野で公知の他の方法を用いて、評価し、野生型（天然由来の）ｔｒｋＢへのその結合と比較することができる。別のアプローチでは、アラニンスキャニングを行うことができる。抗原であるｔｒｋＢ受容体の個別の残基は、別のアミノ酸（通常はアラニン）に系統的に突然変異され、ＥＬＩＳＡまたは当技術分野で公知の他の方法を用いて、修飾ｔｒｋＢが抗体に結合する能力を試験することによって、変化の効果が評定される。
ＢＤＮＦポリペプチド
本発明の方法に用いるｔｒｋＢアゴニストには、ＢＤＮＦポリペプチドが含まれる。本明細書に使用する「ＢＤＮＦポリペプチド」には、米国特許第５，１８０，８２０号に示される成熟ヒトＢＤＮＦなどの天然に存在する成熟タンパク質（相互交換可能に「ＢＤＮＦ」と称される）およびＢＤＮＦの天然に存在するアミノ酸配列変異体と、ＢＤＮＦのアミノ酸配列変異体と、成熟ＢＤＮＦ（ヒトなど）および前記アミノ酸配列変異体のペプチド断片と、成熟ＢＤＮＦおよび前記アミノ酸配列変異体およびペプチド断片の修飾された形態が含まれるが、ただし、ポリペプチドまたはペプチドは、天然に存在するアミノ酸以外の部分との置換により共有的に修飾されている、そのアミノ酸配列変異体、ペプチド断片、およびその修飾された形態は、ｔｒｋＢアゴニストおよび／または天然に存在する成熟ＢＤＮＦタンパク質の１つまたは複数の生物学的活性を示す。ｔｒｋＢアゴニストには、本明細書に記載するＢＤＮＦポリペプチドの任意の実施形態を含む融合タンパク質およびコンジュゲート、例えばＰＥＧまたはペプチドなどの半減期延長部分にコンジュゲートまたは融合したＢＤＮＦポリペプチドもまた含まれる。考慮中のアミノ酸配列変異体、ペプチド断片（変異体の断片を含める）、またはその修飾された形態には、任意の動物種のＮＧＦ、ＮＴ−４／５、またはＮＴ−３は含まれない。ＢＤＮＦポリペプチドには、本明細書に記載する任意の１つまたは複数の実施形態が含まれる。例えば、ＢＤＮＦポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有する天然に存在する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦポリペプチドは、天然に存在する哺乳動物ＢＤＮＦ、または天然に存在する哺乳動物ＢＤＮＦから誘導されたＢＤＮＦポリペプチドであって、天然に存在する非哺乳動物ＢＤＮＦのどの部分とも合致しない配列を有するＢＤＮＦポリペプチドのことがある。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦポリペプチドは、天然に存在するヒトＢＤＮＦ、または天然に存在するヒトＢＤＮＦから誘導されたＢＤＮＦポリペプチドであって、天然に存在する非ヒトＢＤＮＦのどの部分とも合致しない配列を有するＢＤＮＦポリペプチドのことがある。
変異体、ペプチド断片、ＢＤＮＦポリペプチド（天然に存在するＢＤＮＦを含める）の修飾された形態、本発明の融合タンパク質およびコンジュゲートを含めたＢＤＮＦポリペプチドは、以下の任意の（１つまたは複数の）性質を特徴とする：（ａ）ｔｒｋＢ受容体に結合する、（ｂ）ｔｒｋＢ受容体に結合し、ｔｒｋＢの生物学的活性および／またはｔｒｋＢシグナル伝達機能により仲介される１つもしくは複数の下流の経路を活性化する、（ｃ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、体重および／または摂食を増加させる、（ｄ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、悪液質の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｅ）末梢投与した場合に、霊長類においてｔｒｋＢ受容体に結合し、神経性食欲不振の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｆ）末梢投与した場合に、哺乳動物においてｔｒｋＢ受容体に結合し、オピオイド誘導性嘔吐症の１つまたは複数の症状を治療、予防、後退、または回復させる、（ｇ）ｔｒｋＢ受容体の二量体化および活性化を促進する、ならびに（ｈ）ｔｒｋＢ受容体依存性の神経細胞の生存および／または神経突起の成長を増加させる。したがって、すべてのＢＤＮＦポリペプチド（変異体、断片、および修飾された形態を含める）は、上記のように機能的である。
変異体の生物学的活性は、当技術分野で公知の方法および本明細書に記載する方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。ＢＤＮＦポリペプチドは、天然に存在するＢＤＮＦタンパク質に比べて高まった活性または低減した活性を有することがある。いくつかの実施形態では、機能的に等価な変異体は、上記の（または当技術分野で公知の）１つまたは複数の生物学的アッセイに関して、ＢＤＮＦポリペプチドが誘導された天然由来のＢＤＮＦタンパク質に比べて少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の任意の活性を有する。いくつかの実施形態では、機能的に同等の変異体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｋＢ受容体の活性化（例えば、実施例６ならびに米国特許出願第２００５／０２０９１４８号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０８２４０１に記載されているアッセイ）において、約０．０１ｎＭ、約０．１ｎＭ、約１ｎＭ、約１０ｎＭ、または約１００ｎＭのいずれか未満のＥＣ５０（最大有効濃度の半値）を有する。
ＢＤＮＦのアミノ酸配列変異体には、天然に存在するＢＤＮＦ（例えば成熟ヒトＢＤＮＦ）の配列内の１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、および／または置換によって、天然に存在するＢＤＮＦとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。アミノ酸配列変異体は、概して、任意の天然に存在するＢＤＮＦ（成熟ヒトＢＤＮＦなど）と少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一なものである。いくつかの実施形態では、この変異体は、成熟ヒトＢＤＮＦのアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である。いくつかの実施形態では、この変異体は、成熟ヒトＢＤＮＦのアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一である。いくつかの実施形態では、この変異体は、成熟ヒトＢＤＮＦのアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、変異体は、成熟ヒトＢＤＮＦのアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一である。
例えば、ＢＤＮＦをＮＧＦ、ＢＤＮＦ、またはＮＴ−３に変換するような変異は、本発明の範囲内に含まれない。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は所定であっても、突然変異の本質自体は所定である必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を最適化するために、標的コドンまたは標的領域でａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発が行われ、発現したＢＤＮＦ変異体が、最適の所望の活性についてスクリーニングされる。
アミノ酸配列の欠失は、概して約１から３０残基、より好ましくは約１から１０残基の範囲であり、そして典型的には連続している。欠失は、ＢＤＮＦの活性を修飾するために、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５の間で相同性の低い領域に導入することができる。ＮＴ−４／５、ＮＴ−３、およびＮＧＦと実質的に相同な区域でのＢＤＮＦからの欠失は、ＢＤＮＦの生物学的活性をより有意に修飾すると見込みがさらに高いことがある。連続的な欠失の数は、影響を受けたドメインにおけるＢＤＮＦの三次構造（例えば、β−プリーツシートまたはαらせん）を保存するように選択することができる。
アミノ酸配列の挿入には、１残基から１０００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶ、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入（すなわち成熟ＢＤＮＦ配列内の挿入）は、概して、約１から１０残基、より好ましくは、１から５残基、最も好ましくは１から３残基の範囲のことがある。末端挿入の一例には、組換え宿主からの成熟ＢＤＮＦの分泌を容易にするために、ＢＤＮＦ分子のＮ末端に異種Ｎ末端シグナル配列を融合することが含まれる。そのようなシグナルは、概して、意図される宿主細胞と同種であり、それらには、大腸菌についてのＳＴＩＩまたはｌｐｐ、酵母についてのα因子、および哺乳動物細胞についてのヘルペスｇＤなどのウイルスシグナルが含まれる。他の挿入には、ＢＤＮＦのＮまたはＣ末端へのポリペプチドの融合が含まれる。
変異体の別の群には、ＢＤＮＦ中の少なくとも１つ（好ましくは１つだけ）のアミノ酸残基が除去されて、異なる残基がその場所に挿入されているものが含まれる。一例は、アルギニンおよびリシンを他のアミノ酸に置き換えて、ＢＤＮＦをセリンプロテアーゼによるタンパク質分解に抵抗性にすることによって、より安定なＢＤＮＦ変異体を創出することである。置換突然変異誘発のための最大の関心対象の部位には、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５にみられるアミノ酸が、側鎖のかさ高さ、電荷、または疎水性に関して実質的に異なる部位であるが、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５の様々の動物アナログ内で（例えば、すべての動物ＮＧＦ、すべての動物ＮＴ−３、およびすべてのＢＤＮＦのすべての間で）選択された部位に高度の相同性もまたある部位が含まれる。この分析は、栄養因子の活性の区別に関与しうる残基を強調するものであることから、これらの部位での変異体は、そのような活性に影響を及ぼすことがある。関心対象の他の部位は、残基がすべての動物種のＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５の間で同一な部位であり、このコンフォメーションの程度は、全４つの因子に共通する生物学的活性を達成することの重要性を示唆している。
例えば、１つまたは複数のアミノ酸の置換には、保存的置換が含まれる。保存的置換を行う方法は、当技術分野で公知である。例えば、ａｌａ（Ａ）は、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅと、好ましくはｖａｌと置換することができ、ａｒｇ（Ｒ）は、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｓｎと、好ましくはｌｙｓと置換することができ、ａｓｎ（Ｎ）は、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇと、好ましくはｇｌｎと置換することができ、ａｓｐ（Ｄ）は、ｇｌｕと置換することができ、ｃｙｓ（Ｃ）は、ｓｅｒと置換することができ、ｇｌｎ（Ｑ）は、ａｓｎと置換することができ、ｇｌｕ（Ｅ）は、ａｓｐと置換することができ、ｇｌｙ（Ｇ）は、ｐｒｏと置換することができ、ｈｉｓ（Ｈ）は、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇと、好ましくはａｒｇと置換することができ、ｉｌｅ（Ｉ）は、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ノルロイシンと、好ましくはｌｅｕと置換することができ、ｌｅｕ（Ｌ）は、ノルロイシン、ｉｌｅ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅと、好ましくはｉｌｅと置換することができ、ｌｙｓ（Ｋ）は、ａｒｇ、ｇｌｎ、ａｓｎと、好ましくはａｒｇと置換することができ、ｍｅｔ（Ｍ）は、ｌｅｕ、ｐｈｅ、ｉｌｅと、好ましくはｌｅｕと置換することができ、ｐｈｅ（Ｆ）は、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａと、好ましくはｌｅｕと置換することができ、ｐｒｏ（Ｐ）は、ｇｌｙと置換することができ、ｓｅｒ（Ｓ）はｔｈｒと置換することができ、ｔｈｒ（Ｔ）は、ｓｅｒと置換することができ、ｔｒｐ（Ｗ）は、ｔｙｒと置換することができ、ｔｙｒ（Ｙ）は、ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒと、好ましくはｐｈｅと置換することができ、ｖａｌ（Ｖ）は、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａ、ノルロイシンと、好ましくはｌｅｕと置換することができる。
機能の実質的な修飾は、（ａ）置換の区域における、例えばシートまたはらせんコンフォメーションとしてのポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さを維持することに及ぼす置換の効果が有意に異なる置換を選択することにより達成することができる。天然に存在する残基は、共通の側鎖の性質に基づいて群分けされる（残基の一部は、いくつかの機能的群に入ることがある）：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のメンバーと交換することを伴うものである。
ＢＤＮＦのアミノ酸配列変異体は、天然に存在することもあるし、以前に単離したＢＤＮＦ ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することにより、または所望の変異ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成によるなどして、合成的に調製することができる。上記のように、そのような変異体は、成熟ＢＤＮＦのアミノ酸配列（例えば表１に示す配列）内に１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、または挿入もしくは置換を含むことがある。欠失、挿入、および置換の任意の組合せは、結果として生じる変異ポリペプチドが、所望の特徴をもつならば、ＢＤＮＦのアミノ酸配列変異体に到達するように加えられる。そのアミノ酸変化は、組換え宿主に発現した際に、例えばグリコシル化部位を導入もしくは移動するか、または膜アンカー配列を導入して、（ＰＣＴ ＷＯ８９／０１０４１による）ＢＤＮＦのさらなる修飾を招くこともまたある。
いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦポリペプチドは、成熟ヒトＢＤＮＦをコードしている核酸配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含む。
同様に、またはその代わりに、変異ポリペプチドは、天然由来の遺伝子またはその部分もしくは相補体に実質的に相同なことがある。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中程度にストリンジェントな条件で、そのポリペプチドをコードしている天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）にハイブリダイズすることができる。
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載するポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列があることは、当業者に認識されているものである。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然由来遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を担う。それにもかかわらず、コドン利用頻度の差異が原因で変動するポリヌクレオチドが、本発明によって具体的に考えられている。さらに、本明細書に提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内に属する。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つまたは複数の突然変異の結果として変更された内因性遺伝子である。結果として生じたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有することもあるが、有する必要はない。対立遺伝子は、標準技術（ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列の比較など）を用いて同定することができる。
本発明の方法に使用するｔｒｋＢアゴニストには、ＢＤＮＦ（例えばヒトＢＤＮＦ）またはその機能的ペプチド断片のアミノ酸配列を含む融合タンパク質もまた含まれる。生物学的に活性なＢＤＮＦポリペプチドは、配列、例えば、免疫学的反応性を高める配列、支持体もしくは担体へのポリペプチドの結合形成を容易にする配列、または再フォールディングおよび／もしくは精製を容易にする配列（例えば、Ｍｙｃ、インフルエンザウイルスヘマグルチニンから誘導されたＨＡ、Ｈｉｓ−６、ＦＬＡＧなどのエピトープをコードしている配列）と融合することができる。これらの配列は、Ｎ末端またはＣ末端で、ＢＣＮＦポリペプチドに融合することができる。加えて、このタンパク質またはポリヌクレオチドは、その機能を増加させるか、または細胞中のその局在化を特定する、分泌配列などの他のものまたはポリペプチドに融合することができる。上記の組換え融合タンパク質を産生する方法は、当技術分野で公知である。この組換え融合タンパク質は、当技術分野で十分に公知の方法によって、産生、再フォールディング、および単離することができる。
本明細書に記載するＢＤＮＦポリペプチドは、個体におけるそのポリペプチドの半減期を増加させるために修飾することができる。例えば、ＢＤＮＦポリペプチドは、生物学的活性の最小限の損失で、全身クリアランスを低減するために、ＰＥＧ化することができる。本発明は、ＰＥＧ分子に連結したＢＤＮＦポリペプチドを含む組成物（医薬組成物を含む）もまた提供する。いくつかの実施形態では、このＰＥＧ分子は、可逆的連結を介してＢＤＮＦポリペプチドに連結している。ＰＥＧ化ＢＤＮＦポリペプチドの半減期は、非ＰＥＧ化ＢＤＮＦポリペプチドの半減期の約２倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、および約３０倍のいずれかを超えるだけ延長することができる。
ＰＥＧポリマーは、当技術分野で公知の方法を使用して、ＢＤＮＦポリペプチドの様々の官能基に連結することができる。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９〜４７６（２００２）；Ｓａｋａｎｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：１０８５〜９１（１９９７）を参照されたい。ＰＥＧは、このポリペプチドの以下の官能基、すなわちアミノ基、カルボキシル基、修飾または天然Ｎ末端、アミン基、およびチオール基に連結することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の表面アミノ酸残基が、ＰＥＧ分子で修飾される。ＰＥＧ分子は、様々な大きさ（例えば約２から４０ＫＤａの範囲）のことがある。ＢＤＮＦポリペプチドに連結したＰＥＧ分子は、約２０００、約１００００、約１５０００、約２００００、約２５０００、約３００００、約３５０００、約４００００Ｄａの任意の分子量を有することがある。ＰＥＧ分子は、一本鎖または分岐鎖のことがある。ＢＤＮＦポリペプチドにＰＥＧを連結するために、一方または両方の末端に官能基を有するＰＥＧの誘導体を使用することができる。その官能基は、ＢＤＮＦポリペプチド上の利用可能な反応性基の種類に基づいて選択される。ポリペプチドに誘導体を連結する方法は、当技術分野で公知である。Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９から４７６（２００２）。ＢＤＮＦポリペプチドとＰＥＧとの間の連結は、個体において切断または自然分解でき、半減期を改善するが活性の損失を最小限に抑えることができる連結（可逆的または分解可能な連結）のこともまたある。ＢＤＮＦポリペプチド上のＰＥＧ連結部位は、表面の残基を、ＰＥＧ反応性基を有するシステインなどのアミノ酸残基に突然変異させることによって創出することもまたできる。
ＢＤＮＦポリペプチドは、組換え手段によって、すなわち、ＢＤＮＦポリペプチドをコードしている核酸の発現によって産生することができる。組換え細胞培養、および場合により、例えば、変異体の活性のバイオアッセイによるか、またはウサギ抗ＢＤＮＦポリクローナル抗体（天然由来のＢＤＮＦ中にも存在する、その変異体の少なくとも１つの免疫エピトープに結合する）を含む免疫アフィニティーカラムへの吸着による細胞培養物からの変異ポリペプチドの精製において。４０残基以下のオーダーの小さなペプチド断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法により好都合に作られる。
ＢＤＮＦポリペプチドをコードしているＤＮＡは、宿主細胞においてタンパク質を発現させるための発現ベクターにクローニングすることができる。ＢＤＮＦポリペプチドをコードしている核酸の例は、米国特許出願公開第２００３／０２０３３８３号に記載されている。ＢＤＮＦポリペプチドをその成熟形態でコードしているＤＮＡは、そのアミノ末端で分泌シグナルと連結することができる。この分泌シグナルは、好ましくは、通常はヒト細胞からのＢＤＮＦのｉｎ ｖｉｖｏ分泌を指令するＢＤＮＦプレ配列である。しかし、適切な分泌シグナルには、他の動物ＢＤＮＦ由来のシグナル、ＮＧＦ、ＮＴ−２、もしくはＮＴ−３由来のシグナル、ウイルスシグナル、または同種もしくは関係する種の分泌ポリペプチドに由来するシグナルもまた含まれる。任意の宿主細胞（大腸菌など）は、タンパク質またはポリペプチドを発現させるために使用することができる。
発現したＢＤＮＦポリペプチドは、精製することができる。ＢＤＮＦポリペプチドは、培地から分泌タンパク質として回収することができるが、分泌シグナルなしに直接発現した場合には、このポリペプチドは、宿主細胞溶解物からもまた回収することができる。当技術分野で公知のタンパク質精製法を用いることができる。ＢＤＮＦポリペプチドを産生する方法および発現したＢＤＮＦポリペプチドを精製する方法は、当技術分野で公知である。ＢＤＮＦポリペプチドは、当技術分野で公知の方法により、大腸菌に発現させ、再フォールディングさせることができる。成熟ヒトＢＤＮＦは、（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから）商業的に得ることもまたできる。
ＮＴ−４／５ポリペプチドを作製および産生する方法は、ＢＤＮＦポリペプチドを作製および産生するためにもまた用いることができる。
ｔｒｋＢアゴニストの同定
ｔｒｋＢアゴニスト（抗体など）は、以下の方法の１つまたは複数を含めた、当技術分野で認められている方法を用いて同定することができる。例えば、米国特許第５，７６６，８６３号および第５，８９１，６５０号に記載されているキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）アッセイを用いることができる。このＥＬＩＳＡ型アッセイは、受容体型タンパク質チロシンキナーゼ（ｒＰＴＫ、例えばｔｒｋ受容体）のキナーゼドメインの自己リン酸化を測定することによるキナーゼ活性化の定性または定量測定に、ならびに選択されたｒＰＴＫの潜在的アゴニストまたはアンタゴニストの同定および特徴付けに適する。アッセイの第１の段階は、キナーゼ受容体の、本発明の場合はｔｒｋＢ受容体のキナーゼドメインのリン酸化を伴い、ここで、その受容体は、真核細胞の細胞膜に存在する。受容体は、内因性受容体であってもよいし、受容体をコードしている核酸すなわち受容体構築物を細胞に形質転換してもよい。典型的には、第１の固相（例えば第１のアッセイプレートのウェル）にそのような細胞（通常は哺乳動物細胞系）の実質的に均一な集団を被覆することにより、細胞を固相に接着させる。多くの場合、細胞は接着性であり、その結果、第１の固相に自然に接着する。「受容体構築物」が使用されるならば、それは、通常はキナーゼ受容体とｆｌａｇポリペプチドとの融合体を含む。ｆｌａｇポリペプチドは、アッセイのＥＬＩＳＡ部分で、捕捉剤により、多くの場合、捕捉抗体により認識される。次に、接着した細胞を有するウェルに候補アゴニストなどの分析物を加えることにより、チロシンキナーゼ受容体（例えばｔｒｋＢ受容体）を分析物に曝露（または接触）させる。このアッセイは、関心対象のチロシンキナーゼ受容体（例えばｔｒｋＢ）に関するアゴニストリガンドの同定を可能にする。分析物に曝露後に、接着細胞は、溶解緩衝液（可溶化洗剤を中に有する）および穏やかな撹拌を使用して可溶化することによって、アッセイのＥＬＩＳＡ部分に直接供することができる細胞溶解物を放出し、その細胞溶解物は、濃縮する必要も、清澄化する必要もない。
このように調製された細胞溶解物は、次に、アッセイのＥＬＩＳＡ段階に供する準備ができている。ＥＬＩＳＡ段階の第１ステップとして、第２の固相（通常はＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェル）に、チロシンキナーゼ受容体または受容体構築物の場合にはｆｌａｇポリペプチドに特異的に結合する捕捉剤（多くの場合、捕捉抗体）を被覆する。第２の固相の被覆は、捕捉剤が第２の固相に接着するように実施する。捕捉剤は、概してモノクローナル抗体であるが、本明細書の実施例に記載するように、ポリクローナル抗体または他の薬剤もまた使用することができる。得られた細胞溶解物は、次に接着性捕捉剤に曝露するか、またはそれと接触させることにより、その受容体または受容体構築物が第２の固相に接着する（または捕捉される）ようにする。次に、未結合の細胞溶解物を除去し、捕捉された受容体または受容体構築物を残す洗浄ステップを実施する。次に、接着または捕捉された受容体または受容体構築物は、チロシンキナーゼ受容体におけるリン酸化されたチロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体に曝露するか、またはそれと接触させる。好ましい実施形態では、抗ホスホチロシン抗体は、非放射性呈色試薬の色変化を触媒する酵素に（直接的または間接的に）コンジュゲートされる。したがって、受容体のリン酸化は、試薬のその後の色変化により測定することができる。酵素は、抗ホスホチロシン抗体に直接結合することもできるし、コンジュゲート分子（例えばビオチン）が抗ホスホチロシン抗体にコンジュゲートすることができ、その酵素は、そのコンジュゲート分子を介して続いて抗ホスホチロシン抗体に結合することができる。最終的に、捕捉された受容体または受容体構築物への抗ホスホチロシン抗体の結合は、例えば呈色試薬の色変化により測定する。
最初の同定に続いて、候補（例えば抗ｔｒｋＢモノクローナル抗体）のアゴニスト活性は、標的の生物学的活性を試験することが公知であるバイオアッセイによりさらに確認および洗練することができる。例えば、候補がｔｒｋＢを作動する能力は、完全長ｔｒｋＢをトランスフェクトしたＰＣ１２細胞を使用したＰＣ１２神経突起成長アッセイで試験することができる（Ｊｉａｎら、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．８：３６５〜７０、１９９６）。このアッセイは、適切なリガンドによる刺激に応答したラットフェオサイトクローマ（ｐｈｅｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍａ）細胞（ＰＣ１２）による神経突起の成長を測定する。これらの細胞は、内因性ｔｒｋＡを発現するため、ＮＧＦに応答性である。しかし、これらの細胞は、内因性ｔｒｋＢを発現しないため、ｔｒｋＢアゴニストに対する応答を誘起するために、ｔｒｋＢ発現構築物をトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞を候補と共にインキュベートした後に、神経突起の成長が測定され、例えば細胞の直径の２倍を超える神経突起を有する細胞が計数される。トランスフェクトされたＰＣ１２細胞における神経突起の成長を刺激する候補（抗ｔｒｋＢ抗体など）は、ｔｒｋＢアゴニスト活性を実証する。
ｔｒｋＢの活性化は、胚の発生の特異的段階の様々な特異的神経細胞を使用することによってもまた決定することができる。適切に選択された神経細胞は、生存のためにｔｒｋＢの活性化に依存しうるため、これらの神経細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで生存させた後に、ｔｒｋＢの活性化を決定することが可能である。適切な神経細胞の初代培養物に候補を添加することは、その候補がｔｒｋＢを活性化するならば、少なくとも数日間これらの神経細胞の生存を導くものである。これは、候補（抗ｔｒｋＢ抗体など）がｔｒｋＢを活性化する能力を決定させる。この種のアッセイの一例では、Ｅ１５マウス胚由来の下神経節を解剖し、解離させ、結果として得られた神経細胞を低密度で組織培養皿で平板培養する。次に、候補抗体を培地に添加し、プレートを２４〜４８時間インキュベートする。この時点の後で、様々な任意の方法により神経細胞の生存を評定する。アゴニストの投与を受けた試料は、典型的には対照抗体の投与を受けた試料よりも生存率の増加を示すものであり、これにより、アゴニストの存在の判定が可能になる。例えば、Ｂｕｃｈｍａｎら（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８（３）：９８９〜１００１を参照されたい。
ｔｒｋＢアゴニストは、自然に、またはｔｒｋＢをコードしているＤＮＡのトランスフェクション後のいずれかで、ｔｒｋＢを発現している多様な細胞型における下流のシグナル伝達を、それが活性化する能力により同定することができる。このｔｒｋＢは、ヒトｔｒｋＢまたは他の哺乳動物（げっ歯動物または霊長類など）ｔｒｋＢでありうる。下流のシグナル伝達カスケードは、ｔｒｋＢ発現細胞の様々な生化学的または生理学的パラメーター、例えばタンパク質発現レベル、もしくはタンパク質のタンパク質リン酸化レベルに対する変化、または細胞の代謝または生育状態（本明細書に記載する神経細胞の生存および／または神経突起の成長を含める）に対する変化により検出することができる。関連する生化学的または生理学的パラメーターを検出する方法は、当技術分野で公知である。
Ｖ．キット
本発明は、本方法に使用するためのキットもまた提供する。本発明のキットは、精製されたｔｒｋＢアゴニスト（例えば、天然に存在するＮＴ−４／５またはＢＤＮＦ、および抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体）を含む１つまたは複数の容器および本明細書に記載する本発明の任意の方法にしたがって使用するための説明書を包含する。概して、これらの説明書は、本明細書に記載する任意の方法により、悪液質、神経性食欲不振、およびオピオイド誘導性嘔吐症などの疾患を治療するためのｔｒｋＢアゴニストの投与の説明を含む。このキットは、治療に適した個体を、その個体が疾患および疾患の段階を有するかどうかを同定することに基づいて選択する説明をさらに含むことがある。
ｔｒｋＢアゴニストの使用に関係する説明書は、概して意図される治療のための投与量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を包含する。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば多回量パッケージ）、または亜単位用量のことがある。本発明のキットに供給される説明書は、典型的にはラベルまたは添付文書（例えばキットに包含される紙片）に書かれた説明書であるが、機械可読の説明書（例えば、磁気または光保存ディスクに収容される説明書）もまた許容できる。
ラベルまたは添付文書は、組成物が、本明細書に記載する疾患（悪液質、神経性食欲不振、およびオピオイド誘導性嘔吐症など）を治療するために使用されることを表示する。説明書は、本明細書に記載する任意の方法を実施するために提供することができる。
本発明のキットは、適切なパッケージの中にある。適切なパッケージには、非限定的に、バイアル、ボトル、広口瓶、フレキシブルパッケージ（例えば密封マイラーまたはポリ袋）などが含まれる。吸入器、経鼻投与装置（例えばアトマイザー）、またはミニポンプなどの点滴装置などの特定の装置と組み合わせて使用するためのパッケージもまた考えられている。キットは、滅菌アクセスポートを有することがある（例えば、容器は、静脈用溶液バッグまたは皮下注射針で穿刺することができるストッパーを有するバイアルのことがある）。容器もまた、滅菌アクセスポートを有することがある（例えば、容器は、静脈用溶液バッグまたは皮下注射針で穿刺することができるストッパーを有するバイアルのことがある）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤はｔｒｋＢアゴニストである。容器は、第２の薬学的に活性な薬剤をさらに含むことがある。
キットは、緩衝液および解釈上の情報などの追加の構成要素を場合により提供することがある。通常は、キットは、容器と、容器の上もしくは容器に関連したラベルまたは添付文書とを含む。
以下の実施例は、非限定的に本発明を例示するために提供される。
（実施例１）
ＮＴ−４／５の毎日点滴は、肥満ヒヒに体重増加および過食症を招く
肥満雌性ヒヒ３匹（体重範囲２０〜３０ｋｇ）に、１日目から２４日目まで１日１回２ｍｇ／ｋｇのヒトＮＴ−４／５の静脈内（ＩＶ）点滴を受けさせた。追加の肥満雌性ヒヒ３匹（体重範囲２０〜３０ｋｇ）に、１日目から２４日目まで１日１回ビヒクル（ＰＢＳ）のＩＶ点滴を受けさせた。食物摂取を最初の４５日間毎日測定した。動物は、最初の５３日間、１週間に１回体重測定し、次に８１日目および１０９日目にそれぞれ続行した。
図１に、ＮＴ−４／５の毎日点滴が肥満ヒヒの体重に及ぼす効果を示す。図１に示すように、ＮＴ−４／５処置群の体重は、ビヒクル群に比べて有意に増加し、ＮＴ−４／５処置群の体重は、８１日目までにビヒクル群のレベルに戻った。このデータは、ＮＴ−４／５の毎日点滴が、肥満ヒヒに長期であるが可逆的な体重増加を招いたことを示した。
図２に、肥満ヒヒにおける食物摂取に及ぼすＮＴ−４／５の毎日点滴の効果を示す。図２に示すように、ＮＴ−４／５処置群における摂食は、ビヒクル群に比べて有意に増加し、ＮＴ−４／５処置群の摂食は、３３日目までにビヒクル群のレベルに戻った。このデータは、ＮＴ−４／５の毎日点滴が、肥満ヒヒに可逆的な過食症を招いたことを示した。
（実施例２）
ＮＴ−４／５の１週間に２回の点滴は、肥満ヒヒに体重増加を招くが、過食症は招かなかった
肥満雌性ヒヒ３匹（体重範囲２０〜３０ｋｇ）に、１日目から３９日目まで１週間に２回２ｍｇ／ｋｇのヒトＮＴ−４／５の静脈内（ＩＶ）点滴を受けさせた。追加の肥満雌性ヒヒ３匹（体重範囲２０〜３０ｋｇ）に、１日目から３９日目まで１週間に２回ビヒクル（ＰＢＳ）のＩＶ点滴を受けさせた。摂食を最初の５５日間毎日測定した。動物は最初の６６日間１週間に１回体重測定し、次に９４日目および１２２日目にそれぞれ続行した。
図３に、ＮＴ−４／５の１週間に２回の点滴が肥満ヒヒの体重に及ぼす効果を示す。図３に示すように、ＮＴ−４／５処置群の体重は、ビヒクル群に比べて有意に増加し、ＮＴ−４／５処置群の体重は、９４日目までにビヒクル群のレベルに戻った。このデータは、ＮＴ−４／５の１週間に２回の点滴が、肥満ヒヒに可逆的な体重増加を招いたことを示した。
図４に、ＮＴ−４／５の１週間に２回の点滴が肥満ヒヒの食物摂取に及ぼす効果を示す。図４に示すように、二元配置ＡＮＯＶＡ解析によると、１週間に２回のＮＴ−４／５点滴は、肥満ヒヒの摂食を有意に変化させなかった。データのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定解析は、ＮＴ−４／５群（黒三角）とビヒクル対照群（白四角）の間で対での有意な差を示さなかった。
（実施例３）
ＮＴ−４／５の毎日点滴は、痩せたカニクイザルに体重増加および過食症を招いた
痩せた雌性カニクイザル３匹（体重範囲３〜５ｋｇ）に、１日目から３１日目まで毎日２ｍｇ／ｋｇのヒトＮＴ−４／５の静脈内（ＩＶ）点滴を受けさせた。痩せた雌性カニクイザル３匹（体重範囲３〜５ｋｇ）に、１日目から３１日目まで１週間に１回０．６ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化ＮＴ−４／５（ＰＥＧ化ＮＴ４−Ｇ１Ｓ）のＩＶ点滴を受けさせた。ＰＥＧ化ＮＴ４／５は、ヒトＮＴ−４／５成熟配列の１位のグリシンからセリンへの突然変異導入、および米国特許出願公開第２００５／０２０９１４８号およびＰＣＴ ＷＯ２００５／０８２４０１の実施例７に記載されている最初のアミノ酸セリンにＰＥＧを付着させることにより作製した。追加の痩せた雌性カニクイザル３匹（体重範囲３〜５ｋｇ）に、１日目から３１日目まで１日１回ビヒクル（ＰＢＳ）のＩＶ点滴を受けさせた。摂食は、最初の５０日間毎日測定した。動物は、１週間に１回、最長５０日目まで体重測定した。
図５に、痩せた雌性カニクイザルにおける体重に及ぼすＮＴ−４／５の毎日点滴の効果を示す。図５に示すように、ＮＴ−４／５の毎日処置群の体重は、ビヒクル群に比べて有意に増加したが、ＰＥＧ化ＮＴ−４／５の毎週処置群では有意に増加しなかった。ＮＴ−４／５処置群の体重は、ビヒクル群のレベルにまだ完全には戻らなかった。このデータは、ＮＴ−４／５の毎日点滴が、痩せたカニクイザルの体重増加を招いたことを示した。
図６に、痩せたカニクイザルにおける摂食に及ぼすＮＴ−４／５の毎日点滴の効果を示す。図６に示すように、ＮＴ−４／５の毎日処置群における摂食は、ビヒクル群に比べて有意に増加したが、ＰＥＧ化ＮＴ−４／５の毎週処置群では有意に増加せず、ＮＴ−４／５処置群における摂食は、３８日目までにビヒクル群のレベルに戻った。このデータは、ＮＴ−４／５の毎日点滴が、痩せたカニクイザルに可逆的過食症を招いたことを示した。
体重にＮＴ−４／５およびＰＥＧ化ＮＴ−４／５が及ぼす効果を、皮下投与によってもまた試験した。痩せた雌性カニクイザル３匹（体重範囲３〜５ｋｇ）に、１日目から２１日目まで毎日２ｍｇ／ｋｇのヒトＮＴ−４／５の皮下（ＳＣ）注射を受けさせた。痩せた雌性カニクイザル３匹（体重範囲３〜５ｋｇ）に、１日目から２１日目まで１日１回１ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化ＮＴ−４／５のＳＣ注射を受けさせた。追加の痩せた雌性カニクイザル３匹（体重範囲３〜５ｋｇ）に、１日目から２１日目まで１日１回ビヒクル（ＰＢＳ）のＳＣ注射を受けさせた。動物は、最長２１日目まで１週間に１回体重測定した。
図７に、痩せた雌性カニクイザルにおける体重に及ぼすＮＴ−４／５およびＰＥＧ化ＮＴ−４／５の毎日のＳＣ注射の効果を示す。図７に示すように、ＮＴ−４／５処置群の体重は、ビヒクル群に比べて有意に増加した。加えて、ＰＥＧ化ＮＴ−４／５処置群の体重もまた、ビヒクル群に比べて有意に増加した。
（実施例４）
ＮＴ−４／５の毎日の皮下注射は、ＮＺＷウサギにおける体重および摂食に有意な効果を示さなかった
５匹の雄性および５匹の雌性ニュージーランド白色（ＮＺＷ）ウサギ（体重範囲３〜４ｋｇ）に、１日目から１５日目まで毎日２ｍｇ／ｋｇのヒトＮＴ−４／５の皮下（ＳＣ）注射を受けさせた。追加の５匹の雄性および５匹の雌性ＮＺＷウサギ（体重範囲３〜５ｋｇ）に、１日目から１５日間まで１日１回ビヒクル（ＰＢＳ）のＳＣ注射を受けさせた。摂食は、最初の１５日間毎日測定した。動物は、最長１５日目まで１週間に１回体重測定した。
体重または摂食について、ＮＴ−４／５処置群およびビヒクル群の間に統計的に有意な差は観察されなかった。ＮＴ−４／５処置した雄性ウサギおよびビヒクル雄性ウサギの間、ならびにＮＴ−４／５処置した雌性ウサギおよびビヒクル雄性ウサギの間で比較を行った。
（実施例５）
ＮＴ−４／５の単回注射は、フェレットに嘔吐を引き起こさなかったが、モルヒネ誘導性嘔吐を低減することができる
嘔吐症に及ぼすＮＴ−４／５の効果を、約１ｋｇの体重を有する成雌性フェレット（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｆａｒｍ、コネチカット州）で研究した。催吐剤（０．０５ｍｇ／ｋｇのモルヒネ６−グルクロニド、Ｍ６Ｇ）を、陽性対照として皮下に与え、ＮＴ−４／５を投与する前のベースラインを確立した。漸増する用量のＮＴ−４／５（０．１、１、または１０ｍｇ／ｋｇ）を（各投薬量について）フェレット６匹に単独で皮下注射し、ＮＴ−４／５が吐き気または嘔吐などの任意の有害作用を引き起こすことができるかどうかを試験した。加えて、２用量、すなわち１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５をＭ６Ｇの１０分前に与え、ＮＴ−４／５がＭ６Ｇ誘導性嘔吐症を抑制することができるかどうかを試験した。動物をホームケージに戻し、注射後６０分間にわたり潜時、吐き気および嘔吐の回数を観察した。
図８に示すように、０．１、１、または１０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５単独の単回注射は、フェレットに嘔吐を引き起こさなかったが、０．０５ｍｇ／ｋｇのＭ６Ｇの単回ＳＣ注射は、効果的に催吐症を誘導した。１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの両方のＮＴ−４／５は、フェレットにおけるＭ６Ｇ誘導性嘔吐を有意に低減した。
フェレットにおけるＮＴ−４／５のＳＣ注射の抗嘔吐症効果を担いうるｔｒｋＢ活性化部位を試験するために、フェレット脳幹におけるｔｒｋＢのｃ−Ｆｏｓ活性化を試験した。雌性フェレット５匹に単回用量１０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−４／５を皮下注射し、続いて５分後に１０ｍｇ／ｋｇのシスプラチンを静脈内注射した。陰性対照として追加の雌性フェレット４匹に、ビヒクルの単回用量注射に続いて、５分後にシスプラチンの注射を行った。動物は、ペントバルビタールナトリウム（６５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）により１時間後に屠殺し、１Ｌ／ｋｇのＰＢＳに続いて１Ｌ／ｋｇの４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．３）の心臓内潅流により固定した。脳幹切片は、３０ｕｍに切り出し、浮遊切片を、（ＰＢＳ中の）０．１％トリトンＸ−１００に希釈した１０％正常ロバ血清（ＮＤＳ）中で１時間インキュベートし、続いて０．１％トリトンＸ−１００および１０％ＮＤＳを有するＰＢＳ中のヒツジ抗Ｆｏｓ（１：１０００、ＯＡ−１１−８２４、Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国ケンブリッジ）中で、４℃で４８時間インキュベートした。切片は、ＰＢＳ中で洗浄し、次にビオチン化抗ヒツジＩｇＧ二次抗体溶液中で室温で６０分間インキュベートした。アビジンビオチン複合体技術（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅアビジンビオチン複合体（ＡＢＣ）キット、Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて呈色させた。簡潔には、切片をＡＢＣ試薬に入れて室温で６０分間、次に３，３−ジアミノベンジジン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液に入れて３０〜６０秒間インキュベートした。次に、スライド上に脳幹切片を載せ、２４時間乾燥させ、５０、７０、９５、および１００％エタノール中でそれぞれ４分間脱水し、次にキシレンに入れて透明にし、その後、それらの切片をマウントして検鏡した。クレシルバイオレットで染色された隣接切片における孤束核（ＮＴＳ）の核および亜核の境界を評定した。ｃ−Ｆｏｓ免疫反応性神経細胞核の数を、最後野、迷走神経後核（ＤＭＮＸ）、ならびに閂より０．５〜１．０ｍｍ吻側および０．５ｍｍ尾側、ならびに閂での迷走神経背側核（ＤＶＣ）の吻側尾側の範囲に沿った３レベルでＮＴＳのすべての亜核について両側的に決定した。動物毎レベル毎に３つの切片を計数し、平均した。ＡＮＯＶＡ（Ｐｒｉｓｍ；ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）をＴｕｋｅｙの後検定と共に使用してデータを比較した。ＮＴ−４／５処置は、ビヒクルを注射した動物に比べて最後野におけるｃ−Ｆｏｓ陽性核の数を劇的に増加させた（図９Ａ、Ｐ＝０．０００９、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。対照的に、ＮＴ−４／５処置は、ビヒクルを注射した動物に比べて迷走神経後核におけるｃ−Ｆｏｓ陽性核の数を有意に減少させた（図９Ｂ、Ｐ＝０．００４７、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。他方で、ＮＴ−４／５処置は、ＮＴＳの複数の亜核および視床下部の室傍核を含めた他の脳幹核におけるｃ−Ｆｏｓ陽性核の数を有意には変更しなかった。
最後野は、大部分の他の脳領域とは異なり、血液脳関門の外側に位置し、循環している高分子と完全にアクセスできる（最近の例としては、ＹａｎｇおよびＦｅｒｇｕｓｏｎ、２００３、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．１１２（１〜３）：９〜１７参照）。ｃ−Ｆｏｓの誘導は、ＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５などのｔｒｋＢリガンドによるｔｒｋＢ活性化の公知の最初期事象である（Ｉｐら、１９９３、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３（８）：３３９４〜４０５およびＭａｒｓｈら、１９９３、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３（１０）：４２８１〜９２）。
これらのデータは、一緒になって、最後野が、少なくとも部分的に、系統的に送達されたＮＴ−４／５または他のｔｒｋＢアゴニストの真の「末梢的にアクセス可能な」標的になることを示唆している。迷走神経後核におけるｃ−Ｆｏｓの発現低減（図９Ｂ）は、ＮＴ−４／５前処置による嘔吐回路の部分的減弱を反映しているおそれがある。
（実施例６）
ｔｒｋＢアゴニスト抗体の作製およびスクリーニング
モノクローナル抗ＴｒｋＢアゴニスト抗体を作製するための免疫処置：Ｂａｌｂ／Ｃマウス１匹に、抗原としてヒトＴｒｋＢ細胞外ドメイン８ｕｇを定期的なスケジュールで５回注射した。ベクターｐＴｒｉＥｘ−２ Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、２９３細胞にＨｉｓタグ付きヒトＴｒｋＢ細胞外ドメイン（残基３１〜４３０）を発現させた。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）の説明通りに使用して、ｔｒｋＢ細胞外ドメインを精製した。最初の４回の注射については、ヒトＴｒｋＢをＲＩＢＩアジュバントシステムおよびミョウバンと混合することによって抗原を調製した。首筋、足底、およびＩＰにおよそ３日毎に１１日間のクールで注射することにより、合計８ｕｇの抗原を与えた。１３日目にマウスを安楽死させ、脾臓を取り出した。リンパ球を８６５３細胞と融合させ、ハイブリドーマクローンを作った。クローンを生育させ、次に、ヒトおよびラット両方のＴｒｋＢ ＥＬＩＳＡを用いたＥＬＩＳＡスクリーニングにより、抗ＴｒｋＢ陽性クローンとして選択した。
抗ｔｒｋＢ抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング：クローンがヒトおよびラット両方のＴｒｋＢと結合する能力について、生育中のハイブリドーマクローンからの上清をスクリーニングした。アッセイは、０．５ｕｇ／ｍｌのラットまたはヒトＴｒｋＢ−Ｆｃ融合タンパク質１００ｕｌを一晩被覆した９６ウェルプレートを用いて行った。各ステップの間に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳを用いて、過剰の試薬をウェルから洗浄して除いた。次に、０．５％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）でプレートをブロックした。上清をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたヤギ抗マウスＦｃを添加して、ＴｒｋＢに結合したマウス抗体に結合させた。次に、テトラメチルベンジジンをＨＲＰについての基質として添加し、上清に存在するマウス抗体の量を検出した。反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取ることにより抗体の相対量を定量した。５０個の抗体がＥＬＩＳＡアッセイで陽性と示された。これらの抗体のうち、５個をさらに試験し、それらがアゴニスト活性を有することが示された。下記表２を参照されたい。
ＫＩＲＡアッセイ：このアッセイは、ヒトＴｒｋＢに関する受容体型チロシンキナーゼ活性化を誘導する能力について、ＥＬＩＳＡで陽性と見出された抗体をスクリーニングするために使用した。Ｓａｄｉｃｋら（１９９７）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３４（２）：３５４〜６１。天然リガンドであるＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５を用いてみられる活性化に類似して、ｇＤタグ付きヒトＴｒｋＢをトランスフェクトされた安定細胞系を利用して、ハイブリドーマクローンからの精製マウス抗体が細胞表面の受容体を活性化する能力について、それらの抗体を試験した。天然リガンドは、ＴｒｋＢ受容体のキナーゼドメインの自己リン酸化を誘導した。細胞を様々な濃度の抗体に曝露した後で、それらの細胞を溶解させ、ＥＬＩＳＡを行ってＴｒｋＢ受容体のリン酸化を検出した。各推定ＴｒｋＢアゴニストについてＥＣ５０（下記表２および図１０に示す）を決定し、天然リガンドＮＴ−４／５のＥＣ５０と比較した。
Ｅ１５節状神経細胞生存アッセイ：Ｅ１５の胚から得た下神経節神経細胞はＢＤＮＦにより支援されていたため、飽和濃度の神経栄養因子で、生存率は培養４８時間まで１００％に近かった。ＢＤＮＦの不在下では、５％未満の神経細胞が４８時間まで生存した。したがって、Ｅ１５結節性神経細胞の生存率は、抗ＴｒｋＢ抗体のアゴニスト活性を評価するための高感度アッセイであり、すなわち、アゴニスト抗体は、Ｅ１５結節性神経細胞の生存を促進するであろう。
定時交配させた妊娠Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ雌性マウスをＣＯ２吸入により安楽死させた。子宮角を取り出し、胚期Ｅ１５の胚を抽出した。下神経節を解剖し、次にトリプシン処理し、機械的に解離させ、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンで被覆した９６ウェルプレートに入れた所定の無血清培地中で、ウェル１個あたり２００〜３００細胞の密度で平板培養した。抗ＴｒｋＢ抗体のアゴニスト活性は、３回の繰り返しでヒトＢＤＮＦに対して用量反応的に評価した。培養４８時間後に、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ液体取扱いワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で行った自動免疫細胞化学プロトコールに細胞を供した。プロトコールには、固定（４％ホルムアルデヒド、５％スクロース、ＰＢＳ）、透過処理（ＰＢＳ中の０．３％トリトンＸ−１００）、非特異的結合部位のブロッキング（５％正常ヤギ血清、０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ）、ならびに神経細胞を検出するための一次および二次抗体を用いた連続インキュベーションが含まれた。タンパク質遺伝子産物９．５（ＰＧＰ９．５、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対するウサギポリクローナル抗体は、樹立された神経細胞表現型マーカーであったが、その抗体を一次抗体として使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）は、培養物に存在するすべての細胞の核を標識するために、核色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒に二次試薬として使用した。画像取得および画像解析は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１／ＧｅｎＩＩ Ｉｍａｇｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で行った。画像は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２に関する２波長で自動的に取得し、核染色がすべてのウェルに存在することから、画像装置の画像に基づくオートフォーカスシステムに関する基準点として核染色を使用した。適切な目標およびウェル毎に画像化する部位の数は、各ウェルの表面全体に及ぶように選択した。自動化画像解析は、抗ＰＧＰ９．５抗体を用いた神経細胞の特異的染色に基づいて、培養４８時間後に各ウェルに存在する神経細胞数を計数するために設定した。画像の慎重な閾値設定ならびに形態および蛍光強度に基づく選択性フィルターの適用は、ウェル毎に神経細胞の正確な計数を招いた。ＥＣ５０（下記表２および図１１に示す）は、各推定ＴｒｋＢアゴニスト抗体について決定し、天然リガンドのＥＣ５０と比較した。
下記表２に、同定された５つの抗ｔｒｋＢ抗体ならびにマウス神経細胞の生存に及ぼすそれらの活性およびヒトｔｒｋＢに及ぼすリン酸化活性を示す。
Figure 2009528985
マウスへの抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体の頭蓋内注射：雄性Ｃ５７Ｂ６繁殖引退マウス（８〜１２月齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ施設）から得て、それを、１２時間の明暗サイクルで、注射前の少なくとも５日間に食事および水を自由摂取させて、温度／湿度制御環境で順応させた。各マウスをイソフルランで麻酔し、頭蓋の上の部分の毛を刈り込んだ。マウスを脳底固定外科装置（Ｋｏｐｆモデル９００）に固定し、麻酔し、媒質にセットした電気加温パッドで保温した。頭蓋の剪毛した部分にベタジンを塗布し、その領域を滅菌した。頭蓋骨の上の耳のちょうど後ろから開始して眼の方向に、約１ｃｍ長の小さな正中縦切開を行った。頭蓋を露出させ、頭蓋表面の直径約１ｃｍの円形スペースを綿棒で清浄にし、任意の結合組織を除去した。表面は、３０％過酸化水素に浸した綿棒で清浄にし、ブレグマを露出させた。頭蓋の深さを測定するプローブとしてドリルのチップを使用して、頭蓋骨を水平垂直方向に調整して、それがドリル処置前のレベルであったことを保証した。外側０．５ｍｍに比べた内側０．５ｍｍからの、および後側０．５ｍｍに比べた前側０．５ｍｍからの（ブレグマで０に合わせた）深さの偏差は、±０．０５ｍｍの差に入るように最小化した。マウス脳アトラス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｋ．Ｂ．Ｊ．＆ Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．、Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９７）によると、単回外側視床下部内注射の座標は以下の通りであった：ブレグマから１．３０ｍｍ後側；正中から−０．５ｍｍ、（ブレグマでの）頭蓋表面から深さ５．７０ｍｍ。脳と接触するのを避けながら頭蓋を通してドリルで小さな穴を開けた。ドリルを、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（モデル８４８５１）に取り付けた斜端２６ゲージ針に取り換え、同じ座標に戻った。外側視床下部に化合物２ｕｌを２分間にわたり徐々に増やして注射した。注射後３０秒間針をこの位置に保ち、次に１ｍｍ上げた。もう３０秒間経った後で、針を１ｍｍ上げた。３０秒後に、針を完全に取り出した。次に、切開を閉じ、２〜９ｍｍの創傷クリップ（Ａｕｔｏｃｌｉｐ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ブレーントリー）を用いて閉じ合わせた。０日目に注射を行った。体重および摂食を毎日１５日目までモニターした。
図１２Ａおよび１２Ｂに示すように、特定の用量での抗体１８Ｈ６および３６Ｄ１の頭蓋内注射は、マウスにおける体重および摂食を有意に低減した。特定の用量で与えた対照ＩｇＧ抗体および２３Ｂ８は、摂食にも体重にも有意には影響しなかった。統計解析には、二元配置ＡＮＯＶＡをＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定と共に用いた。これは、ＣＮＳに直接注射した場合に、抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体が、体重および摂食に対して、天然ｔｒｋＢアゴニストであるＮＴ−４／５に質的に類似した効果を有することを示している。
（実施例７）
ｔｒｋＢアゴニスト抗体の末梢注射は、サルにおいて摂食および体重の増加を招いた
痩せた成雌性カニクイザル（ベースラインで体重３〜５ｋｇ）に、１週間に２回マウスモノクローナルアゴニスト抗体３８Ｂ８の静脈内注射を受けさせ、別の動物３匹にビヒクルの注射を受けさせた。摂食を毎日モニターし、体重を毎週モニターした。ＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて統計解析を行った。すべてのデータおよびグラフは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表現した。データはＤｕｎｎｅｔ後検定と共に二次元ＡＮＯＶＡにより解析した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
５ｍｇ／ｋｇのｔｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８の１週間に２回の注射で処置したサルは、２週間以内に累積摂食の４０％増加（図１３Ａ）および体重の１０％増加（図１３Ｂ）を示し、これは、ｔｒｋＢチロシンキナーゼ受容体の特異的活性化が摂食の増加、カロリー摂取の増加、および体重増加を仲介することを示している。
本明細書に記載する実施例および実施形態は、単に例示目的であり、それに照らして当業者に様々な修飾または変化が示唆されるものであり、本出願の精神および範囲内に含まれるものとすることは、理解されている。
ＮＴ−４／５の毎日点滴が肥満雌性ヒヒの体重に及ぼす効果を示すグラフである。Ｘ軸は、体重を測定した日に対応し、Ｙ軸は、ベースライン（任意の処置前の体重）に対する率として測定した体重に対応する。ＮＴ−４／５処置群およびビヒクル群を比較するために二元配置ＡＮＯＶＡを用いた。データは、ＮＴ−４／５処置群の体重が、ビヒクル群と有意に異なったことを示した（Ｆ＝５０．７１、Ｐ＜０．０００１）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定解析は、ＮＴ−４／５処置群（黒三角）とビヒクル群（白四角）との間に対での有意な差を示した。グラフに示すように、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示す。 ＮＴ−４／５の毎日点滴が肥満雌性ヒヒの摂食に及ぼす効果を示すグラフである。Ｘ軸は、摂食を測定した日に対応し、Ｙ軸は、ヒヒが１日に食べたビスケットの数に対応する。ＮＴ−４／５処置群をビヒクル群と比較するために二元配置ＡＮＯＶＡを用いた。データは、ＮＴ−４／５処置群の摂食が、ビヒクル群と有意に異なったことを示した（Ｆ＝２６２．５、Ｐ＜０．０００１）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定は、ＮＴ−４／５処置群（黒三角）とビヒクル群（白四角）との間の対での有意な差を示した。グラフの黒棒線は、対応のある比較がＰ＜０．０５以下を招いた期間を示す。 ＮＴ−４／５の１週間に２回の点滴が肥満雌性ヒヒの体重に及ぼす効果を示すグラフである。Ｘ軸は、体重を測定した日に対応し、Ｙ軸は、ベースライン（任意の処置前の体重）に対する率として測定した体重に対応する。ＮＴ−４／５処置群をビヒクル群と比較するために二元配置ＡＮＯＶＡを使用した。データは、ＮＴ−４／５処置群の体重が、ビヒクル群と有意に異なることを示した（Ｆ＝３４．８１、Ｐ＜０．０００１）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定の解析は、ＮＴ−４／５処置群（黒三角）とビヒクル群（白四角）との間の対での有意な差を示した。＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。 ＮＴ−４／５の１週間に２回の点滴が肥満雌性ヒヒの摂食に及ぼす効果を示すグラフである。Ｘ軸は、摂食を測定した日に対応し、Ｙ軸は、ヒヒが１日に食べたビスケットの数に対応する。 ＮＴ−４／５の毎日の点滴およびＰＥＧ化ＮＴ−４／５の毎週の点滴が、痩せたカニクイザルの体重に及ぼす効果を示すグラフである。Ｘ軸は、体重を測定した日に対応し、Ｙ軸は、ベースライン（任意の処置前の体重）に対する率として測定した体重に対応する。ＮＴ−４／５処置群またはＰＥＧ化ＮＴ−４／５（ＰＥＧ−ＮＴ−４／５）をビヒクル群と比較するために二元配置ＡＮＯＶＡを用いた。データは、ＮＴ−４／５処置群の体重が、ビヒクル群と有意に異なったが、ＰＥＧ化ＮＴ−４／５処置群では有意に異ならなかったことを示した（Ｆ＝５４．９８、Ｐ＜０．０００１）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定解析は、ＮＴ−４／５処置群（三角）とビヒクル群（四角）との間に対での有意な差を示したが、ＰＥＧ化ＮＴ−４／５群（逆三角）とビヒクル群との間では示さなかった。グラフに示す＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示す。 ＮＴ−４／５の毎日の点滴およびＰＥＧ化ＮＴ−４／５の毎週の点滴が、痩せたカニクイザルの摂食に及ぼす効果を示すグラフである。Ｘ軸は、摂食を測定した日に対応し、Ｙ軸は、サルが１日に食べたビスケットの数に対応する。ＮＴ−４／５処置群またはＰＥＧ化ＮＴ−４／５（ＰＥＧ−ＮＴ−４／５）をビヒクル群と比較するために二元配置ＡＮＯＶＡを用いた。データは、ＮＴ−４／５処置群の体重が、ビヒクル群と有意に異なったが、ＰＥＧ化ＮＴ−４／５処置群では有意に異ならなかったことを示した（Ｆ＝３３．８２、Ｐ＜０．０００１）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定は、１５、１６、１７、１９、２２、２３、２５、および３０日目にＮＴ−４／５処置群（三角）とビヒクル群（四角）との間に対での有意な差を示した（Ｐ＜０．０５以下）が、ＰＥＧ化ＮＴ−４／５群（逆三角）とビヒクル群との間に対での有意な差は示さなかった。 ＮＴ−４／５の毎日の皮下注射およびＰＥＧ化ＮＴ−４／５の毎日の皮下注射が、痩せたカニクイザルの体重に及ぼす効果を示すグラフである。Ｘ軸は、体重を測定した日に対応し、Ｙ軸は、ベースライン（任意の処置前の体重）に対する率として測定した体重に対応する。ＮＴ−４／５処置群またはＰＥＧ化ＮＴ−４／５（ＰＥＧ−ＮＴ−４／５）をビヒクル群と比較するために二元配置ＡＮＯＶＡを用いた。データは、ＮＴ−４／５処置群の体重が、ビヒクル群と有意に異なったことを示した（Ｆ＝１９．１０、Ｐ＜０．０００１）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定の解析は、ＮＴ−４／５処置群（三角）とビヒクル群（四角）との間で、およびＰＥＧ化ＮＴ−４／５群（逆三角）とビヒクル群との間で対での有意な差を示した。＊＊＊はＰ＜０．００１を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示す。 ＮＴ−４／５の単回注射がフェレットのモルヒネ誘導性嘔吐症に及ぼす効果を示すグラフである。Ｘ軸は、注射した薬物の種類に対応し、Ｙ軸は注射後６０分間にわたる吐き気および嘔吐の回数に対応する。Ｄｕｎｎｅｔｔの後検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを統計解析に用いた。Ｐ値をグラフに示す。 フェレット後脳におけるＮＴ−４／５によるｃ−Ｆｏｓ誘導を示す図である。図９Ａは、最後野で抗ｃ−Ｆｏｓ抗体により染色された核の数を示す。図９Ｂは、迷走神経後核で抗ｃ−Ｆｏｓ抗体に染色された核の数を示す。 様々な抗ｔｒｋＢ抗体（３６Ｄ１、３８Ｂ８、３７Ｄ１２、１９Ｈ８（１）、１Ｆ８、２３Ｂ８、１８Ｈ６）によるＫＩＲＡアッセイにおけるｔｒｋＢチロシンリン酸化レベルをヒトＮＴ−４／５と比較して示す図である。 いくつかのｔｒｋＢアゴニスト抗体により支持される節状神経細胞の生存のグラフである。Ｘ軸は、Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスから得られた胚齢１５日（Ｅ１５）培養節状神経細胞に添加した、異なる濃度の抗ｔｒｋＢ抗体を表す。Ｙ軸は、平板培養の４８時間後の生存神経細胞数を表す。各点は４回の測定の平均であり、誤差の棒線は、平均からの１標準偏差の分散を示す。データは、試験したｔｒｋＢ抗体の一部が、節状神経細胞の生存を支持できること、およびこれらの抗体の５０％有効濃度（ＥＣ５０）が、この培養条件で０．１ｐＭ未満から１０ｐＭ超までの範囲であることを示す（表１参照）。 抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体の頭蓋内注射が、マウスの体重（図１２Ａ）および摂食（図１２Ｂ）に及ぼす効果を示すグラフである。抗体およびＮＴ−４／５を０日目に注射した。体重および摂食は、１５日目まで毎日測定した。＊＊＊は、マウスＩｇＧ対照に比べてＰ＜０．００１を示し、＊＊は、マウスＩｇＧ対照に比べてＰ＜０．０１を示し、＊は、マウスＩｇＧ対照に比べてＰ＜０．０５を示す。 抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体の末梢静脈内注射が、カニクイザルの体重（図１３Ａ）および摂食（図１３Ｂ）に及ぼす効果を示すグラフである。抗体を１日目に注射した。体重を毎週モニターし、摂食を毎日モニターした。＊＊＊は、対照ビヒクルに比べてＰ＞０．００１を示し、＊＊は、対照ビヒクルに比べてＰ＞０．０１を示し、＊は、対照ビヒクルに比べてＰ＞０．０５を示す。

Claims (33)

  1. 有効量のＮＴ−４／５を末梢投与することを含む、霊長類における悪液質を治療する方法。
  2. 前記霊長類がヒトである、請求項１に記載の方法。
  3. 有効量のＮＴ−４／５を末梢投与することを含む、霊長類における神経性食欲不振を治療する方法。
  4. 前記霊長類がヒトである、請求項３に記載の方法。
  5. 有効量のＮＴ−４／５を末梢投与することを含む、哺乳動物におけるオピオイド誘導性嘔吐症を治療する方法。
  6. 前記哺乳動物がヒトである、請求項５に記載の方法。
  7. 有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む、霊長類における悪液質を治療する方法。
  8. 前記霊長類がヒトである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ｔｒｋＢアゴニストが抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体である、請求項７または８に記載の方法。
  10. 前記アゴニストがｔｒｋＢ選択的である、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
  11. 有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む、霊長類における神経性食欲不振を治療する方法。
  12. 前記霊長類がヒトである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ｔｒｋＢアゴニストが抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記アゴニストがｔｒｋＢ選択的である、請求項１１から１３のいずれかに記載の方法。
  15. 有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む、哺乳動物におけるオピオイド誘導性嘔吐症を治療する方法。
  16. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ｔｒｋＢアゴニストが抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体である、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 前記アゴニストがｔｒｋＢ選択的である、請求項１５から１７のいずれかに記載の方法。
  19. 悪液質、神経性食欲不振、望まれない体重減少、またはオピオイド誘導性嘔吐症を治療するための末梢投与用医薬の製造への、ＮＴ−４／５またはその薬学的に許容できる塩の使用。
  20. 悪液質、神経性食欲不振、望まれない体重減少、またはオピオイド誘導性嘔吐症を治療するための末梢投与用医薬の製造への、ｔｒｋＢアゴニストまたはその薬学的に許容できる塩の使用。
  21. 前記ｔｒｋＢアゴニストがｔｒｋＢ選択的である、請求項２０に記載の使用。
  22. 前記ｔｒｋＢアゴニストが抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体である、請求項２０または２１に記載の使用。
  23. 有効量のＮＴ−４／５を末梢投与することを含む、霊長類における望まれない体重減少を治療する方法。
  24. 前記霊長類がヒトである、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記望まれない体重減少が、加齢に関連する、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記ヒトが、約２５．０ｋｇ／ｍ２、約２４．０ｋｇ／ｍ２、約２３．０ｋｇ／ｍ２、約２２．０ｋｇ／ｍ２、約２１．０ｋｇ／ｍ２、約２０ｋｇ／ｍ２、約１９．０ｋｇ／ｍ２、および約１８．５ｋｇ／ｍ２のいずれか未満のボディーマスインデックスを有する、請求項２、２４、または２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 有効量のｔｒｋＢアゴニストを末梢投与することを含む、霊長類における望まれない体重減少を治療する方法。
  28. 前記霊長類がヒトである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ｔｒｋＢアゴニストが抗ｔｒｋＢアゴニスト抗体である、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 前記アゴニストがｔｒｋＢ選択的である、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記ヒトが、約２５．０ｋｇ／ｍ２、約２４．０ｋｇ／ｍ２、約２３．０ｋｇ／ｍ２、約２２．０ｋｇ／ｍ２、約２１．０ｋｇ／ｍ２、約２０ｋｇ／ｍ２、約１９．０ｋｇ／ｍ２、および約１８．５ｋｇ／ｍ２のいずれか未満のボディーマスインデックスを有する、請求項８から１０または２８から３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記望まれない体重減少が、加齢に関連する、請求項２７から３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記ヒトが、約１８．５ｋｇ／ｍ２、約１７．５ｋｇ／ｍ２、または約１６．５ｋｇ／ｍ２のいずれか未満のボディーマスインデックスを有する、請求項４または１２から１４のいずれか１項に記載の方法。
JP2008552918A 2006-02-02 2007-02-01 ｔｒｋＢアゴニストを投与することにより望まれない体重減少または摂食障害を治療する方法 Withdrawn JP2009528985A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76541006P 2006-02-02 2006-02-02
PCT/IB2007/000254 WO2007088476A1 (en) 2006-02-02 2007-02-01 Methods for treating unwanted weight loss or eating disorders by administering a trkb agonist

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2009528985A true JP2009528985A (ja) 2009-08-13
JP2009528985A5 JP2009528985A5 (ja) 2009-10-15

Family

ID=38093467

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008552918A Withdrawn JP2009528985A (ja) 2006-02-02 2007-02-01 ｔｒｋＢアゴニストを投与することにより望まれない体重減少または摂食障害を治療する方法

Country Status (17)

Country Link
US (2) US20070248611A1 (ja)
EP (1) EP1988923A1 (ja)
JP (1) JP2009528985A (ja)
KR (1) KR20080091838A (ja)
CN (1) CN101400367A (ja)
AR (1) AR059304A1 (ja)
AU (1) AU2007210862A1 (ja)
BR (1) BRPI0707482A2 (ja)
CA (1) CA2637826A1 (ja)
DO (1) DOP2007000021A (ja)
IL (1) IL193069A0 (ja)
NL (1) NL2000464C2 (ja)
PE (1) PE20071364A1 (ja)
RU (1) RU2008131939A (ja)
TW (1) TW200808352A (ja)
UY (1) UY30128A1 (ja)
WO (1) WO2007088476A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014516959A (ja) * 2011-05-18 2014-07-17 ユニバーシティ・オブ・バーゼル トロポミオシン関連キナーゼｂレセプターに対する抗体

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0506793A (pt) * 2004-02-20 2007-05-22 Rinat Neuroscience Corp métodos de tratamento de obesidade ou diabetes com o uso de nt-4/5
WO2008058127A2 (en) * 2006-11-09 2008-05-15 Irm Llc Agonist trkb antibodies and uses thereof
JP2010513461A (ja) * 2006-12-20 2010-04-30 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション 自己免疫障害を治療するためのＴｒｋＢアゴニスト
KR20100089851A (ko) * 2007-10-23 2010-08-12 노파르티스 아게 호흡기 질환의 치료를 위한 ｔｒｋｂ 항체의 용도
WO2010086828A2 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Rinat Neuroscience Corporation Agonist anti-trkb monoclonal antibodies
FR2942409B1 (fr) * 2009-02-20 2013-07-26 Natacha Voillot Composition pharmaceutique pour la prevention des avortements a repetition.
CN102944674B (zh) * 2012-11-05 2014-10-22 武汉远征世纪制药有限公司 一种检测TrkB受体pan-Tyr位点活性的ELISA试剂盒及其使用方法
US11078287B2 (en) 2015-11-17 2021-08-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Binding agonist for treatment of neurological and other disorders
US9914781B1 (en) 2016-11-08 2018-03-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Binding agonist for treatment of neurological and other disorders
SG11202002665UA (en) * 2017-11-30 2020-04-29 Regeneron Pharma Anti-trkb monoclonal antibodies and methods of use

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) * 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US5109113A (en) * 1986-05-02 1992-04-28 Genentech, Inc. Membrane anchor fusion polypeptides
US4777127A (en) * 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
US5219740A (en) * 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US5364768A (en) * 1987-07-07 1994-11-15 Farmitalia Carlo Erba S.R.L. Process for the preparation of penems
US5422120A (en) * 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
US5686579A (en) * 1988-06-21 1997-11-11 Hybrisens, Ltd. Use of antibody/antigen interactions to protect biologically active proteins and peptides
ATE219519T1 (de) * 1989-01-23 2002-07-15 Chiron Corp Rekombinanttherapien für infektionen und hyperproliferative störungen
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6673776B1 (en) * 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
JPH03133378A (ja) * 1989-07-19 1991-06-06 Modrovich Ivan E 被験体を安定化させて液体中でのその生物学的活性を保存する方法
US5644034A (en) * 1989-08-07 1997-07-01 Peptide Technology Ltd. Tumour necrosis factor binding ligands
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US5670488A (en) * 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
AU654302B2 (en) * 1990-09-25 1994-11-03 Genentech Inc. Novel neurothrophic factor
US6566091B1 (en) * 1990-09-25 2003-05-20 Genentech, Inc. Neurotrophic factor
US5702906A (en) * 1990-09-25 1997-12-30 Genentech, Inc. Antibodies to neurotrophic factor-4 (NT-4)
US5364769A (en) * 1990-09-25 1994-11-15 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding neurotrophic factor four (NT-4), vectors, host cells and methods of production
CA2055812A1 (en) * 1990-11-20 1992-05-21 Carl N. Skold Method of stabilizing enzyme conjugates
US20030134815A1 (en) * 1991-08-20 2003-07-17 The Govt. Of The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
WO1993010218A1 (en) * 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
FR2688514A1 (fr) * 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
WO1994005697A1 (en) * 1992-09-07 1994-03-17 The Agricultural And Food Research Council Growth hormone potentiating molecules
CA2144539A1 (en) * 1992-09-14 1994-03-31 Judith Siuciak Method of producing analgesia using neurotrophins
US5349056A (en) * 1992-10-09 1994-09-20 Regeneron Pharmaceuticals Modified ciliary neurotrophic factors
IL109280A0 (en) * 1993-04-15 1994-07-31 Regeneron Pharma Neurotrophins for treatment of depression
DK0695169T3 (da) * 1993-04-22 2003-03-17 Skyepharma Inc Multivesikulære liposomer med indkapslet cyclodextrin og farmakologisk aktive forbindelser samt fremgangsmåder til anvendelse af disse
JP2534968B2 (ja) * 1993-05-27 1996-09-18 チッソ株式会社 フラビン還元酵素遺伝子
US6015686A (en) * 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US5766627A (en) * 1993-11-16 1998-06-16 Depotech Multivescular liposomes with controlled release of encapsulated biologically active substances
US5753225A (en) * 1993-12-03 1998-05-19 The Regents Of The University Of California Antibodies that mimic actions of neurotrophins
US20030191061A1 (en) * 1994-03-31 2003-10-09 Brewitt Barbara A. Treatment methods using homeopathic preparations of growth factors
US6024734A (en) * 1994-03-31 2000-02-15 Brewitt; Barbara A. Treatment methods using homeopathic preparations of growth factors
US6436908B1 (en) * 1995-05-30 2002-08-20 Duke University Use of exogenous β-adrenergic receptor and β-adrenergic receptor kinase gene constructs to enhance myocardial function
US6013517A (en) * 1994-05-09 2000-01-11 Chiron Corporation Crossless retroviral vectors
WO1995031183A1 (en) * 1994-05-16 1995-11-23 Washington University Cell membrane fusion composition and method
DE59510779D1 (de) * 1994-06-24 2003-10-02 Dade Behring Marburg Gmbh Verfahren zur Stabilisierung von hydrolyseempfindlichen Molekülen
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US6143718A (en) * 1995-06-07 2000-11-07 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Type II diabetes mellutis with amylin agonists
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US5780484A (en) * 1996-11-13 1998-07-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods for stimulating neurite growth with piperidine compounds
US5840736A (en) * 1996-11-13 1998-11-24 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods and compositions for stimulating neurite growth
HU222666B1 (hu) 1996-11-15 2003-09-29 Genentech, Inc. Eljárás neuorotrofinok tisztítására
KR20000070357A (ko) * 1997-01-23 2000-11-25 다께우찌 마사야쓰 당뇨병 치료제
US20030105057A1 (en) * 1997-03-19 2003-06-05 Yale University Methods and compositions for stimulating apoptosis and cell death or for inhibiting cell growth and cell attachment
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
NZ502820A (en) * 1997-08-29 2002-10-25 Vertex Pharma Heteroaryl or aryl substituted carboxylic acid or carboxamide derivatives optionally substituted with a sulphonamido group
WO1999018792A1 (en) * 1997-10-10 1999-04-22 Johns Hopkins University Gene delivery compositions and methods
US6565874B1 (en) * 1998-10-28 2003-05-20 Atrix Laboratories Polymeric delivery formulations of leuprolide with improved efficacy
DK1409654T3 (da) * 1999-06-16 2008-12-08 Boston Biomedical Res Inst Immunologisk styring af beta-amyloid-niveauer in vivo
JP2003503476A (ja) * 1999-07-06 2003-01-28 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 環化アミド誘導体
WO2001002362A1 (en) * 1999-07-06 2001-01-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Azo amino acid derivatives for the treatment of neurological diseases
AU5919900A (en) * 1999-07-06 2001-01-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Cyclized amino acid derivatives
AU5912900A (en) * 1999-07-06 2001-01-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Quinuclidine derivatives for treatment of neurological disorders
EP1196400A1 (en) * 1999-07-06 2002-04-17 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Amino-alkyl derivatives
WO2001008685A1 (en) * 1999-07-30 2001-02-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Acyclic and cyclic amine derivatives
CA2385929A1 (en) * 1999-10-29 2001-05-03 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh Use of gdnf for treating corneal defects
WO2001060398A1 (fr) * 2000-02-18 2001-08-23 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Medicaments destines a ameliorer l'intolerance au glucose
EP1262189A1 (en) * 2000-03-06 2002-12-04 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Leptin-resistance ameliorating agents
NZ523105A (en) 2000-06-22 2004-07-30 Genentech Inc Agonist anti-trk-C monoclonal antibodies
US7060429B2 (en) * 2001-02-22 2006-06-13 University Of Maryland, Baltimore Treatment of neurodegenerative diseases by altering levels of TrkB isoforms and/or TrkC isoforms
KR20040007714A (ko) * 2001-06-14 2004-01-24 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 신경 손상 치료에 유용한 비환식 피페라진 및 피페리딘유도체
US6818613B2 (en) * 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
BRPI0506793A (pt) * 2004-02-20 2007-05-22 Rinat Neuroscience Corp métodos de tratamento de obesidade ou diabetes com o uso de nt-4/5

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014516959A (ja) * 2011-05-18 2014-07-17 ユニバーシティ・オブ・バーゼル トロポミオシン関連キナーゼｂレセプターに対する抗体

Also Published As

Publication number Publication date
CA2637826A1 (en) 2007-08-09
EP1988923A1 (en) 2008-11-12
TW200808352A (en) 2008-02-16
AR059304A1 (es) 2008-03-26
NL2000464A1 (nl) 2007-08-03
BRPI0707482A2 (pt) 2011-05-03
UY30128A1 (es) 2007-09-28
RU2008131939A (ru) 2010-02-10
PE20071364A1 (es) 2008-01-30
KR20080091838A (ko) 2008-10-14
CN101400367A (zh) 2009-04-01
US20090291897A1 (en) 2009-11-26
WO2007088476A1 (en) 2007-08-09
DOP2007000021A (es) 2007-08-31
IL193069A0 (en) 2009-02-11
AU2007210862A1 (en) 2007-08-09
US20070248611A1 (en) 2007-10-25
NL2000464C2 (nl) 2007-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20090291897A1 (en) Methods for treating unwanted weight loss or eating disorders by administering a trkb agonist
JP4584713B2 (ja) 神経成長因子アンタゴニストを投与することによって術後疼痛を処置するための方法および神経成長因子アンタゴニストを含有する組成物
TWI516501B (zh) Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
US20040131615A1 (en) Methods for treating pain by administering a nerve growth factor antagonist and an opioid analgesic and compositions containing the same
US20100086997A1 (en) TrkB Agonists for Treating Autoimmune Disorders
JP2006517524A5 (ja)
US20110281348A1 (en) Agonist anti-trkc antibodies and methods using same
US20100196390A1 (en) Agonist anti-trkb monoclonal antibodies
US20070031418A1 (en) Methods for treating lower motor neuron diseases and compositions containing the same
US7935342B2 (en) Methods for treating obesity by administering a trkB antagonist
EP1581759B1 (en) Methods for treating taxol-induced sensory neuropathy
MX2008010021A (en) Methods for treating unwanted weight loss or eating disorders by administering a trkb agonist

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090825

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20100126

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20120105